CN103275329A - 一种聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺衍生物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺衍生物，由PEI-Bu溶解在碱性溶液中，与甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺碳酸酯反应得到。本发明制备的PEG修饰的PEI衍生物结构简单、易于合成；与现有PEI-Bu相比，PEG修饰后的PEG-Bu在多种细胞中具有比PEI-Bu更高的转染活性、更小的细胞毒性和更好的生物相容性；与现有的PEG化PEI相比，PEG化PEI-Bu不但能降低细胞毒性，还能明显提高转染活性。是高效、低毒的基因物质载体，更加适合基因物质输送。尤其是可以输送治疗性基因

——高血压相关基因血管紧张素原（AGT）短发夹RNA(shRNA)进行基因沉默，以实现高血压基因治疗。

Description

一种聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺衍生物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

基因治疗，是将外源性基因物质（DNA或RNA）导入细胞，促成或者抑制特定蛋白的表达，或者取代、修复有问题的基因，从而达到疾病治疗的目的。基因治疗在其发展过程中遇到了一系列技术瓶颈，其中最重要的瓶颈之一是基因物质安全有效的体内输送。

目前常用的基因输送载体可以分为重组病毒载体及人工合成载体(即非病毒载体）。病毒载体虽然显示了高的转染效率，但由于病毒的变异会引起潜在的致病危险，并且病毒表面成分会引起人体免疫反应，同时病毒的制备和纯化困难且携载基因容量小。因此非病毒基因载体被认为是更理想的基因物质输送载体。

传统的生物可降解高分子材料（如PGA、PLA、PLGA）不具有基因内吞逃逸功能，所以转染率不高，改性天然高分子如壳聚糖，其结构在设计改造上具有局限性，而以聚乙烯亚胺（PEI）为代表的能够帮助基因物质内吞逃逸的聚阳离子则因高分子量而引起细胞毒性过大。

PEI是目前研究最为广泛的聚阳离子非病毒载体，分支状分子量为25kDa的PEI（PEI25kDa）转染效率最高，但是PEI25kDa同时因其烷基骨架无法降解而导致细胞累计毒性较大。多数的国内外研究集中在小分子量PEI交联衍生物。

我们前期曾以小分子量PEI800Da为骨架，1,4-丁二醇二氯甲酸酯为连接剂合成氨酯键交联的聚乙烯亚胺类聚阳离子载体PEI-Bu（CN102443169A），研究结果显示与商业化的转染试剂PEI25kDa相比，PEI-Bu具有更高的转染活性和更低的细胞毒性，是一种高效、相对低毒的基因载体。但是PEI类聚阳离子有一个共同的特点，就是毒性太大，PEI-Bu也不例外，例如当PEI-Bu浓度达到40μg/mL时，HeLa细胞的存活率仅为55%，高细胞毒性会限制它的应用。另外，PEI/DNA在生理条件下容易聚集，并且转染活性易受血清蛋白的影响，从而不利于体内基因输送。因此，PEI类聚阳离子需要进行化学修饰以进一步降低毒性，同时保持或提高转染活性和提高生物相容性。在众多的化学修饰剂中，聚乙二醇（poly(ethyleneglycol)，PEG）因其较高的安全性和水溶性而被广泛应用。研究显示，对PEI进行PEG化后能提高PEI的生物相容性、降低毒性，降低PEI/DNA复合物的聚集，减少巨噬细胞对复合物的吞噬，降低与血清蛋白的非特异性反应，以及延长体内循环时间等，但是转染活性却明显下降。

发明内容

本发明的目的在于克服现有PEI-Bu和PEG化PEI的不足，提供一种PEG修饰的PEI衍生物，用PEG修饰PEI-Bu不但能明显降低细胞毒性和提高生物相容性，还能明显提高转染活性，从而更加有利于输送基因物质。

本发明的第一个目的是提供一种聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺衍生物（PEG-Bu），其特征在于，所述聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺衍生物的结构式为：

其中，m≥1，n≥1。

优选地，m为1-1000中的整数，更优选为5-900中的整数，更优选为10-800中的整数，更优选为20-700中的整数，更优选为30-600中的整数。

优选地，n为1-1000中的整数，优选为5-900中的整数，更优选为10-800中的整数，更优选为20-700中的整数，更优选为30-600中的整数。

优选地，m+n为200-1000中的整数，优选为220-900中的整数，更优选为240-800中的整数，更优选为260-700中的整数，更优选为300-600中的整数。

优选地，聚乙二醇的分子量大于1000，优选为1500-3000Da，更优选为1600-2800Da，更优选为1700-2600Da，更优选为1800-2400Da。

本发明的第二个目的是提供上述聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺衍生物的制备方法，包括下述步骤：

将1,4-丁二醇二氯甲酸酯为连接剂的聚乙烯亚胺衍生物（PEI-Bu）溶解在碱性溶液中，加入甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺碳酸酯，搅拌、摇动或震荡反应体系，使之反应，得到所述聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺衍生物；

其中，PEI-Bu与甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺碳酸酯的摩尔比为3:1；

所述PEI-Bu的结构式如下：

其中，m≥1，n≥1。

优选地，m为1-1000中的整数，更优选为5-900中的整数，更优选为10-800中的整数，更优选为20-700中的整数，更优选为30-600中的整数。

优选地，n为1-1000中的整数，优选为5-900中的整数，更优选为10-800中的整数，更优选为20-700中的整数，更优选为30-600中的整数。

优选地，m+n为200-1000中的整数，优选为220-900中的整数，更优选为240-800中的整数，更优选为260-700中的整数，更优选为300-600中的整数。

其中，PEI-Bu的制备方法可参照CN102443169A。

优选地，所述甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺碳酸酯的分子量为1500-3000Da，更优选为1600-2800Da，更优选为1700-2600Da，更优选为1800-2400Da，如1900Da、2000Da、2100Da、2200Da、2300Da。

优选地，反应时间为3-6h，如4h、4.5h、5h。

优选地，所述碱性溶液的pH值为8-10，更优选为8.2-9。

优选地，所述碱性溶液为碳酸氢钾溶液或碳酸氢钠溶液。

其中，反应温度为室温，优选为15-35℃，更优选为20-30℃，更优选为22-28℃。

优选地，所述制备方法还包括后处理步骤：将所得聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺衍生物置于活化后的透析袋中透析；透析结束后，用微孔滤膜过滤，冻干。

优选地，所述透析袋的截留分子量为3500Da。

优选地，所述透析的时间为12-96小时，更优选为24-56小时，更优选为20-40小时。

优选地，所述微孔滤膜的孔径为0.22-0.45μm。

本发明的第三个目的是提供一种上述聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺衍生物在制备用于输送基因物质载体中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种复合物，该复合物是采用包括如下步骤的方法制备而得：将上述聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺衍生物溶液加入到基因物质溶液中，混合，室温下孵育，即得。

优选的，所述基因物质为质粒DNA或干扰RNA。

优选的，所述孵育的时间为30-120min。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明制备的PEG修饰的PEI衍生物结构简单、易于合成；（2）与现有PEI-Bu相比，本发明制备的PEG-Bu在多种细胞中具有更高的转染活性、更小的细胞毒性和更好的生物相容性，是高效、低毒的基因物质载体，更加适合基因物质输送。尤其是可以输送治疗性基因

——高血压相关基因血管紧张素原（AGT）短发夹RNA（shRNA）进行基因沉默，以实现高血压基因治疗。（3）与现有的PEG化PEI相比，PEG化PEI-Bu不但能降低细胞毒性，还能明显提高转染活性。

附图说明

图1为PEG修饰的PEI衍生物PEG-Bu合成路线示意图。

图2为PEI-Bu和PEG-Bu的红外图谱；

图3为PEI-Bu和PEG-Bu的核磁图谱；

图4为实施例2中本发明PEG-Bu与质粒在不同质量比时形成的复合物的琼脂糖凝胶电泳图（条带1为Marker，条带2为裸DNA，条带3-10分别对应复合物质量比为0.1、0.3、0.5、1、3、5、10、20）。

图5为实施例2中本发明PEG-Bu与质粒在不同质量比时形成的复合物的粒径和电势图。

图6为实施例2中本发明PEG-Bu与质粒在质量比为5时形成的复合物的原子力显微镜图。

图7（图7A、图7B、图7C和图7D）为实施例3中本发明PEG-Bu在不同浓度或质量比时对BRL-3A(图7A，图7B)和HeLa(图7C，图7D)的细胞毒性（^*p<0.05，^**p<0.01vsPEI25kDa，^àp<0.05，^ààp<0.01vsPEI-Bu）。

图8（图8A、图8B、图8C和图8D）为实施例4中本发明PEG-Bu在无血清和有血清环境中对BRL-3A(图8A，图8C)和HeLa(图8B，图8D)的转染活性，（^*p<0.05，^**p<0.01vsPEI25K，^àp<0.05，^ààp<0.01vsPEI-Buw/w5）。

图9为实施例5中本发明PEG-Bu/shRNA对BRL-3A细胞AGT基因沉默效果(^**p<0.01vsBlankcontrol,^ààp<0.01vsPEI25kDa/antisenseshRNA)。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体额实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。

实施例1PEG修饰的PEI衍生物（PEG-Bu）的制备

图1为PEG修饰的PEI衍生物的合成路线示意图，包括如下步骤：

(a)按照CN102443169A所述方法制备PEI-Bu，进行红外和核磁检测，结果分别如图1和图2所示，结果表明得到PEI-Bu；

(b)将PEI-Bu溶解在碳酸氢钠溶液中，然后与甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺碳酸酯(mPEG-Sc)按摩尔比为3:1的比例室温下搅拌、摇动或震荡反应4小时。

(c)分离纯化，产品用少量超纯水溶解后置于截留分子量为3500Da活化后的透析袋中透析48小时，透析结束后，产品用0.22μm的微孔滤膜过滤，然后分别转移到预先准备好的西林瓶中，产品在-20℃冰箱预冻过夜后用冷冻干燥机冻干，24h后停止冻干，得到产品高分子PEG-Bu，进行红外和核磁检测，结果分别如图1和图2所示，其中，图2的PEG-Bu核磁图谱中位于3.5ppm的质子峰来自PEG的—OCH2CH2—，说明mPEG-Sc成功连接到PEI-Bu上。

测定高分子PEG-Bu分子量：测定方法为凝胶渗透色谱（GPC）法，聚乙二醇（PEG）标准品以及实施例制备的PEG-Bu为样品，分别用纯水溶解得到10mg/ml的溶液，摇匀静置，用0.45μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，进样20μl，记录色谱图。

将PEG标准品的重均分子量的对数值lgMw与相应的保留时间（tR）进行线性回归,得回归方程。Et样品通过该回归方程的公式计算分子量和分布：

Mn=ΣRIi/Σ(RIi/Mi)；

Mw=Σ(RIiMi)/ΣRIi；

D=Mw/Mn；

上式中Mn、Mw分别为数均分子量和重均分子量；D指分布系数；RIi为供试品在保留时间i时的峰高；Mi为供试品在保留时间i时的分子量。

计算得：PEG-Bu的分子量Mn=3714，Mw=5880。

实施例2PEG-Bu与质粒合成的复合物（Polyplex）的制备

称取定量的高分子PEG-Bu，加超纯水配置成2mg/mL的溶液，然后用0.22μm的无菌滤头过滤，荧光素酶（pGL3-Control）质粒的浓度稀释成1mg/mL；

配置不同质量比的复合物溶液，保持质粒溶液的浓度不变，然后按照不同的高分子（PEG-Bu）与质粒的质量比稀释高分子溶液的浓度，保持稀释后的高分子溶液和质粒溶液的体积相等，最后将高分子溶液快速加入到质粒溶液中混合，室温下孵育30-120min，这样就得到一系列质量比的复合物，可用作进一步的物化性质测定。

所述复合物琼脂糖凝胶电泳：配置质量比1.0％琼脂糖溶液，在微波炉中加热溶解，取40mL溶液，倒入专用的EB污染的烧杯中，加入约4μL的EB溶液，搅匀后倒入模具中，插上梳子，约30min之后凝固，电泳槽中加入适量TAE缓冲液，将琼脂糖凝胶放入电泳槽等待上样。然后配置不同质量比的复合物溶液，室温孵育30min。上样的Marker选用1000～10000kb的质粒Marker，上样时先取1μL的上样缓冲液，加入5μL的样品，混合均匀后，加入到凝胶孔中。加上80伏的电压，蓝色的溴酚蓝会快速的移动到胶的底端之后，约40min，用紫外凝胶成像系统拍照。复合物的凝胶电泳结果，如图4所示：当PEG-Bu与DNA的复合物在质量比<3时，由于载体没有包裹住DNA因此无法阻滞DNA的迁移，故显示出亮的条带。当在质量比≥3时由于载体将DNA完全包裹住，故DNA在电泳时无迁移，泳道中没有条带，这表明质量比在3以上时，聚合物具有很强的复合基因物质的能力。

所述复合物粒径测定：复合物粒径的测定的样品量为1.6mL，pGL3-Control质粒和高分子溶液的体积各为800μL，质粒的浓度均为20μg/mL，依据质量比对高分子溶液（原始浓度为2mg/mL）进行稀释，所需测定复合物中PEG-Bu与pGL3-Control质粒的质量比分别为1，3，5，10，20，30。

混合时，将高分子溶液加入质粒溶液中，吹打均匀，室温孵育30min。检测采用BrookhavenInstruments公司的粒径仪，每个样品测定3次，取平均值作图；如图5所示，经检测，质量比在3以上时Polyplex的粒径为65-88nm。

所述复合物Zeta电位测定：复合物ζ点位的测定的样品量为1.6mL，pGL3-Control质粒和高分子溶液的体积各为800μL，质粒的浓度均为20μg/mL，依据质量比对高分子溶液（原始浓度为2mg/mL）进行稀释，所需测定复合物中高分子（PEG-Bu）与pGL3-Control质粒的质量比分别为1，3，5，10，20，30。

混合时，将高分子溶液加入质粒溶液中，吹打均匀，室温孵育120min，然后检测。检测采用BrookhavenInstruments公司的粒径仪，每个样品测定3次，取平均值作图；如图5所示，实验证明，的Zeta电势为正，可包裹带负电荷的DNA。

所述复合物原子力显微镜表征

依据测量粒径的结果，选取质量比为5：1的复合物，通过原子力显微镜（AtomicForceMicroscope）来观察该复合物的形态。

首先PEG-Bu与pGL3-Control质粒配制成复合物溶液，然后用移液枪将约5-10μL的复合物溶液小心翼翼的滴加在新鲜获得的云母片上。云母片置于室温和干燥的环境中晾干。待进行原子力显微镜的测试时，检测在轻敲模式（TappingMode）下进行，捕捉复合物颗粒的图片，如图6所示，Polyplex为直径45-55nm的球形纳米颗粒。

实施例3PEG-Bu的细胞毒性实验

接种细胞（BRL-3A,Hela），将细胞消化，稀释成密度为5×10⁴-10×10⁴/mL的细胞悬液，96孔板中每孔加入100μL，培养过夜。

将2mg/mL的高分子DMEM溶液稀释成不同的浓度梯度，终体积为100μL。制备不同质量比的PEG-Bu与质粒合成的复合物。

取出细胞后，移除有血清的培养基，用100μL的PBS（磷酸盐）缓冲液洗一遍，直接把配制好的高分子DMEM溶液或复合物加到各个细胞孔中，阴性对照组中加入100μL无血清无酚红DMEM。4小时之后，除去培养液和高分子溶液，每孔加入100μL的无血清无酚红培养基，避光条件下再加入25μL的MTT溶液（3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐溶液溶液，该溶液用PBS缓冲液配制成5mg/mL），置于细胞培养箱中培养6小时。

显微镜下观察活细胞的结晶情况，如果还没有完全结晶，可适当延长放置时间。如果完全结晶，小心翼翼的倒出96孔板中的液体，然后在每孔中各加入150μL的DMSO(二甲亚砜)，轻微摇晃96孔板使甲臢晶体充分溶解。由于加入DMSO后溶液颜色会随时间变化，因此最好酶标仪的检测在20min内进行，检测波长为570nm，通过样品组的在此波长的吸收值和空白对照组做比值，从而得到细胞的成活率。不同浓度或质量比的PEG-Bu对BRL-3A和Hela细胞的毒性如图7A-图7D所示，细胞活力测试表明：PEG-Bu的细胞毒性小于PEI-Bu和PEI25kDa。

实施例4PEG-Bu的细胞转染实验

在48孔细胞培养板中，加入0.5mL的细胞悬液（BRL-3A或者Hela），密度是5.0×10⁴-10×10⁴/mL，培养过夜。48孔板转染时，每孔加入pGL3-Control质粒的量是500ng，体积25μL，将聚合物配置成2mg/mL的溶液，并用0.22μm的滤膜无菌过滤，按照设置的待测样品与质粒的质量比，稀释成所需的比例，聚合物溶液的总体积为25μL，然后把聚合物溶液加入到质粒的溶液当中去，快速混匀，孵育30min。这样加入每孔的复合物的体积为50μL，为总体积（500μL）的十分之一，符合规定。每个质量比做三个复孔。阳性对照组PEI25kDa，以其最佳质量比为2时的结果各做三个对照孔，在孵育的这段时间里，从培养箱中拿出细胞，除去有血清的培养基，再用200μL的PBS溶液洗一遍，培养基换成250μL的无血清或有血清的培养基，然后将孵育好的复合物按顺序加入到细胞中去。

4小时后，除去无血清的培养基，每孔加入含10%胎牛血清的完全培养基，再培养48小时，检测其在BRL-3A和Hela细胞中的转染结果，分别如图8A-图8D所示，结果显示，PEG-Bu在不同细胞中均具有担载基因物质的能力，在两种细胞株中在适当的质量比时PEG-Bu的基因转染效率均高于PEI-Bu和PEI25kDa（P<0.01），并且与PEI-Bu和PEI25kDa相比，PEG-Bu具有抗血清干扰的能力，生物相容性好。

实施例5PEG-Bu/AGT-shRNA对AGT基因沉默效果检测

选取优化后的w/w为20的PEG-Bu/shRNA转染BRL-3A细胞，通过RealtimePCR和Westernblot检测PEG-Bu/shRNA对BRL-3A细胞AGT的基因沉默效果。

（1）RealtimePCR检测使用Trizol试剂盒提取BRL-3A细胞中的RNA，使用SYBRRPrimeScriptRT-PCR试剂盒进行反转录。AGT扩增引物上游:5′-CATCTTCCCTCGCTCTCTG-3’，下游:5′-GCCTCTCATCTTCCCTTGG-3′，看家基因β-actin扩增引物上游5′-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3′，下游5′-TGTCACGCACGATTTCC-3′。以β-actin作为内参照，用相对定量法计算AGT在实验组和对照组表达的差异，每个样本重复测定3次。

（2）Western blot检测转染后72小时提取BRL-3A细胞中总蛋白，BCA法测定蛋白含量。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后用半干式电转印仪转移到PVDF膜上。一抗为小鼠抗AGT（Mouse anti-AGT）：1:500；小鼠抗β-肌动蛋白（Mouse anti-beta-actin）：1:5000；二抗为羊抗小鼠IgG（GoatAnti-MouseIgG）：1:8000。以β-actin为内参，凝胶成像系统拍照。拍的图像用软件Imagetool3.0测灰度值，并与内参相比得相对值，每个样本重复测定3次。结果显示（图9），同空白对照组和无关序列对照组（PEG-Bu/nonsense shRNA）相比，PEG-Bu/antisenseshRNA组的AGT mRNA和蛋白表达水平显著下降(P<0.01)。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于，其结构式如下：

其中，m≥1，n≥1。

2.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺衍生物，其特征在于，m为1-1000中的整数，n为1-1000中的整数，且m+n为200-1000中的整数。

3.一种如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺衍生物的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

将1,4-丁二醇二氯甲酸酯为连接剂的聚乙烯亚胺衍生物溶解在碱性溶液中，加入甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺碳酸酯，搅拌、摇动或震荡反应体系，使之反应，得到所述聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺衍生物；

其中，所述1,4-丁二醇二氯甲酸酯为连接剂的聚乙烯亚胺衍生物与甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺碳酸酯的摩尔比为3:1；

所述1,4-丁二醇二氯甲酸酯为连接剂的聚乙烯亚胺衍生物的结构式如下：

其中，m≥1，n≥1。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺碳酸酯的分子量为1500-3000Da。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，反应时间为3-6h。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述碱性溶液为碳酸氢钠或碳酸氢钾溶液。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，还包括后处理步骤：将所得聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺衍生物置于活化后的透析袋中透析；透析结束后，用微孔滤膜过滤，冻干。

8.一种如权利要求1所述的聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺衍生物在制备用于输送基因物质载体中的应用。

9.一种复合物，其特征在于，该复合物是采用包括如下步骤的方法制备而得：将权利要求1所述聚乙二醇修饰的聚乙烯亚胺衍生物溶液加入到基因物质溶液中，混合，室温下孵育，即得。

10.根据权利要求8所述的复合物，其特征在于，所述基因物质为质粒DNA或干扰RNA。

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