CN115386037B - 一种基于树形烷氧醚的树枝化共聚物、其合成方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于树形烷氧醚的树枝化共聚物、其合成方法及其应用，以聚甲基丙烯酸甲酯为主链，树形烷氧醚基元与对硝基苯酚活性酯基元为侧基，其结构式如下所示：其中a＝1～3，X为甲氧基OMe或乙氧基OEt，树形烷氧醚基元不限于三臂、四臂、或者六臂；所述的树形烷氧醚基元和活性酯基元的摩尔比m:n＝(20～40):1。该类共聚物具有优异的温度响应性以及生物相容性，可通过对硝基苯酚活性酯基元将该共聚物与蛋白共价结合起来，从而对蛋白进行负载和保护，具有提高蛋白活性、增强蛋白稳定性的作用，在药物递送、蛋白活性保护等方面具有潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物大分子载体材料领域，主要涉及一类基于烷氧醚基树枝化共聚物对蛋白的共价负载和保护。
背景技术
蛋白质作为生物大分子中不可忽略的一份子，在生命活动中尤其扮演着重要的角色，是一切生命体细胞、组织的基石，生命体内的一切生命活动都有着蛋白质的参与，同时蛋白质还能作为催化剂、药物等在非生理环境中使用，因此人们对蛋白质产生了极大的兴趣，作为天然生物大分子，蛋白质有着一些无法避免的缺点，那就是容易在外部条件的影响下三级构象发生改变导致失去活性，因此，能够在外部环境改变的情况下维持蛋白质的构象不变并保持活性，成为人们一直追求的目标。
随着材料学和化学合成方面的进展，1975年提出生物共轭的概念。即通过共价键将蛋白与聚合物结合起来，利用聚合物对蛋白进行改性和负载，能够有效的改善蛋白质的某些理化性质。近年来，人们一直在尝试利用各种聚合物与蛋白共轭改善蛋白性能。温敏聚合物作为一种重要又独具特色的智能聚合物受到了广泛的青睐。温敏聚合物与蛋白共价结合之后，其温敏行为可以形成一个温敏外壳对蛋白进行保护，对蛋白质分子的性质和彼此的行为之间产生一定的影响，比如聚合物链本身的相变温度、聚集行为以及蛋白质的活性和稳定性。然而，现有利用温敏聚合物作为蛋白共价结合的方法仍然存在诸多挑战，例如，结合方法复杂、聚合物本身会对蛋白活性产生影响等。
烷氧醚类树枝化温敏聚合物是一类极具吸引力的潜在候选材料，该类聚合物具备由密集排列的树枝状基元所构成的三维拥挤微环境，可蛋白等生物大分子提供负载空间，烷氧醚类树枝化聚合物也具有优异的温敏性能，在其相变温度附近相转变迅速，滞后性小。同时，烷氧醚类树枝化聚合物可在酶催化反应过程中起到协同作用，在一定程度上提高蛋白的催化效率。同时，烷氧醚类树枝化聚合物还具有无毒、良好的生物相容性、可调节的相变温度等多种优点，因此是一种在生物领域具有广泛前景的高分子材料。在本课题组前期的工作中，发现树枝化烷氧醚构成的纳米凝胶(WuD.,etal.Polymer Chemistry,2020,11(25):4105-4114)、双网络冻胶(Feng X.,etal.J Mater Chem B,2018,6(13):1903-1911)等体系可以通过电荷相互作用实现对siRNA、蛋白质等生物大分子良好的包络与保护，体现出了烷氧醚类树枝化大分子在生物领域潜在的应用价值。相比于电荷相互作用，利用共价键将生物大分子与树枝化烷氧醚连接可获得更强的协同效应，能够更好的对蛋白进行负载和保护，更能体现出烷氧醚类树形基元在保护生物大分子方面优异的性能。因此本发明通过将烷氧醚类树枝化大分子与一类合成的对硝基苯酚活性酯共聚，得到一种烷氧醚类树枝化共聚物，可在弱碱性条件下通过简单的共混即可将烷氧醚类树枝化共聚物与蛋白共价结合起来，实现对蛋白的共价负载。
发明内容
为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种基于树形烷氧醚的树枝化共聚物、其合成方法及其应用，合成可共价负载蛋白的烷氧醚类树枝化共聚物，提供一种基于烷氧醚类树枝化共聚物共价负载蛋白的方法，提供基于该树枝化共聚物共价结合蛋白之后对蛋白实现保护的方法。本发明共聚物具有优异的温度响应性以及生物相容性，可通过对硝基苯酚活性酯基元将该共聚物与蛋白共价结合起来，从而对蛋白进行负载和保护，具有提高蛋白活性、增强蛋白稳定性的作用，在药物递送、蛋白活性保护等方面具有潜在的应用价值。
根据上述发明目的，本发明采用如下构思：
本发明通过将对硝基苯酚活性酯单体与树枝化烷氧醚单体共聚，得到一种树枝化共聚物，该共聚物可在弱碱性水溶液中与蛋白混合后，共聚物中对硝基苯酚活性酯基元可与蛋白上的氨基发生酰胺化反应，实现共聚物与蛋白的共价结合，达到共聚物对蛋白进行共价负载的目的。
本发明以2-羟乙基二硫化物以及甲基丙烯酰氯以及氯甲酸对硝基苯酯为原料经过两步合成化合物2。树枝化烷氧醚单体的合成可参考文献(Li W.,Zhang A.,SchlueterA.D.Chemical Communications,2008,43:5523-5525)。然后以化合物2和树枝化烷氧醚单体为两种共聚单体，合成烷氧醚类树枝化共聚物，主链为聚甲基丙烯酸甲酯，侧基为树形烷氧醚基元以及对硝基苯酚活性酯基元，将该共聚物溶解于呈弱碱性的水溶液中，加入一定量的蛋白反应一段时间即可实现该树枝化共聚物对蛋白质的共价负载。
本发明共聚物负载蛋白后，蛋白处于树形烷氧醚基元所构成的疏水微环境中，通过树形基元与蛋白质之间的协同效应达到对蛋白质进行负载和保护的效果，其特征在于该共聚物可以通过与氨基反应对任意蛋白进行共价负载，并能够提高蛋白的活性和稳定性。
根据上述发明构思，本发明采用如下技术方案：
一种基于树形烷氧醚的树枝化共聚物，以聚甲基丙烯酸甲酯为主链，以对硝基苯酚活性酯为共聚基元，以分别带有设定支化臂数的树枝化的树形烷氧醚基元为侧基，其结构式如下所示：
其中a＝1～3，X为甲氧基OMe或乙氧基OEt，树形烷氧醚基元采用三臂、四臂、或者六臂；树形烷氧醚基元和对硝基苯酚活性酯基元的摩尔比m:n＝(20～40):1。
优选地，本发明基于树形烷氧醚的树枝化共聚物在水溶液中具有温敏特性，其相变温度在30～70℃。
一种本发明所述的基于树形烷氧醚的树枝化共聚物的合成方法，包括如下步骤：
对硝基酚活性酯单体的合成
步骤a.以2-羟乙基二硫化物以及甲基丙烯酰氯为原料，将2-羟乙基二硫化物置于茄型瓶内，使用冰盐浴降低反应体系温度；同时将溶有甲基丙烯酰氯的二氯甲烷置于恒压漏斗中缓慢滴加，在滴加结束后，维持冰浴反应至少12h，然后用饱和氯化钠溶液清洗，取上层有机相用无水硫酸镁干燥，过滤蒸干后，利用柱层析色谱法纯化，得到初产物；
步骤b.合成两种共聚单体：
将在所述步骤a中得到的初产物溶于干燥的二氯甲烷中，置于茄型瓶中加磁子搅拌，冰浴滴加氯甲酸对硝基苯酯的干燥二氯甲烷溶液，反应至少12h；然后利用有机相用饱和食盐水洗涤，并利用无水硫酸镁对有机相进行干燥处理，然后蒸干，并使用柱层析色谱法纯化产物，即可得到对硝基苯酚活性酯单体，备用；并采用树形烷氧醚单体备用；
步骤c.树枝化共聚物的合成：
将树枝化烷氧醚单体与对硝基苯酚活性酯单体置于舒伦克管中，同时加入AIBN作为引发剂，以DMF作为溶剂，在惰性气体的保护以及不低于65℃恒温条件下，反应至少3h；反应完成后冷却至室温，加入二氯甲烷溶解产物，然后使用层析柱提纯产物，流动相为二氯甲烷，即可得到基于树形烷氧醚的树枝化共聚物。
优选地，在所述步骤a中，按照摩尔比计算，2-羟乙基二硫化物以及甲基丙烯酰氯的投料比为3:1。
优选地，在所述步骤a中，得到的初产物结构式如下：
优选地，在所述步骤b中，在所述步骤a中得到的初产物和氯甲酸对硝基苯酯的摩尔比为44:53。
优选地，在所述步骤b中，得到的对硝基苯酚活性酯单体结构式如下：
树形烷氧醚单体的合成可参见文献(Li W.,Zhang A.,Schlueter A.D.ChemicalCommunications,2008,(43):5523-5525)。
优选地，在所述步骤c中，树枝化烷氧醚单体、对硝基苯酚活性酯单体和引发剂AIBN的混合比例为0.7mmol：0.035mmol：1mg。
一种本发明所述的基于树形烷氧醚的树枝化共聚物的应用，通过与蛋白发生酰胺化反应而实现树枝化烷氧醚与蛋白的共价结合，制备基于烷氧醚类树枝化共聚物共价接枝蛋白，该方法的具体步骤为：
在室温条件下，将烷氧醚类树枝化共聚物溶于pH不大于8的磷酸盐缓冲液中，蛋白按比例质量分数w树枝化共聚物：w蛋白质＝(10～300):1的比例进行添加，烷氧醚类树枝化共聚物比例越高蛋白负载率越高，在室温下，混合均匀反应至少24h，观察到溶液变成淡黄色，得到树枝化共聚物负载的蛋白，无需后处理可直接使用。
采用本发明的树枝化烷氧醚类共聚物，可通过与蛋白发生酰胺化反应而实现树枝化烷氧醚与蛋白的共价结合，操作简单，要求低。该类可共价负载蛋白的烷氧醚类树枝化共聚物具有提高蛋白活性，增强蛋白稳定性的作用，使其具备广泛的应用前景。
本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：
1.本发明采用结构可控的烷氧醚类树枝化大分子作为蛋白负载材料，具有优异的温敏性能，可通过温敏调节溶解度，控制其相变，同时还具有生物相容性好、相变速度快等优点；
2.本发明通过将树枝化烷氧醚与活性酯类分子共聚，合成一种可共价负载蛋白的温敏型共聚物，负载蛋白方式简单，在弱碱性条件下室温混合搅拌即可；
3.与其它类型的体系相比，本发明体系中树形基元与蛋白之间的协同效应更强，可以提高蛋白在非生理条件下的蛋白活性，以及在较高温度、还原剂作用等条件下的稳定性，并可以提高其在碱性条件下室温存储时间。
附图说明
图1为本发明优选实施例的烷氧醚类树枝化共聚物及其接枝蛋白后的流体力学半径图。
图2为游离蛋白以及本发明优选实施例的烷氧醚类树枝化共聚物修饰蛋白在不同pH下生物活性图。
图3游离蛋白以及为本发明优选实施例的烷氧醚类树枝化共聚物修饰蛋白在不同温度下生物活性图。
图4为游离蛋白以及本发明优选实施例的烷氧醚类树枝化共聚物修饰蛋白在较高温度下的存储时间与活性关系图。
图5为游离蛋白以及本发明优选实施例的烷氧醚类树枝化共聚物修饰蛋白在碱性条件下常温(25℃)存储时间图。
图6为游离蛋白以及本发明优选实施例的烷氧醚类树枝化共聚物修饰蛋白还原剂作用下生物活性图。
图7为本发明优选实施例合成可共价负载蛋白的烷氧醚类树枝化共聚物的方法的技术路线示意图。
图8为本发明优选实施例的蛋白共价负载的烷氧醚类树枝化共聚物的负载蛋白后结构示意图。
具体实施方式
以下实施例采用的树形烷氧醚单体的合成可参见文献(Li W.,Zhang A.,Schlueter A.D.Chemical Communications,2008,43:5523-5525)。
以下实施例一种基于树形烷氧醚的树枝化共聚物，以聚甲基丙烯酸甲酯为主链，以对硝基苯酚活性酯为共聚基元，以分别带有设定支化臂数的树枝化的树形烷氧醚基元为侧基，其结构式如下所示：
其中a＝1～3，X为甲氧基OMe或乙氧基OEt，树形烷氧醚基元采用三臂、四臂、或者六臂；树形烷氧醚基元和对硝基苯酚活性酯基元的摩尔比m:n＝(20～40):1。
以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本发明的优选实施例详述如下：
实施例一
在本实施例中，如图7-图8所示，一种基于树形烷氧醚的树枝化共聚物的合成方法，步骤如下：
1.对硝基苯酚活性酯的合成：
步骤a：以2-羟乙基二硫化物以及甲基丙烯酰氯为原料，投料比M2-羟乙基二硫化物：M甲基丙烯酰＝3:1，将氯2-羟乙基二硫化物(0.5g,3.25mmol)置于茄型瓶内，使用冰盐浴降低反应体系温度；同时将溶有甲基丙烯酰氯(0.113g,1.08mmol)的二氯甲烷置于恒压漏斗中缓慢滴加，在滴加结束后，维持冰浴反应12h，经TLC板检验反应完成，然后用饱和氯化钠溶液清洗，取上层有机相用无水硫酸镁干燥，过滤蒸干后利用柱层析色谱法纯化产物,即化合物1(0.098g,0.44mmol)；
步骤b：将在所述步骤a中得到的产物化合物1(0.098g,0.44mmol)溶于干燥的二氯甲烷中，置于茄型瓶中加磁子搅拌，冰浴滴加氯甲酸对硝基苯酯(0.1g,0.53mmol)的干燥二氯甲烷溶液，反应12h。有机相用饱和食盐水洗涤，并利用无水硫酸镁对有机相进行干燥处理，然后蒸干并使用柱层析色谱法纯化产物，得到对硝基苯酚活性酯单体(0.152g,0.39mmol)。
2.树形烷氧醚单体的合成：
树形烷氧醚单体的合成可参见文献(Li W.,Zhang A.,Schlueter A.D.ChemicalCommunications,2008,43:5523-5525)；
3.烷氧醚类树枝化共聚物的合成：
将三臂烷氧醚单体(500mg，0.7mmol)、化合物2(13mg,0.035mmol)以及引发剂AIBN(1mg)混合，加入到10mL舒仑克反应管中，并添加100μL干燥DMF，打开磁力搅拌器设置100r/min，抽真空置换氮气后，将反应管置于65℃油浴中反应3h。待反应结束后冷却至室温，加入少量二氯甲烷溶解产物，溶解后用硅胶柱层析提纯产物，流动相为二氯甲烷，蒸干提纯后为淡黄色油状物，得到目标产物烷氧醚类树枝化共聚物。
实施例二
本实施例与实施例一基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，一种本发明所述的基于树形烷氧醚的树枝化共聚物的应用，通过与蛋白发生酰胺化反应而实现树枝化烷氧醚与蛋白的共价结合，制备基于烷氧醚类树枝化共聚物共价接枝蛋白，该方法的具体步骤为：
在25℃室温条件下，将三臂烷氧醚树枝化共聚物溶于水中，配置为6mg/mL的水溶液，并调节溶液为pH＝8，按蛋白与共聚物质量浓度比为1:300的比例，添加辣根过氧化物酶并搅拌均匀，置于摇床上反应24h，可观察到溶液变为淡黄色。通过对混合后溶液中对硝基苯酚的生成速率来确定烷氧醚类树枝化共聚物负载蛋白的成功制备。
实验测试分析：
1.流体力学半径测试：
对实施例一制备的烷氧醚类树枝化共聚物及实施例二制备的接枝蛋白后的流体力学半径进行测试，由图1可知，3PG1-NPC在水溶液中Rh值有由30nm左右上升到了3PG1-HRP的175nm左右以及3PG1-Mb则增加到了75nm左右；PG1-NPC水溶液中Rh值由119nm左右上升到了4PG1-HRP的368nm左右以及4PG1-Mb的338nm左右。因此在接枝蛋白之后烷氧醚类树枝化共聚物流体力学半径均有所增加，其中根据所接枝的蛋白种类和烷氧醚结构的不同，其增加程度也有所差别。
2.蛋白在不同pH下生物活性测定比较：
对游离蛋白及实施例二制备的接枝蛋白在不同pH下生物活性进行测定，由图2可知，对于肌红蛋白(Mb)，在其最适pH值处3PG1-Mb相比于游离蛋白活性上升了28％，4PG1-Mb活性相比于游离的Mb活性上升了15％；对于辣根过氧化酶(HRP)，其最适pH为4，而3PG1-HRP相比于游离的HRP蛋白其活性上升了47％，4PG1-HRP相比于自由游离的HRP蛋白活性上升了28％。因此经过烷氧醚类树枝化共聚物修饰的蛋白在非生理条件下活性有所增加，其中根据蛋白质种类以及烷氧醚类树枝化共聚物结构的不同，活性增加程度也有差别。
3.蛋白在较高温度下活性测定：
将由烷氧醚类树枝化共聚物负载的蛋白与游离蛋白分别对其不同温度下活性进行检测。配置相同浓度的游离蛋白以及树形烷氧醚负载的蛋白，调节溶液pH值为蛋白最适pH，对其不同温度下活性进行检测，烷氧醚类树枝化共聚物结合的蛋白可在更高温度下维持其活性，其较高温度下维持活性情况如图3所示。由图3可知，对于肌红蛋白(Mb)，其峰值温度位于40℃左右，3PG1-Mb峰值温度上升到了47℃左右，4PG1-Mb上升到了45℃左右；对于辣根过氧化酶(HRP)，HRP峰值温度位于37℃左右，而3PG1-Mb峰值温度则能达到52℃左右，4PG1-HRP则上升到了54℃。因此，蛋白的活性峰值温度提高。
4.蛋白在不同温度下活性测定：
图4为游离蛋白以及烷氧醚类树枝化共聚物修饰蛋白的耐热性图。由图4可知，碱性状态(pH＝8)下，对于肌红蛋白(Mb)，在55℃下保存3.5h后，Mb蛋白活性所剩无几，而3PG1-Mb活性仍有34％的保留，4PG1-Mb还有10％的活性保留；对于辣根过氧化酶(HRP)，游离的HRP以及4PG1-HRP蛋白活性所剩无几，3PG1-HRP仍有39％的活性保留。在较高温度下，烷氧醚类树枝化共聚物修饰的蛋白耐热性提高。
5.蛋白在碱性环境下存储时间的测定：
配置相同浓度的游离蛋白以及树形烷氧醚负载的蛋白，维持碱性状态下(pH＝8)室温存储，每隔2h取样，调节溶液pH值为蛋白最适pH，对其活性进行测定。蛋白在碱性环境下的存储时间延长效果如图5所示。由图5可知，对于肌红蛋白Mb，其在25℃下经过12h后仅剩41％的活性，而4PG1-Mb经过12h的储存后活性还剩49％，3PG-Mb在12h后活性仍然保留着77％；而对于辣根过氧化酶(HRP)，游离的HRP蛋白在经过12h的室温存储之后活性仅剩47％，4PG1-HRP活性仍有着71％的保留，3PG-HRP同样表现为三者最佳活性还保留着78％。弱碱性条件下，存储时间相同的情况下烷氧醚类树枝化共聚物修饰的蛋白活性较高，存储时间延长。
6.蛋白抗还原剂性能的测定：
配置相同浓度的游离蛋白以及树形烷氧醚负载的蛋白，调节溶液pH值为蛋白最适pH，然后分别与不同梯度浓度的蛋白还原剂三(2-羧乙基)膦混合，三(2-羧乙基)膦浓度分别为10、20、30、40、50μg/mL，混合5min后，对其活性进行测定。由图6可知，烷氧醚类树枝化共聚物修饰蛋白抗还原剂效果显著，此例仅对其内部含有二硫键的蛋白有效。对于辣根过氧化酶(HRP)，在三(2-羧乙基)膦浓度为20μg/mL的时候活性已经几乎消失，4PG1-HRP仍有着5％的活性保留，3PG1-SS-HRP保留有84％的活性。烷氧醚类树枝化共聚物修饰蛋白的抗还原剂性能显著提高。
上述实施例经过烷氧醚类树枝化共聚物负载的蛋白在非生理条件下酶催化活性提高、在较高温度下维持活性、耐热性提高、碱性条件下存储时间延长、抗还原剂性能提高。上述实施例可共价负载蛋白的烷氧醚类树枝化共聚物及其应用，以聚甲基丙烯酸甲酯为主链，树形烷氧醚基元与对硝基苯酚活性酯基元为侧基，该类共聚物具有优异的温度响应性以及生物相容性，可通过对硝基苯酚活性酯基元将该共聚物与蛋白共价结合起来，从而对蛋白进行负载和保护，具有提高蛋白活性、增强蛋白稳定性的作用，在药物递送、蛋白活性保护等方面具有潜在的应用价值。
上面对本发明实施例结合附图进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种基于树形烷氧醚的树枝化共聚物，其特征在于：其结构式如下所示：
；
其中a = 1 ~ 3， X 为甲氧基 OMe或乙氧基OEt，树形烷氧醚基元采用三臂；树形烷氧醚基元和对硝基苯酚活性酯基元的摩尔比m:n = (20 ~ 40):1。
2.根据权利要求1所述的基于树形烷氧醚的树枝化共聚物，其特征在于：该共聚物在水溶液中具有温敏特性，其相变温度在30 ~ 70 ℃。
3.一种权利要求1所述的基于树形烷氧醚的树枝化共聚物的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
对硝基酚活性酯单体的合成
步骤a. 以 2-羟乙基二硫化物以及甲基丙烯酰氯为原料，将2-羟乙基二硫化物置于茄型瓶内，使用冰盐浴降低反应体系温度；同时将溶有甲基丙烯酰氯的二氯甲烷置于恒压漏斗中缓慢滴加，在滴加结束后，维持冰浴反应至少12 h，然后用饱和氯化钠溶液清洗，取上层有机相用无水硫酸镁干燥，过滤蒸干后，利用柱层析色谱法纯化，得到初产物；
步骤b. 合成两种共聚单体：
将在所述步骤a中得到的初产物溶于干燥的二氯甲烷中，置于茄型瓶中加磁子搅拌，冰浴滴加氯甲酸对硝基苯酯的干燥二氯甲烷溶液，反应至少12 h；然后利用有机相用饱和食盐水洗涤，并利用无水硫酸镁对有机相进行干燥处理，然后蒸干，并使用柱层析色谱法纯化产物，即可得到对硝基苯酚活性酯单体，备用；并采用树形烷氧醚单体备用；
步骤c. 树枝化共聚物的合成：
将树枝化烷氧醚单体与对硝基苯酚活性酯单体置于舒伦克管中，同时加入AIBN作为引发剂，以DMF作为溶剂，在惰性气体的保护以及不低于65 ℃恒温条件下，反应至少3 h；反应完成后冷却至室温，加入二氯甲烷溶解产物，然后使用层析柱提纯产物，流动相为二氯甲烷，即可得到基于树形烷氧醚的树枝化共聚物。
4.根据权利要求3所述的基于树形烷氧醚的树枝化共聚物的合成方法，其特征在于：在所述步骤a中，按照摩尔比计算，2-羟乙基二硫化物以及甲基丙烯酰氯的投料比为 3:1。
5.根据权利要求3所述的基于树形烷氧醚的树枝化共聚物的合成方法，其特征在于：在所述步骤a中，得到的初产物结构式如下：
。
6.根据权利要求3所述的基于树形烷氧醚的树枝化共聚物的合成方法，其特征在于：在所述步骤b中，在所述步骤a中得到的初产物和氯甲酸对硝基苯酯的摩尔比为44:53。
7.根据权利要求3所述的基于树形烷氧醚的树枝化共聚物的合成方法，其特征在于：在所述步骤b中，得到的对硝基苯酚活性酯单体结构式如下：
。
8.根据权利要求3所述的基于树形烷氧醚的树枝化共聚物的合成方法，其特征在于：在所述步骤c中，树枝化烷氧醚单体、对硝基苯酚活性酯单体和引发剂AIBN的混合比例为0.7mmol：0.035 mmol：1 mg。
9.一种权利要求1所述的基于树形烷氧醚的树枝化共聚物的应用，其特征在于：通过与蛋白发生酰胺化反应而实现树枝化烷氧醚与蛋白的共价结合，制备基于烷氧醚类树枝化共聚物共价接枝蛋白，具体步骤为：
在室温条件下，将烷氧醚类树枝化共聚物溶于pH不大于8的磷酸盐缓冲液中，蛋白按比例质量分数w树枝化共聚物：w蛋白质= (10 ~ 300):1的比例进行添加，烷氧醚类树枝化共聚物比例越高蛋白负载率越高，在室温下，混合均匀反应至少24 h，观察到溶液变成淡黄色，得到树枝化共聚物负载的蛋白，无需后处理可直接使用。
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