CN103588940A - 两亲性嵌段聚合物、聚合物囊泡及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及两亲性嵌段聚合物、由其组成的聚合物囊泡以及该聚合物囊泡的制备方法和应用。更具体地，所述两亲性嵌段聚合物由亲水链段和疏水链段通过可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)法获得，其中所述亲水链段是端基修饰了三硫酯的聚乙二醇，其分子量为1000～20000Da，并且所述疏水链段组成为下式所示，其中m=1～11并且n=1～11。通过使用上述两亲性嵌段聚合物，本发明实现了囊泡负载的亲水和疏水分子的可控同步释放，刺激调控囊泡负载的酶反应器的生物催化活性。另外，在刺激触发交联的过程中，聚合物囊泡的双层膜中产生的筛状亲水通道和膜的渗透性能够通过刺激的持续时间来控制。

Description

两亲性嵌段聚合物、聚合物囊泡及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及高分子材料及其应用，更具体地，涉及一种刺激响应性的两亲性嵌段聚合物、由该两亲性嵌段聚合物组成的聚合物囊泡及其制备方法和应用。

背景技术

探索复杂的生物系统(如细胞和病毒)的结构和功能一直以来激发着各种人工自组装纳米结构的形成，其中以脂质体囊泡和聚合物囊泡为最典型实例。这两种囊泡都有一个由疏水双层膜包裹形成的亲水内腔。囊泡被越来越多的用来构筑药物传输纳米载体、纳米反应器和人工细胞器等(Wolfgang Meier，et al.Acc.Chem.Res.2011，44，1039-1049)。显然，所有的这些应用中都与物质在囊泡膜内外的有效交换密切相关。然而，与脂质体囊泡相比，结构更稳定的聚合物囊泡却面临着严重的膜渗透性问题(Adi Eisenberg，et al.Science2002，297，967-973)，如有机小分子物质、离子甚至水都很难渗透。目前，已经发展了一些方法来提高聚合物囊泡的渗透性，主要包括：将通道蛋白合并到双层膜中，引入刺激敏感的聚合物(如pH、CO₂、葡萄糖响应的聚合物)，带相反电荷的聚合物共同组装，螺旋的棒状-嵌-柔性链聚合物的自组装，还有囊泡膜的后改性法。以上这些策略要么需要外加一些物质，具有复杂的制造过程，要么不能对渗透性进行很好的调控；更重要的是，这些方法都面临降低囊泡稳定性甚至破坏囊泡结构的风险。

另一方面，尽管聚合物囊泡的膜内链段侧向流动性相比于脂质体囊泡降低了，从而其化学和物理稳定性提高了，但是面对很多实际情况，聚合物囊泡结构仍会瓦解，如高度稀释、强剪切作用、遇有机溶剂或在其它更为复杂的环境中应用。最新研究表明，聚合物囊泡的稳定性仍然需要进一步提高(S.P Armes，et al.Langmuir2012，28，1196-1205)。传统的化学交联的方法已经被用来尝试解决聚合物囊泡的稳定性问题，如申请号为201210084255.1的中国专利申请公开了一种制备交联聚合物囊泡来提高其稳定性的方法。但是，现有的通过交联的方法来增强稳定性的同时又会进一步削弱囊泡对亲水或疏水物质的膜渗透能力(Dennis E.Discher，et al.J.Phys.Chem.B2002，106，2848-2854)。因此，同时增强聚合物囊泡双层膜的渗透性和其微结构的稳定性依然是一个严重的挑战和亟待解决的问题，而设计这样的优化聚合物囊泡需要引入新的交联化学并在交联反应发生的同时产生大量的官能基团的转换。

发明内容

本发明的目的是为了解决同步增强聚合物囊泡的稳定性与渗透性的问题，为此提供了一种刺激响应性两亲性嵌段聚合物、由该两亲性嵌段聚合物组成的聚合物囊泡及其制备方法和应用。

在一方面，本发明提供一种两亲性嵌段聚合物，其特征在于，所述两亲性嵌段聚合物由亲水链段和疏水链段通过可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)法获得，其中所述亲水链段是端基修饰了三硫酯的聚乙二醇，其分子量为1000～20000Da，并且所述疏水链段为下式所示，

其中，

其中m=1～11并且n=1～11。

在一个优选实施方式中，所述两亲性嵌段聚合物具有下式I并且由式A的亲水链段和式B的疏水链段通过RAFT法获得，

式I：

式A：

式B：

其中，

其中x=23～445，y=12～150并且m=1～11。

在另一方面，本发明提供一种上述两亲性嵌段聚合物组成的聚合物囊泡，其特征在于，所述聚合物囊泡的最外层和最里层是由所述两亲性嵌段共聚物中的亲水链段构成，所述最外层和最里层之间的中间层(即囊泡的双层膜部分)由所述两亲性嵌段共聚物中的疏水链段构成，其中所述囊泡的尺寸为100～4000nm。

在一个优选实施方式中，所述中间层的厚度为15～35nm。

在另一方面，本发明提供一种通过自组装来制备上述聚合物囊泡的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将所述两亲性嵌段聚合物形成聚合物囊泡水分散液，和在pH=7.0下，将所述聚合物囊泡水分散液用波长为340～380nm的紫外光照射以在所述聚合物囊泡的双层膜内发生交联反应。

在一个优选实施方式中，所述聚合物囊泡水分散液如下形成：将所述两亲性嵌段聚合物溶解在作为共溶剂的有机溶剂中，在室温搅拌条件下向其中加入净化水，并将所得的聚合物乳浊液放置于透析袋中以透析除去所述有机溶剂，从而获得所述聚合物囊泡水分散液。

在一个优选实施方式中，所述交联反应如下发生：在所述紫外光照射下，所述两亲性嵌段聚合物中的疏水链段的侧基发生重排反应，脱除一分子

和CO₂，并释放一分子伯胺，该原位产生的伯胺与所述两亲性嵌段聚合物主链中的酯键发生亲核反应，从而使得所述聚合物囊泡的双层膜发生交联发应。

在另一方面，本发明提供上述聚合物囊泡作为药物载体的应用。

在另一方面，本发明提供上述聚合物囊泡作为负载酶的纳米反应器的应用。

本发明实现了囊泡负载的亲水和疏水分子的可控同步释放，刺激调控囊泡负载的酶反应器的生物催化活性。另外，在刺激触发交联的过程中，聚合物囊泡的双层膜中产生的筛状亲水通道和膜的渗透性能够通过刺激的持续时间来控制。

附图说明

图1示出了根据本发明一个实施方式的单体M1的核磁氢谱。

图2示出了根据本发明一个实施方式的单体M1的核磁碳谱。

图3示出了根据本发明一个实施方式的单体M1的电喷雾质谱。

图4示出了根据本发明一个实施方式的制备聚合物囊泡的过程图。

图5示出了根据本发明一个实施方式的V1囊泡的光照前TEM照片。

图6示出了根据本发明一个实施方式的V1囊泡在光照过程中的散射光强与粒径随辐照时间的变化曲线图。

图7示出了根据本发明一个实施方式的V1囊泡的光照后TEM照片。

图8示出了根据本发明一个实施方式的V1囊泡在光照前(a)和光照后(b)的粒径分布图。

图9示出了根据本发明一个实施方式的V1囊泡在光照前后的尼罗红释放曲线。

图10示出了根据本发明一个实施方式的V1囊泡在光照前后的阿霉素释放曲线。

图11示出了根据本发明一个实施方式的包载酶的V1囊泡在光照前后酶反应动力学曲线。

图12示出了根据本发明一个实施方式的V2囊泡的TEM照片。

图13示出了根据本发明一个实施方式的V3囊泡(负载了极性敏感荧光探针尼罗红)在光照过程中的激光共聚焦显微照片(标尺为2μm)。

具体实施方式

聚合物囊泡通常可以由两亲性嵌段聚合物自组装形成，含有一个由疏水双层膜包裹形成的亲水的内腔。因此，亲水和疏水的物质，如药物，酶的底物，(生物)催化剂等，可以同时被负载在聚合物囊泡中。然而，囊泡双层膜的疏水性屏障质阻碍了亲水物质的渗透，也给疏水物质的可控负载/释放带来困难。这给囊泡在药物传输载体、纳米反应器和人工细胞器/细胞等实际应用方面带来严峻挑战。另一方面，聚合物囊泡的稳定性是其另一个重要的物理性能。通过传统的囊泡交联策略尽管可以提高其稳定性，但会进一步降低囊泡膜的渗透性。

在本发明中，我们提出了一种全新的策略来解决聚合物囊泡的稳定性与渗透性这一对矛盾。具体来讲，我们设计了一种疏水链段含有可在外界刺激作用下解离的保护基团保护的伯胺官能团的两亲性嵌段聚合物。在水中自组装成囊泡后，这些保护的伯胺官能团都分布在囊泡的疏水双层膜(即中间层)中，刺激触发下脱保护后，在双层膜中释放出伯胺。由于原位生成的伯胺处在囊泡的疏水双层膜中，它的pKa会很大程度下降，这促进了原位的酰胺化反应的发生。这样，在刺激过程中，交联的囊泡就形成了，而不是解离成单链。更重要的是，这一过程同时也伴随着双层膜的疏水到亲水的转变。这是由于交联过程中形成的酰胺键和残留的一些未发生酰胺化反应的质子化伯胺。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

首先是结合有机化学中成熟的各种伯胺基团保护化学，选择高效反应来制备疏水的甲基丙烯酸酯基单体或丙烯酸酯基单体，在相应的刺激触发作用下，可以脱保护，生成伯胺。其特征在于，具有以下结构：

其中，

为通过氨基甲酸酯键而保护伯胺的疏水基团，有如上四种结构中的任一种，m=1～11并且n=1～11。

然后，利用端基修饰了三硫酯的聚乙二醇(PEG-CTA)作为链转移剂，采用可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)这一活性自由基聚合方式聚合上述单体，得到疏水链段聚合度以及聚合度分布均可控的两亲性嵌段聚合物。

优选后得到的合适亲水、疏水链段长度的两亲性嵌段聚合物采用共溶剂-加水的方法进行自组装。具体过程为：将聚合物充分溶解在共溶剂(如丙酮，二氧六环，四氢呋喃等)，搅拌过程中向其缓慢加入超纯水，然后用透析或减压蒸馏的方式除去有机溶剂，即可得到几十到几百纳米尺寸的囊泡。也可以用双乳化法制备得到几微米尺寸的大囊泡。

利用自组装所得到的囊泡，在外加刺激作用下可以直接制备交联的同时膜渗透性可控的囊泡。

以下实施例将对本发明作进一步说明，其目的仅在于更好地理解本发明的目的，而不是限制本发明的保护范围。

制备例1

第一步，制备如下疏水单体M1(即m=1)：

其特征为：该邻硝基苄氧羰基保护的伯胺，在紫外光照条件下，可以发生重排反应，脱除一分子邻硝基苯甲醛和CO₂，并释放一个伯胺。

制备方法：将3.0g(19.6mmol)邻硝基苄醇溶于60mL干燥的四氢呋喃中，向其中加入催化量的二月桂酸二丁基锡(DBTL，50μL)，室温搅拌条件下在缓慢加入4.56g(29.4mmol)甲基丙烯酸异氰基乙酯。反应4小时后，减压旋转蒸发(旋蒸)除去有机溶剂，将残余物(粗产物)溶于二氯甲烷，并用饱和食盐水洗涤三次，再用无水硫酸镁干燥。然后旋蒸浓缩粗产物，柱层析纯化(碱性氧化铝为固定相填充物，二氯甲烷为流动相洗脱溶剂)，最后经过旋蒸除去有机溶剂，真空干燥得到白色固体纯品M1(5.56g，92％)。该单体M1的结构的通过核磁氢谱、核磁碳谱与高分辨率质谱进行表征，结果分别显示于图1-3。这些核磁图谱和质谱数据都充分证明了所合成的单体结构。

另外，通过类似的方式和相同的反应步骤，其它同类型结构的单体也可以合成，例如：m=7的甲基丙烯酸酯单体

和n=1的丙烯酸酯单体

第二步，用RAFT聚合手段进一步制备两亲性嵌段聚合物，其反应通式如下所示：

其特征为：聚乙二醇(PEG)链段作为亲水链段，其链段长度(可以任意选择，如PEG聚合度x=23～445；疏水链段的聚合度y可以通过改变聚合参数和条件来有效的改变，优选地y=12～150。本领域技术人员理解，对于本发明来说，聚合度x和y不是关键，只要对本发明没有有害影响即可。为了更清楚地帮助理解，以下选用x=45且y=30的聚合物(P1)为例说明，其中疏水链段末端为RAFT聚合后保留的端基三硫代酯基团，为方便显示，以下均省略显示此端基。

制备方法：将1.28g(4.16mmol)M1单体、0.3g(0.13mmol)PEG-CTA链转移剂和5.3mg(0.032mmol)AIBN引发剂溶于4mL二氧六环，再加入到含磁力搅拌子的封管中，充分脱气后封管，置于70℃的油浴中。聚合反应6小时后终止反应，并沉淀于无水乙醚中，沉淀三次，真空烘箱干燥，得到淡黄色聚合物P1，1.28g(81.2％)。

第三步：自组装制备囊泡(步骤1)与光照刺激条件下囊泡的交联(步骤2)，图4示出了一种制备聚合物囊泡的过程图。更具体地如下：

(1)将50mg P1聚合物溶解于10mL二氧六环共溶剂中，室温搅拌条件下以10mL/h的速度向其中加入90mL超纯水。所得的发白状乳浊液放置于透析袋中，透析于水，透析12小时后除尽有机溶剂。从而得到直径大小约450nm的囊泡(V1)，图5示出了所得V1囊泡的TEM表征结果。

如上方法所得囊泡的特征如下：

i)囊泡的最外层和最里层是由两亲性嵌段共聚物中的亲水链段(即本制备例中的PEG链段)组成，而它们之间的中间层是由疏水链段(即本实施例中的由M1单体聚合所得的嵌段)组成；

ii)中间层的厚度约为25nm，整个囊泡的尺寸约为450nm，尺寸分布较均一。

(2)将所述聚合物囊泡在去离子水水中形成聚合物囊泡的水分散液，然后在pH=约7.0的条件下，将所得聚合物囊泡水分散液在波长为365nm的紫外光照过程中，处于疏水双层膜内的邻硝基苄氧羰基保护的伯胺将会被释放出来。在这个双层膜微环境里，原位产生的伯胺具有高的酰胺化反应活性，很快地与聚合物主链所连接的酯键发生亲核反应，从而使得囊泡的双层膜发生交联发应，而不是解离成全亲水的单链。图6示出了V1囊泡在光照过程中的散射光强与粒径随辐照时间的变化曲线图，其为光照过程中的动态光散射结果，显示了光照过程中的散射光强与粒径的变化，结果表明了以上结论。图7示出了该V1囊泡的光照后TEM照片，图7的TEM也直观的证实了光照后聚合物囊泡的结构依然很好的保持，并具有更高的机械强度。光照前(a)和光照后(b)，囊泡的粒径分布结果如图8的动态光散射数据所示。

根据上述方法所得的交联囊泡的特征如下：

i)囊泡的最外层和最里层是仍然是由两亲性嵌段共聚物中的亲水链部分(即制备例中的PEG链段)组成，而中间层由于发生了光解发应，原位释放出了伯胺，继而发生胺解反应，导致了交联反应的发生，并由最初的疏水性质转变成亲水性质；

ii)中间层的厚度约为25nm，整个囊泡的尺寸仍然保持为450nm左右，尺寸分布较为均一。

应用例1：V1囊泡的亲水/疏水药物负载与可控释放

在聚合物P1的自组装之前，将水溶性分子(如药物阿霉素，DOXHCl)溶于超纯水中，然后将水不溶分子(如模型药物尼罗红)与P1一起溶于有机溶剂(如二氯甲烷)中，然后如制备例中提及的方法进行自组装，得到同时负载了亲水和疏水药物的囊，由此制备了囊泡的药物载体。

参照制备例中所述，在生理pH条件下对囊泡进行光照刺激。结果表明：包载在疏水双层膜中的疏水药物随着光照过程很快释放，这是由于光降解反应后，胺解反应使囊泡发生交联的同时，双层膜也由初始的疏水不断转变成亲水，从而疏水分子不再能够与之相容，而被释放出来(如图9所示)；而亲水药物也能够光控地释放，这是由于光照后产生的交联囊泡的双层膜的渗透性提高了，产生了大量亲水通道，因此由初始的疏水屏障变成亲水分子可透过的通道(如图10所示)。

应用例2：VI囊泡的酶负载与酶促反应活性调控

在聚合物P1的自组装之前，将酶(如碱性磷酸酶，ALP)溶于超纯水中，并将P1溶于有机溶剂中，然后如制备例中所述的方法自组装，得到亲水内腔负载了酶的囊泡，由此制备了囊泡的酶微反应器。

参照制备例中所述，在酶适宜的pH条件(如pH8.0)下对囊泡进行光照刺激，并利用荧光指示的酶底物跟踪该酶微反应器的反应动力学。如图11所示，结果表明：光照后酶促反应活性大大提高，而对照组(负载了酶，但不进行光照处理)基本上没有酶促反应发生，这是由于在光照刺激前，囊泡的疏水双层膜的屏蔽作用，底物不能渗透进入囊泡亲水内腔而与酶接触并发生酶促反应，从而不表现出酶促反应活性；而在光照刺激后，胺解反应使囊泡发生交联的同时，双层膜也由初始的疏水不断转变成亲水，囊泡的双层膜的渗透性提高了，底物可以通过双层膜，从而顺利发生酶促反应。

制备例2

为了考察两亲性嵌段聚合物的组装结果与共溶剂的选择的关系，发明人选用了不同的共溶剂，结果可以得到不同尺寸大小(100～2000nm)的囊泡结构。如使用丙酮作为共溶剂时，以与制备例1相同的方式，在其它参数不变的条件下，得到直径约300nm的囊泡(V2)。

具体组装过程：将50mg P1聚合物溶解于10mL丙酮共溶剂中，室温搅拌条件下以10mL/h的速度向其中加入90mL超纯水。所得的发白状乳浊液放置于透析袋中，透析于水，透析12小时后除尽有机溶剂。从而得到直径大小约300nm的囊泡(V2)，其TEM照片如图12所示。

制备例3

应用水包油包水(W/O/W)的双乳化法，发明人也可以很方便地得到微米级尺寸(2-10μm)的大囊泡(V3)。为了直观地研究囊泡双层膜的疏水-亲水转变，在制备大囊泡V3时加入了极性敏感探针(尼罗红)。

具体制备过程如下：10mg聚合物P1和0.1mg尼罗红溶解于5mL氯仿中，探头超声条件下加入0.5mL的超纯水，再将此悬浊液在探头超声条件下加入25mL超纯水中，减压旋转蒸发除去氯仿，即得到疏水层中负载了极性荧光探针的大囊泡V3。图13示出了该大囊泡V3(负载了极性敏感荧光探针尼罗红)在光照过程中的激光共聚焦显微照片(标尺为2μm)，如图13所示，用激光共聚焦显微镜跟踪光照过程的结果表明，光照过程中大囊泡V3结构依然保持，同时疏水的荧光探针从双层膜中释放出来(由红色荧光强度的减弱可直观的判断得)。这与自组装得到的小囊泡V1的结论是一致的。这表明，无论对于小的纳米级囊泡，还是大的微米级囊泡，这种设计策略都能实现囊泡的交联稳定，同时囊泡膜由疏水转变成亲水，其渗透性得以调控。

以上已对本发明进行了详细描述，但本发明并不局限于本文所描述具体实施方式。本领域技术人员理解，在不背离本发明范围的情况下，可以作出其他更改和变形。本发明的范围由所附权利要求限定。

Claims (9)

1.一种两亲性嵌段聚合物，其特征在于，所述两亲性嵌段聚合物由亲水链段和疏水链段通过可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)法获得，其中所述亲水链段是端基修饰了三硫酯的聚乙二醇，其分子量为1000～20000Da，并且所述疏水链段组成为下式所示，

其中，

其中m=1～11并且n=1～11。

2.根据权利要求1所述的两亲性嵌段聚合物，其特征在于，所述两亲性嵌段聚合物具有下式I并且由式A的亲水链段和式B的疏水链段通过RAFT法获得，

式I：

式A：

式B：

其中，

其中x=23～445，y=12～150并且m=1～11。

3.一种由权利要求1或2所述的两亲性嵌段聚合物组成的聚合物囊泡，其特征在于，所述聚合物囊泡的最外层和最里层是由所述两亲性嵌段共聚物中的亲水链段构成，所述最外层和最里层之间的中间层由所述两亲性嵌段共聚物中的疏水链段构成，其中所述囊泡的尺寸为100～4000nm。

4.根据权利要求3所述的聚合物囊泡，其特征在于，所述中间层的厚度为15～35nm。

5.一种通过自组装来制备根据权利要求3或4所述的聚合物囊泡的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

将所述两亲性嵌段聚合物形成聚合物囊泡水分散液，和在pH=7.0下，将所述聚合物囊泡水分散液用波长为340～380nm的紫外光照射以在所述聚合物囊泡的双层膜内发生交联反应。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述聚合物囊泡水分散液如下形成：

将所述两亲性嵌段聚合物溶解在作为共溶剂的有机溶剂中，在室温搅拌条件下向其中加入净化水，并将所得的聚合物乳浊液放置于透析袋中以透析除去所述有机溶剂，从而获得所述聚合物囊泡水分散液。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述交联反应如下发生：在所述紫外光照射下，所述两亲性嵌段聚合物中的疏水链段的侧基发生重排反应，脱除一分子

和CO₂，并释放一分子伯胺，该原位产生的伯胺与所述两亲性嵌段聚合物主链中的酯键发生亲核反应，从而使得所述聚合物囊泡的双层膜发生交联发应。

8.根据权利要求3或4所述的聚合物囊泡作为药物载体的应用。

9.根据权利要求3或4所述的聚合物囊泡作为负载酶的纳米反应器的应用。

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