CN103665169B - 三功能肽修饰的基因载体及其制备方法与应用 - Google Patents
三功能肽修饰的基因载体及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种三功能肽修饰的基因载体及其制备方法与应用。具体地,提供了具有靶向肿瘤、促进穿膜和核定位三重功能的多肽,该多肽与两亲性壳聚糖修饰的聚乙烯亚胺偶联形成的基因载体及其制备方法,该基因载体与DNA形成的复合物,以及上述具备三重功能的多肽和基因载体在制备用于基因治疗的药物中的应用。本发明的基因载体体内转染效率高、细胞毒性低、靶向性强,具有广阔的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和分子生物学技术领域,具体地说,涉及一种三功能肽修饰的基因载体及其制备方法与应用。
背景技术
基因治疗是近年来建立在基因工程技术和分子遗传学原理基础上的新型治疗方法,因肿瘤发生与发展的生物学基础是基因突变,所以基因治疗现已成为攻克肿瘤最具希望,也是研究最活跃的领域。
基因治疗有三个重要环节,即目的基因、转基因载体和靶细胞。基因导入系统是基因治疗的核心技术。现阶段面临的最大难题在于尚未找到理想的基因载体。目前应用的载体包括病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体转染效率较高但存在运载能力低、有潜在安全威胁等问题,因此,非病毒载体近年来发展迅速,尤其是阳离子聚合物。
聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)是近年来研究最为广泛的阳离子多聚物非病毒基因载体,富含阳离子,具有强大的缓冲能力,有较强结合DNA和黏附细胞的能力。然而,PEI作为基因载体使用存在两个突出问题。第一,转染效率与细胞毒性存在矛盾:小分子PEI虽细胞毒性低,但在生理的离子浓度下与DNA易发生解离,造成转染效果差;分子量在20kDa以上的PEI虽具有较理想转染效率,但由于PEI的表面富含阳性电荷以及体内不可降解性,致使高分子量PEI表现出较强的细胞毒性。第二,PEI靶向性差:它是利用自身所带的正电荷,与细胞表面带负电荷的受体通过静电作用相结合,所以细胞的选择特异性差,解决靶向性问题已成为非病毒载体中最为关注的问题。因此,如何将PEI改造成转染效率高、细胞毒性低、靶向性强的基因载体材料是解决PEI应用难题的突破口。
为解决PEI作为基因载体使用中存在的问题,2010年本课题组申请并获得了项目名称为“壳聚糖季铵盐连接低分子量聚乙烯亚胺作为骨架的靶向DNA纳米复合物的构建及其抗肿瘤作用研究”的国家自然科学基金资助,并就研究成果申请了专利,参见申请号CN201110372497.6,公开日2012.06.27。两亲性壳聚糖N-辛基-N-季铵化壳聚糖(OTMCS)无毒、无刺激、无免疫原性,通过化学交联的方法连接PEI,尤其低分子量PEI(如PEI600/800/2000),以形成多分枝状或网状结构的高分子量PEI衍生物,该衍生物可保证较高转染效率,转染进入体内细胞后,这些交联的化学键又可以通过水解等反应断开,高分子量PEI衍生物断裂成易代谢的低分子量低毒性的PEI,这就使得其在保证一定转染效率的前提下,大大降低了高分子PEI所带来的细胞毒性;另一方面,OTMCS同时具有亲水链和疏水链,在水中可自发形成多分子球形胶束样结构,该胶束可显著提高复合物在体液中的稳定性,且尺寸可达纳米级,因此适宜基因药物在体内的传输。
发明人还提交过专利申请CN201110372844.5,公开日2012.04.04,该研究是将普朗尼克P123连接PEI,得到多分枝状或网状结构的高分子量PEI衍生物P123-PEI,选择特异亲和整合素αvβ3的RGD短肽,与细胞穿膜肽Tat(49-57)连接,合成具有靶向于αvβ3和促进载体穿膜的双功能肽,再利用交联技术将R13与PEI衍生物偶联,构建新型非病毒基因载体系统,并检验了该系统的细胞毒性和体外转染效率。
然而,上述两种非病毒基因载体系统虽然表现出体液稳定性增强、细胞毒性明显降低、体外转染效率及肿瘤靶向能力提高等一系列优点,但其体内转染效率较体外明显偏低,这也是目前非病毒基因载体研究中普遍存在的共性问题。究其原因,可能涉及以下两个方面:其一是体内环境复杂,复合物入体内后要面临免疫系统及生理屏障等诸多因素干扰;其二是体内外转染跨越细胞核膜的方式不同,其中后者更为关键。复合物细胞内解离机理的研究表明,细胞中RNA导致其目的基因的释放,因RNA在细胞中主要分布在细胞核,所以聚合物/DNA复合物也是需要进入到细胞核中,并被RNA解离从而发挥作用的。因此,如何提高阳离子复合物在体内靶细胞的核递送成为其能否应用于临床的关键之一。
核定位信号肽NLS是核内功能蛋白进入细胞核的结构基础,是介导某些蛋白入核的一段充分而必要的信息片段,大分子物质可通过NLS的介导经核孔复合物主动运转至细胞核内,其中研究最多的NLS是来自SV40的T抗原,主要功能序列为Lys-Lys-Lys-Arg-Lys(KKKRK)。
因此,理论上可将RGD短肽、细胞穿膜肽Tat(49-57)、NLS(KKKRK)连接,合成具有靶向于αvβ3、促进载体穿膜、入核的含RGD和Tat(49-57)、NLS(KKKRK)的三功能多肽,用于修饰OTMCS-PEI衍生物,提高其肿瘤细胞选择性,又可促进载体穿膜,并提高核递送能力,从而增加DNA的体内转染效率。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足,提供一种多肽。
本发明的再一的目的是,提供一种基因载体。
本发明的另一的目的是,提供上述基因载体的制备方法。
本发明的第四个目的是,提供一种复合物。
本发明的第五个目的是,提供上述多肽及基因载体的用途。
为实现上述第一个目的,本发明采取的技术方案是:
一种多肽,所述的多肽的氨基酸序列为:Arg-Gly-Asp-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys。
为实现上述第二个目的,本发明采取的技术方案是:
一种基因载体,所述的基因载体包含两亲性壳聚糖修饰的聚乙烯亚胺与如上所述的多肽所形成的偶联物,所述的两亲性壳聚糖的分子量为1-20KDa,所述的聚乙烯亚胺的分子量为0.6-70KDa,所述的两亲性壳聚糖与聚乙烯亚胺的摩尔比为1:1-1:20。
优选地,所述的两亲性壳聚糖与聚乙烯亚胺的摩尔比为1:1-1:10。更优选地,所述的两亲性壳聚糖与聚乙烯亚胺的摩尔比为1:10。
优选地,所述的两亲性壳聚糖修饰的聚乙烯亚胺与多肽的摩尔比为1:1-1:15。更优选地,所述的两亲性壳聚糖修饰的聚乙烯亚胺与多肽的摩尔比为1:2-1:10。
为实现上述第三个目的,本发明采取的技术方案是:
如上任一所述的基因载体的制备方法,包括以下步骤:
(a)合成如上所述的多肽;
(b)于两亲性壳聚糖中加入三光气,溶于无水甲苯和无水二氯甲烷的溶剂中反应过夜,除去溶剂后再用适量溶剂溶解,加入N-羟基琥珀酰亚胺活化,将活化后的两亲性壳聚糖用二氯甲烷溶解,与无水乙醇溶解的聚乙烯亚胺混合,搅拌,偶联得到两亲性壳聚糖修饰的聚乙烯亚胺;
(c)马来酰亚胺化步骤(b)制备的两亲性壳聚糖修饰的聚乙烯亚胺,再加入步骤(a)合成的多肽,搅拌,偶联。
为实现上述第四个目的,本发明采取的技术方案是:
如上任一所述的基因载体与DNA形成的复合物。
所述的DNA可以含报告基因、抗癌基因和/或细胞因子基因。
为实现上述第五个目的,本发明采取的技术方案是:
如上所述的多肽以及如上任一所述的基因载体在制备用于基因治疗的药物中的应用。
本发明优点在于:
将具有靶向肿瘤细胞功能的RGD肽、促进穿膜的Tat(49-57)短肽与核定位信号肽NLS连接,合成了具有三重功能的多肽,此新型多肽在国内外研究中尚未见报道,然后将其与两亲性壳聚糖修饰的聚乙烯亚胺偶联,并对各物质间的最佳摩尔比进行优化,构建了新型的非病毒基因载体系统,该载体系统体内转染效率高、细胞毒性低、靶向性强,是一种优良的基因载体材料,具有广阔的临床应用前景。
附图说明
图1是实施例1的OTMCS核磁共振氢谱图。
图2是实施例1的OTMCS-PEI-R18细胞毒性实验结果。图中,左起第一簇的7根柱子从左至右分别代表OTMCS-PEI-R18h、OTMCS-PEI-R18l、OTMCS-PEI-R13h、OTMCS-PEI-R13l、OTMCS-PEI、PEI(2KDa)、PEI(25KDa)。后续每簇的7根柱子所分别代表的含义同上。
图3是实施例1的OTMCS-PEI-R18体外转染效率实验结果。
图4是实施例1的OTMCS-PEI-R18体内转染效率实验结果。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
本文中,SMCC是一类含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯和马来酰亚胺的双功能偶联剂,可以将分别含有巯基和氨基的化合物键接在一起,分子结构为。
本发明的研究思路是:
1、首先选用OTMCS连接PEI,得到多分枝状或网状结构的高分子量PEI衍生物,考察其理化性质,选出转染效率高且细胞毒性小的阳离子聚合物;
2、利用整合素αvβ3在人肿瘤细胞和肿瘤新生血管高表达的特点,选择特异亲和该整合素的RGD短肽,与细胞穿膜肽Tat(49-57)、核定位信号肽NLS连接,合成具有靶向于αvβ3、促进载体穿膜、提高核递送能力的三功能肽RGD-Tat(49-57)-NLS(命名为R18);
3、利用交联技术将R18与PEI衍生物偶联,从而构建新型非病毒基因载体系统,即本发明的三功能肽修饰的基因载体OTMCS-PEI-R18;
4、以OTMCS-PEI-R13、OTMCS-PEI、PEI(2KDa)、PEI(25KDa)为对照检验构建的新型非病毒基因载体系统OTMCS-PEI-R18的细胞毒性、体外转染效率及体内转染效率。
实施例1OTMCS-PEI-R18的制备和功能验证(一)
一、OTMCS-PEI-R18的制备
(一)两亲性壳聚糖OTMCS的合成
壳聚糖12g和正辛醛(34.0mL,0.370mo1)加入到150mL甲醇中,30℃搅拌12h后,分三次加入KBH4(共计6g/60mL),搅拌过夜,过滤后,用水和热甲醇反复洗涤,50℃真空干燥,取该产物0.96g,置100mL烧瓶中,依次加入N-甲基吡咯烷酮15mL,KI2.4g,15%NaOH水溶液5mL和CH3I5.2mL,搅拌,60℃反应1h,放冷,1000r/min离心30min,弃上清液,残渣加适量水溶解,透析5d,透析液滤过,滤液冷冻干燥,即得淡黄色OTMCS,分子量2KDa。
对终产物OTMCS做核磁共振氢谱分析。由图1可见,各峰的归属如下:1.22(N(CH3)3),0.94(N(CH3)2),3.69~3.24(H3,H4,H5,H6),3.21(H2),1.89(NOCOCH3),4.7左右的一个很强峰为样品中的水峰,通过1H-NMR可知,OTMCS成功合成。
(二)OTMCS-PEI的合成
1、三光气+琥珀酰亚胺法活化OTMCS
称取3.86gOTMCS,加入两倍摩尔量即12.8g三光气,溶于80mL无水甲苯和无水二氯甲烷的混合溶液中(v/v=3:1),室温下磁力搅拌反应过夜。真空旋蒸除去溶剂,再用适量无水甲苯和无水二氯甲烷混合液溶解,然后加入0.49gN-羟基琥珀酰亚胺,搅拌状态下,将无水三乙胺(0.2ml溶于4ml无水二氯甲烷)逐滴加入反应液中,继续搅拌4h。待反应完全后,将反应液过滤并再次真空旋蒸除去溶剂,所得残渣溶解于50mL乙酸乙酯中,高速离心后取上清液,旋转蒸发以挥去乙酸乙酯,冷却固化反应物并保存于-20℃干燥条件下。
2、OTMCS与PEI(2KDa)的连接
取10倍于OTMCS摩尔量的PEI(2KDa)(50wt%)8.56g,除水后用约20mL无水乙醇溶解。活化后的OTMCS用10mL二氯甲烷溶解。将上述两种溶液同时逐滴加入搅拌的20mL无水二氯甲烷中,继续搅拌过夜,高速离心后取上清,旋转蒸发,得初产物即为OTMCS-PEI。
(三)三功能肽R18的合成
三功能肽R18的序列为Arg-Gly-Asp-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys,由上海吉尔生化有限公司采用固相法合成。作为对照的OTMCS-PEI-R13中双功能肽R13的序列为Arg-Gly-Asp-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg,也由上海吉尔生化有限公司采用固相法合成。
(四)OTMCS-PEI-R18的合成
1、SMCC法制备马来酰亚胺化的OTMCS-PEI(maleimidedOTMCS-PEI)
将OTMCS-PEI用适量水溶解使其浓度为10mg/mL,SMCC用二甲基亚砜溶解使其浓度为3.33mg/mL。将SMCC溶液分别按10:1和2:1于OTMCS-PEI的摩尔比逐滴加入到OTMCS-PEI溶液中,常温避光条件下搅拌30min。反应液通过HiTrapDesaltingSephadexTMG-25Superfine凝胶色谱柱一除去未结合的SMCC,所得产物即为maleimidedOTMCS-PEI。
2、偶联R18与maleimidedOTMCS-PEI
三功能肽R18用PBS溶解至浓度为10mg/mL,分别按10:1和2:1于OTMCS-PEI的摩尔比逐滴加入到maleimidedOTMCS-PEI溶液中,4℃搅拌过夜。反应液经截留分子量为10000的超滤离心管离心去除未被结合的三功能肽R18,经冷冻干燥后得不同R18偶联度的OTMCS-PEI-R18,分别命名为OTMCS-PEI-R18-h(10:1),OTMCS-PEI-R18-l(2:1)。
OTMCS-PEI-R13的合成同OTMCS-PEI-R18,也制备成两种偶联度,分别命名为OTMCS-PEI-R13-h(10:1),OTMCS-PEI-R13-l(2:1)。
二、OTMCS-PEI-R18的细胞毒性实验
将Hela细胞接种于96孔板上,培养24h,使细胞汇合度达到70%-80%。实验前,吸去培养基,每孔加入不同浓度阳离子聚合物(4,8,16,24,32μg/mL,无血清1640作为溶剂),继续培养24h,MTT法检测细胞毒性。从图2可看出,未修饰的PEI(25KDa)细胞毒性较强,而OTMCS-PEI-R18则显示了较高的细胞活性,但相对于OTMCS-PEI-R13细胞活性稍低。
三、OTMCS-PEI-R18的体外转染实验
将Hela细胞接种于24孔板上,培养24h,使细胞汇合度达到70%-80%。分别将OTMCS-PEI-R18等阳离子聚合物与虫荧光素酶报告基因按质量比5:1、10:1、20:1和30:1制成复合物,加入24孔板上,培养4h,替换含血清培养基继续培养48h,检测虫荧光素酶表达。从图3可看出,OTMCS-PEI-R18显示了很强转染效率,远远高于对照组PEI(2KDa),也比PEI(25KDa)的最佳表达效果好很多,约为其表达强度的23倍;但可能由于细胞毒性比OTMCS-PEI-R13大,体外转染效率相对较低。
四、OTMCS-PEI-R18的体内转染实验
选择ICR实验鼠建立B16小鼠黑色素瘤移植模型,并将实验动物分为五组:OTMCS-PEI-R18-h,w/w=30;OTMCS-PEI-R18-l,w/w=30;OTMCS-PEI-R13-h,w/w=30;OTMCS-PEI-R13-l,w/w=30;OTMCS-PEI,w/w=30。进而以质粒PGL3-Control(购于Promega)为报告基因,评价静脉给药24h后鼠心、肝、脾、肺、肾、肿瘤等器官荧光素酶表达情况。其中w/w=30表示阳离子聚合物与虫荧光素酶报告基因的质量比是30。从图4可以看出,OTMCS-PEI-R18显示了很强转染效率,荧光素酶的表达强度远远高于对照组PEI(25KDa)和OTMCS-PEI-R13,在肝、脾、肺、肿瘤处甚至是OTMCS-PEI-R13表达强度的9.2倍。
实施例2OTMCS-PEI-R18的制备和功能验证(二)
OTMCS-PEI-R18的制备及体外转染实验步骤同实施例1,不同之处在于:本实施例中OTMCS分子量为1KDa,PEI分子量为70KDa,合成OTMCS-PEI时所用的OTMCS与PEI摩尔比为1:1,合成OTMCS-PEI-R18时所用的R18与OTMCS-PEI的摩尔比为15:1;作为对照的OTMCS-PEI-R13的制备同OTMCS-PEI-R18。
体外转染实验结果表明:OTMCS-PEI-R18荧光素酶的表达强度远远高于OTMCS-PEI-R13,在心、肝、脾、肺、肾、肿瘤处分别是OTMCS-PEI-R13表达强度的6.7、7.2、7.5、8.0、8.6、8.4倍。
实施例3OTMCS-PEI-R18的制备和功能验证(三)
OTMCS-PEI-R18的制备及体外转染实验步骤同实施例1,不同之处在于:本实施例中OTMCS分子量为20KDa,PEI分子量为0.6KDa,合成OTMCS-PEI时所用的OTMCS与PEI摩尔比为1:20,合成OTMCS-PEI-R18时所用的R18与OTMCS-PEI的摩尔比为1:1;作为对照的OTMCS-PEI-R13的制备同OTMCS-PEI-R18。
体外转染实验结果表明:OTMCS-PEI-R18荧光素酶的表达强度远远高于OTMCS-PEI-R13,在心、肝、脾、肺、肾、肿瘤处分别是OTMCS-PEI-R13表达强度的7.3、7.6、7.1、8.2、8.5、8.4倍。
实施例4OTMCS-PEI-R18的制备和功能验证(四)
OTMCS-PEI-R18的制备及体外转染实验步骤同实施例1,不同之处在于:本实施例中OTMCS分子量为10KDa,PEI分子量为40KDa,合成OTMCS-PEI时所用的OTMCS与PEI摩尔比为1:5,合成OTMCS-PEI-R18时所用的R18与OTMCS-PEI的摩尔比为1:8;作为对照的OTMCS-PEI-R13的制备同OTMCS-PEI-R18。
体外转染实验结果表明:OTMCS-PEI-R18荧光素酶的表达强度远远高于OTMCS-PEI-R13,在心、肝、脾、肺、肾、肿瘤处分别是OTMCS-PEI-R13表达强度的6.8、7.0、7.2、8.1、8.7、8.5倍。
实施例5OTMCS-PEI-R18的制备和功能验证(五)
OTMCS-PEI-R18的制备及体外转染实验步骤同实施例1,不同之处在于:本实施例中OTMCS分子量为8KDa,PEI分子量为10KDa,合成OTMCS-PEI时所用的OTMCS与PEI摩尔比为1:15,合成OTMCS-PEI-R18时所用的R18与OTMCS-PEI的摩尔比为1:12;作为对照的OTMCS-PEI-R13的制备同OTMCS-PEI-R18。
体外转染实验结果表明:OTMCS-PEI-R18荧光素酶的表达强度远远高于OTMCS-PEI-R13,在心、肝、脾、肺、肾、肿瘤处分别是OTMCS-PEI-R13表达强度的7.1、7.3、7.5、8.4、8.9、8.7倍。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCELISTING
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<160>3
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
ArgGlyAspArgLysLysArgArgGlnArgArgArgLysLysLysArg
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Lys
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<212>PRT
<213>人工序列
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ArgGlyAspArgLysLysArgArgGlnArgArgArg
1510
<210>3
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<400>3
LysLysLysArgLys
15
Claims (5)
1.一种基因载体,其特征在于,所述的基因载体包含两亲性壳聚糖修饰的聚乙烯亚胺与多肽所形成的偶联物,所述的多肽的氨基酸序列为:Arg-Gly-Asp-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys,所述的两亲性壳聚糖的分子量为2KDa,所述的聚乙烯亚胺的分子量为2KDa,所述的两亲性壳聚糖与聚乙烯亚胺的摩尔比为1:10,所述的两亲性壳聚糖修饰的聚乙烯亚胺与多肽的摩尔比为1:2或1:10。
2.权利要求1所述的基因载体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(a)合成多肽,所述的多肽的氨基酸序列为:Arg-Gly-Asp-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys;
(b)于两亲性壳聚糖中加入三光气,溶于无水甲苯和无水二氯甲烷的溶剂中反应过夜,除去溶剂后再用适量溶剂溶解,加入N-羟基琥珀酰亚胺活化,将活化后的两亲性壳聚糖用二氯甲烷溶解,与无水乙醇溶解的聚乙烯亚胺混合,搅拌,偶联得到两亲性壳聚糖修饰的聚乙烯亚胺;
(c)马来酰亚胺化步骤(b)制备的两亲性壳聚糖修饰的聚乙烯亚胺,再加入步骤(a)合成的多肽,搅拌,偶联。
3.权利要求1所述的基因载体与DNA形成的复合物。
4.根据权利要求3所述的复合物,其特征在于,所述的DNA含报告基因、抗癌基因和/或细胞因子基因。
5.权利要求1所述的基因载体在制备用于基因治疗的药物中的应用。
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2013
- 2013-11-21 CN CN201310587463.8A patent/CN103665169B/zh active Active
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Publication number | Publication date |
---|---|
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