CN115124669B - 一种双载基因和药物的线性嵌段共聚物纳米载体的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双载基因和药物的线性嵌段共聚物纳米载体的制备方法及应用。本发明通过正丁醇与ε‑己内酯单体的开环聚合和线性大分子引发剂与含氮的丙烯酸酯类单体的原子转移自由基聚合得到聚己内酯‑聚丙烯酸酯类嵌段共聚物。该共聚物载体可组装成50‑300nm的纳米粒子，具有良好的水分散性、稳定性和较高的疏水药物装载能力；同时，由于其表面带有正电荷，可以在水环境中装载外源核酸分子，形成稳定的基因/疏水药物双载型纳米粒子，并可快速进入细胞。将其应用于农业领域，可以同时负载疏水性农药及外源核酸，通过基因、药物双载的方式杀虫能有效提高害虫死亡率。
Description
技术领域
本发明属于农业及生物医药技术领域，具体涉及一种双载基因和药物的线性嵌段共聚物纳米载体的制备方法及应用。
背景技术
药物递送系统对于提高给药选择性、有效性和安全性具有重要意义。用于医药和农业中的药物分子结构多具有疏水特性，在使用过程中易发生团聚，使药效降低。药物递送系统能够有效改善其水溶性，提高递送效率。对于蛋白或核酸类药物，其自身的稳定性较差，容易失活，因此需要借助药物递送系统提高其环境稳定性。
药物载体是药物传递系统的核心，可以通过将药物包裹在载体内部或结合在外壳层负载药物。目前对脂质体、嵌段共聚物分子、树枝状分子及介孔无机颗粒等载体的载药特性及制备方法研究已经较为广泛。人们研发出能够同时装载化学药物和基因的双载纳米载体，在农业杀虫和疾病治疗等领域展现出良好应用前景。然而，目前应用在农业杀虫的双载纳米载体存在装载效率不高的问题。因此，开发能够高效负载疏水药物并且能够负载基因的载体意义重大。
发明内容
为解决现有技术的问题，本发明提供一种双载基因和药物的线性嵌段共聚物纳米载体的制备方法及应用。
所述线性嵌段共聚物的化学结构式为：
其中，R1和R2可分别取为H、CH3、CH2CH3或CH2CH2CH3；X的取值范围为1-200；Y的取值范围为1-500。
所述线性嵌段共聚物的制备方法为:
(1)将正丁醇与ε-己内酯单体混合反应获得线性聚己内酯；
(2)将线性聚己内酯与2-溴-2-甲基丙酰溴混合反应得到线性大分子引发剂；
(3)将线性大分子引发剂与含氮的丙烯酸酯类单体混合，加入催化剂和配体反应即得线性嵌段共聚物。
所述正丁醇与ε-己内酯单体的摩尔比为1:1-200，优选1:1-80。该配比范围使所得产物具有较低的分子量分布。
所述步骤(1)中还加入ε-己内酯单体质量5-10％的辛酸亚锡进行混合反应。
所述步骤(1)的反应温度为70-110℃，优选70-90℃，反应时间为5-15h。
所述步骤(2)的反应温度为0-50℃，反应时间为20-50h。
所述含氮的丙烯酸酯类单体选自甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、1-乙烯基-2-吡咯烷酮、N-异丙基丙烯酰胺、甲基丙烯酸二乙氮乙酯、甲基丙烯酸二丙氮乙酯、甲基丙烯酸-N-(叔丁氧羰基)氨基乙酯中的一种或几种。
所述催化剂为溴化亚铜、氯化亚铜、碘化亚铜或氯化亚铁中一种或几种。
所述配体为2,2-联吡啶、N,N,N’,N’,N”-五甲基二亚乙基三胺、三(2-二甲氮乙基)胺或1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺中一种或几种。
所述步骤(3)的反应温度为50-80℃，优选60-65℃，反应时间为3-24h，优选3-15h。
所述步骤(3)中线性大分子引发剂、含氮的丙烯酸酯类单体、催化剂和配体的摩尔比为1:20-500:1-40:2-80，优选1:100-400:10-30:20-60。
所述步骤(1)反应得到的混合物使用二氯甲烷溶解，然后逐滴滴加至冰甲醇中，再通过离心或抽滤的方式获得固体产物，即为线性聚己内酯。
所述步骤(2)的具体操作为：将线性聚己内酯与缚酸剂溶于有机溶剂中，线性聚己内酯的浓度为0.01-1.0g/mL；将2-溴-2-甲基丙酰溴溶于有机溶剂中，2-溴-2-甲基丙酰溴的浓度为0.1-10g/mL；在非氧条件下，0-5℃温度下，将2-溴-2-甲基丙酰溴溶液加入到线性聚己内酯溶液中混合反应，反应完成后，混合液滴加至冰甲醇中沉淀以除去混合液中的副产物及有机溶剂。然后，利用冰甲醇洗涤，通过离心或抽滤获得线性大分子引发剂固体。
所述缚酸剂为三乙胺、碳酸钾或碳酸钠中的一种或几种；线性聚己内酯与缚酸剂的摩尔比为1:50-100。
所述线性聚己内酯与2-溴-2-甲基丙酰溴的摩尔比为1:10-50。
所述步骤(2)中的有机溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷中的一种或几种。
所述步骤(3)中线性大分子引发剂与含氮的丙烯酸酯类单体加入有机溶剂中混合，有机溶剂为四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷中的一种或几种。
将线性聚己内酯与2-溴-2-甲基丙酰溴分别溶于有机溶剂中再混合，可以降低反应底物浓度，从而降低反应速率，减少因反应热而产生的副反应，提高反应率。非氧以及低温条件下以每分钟10-120滴的速度逐滴滴加混合反应可以降低反应速度，减少副反应的产生。
将上述制备的线性嵌段共聚物作为载体与农药、医药、蛋白质、核酸中的一种或多种形成纳米复合体的应用。
本发明通过正丁醇与ε-己内酯单体的开环聚合和线性大分子引发剂与含氮的丙烯酸酯类单体的原子转移自由基聚合得到聚己内酯-聚丙烯酸酯类嵌段共聚物。该共聚物载体可组装成50-300nm的纳米粒子，具有良好的水分散性、稳定性和较高的疏水药物装载能力；同时，由于其表面带有正电荷，可以在水环境中装载外源核酸分子，形成稳定的基因/疏水药物双载型纳米粒子，并可快速进入细胞。将其应用于农业领域，可以同时负载疏水性农药及外源核酸，通过基因、药物双载的方式杀虫能有效提高害虫死亡率。本发明的制备方法所使用的试剂种类少，试剂价格低廉，且制备工艺简单，易于调控。
附图说明
图1为本发明实施例1中的线性聚己内酯的核磁谱图。
图2为本发明实施例1中的线性大分子引发剂的核磁谱图。
图3为本发明实施例1中的线性嵌段共聚物M的核磁谱图。
图4为本发明试验例1中M载体的载药前后的紫外吸收光谱图。
图5为本发明试验例2中M载体的基因水平凝胶电泳图。
图6为本发明试验例3中M载体负载阿维菌素及基因前后的扫描电镜。
图7为本发明试验例4中M载体的体外细胞摄取转染图。
图8为本发明试验例5中M载体的基因、药物双功能杀虫致死率图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明所讲述的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
(1)制备线性聚己内酯PCL45
将54mmolε-己内酯单体、1.35mmol正丁醇和ε-己内酯单体和辛酸亚锡混合加至反应管中，辛酸亚锡加入量为ε-己内酯单体质量的5％；将反应管密封，进行3次冷冻-抽排循环后，置于90℃的油浴锅中进行聚合反应9h，通过液氮冷却停止反应。加入二氯甲烷至产物溶解后，然后逐滴滴加至冰甲醇中，抽滤并用冰甲醇洗涤，最终得到白色固体粉末，将产物真空干燥，最终可得到产物线性聚己内酯PCL45产物5.1g，产率83％。
(2)制备线性大分子引发剂PCL45-Br
在反应瓶中加入线性聚己内酯0.58mmol，加入无水二氯甲烷30mL至聚己内酯溶解，加入三乙胺40mmol，制得第一混合液。随后氮气保护下在0℃的冰水浴条件下滴加含13.04mmol的2-溴-2-甲基丙酰溴的二氯甲烷溶液10ml。待滴加结束，反应体系先在冰水浴下反应0.5h，随后于25℃搅拌反应24h，用甲醇终止反应。将混合液滴加至冰甲醇中，大量白色粉末析出。抽滤并用冰甲醇洗涤至滤液无色，滤饼为白色固体粉末产物，将其真空干燥，可得到线性大分子引发剂PCL45-Br产物2.4g，产率为78％。
(3)制备线性嵌段共聚物M
将0.04mmol线性大分子引发剂PCL45-Br和6.07mmol单体甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)溶解于2mL干燥的四氢呋喃中，进行3次冷冻-抽排循环。在氮气保护下，加入0.1mmol溴化亚铜和0.21mmol N,N,N’,N’,N”-五甲基二亚乙基三胺，再次冷冻抽排后，在65℃下反应5h。反应结束通过液氮冷却及空气暴露中止反应。将反应液在水中透析至无色，冷冻干燥，最终得到白色固体产物280mg，产率为60％。
所得线性嵌段共聚物M的化学结构式为：
试验例1
选择常用的疏水性农药阿维菌素进行载药测试。利用紫外吸收光谱及动态光散射仪测试不同投料质量比下的载药量、包封率、电位及粒径。实验结果表明载体可以有效将微米级的阿维菌素增溶，且载体越多，药物包封率越高，且由阿维菌素不带电荷，基本不影响复合物表面电荷。参照说明书附图4及表1。
表1M载体与阿维菌素不同投料比下的载药性能及粒径电位变化汇总表
试验例2
利用琼脂糖DNA凝胶电泳实验研究线性嵌段共聚物载体M对RNA的负载能力，并寻求最佳N/P(载体刚好能够将RNA完全固定时的比值)。单独的DNA在凝胶电泳中会发生迁移，当N/P＝2:1时，DNA被载体完全固定，不再出现DNA迁移带。参照说明书附图5。
试验例3
使用动态粒径光散射仪(DLS)测试粒径及Zeta电位，并通过扫描电镜观察形貌。运用DLS可以测出M载体可以同时负载药物阿维菌素及dsRNA。线性嵌段共聚物载体M电位约为+63.0mV，负载药物噻虫嗪后电位变为+62.2mV，基本不变。同时负载药物阿维菌素及dsRNA后电位降低至+15.2mV。另外，从扫描电镜也可以看出负载阿维菌素及基因的载体为球状纳米颗粒。参照说明书附图6及表2。
表2M载体基因、药物双载前后的粒径及电位变化汇总表
试验例4
使用害虫细胞测试了双载纳米载体的体外转染能力。合成了带绿色荧光的dseGFP，细胞示踪实验证明M/AVM/基因复合物可以成功进入细胞。实验分四个组，M/AVM/dseGFP为实验组，单独M载体组、单独dseGFP基因组、M/dseGFP组为对照组，分别在12h及24h进行成像。为方便细胞定位，将细胞核进行染色(蓝色)。如图7所示，M载体组及dseGFP组只有细胞核染料的蓝色标记，说明单独的dseGFP不易进入细胞；M/dseGFP组及M/AVM/dseGFP组在12h均出现了少量的绿色荧光，且24h后绿荧光更多，说明负载阿维菌素的载体可以成功递送dseGFP进入细胞。
试验例5
基因/药物双载纳米载体杀虫试验。蚜虫生物测定结果显示，载体对照组(PET28a/M)的蚜虫5天死亡率为30.5％，AVM对照组的蚜虫5天死亡率为59.3％，AVM/M组的蚜虫5天死亡率为78.3％，这说明载体可以有效提高阿维菌素的毒杀效果；Hem/M对照组的蚜虫5天死亡率为66.2％，而通过Hem/AVM/M双载，将致死率提高到了91.5％，明显优于其他对照组。上述结果表明，合成的双载型载体可以同时负载阿维菌素及Hem基因，高效穿透蚜虫体壁，成功建立了纳米载体双载的协同杀虫方式，有效提高了杀虫效率。致死率参照说明书附图8。
Claims (3)
1.一种双载疏水药物和基因的纳米复合体作为杀虫剂的应用，其特征在于，所述疏水药物为阿维菌素；所述的基因为Hem基因；所述的疏水药物和基因负载的载体为线性嵌段共聚物，其化学结构式为：
所述线性嵌段共聚物的制备方法为:
(1)将正丁醇与ε-己内酯单体混合反应获得线性聚己内酯；
(2)将线性聚己内酯与2-溴-2-甲基丙酰溴混合反应得到线性大分子引发剂；
(3)将线性大分子引发剂与甲基丙烯酸二甲氨基乙酯单体混合，加入催化剂和配体反应即得线性嵌段共聚物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述催化剂为溴化亚铜、氯化亚铜、碘化亚铜或氯化亚铁中一种或几种。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述配体为2,2-联吡啶、N,N,N’,N’,N”-五甲基二亚乙基三胺、三(2-二甲氮乙基)胺或1,1,4,7,10,10-六甲基三乙烯四胺中一种或几种。
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