CN103421846B - 二氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺在基因治疗中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及二氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺在基因治疗中的应用。具体地,本发明人发现,小分子量可降解载体PEI-Bu(即小分子量氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺)可以作为优异的基因传送载体,与PEI 25 kDa相比,小分子量可降解载体PEI-Bu对大鼠原代滑膜细胞具有较高转染活性和较低的毒性;且载体-基因复合物性质稳定。
Description
技术领域
本发明属于药剂学和生物医学工程领域,具体地,本发明涉及二氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺在基因治疗中的应用。
背景技术
关节炎主要包括类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis,RA)和骨性关节炎(osteoarthritis,OA),它们在世界范围内造成了大量的长期瘫痪、行动障碍和大量社会经济负担。关节炎虽然属于非致死性疾病,但传统的治疗方法对其效果不佳。
基因治疗是指:对靶标细胞进行可控地、特异性地输送遗传物质(抗体、DNA和RNA等)。白介素-1β(IL-1β)是关节炎基因治疗中的主要炎症因子及天然的靶标。IL-1β可以激活并降解软骨细胞外基质的金属基质蛋白酶(MMPs)的表达。MMP13是关节炎中被IL-1β调控的最重要的MMPs,在软骨的降解中起到关键作用。MMP13特异地在OA和RA病人的软骨和滑膜中表达,而不在正常人的相关组织中出现。因此,下调或抑制MMP13表达的试剂是关节炎治疗的一种先导化合物。白介素-1受体拮抗蛋白(IL-1Ra)是一种属于白介素-1家族的众所周知的抗炎因子。IL-1Ra以跟IL-1相同的特异性与亲和力与白介素-1RI受体结合,但并不激活下游通路。
基因治疗领域的主要挑战在于开发一种能够特异地将基因输送到靶细胞,并能有效在细胞内部表达的方法。目前主要的基因输送载体包括病毒以及非病毒载体。病毒载体的应用存在较多的安全性问题,因此非病毒载体适用于慢性,非致死性疾病的治疗(例如关节炎)。
非病毒基因输送系统是利用阳离子聚合物来复合DNA,从而形成输送复合物。聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)由于具有较高的DNA压缩能力和天然的胞内体逃逸能力而被广泛的应用与研究。商业化的PEI25kDa具有很好的转染效率。由于其较高的正电荷密度,它能有效压缩DNA并形成有利于细胞内吞的纳米级颗粒。然而,虽然高分子量的金标准PEI(25kDa)具有较高体外转染活性,但是具有较高毒性,并且缺乏可降解的化学键而导致毒性容易累积,因此难以用于疾病治疗。此外,小分子量的PEI虽然毒性较低,但转染效率不理想。
因此本领域目前尚缺乏一种低毒性且能特异地将基因输送到靶细胞的输送系统(输送载体),因此迫切需要开发适用于基因治疗的输送载体。
发明内容
本方面的目的就是提供一种基因治疗的输送复合物。
本发明的另一目的是提供小分子量二氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺在基因治疗中的应用。
在本发明的第一方面,提供了一种基因输送试剂,所述的基因输送试剂为二氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺。
在另一优选例中,所述的二氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺为1,4-丁二醇氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺。
在另一优选例中,所述的1,4-丁二醇氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺是用交联剂1,4-丁二醇双(氯甲酸酯)与小分子量PEI800Da交联获得。
在另一优选例中,所述的二氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺的数均分子量(Mn)为1000-5000,较佳地为1500-4000,更佳地为2000-3500,更佳地为3000-3400,最佳地为3278。
在另一优选例中,所述的二氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺的重均分子量(Mw)为1000-6000,较佳地为1500-5000,更佳地为2000-4500,更佳地为3000-4500,最佳地为4289。
在本发明的第二方面,提供了一种基因输送复合物,所述复合物包括:
组分(1):本发明第一方面所述的基因输送试剂;和
组分(2):外源基因或外源基因表达体系。
在另一优选例中,所述的外源基因表达体系为表达盒或重组表达载体。
在另一优选例中,组分(1):组分(2)≥0.5:1(wt/wt);较佳地,组分(1):组分(2)=1:1(wt/wt)—40:1(wt/wt);更佳地组分(1):组分(2)=10:1(wt/wt)。
在另一优选例中,所述复合物的粒径≤200nm,较佳地粒径为50-100nm。
在本发明的第三方面,提供了一种将外源基因转入宿主细胞中的方法,包括步骤:
(i)将本发明第二方面所述的基因输送复合物与宿主细胞接触,从而获得转入了所述基因输送复合物的细胞;和
(ii)对步骤(i)中的细胞进行筛选,获得已导入外源基因的细胞。
在另一优选例中,所述的外源基因为IL-1Ra基因,较佳地IL-1Ra基因来源于人。
在另一优选例中,所述的宿主细胞为滑膜细胞,较佳地为人或非人哺乳动物(如大鼠、小鼠)的滑膜细胞。
在另一优选例中,当宿主细胞为滑膜细胞时,所述的基因输送复合物中组分(1):组分(2)=10:1(wt/wt)。
在本发明的第四方面,提供了一种体外非治疗性的抑制关节炎相关细胞的方法,包括步骤:将所述的关节炎相关细胞与本发明第二方面所述的复合物混合培养,或将关节炎相关细胞与本发明第二方面所述的复合物接触。
在另一优选例中,所述的关节炎相关细胞选自下组:关节炎相关的滑膜细胞、关节炎相关的软骨细胞、或关节炎相关的骨髓间充质细胞。
在本发明的第五方面,提供了一种预防或治疗关节炎的方法,包括步骤:给需要的对象施用本发明第二方面所述的复合物。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案,而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示通过1HNMR和FT-IR确认PEI-Bu的结构;其中,图1A显示,红外谱中δ1.6ppm和δ4.0ppm的化学迁移是由于丁二醇氨基甲酸酯–OCOCH2CH2CH2CH2OCO–中的3,4-亚甲基和2.5-亚甲基;图1B显示:以上的结构同样在FT-IR谱中的1697cm-1处羰基伸缩振动得到确证。
图2为PEI-Bu/pDNA的表征结果;其中,图2A为,琼脂糖凝胶电泳显示PEU-Bu对质粒的压缩能力(w/w=PEI-Bu/pEGFP-N1),1:w/w=0.5,2:w/w=1,3:w/w=2,4:w/w=5,5:w/w=10,6:w/w=20,7:w/w=40,8:w/w=80;图2B显示复合物的粒径和zeta电位;图2C显示原子力显微镜观察复合物形态的结果。
图3显示通过琼脂糖凝胶电泳在不同时间点检测,PEI-Bu在不同缓冲体系中的降解特性;其中,图3A显示降解5天以后的凝胶电泳结果;图3B显示降解10天以后的凝胶电泳结果;图3C显示降解20天以后的凝胶电泳结果;图3D显示,降解40天以后的凝胶电泳结果。1:DNAmarker,2:PEI-Bu/pDNA在PBS(PH=7.4)中,3:PEI-Bu/pDNA在ABS(PH=4.5)中,4:PEI-Bu/pDNA在DMEM中,5:PEI-Bu/pDNA在含有10%FBS的DMEM中,6:PEI25kDa/pDNA在PBS中,7:PEI25kDa/pDNA在ABS中,8:PEI25kDa/pDNA在DMEM中,9:PEI25kDa/pDNA在含有10%FBS的DMEM中,10:裸pDNA。
图4显示通过MTT法检测PEI-Bu对大鼠原代滑膜细胞的毒性;其中,图4A为不同浓度载体的毒性(μg/ml);图4B为不同质量比制备的复合物的毒性(w/w)。
图5显示复合物诱导的大鼠原代滑膜细胞的凋亡;其中,图5A显示annexin/PI染色检测凋亡结果;图5B显示,annexin/PI检测活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和死细胞细胞碎片百分数。
图6显示JC1染色检测大鼠原代滑膜细胞的线粒体电位结果;图6A为荧光显微镜下JC1染色结果;图6B显示流式细胞仪检测JC1染色结果,Q2为正常膜电位细胞,Q4为膜电位降低细胞。
图7显示PEI-Bu对大鼠原代滑膜细胞的转染效率;其中,图7A为荧光显微镜观察转染后的细胞绿色荧光蛋白表达情况;图7B和图7C显示流式细胞仪检测不同质量比制备的PEI-Bu,PEI800Da复合物的转染效率;图7D和图7E显示流式细胞仪检测最优质量比10:1制备的PEI-Bu复合物,和最优质量比制备的PEI25kDa,PEI800Da复合物的转染效率,*p<0.05,**p<0.01。
图8显示激光共聚焦显微镜观察复合物的细胞内吞结果;其中,图8A为转染4小时后的大鼠原代滑膜细胞;图8B为PEI-Bu/DNA转染不同时间点的大鼠原代滑膜细胞,箭头显示细胞核定位的质粒。
图9显示PEI-Bu/pIL-1Ra转染大鼠原代滑膜细胞;其中,图9A为ELISA分析不同时间点培养基中IL-1Ra分泌量;图9B为PCR分析MMP13表达量;图9C为最优质量比下各复合物的毒性;图9D为PEI-Bu/pEGFP转染细胞用作对照组其MMP13表达量与PEI-Bu/pIL-1Ra转染细胞比较;图9E和图9F:最优质量比的不同复合物诱导细胞凋亡的能力。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,首次发现,小分子量可降解载体PEI-Bu,即小分子量氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺可以作为优异的基因传送载体,具体地,与PEI25kDa相比,小分子量可降解载体PEI-Bu对大鼠原代滑膜细胞具有较高转染活性和较低的毒性;且载体基因复合物稳定,可在体外较长时间内降解。在此基础上完成了本发明。
术语
如本文所用,术语“外源基因(目的基因)”可以是任何感兴趣的基因,需要将其转染入靶细胞中,以使其在细胞中表达或发挥相应的作用。所述的转染可以是体内的,也可以是体外非治疗性的。
如本文所用,术语“外源的”或“异源的”是指不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如,如果某基因与靶细胞的组合通常不是天然存在的,则该基因对于该细胞来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。所述外源基因的代表性例子包括(但不限于):抗性基因、筛选标记基因、抗原蛋白基因及生物制剂基因、或动植物品质相关基因等。
本领域的普通技术人员可以使用常规方法将所述的外源基因置于表达盒中,在本发明的一个优选例中,所述的表达盒从5’-3’依次具有下列元件:启动子、外源基因的ORF序列、和终止子。
如本文所用,术语“外源基因的表达体系”通常是指含有外源基因或其表达盒的表达载体,所述的表达载体在进入合适的细胞后,可以表达所述的外源基因。
作为一种优选的实施方式,所述表达载体的启动子下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达外源的基因时,将该基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内,从而将外源基因与启动子可操作地连接。如果需要,所述的表达载体还可以包括选自下组的元件:3’多聚核苷酸化信号;非翻译核酸序列;转运和靶向核酸序列;抗性选择标记(二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白等);增强子;或操作子。用于制备重组表达载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之,只要其能够在宿主体内复制和稳定,任何质粒和载体都是可以被采用的。
本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有外源基因的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。
所述的表达盒或表达载体可以转化适当的宿主细胞,以使宿主表达相应的基因或蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞,如大肠杆菌,链霉菌属、农杆菌:或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如动物细胞或植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时,可以用CaCl2法处理,也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法,例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株,从而获得转基因的植物。
如本文所用,术语“基因输送体系”或“载药输送体系”或“载药体系”可以互换使用,都是指将所述体系与外源基因或外源表达盒或外源表达载体混合,输送至靶标细胞中的复合体系。
本发明提供了一种基因输送试剂,所述的基因输送试剂为二氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺,较佳地,所述的基因输送试剂为1,4-丁二醇氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺。
在本发明的一个优选例中,所述的二氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺的数均分子量(Mn)为1000-5000,较佳地为1500-4000,更佳地为2000-3500,更佳地为3000-3400,最佳地为3278。
在本发明的一个优选例中,所述的二氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺的重均分子量(Mw)为1000-6000,较佳地为1500-5000,更佳地为2000-4500,更佳地为3000-4500,最佳地为4289。
本领域的普通技术人员可以使用常规方法制备和表征所述的基因输送试剂,在一个优选例中,制备1,4-丁二醇氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺包括步骤:0℃下将氯仿溶解的1,4-二氯丁二醇逐滴加入搅拌中的氯仿溶解的PEI800D;室温反应24小时;溶剂减压挥发,得到初级产物;初级产物经3500Da分子截留透析纯化得到1,4-丁二醇氨基甲酸酯。所述输送试剂的结构可以通过核磁共振(1H-NMR)和傅里叶变换红外光谱(FT-IR)得到确证。
本发明还提供了一种基因输送复合物,所述复合物包括:
组分(1):权利要求1所述的基因输送试剂;和
组分(2):外源基因或外源基因表达体系。
较佳地,所述的外源基因表达体系为外源表达盒和重组表达载体。
在本发明的一个优选例中,所述的复合物中组分(1):组分(2)≥0.5:1(wt/wt);较佳地,组分(1):组分(2)=1:1(wt/wt)—40:1(wt/wt)。当宿主细胞为滑膜细胞时,所述的基因输送复合物中组分(1):组分(2)=10:1(wt/wt)。
在本发明的一个优选例中,所述复合物的粒径≤200nm,较佳地粒径为50-100nm。
本领域的普通技术人员可以使用常规方法制备和表征所述的基因输送复合物,如通过简单的混合方法制备。
本发明还提供了一种将外源基因转入宿主细胞中的方法,包括步骤:
(i)将基因输送复合物与宿主细胞接触,从而获得转入了所述基因输送复合物的细胞;和(ii)对步骤(i)中的细胞进行筛选,获得已导入外源基因的细胞。
在本发明的一个优选例中,所述的外源基因为IL-1Ra基因,较佳地IL-1Ra基因来源于人或非人哺乳动物;或所述的宿主细胞为滑膜细胞,较佳地为人或非人哺乳动物(如大鼠、小鼠)的滑膜细胞。
本发明还提供了一种抑制关节炎的方法,包括步骤:给施用的对象施用本发明的复合物。
本发明的主要优点包括:
(1)本发明的基因输送试剂和输送复合物具有较高转染活性;
(2)本发明的基因输送试剂和输送复合物对靶标细胞毒性很低;
(3)本发明的基因输送试剂和输送复合物在短期(数天)内性质稳定,在较长期(数十天)内又可以自发降解,既满足了短期外源基因高表达的需要,也解决了长期积累的毒性问题。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
材料与方法
1.试剂及材料
支链PEI(25kDa,800Da)和1,4-丁二醇双(氯甲酸酯)(1,4-Butanediolbis(chloroformate))购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。
去内毒素质粒提取试剂盒购Qiagen(Hilden,Germany)。
3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide,MTT)购自SigmaAldrich(Milwaukee,WI)。
其他溶剂及试剂均达到分析标准。
细胞培养在加有10%胎牛血清(FBS)(Hyclone,Logan,UT)的Dulbecco改良的Eagle’s培养基(Dulbecco’sModifiedEagle’smedium,DMEM)培养基中(MediaTech,Herndon,VA)。
凋亡试剂盒Alexa488AnnexinV/DeadCellApoptosisKit购自Invitrogen。
5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanineiodide(JC1)染色试剂盒购自碧云天。
Cy5核酸标记试剂盒LabelITTrackerIntracellularNucleicAcidLocalizationKit购自Mirus。
染料DND-99和Hoechstdyes购自Invitrogen。
人IL-1Ra酶联免疫检测试剂盒humanIL-1Raenzyme-linkedimmunosorbentassaykit(ELISA)购自Biosource。
Real-timePCRMasterMix(SYBRGreen)购自Toyobo。
带有绿色荧光蛋白的质粒pEGFP-N1和可表达IL-1Ra的pcDNA3.1-IL-1Ra(pIL-1Ra)质粒购自Invitrogen。
2.细胞培养
体重为160-200g的市售Sprague-Dawley(SD)大鼠被处死并且分离其滑膜组织。将滑膜组织被剪成小片,并用含EDTA的胰蛋白酶消化5min。移去胰酶并用4%一型胶原酶消化组织4-5小时。消化后用100μm的滤网(BDBiosciences,SanJose,CA,USA)过滤以此去掉未消化的组织。1200rpm离心4分钟。去掉上清,用完全培养基重悬细胞并种于10cm的培养皿中。细胞培养于含10%FBS的DMEM培养基中,并在37摄氏度5%CO2的培养箱中孵育。
3.琼脂糖凝胶电泳检测载体材料的体外降解
载体PEI-Bu和PEI25kDa与质粒DNA形成复合物(优化质量比)在体外37℃不同的缓冲体系下降解并释放出质粒DNA的效率用琼脂糖凝胶电泳检测。分别检测孵育5天,10天,20天,40天后载体的降解情况,以裸质粒作为阳性对照。
4.绿色荧光蛋白报告基因的转染及载体的体外毒性测试
为了检测PEI-Bu对滑膜细胞的转染效率,将溶于40μl去离子水的0.8-1μg的pEGFP-N1与等体积不同浓度的PEI-Bu溶液复合制备得到不同质量比的复合物。1ml无血清培养基稀释复合物并加入种于12孔板的滑膜细胞。37℃孵育4小时后用完全培养基换液,并于48小时后利用荧光显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)和流式细胞仪(Becton-Dickinson,FranklinLakes,NJ,USA)检测细胞表达绿色荧光蛋白的效率。
为了利用MTT法检测PEI-Bu对滑膜细胞的毒性,用无血清培养基制备不同浓度的聚合物溶液以及不同质量比复合而成的基因复合物,并加入种入96孔板的滑膜细胞,37℃孵育4小时,加入5mg/mlPBS溶解的MTT溶液(20μL每孔),37℃孵育4小时,弃去溶液,每孔加入150μl的DMSO,37℃摇动震荡10分钟。酶标仪(MK3ThermoLabsystem,Finland)检测记录490nm处的光密度值(opticaldensity,OD)值。以没有种细胞的孔作为调0组(细胞活力定为0%),种了细胞但未加处理的孔作为对照组(细胞活力定为100%)。其他孔中细胞的活力计算方法:
A组的细胞活力=[OD(A)-OD(调0组)]/OD(对照组)
每组设置3个以上复孔,并取平均值计算。
5.凋亡及JC1染色
原代大鼠滑膜细胞以100000个/ml的密度种入12孔板,完全培养基培养24小时后用不含FBS的DMEM培养基换液,并将不同的制备好的聚合物(PEI-Bu/pEGFP-N1,PEI25kDa/pEGFP-N1,PEI800Da/pEGFP-N1)加入细胞,并孵育4小时。收集细胞,根据invitrogen凋亡检测试剂盒说明染色。染色完成后立刻利用流式细胞仪检测530nm,575nm处的发射光,并对阳性细胞计数。
用不同复合物转染细胞后(PEI-Bu/pEGFP-N1,PEI25kDa/pEGFP-N1,PEI800Da/pEGFP-N1)利用碧云天生产的JC1染色试剂盒染色,步骤参考试剂说明。收集细胞后分别利用荧光显微镜和流式细胞仪检测。
6.激光共聚焦显微镜
利用购自Mirus的核酸标记试剂盒对质粒pEGFP-N1标记荧光素cy5并保存于-20℃。用不同载体与荧光素标记的载体pEGFP-N1-cy5复合制备得到不同的复合物。
将滑膜细胞以100000个/ml的密度种于12孔板。培养24小时候用不同复合物(PEI-Bu/pEGFP-N1-cy5,PEI25kDa/pEGFP-N1-cy5,PEI800Da/pEGFP-N1-cy5)以及裸质粒pEGFP-N1转染细胞4小时后用1ml的PBS换掉转染液。
为了研究复合物的细胞内转运过程,复合物PEI-Bu/pEGFP-N1-cy5与细胞孵育不同的时间(15分钟,30分钟,1小时,2小时),随后用1ml的PBS换掉转染液。
溶酶体和细胞核分别用购自Invitrogen染料DND-99和Hoechst染色,步骤参考产品说明。染色以后用PBS冲洗细胞3次,并立刻用激光共聚焦显微镜观察。染料标记的溶酶体,细胞核,质粒在暗视野下观察,并利用相差显微镜观察细胞形态及边界。
7.质粒pIL-1Ra的转染
利用不同载体(PEI-Bu,PEI25kDa,PEI800Da)与质粒pIL-1Ra复合制备得到复合物。并用裸质粒pIL-1Ra作为阴性对照。转染以100000个/ml的密度种于12孔板中的大鼠原代滑膜细胞。4小时后用完全培养基换液,并分别于转染后24,48,72小时收集细胞上清用于细胞合成并分泌的蛋白IL-1Ra的检测。蛋白IL-1Ra的检测使用ELISA试剂盒,方法参考试剂说明。
另外一批转染后的细胞用于MMP13表达量的检测。在转染后24小时对细胞加入10ng/μl的IL-1β,并继续孵育48小时。整个过程不采取换液操作。随后收集并裂解细胞,使用实时荧光定量PCR的方法检测MMP13基因的表达(RocheLC480)。
8.统计分析
所有实验重复三次以上。ANOVAt检验所得P值小于0.05时看作有显著性差异。
实施例1PEI-Bu的合成和表征
0℃下将氯仿(40ml)溶解的1,4-二氯丁二醇(0.43g,2mmol)逐滴加入搅拌中的氯仿(6ml)溶解的PEI800Da。室温下反应24小时。溶剂减压挥发,得到初产物。初级产物经3500Da分子截留透析纯化得到1,4-丁二醇氨基甲酸酯(1,4-Butanediolcarbamate)交联的PEI衍生物命名为PEI-Bu。
PEI-Bu的结构通过核磁共振(1H-NMR)和傅里叶变换红外光谱(FT-IR)得到确证(图1)。PEI-Bu的平均分子量通过凝胶层析-高效液相色谱法(GPC-HPLC)测量,其数均分子量和重均分子量分别为:3278,4289Da。
实施例2复合物PEI-Bu/pDNA的表征
PEI-Bu基因复合物的制备:将不同浓度的PEI-Bu加入DNA溶液(20μg/ml)中制备得到不同质量比复合的PEI-Bu基因复合物。
PEI-Bu基因复合物的的表征:琼脂糖凝胶电泳检测载体的基因复合物的稳定性。复合物的粒径及zeta电位用90PlusParticleSizeAnalyzer(BrookhavenInstrumentsCorp.,Holtsville,NY,USA)检测。利用原子力显微镜(atomicforcemicroscope,AFM)(MultimodeNanoScopeIIIa,DigitalInstrument,Japan)检测复合物的形态及粒径。
通过琼脂糖凝胶电泳确认复合物PEI-Bu/pDNA的形成,凝胶电泳表明质量比≥0.5w/w时,PEI-Bu就可以有效压缩质粒pEGFP-N1并形成稳定的基因复合物(图2A),表明PEI-Bu具有很高的载药能力。
不同聚合物(PEI-Bu,PEI800Da,PEI3500Da,和PEI25kDa)与质粒pEGFP-N1在不同质量比时形成复合物的粒径结果如图2B所示。质量比为1到40时,PEI-Bu可以与质粒形成低于200nm的复合物(50nm左右),同时PEI25kDa形成的复合物粒径在60nm左右,表明载体具有很高的DNA复合以及压缩能力。
PEI-Bu复合物的粒径结果通过原子力显微镜确证,通过原子力显微镜可以观察到直径50-100nm的复合物的形成(图2C)。PEI800Da在质量比1到40时形成的复合物粒径在1000nm以上。PEI3500Da形成复合物粒径在78.63±4.01nm到1137.87±56.07nm之间。在质量比2到40之间PEI800Da与PEI3500Da形成的复合物zeta电势在-7.33±1.66到8.94±9.99左右。PEI-Bu和PEI25kDa形成的复合物的zeta电势为20mV左右(图2B)。
实施例3琼脂糖凝胶电泳检测PEI-Bu的降解特性
在本实施例中,选择4种缓冲液模拟细胞外PH环境、溶酶体环境和体液环境。孵育5天后PEI-Bu与DNA形成稳定复合物(图3A)。10天后由于PEI-Bu的降解开始失去复合质粒的能力(图3B)。40天后由于大部分PEI-Bu降解从而几乎完全失去复合DNA的能力(图3D)。
结果表明,PEI-Bu具有在体外较长时间内可降解的特性。
实施例4MTT法检测PEI-Bu对大鼠原代滑膜细胞的毒性
PEI-Bu对大鼠原代滑膜细胞的毒性通过MTT法检测(图4)。不同浓度的PEI-Bu的毒性(图4A)和不同质量比制备的PEI-Bu/pEGFP-N1复合物的毒性(图4B)在与大鼠原代滑膜细胞孵育4小时后检测。PEI25kDa/pEGFP-N1和PEI800Da/pEGFP-N1作为对照组。
MTT检测结果证明,PEI-Bu对大鼠原代滑膜细胞的毒性随着其浓度的升高变得明显。PEI-Bu浓度在20μg/ml到50μg/ml之间时细胞活力低于PEI800Da组,但显著高于PEI25kDa组。质量比在2到40制备的PEI-Bu/pEGFP-N1复合物的毒性都较低细胞活力都在80%以上。PEI-Bu/pEGFP-N1组跟PEI800Da/pEGFP-N1组之间没有显著差异。当质量比大于10以上,PEI25kDa/pEGFP-N1复合物的毒性高于PEI800Da/pEGFP-N1复合物。
实施例5转染后大鼠原代滑膜细胞的凋亡
转染4小时后大鼠原代滑膜细胞的凋亡通过凋亡检测显示(图5)。
不同质量比下(2:1和5:1)PEI25kDa/pEGFP-N1表现出比PEI-Bu/pEGFP-N1更高的诱导细胞凋亡的能力。PEI-Bu诱导较低百分比的细胞发生凋亡,其诱导后活细胞百分比高于90%。PEI-Bu/pEGFP-N1组和PEI800Da/pEGFP-N1组之间没有显著差异。质量比为2:1时质备的PEI25kDa/pEGFP-N1复合物诱导凋亡的细胞主要在早期凋亡阶段,当质量比为5:1时诱导凋亡的细胞在晚期凋亡阶段。因此,PEI25kDa/pEGFP-N1诱导的细胞凋亡过程跟复合物的质量比相关。
本发明人进一步研究PEI-Bu/pEGFP-N1组细胞凋亡较低的原因。假定涉及线粒体通路。JC-1染色用于显示滑膜细胞线粒体膜电位(图6)。结果显示PEI-Bu/pEGFP-N1组细胞在诱导后具有正常线粒体膜电位,PEI25kDa/pEGFP-N1组在诱导后线粒体膜电位有明显的降低。PEI800Da/pEGFP-N1组和PEI-Bu/pEGFP-N1组之间无明显差异。
这一结果表明:PEI-Bu/pEGFP-N1相比PEI25kDa/pEGFP-N1对线粒体膜的伤害较小,从而解释了PEI-Bu/pEGFP-N1具有较低凋亡诱导能力的原因。
实施例6对大鼠原代滑膜细胞的转染效率
不同质量比制备的PEI-Bu/pEGFP-N1复合物用于转染大鼠原代滑膜细胞,其转染效率用流式细胞仪评价。
结果显示,不同质量比下的PEI-Bu/pEGFP-N1组效率显著高于PEI800Da/pEGFP-N1组(图7B和图7C);质量比为10时,PEI-Bu/pEGFP-N1具有最高转染活性;在最优质量比下,PEI-Bu/pEGFP-N1转染效率高于PEI25kDa/pEGFP-N1(图7D和图7E)。
实施例7激光共聚焦显微镜检测细胞内吞及细胞内运输
PEI-Bu/pEGFP-N1-cy5(质量比10:1)的细胞内吞在其与大鼠原代滑膜细胞孵育4小时后用激光共聚焦显微镜检测。
PEI-Bu/pEGFP-N1-cy5(10:1w/w)相比PEI25kDa/pEGFP-N1-cy5(最优w/w)和PEI800Da/pEGFP-N1-cy5(最优w/w)具有较高细胞内吞活性,箭头显示细胞核定位的cy5标记质粒(图8A)。PEI-Bu/pEGFP-N1-cy5组比PEI25kDa/pEGFP-N1-cy5组和PEI800Da/pEGFP-N1-cy5组具有更多的细胞核定位的质粒。因此PEI-Bu/pEGFP-N1-cy5复合物能够被大鼠原代滑膜细胞细胞更加高效的内吞。
本实施例还研究了PEI-Bu/pEGFP-N1-cy5细胞内运输动力学,结果表明,大鼠原代滑膜细胞在转染两小时内不同的时间点通过激光共聚焦显微镜观察(图8B),转染15分钟后质粒开始被细胞内吞,1小时后质粒开始被运输到细胞核。
实施例8对大鼠滑膜细胞输送质粒IL-1Ra
通过ELISA检测不同时间点细胞培养基中的IL-1Ra检测(图9A)。
结果表明,PEI-Bu/pIL-1Ra组能够在转染后24、48、72小时稳定的表达IL-1Ra蛋白;PEI-Bu/pIL-1Ra组的IL-1Ra的蛋白表达量显著高于PEI25kDa/pIL-1Ra和PEI800Da/pIL-1Ra组。PEI25kDa/pIL-1Ra组能够有效地在转染后24小时表达IL-1Ra,但在48小时后其表达量开始降低。细胞凋亡可能是IL-1Ra表达量下降的解释。结果显示(图9E和图9F),PEI25kDa/pIL-1Ra组细胞凋亡显著高于PEI-Bu/pIL-1Ra组。
PEI-Bu/pIL-1Ra、PEI25kDa/pIL-1Ra、PEI800Da/pIL-1Ra和裸pIL-1Ra转染4小时后,大鼠原代滑膜细胞与IL-1β孵育48小时。裸质粒转染并与IL-1β孵育的细胞作为裸质粒对照,同时裸质粒转染并未与IL-1β孵育的细胞用作阴性对照组。MMP13的表达通过实时荧光定量PCR检测(图9B)。
结果表明,与IL-1β孵育48小时后,裸质粒对照组的MMP13表达量相比阴性对照组升高100倍,这表明高表达MMP13的细胞模型建立成功。PEI-Bu/pIL-1Ra组MMP13的表达量显著低于PEI25kDa/pIL-1Ra,PEI800Da/pIL-1Ra组。
PEI-Bu诱导的细胞毒性和细胞凋亡也可能是MMP13表达量下调的原因。因此最优质量比PEI-Bu复合物的细胞毒性(图9C)和细胞凋亡(图9E和图9F)显示,PEI-Bu/DNA复合物具有较低毒性和细胞凋亡。MMP13也可能会被载体本身所调控。
PEI-Bu/pEGFP-N1转染的细胞作为对照组,其MMP13表达量跟PEI-Bu/pIL-1Ra组进行比较。结果表明,PEI-Bu/pIL-1Ra组的MMP13表达量显著低于PEI-Bu/pEGFP-N1组(图9D)。结果表明,MMP13的下调主要是由于PEI-Bu/pIL-1Ra组中IL-1Ra的表达而不是由于毒性和载体本身的调控。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (17)
1.一种基因输送复合物的用途,所述复合物包括:组分(1):基因输送试剂;和
组分(2):外源基因或外源基因表达体系,所述的外源基因为IL-1Ra基因;
其中所述的基因输送试剂为二氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺,并且所述的二氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺为1,4-丁二醇氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺;
所述的二氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺的数均分子量Mn为1500-4000或所述的二氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺的重均分子量Mw为1500-5000;
所述复合物的粒径≤200nm;
组分(1):组分(2)=1:1(wt/wt)—40:1(wt/wt);
并且所述的1,4-丁二醇氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺是用交联剂1,4-丁二醇双(氯甲酸酯)与小分子量PEI800Da交联获得;
其特征在于,用于制备基因治疗关节炎的基因输送复合物,并且所述的基因输送复合物是用于转染滑膜细胞并将所述外源基因导入所述滑膜细胞。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,
所述的1,4-丁二醇氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺的数均分子量Mn为3000-3400;并且重均分子量Mw为3000-4500。
3.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的二氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺的数均分子量Mn为2000-3500。
4.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的二氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺的重均分子量Mw为2000-4500。
5.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述的外源基因表达体系为表达盒或重组表达载体,并且所述的IL-1Ra基因来源于人。
6.如权利要求1所述的用途,其特征在于,组分(1):组分(2)=40:1(wt/wt)。
7.如权利要求1所述的用途,其特征在于,组分(1):组分(2)=10:1(wt/wt)。
8.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述复合物的粒径为50-100nm。
9.一种非治疗性的将外源基因转入宿主细胞中的方法,其特征在于,包括步骤:
(i)将基因输送复合物与宿主细胞接触,从而获得转入了所述基因输送复合物的细胞;
其中,所述基因输送复合物包括:组分(1):基因输送试剂;和组分(2):外源基因或外源基因表达体系,所述的外源基因为IL-1Ra基因;
其中所述的基因输送试剂为二氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺,并且所述的二氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺为1,4-丁二醇氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺;
所述的二氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺的数均分子量Mn为1500-4000或所述的二氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺的重均分子量Mw为1500-5000;
所述复合物的粒径≤200nm;
组分(1):组分(2)=1:1(wt/wt)—40:1(wt/wt);
并且所述的1,4-丁二醇氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺是用交联剂1,4-丁二醇双(氯甲酸酯)与小分子量PEI800Da交联获得;
以及(ii)对步骤(i)中的细胞进行筛选,获得已导入外源基因的细胞,
其中,所述的宿主细胞为滑膜细胞。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述的1,4-丁二醇氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺的数均分子量Mn为3000-3400;并且重均分子量Mw为3000-4500。
11.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述的二氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺的数均分子量Mn为2000-3500。
12.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述的二氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺的重均分子量Mw为2000-4500。
13.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述的外源基因表达体系为表达盒或重组表达载体,并且所述的IL-1Ra基因来源于人。
14.如权利要求9所述的方法,其特征在于,组分(1):组分(2)=40:1(wt/wt)。
15.如权利要求9所述的方法,其特征在于,组分(1):组分(2)=10:1(wt/wt)。
16.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述复合物的粒径为50-100nm。
17.一种体外非治疗性的抑制关节炎相关细胞的方法,其特征在于,包括步骤:将所述的关节炎相关细胞与基因输送复合物混合培养,或将关节炎相关细胞与所述的基因输送复合物接触,其中所述的关节炎相关细胞为关节炎相关的滑膜细胞;
并且,所述基因输送复合物包括:组分(1):基因输送试剂;和组分(2):外源基因或外源基因表达体系,所述的外源基因为IL-1Ra基因;
其中所述的基因输送试剂为二氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺,并且所述的二氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺为1,4-丁二醇氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺;
所述的二氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺的数均分子量Mn为1500-4000或所述的二氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺的重均分子量Mw为1500-5000;
所述复合物的粒径≤200nm;
组分(1):组分(2)=1:1(wt/wt)—40:1(wt/wt);
并且所述的1,4-丁二醇氨基甲酸酯交联的聚乙烯亚胺是用交联剂1,4-丁二醇双(氯甲酸酯)与小分子量PEI800Da交联获得。
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