CN106511298B - 一种电荷转换纳米颗粒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种电荷转换纳米颗粒及其制备方法。该制备方法包括，将壳聚糖与疏水有机酸反应，制得修饰的壳聚糖；将所述修饰的壳聚糖与碳纳米管混合，所述修饰的壳聚糖通过作用于所述碳纳米管，制得纳米颗粒；向所述纳米颗粒中加入聚合单体及交联剂，引发聚合反应，制得交联温敏聚合物的网状互穿纳米颗粒；进一步胍基化修饰所述纳米颗粒，制得表面富集正电荷的纳米颗粒，将所述表面带正电纳米颗粒与外壳保护剂混合反应，制得所述电荷转换纳米颗粒。本发明的电荷转换纳米颗粒，可用于搭载化疗药物或细胞因子等，以起到靶向抗肿瘤作用。

Description

一种电荷转换纳米颗粒及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种电荷转换纳米颗粒及其制备方法，具体为一种可用于药物传递的具有带正电内核的表面带负电的纳米颗粒及其制备方法。
背景技术
纳米药物传递的一个关键过程就是如何快速的被肿瘤细胞摄取，使药物能够到达胞内作用靶点附近进行治疗。表面带有特异性受体或是正电荷的纳米粒子与细胞膜相互作用增强，有利于细胞摄取纳米粒子。但带有特异性受体或者正电荷的纳米粒子能很快与血液中的蛋白相互作用，使其在血液循环中聚集被快速清除，难以到达肿瘤部位。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种电荷转换纳米颗粒的制备方法，包括，将壳聚糖与疏水有机酸反应，制得修饰的壳聚糖；
将所述修饰的壳聚糖与碳纳米管混合，所述修饰的壳聚糖通过作用于所述碳纳米管，制得纳米颗粒；
向所述纳米颗粒中加入聚合单体及交联剂，引发聚合反应，制得交联温敏聚合物的网状互穿纳米颗粒；
向所述纳米颗粒中加入胍基化试剂，以使所述纳米颗粒中壳聚糖上未反应的氨基胍基化，制得胍基化纳米颗粒；以及
将所述胍基化纳米颗粒与外壳保护剂混合，所述外壳保护剂通过作用于所述胍基化纳米颗粒的表面，制得所述电荷转换纳米颗粒；
其中，所述外壳保护剂选自2,3-二甲基马来酸酐、3,4,5,6-四氢苯酐、2,2,3,3-四甲基丁二酸酐或(Z)-3-羧乙基-2-戊烯二酸酐。
根据本发明的一实施方式，其中所述温敏聚合物选自聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚乙烯基异丁酰胺、聚氧化乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种。
根据本发明的一实施方式，所述胍基化试剂为1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐和/或N,N-二异丙基乙胺。
根据本发明的一实施方式，所述胍基化试剂与所述壳聚糖的摩尔比为(1～10):1。
根据本发明的一实施方式，所述疏水有机酸选自C5～C30的脂肪族羧酸、脂环族羧酸或芳香族羧酸。
根据本发明的一实施方式，所述疏水有机酸选自油酸或胆酸。
根据本发明的一实施方式，所述碳纳米管为单臂碳纳米管。
根据本发明的一实施方式，还包括对所述单臂碳纳米管进行分散处理的步骤；所述分散处理的步骤包括，
将所述单臂碳纳米管分散于浓硫酸和/或浓硝酸中进行酸化；
向上述酸化后的体系中加入碱或强碱弱酸盐进行中和处理。
根据本发明的一实施方式，所述交联剂为甲叉双丙烯酰胺或聚乙二醇二丙烯酸酯。
根据本发明的一实施方式，所述修饰的壳聚糖与所述聚合单体的质量比为(1～2):(10～30)。
根据本发明的一实施方式，所述聚合单体与所述交联剂的摩尔比为(2～6):1。
根据本发明的一实施方式，所述网状互穿纳米颗粒与所述外壳保护剂的质量比为1:(50～100)。
本发明提供了一种电荷转换纳米颗粒，由上述任一项的方法制得。
本发明的电荷转换纳米颗粒，可用于搭载化疗药物或细胞因子等，以起到靶向抗肿瘤作用。当纳米颗粒到达肿瘤部位时，由于肿瘤部位pH值较低，所述纳米颗粒发生电荷转换，促进纳米颗粒被细胞胞吞的效率，增强所携带的治疗物抑制或杀伤肿瘤细胞的作用。
附图说明
图1为制备例1的纳米颗粒(NPS)的透射电镜表征图；
图2分别为制备例1的纳米颗粒(NPS)、胍基化纳米颗粒(G-NPS)及电荷转换纳米颗粒(C-NPS)的动态光散射粒径分布图；
图3为分别应用例1的纳米颗粒(NPS)、胍基化纳米颗粒(G-NPS)及电荷转换纳米颗粒(C-NPS)在不同pH时的表面电势变化图。
具体实施方式
体现本发明特征与优点的典型实施方式将在以下的说明中详细叙述。应理解的是本发明能够在不同的实施方式上具有各种的变化，其皆不脱离本发明的范围，且其中的说明及图示在本质上是当作说明之用，而非用以限制本发明。
鉴于现有的药物纳米粒子的传送问题，在血液循环体系中，纳米粒子需要保持“隐形”的稳定状态，在实体瘤中通过EPR效应，在肿瘤内部有效扩散，进而被肿瘤内部微酸性活化，实现表面配体基团的活化，增强与细胞膜的相互作用，提高细胞摄取效率。肿瘤组织因细胞过度增殖且代谢旺盛，其pH约为6.8，呈弱酸性，而血液中的pH值约为7.4，呈弱碱性。
基于此，本发明提供了一种电荷转换纳米颗粒，内核带正电荷，通过使其外壳带负电荷，可使其在血液循环中稳定存在不被降解。而当其到达肿瘤部位，带负电的表面因水解作用被破坏，暴露出其带正电的内核，与带负电荷的肿瘤细胞膜相互作用进入肿瘤细胞或留在细胞表面。由此，该纳米颗粒可用于搭载化疗药物或细胞因子等，以起到靶向抗肿瘤作用。
本发明一实施方式的电荷转换纳米颗粒的制备方法，包括，将壳聚糖与疏水有机酸反应，制得修饰的壳聚糖；将所述修饰的壳聚糖与碳纳米管混合，所述修饰的壳聚糖通过作用于所述碳纳米管，制得纳米颗粒；向所述纳米颗粒中加入聚合单体及交联剂，引发聚合反应，制得交联温敏聚合物的网状互穿纳米颗粒；向所述纳米颗粒中加入胍基化试剂，制得胍基化的纳米颗粒；将所述纳米颗粒与外壳保护剂混合反应，制得所述电荷转换纳米颗粒。
壳聚糖具有生物相容性好、水溶性好等特性，用于纳米颗粒的制备时便于分散，易于制备成尺寸均一，粒径较小的纳米颗粒。本发明中，壳聚糖的粘度范围为100～200/200～400毫帕秒，例如100～200毫帕秒。通过壳聚糖与疏水有机酸的反应，制得修饰的壳聚糖，其中壳聚糖的氨基通过与疏水有机酸羧基的反应，使壳聚糖的环上连接疏水基团。该疏水有机酸可以为包含疏水基团的有机羧酸，优选为C5～C30的脂肪族羧酸、脂环族羧酸或芳香族羧酸，例如己酸、苯甲酸、油酸或胆酸。优选地，壳聚糖与疏水有机酸的摩尔比为(2～10):1。
修饰的壳聚糖与碳纳米管混合后，作用于碳纳米管，形成壳聚糖的纳米颗粒，修饰的壳聚糖与碳纳米管的质量比可以为(2～10):1。该碳纳米管优选为单臂碳纳米管，其长度可以为1～3微米，也可以为10～20微米。单臂碳纳米管具有疏水性、比表面积大等特性，可用于大量搭载疏水性药物如阿霉素等，以提高纳米颗粒的载药率。
优选地，可将单臂碳纳米管进行分散处理，以使其尺寸变得更小，更适于在人体内的运输。该分散处理工艺可包括：将单臂碳纳米管分散于浓硫酸和浓硝酸的混合液中酸化超声；向上述超声处理后的体系中加入碱或强碱弱酸盐进行中和处理，该强碱弱酸盐可以是碳酸钠或碳酸氢钠。
具体地，分散处理工艺可进一步包括：先将单臂碳纳米管经浓酸酸化并伴以超声，其中浓酸为浓硝酸、浓硫酸或二者混合，超声功率为100～400瓦，时间为12～72小时，温度为不高于40摄氏度，再通过梯度离心法得到尺寸均一的碳纳米管，离心转速为500～14,000转/分钟，最后使用碱或强碱弱酸盐中和剩余浓酸，去离子水清洗去除离子，烘干后保存。用时再用脱氧胆酸钠超声分散于去离子水中，并于10,000～14,000转/分钟离心10～30分钟，上层清液即为分散好的碳纳米管。其中，烘干温度为40～60摄氏度，时间为6～12小时，分散时体系中碳纳米管的质量分数为0.025～0.05％，脱氧胆酸钠的质量分数为0.005～0.015％。超声可以为插入式超声，超声强度为60～80％，作用时间为2～15s/2～15s，超声时间为0.5～2小时，超声温度为0～4摄氏度。
交联温敏聚合物的工艺可包括：向壳聚糖纳米颗粒体系中通入氩气，加入交联剂，搅拌速度为1000～1500转/分钟，温度为25～90摄氏度，反应0～2小时，再逐滴加入聚合单体与引发剂的混合溶液，继续反应1～5小时，透析得到均一的纳米颗粒。其中，聚合单体可以为N-异丙基丙烯酰胺；交联剂可以为甲叉双丙烯酰胺或聚乙二醇二丙烯酸酯，聚乙二醇二丙烯酸酯的分子量可以为250～700；引发剂可以为过硫酸铵；聚合单体与交联剂的摩尔比为(2～6):1。优选地，反应体系中修饰的壳聚糖的质量分数为0.01～0.02％，聚合单体的质量分数为0.1～0.3％，引发剂的质量分数为0.005～0.01％。
进一步地，该制备方法还包括，当交联的反应完成后，向体系中加入胍基化试剂，以使壳聚糖上未与疏水有机酸反应的氨基胍基化。优选地，加入胍基化试剂后，体系的搅拌速度为1000～1500转/分钟，反应12～36小时，透析得到胍基化的纳米颗粒。其中，胍基化试剂可以为1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐和/或N,N-二异丙基乙胺，胍基化试剂与壳聚糖的摩尔比可以为(1～10):1。
最后，可通过胍基化纳米颗粒与外壳保护剂的反应使纳米颗粒表面带负电。该外壳保护剂可以是2,3-二甲基马来酸酐(DM)、3,4,5,6-四氢苯酐(DCA)、2,2,3,3-四甲基丁二酸酐(TM)或(Z)-3-羧乙基-2-戊烯二酸酐。2,3-二甲基马来酸酐可通过酰胺化反应作用于所述纳米颗粒的表面。纳米颗粒与2,3-二甲基马来酸酐的质量比优选为1:(50～100)。
外壳保护剂的存在可使纳米粒子在血液循环中稳定存在而不被降解，当纳米颗粒搭载药物到达患处，纳米颗粒表面的外壳保护剂，例如2,3-二甲基马来酸酐因水解作用脱落，暴露带正电的纳米粒子内核，使得该纳米粒子与带负电的肿瘤细胞膜相互作用进入肿瘤细胞或留在细胞表面。
优选地，先使用pH为8～9的磷酸盐缓冲液调节体系pH，再加入2,3-二甲基马来酸酐，体系的搅拌速度为1000～1500转/分钟，反应12～36小时，透析得到电荷转换纳米颗粒。其中，2,3-二甲基马来酸酐与胍基化纳米颗粒的质量比可以为(50～100):1。
本发明一实施方式的电荷转换纳米颗粒，胍基化试剂可将壳聚糖上未反应的氨基胍基化，从而使纳米颗粒表面富集更多正电荷。壳聚糖交联碳纳米管的纳米颗粒，其表面电势基本为零，胍基化后可增大至约+30mV，从而使纳米颗粒表面正电荷大大增加，提高其进细胞能力，进而增强抗肿瘤效果。且胍基化后不仅可使正电荷增加，还能使带正电的纳米粒子更易于与细胞表面的整合素作用，有助于包吞。将该纳米颗粒用作药物载体时，可通过酰胺化反应连接2,3-二甲基马来酸酐使其表面带负电。如此可使纳米粒子在血液循环中可稳定存在而不被降解，当纳米粒子搭载药物到达患处，例如肿瘤部位时，纳米粒子表面的2,3-二甲基马来酸酐因水解作用脱落，暴露带正电的纳米粒子内核，使得该纳米粒子与带负电的肿瘤细胞膜相互作用进入肿瘤细胞或留在细胞表面。
根据本发明的方法制备得到的纳米粒子尺寸均一，且表面带负电荷的纳米颗粒，其粒径约为200nm。
以下，结合具体实施例对本发明的电荷转换纳米颗粒及其制备方法做进一步说明。其中，粒径通过动态光散射法测得，测量仪器为马尔文粒径分析仪，型号：Nano ZS90。
制备例1
壳聚糖枝接油酸聚合物(CS-OA)的合成
取油酸40毫克，碳二亚胺盐酸盐27毫克，N-羟基琥珀酰亚胺16毫克，溶于10毫升二甲基甲酰胺溶液中，1000转/分钟搅拌1小时。向上述溶液中加入100毫升质量分数为0.25％的壳聚糖溶液，1000转/分钟搅拌12小时。用大量四氢呋喃溶液沉淀上述溶液，得到少量凝胶状的CS-OA，真空抽干，溶于去离子水，透析3天，冻干后得到白色固体。
单臂碳纳米管(SWCNTs)的分散
称取100毫克单臂碳纳米管(长度约1～3微米)溶解于60毫升浓硫酸和20毫升浓硝酸的混合溶液中，超声功率为100瓦，时间为24小时，温度约25摄氏度。所得混合液5000转/分钟离心30分钟，弃沉淀，上清8000转/分钟离心30分钟，弃沉淀，上清14000转/分钟离心30分钟，弃上清。所得沉淀用1摩尔/升的碳酸钠溶液中和，去离子水洗去离子，40摄氏度烘8小时。称取烘干后样品5毫克，加200毫克脱氧胆酸钠，20毫升去离子水，插入式超声，超声强度为80％，作用时间为15秒/15秒，超声时间为1小时。所得混合液于14,000转/分钟离心30分钟，上清即为分散得到SWCNTs。
油酸修饰的壳聚糖纳米颗粒(CS-OA@SWCNTs)的制备
取4毫升上述分散好的单臂碳纳米管溶液，加入以制得的CS-OA所配置的1毫克/毫升的CS-OA的1％醋酸溶液5毫升，插入式超声，超声强度为80％，作用时间为15秒/15秒，超声时间为1小时。透析所得灰白均一体系即为CS-OA@SWCNTs。
交联聚(N-异丙基丙烯酰胺)纳米颗粒(NPS)的制备
取30毫升0.15毫克/毫升上述CS-OA@SWCNTs，并向体系中通入氩气，加入15微升交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯(平均分子量为700)，1000转/分钟，70摄氏度下搅拌反应0.5小时，再逐滴加入30毫克N-异丙基丙烯酰胺与1.5毫克过硫酸铵的混合溶液(溶于1毫升去离子水)，继续反应3小时，透析即得CS/PNIPAAm@SWCNTs，具体参见图1的透射电镜图。其中，该纳米颗粒的粒径约为170nm，表面电势约+0.1mV。
胍基化纳米颗粒(G-NPS)的制备
取20毫升上述纳米颗粒NPS，加入1.5毫克1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐，再加入2微升N,N-二异丙基乙胺，1000转/分钟，室温搅拌反应24小时，透析即得G-NPS，粒径约为190nm，表面电势约+30mV。
电荷转换纳米颗粒(C-NPS)的制备
取5毫升上述G-NPS，加入5毫升pH为8.0的1摩尔/升磷酸盐缓冲溶液，逐滴缓慢加入溶于1毫升二甲基亚砜的20毫克2,3-二甲基马来酸酐，1000转/分钟，室温搅拌反应12小时，透析即得C-NPS，粒径约为200nm，表面电势约为-30mV。
其中，图2、图3分别为上述纳米颗粒(NPS)、胍基化纳米颗粒(G-NPS)及电荷转换纳米颗粒(C-NPS)的动态光散射粒径分布图，及在不同pH时的表面电势变化图。
制备例2
油酸修饰的壳聚糖纳米颗粒(CS-OA@SWCNTs)的制备
取4毫升制备例1中分散好的单臂碳纳米管溶液，加入10毫升使用制备例1制得的CS-OA所配置的1毫克/毫升的CS-OA的1％醋酸溶液，插入式超声，超声强度为80％，作用时间为15秒/15秒，超声时间为1小时。透析所得灰白均一体系即为CS-OA@SWCNTs。
制备例3
交联聚(N-异丙基丙烯酰胺)纳米颗粒(NPS)的制备
取30毫升0.15毫克/毫升的制备例1所得的CS-OA@SWCNTs，并向体系中通入氩气，加入20微升交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯(平均分子量为250)，1000转/分钟，70摄氏度下搅拌反应1小时，再逐滴加入60毫克聚N-异丙基丙烯酰胺与3毫克过硫酸铵的混合溶液(溶于1毫升去离子水)，继续反应3小时，透析即得NPS。
制备例4
胍基化纳米颗粒(G-NPS)的制备
取20毫升制备例1所得纳米颗粒，加入15毫克1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐，再加入2微升N,N-二异丙基乙胺，1000转/分钟，室温搅拌反应24小时，透析即得G-NPS，粒径约300nm，表面电势约+30mV。
制备例5
电荷转换纳米颗粒(C-NPS)的制备
取5毫升制备例1所得G-NPS，加入5毫升pH为8.0的1摩尔/升磷酸盐缓冲溶液，逐滴缓慢加入溶于1毫升二甲基亚砜的40毫克2,3-二甲基马来酸酐，1000转/分钟，室温搅拌反应12小时，透析即得C-NPS，粒径约为400nm，其表面电势约为-30mV。
制备例6
壳聚糖枝接胆酸聚合物(CS-DOC)的合成
取胆酸57毫克，碳二亚胺盐酸盐27毫克，N-羟基琥珀酰亚胺16毫克，溶于10毫升二甲基甲酰胺溶液中，1000转/分钟搅拌1小时。向上述溶液中加入100毫升质量分数为0.25％的壳聚糖溶液，1000转/分钟搅拌12小时。用大量四氢呋喃溶液沉淀上述溶液，得到少量凝胶状的CS-DOC，真空抽干，溶于去离子水，透析3天，冻干后得到白色固体。
制备例7
胆酸修饰的壳聚糖纳米颗粒(CS-DOC@SWCNTs)的制备
取4毫升制备例1中分散好的单臂碳纳米管溶液，加入10毫升以制备例6制得的CS-DOC所配置的1毫克/毫升的CS-DOC的1％醋酸溶液，插入式超声，超声强度为80％，作用时间为15秒/15秒，超声时间为1小时。透析所得灰白均一体系即为CS-DOC@SWCNTs。
制备例8
交联聚(N-异丙基丙烯酰胺)纳米颗粒(NPS)的制备
取30毫升0.15毫克/毫升的制备例1所得的CS-DOC@SWCNTs，并向体系中通入氩气，加入20微升交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯(平均分子量为250)，1000转/分钟，70摄氏度下搅拌反应1小时，再逐滴加入60毫克聚N-异丙基丙烯酰胺与3毫克过硫酸铵的混合溶液(溶于1毫升去离子水)，继续反应3小时，透析即得NPS。
应用例1
电荷转换纳米颗粒(C-NPS)在不同pH条件下的表面电势变化
取5毫升制备例1中所得电荷转换纳米颗粒(C-NPS)，测量其pH约为8.5，用0.1摩尔/升的盐酸溶液调节至不同pH值(设计pH值分别为7.4、6.8、6.0、5.5)，静置24小时后测量其表面电势，随pH降低其表面电势逐渐增加，至pH为5.0时其表面电势约为+20mV。
应用例2
电荷转换纳米颗粒(C-NPS)在不同pH条件下的表面电势变化
取5毫升制备例1中所得电荷转换纳米颗粒(C-NPS)，测量其pH约为8.5，用0.1摩尔/升的盐酸溶液调节至不同pH值(设计pH值分别为7.4、6.8、6.0、5.5)，立即测量其表面电势，随pH降低其表面电势逐渐增加，但始终为负。
应用例3
电荷转换纳米颗粒(C-NPS)在不同pH条件下的表面电势变化
取5毫升制备例1中所得电荷转换纳米颗粒(C-NPS)，测量其pH约为8.5，加入5毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲溶液(其pH值分别为7.4、6.8、6.0、5.5)，静置24小时后测量其表面电势，随pH降低其表面电势逐渐增加，至pH为5.0时其表面电势约为+2mV。
除非特别限定，本发明所用术语均为本领域技术人员通常理解的含义。
本发明所描述的实施方式仅出于示例性目的，并非用以限制本发明的保护范围，本领域技术人员可在本发明的范围内作出各种其他替换、改变和改进，因而，本发明不限于上述实施方式，而仅由权利要求限定。

Claims (7)

1.一种电荷转换纳米颗粒的制备方法，包括，
将壳聚糖与疏水有机酸反应，制得修饰的壳聚糖；
将所述修饰的壳聚糖与碳纳米管混合，所述修饰的壳聚糖通过作用于所述碳纳米管，制得纳米颗粒；
向所述纳米颗粒中加入聚合单体及交联剂，引发聚合反应，制得交联温敏聚合物的网状互穿纳米颗粒；
向所述网状互穿纳米颗粒中加入胍基化试剂，以使所述纳米颗粒中壳聚糖上未反应的氨基胍基化，制得胍基化纳米颗粒；
以及将所述胍基化纳米颗粒与外壳保护剂混合，所述外壳保护剂通过作用于所述胍基化纳米颗粒的表面，制得所述电荷转换纳米颗粒；
其中，所述外壳保护剂选自2,3-二甲基马来酸酐、3,4,5,6-四氢苯酐、2,2,3,3-四甲基丁二酸酐或(Z)-3-羧乙基-2-戊烯二酸酐；所述疏水有机酸选自C5～C30的脂肪族羧酸、脂环族羧酸或芳香族羧酸；所述温敏聚合物选自聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚乙烯基异丁酰胺、聚氧化乙烯醚、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或多种；所述交联剂为聚乙二醇二丙烯酸酯。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述胍基化试剂为1H-吡唑-1-甲脒盐酸盐和/或N,N-二异丙基乙胺。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述胍基化试剂与所述壳聚糖的摩尔比为(1～10):1。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述疏水有机酸选自油酸或胆酸。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述碳纳米管为单臂碳纳米管。
6.根据权利要求5所述的方法，其中还包括对所述单臂碳纳米管进行分散处理的步骤；所述分散处理的步骤包括，
将所述单臂碳纳米管分散于浓硫酸和/或浓硝酸中进行酸化；
向上述酸化后的体系中加入碱或强碱弱酸盐进行中和处理。
7.一种电荷转换纳米颗粒，由权利要求1至6中任一项所述的方法制得。
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单壁碳纳米管的毒性、功能化改性及靶向送药的研究;林高锋;《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑》;20110715;第28-32页 *

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