CN103254442A

CN103254442A - 二硫键键接的聚酯梳型接枝共聚物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103254442A
Application number: CN2013101568915A
Authority: CN
Inventors: 林道舒; 董岸杰; 邓联东; 张建华
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2013-04-28
Filing date: 2013-04-28
Publication date: 2013-08-21
Anticipated expiration: 2033-04-28
Also published as: CN103254442B

Abstract

本发明是二硫键键接的聚酯梳型接枝共聚物及其制备方法和应用，由可降解聚酯或聚乙二醇嵌段聚酯为主链、阳离子聚合物为侧链通过二硫键键接到主链组成，主链聚酯为内酯、交酯的均聚物或它们的共聚物，侧链为(甲基)丙烯酸羟乙酯与N,N-取代的（甲基）丙烯酸酯的共聚物，侧链和主链通过可被谷胱甘肽还原的二硫键键接；另一种主链为单甲氧基聚乙二醇引发的内酯、交酯的均聚物或它们的共聚物，侧链为(甲基)丙烯酸羟乙酯与N,N-N,N-取代的（甲基）丙烯酸酯的共聚物，侧链和主链之间通过可被谷胱甘肽还原的二硫键键接。共聚物可作为疏水药物的纳米、微米载体，作为基因、RNA载体，用于药物制剂、细胞转染试剂、检测试剂和免疫制剂中。

Description

二硫键键接的聚酯梳型接枝共聚物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种两亲性生物降解聚酯梳型接枝共聚物，具体是可生物降解二硫键键接的聚酯梳型接枝共聚物和制备方法及其作为基因载体的应用。

背景技术

聚合物自组装纳米粒是由带有亲水嵌段(如PEG)和疏水嵌段形成的两亲性共聚物在水中自发形成的具有疏水内核、亲水外壳结构的纳米粒，组装过程类似于表面活性剂胶束化，因此，也称为聚合物自组装胶束。但不同于表面活性剂胶束的是嵌段共聚物的两个嵌段的分子量较大(几千～几万)，具有极低的临界胶束浓度(CMC)，且核内疏水嵌段相互缠结并处于动力学冻结状态，而水溶性的PEG伸向水中形成的亲水保护层有较大的空间阻力，避免粒子间的聚并，所以聚合物胶束在水中稳定存在且稀释时不会解体。而带有离子型嵌段的全亲水嵌段共聚物与带相反电荷物质(基因、多肽等)通过静电复合作用也可以自组装成胶束型纳米粒。

两亲性聚合物自组装胶束型纳米粒自20世纪末开始被用于包裹疏水性药物和基因药物，为解决疏水性药物溶解性、基因药物体内易被水解的药剂学难题提供了有效的手段，大大提高了两类药物的生物利用度，引起了广泛的关注。尤其是以PEG为亲水段的嵌段共聚物，作为难溶药物和基因纳米载体，具有防止蛋白质吸附、逃避网状内皮系统和巨噬细胞吞噬的性能，可以携带药物较长时间在体内循环，大大延长了药物的半衰期，降低了毒副作用，提高了疗效，呈现出很好的应用前景。因此，两亲性可降解聚合物具有多方面的应用领域，发展前景较好。

为了提高两亲性聚合物自组装胶束型纳米粒对细胞的转染效率，针对细胞的特点，如内涵体的酸性环境、细胞内谷胱甘肽浓度高等，一些刺激响应性聚合物自组装胶束型纳米粒被研究出，引起了广泛的研究兴趣。其中细胞内高浓度的谷胱甘肽可氧化还原二硫键，使其断裂，具有良好的应用前景。

本发明提供了一类新型的具有良好生物相容性、可生物降解、可响应细胞内谷胱甘肽氧化还原的多功能性两亲性聚酯梳型接枝共聚物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有良好生物相容性、可生物降解性的多功能两亲性共聚物，是可降解聚酯梳型接枝共聚物，这类两亲性共聚物可以包载疏水性药物形成药物纳米制剂，也可以作为基因的载体用于基因的负载和传递，还可以同时负载疏水性药物和基因，由于侧链通过二硫键键接到主链，可响应细胞内的高谷胱甘肽浓度而发生断裂，同时依据接枝侧链的性质，还具有温度敏感性、pH敏感性，可用于智能型给药体系。

本发明中的“可生物降解聚酯”，指内酯、交酯或它们的混合物的共聚物，本发明中的“阳离子聚合物”指具有温敏性的阳离子单体的均聚物或其同其他柔性单体的共聚物。本发明中的“聚乙二醇（PEG）”指带有聚乙二醇链单元的聚合物。

所述的可生物降解二硫键键接的聚酯梳型接枝共聚物，是如式（I）和（II）所示的共聚物，PEG指带有聚乙二醇链单元的聚合物，A为可生物降解聚酯的结构单元，(B_m-co-D_n)为侧链，单体B是N,N-取代的丙烯酸酯类单体；单体D是非阳离子型、非聚乙二醇类的烯类单体或它们的混合物：

所述的可生物降解聚酯梳型接枝共聚物，其特征在于主链聚酯的聚合度为3～200，PEG的数均相对分子质量为600～10000；侧链(B_m-co-D_n)是两种烯类单体B和D的共聚物，m为58～175，n为8～79。

所述的共聚物是以含侧链巯基的聚酯梳型大分子或含侧链巯基的PEG嵌段的聚酯梳型大分子为引发剂，通过二硫键交换反应接上聚合物侧链而制备的。

所述的大分子引发剂是1,4,8-三氧杂螺[4.6]-9-十一烷酮（TOSUO）与己内酯,或其与丙交酯,或其与乙交酯，或其与丙交酯和乙交酯，或其与丙交酯和己内酯的共聚物；脱掉乙二醇保护基团；将醛基还原成羟基；羟基同胱胺二盐酸盐反应；用二硫苏糖醇还原得到巯基而制得聚酯的大分子引发剂；

或以单羟基聚乙二醇引发1,4,8-三氧杂螺[4.6]-9-十一烷酮（TOSUO）与己内酯共聚，或与丙交酯共聚，或与乙交酯共聚，或与丙交酯和乙交酯共聚，或与丙交酯和己内酯共聚，经过一系列反应，形成含侧链巯基的聚乙二醇—聚酯的大分子引发剂。

1,4,8-三氧杂螺[4.6]-9-十一烷酮（1,4,8-Trioxaspiro[4.6]-9-undecanone，简写TOSUO），结构如下：

所述的聚合物侧链，是以N-咔唑二硫代甲酸异丁腈酯(CYCBD)为可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)的引发剂引发烯类单体B和D的共聚；再加入少量α-甲基丙烯酸，以羧基封端；与半胱氨酸盐酸盐在二硫苏糖醇存在的条件下反应，接上巯基；同2,2'-二硫二吡啶进行二硫键交换反应，最后得到2-吡啶二巯基封端的聚合物侧链。

N-咔唑二硫代甲酸异丁腈酯(2-cyanoprop-2-yl N-carbazolylcarbodithioate,简写CYCBD)，结构式如下：

所述的两亲性阳离子梳型接枝共聚物，其特征在于接枝的阳离子聚合物侧链通过可被谷胱甘肽（GSH）等还原的二硫键键接到主链上。

所述的两亲性阳离子梳型接枝共聚物，其特征在于所述的单体B为亲水性单体甲基丙烯酸-2-(N,N-二甲氨基)乙酯。

所述的两亲性阳离子梳型接枝共聚物，其特征是所述的单体D为：亲水性单体，选自丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟乙酯；或疏水性单体，选自甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸叔丁酯。

所述的两亲性阳离子梳型接枝共聚物，其特征是所述的聚乙二醇选自聚乙二醇单甲醚。

所述的带二硫键的两亲性聚酯—聚阳离子梳型接枝共聚物的制备方法，具体是：

（1）反应器中加入1,4,8-三氧杂螺[4.6]-9-十一烷酮（1,4,8-Trioxaspiro[4.6]-9-undecanone，TOSUO）或其它共聚的内酯、交酯以及异丙醇铝，进行开环聚合，反应终止后提纯，得到侧链带环醚基团的均聚物或共聚物PT1；

（2）反应器中加入PT1和三苯基四氟硼酸碳，以二氯甲烷为溶剂，室温反应，脱去环醚基团，反应终止后提纯，得到侧链带羰基的均聚物或共聚物PT2；

（3）反应器中加入PT2和硼氢化钠，二氯甲烷/甲醇作为混合溶剂，室温反应，将羰基还原为羟基，反应终止后提纯，得到侧链带羟基的均聚物或共聚物PT3；

（4）反应器中加入PT3和对硝基苯基氯甲酸酯，以二氯甲烷为溶剂，吡啶作为催化剂，进行羟基的活化，反应终止后提纯，得到侧链带活化羟基的均聚物或共聚物PT4;

（5）反应器中加入PT4和胱胺二盐酸盐，以二甲基亚砜为溶剂，三乙胺作为缚酸剂，反应终止后提纯，得到侧链键接二硫键的均聚物或共聚物PT5；

（6）反应器中加入PT5和二硫苏糖醇，以二甲基亚砜为溶剂，断开二硫键，反应终止后提纯，得到含侧链巯基的聚酯梳型大分子引发剂PI；

（7）反应器中加入引发剂CYCBD和催化剂偶氮二异丁腈(AIBN)、单体B和D，以四氢呋喃为溶剂，至少反复三次抽真空、充氮气，封管；然后在搅拌下于30～90℃恒温水浴中反应8～24h；待反应结束后，打开反应器，迅速加入α-甲基丙烯酸和催化剂AIBN，加入四氢呋喃，反复三次抽真空、充氮气，封管，在搅拌下于30～90℃恒温水浴中反应8～24h；待反应结束后，加入四氢呋喃，溶解聚合物，用透析袋在水中透析去除催化剂和未反应单体，冷冻干燥，得到羧基封端的均聚物或共聚物SC1；

（8）反应器中加入S1，半胱胺盐酸盐，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)为催化剂，水为溶剂，在二硫苏糖醇存在的条件下反应，反应终止后提纯，得到巯基封端的均聚物或共聚物SC2；

（9）反应器中加入S2和2,2'-二硫二吡啶，以水为溶剂，进行二硫键的交换反应，反应终止后提纯，得到2-吡啶二巯基封端的聚合物侧链SI；

（10）反应器中加入大分子引发剂PI和2-吡啶二巯基封端的聚合物侧链SI，以四氢呋喃为溶剂，进行二硫键的交换反应，反应终止后提纯，得到两亲性梳型接枝共聚物。

所述的带二硫键的两亲性聚乙二醇-聚酯-阳离子梳型接枝共聚物的制备方法，具体是：

（1）反应器中加入单羟基聚乙二醇为引发剂，1,4,8-三氧杂螺[4.6]-9-十一烷酮（TOSUO）或其它共聚的内酯、交酯以及异丙醇铝，进行开环聚合，反应终止后提纯，得到侧链带环醚基团的嵌段聚合物PET1；

（2）反应器中加入PET1和三苯基四氟硼酸碳，以二氯甲烷为溶剂，室温反应，脱去环醚基团，反应终止后提纯，得到侧链带羰基的嵌段聚合物PET2；

（3）反应器中加入PET2和硼氢化钠，二氯甲烷/甲醇作为混合溶剂，室温反应，将羰基还原为羟基，反应终止后提纯，得到侧链带羟基的嵌段聚合物PET3；

（4）反应器中加入PET3和对硝基苯基氯甲酸酯，以二氯甲烷为溶剂，吡啶作为催化剂，进行羟基的活化，反应终止后提纯，得到侧链带活化羟基的嵌段聚合物PET4;

（5）反应器中加入PET4和胱胺二盐酸盐，以二甲基亚砜为溶剂，三乙胺作为缚酸剂，反应终止后提纯，得到侧链键接二硫键的嵌段聚合物PET5；

（6）反应器中加入PET5和二硫苏糖醇，以二甲基亚砜为溶剂，断开二硫键，反应终止后提纯，得到含侧链巯基的嵌段聚合物PII；

（10）反应器中加入PEI和2-吡啶二巯基封端的聚合物侧链SI，以四氢呋喃为溶剂，进行二硫键的交换反应，反应终止后提纯，冷冻干燥，得到两亲性梳型接枝共聚物；

所述的二硫键键接的聚酯梳型接枝共聚物，其特征在于：聚合物可以在水中自组装形成纳米粒，纳米粒内核疏水，外壳亲水且具有阳离子特征，可用于制备疏水性药物纳米粒，或与DNA、RNA以及多肽、蛋白类生物大分子复合形成纳米粒，也可以同时负载疏水性药物和DNA或多肽、蛋白，用于药物制剂、基因传递和转染试剂、检测和免疫制剂。由于侧链通过二硫键键接到主链，可响应细胞内的高谷胱甘肽浓度而发生断裂，具备智能响应的特点。

本发明中，所述的二硫键键接的聚酯梳型接枝共聚物还具有温度敏感、pH敏感性，纳米粒的粒径和药物释放性质对温度和pH有较大的依赖性，可用于生物体内环境敏感性药物释放体系。所述嵌段共聚物的载药、载药/DNA或未载药/DNA纳米粒的冻干粉具有可再分散性，粒径小于1000nm。

附图说明

图1是二硫键键接的聚酯梳形大分子引发剂PI-1-1的分子结构示意图及核磁共振谱图，图中出现了分子结构中存在的各种氢质子的核磁共振峰，证明了所制备的产物的结构组成PI-1-1为PCL₇₀-g-SH₅。

图2是二硫键键接的聚乙二醇—聚酯梳形大分子引发剂PII-1-2-1的分子结构示意图及核磁共振谱图，图中出现了分子结构中存在的各种氢质子的核磁共振峰，证明了所制备的产物的结构组成PII-1-1为mPEG₄₅-PCL₇₁-g-SH₅。

图3是实施例5中两亲性梳型接枝阳离子共聚物PCL-g-SS-PDMAEMA的分子结构示意图及核磁共振谱图，图中出现了分子结构中存在的各种氢质子的核磁共振峰，证明了所制备的产物的结构组成为PCL₇₀-g-SS-(PDMAEMA₃₀)₅。

图4是实施例6中两亲性梳型接枝阳离子共聚物mPEG-PCL-g-SS-PDMAEMA的分子结构示意图及核磁共振谱图，图中出现了分子结构中存在的各种氢质子的核磁共振峰，证明了所制备的产物的结构组成为mPEG₄₅-PCL₇₁-g-SS-(PDMAEMA₂₃)₅。

图5a是实施例23中mPEG-PCL-g-SS-PDMAEMA/siRNA复合物在不N/P比的粒径;

图5b是zeta电位图。其中L1代表mPEG₄₅-PCL₇₁-g-SS-(PDMAEMA₂₃)₅，L2代表mPEG₄₅-PCL₇₁-g-SS-(PDMAEMA₃₀)₅。

图6是实施例23中mPEG₄₅-PCL₇₁-g-SS-(PDMAEMA₃₀)₅/siRNA复合物在N/P=20时的透射电镜图。

图7是实施例24中mPEG-PCL-g-SS-PDMAEMA/siRNA复合物的凝胶电泳图。其中L1代表mPEG₄₅-PCL₇₁-g-SS-(PDMAEMA₂₃)₅，L2代表mPEG₄₅-PCL₇₁-g-SS-(PDMAEMA₃₀)₅。在N/P大于5时，聚合物对siRNA具有较好的负载能力。

图8是实施例25中mPEG-PCL-g-SS-PDMAEMA/siRNA复合物的细胞毒性。其中L1代表mPEG₄₅-PCL₇₁-g-SS-(PDMAEMA₂₃)₅，L2代表mPEG₄₅-PCL₇₁-g-SS-(PDMAEMA₃₀)₅。载体并未表现出明显细胞毒性。

图9是实施例26中mPEG-PCL-g-SS-PDMAEMA/siRNA复合物对特异表达luciferase的HeLa细胞中luciferase生长的抑制。其中L1代表mPEG₄₅-PCL₇₁-g-SS-(PDMAEMA₂₃)₅，L2代表mPEG₄₅-PCL₇₁-g-SS-(PDMAEMA₃₀)₅。聚合物对luciferase表达表现出抑制效果，说明载体递送siRNA的能力强。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

所采用的聚酯是聚己内酯、聚乙交酯、聚丙交酯、聚乙交酯和丙交酯混合物或聚己内酯和乙交酯混合物，主链聚酯的聚合度为3～200。

所采用的两亲性阳离子梳型接枝共聚物，在于接枝的阳离子聚合物侧链通过可被谷胱甘肽（GSH）等还原的二硫键键接到主链上。

所采用的单体B为亲水性单体甲基丙烯酸-2-(N,N-二甲氨基)乙酯，单体B聚合物为58～175。

所采用的单体D为：亲水性单体，选自丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟乙酯；或疏水性单体，选自甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸叔丁酯，单体D聚合度为8～79。

所采用的聚乙二醇选自聚乙二醇单甲醚。

本发明是以含侧链巯基的聚酯梳型大分子为引发剂，通过二硫键交换反应接上聚合物侧链而制备的。所述的大分子引发剂是1,4,8-三氧杂螺[4.6]-9-十一烷酮（TOSUO）与己内酯,或其与丙交酯,或其与乙交酯，或其与丙交酯和乙交酯，或其与丙交酯和己内酯的共聚物；脱掉乙二醇保护基团；将醛基还原成羟基；羟基同胱胺二盐酸盐反应；用二硫苏糖醇还原得到巯基而制得。所述的聚合物侧链，是以N-咔唑二硫代甲酸异丁腈酯(CYCBD)为可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)的引发剂，引发烯类单体B和D的共聚；再加入少量α-甲基丙烯酸，以羧基封端；与半胱氨酸盐酸盐在二硫苏糖醇存在的条件下反应，接上巯基；同2,2'-二硫二吡啶进行二硫键交换反应，最后得到2-吡啶二巯基封端的聚合物侧链。

带二硫键的两亲性阳离子梳型接枝共聚物的制备方法，以单羟基聚乙二醇引发1,4,8-三氧杂螺[4.6]-9-十一烷酮（TOSUO）与己内酯共聚，或与丙交酯共聚，或与乙交酯共聚，或与丙交酯和乙交酯共聚，或与丙交酯和己内酯共聚，经过一系列反应，形成含侧链巯基的聚乙二醇—聚酯的大分子引发剂，通过二硫键交换反应接上聚合物侧链而制备的。

本发明用于制备疏水性药物、基因、RNA、多肽、蛋白类药物的纳、微米粒，用于药物制剂、基因递送、细胞转染、检测和免疫制剂。

实施例1：

以己内酯（CL）为疏水段，甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（DMAEMA）为阳离子单体，制备带二硫键的两亲性聚酯—聚阳离子梳型接枝共聚物。

(1)二硫键键接的聚酯梳形大分子引发剂（PI）制备：

①向Schlenk管中加入苯甲醇（1g，9.25mmol），TOSUO（6.36g，37mmol），共聚单体己内酯（73.8g,647mmol），辛酸亚锡（1g,2.5mmol），140℃下反应12h。反应结束后，用四氢呋喃溶解聚合物，将聚合物倒入0℃的正庚烷中沉淀，放入冰箱中，过夜，抽滤，干燥，得到聚酯大分子PCL₇₀-co-TOSUO₄（PT1）；

②反应器中加入PT1（70g,32mmol TOSUO基团）和三苯基四氟硼酸碳（10.5g,32mmol），以二氯甲烷(200mL)为溶剂，室温反应24h，脱去环醚基团，将聚合物倒入0℃的正庚烷中沉淀，放入冰箱中，过夜，抽滤，干燥，得到侧链带羰基的共聚物PCL₇₀-co-Ketone₄(PT2)；

③反应器中加入PT2(60g,28mmol羰基)和硼氢化钠(1.28g,33.6mmol)，二氯甲烷/甲醇(v:v=5:2,200mL)作为混合溶剂，室温反应0.5h，将羰基还原为羟基，将聚合物倒入0℃的正庚烷中沉淀，放入冰箱中，过夜，抽滤，干燥，得到侧链带羟基的共聚物PCL₇₀-co-Hydroxyl₄(PT3)；

④反应器中加入PT3(55g,32mmol羟基)和对硝基苯基氯甲酸酯(25.8g,128mmol)，以二氯甲烷(150mL)为溶剂，吡啶(4g,12.6mmol)作为附酸剂，进行羟基的活化，室温反应24h，将聚合物倒入0℃的正庚烷中沉淀，放入冰箱中，过夜，抽滤，干燥，得到侧链带活化羟基的共聚物PCL₇₀-co-pNPC₅(PT4);

⑤反应器中加入PT4(55g,29mmol p-NPC活化的羟基)和胱胺二盐酸盐(13.2g,58mmol)，以二甲基亚砜(100mL)为溶剂，三乙胺(5.9g)作为缚酸剂，室温反应24h，将聚合物倒入0℃的正庚烷中沉淀，放入冰箱中，过夜，抽滤，干燥，得到侧链键接二硫键的共聚物PT5；

⑥反应器中加入PT5(55g,30.8mmol二硫键)和二硫苏糖醇(10g，64.8mmol)，以二甲基亚砜(100mL)为溶剂，断开二硫键，室温反应48h，透析48h(透析袋Mw:8000-14000)，冷冻干燥，得到带侧链巯基的均聚物大分子引发剂PI-1-1:PCL₇₀-co-SH₅。

按实施例1步骤（1）方法，改变共聚单体的种类与用量及TOSUO的用量，可以得到不同侧链巯基的聚酯梳形大分子引发剂，如表1。

表1侧链巯基的聚酯梳形大分子引发剂PI

表中：引发剂苯甲醇用量均为1mmol；催化剂辛酸亚锡用摩尔量为所用总单体量的1/100；CL:己内酯;LA:丙交酯;GA:乙交酯，PLGA：丙交酯/乙交酯(50/50)。

(2)带二硫键的两亲性聚酯—聚阳离子梳型接枝共聚物(PI-g-SS-PD)制备

①在Schlenk管反应器中按化学计量比加入CYCBD(0.124g,0.4mmol)、AIBN(0.020g,0.10mmol)、甲基丙烯酸-N,N-二甲胺基乙酯(DMAEMA,1.572g,12mmol),以2mL四氢呋喃为溶剂，抽真空通氮气三次，然后搅拌下于60℃恒温水浴中反应24h。待反应结束后，打开反应器，迅速加入α-甲基丙烯酸(MAA，0.052g,0.6mmol),抽真空通氮气三次，搅拌下于60℃恒温水浴中反应12h。反应结束后，加入四氢呋喃溶解聚合物，用透析袋(Mw:3500)水中透析去除催化剂，冷冻干燥，得到羧基封端的PDMAEMA₃₀-COOH。

②反应器中加入PDMAEMA₃₀-COOH(1.534g,0.3mmol)、半胱胺盐酸盐(0.136g,1.20mmol)、EDC(0.116g,0.60mmol)、NHS(0.070g,0.60mmol)、DTT(0.186g,1.20mmol)，以30mL水为溶剂，反应24h，用透析袋(Mw:3500)水中透析去除催化剂，冷冻干燥，得到巯基封端的PDMAEMA₃₀-SH；

③反应器中加入PDMAEMA₃₀-SH(1.034g,0.2mmol)和2,2'-二硫二吡啶(0.088g,0.4mmol)，以30mL水为溶剂，用盐酸将pH调节至1.5,室温下反应48h，反应结束后用透析袋(Mw:3500)水中透析去除未反应单体，冷冻干燥，得到2-吡啶二巯基封端的聚合物PDMAEMA₃₀-SS-pyridine。

④反应器中加入PI-1-1(0.272g,0.03mmol)、PDMAEMA-SS-pyridine(1.056g,0.2mmol),以15ml四氢呋喃为溶剂，用盐酸将pH调节到2，室温下反应48h，反应结束后用透析袋(Mw:8000-14000)水中透析，冷冻干燥，得到实施例1，即两亲性梳型接枝共聚物PCL₇₀-g-(SS-PDMAEMA₃₀)₅。

通过核磁共振表征聚合物结构并计算相对分子质量，核磁谱图示例如图1，所制备的梳形接枝共聚物如表2所示。图2的核磁共振谱图可以证明梳型接枝共聚物的结构并可以计算出聚合物的相对分子质量。

实施例2～13：

按照实施例1步骤（2）方法，选择侧链巯基的聚酯梳形大分子引发剂，改变PI、DMAEMA、的用量，可制备如表2所示的不同结构组成的PI-g-SS-PDMAEMA两亲性梳型接枝共聚物。

表2PI-g-SS-PDMAEMA两亲性梳型接枝共聚物

表中：PI为表1中的聚乙二醇嵌段聚酯大分子引发剂；CYCBD用量均为0.1mmol；AIBN用量为总单体摩尔量的1/100；MAA用量均为1.5mmol；溶剂四氢呋喃用量为总单体质量的两倍；半胱氨酸盐酸盐用量均为0.4mmol；EDC用量均为0.2mmol；NHS用量均为0.2mmol；

DTT用量均为0.4mmol；2,2'-二硫二吡啶用量均为0.2mmol。

实施例14～28：

按照实施例1步骤（2）方法，选择侧链巯基的聚酯梳形大分子引发剂，改变PI、DMAEMA的用量、共聚单体的种类和用量，可制备如表3所示的不同结构组成的PI-g-SS-(PDMAEMA-co-其他单体)两亲性梳型接枝共聚物。

表3PI-g-SS-(PDMAEMA-co-其他单体)两亲性梳型接枝共聚物

表中：PI为表1中的聚乙二醇嵌段聚酯大分子引发剂；CYCBD用量均为0.1mmol；AIBN用量为总单体摩尔量的1/100；MAA用量均为1.5mmol；溶剂四氢呋喃用量为总单体质量的两倍；半胱氨酸盐酸盐用量均为0.4mmol；EDC用量均为0.2mmol；NHS用量均为0.2mmol；DTT用量均为0.4mmol；2,2'-二硫二吡啶用量均为0.2mmol。HEMA：甲基丙烯酸羟乙酯，tBMA：甲基丙烯酸叔丁酯；HEA：丙烯酸羟乙酯；MMA：甲基丙烯酸甲酯。

按实施例1步骤（1）方法，改变引发剂的种类及用量、共聚单体的种类与用量及TOSUO的用量，可以得到不同侧链巯基的聚乙二醇—聚酯梳形大分子引发剂，如表4。

表4侧链巯基的聚乙二醇—聚酯梳形大分子引发剂PII

表中：mPEG用量均为1mmol；催化剂辛酸亚锡用摩尔量为所用总单体量的1/100；CL:己内酯;LA:丙交酯;GA:乙交酯，PLGA：丙交酯/乙交酯(50/50)。

实施例29～43：

按照实施例1步骤（2）方法，选择侧链巯基的聚乙二醇—聚酯梳形大分子引发剂，改变PII、DMAEMA的用量，可制备如表5所示的不同结构组成的PII-g-SS-PDMAEMA两亲性梳型接枝共聚物。

表5PII-g-SS-PDMAEMA两亲性梳型接枝共聚物

表中：PII为表2中的聚乙二醇嵌段聚酯大分子引发剂；CYCBD用量均为0.1mmol；AIBN用量为总单体摩尔量的1/100；MAA用量均为1.5mmol；溶剂四氢呋喃用量为总单体质量的两倍；半胱氨酸盐酸盐用量均为0.4mmol；EDC用量均为0.2mmol；NHS用量均为0.2mmol；

DTT用量均为0.4mmol；2,2'-二硫二吡啶用量均为0.2mmol。

实施例44～58：

按照实施例1步骤（2）方法，选择侧链巯基的聚乙二醇—聚酯梳形大分子引发剂，改变PII、DMAEMA的用量、共聚单体的种类和用量，可制备如表6所示的不同结构组成的PII-g-SS-(PDMAEMA-co-其他单体)两亲性梳型接枝共聚物。

表6PII-g-SS-(PDMAEMA-co-其他单体)两亲性梳型接枝共聚物

实施例59

将mPEG-PCL-g-SS-PDMAEMA、siRNA分别用PBS(pH=7.4)溶解稀释（约1μg/100μL），按照N/P比（聚合物中的氮与siRNA中的磷原子含量的摩尔比）为5/1、10/1、15/1、20/1、25/1、30/1的比例，将聚合物的稀释液逐滴加入到siRNA的稀释液中，边加边振荡，使之充分混匀，形成复合物，室温放置20min。光散射仪测定复合物的粒径，Zeta电位仪测定复合物的zeta电位，见图5。透射电镜观测复合物的形貌，见图6。

实施例60

将20μL mPEG-PCL-g-SS-PDMAEMA/siRNA复合物溶液(N/P为0.5-10)与4μL上样缓冲液充分混合后加入到1%琼脂糖(含0.5μg/mL溴化乙锭)凝胶中。电泳缓冲液为1×TAE,电压为120V，电泳时间为40min，然后在紫外下观察siRNA电泳图谱并照相，见图7。

实施例61

MTT法对复合物的细胞毒性进行了检测，具体方法如下：在96孔板中接种1×104个HeLa细胞/孔；加入50μL含0.2μg NC-siRNA的mPEG-PCL-g-SS-PDMAEMA/siRNA的复合物溶液，同时设置调零孔(培养液、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同体积的复合物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，37°C孵育48h。每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，继续5%CO2，37°C孵育4h。小心弃去孔内上清培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，置低速震荡仪上振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪540nm处测量各孔的吸光值。计算各个样品孔细胞相对活力。将各孔吸光值减去调零孔吸光值，得到修正后吸光值OD540′。计算对照孔修正后吸光值的平均值avg(OD540C′)，见图8。

实施例62

以抑制荧光素酶表达siRNA作为报告基因，在稳定表达荧光素酶的HeLa细胞系中测定了载体的转染效率。转染结束后，弃去孔内液体，冷PBS轻洗2遍，每孔加入200μL1×报告基因裂解缓冲液，冻融1次，将裂解细胞完全。吹打完全后，吸出细胞裂解液到新的EP管，12000rpm离心30s，将上清液吸出。向10μL上清液中加入50μL底物后，由荧光计(Synergy HT,BioTek,USA)测定相对发光单位，见图9。

Claims

1.一种带二硫键的两亲性阳离子梳型接枝共聚物，其特征在于所述的接枝共聚物是以可降解疏水性聚酯为主链、通过可被谷胱甘肽（GSH）等还原的二硫键键接阳离子聚合物的侧链组成的如式（I）所示的接枝度为0.5～100mol%的两亲性阳离子梳型接枝共聚物;A为聚酯的结构单元，主链聚酯的聚合度为3～200；侧链(B_m-co-D_n)是烯类单体B和D的共聚物，单体B聚合度为58～175，单体D聚合度为8～79；单体B是N,N-取代的(甲基)丙烯酸酯；单体D是非阳离子型、非聚乙二醇类的烯类单体或它们的混合物；B与D摩尔比为1～50。

2.一种带二硫键的两亲性阳离子梳型接枝共聚物，其特征在于所述的接枝共聚物是以聚乙二醇嵌段的可降解疏水性聚酯为主链、通过可被谷胱甘肽（GSH）还原的二硫键键接阳离子聚合物的侧链组成的如式（II）所示的接枝度为0.5～100mol%的两亲性梳型接枝共聚物；主链是聚乙二醇（PEG）嵌段的聚酯，A为聚酯的结构单元，主链聚酯的聚合度为3～200，PEG的数均相对分子质量为400～10000；侧链(B_m-co-D_n)是两种烯类单体B和D的共聚物，单体B聚合度为58～175，单体D聚合度为8～79；单体B是N,N-取代的(甲基)丙烯酸酯；单体D是非阳离子型、非聚乙二醇类的烯类单体或它们的混合物；B与D摩尔比为1～50。

3.按权利要求1和2所述的两亲性阳离子梳型接枝共聚物，其特征在于所述的聚酯是聚己内酯、聚乙交酯、聚丙交酯、聚乙交酯和丙交酯混合物或聚己内酯和乙交酯混合物，主链聚酯的聚合度为3～200。

4.按权利要求1和2所述的两亲性阳离子梳型接枝共聚物，其特征在于接枝的阳离子聚合物侧链通过可被谷胱甘肽（GSH）等还原的二硫键键接到主链上。

5.按权利要求1和2所述的两亲性阳离子梳型接枝共聚物，其特征在于所述的单体B为亲水性单体甲基丙烯酸-2-(N,N-二甲氨基)乙酯，单体B聚合物为58～175。

6.权利要求1和2所述的两亲性阳离子梳型接枝共聚物，其特征是所述的单体D为：亲水性单体，选自丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟乙酯；或疏水性单体，选自甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸叔丁酯，单体D聚合度为8～79。

7.权利要求2所述的两亲性阳离子梳型接枝共聚物，其特征是所述的聚乙二醇选自聚乙二醇单甲醚。

8.权利要求1所述的共聚物，是以含侧链巯基的聚酯梳型大分子为引发剂，通过二硫键交换反应接上聚合物侧链而制备的。所述的大分子引发剂是1,4,8-三氧杂螺[4.6]-9-十一烷酮（TOSUO）与己内酯,或其与丙交酯,或其与乙交酯，或其与丙交酯和乙交酯，或其与丙交酯和己内酯的共聚物；脱掉乙二醇保护基团；将醛基还原成羟基；羟基同胱胺二盐酸盐反应；用二硫苏糖醇还原得到巯基而制得。所述的聚合物侧链，是以N-咔唑二硫代甲酸异丁腈酯(CYCBD)为可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)的引发剂，引发烯类单体B和D的共聚；再加入少量α-甲基丙烯酸，以羧基封端；与半胱氨酸盐酸盐在二硫苏糖醇存在的条件下反应，接上巯基；同2,2'-二硫二吡啶进行二硫键交换反应，最后得到2-吡啶二巯基封端的聚合物侧链。

9.权利要求2所述的带二硫键的两亲性阳离子梳型接枝共聚物的制备方法，其特征在于经过的步骤：以单羟基聚乙二醇引发1,4,8-三氧杂螺[4.6]-9-十一烷酮（TOSUO）与己内酯共聚，或与丙交酯共聚，或与乙交酯共聚，或与丙交酯和乙交酯共聚，或与丙交酯和己内酯共聚，经过一系列反应，形成含侧链巯基的聚乙二醇—聚酯的大分子引发剂，通过二硫键交换反应接上聚合物侧链而制备的。

10.权利要求1或2所述的两亲性阳离子梳型接枝共聚物的用途，其特征在于用于制备疏水性药物、基因、RNA、多肽、蛋白类药物的纳、微米粒，用于药物制剂、基因递送、细胞转染、检测和免疫制剂。