CN103695449B - 一种具有肿瘤靶向性的非病毒阳离子基因载体及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种具有肿瘤靶向性的非病毒阳离子基因载体及其制备方法,属于生物医药技术领域。是由聚醚酰亚胺PEI、油酰氯OA和叶酸FA制备得到,交联的阳离子聚合物聚醚酰亚胺-油酰氯PEI-OA形成疏水性核心结构,由具有肿瘤靶向性的配体叶酸FA作为外壳,赋予该传递系统穿透细胞膜的功能,形成性质稳定、生物兼容性好的靶向非病毒基因传递系统。其中,PEI与OA的摩尔比为1:1~4:1,PEI-OA与FA的摩尔比为1:1~20:1。制备的FA-PEI-OA载体系统具有肿瘤靶向性、毒性小、转染效率高等特点,可作为核酸药物的有效传递系统。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种具有肿瘤靶向性的非病毒阳离子基因载体及其制备方法。
背景技术
合成高分子材料在基因治疗中是一个非常有前景的领域,利用这些合成高分子作为靶向载体,应用于癌症治疗正得到迅猛的发展。以特定的基因作为靶位的治疗策略成了国际制药领域的一大研究和开发的热点。基因治疗在实际应用过程中,存在的最大障碍是缺少安全、高效的载体系统。目前所采用的载体主要分为两大类,即病毒载体和非病毒载体。非病毒载体是将外源基因用各种人工的或天然的材料包装起来形成的传递系统,主要包括阳离子聚合物和磷脂。非病毒载体具有安全性好、重复性高、制备简单等多项优点。病毒载体是将外源基因包装到天然病毒的外壳中,利用病毒对宿主细胞的感染性将外源基因导入细胞中。病毒载体因具有转导效率及表达效率高的特点而得到广泛应用,但其本身存在不可避免的安全性问题,如表达外源基因时间短、免疫原性强、易引发强烈的炎症反应和免疫反应、毒性较大等。因此,开发全新的非病毒载体至关重要。
根据基因药物的理化性质,通常将载体系统设计成表面带有正电荷的微粒给药体系,通过静电的作用与带负电的核酸形成复合物,复合物经内吞等方式进入细胞,然后释放出基因药物,转运至细胞核并在核内得以表达。这种极简单的静电吸附原理,已经贯穿于整个非病毒类载体20多年的研究中。PEI(聚醚酰亚胺)是目前常用的阳离子转染聚合物,但是由于其毒性较高,转染效率低等缺陷限制了其使用,对PEI进行改性研究,同时加上靶向基团,增加其转染效率,并减少毒性,使其成为有效的非病毒传递系统,具有重大意义。
发明内容
本发明提供了一种新型的具有肿瘤靶向性的非病毒阳离子基因载体(FA-PEI-OA,在该载体中,PEI与油酰氯摩尔比为1:1~4:1,PEI-OA与叶酸的摩尔比为1:1~20:1)及其制备方法,该载体是由交联的阳离子聚合物聚醚酰亚胺-油酰氯(PEI-OA)形成疏水性核心结构,由具有肿瘤靶向性的配体叶酸(FA)作为外壳,赋予该传递系统穿透细胞膜的功能,形成性质稳定、生物兼容性好的靶向非病毒基因传递系统。制备的FA-PEI-OA载体系统具有肿瘤靶向性、毒性小、转染效率高等特点,可作为核酸药物的有效传递系统。
本发明同时提供了载体系统(FA-PEI-OA)与核酸(DNA/RNA)形成纳米复合物的制备方法,该纳米复合物用来评价专利中载体的传递效果。
本发明涉及到一种含有PEI、油酰氯(OA)和靶向配体叶酸(FA)的基因载体,该载体制备方法如下:
(1)PEI-OA的合成:将PEI溶于二氯甲烷中(浓度范围为0.5~5mg·mL-1),将油酰氯溶解于三乙胺和二氯甲烷(三乙胺和二氯甲烷的体积比为2:1~8:1)的混合溶液中(油酰氯的浓度范围为0.2~2mg·mL-1),按照PEI与油酰氯摩尔比为1:1~4:1比例,将油酰氯溶液缓慢地加入到PEI溶液中,并室温搅拌,控制搅拌转速为100~500rpm,反应进行6~24h,通过透析除去过量的三乙胺,最后通过真空干燥得到PEI-OA粉末;
(2)将步骤(1)得到的PEI-OA粉末使用溶剂溶解后,在DEPC水(焦碳酸二乙酯处理且经高温灭菌)、PB缓冲液或PBS缓冲液体系中与pH=6~8的叶酸溶液均匀混合(PEI-OA与叶酸的摩尔比为1:1~20:1),通过静电吸附作用制得FA-PEI-OA基因载体系统。
优选地,PEI的分子量为800~2000Da。
优选地,步骤(2)中的溶剂为无水乙醇或氯仿。
优选地,透析截留分子量为10~30K,透析时间为8~24h。
本发明同时涉及一种基因载体系统与核酸(DNA/RNA)复合物的制备,该复合物的制备方法为:将FA-PEI-OA基因载体系统与用DEPC水(焦碳酸二乙酯处理且经高温灭菌)溶解的DNA/RNA在PBS缓冲液体系中(FA-PEI-OA中PEI-OA与DNA/RNA的摩尔比为1:1~10:1)旋涡混合,室温孵育(10~30℃),即得FA-PEI-OA基因载体系统与核酸(DNA/RNA)复合物。
优选地,旋涡混合时间为10~30s。
优选地,孵育时间为20~60min。
本发明涉及的FA-PEI-OA基因载体系统具有较高的转染效率,具有一定的靶向性,在几株肿瘤细胞中均表现了低毒高效的特点。
附图说明
图1:实施例1制备的PEI-OA的1H NMR谱图;
图2:不同N/P比的PEI-OA与pDNA(pDNA是质粒DNA,DNA/RNA中DNA的一种)所得复合物(实施例5)的琼脂糖凝胶电泳图,最佳N/P比为4:1;
图3:不同叶酸浓度的FA-PEI-OA与pDNA所得复合物(实施例6)的琼脂糖凝胶电泳图;
图4:不同质量比(FA-PEI-OA与pDNA的质量比)的FA-PEI-OA与pDNA所得复合物(实施例7)的粒径分布图;
图5:不同质量比(FA-PEI-OA与pDNA的质量比)的FA-PEI-OA与pDNA所得复合物(实施例7)的Zeta电位图;
图6:不同质量比(三种载体与pDNA的质量比,其中PEI、PEI-OA组作为对照)的载体(PEI、PEI-OA、FA-PEI-OA)与pDNA所得复合物的流式细胞仪测定转染效率结果图(Hela细胞系);
图7:不同质量比(三种载体与pDNA的质量比,其中PEI、PEI-OA组作为对照)的载体(PEI、PEI-OA、FA-PEI-OA)与pDNA所得复合物的流式细胞仪测定转染效率结果图(A549细胞系);
图8:不同浓度的FA-PEI-OA载体MTT毒性实验(实施例10)结果图(Hela细胞系);
图9:不同浓度的FA-PEI-OA载体MTT毒性实验(实施例11)结果图(A549细胞系);
具体实施方式:
为了便于理解本发明,特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。
实施例1
本实施例为非病毒阳离子基因载体(FA-PEI-OA)的制备,制备方法如下:
PEI-800溶解在2.5毫升二氯甲烷中(浓度为0.5mg·mL-1),油酰氯溶解于100μL三乙胺和2.5mL二氯甲烷中(浓度为0.2mg·mL-1),将油酰氯溶液缓慢地加入到搅拌的PEI溶液中(摩尔比为1:1)。在室温下,搅拌反应进行8小时,搅拌速度为100rpm,通过截留分子量为15K的透析袋除去过量的三乙胺,透析时间为12h。最后,通过真空干燥得到PEI-OA粉末,质量为9.5mg。
采用1H NMR对合成的PEI-OA进行300MHz核磁共振氢谱表征,如图1所示。谱图显示:硬脂酸上末端-CH3集团上的氢在0.8ppm处有特征吸收,PEI中(-HN-CH2-CH2-NH-)在2.5~2.8ppm处有特征吸收,对二者进行整合,显示PEI-OA聚合物一个基本单位中PEI和油酰氯的比例为6.0。
将PEI-OA粉末用无水乙醇溶解后制得5mg·mL-1的PEI-OA溶液,取5μLPEI-OA的无水乙醇溶液迅速注入到20μL的PBS缓冲液中,混合均匀后与pH=7.5的叶酸溶液(15mg·mL-1)室温混合(PEI-OA与叶酸的摩尔比为1:1),室温孵育20min,通过静电吸附作用得到非病毒阳离子基因载体(FA-PEI-OA),终浓度为2mg·mL-1。
实施例2
本实施例为非病毒阳离子基因载体(FA-PEI-OA)的制备,制备方法如下:
PEI-2000溶解在2.5毫升二氯甲烷中(浓度为2.5mg·mL-1),油酰氯溶解于100μL三乙胺和2.5mL二氯甲烷中(浓度为1.5mg·mL-1),将油酰氯溶液缓慢地加入到搅拌的PEI溶液中(摩尔比为2:1)。在室温下,搅拌反应进行12小时,搅拌速度为300rpm,通过截留分子量为30K的透析袋除去过量的三乙胺,透析时间为6h。最后,通过真空干燥得到PEI-OA粉末,质量为10.6mg。
采用1H NMR对合成的PEI-OA进行300MHz核磁共振氢谱表征,谱图显示:硬脂酸上末端-CH3集团上的氢在0.8ppm处有特征吸收,PEI中(-HN-CH2-CH2-NH-)在2.5~2.8ppm处有特征吸收,对二者进行整合,显示PEI-OA聚合物一个基本单位中PEI和油酰氯的比例为8.0。
将PEI-OA粉末用无水乙醇溶解后制得5mg·mL-1的PEI-OA溶液,取5μL的PEI-OA溶液迅速注入到20μL的PBS缓冲液中,混合均匀后与pH=6的叶酸溶液(15mg·mL-1)室温混合(PEI-OA与叶酸摩尔比为5:1),室温孵育30min,通过静电吸附作用得到非病毒阳离子基因载体(FA-PEI-OA),终浓度为1.5mg·mL-1。
实施例3
本实施例为非病毒阳离子基因载体(FA-PEI-OA)的制备,制备方法如下:
PEI-800溶解在2.5毫升二氯甲烷中(浓度为5mg·mL-1),油酰氯溶解于100μL三乙胺和2.5mL二氯甲烷中(浓度为2mg·mL-1),将油酰氯溶液缓慢地加入到搅拌的PEI溶液中(摩尔比为4:1)。在室温下,搅拌反应进行24小时,搅拌速度为500rpm,通过截留分子量为10K的透析袋除去过量的三乙胺,透析时间为24h。最后,通过真空干燥得到PEI-OA粉末,质量为9.8mg。
采用1H NMR对合成的PEI-OA进行300MHz核磁共振氢谱表征,谱图显示:硬脂酸上末端-CH3集团上的氢在0.8ppm处有特征吸收,PEI中(-HN-CH2-CH2-NH-)在2.5~2.8ppm处有特征吸收,对二者进行整合,显示PEI-OA聚合物一个基本单位中PEI和油酰氯的比例为7.2。
将PEI-OA粉末用无水乙醇溶解后制得10mg·mL-1的PEI-OA溶液,取2μL的PEI-OA溶液迅速注入到20μL的PBS缓冲液中,混合均匀后与pH=8的叶酸溶液(15mg·mL-1)室温混合(PEI-OA与叶酸摩尔比为20:1),室温孵育60min,通过静电吸附作用得到非病毒阳离子基因载体(FA-PEI-OA),终浓度为0.5mg·mL-1。
实施例4
本实施例为不同叶酸浓度的非病毒阳离子基因载体(FA-PEI-OA)的制备,制备方法如下:
PEI-OA粉末的制备工艺同实施例1。
将PEI-OA粉末用无水乙醇溶解后制得10mg·mL-1的PEI-OA溶液,取2μL的PEI-OA溶液迅速注入到20μL的PBS缓冲液中,混合均匀后分别与0、1、2、3、4、5μL叶酸溶液(pH=8,初始浓度15mg·mL-1)室温混合,用DEPC水补充至体积为30μL,得到叶酸终浓度分别为0、0.5、1、1.5、2、2.5mg·mL-1的体系,室温孵育60min,通过静电吸附作用得到非病毒阳离子基因载体(FA-PEI-OA)。
实施例5
本实施例为不同N/P(氮/磷)比的载体(PEI-OA)与pDNA复合物的制备,制备方法如下:
使用DEPC水(焦碳酸二乙酯处理且经高温灭菌)将pDNA溶解,浓度为0.5mg·mL-1,同时将实施例1制得的PEI-OA溶液(5mg·mL-1),分别取0、0.5、1、2、3、4、5μL与5μL pDNA在PBS体系中均匀混合,用DEPC水将上述体系分别补充至18μL,漩涡混合20s,室温孵育20min,分别得到N/P(氮/磷)比分别为0、1:1、2:1、4:1、6:1、8:1、10:1的PEI-OA与pDNA复合物。
实施例6
本实施例为不同叶酸浓度的非病毒阳离子基因载体(FA-PEI-OA)与pDNA复合物的制备,制备方法如下:
不同叶酸浓度的非病毒阳离子基因载体(FA-PEI-OA)的制备同实施例4。
使用DEPC水(焦碳酸二乙酯处理且经高温灭菌)将pDNA溶解,浓度为0.5mg·mL-1,同时将实施例4得到的叶酸终浓度分别为0、0.5、1、1.5、2、2.5mg·mL-1的FA-PEI-OA载体体系与pDNA溶液混合(控制FA-PEI-OA中PEI-OA与pDNA的N/P比为4:1)。用DEPC水将上述体系分别补充至18μL,漩涡混合10s,室温孵育20min,即得。
实施例7
本实施例为不同质量比的载体(FA-PEI-OA)与pDNA复合物的制备,制备方法如下:
使用DEPC水(焦碳酸二乙酯处理且经高温灭菌)将pDNA溶解,浓度为0.5mg·mL-1,同时将实施例1制得的FA-PEI-OA载体系统,分别取0.5、2.5、5、7.5、10、12.5、15μL与2μL pDNA在PBS体系中均匀混合,用DEPC水将上述体系分别补充至18μL,漩涡混合30s,室温孵育20min,分别得到载体与pDNA质量比分别为1、5、10、15、20、25、30的FA-PEI-OA与pDNA复合物。
实施例8
本实施例为PEI-OA与pDNA复合物(实施例5)和FA-PEI-OA载体系统与pDNA复合物(实施例6)的琼脂糖凝胶电泳实验,考察PEI-OA和FA-PEI-OA载药系统和pDNA之间形成静电共聚物的能力:
称取2g琼脂糖溶于100mL TBE缓冲液中,加热直至琼脂糖完全溶解于TBE缓冲液,并保证没有气泡。待稍微冷却后加入10uL溴化乙锭(EB)溶液,轻摇使其混匀。将制备好的琼脂糖凝胶倒入电泳胶槽,待冷却后备用。整个电泳槽没在TBE缓冲液中。
制备PEI-OA/pDNA(实施例5)和FA/PEI-OA/pDNA(实施例6)复合物样品。每个样品加入2μL上样缓冲液,以每个样品总体积20μL上样到2%(w/v)的琼脂糖凝胶电泳的上样槽中,接通电源,保持电压在100mV运行20分钟。最后将琼脂糖胶放于紫外凝胶成像系统中分析。实验结果如图2所示,PEI-OA与pDNA具有较强的凝聚能力,当N/P比为4:1时,已完全阻滞了pDNA的迁移。当N/P比为4:1时,在PEI-OA/pDNA复合物样品中加入不同浓度的叶酸,得到FA/PEI-OA体系,叶酸浓度分别为0、0.5、1、1.5、2、2.5mg·mL-1,在一定范围内,均未对体系产生破坏,仍能够阻滞DNA的迁移,说明FA/PEI-OA与pDNA间的结合能力较强,结果如图2、3所示。
实施例9
本实施例为FA-PEI-OA载体系统与pDNA复合物(实施例7)的粒径和Zeta电位测定,考察FA-PEI-OA载体系统与pDNA复合物的稳定性:
按照实施例7方法分别制得质量比分别为1、5、10、15、20、25、30的FA-PEI-OA与pDNA复合物。使用动态光散射法对复合物体系的粒径和电位进行测定,每个样品平行三次。FA-PEI-OA载体系统与pDNA复合物复合物体系粒径均在500nm以下,Zeta电位为10mV~30mV,表明所得体系较稳定。结果如图4、5所示。
实施例10
本实施例FA-PEI-OA载体系统与pDNA复合物(实施例7)的体外细胞转染实验,考察FA-PEI-OA的转染效率及肿瘤细胞的靶向性:
考察按照实施例7方法分别制得质量比分别为5、10、15、20、25、30的FA-PEI-OA与pDNA复合物对不同肿瘤细胞系的转染效果,选取Hela细胞系和A549细胞系作为模型细胞系,于24孔板中加入2mL细胞(每孔个数为5×105左右),于37℃,5%CO2培养箱中孵育24h。吸出培养基后,用无血清培养基洗3遍,加入FA-PEI-OA与pDNA复合物体系,同时以PEI-OA/pDNA和PEI/pDNA体系作为对照,每孔中加入Cy3荧光标记的pDNA体系0.1nmol左右。转染2h后,每孔用1mL的PBS缓冲液洗涤三次。通过流式细胞仪测定转染成功的细胞体系,每个样品平均三次,以平均荧光强度为指标,测定其转染效率,结果如图6、7所示。结果显示,不同组别的FA-PEI-OA载体系统与pDNA复合物的平均荧光强度明显高于PEI和PEI-OA组,表明叶酸的加入对于提高转染效率及肿瘤细胞的靶向性有明显提高,同时PEI-OA组效果好于PEI组,表明PEI的疏水性修饰有利于提高转染效率和肿瘤细胞的靶向性。
实施例11
本实施例为FA-PEI-OA载体系统(实施例1制备)的毒性实验,评价FA-PEI-OA载体系统对细胞的毒性:
将终浓度为2mg·mL-1的FA-PEI-OA载体系统(实施例1制备)使用无血清的培养基进行稀释,得到浓度分别为1、5、10、15、20、25μg·mL-1的载体。采用MTT法对FA-PEI-OA载体系统对Hela和A549细胞系的毒性进行考察。将细胞按照密度为5×104~1×105个/mL置于96孔板中,于37℃,5%CO2培养箱中孵育24h,每孔加入培养基稀释后的体系100μL。给药2h后,吸取96孔板内培养基,使用PBS缓冲液洗涤3次,每孔加入MTT(5mg·mL-1)20μL,37℃培养2h后取出,每孔加DMSO150μL,待蓝紫色结晶物完全溶解后,使用多功能酶标仪进行观察,波长选取490nm。读取吸光度平均值,以细胞存活率为指标作图,结果如图8、9所示。结果显示:FA-PEI-OA载体系统对两种细胞系的毒性较小,细胞活力均在90%以上,效果优于同组的PEI和合成的PEI-OA,说明建立的FA-PEI-OA的载体系统有利于减少毒性。
实施例12
本实施例为使用激光共聚焦显微镜观察FA-PEI-OA载体系统与pDNA复合物(实施例7)的转染效果,观察FA-PEI-OA载体系统的肿瘤靶向效果。
将细胞按照密度为1×104~5×104个/mL置于玻底培养皿中,于37℃,5%CO2培养箱中孵育24h,每孔加入含有Cy3荧光标记的载药系统(实施例7)20μL,给药2h后,吸取培养基,使用PBS缓冲液洗涤3次,加入福尔马林溶液固定5min,使用PBS缓冲液洗涤3次,加入DAPI染料对细胞核进行染色,5min后清洗染液,使用激光共聚焦显微镜对固定后的细胞进行观察。其中,FA-PEI-OA载体系统与pDNA复合物被标记为红色,细胞核被标记为蓝色。结果显示,大量红色的FA-PEI-OA载体系统与pDNA复合物进入到细胞内,与蓝色细胞核重叠,表明FA-PEI-OA载体系统成功将pDNA复合物转染进入细胞内部。
Claims (5)
1.一种具有肿瘤靶向性的非病毒阳离子基因载体FA-PEI-OA,其特征在于:是由聚醚酰亚胺PEI、油酰氯OA和叶酸FA制备得到,交联的阳离子聚合物聚醚酰亚胺-油酰氯PEI-OA形成疏水性核心结构,由具有肿瘤靶向性的配体叶酸FA作为外壳,PEI与OA的摩尔比为1:1~4:1,PEI-OA与FA的摩尔比为1:1~20:1。
2.权利要求1所述的具有肿瘤靶向性的非病毒阳离子基因载体FA-PEI-OA的制备方法,其步骤如下:
(1)PEI-OA的合成:将聚醚酰亚胺溶于二氯甲烷中,浓度范围为0.5~5mg·mL-1;将油酰氯溶解于三乙胺和二氯甲烷的混合溶液中,三乙胺和二氯甲烷的体积比为2:1~8:1,油酰氯的浓度范围为0.2~2mg·mL-1,按照聚醚酰亚胺与油酰氯摩尔比为1:1~4:1比例,将油酰氯溶液缓慢地加入到聚醚酰亚胺溶液中,并室温搅拌,控制搅拌转速为100~500rpm,反应进行6~24h,通过透析除去过量的三乙胺,最后通过真空干燥得到PEI-OA粉末;
(2)将步骤(1)得到的PEI-OA粉末使用溶剂溶解后,在DEPC水、PB缓冲液或PBS缓冲液体系中与pH=6~8的叶酸溶液均匀混合,PEI-OA与叶酸的摩尔比为1:1~20:1,通过静电吸附作用制得FA-PEI-OA基因载体。
3.如权利要求2所述的具有肿瘤靶向性的非病毒阳离子基因载体FA-PEI-OA的制备方法,其特征在于:PEI的分子量为800~2000Da。
4.如权利要求2所述的具有肿瘤靶向性的非病毒阳离子基因载体FA-PEI-OA的制备方法,其特征在于:步骤(1)中透析截留分子量为10~30K,透析时间为8~24h。
5.如权利要求2所述的具有肿瘤靶向性的非病毒阳离子基因载体FA-PEI-OA的制备方法,其特征在于:步骤(2)中的溶剂为无水乙醇或氯仿。
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Non-Patent Citations (3)
Title |
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Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN103695449A (zh) | 2014-04-02 |
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