CN102030898A - Abc型两亲性生物降解聚酯三嵌段共聚物及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种ABC型两亲性生物降解聚酯三嵌段共聚物及其制备方法和应用，这种ABC型聚酯三嵌段共聚物，A段为聚乙二醇类单体单元，B段为疏水的可降解聚酯，是内酯、交酯或它们的共聚物，C嵌段是可进行原子转移自由基聚合的单体的均聚物或共聚物，所述的两亲性ABC型聚酯三嵌段共聚物可以在水中自组装形成球形纳米粒，用于疏水性药物纳米、微米载体，作为DNA、RNA载体，用于药物制剂、细胞转染试剂、检测试剂和免疫制剂中。聚合物在体内可生物降解，降解产物无毒无害，具有吸水性、通透性和生物相容性，操作简单方便，可用于药物传递、组织工程等生物医学领域。

Description

ABC型两亲性生物降解聚酯三嵌段共聚物及制备方法和应用

技术领域：

本发明涉及一种ABC型两亲性生物降解三嵌段共聚物及制备方法和应用，具体是ABC型两亲性可生物降解聚酯三嵌段共聚物及具有温敏性的纳米粒水溶液，可用于药物的负载、基因传递和体内注射的药物缓控释给药制剂。

技术背景：

聚合物自组装纳米粒是由带有亲水嵌段(如PEG)和疏水嵌段形成的两亲性共聚物在水中自发形成的具有疏水内核、亲水外壳结构的纳米粒，组装过程类似于表面活性剂胶束化，因此，也称为聚合物自组装胶束。但不同于表面活性剂胶束的是嵌段共聚物的两个嵌段的分子量较大(几千～几万)，具有极低的临界胶束浓度(CMC)，且核内疏水嵌段相互缠结并处于动力学冻结状态，而水溶性的PEG伸向水中形成的亲水保护层有较大的空间阻力，避免粒子间的聚并，所以聚合物胶束在水中稳定存在且稀释时不会解体。而带有离子型嵌段的全亲水嵌段共聚物与带相反电荷物质(基因、多肽等)通过静电复合作用也可以自组装成胶束型纳米粒。

两亲性聚合物自组装胶束型纳米粒自20世纪末开始被用于包裹疏水性药物和基因药物，为解决疏水性药物溶解性、基因药物体内易被水解的药剂学难题提供了有效的手段，大大提高了两类药物的生物利用度，引起了广泛的关注。尤其是以PEG为亲水段的嵌段共聚物，作为难溶药物和基因纳米载体，具有防止蛋白质吸附、逃避网状内皮系统和巨噬细胞吞噬的性能，可以携带药物及DNA较长时间在体内循环，大大延长了药物的半衰期，降低了毒副作用，提高了疗效，呈现出很好的应用前景。

两亲性聚合物自组装纳米粒还可以作为疏水性药物纳米载体，而阳离子聚合物则在基因传递方面具有应用价值。因此，两亲性可降解聚合物具有多方面的应用领域，发展前景较好。

本发明提供了一类新型的具有良好生物相容性、可生物降解性的ABC型两亲性生物降解聚酯三嵌段共聚物及其纳米粒载药/DNA体系。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种ABC型两亲性生物降解聚酯三嵌段共聚物及制备方法和应用，它是具有良好生物相容性、可生物降解性的多功能两亲性三嵌段共聚物，是以疏水的可降解聚酯与亲水的聚乙二醇，以及阳离子聚合物成的ABC型两亲性三嵌段共聚物，这类ABC型两亲性三嵌段共聚物可以包载疏水性药物形成药物纳米制剂，也可以作为基因的载体用于基因的负载和传递，从而在疾病的预防及治疗方面发挥潜在的作用。

本发明中的“聚酯”指内酯、交酯或它们的混合物的共聚物。

本发明提供的ABC型两亲性生物降解聚酯三嵌段共聚物包括：

一种ABC型两亲性生物降解三嵌段共聚物，其特征在于：A嵌段是含聚乙二醇链单元的聚合物，B嵌段是内酯、交酯或它们的共聚物，C嵌段是可进行原子转移自由基聚合的单体的均聚物或共聚物；所述的三嵌段共聚物是通过下述方法制备的：聚乙二醇类大分子单体与内酯、交酯或它们的混合物进行共聚形成两嵌段聚合物AB，再把AB聚酯的端基转变为原子转移自由基聚合的活性中心，与可进行原子转移自由基聚合的单体进行原子转移自由基聚合制备出所述的ABC三嵌段共聚物。

所述的ABC型两亲性生物降解三嵌段共聚物，其特征在于所述的A嵌段相对分子质量为400～10000，B嵌段相对分子质量是400～20000；C嵌段相对分子质量是400～50000。

所述的ABC型两亲性生物降解三嵌段共聚物，其特征在于：所述的A嵌段选自烷基醚或烷基酯单封端的聚乙二醇；B嵌段是丙交酯、乙交酯和己内酯的均聚物或它们的共聚物；C嵌段是带有阳离子的均聚物或共聚物，聚合单体主要选自：甲基丙烯酸-N，N-二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸-N，N-二甲氨基甲酯、丙烯酸-N，N-二甲氨基乙酯、丙烯酸-N，N-二甲氨基甲酯、甲基丙烯酸-N，N-二乙氨基乙酯、甲基丙烯酸-N，N-二乙氨基甲酯、丙烯酸-N，N-二乙氨基乙酯或丙烯酸-N，N-二乙氨基甲酯、乙烯基吡啶、甲基丙烯酰氧乙基二甲基辛基溴化铵、丙烯酰氧乙基二甲基辛基溴化铵、甲基丙烯酸酯季铵盐、丙烯酸酯季铵盐、甲基丙烯酰胺季铵盐、丙烯酰胺季铵盐、乙烯氧烷基季铵盐、乙烯苄基三甲基季铵盐、N-烯丙基季铵盐或N-烷基乙烯吡啶季铵盐。

本发明提供ABC型两亲性生物降解三嵌段共聚物的制备方法经过的步骤：

(1)反应器中依次加入计量的聚乙二醇、内酯或交酯、催化剂，加热抽真空通氮气反复三次，密封下140℃反应12h。反应结束，加入二氯甲烷溶解，冷乙醚沉淀，抽滤，反复三次，最后真空干燥得AB二嵌段共聚物；

(2)将AB二嵌段共聚物加入三口瓶，加入二氯甲烷溶解，然后加入化学计量比的三乙胺，冰水浴搅拌，将化学计量比的2-溴异丁酰溴的二氯甲烷溶液逐滴加入，室温反应48h后，在冷乙醚中沉淀，抽滤；然后再用二氯甲烷溶解，冷乙醚中沉淀，反复三次，最后真空干燥得聚酯大分子引发剂AB-Br；

(3)反应器中加入AB-Br和2，2’-联吡啶，至少反复三次抽真空、充氮气或氩气；迅速加入催化剂(CuBr)和阳离子型单体，再至少反复三次抽真空、充氮气，封管；然后在搅拌下于30～90℃恒温水浴中反应8～24h，待反应结束后，打开反应器，加入四氢呋喃溶解聚合物，用透析袋在蒸馏水中透析去除催化剂及未反应的单体，冷冻干燥，得到ABC两亲性三嵌段共聚物。

所述的ABC型两亲性生物降解三嵌段共聚物的应用：聚合物可以在水中自组装形成纳米粒，纳米粒内核疏水，外壳亲水且具有阳离子特征，可用于制备疏水性药物纳米粒，或与DNA、RNA以及多肽、蛋白类生物大分子复合形成纳米粒，也可以同时负载疏水性药物和DNA或多肽、蛋白，用于药物制剂、基因传递和转染试剂、检测和免疫制剂。

本发明中，所述的ABC型可生物降解三嵌段共聚物还具有温度敏感、pH敏感性，纳米粒的粒径和药物释放性质对温度和pH有较大的依赖性，可用于生物体内环境敏感性药物释放体系。所述嵌段共聚物的载药、载药/DNA或未载药/DNA纳米粒的冻干粉具有可再分散性，粒径小于1000nm。

本发明提供一种ABC型两亲性生物降解聚酯三嵌段共聚物具有良好生物相容性、可生物降解性的多功能两亲性三嵌段共聚物，是以疏水的可降解聚酯与亲水的聚乙二醇，以及阳离子聚合物成的ABC型两亲性三嵌段共聚物，可以在水中自组装形成球形纳米粒，用于疏水性药物纳米、微米载体，作为DNA、RNA载体，用于药物制剂、细胞转染试剂、检测试剂和免疫制剂中。聚合物在体内可生物降解，降解产物无毒无害，具有吸水性、通透性和生物相容性，操作简单方便，可用于药物传递、组织工程等生物医学领域。

附图说明：

图1是mPEG5000，mPEG₅₀₀₀-PCL₄₄₅₁和实施例25制备的两亲性聚酯三嵌段共聚物mPEG₅₀₀₀-PCL₄₄₅₁-PDMAEMA₉₄₈₀的分子结构示意图及它们的核磁共振谱图，对比可以看出图中出现了三嵌段聚合物分子结构中存在的各种氢质子的核磁共振峰，证明了所制备的产物符合预期结构。

图2是mPEG5000，mPEG₅₀₀₀-PDLLA₂₇₃₆-Br和实施例44制备的两亲性聚酯三嵌段共聚物mPEG₅₀₀₀-PDLLA₂₇₃₆-PDMAEMA₉₄₇₈的分子结构示意图及它们的核磁共振谱图。

图3是mPEG5000，mPEG₅₀₀₀-PCL₄₄₅₁和实施例25制备的两亲性聚酯三嵌段共聚物mPEG₅₀₀₀-PCL₄₄₅₁-PDMAEMA₉₄₈₀的红外谱图，对从谱图可以看出mPEG₅₀₀₀-PCL₄₄₅₁-PDMAEMA₉₄₈₀谱图上出现了聚酯及DMAEMA的特征峰，因此可以证明合成了符合预期结构的聚合物。

图4是mPEG5000，mPEG₅₀₀₀-PDLLA₂₇₃₆和实施例44制备的两亲性聚酯三嵌段共聚物mPEG₅₀₀₀-PDLLA₂₇₃₆-PDMAEMA₉₄₇₈的红外谱图，对从谱图可以看出mPEG₅₀₀₀-PDLLA₂₇₃₆-PDMAEMA₉₄₇₈谱图上出现了聚酯及DMAEMA的特征峰，因此可以证明合成了符合预期结构的聚合物。

图5是载有3％紫杉醇的mPEG₅₀₀₀-PCL₄₄₅₁-PDMAEMA₉₄₈₀纳米粒(A)以及mPEG₅₀₀₀-PDLLA₂₇₃₆-PDMAEMA₉₄₇₈纳米粒(B)的粒径分布图。可见，平均粒径分别为98nm和92nm，粒径均在500纳米以下。

图6是载有3％紫杉醇的mPEG₅₀₀₀-PCL₄₄₅₁-PDMAEMA₉₄₈₀纳米粒(A)以及mPEG₅₀₀₀-PDLLA₂₇₃₆-PDMAEMA₉₄₇₈纳米粒(B)的体外药物释放结果。能够较好地控制药物缓慢释放。

图7是mPEG₅₀₀₀-PDLLA₂₇₃₆-PDMAEMA₉₄₇₈与质粒DNA复合物(N/P＝10/1)的DLS粒径分布图(A)和透射电镜图(B)。表明mPEG₅₀₀₀-PDLLA₂₇₃₆-PDMAEMA₉₄₇₈能够较好负载DNA，形成纳米粒子，可望用于基因载体。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：

聚酯大分子引发剂的制备：

在Schlenk管中依次加入聚乙二醇单甲醚(mPEG₅₀₀₀，5g)、ε-己内酯(4.55g)和催化剂辛酸亚锡(占ε-己内酯物质的量的0.1％)，酒精灯加热抽真空通氮气反复三次，封管140C反应12h。反应结束，加入2mL二氯甲烷溶解，冷乙醚沉淀，抽滤，然后再用2mL二氯甲烷溶解，冷乙醚沉淀，反复三次，最后真空干燥得产物mPEG₅₀₀₀-PCL₄₄₅₁。

将mPEG-PCL(1.57g)加入三口瓶，加入20mL二氯甲烷溶解，然后加入化学计量比的三乙胺(TEA，125μL)，冰水浴搅拌；将化学计量比的2-溴异丁酰溴(138μL)溶于20mL二氯甲烷然后逐滴加入上述体系，室温反应48h，反应结束，35℃旋蒸除去大量有机溶剂，然后在冷乙醚中沉淀，抽滤；然后再用2mL二氯甲烷溶解，冷乙醚中沉淀，反复三次，最后真空干燥得聚酯大分子引发剂mPEG₅₀₀₀-PCL₄₄₅₁-Br。

表1PEG-聚酯大分子引发剂

mPEG：聚乙二醇单甲醚；ePEG：聚乙二醇单乙醚；mePEG：聚乙二醇单甲酯；

CL：己内酯；LA：L-丙交酯；DLLA：D，L-丙交酯；GA：乙交酯；溴化剂：2-溴异丁酰溴。

实施例2～24：

按实施例1方法，改变聚乙二醇、内酯或交酯的原料组成和配比，可以制备出不同结构、组成的聚酯大分子引发剂，如表1所示。

实施例25：

在Schlenk管反应器中按化学计量比加入实施例1制备的含溴官能团聚己内酯大分子引发剂mPEG₅₀₀₀-PCL₄₄₅₁-Br(658mg)、2，2’-联吡啶(bpy，63.2mg)，加入催化剂(CuBr，28.8mg)和甲基丙烯酸-N，N-二甲胺基乙酯(DMAEMA，1-9g)，真空通氮气反复三次，封管，然后搅拌下于60℃恒温水浴中反应12h，待反应结束后，打开反应器，加入四氢呋喃溶解聚合物，用透析袋(Mw：8000-14000)蒸馏水中透析去除催化剂，冷冻干燥，得到两亲性三嵌段共聚物mPEG-PCL-PDMAEMA。通过核磁共振表征聚合物结构并计算相对分子质量，核磁谱图示例如图1，所制备的两亲性三嵌段共聚物为mPEG₅₀₀₀-PCL₄₄₅₁-PDMAEMA₉₄₈₀。图1是mPEG5000，mPEG₅₀₀₀-PDLLA₄₄₅₁-Br  和两亲性聚酯三嵌段共聚物mPEG₅₀₀₀-PDLLA₄₄₅₁-PDMAEMA₉₄₈₀的分子结构示意图及它们的核磁共振谱图，对比可以看出图中出现了三嵌段聚合物分子结构中存在的各种氢质子的核磁共振峰，证明了所制备的产物符合预期结构。

实施例26～50：

改变大分子单体、阳离子单体的种类和配比，按表2所示的投料组成，按照实施例25方法制备出表2中的不同结构、不同分子量的三嵌段共聚物。

实施例51：

将97mg实施例25制备的mPEG₅₀₀₀-PCL₄₄₅₁-PDMAEMA₉₄₈₀与3mg紫杉醇一起溶于3mL丙酮，在氮气保护下，加热至60℃蒸发2h，得到药物与共聚物的固态混合物，室温真空干燥后，将药物与共聚物的固态混合物在60℃预热至透明胶状，搅拌下加入60℃的双蒸水(或磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.6))10mL，形成药物纳米粒水分散液，离心分离，上清液冷冻干燥得载药纳米粒冻干粉A。将97mg mPEG₅₀₀₀-PDLLA₂₇₃₆-PDMAEMA₉₄₇₈与3mg紫杉醇一起溶于3mL丙酮，采用同样的方法制备载药纳米粒冻干粉B。两种纳米粒冻干粉的水分散液(1％)的粒径分布如图5(A)和5(B)所示，粒径均在100nm左右。

精确称取4mg载药纳米粒冻干粉A或B，置于透析袋内，用2mL配制好的PBS分散A或B。将密封好的透析袋置于28mL PBS中，于37°恒温振荡下进行体外释放实验。每2小时取20mL释放液，并补充20mL新鲜的PBS，即置换量为20mL。用HPLC检测取出的释放液中的紫杉醇含量，再计算累积释放量，结果如图6。图6是载有3％紫杉醇的mPEG₅₀₀₀-PCL₄₄₅₁-PDMAEMA₉₄₈₀纳米粒(A)以及mPEG₅₀₀₀-PDLLA₂₇₃₆-PDMAEMA₉₄₇₈纳米粒(B)的体外药物释放结果，可见，纳米粒能够较好地控制药物缓释。

累计释放量的计算公式如下：

$E_r=\frac{V_e\underset{1}{\overset{n-1}{\mathrm{\Σ}}}{C}_i+V_0{C}_n}{m_{\mathrm{drug}}}$

式中E_r：药物累积释放量，％；V_e：PBS的置换体积，20mL；V₀：释放液PBS的体积，30mL；C_i：第i次置换取样时释放液中药的浓度，μg/mL；m_drug：用于释放的载药胶束中紫杉醇的质量，μg；n：置换PBS的次数。

表2实施例4～6制备的两亲性聚酯三嵌段共聚物

注：CuBr用量：1mol；2，2’-联吡啶用量：2mol；

阳离子单体：丙烯酸-N，N-二甲氨基乙酯(DMAEA)，甲基丙烯酸-N，N-二甲氨基甲酯(DMAMMA)，丙烯酸-N，N-二甲氨基甲酯(DMAMA)，甲基丙烯酸-N，N-二乙氨基乙酯(DEAEMA)，丙烯酸-N，N-二乙氨基乙酯(DEAEA)，甲基丙烯酸-N，N-二乙氨基甲酯(DEAMMA)，丙烯酸-N，N-二乙氨基甲酯(DEAMA)，乙烯基吡啶(EP)、甲基丙烯酰氧乙基二甲基辛基溴化铵(ADMOAB)，丙烯酰氧乙基二甲基辛基溴化铵(ADOAB)、甲基丙烯酸酯季铵盐(MAQAB)、乙烯苄基三甲基季铵盐(EBTMQA)、N-烯丙基季铵盐(PQA)，N-烷基乙烯吡啶季铵盐(AEPQA)。

实施例52

将实施例44制备的mPEG₅₀₀₀-PDLLA₂₇₃₆-PDMAEMA₉₄₇₈和pEGFP-N1质粒DNA分别用PBS(pH7.4)溶解稀释(约1μg/100μL)，按照N/P比(聚合物中的氮与DNA中的磷原子含量的摩尔比)为5/1、10/1、20/1、30/1的比例，将聚合物的稀释液逐滴加入到pEGFP-N1质粒DNA的稀释液中，边加边振荡，使之充分混匀，形成复合物，室温放置20min，分别用光散射仪和透射电镜来测定复合物的粒径大小及分布，结果如图7所示。图7是mPEG₅₀₀₀-PDLLA₂₇₃₆-PDMAEMA₉₄₇₈与质粒DNA复合物(N/P＝10/1)的DLS粒径分布图(A)和透射电镜图(B)，从图中可以看出复合物分布均一，呈球型结构，可以有效负载DNA形成纳米粒。

Claims (5)

1.一种ABC型两亲性生物降解三嵌段共聚物，其特征在于：A嵌段是含聚乙二醇链单元的聚合物，B嵌段是内酯、交酯或它们的共聚物，C嵌段是可进行原子转移自由基聚合的单体的均聚物或共聚物；所述的三嵌段共聚物是通过下述方法制备的：聚乙二醇类大分子单体与内酯、交酯或它们的混合物进行共聚形成两嵌段聚合物AB，再把AB聚酯的端基转变为原子转移自由基聚合的活性中心，与可进行原子转移自由基聚合的单体进行原子转移自由基聚合制备出所述的ABC三嵌段共聚物。

2.按权利要求1所述的ABC型两亲性生物降解三嵌段共聚物，其特征在于所述的A嵌段相对分子质量为400～10000，B嵌段相对分子质量是400～20000；C嵌段相对分子质量是400～50000。

3.按权利要求1所述的ABC型两亲性生物降解三嵌段共聚物，其特征在于：所述的A嵌段选自烷基醚或烷基酯单封端的聚乙二醇；B嵌段是丙交酯、乙交酯和己内酯的均聚物或它们的共聚物；C嵌段是带有阳离子的均聚物或共聚物，聚合单体主要选自：甲基丙烯酸-N，N-二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸-N，N-二甲氨基甲酯、丙烯酸-N，N-二甲氨基乙酯、丙烯酸-N，N-二甲氨基甲酯、甲基丙烯酸-N，N-二乙氨基乙酯、甲基丙烯酸-N，N-二乙氨基甲酯、丙烯酸-N，N-二乙氨基乙酯或丙烯酸-N，N-二乙氨基甲酯、乙烯基吡啶、甲基丙烯酰氧乙基二甲基辛基溴化铵、丙烯酰氧乙基二甲基辛基溴化铵、甲基丙烯酸酯季铵盐、丙烯酸酯季铵盐、甲基丙烯酰胺季铵盐、丙烯酰胺季铵盐、乙烯氧烷基季铵盐、乙烯苄基三甲基季铵盐、N-烯丙基季铵盐或N-烷基乙烯吡啶季铵盐。

4.权利要求1所述的ABC型两亲性生物降解三嵌段共聚物的制备方法，其特征在于经过的步骤：

(1)反应器中依次加入计量的聚乙二醇、内酯或交酯、催化剂，加热抽真空通氮气反复三次，密封下140℃反应12h。反应结束，加入二氯甲烷溶解，冷乙醚沉淀，抽滤，反复三次，最后真空干燥得AB二嵌段共聚物；

(2)将AB二嵌段共聚物加入三口瓶，加入二氯甲烷溶解，然后加入化学计量比的三乙胺，冰水浴搅拌，将化学计量比的2-溴异丁酰溴的二氯甲烷溶液逐滴加入，室温反应48h后，在冷乙醚中沉淀，抽滤；然后再用二氯甲烷溶解，冷乙醚中沉淀，反复三次，最后真空干燥得聚酯大分子引发剂AB-Br；

(3)反应器中加入AB-Br和2，2’-联吡啶，至少反复三次抽真空、充氮气或氩气；迅速加入催化剂(CuBr)和阳离子型单体，再至少反复三次抽真空、充氮气，封管；然后在搅拌下于30～90℃恒温水浴中反应8～24h，待反应结束后，打开反应器，加入四氢呋喃溶解聚合物，用透析袋在蒸馏水中透析去除催化剂及未反应的单体，冷冻干燥，得到ABC两亲性三嵌段共聚物。

5.权利要求1～4任一所述的ABC型两亲性生物降解三嵌段共聚物的应用，其特征在于：聚合物可以在水中自组装形成纳米粒，用于制备疏水性药物、DNA、RNA、多肽、蛋白类药物的纳、微米粒载体材料，也可以同时负载疏水性药物和DNA或多肽、蛋白，用于药物制剂、基因传递和转染试剂、检测和免疫制剂。

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