CN107617108A

CN107617108A - 一种双靶向和pH/氧化还原双敏感的核交联纳米粒及其制备方法和应用

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Publication number: CN107617108A
Application number: CN201710844103.XA
Authority: CN
Inventors: 赵军强; 闫彩霞; 陈泽; 李冬阳; 韩洪蕊; 冯霞; 赵义平
Original assignee: Tianjin Polytechnic University
Current assignee: Tianjin Polytechnic University
Priority date: 2017-09-14
Filing date: 2017-09-14
Publication date: 2018-01-23

Abstract

本发明公开了一种双靶向和pH/氧化还原双敏感的核交联纳米粒及其制备方法和应用。纳米粒表面是含有叶酸靶向配体和聚6‑O‑甲基丙烯酰氯‑D‑吡喃半乳糖(PMApGP)的亲水层，内部是含有pH/氧化还原双重敏感聚合物单元的疏水核，疏水内核在二硫苏糖醇作用下发生交联，得到稳定可逆并具有双靶向和pH/氧化还原双敏感性的核交联纳米粒。以阿霉素为模型药物制备载药纳米粒，并通过体外药物释放实验考察载药交联纳米粒的稳定性和pH/还原双敏感性。结果表明，双靶向和双敏感核交联纳米粒制备方法简便、载药率高，且该纳米粒具有体外稳定、而在肿瘤细胞内低pH和谷胱甘肽作用下pH/氧化还原敏感聚合物单元发生亲水‑疏水转变和交联结构解离可快速释放药物的性能。

Description

一种双靶向和pH/氧化还原双敏感的核交联纳米粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及高分子化学和生物医学工程领域，涉及一种具有双靶向和pH/氧化还原双敏感的核交联半乳糖基纳米粒，及其制备方法和应用。

背景技术

众所周知，癌症治疗对人类健康非常重要，因为癌症仍然是全球死亡的主要原因之一。在众多治疗癌症的方法中，化学疗法因其高效率而成为大多数癌症治疗的主要策略，但大多数化学治疗剂在给药后释放到血液中，并且会非选择性的转运到正常组织，这通常会给患者带来严重的毒副作用，导致临床治疗往往因毒副作用大而失败，或因毒副作用的限制无法提高剂量而达不到理想治疗效果。可见，要提高化疗效果、降低毒副作用，必须提高抗肿瘤药物的靶向递送效率，降低药物在正常组织内的富集。纳米载体与各种促进肿瘤靶向递送手段的结合在提高抗癌药物溶解性、有效性和安全性三方面具有整体优势，这为抗肿瘤药物的高效递送带来了希望。

肿瘤组织具有不同于正常组织的微环境，首先表现为肿瘤组织与正常组织间存在pH梯度：正常组织的pH约为7.4，而肿瘤组织的pH在6.8左右，肿瘤细胞内的内涵体及溶酶体的pH为4.0～ 6.5。其次肿瘤细胞质内谷胱甘肽(GSH)的浓度(～10mmol)远高于血液和正常组织内的GSH 浓度(2～20μmol)。因此，为提高抗肿瘤药物的靶向递送效率，人们研发了多种pH、氧化还原敏感的纳米载体，旨在促进抗癌药物在肿瘤细胞内的释放。但是，非交联结构的pH或GSH敏感的纳米载体在血液长循环过程中稳定性较差，并且在循环过程中不能高效入胞。人们采用pH或GSH 敏感的化学键进行壳或核交联，提高纳米载体体循环的稳定性及高效入胞的能力，

糖是生物体能量的主要来源，是参与生命活动过程(例如，细胞识别、细胞增殖、病原体感染、信号传递等)的重要生物分子。糖与癌症有着密切的联系，如去唾液酸糖蛋白受体 (asiaglycoprotein receptor，ASGPR)与半乳糖残基或乙酰半乳糖胺残基的特异性识别可以用于制备肝主动靶向的载体材料。含糖聚合物可以改善聚合物的亲水性、生物相容性、生物降解性以及生物识别能力，基于含糖聚合物可以制备出在生物、医药等诸多方面具有各种特殊用途的功能材料。癌细胞表面具有和糖分子特异性结合的蛋白，糖与癌症有着密切的联系。因此，利用糖与癌细胞的特异性结合能力，能够制备对癌细胞具有高亲和力的功能材料。此外，为进一步提高递药系统的靶向性和递送效果，通过化学修饰等方法将载体与靶向配体相连，可实现载体的主动靶向性。由于叶酸无害且与叶酸受体的结合力强对肿瘤有很强的靶向性，叶酸受体介导的递药系统成为了靶向剂。

本发明目的在于提供一种肿瘤靶向、响应肿瘤细胞内环境和实现细胞内药物快速释放的纳米粒及其制备方法和应用。这种纳米粒的特点是：在人体血液长循环过程中结构稳定并有效抑制药物早释、能够双重靶向作用于肿瘤组织并在肿瘤细胞内协同响应低pH和GSH刺激和快速释放药物，克服现有载体的不足。

发明内容

本发明中，以可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合方法，制备组成和结构可控的含糖两亲性嵌段聚合物，并键合肿瘤靶向配体，构建抗肿瘤药物靶向递送的纳米载体。旨在通过靶向配体、交联和pH/氧化还原双敏感疏水内核的协同作用，提高纳米载体的靶向递送效率，实现药物在肿瘤细胞内的定位可控释放，来解决纳米药物载体的体循环稳定性较差、靶向性差和控释效果差等诸多问题。

第一，本发明提供了一种双靶向和pH/氧化还原双敏感的核交联半乳糖基纳米粒，组成为 FA-P(MApGP)_x-b-P(DPA_y-co-PDEMA_z)，其中：FA是叶酸；PMApGP是聚6-O-甲基丙烯酰氯-D- 吡喃半乳糖；PDPA是聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯；PPDEMA是聚2-(吡啶-2-二硫)甲基丙烯酸乙酯；P(MApGP)_x聚合度x为15～40的整数，P(DPA)_y聚合度y为10～40的整数，P(PDEMA)_z聚合度z为5～30的整数；其特征在于表面是至少含有聚6-O-甲基丙烯酰氯-D-吡喃半乳糖 (PMApGP)和叶酸靶向配体的亲水层，内部是至少含有pH敏感聚合物单元和氧化还原敏感聚 2-(吡啶-2-二硫)甲基丙烯酸乙酯(PPDEMA)单元的疏水核，且其疏水内核在DTT作用下发生交联，所制备的载药交联纳米粒平均粒径为25～200nm。

优选的，所述pH敏感的聚合物聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯(PDPA)在pH为7.4的环境下疏水，即保持纳米粒内核的疏水性，用于药物负载和体循环稳定性；在pH为6.5以下可质子化变为亲水。因此，在体循环(pH 7.4)中，以PDPA为内核的纳米粒保持稳定；但被肿瘤细胞摄取后，在内涵体/溶酶体pH 4.0～6.5条件下，PDPA链上的二异丙氨基发生质子化而使内核由疏水变为亲水，并协同交联层二硫键(S-S)的GSH响应性断裂，促进纳米粒在肿瘤细胞内分解并快速释放药物。

所述双靶向和pH/氧化还原双敏感的核交联半乳糖基纳米粒的表面为亲水性聚合物PMApGP，能与人肝癌细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)特异性结合，介导向肝癌细胞递送药物，而且在纳米粒的表面亲水层上进一步修饰了靶向配体叶酸，促进纳米粒在肿瘤组织的富集和肿瘤细胞的内吞。

进一步优选的，由式1所示的FA-PMgDP聚合物自组装形成的核交联纳米粒，其特征在于，该纳米粒最外层为主动靶向配体叶酸以及能够与肝癌细胞表面的糖蛋白ASGPR特异性结合的 PMApGP，内部为高度pH和氧化还原敏感的交联疏水核。该纳米粒，通过内核交联使得纳米粒在血液长循环中结构稳定，延长了体循环时间；半乳糖和叶酸靶向配体，提高纳米载体在肿瘤组织的富集，增强肿瘤细胞对纳米药物载体的摄取；纳米药物载体被肿瘤细胞摄取后，在肿瘤细胞内 GSH作用下，二硫键断裂使交联结构快速解离；酸敏感的疏水内核在内涵体/溶酶体弱酸环境中(pH 4.0～6.5)，发生疏水-亲水转变而使纳米粒解体，促进药物快速释放，提高药效。

第二，本发明提供了双靶向和pH/氧化还原双敏感的核交联半乳糖基纳米粒，制备包括以下步骤：

一、FA-PMgDP嵌段共聚物的合成

1)6-O-甲基丙烯酰氯-1，2∶3，4-O-异亚丙基-D-吡喃半乳糖(MAIpGP)单体的制备

冰水浴条件下，将浓硫酸逐滴加入无水丙酮中，溶解均匀后再分批加入D-(+)-半乳糖，搅拌0.5 h后在室温下搅拌5h，之后用饱和NaOH溶液将上述混合溶液的pH中和至7～8，过滤收集滤液并旋蒸除去溶剂，继续用适量乙醚萃取收集乙醚相，经无水MgSO₄干燥和减压蒸馏得到黄色糖浆状液体；将黄色糖浆状液体加入干燥四氢呋喃和干燥三乙胺的混合溶液中，在冰水浴条件下将甲基丙烯酰氯逐滴加入上述混合液中，0.5h后在室温下搅拌三天，之后过滤收集滤液并旋蒸除溶剂，最后用硅胶层析柱精制，得到产物MAIpGP；

2)采用三硫代十二烷基-2-氰基异丙酸(CTA)为RAFT链转移剂，偶氮二异丁腈(AIBN) 为引发剂，逐步引发6-O-甲基丙烯酰氯-1，2；3，4-O-异亚丙基-D-吡喃半乳糖(MAIpGP)、甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯(DPA)和2-(吡啶-2-二硫)甲基丙烯酸乙酯(PDEMA)聚合，得到 P(MAIpGP)_x-b-P(DPA_y-co-PDEMA_z)(PMpDP)嵌段聚合物；

3)PMpDP物与甲酸溶液(85％)于室温下反应48h后，再加入适量蒸馏水于室温下搅拌3h，然后置于蒸馏水中透析48h后冷冻干燥，得到脱保护后的P(MApGP)_x-b-P(DPA-co-PDEMA) (PMgDP)嵌段聚合物；

4)二甲基亚砜(DMSO)中，PMgDP聚合物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)于室温下反应5h后，加入FA-NH₂在60℃下继续反应2h，蒸馏水透析48h并冷冻干燥后，得到FA-PMgDP嵌段共聚物。

二、未交联FA-PMgDP纳米粒(FA-PMgDP NC NPs)的制备

1)将FA-PMgDP嵌段共聚物完全溶解于与水混溶的有机溶剂中，搅拌条件下用注射器注入适量磷酸缓冲溶液(pH＝7.4，10mM)(PB溶液)，随着水溶液的加入，逐渐形成纳米悬液。

所述有机溶剂为DMSO；

2)将纳米悬液移入透析袋中，PB溶液透析24～48h，以除去有机溶剂。

三、FA-PMgDP NC NPs的交联

1)将FA-PMgDP NC NPs溶液除氧，在无氧环境中加入DTT，搅拌8～12h；

所述无氧环境为真空条件或氮气保护；

所述DTT摩尔量为纳米粒中S-S键摩尔量的1.2～2倍；

2)将反应完全的纳米粒溶液装入透析袋中，PB溶液中透析12～24h，即空气氧化制备出交联的FA-PMgDP纳米粒(FA-PMgDP CC NPs)。

本发明提供了一种具有双靶向和pH/氧化还原双敏感的核交联半乳糖包载药物纳米粒，它是以 FA-PMgDP共聚物为载体，物理包埋抗肿瘤药物，所得载药交联纳米粒的平均粒径为25～200nm。

所述的抗肿瘤药物与FA-PMgDP嵌段共聚物的质量比为1∶10～5∶20；所述的有机溶剂为二甲基亚砜；所述的抗肿瘤药物选自阿霉素、紫杉醇、喜树碱、姜黄素或吉西他滨中的一种或多种的任意组合。

所述的包载药物纳米粒的制备方法是：将抗肿瘤药物与载体材料溶于能和水混溶的有机溶剂中，搅拌条件下逐滴加入一定体积的PB溶液，然后用透析法除去有机溶剂。

对抗肿瘤药物阿霉素的包埋方法包括如下步骤：

载体浓度为1mg/mL；所述的抗肿瘤药物与FA-PMgDP嵌段共聚物的质量比为1∶10～5∶20；搅拌条件下用注射器将PB溶液注入FA-PMgDP聚合物、DOX与DMSO混溶的有机溶剂中，得到纳米悬液，将纳米悬液在PB溶液中透析24h，以除去有机溶剂，得到未交联的载药纳米粒悬液。

交联载阿霉素纳米粒的制备方法包括以下步骤：

1)在无氧环境中将DTT加入载药纳米悬液中，搅拌8～12h；

所述无氧环境为真空条件或氮气保护；

所述DTT的摩尔量为纳米粒中S-S键摩尔量的1.2～2倍；

2)将反应完全的纳米粒溶液装入透析袋中，PB溶液中透析12～24h，完成纳米粒的交联，即得交联载阿霉素纳米悬液。

透析袋为截留分子量为3500Da的透析袋；

所得到包载阿霉素的FA-PMgDP核交联纳米粒的平均粒径为25～200nm。

本发明提供的双靶向和pH/氧化还原双敏感的核交联半乳糖基纳米粒及其制备方法，具有如下优点：

1)纳米粒形态呈球形，粒径分布范围小。

2)纳米粒结构稳定、其生物相容性良好，能包载疏水性的抗肿瘤药物。

3)本发明提供的双靶向和pH/氧化还原双敏感的核交联半乳糖基纳米粒，二硫键交联的内核能够抑制药物在正常生理条件下的释放以降低药物突释带来的毒副作用，被肿瘤细胞摄取后，在肿瘤细胞内低pH和谷胱甘肽(GSH)作用下pH/氧化还原敏感聚合物单元发生亲水-疏水转变和交联结构解离，促进药物释放。

4)本发明提供的双靶向和pH/氧化还原双敏感的核交联半乳糖基纳米粒，酸敏感的疏水内核在内涵体/溶酶体弱酸环境下(pH 4.0～6.5)，发生疏水-亲水转变而使纳米粒解体，促进药物快速释放。

5)本发明提供的双靶向和pH/氧化还原双敏感的核交联半乳糖基纳米粒，靶向配体、交联和 pH敏感疏水内核可以协同发挥作用，提高纳米药物的递送效率，实现药物在肿瘤细胞内的可控释放。

6)本发明提供的双靶向和pH/氧化还原双敏感的核交联半乳糖基纳米粒，是一种较好的具有肿瘤靶向性的智能载体材料，制备方法简便易行，稳定性良好，便于操作推广。

附图说明

图1为FA-PMgDP-III嵌段共聚物合成路线图及PMgDP-III聚合物的核磁共振氢谱。

图2为FA-PMgDP-III嵌段共聚物的紫外光谱。

图3为非交联FA-PMgDP-III载药纳米粒(FA-PMgDP-III NC/DOX NPs)和交联FA-PMgDP-III 载药纳米粒(FA-PMgDP-III CC/DOX NPs)的粒径分布图和透射电镜图。

图4为非交联PMgDP-III纳米粒(PMgDP-III NC NPs)与交联PMgDP-III纳米粒(PMgDP-III CC NPs)在(i)pH变化；(i)DTT(10mM)；(iii)pH与DTT(10mM)变化条件下纳米粒粒径的变化。

图5为非交联PMgDP-III载药纳米粒和交联PMgDP-III载药纳米粒的体外DOX释放。

图6为HepG2细胞对非交联PMgDP-III载药纳米粒(PMgDP-III NC/DOX NPs)、交联PMgDP-III载药纳米粒(PMgDP-III NC/DOX NPs)和交联FA-PMgDP-III载药纳米粒的细胞胞吞。

图7为载药纳米粒细胞毒性评价：(A)非交联PMgDP-III纳米粒、交联PMgDP-III纳米粒和交联FA-PMgDP-III纳米粒对HepG2细胞的细胞毒性；(B)裸药DOX、非交联PMgDP-III载药纳米粒、交联PMgDP-III载药纳米粒和交联FA-PMgDP-III载药纳米粒对HepG2细胞的细胞毒性。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明做进一步说明，但需要指出的是，以下实施例不能构成对本发明的任何限制。以下所述是本发明实施例的优选实施方式：

实施例1：FA-P(MApGP)_x-b-P(DPA_y-co-PDEMA_z)(FA-PMgDP)两亲性嵌段聚合物的合成

冰水浴条件下，将浓硫酸(10mL)逐滴加入无水丙酮(250mL)中，溶解均匀后再分批加入D-(+)-半乳糖(10g)，搅拌0.5h后在室温下搅拌5h。之后用饱和NaOH溶液将上述混合溶液的pH中和至7～8，过滤收集滤液并旋蒸除去溶剂，继续用适量乙醚萃取收集乙醚相，经无水MgSO₄干燥和减压蒸馏得到黄色糖浆状液体；将黄色糖浆状液体加入干燥四氢呋喃(70mL)和干燥三乙胺(7mL)的混合溶液中，在冰水浴条件下将甲基丙烯酰氯(6mL)加入上述混合液中，0.5h后在室温下搅拌三天，之后过滤收集滤液并旋蒸除溶剂，最后用硅胶层析柱精制，得到产物MAIpGP。

2)P(MAIpGP)_x-b-P(DPA-co-PDSMA)(PMpDP)聚合物的制备

在shlenk反应管中依次加入聚合物PMAIpGP(0.2g，2.32×10^-5mol)、引发剂(AIBN)(1mg， 0.58×10^-5mol)、DPA(0.1336g，6.26×10^-4mol)、PDSMA(0.1107g，4.176×10^-4mol)和2mL溶剂甲苯，经抽真空-通氩气三个循环后，密闭反应管，在70℃的油浴中反应24h；反应体系降至室温后，经冰冻正己烷沉淀和室温真空干燥，得到产物PMpDP。

3)P(MApGP)_x-b-P(DPA_y-co-PDEMA_z)(PMgDP)聚合物的制备

PMpDP嵌段聚合物溶于3mL甲酸，室温下搅拌48h，后再加入1mL蒸馏水并在室温下搅拌3h，装入透析袋中，用去离子水透析48h，冷冻干燥得到PMgDP嵌段聚合物。

实施例2：一系列PMgDP嵌段聚合物的制备

装置与步骤同实施例1，只是通过调节DPA、PDEMA单体与大分子引发剂PMAIpGP的比例，得到一系列不同聚合度和不同亲疏水比的嵌段聚合物PMgDP。如表一所示，利用核磁共振波谱对 PMgDP聚合物进行表征，优选的结果如图1所示。对本实施例中所得聚合物PMgDP-III的特征峰进行分析，结果表明，该聚合物被成功合成，组成与投料比一致。利用紫外光谱对FA-PMgDP-III 聚合物进行表征，结果如图2所示。与PMgDP-III聚合物的紫外光谱相比，FA-PMgDP-III聚合物在362nm处出现叶酸的特征峰，说明该聚合物被成功合成。

表一一系列PMgDP嵌段聚合物的组成

利用核磁共振波谱对PMgDP聚合物进行表征，优选的结果如图1所示。对本实施例中所得聚合物PMgDP-III的特征峰进行分析，结果表明，该聚合物被成功合成，组成与投料比一致。利用紫外光谱对FA-PMgDP-III聚合物进行表征，结果如图2所示。与PMgDP-III聚合物的紫外光谱相比，FA-PMgDP-III聚合物在362nm处出现叶酸的特征峰，说明该聚合物被成功合成。

实施例3：载阿霉素纳米粒的制备

将聚合物FA-PMgDP-III和DOX共溶于DMSO中，在磁力搅拌条件下将五倍量的PB溶液滴入DMSO混合溶液中，然后将溶液装入透析袋(MWCO：3500Da)在PB溶液中透析24h，除去溶剂DMSO，得到未交联的载药纳米粒溶液。

实施例4：载药纳米粒的交联

取上述未交联的载药纳米粒溶液(1mg/mL)10mL，通氮气15分钟，确保将空气赶净，加入交联剂DTT，交联剂的量为FA-PMgDP-III纳米粒溶液中二硫键摩尔量的1.2倍，然后在室温和氮气保护条件下搅拌反应12h，反应结束后，将纳米粒溶液装入透析袋中(MWCO：3500Da)，用 PB溶液透析24h，除去DMSO和过量的DTT，得到交联的载药纳米粒溶液。

取一定量的未交联和交联载药纳米粒溶液，先通过冷冻干燥将溶液中的水除去，然后精确称取适量冷冻干燥后的固体，加5mL DMSO溶解，通过紫外测定，结合DOX的标准曲线计算DOX 的载药量和包封率。交联FA-PMgDP-III载药纳米粒的载药量可以达到16％，包封率可以达到89％。载DOX的FA-PMgDP-III纳米粒呈球形，大小较均匀，见图3。图3为载药纳米粒的粒径分布图和透射电镜图。结果表明粒径分布较窄。

实施例5：交联PMgDP-III纳米粒的敏感性表征，具体步骤如下：

将制备的交联PMgDP-III纳米粒溶液分为四组，调控纳米粒溶液的条件，利用激光粒度仪检测纳米粒粒径的变化。条件如下：(i)磷酸缓冲溶液(10mM，pH＝7.4)；(ii)磷酸缓冲溶液(10mM，pH＝7.4)和DTT(10mM)(iii)乙酸/乙酸钠缓冲溶液，pH＝5.0；(iv)乙酸/乙酸钠缓冲溶液(10mM， pH＝5.0)和DTT(10mM)。

检测结果如图4所示，交联纳米粒在加DTT和pH＝7.4条件下，由于二硫键的断裂，纳米粒发生膨胀，4h后纳米粒粒径从24nm增加到28nm，但是20h后，交联纳米粒的粒径没有明显的变化；而在还原性DTT(10mM)和pH＝5.0条件的双重作用下，纳米粒粒径变化明显，说明纳米粒发生解体。

实施例6：双靶向和pH/氧化还原双敏感的核交联半乳糖载药纳米粒的体外药物释放行为表征，具体步骤如下：

双靶向和pH/氧化还原双敏感的核交联半乳糖载药纳米粒的刺激响应性释放：5mL载DOX的 FA-PMgDP-III交联纳米溶液(2.5mg/mL)封装在截留分子量为3500Da的透析袋中，释放液为pH＝7.4 或5.0的缓冲溶液，为了模拟细胞内的还原环境，DTT的浓度为10mM。释放在37℃的恒温振荡器中进行。在预定的时间点，取出4mL的释放液，补加相同体积的新鲜释放液。药物的释放量，利用紫外分光光度计进行测定。

释放结果如图5所示，在单一刺激条件下，药物的释放速率依然达不到要求。而一旦在双重刺激作用下，药物发生快速释放。

实施例7：双靶向和pH/氧化还原双敏感的核交联半乳糖载药纳米粒的细胞胞吞，具体步骤如下：

以含10％胎牛血清(FBS)的DMEM(Sigma-Aldrich，USA)为基础培养液，将HepG2细胞以1×10⁵个/mL细胞浓度接种于24孔板中，置于37℃、5％CO₂和饱和湿度条件下培养。将裸药 DOX、非交联PMgDP-III载药纳米粒(PMgDP-III NC/DOX NPs)溶液、交联PMgDP-III载药纳米粒(PMgDP-III CC/DOX NPs)溶液和交联FA-PMgDP-III载药纳米粒(FA-PMgDP-III CC/DOX NPs)溶液用DMEM稀释，得到药物浓度在10μg/mL的溶液。取500μL的上述溶液分别加到接种过细胞的孔板中替代原培养液。与载药纳米粒及裸药DOX培养一段时间后，取出培养板，用共聚焦显微镜检测细胞对纳米载体的胞吞能力。检测结果如图6所示，可见HepG2细胞对 FA-PMgDP-III CC/DOX NPs的胞吞能力远高于PMgDP-III NC/DOX NPs和交联PMgDP-IIICC/DOX NPs。

实施例8：交联载药纳米粒的细胞毒性评价，具体步骤如下：

以含10％胎牛血清(FBS)的DMEM为基础培养液，将HepG2细胞以1×10⁵个/mL细胞浓度接种于96孔板中，置于37℃、5％CO₂和饱和湿度条件下培养。首先，将PMgDP-III NCNPs、 PMgDP-III CC NPs和FA-PMgDP-III CC NPs用DMEM稀释，得到纳米粒浓度在0.05～1.00mg/mL 的溶液，取100μL各浓度的上述溶液分别加到接种过HepG2细胞的孔板中替代原培养液。其次，裸药DOX、PMgDP-III NC/DOX NPs、PMgDP-III CC/DOX NPs和FA-PMgDP-IIICC/DOX NPs溶液，用DMEM稀释，得到0.01～40μg/mL的溶液，取100μL各浓度的上述溶液分别加到接种过 HepG2细胞的孔板中替代原培养液。分别培养一段时间后，取出培养液，用MTT法检测材料的毒性。

结果如图7所示，纳米粒均表现出良好的细胞相容性，即使在溶液浓度达到1.00mg/mL。并且FA-PMgDP-III CC/DOX NPs对肿瘤细胞的抑制能力明显高于PMgDP-IIINC/DOX NPs和 PMgDP-III CC/DOX NPs，这与细胞胞吞实验的结果一致。

Claims

1.一种双靶向和pH/氧化还原双敏感的核交联纳米粒，其特征在于纳米粒表面是至少含有聚6-O-甲基丙烯酰氯-D-吡喃半乳糖(PMApGP)的亲水层，内部是至少含有pH敏感聚合物单元和氧化还原敏感聚2-(吡啶-2-二硫)甲基丙烯酸乙酯(PPDEMA)单元的疏水核，纳米粒表面主动靶向基团除了半乳糖之外，至少含有多肽、抗体和叶酸中的一种，且其疏水内核在二硫苏糖醇(DTT)作用下发生交联。

2.权利要求1所述的双靶向和pH/氧化还原双敏感的核交联半乳糖基纳米粒，其特征在于：

1)所述的pH敏感聚合物为聚甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯(PDPA)；

2)所述的氧化还原敏感聚合物为含二硫键的聚2-(吡啶-2-二硫)甲基丙烯酸乙酯(PPDEMA)；

3)所述纳米粒表面亲水层除带有肿瘤靶向配体半乳糖(GAL)外，至少还含有多肽、抗体、和叶酸(FA)中的一种；

4)所述纳米粒的表面亲水层配体PMApGP通过与人肝癌细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体(ASGP-R)特异性结合，可介导向肝癌细胞递送药物；叶酸靶向配体通过生物接头以主动结合肿瘤位点，可实现主动靶向递送；

5)所述的PPDEMA在还原环境中，分子内的二硫键被还原成巯基，在氧化环境中被氧化成分子间的二硫键；

所述还原环境为DTT或谷胱甘肽(GSH)；所述氧化环境为空气或人体血液循环系统。

3.权利要求2所述的双靶向和pH/氧化还原双敏感的核交联半乳糖基纳米粒，其特征在于是由式1所示的嵌段共聚物FA-P(MApGP)_x-b-P(DPA_y-co-PDEMA_z)(FA-PMgDP)自组装形成纳米粒，再经DTT与PPDEMA的反应形成核交联的纳米粒；所述的嵌段共聚物FA-PMgDP中，P(MApGP)_x聚合度x为15～40的整数，P(DPA)_y聚合度y为10～40的整数，P(PDEMA)_z聚合度z为5～30的整数。

4.权利要求3所述的双靶向和pH/氧化还原双敏感的核交联半乳糖基纳米粒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

一、FA-PMgDP嵌段共聚物的合成

1)6-O-甲基丙烯酰氯-1，2：3，4-O-异亚丙基-D-吡喃半乳糖(MAIpGP)单体的制备

冰水浴条件下，将浓硫酸逐滴加入无水丙酮中，溶解均匀后再分批加入D-(+)-半乳糖，搅拌0.5h后在室温下搅拌5h，之后用饱和NaOH溶液将上述混合溶液的pH中和至7～8，过滤收集滤液并旋蒸除去溶剂，继续用适量乙醚萃取收集乙醚相，经无水MgSO₄干燥和减压蒸馏得到黄色糖浆状液体；将黄色糖浆状液体加入干燥四氢呋喃和干燥三乙胺的混合溶液中，在冰水浴条件下将甲基丙烯酰氯逐滴加入上述混合液中，0.5h后在室温下搅拌三天，之后过滤收集滤液并旋蒸除溶剂，最后用硅胶层析柱精制，得到产物MAIpGP；

2)采用三硫代十二烷基-2-氰基异丙酸(CTA)为RAFT链转移剂，偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，逐步引发MAIpGP、甲基丙烯酸二异丙氨基乙酯(DPA)和2-(吡啶-2-二硫)甲基丙烯酸乙酯(PDEMA)聚合，得到P(MAIpGP)_x-b-P(DPA_y-co-PDEMA_z)(PMpDP)嵌段聚合物；

3)PMpDP嵌段聚合物与甲酸溶液(85％)于室温下搅拌48h后，再加入适量蒸馏水于室温下搅拌3h，然后置于蒸馏水中透析48h后冷冻干燥，得到脱保护后的P(MApGP)_x-b-P(DPA_y-co-PDEMA_z)(PMgDP)嵌段聚合物；

4)二甲基亚砜(DMSO)中，PMgDP聚合物与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)于室温下反应5h后，加入氨基化的叶酸(FA-NH₂)在60℃下继续反应2h，蒸馏水透析48h并冷冻干燥后，得到FA-PMgDP嵌段共聚物。

二、未交联FA-PMgDP纳米粒的制备

所述有机溶剂为DMSO；

三、FA-PMgDP纳米粒的交联

1)将FA-PMgDP纳米粒溶液除氧，在无氧环境中加入DTT，搅拌8～12h；

所述无氧环境为真空条件或氮气保护；

所述DTT摩尔量为纳米粒中S-S键摩尔量的1.2～2倍；

2)将反应完全的纳米粒溶液装入透析袋中，PB溶液中透析12～24h，即空气氧化制备出交联的FA-PMgDP纳米粒。

5.一种具有双靶向和pH/氧化还原双敏感性的核交联半乳糖包载药物纳米粒，其特征在于它是以FA-PMgDP聚合物为载体，物理包埋抗肿瘤药物；

所述的抗肿瘤药物与FA-PMgDP嵌段共聚物的质量比为1∶10～5∶20；

所述的载药交联纳米粒平均粒径为25～200nm。

6.如权利要求5所述的包载药物交联纳米粒的制备方法，其特征在于将抗肿瘤药物与载体材料溶于能和水混溶的有机溶剂中，搅拌条件下逐滴加入PB溶液，用透析法除去有机溶剂。

7.权利要求5和6所述的制备方法，其特征在于：

1)所述的抗肿瘤药物选自阿霉素(DOX)、紫杉醇、喜树碱、姜黄素或吉西他滨中的一种或多种的任意组合；

2)所述的载体浓度为1～5mg/mL，药物为阿霉素；

3)所述的抗肿瘤药物与FA-PMgDP嵌段共聚物的质量比为1∶10～5∶20；

4)搅拌条件下用注射器将PB溶液注入FA-PMgDP聚合物、DOX与DMSO混溶的有机溶液中，得到纳米悬液，将纳米悬液在PB溶液中透析24h，然后将所得载药纳米粒溶液按权利要求4步骤三所述的交联方法进行交联，得到包载阿霉素的FA-PMgDP核交联纳米粒，所述的载药交联纳米粒平均粒径为25～200nm。

8.权利要求3所述的嵌段共聚物FA-PMgDP，其特征在于可用于药物、核酸、蛋白、多肽、多糖类大分子的体内递送，或用于诊断试剂。