CN104004149B - 一种可荧光实时监测抗癌药物释放的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及两亲性嵌段聚合物、由其组成的聚合物纳米粒子以及该聚合物纳米粒子的制备方法和应用。更具体地，所述两亲性嵌段聚合物由亲水链段和疏水链段通过原子转移自由基聚合(ATRP)和点击化学方法获得，其中所述亲水链段是端基修饰了溴基元的聚乙二醇，其分子量为1000～20000Da，并且所述疏水链段为下式所示，其中m＝29～38并且n＝0～11。通过使用上述两亲性嵌段聚合物，本发明实现了聚合物纳米载体负载的疏水分子的可控释放，同时聚合物上香豆素基元的荧光增强，可以通过聚合物上香豆素的荧光来同步跟踪药物的释放。

Description

一种可荧光实时监测抗癌药物释放的方法

技术领域

本发明涉及高分子材料及其应用，更具体地，涉及一种刺激响应性的两亲性嵌段聚合物、由该两亲性嵌段聚合物组成的聚合物纳米粒子及其制备方法和应用。

背景技术

由两亲性嵌段聚合物形成的聚合物组装体在药物传输中的应用一直以来广受人们的关注，因为它相对于小分子药物具有更好的生物相容性和较长的血液循环时间。尽管主动靶向和被动靶向的方法可以增强药物在体内传输过程中的位点选择性，将刺激响应性的作用融合到嵌段聚合物体系中也是十分必要的，它可以使其到达特定部位后实现触发释放，如释放治疗药物或者造影剂等(Y.Bae,S.Fukushima,A.Harada,K.Kataoka,Angew.Chem.Int.Ed.2003,42,4640-4643)，同时增加传输的准确度和提高药物的生物活性。精准设计的嵌段聚合物组装体是纳米尺度上的，它可以在一定外界刺激下实现组装体的解离。在以往的研究中，具有pH，温度，酶或还原响应性的体系被广泛用于生物响应性的聚合物纳米载体。

考虑到嵌段聚合物纳米载体在实际诊疗中的应用，设计一种可以在亚细胞层面上示踪药物的传输过程的体系是十分必要的。近期，可在生理环境下断键且可以通过荧光示踪的小分子被报道(M.H.Lee,J.H.Han,P.S.Kwon,S.Bhuniya,J.Y.Kim,J.L.Sessler,C.Kang,J.S.Kim,J.Am.Chem.Soc.2012,134,1316-1322)。尽管传统的荧光标记的聚合物可以用来实现荧光成像，但这种“始终存在”的荧光性质限制了它在细胞层次上的应用。

发明内容

本发明的目的是通过监测荧光的变化来示踪药物的传输和释放过程，解决传统荧光标记聚合物无法实现示踪药物释放这一问题，为此提供了一 种刺激响应性两亲性嵌段聚合物、由该两亲性嵌段聚合物组成的聚合物纳米载体及其制备方法和应用。

具体的，本发明提供以下各项：

1.一种两亲性嵌段聚合物，所述两亲性嵌段聚合物包括亲水链段和疏水链段，所述疏水链段组成如下式所示，

其中m＝29～38并且n＝0～11。

2.如1所述两亲性嵌段聚合物，其中所述亲水链段是端基修饰了溴基元的聚乙二醇，其分子量为1000～20000Da。

3.如1或2所述两亲性嵌段聚合物，其中所述两亲性嵌段聚合物通过原子转移自由基聚合(ATRP)和点击化学方法获得。

4.如1或2所述的两亲性嵌段聚合物，其特征在于，所述两亲性嵌段聚合物具有下式I结构

式I：

其中x＝23～445，m＝29～38并且n＝0～11。

5.如4所述两亲性嵌段聚合物的制备方法，包括以下步骤：

a)由式A的亲水链段通过ATRP法得到式B结构；

b)再由式B和式C通过点击化学方法获得所述两亲性嵌段聚合物。

式A：

式B：

式C：

其中x＝23～445，m＝29～38并且n＝0～11。

6.一种由1-4任一项所述的两亲性嵌段聚合物组成的聚合物纳米粒子，其特征在于，所述聚合物纳米粒子尺寸为60～150nm，且具有温度响应性。

7.一种示踪纳米粒子的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将6所述的两亲性嵌段聚合物组成的聚合物纳米粒子形成水分散液；

b)加入谷胱甘肽，其加成到香豆素基元的双键上，香豆素基元的荧光随之由弱变强，并且加成后使原来的疏水嵌段转变成亲水性嵌段。

8.如7所述的方法，其中加成的反应条件为pH＝7.4，温度为37℃，谷胱甘肽作用浓度为10mM。

9.如6所述的聚合物纳米粒子作为药物载体的应用。

10.如6所述的聚合物纳米粒子用于荧光实时监控药物释放的用途。

本发明实现了聚合物纳米载体负载的疏水分子的可控释放，同时聚合物上香豆素的荧光增强，可以通过聚合物上香豆素的荧光来同步跟踪药物的释放。

发明详述

以下对本发明的技术方案做进一步详细阐述。应当指出，本发明的各实施方案可以根据需要以任何方式组合。

聚合物纳米粒子通常可以由两亲性嵌段聚合物自组装形成，含有疏水 的核和亲水的壳层。因此，疏水的物质，如疏水药物被负载在聚合物纳米粒子中，通过设计响应性的聚合物纳米粒子可以实现药物的可控释放。然而，在亚细胞层次上跟踪这一释放过程却比较困难。尽管传统的荧光标记的聚合物纳米载体可以用来实现荧光成像，但这种“始终存在”的荧光性质限制了它在细胞层次上的应用。

本发明中，我们提出了一种全新的策略来解决传统荧光标记聚合物无法实现示踪药物释放这一问题。具体来讲，我们设计了一种嵌段聚合物，该聚合物疏水链段含有可在外界刺激作用下实现亲疏水转变的香豆素基元。聚合物在水中自组装成纳米粒子后，香豆素基元分布于纳米粒子的疏水核中，在中性环境下加入谷胱甘肽，谷胱甘肽会加成到香豆素基元的双键上，香豆素基元的荧光由弱变强，并且香豆素基元和谷胱甘肽发生迈克尔加成后可使原来的疏水嵌段转变成亲水性很好的嵌段，所以这一过程同时也伴随着胶束粒子的解离，从而释放疏水抗癌药物。

在本发明的一个方面，提供一种两亲性嵌段聚合物，其特征在于，所述两亲性嵌段聚合物由亲水链段和疏水链段通过原子转移自由基聚合(ATRP)和点击化学方法获得，其中所述亲水链段是端基修饰了溴基元的聚乙二醇，其分子量为1000～20000Da，并且所述疏水链段为下式所示，

其中m＝29～38并且n＝0～11。

应该注意的是，所述亲水链段不限于端基修饰了溴基元的聚乙二醇，本领域中常用的包裹疏水核心的亲水聚合物均可以用于本发明；所述两亲性聚合物的制备方法不限于ATRP和点击化学方法，还可以使用本领域技术人员知晓其它适合的合成方法。

在一个优选实施方式中，所述两亲性嵌段聚合物具有下式I并且由式A的亲水链段出发通过ATRP方法和点击化学方法获得。

式I：

式A：

其中x＝45，m＝29～38并且n＝0～11。

在本发明的另一个方面，提供一种所述两亲性嵌段聚合物组成的聚合物纳米粒子，所述聚合物纳米粒子分散均匀，尺寸为30～150nm。在一个优选实施方式中，所述纳米粒子尺寸约为125nm左右。在进一步优选的实施方案中，所述纳米粒子具有温度响应性。

在本发明的另一个方面，提供一种示踪纳米粒子的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将所述两亲性嵌段聚合物形成聚合物纳米粒子水分散液，和在pH＝7.4温度为37℃下，将所述聚合物纳米粒子水分散液加入谷胱甘肽使得谷胱甘肽的浓度为10mM，从而可以使胶束解离，同时聚合物上香豆素基元荧光增强。

在一个优选实施方式中，所述聚合物纳米粒子水分散液如下形成：将所述两亲性嵌段聚合物溶解在作为共溶剂的有机溶剂中，在一定温度和搅拌条件下向其中加入净化水，并将所得的聚合物纳米粒子于一定温度放置于透析袋中以透析除去所述有机溶剂，从而获得所述聚合物纳米粒子水分散液。

在一个优选实施方式中，所述反应如下发生：在所述谷胱甘肽加入时，所述两亲性嵌段聚合物中的疏水链段的香豆素侧基与谷胱甘肽发生迈克尔加成反应，从而在聚合物侧链上引入亲水性很强的基元，使得聚合物的临界胶束温度升高，从而使得所述聚合物纳米粒子发生解离。

在本发明的另一个方面，提供上述聚合物纳米粒子作为药物载体的应用。

在本发明的另一个方面，提供上述聚合物纳米粒子用于荧光实时监控药物释放的用途。

附图说明

图1示出了根据本发明一个实施方式的中间体1,2及小分子M1的核磁氢谱。

图2示出了根据本发明一个实施方式的小分子M1的核磁碳谱。

图3示出了根据本发明一个实施方式的小分子M1的电喷雾质谱。

图4示出了根据本发明一个实施方式的聚合物纳米粒子的动态光散射和电镜图片。

图5示出了根据本发明一个实施方式的聚合物纳米粒子用谷胱甘肽处理后的散射强度的变化和荧光变化。

图6示出了根据本发明一个实施方式的聚合物纳米粒子中的阿霉素释放曲线。

图7示出了根据本发明一个实施方式的聚合物纳米粒子的共聚焦荧光图片。

图8示出了根据本发明一个实施方式的聚合物纳米粒子的共聚焦荧光共定位比例图片。

具体实施方式

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

首先是结合有机化学中的化学反应来制备带有炔基以供改性到聚合物上的香豆素基元，在相应的刺激触发作用下，可以发生迈克尔加成反应。其特征在于，所述香豆素基元具有以下结构：

然后，利用端基修饰溴的聚乙二醇(PEG-Br)作为引发剂，采用原子转移自由基聚合(ATRP)这一活性自由基聚合方式聚合二甘醇单甲醚甲基丙烯酸酯,二甘醇单乙醚甲基丙烯酸酯和叠氮单体，得到的聚合物再通过点击化学方法与香豆素基元反应，制得疏水链段聚合度以及聚合度分布均可控的两亲性嵌段聚合物。

优选地，后得到的合适亲水、疏水链段长度的两亲性嵌段聚合物采用共溶剂-加水的方法进行自组装。具体过程为：将聚合物充分溶解在二甲亚砜中，在一定温度和搅拌作用下向其缓慢加入超纯水，然后在一定温度下用透析的方式除去有机溶剂，即可得到几十到一百多纳米尺寸的纳米粒子。

利用自组装所得到的纳米粒子，在外加刺激作用下可以改变核的亲疏水性质，从而实现解离，同时伴随着香豆素基元荧光的增强。

以下实施例将对本发明作进一步说明，其目的仅在于更好地理解本发明的目的，而不是限制本发明的保护范围。

制备例1

第一步，制备如下小分子M1：

其特征为：分子上的烯酮结构可淬灭香豆素的荧光，在有巯基存在情况下，巯基可以与双键发生迈克尔加成反应，反应后香豆素的荧光增强，同时该分子由疏水性转变为亲水性。

制备方法：

将44g间苯二酚(国药)溶于150mL乙腈中(0-5℃)，将干燥后的N，N-二甲基甲酰胺(12.6g，128mmol)和干燥的三氯氧磷(22.6g，146mmol，国药)混合后滴入乙腈溶液中，两小时后，将反应得到的盐抽滤收集。将100mL水加入盐中并加热至50℃，水解30分钟后冷却至室温，有白色晶体析出，收集晶体。将收集到的晶体(10g)与8.33g溴丙炔(阿尔法试剂)及19.35g无水碳酸钾加入到100mL丙酮中并加热至50℃反应3小时，随后将反应液冷却至室温，过滤除去不溶物。旋蒸滤液后通过柱层析的方法得到中间体1(3.2g，26％)。其结构式如下所示：

将1.72g上述中间体1与1.43g乙酰乙酸乙酯(国药)及0.1g哌啶(国药)和0.1ml乙酸加入到15mL无水乙醇中，混合液加热回流12小时后冷却至室温，有大量黄色固体析出，抽滤后对其用乙醇进行重结晶，得到中间体2(1.53g，65％)。其结构式如下所示：

将1.4g上述中间体2与2-醛基吡啶溶于体积分数1:1的乙醇和乙腈中(各为20mL)，加入0.4g哌啶作为催化剂。混合液加热回流24小时，旋蒸除去溶剂得到粗产物，进一步通过用乙醇对其重结晶得到纯品M1(0.77g，40％)。中间体1，2的核磁氢谱示于图1，小分子M1的结构通过核磁氢谱、核磁碳谱与高分辨率质谱进行表征，结果分别显示于图1-3。这些核磁图谱和质谱数据都充分证明了所合成的分子。

第二步，用ATRP聚合手段进一步制备两亲性嵌段聚合物，其反应通式如下所示：

其特征为：聚乙二醇(PEG)链段作为亲水链段，其链段长度(可以任意选择，如PEG聚合度x＝23～445；疏水链段的m和n可以通过改变聚合参数和条件来有效的改变。本领域技术人员理解，对于本发明来说，聚合度m和n不是关键，只要对本发明没有有害影响即可。为了更清楚地帮助理解，以下选用x＝45且m＝32，n＝4的聚合物为例说明，其中疏水链段末端为ATRP聚合后保留的端基溴基团，为方便显示，以下均省略显示此端基。

制备方法：将1.6g二甘醇单甲醚甲基丙烯酸酯单体、0.232g二甘醇单乙醚甲基丙烯酸酯单体、0.18g叠氮单体、0.468g PEG-Br引发剂和37mg五甲基二乙烯三胺配体溶于2.5mL异丙醇，加入到含磁力搅拌子的封管中，充分脱气后加入30mg的溴化亚铜，再脱气一次后封管，置于35℃的油浴中。聚合反应6小时后终止反应，过硅胶柱除去铜盐，将所得溶液旋蒸后沉淀于无水乙醚中，沉淀三次，真空烘箱干燥，得到无色聚合物1.78g(72％)。

第三步，用点击化学方法制备带有香豆素基元侧基的两亲性嵌段聚合物，点击化学反应式及其产物P1的结构式如下所示：

其特征为：聚乙二醇(PEG)链段作为亲水链段，选用x＝45且m＝32，n＝4。

制备方法：将第二步得到的聚合物0.5g以及78mg的M1和41mg的五甲基二乙烯三胺溶于3mLN,N-二甲基甲酰胺中，加入到含磁力搅拌子的封管中，充分脱气后加入34mg的溴化亚铜，再脱气一次后封管，置于35℃的油浴中。聚合反应24小时后终止反应，过硅胶柱除去铜盐，将所得溶液旋蒸后沉淀于无水乙醚中，沉淀三次，真空烘箱干燥，得到淡黄色聚合物425mg(74％)(P1)。

第四步：自组装制备纳米粒子与谷胱甘肽存在条件下纳米粒子的解离。具体如下：

(1)将5mg P1聚合物溶解于1mL二甲亚砜共溶剂中，37℃搅拌条件下以5mL/h的速度向其中加入9mL超纯水。所得的蓝光溶液放置于透 析袋中，37℃透析于水，透析12小时后除尽有机溶剂。从而得到直径大小125nm左右的纳米粒子。

如上方法所得纳米粒子的特征如下：

i)纳米粒子由疏水的核(含有M1侧基)和亲水的PEG层构成，其粒径为125nm左右，尺寸分布较均一。图4示出了动态光散射数据和TEM图片。

ii)聚合物存在临界胶束温度，该聚合物的临界胶束温度为32℃。

(2)将所述聚合物纳米粒子的水分散液在pH＝7.4和温度为37℃的条件下，向所得聚合物纳米粒子水分散液中加入谷胱甘肽并使得谷胱甘肽的浓度为10mM，谷胱甘肽将会与聚合物胶束核中的M1基团发生迈克尔加成反应，使胶束的核的亲水性大大上升，从而诱导胶束的解离。同时聚合物上香豆素基元的荧光增强。图5示出了聚合物纳米粒子溶液加入谷胱甘肽后的胶束解离和荧光的增强。

应用例1：P1聚合物纳米粒子对疏水药物的负载与可控释放

在聚合物P1的自组装之前，将药物阿霉素(武汉大华制药)与P1一起溶于二甲亚砜中，加入5倍于阿霉素当量的三乙胺，然后如制备例中提及的方法进行自组装，得到同时负载疏水药物的纳米粒子，由此制备了纳米粒子的药物载体。

参照制备例中所述，在pH为7.4温度为37℃条件下对纳米粒子水分散中加入谷胱甘肽使得谷胱甘肽的浓度为10mM。结果表明：包载在疏水核中的疏水药物阿霉素很快释放，这是由于聚合物链上的香豆素基元与巯基加成后，亲水性大大上升，临界胶束温度由原来的32℃上升至84℃，聚合物胶束解离，从而达到药物释放的目的。图6示出了在不同浓度谷胱甘肽存在时，包埋在疏水内核的阿霉素的释放曲线图。

应用例2：P1聚合物纳米粒子的荧光性质及其在细胞成像方面的应用

收集对数期的A549细胞，接种至可用于共聚焦荧光拍摄的四孔板中，每孔约含3万个细胞。37℃，5％二氧化碳细胞培养箱中培养24小时后按照拍照所需在不同时间加入包裹阿霉素的聚合物P1纳米粒子(最终浓度 为0.4g/L)使其共培养时间为1小时，6小时，12小时。拍共聚焦图片之前半小时用可特异性染晚期内涵体和溶酶体的绿色荧光染料来标记，拍照前将细胞用磷酸盐缓冲液清洗两次，加入培养基后进行荧光共聚焦拍摄。结果表明：蓝色荧光通道的光强度随着培养时间的增加而增强，同时内涵体和阿霉素的荧光共定位比例下降，说明了负载阿霉素的纳米粒子从内涵体中逃逸出来进入细胞质中，从而可以与细胞质中的谷胱甘肽发生迈克尔加成反应，使胶束解离，蓝色荧光增强。图7示出了不同共培养时间和不同荧光通道的共聚焦荧光图片。图8示出了阿霉素荧光和内涵溶酶体标记荧光及香豆素荧光和内涵溶酶体标记荧光的共定位比例随培养时间的变化。

制备例2

为了考察两亲性嵌段聚合物上的两种单体(二甘醇单甲醚甲基丙烯酸酯和二甘醇单乙醚甲基丙烯酸酯)的组成比例的不同对聚合物临界胶束温度的影响，发明人合成了具有不同比例单体组成的聚合物。

第一步，用ATRP聚合和点击化学方法制备两亲性嵌段聚合物。

具体制备方法：将1.39g二甘醇单甲醚甲基丙烯酸酯单体、0.465g二甘醇单乙醚甲基丙烯酸酯单体、0.18g叠氮单体、0.468g PEG-Br引发剂和37mg五甲基二乙烯三胺配体溶于2.5mL异丙醇，加入到含磁力搅拌子的封管中，充分脱气后加入30mg的溴化亚铜，再脱气一次后封管，置于35℃的油浴中。聚合反应6小时后终止反应，过硅胶柱除去铜盐，将所得溶液旋蒸后沉淀于无水乙醚中，沉淀三次，真空烘箱干燥，得到无色聚合物1.63g(65％)。将得到的聚合物0.5g以及73mg的M1和38mg的五甲基二乙烯三胺溶于3mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入到含磁力搅拌子的封管中，充分脱气后加入31mg的溴化亚铜，再脱气一次后封管，置于35℃的油浴中。聚合反应24小时后终止反应，过硅胶柱除去铜盐，将所得溶液旋蒸后沉淀于无水乙醚中，沉淀三次，真空烘箱干燥，得到淡黄色聚合物407mg(71％)(P2)。P2的结构式如下所示：

其特征为：聚乙二醇(PEG)链段作为亲水链段，选用x＝45且m＝30，n＝8。

第二步：自组装制备纳米粒子。具体如下：

将5mg P1聚合物溶解于1mL二甲亚砜共溶剂中，37℃搅拌条件下以5mL/h的速度向其中加入9mL超纯水。所得的蓝光溶液放置于透析袋中，37℃透析于水，透析12小时后除尽有机溶剂。如上方法所得纳米粒子的特征如下：

i)纳米粒子由疏水的核(含有M1侧基)和亲水的PEG层构成，其粒径为100nm左右，尺寸分布较均一。

ii)聚合物存在临界胶束温度，该聚合物的临界胶束温度为27℃，用谷胱甘肽处理后的聚合物临界胶束温度为75℃。

以上已对本发明进行了详细描述，但本发明并不局限于本文所描述具体实施方式。本领域技术人员理解，在不背离本发明范围的情况下，可以作出其他更改和变形。本发明的范围由所附权利要求限定。

Claims (9)

1.一种两亲性嵌段聚合物，所述两亲性嵌段聚合物包括亲水链段和疏水链段，所述疏水链段组成如下式所示，

其中m＝29～38并且n＝0～11，

其中所述亲水链段是端基修饰了溴基元的聚乙二醇，其分子量为1000～20000Da。

2.如权利要求1所述两亲性嵌段聚合物，其中所述两亲性嵌段聚合物通过原子转移自由基聚合(ATRP)和点击化学方法获得。

3.如权利要求1所述的两亲性嵌段聚合物，其特征在于，所述两亲性嵌段聚合物具有下式I结构

式I：

其中x＝23～445，m＝29～38并且n＝0～11。

4.如权利要求3所述两亲性嵌段聚合物的制备方法，包括以下步骤：

a)由式A的亲水链段通过ATRP法得到式B结构；

b)再由式B和式C通过点击化学方法获得所述两亲性嵌段聚合物，

式A：

式B：

式C：

其中x＝23～445，m＝29～38并且n＝0～11。

5.一种由权利要求1-3任一项所述的两亲性嵌段聚合物组成的聚合物纳米粒子，其特征在于，所述聚合物纳米粒子尺寸为60～150nm，且具有温度响应性。

6.一种示踪纳米粒子的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将权利要求5所述的两亲性嵌段聚合物组成的聚合物纳米粒子形成水分散液；

b)加入谷胱甘肽，其加成到香豆素基元的双键上，香豆素基元的荧光随之由弱变强，并且加成后使原来的疏水嵌段转变成亲水性嵌段。

7.如权利要求6所述的方法，其中加成的反应条件为pH＝7.4，温度为37℃，谷胱甘肽作用浓度为10mM。

8.如权利要求5所述的聚合物纳米粒子作为药物载体的应用。

9.如权利要求5所述的聚合物纳米粒子用于荧光实时监控药物释放的用途。