CN105968276A - 一种酸敏感的两亲性阳离子共聚物及其纳米粒与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种酸敏感的两亲性阳离子共聚物及其纳米粒与应用。其特征是该聚合物是由A、B/或A、B、C三段组成，其中A段是酸敏感聚合物段，在pH 7及以上环境下是电中性的疏水聚合物，在pH6.5及以下环境下质子化而变成亲水性；B段是带有胍基基团的阳离子聚合物；C段是带有聚乙二醇链单元的聚合物或带有聚羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯单元的聚合物及其他亲水性聚合物。共聚物可作为疏水药物的纳米、微米载体，作为基因、siRNA载体，用于药物制剂、细胞转染试剂、检测试剂和免疫制剂中。
Description
技术领域
本发明涉及一种酸敏感的两亲性阳离子共聚物及其纳米粒与应用，具体是带有胍基阳离子的两亲性阳离子共聚物，其组装形成纳米粒及其作为核酸载体的应用。
背景技术
带有亲水嵌段(如聚两性离子聚羧酸甜菜碱(PCB)、聚乙二醇(PEG))和疏水嵌段的两亲性嵌段共聚物在水中自组装形成具有疏水内核、亲水外壳结构的纳米粒，其过程与表面活性剂胶束化过程类似，但不同于表面活性剂胶束的是两亲性嵌段共聚物的分子量大，具有极低的临界胶束浓度(CMC)，且核内疏水嵌段相互缠结并处于动力学冻结状态，而水溶性的PEG或PCB嵌段伸向水中形成的亲水保护层具有较大的空间阻力，可以避免粒子间的聚并。所以两亲性聚合物纳米粒在水中可稳定存在且稀释时不易解体。
两亲性聚合物自组装纳米粒自20世纪末开始被用于药物递送，为新药的研发提供了革命性的手段，引起了人们的广泛关注。其中，两亲性阳离子聚合物作为两亲性聚合物中的一类，可以在水中自组装形成表面带正电荷的纳米粒，这种两亲性阳离子聚合物纳米粒被广泛应用于核酸负载。研究表明，两亲性阳离子聚合物纳米粒可以很大程度上提高基因对细胞的转染效率，同时也可以保护基因不被降解。目前，为了提高两亲性阳离子聚合物纳米粒负载的基因药物对细胞的转染效率，人们针对细胞特点，如内涵体的酸性环境、细胞内氧化还原环境，设计了许多具有敏感性的基因载体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有良好生物相容性、在弱酸性条件下可快速质子化的两亲性阳离子共聚物，其组装的纳米粒作为核酸(包括DNA、siRNA、miRNA等)的载体，可通过响应内涵体酸性环境促进siRNA释放，可在较低剂量下达到细胞水平的高效的基因表达抑制效率。
本发明是通过以下技术方案加以实现的：
本发明涉及一种酸敏感的两亲性阳离子共聚物，其特征是大分子链上至少含有A、B段的聚合物，其中A段是酸敏感聚合物段，在pH≧7的环境下是电中性的疏水聚合物，在pH≦6.5的环境下质子化而变成亲水性；B段是带有胍基基团的阳离子聚合物。
上述的酸敏感的两亲性阳离子共聚物，特征是由一种水溶性聚合物C键接的含有A、B段的聚合物；所述的A段的分子量为500～20000，B段的分子量为500～20000，C段的分子量为800～10000。
上述的酸敏感的两亲性阳离子共聚物，特征是C-A-B型嵌段共聚物，其中A段的质量百分比为10％～80％，B段的质量百分比为10％～70％，C段的质量百分比为4％～40％；所述的C段优选自聚羧酸甜菜碱、聚磷酸甜菜碱、聚乙二醇，或者是靶向分子或穿膜肽修饰的聚羧酸甜菜碱、聚磷酸甜菜碱、聚乙二醇。
上述的酸敏感的两亲性阳离子共聚物，特征是A-B型二嵌段共聚物，其中A段的质量百分比为10％～80％，B段的质量百分比为20％～90％。
所述的酸敏感的两亲性阳离子共聚物，其中A段是带有N,N-二异丙基氨基酯侧基的可聚合单体(Y1)与带有N,N-二甲氨基酯侧基的可聚合单体(Y2)的无规共聚物，且Y1与Y2的摩尔比为9～0.5。
所述的酸敏感的两亲性阳离子共聚物，其特征是A段是甲基丙烯酸‐N,N‐二异丙基氨基乙酯与甲基丙烯酸‐N,N‐二甲氨基乙酯的无规共聚物，或者是N‐(2‐(二异丙基)乙基)-2,5-二氧代恶唑烷-4-甲酰胺与N-(2-(二甲氨基)乙基)-2,5-二氧代恶唑烷-4-甲酰胺的无规共聚物，Y1与Y2的摩尔比优选为4～0.5；B段指的是聚甲基丙烯酸胍基乙酯或胍基化的聚氨基酸。
所述的酸敏感的两亲性阳离子共聚物的纳米粒，其特征在于是聚合物在水中自组装或与其它组分共组装形成的50～500nm的纳米粒，纳米粒中所述的两亲性阳离子共聚物含量50～100％；纳米粒在pH≧7的环境下稳定，在pH≦6.5的环境下纳米粒内核pH敏感质子化，纳米粒解体。
所述的两亲性阳离子共聚物纳米粒的应用：与DNA、RNA以及多肽、蛋白类生物大分子复合形成纳米粒，用于DNA、siRNA递送和转染试剂、检测和免疫制剂的应用。
所述的两亲性阳离子共聚物纳米粒的应用，其特征是A-B、C-A-B型嵌段共聚物在pH>7.2的水介质中自组装的纳米粒或参与组装的纳米粒，再与负电性的DNA、RNA以及多肽、蛋白类生物大分子复合形成复合纳米粒，所述的嵌段共聚物在复合纳米粒中的质量含量为40％～98％。
所述的酸敏感的两亲性阳离子共聚物纳米粒的应用，其特征是所述的A-B、C-A-B型嵌段共聚物中A段是N,N-取代的甲基丙烯酸氨基酯和甲基丙烯酸N,N-二异丙基氨基酯的无规共聚物，或者是N-(2-(二异丙基)乙基)-2,5-二氧代恶唑烷-4-甲酰胺与N-(2-(二甲氨基)乙基)-2,5-二氧代恶唑烷-4-甲酰胺的无规共聚物，Y1与Y2的摩尔比优选为4～0.5，B段指的是聚甲基丙烯酸胍基乙酯或胍基化的聚氨基酸；所述的纳米粒与核酸静电复合形成的纳米复合物，纳米粒与核酸的质量比N/P在1～30，粒径在50～300nm，用于转染试剂和核酸的体内外递送试剂的应用。
附图说明
图1是实施例1大分子引发剂PY1的分子结构示意图及核磁共振谱图，图中出现了分子结构中存在的各种氢质子的核磁共振峰，证明了所制备的产物的结构组成PY1为PAMA-BTAm
图2是实施例1以PCB为亲水段的终产物PY5(DPA-2)的分子结构示意图及1H核磁共振谱图，图中出现了分子结构中存在的各种氢质子的核磁共振峰，证明了所制备的产物PY5的结构组成为PCB10-P(DPA48/DMA12)-PG32。
图3是实施例1以PCB为亲水段的终产物PY5的分子结构示意图及13C核磁共振谱图，图中出现了分子结构中存在的各种碳原子的核磁共振峰，证明了所制备的产物PY5中胍基的存在。
图4是实施例1中PCB10-P(DPA48/DMA12)-PG32聚合物纳米粒为负载siRNA条件下粒径随pH变化的示意图，纳米粒在pH 6.3以下解体。
图5是实施例1中PCB10-P(DPA48/DMA12)-PG32包裹了尼罗红的聚合物纳米粒在不同pH条件下的荧光值的示意图。
图6是实施例中PCB-P(DPA/DMA)-PG/siRNA复合物的凝胶电泳图。在N/P大于2.1时，聚合物对siRNA具有较好的负载能力。
图7是实施例中PCB-P(DPA/DMA)-PG/siRNA复合物的细胞毒性的示意图。载体并未表现出明显细胞毒性。
图8是实施例中PCB-P(DPA/DMA)-PG/siRNA复合物对特异表达luciferase的HeLa细胞中luciferase生长的抑制的示意图。聚合物对luciferase表达表现出抑制效果，说明载体递送siRNA的能力强。
图9是实施例21三嵌段共聚物C-A-B-2的分子结构示意图及1H核磁共振谱图，图中出现了分子结构中存在的各种氢质子的核磁共振峰，证明了所制备的产物的C-A-B-2结构组成为PCB25-P(DMA24/DPA36)-PG32。
图10是实施例21的C-A-B-2聚合物纳米粒与siRNA复合纳米粒的透射电镜图。
图11是实施例21的聚合物C-A-B-2纳米粒在不同pH条件下的粒径变化的示意图，在pH>7.0时，纳米粒稳定存在，说明聚合物呈疏水性聚集状态，随着pH下降，在pH＝6.5时粒子尺寸降到10纳米以下，证明纳米粒解体，因此，pH＝6.5即为C-A-B-3纳米粒开始解聚集的pHdis。
图12是实施例23的聚合物C-A-B-4纳米粒在不同pH条件下的粒径变化的示意图，在pH在6.4解体。
图13是实施例21～25中PCB-P(DMA/DPA)-PG/siRNA复合物的凝胶电泳图。在N/P质量比大于4.5时，聚合物对siRNA具有较好的负载能力。
图14是实施例21～24中PCB-P(DMA/DPA)-PG/siRNA复合物对Hep‐G2细胞中luciferase生长的抑制示意图。在本权利要求范围内复合物对luciferase表达表现出较好抑制效果(超过50％)，说明载体较强的siRNA的胞内递送能力。
图15是P(DPA/DMA)-PGA二嵌段共聚物A-B-2的1H核磁共振谱图，图中出现了分子结构中存在的各种碳原子的核磁共振峰，证明了所制备的产物。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例中，酸敏感共聚物A采用甲基丙烯酸‐N,N‐二甲氨基乙酯(DMA)或甲基丙烯酸氨基乙酯(AMA)与甲基丙烯酸‐N,N‐二异丙基氨基乙酯(DPA)进行无规共聚制备，以聚甲基丙烯酸胍基乙酯(PG)为B段，采用以聚羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯(PCB)或聚乙二醇(PEG)为C段，制备C‐A‐B三嵌段共聚物PCB-P(DPA/DMA)-PG和A-B型二嵌段共聚物P(DPA/DMA)-PG。
或者采用N‐(2‐(二甲氨基)乙基)‐2,5‐二氧代恶唑烷‐4‐甲酰胺(DMAE)与N‐(2‐(二异丙基)乙基)‐2,5‐二氧代恶唑烷‐4‐甲酰胺(DPAE)无规共聚制备酸敏感性的A段，聚羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯(PCB)或聚乙二醇(PEG)为C段，以胍基化聚氨基酸为B段。
本发明是以CTAm或PEG-CTAm大分子为引发剂，采用可控自由基聚合制备而成。或采用氨基酸聚合而成。本发明可用于制备疏水性药物、基因、RNA、多肽、蛋白类药物的纳、微米粒，亦可用于药物制剂、基因递送、细胞转染、检测和免疫制剂。
实施例1
(1)以羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMA)单体为例，制备可在弱酸条件下快速响应的胍基化三嵌段共聚物：
①在100mL干燥Schlenk瓶中加入20mL无水乙腈，氮气保护下加入DMA(5.0g,32mmol)，溴乙酸叔丁酯(8.7g,44.5mmol)，室温下反应30min后，移入50℃恒温油浴中继续反应24h。反应体系降至室温后，滴入250mL无水乙醚中析出白色固体，抽滤后用100mL无水乙醚洗涤3次，真空干燥24h，制得甲基丙烯酸(羧酸甜菜碱)乙酯(CB(tBu))。1H NMR(500MHz,D2O)化学位移δ(ppm):1.44(s,9H,-OC(CH3)3),1.87(s,3H,CH2＝C(CH3)COO-),3.31(s,6H,-CH2N(CH3)2CH2-),3.98(t,2H,-COOCH2CH2N(CH3)2CH2-),4.28(s,2H,-CH2N(CH3)2CH2COO-),4.60(t,2H,-COOCH2CH2N(CH3)2-),5.73,6.10(s,2H,CH2＝C(CH3)-)证明了CB(tBu)单体结构。
②向Schlenk管中加入链转移剂s‐1‐十二烷基‐s‐(α，α‐二甲基‐α‐乙酸)三硫代碳酸酯(CTAm)(54.75mg，0.15mmol)，AMA(1.718g，7.5mmol)，AIBN(4.92mg,0.03mmol)和3ml二甲基甲酰胺(DMF)，70℃下反应24h。反应结束，得到PAMA30-CTAm(PY1)，其核磁图如1；
③向Schlenk管中加入DMA(0.188g，1.2mmol),DPA(1.022g,4.8mmol)和AIBN(4.92mg,0.03mmol)，70℃下反应24h。反应结束，得到PY2；
④向Schlenk管中加入CB(tBu)(0.408g，1.5mmol)，AIBN(4.92mg,0.03mmol)，70℃下反应24h。反应结束后，用透析袋(Mw:8000-14000)在纯水中透析1天，冻干得到PY3；
⑤向反应管中加入2.5g PY3和5ml三氟乙酸，反应4个小时，旋蒸除去三氟乙酸，用透析袋(Mw:8000-14000)在纯水中透析1天，冷冻干燥，得到PY4；
⑥向反应管中加入2g PY4、1.15g 1-H-吡唑甲脒盐酸盐和20ml 0.1M碳酸氢钠溶液，反应24h，用透析袋(Mw:8000-14000)在纯水中透析3天，冷冻干燥，得到终产物PY5。
将20mg共聚物溶于含有氘代磷酸的0.6ml重水中，用400MHz的核磁共振仪表征，其核磁图如图2和图3，结构为PCB15-P(DPA48/DMA12)-PG32，记为共聚物DPA-2，见表1。性能见表3。
实施例2～6
装置与操作同实施例1，只是改变DMA、DPA、AMA和CB(tBu)的投料比，按表1所示的比例投料，制备出表1所示其它三嵌段共聚物。
实施例7：
装置与操作同实施例1，只是将其中甲基丙烯酸二甲氨基乙酯换成甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(DEA)，所制备的共聚物PCB25-P(DPA48/DEA12)-PG32记为DPA-11。
表1 DMA、DPA、AMA和CB(tBu)投料配比表及共聚物大分子结构
MA：A段分子量；MB：B段分子量；MC：C段分子量。
实施例8
(1)以mPEG、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMA)单体为例，制备可在弱酸条件下快速响应的胍基化三嵌段共聚物：
向反应器中加入mPEG(1g、0.2mmol)、CTAm(87.6mg，0.24mmol)，二环己基碳二亚胺(DCC)(61.8mg，0.3mmol)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)(2.44mg，0.02mmol)，常温下反应24h。反应结束，沉淀干燥得到PEG-CTAm(PE1)；
向Schlenk管中加入PE1(0.805g，0.15mmol)，DPA(0.70g,3.6mmol)，DMA(0.846g,5.4mmol)，AIBN(4.92mg,0.03mmol)和3mL DMF，70℃下反应24h。反应结束，得到PE2；
向Schlenk管中AMA(0.76g，4.5mmol)，AIBN(4.92mg,0.03mmol)，70℃下反应24h。反应结束后，用截留分子量为3500的透析袋在纯水中透析1天，冻干得到PE3；
向反应管中加入2.5g PE3和5ml三氟乙酸，反应4个小时，旋蒸除去三氟乙酸，用透析袋(Mw:8000-14000)在纯水中透析1天，冷冻干燥，得到PE4；
向反应管中加入2g PE4、1.15g1-H-吡唑甲脒盐酸盐和20ml 0.1M碳酸氢钠溶液，反应24h，用透析袋(Mw:8000-14000)在纯水中透析3天，冷冻干燥，得到终产物PEG5000-P(DPA24/DMA36)；记为DPA-0-1。结构性能见表2和表3。
实施例9～13
装置与操作同实施例8，只是改变了DMA、DPA和AMA三者的投料比，按表2所示的比例投料，制备出表2所示其它三嵌段共聚物。
实施例14
装置与操作同实施例8，只是将其中甲基丙烯酸二甲氨基乙酯换成甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(DEA)，得到的共聚物记为DPA-11-7，如表2。
表2 DMA、DPA和AMA三者的投料配比表
MA：A段分子量；MB：B段分子量；MC：C段分子量。
实施例15
准确称取10mg的DPA-2嵌段共聚物溶于1mL的三氟乙醇，把嵌段共聚物溶液缓慢滴加到10mL搅拌下的pH 7.4的PBS中，室温搅拌3h后，离心分离，清液为DPA-2自组装纳米粒分散液；将分散液冷冻干燥，可得纳米粒冻干粉。取上述含9μg DPA-2纳米粒的pH 7.4的PBS缓冲液溶液，稀释至10mL，加入2μg的荧光素酶siRNA，形成DPA-2/siRNA的复合物纳米粒水分散液；用稀盐酸调节纳米粒分散液的pH为8.0、7.8、7.6、7.4、7.2、7.0、6.8、6.5等，室温放置2h后，激光粒度仪测定纳米粒解体时的pH值，定为pHdis，见图4及表3。
实施例16
将DPA-2和尼罗红溶于三氟乙醇中，把溶液缓慢滴加到10mL搅拌PBS或生理盐水中，室温搅拌3h后，离心分离，清液为自组装纳米粒分散液。用稀盐酸调节纳米粒分散液的pH为8.0、7.8、7.4、7.2、7.0、6.8、6.5等，室温放置2h。荧光测试，见图5。
实施例17
将20μL PCB-P(DPA/DMA)-PG/siRNA复合物溶液(N/P为1-8)与4μL上样缓冲液充分混合后加入到1％琼脂糖(含0.5μg/mL溴化乙锭)凝胶中。电泳缓冲液为1×TAE,电压为120V，电泳时间为40min，然后在紫外下观察siRNA电泳图谱并照相，见图6及表3。
实施例18
MTT法对复合物的细胞毒性进行了检测，具体方法如下：在96孔板中接种1×104个HeLa细胞/孔；加入50μL含0.2μg NC-siRNA的PCB-P(DPA-Bo-DMA)-PG/siRNA的复合物溶液，同时设置调零孔(培养液、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同体积的复合物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，37℃孵育48h。每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，继续5％CO2，37℃孵育4h。小心弃去孔内上清培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，置低速震荡仪上振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪540nm处测量各孔的吸光值。计算各个样品孔细胞相对活力。将各孔吸光值减去调零孔吸光值，得到修正后吸光值OD540′。计算对照孔修正后吸光值的平均值avg(OD540C′)，见图7及表3。
实施例19
以抑制荧光素酶表达siRNA作为报告基因，在稳定表达荧光素酶的Hela细胞系中测定载体的转染效率。在24孔板细胞培养板中每孔加入5*104的Hep‐G2细胞，培养一段时间后向每个孔中加入含50nM siRNA的siRNA/polycations复合物，转染24小时后，弃去孔内液体，冷PBS轻洗2遍，每孔加入200μL 1×报告基因裂解缓冲液，冻融1次，将裂解细胞完全。吹打完全后，吸出细胞裂解液到新的EP管，12000rpm离心30s，将上清液吸出。向10μL上清液中加入50μL底物后，由荧光计(Synergy HT,BioTek,USA)测定相对发光单位，见图8及表3。
按上述纳米粒制备方法及性能评价方法得到的表1和表2中各共聚物纳米粒的结构性能见表3。
表3.实施例1‐14所制备的C‐A‐B共聚物纳米粒的结构性能
a粒径是未负载siRNA纳米粒；b粒径是负载siRNA纳米粒；N/P为共聚物纳米粒与siRNA的质量比
实施例20
Schlenk管中，加入0.02mol链转移剂CTAm的DMF溶液10mL，加入0.7mol甲基丙烯酸氨基乙酯(AMA)，然后抽真空通氮气，反复三次。然后在70℃条件下反应24小时，透析冻干得到聚阳离子大分子引发剂PAMA‐CTAm。0.01mol聚阳离子链转移剂PAMA‐CTAm的DMF溶液，加入0.24mol DPA和0.36mol DMA，抽真空通入氮气后加入0.002mol AIBN，然后继续抽真空通氮气，反复三次。然后在70℃条件下反应24小时，透析冻干得到产物，记为A‐B‐1。
把A‐B‐1 0.01mol，加入Schlenk管中，再加入CB(0.25mol)，AIBN(0.002mol)，70℃下反应24h。反应结束后，用透析袋(Mw:8000‐14000)在纯水中透析1天，冻干得到PY3；向反应管中加入2.5g PY3和5ml三氟乙酸，反应4个小时，旋蒸除去三氟乙酸，用透析袋(Mw:8000‐14000)在纯水中透析1天，冷冻干燥，得到C‐A‐B‐1。
准确称取10mg的C‐A‐B‐1嵌段共聚物溶于1mL的三氟乙醇，把嵌段共聚物溶液缓慢滴加到10mL搅拌下的pH 7.4的PBS中，室温搅拌3h后，离心分离，清液为C‐A‐B‐1自组装纳米粒分散液；取上述含9μg C‐A‐B‐1纳米粒的pH 7.4的PBS缓冲液溶液，稀释至10mL，加入2μg的荧光素酶siRNA，形成A‐B‐1/siRNA的复合物纳米粒水分散液。
C‐A‐B‐1、C‐A‐B‐1纳米粒及C‐A‐B‐1/siRNA纳米粒的结构性能见表4和表5。
实施例21
向反应管中加入2g C‐A‐B‐1，1.15g 1‐H‐吡唑甲脒盐酸盐和20ml 0.1M碳酸氢钠溶液，反应24h，用透析袋(Mw:8000‐14000)在纯水中透析3天，冷冻干燥，得到阳离子段胍基化修饰的C‐A‐B型嵌段共聚物PG‐b‐P(DPA/DMA)‐PCB，记做C‐A‐B‐2；同实施例20方法，改变配比，制备出C‐A‐B‐2纳米粒及C‐A‐B‐2/siRNA纳米粒。结构性能见表4和表5。
实施例22～24
按实施例21方法，只是改变DMA、DPA、AMA和CB(tBu)的投料比，即可制备出表4所示其它三嵌段共聚物。同样制备出表4和表5中其它三嵌段共聚物及其自组装纳米粒和负载siRNA的纳米粒。
实施例25
0.02mol大分子链转移剂PEG5000‐CTAm的DMF溶液，加入0.48mol DPA和0.72molDMA，抽真空通入氮气后加入0.002mol AIBN，然后继续抽真空通氮气，反复三次。然后在70℃条件下反应24小时，透析冻干得到产物PY6。取0.01mol的PY6，加入0.35mol甲基丙烯酸氨基乙酯(AMA)，然后抽真空通氮气，反复三次。然后在70℃条件下反应24小时，透析冻干得到PAMA‐P(DPA/DMA)‐PEG三嵌段聚合物C‐A‐B‐6。同实施例20方法制备出C‐A‐B‐6纳米粒及C‐A‐B‐6/siRNA纳米粒。结构性能见表4和表5。
表4.实施例20‐35所制备的C‐A‐B三嵌段酸敏感的两亲性阳离子共聚物的结构组成
R8为精氨酸八聚体
实施例26
向反应管中加入2g C‐A‐B‐6，1.15g 1‐H‐吡唑甲脒盐酸盐和20ml 0.1M碳酸氢钠溶液，反应24h，用透析袋(Mw:8000‐14000)在纯水中透析3天，冷冻干燥，得到C‐A‐B型嵌段共聚物PG‐b‐P(DPA/DMA)‐PEG，记做C‐A‐B‐7。同实施例20方法制备出C‐A‐B‐7纳米粒及C‐A‐B‐7/siRNA纳米粒。结构性能见表4和表5。
实施例27‐33
按实施例26方法，只是改变DMA、DPA、AMA和CB(tBu)的投料比，以及采用不同靶向基团修饰的PEG，即可制备出表4所示其它B段为PEG的三嵌段共聚物，并同实施例20方法制备出C‐A‐B‐2纳米粒及C‐A‐B‐2/siRNA纳米粒。结构性能见表4和表5。
表5.实施例20‐35所制备的C‐A‐B共聚物纳米粒的结构性能
a粒径是未负载siRNA纳米粒；b粒径是负载siRNA纳米粒；cHep‐G2细胞系
实施例34
靶向基团RGD修饰的共聚物的制备：
加入Schlenk管中，加入0.01mol链转移剂CTAm的DMF溶液10mL，加入CB(tBu)(0.25mol)，AIBN(0.002mol)，抽真空通氮气，反复三次，然后70℃下反应24h，制备出端羧基的PCB(tBu)-CTAm。反应结束后，降至室温终止反应。在氮气保护下，加入0.24mol DPA和0.36mol DMA，抽真空通入氮气后加入0.002mol AIBN，然后继续抽真空通氮气，反复三次后，在70℃条件下反应24小时，得到端羧基聚合物。降至室温终止反应，在氮气保护下，加入0.35mol甲基丙烯酸氨基乙酯(AMA)，抽真空通氮气，反复三次，然后70℃下反应24h。反应结束后，再用透析袋(Mw:8000‐14000)在纯水中透析1天，冻干得到产物PY7。
将PY7(0.01mmol)溶解在3mL无水二甲基亚砜(DMSO)中，加入1‐乙基‐(3‐二甲基氨基丙基)(EDC·HCl)(9.5mg,0.05mmol)和N‐羟基琥珀酰亚胺(NHS)(11.5mg,0.10mmol)活化PY7的端羧基，室温下反应3h后，用巯基乙醇淬灭过量的EDC·HCl。随后加入短肽RGD(3.5mg,0.01mM)，室温下继续反应24h后用去离子水透析2天，冻干后得到RGD‐PY7。
向反应管中加入2.5g RGD‐PY7和5ml三氟乙酸，反应4个小时，水解掉PCB(tBu)的叔丁酯，旋蒸除去三氟乙酸，用透析袋(Mw:8000‐14000)在纯水中透析1天，冷冻干燥，得到RGD‐PY8。
向反应管中加入2g RGD‐PY8，1.15g 1‐H‐吡唑甲脒盐酸盐和20ml 0.1M碳酸氢钠溶液，进行胍基化反应24h，用透析袋(Mw:8000‐14000)在纯水中透析3天，冷冻干燥，得到阳离子段胍基化修饰的C‐A‐B型嵌段共聚物RGD‐PCB25‐P(DPA24/DMA36)‐PG32，记为C‐A‐B‐15。见表4。
准确称取10mg的C‐A‐B‐15嵌段共聚物溶于1mL的三氟乙醇，把嵌段共聚物溶液缓慢滴加到10mL搅拌下的pH 7.4的PBS中，室温搅拌3h后，离心分离，清液为C‐A‐B‐15自组装纳米粒分散液；取上述含9μg C‐A‐B‐15纳米粒的pH 7.4的PBS缓冲液溶液，稀释至10mL，加入2μg的荧光素酶siRNA，形成C‐A‐B‐15/siRNA的复合物纳米粒水分散液。纳米粒的结构性能见表5。
实施例35
同实施例34方法，只是把RGD换成穿膜肽精氨酸八聚体(R8)，得到的共聚物为C‐A‐B‐16，结构性能见表4和表5。
实施例36
0.02mol链转移剂CTAm的DMF溶液，加入0.7mol甲基丙烯酸氨基乙酯(AMA)，然后抽真空通氮气，反复三次。然后在70℃条件下反应24小时，透析冻干得到聚阳离子大分子引发剂PAMA‐CTAm。0.01mol聚阳离子链转移剂PAMA‐CTAm的DMF溶液，加入0.24molDPA和0.36mol DMA，抽真空通入氮气后加入0.002mol AIBN，然后继续抽真空通氮气，反复三次。然后在70℃条件下反应24小时，透析冻干得到两亲性二嵌段聚合物P(DPA/DMA)‐PAMA，记为A‐B‐1。
准确称取8mg的A‐B‐1，溶于1mL的三氟乙醇，把嵌段共聚物溶液缓慢滴加到10mL搅拌下的pH 7.4的PBS中，室温搅拌3h后，离心分离，清液为A‐B‐1自组装纳米粒分散液；取上述含8μg A‐B‐1纳米粒的pH 7.4的PBS缓冲液溶液稀释至10mL，加入2μg的荧光素酶siRNA，形成A‐B‐1/siRNA的复合物纳米粒水分散液。
A‐B‐1、A‐B‐1纳米粒及A‐B‐1/siRNA纳米粒的结构性能见表6。
实施例37
实施例36制备的A‐B‐1 0.5mol，向反应管中加入1mol 1‐H‐吡唑甲脒盐酸盐和20ml 0.1M碳酸氢钠溶液，反应24h，用透析袋(Mw:8000‐14000)在纯水中透析3天，冷冻干燥，得到终产物A1嵌段的胍基化聚阳离子二嵌段共聚物A‐B‐2，核磁谱图见图15。同样可以制备纳米粒和负载siRNA的纳米粒，如表6。
实施例38～41
同实施例20、21的方法，改变DPA、DMA、AMA的用量，或用甲基丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯(DEA)替代DMA，即可制备出不同组成的A‐B型酸敏感的两亲性阳离子共聚物，同样可以制备纳米粒和负载siRNA的纳米粒，如表6。
表6.实施例36～41所制备的A‐B二嵌段酸敏感的两亲性阳离子共聚物的结构组成
MB：B段分子量；a粒径是未负载siRNA纳米粒；b粒径是负载siRNA纳米粒
本发明中的酸敏感的两亲性阳离子共聚物，可以通过氨基酸类单体的缩聚制备聚氨基酸类型的酸敏感的两亲性阳离子共聚物，并通过组装纳米粒，制备方法示例如下：
实施例42
聚氨基酸类A‐B型酸敏感的两亲性阳离子共聚物A‐B‐7的制备：
取0.01mol氨基乙醇溶于10ml乙酸乙酯中，加入0.35mol异丁基(2‐(2,5‐二氧代恶唑烷‐4‐甲酰胺)乙基)氨基甲酸酯(AMAE)，反应24小时后，加入0.24mol DMAE与0.36mol DPAE，在110℃条件下反应24h，制备出PAMAE‐P(DMAE/DPAE),记为A‐B‐7。
采用实施例36方法，制备A‐B‐7及与siRNA的复合纳米粒。结构性能见表7和表8。
实施例43
按实施例21方法对A‐B‐7的氨基进行胍基化，则得到PGAE‐P(DMAE/DPAE)，记为A‐B‐8。
采用实施例36方法，制A‐B‐8及与siRNA的复合纳米粒。结构性能见表7和表8。
实施例44～45
按实施例42方法，改变DMAE与DPAE的比例，以及不同的C段单体，即可得到不同侧链氨基摩尔比的A‐B型酸敏感的两亲性阳离子共聚物。同样方法制备自组装纳米粒及与siRNA的复合纳米粒。结构性能见表7和表8。
实施例46
聚氨基酸类C‐A‐B型酸敏感的两亲性阳离子共聚物的制备：
C‐A‐B‐17
取0.01mol PEG5000‐NH2溶于10ml乙酸乙酯中，加入0.24mol N‐(2‐(二甲氨基)乙基)‐2,5‐二氧代恶唑烷‐4‐甲酰胺(DMAE)与0.36mol N‐(2‐(二异丙基)乙基)‐2,5‐二氧代恶唑烷‐4‐甲酰胺(DPAE)，在110℃条件下反应24h，制备出产物PY8。取0.01mol PY8溶于5ml乙酸乙酯中，加入0.35mol异丁基(2‐(2,5‐二氧代恶唑烷‐4‐甲酰胺)乙基)氨基甲酸酯(AMAE(tBu))，在110℃条件下反应24h。透析冻干获得产物。向反应管中加入2.5g产物和5ml三氟乙酸，反应4个小时，旋蒸除去三氟乙酸，用透析袋(Mw:8000‐14000)在纯水中透析1天，冷冻干燥，得到产物按实施例21方法进行胍基化，得到C‐A‐B‐17。
采用实施例20方法，制备C‐A‐B‐17及C‐A‐B‐17/siRNA纳米粒。结构性能见表7和表8。
实施例47～49
按实施例46方法，改变DMAE与DPAE的比例，以及不同的B、C组分，即可得到不同侧链氨基摩尔比的C‐A‐B型酸敏感的两亲性阳离子共聚物。同样方法制备自组装纳米粒及与siRNA的复合纳米粒。结构性能见表7和表8。
表7实施例42‐49所制备的聚氨基酸类型的酸敏感的两亲性阳离子共聚物的结构组成
表8.实施例42‐49所制备的共聚物所组装的纳米粒的结构性能
实施例50
同实施例46方法，只是把PEG5000‐NH2换成氨基化的聚磷酸甜菜碱(PPB5000‐NH2)，制备出C段为PPB的三嵌段共聚物C‐A‐B‐21。结构性能见表7和8。
实施例51
取0.01mol实施例34制备的PCB(tBu)‐CTAm溶于无水DMF中，加入DCC和NHS，活化2小时后，加入0.06mol的乙二胺，反应8h，透析冻干得到PCB(tBu)‐NH2。按实施例46方法，只是把PEG5000‐NH2换成PCB(tBu)‐NH2，制备出C段为PCB的三嵌段共聚物C‐A‐B‐22。结构性能见表7和8。
实施例52
同实施例46方法，只是把PEG5000‐NH2换成RGD‐PEG5000‐NH2，制备出C‐A‐B‐23。结构性能见表7和8。
还可以采用所述的酸敏感的两亲性阳离子聚合物共组装来制备纳米粒，实施例示例如下，结构性能见表9：
实施例53
准确称取5mg DPAE/DMAE(摩尔比0.7)的无规共聚物P(DPAE/DMAE)，5mg的C‐A‐B‐12溶于1mL的三氟乙醇，把嵌段共聚物溶液缓慢滴加到10mL搅拌下的pH 7.4的PBS中，室温搅拌3h后，离心分离，清液为P(DPAE/DMAE)/C‐A‐B‐12共组装的纳米粒分散液。用实施例20方法制备P(DPAE/DMAE)/C‐A‐B‐12/siRNA纳米粒。
采用同样共组装的方法，可以调节纳米粒的内核A的组成以及外层C与B段的组成及结构。
实施例54
准确称取2mg表1中的C‐A‐B‐15，8mg表6中的A‐B‐2，溶于1mL的三氟乙醇，把共聚物溶液缓慢滴加到10mL搅拌下的生理盐水中，室温搅拌3h后，离心分离，清液为C‐A‐B‐15/A‐B‐2组装纳米粒的分散液。按实施例20方法制备C‐A‐B‐15/A‐B‐2纳米粒与siRNA复合纳米粒(C‐A‐B‐15/A‐B‐2)/siRNA。
实施例55
准确称取3mg表1中的A‐B‐8，7mg表7中的C‐A‐B‐21，按实施例20方法组装A‐B‐8/C‐A‐B‐21纳米粒和负载siRNA的纳米粒(A‐B‐8/C‐A‐B‐21)/siRNA。
实施例56
准确称取8mg表7中的A‐B‐10，2mg的DPAE/DMAE(摩尔比0.7)的无规共聚物P(DPAE/DMAE)，溶于1mL的三氟乙醇，把共聚物溶液缓慢滴加到10mL搅拌下的生理盐水中，室温搅拌3h后，离心分离，清液为A‐B‐10/P(DPAE/DMAE)组装纳米粒的分散液。用实施例25方法制备负载siRNA的纳米粒A‐B‐10/P(DPAE/DMAE)/siRNA复合纳米粒。
表8.实施例53‐56所制备的共聚物所组装的纳米粒的结构性能
采用本发明的上述方法，共组装纳米粒，可以比较方便地调控纳米粒的结构组成，得到适宜负载负电性的抗体、蛋白、多肽、DNA等生物大分子类物质的纳米粒，调控递送性能，为这些生物类药物的体内外递送提供了一个普适性的高效递送技术。
Claims (10)
1.一种酸敏感的两亲性阳离子共聚物，其特征是大分子链上至少含有A、B段的聚合物，其中A段是酸敏感聚合物段，在pH≧7的环境下是电中性的疏水聚合物，在pH≦6.5的环境下质子化而变成亲水性；B段是带有胍基基团的阳离子聚合物。
2.一种权利要求1所述的酸敏感的两亲性阳离子共聚物，特征是由一种水溶性聚合物C键接的含有A、B段的聚合物；所述的A段的分子量为500～20000，B段的分子量为500～20000，C段的分子量为800～10000。
3.如权利要求2所述的酸敏感的两亲性阳离子共聚物，特征是C-A-B型嵌段共聚物，其中A段的质量百分比为10％～80％，B段的质量百分比为10％～70％，C段的质量百分比为4％～40％；所述的C段优选自聚羧酸甜菜碱、聚磷酸甜菜碱、聚乙二醇，或者是靶向分子或穿膜肽修饰的聚羧酸甜菜碱、聚磷酸甜菜碱、聚乙二醇。
4.一种权利要求1所述的酸敏感的两亲性阳离子共聚物，特征是A-B型二嵌段共聚物，其中A段的质量百分比为10％～80％，B段的质量百分比为20％～90％。
5.如权利要求1～4所述的酸敏感的两亲性阳离子共聚物，其中A段是带有N,N-二异丙基氨基酯侧基的可聚合单体(Y1)与带有N,N-二甲氨基酯侧基的可聚合单体(Y2)的无规共聚物，且Y1与Y2的摩尔比为9～0.5。
6.如权利要求5所述的酸敏感的两亲性阳离子共聚物，其特征是A段是甲基丙烯酸-N,N-二异丙基氨基乙酯与甲基丙烯酸-N,N-二甲氨基乙酯的无规共聚物，或者是N-(2-(二异丙基)乙基)-2,5-二氧代恶唑烷-4-甲酰胺与N-(2-(二甲氨基)乙基)-2,5-二氧代恶唑烷-4-甲酰胺的无规共聚物，Y1与Y2的摩尔比优选为4～0.5；B段指的是聚甲基丙烯酸胍基乙酯或胍基化的聚氨基酸。
7.权利要求1～6所述的酸敏感的两亲性阳离子共聚物的纳米粒，其特征在于是聚合物在水中自组装或与其它组分共组装形成的50～500nm的纳米粒，纳米粒中所述的两亲性阳离子共聚物含量50～100％；纳米粒在pH≧7的环境下稳定，在pH≦6.5的环境下纳米粒内核pH敏感质子化，纳米粒解体。
8.权利要求7的两亲性阳离子共聚物纳米粒的应用：与DNA、RNA以及多肽、蛋白类生物大分子复合形成纳米粒，用于DNA、siRNA递送和转染试剂、检测和免疫制剂的应用。
9.权利要求8的酸敏感的两亲性阳离子共聚物纳米粒的应用，其特征是A-B、C-A-B型嵌段共聚物在pH>7.2的水介质中自组装的纳米粒或参与组装的纳米粒，再与负电性的DNA、RNA以及多肽、蛋白类生物大分子复合形成复合纳米粒，所述的嵌段共聚物在复合纳米粒中的质量含量为40％～98％。
10.权利要求9的酸敏感的两亲性阳离子共聚物纳米粒的应用，其特征是所述的A-B、C-A-B型嵌段共聚物中A段是甲基丙烯酸N,N-二异丙基氨基酯的无规共聚物与N,N-取代的甲基丙烯酸氨基酯的无规共聚物，或者是N-(2-(二异丙基)乙基)-2,5-二氧代恶唑烷-4-甲酰胺与N-(2-(二甲氨基)乙基)-2,5-二氧代恶唑烷-4-甲酰胺的无规共聚物，Y1与Y2的摩尔比优选为4～0.5，B段指的是聚甲基丙烯酸胍基乙酯或胍基化的聚氨基酸；所述的纳米粒与核酸静电复合形成的纳米复合物，纳米粒与核酸的质量比N/P在1～30，粒径在50～300nm，用于转染试剂和核酸的体内外递送试剂的应用。
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