CN101845451B - 低分子量pei-壳聚糖三重复合基因载体及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种RGD-硫酸软骨素包覆PEI修饰壳聚糖三重复合基因载体及制备方法和应用。它是由RGD多肽修饰硫酸软骨素、pDNA和PEI接枝壳聚糖混合组成，其中，PEI接枝壳聚糖、pDNA和RGD多肽修饰硫酸软骨素质量比15∶1∶4。采用PEI接枝的方法提高壳聚糖载体转染效率；并通过带负电的硫酸软骨素包覆的方法防止吸附血浆中红细胞减小和血浆蛋白作用，增强血液循环稳定性；而且通过特殊的靶向RGD多肽对硫酸软骨素修饰，增强复合物粒子的跨膜能力。以PEI接枝壳聚糖与DNA复合物粒子为核，以RGD修饰硫酸软骨素为外壳，构建了三重基因运载体系。制备方法简便，条件温和。改性后的壳聚糖用作基因载体，转染效率高，细胞毒性低，而且能够有效防止对红细胞以及带负电的大分子的吸附，体液循环稳定性好，有望被运用于基因治疗临床试验。

Description

低分子量PEI-壳聚糖三重复合基因载体及制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种RGD多肽修饰硫酸软骨素包覆低分子量PEI-壳聚糖三重复合基因载体及制备方法和应用，可以作为高效靶向非病毒基因载体在基因治疗中得到应用。

背景技术

近年来基因治疗受到广泛的关注。尽管病毒载体在基因治疗中取得了一些突破性进展，但是在临床应用过程中，其免疫原性和潜在致癌性等仍然是其难以克服的重大隐患。非病毒载体作为基因递送的另一条途径，被人们广泛研究。目前非病毒载体主要包括两种：阳离子脂质体和阳离子聚合物。

病毒载体由于充分利用了病毒高度进化所具有的感染和寄生特性，在转染率上有很大优势。由于非病毒载体缺少这种基因递送机制，效率低下，这一缺陷极大地限制了其实际应用。在基因递送过程中，治疗基因要成功进入靶细胞并实现表达需要跨越一系列的障碍，这些障碍主要包括：体液循环稳定性，细胞摄取，内涵体逃逸，胞浆中的运输以及载体入核等。

复合物粒子在体液循环中不稳定是造成非病毒载体体内转染效率低下的一个最首要因素。为了能够成功压缩DNA，需要载体具有较高的阳离子电位，因而载体/DNA复合物粒子表面显示一定的正电位。这种带正电的纳米粒子一旦进入血液，会和体液中存在的带负电的分子，如粘多糖、血清蛋白以及其他细胞外蛋白相互作用而聚沉，同时聚阳离子会吸附膜电位为负值的红细胞而造成红细胞的团聚，甚至发生溶血现象。为了提高载体/DNA复合物在细胞外环境中的稳定性，许多研究者将亲水高分子聚乙二醇(PEG)引入非病毒载体体系。研究表明，PEG可以提供空间位阻有效防止复合物的聚集，从而延长复合物的体内血液循环滞留时间。此外，有研究报道，通过在阳离子载体/DNA复合物外面包覆一层带负电的高聚物(粘多糖，聚谷氨酸等)，能有效防止载体对于红细胞等带负电物质的吸附，延长体液循环时间，提高体内转染效率。

复合物粒子与细胞膜发生接触，通过细胞内吞的方式进入受体细胞。这种内吞方式主要分为两种，被动吸附和靶向吸收。普通阳离子DNA复合物与细胞膜带负电的糖蛋白发生接触，形成内吞小泡，被胞吞进入细胞。除此之外，细胞膜表面存在大量的受体蛋白，这些受体蛋白针对不同的配体物质有特异性的吸收作用。目前被广泛研究的受体主要包括：唾液酸受体，生长因子受体，叶酸受体，整合蛋白，乳糖受体，甘露糖受体和转铁蛋白受体。因而针对细胞的这种内吞方式，对非病毒载体进行配体修饰，能够有效提高其转染效率。此外，由于不同细胞膜表达不同受体蛋白程度有所差异，这种配体-受体模式，能够提高非病毒载体对于某些细胞的特异性。例如：半乳糖修饰的壳聚糖载体能够特异性的提高其对于HepG2肝癌细胞的转染效率。研究表明，含有精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸序列RGD多肽能够与细胞膜上的整合蛋白发生特异性的相互作用。这些多肽存在于细胞外基质中，对细胞粘附以及细胞的生长分化起到重要作用。一些病毒(如腺病毒)的突刺也是由RGD多肽构成。短序列RGD多肽在一定程度上能够模仿天然多肽的这种作用，因此很多研究通过将短序列RGD多肽接枝到组织工程支架或者载体上，提高细胞对于支架材料的粘附和对于载体的内吞吸收。

复合物一旦被细胞内吞吸收，还需要面临一系列的细胞内障碍。其中DNA从内涵体逃逸，是其摆脱被溶酶体降解并成功入核表达的关键。在体外转染时，阳离子高聚物如PAMAM树状高分子，聚乙烯亚胺(PEI)等具有很高的转染效率，主要是因为这种聚合物分子上大量的氨基形成强大的pH缓冲能力，导致内涵体内部渗透压改变，最终引起内涵体破裂和DNA从内涵体中释放，即所谓的“质子海绵体效应”。

在非病毒载体中，壳聚糖是一种被报道最多的聚合物转基因载体，也是唯一的一种天然阳离子多糖。它具有良好的生物相容性，生物可降解性，低毒性，高阳离子电位。壳聚糖分子上的有大量的羟基和氨基官能团便于对其进行化学改性。壳聚糖的转染效率和细胞靶向性都很差，很多研究围绕着化学修饰提高壳聚糖转染效率展开。Jiang等将低毒性的小分子PEI通过化学方法耦联到壳聚糖上，取得了较高的转染效率的同时，保存了壳聚糖分子固有的低毒性的优点。我们采用另一种化学手段将PEI800耦联到壳聚糖分子上，获得了同样的结果。

针对以上非病毒载体的基因递送过程中的三个主要障碍，我们设计了一种RGD-硫酸软骨素包覆的PEI修饰壳聚糖三重复合载体。首先将合成一种低毒高效的壳聚糖-PEI共聚物，将这种聚合物与DNA复合形成阳离子纳米粒子，作为复合载体的内核。然后利用正负电荷间的相互作用将一种带负电粘多糖硫酸软骨素作为衣壳包裹到常规阳离子载体/DNA复合物表面，形成外壳带负电的三重纳米复合载体。用于包裹层的硫酸软骨素经过短序列RGD多肽修饰(RGD-硫酸软骨素)，上皮细胞和癌细胞表面存在大量的整合蛋白，可以作为RGD多肽的受体，有效促进载体粒子的跨膜。PEI接枝壳聚糖具有较高的电荷密度，又能够有效的促进DNA从溶酶体中逃逸，使其具有很高的转染效率；其次，由于这种硫酸软骨素包覆后复合载体粒子表面电荷为负值，能够有效的避免对于红细胞以及血液中带负电大分子的粘附；另外，阴离子外壳部分经过具有靶向作用的RGD多肽配体的修饰，它又能够提高多种细胞对于载体粒子的内吞吸收。体外转染实验表明，这种PEI修饰壳聚糖三重纳米运载体系，具有较高的转染效率。而且这种载体能够有效的避免红细胞的聚集，体液循环稳定性好，有望成为一种良好的基因载体用于临床实验。

发明内容

本发明的目的在于提供一种RGD-硫酸软骨素包覆低分子量PEI修饰壳聚糖三重复合基因载体及制备方法和应用。首先对原始壳聚糖羧甲基化，通过酰胺化反应将小分子PEI耦联至羧甲基壳聚糖，制备PEI接枝壳聚糖。然后，同样利用酰化反应将一种4聚RGD多肽接枝到硫酸软骨素分子上，制备RGD多肽修饰的硫酸软骨素(RGD-硫酸软骨素)。将具有质子缓冲作用的PEI修饰壳聚糖，作为基因压缩和递送核心，与DNA复合形成纳米粒子，利用正负电荷间的相互作用，将带负电的RGD修饰的硫酸软骨素包裹在粒子外层。这种三重复合基因载体，安全高效，还能够有效防止与红细胞发生吸附作用，因而具有很高的体内应用前景。另外材料的合成方法简便，条件较为温和。

本发明的目的在于提供一种RGD-硫酸软骨素包覆低分子量PEI修饰壳聚糖三重复合基因载体是由RGD多肽修饰硫酸软骨素、pDNA和PEI接枝壳聚糖组成，其中，PEI接枝壳聚糖、pDNA和RGD多肽修饰硫酸软骨素质量比15∶1∶4。

RGD为c(RGDfK)，氨基酸序列cyclo(Arg-Gly-Asp-d-Phe-Lys)。

壳聚糖分子量＝50kDa；PEI分子量＝800；PEI接枝率为27％；

PEI接枝壳聚糖的结构式表示为：

RGD多肽修饰的硫酸软骨素的结构式表示为：

本发明提供一种供一种硫酸软骨素包覆低分子量PEI修饰壳聚糖三重复合基因载体的制备方法包括以下步骤：

1)壳聚糖在40％NaOH溶液中浸泡过夜，倒掉上层碱液，加入异丙醇，然后加入过量的氯乙酸，常温放置反应2h，然后在65℃下继续反应3h，冷却，将反应产物加水溶解，10000r/min下离心5min，弃掉不溶物，取上层溶液，加入过量无水乙醇沉淀出白色絮状固体，滤取沉淀，加水溶解，反复溶解沉淀，至pH接近中性，沉淀放入烘箱干燥，得到羧甲基壳聚糖。

2)取羧甲基壳聚糖加水溶解，加入相当于单元摩尔数5倍的PEI，用38％的盐酸调节PH值至5.0，并加入和羧甲基壳聚糖羧基等摩尔的NHS，室温搅拌1h，取和羧甲基壳聚糖羧基等摩尔的EDC，加水溶解，缓慢滴加到上述溶液中，控制速率1h内滴完，室温继续反应24h，将反应液在去离子水中透析5天(透析袋截留分子量3500)，冻干，得到PEI修饰壳聚糖；壳聚糖Mw＝50KDa，PEI Mw＝800)。

3)取硫酸软骨素加水溶解，加入相当于硫酸软骨素上羧基摩尔数30％的RGD多肽，加入与RGD多肽等摩尔的EDC和NHS，室温反应24h，反应液在超纯水中透析5天(透析袋截留分子量3500)备用，得到RGD多肽修饰的硫酸软骨素溶液(RGD-硫酸软骨素)。

4)按照计量将pDNA和PEI修饰壳聚糖复合，复合30min后，将其加入到RGD修饰的硫酸软骨素中，继续复合20min，即得到RGD-硫酸软骨素包覆的PEI修饰壳聚糖三重复合基因载体。

本发明RGD-硫酸软骨素包覆的PEI修饰壳聚糖三重复合基因载体可以作为高效靶向非病毒基因载体用于基因治疗。实现提高壳聚糖载体基因转染效率，延长体内循环时间的作用。

本发明合成了PEI修饰壳聚糖，RGD多肽修饰硫酸软骨素(RGD-硫酸软骨素)，并制备了RGD-硫酸软骨素包覆PEI修饰壳聚糖三重复合基因载体，合成及制备方法简便，条件温和。这种三重复合基因载体，转染效率高，同时能有显著降低阳离子载体对于红细胞的吸附。经过RGD修饰后，同未修饰的单纯硫酸软骨素包覆相比转染效率明显提高。这种载体安全高效，对于基因治疗具有极大的应用价值。

附图说明

图1是荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。

图2是普通光学显微镜下红细胞吸附实验。

具体实施方式

实施例1：

烧杯中加入32ml 40％NaOH溶液，加入3.2g壳聚糖(Mw＝50kDa，0.02mol)在中浸泡过夜。倒掉上层碱液，加入13ml的异丙醇，然后加入氯乙酸(12.8g，0.13mol)，常温放置2h，然后在65℃下继续反应3h，冷却。将反应产物加100ml水溶解，10000r/min下离心5min，弃掉不溶物，取上层溶液。加入过量无水乙醇沉淀出白色絮状固体，滤取沉淀，再加水50ml溶解，反复溶解沉淀数次，至pH为中性。沉淀放入37度烘箱干燥，得到羧甲基壳聚糖。

取0.22g羧甲基壳聚糖(约1mmol)到三口瓶中，加15ml水溶解，加入4gPEI(Mw＝800，5mmol)，用38％的盐酸调节PH值至5.0，然后加入NHS(0.117g，1mmol)，室温搅拌1h。称取EDC(0.192g，1mmol)，加5ml去离子水溶解，利用恒压滴液漏斗缓慢滴加到上述溶液中，控制速率1h内滴完。室温继续反应24h，将反应液去离子水中透析5天(透析袋截留分子量3500)，每8小时换一次水，冻干，得到PEI修饰壳聚糖(CS-PEI)。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。

元素分析测定，PEI接枝率为27％.

将得到的CS-PEI 1mg溶于1ml超纯水中，滤菌，与pGL3质粒DNA溶液混合配制成CS-PEI/DNA复合物，复合质量比为15/1，静置30分钟后，将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-7细胞含血清培基中，转染24h后，换液，继续培养24h。裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为：1.05×10⁸RLU/mg protein。

实施例2

烧杯中加入32ml 40％NaOH溶液，加入3.2g壳聚糖(Mw＝50kDa，0.02mol)在中浸泡过夜。倒掉上层碱液，加入13ml的异丙醇，然后加入氯乙酸(12.8g，0.13mol)，常温放置2h，然后在65℃下继续反应3h，冷却。将反应产物加100ml水溶解，10000r/min下离心5min，弃掉不溶物，取上层溶液。加入过量无水乙醇沉淀出白色絮状固体，滤取沉淀，再加水50ml溶解，反复溶解沉淀数次，至pH为中性。沉淀放入37度烘箱干燥，得到羧甲基壳聚糖。

取0.22g羧甲基壳聚糖(约1mmol)到三口瓶中，加15ml水溶解，加入4g PEI(Mw＝800)，用38％的盐酸调节PH值至5.0，然后加入NHS(0.117g，1mmol)，室温搅拌1h。称取EDC(0.192g，1mmol)，加5ml去离子水溶解，利用恒压滴液漏斗缓慢滴加到上述溶液中，控制速率1h内滴完。室温继续反应24h，将反应液去离子水中透析5天(透析袋截留分子量3500)，每8小时换一次水，冻干，得到PEI修饰壳聚糖(CS-PEI)。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。

将得到的CS-PEI 1mg溶于1ml超纯水中，滤菌。称取硫酸软骨素1mg溶于1ml超纯水中，滤菌。CS-PEI溶液与pGL3质粒DNA溶液混合配制成CS-PEI/DNA复合物，静置30分钟后，加入到一定量的硫酸软骨素溶液中，继续静置20min，三者质量比15∶1∶4，得到硫酸软骨素包覆的三重复合载体。将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-7细胞含血清培基中，转染24h后，换液，继续培养24h。裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为1.04×10⁸RLU/mg protein。

实施例3

烧杯中加入32ml 40％NaOH溶液，加入3.2g壳聚糖(Mw＝50kDa，0.02mol)在中浸泡过夜。倒掉上层碱液，加入13ml的异丙醇，然后加入氯乙酸(12.8g，0.13mol)，常温放置2h，然后在65℃下继续反应3h，冷却。将反应产物加100ml水溶解，10000r/min下离心5min，弃掉不溶物，取上层溶液。加入过量无水乙醇沉淀出白色絮状固体，滤取沉淀，再加水50ml溶解，反复溶解沉淀数次，至pH为中性。沉淀放入37度烘箱干燥，得到羧甲基壳聚糖。

取0.22g羧甲基壳聚糖(约1mmol)到三口瓶中，加15ml水溶解，加入4gPEI(Mw＝800)，用38％的盐酸调节PH值至5.0，然后加入NHS(0.117g，1mmol)，室温搅拌1h。称取EDC(0.192g，1mmol)，加5ml去离子水溶解，利用恒压滴液漏斗缓慢滴加到上述溶液中，控制速率1h内滴完。室温继续反应24h，将反应液去离子水中透析5天(透析袋截留分子量3500)，每8小时换一次水，冻干，得到PEI修饰壳聚糖(CS-PEI)。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。

称取硫酸软骨(0.046g，0.1mmol)，加水5ml溶解。称取c(RGDfK)多肽(Mw＝603，0.018g，0.3mmol)。然后分别加入EDC(0.57g，0.3mmol)和NHS(0.35g，0.3mmol)，室温反应24h。将反应液去超纯水中透析5天(透析袋截留分子量3500)，得到RGD多肽修饰的硫酸软骨素(RGD-硫酸软骨素)溶液，浓度约为10mg/ml。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。

将得到的CS-PEI 1mg溶于1ml超纯水中，滤菌。将RGD-硫酸软骨素稀释到1mg/ml。CS-PEI溶液与pGL3质粒DNA溶液混合配制成CS-PEI/DNA复合物，静置30分钟后，加入到一定量的RGD-硫酸软骨素溶液中，继续静置20min，三者质量比15∶1∶4，得到RGD-硫酸软骨素包覆的三重复合载体。将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-7细胞含血清培基中，转染24h后，换液，继续培养24h。裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为3.1×10⁸RLU/mg protein。

实施例4

烧杯中加入32ml 40％NaOH溶液，加入3.2g壳聚糖(Mw＝50kDa，0.02mol)在中浸泡过夜。倒掉上层碱液，加入13ml的异丙醇，然后加入氯乙酸(12.8g，0.13mol)，常温放置2h，然后在65℃下继续反应3h，冷却。将反应产物加100ml水溶解，10000r/min下离心5min，弃掉不溶物，取上层溶液。加入过量无水乙醇沉淀出白色絮状固体，滤取沉淀，再加水50ml溶解，反复溶解沉淀数次，至pH为中性。沉淀放入37度烘箱干燥，得到羧甲基壳聚糖。

取0.22g羧甲基壳聚糖(约1mmol)到三口瓶中，加15ml水溶解，加入4g PEI(Mw＝800)，用38％的盐酸调节PH值至5.0，然后加入NHS(0.117g，1mmol)，室温搅拌1h。称取EDC(0.192g，1mmol)，加5ml去离子水溶解，利用恒压滴液漏斗缓慢滴加到上述溶液中，控制速率1h内滴完。室温继续反应24h，将反应液去离子水中透析5天(透析袋截留分子量3500)，每8小时换一次水，冻干，得到PEI修饰壳聚糖(CS-PEI)。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。

将得到的CS-PEI 1mg溶于1ml超纯水中，滤菌。称取硫酸软骨素1mg溶于1ml超纯水中，滤菌。CS-PEI溶液与GFP质粒DNA溶液混合配制成CS-PEI/DNA复合物，静置30分钟后，加入到一定量的硫酸软骨素溶液中，继续静置20min，三者质量比15∶1∶4，得到硫酸软骨素包覆的三重复合载体。将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-7细胞含血清培基中，转染24h后，换液，继续培养24h。用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达(如下图1-a所示)

实施例5

烧杯中加入32ml 40％NaOH溶液，加入3.2g壳聚糖(Mw＝50kDa，0.02mol)在中浸泡过夜。倒掉上层碱液，加入13ml的异丙醇，然后加入氯乙酸(12.8g，0.13mol)，常温放置2h，然后在65℃下继续反应3h，冷却。将反应产物加100ml水溶解，10000r/min下离心5min，弃掉不溶物，取上层溶液。加入过量无水乙醇沉淀出白色絮状固体，滤取沉淀，再加水50ml溶解，反复溶解沉淀数次，至pH为中性。沉淀放入37度烘箱干燥，得到羧甲基壳聚糖。

取0.22g羧甲基壳聚糖(约1mmol)到三口瓶中，加15ml水溶解，加入4g PEI(Mw＝800)，用38％的盐酸调节PH值至5.0，然后加入NHS(0.117g，1mmol)，室温搅拌1h。称取EDC(0.192g，1mmol)，加5ml去离子水溶解，利用恒压滴液漏斗缓慢滴加到上述溶液中，控制速率1h内滴完。室温继续反应24h，将反应液去离子水中透析5天(透析袋截留分子量3500)，每8小时换一次水，冻干，得到PEI修饰壳聚糖(CS-PEI)。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。

称取硫酸软骨(0.046g，0.1mmol)，加水5ml溶解。称取C(RGDfK)多肽(Mw＝603，0.018g，0.3mmol)。然后分别加入EDC(0.57g，0.3mmol)和NHS(0.35g，0.3mmol)，室温反应24h。将反应液去离子水中透析5天(透析袋截留分子量3500)，得到RGD多肽修饰的硫酸软骨素(RGD-硫酸软骨素)溶液，浓度约为10mg/ml。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。

将得到的CS-PEI 1mg溶于1ml超纯水中，滤菌。将RGD-硫酸软骨素稀释到1mg/ml。CS-PEI溶液与GFP质粒DNA溶液混合配制成CS-PEI/DNA复合物，静置30分钟后，加入到一定量的RGD-硫酸软骨素溶液中，继续静置20min，三者质量比15∶1∶4，得到RGD-硫酸软骨素包覆的三重复合载体。将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-7细胞含血清培基中，转染24h后，换液，继续培养24h。用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达(如下图1-b所示，同未经修饰壳聚糖相比绿色荧光蛋白能表达显著增加)。

实施例6

烧杯中加入32ml 40％NaOH溶液，加入3.2g壳聚糖(Mw＝50kDa，0.02mol)在中浸泡过夜。倒掉上层碱液，加入13ml的异丙醇，然后加入氯乙酸(12.8g，0.13mol)，常温放置2h，然后在65℃下继续反应3h，冷却。将反应产物加100ml水溶解，10000r/min下离心5min，弃掉不溶物，取上层溶液。加入过量无水乙醇沉淀出白色絮状固体，滤取沉淀，再加水50ml溶解，反复溶解沉淀数次，至pH为中性。沉淀放入37度烘箱干燥，得到羧甲基壳聚糖。

取0.22g羧甲基壳聚糖(约1mmol)到三口瓶中，加15ml水溶解，加入4gPEI(Mw＝800)，用38％的盐酸调节PH值至5.0，然后加入NHS(0.117g，1mmol)，室温搅拌1h。称取EDC(0.192g，1mmol)，加5ml去离子水溶解，利用恒压滴液漏斗缓慢滴加到上述溶液中，控制速率1h内滴完。室温继续反应24h，将反应液去离子水中透析5天(透析袋截留分子量3500)，每8小时换一次水，冻干，得到PEI修饰壳聚糖(CS-PEI)。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。

称取硫酸软骨(0.046g，0.1mmol)，加水5ml溶解。称取C(RGDfK)多肽(Mw＝603，0.018g，0.3mmol)。然后分别加入EDC(0.57g，0.3mmol)和NHS(0.35g，0.3mmol)，室温反应24h。将反应液去离子水中透析5天(透析袋截留分子量3500)，得到RGD多肽修饰的硫酸软骨素(RGD-硫酸软骨素)溶液，浓度约为10mg/ml。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。

取一定量的血浆，离心弃掉上清液，用PBS吹打红细胞至悬浮，继续离心，如此反复数次，最后得到红细胞悬浊液。将得到的CS-PEI 1mg溶于1ml超纯水中，滤菌。将RGD-硫酸软骨素稀释到1mg/ml。CS-PEI溶液与pGL3质粒DNA溶液混合配制成CS-PEI/DNA复合物，静置30分钟后，加入到一定量的RGD-硫酸软骨素溶液中，继续静置20min，三者质量比15∶1∶4，得到RGD-硫酸软骨素包覆的三重复合载体。将复合物溶液加入到经过稀释后的红细胞悬浊液中，静置5min，取少量的悬浊液置于光学显微镜下观察，观察结果如图2-a所示，红细胞无明显团聚现象。

对比例1：

将原始壳聚糖(Mw＝50kDa，1mg)溶于1ml醋酸溶液中(0.1M)，滤菌。与pGL3质粒DNA溶液混合配制成CS/DNA复合物，复合质量比为10/1，静置30分钟后，将复合物溶液加入到已培养至指数生长期的COS-7细胞含血清培基中，转染24h后，换液，继续培养24h。裂解细胞，测定其中的荧光素酶活性为：3.67×103RLU/mg protein

对比例2

烧杯中加入32ml 40％NaOH溶液，加入3.2g壳聚糖(Mw＝50kDa，0.02mol)在中浸泡过夜。倒掉上层碱液，加入13ml的异丙醇，然后加入氯乙酸(12.8g，0.13mol)，常温放置2h，然后在65℃下继续反应3h，冷却。将反应产物加100ml水溶解，10000r/min下离心5min，弃掉不溶物，取上层溶液。加入过量无水乙醇沉淀出白色絮状固体，滤取沉淀，再加水50ml溶解，反复溶解沉淀数次，至pH为中性。沉淀放入37度烘箱干燥，得到羧甲基壳聚糖。

取0.22g羧甲基壳聚糖(约1mmol)到三口瓶中，加15ml水溶解，加入4g PEI(Mw＝800)，用38％的盐酸调节PH值至5.0，然后加入NHS(0.117g，1mmol)，室温搅拌1h。称取EDC(0.192g，1mmol)，加5ml去离子水溶解，利用恒压滴液漏斗缓慢滴加到上述溶液中，控制速率1h内滴完。室温继续反应24h，将反应液去离子水中透析5天(透析袋截留分子量3500)，每8小时换一次水，冻干，得到PEI修饰壳聚糖(CS-PEI)。1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。

取一定量的血浆，离心弃掉上清液，用PBS吹打红细胞至悬浮，继续离心，如此反复数次，最后得到红细胞悬浊液。将得到的CS-PEI 1mg溶于1ml超纯水中，滤菌，与pGL3质粒DNA溶液混合配制成CS-PEI/DNA复合物，复合质量比为15/1，静置30分钟后，将复合物溶液加入到经过稀释后的红细胞悬浊液中，静置5min，取少量的悬浊液置于光学显微镜下观察，观察结果如图2-b所示，红细胞团聚现象明显。

Claims (5)

1.一种RGD-硫酸软骨素包覆聚乙烯亚胺修饰壳聚糖三重复合基因载体，其特征在于它是由RGD多肽修饰硫酸软骨素、pGL3质粒DNA和聚乙烯亚胺接枝壳聚糖组成，其中，聚乙烯亚胺接枝壳聚糖、pGL3质粒DNA和RGD多肽修饰硫酸软骨素质量比15∶1∶4。

2.根据权利要求1所述的复合基因载体，其特征在于所述的RGD为c(RGDfK)，氨基酸序列cyclo(Arg-Gly-Asp-d-Phe-Lys)。

3.根据权利要求1所述的复合基因载体，其特征在于所述的壳聚糖分子量＝50kDa；聚乙烯亚胺分子量＝800；聚乙烯亚胺接枝率为27％。

4.一种权利要求1所述的复合基因载体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)烧杯中加入32ml 40％NaOH溶液，加入3.2g壳聚糖，Mw＝50kDa，0.02mol，浸泡过夜，倒掉上层碱液，加入13ml的异丙醇，然后加入12.8g氯乙酸，常温放置2h，然后在65℃下继续反应3h，冷却，将反应产物加100ml水溶解，10000r/min下离心5min，弃掉不溶物，取上层溶液；加入过量无水乙醇沉淀出白色絮状固体，滤取沉淀，再加水50ml溶解，反复溶解沉淀数次，至pH为中性，沉淀放入37度烘箱干燥，得到羧甲基壳聚糖；

2)取0.22g羧甲基壳聚糖到三口瓶中，加15ml水溶解，加入4g分子量为800的聚乙烯亚胺，用38％的盐酸调节pH值至5.0，然后加入0.117g的N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌1h，取0.192g1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺，加5ml去离子水溶解，利用恒压滴液漏斗缓慢滴加到上述溶液中，控制速率1h内滴完，室温继续反应24h，将反应液去离子水中透析5天，透析袋截留分子量3500，每8小时换一次水，冻干，得到聚乙烯亚胺修饰壳聚糖；

3)取硫酸软骨素0.046g加5ml水溶解，加入0.018g分子量为603的c(RGDfK)多肽，加入0.57g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和0.35g N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应24h，反应液在超纯水中透析5天，透析袋截留分子量3500，得到RGD多肽修饰的硫酸软骨素溶液，浓度为10mg/ml；

4)将得到的聚乙烯亚胺修饰壳聚糖1mg溶于1ml超纯水中，滤菌，将RGD-硫酸软骨素稀释到1mg/ml，聚乙烯亚胺修饰壳聚糖溶液与pGL3质粒DNA溶液混合配制成聚乙烯亚胺修饰壳聚糖DNA复合物，静置30分钟后，加入到RGD-硫酸软骨素溶液中，继续静置20min，三者质量比15∶1∶4，得到RGD-硫酸软骨素包覆的三重复合基因载体。

5.权利要求1所述的复合基因载体的应用，其特征在于作为靶向非病毒基因载体。 

Images