CN105663033B

CN105663033B - 瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物及应用

Info

Publication number: CN105663033B
Application number: CN201610105499.1A
Authority: CN
Inventors: 赵彦兵; 杨祥良; 万江山; 周小顺; 耿石楠; 赵浩; 李涵
Original assignee: Huazhong University of Science and Technology
Current assignee: Huazhong University of Science and Technology
Priority date: 2016-02-25
Filing date: 2016-02-25
Publication date: 2019-04-19
Anticipated expiration: 2036-02-25
Also published as: CN105663033A

Abstract

本发明涉及瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物及应用，本发明所述瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物由碱性抗肿瘤药物键合酸性温敏嵌段聚合物后以质量百分比浓度5～30％分散于超纯水，所述酸性温敏嵌段聚合物包括由酸性嵌段A和温敏嵌段B组成的AB两嵌段或ABA三嵌段，所述酸性嵌段A为侧链带有羧酸根、硫酸根、磺酸根或磷酸根的聚合物嵌段，所述温敏嵌段B为侧链带有温度敏感基团的聚合物嵌段。本发明所制备的瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物载药量高、可实现碱性抗肿瘤药物在瘤内缓控释放和长期滞留，可用于肝癌、皮肤癌、肾癌、肺癌瘤内注射，达到增强疗效、降低毒副作用和不良反应的作用。

Description

瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物及应用

技术领域

本发明涉及一种瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物及应用，属于药物制剂技术领域。

背景技术

癌症是严重危害人类健康的重大疾病，全身化疗是目前临床上经常采用的治疗方法之一，然而由于细胞毒性药物在血液中的快速释放以及对正常组织器官和靶标肿瘤的非选择性传递，导致治疗指数低、严重的毒副作用和不良反应。近年来，主动靶向和被动靶向等多种肿瘤靶向策略被用于提高抗肿瘤药物的选择性传递，以提高治疗指数并降低毒副作用。例如作为第一个长循环被动靶向阿霉素脂质体，在临床上已经得到了广泛的应用，显著降低了阿霉素的毒副作用，增强了肿瘤治疗效果。

与主动/被动靶向策略对肿瘤血管、血供的高度依赖性不同，肿瘤局部化疗(有时也称之为物理靶向)对于化疗药物的传递不依赖于肿瘤血管形态和血供情况，因此可以显著提高药物在靶标部位的蓄积浓度，降低药物在正常组织和血液中的弥散浓度，从而增强药物疗效和治疗指数、降低毒副作用。目前在临床上广泛用于多种恶性实体瘤的局部化疗方法包括动脉灌注/动脉栓塞、瘤内/瘤周注射、经皮穿刺等等。如苯乙烯马来酸新制癌菌素(SMANCS，日本批准用于治疗肝癌的药物)通过动脉灌注/栓塞等局部给药手段，可实现肿瘤/血液药物浓度比超过2500倍的靶向效率，为单克隆抗体的靶向效率的2～10倍。

与之类似，化疗药物的瘤内注射也具有在靶标部位高效蓄积药物浓度，降低非靶标部位药物弥散浓度的优异特性。近年来，多种瘤内注射用的新型药物载体已有许多研究报道，如紫杉醇凝胶采用可生物降解的三嵌段温敏聚合物PLGA-PEG-PLGA以其在体内形成原位凝胶药物储库，提高疏水性药物紫杉醇在肿瘤部位的缓慢释放和长期滞留，释放长达6个星期，在增强疗效和降低毒性方面取得了引人注目的成功。与之类似的，Harper等人报道了用于非小细胞肺癌局部化疗的载紫杉醇可生物降解聚酯微球【Clin cancer Res 1999，5:4242】。此外，一些具有良好生物相容性的小分子和大分子也被广泛用于肿瘤局部化疗，如脂质凝胶、壳聚糖凝胶、纤维素凝胶等。

在这些瘤内注射用原位凝胶药物递送系统的报道中，紫杉醇被认为是最适合局部化疗的抗肿瘤药物。这主要是因为紫杉醇的高疏水性有利于其在肿瘤靶标组织内的长期滞留和缓控释放。中国专利“一种联合分子靶向药物和细胞毒药物的凝胶注射剂”(公开号：104622794A，公开日：20150520)公开了一种将分子靶向药物和细胞毒药物的单一制剂或联合制剂包载于温敏材料形成的凝胶中，实现瘤内/瘤周注射局部化疗，以提升药物的治疗效果并降低全身相关毒性，但是该专利说明书中实施例均以高疏水性的紫杉醇、喜树碱为化疗药物的代表，没有体现亲水性化疗药物；二是药物以包载于温敏凝胶的方式存在，其药物的释放速度快，且易受瘤内环境的影响，导致药物释放波动性大；三是制备方法使用有机溶剂作溶剂，增加了刺激性和降低了安全性。此外，一些文献报道了瘤内注射用原位凝胶递药系统(如超分子水凝胶、脂质体、可生物降解大分子等)对于亲水性药物如阿霉素的负载与缓控释放，然而仍然存在载药量低、释放速率快、初始突释等问题。其原因在于亲水性阿霉素等药物体内的释放、扩散行为与高疏水性的紫杉醇有很大的差异，载体材料的简单负载无法实现水溶性药物在肿瘤部位的缓控释放和长期滞留。

发明内容

本发明的目的在于提供一种瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物及应用，所制备的瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物载药量高、可瘤内局部注射给药，可使碱性抗肿瘤药物在瘤内缓控释放和长期滞留，达到增强疗效、降低毒副作用和不良反应的作用。

实现本发明的技术目的采用的技术方案是：

一种瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物，所述纳米组合物由碱性抗肿瘤药物键合酸性温敏嵌段聚合物后以质量百分比浓度5～30％分散于超纯水，所述超纯水是指在25℃时电阻率≥15兆欧·厘米的水；

所述酸性温敏嵌段聚合物包括由酸性嵌段A和温敏嵌段B组成的AB两嵌段或ABA三嵌段，所述酸性嵌段A为侧链带有羧酸根、硫酸根、磺酸根或磷酸根的聚合物嵌段，所述温敏嵌段B为侧链带有温度敏感基团的聚合物嵌段。

本发明所述酸性嵌段A为丙烯酸、丙烯酸特丁酯-co-丙烯酸、4-苯乙烯磺酸钠、甲基丙烯酸-2-丙磺酸、甲基丙烯酸β-硫酸乙酯、甲基丙烯酸β-磷酸乙酯中的一种，所述酸性温敏嵌段聚合物中酸性嵌段A的数均分子量为1000～40000Da，优选为5000～20000Da。对于羧酸根，通常采用酸性单体前体聚合后再水解而得，这些酸性单体前体包括丙烯酸特丁酯、甲基丙烯酸特丁酯、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯等；对于含硫酸根/磺酸根或磷酸根的单体，直接参与共聚物的聚合反应。

本发明所述温敏嵌段B为N-异丙基丙烯酰胺、N，N-二乙基丙烯酰胺、寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯、寡聚乙二醇乙醚甲基丙烯酸酯、N-乙烯基己内酰胺、N-乙烯基吡咯烷酮、N-二甲胺乙基甲基丙烯酸酯、N-(1-羟甲基)丙基甲基丙烯酰胺、N-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊环)甲基丙烯酰胺、N-乙烯基异丁酰胺、N-乙烯基正丁酰胺中的一种，所述酸性温敏嵌段聚合物中温敏嵌段B的数均分子量为5000～80000Da，优选为10000～40000Da。

本发明所述酸性温敏嵌段聚合物为聚丙烯酸-b-聚N-异丙基丙烯酰胺-b-聚丙烯酸、聚4-苯乙烯磺酸钠-b-聚寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸-2-丙磺酸-聚N-异丙基丙烯酰胺-b-聚甲基丙烯酸-2-丙磺酸之中的一种。

本发明所述酸性温敏嵌段聚合物的酸性嵌段A的摩尔含量为1～50％，所述温敏嵌段B的摩尔含量为50～99％，酸性嵌段A与温敏嵌段B共同构成酸性温敏嵌段聚合物。

本发明所述碱性抗肿瘤药物为多柔比星(阿霉素，DOX)、柔红霉素、表柔比星、吡柔比星、长春瑞宾、吉西他滨、安西他滨、羟基脲、丝裂霉素、博莱霉素A5、培洛霉素、米托蒽醌、伊立替康、10-羟基喜树碱、长春新碱、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶中的一种或多种。

本发明所述碱性抗肿瘤药物与酸性温敏嵌段聚合物质量比为0.01～0.8:1，优选为0.05～0.5:1。

本发明所述瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物包封率不低于90％，优选不低于95％。

本发明所述瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物只有在一定浓度范围内才能表现出明显的温敏溶胶-凝胶相变行为，当浓度低于临界浓度时，原位温敏聚合物凝胶纳米组合物随温度升高只发生溶胶-相分离转变，而不出现凝胶态；当浓度过高时，原位温敏聚合物凝胶纳米组合物在室温或室温以下即以凝胶态的形式存在，随温度升高发生凝胶-相分离转变。因此，作为瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶使用时，瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物质量百分比浓度范围应为5～30％，优选浓度范围为10～20％。在此浓度范围内，发生溶胶-凝胶相变的温度为27～37℃，优选为25～35℃；该瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物溶胶态的复合模量G*为0.1～0.8Pa，优选为0.1～0.5Pa；而凝胶态后的复合模量G*为500～1500Pa，优选为900～1200Pa。

一种瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物的制备方法，包括如下步骤：

1)药物溶液的制备：称取碱性抗肿瘤药物，将其制备成浓度为1～10mg/mL的水溶液；

2)酸性温敏嵌段聚合物的制备：酸性嵌段A和温敏嵌段B制备成AB两嵌段酸性温敏嵌段聚合物或ABA三嵌段酸性温敏嵌段聚合；

3)酸性温敏嵌段聚合物溶液的制备：取步骤2)所制备的酸性温敏嵌段聚合物，将其制备成浓度为1～3mg/mL水溶液，并用氢氧化钠调节至pH 8.0；

4)共组装：将步骤1)制备的药物溶液加入到步骤3)所制备的酸性温敏嵌段聚合物溶液中，在0～60℃下避光搅拌反应0.5～24h，得到负载药物的温敏凝胶纳米粒溶液；

5)瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物：将步骤4)所制备的负载药物的温敏凝胶纳米粒溶液冷冻干燥后得共组装纳米粒，以质量百分比浓度为5～30％分散于超纯水中。

一种瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物用于肝癌、皮肤癌、肾癌或肺癌瘤内的注射物，用于肿瘤局部化疗，该纳米组合物可以单独使用，也可以与其它肿瘤治疗方法联合使用。

本发明所述瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物的制备可以通过碱性抗肿瘤药物与酸性温敏嵌段聚合物进行混合来实现，碱性抗肿瘤药物与酸性温敏嵌段聚合物混合后形成纳米尺度的不溶性药物-聚合物盐，稳定分散于超纯水中，得到瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物，其流体力学直径为100～300nm，优选为100～250nm；zeta电位为-30～-10mV。如多柔比星与两嵌段或三嵌段酸性温敏嵌段聚合物上的酸性嵌段通过酸碱中和作用，形成不溶性的多柔比星盐，共组装形成具有核壳结构的瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物，在瘤内注射后发生温敏溶胶-凝胶相变，通过不溶性多柔比星盐以及体内凝胶化的形成，实现多柔比星在肿瘤组织内的局部缓释和长期滞留，达到增强肿瘤治疗效果、降低毒副作用的目的。

本发明所述酸性温敏嵌段聚合物采用活性/可控自由基聚合机理，在合适的催化剂和引发剂条件下，制备成不同分子量比例的酸性嵌段和温敏嵌段的酸性温敏嵌段聚合物；也可以采用活性/可控自由基聚合首先制备酸性温敏嵌段聚合物前体，再经水解得到酸性温敏嵌段聚合物。

本发明有益技术效果：

1、本发明制备的瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物为碱性抗肿瘤药物与酸性温敏嵌段聚合物的酸性嵌段以离子键的形式形成的纳米聚合物-药物不溶性盐，水溶性和脂溶性碱性抗肿瘤药物均能在肿瘤组织微酸性环境中缓慢电离，实现稳定、长时释放，同时可解决水溶性碱性抗肿瘤药物释放速率快、初始突释现象。

2、本发明制备的瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物释放行为具有酸度依赖性，在微酸性肿瘤组织环境中，利于碱性抗肿瘤药物的释放。

3、本发明瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物的共组装是将药物水溶液加入到酸性温敏嵌段聚合物水溶液中，在0～60℃下避光搅拌反应0.5～24h，即得，共组装未使用有机溶剂。

4、本发明制备的瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物载药量高，载药量最高可达80％，在肿瘤内形成一个药物储库；瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物中的酸性温敏嵌段聚合物能够在体温下实现相变，转变成凝胶，实现碱性抗肿瘤药物在瘤内缓控释放和长期滞留，本发明制备的瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物在瘤内释放10天后，阿霉素的滞留量仍高达43.4％，远高于游离阿霉素制剂21.4％的滞留量。如图2所示。

5、本发明制备的瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物肿瘤抑制效果好，使用本发明制备的瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物可使H22荷瘤Balb/C小鼠肿瘤得到有效抑制，14天后肿瘤尺寸为0.12cm³，重量为0.04g，优于游离阿霉素制剂，其14天后肿瘤尺寸为0.20cm³，重量为0.08g。图1是瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物D-PNA100对H22荷瘤Balb/C小鼠皮下移植瘤的抑制效果图。如图1所示，D-PNA100的抑制效果最好。

6、本发明制备的瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物生物相容性好，MTT法中D-PNA100与游离阿霉素具有相近的细胞杀伤效果，但在H22荷瘤Balb/C小鼠整体动物实验中，使用本发明制备瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物H22荷瘤Balb/C小鼠存活期长、体重变化小，明显优于游离阿霉素制剂。

7、本发明制备的瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物为肿瘤局部给药制剂，可在肝癌、皮肤癌、肾癌和肺癌的瘤内注射，可有效提高肿瘤病变部位药物浓度并降低正常组织药物浓度，实现增效、降毒的功效，增强顺应性。

附图说明

图1瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物D-PNA100对H22荷瘤Balb/C小鼠皮下移植瘤的抑制效果图。

图2 H22荷瘤Balb/C小鼠瘤内注射游离阿霉素溶液(DOX)和D-PNA100后瘤内阿霉素滞留量关系图。

图3 H22荷瘤Balb/C小鼠瘤内注射游离阿霉素溶液(DOX)和D-PNA100后瘤内阿霉素荧光强度图。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步说明，使本领域技术人员可以更好的理解本发明。本发明所优选的具体实施方式应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明。

实施例1

1)药物溶液的制备：称取多柔比星20mg，将其制备成浓度为2mg/mL的水溶液；

2)酸性温敏嵌段聚合物的制备：①称取2.26g N-异丙基丙烯酰胺于100mL反应试管，加入8mL丙酮与2mL超纯水，搅拌使N-异丙基丙烯酰胺溶解，将整个反应试管置于装有液氮的1L的保温瓶中，使整个体系冻成固态，再抽真空，接着用高纯氩气填充溶融，氩气填充后加入20mg氯化亚铜和0.2mmol三(2-甲氨基乙基)胺，混匀，再次冷冻—抽真空—通氩气溶融两个循环，最后用进样针加入0.1mmol双[2-(2′-溴代异丁酰氧基)乙基]二硫化物，置于0℃低温恒温反应12h，得到聚N-异丙基丙烯酰胺；②用20mL的进样针加入0.02mol无氧的丙烯酸特丁酯，反应18h后将产物转移至洁净的烧杯中加水使产物析出，抽滤得到析出物，析出物再转移至透析袋中，用体积比为1:1的无水乙醇与水的混合溶剂透析24h，再用超纯水透析，冻干得到聚丙烯酸特丁酯-b-聚N-异丙基丙烯酰胺-b-聚丙烯酸特丁酯；③称取聚丙烯酸特丁酯-b-聚N-异丙基丙烯酰胺-b-聚丙烯酸特丁酯1g溶解于20mL二氯甲烷中，完全溶解后快速加入27mmol三氟乙酸，30℃下水解10h，再向反应液中加入乙醚沉淀，沉淀物用氯仿复溶，乙醚沉淀-氯仿复溶过程重复3次，离心去除上清液，60℃真空干燥后，得到聚丙烯酸-b-聚N-异丙基丙烯酰胺-b-聚丙烯酸三嵌段聚合物，以PNA100标记；

3)酸性温敏嵌段聚合物溶液的制备：称取20mg步骤2)所制备的PNA100，将其制备成浓度为2mg/mL水溶液，并用氢氧化钠调节至pH 8.0；

4)共组装：将步骤1)制备的0.5mL药物溶液加入到10mL步骤3)所制备的酸性温敏嵌段聚合物溶液中，在30℃下避光搅拌反应2h，得到负载多柔比星的温敏凝胶纳米粒溶液；

5)瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物：将步骤4)所制备的负载多柔比星的温敏凝胶纳米粒溶液冷冻干燥后得共组装纳米粒，以质量百分比浓度为10％分散于超纯水中，以D-PNA100标记。

实施例2

1)药物溶液的制备：称取长春瑞宾20mg，将其制备成浓度为10mg/mL的水溶液；

2)酸性温敏嵌段聚合物的制备：①称取2.26g N-异丙基丙烯酰胺于100mL反应试管，加入8mL丙酮与2mL超纯水，搅拌使N-异丙基丙烯酰胺溶解，将整个反应试管置于装有液氮的1L的保温瓶中，使整个体系冻成固态，再抽真空，接着用高纯氩气填充溶融，氩气填充后加入20mg氯化亚铜和0.2mmol三(2-甲氨基乙基)胺，混匀，再次冷冻-抽真空-通氩气溶融两个循环，最后用进样针加入0.1mmol双[2-(2′-溴代异丁酰氧基)乙基]二硫化物，置于0℃低温恒温反应12h，得到聚N-异丙基丙烯酰胺；②用20mL的进样针加入0.02mol无氧的丙烯酸特丁酯，反应18h后将产物转移至洁净的烧杯中加水使产物析出，抽滤得到析出物，析出物再转移至透析袋中，用体积比为1:1的无水乙醇与水的混合溶剂透析24h，再用超纯水透析，冻干得到聚丙烯酸特丁酯-b-聚N-异丙基丙烯酰胺-b-聚丙烯酸特丁酯；③称取聚丙烯酸特丁酯-b-聚N-异丙基丙烯酰胺-b-聚丙烯酸特丁酯1g溶解于20mL二氯甲烷中，完全溶解后快速加入27mmol三氟乙酸，30℃下水解10h，再向反应液中加入乙醚沉淀，沉淀物用氯仿复溶，乙醚沉淀-氯仿复溶过程重复3次，离心去除上清液，60℃真空干燥后，得到聚丙烯酸-b-聚N-异丙基丙烯酰胺-b-聚丙烯酸三嵌段聚合物，以PNA100标记；

3)酸性温敏嵌段聚合物溶液的制备：称取15mg步骤2)所制备的PNA100，将其制备成浓度为3mg/mL水溶液，并用氢氧化钠调节至pH 8.0；

4)共组装：将步骤1)制备的0.5mL药物溶液加入到5mL步骤3)所制备的酸性温敏嵌段聚合物溶液中，在40℃下避光搅拌反应12h，得到负载长春瑞宾的温敏凝胶纳米粒溶液；

5)瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物：将步骤4)所制备的负载长春瑞宾的温敏凝胶纳米粒溶液冷冻干燥后得共组装纳米粒，以质量百分比浓度为5％分散于超纯水中。

实施例3

1)药物溶液的制备：称取丝裂霉素30mg，将其制备成浓度为7.5mg/mL的水溶液；

2)酸性温敏嵌段聚合物的制备：①称取2.26g N-异丙基丙烯酰胺于100mL反应试管，加入8mL丙酮与2mL超纯水，搅拌使N-异丙基丙烯酰胺溶解，将整个反应试管置于装有液氮的1L的保温瓶中，使整个体系冻成固态，再抽真空，接着用高纯氩气填充溶融，氩气填充后加入20mg氯化亚铜和0.2mmol三(2-甲氨基乙基)胺，混匀，再次冷冻—抽真空—通氩气溶融两个循环，最后用进样针加入0.1mmol双[2-(2′-溴代异丁酰氧基)乙基]二硫化物，置于0℃低温恒温反应12h，得到聚N-异丙基丙烯酰胺；②聚N-异丙基丙烯酰胺干燥粉末0.25g溶于3mL甲基吡咯烷酮，高纯氩气保护下加入3mL浓度为0.3mmol/mL甲基丙烯酸-2-丙磺酸(MPSA)的二甲基亚砜溶液，混合后加入13mg溴化亚铜和41.5mg 1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺，80℃反应8h，反应液用甲醇稀释后，硅胶柱分离纯化，洗脱液旋蒸浓缩后40℃真空干燥，得到聚甲基丙烯酸-2-丙磺酸-聚N-异丙基丙烯酰胺-b-聚甲基丙烯酸-2-丙磺酸三嵌段聚合物，以PNM标记；

3)酸性温敏嵌段聚合物溶液的制备：称取30mg步骤2)所制备的PNM，将其制备成浓度为2mg/mL水溶液，并用氢氧化钠调节至pH 8.0；

4)共组装：将步骤1)制备的2mL药物溶液加入到15mL步骤3)所制备的酸性温敏嵌段聚合物溶液中，在10℃下避光搅拌反应24h，得到负载丝裂霉素的温敏凝胶纳米粒溶液；

5)瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物：将步骤4)所制备的负载丝裂霉素的温敏凝胶纳米粒溶液冷冻干燥后得共组装纳米粒，以质量百分比浓度为8％分散于超纯水中。

实施例4

1)药物溶液的制备：称取5-氟尿嘧啶10mg，将其制备成浓度为1mg/mL的水溶液；

2)酸性温敏嵌段聚合物的制备：①称取2.26g N-异丙基丙烯酰胺于100mL反应试管，加入8mL丙酮与2mL超纯水，搅拌使N-异丙基丙烯酰胺溶解，将整个反应试管置于装有液氮的1L的保温瓶中，使整个体系冻成固态，再抽真空，接着用高纯氩气填充溶融，氩气填充后加入20mg氯化亚铜和0.2mmol三(2-甲氨基乙基)胺，混匀，再次冷冻—抽真空—通氩气溶融两个循环，最后用进样针加入0.1mmol双[2-(2′-溴代异丁酰氧基)乙基]二硫化物，置于0℃低温恒温反应12h，得到聚N-异丙基丙烯酰胺；②聚N-异丙基丙烯酰胺干燥粉末0.25g溶于3mL甲基吡咯烷酮，高纯氩气保护下加入3mL浓度为0.3mmol/mL甲基丙烯酸-2-丙磺酸(MPSA)的二甲基亚砜溶液，混合后加入13mg溴化亚铜和41.5mg 1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺，80℃反应18h，反应液用甲醇稀释后，硅胶柱分离纯化，洗脱液旋蒸浓缩后40℃真空干燥，得到聚甲基丙烯酸-2-丙磺酸-聚N-异丙基丙烯酰胺-b-聚甲基丙烯酸-2-丙磺酸三嵌段聚合物，以PNM标记；

3)酸性温敏嵌段聚合物溶液的制备：称取30mg步骤2)所制备的PNM，将其制备成浓度为2.5mg/mL水溶液，并用氢氧化钠调节至pH 8.0；

4)共组装：将步骤1)制备的0.25mL药物溶液加入到10mL步骤3)所制备的酸性温敏嵌段聚合物溶液中，在60℃下避光搅拌反应0.5h，得到负载5-氟尿嘧啶的温敏凝胶纳米粒溶液；

5)瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物：将步骤4)所制备的负载5-氟尿嘧啶的温敏凝胶纳米粒溶液冷冻干燥后得共组装纳米粒，以质量百分比浓度为20％分散于超纯水中。

实施例5

1)药物溶液的制备：称取多柔比星10mg和表柔比星10mg，将多柔比星和表柔比星溶解于4mL超纯水中，制备成浓度为2.5mg/mL多柔比星和2.5mg/mL表柔比星的混合水溶液；

2)酸性温敏嵌段聚合物的制备：①在橡皮塞密封的脱气干燥斯托克斯管中加入13mg溴化亚铜和28.3mg 2,2'-联吡啶，高纯氩气保护下，用脱气的注射器经橡皮塞迅速加入93mg三乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯和2.4mL乙醇，最后用微量注射器加入15.1mg引发剂2-溴丙酸乙酯，60℃反应3h，反应液用四氢呋喃稀释后过活化氧化铝柱除去催化剂溴化亚铜，室温下真空干燥得到大分子引发剂聚寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯；②聚寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯干燥粉末0.25g溶于3mL甲基吡咯烷酮，高纯氩气保护下加入3mL浓度为0.3mmol/mL 4-苯乙烯磺酸钠(SSA)的二甲基亚砜溶液，混合再迅速加入13mg溴化亚铜和41.5mg 1，1，4，7，10，10-六甲基三亚乙基四胺，110℃反应24h，反应液过活性氧化铝柱除去催化剂溴化亚铜，洗脱液甲醇沉淀，沉淀物室温真空干燥，得到聚4-苯乙烯磺酸钠-b-聚寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯两嵌段聚合物，以PMS标记；

3)酸性温敏嵌段聚合物溶液的制备：称取20mg步骤2)所制备的PMS，将其制备成浓度为1mg/mL水溶液，并用氢氧化钠调节至pH 8.0；

4)共组装：将步骤1)制备的0.5mL药物溶液加入到10mL步骤3)所制备的酸性温敏嵌段聚合物溶液中，在0℃下避光搅拌反应6h，得到负载多柔比星和表柔比星的温敏凝胶纳米粒溶液；

5)瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物：将步骤4)所制备的负载多柔比星和表柔比星的温敏凝胶纳米粒溶液冷冻干燥后得共组装纳米粒，以质量百分比浓度为30％分散于超纯水中。

实施例6

1)药物溶液的制备：称取多柔比星20mg，将其制备成浓度为4mg/mL的水溶液；

2)酸性温敏嵌段聚合物的制备：①在橡皮塞密封的脱气干燥斯托克斯管中加入13mg溴化亚铜和28.3mg 2，2'-联吡啶，高纯氩气保护下，用脱气的注射器经橡皮塞迅速加入93mg三乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯和2.4mL乙醇，最后用微量注射器加入15.1mg引发剂2-溴丙酸乙酯，60℃反应3h，反应液用四氢呋喃稀释后过活化氧化铝柱除去催化剂溴化亚铜，室温下真空干燥得到大分子引发剂聚寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯；②聚寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯干燥粉末0.25g溶于3mL甲基吡咯烷酮，高纯氩气保护下加入3mL浓度为0.3mmol/mL 4-苯乙烯磺酸钠(SSA)的二甲基亚砜溶液，混合再迅速加入13mg溴化亚铜和41.5mg 1,1,4,7，10，10-六甲基三亚乙基四胺，110℃反应24h，反应液过活性氧化铝柱除去催化剂溴化亚铜，洗脱液甲醇沉淀，沉淀物室温真空干燥，得到聚4-苯乙烯磺酸钠-b-聚寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯两嵌段聚合物，以PMS标记；

3)酸性温敏嵌段聚合物溶液的制备：称取10mg步骤2)所制备的PMS，将其制备成浓度为1mg/mL水溶液，并用氢氧化钠调节至pH 8.0；

4)共组装：将步骤1)制备的1mL药物溶液加入到5mL步骤3)所制备的酸性温敏嵌段聚合物溶液中，在35℃下避光搅拌反应18h，得到负载多柔比星的温敏凝胶纳米粒溶液；

5)瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物：将步骤4)所制备的负载多柔比星的温敏凝胶纳米粒溶液冷冻干燥后得共组装纳米粒，以质量百分比浓度为20％分散于超纯水中。

二、实验例部分

实验例1瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物平均粒径、载药量和包封率测定

动态光散射：将本发明制备的共组装纳米粒用超纯水稀释至0.5mg/mL，平行三个样品。然后置于激光粒度仪上测定流体动力学直径和流体动力学直径分布，其中激光粒度仪参数为He-Ne激光(波长＝633nm)，4mW，角度为90°。

载药量和包封率测定：载药量和包封率通过测定透析袋外液中的药物含量，采用荧光分光光度计或紫外分光光度计按照下面的公式进行测定与计算：

这里，W₀是药物的投料量，C_f和V_f分别是载药后透析袋外液中药物的质量体积浓度和体积。C_p和V_p分别是透析袋内液中酸性温敏嵌段聚合物药物载体的质量体积浓度和体积，DL(Drug Loading)表示载药量，EE(Entrapment Efficiency)表示包封率。

本发明实施例1～6制备的瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物平均粒径、载药量和包封率结果见表1。

表1瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物检测结果

实施例	载药量(％)	包封率(％)	平均粒径(nm)
				实施例1	5	大于98％	150
实施例2	33	大于91％	250
				实施例3	50	大于95％	140
实施例4	1	大于90％	300
				实施例5	25	大于97％	100
实施例6	80	大于98％	155

由表1可知，本发明实施例1～6制备的瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物平均粒径为100～300nm，粒径均一；本发明实施例1～6制备的瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物可在1～80％之间根据需要调整，载药量最高可达80％，作为药物储库实现长效释放；本发明所制备的瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物包封率不低于90％。

实验例2瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物的温敏溶胶-凝胶相变行为

本发明实施例1～6所制备的注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物的温敏溶胶-凝胶相变行为采用高级旋转流变仪(Kinexus ultra+，马尔文公司，英国)进行测定。仪器参数为：平板转子(PP50，直径50mm)；间隙：0.5mm；温度范围：20～50℃，应力：0.05Pa；升温速率：1℃/min；频率：1.0Hz。

本发明实施例1～6所制备的瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物25℃复数模量、40℃复数模量和40℃复数模量/25℃复数模量的比值见表2。

表2实施例1～6瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物复数模量结果

由表2可知，在25℃时，实施例1～6都具有较小的模量，基本维持在0.35Pa左右，而在40℃时，其模量有指数级的增加，达到700～1200Pa。正是利用这种特性，瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物在室温下具有低的粘度与弹性，宏观上呈液态，便于瘤内注射，一旦注射到瘤内，在生理温度下弹性模量急剧增加，变成不能流动的凝胶态，在瘤内形成一个药物“仓库”，能够不断的往外释放药物，起到长效治疗的作用。

实验例3瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物的体外长期释药行为的评价

用微量注射器取实施例1制备的瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物D-PNA100100μL加入到释放池的底部(直径×高：2cm×2cm)，加热到37℃使之凝胶化。采用蠕动泵从储备瓶中不断抽取新鲜配制的磷酸缓冲溶液，将其作为药物洗脱液流经瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物凝胶表面，流速为10mL/h。药物洗脱液用接收瓶收集，每12h更换一次接收瓶。采用荧光分光光度计测定接收瓶中阿霉素的含量，按照以下公式计算累计释放率(AR，％)：

C_i和V_i分别为第i个接收瓶中洗脱液的阿霉素含量及体积。

瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物分别在pH5.0、6.8、7.4洗脱液中的体外累计释放量，结果见表3。

表3 D-PNA100在不同pH洗脱液中的体外累计释放率(％)

由表3可知，瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物具有缓释的特性，可连续释放十天以上，这种缓释特性满足瘤内注射治疗方式的需求，因为高浓度的瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物中含有大量的抗癌药物，缓释的特性不仅使得瘤内药物浓度始终维持在治疗水平之上，并且大大减小了对正常组织的损伤。此外高浓度的瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物释放行为具有酸度依赖性，在微酸性肿瘤组织环境中，利于药物的释放，这与实验结果相符。

实验例4瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物D-PNA100对于H22荷瘤Balb/C小鼠皮下移植瘤的抑制效果

将H22肿瘤细胞悬浮液(2.0×10⁷个细胞/100μL生理盐水)接种到Balb/C雄性小鼠(22±2g)的右背。当肿瘤生长到约150～200mm³(直径约7mm)时，将H22荷瘤Balb/C小鼠随机分为四组，每组五只，分别行生理盐水(saline)、PNA100溶液、游离DOX溶液和D-PNA100组合物的单次瘤内注射。注射体积为70μL，游离DOX溶液和D-PNA100组的阿霉素给药量为17.5mg/kg体重。给药后观察14天，每天按照公式：体积＝瘤长×(瘤宽)²/2，测定瘤体积，14天后，处死小鼠，取出瘤块，拍照并称重并测量体积，结果见表4。

表4四组H22荷瘤Balb/C小鼠肿瘤平均重量与平均体积结果

	saline	PNA100溶液	游离DOX溶液	D-PNA100
					14天后瘤块平均体积(cm<sup>3</sup>)	0.477	0.348	0.201	0.120
14天后瘤块平均重量(g)	0.183	0.104	0.08	0.04

由表4可知，在单次给药14天后，D-PNA100实验组的瘤体积为0.12cm³，仅为游离Dox组的60％，生理盐水组的25％，具有显著的抑瘤效果，处死老鼠后，解剖称重肿瘤组织，瘤重数据与瘤体积数据相符，显示为最佳的治疗效果。

实验例5瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物D-PNA100瘤内滞留效果

在H22荷瘤Balb/C小鼠上分别进行游离DOX溶液和D-PNA100瘤内注射后，分别在处理1h、1天、3天、5天、7天和10天处死小鼠，取出肿瘤组织，0.2g肿瘤组织加0.5mL超纯水进行匀浆，然后加2倍体积的甲醇/浓盐酸(体积比为94/6)混合液，涡旋15分钟，离心(10000rpm×10min)，取上清液用荧光分光光度计(Hitachi F-4500，日立公司，日本)测定阿霉素浓度。瘤内注射游离DOX溶液和D-PNA100后不同时间点的瘤内阿霉素滞留量见表5。

表5 H22荷瘤Balb/C小鼠瘤内注射游离DOX溶液和D-PNA100后瘤内阿霉素滞留量

	1h	1day	3day	5day	7day	10day
							游离DOX溶液(％)	59.2	41.6	32.0	33.0	25.9	21.4
D-PNA100(％)	87.4	71.9	48.5	47.3	44.4	43.4

在H22荷瘤Balb/C小鼠上分别进行游离DOX溶液和D-PNA100瘤内注射后，分别在处理1h、1天、3天、5天、7天和10天处死小鼠，取出肿瘤组织，采用IVIS Lumina XR小动物荧光成像系统(Caliper生命科学，美国)进行离体荧光拍照，激发光和发射光波长分别为485nm和554nm，测定肿瘤组织阿霉素荧光强度。瘤内注射游离DOX溶液和D-PNA100后不同时间点的瘤内阿霉素荧光强度见表6。图3是H22荷瘤Balb/C小鼠瘤内注射游离阿霉素溶液(DOX)和D-PNA100后瘤内阿霉素荧光强度图。

表6 H22荷瘤Balb/C小鼠瘤内注射游离DOX溶液和D-PNA100后瘤内阿霉素荧光强度

	1h	1day	3day	7day	10day
						游离DOX溶液	5.5×10<sup>8</sup>	6.5×10<sup>8</sup>	7.0×10<sup>8</sup>	6.1×10<sup>8</sup>	6.5×10<sup>8</sup>
D-PNA100	5.6×10<sup>8</sup>	1.04×10<sup>9</sup>	8.0×10<sup>8</sup>	1.25×10<sup>9</sup>	1.24×10<sup>9</sup>

荧光强度的单位为p/sec/cm²/sr/mW/cm²

由表5可知，H22荷瘤Balb/C小鼠瘤内注射游离DOX溶液和D-PNA100后，研究不同时间点瘤内阿霉素滞留量。结果表明，注射1小时后，D-PNA100实验组还保留着初始88％的滞留量，而游离DOX组却不到60％；注射10天后，D-PNA100实验组瘤内药物含量为初始注射的43.4％，远大于游离阿霉素组的21.4％，因此，D-PNA100较游离DOX具有更好的瘤内滞留行为。

药物瘤内滞留量也可以通过测定瘤内阿霉素的荧光来半定量，由表6可知，在注射后1小时(即第0天)，D-PNA100实验组只有很微弱的荧光，而随着时间的延长，D-PNA100实验组瘤内荧光逐渐增强，这是由于在刚注射初期，阿霉素存在于凝胶态中，还没有释放与渗透，随着时间的延长，阿霉素逐渐释放并渗透出来，在小动物成像上显示为较高的荧光强度，而游离DOX组在实验前几天就具有快速的释放，显示为较强的荧光，而后期荧光强度降低，显示为较弱的滞留特性。

实验例7瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物D-PNA100生物相容性评价

A)采用MTT法评价D-PNA100的细胞毒性：将HepG2细胞(5×10³个细胞/孔)种于96孔板，孵育过夜，加入不同浓度的D-PNA100、PNA100聚合物、游离DOX溶液。然后加入磷酸缓冲溶液和MTT，37℃孵育4h后，每孔加入150μL的DMSO后，用酶标仪(1420multilabel，PE公司，美国)测定其光密度(OD)值，细胞存活率按照下面公式进行计算：

OD_s，OD_b和OD_n分别是样品(Samples)、空白对照(Blank control)和阴性对照(Negative control)的光密度值。不同浓度D-PNA100和游离DOX溶液48h时的MTT细胞存活率数据见表7。

表7不同浓度D-PNA100和游离DOX溶液48h时的MTT细胞存活率数据

	0.1μg/mL	1.0μg/mL	5.0μg/mL	10μg/mL
					游离DOX溶液	90.6％	46.9％	18.7％	20.4％
D-PNA100	90.5％	55.7％	18.7％	27.0％

B)采用H22荷瘤Balb/C小鼠存活期与小鼠体重变化进行D-PNA100的生物相容性评价，H22荷瘤Balb/C小鼠用D-PNA100，游离DOX溶液分别行瘤内注射，单次给药剂量为17.5mg阿霉素/kg，H22荷瘤Balb/C小鼠存活期与小鼠体重变化见表8。

表8 H22荷瘤Balb/C小鼠存活期与小鼠体重变化表

由表7可知，细胞杀伤效果与药物浓度相关，随着药物浓度的升高，细胞杀伤效果越来越好，但是到5μg/mL时，杀伤效果到达一个顶值；此外数据显示，D-PNA100与游离阿霉素具有相近的细胞杀伤效果，表明酸性温敏嵌段聚合物与阿霉素形成的纳米粒并没有减小抗癌药物阿霉素的抗癌活性。

由表8可知，从生存期可知，在整个实验阶段D-PNA100实验组H22荷瘤Balb/C小鼠全部存活，而游离阿霉素组到第9天开始出现死亡，到第12天仅剩1只H22荷瘤Balb/C小鼠存活；从体重数据可知，在给药初期，两个实验组的H22荷瘤Balb/C小鼠体重都有所下降，游离阿霉素组的老鼠体重一直在初始体重的90％以下，而D-PNA100实验组老鼠体重从第8天逐渐上升，到第14天已接近原始体重，因此相较于游离阿霉素，D-PNA100具有良好的生物相容性。

Claims

1.一种瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物，其特征在于：所述瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物由碱性抗肿瘤药物键合酸性温敏嵌段聚合物后以质量百分比浓度5～30％分散于超纯水，所述超纯水是指在25℃时电阻率≥15兆欧·厘米的水；

所述酸性温敏嵌段聚合物包括由酸性嵌段A和温敏嵌段B组成的AB两嵌段或ABA三嵌段，且，所述酸性温敏嵌段聚合物在制备时利用引发剂双[2-(2′-溴代异丁酰氧基)乙基]二硫化物做引导，所述酸性嵌段A为侧链带有羧酸根、硫酸根、磺酸根或磷酸根的聚合物嵌段，所述温敏嵌段B为侧链带有温度敏感基团的聚合物嵌段。

2.根据权利要求1所述的瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物，其特征在于：所述酸性嵌段A为丙烯酸、丙烯酸特丁酯-co-丙烯酸、4-苯乙烯磺酸钠、甲基丙烯酸-2-丙磺酸、甲基丙烯酸β-硫酸乙酯、甲基丙烯酸β-磷酸乙酯中的一种，所述酸性温敏嵌段聚合物中酸性嵌段A的数均分子量为1000～40000Da。

3.根据权利要求1所述的瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物，其特征在于：所述温敏嵌段B为N-异丙基丙烯酰胺、N，N-二乙基丙烯酰胺、寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯、寡聚乙二醇乙醚甲基丙烯酸酯、N-乙烯基己内酰胺、N-乙烯基吡咯烷酮、N-二甲胺乙基甲基丙烯酸酯、N-(1-羟甲基)丙基甲基丙烯酰胺、N-(2，2-二甲基-1，3-二氧戊环)甲基丙烯酰胺、N-乙烯基异丁酰胺、N-乙烯基正丁酰胺中的一种，所述酸性温敏嵌段聚合物中温敏嵌段B的数均分子量5000～80000Da。

4.根据权利要求1所述的瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物，其特征在于：所述酸性温敏嵌段聚合物为聚丙烯酸-b-聚N-异丙基丙烯酰胺-b-聚丙烯酸、聚4-苯乙烯磺酸钠-b-聚寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸-2-丙磺酸-聚N-异丙基丙烯酰胺-b-聚甲基丙烯酸-2-丙磺酸之中的一种。

5.根据权利要求1所述的瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物，其特征在于：所述酸性温敏嵌段聚合物酸性嵌段A的摩尔含量为1～50％。

6.根据权利要求1所述的瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物，其特征在于：所述碱性抗肿瘤药物为多柔比星、柔红霉素、表柔比星、吡柔比星、长春瑞宾、吉西他滨、安西他滨、羟基脲、丝裂霉素、博莱霉素A5、培洛霉素、米托蒽醌、伊立替康、10-羟基喜树碱、长春新碱、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶中的一种或多种。

7.根据权利要求1所述的瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物，其特征在于：所述碱性抗肿瘤药物与酸性温敏嵌段聚合物质量比为0.01～0.8:1。

8.一种瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

2)酸性温敏嵌段聚合物的制备：酸性嵌段A和温敏嵌段B制备成AB两嵌段酸性温敏嵌段聚合物或ABA三嵌段酸性温敏嵌段聚合，所述酸性温敏嵌段聚合物在制备时利用引发剂双[2-(2′-溴代异丁酰氧基)乙基]二硫化物做引导；

3)酸性温敏嵌段聚合物溶液的制备：取步骤2)所制备的酸性温敏嵌段聚合物，将其制备成浓度为1～3mg/mL水溶液，并用氢氧化钠调节至pH8.0；

9.根据权利要求1～7任一所述的瘤内注射用原位温敏聚合物凝胶纳米组合物在制备用于肝癌、皮肤癌、肾癌或肺癌瘤内的注射物中的应用。