CN109880021A - 聚合物及其制备方法、ROS响应型siRNA纳米胶束及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及化合物领域，具体而言，涉及一种聚合物及其制备方法、ROS响应型siRNA纳米胶束及其应用。一种聚合物的制备方法，制备聚合物Ⅰ、聚合物Ⅱ、聚合物Ⅲ以及聚合物Ⅵ。包括上述聚合物的ROS响应型siRNA纳米胶束能够建立稳定siRNA纳米药物，没有细胞毒性并具有有效的siRNA现场释放能力。可以用于制备抑制肿瘤细胞增长和/或抑制肿瘤部位新生血管药物中。
Description
技术领域
本申请涉及化合物领域，具体而言，涉及一种聚合物及其制备方法、ROS响应型siRNA纳米胶束及其应用。
背景技术
胶质母细胞瘤(GBM)是最致命的原发性脑恶性肿瘤，在目前标准的治疗中生存期仅为15个月。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是一种利用小干扰RNA(smallinterference RNA,siRNA)抑制特定基因活性的方法，具有良好的治疗GBM的前景。然而，现有技术中RNAi不能有效导入脑内，实现其有效性。
发明内容
本申请实施例的目的在于提供一种聚合物及其制备方法、ROS响应型siRNA纳米胶束及其应用，其旨在改善现有的核酸纳米胶束效性较差的问题。
本申请第一方面提供一种聚合物的制备方法，聚合物的制备方法主要包括以下步骤：
MEO-PEG2K-CPADN与(3-甲基丙烯酰氯丙基)氨基甲酸叔丁单体【tert-butyl(3-methacrylamidopropyl)carbamate)】聚合得到聚合物Ⅰ；或者
MEO-PEG2K-CPADN与GUA聚合得到聚合物Ⅱ；或者
MEO-PEG2K-CPADN与GUA、HB单体聚合得到聚合物Ⅲ；或者
GUA单体与ANG-PEG3.4K-CPADN聚合得到聚合物Ⅵ。
聚合物Ⅰ、聚合物Ⅱ、聚合物Ⅲ或者聚合物Ⅵ能够建立稳定siRNA纳米药物，没有细胞毒性并具有有效的siRNA现场释放能力。实现药物的有效性。
在本申请第一方面的一些实施例中：
ANG-PEG3.4K-CPADN通过Angiopep-HS与MAL-PEG3.4K-CPADN聚合得到；
可选地，MAL-PEG3.4K-CPADN通过MAL-PEG3.4K-NH2与NHS-CPADN反应得到。
在本申请第一方面的一些实施例中，
MAL-PEG3.4K-CPADN通过以下步骤制得：摩尔比为1：1.2-1.5的MAL-PEG3.4K-NH2与NHS-CPADN于二氯甲烷溶液中反应制得；
ANG-PEG3.4K-CPADN通过以下步骤制得：摩尔比为1：3-4的MAL-PEG3.4K-CPADN与Angiopep-HS于氮气保护的PBS溶液中反应制得。
在本申请第一方面的一些实施例中，
聚合物Ⅰ通过以下步骤制得：摩尔比为1：22-26的MEO-PEG2K-CPADN与(3-甲基丙烯酰氯丙基)氨基甲酸叔丁单体在引发剂偶氮二异丁腈作用下聚合。
在本申请第一方面的一些实施例中，
聚合物Ⅱ通过以下步骤制得：摩尔比为1：22-26的MEO-PEG2K-CPADN与GUA在引发剂偶氮二异丁腈作用下聚合。
在本申请第一方面的一些实施例中，
聚合物Ⅲ通过以下步骤制得：摩尔比为1：22-26：4-5的MEO-PEG2K-CPADN与GUA、HB单体在引发剂偶氮二异丁腈作用下聚合；
聚合物Ⅵ通过以下步骤制得：摩尔比为1：22-26的ANG-PEG3.4K-CPADN与GUA单体在引发剂偶氮二异丁腈作用下聚合。
本申请第二方面提供一种聚合物，聚合物由本申请第一方面提供的聚合物的合成方法制得。
本申请第三方面提供一种ROS响应型siRNA纳米胶束，ROS响应型siRNA纳米胶束包括聚合物和siRNA；
聚合物选自本申请第二方面提供的聚合物Ⅰ、聚合物Ⅱ、聚合物Ⅲ或者聚合物Ⅵ中的至少一种；
可选地，聚合物包括摩尔比为1:3.8-4.2的聚合物Ⅲ和聚合物Ⅵ。
可选地，siRNA选用siPLK1或者siVEGFR2。
在本申请第三方面的一些实施例中，
ROS响应型siRNA纳米胶束主要通过以下步骤制得：
将聚合物和siRNA分别溶于10mmol/L HEPES缓冲溶液，吹打混匀后静置20-40分钟。
聚合物Ⅰ中的氨基(NH4+)与siRNA中的磷酸根(PO34-)通过电荷作用结合；聚合物Ⅱ中的胍基(Gu+)与siRNA中的磷酸根(PO34-)通过盐桥、氢键作用结合；聚合物Ⅲ中的胍基(Gu+)与siRNA中的磷酸根(PO34-)通过盐桥、氢键作用结合，并通过HB的疏水作用使纳米胶束被压缩，粒径变小，更稳定。
本申请第四方面提供一种应用，本申请第三方面提供的ROS响应型siRNA纳米胶束在制备抑制肿瘤细胞增长和/或抑制肿瘤部位新生血管中药物的应用。
聚合物@siRNA(聚合物选自聚合物Ⅰ、聚合物Ⅱ、聚合物Ⅲ或者聚合物Ⅵ中的至少一种)能够建立稳定siRNA纳米药物，没有细胞毒性并具有有效的siRNA现场释放能力。可以用于制备抑制肿瘤细胞增长和/或抑制肿瘤部位新生血管药物中。
ROS响应型siRNA纳米胶束制备得到的抑制肿瘤细胞增长和/或抑制肿瘤部位新生血管中药物至少具有以下优点：
(1)Angiopep-2配体使药物能够主动跨血脑屏障和靶向GBM。
(2)盐桥和苯硼酯疏水倍数提高了药物的稳定性。当这种给药纳米药物到达肿瘤细胞内ROS水平较高的位置时，疏水苯硼酯会与羧基发生亲水反应。这种逆转不仅耗尽了疏水增强的稳定，而且还由于负电的羧基组竞争损害Gu+/PO4 3-的盐桥,导致有效的siRNA释放。
(3)组合RNAi技术具有更好的治疗效果。我们的研究结果表明，该多功能siRNA纳米药物具有延长体内循环时间、强脑靶向性和有效的组合RNAi效率。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本申请实施例叔丁基氨基甲酸酯的核磁共振图谱图；
图2为本申请实施例MEO-PEG2K-CPADN的核磁共振图谱图；
图3为本申请实施例聚合物Ⅰ的核磁共振图谱图；
图4为本申请实施例GUA的核磁共振图谱图；
图5为本申请实施例聚合物Ⅱ的核磁共振图谱图；
图6为本申请实施例HB单体的核磁共振图谱图；
图7为本申请实施例聚合物Ⅲ的核磁共振图谱图；
图8为试验例1琼脂糖凝胶电泳表征结果；
图9为试验例1动态光散射仪和投射电子显微镜检测结果；
图10为试验例2琼脂糖凝胶电泳方法检测siRNA的释放量；
图11为试验例3琼脂糖凝胶电泳方法检测siRNA的释放量；
图12为试验例4流式细胞分析检测结果；
图13为试验例4共聚焦显微镜结果；
图14为试验例4中MTT法细胞毒性检测结果；
图15示出了试验例4中U87-MG-LUC细胞转染效果；
图16示出了试验例4中mRNA水平转染效果；
图17示出了试验例4中蛋白水平转染效果。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本申请实施例的聚合物及其制备方法、ROS响应型siRNA纳米胶束及其应用进行具体说明。
MEO-PEG2K-CPADN与(3-甲基丙烯酰氯丙基)氨基甲酸叔丁单体【tert-butyl(3-methacrylamidopropyl)carbamate)】聚合得到聚合物Ⅰ；或者
MEO-PEG2K-CPADN与GUA聚合得到聚合物Ⅱ；或者
MEO-PEG2K-CPADN与GUA、HB单体聚合得到聚合物Ⅲ；或者
GUA单体与ANG-PEG3.4K-CPADN聚合得到聚合物Ⅵ。
MEO-PEG2K-CPADN分子结构式如下所示：
tert-butyl(3-methacrylamidopropyl)carbamate的分子结构式如下所示：
聚合物Ⅰ的分子结构式如下所示：
进一步地，聚合物Ⅰ通过以下步骤制得：摩尔比为1：22-26的MEO-PEG2K-CPADN与tert-butyl(3-methacrylamidopropyl)carbamate在引发剂偶氮二异丁腈作用下聚合。
反应路线如下所示：
可以理解的是，在本申请的其他实施例中，引发剂也可以不为偶氮二异丁腈，例如可以为偶氮二异庚腈。
进一步地，在本申请的一些实施例中，聚合物Ⅰ通过以下步骤制得：
tert-butyl(3-methacrylamidopropyl)carbamate单体，MEO-PEG-CPADN，引发剂AIBN(偶氮二异丁腈)在摩尔比为25：1：0.2在N,N-二甲基甲酰胺溶液中，于70℃聚合反应二十四小时生成MEO-PEG-Ptert-Butyl(3-methacrylamidopropyl)carbamate聚合物。然后把得到的纯净的该产物溶于二氯甲烷，并加入三氟乙酸搅拌一小时，最后于环己烷中沉淀提纯得到做终产物聚合物ⅠMEO-PEG2K-P(N-(3-aminopropyl)methacrylamide)3k。
进一步地，在本申请的一些实施例中，MEO-PEG2K-CPADN通过以下步骤制得：
MEO-PEG2K与NHS-CPADN以摩尔比1：1.2混合于二氯甲烷溶液中反应，室温反应24h。在冰乙醚中沉淀，得到的沉淀重新溶于少量二氯甲烷，再沉淀于冰乙醚中，反复此步骤三次，最后真空干燥得到MEO-PEG2K-CPADN。
反应路线如下所示：
式中RT表示室温25℃±3℃。
进一步地，在本申请的一些实施例中，tert-butyl(3-methacrylamidopropyl)carbamate通过以下步骤制得：
使叔丁基氨基甲酸酯(3-aminopropyl)溶于二氯甲烷和饱和碳酸氢钠溶液的混合溶液中，然后在冰浴上缓慢滴加1.4当量的甲基丙烯酰氯，室温反应30分钟后，加入50mL的二氯甲烷，再用饱和碳酸氢钠溶液洗三次，接着浓缩分散在二氯甲烷中的反应产物，然后用纯的二氯甲烷溶液过硅胶柱，最后得到纯净的tert-butyl(3-methacrylamidopropyl)carbamate单体。
反应路线如下所示：
需要说明的是，在本申请的其他实施例中，MEO-PEG2K-CPADN也可以通过其他方式制得，或者通过购买等途径制得。
(3-甲基丙烯酰氯丙基)氨基甲酸叔丁单体分子结构式如下所示：
采用本申请实施例提供的聚合物Ⅰ的制备方法制备得到的聚合物Ⅰ采用RAFT聚合方式使(3-甲基丙烯酰氯丙基)氨基甲酸叔丁单体被聚合到MEO-PEG上，制备方法简单，易操作且稳定。
聚合物Ⅱ的分子结构式如下所示：
在本申请的一些实施例中，聚合物Ⅱ通过以下步骤制得：摩尔比为1：22-26的MEO-PEG2K-CPADN与GUA在引发剂偶氮二异丁腈作用下聚合。
进一步地，在本申请中，聚合物Ⅱ通过以下步骤制得：
摩尔比为25：1：0.2的GPMA单体，MEO-PEG2K-CPADN，引发剂AIBN(偶氮二异丁腈)在N,N-二甲基甲酰胺溶液中，于70℃聚合反应二十四小时生成MEO-PEG2K-P(GUA)3K聚合物。然后通过透析和冷冻干燥等方法得到浅黄色终产物。
反应路线如下所示：
在本申请的一些实施例中，
GUA通过以下步骤制得：
取5.6mmol APMA·HCl(N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐酸盐)、5.6mmol Praxadine(吡唑脒)和12.3mmol三乙胺溶解于16mL DMF中，加入0.091mmol对苯酚(10mg，MW＝110.11)(抑制聚合)，在氮气保护环境下，室温反应24h。然后将上述反应液倒入到100mL乙醚中，上清去除，有机相沉淀留下，然后用乙腈(20mL)和三乙胺(1mL)分别洗涤两遍，最后再二氯甲烷(30mL)洗涤1遍，得到苍黄色产物真空干燥。
反应路线如下所示：
HB单体的分子结构式如下所示：
采用本申请实施例提供的聚合物Ⅱ的制备方法制备得到的聚合物Ⅱ采用RAFT聚合方式使GUA单体被聚合到MEO-PEG上，制备条件柔和不苛刻，制备方法简单。
聚合物Ⅲ的分子结构式如下所示：
进一步地，在本申请的实施例中，聚合物Ⅲ通过以下步骤制得：摩尔比为1：22-26：4-5的MEO-PEG2K-CPADN与GUA、HB单体在引发剂偶氮二异丁腈作用下聚合。
进一步地，摩尔比为25：5：1：0.2的GUA单体，HB单体，MEO-PEG-CPADN，引发剂AIBN(偶氮二异丁腈)在N,N-二甲基甲酰胺溶液中，于70℃聚合反应二十四小时生成MEO-PEG2K-P(GUA3K,HB1K)聚合物。然后通过乙醚沉淀，透析和冷冻干燥等方法得到浅黄色终产物。
在其他实施例中，引发剂也可以不为偶氮二异丁腈，例如可以为偶氮二异庚腈。
合成路线如下：
在本申请的一些实施例中，HB单体主要通过以下步骤制得：
4-(羟甲基)phenylboronic酸(0.1mol)和频哪醇(0.1mol)加入到含有新鲜分子筛的圆底烧瓶中，然后添加120mL甲苯，然后120℃反应24h直到反应溶液澄清，接着过滤并旋蒸溶剂得到白色粉末S1。把S1(50mmol)分散到无水二氯甲烷中，然后加入三乙胺(60mmol)，接着冰浴滴加甲基丙烯酰氯(60mmol)，室温反应24h，过滤。旋蒸溶液后用乙酸乙酯稀释，然后用盐水洗三次，MgSO4干燥过夜后浓缩，然后用石油醚/乙酸乙酯(体积比＝30/1)为展开剂过硅胶柱获得无色结晶。
合成路线如下：
式中toluene代表甲苯；TEA代表三乙胺。
可以理解的是，在本申请的其他实施例中，HB单体也可以通过其他方式制得，或者进行市购等。
采用本申请实施例提供的聚合物Ⅲ的制备方法制备得到的聚合物Ⅲ采用RAFT聚合方式使GUA、HB单体无规则地被聚合到MEO-PEG上。制备方法简单，条件不苛刻，易操作且稳定。
聚合物Ⅵ的分子结构式如下所示：
在本申请的一些实施例中，聚合物Ⅵ通过以下步骤制得：摩尔比为1：22-26的ANG-PEG3.4K-CPADN与GUA单体在引发剂偶氮二异丁腈作用下聚合。
进一步地，摩尔比为25：1：0.2的GPMA单体，ANG-PEG3.4K-CPADN，引发剂AIBN(偶氮二异丁腈)在N,N-二甲基甲酰胺溶液中，于70℃聚合反应二十四小时生成ANG-PEG3.4K-P(GUA)3K聚合物。然后通过透析和冷冻干燥等方法得到浅黄色终产物。
进一步地，在本申请的一些实施例中，ANG-PEG3.4K-CPADN通过Angiopep-HS与MAL-PEG3.4K-CPADN聚合得到。
进一步地，Angiopep-HS与MAL-PEG3.4K-CPADN以摩尔比3：1混合加入到氮气保护的PBS溶液中，室温反应过夜，用3.5K的透析袋在纯水里透析两天，冷冻干燥得到产物ANG-PEG3.4K-CPADN。
进一步可选地，MAL-PEG3.4K-CPADN通过MAL-PEG3.4K-NH2与NHS-CPADN反应得到。
MAL-PEG3.4K-NH2与NHS-CPADN以摩尔比1：1.2混合于二氯甲烷溶液中反应，室温反应24h。在冰乙醚中沉淀，得到的沉淀重新溶于少量二氯甲烷，再沉淀于冰乙醚中，反复此步骤三次，最后真空干燥得到MAL-PEG3.4K-CPADN。
反应路线如下所示：
式中Angiopep-HS是指巯基修饰的Angiopep，AIBN指偶氮二异丁腈，DMF是指二甲基甲酰胺。
可以理解的是，在本申请的其他实施例中，ANG-PEG3.4K-CPADN可以通过其他方式制得。
采用本申请实施例提供的聚合物Ⅵ的制备方法制备得到的聚合物Ⅵ：采用RAFT聚合方式使GUA单体被聚合到Ang-PEG上，聚合物Ⅵ带有靶向基团Angiopep，在纳米药物中除了有装载siRNA的功能还具有靶向脑胶质瘤的功能。
本申请还提供一种聚合物，聚合物由上述聚合物的制备方法制得。
小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)载体的聚合物，主要是富含氨基的阳离子聚合物，可以压缩siRNAs形成纳米复合物。聚合物中的氨基(NH3 +)与siRNA的磷酸基(PO3 4-)之间的静电相互作用,可以避免核酸酶对siRNA的消化和肾脏排泄，延长其等离子体寿命。此外，siRNAs复合物容易被靶向配体如angiopep-2修饰从而促使siRNA分别通过受体介导的转胞吞作用和受体介导的内吞作用，穿过血脑屏障进入GBM细胞。由于制备方便且RNAi效率高，静电相互作用的siRNA复合物是目前GBM RNAi治疗的主流。
发明人研究后发现，单次静电相互作用增强的siRNA纳米药物在体内通常会发生游离，因为血液中含有大量的带负电荷的生物大分子，干扰了阳离子聚合物与siRNA的结合，削弱了siRNA载体的保护能力。最近的报告表明,不同于NH4 +/PO3 4-静电相互作用，胍盐组(Gu+)可以通过形成Gu+/PO3 4-盐桥与siRNA结合。Gu+/PO3 4-是静电和氢键双重相互作用，其组成纳米药物的稳定性明显优于单一静电作用的稳定性。
在本申请的实施例中，应用Gu+/PO3 4-相互作用和疏水作用共同合成核酸纳米药物将显示良好的体内稳定性。在体外建立稳定siRNA纳米药物，并具有有效的siRNA现场释放能力，有利于GBM治疗。
本申请提供一种核ROS响应型siRNA纳米胶束，ROS响应型siRNA纳米胶束包括聚合物和siRNA；在本实施例中，ROS响应型siRNA纳米胶束记为聚合物@siRNA。
聚合物选自上述聚合物Ⅰ、聚合物Ⅱ、聚合物Ⅲ或者聚合物Ⅵ中的至少一种；
可选地，聚合物包括摩尔比为1:3.8-4.2的聚合物Ⅲ和聚合物Ⅵ。
可选地，siRNA选用siPLK1或者siVEGFR2。
进一步地，ROS响应型siRNA纳米胶束主要通过以下步骤制得：
将聚合物和siRNA分别溶于10mmol/L HEPES缓冲溶液，吹打混匀后静置20-40分钟。
本申请提供的ROS响应型siRNA纳米胶束，聚合物Ⅰ中的氨基(NH4 +)与siRNA中的磷酸根(PO3 4-)通过电荷作用结合；聚合物Ⅱ中的胍基(Gu+)与siRNA中的磷酸根(PO3 4-)通过盐桥、氢键作用结合；聚合物Ⅲ中的胍基(Gu+)与siRNA中的磷酸根(PO3 4-)通过盐桥、氢键作用结合，并通过HB的疏水作用使纳米胶束被压缩，粒径变小，更稳定。
本申请提供的ROS响应型siRNA纳米胶束在制备抑制肿瘤细胞增长和/或抑制肿瘤部位新生血管药物中的应用。
包括聚合物和siRNA的核酸纳米胶束稳定性好，靶向性强，聚合物主要作为siRNA的递送载体。
ROS响应型siRNA纳米胶束对活性氧(ROS)产生响应，用于触发siRNA传递和有效的GBM治疗。
siPLK1或者siVEGFR2与上述聚合物(聚合物Ⅰ、聚合物Ⅱ、聚合物Ⅲ或者聚合物Ⅵ中的至少一种)制备得到ROS响应型siRNA纳米胶束，用于制备治疗GBM的药物，GBM是高血管化脑瘤，且PLK1(pololike kinase 1)过表达。
ROS响应型siRNA纳米胶束制备的RNAi药物至少具有以下优点：
(1)Angiopep-2配体使药物能够主动跨血脑屏障和靶向GBM。
(2)盐桥和苯硼酯疏水倍数提高了药物的稳定性。当这种给药纳米药物到达肿瘤细胞内ROS水平较高的位置时，疏水苯硼酯会与羧基发生亲水反应。这种逆转不仅耗尽了疏水增强的稳定，而且还由于负电的羧基组竞争损害Gu+/PO4 3-的盐桥,导致有效的siRNA释放。
(3)组合RNAi技术具有更好的治疗效果。我们的研究结果表明，该多功能siRNA纳米药物具有延长体内循环时间、强脑靶向性和有效的组合RNAi效率等优点。
以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种ROS响应型siRNA纳米胶束，主要通过以下步骤制得：
制备聚合物Ⅰ：
使叔丁基氨基甲酸酯(3-aminopropyl)溶于二氯甲烷和饱和碳酸氢钠溶液的混合溶液中，然后在冰浴上缓慢滴加1.4当量的甲基丙烯酰氯，室温反应30分钟后，加入50mL的二氯甲烷，再用饱和碳酸氢钠溶液洗三次，接着浓缩分散在二氯甲烷中的反应产物，然后用纯的二氯甲烷溶液过硅胶柱，最后得到纯净的产物，即叔丁基氨基甲酸酯(3-methacrylamidopropyl)【tert-butyl(3-methacrylamidopropyl)carbamate)】单体。
采用核磁共振检测产物，产物的核磁共振图谱图如图1所示，从图1中可以看出产物即叔丁基氨基甲酸酯(3-methacrylamidopropyl)单体的结构式如下：
图1中abcdefg分别与上述结构式中的碳氢键对应。
MEO-PEG2K与NHS-CPADN以摩尔比1：1.2混合于二氯甲烷溶液中反应，室温反应24h。在冰乙醚中沉淀，得到的沉淀重新溶于少量二氯甲烷，再沉淀于冰乙醚中，反复此步骤三次，最后真空干燥得到产物，即MEO-PEG2K-CPADN。
采用核磁共振检测产物，产物的核磁共振图谱图如图2所示，从图2中可以看出MEO-PEG2K-CPADN的结构式如下：
图2中abcd分别与上述结构式中的碳氢键对应。
叔丁基氨基甲酸酯(3-methacrylamidopropyl)单体，MEO-PEG-CPADN，引发剂AIBN(偶氮二异丁腈)在摩尔比为25：1：0.2在N,N-二甲基甲酰胺溶液中，于70℃聚合反应二十四小时生成MEO-PEG-Ptert-Butyl(3-methacrylamidopropyl)carbamate【MEO-PEG-P(叔丁基氨基甲酸酯(3-methacrylamidopropyl)】聚合物。然后把得到的纯净的该产物溶于二氯甲烷，并加入三氟乙酸搅拌一小时，最后于环己烷中沉淀提纯得到做终产物聚合物ⅠMEO-PEG2K-P(N-(3-aminopropyl)methacrylamide)3k。
采用核磁共振检测产物，产物的核磁共振图谱图如图3所示，从图3中可以看出聚合物Ⅰ
MEO-PEG2K-P(N-(3-aminopropyl)methacrylamide)3k的结构式如下：
图3中abcdef分别与上述结构式中的碳氢键对应。
制备ROS响应型siRNA纳米胶束：
聚合物Ⅰ和siRNA溶于10mmol/L HEPES缓冲溶液，吹打混匀后静置20分钟，制得聚合物Ⅰ@siRNA即：
MEO-PEG2K-P(N-(3-aminopropyl)methacrylamide)3k@siRNA。
将实施例1制备得到的聚合物Ⅰ@siRNA用于制备抑制肿瘤细胞增长和/或抑制肿瘤部位新生血管药物。
实施例2
本实施例提供一种ROS响应型siRNA纳米胶束，主要通过以下步骤制得：
制备聚合物Ⅱ：
在本实施例中，MEO-PEG2K-P(GUA)的制备方法请参阅实施例1。
合成单体GUA：取5.6mmol APMA·HCl(N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐酸盐)、5.6mmol Praxadine(吡唑脒)和12.3mmol三乙胺溶解于16mL DMF中，加入0.091mmol对苯酚(10mg，MW＝110.11)(抑制聚合)，在氮气保护环境下，室温反应24h。然后将上述反应液倒入到100mL乙醚中，上清去除，有机相沉淀留下，然后用乙腈(20mL)和三乙胺(1mL)分别洗涤两遍，最后再二氯甲烷(30mL)洗涤1遍，得到苍黄色产物即单体GUA真空干燥。
采用核磁共振检测产物，产物的核磁共振图谱图如图4所示，从图4中可以看出GUA的结构式如下：
图4中abcdef分别与上述结构式中的碳氢键对应。
摩尔比为25：1：0.2的GUA单体，MEO-PEG2K-CPADN，引发剂AIBN(偶氮二异丁腈)在N,N-二甲基甲酰胺溶液中，于70℃聚合反应二十四小时生成MEO-PEG2K-P(GUA)3K聚合物。然后通过透析和冷冻干燥等方法得到浅黄色终产物，即聚合物Ⅱ。
采用核磁共振检测产物，产物的核磁共振图谱图如图5所示，从图5中可以看出聚合物Ⅱ的结构式如下：
图5中abcdefg分别与上述结构式中的碳氢键对应，上述式中xy代表正整数，表示式中相应结构式的数量。
制备ROS响应型siRNA纳米胶束：
聚合物Ⅱ和siRNA溶于10mmol/L HEPES缓冲溶液，吹打混匀后静置20分钟，制得聚合物Ⅱ@siRNA即：
MEO-PEG2K-P(GUA)3K@siRNA。
将制备得到的聚合物Ⅱ@siRNA用于制备抑制肿瘤细胞增长和/或抑制肿瘤部位新生血管药物。
实施例3
本实施例提供一种ROS响应型siRNA纳米胶束，主要通过以下步骤制得：
制备聚合物Ⅲ：
在本实施例中，GUA单体的制备方法请参阅实施例2。
HB单体的制备：
4-(羟甲基)phenylboronic酸(0.1mol)和频哪醇(0.1mol)加入到含有新鲜分子筛的圆底烧瓶中，然后添加120mL甲苯，然后120℃反应24h直到反应溶液澄清，接着过滤并旋蒸溶剂得到白色粉末S1。把S1(50mmol)分散到无水二氯甲烷中，然后加入三乙胺(60mmol)，接着冰浴滴加甲基丙烯酰氯(60mmol)，室温反应24h，过滤。旋蒸溶液后用乙酸乙酯稀释，然后用盐水洗三次，MgSO4干燥过夜后浓缩，然后用石油醚/乙酸乙酯(体积比＝30/1)为展开剂过硅胶柱获得无色结晶，即HB单体。
采用核磁共振检测产物，产物的核磁共振图谱图如图6所示，从图6中可以看出产物HB单体的结构式如下：
图6中abcdefg分别与上述结构式中的碳氢键对应。
摩尔比为25：5：1：0.2的GUA单体，HB单体，MEO-PEG-CPADN，引发剂AIBN(偶氮二异丁腈)在N,N-二甲基甲酰胺溶液中，于70℃聚合反应二十四小时生成MEO-PEG2K-P(GUA3K,HB1K)聚合物。然后通过乙醚沉淀，透析和冷冻干燥等方法得到浅黄色终产物即聚合物Ⅲ。
采用核磁共振检测产物，产物的核磁共振图谱图如图7所示，从图7中可以看出产物聚合物Ⅲ的结构式如下：
上述结构式中xy为正整数，表示式中相应结构式的数量。
制备ROS响应型siRNA纳米胶束：
聚合物Ⅲ和siRNA溶于10mmol/L HEPES缓冲溶液，吹打混匀后静置30分钟，制得聚合物Ⅲ@siRNA即：
MEO-PEG2K-P(GUA3K,HB1K)@siRNA。
将制备得到的聚合物Ⅲ@siRNA用于制备抑制肿瘤细胞增长和/或抑制肿瘤部位新生血管药物。
实施例4
本实施例提供一种核酸纳米胶束主要通过以下步骤制得：
制备聚合物Ⅵ：
合成MAL-PEG3.4K-CPADN：MAL-PEG3.4K-NH2与NHS-CPADN以摩尔比1：1.2混合于二氯甲烷溶液中反应，室温反应24h。在冰乙醚中沉淀，得到的沉淀重新溶于少量二氯甲烷，再沉淀于冰乙醚中，反复此步骤三次，最后真空干燥得到MAL-PEG3.4K-CPADN。
合成ANG-PEG3.4K-CPADN：Angiopep-HS与MAL-PEG3.4K-CPADN以摩尔比3：1混合加入到氮气保护的PBS溶液中，室温反应过夜，用3.5K的透析袋在纯水里透析两天，冷冻干燥得到产物ANG-PEG3.4K-CPADNH。
摩尔比为25：1：0.2的GUA单体，ANG-PEG3.4K-CPADN，引发剂AIBN(偶氮二异丁腈)在N,N-二甲基甲酰胺溶液中，于70℃聚合反应二十四小时生成ANG-PEG3.4K-P(GUA)3K聚合物。然后通过透析和冷冻干燥等方法得到浅黄色产物聚合物Ⅵ。
聚合物Ⅵ的结构式如下：
制备ROS响应型siRNA纳米胶束：
在本实施例中，聚合物Ⅱ的制备方法请参阅实施例2。
以摩尔比1：4取聚合物Ⅵ和聚合物Ⅲ，混合后和siRNA溶于10mmol/L HEPES缓冲溶液，吹打混匀后静置30分钟，制得聚合物Ⅵ/聚合物Ⅲ@siRNA即：
ANG-PEG3.4K-P(GUA)3K/MEO-PEG2K-P(GUA3K,HB1K)@siRNA。
将制备得到的聚合物Ⅵ/聚合物Ⅲ@siRNA用于制备抑制肿瘤细胞增长和/或抑制肿瘤部位新生血管药物。
试验例1
比较聚合物Ⅰ、聚合物Ⅱ、聚合物Ⅲ与siRNA的结合能力。
聚合物@siRNA制备方法如下：
聚合物Ⅰ、聚合物Ⅱ、聚合物Ⅲ与siRNA分别溶于10mMol/L HEPES缓冲溶液中，按照聚合物中Gu+/NH3 +与PO3 4-不同摩尔比制备聚合物@siRNA纳米胶束(聚合物Ⅰ@siRNA纳米胶束、聚合物Ⅱ@siRNA纳米胶束、聚合物Ⅲ@siRNA纳米胶束)，并比较三种聚合物与siRNA的结合能力。采用琼脂糖凝胶电泳(电压35V)进行表征，表征结果如图8所示。
从图8可以看出：当摩尔比NH3 +:PO3 4-为3：1时聚合物Ⅰ(包含NH3 +)才能与siRNA完全结合；当摩尔比Gu+:PO3 4-为1：1时聚合物Ⅱ(包含Gu+)与siRNA完全结合；当摩尔比Gu+:PO3 4-为1.5：1时聚合物Ⅲ(包含Gu+)与siRNA完全结合。
通过动态光散射仪和投射电子显微镜检测Gu+/NH3 +:PO3 4-摩尔比为3：1时纳米胶束的粒径，粒径分布如图9所示。
从图9可以看出：当Gu+/NH3 +:PO3 4-摩尔比为3：1时，聚合物Ⅲ与siRNA形成的纳米胶束粒径最小。
试验例2
探究聚合物Ⅰ@siRNA纳米胶束、聚合物Ⅱ@siRNA纳米胶束、聚合物Ⅲ@siRNA纳米胶束稳定性。在Gu+/NH3 +:PO3 4-摩尔比为3：1时，聚合物Ⅰ、聚合物Ⅱ、聚合物Ⅲ与siRNA分别溶于10mMol/L HEPES缓冲溶液中，按照聚合物中Gu+/NH3 +:PO3 4-摩尔比3：1制备聚合物@siRNA纳米胶束，静置30分钟后，向纳米胶束溶液里加入不同浓度heparin(肝素钠)，1小时后通过琼脂糖凝胶电泳方法检测siRNA的释放量。检测结果如图10所示。
从图10可以看出：在Gu+/NH3 +:PO3 4-摩尔比为3：1时，纳米胶束稳定性顺序为聚合物Ⅲ@siRNA>聚合物Ⅱ@siRNA>聚合物Ⅰ@siRNA。
试验例3
聚合物Ⅱ@siRNA纳米胶束、聚合物Ⅲ@siRNA纳米胶束的ROS响应效果
聚合物Ⅱ、聚合物Ⅲ与siRNA分别溶于10mmol/L HEPES缓冲溶液中，按照聚合物中Gu+:PO3 4-摩尔比1.5：1制备得到聚合物Ⅱ@siRNA纳米胶束、聚合物Ⅲ@siRNA纳米胶束；24小时后通过琼脂糖凝胶电泳方法检测siRNA的释放量。释放如图11所示。
从图11可以看出：聚合物Ⅲ对H2O2(双氧水)敏感，主要原因为聚合物Ⅲ中含有单体HB。在H2O2作用下，HB化学键断裂，导致HB中的疏水基团从聚合物Ⅲ中丢失，并且暴露出羧基。羧基会与siRNA竞争Gu+，最终导致部分siRNA被迫释放。
试验例4
细胞水平表征ROS响应型siRNA纳米胶束的作用效果
取聚合物Ⅵ和聚合物Ⅲ的混合物与siRNA分别溶于10mmol/L HEPES缓冲溶液中制备得到聚合物Ⅵ/聚合物Ⅲ@siRNA(命名为ANG-GHNP@siRNA)，聚合物Ⅵ和聚合物Ⅲ的混合物中聚合物Ⅵ的摩尔比例为20％。取聚合物Ⅲ与siRNA分别溶于10mmol/L HEPES缓冲溶液中制备得到聚合物Ⅲ@siRNA(命名为GHNP@siRNA)。
把siRNA,ANG-GHNP@siRNA与GHNP@siRNA两种纳米胶束分别与U87-MG细胞孵育，4小时后洗掉多余的纳米胶束，进行共聚焦成像或者用胰酶消化细胞进行流式细胞分析。siRNA类型：Cy5-siScr(Cy5标记的非功能性siRNA)。
流式细胞分析检测结果如图12所示；共聚焦显微镜结果如图13所示。
从图12、图13可以看出：ANG-GHNP@siRNA被U87-MG细胞摄入的量是GHNP@siRNA的3.5倍。
通过MTT(噻唑蓝比色法)检测ANG-GHNP@siRNA和GHNP@siRNA，在siRNA(siRNA类型为siScr即非功能性siRNA)浓度分别为200nM，400nM和800nM时的细胞毒性，检测结果如图14所示结果，从图14中可以看出：ANG-GHNP@siRNA和GHNP@siRNA基本无毒性。
采用U87-MG-LUC细胞比较ANG-GHNP@siRNA和聚合物Ⅲ@siRNA在siRNA浓度为200nM时的转染效果。
结果如图15所示；从图15中可以看出：与siScr(非功能性siRNA)相比，siGL3(荧光素敲除siRNA)表现出明显的转染效果，并且ANG-GHNP@siGL3转染效果是GHNP@siRNA转染效果的3倍。
在mRNA水平，通过荧光定量RT-PCR比较ANG-GHNP@siPLK1及GHNP@siPLK1在siRNA浓度为200nM时的转染效果。结果如图16所示；从图16中可以看出：ANG-GHNP@siPLK1转染效果是GHNP@siPLK1转染效果的2-3倍。PLK1代表肿瘤原癌基因。
在蛋白水平，通过western-blot比较ANG-GHNP@siPLK1及GHNP@siPLK1在siRNA浓度为200nM时的转染效果。结果如图17所示；从图17中可以看出：ANG-GHNP@siPLK1转染效果是GHNP@siPLK1转染效果的1-2倍。
综上，聚合物@siRNA(聚合物选自聚合物Ⅰ、聚合物Ⅱ、聚合物Ⅲ或者聚合物Ⅵ中的至少一种)能够建立稳定siRNA纳米药物，没有细胞毒性并具有有效的siRNA现场释放能力。可以用于制备抑制肿瘤细胞增长和/或抑制肿瘤部位新生血管药物中。
以上仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种聚合物的制备方法，其特征在于，所述聚合物的制备方法主要包括以下步骤：
MEO-PEG2K-CPADN与tert-butyl(3-methacrylamidopropyl)carbamate聚合得到聚合物Ⅰ；或者
MEO-PEG2K-CPADN与GUA聚合得到聚合物Ⅱ；或者
MEO-PEG2K-CPADN与GUA、HB单体聚合得到聚合物Ⅲ；或者
GUA单体与ANG-PEG3.4K-CPADN聚合得到聚合物Ⅵ。
2.根据权利要求1所述的聚合物的制备方法，其特征在于，
所述ANG-PEG3.4K-CPADN通过Angiopep-HS与MAL-PEG3.4K-CPADN聚合得到；
可选地，所述MAL-PEG3.4K-CPADN通过MAL-PEG3.4K-NH2与NHS-CPADN反应得到。
3.根据权利要求2所述的聚合物的制备方法，其特征在于，
所述MAL-PEG3.4K-CPADN通过以下步骤制得：摩尔比为1：1.2-1.5的所述MAL-PEG3.4K-NH2与所述NHS-CPADN于二氯甲烷溶液中反应制得；
所述ANG-PEG3.4K-CPADN通过以下步骤制得：摩尔比为1：3-4的所述MAL-PEG3.4K-CPADN与所述Angiopep-HS于氮气保护的PBS溶液中反应制得。
4.根据权利要求1所述的聚合物的制备方法，其特征在于，
所述聚合物Ⅰ通过以下步骤制得：摩尔比为1：22-26的所述MEO-PEG2K-CPADN与所述tert-butyl(3-methacrylamidopropyl)carbamate在引发剂偶氮二异丁腈作用下聚合。
5.根据权利要求1所述的聚合物的制备方法，其特征在于，
所述聚合物Ⅱ通过以下步骤制得：摩尔比为1：22-26的所述MEO-PEG2K-CPADN与所述GUA在引发剂偶氮二异丁腈作用下聚合。
6.根据权利要求1所述的聚合物的制备方法，其特征在于，
所述聚合物Ⅲ通过以下步骤制得：摩尔比为1：22-26：4-5的所述MEO-PEG2K-CPADN与所述GUA、所述HB单体在引发剂偶氮二异丁腈作用下聚合；
所述聚合物Ⅵ通过以下步骤制得：摩尔比为1：22-26的所述ANG-PEG3.4K-CPADN与所述GUA单体在引发剂偶氮二异丁腈作用下聚合。
7.一种聚合物，其特征在于，所述聚合物由权利要求1-6任一项所述的聚合物的制备方法制得。
8.一种ROS响应型siRNA纳米胶束，其特征在于，所述ROS响应型siRNA纳米胶束包括聚合物和siRNA；
所述聚合物选自权利要求7的所述聚合物Ⅰ、所述聚合物Ⅱ、所述聚合物Ⅲ或者所述聚合物Ⅵ中的至少一种；
可选地，所述聚合物包括摩尔比为1:3.8-4.2的所述聚合物Ⅲ和所述聚合物Ⅵ；
可选地，所述siRNA选用siPLK1或者siVEGFR2。
9.根据权利要求8所述的ROS响应型siRNA纳米胶束，其特征在于，所述ROS响应型siRNA纳米胶束主要通过以下步骤制得：
将所述聚合物和所述siRNA分别溶于10mMol/L HEPES缓冲溶液，吹打混匀后静置20-40分钟。
10.权利要求8或9所述的ROS响应型siRNA纳米胶束在制备抑制肿瘤细胞增长和/或抑制肿瘤部位新生血管药物中的应用。
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