CN103080313A - 缀合物、粒子、组合物以及相关方法 - Google Patents

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Abstract

用于递送核酸试剂的粒子和缀合物。含有所述粒子、所述缀合物或两者的组合物。使用所述粒子、所述缀合物以及所述组合物的方法。

Description

缀合物、粒子、组合物以及相关方法
优先权要求
本申请要求于2010年8月20日提交的U.S.S.N.61/375,783、于2010年9月29日提交的U.S.S.N.61/387,882、于2011年2月17日提交的U.S.S.N.61/443,972以及于2011年4月15日提交的U.S.S.N.61/475,923的优先权，其中所述各案的内容以引用的方式并入本文。
发明背景
为了提供核酸试剂的最佳使用和有效性，需要将所述核酸试剂有效递送至治疗靶点。粒子递送系统可以增加核酸试剂的功效或耐受性。
发明概述
本文描述可以用于例如递送核酸试剂的粒子。通常，粒子包括核酸试剂和阳离子部分、疏水部分(如聚合物)或亲水-疏水聚合物中的至少一种。在一些实施方案中，粒子包括核酸试剂和阳离子部分，以及疏水部分(如聚合物)或亲水-疏水聚合物中的至少一种。在一些实施方案中，粒子包括核酸试剂、阳离子部分以及疏水部分(如聚合物)和亲水-疏水聚合物两者。在其它实施方案中，粒子包括核酸试剂、阳离子部分以及存在i)疏水部分(如聚合物)或ii)亲水-疏水聚合物中的任一者，并且当一者存在时，另一者大致上不存在，或两者中的一者以少于另一者的5重量％、2重量％或1重量％存在，例如，如由粒子中的量所确定或如由用于制备粒子的材料的量所确定。在一个实施方案中，疏水部分(例如，疏水聚合物)、亲水-疏水聚合物、阳离子部分或核酸试剂中的一个或多个可以连接至另一个部分，例如，本文上文或别处所述的另一个部分。例如，在一个实施方案中，阳离子部分和/或核酸试剂可以连接至疏水部分(例如，疏水聚合物)和/或亲水-疏水聚合物。粒子还可以包括其它组分如表面活性剂或亲水聚合物(例如，亲水聚合物如PEG，所述亲水聚合物可以进一步连接至脂质)。本文还描述缀合物(如核酸试剂-聚合物缀合物)、混合物、组合物以及含有粒子或缀合物的剂型、使用粒子的方法(例如，用于治疗病症)、包括核酸试剂-聚合物缀合物和粒子的试剂盒、制备核酸试剂-聚合物缀合物和粒子的方法、储存粒子的方法以及分析粒子的方法。
本文公开的粒子提供核酸试剂(例如，siRNA)或促进RNAi的试剂的递送。
因此，一方面，本公开的特点在于一种粒子，其包含：
a)多个疏水部分，例如，疏水聚合物；
b)多个亲水-疏水聚合物；
c)任选地，多个阳离子部分；以及
d)多个核酸试剂，其中多个核酸试剂中的至少一部分是
(i)共价连接至以下中的任一者：
a)的疏水部分，例如，疏水聚合物或
b)的亲水-疏水聚合物，或
(ii)与共价连接至a)的疏水部分(例如，疏水聚合物)或b)的亲水-疏水聚合物中任一者的核酸形成双链体(例如，异源双链体)。
在一些实施方案中，粒子包含阳离子部分。
在一个实施方案中，粒子是纳米粒子。
在一些实施方案中，疏水部分是疏水聚合物。在一些实施方案中，疏水部分不是聚合物。
在一些实施方案中，a)的疏水部分(例如，疏水聚合物)中的至少一部分未共价连接至核酸试剂。在一些实施方案中，a)的疏水聚合物中的至少一部分未共价连接至阳离子部分。
在一些实施方案中，大致上c)的所有阳离子部分都未共价连接至疏水部分(例如，疏水聚合物)并且没有共价连接至b)的聚合物。
在一些实施方案中，多个疏水聚合物中的至少一部分没有共价连接至c)的阳离子部分或d)的核酸试剂中的一者或两者。
在一些实施方案中，a)的疏水部分(例如，疏水聚合物)中的至少一部分各自共价连接至d)的核酸试剂。
在一些实施方案中，a)的疏水部分(例如，疏水聚合物)中的至少一部分各自共价连接至d)的单一核酸试剂。在一些实施方案中，a)的疏水聚合物中的至少一部分各自共价连接至d)的多个核酸试剂。
在一些实施方案中，a)的疏水部分(例如，疏水聚合物)中的至少一部分各自直接共价连接(例如，不存在来自插入间隔基部分的原子)至d)的核酸试剂(例如，在疏水聚合物的羧基端或羟基端)。
在一些实施方案中，d)的核酸试剂中的至少一部分经由连接基共价连接至疏水聚合物。示例性连接基包括以下连接基：包含使用点击化学(例如，如WO2006/115547中所描述)形成的键的连接基和包含酰胺、酯、二硫化物、硫化物、缩酮、琥珀酸酯、肟、氨基甲酸酯、碳酸酯、硅烷基醚或三唑的连接基(例如，酰胺、酯、二硫化物、硫化物、缩酮、琥珀酸酯或三唑)。在一些实施方案中，连接基包含官能团，如可在生理条件下裂解的键。在一些实施方案中，连接基包括多个官能团，如在生理条件下可裂解的键。在一些实施方案中，连接基包括并非在连接基的末端直接连接至通过连接基连接的第一或第二部分，而是在连接基的内部的官能团，如本文描述的键或官能团。在一些实施方案中，连接基可在生理条件下水解、连接基可在生理条件下酶促裂解或连接基包含可在生理条件下还原的二硫化物。在一些实施方案中，连接基在生理条件下不裂解，例如，连接基具有使得核酸试剂不需要裂解即具有活性的足够长度，例如，连接基的长度是至少约20埃(例如，至少约24埃)。
在一些实施方案中，核酸试剂与连接至疏水聚合物的核酸形成双链体。例如，核酸试剂(例如，siRNA或促进RNAi的试剂)可以与连接至疏水聚合物的DNA形成双链体(例如，异源双链体)。
在一些实施方案中，a)的疏水部分(例如，疏水聚合物)中的至少一部分通过核酸试剂的3’和/或5’位置各自共价连接至d)的核酸试剂。在一些实施方案中，a)的疏水部分(例如，疏水聚合物)中的至少一部分通过核酸试剂的2’位置各自共价连接至d)的核酸试剂。
在一些实施方案中，b)的亲水-疏水聚合物中的至少一部分各自共价连接至d)的核酸试剂(例如，在疏水聚合物的羧基端或羟基端或在亲水聚合物的末端)。在一些实施方案中，b)的亲水-疏水聚合物中的至少一部分各自共价连接至d)的单一核酸试剂。在一些实施方案中，b)的亲水-疏水聚合物中的至少一部分各自共价连接至d)的多个核酸试剂。
在一些实施方案中，b)的亲水-疏水聚合物中的至少一部分各自直接共价连接(例如，不存在来自插入间隔基部分的原子)至d)的核酸试剂(例如，在疏水聚合物的羧基端或羟基端或在亲水聚合物的末端)。在一些实施方案中，核酸试剂中的至少一部分经由连接基各自共价连接至亲水-疏水聚合物。
示例性连接基包括以下连接基：包含使用点击化学(例如，如WO2006/115547中所描述)形成的键的连接基和包含酰胺、酯、二硫化物、硫化物、缩酮、琥珀酸酯、肟、氨基甲酸酯、碳酸酯、硅烷基醚或三唑的连接基(例如，酰胺、酯、二硫化物、硫化物、缩酮、琥珀酸酯或三唑)。在一些实施方案中，连接基包含官能团，如可在生理条件下裂解的键。在一些实施方案中，连接基包含多个官能团，如可在生理条件下裂解的键。在一些实施方案中，连接基包含并非在连接基的末端直接连接至通过连接基连接的第一或第二部分，而是在连接基的内部的官能团，如本文描述的键或官能团。在一些实施方案中，连接基可在生理条件下水解、连接基可在生理条件下酶促裂解或连接基包含可在生理条件下还原的二硫化物。在一些实施方案中，连接基在生理条件下不裂解，例如，连接基具有使得核酸试剂不需要裂解即具有活性的足够长度，例如，连接基的长度是至少约20埃(例如，至少约24埃)。
在一些实施方案中，核酸试剂与连接至疏水聚合物的核酸形成双链体。例如，核酸试剂(例如，RNAi)可以与连接至疏水部分(例如，疏水聚合物)的DNA形成双链体(例如，异源双链体)。在一些实施方案中，核酸试剂与连接至亲水-疏水聚合物的核酸形成双链体。例如，核酸试剂(例如，RNAi)可以与连接至疏水部分(例如，疏水聚合物)的DNA形成双链体(例如，异源双链体)。
在一些实施方案中，b)的多个亲水-疏水聚合物中的至少一部分通过核酸试剂的3’和/或5’位置各自共价连接至核酸试剂。在一些实施方案中，b)的多个亲水-疏水聚合物中的至少一部分通过核酸试剂的2’位置各自共价连接至核酸试剂。
在一些实施方案中，a)的疏水部分(例如，疏水聚合物)中的至少一部分各自共价连接至c)的阳离子部分，例如，a)的多个疏水部分(例如，疏水聚合物)中的至少一部分各自直接共价连接(例如，不存在来自插入间隔基部分的原子)至c)的阳离子部分。在一些实施方案中，a)的多个疏水部分(例如，疏水聚合物)中的至少一部分通过酰胺、酯、硫醚或醚(例如，在疏水聚合物的羧基端)各自共价连接至c)的阳离子部分。
在一些实施方案中，a)的多个疏水部分(例如，疏水聚合物)中的至少一部分在疏水聚合物的末端各自共价连接至c)的阳离子部分。在一些实施方案中，c)的单一阳离子部分共价连接至a)的单一疏水聚合物(例如，在疏水聚合物的末端)。在一些实施方案中，a)的单一疏水聚合物共价连接至c)的多个阳离子部分。
在一些实施方案中，c)的多个阳离子部分中的至少一部分各自连接至a)的疏水聚合物的主链。
在一些实施方案中，a)的多个疏水部分(例如，疏水聚合物)中的至少一部分各自共价连接至c)的阳离子部分，并且a)的多个疏水部分(例如，疏水聚合物)中的至少一部分各自连接至d)的核酸试剂。
在一些实施方案中，粒子包含c)的阳离子部分，并且进一步包含多个额外阳离子部分，其中额外阳离子部分与c)的阳离子部分不同。额外阳离子部分可以是例如阳离子聚合物(例如，PEI、阳离子PVA、聚(组氨酸)、聚(赖氨酸)或聚(甲基丙烯酸(2-二甲氨基)乙酯)。在一些实施方案中，多个额外阳离子部分中的至少一部分各自连接至a)的多个疏水部分(例如疏水聚合物)和/或b)的多个亲水-疏水聚合物中的至少一部分。在一些实施方案中，多个额外阳离子部分中的至少一部分连接至a)的多个疏水部分(例如疏水聚合物)中的至少一部分。
在一些实施方案中，粒子进一步包含多个额外核酸试剂，其中额外核酸试剂例如在核酸试剂的结构(例如，序列、长度、悬突的长度)或衍生化(例如，糖或碱基的修饰)上与d)的多个核酸试剂不同。在一些实施方案中，多个额外核酸试剂中的至少一部分连接至a)的多个疏水部分(例如疏水聚合物)和/或b)的多个亲水-疏水聚合物中的至少一部分。在一些实施方案中，多个额外核酸试剂中的至少一部分连接至a)的多个疏水部分(例如，疏水聚合物)中的至少一部分。
本文公开的粒子提供核酸试剂(例如，促进RNAi的试剂如siRNA)的递送，其中核酸试剂连接至疏水聚合物，或与连接至疏水聚合物的核酸形成双链体。
因此，另一方面，本公开的特点在于一种粒子，其包含：
a)多个核酸试剂-聚合物缀合物，每个所述缀合物包含核酸试剂，所述核酸试剂
(i)连接至疏水聚合物或
(ii)与共价连接至疏水聚合物的核酸形成双链体(例如，异源双链体)；
b)多个亲水-疏水聚合物；以及
c)任选地，多个阳离子部分。
在一些实施方案中，粒子包含阳离子部分。
在一个实施方案中，粒子是纳米粒子。
在一些实施方案中，粒子进一步包含疏水聚合物，例如，其中疏水聚合物未连接至核酸如核酸试剂。在一些实施方案中，粒子包含c)的多个阳离子部分，所述阳离子部分中的至少一部分各自共价连接至疏水聚合物(例如，未连接至核酸(如核酸试剂)的疏水聚合物)。示例性阳离子部分-疏水聚合物缀合物包括N1-PLGA-N5，N10，N14-四甲基化精胺。
在一些实施方案中，粒子包含c)的多个阳离子部分，并且b)的多个亲水-疏水聚合物中的至少一部分各自共价连接至c)的阳离子部分。在一些实施方案中，c)的多个阳离子部分中的至少一部分各自共价连接至b)的亲水-疏水聚合物的疏水部分(例如，通过本文描述的连接基，如酰胺、酯或醚)。在一些实施方案中，c)的多个阳离子部分中的至少一部分各自共价连接至b)的亲水-疏水聚合物的亲水部分。
在一些实施方案中，核酸试剂经由连接基共价连接至疏水聚合物。示例性连接基包括以下连接基：包含使用点击化学(例如，如WO2006/115547中所描述)形成的键的连接基和包含酰胺、酯、二硫化物、硫化物、缩酮、琥珀酸酯、肟、氨基甲酸酯、碳酸酯、硅烷基醚或三唑的连接基(例如，酰胺、酯、二硫化物、硫化物、缩酮、琥珀酸酯或三唑)。在一些实施方案中，连接基包含官能团，如可在生理条件下裂解的键。在一些实施方案中，连接基包含多个官能团，如可在生理条件下裂解的键。在一些实施方案中，连接基包含并非在连接基的末端直接连接至通过连接基连接的第一或第二部分，而是在连接基的内部的官能团，如本文所述的键或官能团。在一些实施方案中，连接基可在生理条件下水解、连接基可在生理条件下酶促裂解或连接基包含可在生理条件下还原的二硫化物。在一些实施方案中，连接基在生理条件下不裂解，例如，连接基具有使得核酸试剂不需要裂解即具有活性的足够长度，例如，连接基的长度是至少约20埃(例如，至少约24埃)。
在一些实施方案中，核酸试剂与连接至疏水聚合物的核酸形成双链体。例如，核酸试剂(例如，siRNA或促进RNAi的试剂)可以与连接至疏水聚合物的核酸(例如和RNA或DNA)形成双链体(例如，同源或异源双链体)。
在一些实施方案中，粒子包含c)的阳离子部分，并且进一步包含多个额外阳离子部分，其中额外阳离子部分例如在分子量、粘度、电荷或结构上与c)的多个阳离子部分不同。在一些实施方案中，多个额外阳离子部分中的至少一部分连接至疏水聚合物和/或b)的亲水-疏水聚合物中的至少一部分。在一些实施方案中，多个额外阳离子部分中的至少一部分连接至疏水聚合物。
在一些实施方案中，粒子进一步包含多个额外核酸试剂，其中额外核酸试剂例如在核酸试剂的结构(例如，序列、长度、悬突的长度)或衍生化(例如，糖或碱基的修饰)上与a)的多个核酸试剂不同。在一些实施方案中，多个额外核酸试剂中的至少一部分连接至疏水聚合物和/或b)的多个亲水-疏水聚合物中的至少一部分。在一些实施方案中，多个额外核酸试剂中的至少一部分连接至疏水聚合物。
本发明的粒子提供核酸试剂(例如，siRNA或促进RNAi的试剂)与亲水-疏水聚合物的连接。还包括疏水部分和阳离子部分，例如，如以下所描述。
因此，另一方面，本发明的特点在于一种粒子，其包含：
a)多个疏水部分，例如，疏水聚合物；
b)多个核酸试剂-亲水-疏水聚合物缀合物，其中所述多个的每个核酸试剂-亲水-疏水聚合物缀合物的核酸试剂
(i)共价连接至亲水-疏水聚合物或
(ii)与共价连接至亲水-疏水聚合物的核酸形成双链体(例如，异源双链体)；以及
c)任选地，多个阳离子部分。
在一些实施方案中，粒子包含多个阳离子部分。
在一个实施方案中，粒子是纳米粒子。
在一些实施方案中，粒子还包括多个亲水-疏水聚合物，其中亲水-疏水聚合物未共价连接至核酸如核酸试剂。
在一些实施方案中，粒子包含c)的多个阳离子部分，并且c)的多个阳离子部分中的至少一部分共价连接至亲水-疏水聚合物，例如，c)的阳离子部分共价连接至未连接至核酸试剂的亲水-疏水聚合物。
在一些实施方案中，粒子包含c)的多个阳离子部分，并且多个亲水-疏水聚合物中的至少一部分通过亲水-疏水聚合物的疏水部分(例如，通过酰胺、酯或醚)共价连接至c)的阳离子部分。在一些实施方案中，a)的多个疏水聚合物中的至少一部分共价连接至c)的阳离子部分(例如，通过酰胺、酯或醚)。在一些实施方案中，b)的缀合物的疏水-亲水聚合物经由连接基共价连接至核酸试剂。示例性连接基包括以下连接基：包含使用点击化学(例如，如WO2006/115547中所描述)形成的键的连接基和包含酰胺、酯、二硫化物、硫化物、缩酮、琥珀酸酯、肟、氨基甲酸酯、碳酸酯、硅烷基醚或三唑的连接基(例如，酰胺、酯、二硫化物、硫化物、缩酮、琥珀酸酯或三唑)。在一些实施方案中，连接基包含官能团，如可在生理条件下裂解的键。在一些实施方案中，连接基包含多个官能团，如可在生理条件下裂解的键。在一些实施方案中，连接基包含并非在连接基的末端直接连接至通过连接基连接的第一或第二部分，而是在连接基的内部的官能团，如本文所述的键或官能团。在一些实施方案中，连接基可在生理条件下水解、连接基可在生理条件下酶促裂解或连接基包含可在生理条件下还原的二硫化物。在一些实施方案中，连接基在生理条件下不裂解，例如，连接基具有使得核酸试剂不需要裂解即具有活性的足够长度，例如，连接基的长度是至少约20埃(例如，至少约24埃)。
在一些实施方案中，粒子包含c)的阳离子部分，并且进一步包含多个额外阳离子部分，其中额外阳离子部分例如在分子量、粘度、电荷或结构上与c)的阳离子部分不同。在一些实施方案中，多个额外阳离子部分中的至少一部分各自连接至a)的多个疏水聚合物和/或多个亲水-疏水聚合物中的至少一部分。在一些实施方案中，多个额外阳离子部分中的至少一部分连接至a)的多个疏水聚合物中的至少一部分。
在一些实施方案中，粒子进一步包含多个额外核酸试剂，其中额外核酸试剂例如在核酸试剂的结构(例如，序列、长度、悬突的长度)或衍生化(例如，糖或碱基的修饰)上与b)的多个核酸试剂不同。在一些实施方案中，多个额外核酸试剂中的至少一部分连接至a)的多个疏水聚合物和/或多个亲水-疏水聚合物中的至少一部分。在一些实施方案中，多个额外核酸试剂中的至少一部分连接至a)的多个疏水聚合物中的至少一部分。
在一些实施方案中，核酸试剂与连接至a)的多个疏水聚合物中的至少一部分的核酸形成双链体。例如，核酸试剂(例如，siRNA或促进RNAi的试剂)可以与连接至疏水聚合物的核酸(例如，RNA或DNA)形成双链体(例如，同源或异源双链体)。
如本文所描述，本发明的粒子提供核酸试剂(例如，siRNA或促进RNAi的试剂)在包含连接至聚合物的阳离子部分的粒子中的递送。
因此，另一方面，本发明的特点在于一种粒子，其包含：
a)多个疏水部分，例如，疏水聚合物；
b)多个亲水-疏水聚合物；
c)多个阳离子部分，其中多个阳离子部分中的至少一部分连接至a)的疏水聚合物或b)的亲水-疏水聚合物；以及
d)多个核酸试剂。
在一些实施方案中，a)的多个疏水部分(例如，聚合物)中的至少一部分未共价连接至c)的阳离子部分。在一些实施方案中，a)的多个疏水聚合物中的至少一部分未共价连接至d)的核酸试剂。
在一个实施方案中，粒子是纳米粒子。
在一些实施方案中，大致上d)的所有多个核酸试剂未共价连接至聚合物(例如，a)或b)的聚合物)。在一些实施方案中，a)的多个疏水聚合物中的至少一部分未共价连接至c)的阳离子部分或d)的核酸试剂。
在一些实施方案中，核酸试剂共价连接至亲水聚合物，如PEG聚合物。在一些实施方案中，PEG连接至脂质和或在末端被甲基修饰。
在一些实施方案中，a)的多个疏水聚合物中的至少一部分各自共价连接至c)的阳离子部分，例如，多个疏水聚合物共价连接至四甲基化精胺(例如，N1-PLGA-N5，N10，N14四甲基化精胺)。在一些实施方案中，a)的多个疏水聚合物中的至少一部分通过酰胺、酯或醚(例如，在疏水聚合物的羧基端)各自共价连接至c)的阳离子部分。在一些实施方案中，a)的多个疏水聚合物中的至少一部分在疏水聚合物的末端各自共价连接至c)的阳离子部分。在一些实施方案中，c)的多个阳离子部分中的至少一部分直接共价连接(例如，不存在来自插入间隔基部分的原子)至a)的疏水聚合物(例如，在疏水聚合物的羧基端或羟基端)。在一些实施方案中，c)的多个阳离子部分中的至少一部分经由连接基共价连接至a)的疏水聚合物(例如，在疏水聚合物的羧基端或羟基端)。在一些实施方案中，连接基包含使用点击化学(例如，如WO2006/115547中所描述)形成的键。在一些实施方案中，连接基包含酰胺、酯、二硫化物、硫化物(即，硫醚键)、缩酮、琥珀酸酯、肟、碳酸酯、氨基甲酸酯、硅烷基醚或三唑。在一些实施方案中，c)的单一阳离子部分共价连接至a)的单一疏水聚合物(例如，在疏水聚合物的末端)。在一些实施方案中，c)的多个阳离子部分中的至少一部分经由酰胺、酯、硫醚或醚键通过疏水部分共价连接至b)的亲水-疏水聚合物。在一些实施方案中，a)的单一疏水聚合物共价连接至c)的多个阳离子部分。在一些实施方案中，c)的多个阳离子部分中的至少一部分连接至a)的疏水聚合物中的至少一部分的主链。
在一些实施方案中，b)的多个亲水-疏水聚合物中的至少一部分共价连接至c)的阳离子部分。在一些实施方案中，c)的多个阳离子部分中的至少一部分直接共价连接(例如，不存在来自插入间隔基部分的原子)至b)的亲水-疏水聚合物(例如，在疏水聚合物的羧基端或羟基端)。在一些实施方案中，c)的多个阳离子部分中的至少一部分经由连接基共价连接至a)的亲水-疏水聚合物(例如，在疏水聚合物的羧基端或羟基端)。在一些实施方案中，连接基包含使用点击化学(例如，如WO2006/115547中所描述)形成的键。在一些实施方案中，连接基包含酰胺、酯、二硫化物、硫化物、缩酮、琥珀酸酯、肟、碳酸酯、氨基甲酸酯、硅烷基醚或三唑。在一些实施方案中，c)的单一阳离子部分共价连接至b)的单一亲水-疏水聚合物(例如，在亲水-疏水聚合物的末端)。在一些实施方案中，c)的多个阳离子部分中的至少一部分通过疏水部分共价连接至b)的亲水-疏水聚合物。在一些实施方案中，c)的多个阳离子部分中的至少一部分通过疏水部分共价连接至b)的亲水-疏水聚合物。在一些实施方案中，c)的多个阳离子部分中的至少一部分经由酰胺、酯或醚键通过疏水部分共价连接至b)的亲水-疏水聚合物。在一些实施方案中，b)的单一亲水-疏水聚合物共价连接至c)的多个阳离子部分。在一些实施方案中，c)的多个阳离子部分中的至少一部分连接至b)的亲水-疏水聚合物中的至少一部分的主链。
在一些实施方案中，a)的多个疏水聚合物中的至少一部分共价连接至d)的核酸试剂。在一些实施方案中，a)的疏水聚合物中的至少一部分共价连接至d)的单一核酸试剂。在一些实施方案中，a)的疏水聚合物中的至少一部分共价连接至d)的多个核酸试剂。在一些实施方案中，d)的核酸试剂直接共价连接(例如，不存在来自插入间隔基部分的原子)至a)的疏水聚合物(例如，在亲水-疏水聚合物的羟基端)。在一些实施方案中，核酸试剂经由连接基共价连接至a)的疏水聚合物(例如，在亲水-疏水聚合物的羟基端)。示例性连接基包括以下连接基：包含使用点击化学(例如，如WO2006/115547中所描述)形成的键的连接基和包含酰胺、酯、二硫化物、硫化物、缩酮、琥珀酸酯、肟、氨基甲酸酯、碳酸酯、硅烷基醚或三唑的连接基(例如，酰胺、酯、二硫化物、硫化物、缩酮、琥珀酸酯或三唑)。在一些实施方案中，连接基包含官能团，如可在生理条件下裂解的键。在一些实施方案中，连接基包含多个官能团，如可在生理条件下裂解的键。在一些实施方案中，连接基包含并非在连接基的末端直接连接至通过连接基连接的第一或第二部分，而是在连接基的内部的官能团，如本文所述的键或官能团。在一些实施方案中，连接基可在生理条件下水解、连接基可在生理条件下酶促裂解或连接基包含可在生理条件下还原的二硫化物。在一些实施方案中，连接基在生理条件下不裂解，例如，连接基具有使得核酸试剂不需要裂解即具有活性的足够长度，例如，连接基的长度是至少约20埃(例如，至少约24埃)。
在一些实施方案中，a)的疏水聚合物中的至少一部分通过核酸试剂的3’和/或5’位置共价连接至d)的核酸试剂。在一些实施方案中，a)的疏水聚合物中的至少一部分通过核酸试剂的2’位置共价连接至d)的核酸试剂。
在一些实施方案中，核酸试剂与连接至a)的多个疏水聚合物中的至少一部分的核酸形成双链体。例如，核酸试剂(例如，siRNA或促进RNAi的试剂)可以与连接至疏水聚合物的核酸(例如，RNA或DNA)形成双链体(例如，同源或异源双链体)。
在一些实施方案中，b)的亲水-疏水聚合物中的至少一部分共价连接至d)的核酸试剂。在一些实施方案中，b)的亲水-疏水聚合物中的至少一部分各自共价连接至d)的单一核酸试剂。在一些实施方案中，b)的亲水-疏水聚合物中的至少一部分各自共价连接至d)的多个核酸试剂。在一些实施方案中，d)的核酸试剂中的至少一部分直接共价连接(例如，不存在来自插入间隔基部分的原子)至b)的亲水-疏水聚合物(例如，在亲水-疏水聚合物的羟基端)。在一些实施方案中，d)的核酸试剂中的至少一部分经由连接基各自共价连接至b)的亲水-疏水聚合物(例如，在亲水-疏水聚合物的羟基端)。示例性连接基包括以下连接基：包含使用点击化学(例如，如WO2006/115547中所描述)形成的键的连接基和包含酰胺、酯、二硫化物、硫化物、缩酮、琥珀酸酯、肟、氨基甲酸酯、碳酸酯、硅烷基醚或三唑的连接基(例如，酰胺、酯、二硫化物、硫化物、缩酮、琥珀酸酯或三唑)。在一些实施方案中，连接基包含官能团，如可在生理条件下裂解的键。在一些实施方案中，连接基包含多个官能团，如可在生理条件下裂解的键。在一些实施方案中，连接基包含并非在连接基的末端直接连接至通过连接基连接的第一或第二部分，而是在连接基的内部的官能团，如本文所述的键或官能团。在一些实施方案中，连接基可在生理条件下水解、连接基可在生理条件下酶促裂解或连接基包含可在生理条件下还原的二硫化物。在一些实施方案中，连接基在生理条件下不裂解，例如，连接基具有使得核酸试剂不需要裂解即具有活性的足够长度，例如，连接基的长度是至少约20埃(例如，至少约24埃)。
在一些实施方案中，b)的亲水-疏水聚合物中的至少一部分通过核酸试剂的3’和/或5’位置各自共价连接至d)的核酸试剂。在一些实施方案中，b)的亲水-疏水聚合物中的至少一部分通过核酸试剂的2’位置共价连接至d)的核酸试剂。
在一些实施方案中，a)的疏水聚合物中的至少一部分共价连接至c)的阳离子部分，并且a)的疏水聚合物中的至少一部分连接至d)的核酸试剂。
在一些实施方案中，粒子进一步包含多个额外阳离子部分，其中额外阳离子部分例如在分子量、粘度、电荷或结构上与c)的阳离子部分不同。在一些实施方案中，多个额外阳离子部分中的至少一部分连接至a)的疏水聚合物和/或b)的亲水-疏水聚合物中的至少一部分。在一些实施方案中，多个额外阳离子部分中的至少一部分连接至a)的疏水聚合物中的至少一部分。
在一些实施方案中，粒子进一步包含多个额外核酸试剂，其中额外核酸试剂例如在核酸试剂的结构(例如，序列、长度、悬突的长度)或衍生化(例如，糖或碱基的修饰)上与d)的核酸试剂不同。在一些实施方案中，多个额外核酸试剂中的至少一部分连接至a)的疏水聚合物和/或b)的亲水-疏水聚合物中的至少一部分。在一些实施方案中，多个额外核酸试剂中的至少一部分连接至a)的疏水聚合物中的至少一部分。
本发明的粒子提供核酸试剂(例如，siRNA或促进RNAi的试剂)的递送，其中核酸试剂共价连接至亲水聚合物，或与共价连接至亲水聚合物的核酸形成双链体。
因此，另一方面，本发明的特点在于一种粒子，其包含：
a)多个疏水部分(例如，疏水聚合物)；
b)任选地多个亲水-疏水聚合物；
c)多个阳离子部分；以及
d)多个核酸试剂，其中多个核酸试剂中的至少一部分共价连接至疏水聚合物或与共价连接至亲水聚合物的核酸形成双链体(例如，异源双链体)。
在一个实施方案中，粒子是纳米粒子。
在一些实施方案中，核酸试剂共价连接至亲水聚合物(例如，包含PEG)。在一些实施方案中，PEG具有约2kDa的分子量。在一些实施方案中，聚合物(例如，亲水聚合物)共价连接至脂质(例如，1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[PDP(聚乙二醇)-2k])。示例性脂质在本文描述，如DSPE。在一些实施方案中，聚合物是共价连接至脂质的PEG，例如，共价连接至1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[PDP(聚乙二醇)-2kDa]的PEG。
在一个实施方案中，粒子大致上不含疏水-亲水聚合物。在一个实施方案中，疏水-亲水聚合物(如果存在)的量小于粒子中或用作制备粒子的起始材料的组分(例如，聚合物)的5重量％、2重量％或1重量％。
在一些实施方案中，疏水部分是疏水聚合物，如PLGA。在一些实施方案中，亲水-疏水聚合物是PEG-PLGA聚合物。
本发明的粒子提供核酸试剂(例如，siRNA或促进RNAi的试剂)的递送，其中核酸试剂未连接(例如，共价连接)至疏水部分(如聚合物)或亲水-疏水聚合物并且不与连接(例如，共价连接)至疏水部分(如聚合物)或亲水-疏水聚合物的核酸形成双链体。在替代方案中，在一些粒子中，粒子中或用作制备粒子的起始材料的核酸试剂的小于5重量％、2重量％或1重量％连接至此类聚合物。
因此，另一方面，本发明的特点在于一种粒子，其包含：
a)多个疏水部分(例如，疏水聚合物)；
b)多个亲水-疏水聚合物；以及
c)多个核酸试剂-阳离子聚合物缀合物。
在一个实施方案中，粒子是纳米粒子。
在一个实施方案中，核酸试剂未连接(例如，共价连接)至疏水聚合物或亲水-疏水聚合物。在一个实施方案中，粒子中或用作制备粒子的起始材料的核酸试剂的小于5重量％、2重量％或1重量％连接至疏水聚合物或亲水-疏水聚合物。
在一些实施方案中，阳离子聚合物是PVA，例如，核酸试剂-阳离子聚合物缀合物是siRNA-阳离子PVA缀合物。在一些实施方案中，疏水部分是疏水聚合物如PLGA。在一些实施方案中，亲水-疏水聚合物是PEG-PLGA聚合物。
本发明的粒子提供核酸试剂(例如，siRNA或促进RNAi的试剂)的递送，其中核酸试剂和阳离子聚合物两者都未连接(例如，共价连接)至疏水聚合物或亲水-疏水聚合物或其中，独立地，粒子中或用作制备粒子的起始材料的核酸试剂和阳离子部分的小于5重量％、2重量％或1重量％连接至此类聚合物。因此粒子的核酸试剂和阳离子部分(例如，大致上粒子的所有核酸试剂和阳离子部分)包埋于粒子中，而不是共价连接至聚合物组分。
因此，另一方面，本发明的特点在于一种粒子，其包含：
a)多个疏水部分(例如，疏水聚合物)；
b)多个亲水-疏水聚合物；
c)任选地，多个阳离子部分；以及
d)多个核酸试剂；
其中c)的阳离子部分的大部分和d)的核酸试剂的大部分未共价连接至疏水聚合物或亲水-疏水聚合物。例如，核酸试剂或阳离子部分包埋于粒子中。
在一些实施方案中，粒子包含多个阳离子部分。
在一个实施方案中，粒子是纳米粒子。
在一个实施方案中，独立地，粒子中或用作制备粒子的起始材料的核酸试剂的小于5重量％、2重量％或1重量％连接至此类聚合物并且，粒子中或用作制备粒子的起始材料的阳离子部分的小于5重量％、2重量％或1重量％连接至此类聚合物。
在一些实施方案中，阳离子部分是阳离子聚合物。示例性阳离子聚合物包括阳离子PVA(如本文描述的阳离子PVA)或精胺，包括修饰的精胺(例如，四甲基化精胺)。核酸试剂可以与阳离子部分(如本文所描述的阳离子聚合物)形成复合物。与阳离子部分复合的核酸试剂可以包埋于粒子中。在一些实施方案中，阳离子部分的电荷与核酸试剂的主链的电荷的比率是约2∶1至约1∶1(例如，约1.5∶1至约1∶1)。
在一些实施方案中，疏水部分是疏水聚合物如PLGA。在一些实施方案中，亲水-疏水聚合物是PEG-PLGA聚合物。
本文描述的粒子可以具有一种或多种以下性质。在一个实施方案中，a)的疏水聚合物中的至少一部分具有羧基末端。在一个实施方案中，末端如羧基末端被修饰(例如，用反应性基团，包括本文描述的反应性基团)。在一个实施方案中，a)的疏水聚合物中的至少一部分具有羟基末端。在一个实施方案中，羟基末端被修饰(例如，用反应性基团)。在一个实施方案中，具有羟基末端的a)的疏水聚合物中的至少一部分的羟基末端被封端(例如，用酰基部分封端)。在一个实施方案中，a)的疏水聚合物中的至少一部分具有羧基末端和羟基末端。在一个实施方案中，a)的疏水聚合物中的至少一部分包含乳酸和/或乙醇酸的单体。在一个实施方案中，a)的疏水聚合物中的至少一部分包含PLA或PGA。在一个实施方案中，a)的疏水聚合物中的至少一部分包含乳酸和乙醇酸的共聚物(即，PLGA)。在一个实施方案中，聚合物多分散性指数小于约2.5(例如，小于约1.5)。在一个实施方案中，a)的疏水聚合物的一部分包含乳酸与乙醇酸的比率是约25∶75至约75∶25的PLGA。在一个实施方案中，a)的疏水聚合物的一部分包含乳酸与乙醇酸的比率是约50∶50的PLGA。在一个实施方案中，a)的疏水聚合物具有约4kDa至约66kDa的Mw，例如约4kDa至约12kDa，约8kDa至约12kDa。在一个实施方案中，a)的疏水聚合物具有约4kDa至约12kDa(例如，约4kDa至约8kDa)的重量平均分子量。在一个实施方案中，a)的疏水聚合物包含粒子的或用作制备粒子的起始材料的约35重量％至约90重量％(例如，约35重量％至约80重量％)。在一个实施方案中，a)的疏水聚合物中的至少一部分各自共价连接至单一阳离子部分并且a)的疏水聚合物的一部分连接至多个阳离子部分。在一个实施方案中，a)的疏水聚合物中的至少一部分各自共价连接至单一核酸试剂并且a)的疏水聚合物的一部分连接至多个核酸试剂。
本文描述的粒子的其它性质包括以下。在一些实施方案中，b)的亲水-疏水聚合物是嵌段共聚物。在一些实施方案中，b)的亲水-疏水聚合物是二嵌段共聚物。在一些实施方案中，b)的亲水-疏水聚合物中的至少一部分的疏水部分具有羟基末端。在一些实施方案中，具有羟基末端的b)的亲水-疏水聚合物中的至少一部分的疏水部分的羟基末端被封端(例如，用酰基部分封端)。在一些实施方案中，具有羟基末端的b)的亲水-疏水聚合物中的至少一部分的疏水部分的羟基末端被酰基部分封端。
本文描述的粒子的其它性质包括以下。在一些实施方案中，b)的亲水-疏水聚合物中的至少一部分的疏水部分包含乳酸和乙醇酸的共聚物(即，PLGA)。在一些实施方案中，b)的亲水-疏水聚合物中的至少一部分的疏水部分包含乳酸与乙醇酸的比率是约25∶75至约75∶25的PLGA。在一些实施方案中，b)的亲水-疏水聚合物中的至少一部分的疏水部分包含酸与乙醇酸的比率是约50∶50的PLGA。
本文描述的粒子的其它性质包括以下。在一些实施方案中，b)的亲水-疏水聚合物中的至少一部分的疏水部分具有约4kDa至约20kDa(例如，约4kDa至约12kDa、约6kDa至约20kDa或约8kDa至约15kDa)的重量平均分子量。在一些实施方案中，b)的亲水-疏水聚合物中的至少一部分的亲水部分具有约1kDa至约8kDa(例如，约2kDa至约6kDa)的重量平均分子量。在一些实施方案中，b)的多个亲水-疏水聚合物中的至少一部分是粒子的或用作制备粒子的起始材料的约2重量％至约30重量％(例如，约4重量％至约25重量％)。在一些实施方案中，b)的亲水-疏水聚合物的亲水部分中的至少一部分包含PEG、聚噁唑啉、聚乙烯吡咯烷、聚羟丙基甲基丙烯酰胺或聚唾液酸(例如，PEG)。在一些实施方案中，b)的亲水-疏水聚合物的亲水部分中的至少一部分终止于甲氧基。在一些实施方案中，b)的亲水-疏水聚合物中的至少一部分各自共价连接至单一阳离子部分并且b)的亲水-疏水聚合物的一部分连接至多个阳离子部分。在一些实施方案中，b)的亲水-疏水聚合物中的至少一部分各自共价连接至单一核酸试剂并且b)的亲水-疏水聚合物的一部分连接至多个核酸试剂。
本文描述的粒子的其它性质包括以下。在一些实施方案中，c)的阳离子部分中的至少一部分包含至少一个胺(例如，伯胺、仲胺、叔胺或季胺)。在一些实施方案中，c)的阳离子部分中的至少一部分包含多个胺(例如，伯胺、仲胺、叔胺或季胺)。在一些实施方案中，阳离子部分中的至少一个胺是仲胺或叔胺。在一些实施方案中，c)的阳离子部分中的至少一部分包含聚合物，例如，聚乙烯亚胺或聚赖氨酸。聚合阳离子部分具有多个分子量(例如，范围为约500Da至约5000Da，例如，约1kDa至约2kDa或约2.5kDa)。在一些实施方案中，c)的阳离子部分中的至少一部分包含阳离子PVA(例如，如由Kuraray所提供，如CM-318或C-506)。其它示例性阳离子部分包括聚氨基酸、聚(组氨酸)以及聚甲基丙烯酸(2-二甲氨基)乙酯。在一些实施方案中，阳离子部分具有5或更大的pKa。在一些实施方案中，胺在酸性pH下带正电荷。在一些实施方案中，胺在生理pH下带正电荷。在一些实施方案中，c)的阳离子部分中的至少一部分选自由硫酸鱼精蛋白、海美溴铵(hexademethrine bromide)、十六烷基三甲基溴化铵、精胺(例如，四甲基化精胺)以及亚精胺。在一些实施方案中，c)的阳离子部分中的至少一部分选自由四烷基铵部分、三烷基铵部分、咪唑鎓部分、芳基铵部分、亚胺阳离子部分、脒阳离子部分、胍阳离子部分、噻唑鎓部分、吡唑鎓部分、吡嗪阳离子部分、吡啶阳离子部分以及鏻部分组成的组。在一些实施方案中，c)的阳离子部分中的至少一部分是阳离子脂质。在一些实施方案中，c)的阳离子部分中的至少一部分缀合至非聚合物疏水部分(例如，胆固醇或维生素E TPGS)。在一些实施方案中，c)的多个阳离子部分是粒子的或用作制备粒子的起始材料的约0.1重量％至约60重量％，例如，粒子的约1重量％至约60重量％。在一些实施方案中，多个阳离子部分的电荷与来自多个核酸试剂的电荷的比率是约1∶1至约50∶1(例如，1∶1至约10∶1或1∶1至5∶1、约1.5∶1或约1∶1)。在阳离子部分是含氮部分的实施方案中，这一比率可以被称为N/P比。
本文描述的粒子的其它性质包括以下。在一些实施方案中，核酸试剂中的至少一部分是DNA试剂。在一些实施方案中，核酸试剂中的至少一部分是RNA试剂(例如，siRNA或微RNA或促进RNAi的试剂)。在一些实施方案中，核酸试剂中的至少一部分选自由siRNA、反义寡核苷酸、微RNA(miRNA)、shRNA、miRNA拮抗剂(antagomirs)、适体、基因组DNA、cDNA、mRNA以及质粒组成的组。在一些实施方案中，多个核酸试剂中的至少一部分经过化学修饰(例如，包括一个或多个主链修饰、碱基修饰和或对于糖的修饰)以便增加核酸试剂的稳定性。在一些实施方案中，多个核酸试剂是粒子的或用作制备粒子的起始材料的约1重量％至约50重量％(例如，约1％至约20％、约2％至约15％、约3％至约12％)。
本文描述的粒子的其它性质包括以下。在一些实施方案中，粒子还包括表面活性剂。在一些实施方案中，表面活性剂是聚合物如PVA。在一些实施方案中，PVA具有约2cP至约27cP的粘度。在一些实施方案中，表面活性剂是粒子的或用作制备粒子的起始材料的约0重量％至约40重量％(例如，约15重量％至约35重量％)。在一些实施方案中，粒子的直径小于约200nm(例如，约200nm至约20nm、约150nm至约50nm、或小于约150nm)。在一些实施方案中，粒子的表面大致上涂有PEG、PVA、聚噁唑啉、聚乙烯吡咯烷、聚羟丙基甲基丙烯酰胺或聚唾液酸(例如，PEG)。在一些实施方案中，粒子包含靶向剂。在一些实施方案中，粒子的表面大致上不含核酸试剂。
本文描述的粒子的其它性质包括以下。在一些实施方案中，d)的多个核酸试剂是大致上完整的。在一些实施方案中，粒子的ζ电位是约-20mV至约50mV(例如，约-20mV至约20mV、约-10mV至约10mV或中性)。在一些实施方案中，粒子在以下条件下是化学上稳定的，所述条件包括23摄氏度的温度和60％百分比湿度持续至少一天(例如，至少7天、至少14天、至少21天、至少30天)。在一些实施方案中，粒子是冻干粒子。在一些实施方案中，粒子被配制成药物组合物。在一些实施方案中，粒子的表面大致上不含靶向剂。
在一些实施方案中，本文描述的粒子可以递送有效量的核酸试剂以使得受试者体内的靶基因的表达在将粒子施用至受试者之后大约72小时、96小时、120小时、144小时、168小时、192小时、216小时、240小时、264小时减少至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在一个实施方案中，本文描述的粒子可以递送有效量的核酸试剂以使得受试者体内的靶基因的表达在将粒子施用至受试者之后大约120小时减少至少50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。在一些实施方案中，将施用了本文描述的粒子或组合物的受试者体内的靶基因表达的水平与当核酸试剂以不同于粒子或缀合物(即，不以粒子的形式，例如，未包埋于粒子中或缀合至聚合物，例如，本文描述的粒子)的制剂施用时观察到的靶基因的表达的水平或与在不存在施用核酸试剂或其它治疗剂的情况下观察到的靶基因的表达的水平进行比较。
在一些实施方案中，粒子包括疏水聚合物，例如，其中核酸试剂连接至a)的疏水聚合物并且其中疏水聚合物或核酸试剂-疏水聚合物缀合物具有一种或多种以下性质：
i)连接至核酸试剂的疏水聚合物可以是由多于一种单体亚单位构成的均聚物或聚合物；
ii)连接至核酸试剂的疏水聚合物具有约4kDa至约20kDa的重量平均分子量；
iii)疏水聚合物是由第一类型和第二类型的单体亚单位构成，并且连接至试剂的疏水聚合物中的第一类型单体亚单位与第二类型单体亚单位的比率是约25∶75至约75∶25，例如，约50∶50；
iv)疏水聚合物是PLGA；
v)核酸试剂是粒子的约1重量％至约20重量％；
vi)多个核酸试剂-疏水聚合物缀合物是粒子的约10重量％。
在一些实施方案中，连接至核酸试剂的疏水聚合物具有约4kDa至约12kDa的重量平均分子量，例如，约6kDa至约12kDa或约8kDa至约12kDa。
在一些实施方案中，b)的亲水-疏水聚合物具有一种或多种以下性质：
i)疏水部分具有约1kDa至约6kDa的重量平均分子量(例如，约2kDa至约6kDa)，
ii)疏水聚合物具有约4kDa至约15kDa的重量平均分子量；
iii)多个亲水-疏水聚合物是粒子的约25重量％；
iv)亲水聚合物是PEG；
v)疏水聚合物是由第一类型和第二类型的单体亚单位构成，并且连接至试剂的疏水聚合物中的第一类型单体亚单位与第二类型单体亚单位的比率是约25∶75至约75∶25，例如，约50∶50；以及
vi)疏水聚合物是PLGA。
在一些实施方案中，如果亲水部分的重量平均分子量是约1kDa至约3kDa(例如，约2kDa)，则亲水部分的重量平均分子量与疏水部分的重量平均分子量的比率是在1∶3至1∶7之间，并且如果亲水部分的重量平均分子量是约4kDa至约6kDa(例如，约5kDa)，则亲水部分的重量平均分子量与疏水部分的重量平均分子量的比率是在1∶1至1∶4之间。
在一些实施方案中，亲水部分具有约2kDa至约6kDa的重量平均分子量并且疏水部分具有约8kDa至约13kDa的重量平均分子量。在一些实施方案中，亲水-疏水聚合物的亲水部分终止于甲氧基。
在一些实施方案中，核酸试剂连接至疏水聚合物并且其中核酸试剂-疏水聚合物缀合物具有一种或多种以下性质：
i)连接至核酸试剂的疏水聚合物可以是由多于一种单体单位构成的均聚物或聚合物；
ii)连接至核酸试剂的疏水聚合物具有约4kDa至约15kDa的重量平均分子量；
iii)疏水聚合物是由第一类型和第二类型的单体亚单位构成，并且连接至试剂的疏水聚合物中的第一类型单体亚单位与第二类型单体亚单位的比率是约25∶75至约75∶25，例如，约50∶50；
iv)疏水聚合物是PLGA；
v)阳离子部分与核酸试剂的电荷比率是约1∶1至约4∶1；
vi)多个核酸试剂-疏水聚合物缀合物是粒子的约10重量％。在一些实施方案中，粒子还包括表面活性剂(例如PVA)。
另一方面，本发明的特点在于一种组合物，其包含本文描述的多个粒子。在一些实施方案中，组合物是药物组合物。
在一些实施方案中，组合物中的粒子的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或全部具有小于约200nm的直径。在一些实施方案中，粒子具有小于200nm的Dv90(例如，约200nm至约20nm、约150nm至约50nm、或小于约150nm)。
在一些实施方案中，组合物大致上不含分子量小于约1kDa(例如，小于约500Da)的聚合物。在一些实施方案中，组合物大致上不含游离核酸试剂(即，未包埋于粒子中或连接至粒子的核酸试剂)。在一些实施方案中，粒子进一步包含靶向剂。在一些实施方案中，组合物大致上不含阳离子部分(即，未包埋于粒子中或连接至粒子中的组分的阳离子部分)。
在一些实施方案中，组合物在以下条件下是化学上稳定的，所述条件包括23摄氏度的温度和60％百分比湿度持续至少一天(例如，至少7天、至少14天、至少21天、至少30天)。在一些实施方案中，组合物是冻干组合物。
在一些实施方案中，粒子被配制成药物组合物。
另一方面，本发明的特点在于一种试剂盒，其包含本文描述的多个粒子或本文描述的组合物。
另一方面，本发明的特点在于一种单一剂量单位，其包含本文描述的多个粒子或本文描述的组合物。
另一方面，本发明的特点在于一种治疗患有病症的受试者的方法，其包括将有效量的本文描述的粒子或本文描述的组合物施用至受试者，由此治疗受试者。
在一个实施方案中，病症是增生性病症，例如，缓慢生长的增生性病症。在一个实施方案中，增生性病症是癌症，例如，本文描述的癌症。在一个实施方案中，癌症是缓慢生长的癌症，例如，实体肿瘤或白血病。例如，缓慢生长的癌症可以是I期或II期实体肿瘤。示例性癌症包括但不限于膀胱癌(包括加速和转移性膀胱癌)、乳腺癌(例如，雌激素受体阳性乳腺癌；雌激素受体阴性乳腺癌；HER-2阳性乳腺癌；HER-2阴性乳腺癌；孕酮受体阳性乳腺癌；孕酮受体阴性乳腺癌；雌激素受体阴性、HER-2阴性以及孕酮受体阴性乳腺癌(即，三阴性乳腺癌)；炎症性乳腺癌)、结肠癌(包括结肠直肠癌)、肾癌、肝癌、肺癌(包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌、肺腺癌以及鳞状细胞癌)、泌尿生殖道(例如卵巢)癌(包括输卵管和腹膜癌)、宫颈癌、前列腺和睾丸癌、淋巴系统癌、直肠癌、喉癌、胰腺癌(包括外分泌性胰腺癌)、食道癌、胃癌、胆囊癌、甲状腺癌、皮肤癌(包括鳞状细胞癌)、脑癌(包括多形性成胶质细胞瘤)以及头颈部癌。优选的癌症包括乳腺癌(例如，转移性或局部晚期乳腺癌)、前列腺癌(例如，激素难治性前列腺癌)、肾细胞癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺腺癌以及鳞状细胞癌，例如，晚期非小细胞肺癌、晚期小细胞肺癌、晚期肺腺癌以及晚期鳞状细胞癌)、胰腺癌、胃癌(例如，转移性胃腺癌)、结肠直肠癌、直肠癌、头颈部鳞状细胞癌、淋巴瘤(何杰金氏淋巴瘤或非何杰金氏淋巴瘤)、肾细胞癌、尿道上皮癌、软组织肉瘤、神经胶质瘤、黑色素瘤(例如，晚期或转移性黑色素瘤)、生殖细胞肿瘤、卵巢癌(例如，晚期卵巢癌(例如，晚期输卵管或腹膜癌))以及胃肠癌。
另一方面，本发明的特点在于一种减少受试者(例如，患有可以通过减少靶基因的表达来治疗的病症的受试者)体内的靶基因表达的方法。所述方法包括施用有效量的本文描述的粒子或本文描述的组合物，其中通过粒子递送的核酸试剂在施用粒子之后大约72小时、96小时、120小时、144小时、168小时、192小时、216小时、240小时、264小时使受试者体内的靶基因的表达减少至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在一个实施方案中，通过粒子递送的核酸试剂在施用粒子之后大约120小时使受试者体内的靶基因的表达减少至少50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。在一些实施方案中，将施用了本文描述的粒子或组合物的受试者体内的靶基因表达的水平与当核酸试剂以不同于粒子或缀合物(即，不以粒子的形式，例如，未包埋于粒子中或缀合至聚合物，例如，本文描述的粒子)的制剂施用时观察到的靶基因的表达的水平或与在不存在施用核酸试剂或其它治疗剂的情况下观察到的靶基因的表达的水平进行比较。
另一方面，本发明的特点在于一种核酸试剂-疏水聚合物缀合物，其包含共价连接至疏水聚合物的核酸试剂或与共价连接至疏水聚合物的核酸形成双链体(例如，异源双链体)的核酸试剂。
在一些实施方案中，核酸试剂经由核酸试剂的2’、3’和/或5’末端共价连接至疏水聚合物。在一些实施方案中，核酸试剂在聚合物的末端共价连接至疏水聚合物。在一些实施方案中，核酸试剂在疏水聚合物的主链上共价连接至聚合物。在一些实施方案中，单一核酸试剂共价连接至单一疏水聚合物。在一些实施方案中，多个核酸试剂各自共价连接至单一疏水聚合物。
在一些实施方案中，核酸试剂直接共价连接(例如，不存在来自插入间隔基部分的原子)至疏水疏水聚合物(例如，经由酯)。在一些实施方案中，核酸试剂经由连接基共价连接至疏水聚合物。示例性连接基包括以下连接基：包含使用点击化学(例如，如WO2006/115547中所描述)形成的键的连接基和包含酰胺、酯、二硫化物、硫化物、缩酮、琥珀酸酯、肟、氨基甲酸酯、碳酸酯、硅烷基醚或三唑的连接基(例如，酰胺、酯、二硫化物、硫化物、缩酮、琥珀酸酯或三唑)。在一些实施方案中，连接基包含官能团，如可在生理条件下裂解的键。在一些实施方案中，连接基包含多个官能团，如可在生理条件下裂解的键。在一些实施方案中，连接基包含并非在连接基的末端直接连接至通过连接基连接的第一或第二部分，而是在连接基的内部的官能团，如本文所述的键或官能团。在一些实施方案中，连接基可在生理条件下水解、连接基可在生理条件下酶促裂解或连接基包含可在生理条件下还原的二硫化物。在一些实施方案中，连接基在生理条件下不裂解，例如，连接基具有使得核酸试剂不需要裂解即具有活性的足够长度，例如，连接基的长度是至少约20埃(例如，至少约24埃)。
在一些实施方案中，疏水聚合物具有末端羟基部分。在一些实施方案中，疏水聚合物的末端羟基部分被封端(例如，用酰基部分)。
在一些实施方案中，疏水聚合物具有一种或多种以下性质：
i)连接至核酸试剂的疏水聚合物是由多于一种单体亚单位构成的均聚物或聚合物；
ii)连接至核酸试剂的疏水聚合物具有约4kDa至约15kDa的重量平均分子量(例如，约4kDa至约12kDa、约6kDa至约12kDa或约8kDa至约12kDa)；
iii)疏水聚合物是由第一类型和第二类型的单体亚单位构成，并且连接至试剂的疏水聚合物中的第一类型单体亚单位与第二类型单体亚单位的比率是约25∶75至约75∶25，例如，约50∶50；以及
iv)疏水聚合物是PLGA。
在一个实施方案中，核酸试剂是RNA、DNA或RNA与DNA的混合聚合物。在一个实施方案中，RNA是mRNA或siRNA。在一个实施方案中，DNA是cDNA或基因组DNA。在一个实施方案中，核酸试剂是单链并且在另一个实施方案中它包含两条链。在一个实施方案中，核酸试剂可以具有由一个或两个分子的链构成的双链区域。在一个实施方案中，核酸试剂是抑制基因表达的试剂，例如，促进RNAi的试剂。在一些实施方案中，核酸试剂选自由siRNA、shRNA、反义寡核苷酸或微RNA(miRNA)组成的组。在一个实施方案中，核酸试剂是miRNA拮抗剂或适体。
另一方面，本发明的特点在于一种组合物，其包含本文描述的多个核酸试剂-疏水聚合物缀合物。在一些实施方案中，组合物是药物组合物。在一些实施方案中，组合物是反应混合物。在一些实施方案中，组合物大致上不含未缀合的核酸试剂。在一些实施方案中，核酸试剂-聚合物缀合物上的核酸试剂的至少约50％是完整的。
在一些实施方案中，组合物大致上不含分子量小于约1kDa(例如，小于约500Da)的疏水聚合物。
另一方面，本发明的特点在于一种制备核酸试剂-疏水聚合物缀合物的方法，所述方法包括：
提供核酸试剂和聚合物；以及
使核酸试剂和聚合物经受实现核酸试剂共价连接至聚合物的条件。
在一些实施方案中，方法是在反应混合物中进行。在一些实施方案中，反应混合物包含单一溶剂。在一些实施方案中，反应混合物包含溶剂体系，所述溶剂体系包含多种溶剂。在一些实施方案中，多种溶剂是可混溶的。在一些实施方案中，溶剂体系包含水和极性溶剂如本文描述的溶剂(例如，DMF、DMSO、丙酮、苄醇、二噁烷、四氢呋喃或乙腈)。在一些实施方案中，溶剂体系包含水性缓冲液(例如，磷酸盐缓冲溶液(PBS)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)、TE缓冲液或2-(N-吗啉基)乙烷磺酸缓冲液(MES))。在一些实施方案中，溶剂体系是双相的(例如，包含有机相和水相)。
在一些实施方案中，核酸试剂或聚合物中的至少一种连接至不溶性基质。在一些实施方案中，聚合物连接至不溶性基质。
在一些实施方案中，方法的结果是形成使用点击化学(例如，如WO2006/115547中所描述)形成的键。方法的结果是形成酰胺、二硫化物、硫化物、酯、缩酮、琥珀酸酯、肟、碳酸酯、氨基甲酸酯、硅烷基醚和/或三唑。
在一些实施方案中，疏水聚合物具有小于约1mg/ml的水溶解度。
在一些实施方案中，核酸试剂经由核酸试剂的2’、3’和/或5’末端共价连接至疏水聚合物。在一些实施方案中，核酸试剂在疏水聚合物的末端共价连接至聚合物。在一些实施方案中，疏水聚合物具有羟基和/或羧酸末端。在一些实施方案中，核酸试剂在疏水聚合物的主链上共价连接至聚合物。在一些实施方案中，单一核酸试剂共价连接至单一疏水聚合物。在一些实施方案中，多个核酸试剂各自共价连接至单一疏水聚合物。
在一些实施方案中，方法产生具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％)纯度的核酸试剂-疏水聚合物缀合物。在一些实施方案中，方法产生至少约100mg的核酸试剂-疏水聚合物缀合物(例如，至少约1g)。
另一方面，本发明的特点在于一种通过本文描述的方法制成的核酸试剂-疏水聚合物缀合物。
另一方面，本发明的特点在于一种核酸试剂-亲水-疏水聚合物缀合物，其包含共价连接至亲水-疏水聚合物的核酸试剂或与共价连接至亲水-疏水聚合物的核酸形成双链体(例如，异源双链体)的核酸试剂，其中亲水-疏水聚合物包含连接至疏水部分的亲水部分。
在一些实施方案中，核酸试剂连接至亲水-疏水聚合物的亲水部分。在一些实施方案中，核酸试剂连接至亲水-疏水聚合物的疏水部分。在一些实施方案中，核酸试剂经由核酸试剂的2’、3’和/或5’末端共价连接至亲水-疏水聚合物。在一些实施方案中，核酸试剂在聚合物的末端共价连接至亲水-疏水聚合物。在一些实施方案中，核酸试剂在亲水-疏水聚合物的主链上共价连接至聚合物。在一些实施方案中，单一核酸试剂共价连接至单一亲水-疏水聚合物。在一些实施方案中，多个核酸试剂各自共价连接至单一亲水-疏水聚合物。
在一些实施方案中，核酸试剂直接共价连接(例如，不存在来自插入间隔基部分的原子)至疏水-疏水聚合物的疏水部分(例如，经由酯)。在一些实施方案中，核酸试剂直接共价连接(例如，不存在来自插入间隔基部分的原子)至亲水-疏水聚合物的亲水部分(例如，经由酯)。在一些实施方案中，核酸试剂经由连接基连接至亲水-疏水聚合物(例如，聚合物的亲水部分或聚合物的疏水部分)。
示例性连接基包括以下连接基：包含使用点击化学(例如，如WO2006/115547中所描述)形成的键的连接基和包含酰胺、酯、二硫化物、硫化物、缩酮、琥珀酸酯、肟、氨基甲酸酯、碳酸酯、硅烷基醚或三唑的连接基(例如，酰胺、酯、二硫化物、硫化物、缩酮、琥珀酸酯或三唑)。在一些实施方案中，连接基包含官能团，如可在生理条件下裂解的键。在一些实施方案中，连接基包含多个官能团，如可在生理条件下裂解的键。在一些实施方案中，连接基包含并非在连接基的末端直接连接至通过连接基连接的第一或第二部分，而是在连接基的内部的官能团，如本文描述的键或官能团。在一些实施方案中，连接基可在生理条件下水解、连接基可在生理条件下酶促裂解或连接基包含可在生理条件下还原的二硫化物。在一些实施方案中，连接基在生理条件下不裂解，例如，连接基具有使得核酸试剂不需要裂解即具有活性的足够长度，例如，连接基的长度是至少约20埃(例如，至少约24埃)。
在一些实施方案中，亲水-疏水聚合物具有一种或多种以下性质：
i)疏水部分具有约1kDa至约6kDa的重量平均分子量(例如，约2kDa至约6kDa)，
ii)疏水聚合物具有约4kDa至约15kDa的重量平均分子量(例如，约4kDa至约12kDa、约6kDa至约12kDa或约8kDa至约12kDa)；
iii)亲水聚合物是PEG；
iv)疏水聚合物是由第一类型和第二类型的单体亚单位构成，并且连接至核酸试剂的疏水聚合物中的第一类型单体亚单位与第二类型单体亚单位的比率是约25∶75至约75∶25，例如，约50∶50；以及
v)疏水聚合物是PLGA。
在一些实施方案中，如果亲水-疏水聚合物的亲水部分的重量平均分子量是约1kDa至约3kDa(例如，约2kDa)，则亲水部分的重量平均分子量与疏水部分的重量平均分子量的比率是在1∶3至1∶7之间，并且如果亲水部分的重量平均分子量是约4kDa至约6kDa(例如，约5kDa)，则亲水部分的重量平均分子量与疏水部分的重量平均分子量的比率是在1∶1至1∶4之间。在一些实施方案中，亲水部分具有约2kDa至约6kDa的重量平均分子量并且疏水部分具有约8kDa至约13kDa的重量平均分子量。
在一些实施方案中，亲水-疏水聚合物的亲水部分终止于甲氧基。
在一些实施方案中，核酸试剂是RNA、DNA或RNA与DNA的混合聚合物。在一个实施方案中，RNA是mRNA或siRNA。在一个实施方案中，DNA是cDNA或基因组DNA。在一个实施方案中，核酸试剂是单链的并且在另一个实施方案中它包含两条链。在一个实施方案中，核酸试剂可以具有由一个或两个分子的链构成的双链区域。在一个实施方案中，核酸试剂是抑制基因表达的试剂，例如，促进RNAi的试剂。在一些实施方案中，核酸试剂选自由siRNA、shRNA、反义寡核苷酸或微RNA(miRNA)组成的组。在一个实施方案中，核酸试剂是miRNA拮抗剂或适体。
另一方面，本发明的特点在于一种组合物，其包含本文描述的多个核酸试剂-亲水-疏水聚合物缀合物。
在一些实施方案中，组合物是反应混合物。在一些实施方案中，组合物是药物组合物。在一些实施方案中，组合物大致上不含未缀合的核酸试剂。在一些实施方案中，核酸试剂-聚合物缀合物上的核酸试剂的至少约50％是完整的。在一些实施方案中，组合物大致上不含分子量小于约1kDa的亲水-疏水聚合物。
另一方面，本发明的特点在于一种制备本文描述的核酸试剂-亲水-疏水聚合物缀合物的方法，所述方法包括：
提供核酸试剂和聚合物；以及
使核酸试剂和聚合物经受实现核酸试剂共价连接至聚合物的条件。
在一些实施方案中，方法是在反应混合物中进行。在一些实施方案中，反应混合物包含单一溶剂。在一些实施方案中，反应混合物包含溶剂体系，所述溶剂体系包含多种溶剂。在一些实施方案中，多种溶剂是可混溶的。在一些实施方案中，溶剂体系包含水和极性溶剂(例如，DMF、DMSO、丙酮、苄醇、二噁烷、四氢呋喃或乙腈)。在一些实施方案中，溶剂体系包含水性缓冲液(例如，磷酸盐缓冲溶液(PBS)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)、TE缓冲液或2-(N-吗啉基)乙烷磺酸缓冲液(MES))。在一些实施方案中，溶剂体系是双相的(例如，包含有机相和水相)。
在一些实施方案中，核酸试剂或聚合物中的至少一个连接至不溶性基质。在一些实施方案中，聚合物连接至不溶性基质。
在一些实施方案中，方法包括通过点击化学(例如，如WO2006/115547中所描述)形成键。在一些实施方案中，方法的结果是形成酰胺、二硫化物、硫化物、酯、肟、碳酸酯、氨基甲酸酯、硅烷基醚和/或三唑。
在一些实施方案中，亲水-疏水聚合物具有小于约50mg/ml的水溶解度。
在一些实施方案中，核酸试剂经由核酸试剂的2’、3’和/或5’末端共价连接至疏水-亲水聚合物。在一些实施方案中，核酸试剂在聚合物的末端共价连接至疏水-亲水聚合物。在一些实施方案中，核酸试剂在聚合物的亲水部分上共价连接至疏水-亲水聚合物。在一些实施方案中，核酸试剂在聚合物的疏水部分上共价连接至疏水-亲水聚合物。在一些实施方案中，核酸试剂在聚合物的主链上共价连接至疏水-亲水聚合物。在一些实施方案中，单一核酸试剂共价连接至单一疏水-亲水聚合物(例如，至亲水部分或疏水部分)。在一些实施方案中，多个核酸试剂各自共价连接至单一疏水-亲水聚合物。
在一些实施方案中，方法产生具有至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％)纯度的核酸试剂-亲水-疏水聚合物缀合物。在一些实施方案中，方法产生至少约100mg的核酸试剂-疏水聚合物缀合物(例如，至少约1g)。
另一方面，本发明的特点在于一种通过本文描述的方法制成的核酸试剂-亲水-疏水聚合物缀合物。
另一方面，本发明的特点在于一种粒子，所述粒子包括
多个核酸试剂-聚合物缀合物；
多个阳离子聚合物或脂质；以及
多个聚合物或脂质，其中聚合物或脂质大致上围绕多个核酸试剂-聚合物缀合物。在一些实施方案中，粒子是自组装的。
另一方面，本发明的特点在于一种制备粒子的方法，所述方法包括：
a)形成包含多个核酸试剂-聚合物缀合物的粒子；
b)使粒子与多个阳离子多价聚合物或脂质接触；
c)使b)的产物与多个聚合物或脂质接触，其中多个聚合物或脂质大致上围绕b)的产物形成粒子。
另一方面，本发明的特点在于一种制备粒子(例如，纳米粒子)的方法，所述方法包括在极性溶剂(例如，DMF、DMSO、丙酮、苄醇、二噁烷、四氢呋喃或乙腈)中在允许形成粒子的条件(例如，通过沉淀)下组合核酸试剂(例如，siRNA部分)，
(a)核酸试剂-疏水聚合物缀合物，各核酸试剂-疏水聚合物缀合物包含共价连接至疏水聚合物的核酸试剂(例如，siRNA部分)，其中核酸试剂-疏水聚合物缀合物与阳离子部分缔合，
b)多个亲水-疏水聚合物，例如，PEG-PLGA，以及
c)多个疏水聚合物(未共价连接至核酸试剂)
由此形成粒子。
在一些实施方案中，组合是在包含丙酮的溶剂体系中进行。在一些实施方案中，溶剂是混合溶剂体系(例如，组合水性/有机溶剂体系如乙腈和水性缓冲液体系)。
在一些实施方案中，方法包括：
组合，
(i)乙腈/TE缓冲液(例如，约90/10wt％至约50/50wt％，例如，约90/10wt％至约70/30wt％，例如，约80/20wt％)中的多个核酸试剂，各核酸试剂(例如，siRNA或其它核酸试剂)偶合至疏水聚合物并且与阳离子部分缔合；与
(ii)乙腈/TE缓冲液(例如，约90/10wt％至约50/50wt％，例如，约90/10wt％至约70/30wt％，例如，约80/20wt％)中的多个亲水-疏水聚合物(例如，PEG-PLGA)和多个疏水聚合物(未偶合至核酸试剂)。
另一方面，本发明的特点在于一种步骤a)的反应混合物，或其组合物或药物制剂。
另一方面，本发明的特点在于一种步骤(i)的反应混合物，或其组合物或药物制剂。
另一方面，本发明的特点在于一种步骤(ii)的反应混合物，或其组合物或药物制剂。
另一方面，本发明的特点在于一种通过上述方法制成的粒子。
另一方面，本发明的特点在于一种包含通过上述方法制成的粒子的组合物(例如，药物组合物)。
另一方面，本发明的特点在于一种制备粒子(例如，纳米粒子)的方法，所述粒子包含水溶性核酸试剂(例如，siRNA部分)、疏水-亲水聚合物以及疏水聚合物，所述方法包括
a)例如，在水溶剂中使以下接触
i)第一多个亲水-疏水聚合物，例如，PEG-PLGA，与
ii)第一多个疏水聚合物(例如，PLGA)，所述多个疏水聚合物各自具有第一反应性部分(例如，硫氢基部分)；
以形成水溶性中间体粒子；
b)使中间体粒子与多个水溶性核酸试剂(例如，siRNA部分)(各自具有第二反应性部分(例如，SH部分))在允许形成中间体复合物(例如，具有约小于100nm的直径)(例如，包含偶合至核酸试剂的亲水-疏水聚合物和疏水聚合物的中间体结构)的条件下接触(例如，在水性溶剂中)，以及，
c)使中间体复合物与第二多个亲水-疏水聚合物(例如，PEG-PLGA)和第二多个疏水聚合物(例如，PLGA)在允许形成粒子的条件下接触(例如，在非水性溶剂(例如，DMF、DMSO、丙酮、苄醇、二噁烷、四氢呋喃或乙腈)中)，
由此形成粒子。
另一方面，本发明的特点在于一种形成粒子(例如，纳米粒子)的方法，所述方法包括：
a)例如，在乙腈/TE缓冲液(例如，约90/10wt％至约50/50wt％，例如，约90/10wt％至约70/30wt％，例如，约80/20wt％))中使以下接触
i)第一多个亲水-疏水聚合物，例如，PEG-PLGA，与
ii)第一多个疏水聚合物(例如，PLGA)，所述多个疏水聚合物各自具有第一反应性部分，例如，硫氢基部分；
以形成中间体粒子(例如，具有小于约100nm的直径)，其中，在一些实施方案中，中间体粒子在官能上可溶于水溶液中，例如，凭借具有足够的亲水部分以使得它在水溶液中是可溶的；
b)使中间体粒子与多个药物部分(例如，siRNA或其它核酸药物部分部分)(各自具有第二反应性部分(例如，SH部分))在允许形成中间体复合物(例如，包含偶合至药物部分的亲水-疏水聚合物和疏水聚合物的中间体结构)的条件下接触(例如，在乙腈/TE缓冲液(例如，约90/10wt％至约50/50wt％，例如，约90/10wt％至约70/30wt％，例如，约80/20wt％)中)，以及，
c)使中间体复合物与第二多个亲水-疏水聚合物(例如，PEG-PLGA)和第二多个疏水聚合物(例如，PLGA)在允许形成粒子的条件下接触(例如，在乙腈/TE缓冲液(例如，约90/10wt％至约50/50wt％，例如，约90/10wt％至约70/30wt％，例如，约80/20wt％)中)，
由此形成粒子。
在一些实施方案中，中间体粒子a)的直径小于100nm。在一些实施方案中，粒子的直径小于150nm。在一些实施方案中，在步骤b)中添加共价连接至疏水聚合物的多个阳离子部分。
另一方面，本发明的特点在于一种步骤a)的反应混合物，或其组合物或药物制剂。
另一方面，本发明的特点在于一种步骤b)的反应混合物，或其组合物或药物制剂。
另一方面，本发明的特点在于一种通过上述方法制成的粒子。
另一方面，本发明的特点在于一种包含通过上述方法制成的粒子的组合物(例如，药物组合物)。
另一方面，本发明的特点在于一种本文描述的组合物(例如，药物组合物)，所述组合物当被施用至受试者使时使得靶基因的表达的减少程度与用以不同于粒子或缀合物(即，不以粒子的形式，例如，未包埋于粒子中或缀合至聚合物，例如，本文描述的粒子中)的制剂施用至受试者的核酸试剂观察到的靶基因的表达的减少程度或在不存在施用核酸试剂或其它治疗剂的情况下观察到的靶基因的表达的减少程度相比高至少10％、20％、50％、75％、80％、90％、100％、200％或500％。
在一个实施方案中，核酸试剂是RNA、DNA或RNA与DNA的混合聚合物。在一个实施方案中，RNA是mRNA或siRNA。在一个实施方案中，DNA是cDNA或基因组DNA。在一个实施方案中，核酸试剂是单链的并且在另一个实施方案中它包含两条链。在一个实施方案中，核酸试剂可以具有由一个或两个分子的链构成的双链区域。在一个实施方案中，核酸试剂是抑制基因表达的试剂，例如，促进RNAi的试剂。在一些实施方案中，核酸试剂选自由siRNA、shRNA、反义寡核苷酸或微RNA(miRNA)组成的组。在一个实施方案中，核酸试剂是miRNA拮抗剂或适体。
在一些实施方案中，减少是与未经组合物或游离核酸试剂治疗的对照样品相比的减少。在一些实施方案中，游离地施用的组合物和核酸试剂是在类似条件下施用。在一些实施方案中，施用至受试者的粒子组合物中的核酸试剂的量例如就重量或分子数而言与游离地施用的核酸试剂的量相同。在一些实施方案中，靶基因是荧光蛋白，例如，GFP或RFP。在一些实施方案中，靶基因是编码包含标记(例如，荧光部分，例如，GFP或RFP)的融合蛋白的融合基因。在一些实施方案中，在施用一定剂量的组合物或游离核酸试剂之后1分钟、10分钟、60分钟、2小时、12小时、24小时、2天或7天时测量减少。在一些实施方案中，受试者是小鼠、大鼠、狗或人中的任何一种。在一些实施方案中，受试者是小鼠，靶基因是GFP，并且GFP是在植入小鼠体内的海拉细胞中表达。在一些实施方案中，靶基因是在植入小鼠体内的MDA-MB-231GFP或MDA-MB-468GFP细胞中表达。
另一方面，本发明的特点在于一种本文描述的组合物(例如，药物组合物)，所述组合物当与培养细胞接触时，使得：靶基因的表达的减少程度与游离地施用至受试者的核酸试剂(其可以是DNA试剂、RNA试剂，例如，促进RNAi的试剂或微RNA、siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、miRNA拮抗剂、适体、基因组DNA、cDNA、mRNA或质粒)所观察到的减少程度相比高至少10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、60％、80％、90％、100％、200％、300％、400％或500％。
在一些实施方案中，减少是与未经组合物或游离核酸试剂治疗的对照样品相比的减少。在一些实施方案中，游离地施用的组合物和核酸试剂是在类似条件下与细胞接触。在一些实施方案中，与培养细胞接触的粒子组合物中的核酸试剂的量例如就重量或分子数而言与游离地接触的量相同。在一些实施方案中，靶基因是荧光蛋白，例如，GFP或RFP。在一些实施方案中，靶基因是编码包含标记(例如，荧光部分，例如，GFP或RFP)的融合蛋白的融合基因。在一些实施方案中，在与培养细胞接触之后10分钟、60分钟、2小时、12小时、24小时、2天或7天时测量减少。在一些实施方案中，培养细胞是海拉细胞。在一些实施方案中，培养细胞是MDA-MB-231GFP细胞或MDA-MB-468GFP细胞。在一些实施方案中，靶基因是GFP并且通过使组合物的等分部分与用GFP转染的培养海拉细胞接触、使游离核酸试剂的等分部分与用GFP转染的培养海拉细胞接触并且评价每个中GFP活性的水平来测定靶基因表达的减少。
另一方面，本发明的特点在于一种本文描述的组合物(例如，药物组合物)，所述组合物当在血清或细胞裂解液中孵育并且然后与培养细胞接触时保留至少10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、60％、80％、90％或100％的粒子的对照组合物(例如，未用血清或细胞裂解液孵育过的组合物，例如，在生理pH缓冲液中在其它方面类似的条件下孵育过的组合物)当与培养细胞接触时减少靶基因表达的能力。
在一些实施方案中，减少是与未经组合物或游离核酸试剂治疗的对照样品相比的减少。在一些实施方案中，在血清或细胞裂解液中孵育10分钟、20分钟、30分钟、1小时、2小时、5小时、24小时、2天、3天、5天或10天。在一些实施方案中，靶基因是荧光蛋白，例如，GFP或RFP。在一些实施方案中，靶基因是编码包含标记(例如，荧光部分，例如，GFP或RFP)的融合蛋白的融合基因。在一些实施方案中，靶基因是GFP并且通过使组合物的等分部分与用GFP转染的培养海拉细胞接触、使游离核酸试剂的等分部分与用GFP转染的培养海拉细胞接触并且评价每个中GFP活性的水平来测定靶基因表达的减少。在一些实施方案中，使组合物和游离地施用的核酸试剂(其可以是DNA试剂、RNA试剂，例如，促进RNAi的试剂，微RNA、siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、miRNA拮抗剂、适体、基因组DNA、cDNA、mRNA或质粒)在类似条件下与细胞接触。在一些实施方案中，与培养细胞接触的粒子组合物中的核酸试剂的量例如就重量或分子数而言与游离地接触的量相同。在一些实施方案中，培养细胞是海拉细胞。在一些实施方案中，培养细胞是MDA-MB-231GFP细胞或MDA-MB-468GFP细胞。
另一方面，本发明的特点在于一种本文描述的组合物(例如，药物组合物)，所述组合物当在血清中孵育并且然后与培养细胞接触时，具有至少一种以下性质：
a)保留至少10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、60％、80％、90％或100％的粒子的对照组合物(例如，未用血清孵育过的组合物，例如，在生理pH缓冲液中在其它方面类似条件下孵育过的组合物)当与培养细胞接触时减少靶基因表达的能力。
b)保留至少10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、60％、80％、90％或100％的粒子的对照组合物(例如，未用血清孵育过的组合物，例如，在生理pH缓冲液中在其它方面类似条件下孵育过的组合物)释放完整核酸试剂的能力。
在一些实施方案中，在血清中孵育10分钟、20分钟、30分钟、1小时、2小时、5小时、24小时、2天、3天、5天或10天。在一些实施方案中，以不同于粒子或缀合物(即，不以粒子，例如，未包埋于粒子中或缀合至本文描述的粒子中的聚合物)的制剂施用的组合物和核酸试剂是在类似条件下与细胞接触。在一些实施方案中，与培养细胞接触的粒子组合物中的核酸试剂的量例如就重量或分子数而言与游离地接触的量相同。在一些实施方案中，核酸试剂是RNA、DNA或RNA与DNA的混合聚合物。在一个实施方案中，RNA是mRNA或siRNA。在一个实施方案中，DNA是cDNA或基因组DNA。在一个实施方案中，核酸试剂是单链的并且在另一个实施方案中它包含两条链。在一个实施方案中，核酸试剂可以具有由一个或两个分子的链构成的双链区域。在一个实施方案中，核酸试剂是抑制基因表达的试剂，例如，促进RNAi的试剂。在一些实施方案中，核酸试剂选自由siRNA、shRNA、反义寡核苷酸或微RNA(miRNA)组成的组。在一个实施方案中，核酸试剂是miRNA拮抗剂或适体。
另一方面，本发明的特点在于一种储存缀合物、粒子或组合物的方法，所述方法包括：
提供安置于容器(例如，气密或液密性容器，例如，本文描述的容器，例如，具有惰性气体的容器，例如，顶部空间填充氩气或氮气)中的所述缀合物、粒子或组合物；
储存所述缀合物、粒子或组合物，例如，在预先选择的条件下，例如，温度，例如，本文描述的温度；
以及，将所述容器移至第二位置或从所述容器移除所述缀合物、粒子或组合物的全部或等分部分。
在一个实施方案中，评价缀合物、粒子或组合物，例如，核酸试剂的稳定性或活性、物理性质(例如，颜色、凝结、流动或倾倒能力、或粒径或电荷)。可以将评价与标准进行比较，并且任选地，与所述标准相对应，将缀合物、粒子或组合物进行分类。
在一个实施方案中，缀合物、粒子或组合物以复原制剂形式储存(例如，在液体中作为溶液或悬浮液)。
附图简述
图1A至1C描述可以用于连接本文描述的部分的示例性连接基。
图2是示出消化测定的结果的凝胶，其中用核糖核酸酶处理含有包埋(未缀合)于其中的siRNA的粒子。
图3是示出消化测定的结果的凝胶，其中用核糖核酸酶处理含有缀合至聚合物的siRNA的粒子。
图4是凝胶，其示出当用siEGFP粒子活体内处理异种移植小鼠时，在异种移植小鼠中经过工程改造以便表达EGFP的人乳腺肿瘤细胞中靶(EGFP)mRNA的特异性裂解。凝胶示出经过处理的异种移植小鼠的肿瘤的RNA提取物中由5’RLM RACE-PCR产生的裂解特异性扩增产物的水平。
图5示出接触根据实施例61a和实施例32a制备的粒子的人全血样品中的C3a和Bb浓度。
详细描述
本发明的应用不限于以下描述中所示的或附图中示出的组分的构造和配置的细节。本发明有其它实施方案的可能性并且能够以不同方式实施或进行。而且，本文使用的措辞和术语是出于描述的目的并且不应视为具有限制性。本文中“包括(including)”、“包含(comprising)”或“具有(having)”、“含有(containing)”、“涉及(involving)”以及其变化形式的使用是意指包括在其之后列举的项及其等同物以及其它项。
本文描述粒子、缀合物(例如，核酸试剂-聚合物缀合物)以及组合物。还公开含有缀合物、粒子以及组合物的剂型；使用缀合物、粒子以及组合物的方法(例如，用于治疗病症)；包括缀合物、粒子以及组合物的试剂盒；制备缀合物、粒子以及组合物的方法；储存缀合物、粒子以及组合物的方法；以及分析粒子和包含粒子的组合物的方法。
呈现标题和其它标识符(例如，(a)、(b)、(i)等)仅是为了便于阅读本说明书和权利要求书。本说明书和权利要求书中标题和其它标识符的使用并不要求步骤或要素是以字母或数字顺序或以他们出现的顺序进行。
定义
除非如另外指明，否则本文使用的术语“环境条件”是指在约一个大气压、50％相对湿度和约25℃下的环境条件。
本文所用的关于第一部分与第二部分的关系的术语“连接”(例如，试剂连接至聚合物)是指第一部分与第二部分之间形成共价键。在相同上下文中，名词“连接(attachment)”是指第一与第二部分之间的共价键。例如，连接至聚合物的核酸试剂是治疗剂，在这种情况下核酸试剂共价键合至聚合物(例如，本文描述的疏水聚合物)。连接可以是直接连接，例如，通过第一部分与第二部分的直接键，或可以是通过连接基(例如，通过安置于第一和第二部分之间的一个或多个原子的共价连接链)。例如，当连接是通过连接基时，第一部分(例如，药物)共价键合至连接基，所述连接基进而共价键合至第二部分(例如，本文描述的疏水聚合物)。
术语“生物可降解的”包括意欲在使用期间降解的聚合物、组合物以及制剂，如本文所描述者。生物可降解聚合物通常不同于非生物可降解聚合物，在于前者可以在使用期间降解。在某些实施方案中，此类使用涉及活体内使用，如活体内疗法，并且在其它某些实施方案中，此类使用涉及活体外使用。一般而言，可归因于生物可降解性的降解涉及生物可降解聚合物降解成它的组分亚单位，或聚合物消化(例如，通过生化过程)成更小的非聚合物亚单位。在某些实施方案中，通常可以鉴定两种不同类型的生物降解。例如，一种类型的生物降解可能涉及聚合物主链中的键(无论是共价或其它形式)的裂解。在这类生物降解中，通常产生单体和寡聚物，并且甚至更通常，这类生物降解通过连接聚合物的一个或多个亚单位的键的裂解而发生。相比之下，另一类型的生物降解可能涉及侧链的内部或将侧链连接至聚合物主链的键(无论是共价或其它形式)的裂解。在某些实施方案中，一种或另一种或两种一般类型的生物降解可以在聚合物使用期间发生。
本文所用的术语“生物降解”包括以上描述的生物降解的两种一般类型。可生物降解的聚合物的降解速率经常部分地取决于多种因素，包括造成任何降解的键的化学特性、分子量、结晶性、生物稳定性以及此类聚合物的交联度、聚合物的物理特性(例如，形状和大小)、聚合物或粒子的组装以及施用的方式和位置。例如，更大的分子量、更高的结晶度、和/或更高的生物稳定性通常导致更慢的生物降解。
术语“阳离子部分”是指在至少一种以下条件下具有pKa5或更大(例如，具有pKa5或更大的路易斯碱)和/或正电荷的部分：在制备本文描述的粒子期间，当被配制成本文描述的粒子时，或在将本文描述的粒子施用至受试者之后，例如，当在受试者体内循环和/或在内体中时。示例性阳离子部分包括含胺部分(例如，带电荷的胺部分如季胺)、含胍部分(例如，带电荷的胍如胍阳离子(quanadinium)部分)以及杂环和/或杂芳香族部分(例如，带电荷的部分如吡啶鎓或组氨酸部分)。阳离子部分包括聚合物质，如具有多于一个电荷的部分，例如，由部分的重复存在所促成，(例如，阳离子PVA和/或聚胺)。阳离子部分还包括两性离子，意指同时具有正电荷和负电荷的化合物(例如，氨基酸如精氨酸、赖氨酸或组氨酸)。
术语“阳离子聚合物”(例如，聚胺)是指当配制成本文描述的粒子时具有多个正电荷(即，至少2个)的聚合物(术语聚合物在下文描述)。在一些实施方案中，阳离子聚合物(例如，聚胺)具有至少3、4、5、10、15或20个正电荷。
措辞“可在生理条件下裂解”是指当经受生理条件时具有小于约50或100小时的半衰期的键。例如，酶促降解可以在暴露于生理条件(例如，pH为约4至8的水溶液和约25℃至约37℃的温度)后短于约五年、一年、六个月、三个月、一个月、十五天、五天、三天或一天的一段时间内发生。
“有效量”或“有效地......的量”是指在向受试者施用单一剂量或多次剂量有效治疗细胞或治愈、减轻、缓解或改善病症症状的聚合物-试剂缀合物、粒子或组合物的量。组合物的有效量可以根据多种因素而不同，如个体的疾病病况、年龄、性别以及体重和化合物在个体体内引发所希望的反应的能力。有效量还是其中治疗有益作用超过组合物的任何毒性或有害作用的量。
本文所用的术语“包埋”是指通过在第一部分与第二部分(例如，核酸试剂或阳离子部分与聚合物)之间形成非共价相互作用来安置第一部分和第二部分或将第一部分安置于第二部分内。在一些实施方案中，当提及包埋于粒子中的部分时，所述部分(例如，核酸试剂或阳离子部分)通过一种或多种非共价相互作用(如，范德华相互作用、疏水相互作用、氢键合、偶极-偶极相互作用、离子相互作用以及π-堆积)与粒子的聚合物或其它组分缔合并且部分与粒子的聚合物或其它组分之间不存在共价键。包埋的部分可以完全或部分地被将它包埋于其中的聚合物或粒子围绕。
本文所用的术语“疏水”描述可以在生理离子强度下仅以小于约0.05mg/mL(如，约0.01mg/mL或更小)的程度溶解于水溶液中的部分。
本文所用的术语“亲水”描述在生理离子强度下在水溶液中具有至少约0.05mg/mL或更大的溶解度的部分。
本文所用的术语“亲水-疏水聚合物”描述包含连接至疏水部分的亲水部分的聚合物。示例性亲水-疏水聚合物包括嵌段共聚物(例如，亲水和疏水聚合物的嵌段共聚物)。
本文所用的“羟基保护基”是本领域中熟知的并且包括在Protecting Groups in Organic Synthesis，T.W.Greene和P.G.M.Wuts，第三版，John Wiley&Sons，1999中详细描述的那些保护基，所述文献的全部以引用的方式并入本文。适合的羟基保护基包括例如酰基(例如，乙酰基)、三乙基甲硅烷基(TES)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、2，2，2-三氯乙氧基羰基(Troc)以及Cbz(Cbz)。
本文用于描述核酸试剂的术语“完整的”意指核酸试剂保留使它的靶基因有效沉默所要求的足够量的结构。当靶基因与完整核酸试剂接触时，如果它的表达减少至少90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或至少10％，则靶基因被“有效沉默”。通常，在核酸试剂(例如，siRNA)的完整制剂中，核酸试剂分子的至少60％、70％、80％、90％或全部具有与完整核酸试剂分子相同的分子量或长度。
本文所用的“惰性氛围”是指主要由惰性气体构成的氛围，所述惰性气体不与本文描述的聚合物-试剂缀合物、粒子、组合物或混合物化学反应。惰性气体的实例是氮气(N2)、氦气以及氩气。
本文所用的“连接基”是将两个或更多个部分连接在一起的部分(例如，核酸试剂或阳离子部分和聚合物如疏水聚合物、或亲水-疏水聚合物或亲水聚合物)。连接基具有至少两个官能团。例如，具有两个官能团的连接基可以具有能够与部分(如核酸试剂、阳离子部分、疏水部分(如本文描述的聚合物或亲水-疏水聚合物))上的官能团反应的第一官能团，和能够与第二部分(如本文描述的核酸试剂)上的官能团反应的第二官能团。
连接基可以具有多于两个官能团(例如，3、4、5、6、7、8、9、10或更多个官能团)，所述官能团可以用于例如将多个试剂连接至一个聚合物或用于在连接基内提供生物可裂解部分。在一些实施方案中，例如，当连接基具有多于两个官能团，例如，并且连接基除将第一部分连接至第二部分的两个官能团之外还包括官能团时，所述额外官能团(例如，第三官能团)可以被安置于第一与第二基团之间，并且在一些实施方案中，例如在生理条件下可以裂解。例如，连接基可以具有以下形式
Figure BDA00002844406900481
其中f1是第一官能团，例如，能够与部分(如本文描述的核酸试剂、阳离子部分、疏水部分(如聚合物)或亲水-疏水聚合物)上的官能团反应的官能团；f2是第二官能团，例如，能够与第二部分(如本文描述的核酸试剂)上的官能团反应的官能团；f3是生物可裂解官能团，例如，本文描述的生物可裂解的键；并且
Figure BDA00002844406900482
表示连接官能团的间隔基，例如，亚烷基(二价烷基)基团，其中任选地，亚烷基连接基的一个或多个碳原子置换为一个或多个杂原子(例如，产生以下基团中的一个：硫醚、氨基、酯、醚、酮基、酰胺、硅烷基醚、肟、氨基甲酸酯、碳酸酯、二硫化物、杂环或杂芳香族)。取决于上下文，连接基可以指在连接至第一或第二部分(例如，核酸试剂或聚合物)中的任一者之前的连接基部分、在连接至一个部分之后但在连接至第二部分之前的连接基部分或在连接至第一部分和第二部分两者之后存在的连接基的残基。
本文所用的术语“冻干保护剂”是指存在于冻干制剂中的物质。通常它存在于冻干过程之前并且持续存在于所得到的冻干制剂中。通常在粒子形成之后添加冻干保护剂。如果存在浓缩步骤，例如，在粒子形成与冻干之间，则可以在浓缩步骤之前或之后添加冻干保护剂。冻干保护剂可以用于在冻干期间保护粒子，例如用于减少或防止聚集、粒子破裂和/或其它类型的损害。在一个实施方案中，冻干保护剂是冷冻保护剂。
在一个实施方案中，冻干保护剂是碳水化合物。本文所用的术语“碳水化合物”是指并且包括单糖、二糖、寡糖以及多糖。
在一个实施方案中，冻干保护剂是单糖。本文所用的术语“单糖”是指不能被水解成更简单的碳水化合物单位的单一碳水化合物单位(例如，简单糖)。示例性单糖冻干保护剂包括葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、核糖等。
在一个实施方案中，冻干保护剂是二糖。本文所用的术语“二糖”是指由通过糖苷键(例如通过1-4键或1-6键)键合在一起的2个单糖单位形成的化合物或化学部分。二糖可以被水解成两个单糖。示例性二糖冻干保护剂包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖等。
在一个实施方案中，冻干保护剂是寡糖。本文所用的术语“寡糖”是指由通过糖苷键(例如通过1-4键或1-6键)键合在一起形成线性、支链或环状结构的3至约15个，优选地3至约10个单糖单位形成的化合物或化学部分。示例性寡糖冻干保护剂包括环糊精、棉籽糖、松三糖、麦芽三糖、水苏糖、阿卡波糖等。寡糖可以被氧化或还原。
在一个实施方案中，冻干保护剂是环状寡糖。本文所用的术语“环状寡糖”是指由通过糖苷键(例如通过1-4键或1-6键)键合在一起形成环状结构的3至约15个，优选地6、7、8、9或10个单糖单位形成的化合物或化学部分。示例性环状寡糖冻干保护剂包括作为离散化合物的环状寡糖，如α环糊精、β环糊精或γ环糊精。
其它示例性环状寡糖冻干保护剂包括在更大的分子结构中包括环糊精部分的化合物，如包含环状寡糖部分的聚合物。环状寡糖可以被氧化或还原，例如，被氧化成二羰基形式。本文所用的术语“环糊精部分”是指并入更大的分子结构(如聚合物)中或是更大的分子结构(如聚合物)的一部分的环糊精(例如，α、β或γ环糊精)基团。环糊精部分可以直接地或通过任选的连接基键合至一个或多个其它部分。环糊精部分可以被氧化或还原，例如，氧化成二羰基形式。
碳水化合物冻干保护剂(例如，环状寡糖冻干保护剂)可以是衍生的碳水化合物。例如，在一个实施方案中，冻干保护剂是衍生的环状寡糖，例如，衍生的环糊精，例如，2羟丙基-β环糊精，例如，美国专利号6,407,079中公开的部分醚化的环糊精(例如，部分醚化的β环糊精)，所述专利的内容以引用的方式并入本文。衍生的环糊精的另一个实例是β-环糊精磺丁基醚钠。
示例性冻干保护剂是多糖。本文所用的术语“多糖”是指由通过糖苷键(例如通过1-4键或1-6键)键合在一起形成线性、支链或环状结构的至少16个单糖单位形成的化合物或化学部分，并且包括包含多糖作为它们的主链结构的聚合物。在主链中，多糖可以是线性的或环状的。示例性多糖冻干保护剂包括糖原、淀粉酶、纤维素、葡聚糖、麦芽糊精等。
术语“衍生的碳水化合物”是指至少一个原子与主题非衍生碳水化合物不同的实体。例如，代替非衍生碳水化合物上存在的-OH，衍生的碳水化合物可以具有-OX，其中X不为H。可以通过化学官能化和/或取代或通过从头合成得到衍生物-术语“衍生物”暗示着不存在基于方法的限制。
术语“纳米粒子”在本文用于指在至少任何一个维度(例如，x、y以及z笛卡尔维度)中的大小小于约1微米(微米(micron))(例如，小于约500nm或小于约200nm或小于约100nm)并且大于约5nm的材料结构。在实施方案中，大小是小于约70nm但大于约20nm。纳米粒子可以具有多种几何形状，例如，球形、椭圆体等。术语“纳米粒子(nanoparticles)”是用作术语“纳米粒子(nanoparticle)”的复数。
术语“核酸试剂”是指任何合成的或天然存在的包括两个或更多个核苷酸残基的治疗剂。在一些实施方案中，核酸试剂是RNA、DNA或RNA与DNA的混合聚合物。在一个实施方案中，RNA是mRNA或siRNA。在一个实施方案中，DNA是cDNA或基因组DNA。在一个实施方案中，核酸试剂是单链的并且在另一个实施方案中它包含两条链。在一个实施方案中，核酸试剂可以具有由一个或两个分子的链构成的双链区域。在一个实施方案中，核酸试剂是抑制基因表达的试剂，例如，促进RNAi的试剂。在一些实施方案中，核酸试剂是siRNA、shRNA、反义寡核苷酸或微RNA(miRNA)。在一个实施方案中，核酸试剂是miRNA拮抗剂或适体。
如本文所用，“粒子多分散性指数(PDI)”或“粒子多分散性”是指粒子粒径分布的宽度。可以从等式PDI＝2a2/a1 2计算粒子PDI，其中a1是用于计算强度加权Z平均均值粒径的第一累积量或矩并且a2是用于计算定义为多分散性指数(PdI)的参数的第二矩。1的粒子PDI是理论最大值并且将是完全平坦的粒径分布曲线图。本文描述的粒子的组合物可以具有小于0.5、小于0.4、小于0.3、小于0.2或小于0.1的粒子PDI。
本文所用的“药学上可接受的载体或佐剂”是指可以与本文描述的聚合物-试剂缀合物、粒子或组合物一起施用至患者，并且当以足够用于递送治疗量的粒子的剂量施用时不会破坏其药理学活性并且是无毒的载体或佐剂。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖，如乳糖、葡萄糖、甘露醇以及蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素和它的衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素以及乙酸纤维素；(4)黄芪胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油以及大豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇以及聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)褐藻酸；(16)无热原质水；(17)等渗盐水；(18)林格式溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；以及(21)药物组合物中采用的其它无毒相容性物质。
本文所用的术语“聚合物”是给予它的如本领域中所用的普通含义，即，以由共价键连接的一个或多个重复单位(单体)为特征的分子结构。重复单位可以全部是相同的，或在一些情况下，可以有多于一种类型的重复单元存在于聚合物内。聚合物可以是天然的或非天然的(合成的)聚合物。聚合物可以是含有两个或更多个单体的均聚物或共聚物。聚合物可以是线性的或支链的。
如果聚合物内存在多于一种类型的重复单元，则聚合物是“共聚物”。应理解，在采用聚合物的任何实施方案中，被采用的聚合物可以是共聚物。形成共聚物的重复单位可以以任何方式排列。例如，重复单位可以以随机顺序、交替顺序排列或排列为“嵌段”共聚物，即，含有一个或多个各自含有第一重复单位(例如，第一嵌段)的区域，和一个或多个各自含有第二重复单位(例如，第二嵌段)的区域等。嵌段共聚物可以具有两个(二嵌段共聚物)、三个(三嵌段共聚物)或更多数量的相异嵌段。就序列而言，共聚物可以是随机、嵌段或含有随机和嵌段序列的组合。
在一些情况下，聚合物是从生物得到的，即，生物聚合物。生物聚合物的非限制性实例包括多肽或蛋白质(即，不同氨基酸的聚合物)或核酸如DNA或RNA。
如本文所用，“聚合物多分散性指数(PDI)”或“聚合物多分散性”是指指定聚合物样品中分子质量的分布。计算的聚合物PDI是重量平均分子量除以数量平均分子量。它指示一批聚合物中个体分子质量的分布。聚合物PDI具有通常大于1的值，但随着聚合物链接近均匀链长度，PDI接近一(1)。
如本文所用，如在将试剂施用至受试者的上下文中使用的术语“预防(prevent)”或“预防(preventing)”是指使受试者经受方案(例如，施用聚合物-试剂缀合物、粒子或组合物)以使得与没有方案存在的情况下所观察到的相比，病症的至少一种症状的发作延迟。
如本文所用，术语“受试者”意欲包括人和非人动物。示例性人受试者包括患有病症(例如，本文描述的病症)的人患者或正常受试者。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如，非哺乳动物(如鸡、两栖动物、爬行动物)和哺乳动物，如非人灵长类动物、驯养和/或农业上有用的动物(例如，羊、狗、猫、牛、猪等)。
如本文所用，术语“治疗(treat)”或“治疗(treating)”患有病症的受试者是指使受试者经受方案(例如，施用聚合物-试剂缀合物、粒子或组合物)以使得病症的至少一种症状被治愈、痊愈、减轻、缓解、改变、医治、改善或改进。治疗包括施用有效地减轻、缓解、改变、医治、改善、改进或影响病症或病症的症状的量。治疗可以抑制病症的症状的劣化或恶化。
术语“酰基”是指烷基羰基、环烷基羰基、芳基羰基、杂环基羰基或杂芳基羰基取代基，所述取代基中的任一者可以被进一步取代(例如，由一个或多个取代基)。示例性酰基包括乙酰基(CH3C(O)-)、苯甲酰基(C6H5C(O)-)以及乙酰氨基酸(例如，乙酰甘氨酸，CH3C(O)NHCH2C(O)-)。
术语“烷氧基”是指连接有氧基的如以下所定义的烷基。代表性烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。
术语“羧基”是指-C(O)OH或其盐。
术语“羟基(hydroxy)”和“羟基(hydroxyl)”可以互换使用并且是指-OH。
术语“取代基”是指在烷基、环烷基、烯基、炔基、杂环基、杂环烯基、环烯基、芳基或杂芳基的任何原子上“取代”的基团。任何原子都可以被取代。适合的取代基包括但不限于烷基(例如，C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12直链或支链烷基)、环烷基、卤烷基(例如，全氟烷基如CF3)、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、杂环基、烯基、炔基、环烯基、杂环烯基、烷氧基、卤烷氧基(例如，全氟烷氧基如OCF3)、卤代、羟基、羧基、羧酸酯基、氰基、硝基、氨基、烷基氨基、SO3H、硫酸酯基、磷酸酯基、亚甲二氧基(-O-CH2-O-其中氧连接至邻位原子)、亚乙二氧基、氧代、硫代(例如，C＝S)、亚氨基(烷基、芳基、芳烷基)、S(O)n烷基(其中n是0-2)、S(O)n芳基(其中n是0-2)、S(O)n杂芳基(其中n是0-2)、S(O)n杂环基(其中n是0-2)、胺(单、二、烷基、环烷基、芳烷基、杂芳烷基、芳基、杂芳基及其组合)、酯(烷基、芳烷基、杂芳烷基、芳基、杂芳基)、酰胺(单、二、烷基、芳烷基、杂芳烷基、芳基、杂芳基及其组合)、磺酰胺(单、二、烷基、芳烷基、杂芳烷基及其组合)。一方面，基团上的取代基独立的是上述取代基中的任何一个单一的基团或任何子集。另一方面，取代基本身可以被上述取代基中的任何一个取代。
粒子
一般而言，粒子包括核酸试剂和阳离子部分、疏水部分(如聚合物)或亲水-疏水聚合物中的至少一种。在一些实施方案中，粒子包括核酸试剂和阳离子部分以及疏水部分(如聚合物)或亲水-疏水聚合物中的至少一种。在一些实施方案中，本文描述的粒子包括疏水部分如疏水聚合物或脂质(例如，疏水聚合物)、含有亲水部分和疏水部分的聚合物、核酸试剂以及阳离子部分。在一些实施方案中，核酸试剂和/或阳离子部分连接至部分。例如，核酸试剂和/或阳离子部分可以连接至聚合物(例如，疏水聚合物或含有亲水部分和疏水部分的聚合物)或核酸试剂与连接至聚合物的核酸形成双链体。在一些实施方案中，核酸试剂连接至聚合物(例如，疏水聚合物或含有亲水部分和疏水部分的聚合物)，并且阳离子部分未连接至聚合物(例如，阳离子部分包埋于粒子中)。在一些实施方案中，核酸试剂和阳离子部分都连接至聚合物(例如，疏水聚合物或含有亲水部分和疏水部分的聚合物)或核酸试剂与连接至聚合物的核酸形成双链体并且阳离子部分连接至聚合物。在一些实施方案中，阳离子部分连接至聚合物(例如，疏水聚合物或含有亲水部分和疏水部分的聚合物)，并且核酸试剂未连接至聚合物(例如，核酸试剂包埋于粒子中)。在一些实施方案中，核酸试剂和阳离子部分都未连接至聚合物。核酸试剂和/或阳离子部分还可以连接至其它部分。例如，核酸试剂可以连接至阳离子部分或连接至亲水聚合物如PEG。
除疏水部分如疏水聚合物或脂质(例如，疏水聚合物)、含有亲水部分和疏水部分的聚合物、核酸试剂以及阳离子部分之外，本文描述的粒子还可以包括一种或多种其它组分如其它核酸试剂或其它阳离子部分。本文描述的粒子还可以包括具有至少一个酸性部分(如羧酸基团)的化合物。化合物可以是具有至少一个酸性部分的小分子或聚合物。在一些实施方案中，化合物是聚合物如PLGA。
在一些实施方案中，粒子配置成使得当施用至受试者时在预先选择的区室中存在核酸试剂(例如，siRNA)的优先释放。预先选择的区室可以是靶标部位、位置、组织类型、细胞类型(例如，疾病特异性细胞类型(例如，癌细胞))或亚细胞区室(例如，细胞溶质)。在一个实施方案中，粒子提供肿瘤中的优先释放，而不是其它区室，例如，非肿瘤区室(例如，周边血)。在核酸试剂(例如，siRNA)连接至聚合物或阳离子部分的实施方案中，核酸试剂在受试者的肿瘤中比在受试者的非肿瘤区室(例如，周边血)中以更大的程度释放(例如，通过连接基的还原裂解)。在一些实施方案中，粒子配置成使得当施用至受试者时，它比游离地施用核酸试剂时递送更多的核酸试剂(例如，siRNA)至受试者的区室(例如，肿瘤)。
在一些实施方案中，粒子与赋形剂，例如，碳水化合物组分或稳定剂或冻干保护剂缔合，例如，本文描述的碳水化合物组分、稳定剂或冻干保护剂。虽然不希望受理论束缚，但碳水化合物组分可以充当稳定剂或冻干保护剂。在一些实施方案中，碳水化合物组分、稳定剂或冻干保护剂包含一种或多种碳水化合物(例如，一种或多种本文描述的碳水化合物，如，蔗糖、环糊精或环糊精的衍生物(例如2-羟丙基-β-环糊精，本文有时称为HP-β-CD)、盐、PEG、PVP或冠醚。在一些实施方案中，碳水化合物组分、稳定剂或冻干保护剂包含两种或更多种碳水化合物，例如，两种或更多种本文描述的碳水化合物。在一个实施方案中，碳水化合物组分、稳定剂或冻干保护剂包括环状碳水化合物(例如，环糊精或环糊精的衍生物，例如，α环糊精、β环糊精、或γ环糊精(例如2-羟丙基-β-环糊精))和非环状碳水化合物。示例性非环状寡糖包括少于10、8、6或4个单糖亚单位的那些寡糖(例如，单糖或二糖(例如，蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖)或其组合)。
在一个实施方案中，碳水化合物组分、稳定剂或冻干保护剂包含第一和第二组分，例如环状碳水化合物和非环状碳水化合物(例如，单糖、二糖或四糖)。
在一个实施方案中，环状碳水化合物与与粒子缔合的非环状碳水化合物的重量比是本文描述的重量比，例如，0.5∶1.5至1.5∶0.5。
在一个实施方案中，碳水化合物组分、稳定剂或冻干保护剂包含如下第一和第二组分(此处指定为A和B)：
(A)包含环状碳水化合物并且(B)包含二糖；(A)包含多于一种环状碳水化合物，例如，β-环糊精(本文有时称为β-CD)或β-CD衍生物(例如，HP-β-CD)，并且(B)包含二糖；
(A)包含环状碳水化合物，例如，β-CD或β-CD衍生物(例如，HP-β-CD)，并且(B)包含多于一种二糖；
(A)包含多于一种环状碳水化合物，并且(B)包含多于一种二糖；
(A)包含环糊精，例如，β-CD或β-CD衍生物(例如，HP-β-CD)，并且(B)包含二糖；
(A)包含β-环糊精，例如，β-CD衍生物(例如，HP-β-CD)，并且(B)包含二糖；
(A)包含β-环糊精，例如，β-CD衍生物(例如，HP-β-CD)，并且(B)包含蔗糖；
(A)包含β-CD衍生物，例如，HP-β-CD，并且(B)包含蔗糖；
(A)包含β-环糊精，例如，β-CD衍生物(例如，HP-β-CD)，并且(B)包含海藻糖；
(A)包含β-环糊精，例如，β-CD衍生物(例如，HP-β-CD)，并且(B)包含蔗糖和海藻糖；
(A)包含HP-β-CD，并且(B)包含蔗糖和海藻糖。
在一个实施方案中，组分A和B以以下比率存在：0.5∶1.5至1.5∶0.5。在一个实施方案中，组分A和B以以下比率存在：3-1∶0.4-2；3-1∶0.4-2.5；3-1∶0.4-2；3-1∶0.5-1.5；3-1∶0.5-1；3-1∶1；3-1∶0.6-0.9；以及3∶1∶0.7。在一个实施方案中，组分A和B以以下比率存在：2-1∶0.4-2；3-1∶0.4-2.5；2-1∶0.4-2；2-1∶0.5-1.5；2-1∶0.5-1；2-1∶1；2-1∶0.6-0.9；以及2∶1∶0.7。在一个实施方案中，组分A和B以以下比率存在：2-1.5∶0.4-2；2-1.5∶0.4-2.5；2-1.5∶0.4-2；2-1.5∶0.5-1.5；2-1.5∶0.5-1；2-1.5∶1；2-1.5∶0.6-0.9；2∶1.5∶0.7。在一个实施方案中，组分A和B以以下比率存在：2.5-1.5∶0.5-1.5；2.2-1.6∶0.7-1.3；2.0-1.7∶0.8-1.2；1.8∶1；1.85∶1以及1.9∶1。
在一个实施方案中，组分A包含环糊精，例如，β-环糊精，例如，β-CD衍生物(例如，HP-β-CD)，并且(B)包含蔗糖，并且它们以以下比率存在：2.5-1.5∶0.5-1.5；2.2-1.6∶0.7-1.3；2.0-1.7∶0.8-1.2；1.8∶1；1.85∶1以及1.9∶1。
在一些实施方案中，粒子是纳米粒子。在一些实施方案中，纳米粒子具有小于或等于220nm(例如，小于或等于约215nm、210nm、205nm、200nm、195nm、190nm、185nm、180nm、175nm、170nm、165nm、160nm、155nm、150nm、145nm、140nm、135nm、130nm、125nm、120nm、115nm、110nm、105nm、100nm、95nm、90nm、85nm、80nm、75nm、70nm、65nm、60nm、55nm或50nm)的直径。在一个实施方案中，纳米粒子具有至少10nm(例如，至少约20nm)的直径。
本文描述的粒子还可以包括靶向剂或脂质(例如，在粒子的表面上)。
本文描述的多个粒子的组合物可以具有约50nm至约500nm的平均直径(例如，约50nm至约200nm)。多个粒子粒子的组合物可以具有约50nm至约220nm(例如，约75nm至约200nm)的中值粒径(约50nm至约500nm(例如，约75nm至约220nm)的Dv50(存在50％的粒子体积低于该粒径))。多个粒子的组合物可以具有约50nm至约500nm(例如，约75nm至约220nm)的Dv90(存在90％的粒子体积低于该粒径)。在一些实施方案中，多个粒子的组合物具有小于约150nm的Dv90。多个粒子的组合物可以具有小于0.5、小于0.4、小于0.3、小于0.2或小于0.1的粒子PDI。
当在水中测量时，本文描述的粒子可以具有约-20mV至约50mV范围内的表面ζ电位。ζ电位是粒子的表面电位的测量值。在一些实施方案中，当在水中测量时，粒子可以具有约-20mV至约20mV、约-10mV至约10mV之间的范围内或中性的表面ζ电位。
在一个实施方案中，本文描述的粒子或包含多个粒子的组合物具有足以在施用时例如在活体内模型系统(例如，小鼠模型如本文描述的任何模型)中观察到作用(例如，敲低)的量的核酸试剂(例如，siRNA)。
在一个实施方案中，本文描述的粒子或包含多个粒子的组合物是按数量或重量计它的核酸试剂(例如，siRNA)的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％是完整的(例如，如通过物理特性的功能性所测量，例如，分子量)的粒子或组合物。
在一个实施方案中，本文描述的粒子或包含多个粒子的组合物是按数量或重量计它的核酸试剂(例如，siRNA)的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％是在粒子的内部，而不是暴露在粒子的表面的粒子或组合物。
在一个实施方案中，当在50/50小鼠/人血清中孵育时，本文描述的粒子或包含多个粒子的组合物显示出很少或没有聚集。例如，当孵育时，按数量或重量计少于30％、20％或10％的粒子将会聚集。
在一个实施方案中，当在25℃±2℃/60％相对湿度±5％相对湿度下在敞开或密闭容器中储存20、30、40、50或60天时，本文描述的粒子或包含多个粒子的组合物可以保留它的活性的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％，例如，如在活体内模型系统中所测定，(例如，小鼠模型如本文描述的任何模型)。
在一个实施方案中，当在活体内模型系统(例如，小鼠模型如本文描述的任何模型)中作为1mg/kg或3mg/kg的单一剂量施用时，本文描述的粒子或包含多个粒子的组合物可以导致蛋白质减少至少20％、30％、40％、50％或60％和/或mRNA敲低。
在一个实施方案中，当在活体内模型系统(例如，小鼠模型如本文描述的任何模型)中(例如，作为1mg/kg或3mg/kg的单一剂量)施用时，如通过蛋白质或mRNA所测量，本文描述的粒子或包含多个粒子的组合物导致针对脱靶基因少于20％、10％、5％的敲低或没有敲低。
在一些实施方案中，本文描述的粒子可以递送有效量的核酸试剂以使得在将粒子施用至受试者之后大约72小时、96小时、120小时、144小时、168小时、192小时、216小时、240小时、264小时受试者体内的靶基因的表达减少至少20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在一个实施方案中，本文描述的粒子可以递送有效量的核酸试剂以使得在将粒子施用至受试者之后大约120小时受试者体内的靶基因的表达减少至少50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％。在一些实施方案中，将施用了本文描述的粒子或组合物的受试者体内的靶基因表达的水平与当核酸试剂以不同于粒子或缀合物(即，不以粒子的形式，例如，未包埋于粒子中或缀合至聚合物，例如，本文描述的粒子)的制剂施用时观察到的靶基因的表达的水平或与在不存在施用核酸试剂或其它治疗剂的情况下观察到的靶基因的表达的水平进行比较。
在一个实施方案中，当与靶基因mRNA接触时，本文描述的粒子或包含多个粒子的组合物导致mRNA裂解。
在一个实施方案中，当在活体内模型系统(例如，小鼠模型如本文描述的任何模型)中(例如，作为1mg/kg或3mg/kg的单一剂量)施用时，本文描述的粒子或包含多个粒子的组合物造成小于2、5或10倍的细胞因子诱导。例如，施用造成以下各项中的一个或多个(例如二、三、四、五、六或七个或全部)小于2、5或10倍的因子诱导：肿瘤坏死因子α、白细胞介素-1α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6、白细胞介素-10、白细胞介素-12、角质化细胞衍生的细胞因子以及干扰素γ。
在一个实施方案中，当在活体内模型系统(例如，小鼠模型如本文描述的任何模型)中(例如，作为1mg/kg或3mg/kg的单一剂量)施用时，本文描述的粒子或包含多个粒子的组合物造成丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)小于2、5或10倍的增加。
在一个实施方案中，在活体内模型系统(例如，小鼠模型如本文描述的模型)中2次剂量的3mg/kg之后48小时，本文描述的粒子或包含多个粒子的组合物没有造成血细胞计数的显著变化。
在一个实施方案中，粒子在非极性有机溶剂(例如，己烷、氯仿或二氯甲烷中的任何一种)中是稳定的。举例而言，粒子大致上不会转化，例如，如果存在，外层不会内化，或大量的表面组分相对于它们在水性溶剂中的构型会内化。在实施方案中，组分的分布在非极性有机溶剂和在水性溶剂中是大致上相同的。
在一个实施方案中，粒子缺乏胶束的至少一种组分，例如，它缺乏大致上不含亲水组分的核心。
在一个实施方案中，粒子的核心包含大量亲水组分。
在一个实施方案中，粒子的核心包含大量(例如，(按重量或数量计)至少10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％)粒子的核酸试剂(例如，siRNA)。
在一个实施方案中，粒子的核心包含大量(例如，(按重量或数量计)至少10％、20％、30％、40％、50％、60％或70％)粒子的阳离子(例如，聚阳离子)部分。
本文描述的粒子可以包括少量残留溶剂，例如，在制备粒子中使用的溶剂如丙酮、叔丁基甲基醚、苄醇、二噁烷、庚烷、二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、乙酸乙酯、乙腈、四氢呋喃、乙醇、甲醇、异丙醇、甲基乙基酮、乙酸丁酯或乙酸丙酯(例如，乙酰乙酸异丙酯)。在一些实施方案中，粒子可以包括小于5000ppm的溶剂(例如，小于4500ppm、小于4000ppm、小于3500ppm、小于3000ppm、小于2500ppm、小于2000ppm、小于1500ppm、小于1000ppm、小于500ppm、小于250ppm、小于100ppm、小于50ppm、小于25ppm、小于10ppm、小于5ppm、小于2ppm或小于1ppm)。
在一些实施方案中，粒子大致上不含如由美国卫生及公共服务部食品与药品管理局“Q3c-表和列表”定义的II类或III类溶剂。在一些实施方案中，粒子包含小于5000ppm的丙酮。在一些实施方案中，粒子包含小于5000ppm的叔丁基甲基醚。在一些实施方案中，粒子包含小于5000ppm的庚烷。在一些实施方案中，粒子包含小于600ppm的二氯甲烷。在一些实施方案中，粒子包含小于880ppm的二甲基甲酰胺。在一些实施方案中，粒子包含小于5000ppm的乙酸乙酯。在一些实施方案中，粒子包含小于410ppm的乙腈。在一些实施方案中，粒子包含小于720ppm的四氢呋喃。在一些实施方案中，粒子包含小于5000ppm的乙醇。在一些实施方案中，粒子包含小于3000ppm的甲醇。在一些实施方案中，粒子包含小于5000ppm的异丙醇。在一些实施方案中，粒子包含小于5000ppm的甲基乙基酮。在一些实施方案中，粒子包含小于5000ppm的乙酸丁酯。在一些实施方案中，粒子包含小于5000ppm的乙酸丙酯。
本文描述的粒子可以包括不同量的疏水部分(如疏水聚合物)，例如，粒子的或用作制备粒子的起始材料的约20重量％至约90重量％(例如，约20重量％至约80重量％、约25重量％至约75重量％或约30重量％至约70重量％)。
本文描述的粒子可以包括不同量的含有亲水部分和疏水部分的聚合物，例如，高达粒子的或用作制备粒子的起始材料的约50重量％(例如，约4重量％至约50重量％、约5重量％、约8重量％、约10重量％、约15重量％、约20重量％、约23重量％、约25重量％、约30重量％、约35重量％、约40重量％、约45重量％或约50重量％中的任何一个)。例如，粒子的疏水-亲水聚合物的重量百分比是约3％至约30％、约5％至约25％或约8％至约23％。
在本文描述的粒子中，疏水聚合物与疏水-亲水聚合物的比率使得粒子包含具有疏水部分和亲水部分的粒子的或用作制备所述粒子的起始材料的聚合物的至少5重量％、8重量％、10重量％、12重量％、15重量％、18重量％、20重量％、23重量％、25重量％或30重量％。
本文描述的粒子可以包括不同量的阳离子部分，例如，粒子的或用作制备粒子的起始材料的约0.1重量％至约60重量％(例如，约1重量％至约60重量％、约2重量％至约20重量％、约3重量％至约30重量％、约5重量％至约40重量％或约10重量％至约30重量％)。当阳离子部分是含氮部分时，粒子中氮部分与粒子中核酸试剂主链的磷酸酯的比率(即，N/P比率)可以是约1∶1至约50∶1(例如，约1∶1至约25∶1、约1∶1至约10∶1、约1∶1至约5∶1或约1∶1至约1.5至1∶1)。
本文描述的粒子可以包括不同量的核酸试剂，例如，粒子的或用作制备粒子的起始材料的约0.1重量％至约50重量％(例如，约1重量％至约50重量％、约0.5重量％至约20重量％、约2重量％至约20重量％、约或约5重量％至约15重量％)。
当粒子包括表面活性剂时，粒子可以包括不同量的表面活性剂，例如，高达粒子的或用作制备粒子的起始材料的约40重量％，或约15重量％至约35重量％或约3重量％至约10重量％。在一些实施方案中，表面活性剂是PVA并且阳离子部分是阳离子PVA。在一些实施方案中，粒子可以包括约2％至约5％的PVA(例如，约4％)和约0.1％至约3％的阳离子PVA(例如，约1％)。
本文描述的粒子可以大致上不含靶向剂(例如，共价连接至粒子中的组分的靶向剂，例如，能够结合靶生物实体或以其它方式与靶生物实体缔合的靶向剂，所述靶生物实体为例如膜组分、细胞表面受体、前列腺特异性膜抗原等)。本文描述的粒子可以大致上不含选自以下的靶向剂：核酸适体、生长因子、激素、细胞因子、白细胞介素、抗体、整联蛋白、纤连蛋白受体、p-糖蛋白受体、肽以及细胞结合序列。在一些实施方案中，粒子内无聚合物缀合至靶向部分。本文描述的粒子可以不含出于使粒子选择性地靶向至受试者体内的部位的目的而添加的部分，例如，通过使用对于受试者体内的靶标具有高度特异性亲和力的粒子上的部分。
在一些实施方案中，粒子不含脂质，例如，不含磷脂。本文描述的粒子可以大致上不含能减少水渗透至纳米粒子中的两亲性层。本文描述的粒子可以包含小于5％或10％(例如，如根据w/w、v/v所确定)的脂质，例如，磷脂。本文描述的粒子可以大致上不含脂质层，例如，磷脂层，例如，能减少水渗透至纳米粒子中的脂质层。本文描述的粒子可以大致上不含脂质，例如，大致上不含磷脂。
本文描述的粒子可以大致上不含放射性药剂，例如，放射性治疗剂、放射性诊断剂、预防剂或其它放射性同位素。本文描述的粒子可以大致上不含免疫调节剂，例如，免疫刺激剂或免疫抑制剂。本文描述的粒子可以大致上不含疫苗或免疫原，例如，肽、糖、基于脂质的免疫原、B细胞抗原或T细胞抗原。
本文描述的粒子可以大致上不含水溶性疏水聚合物，如PLGA，例如，分子量小于约1kDa(例如，小于约500Da)的PLGA。
示例性粒子
一种示例性粒子包括包含以下的粒子：
a)多个疏水部分，例如，疏水聚合物；
b)多个亲水-疏水聚合物；
c)任选地，多个阳离子部分；以及
d)多个核酸试剂，其中多个核酸试剂中的至少一部分
(i)共价连接至以下中的任一者：
疏水部分，例如，a)的疏水聚合物)或
b)的亲水-疏水聚合物，或
(ii)与共价连接至疏水部分(例如，a)的疏水聚合物)或b)的亲水-疏水聚合物的核酸形成双链体(例如，异源双链体)。
另一种示例性粒子包括包含以下的粒子：
a)多个核酸试剂-聚合物缀合物，每个所述缀合物包含核酸试剂，所述核酸试剂
(i)连接至疏水聚合物或
(ii)与共价连接至疏水聚合物的核酸形成双链体(例如，异源双链体)；
b)多个亲水-疏水聚合物；以及
c)任选地，多个阳离子部分。
另一种示例性粒子包括包含以下的粒子：
a)多个疏水部分，例如，疏水聚合物；
b)多个核酸试剂-亲水-疏水聚合物缀合物，其中所述多个的各核酸试剂-亲水-疏水聚合物缀合物的核酸试剂
(i)共价连接至亲水-疏水聚合物或
(ii)与共价连接至亲水-疏水聚合物的核酸形成双链体(例如，异源双链体)；以及
c)任选地，多个阳离子部分。
另一种示例性粒子包括包含以下的粒子：
a)多个疏水部分，例如，疏水聚合物；
b)多个亲水-疏水聚合物；
c)多个阳离子部分，其中多个阳离子部分中的至少一部分连接至a)的疏水聚合物或b)的亲水-疏水聚合物；以及
d)多个核酸试剂。
另一种示例性粒子包括包含以下的粒子：
a)多个疏水部分(例如，疏水聚合物)；
b)多个亲水-疏水聚合物；
c)任选地，多个阳离子部分；以及
d)多个核酸试剂；
其中c)的阳离子部分的大部分和d)的核酸试剂的大部分未共价连接至疏水聚合物或亲水-疏水聚合物。例如，核酸试剂或阳离子部分包埋于粒子中。
另一种示例性粒子包括包含以下的粒子：
a)多个疏水部分，例如，疏水聚合物；
b)任选地多个亲水-疏水聚合物；
c)多个阳离子部分；以及
d)多个核酸试剂，其中多个核酸试剂中的至少一部分共价连接至疏水聚合物或与共价连接至亲水聚合物的核酸形成双链体(例如，异源双链体)。
另一种示例性粒子包括包含以下的粒子：
a)多个疏水部分，例如，疏水聚合物；
b)多个亲水-疏水聚合物；以及
c)多个核酸试剂-阳离子聚合物缀合物。
在一个实施方案中，核酸试剂未连接(例如，共价连接)至疏水聚合物或亲水-疏水聚合物。在一个实施方案中，粒子中或用作制备粒子的起始材料的核酸试剂的小于5重量％、2重量％或1重量％连接至疏水聚合物或亲水-疏水聚合物。
另一种示例性粒子包括多个核酸试剂聚合物缀合物；多个阳离子聚合物或脂质；以及多个聚合物或脂质，其中聚合物或脂质大致上围绕多个核酸试剂-聚合物缀合物，例如，所述核酸试剂大致上在粒子的内部，而不在粒子的表面。
疏水部分
疏水聚合物
本文描述的粒子可以包括疏水聚合物。疏水聚合物可以连接至核酸试剂和/或阳离子部分以形成缀合物(例如，核酸试剂-疏水聚合物缀合物或阳离子部分-疏水聚合物缀合物)。在一些实施方案中，核酸试剂与连接至疏水化合物的核酸形成双链体。
在一些实施方案中，疏水聚合物未连接至另一部分。粒子可以包括多个疏水聚合物，例如其中一些连接至另一部分如核酸试剂和/或阳离子部分并且一些是游离的。
示例性疏水聚合物包括以下：丙烯酸酯，包括丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸正丁酯(BA)、丙烯酸异丁酯、丙烯酸2-乙酯以及丙烯酸叔丁酯；甲基丙烯酸酯，包括甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸正丁酯以及甲基丙烯酸异丁酯；丙烯腈；甲基丙烯腈；乙烯基化合物，包括乙酸乙烯酯、叔碳酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、乙烯基甲酰胺、乙烯基乙酰胺、乙烯基吡啶以及乙烯基咪唑；氨基烷基化合物，包括丙烯酸氨基烷基酯、甲基丙烯酸氨基烷基酯以及氨基烷基(甲基)丙烯酰胺；苯乙烯；乙酸邻苯二甲酸纤维素；乙酸琥珀酸纤维素；邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素；聚(D，L-丙交酯)；聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)；聚(乙交酯)；聚(羟基丁酸酯)；聚(烷基碳酸酯)；聚(原酸酯)；聚酯；聚(羟基戊酸)；聚二噁烷酮；聚(对苯二甲酸乙二酯)；聚(苹果酸)；聚(丙醇二酸)；聚酐；聚磷腈；聚(氨基酸)以及它们的共聚物(大体上参见，Svenson，S(编著).，Polymeric Drug Delivery：第I卷：Particulate Drug Carriers.2006；ACS研讨会丛书；Amiji，M.M(编著).，Nanotechnology for Cancer Therapy.2007；Taylor&Francis Group，LLP；Nair等Prog.Polym.Sci.(2007)32：762-798)；基于疏水性肽的聚合物和基于聚(L-氨基酸)的共聚物(Lavasanifar，A.，等，AdvancedDrug Delivery Reviews(2002)54：169-190)；聚(乙烯-乙酸乙烯酯)(“EVA”)共聚物；硅橡胶；聚乙烯；聚丙烯；聚二烯(聚丁二烯、聚异戊二烯以及这些聚合物的氢化形式)；乙烯甲基醚和其它乙烯基醚的马来酸酐共聚物；聚酰胺(尼龙6，6)；聚氨酯；聚(酯聚氨酯)；聚(醚聚氨酯)；以及聚(酯-脲)。
可用于制备本文描述的聚合物-试剂缀合物或粒子的疏水聚合物还包括可生物降解的聚合物。可生物降解的聚合物的实例包括聚丙交酯、聚乙交酯、基于己内酯的聚合物、聚(己内酯)、聚二噁烷酮、聚酐、聚胺、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚二噁烷酮、聚缩醛、聚缩酮、聚碳酸酯、聚磷酸酯、聚酯、聚对苯二甲酸丁二酯、聚原碳酸酯、聚磷腈、琥珀酸酯、聚(苹果酸)、聚(氨基酸)、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚乙二醇、聚羟基纤维素、多糖、几丁质、壳聚糖和透明质酸及其共聚物、三聚物以及混合物。可生物降解的聚合物还包括共聚物(包括基于已内酯的聚合物、聚己内酯)和包括聚对苯二甲酸丁二酯的共聚物。
在一些实施方案中，聚合物是从选自由以下组成的组的单体合成的聚酯：D，L-丙交酯、D-丙交酯、L-丙交酯、D，L-乳酸、D-乳酸、L-乳酸、乙交酯、乙醇酸、ε-己内酯、ε-羟基己酸、γ-丁内酯、γ-羟基丁酸、δ-戊内酯、δ-羟基戊酸、羟基丁酸以及苹果酸。
还可以在本文描述的聚合物-试剂缀合物或粒子中使用共聚物。在一些实施方案中，聚合物可以是PLGA，其是乳酸和乙醇酸的可生物降解的无规共聚物。PLGA聚合物可以具有不同比率的乳酸∶乙醇酸，例如，范围为约0.1∶99.9至约99.9∶0.1(例如，约75∶25至约25∶75、约60∶40至40∶60或约55∶45至45∶55)。在一些实施方案中，例如，在PLGA中，乳酸单体与乙醇酸单体的比率是50∶50、60∶40或75∶25。
在具体实施方案中，通过优化聚合物-试剂缀合物或粒子中的PLGA聚合物中乳酸单体与乙醇酸单体的比率，可以优化参数如吸水率、试剂释放(例如，“控释”)以及聚合物降解动力学。此外，调整比率还将影响共聚物的疏水性，这将进而影响药物负载。
在可生物降解的聚合物还具有核酸试剂或其它材料(如连接至它的阳离子部分或与连接至它的核酸形成双链体的核酸试剂)的某些实施方案中，此类聚合物的生物降解速率可以由此类材料的释放速率表征。在此类情况下，生物降解速率不仅可以取决于聚合物的化学特性和物理特征，而且还可以取决于连接至其上的材料的特性。主题组合物的降解不仅包括分子内键的裂解(例如，通过氧化和/或水解)，而且还包括分子间键的破坏(如，通过与外来包含主体形成竞争性复合物而使主体/客体复合物解离)。在一些实施方案中，可以通过粒子中的额外组分(例如，具有至少一个酸性部分的化合物(例如，游离酸PLGA))影响释放。
在某些实施方案中，包含一种或多种聚合物(如疏水聚合物)的粒子在所希望的应用中可接受的一段时期内生物降解。在某些实施方案中，如活体内疗法中，在暴露至pH在4与8之间且温度在25℃与37℃之间的生理溶液时在通常短于约五年、一年、六个月、三个月、一个月、十五天、五天、三天或甚至一天的一段时期内发生这种降解。在其它实施方案中，取决于所希望的应用，聚合物在约一小时与若干周之间的一段时期内降解。
当聚合物用于活体内递送核酸试剂时，重要的是聚合物本身是无毒性的并且随着聚合物被体液侵蚀，它们降解成无毒的降解产物。然而，许多合成的可生物降解的聚合物在活体内侵蚀时产生与周围组织不利地相互作用的寡聚物和单体(D.F.Williams，J.Mater.Sci.1233(1982))。为了使完整聚合物载体和它的降解产物的毒性降至最低，已经基于天然存在的代谢物设计聚合物。示例性聚合物包括衍生自乳酸和/或乙醇酸的聚酯和衍生自氨基酸的聚酰胺。
多种可生物降解的聚合物是已知的并且用于药剂的控释。此类聚合物描述于例如美国专利号4,291,013；4,347,234；4,525,495；4,570,629；4,572,832；4,587,268；4,638,045；4,675,381；4,745,160；以及5,219,980；和PCT公布WO2006/014626中，所述文献各自以引用的方式整体并入本文。
本文描述的疏水聚合物可以具有多个端基。在一些实施方案中，聚合物的端基未进一步修饰，例如，当端基是羧酸、羟基或氨基时。在一些实施方案中，端基可以被进一步修饰。例如，具有羟基端基的聚合物可以用酰基衍生化来产生酰基封端的聚合物(例如，乙酰基封端的聚合物或苯甲酰基封端的聚合物)或用烷基衍生化来产生烷氧基封端的聚合物(例如，甲氧基封端的聚合物)或用苄基衍生化来产生苄基封端的聚合物。端基还可以进一步与官能团反应例如以提供与另一部分(如核酸试剂、阳离子部分或不溶性基质)的键。在一些实施方案中，粒子包含用未与另一部分(例如，核酸试剂)反应的部分(例如，N-(2-氨乙基)马来酰亚胺、2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙氨基或琥珀酰亚胺基-N-甲酯)进行官能化的官能化疏水聚合物(例如，疏水聚合物，如PLGA(例如，50∶50PLGA))。
疏水聚合物可以具有约1kDa至约70kDa范围内的重量平均分子量(例如，约4kDa至约66kDa、约2kDa至约12kDa、约6kDa至约20kDa、约5kDa至约15kDa、约6kDa至约13kDa、约7kDa至约11kDa、约5kDa至约10kDa、约7kDa至约10kDa、约5kDa至约7kDa、约6kDa至约8kDa、约6kDa、约7kDa、约8kDa、约9kDa、约10kDa、约11kDa、约12kDa、约13kDa、约14kDa、约15kDa、约16kDa或约17kDa)。
本文描述的疏水聚合物可以具有小于或等于约2.5(例如，小于或等于约2.2、小于或等于约2.0、或小于或等于约1.5)的聚合物多分散性指数(PDI)。在一些实施方案中，本文描述的疏水聚合物可以具有约1.0至约2.5、约1.0至约2.0、约1.0至约1.7或约1.0至约1.6的聚合物PDI。
本文描述的粒子可以包括不同量的疏水聚合物，例如，粒子的约10重量％至约90重量％(例如，约20重量％至约80重量％、约25重量％至约75重量％、或约30重量％至约70重量％)。
本文描述的疏水聚合物可以是可商购获得的，例如，从商用供应商如BASF、Boehringer Ingelheim、Durcet Corporation、Purac America以及SurModics Pharmaceuticals获得。本文描述的聚合物还可以是合成的。合成聚合物的方法是本领域已知的(参见，例如，PolymerSynthesis：Theory and Practice Fundamentals，Methods，Experiments.D.Braun等.，第四版，Springer，Berlin，2005)。此类方法包括，例如，缩聚、自由基聚合、离子聚合(例如，阳离子或阴离子聚合)或开环易位聚合。
可商购获得的或合成的聚合物样品可以在形成聚合物-试剂缀合物或并入本文描述的粒子或聚合物之前被进一步纯化。在一些实施方案中，纯化可以降低聚合物样品的多分散性。可以通过从溶液中沉淀或沉淀至固体(如硅藻土)上来纯化聚合物。还可以通过尺寸排阻色谱法(SEC)进一步纯化聚合物。
其它疏水部分
对于本文描述的粒子的其它适合的疏水部分包括脂质，例如，磷脂。示例性脂质包括卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、磷酸二鲸蜡酯、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈油酰基-磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、棕榈油酰基-磷脂酰甘油(POPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基-磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基-磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、单甲基-磷脂酰乙醇胺、二甲基-磷脂酰乙醇胺、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DEPE)、硬脂酰油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、溶血磷脂酰胆碱以及二亚油酰基-磷脂酰胆碱。
其它示例性疏水部分包括胆固醇和维生素E TPGS。
在一个实施方案中，疏水部分不是脂质(例如，不是磷脂)或不包含脂质。
疏水-亲水聚合物
本文描述的粒子可以包括含有亲水部分和疏水部分的聚合物，例如，疏水-亲水聚合物。疏水-亲水聚合物可以连接至另一部分如核酸试剂(例如，通过亲水部分或疏水部分)和/或阳离子部分或核酸试剂可以与连接至疏水-亲水聚合物的核酸形成双链体。在一些实施方案中，疏水-亲水聚合物是游离的(即，未连接至另一部分)。粒子可以包括多个疏水-亲水聚合物，例如其中一些连接至另一部分如核酸试剂和/或阳离子部分并且一些是游离的。
含有亲水部分和疏水部分的聚合物可以是亲水嵌段与疏水嵌段偶合的共聚物。这些共聚物可以具有约5kDa与约30kDa之间的重量平均分子量(例如，约5kDa至约25kDa、约10kDa至约22kDa、约10kDa至约15kDa、约12kDa至约22kDa、约7kDa至约15kDa、约15kDa至约19kDa或约11kDa至约13kDa，例如，约9kDa、约10kDa、约11kDa、约12kDa、约13kDa、约14kDa、约15kDa、约16kDa、约17kDa、约18kDa或约19kDa)。含有亲水部分和疏水部分的聚合物可以连接至试剂。
聚合物的适合的疏水部分的实例包括以上描述的那些部分。共聚物的疏水部分可以具有约1kDa至约20kDa的重量平均分子量(例如，约8kDa至约15kDa、约1kDa至约18kDa、17kDa、16kDa、15kDa、14kDa或13kDa、约2kDa至约12kDa、约6kDa至约20kDa、约5kDa至约18kDa、约7kDa至约17kDa、约8kDa至约13kDa、约9kDa至约11kDa、约10kDa至约14kDa、约6kDa至约8kDa、约6kDa、约7kDa、约8kDa、约9kDa、约10kDa、约11kDa、约12kDa、约13kDa、约14kDa、约15kDa、约16kDa或约17kDa)。
聚合物的适合的亲水部分的实例包括以下：羧酸，包括丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸、以及马来酸；聚氧乙烯或聚环氧乙烷(PEG)；聚丙烯酰胺(例如，聚羟丙基甲基丙烯酰胺)及其与甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、二烯丙基二甲基氯化铵、乙烯基苄基三甲基氯化铵、丙烯酸、甲基丙烯酸、2-丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸和苯乙烯磺酸酯、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚噁唑啉、聚唾液酸、淀粉和淀粉衍生物、葡聚糖和葡聚糖衍生物的共聚物；多肽，如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚谷氨酸；聚透明质酸、褐藻酸、聚乳酸、聚乙烯亚胺、聚紫罗烯、聚丙烯酸以及聚亚氨基羧酸酯、明胶以及不饱和乙烯一元羧酸或二羧酸。可以在Handbook of Water-Soluble Gums and Resins，R.Davidson，McGraw-Hill(1980)中找到适合的亲水聚合物的列表。共聚物的亲水部分可以具有约1kDa至约21kDa的重量平均分子量(例如，约1kDa至约8kDa、约1kDa至约3kDa(例如，约2kDa)或约2kDa至约6kDa(例如，约3.5kDa)或约4kDa至约6kDa(例如，约5kDa))。在一个实施方案中，亲水部分是PEG，并且重量平均分子量是约1kDa至约21kDa(例如，约1kDa至约8kDa、约1kDa至约3kDa(例如，约2kDa)或约2kDa至约6kDa(例如，约3.5kDa)或约4kDa至约6kDa(例如，约5kDa))。在一个实施方案中，亲水部分是PVA，并且重量平均分子量是约1kDa至约21kDa(例如，约1kDa至约8kDa、约1kDa至约3kDa(例如，约2kDa)或约2kDa至约6kDa(例如，约3.5kDa)或约4kDa至约6kDa(例如，约5kDa))。在一个实施方案中，亲水部分是聚噁唑啉，并且重量平均分子量是约1kDa至约21kDa(例如，约1kDa至约8kDa、约1kDa至约3kDa(例如，约2kDa)或约2kDa至约6kDa(例如，约3.5kDa)或约4kDa至约6kDa(例如，约5kDa))。在一个实施方案中，亲水部分是聚乙烯吡咯烷，并且重量平均分子量是约1kDa至约21kDa(例如，约1kDa至约8kDa、约1kDa至约3kDa(例如，约2kDa)或约2kDa至约6kDa(例如，约3.5kDa)或约4kDa至约6kDa(例如，约5kDa))。在一个实施方案中，亲水部分是聚羟丙基甲基丙烯酰胺，并且重量平均分子量是约1kDa至约21kDa(例如，约1kDa至约8kDa、约1kDa至约3kDa(例如，约2kDa)或约2kDa至约6kDa(例如，约3.5kDa)或约4kDa至约6kDa(例如，约5kDa))。在一个实施方案中，亲水部分是聚唾液酸，并且重量平均分子量是约1kDa至约21kDa(例如，约1kDa至约8kDa、约1kDa至约3kDa(例如，约2kDa)或约2kDa至约6kDa(例如，约3.5kDa)或约4kDa至约6kDa(例如，约5kDa))。
含有亲水部分和疏水部分的聚合物可以是嵌段共聚物，例如，二嵌段或三嵌段共聚物。在一些实施方案中，聚合物可以是含有亲水嵌段和疏水嵌段的二嵌段共聚物。在一些实施方案中，聚合物可以是含有疏水嵌段、亲水嵌段和另一疏水嵌段的三嵌段共聚物。两个疏水嵌段可以是相同疏水聚合物或不同疏水聚合物。本文使用的嵌段共聚物可以具有不同的亲水部分与疏水部分的比率，例如，范围为按重量计1∶1至1∶40(例如，按重量计约1∶1至约1∶10、按重量计约1∶1至约1∶2、或按重量计约1∶3至约1∶6)。
含有亲水部分和疏水部分的聚合物可以具有多个端基。在一些实施方案中，端基可以是羟基或烷氧基(例如，甲氧基)。在一些实施方案中，聚合物的端基未进一步修饰。在一些实施方案中，端基可以被进一步修饰。例如，端基可以被烷基封端以产生烷氧基封端的聚合物(例如，甲氧基封端的聚合物)、可以用靶向剂(例如，叶酸)或染料(例如，若丹明)衍生化或可以与官能团反应。
含有亲水部分和疏水部分的聚合物可以在共聚物的两个嵌段之间包括连接基。例如，这种连接基可以是酰胺、酯、醚、氨基、氨基甲酸酯或碳酸酯键。
本文描述的含有亲水部分和疏水部分的聚合物可以具有小于或等于约2.5(例如，小于或等于约2.2、小于或等于约2.0、或小于或等于约1.5)的聚合物多分散性指数(PDI)。在一些实施方案中，聚合物PDI是约1.0至约2.5，例如，约1.0至约2.0、约1.0至约1.8、约1.0至约1.7或约1.0至约1.6。
本文描述的粒子可以包括不同量的含有亲水部分和疏水部分的聚合物，例如，高达粒子的约50重量％(例如，约4重量％至约50重量％、约5重量％、约10重量％、约15重量％、约20重量％、约25重量％、约30重量％、约35重量％、约40重量％、约45重量％或约50重量％)。例如，粒子内的第二聚合物的重量百分比是约3％至30％、约5％至25％或约8％至23％。
本文描述的含有亲水部分和疏水部分的聚合物可以是可商购获得的或可以是合成的。合成聚合物的方法是本领域已知的(参见，例如，Polymer Synthesis：Theory and Practice Fundamentals，Methods，Experiments.D.Braun等.，第四版，Springer，Berlin，2005)。此类方法包括，例如，缩聚、自由基聚合、离子聚合(例如，阳离子或阴离子聚合)或开环易位聚合。可以通过分别合成两种聚合物单位并且然后使用既定方法缀合两个部分来制备嵌段共聚物。例如，可以使用偶合剂如EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐)来连接嵌段。缀合之后，两个嵌段可以经由酰胺、酯、醚、氨基、氨基甲酸酯或碳酸酯键连接。
在形成聚合物-试剂缀合物或并入本文描述的粒子或聚合物之前可以进一步纯化可商购获得的或合成的聚合物样品。在一些实施方案中，纯化可以去除可能导致不可过滤的聚合物样品的较低分子量聚合物。可以通过从溶液中沉淀或沉淀至固体(如硅藻土)上来纯化聚合物。还可以通过尺寸排阻色谱法(SEC)进一步纯化聚合物。
阳离子部分
供本文描述的粒子或缀合物中使用的示例性阳离子部分包括胺(包括例如，伯胺、仲胺、叔胺以及季胺)和聚胺(例如，支链和线性聚乙烯亚胺(PEI)或其衍生物如聚乙烯亚胺-PLGA、聚乙烯亚胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亚胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-triGAL)衍生物)。在一些实施方案中，阳离子部分包含阳离子脂质(例如，1-[2-(油酰基氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羟乙基)氯化咪唑啉鎓(DOTIM)、二甲基双十八烷基溴化铵、1，2二油基氧基丙基-3-三甲基溴化铵、DOTAP、1，2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(EDMPC)、乙基-PC、1，2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)、DC-胆固醇、以及MBOP、CLinDMA、1，2-二亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、pCLinDMA、eCLinDMA、DMOBA以及DMLBA)。在一些实施方案中，例如，其中阳离子部分是聚胺，所述聚胺包括聚氨基酸(例如，聚(赖氨酸)、聚(组氨酸)以及聚(精氨酸))和衍生物(例如，聚(赖氨酸)-PLGA、咪唑改性的聚(赖氨酸))或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在一些实施方案中，例如，其中阳离子部分是包含多个胺的阳离子聚合物，所述胺可以沿聚合物安置以使得胺隔开约4至约10埃(例如，约5至约8或约6至约7)。在一些实施方案中，胺可以沿聚合物安置以便与核酸试剂上的磷酸酯基对齐。
阳离子部分可以具有5或更大的pKa和/或可以在生理pH下带正电荷。
在一些实施方案中，阳离子部分包括至少一种胺(例如，伯胺、仲胺、叔胺或季胺)或多种胺，各自独立地为伯胺、仲胺、叔胺或季胺。在一些实施方案中，阳离子部分是例如具有一个或多个仲胺或叔胺的聚合物，例如阳离子聚乙烯醇(PVA)(例如，如由Kuraray所提供，如CM-318或C-506)、壳聚糖、聚胺支链和星形PEG以及聚乙烯亚胺的聚合物。阳离子PVA可以是例如通过聚合乙酸乙烯酯/N-乙烯基甲酰胺共聚物来制备，例如，如美国US2002/0189774中所描述，所述专利的内容以引用的方式并入本文。阳离子PVA的其它实例包括美国6,368,456和Fatehi(Carbohydrate Polymers79(2010)423-428)中描述者，所述文献的内容以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，阳离子部分包括含氮杂环或杂芳香族部分(例如，吡啶鎓基、咪唑鎓基、吗啉鎓基、哌嗪鎓基等)。在一些实施方案中，阳离子部分包含含氮杂环或杂芳香族部分，如聚乙烯吡咯烷或聚乙烯吡咯烷酮。
在一些实施方案中，阳离子部分包括胍阳离子部分(例如，精氨酸部分)。
在一些实施方案中，阳离子部分是表面活性剂，例如，阳离子PVA如本文描述的阳离子PVA。
其它示例性阳离子部分包括胍基丁胺、硫酸鱼精蛋白、海美溴铵、十六烷基三甲基溴化铵、1-己基三乙基-磷酸铵、1-十二烷基三乙基-磷酸铵、精胺(例如，精胺四盐酸盐)、亚精胺及其衍生物(例如，N1-PLGA-精胺、N1-PLGA-N5，N10，N14-三甲基化精胺、(N1-PLGA-N5，N10，N14，N14-四甲基化精胺)、PLGA-谷氨酸-二-三Cbz-精胺、三Cbz-精胺、amiphipole、PMAL-C8以及乙酰基-PLGA5050-谷氨酸-二(N1-氨基-N5，N10，N14-精胺)、聚甲基丙烯酸(2-二甲基氨基)乙酯)、己基癸基三甲基氯化铵、海美溴铵和去端肽胶原以及例如WO2005007854、US7,641,915以及WO2009055445中描述者，各案的内容以引用的方式并入本文。
在一个实施方案中，阳离子部分是在本文描述的粒子中的存在伴随粒子的外部存在少于50％、40％、30％、20％或10％(按重量计或数量计)的核酸试剂(例如，siRNA)的阳离子部分。
在一个实施方案中，阳离子部分不是脂质(例如，不是磷脂)或不包含脂质。
核酸试剂
可以使用本文所述的粒子、缀合物或组合物递送核酸试剂。合适的核酸试剂的实例包括但不限于：多核苷酸(如siRNA)、反义寡核苷酸、微RNA(miRNA)、miRNA拮抗剂、适体、基因组DNA、cDNA、mRNA以及质粒。核酸试剂可以靶向多个相关基因，如其过量表达与疾病或病症相关联的基因。
使用本文所述的聚合物-核酸试剂缀合物、粒子或组合物递送的核酸试剂可以单独或结合施用(例如，在同一或单独的制剂中施用)。在一个实施方案中，施用多种试剂如siRNA来靶向相同基因的不同位点，用于治疗疾病或病症。在另一个实施方案中，施用多种试剂例如siRNA来靶向两种或更多种不同的基因，用于治疗疾病或病症。
siRNA
适合于通过本文所述的聚合物核酸试剂缀合物、粒子或组合物递送的治疗性核酸可以是“短干扰RNA”或“siRNA”。本文使用的siRNA是指能够通过以序列特异性方式介导RNA干扰“RNAi”或基因沉默来抑制或下调基因表达或病毒复制的任何核酸分子。例如，siRNA可以是包含自身互补的有义和反义区的双链核酸分子，其中反义区包含与靶核酸分子或其一部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且有义区具有与靶核酸序列或其一部分对应的核苷酸序列。
在一个实施方案中，适合于使用本文所述的缀合物、粒子或组合物递送的治疗性siRNA分子以引起对靶基因表达的抑制的方式与靶基因的核苷酸序列相互作用。
siRNA包括一个双链结构，所述双链结构通常含有15-50个碱基对，例如19-25、19-23、21-25、21-23或24-29个碱基对，并且具有与细胞内的表达的靶基因或RNA一致或几乎一致的核苷酸序列。siRNA可以由两个退火的多核苷酸或形成发夹结构的单一多核苷酸构成。在一个实施方案中，治疗性siRNA以表达载体的形式提供，所述表达载体被封装在本文所述的缀合物、粒子或组合物中，其中所述载体具有在施用至受试者之后转录产生一个或多个产生siRNA的转录产物的编码序列。
siRNA可以由两个单独的寡核苷酸组装，其中一条链是有义链并且另一条链是反义链，其中反义链和有义链是自身互补的(即，每条链包含与另一条链中的核苷酸序列互补的核苷酸序列)；如其中反义链和有义链形成双链体或双链结构，例如其中双链区为约15至约30个碱基对，例如约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基对；反义链包括与靶核酸分子或其一部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且有义链包含与靶核酸序列或其一部分对应的核苷酸序列(例如，siRNA分子的约15至约25个或更多个核苷酸与靶核酸或其一部分互补)。或者，siRNA由单一寡核苷酸组装，其中siRNA的自身互补的有义和反义区借助于基于核酸或不基于核酸的连接基连接。
在某些实施方案中，siRNA分子的至少一条链具有长度为约1至约6个核苷酸(不过可以是2至4个核苷酸)的3′悬突。通常，3′悬突长度为1-3个核苷酸。在一些实施方案中，一条链具有3′悬突并且另一条链是平端的或者也具有悬突。对于每条链，悬突的长度可以相同或不同。为了进一步增强siRNA的稳定性，可以稳定3′悬突以免降解。
siRNA具有与靶RNA显著的序列相似性，这样使得siRNA可以与靶RNA配对并且通过RNA干扰机制使靶RNA发生序列特异性降解。任选地，siRNA分子包括3′羟基。在一个实施方案中，RNA通过包括嘌呤核苷酸，如腺苷或鸟苷核苷酸而稳定。或者，通过修饰的类似物取代嘧啶核苷酸，例如用2′-脱氧胸苷取代尿苷核苷酸3′悬突是可以容忍的并且不影响RNAi的功效。不存在2′-羟基显著增强了组织培养基中悬突的核酸酶耐受性并且在活体内可能是有益的。
siRNA可以是具有双链体、不对称双链体、发夹或不对称发夹二级结构的多核苷酸，其具有自身互补的有义和反义区，其中反义区包含与单独的靶核酸分子或其一部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且有义区具有与靶核酸序列或其一部分对应的核苷酸序列。siRNA可以是具有两个或更多个环结构以及一个主干的环形单链多核苷酸，所述主干包含自身互补的有义和反义区，其中反义区包括与靶核酸分子或其一部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且有义区具有与靶核酸序列或其一部分对应的核苷酸序列，并且其中环形多核苷酸可以在活体内或活体外处理产生能够介导RNAi的活性siRNA分子。
siRNA还可以包括一个单链多核苷酸，所述单链多核苷酸具有与靶核酸分子或其一部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列(例如，其中所述siRNA分子不需要在siRNA分子内存在与靶核酸序列或其一部分对应的核苷酸序列)，其中单链多核苷酸可以进一步包括末端磷酸基，如5′-磷酸(参见，例如Martinez等，2002，Cell.，110，563-574以及Schwarz等，2002，Molecular Cell，10，537-568)或5′，3′-二磷酸。在某些实施方案中，本发明的siRNA分子包含分开的有义和反义序列或区，其中有义和反义区通过如本领域已知的核苷酸或非核苷酸连接基共价连接，或者可替代地通过离子相互作用、氢键合、范德华相互作用、疏水性相互作用和/或堆积相互作用非共价连接。
siRNA仅需要与具有介导RNAi的能力的天然RNA足够相似。因此，siRNA可以容忍预期可能由于基因突变、应变多态性和进化趋异性导致的序列变异。靶序列与RNAi构建体序列之间可以容忍的核苷酸错配的数量不多于5个碱基对中错配1个，或10个碱基对中错配1个，或20个碱基对中错配1个，或50个碱基对中错配1个。在一些实施方案中，试剂包含在评估窗口上与长度在15-29个核苷酸之间的靶转录物，如长度为至少约15个核苷酸、至少约17个核苷酸或至少约18或19个至约21-23或24-29个核苷酸的序列具有至少约70％，例如至少约80％、84％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％精确序列互补性的链。换句话说，在长度约为19-25个核苷酸的siRNA中，具有不多于约4个错配的siRNA通常是可以容忍的，如具有不多于3个错配、2个错配、和或1个错配的siRNA。
在siRNA双链体中心的错配是较不能容忍的，并且可能基本上消除对靶RNA的裂解。相比之下，siRNA的3′核苷酸(例如，siRNA反义链的3′核苷酸)通常对靶标识别的特异性不起显著作用。具体而言，与靶RNA互补的siRNA序列(例如引导序列)的3′残基通常对靶RNA裂解不那么关键。
适合于通过本文所述的缀合物、粒子或组合物递送的siRNA可以在功能上界定为包括能够与靶基因转录物的一部分杂交(例如，400mM NaCl、40mM PIPES pH6.4、1mM EDTA，50℃或70℃杂交12-16小时；随后洗涤)的核苷酸序列(或寡核苷酸序列)。另外优选的杂交条件包括：在70℃下于1xSSC中或在50℃下于1xSSC、50％甲酰胺中杂交，随后在70℃下于0.3xSSC中洗涤；或在70℃下于4xSSC中或在50℃下于4xSSC、50％甲酰胺中杂交，随后在67℃下于1xSSC中洗涤。预计长度小于50个碱基对的杂交体的杂交温度应比杂交体的解链温度(Tm)低5℃-10℃，其中Tm根据以下等式进行确定。对于长度小于18个碱基对的杂交体，Tm(℃)＝2(A+T碱基的数量)+4(G+C碱基的数量)。对于长度在18与49个碱基对之间的杂交体，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)(600/N)，其中N是杂交体中的碱基数量，并且[Na+]是杂交缓冲剂中的钠离子浓度(1xSSC中[Na+]＝0.165M)。用于多核苷酸杂交的严谨性条件的另外的实例提供在Sambrook，J.等，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，第9和11章，以及Current Protocols in Molecular Biology，1995，F.M.Ausubel等，编著，John Wiley&Sons，Inc.，第2.10以及6.3-6.4节中，其内容以引用的方式并入本文。一致的核苷酸序列的长度可为至少约10、12、15、17、20、22、25、27、30、32、35、37、40、42、45、47或50个碱基。
本文使用的siRNA分子不必局限于仅含有RNA的那些分子，而是可以进一步涵盖化学修饰的核苷酸和非核苷酸。在某些实施方案中，治疗性siRNA缺乏含有2′-羟基(2′-OH)的核苷酸。在某些实施方案中，治疗性siRNA不要求存在具有用于介导RNAi的2′-羟基的核苷酸，并且同样地，siRNA将不包括任何核糖核苷酸(例如，具有2′-OH基团的核苷酸)。然而，不要求存在核糖核苷酸来支持RNAi的这类siRNA分子可以具有连接的一个或多个连接基或其它连接或缔合的基团、部分或含有一个或多个具有2′-OH基团的部分的链。任选地，siRNA分子可以在约5％、10％、20％、30％、40％或50％的核苷酸位置上包括核糖核苷酸。
其它有用的治疗性siRNA寡核苷酸可以具有硫代磷酸酯主链以及具有杂原子的寡核苷，并且具体而言是如美国专利号5,489,677中教导的CH2NHOCH2、CH2N(CH3)OCH2、CH2ON(CH3)CH2、CH2N(CH3)N(CH3)CH2以及ON(CH3)CH2CH2(其中天然磷酸二酯主链表示为OPOCH2)，以及在美国专利号5,602,240中公开的酰胺主链。
取代的糖部分也可以包括在修饰的寡核苷酸中。用于通过本文所述的缀合物、粒子或组合物递送的治疗性反义寡核苷酸可以在2′位置包括以下中的一个或多个：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基以及炔基可以是取代的或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。有用的修饰还可以包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2以及O(CH2)nON[(C2)nCH3]2，其中n和m是1至约10。此外，寡核苷酸可以在2′位置包括以下中的一个：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基团、报道基团、嵌插剂、用于改善寡核苷酸的药代动力学或药效学特性的基团，以及具有类似特性的其它取代基。其它有用的修饰包括烷氧基烷氧基，例如2′-甲氧基乙氧基(2′-OCH2CH2OCH3)、二甲基氨氧基乙氧基(2′-O(CH2)2ON(CH3)2)或二甲基氨基-乙氧基乙氧基(2′-OCH2OCH2N(CH2)2)。其它修饰可以包括2′-甲氧基(2′-OCH3)、2′-氨基丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)或2′-氟(2′-F)。类似的修饰还可以在寡核苷酸内的其它位置，如3′末端核苷酸上的或2′-5′连接寡核苷酸中的糖的3′位置，以及5′末端核苷酸的5′位置处进行。寡核苷酸还可以具有如环丁基部分等糖模拟物来替换戊呋喃糖基。教导了这类取代的糖部分的制备的参考文献包括美国专利号4,981,957和5,359,044。
用本文所述的缀合物、粒子或组合物配制的siRNA可以包括天然存在的核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷以及脱氧胞苷)、核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、C5-丙炔基胞苷、C5-丙炔基尿苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-甲基胞苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代腺苷、O(6)-甲基鸟苷以及2-硫代胞苷)、化学修饰的碱基、生物修饰的碱基(例如甲基化碱基)、嵌插的碱基、修饰的糖(例如，2′-氟核糖、核糖、2′-脱氧核糖、阿拉伯糖以及己糖)。合适的修饰的核苷碱基包括其它合成的或天然的核苷碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-甲基-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-氢硫基、8-硫烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代，特别是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其它有用的核苷碱基包括例如在美国专利号3,687,808中公开者。
用于并入本文所述的聚合物-核酸试剂缀合物、粒子或组合物中的治疗性siRNA可以化学合成或从较长的双链RNA或发夹RNA得到。可以酶促方式或通过部分/完全有机合成来产生siRNA，并且可以通过活体外酶促或有机合成来引入任何修饰的核糖核苷酸。至少部分由RNA构成的单链物质可以充当siRNA反义链或可以从质粒载体表达。
“RNA干扰”或“RNAi”意思是通常如本领域已知的并且由短干扰核酸分子介导的抑制或下调细胞中的基因表达的过程。此外，本文使用的术语RNAi意思等同于用来描述序列特异性RNA干扰，如转录后基因沉默、翻译抑制、转录抑制或表观遗传的其它术语。例如，适合于通过本文所述的缀合物、粒子或组合物递送的治疗性siRNA分子可以在转录后水平或转录前水平下表观遗传地使基因沉默。在一个非限制性实例中，本发明的siRNA分子对基因表达的表观遗传调控可以由对染色质结构或甲基化型态的siRNA介导的修饰，从而改变基因表达而引起。在另一个非限制性实例中，如本领域所已知，siRNA分子对基因表达的调控可以由经由RISC对RNA(编码的或非编码的RNA)的siRNA介导的裂解，或者可替代地翻译抑制引起。在另一个实施方案中，本发明的siRNA分子对基因表达的调控可以由转录抑制引起。RNAi还包括由微RNA或充当微RNA的siRNA引起的翻译阻抑。RNA干扰可以通过引入小干扰RNA(siRNA)或在细胞内产生siRNA(例如，从质粒或转基因)而启动，以使一个或多个靶基因的表达沉默。或者，RNAi在细胞中天然存在以除去外来RNA(例如，病毒RNA)。天然RNAi经由前体dsRNA的切片机引导的断裂而进行，所述断裂引导得到其它同源RNA序列的降解机制。
本文使用的术语siRNA意思等同于用来描述能够介导序列特异性RNAi的核酸分子的其它术语，并且包括例如，短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡核苷酸、短干扰核酸、短干扰修饰寡核苷酸、化学修饰的siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)以及其它。
miRNA
在一个实施方案中，适合于通过本文所述的聚合物-核酸试剂缀合物、粒子或组合物递送的治疗性核酸可以是微RNA(miRNA)。“微RNA”或“miRNA”是指通过mRNA裂解、翻译阻抑/抑制或异染色质沉默调节靶信使RNA的表达的小双链RNA(参见例如Ambros，2004，Nature，431，350-355；Bartel，2004，Cell，116，281-297；Cullen，2004，Virus Research.，102，3-9；He等，2004，Nat.Rev.Genet.，5，522-531；以及Ying等，2004，Gene，342，25-28)。微RNA(miRNA)是小的非编码多核苷酸，长约22个核苷酸，所述多核苷酸引导其mRNA靶标的破坏或翻译阻抑。
在一个实施方案中，治疗性微RNA在miRNA分子的有义链或有义区与反义链或反义区之间，或在miRNA的反义链或反义区与对应的靶核酸分子之间具有部分互补性(即，小于100％的互补性)。例如，部分互补性可以包括在双链核酸分子内的各种错配或非碱基配对核苷酸(例如，1、2、3、4、5个或更多个错配或非碱基配对核苷酸，如核苷酸凸起)，这是可以导致在miRNA的有义链或有义区与反义链或反义区之间，或在miRNA的反义链或反义区与对应的靶核酸分子之间产生凸起、环或悬突的结构。经由微RNA翻译阻抑路径起作用的试剂在与靶标形成的双链体中含有至少一个凸起和/或错配。在某些实施方案中，出于确定RNAi试剂是否靶向转录物的目的，不认为由引导链和靶转录物形成的双链体中的GU或UG碱基对是错配。
在一个实施方案中，适合于通过本文所述的聚合物-核酸试剂缀合物、粒子或组合物递送的治疗性核酸是miRNA拮抗剂，所述miRNA拮抗剂是能够例如通过促进互补miRNA的降解而抑制互补miRNA的经过化学修饰的寡核苷酸(参见，例如Krutzfeldt等，Nature，438：685-689，2005)。
反义寡核苷酸
治疗性“反义寡核苷酸”适合于经由本文所述的聚合物-核酸试剂缀合物、粒子或组合物来递送。术语“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其类似物的寡聚物或聚合物。此术语包括由天然存在的核苷碱基、糖和共价核苷间(主链)键构成的寡核苷酸，以及具有起相似作用的非天然存在的部分的寡核苷酸。由于所希望的特性，例如增强的细胞摄入、增强的对核酸靶标的亲和力以及在核酸酶的存在下增加的稳定性，这类修饰的或置换的寡核苷酸通常比天然形式优选。
治疗性反义寡核苷酸的长度通常为约10至约50个核苷酸(例如，长度为12至40、14至30或15至25个核苷酸)。特别有用的是长度为15至23个核苷酸的反义寡核苷酸。然而，应理解，含有甚至少于10个核苷酸的反义核苷酸(例如，优选的反义核苷酸之一的一部分)包括在本发明之内，只要它展示出所希望的抑制靶基因的表达的活性即可。
反义寡核苷酸可以基本上由与靶核酸中的可接近区特异性杂交的核苷酸序列组成。然而，这类反义寡核苷酸可以在任一端含有5至10个核苷酸的另外的侧接序列。侧接序列可以包括，例如靶核酸的其它序列、与扩增引物互补的序列，或与限制性酶位点对应的序列。
为获得最大有效性，可以将另外的准则应用于反义寡核苷酸的设计。这类准则是本领域所熟知的，并且在例如寡核苷酸引物的设计中广泛使用。这些准则包括缺乏潜在反义寡核苷酸的预测二级结构、适当的G和C核苷酸含量(例如约50％)，以及不存在序列基元如单核苷酸重复(例如GGGG序列)。
虽然反义寡核苷酸是反义化合物的一种优选形式，但是本发明包括其它寡聚物反义化合物，包括但不限于如以下描述的那些寡核苷酸类似物。如本领域所已知，核苷是碱基-糖组合，其中碱基部分通常是杂环碱基。这类杂环碱基的两种最常见的类别是嘌呤和嘧啶。核苷酸是进一步包括共价连接至核苷的糖部分的磷酸基的核苷。对于包括戊呋喃糖基糖的那些核苷，磷酸基可以连接至糖的2′、3′或5′羟基部分。在形成寡核苷酸时，磷酸基彼此共价连接相邻的核苷以形成线性聚合物分子。此线性聚合物分子的各别末端可以进一步接合形成环形分子，不过线性分子一般是优选的。在寡核苷酸分子之内，磷酸基通常被称为形成寡核苷酸的核苷间主链。RNA和DNA的正常的键或主链是3′至5′磷酸二酯键。
适合于通过本文所述的聚合物-核酸试剂缀合物、粒子或组合物递送的治疗性反义寡核苷酸包括含有修饰的主链或非天然核苷间键的寡核苷酸。如本文所定义，具有修饰的主链的寡核苷酸包括在主链中具有磷原子的那些寡核苷酸和在主链中不具有磷原子的那些寡核苷酸。出于本说明书的目的，以及如有时本领域所提及，在它们的核苷间主链中不具有磷原子的修饰的寡核苷酸也可以认为是寡核苷酸。
修饰的寡核苷酸主链可以包括，例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(例如，3′-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、磷酰胺酯(例如，3′-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯)、硫羰基磷酰胺酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯，以及具有正常3′-5′键以及其2′-5′连接类似物的硼烷磷酸酯，以及具有其中相邻成对的核苷单元是3′-5′至5′-3′或2′-5′至5′-2′连接的反转极性的那些主链。还可以包括各种盐、混合盐以及游离酸形式。教导了这类修饰的主链寡核苷酸的制备的参考文献提供在例如美国专利号4,469,863和5,750,666中。
具有其中不包括磷原子的修饰的寡核苷酸主链的治疗性反义分子可以具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键，或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的主链。它们包括具有吗啉基键的主链(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰乙酰和硫代甲酰乙酰；亚甲基甲酰乙酰和硫代甲酰乙酰主链；含亚烷基主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；以及具有混合的N、O、S和CH2组成部分的其它主链。教导了这类修饰的主链寡核苷酸的制备的参考文献提供在例如美国专利号5,235,033和5,596,086中。
在另一个实施方案中，治疗性反义化合物是寡核苷酸类似物，其中核苷酸单元的糖和核苷间键(即主链)均置换为新型基团，而保持碱基单元与适当的核酸靶标的杂交。已经显示出具有优良杂交特性的这样一种寡核苷酸类似物被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖主链置换为含酰胺的主链(例如，氨基乙基甘氨酸主链)。核苷碱基被保留并且直接或间接结合至主链的酰胺部分的氮杂氮原子。教导了这类修饰的主链寡核苷酸的制备的参考文献提供在例如Nielsen等，Science254：1497-1500(1991)以及美国专利号5,539,082中。
其它有用的治疗性反义寡核苷酸可以具有硫代磷酸酯主链以及具有杂原子的寡核苷酸主链，并且具体是如美国专利号5,489,677中所教导的CH2NHOCH2、CH2N(CH3)OCH2、CH2ON(CH3)CH2、CH2N(CH3)N(CH3)CH2以及ON(CH3)CH2CH2(其中天然磷酸二酯主链表示为OPOCH2)，以及在美国专利号5,602,240中公开的酰胺主链。
取代的糖部分还可以包括在修饰的寡核苷酸中。用于通过本文所述的聚合物-核酸试剂缀合物、粒子或组合物递送的治疗性反义寡核苷酸可以在2′位置包括以下中的一个或多个：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基以及炔基可以是取代的或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。有用的修饰还可以包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2以及O(CH2)nON[(C2)nCH3]2，其中n和m是1至约10。此外，寡核苷酸可以在2′位置包括以下中的一个：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基团、报道基团、嵌插剂、用于改善寡核苷酸的药代动力学或药效学特性的基团，以及具有类似特性的其它取代基。其它有用的修饰包括烷氧基烷氧基，例如2′-甲氧基乙氧基(2′-OCH2CH2OCH3)、二甲基氨氧基乙氧基(2′-O(CH2)2ON(CH3)2)，或二甲基氨基-乙氧基乙氧基(2′-OCH2OCH2N(CH2)2)。其它修饰可以包括2′-甲氧基(2′-OCH3)、2′-氨基丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)或2′-氟(2′-F)。类似的修饰还可以在寡核苷酸内的其它位置，如3′末端核苷酸上的或2′-5′连接寡核苷酸中的糖的3′位置，以及5′末端核苷酸的5′位置上进行。寡核苷酸还可以具有如环丁基部分等糖模拟物来替换戊呋喃糖基。教导了这类取代的糖部分的制备的参考文献包括美国专利号4,981,957和5,359,044。
治疗性反义寡核苷酸还可以包括核苷碱基修饰或取代。本文使用的“未修饰的”或“天然的”核苷碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)以及尿嘧啶(U)。修饰的核苷碱基可以包括其它合成的或天然的核苷碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-甲基-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-氢硫基、8-硫烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代，特别是5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其它有用的核苷碱基包括例如在美国专利号3,687,808中公开者。
某些核苷碱基取代可对增加本发明的反义寡核苷酸的结合亲和力特别有用。例如，已经显示5-甲基胞嘧啶取代使核酸双链体稳定性增加0.6℃至1.2℃。(Sanghvi等，编著，Antisense Research andApplications，第276-278页，CRC Press，Boca Raton，Fla.(1993))。其它有用的核苷碱基取代包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，如2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。
没有必要将指定的反义寡核苷酸中的所有核苷碱基位置统一修饰。可以将以上提及的修饰中的多于一种并入单一寡核苷酸中或甚至并入在寡核苷酸内的单一核苷处。适合于通过本文所述的缀合物、粒子或组合物递送的治疗性核酸还包括作为嵌合寡核苷酸的反义寡核苷酸。“嵌合”反义寡核苷酸可以含有两个或更多个化学上相异的区，所述区各自由至少一个单体单元(例如，在寡核苷酸的情况下为核苷酸)构成。嵌合寡核苷酸通常含有至少一个这样的区：其中寡核苷酸被修饰以便赋予例如增加的对核酸酶降解的抗性、增加的细胞摄入，和/或增加的对靶核酸的亲和力。例如，嵌合寡核苷酸的区可以充当如RNA酶H等酶的底物，所述RNA酶H能够裂解如在靶mRNA与反义寡核苷酸之间形成的RNA∶DNA双链体的RNA链。因此，通过RNA酶H裂解这样的双链体可以大大增强反义寡核苷酸的有效性。
治疗性反义寡核苷酸可以在活体外合成。根据本发明使用的反义寡核苷酸可以通过已知的方法，例如通过固相合成来方便地合成。还可以使用相似的技术来制备修饰的寡核苷酸，如硫代磷酸酯或烷基化衍生物。
反义多核苷酸包括与基因或mRNA互补的序列。反义多核苷酸包括但不限于：吗啉基、2′-O-甲基多核苷酸、DNA、RNA等等。基于多核苷酸的表达抑制剂可以在活体外聚合、是重组体、含有嵌合序列或这些组的衍生物。基于多核苷酸的表达抑制剂可以含有核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、合成核苷酸，或任何合适的组合，以使得靶RNA和/或基因被抑制。
本文使用的术语“杂交”意思是互补核苷或核苷酸碱基之间的氢键合，所述氢键合可以是Watson-Crick、Hoogsteen或反转的Hoogsteen氢键合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶，以及鸟嘌呤和胞嘧啶分别是通过形成氢键而配对的互补核苷碱基(通常在本领域中简称为“碱基”)。本文使用的“互补”是指在两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果寡核苷酸的某一位置处的核苷酸能够与靶核酸分子中的核苷酸氢键合，则认为寡核苷酸与靶核酸在那一位置彼此互补。当每个分子中足够数量的对应位置被可以与彼此氢键合的核苷酸占据时，寡核苷酸与靶核酸彼此互补。因此，“可特异性杂交”用来表示足够程度的互补性或精确配对，以使得在寡核苷酸与靶核酸之间发生稳定且特异性的结合。
在本领域中应理解，反义寡核苷酸的序列不需要与它的可特异性杂交的靶核酸的序列100％互补。当(a)寡核苷酸与靶核酸的结合干扰了靶核酸的正常功能，并且(b)在其中希望特异性结合的条件下，即，在其中进行活体外测定的条件下或在用于活体外测定或治疗用途的生理条件下存在足够的互补性以避免反义寡核苷酸与非靶序列的非特异性结合时，反义寡核苷酸是可特异性杂交的。
活体外严谨性条件取决于温度、时间以及盐浓度(参见，例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，NY(1989))。通常来说，高至中等严谨性条件用于活体外特异性杂交中，以使得杂交发生在大致上相似的核酸之间，而不发生在不相似的核酸之间。特异性杂交条件是在40℃下于5x SSC(0.75M氯化钠/0.075M柠檬酸钠)中杂交1小时，随后在40℃下于1xSSC中洗涤10次以及在室温下于1xSSC中洗涤5次。
活体内杂交条件由支配反义寡核苷酸与靶序列的杂交的细胞内条件(例如，生理pH和细胞内离子条件)组成。通过相对低的严谨性条件可以在活体外模仿活体内条件。例如，可以在活体外在37℃下于2xSSC(0.3M氯化钠/0.03M柠檬酸钠)、0.1％SDS中实施杂交。可以在37℃下使用含有4xSSC、0.1％SDS的洗涤溶液，最后在45℃下于1xSSC中洗涤。
反义分子与其靶核酸的特异性杂交可以干扰靶核酸的正常功能。对于靶DNA核酸，反义技术可以破坏复制和转录。对于靶RNA核酸，反义技术可以破坏例如RNA至蛋白质翻译位点的移位、蛋白质自RNA的翻译、用于产生一个或多个mRNA物质的RNA的拼接，以及RNA的催化活性。在编码靶基因的核酸的情况中，这种对靶核酸功能的干扰的整体效果是抑制靶基因的表达。在本发明的背景下，“抑制靶基因的表达”意思是破坏靶核酸序列的转录和/或翻译，从而导致靶多肽的水平降低或使靶多肽完全不存在。
反义寡核苷酸，例如siRNA的反义链可被优选地引导至靶核酸分子内的特定靶标。靶向方法包括鉴别靶核酸分子内的一个或多个位点，在所述位点可以发生反义相互作用，以使得将产生所希望的效果，例如抑制靶基因表达。传统上，用于反义寡核苷酸的优选靶位点包括涵盖基因的开放阅读框(ORF)的翻译起始或终止密码子的区。此外，ORF已经在反义技术中有效靶向，5′和3′非翻译区同样如此。另外，反义寡核苷酸已被成功地引导至内含子区和内含子-外显子接合区。
然而，对靶核酸的序列和结构域结构(例如，翻译起始密码子、外显子或内含子的位置)的简单认识通常不足以确保引导至特定区的反义寡核苷酸将有效地结合靶核酸并且抑制靶核酸的转录和/或翻译。在其天然状态下，mRNA分子被折叠成复杂的二级和三级结构，并且在这类结构的内部的序列难以接近反义寡核苷酸。为获得最大有效性，可将反义寡核苷酸引导至最可接近的靶mRNA的区，即在或靠近折叠的mRNA分子的表面的区。mRNA分子的可接近区可以通过本领域已知的方法，包括使用RiboTAGTM或mRNA可接近位点标记(MAST)技术来鉴别。RiboTAGTM技术公开于PCT申请号SE01/02054中。
一旦鉴别出一个或多个靶位点，就可以合成与靶标足够互补的反义寡核苷酸(即以足够的强度和特异性杂交以得到所希望的效果)。通过使用例如RNA印迹法、RT-PCR、蛋白质印迹法、ELISA或免疫组织化学染色法测量靶mRNA或蛋白质的水平可以评估反义寡核苷酸抑制靶核酸的表达的有效性。
在一些实施方案中，可能有用的是靶向一个靶核酸的多个可接近区。在这类实施方案中，可以使用各自特异性杂交不同的可接近区的多个反义寡核苷酸。多个反义寡核苷酸可以一起或循序使用。在一些实施方案中，可能有用的是靶向多个靶核酸的多个可接近区。
适体
适合于通过本文所述的聚合物-核酸试剂缀合物、粒子或组合物递送的治疗性核酸可以是适体(还叫做核酸配体或核酸适体)，所述适体是特异性结合靶分子的多肽，其中核酸分子具有与由靶分子在其天然环境中识别的序列不同的序列。或者，适体可以是结合靶分子的核酸分子，其中靶分子不天然结合核酸。靶分子可以是任何相关分子。靶分子可以是例如多肽、碳水化合物、核酸分子或细胞。适体的靶标是结合所述适体的三维化学结构。例如，靶向核酸(例如RNA或DNA)的适体可以包括经由互补性Watson-Crick碱基配对结合被如发夹环等其它结构中断的核酸靶标的区。在另一个实施方案中，适体结合靶蛋白的配体结合结构域，从而阻止天然存在的配体与靶蛋白的相互作用。
在一个实施方案中，适体结合处于特定的发育阶段或特定的疾病病况的细胞或组织。靶标是细胞表面上的抗原，如细胞表面受体、整合素、跨膜蛋白、离子通道或膜转运蛋白。在一个实施方案中，靶标是肿瘤标志物。肿瘤标记物可以是存在于肿瘤中、在正常组织中不存在的抗原，或是在肿瘤中比在正常组织中更普遍的抗原。
形成核酸配体的核酸可以由以下构成：天然存在的核苷、修饰的核苷、具有在一个或多个核苷之间插入的烃连接基(例如亚烷基)或聚醚连接基(例如PEG连接基)的天然存在的核苷、具有在一个或多个核苷之间插入的烃或PEG连接基的修饰的核苷或其组合。在一个实施方案中，核酸配体的核苷酸或修饰的核苷酸可以置换为烃连接基或聚醚连接基，其条件是取代大致上不降低核酸配体的结合亲和力和选择性(例如，适体对靶标的解离常数通常不大于约1x10-6M)。
可以通过任何方法，如通过指数富集的配体系统进化(SELEX)来制备适体。用于获得核酸配体的SELEX方法描述于美国专利号5,567,588中，其整个教义以引用的方式并入本文。
在本文所述的粒子内，核酸试剂可以连接至另一部分，如上文描述的聚合物、本文所述的阳离子部分或亲水聚合物如PEG。核酸试剂还可以是“游离”的，这意味着不连接至另一部分。在粒子包括多个核酸试剂的情况下，核酸试剂中的一些可以连接至另一部分而一些可以是游离的。例如，在某些实施方案中，粒子中的核酸试剂连接至粒子的聚合物。核酸试剂可以连接至粒子中的任何聚合物，例如疏水聚合物或含有亲水和疏水部分的聚合物。
在某些实施方案中，核酸在粒子中是“游离”的。核酸试剂可以通过一种或多种非共价相互作用，如范德华相互作用、疏水相互作用、氢键合、偶极-偶极相互作用、离子相互作用以及π堆积来与粒子的聚合物或其它组分缔合。
核酸试剂可以按照本文所述的聚合物-核酸试剂缀合物、粒子或组合物的不同量存在。当存在于粒子中时，核酸试剂可以按照粒子的约0.1重量％至50重量％的量存在(例如，粒子的约1重量％至约50重量％、约1重量％至约30重量％、粒子的约1重量％至约20重量％、粒子的约4重量％至约25重量％，或粒子的约5重量％至约13重量％、14重量％、15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％或20重量％)。
另外的组分
在一些实施方案中，粒子进一步包含一种表面活性剂或多种表面活性剂的混合物。在一些实施方案中，表面活性剂是PEG、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、泊洛沙姆、己基癸基三甲基氯化铵、聚山梨醇酯、聚氧乙烯酯、PEG-脂质(例如，PEG-脑酰胺、d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯)、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-[磷酸基-rac-(1-甘油)]、卵磷脂或其混合物。在一些实施方案中，表面活性剂是PVA并且PVA为约3kDa至约50kDa(例如，约5kDa至约45kDa、约7kDa至约42kDa、约9kDa至约30kDa，或约11kDa至约28kDa)，并且多达约98％是水解了的(例如，约75％-95％、约80％-90％是水解了的，或约85％是水解了的)。在一些实施方案中，PVA的粘度为约2至约27cP。在一些实施方案中，PVA是阳离子PVA，例如如上文所述，例如像阳离子PVA的阳离子部分也可以充当表面活性剂。在一些实施方案中，表面活性剂是聚山梨醇酯80。在一些实施方案中，表面活性剂是HS15。在一些实施方案中，表面活性剂不是脂质(例如磷脂)或不包含脂质。在一些实施方案中，表面活性剂以粒子的多达约35重量％的量存在(例如，多达20重量％或多达25重量％、约15重量％至约35重量％、约20重量％至约30重量％，或约23重量％至约26重量％)。
在一些实施方案中，粒子与赋形剂(例如，碳水化合物组分)或稳定剂或冻干保护剂(例如本文所述的碳水化合物组分、稳定剂或冻干保护剂)缔合。然而不希望受理论的束缚，碳水化合物组分可以充当稳定剂或冻干保护剂。在一些实施方案中，碳水化合物组分、稳定剂或冻干保护剂包括一种或多种糖、糖醇、碳水化合物(例如，蔗糖、甘露糖醇、环糊精或环糊精的衍生物(例如2-羟丙基-β-环糊精，在本文中有时也称为HP-β-CD、或磺丁基-CD，在本文中有时称为CYTOSOL))、盐、PEG、PVP或冠醚。在一些实施方案中，碳水化合物组分、稳定剂或冻干保护剂包括两种或更多种碳水化合物，例如本文所述的两种或更多种碳水化合物。在一个实施方案中，碳水化合物组分、稳定剂或冻干保护剂包括环状碳水化合物(例如，环糊精或环糊精的衍生物，例如，α-、β-或γ-环糊精(例如，2-羟丙基-β-环糊精))和非环状碳水化合物。示例性的非环状寡糖包括具有少于10、8、6或4个单糖亚基的那些寡糖(例如，单糖或二糖(例如蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖)或其组合)。在一些实施方案中，冻干保护剂是单糖，如糖醇(例如甘露糖醇)。
在一个实施方案中，碳水化合物组分、稳定剂或冻干保护剂包含第一和第二组分，例如环状碳水化合物和非环状碳水化合物，例如单、二或四糖。
在一个实施方案中，同粒子缔合的环状碳水化合物与非环状碳水化合物的重量比是本文所述的重量比，例如0.5∶1.5至1.5∶0.5。
在一个实施方案中，碳水化合物组分、稳定剂或冻干保护剂包含第一和第二组分(此处特指为A和B)，如下：
(A)包含环状碳水化合物并且(B)包含二糖；
(A)包含多于一种环状碳水化合物，例如β-环糊精(在本文中有时称为β-CD)或β-CD衍生物，例如HP-β-CD，并且(B)包含二糖；
(A)包含环状碳水化合物，例如β-CD或β-CD衍生物，例如HP-β-CD，并且(B)包含多于一种二糖；
(A)包含多于一种环状碳水化合物，并且(B)包含多于一种二糖；
(A)包含环糊精，例如β-CD或β-CD衍生物，例如HP-β-CD，并且(B)包含二糖；
(A)包含β-环糊精，例如β-CD衍生物，例如HP-β-CD，并且(B)包含二糖；
(A)包含β-环糊精，例如β-CD衍生物，例如HP-β-CD，并且(B)包含蔗糖；
(A)包含β-CD衍生物，例如HP-β-CD，并且(B)包含蔗糖；
(A)包含β-环糊精，例如β-CD衍生物，例如HP-β-CD，并且(B)包含海藻糖；
(A)包含β-环糊精，例如β-CD衍生物，例如HP-β-CD，并且(B)包含蔗糖和海藻糖；
(A)包含HP-β-CD，并且(B)包含蔗糖和海藻糖。
在一个实施方案中，组分A和B以以下比率存在：0.5∶1.5至1.5∶0.5。在一个实施方案中，组分A和B以以下比率存在：3-1∶0.4-2；3-1∶0.4-2.5；3-1∶0.4-2；3-1∶0.5-1.5；3-1∶0.5-1；3-1∶1；3-1∶0.6-0.9；以及3∶1∶0.7。在一个实施方案中，组分A和B以以下比率存在：2-1∶0.4-2；3-1∶0.4-2.5；2-1∶0.4-2；2-1∶0.5-1.5；2-1∶0.5-1；2-1∶1；2-1∶0.6-0.9；以及2∶1∶0.7。在一个实施方案中，组分A和B以以下比率存在：2-1.5∶0.4-2；2-1.5∶0.4-2.5；2-1.5∶0.4-2；2-1.5∶0.5-1.5；2-1.5∶0.5-1；2-1.5∶1；2-1.5∶0.6-0.9；2∶1.5∶0.7。在一个实施方案中，组分A和B以以下比率存在：2.5-1.5∶0.5-1.5；2.2-1.6∶0.7-1.3；2.0-1.7∶0.8-1.2；1.8∶1；1.85∶1以及1.9∶1。
在一个实施方案中，组分A包含环糊精，例如β-环糊精，例如β-CD衍生物，例如HP-β-CD，并且(B)包含蔗糖，并且它们以以下比率存在：2.5-1.5∶0.5-1.5；2.2-1.6∶0.7-1.3；2.0-1.7∶0.8-1.2；1.8∶1；1.85∶1以及1.9∶1。
在一些实施方案中，粒子的表面可以大致上被表面活性剂或聚合物涂布，例如PVA、聚噁唑啉、聚乙烯吡咯烷、聚羟丙基甲基丙烯酰胺、聚唾液酸或PEG。
缀合物
粒子的一种或多种组分可以是缀合物的形式，即连接至另一部分。示例性缀合物包括核酸试剂-聚合物缀合物(例如，核酸试剂-疏水聚合物缀合物、核酸试剂-疏水-亲水聚合物缀合物，或核酸试剂-亲水聚合物缀合物)、阳离子部分-聚合物缀合物(例如，阳离子部分-疏水聚合物缀合物或阳离子部分-疏水-亲水聚合物缀合物)、核酸试剂-阳离子聚合物缀合物，以及核酸试剂-疏水部分缀合物。
本文所述的核酸试剂-聚合物缀合物包括聚合物(例如，疏水聚合物、亲水聚合物或亲水-疏水聚合物)和核酸试剂。本文所述的核酸试剂可以例如直接(例如，不存在来自插入间隔基部分的原子)或通过连接基连接至本文所述的聚合物。核酸试剂可以连接至疏水聚合物(例如PLGA)、亲水聚合物(例如PEG)或亲水-疏水聚合物(例如PEG-PLGA)。核酸试剂可以连接至聚合物的一个末端，连接至聚合物的两个末端，或连接至沿着聚合物链的一个点。在一些实施方案中，多个核酸试剂可以连接至沿着聚合物链的点，或多个核酸试剂可以经由多官能的连接基连接至聚合物的末端。核酸试剂可以通过核酸试剂的2’、3’或5’位置连接至本文所述的聚合物。在核酸试剂是双链(例如，siRNA)的实施方案中，核酸试剂可以通过有义或反义链连接。
本文所述的阳离子部分-聚合物缀合物包括聚合物(例如，疏水聚合物或含有亲水部分和疏水部分的聚合物)以及阳离子部分。本文所述的阳离子部分可以例如直接(例如，不存在来自插入间隔基部分的原子)或通过连接基连接至本文所述的聚合物。阳离子部分可以连接至疏水聚合物(例如PLGA)或具有疏水和亲水部分的聚合物(例如PEG-PLGA)。阳离子部分可以连接至聚合物的一个末端，连接至聚合物的两个末端，或连接至沿着聚合物链的一个点。在一些实施方案中，多个阳离子部分可以连接至沿着聚合物链的点，或多个阳离子部分可以经由多官能的连接基连接至聚合物的末端。
本文所述的核酸试剂-阳离子聚合物缀合物包括阳离子聚合物(例如，PEI、阳离子PVA、聚(组氨酸)、聚(赖氨酸)、或聚甲基丙烯酸(2-二甲氨基)乙酯)和核酸试剂。本文所述的核酸试剂可以例如直接(例如，不存在来自插入间隔基部分的原子)或通过连接基连接至本文所述的聚合物。核酸试剂可以连接至疏水聚合物(例如PLGA)、亲水聚合物(例如PEG)或具有疏水部分和亲水部分的聚合物(例如PEG-PLGA)。核酸试剂可以连接至聚合物的一个末端，连接至聚合物的两个末端，或连接至沿着聚合物链的一个点。在一些实施方案中，多个核酸试剂可以连接沿着至聚合物链的点，或多个核酸试剂可以经由多官能的连接基连接至聚合物的末端。
在一些实施方案中，缀合物可以包括与连接至本文所述的聚合物的核酸试剂形成双链体的核酸。例如，本文所述的聚合物可以连接至核酸寡聚物(例如，单链DNA)，所述核酸寡聚物与核酸试剂杂交形成双链体。例如可以使用细胞核酸酶裂解双链体，从而在活体内释放核酸试剂。
连接模式
本文所述的核酸试剂或阳离子部分可以直接(例如，不存在来自插入间隔基部分的原子)连接至本文所述的聚合物或疏水部分(例如聚合物)。连接可以在聚合物的末端或沿着聚合物的主链。例如，当核酸试剂是双链时，核酸试剂可以通过有义链或反义链连接至聚合物或阳离子部分。在一些实施方案中，核酸试剂在聚合物的连接点被修饰；例如，核酸试剂的末端羟基部分(例如5’或3’末端羟基部分)转化成与聚合物反应的官能团(例如，羟基部分转化成氢硫基部分)。核酸试剂或阳离子部分的反应性官能团可以直接连接(例如，不存在来自插入间隔基部分的原子)至聚合物上的官能团。核酸试剂或阳离子部分可以经由多种键，例如酰胺、酯、硫化物(例如，硫化马来酰亚胺)、二硫化物、琥珀酰亚胺、肟、硅烷基醚、碳酸酯或氨基甲酸酯键连接至聚合物。例如，在一个实施方案中，核酸试剂或阳离子部分的羟基可以与聚合物的羧酸基反应，从而在核酸试剂或阳离子部分与聚合物之间形成直接酯键。在另一个实施方案中，核酸试剂或阳离子部分的氨基可以连接至聚合物的羧酸基，形成酰胺键。在一个实施方案中，氢硫基修饰的核酸试剂可以与聚合物(例如，丙烯酸酯PLGA，或吡啶基-SS-活化的PLGA或马来酰亚胺活化的PLGA)的末端上的反应性部分反应，以形成硫化物或二硫化物或硫醚键(例如硫化物键)。示例性连接模式包括由点击化学产生者(例如，酰胺键、酯键、缩酮、琥珀酸酯或三唑以及WO2006/115547中描述者)。
在一些实施方案中，核酸试剂或阳离子部分可以直接连接(例如，不存在来自插入间隔基部分的原子)至聚合物的末端。例如，在末端具有羧酸基团的聚合物可共价连接至核酸试剂或阳离子部分的羟基、氢硫基或氨基部分，从而形成酯、硫酯或酰胺键。在另一个实施方案中，核酸试剂或阳离子部分可以沿着聚合物的主链直接连接(例如，不存在来自插入间隔基部分的原子)。例如，当核酸试剂是双链时，核酸试剂可以通过有义链或反义链连接至聚合物或阳离子部分。
在某些实施方案中，在其它聚合物末端或试剂的其它反应性取代基上可能需要合适的保护基以促进形成特定希望的缀合物。例如，可以使用例如甲硅烷基(例如三甲基甲硅烷基)或酰基(例如乙酰基)来保护具有羟基末端的聚合物。例如，可以使用乙酰基或其它保护基来保护核酸试剂或阳离子部分。
在一些实施方案中，将核酸试剂或阳离子部分连接至聚合物的方法可以产生包含具有相同的聚合物和相同的核酸试剂或阳离子部分，但是核酸试剂或阳离子部分与聚合物之间的键在性质上不同的缀合物的混合物的组合物。例如，当核酸试剂或阳离子部分具有多个可与聚合物反应的反应性部分时，核酸试剂或阳离子部分与聚合物的反应产物可以包括其中核酸试剂或阳离子部分经由一个反应性部分连接至聚合物的缀合物，以及其中核酸试剂或阳离子部分经由另一个反应性部分连接至聚合物的缀合物。例如，当核酸试剂连接至聚合物时，反应产物可以包括这样的缀合物：其中核酸试剂中的一些通过核酸试剂的3’端连接至聚合物，并且核酸试剂中的一些通过核酸试剂的5’端连接至聚合物。例如，当具有双链区的核酸试剂连接至聚合物时，反应产物可以包括这样的缀合物：其中具有双链区的核酸试剂中的一些通过有义端连接至聚合物，并且具有双链区的核酸试剂中的一些连接至反义端。同样，在阳离子部分具有多个反应性基团如多个胺的情况下，反应产物可以包括这样的缀合物：其中阳离子部分中的一些通过第一反应性基团连接至聚合物，并且阳离子部分中的一些通过第二反应性基团连接至聚合物。
在一些实施方案中，将核酸试剂或阳离子部分连接至聚合物的方法可以涉及使用保护基。例如，当核酸试剂或阳离子部分具有多个可与聚合物反应的反应性部分时，核酸试剂或阳离子部分可以在某些反应性位置加以保护，以使得聚合物将经由指定位置连接。在一个实施方案中，在连接至聚合物时，核酸或核酸试剂可以在核酸试剂的3’或5’端加以保护。在一个实施方案中，在连接至聚合物时，具有双链区的核酸试剂可以在有义或反义端加以保护。
在一些实施方案中，选择性偶合的产物(如上文描述者)可以组合以形成聚合物-试剂缀合物的混合物。例如，通过核酸试剂的3’端连接至核酸试剂的PLGA和通过核酸试剂的5’端连接至核酸试剂的PLGA可以组合形成这两种缀合物的混合物，并且混合物可以用于制备粒子。在另一个实施方案中，通过有义链(例如有义链的5’端)连接至siRNA的PLGA和通过反义链连接至siRNA的PLGA可以组合形成这两种缀合物的混合物，并且混合物可以用于制备粒子。
聚合物-试剂缀合物可以包含单个连接至聚合物的核酸试剂或阳离子部分。核酸试剂或阳离子部分可以连接至聚合物的末端，或连接至沿着聚合物链的点。
在一些实施方案中，缀合物可以包含多个连接至聚合物的核酸试剂或阳离子部分(例如，2、3、4、5、6个或更多个试剂可以连接至聚合物)。核酸试剂或阳离子部分可以相同或不同。在一些实施方案中，多个核酸试剂或阳离子部分可以连接至多官能的连接基(例如聚谷氨酸连接基)。在一些实施方案中，多个核酸试剂或阳离子部分可以连接至沿着聚合物链的点。
连接基
核酸试剂或阳离子部分可以经由连接基，如本文所述的连接基连接至如聚合物或疏水部分(如脂质)等部分，或彼此连接。例如：疏水聚合物可以连接至阳离子部分；疏水聚合物可以连接至核酸试剂；亲水-疏水聚合物可以连接至核酸试剂；亲水聚合物可以连接至核酸试剂；亲水聚合物可以连接至阳离子部分；或疏水部分可以连接至阳离子部分，或核酸试剂可以连接至阳离子部分。核酸试剂可以通过核酸试剂的2’、3’或5’位置，如核酸试剂的末端2’、3’或5’位置(例如通过本文所述的连接基)连接至如本文所述的聚合物等部分。在核酸试剂是双链(例如，siRNA)的实施方案中，核酸试剂可以通过有义或反义链连接。在一些实施方案中，核酸试剂通过聚合物(例如，PLGA聚合物，其中连接是在羟基末端或羧基末端)的末端连接。
在某些实施方案中，多个连接基部分连接至聚合物，从而允许例如在连接基在聚合物的多个地方(如沿着聚合物主链)连接的情况下，多个核酸试剂或阳离子部分通过连接基连接至聚合物。在一些实施方案中，连接基被配置成允许多个第一部分通过连接基连接至第二部分，例如多个核酸试剂可以经由分支的连接基连接至单个聚合物，如PLGA聚合物，其中分支的连接基包含多个核酸可以通过其连接的官能团。在一些实施方案中，核酸试剂或阳离子部分在生物条件下从连接基释放(即在生理条件下可裂解)。在另一个实施方案中，单个连接基例如在聚合物的末端连接至聚合物。
连接基可以包含例如亚烷基(二价烷基)。在一些实施方案中，亚烷基连接基的一个或多个碳原子可以置换为一个或多个杂原子或官能团(例如，硫醚、氨基、醚、酮、酰胺、硅烷基醚、肟、氨基甲酸酯、碳酸酯、二硫化物或杂环或杂芳香族部分)。例如，丙烯酸酯聚合物(例如，丙烯酸酯PLGA)可以与氢硫基修饰的核酸试剂(例如，氢硫基修饰的siRNA)反应形成通过硫化物键(例如，硫代丙酸酯键)连接的核酸试剂-聚合物缀合物。通过使丙烯酰氯与聚合物的羟基末端反应，丙烯酸酯可以连接至聚合物的末端(例如，PLGA聚合物的羟基末端，如50∶50PLGA聚合物)。
在一些实施方案中，除了允许第一部分连接至第二部分的官能团之外，连接基还具有另外的官能团。在一些实施方案中，另外的官能团可以在生理条件下裂解。这样的连接基可以例如通过使第一活化部分如核酸试剂或阳离子部分(例如本文所述的核酸试剂或阳离子部分)与第二活化部分如聚合物(例如，本文所述的聚合物)反应而形成，从而产生包括通过将核酸试剂或阳离子部分接合至聚合物而形成的官能团的连接基。任选地，另外的官能团可以提供用于另外的连接的位点或者允许在生理条件下裂解。例如，另外的官能团可以包括在生理条件下可裂解的二硫化物、酯、肟、碳酸酯、氨基甲酸酯或酰胺键。在一些实施方案中，将连接基连接至第一或第二部分的官能团中的一者或两者可以在生理条件下裂解，如酯、酰胺或二硫化物。
在一些实施方案中，另外的官能团是杂环的或杂芳香族部分。
核酸试剂可以通过核酸试剂的2’、3’或5’位置，如核酸试剂的末端2’、3’或5’位置通过连接基(例如，包含两个或三个官能团的连接基，如本文所述的连接基)连接至如本文所述的聚合物等部分。在核酸试剂是双链(例如，siRNA)的实施方案中，核酸试剂可以通过有义或反义链连接。在一些实施方案中，核酸试剂通过聚合物(例如，PLGA聚合物，其中连接是在羟基末端或羧基末端)的末端连接。
在一些实施方案中，连接基包括可以调节连接基中的官能团的反应性的部分(例如，可以例如在生理条件下增加或降低官能团的反应性的另一个官能团或原子)。
例如，如图1A-C所示，具有第一反应性基团的核酸试剂(NA)，例如RNA可与具有第二反应性基团的聚合物反应以将核酸试剂连接至聚合物，同时提供生物可裂解的官能团。所生成的连接基包括将核酸试剂连接至由于连接而产生的官能团(即通过形成共价键)的第一间隔基如亚烷基间隔基，以及将聚合物连接至由于连接而产生的官能团的第二间隔基如亚烷基间隔基(例如，约C1至约C6)。
如图1A-C所示，核酸试剂(NA)可以经由部分Y连接至第一间隔基，所述Y也是生物可裂解的。Y可以是例如-O-、-S-或-NH-。在一些实施方案中，第二间隔基可以连接至离去基团X-，例如卤代(例如氯代)或N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS)。第二间隔基可以经由与聚合物末端，例如聚合物的末端-OH、-CO2H、-NH2或-SH，例如PLGA的末端-OH或-CO2H连接的另外的官能团(Z)连接至聚合物。另外的官能团(Z)可以是例如-O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-OC(＝O)NR-、-NR-、-NRC(＝O)-、-NRC(＝O)O-、-NRC(＝O)NR′-、-NRS(＝O)2-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-C(＝O)O-或-C(＝O)NR-，并且提供另外的用于反应，例如连接或裂解的位点。
核酸试剂可以通过核酸试剂的2’、3’或5’位置，如核酸试剂的末端2’、3’或5’位置连接。在核酸试剂是双链(例如，siRNA)的实施方案中，核酸试剂可以通过有义或反义链连接。在一些实施方案中，核酸试剂通过间隔基连接至聚合物(例如，PLGA聚合物，其中连接是在羟基末端或羧基末端)的末端。
在一个实施方案中，例如如图1A所示，氢硫基修饰的核酸试剂(例如，氢硫基修饰的siRNA)可以与吡啶基-SS-活化的聚合物(例如，吡啶基-SS-活化的PLGA，例如吡啶基-SS-活化的5050PLGA)反应以形成通过二硫化物键连接的核酸试剂-聚合物缀合物。在一个实施方案中，氢硫基修饰的核酸试剂(例如，氢硫基修饰的siRNA)可以与马来酰亚胺活化的聚合物(例如，马来酰亚胺活化的PLGA，例如马来酰亚胺活化的5050PLGA)反应以形成通过马来酰亚胺硫化物键连接的核酸试剂-聚合物缀合物。在一个实施方案中，氢硫基修饰的核酸试剂(例如，氢硫基修饰的siRNA)可以与丙烯酸酯活化的聚合物(例如，丙烯酸酯活化的PLGA，例如丙烯酸酯活化的5050PLGA)反应以形成通过巯基丙酸酯键连接的核酸试剂-聚合物缀合物。核酸试剂可以通过核酸试剂的2’、3’或5’位置，如核酸试剂的末端2’、3’或5’连接。在核酸试剂是双链(例如，siRNA)的实施方案中，核酸试剂可以通过有义或反义链连接。在一些实施方案中，核酸试剂通过间隔基连接至聚合物(例如，PLGA聚合物，其中连接是在羟基末端或羧基末端)的末端。在一个实施方案中，例如如图1B所示，胺修饰的核酸试剂(例如，胺修饰的siRNA)可以与具有活化的羧酸或酯的聚合物(例如，活化的羧酸PLGA，例如活化的羧酸5050PLGA，例如SPA活化的羧酸5050PLGA，例如SPA活化的羧酸5050PLGA)反应以形成通过酰胺键连接的核酸试剂-聚合物缀合物。在一个实施方案中，胺修饰的核酸试剂(例如，胺修饰的siRNA)可以与活化的聚合物(例如，活化的PLGA，例如活化的5050PLGA)反应以形成通过氨基甲酸酯键连接的核酸试剂-聚合物缀合物。在一个实施方案中，胺修饰的核酸试剂(例如，胺修饰的siRNA)可以与活化的聚合物(例如，活化的PLGA，例如活化的5050PLGA)反应以形成通过碳酰胺键连接的核酸试剂-聚合物缀合物。在一个实施方案中，胺修饰的核酸试剂(例如，胺修饰的siRNA)可以与活化的聚合物(例如，活化的PLGA，例如活化的5050PLGA)反应以形成通过氨基烷基磺酰胺键连接的核酸试剂-聚合物缀合物。核酸试剂可以通过核酸试剂的2’、3’或5’位置，如核酸试剂的末端2’、3’或5’连接。在核酸试剂是双链(例如，siRNA)的实施方案中，核酸试剂可以通过有义或反义链连接。在一些实施方案中，核酸试剂通过间隔基连接至聚合物(例如，PLGA聚合物，其中连接是在羟基末端或羧基末端)的末端。
在一个实施方案中，例如如图1C所示，羟胺修饰的核酸试剂(例如，羟胺修饰的siRNA)可以与醛活化的聚合物(例如，醛活化的PLGA，例如醛活化的5050PLGA，例如甲醛活化的5050PLGA，例如甲醛活化的5050PLGA)反应以形成通过醛肟键连接的核酸试剂-聚合物缀合物。核酸试剂可以通过核酸试剂的2’、3’或5’位置，如核酸试剂的末端2’、3’或5’连接。在核酸试剂是双链(例如，siRNA)的实施方案中，核酸试剂可以通过有义或反义链连接。在一些实施方案中，核酸试剂通过间隔基连接至聚合物(例如，PLGA聚合物，其中连接是在羟基末端或羧基末端)的末端。
在一个实施方案中，例如如图1C所示，炔修饰的核酸试剂(例如，炔修饰的siRNA，例如乙炔修饰的siRNA)可以与叠氮化物活化的聚合物(例如，叠氮化物活化的PLGA，例如叠氮化物活化的5050PLGA)反应以形成通过三唑键连接的核酸试剂-聚合物缀合物。核酸试剂可以通过核酸试剂的2’、3’或5’位置，如核酸试剂的末端2’、3’或5’连接。在核酸试剂是双链(例如，siRNA)的实施方案中，核酸试剂可以通过有义或反义链连接。在一些实施方案中，核酸试剂通过间隔基连接至聚合物(例如，PLGA聚合物，其中连接是在羟基末端或羧基末端)的末端。
在一些实施方案中，连接基在连接至试剂和聚合物之前可以具有以下官能团中的一个或多个：胺、酰胺、羟基、羧酸、酯、卤素、氢硫基、马来酰亚胺、碳酸酯或氨基甲酸酯。在一些实施方案中，官能团在通过连接基连接第一和第二部分之后仍然保留在连接基中。在一些实施方案中，连接基包括调节官能团的反应性的一个或多个原子或基团(例如，以使得官能团如通过在生理条件下水解或还原而裂解)。
在一些实施方案中，连接基可以在连接基内包含氨基酸或肽。经常地，在这类实施方案中，肽连接基可以在还原条件下通过水解，或由特定的酶(例如在生理条件下)裂解。
当连接基是二价有机分子的残基时，连接基的裂解可以在连接基自身内部，或它可以在将连接基偶合至缀合物的剩余部分，例如偶合至核酸试剂或聚合物的一个键处。
在一些实施方案中，连接基可以选自以下之一或连接基可以包含以下之一：
Figure BDA00002844406901071
Figure BDA00002844406901081
其中m是1-10，n是1-10，p是1-10，并且R是氨基酸侧链。
连接基可以包括由点击化学产生的键(例如，酰胺键、酯键、缩酮、琥珀酸酯或三唑以及WO2006/115547中描述者)。连接基可以例如通过水解、还原反应、氧化反应、pH迁移、光解或其组合；或通过酶反应进行裂解。连接基还可以包含在氧化或还原条件下可裂解或可以对酸敏感的键。
在一些实施方案中，连接基不在生理条件下裂解，例如连接基具有足够的长度使得核酸试剂不需要裂解即具有活性，例如连接基的长度至少为约20埃(例如，至少约24埃)。
制备缀合物的方法
可以使用多种方法，包括本文所述的那些方法来制备缀合物。在一些实施方案中，为了将核酸试剂或阳离子部分共价连接至聚合物，可以使用本领域已知的技术来以化学方式活化聚合物或试剂。然后在允许在聚合物与试剂之间形成共价键的合适条件下，将活化的聚合物与试剂混合，或将活化的试剂与聚合物混合。在一些实施方案中，试剂上的亲核体，如氢硫基、羟基或氨基攻击亲电体(例如，活化的羰基)产生共价键。核酸试剂或阳离子部分可以经由多种键，例如酰胺、酯、琥珀酰亚胺、碳酸酯或氨基甲酸酯键连接至聚合物。
在一些实施方案中，核酸试剂或阳离子部分可以经由连接基连接至聚合物。在这类实施方案中，连接基可以首先共价连接至聚合物，然后连接至核酸试剂或阳离子部分。在其它实施方案中，连接基可以首先连接至核酸试剂或阳离子部分，然后连接至聚合物。
在一些实施方案中，在方法包括形成核酸试剂-聚合物缀合物，如核酸试剂-疏水聚合物缀合物或核酸试剂-疏水-亲水聚合物缀合物的情况下，核酸试剂和聚合物的溶解度是显著不同的。例如，核酸试剂可以是高度可溶于水的而聚合物(例如，疏水聚合物)可以具有低的溶解度(例如，小于约1mg/mL)。这类反应可以在单一溶剂，或包含多种溶剂(例如，可混溶的溶剂)的溶剂系统中完成。溶剂系统可包括水(例如，水性缓冲系统)和极性溶剂，如二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、六甲基磷酰胺(HMPA)、氟异丙醇、三氟乙醇、碳酸丙烯酯、丙酮、苄醇、二噁烷、四氢呋喃(THF)或乙腈(例如ACN)。示例性的水性缓冲液包括磷酸盐缓冲溶液(PBS)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)、TE缓冲液，或2-(N-吗啉基)乙烷磺酸缓冲液(MES))。溶剂系统可以是二相的(例如，具有有机相和水相)。在一些实施方案中，极性溶剂(例如，“org”)与水(例如，水性缓冲系统)的比率为约90/10至约40/60(例如约80/10至约50/50、约80/10至约60/40、约80/20、约60/40或约50/50)。
可以用于将核酸试剂连接至疏水聚合物的示例性溶剂系统包括下表1中的那些系统。
表1
Figure BDA00002844406901091
Figure BDA00002844406901101
上表是针对浓度为10mg/mL的聚合物。
*Org是指有机溶剂。
**TE是指具有TE作为缓冲剂的水性缓冲溶液(即，1mM Tris，用HCl达到pH8.0，以及1Mm EDTA)。
***PBS是指具有PBS作为缓冲剂的水性缓冲溶液(即，磷酸盐缓冲盐水)。
可以用于将核酸试剂连接至疏水-亲水聚合物的示例性溶剂系统包括下表2中的那些系统。
表2
Figure BDA00002844406901102
上表是针对浓度为10mg/mL的聚合物。
*Org是指有机溶剂。
**TE是指具有TE作为缓冲剂的水性缓冲溶液(即，1mM Tris，用HCl达到pH8.0，以及1Mm EDTA)。
***PBS是指具有PBS作为缓冲剂的水性缓冲溶液(即，磷酸盐缓冲盐水)。
本文所述的方法可以使用过量的一种或多种试剂来进行。例如，当形成核酸试剂聚合物缀合物时，可以使用过量的聚合物或核酸试剂进行反应。
本文所述的方法可以在核酸试剂或聚合物中的至少一种连接至不溶性底物(例如聚合物)的情况下进行。
本文所述的方法可以产生纯度为至少约80％(例如，至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％)的核酸试剂-聚合物缀合物。在一些实施方案中，方法产生至少约100mg的核酸试剂-聚合物缀合物(例如至少约1g)。
缀合物的组合物
以上描述的缀合物的组合物(例如，核酸试剂-聚合物缀合物或阳离子部分-聚合物缀合物)可以包括产物的混合物。例如，核酸试剂或阳离子部分与聚合物的缀合可能以小于100％的产率进行，并且因此包含缀合物的组合物可能还包括未缀合的聚合物、未缀合的核酸试剂，和/或未缀合的阳离子部分。
缀合物的组合物(核酸试剂-聚合物缀合物或阳离子部分-聚合物缀合物)还可以包括具有相同的聚合物和相同的核酸试剂或/或阳离子部分的缀合物，并且核酸试剂和/或阳离子部分与聚合物之间的键在性质上不同。例如，在一些实施方案中，当缀合物是核酸试剂-聚合物缀合物时，组合物可以包括经由核酸试剂上存在的不同羟基(例如，2’、3’或5’羟基如3’或5’)连接至核酸试剂的聚合物。当缀合物是阳离子部分-聚合物缀合物并且阳离子部分包括多个反应性基团时，组合物可以包括经由阳离子部分上存在的不同反应性基团(例如，不同反应性胺)连接至阳离子部分的聚合物。
缀合物可以按照不同的量存在于组合物中。例如，当具有多个可用的连接点的核酸试剂和/或阳离子部分与聚合物反应时，所得到的组合物可以包括较多的经由反应性较大的基团(例如，第一羟基或氨基)缀合的产物，以及较少的经由反应性较小的基团(例如，第二羟基或氨基)缀合的产物。
此外，缀合物的组合物可以包括连接至多于一条聚合物链的核酸试剂和/或阳离子部分。例如，在核酸试剂-聚合物缀合物的情况中，核酸试剂可以通过3’羟基连接至第一聚合物链并且通过5’羟基连接至第二聚合物链。例如，在阳离子部分-聚合物缀合物(其中阳离子部分包括多个反应性基团)的情况中，阳离子部分可以通过第一反应性基团(例如第一胺)连接至第一聚合物链并且通过第二反应性基团(例如第二胺)连接至第二聚合物链。
制备粒子和组合物的方法
可以使用本领域已知的任何用于制备粒子，例如纳米粒子的方法来制备本文所述的粒子。示例性方法包括喷雾干燥、乳液(例如，乳液-溶剂蒸发或双乳液)、沉淀(例如，纳米沉淀)以及相反转。
在一个实施方案中，本文所述的粒子可以通过沉淀(例如，纳米沉淀)来制备。这一方法涉及将粒子的组分(即，一种或多种聚合物、可任选的另外的一种或多种组分、阳离子部分以及核酸试剂)个别地或组合地溶解于一种或多种溶剂中以形成一种或多种溶液。例如，可以(以合适的速率或速度)将含有一种或多种组分的第一溶液倒入含有一种或多种组分的第二溶液中。例如，可以使用注射泵、微混合器，或任何允许受控的强力混合的装置来组合溶液。在一些情况中，在第一溶液接触第二溶液时可以形成纳米粒子，例如接触时聚合物的沉淀使得聚合物形成纳米粒子。可以容易地优化对这种粒子形成的控制。
在一组实施方案中，通过提供一种或多种含有一种或多种聚合物和另外的组分的溶液，并且使溶液与某些溶剂接触以产生粒子来形成粒子。在一个非限制性实例中，将疏水聚合物(例如，PLGA)缀合至核酸试剂或阳离子部分以形成缀合物。将此聚合物-缀合物、含有疏水部分和亲水部分的聚合物(例如，PEG-PLGA)、核酸试剂和/或阳离子部分，以及任选地第三聚合物(例如，生物可降解的聚合物，例如PLGA)溶解于可部分混溶于水的有机溶剂(例如，丙酮)中。将此溶液添加至含有表面活性剂的水溶液中，形成所希望的粒子。在混合/沉淀之前，可以个别地对这两种溶液进行无菌过滤。
可以将形成的纳米粒子暴露于另外的处理技术以除去溶剂或者纯化纳米粒子(例如，透析)。出于上述方法的目的，可混溶于水的溶剂包括丙酮、乙醇、甲醇以及异丙醇；并且可部分混溶于水的有机溶剂包括乙腈、四氢呋喃、乙酸乙酯、异丙醇、乙酸异丙酯或二甲基甲酰胺。
可以用于产生本文所述的粒子的另一方法是如Johnson，B.K.，等，AlChE Journal(2003)49：2264-2282以及U.S.2004/0091546所描述的称为“快速纳米沉淀”的方法，所述文献的全部内容以引用的方式并入本文。此方法能够在高负载和产率下产生疏水有机物的大小受控、聚合物稳定且受保护的纳米粒子。快速纳米沉淀技术是基于疏水有机物的成核和生长受到两亲性二嵌段共聚物阻滞。溶解于合适的溶剂中的两亲性二嵌段共聚物在针对一个嵌段的溶剂品质降低时可以形成胶束。为了实现这样的溶剂品质变化，使用切向流混合池(涡旋混合器)。涡旋混合器由一个封闭的容积腔组成，其中含有溶解于可混溶于水的溶剂中的二嵌段共聚物和核酸试剂的一个喷射流在高速度下与含有水、用于核酸试剂和共聚物的疏水嵌段的反溶剂的另一喷射流混合。在此方法中所涉及的快速混合和高能耗散提供了短于粒子的成核和生长时标的时标，这导致形成具有其它技术未提供的核酸试剂负载量和大小分布的纳米粒子。在经由快速纳米沉淀形成纳米粒子时，足够快地进行混合以允许所有组分在聚集开始之前达到高过饱和水平。因此，一种或多种核酸试剂和聚合物同时沉淀，并且克服了使用广泛使用的基于慢溶剂交换(例如，透析)的技术所发现的低活性试剂并入和聚集的局限性。快速纳米沉淀方法对组分的化学特异性不敏感，这使得它成为通用的纳米粒子形成技术。
本文所述的粒子还可以使用混合器技术，如静态混合器或微混合器(例如，分裂重组微混合器、狭缝叉指微混合器、星形层压机叉指微混合器、超聚焦叉指微混合器、液-液微混合器，或冲击射流微混合器)来制备。
分裂重组微混合器的混合原理涉及分流，在每个混合步骤中将液流彼此折叠/引导并重组，由8至12个这类步骤组成。最终经由在数毫秒内(排除多步骤流道的停留时间)扩散而发生混合。此外，在更高的流速下向此混合作用添加湍流进一步改善了总体混合品质。
狭缝叉指微混合器将多层压产生的规则流动型态与几何聚焦组合，从而加快了液体混合。由于此双步骤混合，狭缝混合器适合于各种各样的方法。
本文所述的粒子还可以使用微流体反应技术(MRT)来制备。在MRT的核心处是一个可扩展到至少50升/分的连续的冲击射流微反应器。在反应器中，高速液体反应物被迫在微升规模容积内部相互作用。反应物在纳米水平下混合，是因为它们暴露于高剪切应力和湍流。MRT提供对反应物的进料速度和混合位置的精确控制。这确保了对成核和生长过程的控制，从而产生均一的晶体生长和稳定速率。
本文所述的粒子还可以通过乳液来制备。示例性乳化方法公开在美国专利号5,407,609中，其内容以引用的方式并入本文。此方法涉及将试剂、液体或固体溶解或以其它方式分散在含有溶解的成壁材料的溶剂中；将核酸试剂/聚合物-溶剂混合物分散至处理介质中以形成乳液；以及立即将所有的乳液转移到大体积处理介质或其它合适的提取介质中，以立即从乳液中的微滴中提取溶剂以形成微囊化的产物，如微胶囊或微球体。用于制备聚合物递送媒介物制剂的最常见的方法是溶剂乳化-蒸发方法。此方法涉及将聚合物和药物溶解在完全不混溶于水的有机溶剂(例如，二氯甲烷)中。将有机混合物添加至含有稳定剂(最常见的是聚(乙烯醇)(PVA))的水中，然后通常进行声波处理。
制备粒子之后，它们可以通过过滤、筛分、挤压或超速离心来分级分离以回收特定的大小范围内的粒子。一个确定尺寸的方法涉及将粒子的水性悬浮液挤压通过一系列的具有选定的均一孔径的聚碳酸酯膜；膜的孔径将大略对应通过挤压通过所述膜而产生的粒子的最大尺寸。参见，例如美国专利4,737,323，其内容以引用的方式并入本文。另一种方法是在规定的速度(例如，8,000、10,000、12,000、15,000、20,000、22,000以及25,000rpm)下进行的分离规定大小的部分的连续超速离心。另一种方法是切向流过滤，其中含有粒子的溶液被沿着膜的表面切向泵送。施加的压力用于迫使流体的一部分通过膜到达滤液侧。太大而不能穿过膜孔的粒子被保留在上游侧。保留组分不像在正常的流过滤中那样在膜的表面积累，而是被切向流冲走。因此切向流过滤可以用于除去水溶液中存在的过量表面活性剂或者用于经由渗滤来浓缩溶液。
制备本文所述的粒子的一种示例性方法包括在极性溶剂(例如，DMF、DMSO、丙酮、苄醇、二噁烷、四氢呋喃或乙腈)中，在允许例如通过沉淀形成粒子的条件下，组合(a)核酸试剂-疏水聚合物缀合物，各核酸试剂-疏水聚合物缀合物包含共价连接至疏水聚合物的核酸试剂，例如siRNA部分，其中所述核酸试剂-疏水聚合物缀合物与阳离子部分缔合；(b)多个亲水-疏水聚合物，例如PEG-PLGA；以及(c)多个疏水聚合物(未共价连接至核酸试剂)，从而形成粒子。组合可以在极性溶剂(例如，丙酮)或在混合的溶剂系统(例如，组合水性/有机溶剂系统，如乙腈和水性缓冲系统)中完成。方法还可以包括：(i)乙腈/TE缓冲液(例如，80/20重量％)中的多个核酸试剂，各核酸试剂包含偶合至疏水聚合物并且与阳离子部分缔合的核酸试剂，例如siRNA或其它核酸试剂；与(ii)乙腈/TE缓冲液(例如，80/20重量％)中的多个亲水-疏水聚合物，例如PEG-PLGA，以及多个疏水聚合物(未偶合至核酸试剂)。
制备本文所述的粒子的另一种示例性方法包括：a)例如在水性溶剂中，使i)第一多个疏水-亲水聚合物(例如PEG-PLGA)与ii)各自具有第一反应性部分，例如巯基部分的第一多个疏水聚合物(例如PLGA)接触，以形成可溶于水的中间粒子(例如，直径小于约100nm)；b)例如在水性溶剂中，在允许形成中间复合物，例如包含偶合至药物部分的亲水-疏水聚合物和疏水聚合物的中间结构的条件下，使中间粒子与各自具有第二反应性部分，例如SH部分的多个可溶于水的核酸试剂(例如siRNA部分)接触；以及c)例如在非水性溶剂，例如DMF、DMSO、丙酮、苄醇、二噁烷、四氢呋喃或乙腈中，在允许形成粒子的条件下，使中间复合物与第二多个亲水-疏水聚合物(例如PEG-PLGA)和第二多个疏水聚合物(例如PLGA)接触，从而形成粒子(其中所形成的粒子大于中间粒子)。
制备本文所述的粒子的另一种示例性方法包括：a)例如在乙腈/TE缓冲液(例如，80/20wt％)中，使i)第一多个亲水-疏水聚合物(例如PEG-PLGA)与ii)各自具有第一反应性部分，例如巯基的第一多个疏水聚合物(例如PLGA)接触，以形成中间粒子(例如，直径小于约100nm)，其中，在一些实施方案中，中间粒子因具有足够的亲水部分使得其可溶于水溶液而在功能上可溶于水溶液；b)在允许形成中间复合物，例如包含偶合至核酸试剂的亲水-疏水聚合物和疏水聚合物的中间结构的条件下，使中间粒子与各自具有第二反应性部分，例如SH部分的多个核酸试剂(例如siRNA或其它核酸试剂)接触；以及c)在允许形成粒子的条件下，使中间复合物与第二多个亲水-疏水聚合物(例如PEG-PLGA)和第二多个疏水聚合物(例如PLGA)接触，从而形成粒子(例如，其中粒子的直径小于150nm)。多个阳离子部分可以共价连接至b的疏水聚合物。
制备本文所述的粒子的另一种示例性方法包括将阳离子-PLGA和缀合核酸的5050-O-乙酰基-PLGA溶解在溶液中。将所得到的溶液添加至水中形成纳米粒子悬浮液。将例如包括DOTAP、胆固醇以及DOPE-PEG2k在内的脂质混合物在允许脂质混合物包覆粒子的条件下添加至粒子悬浮液中。
制备本文所述的粒子的另一种示例性方法包括将缀合核酸试剂的5050-O-乙酰基-PLGA(Mw为约23.7kDa)溶解在溶液中。将所得到的溶液添加至水中以形成纳米粒子悬浮液。将阳离子聚合物(例如聚组氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚乙烯亚胺以及壳聚糖60wt.％)溶解在丙酮中，以形成1％的聚合物溶液，并且在允许聚合物混合物包覆粒子的条件下添加至粒子悬浮液中。
制备本文所述的粒子的另一种示例性方法包括形成包含多个核酸试剂-聚合物缀合物的粒子；使粒子与阳离子多价聚合物或脂质接触；以及使b)的产物与多个聚合物或脂质接触，其中多个聚合物或脂质大致上围绕b)的产物，从而形成粒子。
在一些实施方案中，对粒子进行进一步处理，例如进行纯化。示例性纯化方法包括凝胶电泳、毛细管电泳、凝胶渗透色谱法、透析、切向流过滤(例如，使用300kDa过滤器)，以及尺寸排阻色谱法。
纯化粒子之后，当粒子在溶液中时对它们进行无菌过滤(例如，使用0.22微米过滤器)。
在某些实施方案中，粒子被制备成在选定的大小范围内大小大致均匀。粒子的最大直径优选在30nm至300nm范围内(例如，约30nm至约250nm)。可以通过本领域已知的技术，如动态光散射和/或电子显微镜术(例如，透射电子显微镜术或扫描电子显微镜术)来分析粒子以确定粒子的大小。还可以测试粒子的核酸试剂负载和/或杂质的存在或不存在(如残余溶剂)。
冻干
本文所述的粒子可以经由冻干，俗称冷冻干燥来制备以用于干燥储存。冻干是将水从溶液中提取出来以形成粒状固体或粉末的方法。通过冷冻溶液并且随后通过在真空下升华提取任何水或水分来实施所述方法。冻干的优点包括维持物质品质以及使治疗性化合物的降解减至最少。冻干可以特别适用于开发复原并且通过注射施用至患者的医药品，例如肠胃外药品。或者，冻干适用于开发口服药品，尤其是快速熔融物或快速溶解的制剂。
冻干可以在冻干保护剂，例如本文所述的冻干保护剂存在下进行。在一些实施方案中，冻干保护剂是碳水化合物(例如，本文所述的碳水化合物，诸如蔗糖、环糊精或环糊精的衍生物(例如，2-羟丙基-β-环糊精))、盐、PEG、PVP或冠醚。
在一些实施方案中，可以通过使用包含环状寡糖的冻干保护剂来使冻干过程中PEG化粒子的聚集减少或减至最少。使用合适的冻干保护剂提供具有延长的保存期的冻干制剂。
本公开内容的特点在于包含环状寡糖的液体制剂和冻干制剂。在一些实施方案中，液体制剂或冻干制剂可以包含至少两种碳水化合物，例如环状寡糖(例如，环糊精或环糊精的衍生物)和非环状寡糖(例如，长度小于约10、8、6、4个单糖的非环状寡糖，例如单糖或二糖)。在一些实施方案中，液体制剂还包含复原试剂。
合适的环状寡糖的实例包括但不限于：α-环糊精、β-环糊精，如2-羟丙基-β-环糊精、β-环糊精磺丁基醚钠、γ-环糊精、其任何衍生物，以及其任意组合。
在某些实施方案中，环状碳水化合物，例如环状寡糖可以包括在较大分子结构如聚合物中。相对于粒子的聚合物组合物在本文中公开合适的聚合物。在这类实施方案中，环状寡糖可以并入聚合物的主链中。参见，例如US7,270,808和US7,091,192，其公开了可以根据本发明使用的在聚合物主链中含有环糊精部分的示例性聚合物。US7,270,808和US7,091,192的全部教义以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，环状寡糖可以含有至少一次氧化事件。
包含环状寡糖的冻干保护剂可以抑制包括亲水聚合物(如PEG)的粒子在其冻干和/储存期间的分子间聚集的速率，并且因此提供延长的保存期。不希望受理论的限制，环状寡糖阻止粒子聚集的机制可能是因为环状寡糖减少或阻止冻干过程中粒子中存在的亲水聚合物如PEG的结晶。这可以通过在环形寡糖与亲水聚合物(例如PEG)之间形成包含复合物来发生。这种复合物可以在环糊精与例如聚乙二醇链之间形成。环糊精的内部腔是亲脂性的，而环糊精的外部是亲水的。这些特性可以允许与本文所述的粒子的其它组分形成包含复合物。出于在冻干过程中稳定制剂的目的，可以将聚(乙二醇)链适配至环糊精的腔内。可以允许环状寡糖减少或最小化或阻止粒子聚集的另外的机制涉及在冻干过程中环状寡糖与亲水聚合物(PEG)之间氢键的形成。例如，环糊精与聚(乙二醇)链之间的氢键可以阻止有序的聚乙二醇结构，如晶体。
环状寡糖可以按照不同的量存在于本文所述的制剂中。在某些实施方案中，环状寡糖与液体制剂的比率的范围按重量计为约0.75∶1至约3∶1。在优选实施方案中，环状寡糖与总聚合物的比率的范围按重量计为约0.75∶1至约3∶1。
在优选方面，制剂含有两种或更多种碳水化合物，例如环状寡糖和非环状碳水化合物，例如非环状寡糖，例如具有10、8、6、4或更少个单糖单元的非环状寡糖。如本文所述，将非环状碳水化合物，例如非环状寡糖包括在待被冻干的液体制剂中可以促进所得到的冻干制剂的水吸收，并且促进冻干制剂的崩解。
在优选方面，冻干或液体制剂包含环状寡糖(如α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、其任何衍生物，以及其任意组合)以及非环状寡糖(例如本文所述的非环状寡糖)。在一些优选实施方案中，冻干保护剂包含环状寡糖，如α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、其任何衍生物，以及其任意组合，并且非环状寡糖是二糖，如蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖及其衍生物，和单糖，如葡萄糖。在一个优选实施方案中，冻干保护剂包含β-环糊精或其衍生物，如2-羟丙基-β-环糊精或β-环糊精磺丁基醚；并且非环状寡糖是二糖，如蔗糖。β-环糊精或其衍生物以及非环状寡糖可以按照任何合适的相对量存在。优选地，环状寡糖与非环状寡糖的比率(w/w)为约0.5∶1.5至约1.5∶0.5，并且更优选为0.7∶1.3至1.3∶0.7。在一些实例中，环状寡糖与非环状寡糖的比率(w/w)为0.7∶1.3、1∶0.7、1∶1、1.3∶1或1.3∶0.7。当液体或冻干制剂包含本文所述的粒子时，环状寡糖加非环状寡糖与聚合物的比率(w/w)为约1∶1至约10∶1，并且优选为约1∶1至约3∶1。
在某些实施方案中，冻干制剂可以用复原试剂进行复原。在一些实施方案中，合适的复原试剂可以是任何生理上可接受的液体。合适的复原试剂包括但不限于：水、5％右旋糖注射液、乳酸林格氏和右旋糖注射液、或相等体积份的无水乙醇、USP和非离子表面活性剂的混合物，如可从GAF Corporation，Mount Olive，N.J获得的商标为Cremophor EL的聚氧乙烯蓖麻油表面活性剂。为了使复原溶液中的表面活性剂的量最小，可以仅提供足量的媒介物以形成冻干制剂的溶液。一旦实现冻干制剂的溶解，就可使用合适的肠胃外稀释剂来进一步稀释所得到的溶液，随后进行注射。这类稀释剂是本领域的普通技术人员所熟知的。这些稀释剂通常在临床设施中可获得。典型的稀释剂的实例包括但不限于：乳酸林格氏注射液、5％右旋糖注射液、无菌注射用水等等。然而，由于其窄的pH范围-pH6.0至7.5，乳酸林格氏注射液是最典型的。每100mL中，乳酸林格氏注射液含有氯化钠USP0.6g、乳酸钠0.31g、氯化钾USP0.03g以及单水合氯化钙USP0.02g。摩尔渗透压浓度是275mOsmol/L，这非常接近等渗性。
因此，液体制剂可以是在合适的复原试剂中再悬浮或再水合的冻干制剂。合适的复原试剂包括生理上可接受的载体，例如，如本文所述的生理上可接受的液体。优选地，冻干制剂的再悬浮或再水合形成了大致上具有与冻干之前本发明的液体制剂中的原始粒子相同的特性(例如，平均粒径(Zave)、大小分布(Dv90、Dv50)、多分散性、药物浓度)和形态学的粒子的溶液或悬浮液，并且进一步维持了冻干之前原始液体制剂的治疗剂与聚合物的比率。在某些实施方案中，再悬浮或再水合的冻干制剂中约50％至约100％、优选约80％至约100％的粒子维持了原始液体制剂中的粒子的大小分布和/或药物与聚合物的比率。优选地，通过再悬浮冻干制剂产生的制剂中的粒子的Zave、Dv90以及多分散性与冻干之前原始溶液或悬浮液中的粒子的Zave、Dv90以及多分散性的差异不多于约5％、不多于约10％、不多于约15％、不多于约20％、不多于约15％、不多于约30％、不多于约35％、不多于约40％、不多于约45％，或不多于约50％。
优选地，此方面的液体制剂含有粒子，并且特征在于比可以使用包含一种或多种碳水化合物(例如，环状寡糖和/或非环状寡糖)的冻干保护剂来冻干并且再悬浮的聚合物浓度高的聚合物浓度(形成粒子的一种或多种聚合物的浓度)。例如，聚合物浓度可以是至少约20mg/mL、至少约25mg/mL、至少约30mg/mL、至少约31mg/mL、至少约32mg/mL、至少约33mg/mL、至少约34mg/mL、至少约35mg/mL、至少约36mg/mL、至少约37mg/mL、至少约38mg/mL、至少约39mg/mL、至少约40mg/mL、至少约45mg/mL、至少约50mg/mL、至少约55mg/mL、至少约60mg/mL、至少约65mg/mL、至少约70mg/mL、至少约75mg/mL、至少约80mg/mL、至少约85mg/mL、至少约90mg/mL、至少约95mg/mL、至少约100mg/mL。例如，液体制剂可以是复原的冻干制剂。
储存粒子和组合物的方法
在另一方面，本发明的特点在于储存缀合物、粒子或组合物，例如药物组合物的方法。
在一个实施方案中，本文所述的储存缀合物、粒子或组合物的方法包括例如以下步骤：(a)将所述缀合物、粒子或组合物安置在容器中；(b)储存所述缀合物、粒子或组合物；以及任选地(c)将所述容器移至第二地点或从所述容器中除去全部或等分部分的所述缀合物、粒子或组合物。
缀合物、粒子或组合物可以是液体、干的、冻干的或复原的(例如在如溶液或悬浮液等液体中)制剂或形式。缀合物、粒子或组合物可以按照单剂量或多剂量的量储存，例如它可以按照足够至少2、5、10或100次剂量的量储存。在一个实施方案中，方法包括透析、稀释、浓缩、干燥、冻干或包装(例如，将材料安置在容器中)缀合物、粒子或组合物。在一个实施方案中，方法包括组合缀合物、粒子或组合物与另一组分，例如赋形剂、冻干保护剂或惰性物质，例如惰性气体。在一个实施方案中，方法包括将缀合物、粒子或组合物的制剂分成等分部分，以及任选地将多个等分部分安置在多个容器中。在实施方案中，将缀合物、粒子或组合物，例如药物组合物储存本文所公开的时间段。在实施方案中，在储存一段时间之后，评估储存的缀合物、粒子或组合物的例如聚集、颜色或其它参数。
在实施方案中，本文所述的缀合物、粒子或组合物可以例如在容器中储存至少约1小时(例如，至少约2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、2天、1周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、1年、2年或3年)。因此，本文描述包括本文所述的缀合物、粒子或组合物的容器。
在实施方案中，缀合物、粒子或组合物可以在多种条件，包括环境条件或本文所述的其它条件下储存。在一个实施方案中，缀合物、粒子或组合物在低温下，例如在低于或等于约5℃(例如，低于或等于约4℃或低于或等于约0℃)的温度下储存。缀合物、粒子或组合物还可以冷冻并且在低于约0℃(例如，在-80℃与-20℃之间)的温度下储存。缀合物、粒子或组合物还可以在惰性氛围，例如含有如氮气或氩气等惰性气体的氛围下储存。这种氛围可以大致上不含大气氧气和/或其它反应性气体，和/或大致上不含水分。
在一些实施方案中，缀合物、粒子或组合物可以作为复原的制剂(例如在如溶液或悬浮液等液体中)储存。
在一个实施方案中，本文所述的缀合物、粒子或组合物可以储存在多种容器，包括遮光容器如琥珀色小瓶中。容器可以是小瓶，例如，具有橡胶或硅酮外壳(例如，由聚丁二烯或聚异戊二烯制成的外壳)的密封小瓶。容器可以大致上不含大气氧气和/或其它反应性气体，和/或大致上不含水分。
在另一方面，本发明的特点在于例如以本文所述的量、形式或制剂安置在容器(例如本文所述的容器)中的缀合物、粒子或组合物。
评估粒子和组合物的方法
在另一方面，本发明的特点在于评估粒子或粒子制剂的例如本文所述的特性的方法。在一个实施方案中，特性是物理特性，例如平均直径。在另一个实施方案中，特性是功能特性，例如介导靶基因的敲低的能力，例如，如在本文所述的测定中所测量。方法包括：
提供包含一个或多个所述粒子的样品，例如一种组合物，例如一种药物组合物；
例如通过物理测试评估本文所述的特性，以提供特性的测定值，
从所评估粒子或粒子制剂。
在一个实施方案中，方法包括以下中的一者或两者：
a)将测定值与参考或标准值，例如一系列值(例如本文公开的值，或由监管机构、制造商或出版权威设定的值)进行比较，或者
b)回应于所述测定或比较，对所述粒子进行分类。
在一个实施方案中，回应于所述测定或比较，采取决定或步骤，例如，改变制备粒子的方法中的生产参数，将样品归类、选择、接受或丢弃、释放或截留、加工成药品、运输、移至不同位置、配制(例如，与其它物质，例如赋形剂一起配制)、贴标签、包装、投放到市场，或出售或供出售。
在一个实施方案中，将特性的测定值与参照值进行比较，并且回应于比较将所述粒子或粒子制剂分类为例如适合于在人受试者中使用、不适合于在人受试者中使用、适合于销售、符合投放规格，或不符合投放规格。
在一个实施方案中，使粒子或粒子制剂经受测量以确定是否存在杂质或残留溶剂(例如，经由气相色谱法(GC))；确定一种或多种组分的相对量(例如，经由高效液相色谱法(HPLC))；测量粒径(例如，经由动态光散射和/或扫描电子显微镜术)；或确定表面组分的存在或不存在。
在一个实施方案中，针对组合物中的粒子的平均直径，对粒子或粒子制剂进行评估。在一个实施方案中，进行包括物理测量的实验来测定平均值。然后可以将组合物的平均直径与参考值进行比较。在一个实施方案中，粒子的平均直径为约50nm至约500nm(例如，约50nm至约200nm)。多个粒子的组合物的中值粒径(Dv50(存在50％的粒子体积低于该粒径)为约50nm至约500nm(例如，约75nm至约220nm))可以为约50nm至约220nm(例如，约75nm至约200nm)。多个粒子的组合物的Dv90(存在90％的粒子体积低于该粒径)可以为约50nm至约500nm(例如，约75nm至约220nm)。在一些实施方案中，多个粒子的组合物的Dv90小于约150nm。多个粒子的组合物的粒子PDI可以小于0.5、小于0.4、小于0.3、小于0.2，或小于0.1。
在一个实施方案中，使粒子或粒子制剂经受动态光散射，例如以测定大小或直径。粒子可以用激光照射，并且散射光的强度以与粒子的大小相关的比率波动，因为较小的粒子被溶剂分子“踢”得更远并且更迅速地移动。分析这些强度波动产生布朗运动速度，并且使用斯托克斯-爱因斯坦关系由此得到粒径。在动态光散射法中测量的直径被称为水动力学直径并且是指粒子如何在流体中扩散。通过这种技术获得的直径是具有与所测量的粒子相同的平移扩散系数的球体的直径。
在一个实施方案中，使用低温扫描电子显微镜术(Cryo-SEM)来评估粒子或粒子制剂，以测定结构或组成。SEM是其中通过使用高能电子束以光栅扫描型态扫描样品而对样品表面成像的一种类型的电子显微镜术。电子与构成样品的原子相互作用产生了信号，所述信号含有关于样品的表面拓扑学、组成以及其它特性如电导率的信息。对于Cryo-SEM，SEM装备有冷载台用于低温显微镜术。可以使用低温固定并且对低温固定的标本进行低温扫描电子显微镜术。可将低温固定标本在特殊设备中在真空下进行低温断裂以便显示内部结构、溅涂，并转移到SEM低温载台上，同时仍然冷冻。
在一个实施方案中，使用透射扫描电子显微镜术(TEM)来评估粒子或粒子制剂，以测定结构或组成。在此技术中，电子束透射通过超薄标本，在穿过时与标本相互作用。从投射穿过标本的电子的相互作用形成了图像；图像被放大并且聚焦至胶片层上的成像装置，如荧光屏上，或者被传感器如电荷耦合装置(CCD)摄像机检测到。
在一个实施方案中，评估粒子或粒子制剂的表面ζ电位。在一个实施方案中，进行包括物理测量的实验来测定表面ζ电位的平均值。然后可以将表面ζ电位与参考值进行比较。在一个实施方案中，当在水中测量时，表面ζ电位在约-20mV至约50mV之间。ζ电位是粒子的表面电位的测量值。在一些实施方案中，当在水中测量时，粒子可以具有范围在约-20mV至约20mV、约-10mV至约10mV之间的表面ζ电位或者是中性的。
在一个实施方案中，评估粒子或粒子制剂所含的核酸试剂(例如，siRNA)的有效量。在实施方案中，例如在活体内模型系统中(例如，小鼠模型，如本文所述的任何模型)施用粒子，并且观察效应(例如敲低)水平。在实施方案中，将水平与参考标准进行比较。
在一个实施方案中，评估粒子或粒子制剂的表面上核酸试剂的存在。例如，可以使用嵌插剂如RIBOGREEN或HPLC来测定粒子表面上的双链核酸试剂的存在或量(例如，siRNA的存在或量)。
在一个实施方案中，评估粒子或粒子制剂的粒子内部的(相对于表面暴露的)核酸试剂(例如，siRNA)的量。在实施方案中，将水平与参考标准进行比较。在实施方案中，粒子中按数量或重量计至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的核酸试剂(例如，siRNA)在粒子的内部。
在一个实施方案中，使用提供关于核酸试剂的结构或功能的信息的测定(例如，消化测定)来评估粒子或粒子制剂。例如，可以在评估核酸试剂调节靶标表达的能力(例如，敲低)的实验中评估粒子。还可以评估粒子的治疗病症，例如调节肿瘤生长的能力。在一些实施方案中，评估是活体外或活体内测定(例如异种移植模型)。可以将评估与标准进行比较，并且任选地，回应于所述标准，对粒子进行分类。
在一个实施方案中，在活体内，例如在实验动物(例如小鼠)中评估粒子或粒子制剂的递送敲低靶基因的核酸试剂(例如，siRNA)的能力。可以将组合物的活性与等量的游离核酸试剂的活性进行比较。在一些实施方案中，靶基因是GFP并且GFP在HeLA细胞中表达。例如，测定可以使用Bertrand等，2002，BBRC296：1000-1004中描述的抗GFP siRNA、GFP质粒、HeLA-GFP细胞、小鼠以及GFP表达测定，所述文献以引用的方式并入本文。用于评估缀合物、粒子以及组合物的其它示例性细胞包括MDA-MB-435和MDA-MB-468GFP细胞。
在一个实施方案中，在活体外，例如在培养细胞中评估粒子或粒子制剂的递送敲低靶基因的核酸试剂(例如，siRNA)的能力。可以将组合物的活性与等量的游离核酸试剂的活性进行比较。在一些实施方案中，靶基因是GFP并且培养细胞是用GFP转染的HeLA细胞。例如，测定可以使用Bertrand等，2002，BBRC296：1000-1004中描述的抗GFP siRNA、GFP质粒、HeLA-GFP细胞、细胞培养条件以及GFP表达测定，所述文献以引用的方式并入本文。用于评估本文所述的粒子和组合物的其它示例性细胞包括MDA-MB-435和MDA-MB-468GFP细胞。
在一个实施方案中，在血清或细胞裂解液中孵育之后，在活体外，例如在培养细胞中评估粒子或粒子制剂的递送敲低靶基因的核酸试剂(例如，siRNA)的能力。可以将所处理的组合物的活性与等量的游离核酸试剂的活性进行比较。在一些实施方案中，靶基因是GFP并且培养细胞是用GFP转染的HeLA细胞。例如，测定可以使用Bertrand等，2002，BBRC296：1000-1004中描述的抗GFP siRNA、GFP质粒、HeLA-GFP细胞、细胞培养条件、GFP表达测定，以及HeLa细胞裂解液(在使用细胞裂解液的测定的情况下)，所述文献以引用的方式并入本文。或者，在Hu-Lieskovan等，2005，Cancer Res.65：8984-8992(其以引用的方式并入本文)中描述的小鼠表达系统可以用于评估组合物的性能。Hu-Lieskovan等的靶基因和构建体，或其它靶基因和构建体可以用于Hu-Lieskovan等中描述的小鼠系统。用于评估本文所述的粒子和组合物的其它示例性细胞包括MDA-MB-435和MDA-MB-468GFP细胞。
在一个实施方案中，评估粒子或粒子制剂的保护核酸试剂不受如RNA酶(例如，RNA酶A)的降解产物影响的能力。在一些实施方案中，相对于未处理的核酸试剂(例如，游离siRNA)，本文所述的组合物可以给予核酸试剂如siRNA以保护。评估可以包括这样的测定：其中将组合物和/或游离核酸试剂与降解产物如RNA酶一起孵育，并且例如其中例如使用凝胶色谱法在不同的时间点评估组合物和游离核酸。
在一个实施方案中，评估粒子或粒子制剂所含有的完整核酸试剂(例如，siRNA)的水平。在实施方案中，可以通过物理特性，例如分子量的存在，或通过例如在活体内模型系统(例如，小鼠模型，如本文所述的任何模型)中的功能性来测定完整性。在实施方案中，将水平与参考标准进行比较。在实施方案中，粒子中按数量或重量计至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的核酸试剂(例如，siRNA)可能是完整的。
在一个实施方案中，评估粒子或粒子制剂的聚集的倾向。例如，可以在预先选择的介质，例如50/50小鼠/人血清中测量聚集。在实施方案中，当在50/50小鼠人血清中孵育时，粒子展现出很少的聚集或没有聚集。例如，按数量或重量计少于30％、20％或10％的粒子将会聚集。在实施方案中，将水平与参考标准进行比较。
在一个实施方案中，评估粒子或粒子制剂的稳定性，例如在预先选择的条件下，例如在25℃±2℃/60％相对湿度±5％相对湿度下，例如在敞开或密闭容器中的稳定性。在实施方案中，当在25℃±2℃/60％相对湿度±5％相对湿度下在敞开或密闭容器中储存20、30、40、50或60天时，粒子保留其活性的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％，例如，如在活体内模型系统(例如，小鼠模型，如本文所述的模型)中所测定。在实施方案中，将保留的活性水平与参考标准进行比较。
在一个实施方案中，评估粒子或粒子制剂的例如在预先选择的剂量下减少蛋白质和或mRNA的能力。例如，可以通过在活体内模型系统(例如，小鼠模型，如本文所述的那些模型)中作为1mg/kg或3mg/kg的单一剂量施用来评估粒子。本文所述的粒子可以导致至少20％、30％、40％、50％或60％的蛋白质减少和或mRNA敲低。在实施方案中，将水平与参考标准进行比较。
在一个实施方案中，评估粒子或粒子制剂的例如在预先选择的剂量下减少靶基因的蛋白质和或mRNA的能力。例如，可以通过在活体内模型系统(例如，小鼠模型，如本文所述的任何模型)中作为1mg/kg或3mg/kg的单一剂量施用来评估粒子。本文所述的粒子可以导致至少20％、30％、40％、50％或60％的蛋白质减少和或mRNA敲低。在实施方案中，将水平与参考标准进行比较。
在一个实施方案中，评估粒子或粒子制剂的例如在预先选择的剂量下对脱靶基因的蛋白质和或mRNA的减少。例如，可以通过例如在活体内模型系统(例如，小鼠模型，如本文所述的任何模型)中作为1mg/kg或3mg/kg的单一剂量施用来评估粒子。当在活体内模型系统(例如，小鼠模型，如本文所述的任何模型)中(例如，作为1mg/kg或3mg/kg的单一剂量)施用时，如通过蛋白质或mRNA所测量，本文所述的粒子或制剂可导致小于20％、10％、5％的敲低或无敲低。
在一个实施方案中，评估粒子或粒子制剂的裂解mRNA的能力。
在一个实施方案中，评估粒子或粒子制剂的诱导细胞因子的能力。当在活体内模型系统(例如，小鼠模型，如本文所述的任何模型)中(例如，作为1mg/kg或3mg/kg的单一剂量)施用时，本文所述的粒子或制剂可导致小于2、5或10倍的细胞因子诱导。例如，施用导致以下中的一个或多个(例如二、三、四、五、六或七个)或全部的小于2、5或10倍的诱导：肿瘤坏死因子α、白细胞介素-1α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6、白细胞介素-10、白细胞介素-12、角质化细胞衍生的细胞因子以及干扰素γ。
在一个实施方案中，评估粒子或粒子制剂当在活体内模型系统(例如，小鼠模型，如本文所述的任何模型)中(例如，作为1mg/kg或3mg/kg的单一剂量)施用时，增加丙氨酸氨基转移酶(ALT)和或天冬氨酸氨基转移酶(AST)的能力。在一个实施方案中，粒子或制剂导致小于2、5或10倍的增加。
在一个实施方案中，评估粒子或粒子制剂的改变血细胞计数的能力。在一个实施方案中，粒子或制剂没有导致血细胞计数变化，例如在活体内模型系统(例如，小鼠模型，如本文所述的任何模型)中2次剂量的3mg/kg的48小时之后没有变化。
可以使本文所述的粒子经受多种分析方法。例如，可以使本文所述的粒子经受测量以确定是否存在杂质或残留溶剂(例如，经由气相色谱法(GC))；确定一种或多种组分的相对量(例如，经由高效液相色谱法(HPLC))；测量粒径(例如，经由动态光散射和/或扫描电子显微镜术)；或确定表面组分的存在或不存在。
可以在活体内，例如在实验动物(例如小鼠)中评估本文所述的组合物的例如递送敲低靶基因的核酸试剂(例如，siRNA)的能力。可以将组合物的活性与等量的游离核酸试剂的活性进行比较。在一些实施方案中，靶基因是GFP(例如，EGFP)，所述GFP在HeLA细胞中表达。例如，测定可以使用Bertrand等，2002，BBRC296：1000-1004中描述的抗GFP siRNA、GFP质粒、HeLA-GFP细胞、小鼠以及GFP表达测定，所述文献以引用的方式并入本文。用于评估本文所述的粒子和组合物的其它示例性细胞包括MDA-MB-435和M4A4GFP细胞。
可以在活体外，例如在培养细胞中评估本文所述的组合物的递送敲低靶基因的核酸试剂(例如，siRNA)的能力。可以将组合物的活性与等量的游离核酸试剂的活性进行比较。在一些实施方案中，靶基因是GFP并且培养细胞是用GFP转染的HeLA细胞。例如，测定可以使用Bertrand等，2002，BBRC296：1000-1004中描述的抗GFP siRNA、GFP质粒、HeLA-GFP细胞、细胞培养条件以及GFP表达测定，所述文献以引用的方式并入本文。用于评估本文所述的粒子和组合物的其它示例性细胞包括MDA-MB-435和M4A4GFP细胞。
可以在血清或细胞裂解液中孵育之后，在活体外，例如在培养细胞中评估本文所述的组合物的递送敲低靶基因的核酸试剂(例如，siRNA)的能力。可以将所处理的组合物的活性与等量的游离核酸试剂的活性进行比较。在一些实施方案中，靶基因是GFP并且培养细胞是用GFP转染的HeLA细胞。例如，测定可以使用Bertrand等，2002，BBRC296：1000-1004中描述的抗GFP siRNA、GFP质粒、HeLA-GFP细胞、细胞培养条件、GFP表达测定，以及HeLa细胞裂解液(在使用细胞裂解液的测定的情况下)，所述文献以引用的方式并入本文。或者，在Hu-Lieskovan等，2005，Cancer Res.65：8984-8992(其以引用的方式并入本文)中描述的小鼠表达系统可以用于评估组合物的性能。Hu-Lieskovan等的靶基因和构建体，或其它靶基因和构建体可以用于Hu-Lieskovan等中描述的小鼠系统。用于评估本文所述的粒子和组合物的其它示例性细胞包括MDA-MB-435和M4A4GFP细胞。
可以评估本文所述的组合物的保护核酸试剂不受如RNA酶(例如，RNA酶A)的降解产物影响的能力。在一些实施方案中，相对于未处理的核酸试剂(例如，游离siRNA)，本文所述的组合物可以给予核酸试剂如siRNA以保护。评估可以包括这样的测定：其中将组合物和/或游离核酸试剂与降解产物如RNA酶一起孵育，并且其中例如使用凝胶色谱法在不同的时间点评估组合物和游离核酸。
药物组合物
本文提供包含多个本文所述的粒子以及药学上可接受的载体或佐剂的组合物，例如药物组合物。
在一些实施方案中，药物组合物可以包括本文所述的化合物(例如缀合物)的药学上可接受的盐。本文所述的化合物的药学上可接受的盐包括衍生自药学上可接受的无机和有机酸和碱的那些盐。合适的酸盐的实例包括乙酸盐、己二酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、甲酸盐、富马酸盐、乙醇酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲烷磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、扑酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。衍生自适当的碱的盐包括碱金属(例如，钠)盐、碱土金属(例如，镁)盐、铵盐以及N-(烷基)4 +盐。本发明还设想本文所述的化合物中任何碱性含氮基团的季铵化。通过这种季铵化可以获得可溶于或可分散于水或油的产物。
润湿剂、乳化剂和润滑剂，如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中。
药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)可溶于水的抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)可溶于油的抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；以及(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
组合物可以包括用于悬浮缀合物、粒子或组合物的液体，所述液体可以是与缀合物、粒子或组合物相容的任何液体溶液，所述液体还适合用于药物组合物，如药学上可接受的无毒液体中。合适的悬浮液体包括但不限于选自由以下组成的组的悬浮液体：水、水性蔗糖糖浆、玉米糖浆、山梨糖醇、聚乙二醇、丙二醇、D5W及其混合物。
本文所述的组合物还可以包括另一组分，如抗氧化剂、抗细菌剂、缓冲剂、增容剂、螯合剂、惰性气体、张力剂和/或粘性剂。
在一个实施方案中，聚合物-试剂缀合物、粒子或组合物以冻干形式提供并且在施用至受试者之前复原。冻干的聚合物-试剂缀合物、粒子或组合物可以通过稀释溶液，如盐或盐水溶液，例如pH在6与9之间的氯化钠溶液、乳酸林格氏注射溶液或可商购获得的稀释剂，如PLASMA-LYTE A注射液
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(Baxter，Deerfield，IL)进行复原。
在一个实施方案中，冻干制剂包括冻干保护剂或稳定剂以通过保护粒子和活性剂不受冷冻干燥过程中的晶体形成和融合过程损害来维持物理和化学稳定性。冻干保护剂或稳定剂可以是以下中的一种或多种：聚乙二醇(PEG)、PEG脂质缀合物(例如，PEG-脑酰胺或D-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚氧乙烯酯、泊洛沙姆、聚山梨醇酯、聚氧乙烯酯、卵磷脂、糖、寡糖、多糖、碳水化合物、环糊精(例如2-羟丙基-β-环糊精)和多元醇(例如，海藻糖、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、蔗糖、葡萄糖和葡聚糖)、盐以及冠醚。
在一些实施方案中，冻干的聚合物-试剂缀合物、粒子或组合物使用以下进行复原：水、5％右旋糖注射液、乳酸林格氏和右旋糖注射液、或相等体积份的无水乙醇、USP和非离子表面活性剂的混合物，如可从GAF Corporation，Mount Olive，N.J获得的商标为CremophorEL的聚氧乙烯蓖麻油表面活性剂。用于复原的冻干产品和媒介物可以单独包装在适当避光的小瓶中。为使复原溶液中的表面活性剂的量减至最少，可以仅提供足量的媒介物以形成聚合物-试剂缀合物、粒子或组合物的溶液。一旦实现药物的溶解，就使用合适的肠胃外稀释剂来进一步稀释所得到的溶液，随后注射。这类稀释剂是本领域的普通技术人员所熟知的。这些稀释剂通常在临床设施中可获得。然而，在本发明的范围内，使用含有足够的肠胃外稀释剂的第三小瓶包装主题聚合物-试剂缀合物、粒子或组合物以制备用于施用的最终浓度。典型的稀释剂是乳酸林格氏注射液。
可以使用具有相似效用的其它制剂，例如5％右旋糖注射液、乳酸林格氏和右旋糖注射液、无菌注射用水等实施对复原的聚合物-试剂缀合物、粒子或组合物的最终稀释。然而，由于其窄的pH范围-pH6.0至7.5，乳酸林格氏注射液是最典型的。每100mL中，乳酸林格氏注射液含有氯化钠USP0.6g、乳酸钠0.31g、氯化钾USP0.03g以及单水合氯化钙USP0.02g。摩尔渗透压浓度是275mOsmol/L，这非常接近等渗性。
组合物可以方便地以单位剂型提供并且可以通过药剂学领域所熟知的任何方法来制备。可以与药学上可接受的载体组合产生单一剂型的核酸试剂的量将取决于所治疗的宿主、特定的施用模式而变化。可以与药学上可接受的载体组合产生单一剂型的核酸试剂的量通常是产生治疗效果的化合物的量。
施用途经
本文所述的药物组合物可以口服、肠胃外(例如，经由静脉内、皮下、皮内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内、眼内或颅内注射)、局部、粘膜(例如，直肠或阴道)、经鼻、经颊、经眼、经由吸入喷雾(例如，通过雾化、推进剂或干粉装置递送)或经由植入式储药器进行施用。
适合于肠胃外施用的药物组合物包含一种或多种聚合物-试剂缀合物、粒子或组合物与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性溶液或非水溶液、分散液、悬浮液或乳液，或可在临使用前复原成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末的组合，所述组合可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、使制剂与预期受体的血液等渗的溶质，或悬浮剂或增稠剂。
药物组合物中可以采用的合适的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(如橄榄油)，以及可注射的有机酯，如油酸乙酯。适合的流动性可以例如通过使用包衣材料(如卵磷脂)、在分散液的情况下通过维持所要求的粒度、和通过使用表面活性剂来维持。
这些组合物还可以含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过纳入各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等可以确保防止微生物的作用。还希望在组合物中纳入等渗剂，如糖、氯化钠等。此外，可注射的药物形式的延长吸收可以通过纳入延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶而达成。
在一些情况下，为了延长核酸试剂的作用，希望减缓试剂自皮下或肌肉内注射的吸收。这可以通过使用水溶性差的晶态或非晶态物质的液体悬浮液来实现。缀合物、粒子或组合物的吸收速率因此取决于它的溶解速率，溶解速率又可能取决于晶体大小和晶态形式。或者，通过将缀合物、粒子或组合物溶解或悬浮在油媒介物中实现肠胃外施用药物形式的延迟吸收。
适合于口服施用的药物组合物可以是以下形式：胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、口香糖、锭剂(使用调味基质，通常是蔗糖和阿拉伯树胶或黄芪胶)、散剂、颗粒剂、或作为水性或非水性液体中的溶液或悬浮液、或作为水包油或油包水液体乳液、或作为酏剂或糖浆、或作为软锭剂(使用惰性基质，如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯树胶)和/或作为漱口水等，各自含有预定量的试剂作为活性成分。组合物还可以作为大丸剂、药糖剂或糊剂施用。
片剂可通过压缩或模制来制备，任选地具有一种或多种辅助成分。压缩片剂可使用粘合剂(例如，明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，羟基乙酸淀粉钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂来制备。模制片剂可通过在合适机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉状肽或肽模拟物的混合物来制备。
片剂和其它固体剂型，如糖衣药丸、胶囊、丸剂和颗粒剂，可以任选地刻痕或制备成具有包衣和外壳，如肠溶包衣和药物配制领域中熟知的其它包衣。它们也可配制成使用例如不同比率的用于提供所希望的释放概况的羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、脂质体和/或微球体来提供其中的活性成分的的缓释或控释。它们可以通过例如经由细菌保留过滤器过滤、或通过并入灭菌剂来灭菌，成可在临使用前溶解于无菌水或一些其它无菌可注射介质中的无菌固体组合物形式。这些组合物还可以任选地含有遮光剂，并且可以是这样的组合物：它们仅仅或者优先在胃肠道的某些部分任选地以延迟方式释放一种或多种活性成分。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。适当时，活性成分还可以呈具有一种或多种上述赋形剂的微囊化形式。
用于口服施用的液体剂型包括药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除了聚合物-试剂缀合物、粒子或组合物外，液体剂型还可以含有本领域中常用的惰性稀释剂，诸如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯，及其混合物。
除了惰性稀释剂外，口服组合物还可以包括佐剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。
除了聚合物-试剂缀合物、粒子或组合物外，悬浮液还可以含有悬浮剂，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄芪胶，及其混合物。
适合于局部施用的药物组合物在所希望的治疗涉及局部应用可容易地接近的区域或器官时是有用的。对于皮肤的局部应用，药物组合物应配制成含有悬浮或溶解在载体中的活性组分的合适软膏剂。用于本文所述粒子的局部施用的载体包括但不限于：矿物油、液体石蜡、白石蜡、丙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，药物组合物可以配制成合适的洗液或霜剂，所述洗液或霜剂含有利用合适的乳化剂悬浮或溶解在载体中的活性粒子。合适的载体包括但不限于：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。本文所述的药物组合物还可以通过直肠栓剂制剂或以合适灌肠剂制剂局部施用至下肠道。局部经皮贴剂也包括在本文中。
本文所述的药物组合物可通过鼻气雾剂或吸入来施用。采用苄醇或其它合适的防腐剂、提高生物利用率的吸收促进剂、碳氟化合物和/或本领域已知的其它增溶剂或分散剂，根据药物配制领域中熟知的技术来制备这类组合物，并且可以制备成盐水中的溶液。
本文所述的药物组合物还可以栓剂的形式来施用用于直肠或阴道施用。栓剂可以通过将本文所述的一种或多种聚合物-试剂缀合物、粒子或组合物与在室温下为固体，但在体温下为液体的一种或多种合适的无刺激性的赋形剂混合来制备。因此组合物将在直肠或阴道腔内熔融并且释放聚合物-试剂缀合物、粒子或组合物。这类材料包括，例如可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸酯。适合于阴道施用的本发明的组合物还包括含有如在本领域已知是适当的载体的子宫托、卫生棉条、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫或喷雾制剂。
眼用制剂、眼用软膏剂、散剂、溶液等也涵盖在本发明的范围内。可以使眼组织(例如，眼的深皮层区、核上区或房水区)与允许分布至晶状体中的眼用制剂相接触。可以采用任何合适的施用或应用本发明的眼用制剂的方法(例如，局部、注射、肠胃外、空气传播等)。例如，接触可以经由局部施用或经由注射而进行。
剂量和给药方案
缀合物、粒子或组合物可以通过本领域的技术人员所已知的常规方法配制成药学上可接受的剂型。
可改变本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平以便获得对于特定受试者、组合物以及施用模式有效实现所希望的治疗反应，而对受试者无毒的活性成分的量。
在一个实施方案中，缀合物、粒子或组合物以以下剂量施用至受试者：例如，约0.001至300mg/m2、约0.002至200mg/m2、约0.005至100mg/m2、约0.01至100mg/m2、约0.1至100mg/m2、约5至275mg/m2、约10至250mg/m2，例如约0.001、0.002、0.005、0.01、0.05、0.1、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、1R0、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290mg/m2。可以按照规则的时间间隔，如每1、2、3、4或5天、或每周、或每2、3、4、5、6或7或8周进行施用。施用可以历时约10分钟至约6小时的时间段，例如，约30分钟至约2小时、约45分钟至约90分钟，例如约30分钟、45分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或更长时间。在一个实施方案中，聚合物-试剂缀合物、粒子或组合物以大丸剂输注或静脉推注，例如历时15分钟、10分钟、5分钟或更短的时间段来施用。在一个实施方案中，缀合物、粒子或组合物是以使得所希望剂量的试剂被施用的量来施用。优选地，缀合物、粒子或组合物的剂量是本文所述的剂量。
在一个实施方案中，受试者接收1、2、3，至10、至12、至15次治疗或更多次，或者直到病症或病症的症状得以治愈、恢复、缓解、减轻、改变、纠正、改良、缓和、改善或受到影响。例如，受试者每1、2、3或4周接收一次输注，直到病症或病症的症状得以治愈、恢复、缓解、减轻、改变、纠正、改良、缓和、改善或受到影响。优选地，给药方案是本文所述的给药方案。
缀合物、粒子或组合物可以单独地或与另外的一种或多种试剂组合施用作为一线治疗。在其它实施方案中，缀合物、粒子或组合物在受试者已经发展出对一线治疗的抗性、未能回应一线治疗或在一线治疗后复发之后施用。缀合物、粒子或组合物可以与第二试剂组合施用。优选地，缀合物、粒子或组合物与本文所述的第二试剂组合施用。第二试剂可以与粒子中的核酸试剂相同或不同。
试剂盒
本文所述的缀合物、粒子或组合物可以在试剂盒中提供。试剂盒包括本文所述的缀合物、粒子或组合物以及任选地容器、药学上可接受的载体和/或信息材料。信息材料可以是涉及本文所述的方法和/或粒子用于本文所述的方法的用途的说明性、介绍性、营销或其它材料。
试剂盒的信息材料在其形式方面不受限制。在一个实施方案中，信息材料可以包括有关缀合物、粒子或组合物的生产、缀合物、粒子或组合物的物理特性、浓度、到期日期、批次或生产位置信息的信息等等。在一个实施方案中，信息材料涉及用于施用缀合物、粒子或组合物的方法。
在一个实施方案中，信息材料可以包括关于例如以合适的剂量、剂型或施用模式(例如，本文所述的剂量、剂型或施用模式)，以合适的方式施用本文所述的缀合物、粒子或组合物以执行本文所述的方法的说明。在另一个实施方案中，信息材料可以包括关于将本文所述的缀合物、粒子或组合物施用至合适的受试者，例如人，例如患有本文所述的病症或存在患上本文所述的病症的风险的人的说明。在另一个实施方案中，信息材料可以包括关于将本文所述的缀合物或粒子复原成药学上可接受的组合物的说明。
在一个实施方案中，试剂盒包括关于使用缀合物、粒子或组合物如用于治疗受试者的说明。说明可以包括用于复原或稀释缀合物、粒子或组合物以供特定受试者使用或与特定化疗剂组合使用的方法。说明还可以包括用于复原或稀释聚合物缀合物组合物以利用特定的施用手段，如通过静脉输注来使用的方法。
在另一个实施方案中，试剂盒包括关于治疗患有特定适应症的受试者的说明。试剂盒的信息材料在其形式方面不受限制。在许多情况下，信息材料(例如说明)以印刷物，例如，印刷文本、图片和/或照片，例如标签或印刷片提供。然而，信息材料还可以按照其它格式，如盲文、计算机可读材料、视频记录或音频记录来提供。在另一个实施方案中，试剂盒的信息材料是联系信息，例如，物理地址、电子邮件地址、网站或电话号码，其中试剂盒的用户可以获得关于本文所述的粒子和/或其在本文所述的方法中的用途的实质性信息。信息材料还可以按照格式的任意组合来提供。
除了本文所述的缀合物、粒子或组合物外，试剂盒的组合物还可以包括其它成分，如表面活性剂、冻干保护剂或稳定剂、抗氧化剂、抗细菌剂、增容剂、螯合剂、惰性气体、张力剂和/或粘性剂、溶剂或缓冲剂、稳定剂、防腐剂、调味剂(例如，苦味拮抗剂或甜味剂)、香料、例如用于对试剂盒中的一种或多种组分进行着色或染色的染料或着色剂，或其它修饰成分、药学上可接受的载体和/或用于治疗本文所述的病状或病症的第二试剂。或者，其它成分可以包括在试剂盒中，但是在与本文所述的粒子不同的组合物或容器中。在这类实施方案中，试剂盒可以包括关于混合本文所述的缀合物、粒子或组合物与其它成分，或关于将本文所述的缀合物、粒子或组合物与其它成分一起使用的说明。
在一个实施方案中，试剂盒包括第二治疗剂。在一个实施方案中，第二试剂呈冻干或液体形式。在一个实施方案中，缀合物、粒子或组合物和第二治疗剂在单独的容器中，并且在另一个实施方案中，缀合物、粒子或组合物和第二治疗剂被包装在同一容器中。
在一些实施方案中，试剂盒的组分储存在例如具有橡胶或硅酮外壳(例如，聚丁二烯或聚异戊二烯外壳)的密封小瓶中。在一些实施方案中，试剂盒的组分是在惰性条件下(例如，在氮气或另一种惰性气体如氩气下)储存。在一些实施方案中，试剂盒的组分是在无水条件(例如，具有干燥剂)下储存。在一些实施方案中，试剂盒的组分是在遮光容器如琥珀色小瓶中储存。
本文所述的缀合物、粒子或组合物可以按照任何形式，例如液体、冷冻、干燥或冻干形式提供。优选本文所述的缀合物、粒子或组合物大致上是纯的和/或无菌的。在一些实施方案中，缀合物、粒子或组合物是无菌的。当本文所述的缀合物、粒子或组合物是以液体溶液提供时，液体溶液优选是水溶液，其中无菌水溶液是优选的。在一个实施方案中，缀合物、粒子或组合物以冻干形式提供，并且任选地提供稀释溶液用于复原冻干试剂。稀释剂可以包括，例如盐或盐水溶液，例如pH在6与9之间的氯化钠溶液、乳酸林格氏注射溶液、D5W或PLASMA-LYTEA注射液(Baxter，Deerfield，IL)。
试剂盒可以包括用于含有本文所述的缀合物、粒子或组合物的组合物的一个或多个容器。在一些实施方案中，试剂盒含有用于组合物的单独的容器、分隔器或隔室和信息材料。例如，组合物可以包含在瓶子、小瓶、IV掺混袋、IV输注器、搭载器或注射器中，并且信息材料可以包含在塑料套筒或包装中。在其它实施方案中，试剂盒的单独元件是包含在单个、未分开的容器内。例如，组合物包含在已经附接有呈标签形式的信息材料的瓶子、小瓶或注射器中。在一些实施方案中，试剂盒包括多个(例如，一组)个别容器，所述容器各自含有本文所述的聚合物-试剂缀合物、粒子或组合物的一个或多个单位剂型(例如，本文所述的剂型)。例如，试剂盒包括多个注射器、安瓿、箔包装或泡罩包装，其各自含有单一单位剂量的本文所述的粒子。试剂盒的容器可以是气密性的、防水的(例如，对水分的变化或蒸发不渗透)和/或光密性的。
试剂盒任选地包括适合于施用组合物的装置，例如注射器、吸入器、移液管、镊子、测量匙、滴管(例如滴眼管)、拭子(例如，棉签或木制签)或任何这类递送装置。在一个实施方案中，装置是例如包装用于手术插入的医用植入装置。
使用粒子和组合物的方法
本文所述的聚合物-试剂缀合物、粒子或组合物可以例如在活体外或离体施用至培养中的细胞或例如在活体内施用至受试者，以治疗或预防多种疾病或病症(例如，癌症(例如实体肿瘤)、自身免疫性病症、心血管病症、炎症性病症、代谢性病症、感染性疾病等)。
因此，在另一方面，本发明的特点在于用于治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，其中疾病或病症是癌症(例如实体肿瘤)、自身免疫性病症、心血管病症、炎症性病症、代谢性病症或感染性疾病。方法包括施用有效量的本文所述的缀合物、粒子或组合物，由此治疗疾病或病症。在一个实施方案中，缀合物、粒子和组合物可以用作一线、二线或辅助治疗的一部分，并且还可以单独使用或者与一种或多种另外的治疗方案组合使用。
在一个实施方案中，本文公开的缀合物(例如，聚合物-核酸试剂缀合物)、粒子或组合物可以用于治疗或预防多种疾病或病症，并且可以用于将核酸试剂，例如反义或siRNA递送至例如有需要的受试者；用于治疗本文所述的疾病或病症，如癌症、炎症性或自身免疫性疾病或心血管疾病，包括下表A、B或C中所列的那些疾病。在实施方案中，聚合物-核酸试剂缀合物、粒子和组合物可以用作一线、二线或辅助治疗的一部分，并且还可以单独使用或者与一种或多种另外的治疗方案组合使用。
癌症
因此，在另一方面，本发明的特点在于用于治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，其中疾病或病症是癌症(例如实体肿瘤)。方法包括施用有效量的本文所述的缀合物、粒子或组合物由此治疗疾病或病症。在一个实施方案中，缀合物、粒子和组合物可以用作一线、二线或辅助治疗的一部分，并且还可以单独使用或者与一种或多种另外的治疗方案组合使用。
在实施方案中，所公开的聚合物-核酸试剂缀合物、粒子和组合物用于治疗或预防增生性病症，例如治疗肿瘤和其转移，其中肿瘤或其转移是本文所述的癌症。在试剂是诊断剂的一些实施方案中，本文所述的聚合物-试剂缀合物、粒子和组合物可以用于评估或诊断癌症。
在实施方案中，增生性病症是实体肿瘤、软组织肿瘤或液体肿瘤。示例性的实体肿瘤包括各种器官系统的恶性疾病(例如，肉瘤和癌瘤(例如，腺癌或鳞状细胞癌))，如脑、肺、乳房、淋巴、胃肠(例如结肠)以及泌尿生殖道(例如，肾、泌尿道上皮或睾丸肿瘤)、咽、前列腺以及卵巢的恶性疾病。示例性腺癌包括结肠直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌以及小肠癌。在实施方案中，方法包括评估或治疗软组织肿瘤，如肌腱、肌肉或脂肪的肿瘤，以及液体肿瘤。
在实施方案中，癌症是任何癌症，例如国家癌症研究所(NationalCancer Institute)描述的那些癌症。癌症可以是癌瘤、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤或混合型。国家癌症研究所描述的示例性癌症包括：
消化/胃肠癌，如肛门癌；胆管癌；肝外胆管癌；阑尾癌；类癌肿瘤、胃肠癌；结肠癌；结肠直肠癌，包括儿童结肠直肠癌；食管癌，包括儿童食管癌；胆囊癌；胃(gastric、stomach)癌，包括儿童胃癌；肝细胞(肝)癌，包括成人(原发性)肝细胞(肝)癌和儿童(原发性)肝细胞(肝)癌；胰腺癌，包括儿童胰腺癌；肉瘤、横纹肌肉瘤；胰岛细胞胰腺癌；直肠癌；以及小肠癌；
内分泌癌，如胰岛细胞癌(内分泌胰腺癌)；肾上腺皮质癌，包括儿童肾上腺皮质癌；胃肠类癌肿瘤；甲状旁腺癌；嗜铬细胞瘤；垂体瘤；甲状腺癌，包括儿童甲状腺癌；儿童多发性内分泌瘤形成综合症；以及儿童类癌肿瘤；
眼癌，如眼内黑色素瘤；以及成视网膜细胞瘤；
肌肉骨骼癌症，如尤因氏家族肿瘤，骨肉瘤/骨的恶性纤维组织细胞瘤；儿童横纹肌肉瘤；软组织肉瘤，包括成人和儿童软组织肉瘤；腱鞘的透明细胞肉瘤；以及子宫肉瘤；
乳腺癌，如包括儿童和男性乳腺癌和妊娠在内的乳腺癌；
神经癌症，如儿童脑干胶质瘤；脑瘤；儿童小脑星形细胞瘤；儿童大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤；儿童室管膜瘤；儿童成神经管细胞瘤；儿童松果体和幕上原始神经外胚层肿瘤；儿童视觉路径和下丘脑胶质瘤；其它儿童脑癌；肾上腺皮质癌；原发性中枢神经系统淋巴瘤；儿童小脑星形细胞瘤；成神经细胞瘤；颅咽管瘤；脊髓肿瘤；中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤；中枢神经系统胚胎肿瘤；以及儿童幕上原始神经外胚层肿瘤和垂体肿瘤；
泌尿生殖系统癌症，如膀胱癌，包括儿童膀胱癌；肾细胞(肾)癌；卵巢癌，包括儿童卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢低恶性度肿瘤；阴茎癌；前列腺癌；肾细胞癌，包括儿童肾细胞癌；肾盂和输尿管移行细胞癌；睾丸癌；尿道癌；阴道癌；外阴癌；宫颈癌；威尔姆氏肿瘤(Wilms tumor)和其它儿童肾肿瘤；子宫内膜癌；以及妊娠滋养细胞肿瘤；
生殖细胞癌，如儿童颅外生殖细胞瘤；性腺外生殖细胞瘤；卵巢生殖细胞瘤；和睾丸癌；
头颈部癌，如唇癌和口腔癌；口腔癌，包括儿童口腔癌；下咽癌；喉癌，包括儿童喉癌；具有隐匿原发性的转移性鳞状颈部癌；口癌；鼻腔和鼻窦癌；鼻咽癌，包括儿童鼻咽癌；口咽癌；甲状旁腺癌；咽癌；唾液腺癌，包括儿童唾液腺癌；咽喉癌；以及甲状腺癌；
血液/血细胞癌，如白血病(例如，急性成淋巴细胞白血病，包括成人和儿童急性成淋巴细胞白血病；急性骨髓性白血病，包括成人和儿童急性骨髓性白血病；慢性淋巴细胞性白血病；慢性粒细胞性白血病；以及毛细胞白血病)；淋巴瘤(例如，AIDS相关性淋巴瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；霍奇金氏(Hodgkin’s)淋巴瘤，包括成人和儿童霍奇金氏淋巴瘤和怀孕期间的霍奇金氏淋巴瘤；非霍奇金氏淋巴瘤，包括成人和儿童非霍奇金氏淋巴瘤和怀孕期间的非霍奇金氏淋巴瘤；蕈样肉芽肿病；Sézary综合症；沃尔丹斯特伦氏(Waldenstrom’s)巨球蛋白血症；以及原发性中枢神经系统淋巴瘤)；以及其它血液癌症(例如，慢性骨髓增生性病症；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；骨髓增生异常综合症；以及骨髓增生异常/骨髓增生性病症)；
肺癌，如非小细胞肺癌；以及小细胞肺癌；
呼吸系统癌症，如成人恶性间皮瘤；儿童恶性间皮瘤；恶性胸腺瘤；儿童胸腺瘤；胸腺癌；支气管腺瘤/类癌瘤，包括儿童支气管腺瘤/类癌瘤；成胸膜肺细胞瘤；非小细胞肺癌；以及小细胞肺癌；
皮肤癌，如卡波西氏(Kaposi’s)肉瘤；麦克尔(Merkel)细胞癌；黑色素瘤；以及儿童皮肤癌；
AIDS相关性恶性疾病；
其它儿童癌症，通常是儿童癌症以及原发部位不明的癌症；
并且上述癌症的转移也可以根据本文所述的方法进行治疗或预防。
本文所述的聚合物-试剂缀合物、化合物或组合物特别适合于治疗膀胱癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、结肠直肠癌以及乳腺癌的加速的或转移性癌症。
在一个实施方案中，提供方法用于如通过利用聚合物-试剂缀合物、化合物或组合物以及第二治疗剂进行治疗来组合治疗癌症。各种组合在本文中进行描述。组合可以减少哺乳动物宿主的肿瘤发展，减少其肿瘤负荷，或引起其肿瘤退化。
在一个实施方案中，施用例如含有靶向表A中所列的基因的siRNA的核酸试剂-聚合物缀合物、粒子或组合物例如以治疗或预防表A中所列的相关疾病。
表A.核酸试剂，例如siRNA可以靶向下表中所列的基因例如以治疗或预防相关疾病。
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Figure BDA00002844406901471
Figure BDA00002844406901481
炎症和自身免疫性疾病
在另一方面，本发明的特点在于用于治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，其中疾病或病症是炎症或自身免疫性疾病。方法包括施用有效量的本文所述的缀合物、粒子或组合物由此治疗疾病或病症。在一个实施方案中，缀合物、粒子和组合物可以用作一线、二线或辅助治疗的一部分，并且还可以单独使用或者与一种或多种另外的治疗方案组合使用。
在一个实施方案中，本文所述的聚合物-试剂缀合物、粒子、组合物以及方法可以用于治疗或预防与炎症相关联的疾病或病症。在实施方案中，本文所述的聚合物-试剂缀合物、粒子或组合物可以在炎症发作之前、炎症开始期间或之后施用。在实施方案中，预防上使用的聚合物-试剂缀合物、粒子或组合物是在任何炎症反应或症状之前提供。在实施方案中，施用聚合物-试剂缀合物、粒子或组合物可以预防或减弱炎症反应或症状。示例性的炎症性病状包括，例如多发性硬化症、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、退化性关节病、脊柱关节病、痛风性关节炎、全身性红斑狼疮、青少年关节炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、骨质疏松症、糖尿病(例如，胰岛素依赖型糖尿病或青少年发作型糖尿病)、经期痉挛、囊性纤维化、炎症性肠病、肠易激综合症、克罗恩氏病、粘液性结肠炎、溃疡性结肠炎、胃炎、食管炎、胰腺炎、腹膜炎、阿兹海默病、休克、强直性脊柱炎、胃炎、结膜炎、胰腺炎(急性或慢性)、多器官损伤综合症(如继发于败血症或外伤)、心肌梗塞、动脉粥样硬化、中风、再灌注损伤(例如，由于心肺分流术或肾透析)、急性肾小球肾炎、血管炎、热损伤(即晒伤)、坏死性小肠结肠炎、粒细胞灌输相关综合症和/或舍格伦氏综合症。示例性的皮肤的炎症性病症包括，例如湿疹、特应性皮炎、接触性皮炎、荨麻疹、硬皮病、银屑病以及具有急性炎症性组分的皮肤病。
在另一个实施方案中，本文所述的聚合物-试剂缀合物、粒子、组合物或方法可用于治疗或预防过敏和呼吸系统病状，包括哮喘、支气管炎、肺纤维化、过敏性鼻炎、氧中毒、肺气肿、慢性支气管炎、急性呼吸窘迫综合症，以及任何慢性阻塞性肺病(COPD)。聚合物-试剂缀合物、粒子或组合物可以用于治疗慢性肝炎感染，包括乙型肝炎和丙型肝炎。
在实施方案中，本文所述的聚合物-试剂缀合物、粒子、组合物或方法可用于治疗自身免疫性疾病和/或与自身免疫性疾病相关联的炎症，如器官-组织自身免疫性疾病(例如，雷诺氏综合症)、硬皮病、重症肌无力、移植排斥、内毒素休克、脓毒症、银屑病、湿疹、皮炎、多发性硬化症、自身免疫性甲状腺炎、葡萄膜炎、全身性红斑狼疮、阿狄森氏病、自身免疫性多腺体疾病(又称为自身免疫性多腺体综合症)以及格雷夫氏病。
在一个实施方案中，施用例如含有靶向表B中所列的基因的siRNA的核酸试剂-聚合物缀合物、粒子或组合物例如以治疗或预防表B中所列的相关疾病。
表B.核酸试剂，例如siRNA可以靶向下表中所列的基因例如以治疗或预防相关疾病。
Figure BDA00002844406901491
Figure BDA00002844406901501
Figure BDA00002844406901511
心血管疾病
在另一方面，本发明的特点在于用于治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，其中病症是心血管疾病。方法包括施用有效量的本文所述的缀合物、粒子或组合物由此治疗疾病或病症。在一个实施方案中，缀合物、粒子和组合物可以用作一线、二线或辅助治疗的一部分，并且还可以单独使用或者与一种或多种另外的治疗方案组合使用。
在实施方案中，所公开的方法可以用于预防和治疗心血管疾病。可以使用本文所述的聚合物-试剂缀合物、粒子、组合物和方法进行治疗或预防的心血管疾病包括心肌病或心肌炎；如特发性心肌病、代谢性心肌病、酒精性心肌病、药物诱发的心肌病、缺血性心肌病以及高血压性心肌病。也可以使用本文所述的聚合物-试剂缀合物、粒子、组合物和方法治疗或预防主要血管如主动脉、冠状动脉、颈动脉、脑血管动脉、肾动脉、髂动脉、股动脉以及腘动脉的动脉粥样硬化病症(大血管疾病)。在实施方案中，可以治疗或预防的其它血管疾病包括与血小板聚集、视网膜小动脉、肾小球小动脉、神经滋养血管、心脏小动脉，以及眼的相关毛细血管床、肾、心脏以及中枢和周边神经系统有关的那些疾病。本文所述的聚合物-试剂缀合物、粒子、组合物和方法还可以用于增加个体血浆中的HDL水平。
可以使用本文所述的聚合物-试剂缀合物、粒子、组合物和方法进行治疗的其它病症包括例如冠状动脉介入术之后的再狭窄，以及与高密度和低密度胆固醇的异常水平有关的病症。
在实施方案中，聚合物-试剂缀合物、粒子或组合物可以施用至正在经受或已经经受血管成形术的受试者。在一个实施方案中，聚合物-试剂缀合物、粒子或组合物施用至正在经受或已经经受利用支架置入进行血管成形术的受试者。在一些实施方案中，聚合物-试剂缀合物、粒子或组合物可以用作支架的涂层。
在实施方案中，聚合物-试剂缀合物、粒子或组合物可以在支架的植入过程中使用，例如作为单独的静脉施用，如作为支架的涂层。
在一个实施方案中，施用例如含有靶向表C中所列的基因的siRNA的核酸试剂-聚合物缀合物、粒子或组合物例如以治疗或预防表C中所列的相关疾病。
表C.核酸试剂，例如siRNA可以靶向下表中所列的基因例如以治疗或预防相关疾病。
如此已经描述了本发明的至少一个实施方案的多个方面，应理解本领域的技术人员将容易地想到各种改变、修改以及改进。这类改变、修改以及改进意欲为本公开内容的一部分，并且意欲在本发明的精神和范围之内。因此，前述说明和附图仅仅是举例的方式。
除非另外限定，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员所普遍理解的相同的含义。本文提及的所有公布、专利申请、专利以及其它参考文献以其全文以引用的方式并入本文。在矛盾的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例仅是示例性的，并不意欲为限制性的。
实施例
实施例1.5050PLGA的纯化和表征。
步骤A：将5050PLGA(300g，Mw：7.8kDa；Mn：2.7kDa)和丙酮(900mL)装入配备有机械搅拌器的3-L圆底烧瓶中。在环境温度下，将混合物搅拌1小时以形成澄清的带黄色溶液。
步骤B：将MTBE(9.0L，对于5050PLGA的质量来说是30体积)装入配备有机械搅拌器的具有底部排出阀的22-L夹套反应器中。将
Figure BDA00002844406901541
(795g)添加至溶液中，以约200rpm进行置顶式搅拌得到悬浮液。在1小时内将来自步骤A的溶液缓慢添加至这种悬浮液中。在添加聚合物溶液之后，将混合物再搅拌一小时并且通过聚丙烯过滤器进行过滤。用MTBE(3×300mL)洗涤滤饼，调节0.5小时，在环境温度下进行风干(通常为12小时)直到残留MTBE≤5wt％(如由1HNMR分析所测定)。
步骤C：将丙酮(2.1L，对于5050PLGA的质量来说是7体积)装入配备有机械搅拌器的具有底部排出阀的12-L夹套反应器中。将来自步骤B的聚合物/
Figure BDA00002844406901542
络合物装到反应器中，其中以约200rpm进行置顶式搅拌得到悬浮液。在环境温度下将悬浮液再搅拌1小时并且通过聚丙烯过滤器进行过滤。用丙酮(3×300mL)洗涤滤饼并且通过0.45mM在线过滤器净化组合滤液得到澄清的溶液。将这种溶液浓缩至约1000mL。
步骤D：将水(9.0L，30体积)装入配备有机械搅拌器的具有底部排出阀的22-L夹套反应器中并且使用冷冻器将水冷却至0℃至5℃。在2小时内，缓慢添加来自步骤C的溶液，其中以约200rpm进行置顶式搅拌。在添加溶液之后，将混合物再搅拌一小时并且通过聚丙烯过滤器进行过滤。将滤饼调节1小时，在环境温度下风干1天，然后真空干燥3天，得到呈白色粉末状的纯化5050PLGA[258g，86％产率]。1H NMR分析与所期望的产物范围一致并且Karl Fisher分析显示0.52wt％的水。通过HPLC(AUC，230nm)和GPC(AUC，230nm)来分析产物。方法产生了较窄的聚合物多分散性，即，Mw：8.8kDa以及Mn：5.8kDa。
实施例2.5050PLGA月桂酯的纯化和表征。
将MTBE(4L)和庚烷(0.8L)装入配备有机械搅拌器的12-L圆底烧瓶中。以约300rpm搅拌混合物，将5050PLGA月桂酯(65g)的丙酮(300mL)溶液逐滴添加至混合物中。随着时间的流逝形成胶质固体并且最终结块在烧瓶的底部上。缓慢倾析上清液并且在25℃真空下将固体干燥24小时得到呈白色粉末状的40g纯化5050PLGA月桂酯[产率：61.5％]。1H NMR(CDCl3，300MHz)：δ5.25-5.16(m，53H)，4.86-4.68(m，93H)，4.18(m，7H)，1.69-1.50(m，179H)，1.26(bs，37H)，0.88(t，J＝6.9Hz，6H)。1H NMR分析与所期望的产物范围一致。GPC(AUC，230nm)：6.02-9.9min，tR＝7.91min。
实施例3.7525PLGA的纯化和表征。
将12L MTBE装入配备有机械搅拌器的22-L圆底烧瓶中，在一小时内在约300rpm搅拌下向所述圆底烧瓶中逐滴添加7525PLGA(150g，约6.6kD)的二氯甲烷(DCM，750mL)溶液，从而形成胶质固体。缓慢倾析上清液并且将胶质固体溶解于DCM(3L)中。将溶液转移到圆底烧瓶中并且浓缩成残余物，在25℃真空下将所述残余物干燥40小时得到呈白色泡沫状的纯化7525PLGA[产率：62.7％]。1HNMR(CDCl3，300MHz)：δ5.24-5.15(m，68H)，4.91-4.68(m，56H)，3.22(s，2.3H，MTBE)，1.60-1.55(m，206H)，1.19(s，6.6H，MTBE)。1HNMR分析与所期望的产物范围一致。GPC(AUC，230nm)：6.02-9.9min，tR＝7.37min。
实施例4.O-乙酰基-5050-PLGA的合成、纯化以及表征。
将纯化的5050PLGA[220g，Mn为5700]和DCM(660mL)装入配备有置顶式搅拌器的2000-mL圆底烧瓶中。将混合物搅拌10分钟以形成澄清的溶液。将Ac2O(11.0mL，116mmol)和吡啶(9.4mL，116mmol)添加至溶液中，产生约0.5℃的最小温升。在环境温度下将反应搅拌3小时并且浓缩至约600mL。在1小时内，在约200rpm置顶式搅拌下将溶液添加至
Figure BDA00002844406901561
(660g)的MTBE(6.6L，30体积)悬浮液中。通过聚丙烯过滤器过滤悬浮液并且在环境温度下将滤饼风干1天。在置顶式搅拌下使悬浮液在丙酮(1.6L，约8体积)中悬浮1小时。通过玻璃烧结漏斗(粗料)来过滤浆料并且用丙酮(3×300mL)洗涤滤饼。通过
Figure BDA00002844406901562
垫来净化组合滤液得到澄清的溶液。在2小时内，在200rpm置顶式搅拌下将溶液浓缩至约700mL并且添加至冷水(7.0L，0℃至5℃)中。通过聚丙烯过滤器过滤悬浮液。用水(3×500mL)洗涤滤饼并且调节1小时得到543g湿饼。将湿饼转移到两个玻璃托盘上并且在环境温度下风干过夜得到338g湿润产物，然后在25℃下将所述湿润产物真空干燥2天，干燥至恒重，得到201g呈白色粉末状的产物[产率：91％]。1H NMR分析与所期望的产物范围一致。通过HPLC(AUC，230nm)和GPC(Mw：9.0kDa和Mn：6.3kDa)来分析产物。
实施例5.叶酸-PEG-PLGA-月桂酯的合成、纯化以及表征。
叶酸-PEG-PLGA-月桂酯的合成涉及叶酸与PEG双胺(Sigma-Aldrich，n＝75，MW3350Da)的直接偶合。因小分子量胺存在于产物中的可能性而对PEG双胺进行纯化。将4.9g PEG双胺溶解于DCM(25mL，5体积)中，然后在剧烈搅拌下转移到MTBE(250mL，50体积)中。聚合物以白色粉末状沉淀。然后过滤混合物并且在真空下干燥固体得到4.5g产物[92％]。固体的1H NMR分析得到清晰的光谱；然而，并非所有的醇基团都基于α-亚甲基至胺基的整合转化成胺(63％双胺，37％单胺)。
使用纯化的PEG双胺来合成叶酸-(γ)CO-NH-PEG-NH2。将叶酸(100mg，1.0当量)溶解于热DMSO(4.5mL，对于PEG双胺来说是3体积)中。将溶液冷却至环境温度并且添加(六氟磷酸2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲盐)(HATU，104mg，1.2当量)和N，N-二异丙基乙胺(DIEA，80μL，2.0当量)。将所得黄色溶液搅拌30分钟并且添加含PEG双胺(1.5g，2当量)的DMSO(3mL，2体积)。使用过量PEG双胺来避免PEG双胺的双加成物的可能形成并且提高叶酸的转化。在20℃下将反应搅拌16小时并且通过
Figure BDA00002844406901571
使用C18色谱柱(RediSep，43g，C18)来直接纯化反应。将含有产物的部分组合并且在真空下去除CH3CN。用氯仿(200mL×2)提取剩余水溶液(约200mL)。将组合的氯仿相浓缩至约10mL并且转移到MTBE中以沉淀出呈黄色粉末状的产物。为了完全去除材料中任何未反应的PEG双胺，用丙酮(200mL)将黄色粉末洗涤三次。在真空下干燥剩余固体得到黄色的半固体产物(120mg)。HPLC分析表明97％的纯度并且1H NMR分析显示产物是纯净的。
使叶酸-(γ)CO-NH-PEG-NH2与对硝基苯基-COO-PLGA-CO2-月桂基反应得到叶酸-PEG-PLGA-月桂酯。为了制备对硝基苯基-COO-PLGA-CO2-月桂基，将PLGA5050(月桂酯)[10.0g，1.0当量]和对硝基苯基氯甲酸酯(0.79g，2.0当量)溶解于DCM中。将一份TEA(3.0当量)添加至溶解的聚合物溶液中。在20℃下将所得溶液搅拌2小时并且1H NMR分析表明完全转化。然后将反应溶液转移到4∶1的MTBE/庚烷(50体积)的溶剂混合物中。产物发生沉淀并且胶化。倾析上清液并且将固体溶解于丙酮(20体积)中。过滤所得丙酮悬浮液并且将滤液浓缩至干燥得到呈白色泡沫状的产物[7.75g，78％，基于GPCMn＝4648]。1H NMR分析表明不具有可检出的对硝基苯酚的纯净产物。
将叶酸-(γ)CO-NH-PEG-NH2(120mg，1.0当量)溶解于DMSO(5mL)中并且添加TEA(3.0当量)。反应混合物的pH是8至9。添加含对硝基苯基-COO-PLGA-CO2-月桂基(158mg，1.0当量)的DMSO(1mL)并且通过HPLC来监测反应。在1小时内从HPLC色谱图观察到16.1分钟时的新峰(约40％，AUC，280nm)。用过量1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)处理反应混合物的小样品并且颜色立即变为深黄色。这一样品的HPLC分析表明对硝基苯基-COO-PLGA-CO2-月桂基和第16.1分钟的峰完全消失。反之，在叶酸-(γ)CO-NH-PEG-NH2右侧上出现峰。可以总结出在强碱条件下对硝基苯基-COO-PLGA-CO2-月桂基和可能的产物是不稳定的。为了鉴定16.1分钟时的新峰，通过
Figure BDA00002844406901581
来纯化约1/3的反应混合物。最终用1∶4的DMSO/CH3CN的溶剂混合物来洗脱材料。观察到这种材料是黄色的，这可以表明叶酸含量。由于存在大量DMSO，所以这种材料未与溶液分离。将含有未反应的叶酸-(γ)CO-NH-PEG-NH2的部分组合并且浓缩成残余物。这种残余物的水合茚三酮试验给出了阴性结果，这可能意味着PEG的末端缺少胺基。这种观察结果也可以说明反应的不完全转化。
通过来纯化其余的反应溶液。与前述纯化类似，色谱柱保留了可疑的黄色产物。使用含有0.5％TFA的MeOH来洗脱材料。将含有可能的产物的部分组合并且浓缩至干燥。这一样品的1HNMR分析表明了叶酸、PEG以及月桂基-PLGA的存在，并且这些区段的组合接近所有三种组分的期望的1∶1∶1比值。从HPLC和GPC分析都观察到了高纯度。基于GPC的Mn是8.7kDa。DMSO中的样品通过沉淀到MTBE中来进行回收。
实施例6.PLGA-PEG-PLGA核酸试剂缀合物的合成。
使用由Zentner等，Journal of Controlled Release，72，，2001，203-215开发的方法来合成三嵌段共聚物PLGA-PEG-PLGA。使用这一方法获得的PLGA的分子量是约3kDa。使用由Chen等，International Journal of Pharmaceutics，288，2005，207-218报道的类似方法来合成分子量范围为1至7kDa的PLGA。LA/GA比率通常是，但不限于1∶1的比率。最小PEG分子量将是2kDa，其中上限为30kDa。PEG的优选范围将是3至12kDa。PLGA分子量的最小值是4kDa并且最大值是30kDa。PLGA的优选范围将是7至20kDa。核酸试剂例如RNA试剂将通过适当的连接基(即，如实施例中所列出)而缀合到PLGA以形成聚合物-核酸试剂缀合物。此外，可以将相同的核酸试剂或不同的核酸试剂连接到另一个PLGA上以形成具有两个相同核酸试剂或两个不同核酸试剂的双核酸试剂-聚合物缀合物。可以单独从PLGA-PEG-PLGA或从由三嵌段共聚物构成的单核酸试剂或双核酸试剂-聚合物缀合物形成粒子。
实施例7.聚己内酯-聚(乙二醇)-聚己内酯(PCL-PEG-PCL)核酸试剂缀合物的合成。
按照Hu等，Journal of Controlled Release，118，2007，7-17中所报道，在催化剂(即，辛酸锡)存在下，使用开环聚合方法来合成三嵌段PCL-PEG-PCL。从所述合成获得的PCL的分子量范围是2至22kDa。也使用Ge等，Journal of Pharmaceutical Sciences，91，2002，1463-1473文章中所示的非催化方法来合成PCL-PEG-PCL。可以从所述特定合成获得的PCL的分子量范围是9至48kDa。类似地，使用由Cerrai等，Polymer，30，1989，338-343开发的另一种无催化剂方法来合成PCL分子量范围为1至9kDa的三嵌段共聚物。最小PEG分子量将是2kDa，其中上限为30kDa。PEG的优选范围将是3至12kDa。PCL分子量的最小值是4kDa并且最大值是30kDa。PCL的优选范围将是7至20kDa。核酸试剂例如RNA试剂将通过适当的连接基(即，如实施例中所列出)缀合到PCL以形成核酸试剂-聚合物缀合物。此外，可以将相同的核酸试剂或不同的核酸试剂连接到另一个PCL上以形成具有两个相同核酸试剂或两个不同核酸试剂的双核酸试剂-聚合物缀合物。可以单独从PCL-PEG-PCL或从由三嵌段共聚物构成的单核酸试剂或双核酸试剂-聚合物缀合物形成粒子。
实施例8.聚丙交酯-聚(乙二醇)-聚丙交酯(PLA-PEG-PLA)核酸试剂缀合物的合成。
将按照Chen等，Polymers for Advanced Technologies，14，2003，245-253中所报道，使用采用催化剂(即，辛酸锡)的开环聚合来合成三嵌段PLA-PEG-PLA共聚物。可以形成的PLA的分子量范围是6至46kDa。可以通过使用由Zhu等，Journal of Applied PolymerScience，39，1990，1-9所示的方法来实现较低的分子量范围(即，1至8kDa)。最小PEG分子量将是2kDa，其中上限为30kDa。PEG的优选范围将是3至12kDa。PLA分子量的最小值是4kDa并且最大值是30kDa。PLA的优选范围将是7至20kDa。核酸试剂例如RNA试剂将通过适当的连接基(即，如实施例中所列出)缀合到PLA以形成核酸试剂-聚合物缀合物。此外，可以将相同的核酸试剂或不同的核酸试剂连接到另一个PLA上以形成具有两个相同核酸试剂或两个不同核酸试剂的双核酸试剂-聚合物缀合物。可以单独从PLA-PEG-PLA或从由三嵌段共聚物构成的单核酸试剂或双核酸试剂-聚合物缀合物形成粒子。
实施例9.对二氧环己酮-共-丙交酯-聚(乙二醇)-对二氧环己酮-共-丙交酯(PDO-PEG-PDO)核酸试剂缀合物的合成。
在催化剂(2-乙基己酸锡)存在下，将使用由Bhattari等，PolymerInternational，52，2003，6-14开发的方法来合成三嵌段PDO-PEG-PDO。从所述方法获得的PDO的分子量范围是2至19kDa。最小PEG分子量将是2kDa，其中上限为30kDa。PEG的优选范围将是3至12kDa。PDO分子量的最小值是4kDa并且最大值是30kDa。PDO的优选范围将是7至20kDa。核酸试剂例如RNA试剂将通过适当的连接基(即，如实施例中所列出)缀合到PDO以形成核酸试剂-聚合物缀合物。此外，可以将相同的核酸试剂或不同的核酸试剂连接到另一个PDO上以形成具有两个相同核酸试剂或两个不同核酸试剂的双核酸试剂-聚合物缀合物。可以单独从PDO-PEG-PDO或从由三嵌段共聚物构成的单核酸试剂或双核酸试剂-聚合物缀合物形成粒子。
实施例10.多官能化的基于PLGA/PLA的聚合物的合成。
人们可以合成具有分散遍及聚合物链的官能团的PLGA/PLA相关聚合物，所述聚合物可容易地生物降解并且它的组分都是生物可降解组分(即，在人体内已知是安全的)。具体来说，可以合成衍生自3-S-[苄氧基羰基)甲基]-1，4-二噁烷-2，5-二酮(BMD)的PLGA/PLA相关聚合物(参见以下结构)。(以下结构意图表示具有括号内所示单体单元的无规共聚物。)示例性R基团包括负电荷、H、烷基以及芳烷基。
1.衍生自BMD的PLGA/PLA相关聚合物
Figure BDA00002844406901611
2.衍生自BMD和3，5-二甲基-1，4-二噁烷-2，5-二酮(双-DL-乳酸环二酯)的PLGA/PLA相关聚合物
Figure BDA00002844406901612
3.衍生自BMD和1，4-二噁烷-2，5-二酮(双-乙醇酸环二酯)的PLGA/PLA相关聚合物
Figure BDA00002844406901621
在一个优选实施方案中，将通过改变BMD和丙交酯的比率，用许多不同的侧官能团来制备衍生自BMD和-DL-乳酸环二酯的PLGA/PLA聚合物。为了便于参考，如果假设每种聚合物具有8kDa的数量平均分子量(Mn)，那么100wt％衍生自BMD的聚合物具有约46个侧羧酸基团(每0.174kDa有1个酸基团)。类似地，25wt％衍生自BMD以及75wt％衍生自3，5-二甲基-1，4-二噁烷-2，5-二酮(双-DL-乳酸环二酯)的聚合物具有约11个侧羧酸基团(每0.35kDa有1个酸基团)。相比较而言，未官能化的8kDaPLGA聚合物正好有1个酸基团，并且如果在线性PLGA/PLA聚合物的末端基团的官能化期间添加了4个位点，则每2kDa有1个酸基团或者如果4kDa分子连接了四个官能团，则每1kDa有1个酸基团。
具体来说，使用Kimura等，Macromolecules，21，1988，3338-3340的方法来开发衍生自BMD的PLGA/PLA相关聚合物。所述聚合物将具有乙醇酸和苹果酸的重复单元，每单元[RO(COCH2OCOCHR1O)nH，其中R是H或烷基或PEG单元等，并且R1是CO2H]上具有1个侧羧酸基团。针对每174个质量单位，存在一个侧羧酸基团。聚合物的分子量和聚合物多分散性可以随着不同的反应条件(即，引发剂类型、温度、处理条件)而改变。Mn范围可以是2至21kDa。而且，针对聚合物中的每两个单体组分，将存在一个侧羧酸基团。基于上述参考，NMR分析显示酯交换或其它机制未产生可检测量的β-苹果酸盐聚合物。
使用Kimura等，Polymer，1993，34，1741-1748开发的方法来合成衍生自BMD和3，5-二甲基-1，4-二噁烷-2，5-二酮(双-DL-乳酸环二酯)的另一种类型的PLGA/PLA相关聚合物。它们显示所使用的最高BMD比率是15mol％并且这被解释成含有14mol％(16.7wt％)BMD衍生单元的聚合物。这种水平的BMD并入表示每8kDa聚合物有约8个羧酸残基(每kDa的聚合物有1个羧酸残基)。与单独使用BMD类似，未检测到衍生自β-苹果酸盐的聚合物。而且，Kimura等报道了玻璃化转变温度(Tg)是处于低20℃+范围内，尽管使用了高聚合物分子量(36至67kDa)g无论羧酸是游离的还是为苄基，对于这些聚合物来说Tg都是20℃至23℃。纳入更硬化的要素(即，可以形成强氢键的羧酸)应增大Tg。由于可能的较低Tg值，将需要对衍生自所述特定聚合物的聚合物药物缀合物形成的任何粒子的聚结的可能防止进行评估。
用于合成含有不同量乙醇酸苹果酸苄酯的PLA-PEG聚合物的另一方法涉及在3，5-二甲基-1，4-二噁烷-2，5-二酮(双-DL-乳酸环二酯)存在下使BMD聚合，由Lee等，Journal of Controlled Release，94，2004，323-335所报道。它们报道了，取决于聚合中所使用的BMD的量，合成聚合物在具有约5至8kDa(聚合物总重是约11至13kDa，其中PEG是5kDa)的PLA链中含有1.3至3.7个羧酸单元。在一种聚合物中，存在3.7个羧酸单元/疏水嵌段，其中BMD表示疏水嵌段重量的约19wt％。BMD与丙交酯的比率类似于Kimura等，Polymer，1993，34，1741-1748所观察到的比率并且酸残基在所得聚合物中是类似的(每kDa的疏水聚合物约有1个酸单元)。
使用由Kimura等，International Journal of BiologicalMacromolecules，25，1999，265-271开发的方法来制备用BMD官能化的更容易水解的聚合物。它们报道了，水解的速率与所存在的游离酸基团的数目相关(其中具有更多酸基团的聚合物水解更快)。聚合物具有约5mol％或10mol％的BMD含量。而且，在Lee等，Journal ofControlled Release，94，2004，323-335的参考文献中，侧酸基团的浓度最高时聚合物水解的速率最快(对于含有19.5wt％的BMD的聚合物是6天并且对于含有0wt％的BMD的聚合物是20天)。
核酸试剂例如DNA试剂或RNA试剂可以缀合到衍生自BMD的PLGA/PLA相关聚合物(参考上述实施例)。类似地，可以从这种核酸试剂-聚合物缀合物制备粒子。
实施例11.使用苹果酸苄酯的β-内酯制备的聚合物的合成。
人们可以通过使MePEGOH与苹果酸RS-β-苄基内酯(β-内酯)和DL-丙交酯(乳酸的环二酯)聚合来制备聚合物得到含有MePEG(乳酸)(苹果酸)Me(OCH2CH2O)[OCCCH(CH3)O]m[COCH2CH(CO2H)O]的聚合物，如由Wang等，Colloid Polymer Sci.，2006，285，273-281所开发。这些聚合物将可能更快降解，因为它们含有较高水平的酸性基团。应注意的是，使用β-内酯会产生与使用3-[(苄氧基羰基)甲基]-1，4-二噁烷-2，5-二酮所获得的聚合物不同的聚合物。在这些聚合物中，在不存在亚甲基间隔基的情况下，羧酸基团直接连接到聚合物链上。
Ouhib等，Ch.Des.Monoeres.Polym，2005，1，25报道了可以从β-内酯直接制备的另一种聚合物。所得聚合物(即，聚-3，3-二甲基苹果酸)作为游离酸可溶于水，在聚合物链的每个单元上具有侧羧酸基团并且还报道了3，3-二甲基苹果酸是无毒分子。
人们可以在3，5-二甲基-1，4-二噁烷-2，5-二酮(DDD)和β-丁内酯存在下聚合4-苄氧基羰基-，3，3-二甲基-2-氧杂环丁酮来产生具有侧羧酸基团的嵌段共聚物，如由Coulembier等，Macromolecules，2006，39，4001-4008所示。聚合反应在乙二醇存在下用卡宾催化剂来执行。所使用的催化剂是三唑卡宾催化剂，这形成了具有狭窄多分散性的聚合物。
实施例12.2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙胺的合成、纯化以及表征。
Figure BDA00002844406901641
在25mL圆底烧瓶中，将2，2′-二硫代联吡啶(2.0g，9.1mmol)溶解于具有乙酸(0.3mL)的甲醇(8mL)中。将半胱胺盐酸盐(520mg，4.5mmol)溶解于甲醇(5mL)中并且在1/2小时内逐滴添加至混合物中。将混合物搅拌过夜。然后在真空下浓缩混合物得到黄色的油。将油回溶于甲醇(5mL)中，然后沉淀至乙醚(100mL)中。滤出沉淀并且干燥。然后将沉淀再次溶解于甲醇(5mL)中并且沉淀至乙醚(100mL)中。再将所述程序重复两次。滤出淡黄色固体并且干燥得到最终产物(0.74g，74％产率)，所述最终产物在未进一步纯化的情况下就可使用。1HNMR分析与所期望的产物范围一致。
实施例13.3-(2-(吡啶-2-基)二硫基)丙酸的合成、纯化以及表征。
Figure BDA00002844406901651
在250mL圆底烧瓶中，将2，2′-联吡啶二硫醚(8.3g，38mmol)溶解于具有乙酸(1.5mL)的甲醇(100mL)中。将3-巯基丙酸(2.0g，19mmol)添加至溶液中并且在环境温度下搅拌18小时。在真空下去除溶剂得到黄色的油和固体混合物。以DCM∶MeOH(30∶1)通过快速柱色谱法来纯化反应混合物。然后通过重结晶来进一步纯化得到白色晶体(1.2g，29％)。1H NMR分析与所期望的产物范围一致。
实施例14.琥珀酸-5050PLGA-mPEG2k的合成、纯化以及表征。
Figure BDA00002844406901661
在50mL圆底烧瓶中，将mPEG2k-5050PLGA9k(MW＝11k，5.0g，0.45mmol)、琥珀酸酐(91mg，0.91mmol)以及DMAP(56mg，0.45mmol)溶解于二氯甲烷(15mL)中并且在环境温度下搅拌18小时。将聚合物沉淀至
Figure BDA00002844406901662
(15g)于乙醚(100mL)中的悬浮液中。滤出
Figure BDA00002844406901663
并且干燥过夜。将丙酮(50mL)添加至中并且搅拌1/2小时。然后对其进行过滤，用丙酮洗涤，并且在真空下浓缩至约5mL。它在乙醚(50mL)中沉淀出来，产生带有褐色胶质的褐色油脂状固体。将胶质保留在冷冻机(-20℃)中直到固化(约15分钟)。然后在真空下干燥胶质得到淡褐色固体(3.2g，58％产率)。1H NMR分析与所期望的产物范围一致。
实施例15.N，N-二乙基二亚乙基三胺-琥珀酰胺-5050PLGA-mPEG2k的合成、纯化以及表征。
在50mL圆底烧瓶中，将mPEG2k-5050PLGA9k-琥珀酸酯(2.0g，0.26mmol)溶解于DCM(10mL)中。将N，N-二乙基二亚乙基三胺(210mg，1.3mmol)、NHS(61mg、0.53mmol)以及EDC(82mg，0.53mmol)添加至反应混合物中。然后在室温下将反应混合物搅拌4小时。将Et2O(100mL)添加至反应混合物中以沉淀出聚合物。然后用Et2O(20mL)冲洗聚合物并且在真空下干燥得到淡褐色固体(1.9g，95％产率)。1H NMR分析与所期望的产物范围一致。
实施例16.2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙氨基-5050-PLGA-O-乙酰基的合成、纯化以及表征。
Figure BDA00002844406901672
在50mL圆底烧瓶中，将5050PLGA6.3k-O-乙酰基(2.0g，0.32mmol)、NHS(66mg，0.57mmol)以及EDC(122mg，0.63mmol)溶解于DMF(12mL)中。将含2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙胺(127mg，0.57mmol)和二异丙基乙胺(82mg，0.63mmol)的DMF(6mL)添加至反应混合物中。然后在室温下将反应混合物搅拌4小时。将水(40mL)添加至反应混合物中得到胶质固体。将胶质固体溶解于DCM(15mL)中并且用0.1％HCl水溶液(50mLx2)洗涤两次，接着用盐水(100mL)洗涤。用硫酸钠干燥有机层并且通过沉淀到冷乙醚(100mL)中来进一步纯化。去除溶剂并且在真空下干燥材料得到白色固体(1.4g，68％产率)。1H NMR分析与所期望的产物范围一致。
实施例17.N，N-二乙基二亚乙基三胺5050PLGA-O-乙酰基的合成、纯化以及表征。
Figure BDA00002844406901681
在50mL圆底烧瓶中，将5050PLGA-O-乙酰基(Mw：16kDa，2.0g，0.13mmol)溶解于DCM(10mL)中。将N，N-二乙基二亚乙基三胺(100mg，0.63mmol)、NHS(29mg、0.25mmol)以及EDC(39mg，0.25mmol)添加至反应混合物中。然后在室温下将反应混合物搅拌4小时。将冷Et2O(100mL)添加至反应混合物中以沉淀出聚合物。在真空下干燥沉淀出的聚合物得到白色泡沫。1H NMR分析与所期望的产物范围一致。
实施例18.琥珀酰亚胺基-N-羟基酯5050PLGA-O-乙酰基的合成、纯化以及表征。
在50mL圆底烧瓶中，将5050-PLGA9k-O-乙酰基(2g，0.33mmol)溶解于DCM(12mL)中，接着添加NHS(78mg，0.67mmol)和EDC(100mg，0.67mmol)。在室温下将反应混合物搅拌4小时。在DCM中使聚合物溶剂化并且通过在冷乙醚(50x3mL)中沉淀三次进行纯化。在真空下将固体干燥过夜并且通过1H NMR来分析。
实施例19.2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙氨基-mPEG10k的合成、纯化以及表征。
Figure BDA00002844406901692
在PBS缓冲液(pH7.2)中使胺基封端mPEG10k(5.5mg，0.0053mmol)与N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(1.12mg，0.032mmol)反应3小时并且通过透析(膜分子量截断值：3500)来纯化。冻干纯化的材料并且通过1H NMR来分析。
实施例20.2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)丙酸酯-5050-PLGA-mPEG2k的合成、纯化以及表征。
Figure BDA00002844406901701
在50mL圆底烧瓶中，将5050PLGA9k-O-mPEG2k(Mw.：11kDa，1.0g，0.09mmol)溶解于DCM(8mL)中。将3-(2-(吡啶-2-基)二硫基)丙酸(30mg，0.14mmol)、NHS(20mg，0.1mmol)以及EDC(22mg，0.17mmol)添加至反应混合物中。然后在室温下将反应混合物搅拌4小时。将冷Et2O(100mL)添加至反应混合物中以沉淀出聚合物。在真空下干燥沉淀出的聚合物得到白色泡沫。1H NMR分析与所期望的产物范围一致。
实施例21.叠氮封端-PEG连接基-5050PLGA-O-乙酰基的合成、纯化以及表征。
在50mL圆底烧瓶中，将5050PLGA-O-乙酰基(2.0g，0.13mmol)溶解于DCM(10mL)中。将叠氮-PEG8-OH(40mg，0.13mmol)、NHS(29mg、0.25mmol)以及EDC(39mg，0.25mmol)添加至反应混合物中。然后在室温下将反应混合物搅拌4小时。然后将冷Et2O(100mL)添加至反应混合物中以沉淀出聚合物。在真空下干燥沉淀出的聚合物得到白色泡沫。执行1H NMR分析来确定所需化合物的身份。
实施例21a.谷氨酸-PLGA5050-O-乙酰基的合成、纯化以及表征。
将5050PLGA-O-乙酰基(40g，5.88mmol)、谷氨酸二苄酯(3.74g，7.35mmol)以及DMF(120mL，3体积)装入500-mL圆底烧瓶中并且混合10分钟得到澄清的溶液。添加CMPI(2.1g，8.23mmol)和TEA(2.52mL)并且在环境温度下将溶液搅拌3小时。在0.5小时内，在置顶式搅拌下将带黄色的溶液添加至
Figure BDA00002844406901712
(120g)于MTBE(2.0L)中的悬浮液中。过滤固体，用MTBE(300mL)洗涤，并且在25℃下真空干燥16小时。然后将固体悬浮在丙酮(400mL，10体积)中，搅拌0.5小时，过滤并且用丙酮(3x100mL)洗涤滤饼。将合并的滤液浓缩至150mL并且在0.5小时内在置顶式搅拌下添加至冷水(3.0L，0℃至5℃)中。将所得悬浮液搅拌2小时并且通过PP过滤器进行过滤。将滤饼风干3小时，然后在28℃下真空干燥16小时得到产物谷氨酸二苄酯5050PLGA-O-乙酰基(40g，产率：95％)。1H NMR分析表明乳酸的苄基芳香性质子与甲烷质子的比率是10∶46。HPLC分析表明96％纯度(AUC，227nm)并且GPC分析显示Mw8.9kDa和Mn6.5kDa。
将谷氨酸二苄酯5050PLGA-O-乙酰基(40g)溶解于乙酸乙酯(400mL)中得到带黄色的溶液。将炭(10g)添加至混合物中并且在环境温度下搅拌1小时。通过
Figure BDA00002844406901721
垫(60mL)来过滤溶液得到无色滤液。用乙酸乙酯(3x50mL)洗涤滤饼并且将合并的滤液浓缩至400mL。添加载钯活性炭(Pd/C，5wt％，4.0g)，1分钟内将混合物抽空，使用气球使烧瓶充满H2，并且在环境温度下将反应搅拌3小时。通过
Figure BDA00002844406901722
垫(100mL)过滤溶液并且用丙酮(3x50mL)洗涤滤饼。合并的滤液带有灰色并且将合并的滤液浓缩至200mL。在0.5小时内，在置顶式搅拌下将溶液添加至(120g)于MTBE(2.0L)中的悬浮液中。在环境温度下将悬浮液搅拌1小时并且通过PP过滤器进行过滤。在环境温度下将滤饼干燥16小时，悬浮在丙酮(400mL)中，并且搅拌0.5小时。通过PP过滤器过滤溶液并且用丙酮(3x50mL)洗涤滤饼。为了去除任何残余的Pd，在环境温度下在置顶式搅拌下持续16小时添加大孔聚苯乙烯-2，4，6-三聚硫氰酸树脂(MP-TMT，2.0g，Biotage，容量：0.68mmol/g)。通过
Figure BDA00002844406901724
垫过滤溶液得到淡灰色溶液。将溶液浓缩至200mL并且在0.5小时内在置顶式搅拌下添加至冷水(3.0L，0℃至5℃)中。在＜5℃下，将所得悬浮液搅拌1小时并且通过PP过滤器进行过滤。将滤饼风干12小时并且真空干燥2天得到半玻璃质固体(谷氨酸-PLGA5050-O-乙酰基，38g，产率：95％)。HPLC分析显示99.6％纯度(AUC，227nm)并且GPC分析表明Mw8.8kDa和Mn6.6kDa。
实施例21b.双-(N1-精胺)谷氨酰胺-5050PLGA-O-乙酰基的合成以及纯化。
Figure BDA00002844406901731
将谷氨酸-PLGA5050-O-乙酰基(1.4g，0.26mmol)、(N1-PLGA-N5，N10，N14-三-Cbz)-精胺(630mg，1.0mmol)、DCC(160mg，0.77mmol)、NHS(89mg，0.77mmol)以及TEA(160mg，1.5mmol)溶解于DCM(50mL)中并且在室温下搅拌过夜。在真空下去除DCM。将DMF溶液添加至乙醚(50mL)中以分离黄色材料。然后用MeOH(25mL)将黄色材料洗涤两次，并且接着用水(25mL)洗涤。然后将黄色材料冻干得到白色固体双-(N1-PLGA-N5，N10，N14-三-Cbz)-精胺谷氨酰胺-5050PLGA-O-乙酰基(1.3g，93％产率)。
将双-(N1-PLGA-N5，N10，N14-三-Cbz)-精胺谷氨酰胺-5050PLGA-O-乙酰基(1.0g，0.15mmol，MW6，600)溶解于含33％HBr的乙酸(5mL)中得到澄清的褐色溶液并且在室温下将反应混合物搅拌2小时。然后将褐色溶液添加至乙醚(100mL)中。用MeOH(30mL)冲洗固体。倾析固体并且用水(30mL)再洗涤。然后将固体冷冻并且冻干得到淡黄色固体(0.79g，79％产率)。
实施例22.寡核苷酸-C6-SS-5050PLGA-O-乙酰基的合成、纯化以及表征。
在95∶5DMSO∶TE缓冲液的溶剂混合物(1mL)中将经过C6-硫醇修饰的寡核苷酸(siRNA，0.2mg，14.7nmol)缀合到实施例16中所制备的2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙氨基-5050-PLGA-O-乙酰基(10mg，1.58μmol)。在65℃下将反应混合物搅拌2小时。通过反相HPLC和凝胶电泳来分析寡核苷酸-5050-PLGA-O-乙酰基缀合物。
Figure BDA00002844406901741
实施例22a.寡核苷酸-C6-SS-5050PLGA-O-乙酰基的合成、纯化以及表征。
在95∶5DMSO∶TE缓冲液的溶剂混合物(10mL)中将经过C6-硫醇修饰的寡核苷酸(siRNA，20mg，1.51μmol)缀合到实施例16中所制备的2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙氨基-5050-PLGA-O-乙酰基(85mg，11μmol)，所述寡核苷酸是针对EGFP(增强型绿色荧光蛋白)，具有13.2kDa的Mw，含有具有与EGFP序列的一部分大致上相同的核苷酸序列的有义链，长度为19个碱基对，具有UU悬突，并且具有互补反义链。在65℃下将反应混合物搅拌3小时。通过反相HPLC和凝胶电泳来分析寡核苷酸-5050-PLGA-O-乙酰基缀合物。
Figure BDA00002844406901742
实施例22b.寡核苷酸-C6-SS-5050PLGA-O-乙酰基的合成、纯化以及表征。
在95∶5DMSO∶TE缓冲液的溶剂混合物(10mL)中将针对荧光素酶的经过C6-硫醇修饰的寡核苷酸(siRNA，20mg，1.51μmol，Mw为13.6kDa)缀合到实施例16中所制备的2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙氨基-5050-PLGA-O-乙酰基(85mg，11μmol)，所述寡核苷酸含有具有与荧光素酶序列的一部分大致上相同的核苷酸序列的有义链，长度为19个碱基对，具有UU悬突，并且具有互补反义链。在65℃下将反应混合物搅拌3小时。通过反相HPLC和凝胶电泳来分析寡核苷酸-5050-PLGA-O-乙酰基缀合物。
Figure BDA00002844406901751
实施例23.寡核苷酸-C6-SS-5050PLGA-O-mPEG2k的合成、纯化以及表征。
在溶剂混合物(20∶80，PBS∶ACN，pH8，0.6mL)中将经过C6-硫醇修饰的寡核苷酸(siRNA或DNA，2mg，0.13μmol)(如实施例22中所使用)缀合到2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙氨基-5050PLGA-mPEG2k(6.9mg，0.625μmol)。在室温下于氩气中将反应混合物搅拌48小时。通过制备型阴离子交换和反相HPLC来分析和纯化寡核苷酸-5050PLGA-mPEG2k缀合物。
实施例24.经由粒子形成对寡核苷酸-C6-SS-5050PLGA-O-乙酰基进行的合成、纯化以及表征。
在缓冲液(PBS，pH8，0.4mL)中将经过C6-硫醇修饰的寡核苷酸(siRNA或DNA，2mg，0.13μmol)(如实施例22中所使用)缀合到含有2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙氨基-5050-PLGA-O-乙酰基的预成型粒子(4mg，0.625μmol)。在室温下于氩气中将反应混合物搅拌48小时。通过制备型阴离子交换和反相HPLC来分析和纯化寡核苷酸-5050PLGA-mPEG2k缀合物。
实施例25.寡核苷酸-C12-酰胺-5050PLGA-O-乙酰基的合成、纯化以及表征。
在溶剂混合物(20∶80，PBS∶ACN，pH8，0.4mL)中将经过C12-氨基修饰的寡核苷酸(siRNA或DNA，2mg，0.13μmol)缀合到琥珀酰亚胺基-N-羟基酯5050PLGA-O-乙酰基(4mg，0.625μmol)。在室温下于氩气中将反应混合物搅拌48小时。通过制备型阴离子交换和反相HPLC来分析和纯化寡核苷酸-C12酰胺5050PLGA-O-乙酰基缀合物。
Figure BDA00002844406901761
实施例26.寡核苷酸-PEG-酯-5050PLGA-O-乙酰基的合成、纯化以及表征。
在具有DMAP(0.625mmol)的DMSO(0.4mL)中，将经过PEG修饰的寡核苷酸(siRNA或DNA，2mg，0.13μmol)缀合到琥珀酰亚胺基-N-羟基酯5050PLGA-O-乙酰基(4mg，0.625μmol)。在室温下于氩气中将反应混合物搅拌48小时。通过制备型阴离子交换和反相HPLC来分析和纯化寡核苷酸-C18PEG5050PLGA-O-乙酰基缀合物。
Figure BDA00002844406901762
实施例27.寡核苷酸-SS-mPEG的合成以及纯化。
在缓冲液(PBS，pH8，0.4mL)中将经过C6-硫醇修饰的寡核苷酸(siRNA或DNA，2mg，0.13μmol)(如实施例22中所使用)缀合到2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙氨基-mPEG10k(6.5mg，0.625μmol)。在室温下于氩气中将反应混合物搅拌48小时。使用
Figure BDA00002844406901763
色谱柱通过HPLC分析来分析和纯化反应混合物。
实施例28.寡核苷酸-C12-酰胺-5050PLGA-mPEG2k的合成、纯化以及表征。
在溶剂混合物(50∶50，PBS∶ACN，pH8，0.4mL)中将经过C12-氨基修饰的寡核苷酸(siRNA或DNA，2mg，0.13μmol)(如实施例25中所使用)缀合到mPEG2k-5050PLGA-琥珀酸酯(4mg，0.625μmol)。在室温下于氩气中将反应混合物搅拌48小时。通过制备型阴离子交换和反相HPLC来分析和纯化寡核苷酸-C12酰胺5050PLGA-mPEG2k缀合物。
实施例29.寡核苷酸-PEG-酯-5050PLGA-mPEG2k的合成、纯化以及表征。
在具有DMAP(0.625mmol)的溶剂混合物(50∶50，PBS∶ACN，pH8，0.4mL)中将经过PEG修饰的寡核苷酸(siRNA或DNA，2mg，0.13μmol)(如实施例26中所使用)缀合到mPEG2k-5050PLGA-琥珀酸酯(4mg，0.625μmol)。在室温下于氩气中将反应混合物搅拌48小时。通过制备型阴离子交换和反相HPLC来分析和纯化寡核苷酸-C18PEG5050PLGA-mPEG2k缀合物。
实施例30.寡核苷酸-C6-三唑-PEG-5050PLGA-O-乙酰基的合成、纯化以及表征。
将10μL预络合Cu(I)(10mM；在叔丁醇∶DMSO1∶3中将1mgCuBr(99.99％)溶解于700μL10mM TBTA三(苄基三唑基甲基)胺配体中)添加至C6-炔修饰的寡核苷酸(siRNA或DNA)(1至4pmolsiRNA或DNA，10mM Tris)和叠氮封端-PEG-5050PLGA-O-乙酰基溶液(10μL5mM，用含5％tBuOH的10mM Tris自DMSO中的0.1N储备液稀释)(实施例21)的反应混合物中。在室温下将样品搅拌2小时。通过阴离子型交换和反相HPLC来分析反应混合物。
Figure BDA00002844406901781
实施例31.寡核苷酸-PEG-三唑-PEG-5050PLGA-O-乙酰基的合成、纯化以及表征。
将10μL预络合Cu(I)(10mM；在叔丁醇∶DMSO1∶3中将1mgCuBr(99.99％)溶解于700μL10mM TBTA三(苄基三唑基甲基)胺配体中)添加至炔-PEG修饰的寡核苷酸(siRNA或DNA)(1至4pmolsiRNA或DNA，10mM Tris)和叠氮封端-PEG-5050PLGA-O-乙酰基溶液(10μL5mM，用含5％tBuOH的10mM Tris自DMSO中的0.1N储备液稀释)(实施例21)的反应混合物中。在室温下将样品搅拌2小时。通过阴离子型交换和反相HPLC来分析反应混合物。
Figure BDA00002844406901782
实施例31a.三甲基丙铵PVA(阳离子PVA)的合成、纯化以及表征。
在65℃下将PVA(0.056mmol，80％水解，粘度2.5至3.5cP，Sigma-Aldrich)溶解于DMSO(5mL)中，接着添加氢化钠(12.5mmol)。将反应混合物搅拌1小时，接着添加缩水甘油基三甲基氯化铵(13mmol)。(参见以下方案。)在65℃下将反应混合物搅拌过夜。将反应混合物透析5天并且冻干得到淡褐色的产物。通过H1NMR来分析产物。
Figure BDA00002844406901791
[阳离子PVA也可以购自Kuraray，包括例如，阳离子PVACM-318(Kuraray)(C10H21N2O.C4H6O2.C2H4O.Cl)x1-N，N，N-三甲基-s-[(2-甲基-1-氧代-2-丙烯-1-基)氨基]-氯化丙铵(1∶1)，含有乙醇和乙酸乙烯酯的聚合物。]
实施例32.经由纳米沉淀(包括阳离子PVA)对含有siRNA的聚乙二醇化粒子的配制以及表征。
将O-乙酰基5050PLGA(60mg，54.5wt％)(实施例4)、共聚物mPEG(2k)-PLGA(40mg，36.4wt％，Mw11kDa)以及siRNA(10mg，Mw14，929)溶解于比率为1∶4的Tris-EDTA缓冲液∶乙腈的溶剂混合物中。聚合物的总浓度是1.0wt％。在另一溶液中，将0.3％w/v PVA(80％水解，粘度2.5至3.5cP)和0.2％w/v阳离子PVA(Kuraray)(参见实施例65中的评注)(86％至91％水解，粘度17至27cP)溶解于水中。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至水溶液(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中。通过将溶液搅拌2至3小时来去除有机溶剂。然后用10体积缓冲液洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。使用荧光测定来定量siRNA的负载。(参见实施例70b。)使用RNA作为标准物利用
Figure BDA00002844406901802
试剂产生校准曲线。在480nm激发波长和520nm发射波长下测量siRNA的荧光。
通过使用上述方法中制得的所得多个粒子所评估的粒子特性：
Zavg＝119nm
PDI＝0.142
Dv50＝94.9nm
Dv90＝191nm
siRNA负载：1％w/w
实施例32a.经由纳米沉淀(包括阳离子PVA)对含有siRNA的聚乙二醇化的粒子的配制以及表征。
将聚合物O-乙酰基PLGA5050(120mg，57.1wt％)(实施例4)、共聚物mPEG2k-PLGA(80mg，38.1wt％，Mw11kDa)以及siRNA(10mg，4.8wt.％，Mw13.0kDa)溶解于比率为1∶4的Tris-EDTA缓冲液∶乙腈的溶剂混合物中，所述siRNA含有具有与EGFP序列的一部分大致上相同的核苷酸序列的有义链，所述有义链长度为19个碱基对、具有UU悬突并且具有互补反义链。聚合物的总浓度是1.0wt％。在另一溶液中，将0.3％w/v PVA(80％水解，粘度2.5至3.5cP)和0.2％w/v阳离子PVA(86％至91％水解，粘度17至27cP)溶解于水中。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至水溶液(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中。然后用10体积缓冲液洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。以RNA为标准品，使用
Figure BDA00002844406901803
荧光测定来定量siRNA的负载。在480nm激发波长和520nm发射波长下测量siRNA的荧光。
通过使用上述方法中制得的所得多个粒子所评估的粒子特性：
Zavg＝131.5nm
PDI＝0.156
Dv50＝123nm
Dv90＝202nm
siRNA负载：1.1％w/w
实施例32b.经由纳米沉淀(包括阳离子PVA)对含有siRNA的聚乙二醇化的粒子的配制以及表征。
按照实施例32a中所述来制备含有SiRNA的聚乙二醇化粒子。代替实施例32中所使用的EGFP siRNA，使用荧光素酶siRNA(Mw为13617Da)，所述荧光素酶siRNA含有具有与荧光素酶序列的一部分大致上相同的核苷酸序列的有义链，所述有义链长度为19个碱基对，具有UU悬突并且具有互补反义链。
通过使用上述方法中制得的所得多个粒子所述评估的粒子特性：
Zavg＝114.1nm
PDI＝0.163
Dv50＝103nm
Dv90＝182nm
siRNA负载：1.4％wt/wt
实施例33c.在没有阳离子物质的情况下对含有DNA的聚乙二醇化的粒子的形成以及表征。
在丙酮中将O-乙酰基PLGA(57wt.％，Mw10kDa)和mPEG2k-PLGA(38wt％，Mw11kDa)溶解以形成1.0％聚合物的总浓度。在另一溶液中，将具有21个碱基对的DNA(5wt.％，Mw12835)溶解于0.5％w/v PVA(80％水解，粘度2.5至3.5cP，Sigma-Aldrich)的水溶液中。经由纳米沉淀以239mL/min的总流速在搅拌下添加聚合物丙酮溶液(有机相与水相的v/v比率等于1∶8)。通过将溶液搅拌2至3小时来去除丙酮。然后用10体积水洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝50cm2)进行浓缩。
通过使用上述方法中制得的所得多个粒子所评估的粒子特性：
Zavg＝217nm
PDI＝0.12
Dv50＝233nm
Dv90＝413nm
ζ电位＝-22mV
药物浓度＝0.22mg/mL
实施例33.使用PVA作为表面活性剂经由纳米沉淀形成包括阳离子PLGA的含有siRNA的聚乙二醇化的粒子。
在Tris-EDTA缓冲液∶乙腈(2∶8)的溶剂混合物中将阳离子PLGA(60mg，54.5％)(实施例17)、mPEG2k-PLGA(40mg，36.4wt％，Mw11kDa)以及siRNA(10mg，Mw14929.06)溶解以形成1.0％聚合物的总浓度，所述siRNA具有22个碱基对和dTdT悬突。在另一溶液中，制备0.5％w/v PVA(80％水解，粘度2.5至3.5cP，Sigma-Aldrich)的水溶液。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至水溶液(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中。通过将溶液搅拌2至3小时来去除有机溶剂。然后用10体积TE缓冲液洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。
实施例34.使用PVA作为表面活性剂经由纳米沉淀形成和表征包括硫酸鱼精蛋白的含有siRNA的聚乙二醇化的粒子。
在Tris-EDTA缓冲液∶乙腈(2∶8)的溶剂混合物中将5050PLGA-O-乙酰基(60mg，54.5％)、mPEG2k-5050PLGA9k(40mg，36.4wt％，Mw11kDa)以及siRNA(实施例31)(10mg，Mw14929.06)溶解以形成1.0％聚合物的总浓度。在另一溶液中，制备0.5％w/v PVA(80％水解，粘度2.5至3.5cP，Sigma-Aldrich)和1％w/v硫酸鱼精蛋白的水溶液。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至水溶液(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中。通过将溶液搅拌2至3小时来去除有机溶剂。用10体积TE缓冲液洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。
通过使用上述方法中制得的所得多个粒子所评估的粒子特性：
Zavg＝116.9nm
PDI＝0.220
Dv50＝98.1nm
Dv90＝144nm
实施例35.使用PVA作为表面活性剂经由纳米沉淀形成和表征包括N1-PLGA-N5，N10，N14-四甲基化精胺的含有siRNA的聚乙二醇化的粒子。
在Tris-EDTA缓冲液∶乙腈(2∶8)的溶剂混合物中将N1-PLGA-N5，N10，N14-四甲基化精胺(60mg，57.1wt.％，Mw5.3kDa)、mPEG2k-PLGA(40mg，38.1wt％，Mw11kDa)以及siRNA(5mg，4.8wt.％，Mw14929.06)溶解以形成1.0％聚合物的总浓度，所述siRNA具有22个碱基对和dTdT悬突。在另一溶液中，制备0.5％w/vPVA(80％水解，粘度2.5至3.5cP，Sigma-Aldrich)的水溶液。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至水溶液(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中。然后用10体积TE缓冲液洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。
通过使用上述方法中制得的所得多个粒子所评估的粒子特性：
Zavg＝118.5nm
PDI＝0.13
Dv50＝102nm
Dv90＝162nm
ζ电位＝-18.4mV
实施例36.使用两步法形成和表征包括N1-PLGA-N5，N10，N14-四甲基化精胺的含有DNA的粒子。
在丙酮中将PLGA-O-乙酰基(20wt％，Mw10kDa)、mPEG2k-5050PLGA9k(39wt％，Mw11kDa)以及N1-PLGA-N5，N10，N14-四甲基化精胺(39wt％，Mw8.3kDa)溶解以形成1.0％聚合物的总浓度。在另一溶液中，将具有21个碱基对的DNA(2wt.％，Mw12835)溶解于水中。经由纳米沉淀以335mL/min的总流速在搅拌下添加聚合物丙酮溶液(有机相与水相的v/v比率等于1∶10)。通过将溶液搅拌2至3小时来去除丙酮。然后用10体积水洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝50cm2)进行浓缩。将PVA(粘度2.5至3.5cp，Sigma-Aldrich)添加至粒子中并且搅拌2至3小时。
通过使用上述方法中制得的所得多个粒子所评估的粒子特性：
Z平均：108nm
PDI：0.24
Dv50：84nm
Dv90：163nm
ζ电位：10.8mV
实施例37.使用PVA作为表面活性剂经由纳米沉淀形成和表征包括精胺的含有siRNA的聚乙二醇化的粒子。
在水∶乙腈(2∶8)的溶剂混合物中将具有22个碱基对和dTdT悬突的SiRNA(5mg，4.5wt.％，Mw14.9kDa)、5050-O-乙酰基-PLGA(60mg，54.5wt.％，Mw10kDa)、mPEG2k-PLGA(40mg，36.4wt％，Mw11kDa)以及四盐酸精胺(5mg，4.5wt.％，Mw348Da)溶解以形成1.0％聚合物的总浓度。在另一溶液中，制备0.5％w/v PVA(80％水解，粘度2.5至3.5cP，Sigma-Aldrich)的水溶液。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至水溶液(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中。然后用10体积TE缓冲液洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。
通过使用上述方法中制得的所得多个粒子所评估的粒子特性：
Zavg＝210.6nm
PDI＝0.27
Dv50＝193nm
Dv90＝323nm
ζ电位＝-23.3mV
实施例38.经由纳米沉淀形成和表征包括精胺的含有siRNA的聚乙二醇化的粒子。
在具有mPEG2k-5050PLGA9k(67mg，39wt.％，Mw11kDa)的溶剂混合物(95∶5，DMSO∶TE，10mL)中，将经过C6-硫醇修饰的寡核苷酸(如实施例22中所使用)(siRNA，5mg，0.37μmol，2.9wt.％，Mw13.6kDa)缀合到2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙氨基-5050-PLGA-O-乙酰基(100mg，15.8μmol，58.1wt.％，Mw6.3kDa)。在另一溶液中，制备0.5％w/v PVA(80％水解，粘度2.5至3.5cP，Sigma-Aldrich)和0.3％w/v四盐酸精胺的水溶液。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至水溶液(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中。然后用10体积TE缓冲液洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。
通过使用上述方法中制得的所得多个粒子所评估的粒子特性：
Zavg＝143.2nm
PDI＝0.21
Dv50＝119nm
Dv90＝200nm
ζ电位＝-11.5mV
实施例39.经由纳米沉淀形成和表征包括N1-PLGA-N5，N10，N14-四甲基化精胺的含有siRNA的聚乙二醇化的粒子。
在具有mPEG2k-5050PLGA9k(100mg，39.7wt.％，Mw11kDa)和N1-PLGA-N5，N10，N14-四甲基化精胺(100mg，39.7wt.％，Mw5.3kDa)的溶剂混合物(95∶5，DMSO∶TE，10mL)中，将经过C6-硫醇修饰的寡核苷酸(如实施例22中所使用)(siRNA，2mg，0.37μmol，0.8wt.％，Mw13.6kDa)缀合到2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙氨基-5050-PLGA-O-乙酰基(50mg，15.8μmol，19.8wt.％，Mw6.3kDa)。在另一溶液中，制备0.5％w/v PVA(80％水解，粘度2.5至3.5cP，Sigma-Aldrich)的水溶液。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至水溶液(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中。然后用10体积TE缓冲液洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。
通过使用上述方法中制得的所得多个粒子所评估的粒子特性：
Zavg＝135.4nm
PDI＝0.12
Dv50＝120nm
Dv90＝208nm
ζ电位＝-8.39mV
实施例39a.使用PVA作为表面活性剂经由纳米沉淀配制和表征包括双-(N1-精胺)谷氨酰胺-5050PLGA-O-乙酰基的含有siRNA的聚乙二醇化的粒子。
在丙酮中将双-(N1-精胺)谷氨酰胺-5050PLGA-O-乙酰基(67wt.％)和mPEG2k-PLGA(28wt％，Mw11kDa)溶解以形成1.0％聚合物的总浓度。在另一溶液中，将具有22个碱基对和dTdT悬突的siRNA(2wt.％，Mw14929.06)溶解于0.5％w/v PVA(80％水解，粘度2.5至3.5cP，Sigma-Aldrich)的水溶液中。阳离子氨基与siRNA磷酸根基团的摩尔比(N/P比)是4.4∶1，例如，分别双-(N1-精胺)谷氨酰胺-5050PLGA-O-乙酰基与siRNA的比率。经由纳米沉淀以335mL/min的总流速在搅拌下添加聚合物丙酮溶液(有机相与水相的v/v比率等于1∶8)。通过将溶液搅拌2至3小时来去除丙酮。然后用10体积水洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝50cm2)进行浓缩。
通过使用上述方法中制得的所得多个粒子所评估的粒子特性：
Zavg＝61nm
PDI＝0.16
Dv50＝43nm
Dv90＝72nm
ζ电位＝-2.6mV
药物浓度：3.1wt％
实施例39b.使用两步法配制和表征包括双-(N1-精胺)谷氨酰胺-5050PLGA-O-乙酰基的含有siRNA的聚乙二醇化的粒子。
在丙酮中将双-(N1-精胺)谷氨酰胺-5050PLGA-O-乙酰基(68wt.％)和mPEG2k-5050PLGA9k(29wt％，Mw11kDa)溶解以形成1.0％聚合物的总浓度。在另一溶液中，将具有22个碱基对和dTdT悬突的siRNA(2wt.％，Mw14929.06)溶解于水中。阳离子氨基与siRNA磷酸根基团的摩尔比(N/P比)是11∶1，例如，分别双-(N1-精胺)谷氨酰胺-5050PLGA-O-乙酰基与siRNA的比率。经由纳米沉淀以335mL/min的总流速在搅拌下添加聚合物丙酮溶液(有机相与水相的v/v比率等于1∶8)。通过将溶液搅拌2至3小时来去除丙酮。然后用10体积水洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝50cm2)进行浓缩。将PVA(粘度2.5至3.5cp，Sigma-Aldrich)添加至粒子中并且搅拌2至3小时。
通过使用上述方法中制得的所得多个粒子所评估的粒子特性：
Zavg＝132nm
PDI＝0.18
Dv50＝101nm
Dv90＝226nm
ζ电位＝-1.6mV
药物浓度：4.6wt％
实施例39c.使用PVA作为表面活性剂经由纳米沉淀配制和表征包括双-(N1-精胺)谷氨酰胺-5050PLGA-O-乙酰基的含有siRNA的聚乙二醇化的粒子。
在具有mPEG2k-5050PLGA9k(100mg，42.1wt.％，Mw11kDa)和双-(N1-精胺)谷氨酰胺-5050PLGA-O-乙酰基(85mg，35.8wt.％)的95∶5DMSO∶TE的溶剂混合物(10mL)中，将如实施例22b中所示的经过C6-硫醇修饰的寡核苷酸(siRNA，10mg，0.755μmol，4.2wt.％，Mw13.2kDa)缀合到如实施例16中所示的2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙氨基-5050-PLGA-O-乙酰基(42.5mg，6μmol，17.9wt.％，Mw6.9kDa)。在另一溶液中，制备0.5％w/v PVA(80％水解，粘度2.5至3.5cP)的水溶液。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至水溶液(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中。然后用10体积TE缓冲液洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。以RNA为标准品，使用荧光测定来定量siRNA的负载。在480nm激发波长和520nm发射波长下测量siRNA的荧光。
通过使用上述方法中制得的所得多个粒子所评估的粒子特性：
Zavg＝130.1nm
PDI＝0.205
Dv50＝96.5nm
Dv90＝165nm
ζ电位＝-14.7mV
siRNA负载：1.8wt％
实施例39d.使用PVA作为表面活性剂经由纳米沉淀配制和表征包括双-(N1-精胺)谷氨酰胺-5050PLGA-O-乙酰基的含有siRNA的聚乙二醇化的粒子。
将双-(N1-精胺)谷氨酰胺-5050PLGA-O-乙酰基(60mg，57.1wt％)、mPEG2k-PLGA(40mg、38.1wt％、Mw11kDa)以及siRNA(5mg，4.8wt.％，Mw13029.2)溶解于比率为1∶4的Tris-EDTA缓冲液∶乙腈的溶剂混合物中。聚合物的总浓度是1.0wt％。在另一溶液中，将0.5％w/v PVA(80％水解，粘度2.5至3.5cP)溶解于水中。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至水溶液(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中。然后用10体积缓冲液洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。以RNA为标准品，使用
Figure BDA00002844406901901
荧光测定来定量siRNA的负载。在480nm激发波长和520nm发射波长下测量siRNA的荧光。
通过使用上述方法中制得的所得多个粒子所评估的粒子特性：
Zavg＝67.35nm
PDI＝0.366
Dv50＝43.4nm
Dv90＝75.1nm
ζ电位＝+17.6mV
siRNA负载：1.8wt％
实施例39e.在没有表面活性剂的情况下经由纳米沉淀配制和表征包括双-(N1-精胺)谷氨酰胺-5050PLGA-O-乙酰基的含有siRNA的聚乙二醇化的粒子。
将双-(N1-精胺)谷氨酰胺-5050PLGA-O-乙酰基(60mg，57.1wt％)、mPEG2k-PLGA(40mg、38.1wt％、Mw11kDa)以及siRNA(5mg，4.8wt.％，Mw13029.2)溶解于比率为1∶4的Tris-EDTA缓冲液∶乙腈的溶剂混合物中。聚合物的总浓度是1.0wt％。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至水(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中。然后用10体积缓冲液洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。以RNA为标准品，使用荧光测定来定量siRNA的负载。在480nm激发波长和520nm发射波长下测量siRNA的荧光。
通过使用上述方法中制得的所得多个粒子所评估的粒子特性：
Zavg＝74.75nm
PDI＝0.233
Dv50＝53nm
Dv90＝85.6nm
ζ电位＝+20mV
siRNA负载：2.4wt％
实施例40.使用PVA作为表面活性剂经由纳米沉淀形成包括阳离子聚合物的含有核酸试剂的聚乙二醇化的粒子。
在Tris-EDTA∶DMSO(5∶95)或者Tris-EDTA∶乙腈的溶剂混合物中，将5050-O-乙酰基-PLGA(60mg，60wt.％)和缀合核酸的mPEG2k-PLGA(实施例23)(40mg，40wt％，Mw为约25.7kDa)溶解以形成1.0％聚合物的总浓度。在另一溶液中，制备0.3％w/v PVA(80％水解，粘度2.5至3.5cP，Sigma-Aldrich)和0.2％w/v阳离子PVA(86％至91％水解，粘度17至27cP，Kuraray)的水溶液。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至水溶液(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中。然后将用10体积TE缓冲液洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。在一些情况下，将粒子冻干成粉末形式。
实施例41.使用PVA作为表面活性剂经由纳米沉淀形成包括阳离子部分的含有核酸试剂的聚乙二醇化的粒子。
在Tris-EDTA缓冲液∶乙腈(2∶8)的溶剂混合物中将5050PLGA(60mg，54.5％)、mPEG2k-PLGA(40mg，36.4wt％，Mw11kDa)以及缀合核酸的mPEG2k-PLGA(实施例23)(10mg，Mw为约25.7kDa)溶解以形成1.0％聚合物的总浓度。在另一溶液中，可以制备0.5％w/v PVA(80％水解，粘度2.5-3.5cP，Sigma-Aldrich)的水溶液，所述水溶液含有0.1mM至50mM的阳离子部分(例如，四盐酸精胺、己基癸醇三甲基氯化铵、海美溴铵、硫酸鱼精蛋白以及阳离子聚合物，例如聚组氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚乙烯亚胺以及壳聚糖)。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至水溶液(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中。可以通过将溶液搅拌2至3小时来去除有机溶剂。然后用10体积TE缓冲液洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。在一些情况下，将粒子冻干成粉末形式。
实施例42.使用PVA作为表面活性剂经由纳米沉淀形成包括阳离子-mPEG2k-PLGA的含有核酸试剂的聚乙二醇化的粒子。
在Tris-EDTA缓冲液∶乙腈(2∶8)的溶剂混合物中将5050PLGA(60mg，60wt％)、阳离子-mPEG2k-PLGA(实施例15)(30mg，30wt％，Mw11kDa)以及缀合核酸的mPEG2k-PLGA(实施例23)(10mg，Mw为约25.7kDa)溶解以形成1.0％聚合物的总浓度。在另一溶液中，制备0.5％w/v PVA(80％水解，粘度2.5至3.5cP，Sigma-Aldrich)的水溶液。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至水溶液(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中。通过将溶液搅拌2至3小时来去除有机溶剂。然后用10体积TE缓冲液洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。在一些情况下，将粒子冻干成粉末形式。
实施例43.使用PVA作为表面活性剂经由纳米沉淀形成包括阳离子-PLGA的含有核酸试剂的聚乙二醇化的粒子。
在Tris-EDTA缓冲液∶乙腈(2∶8)的溶剂混合物中将阳离子-PLGA(60mg，60％)(实施例68)和缀合核酸的mPEG2k-PLGA(实施例23)(40mg，40wt％，Mw为约25.7kDa)溶解以形成1.0％聚合物的总浓度。在另一溶液中，制备0.5％w/v PVA(80％水解，粘度2.5至3.5cP，Sigma-Aldrich)的水溶液。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至水溶液(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中。通过将溶液搅拌2至3小时来去除有机溶剂。然后用10体积TE缓冲液洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。在一些情况下，将粒子冻干成粉末形式。
实施例44.使用PVA作为表面活性剂经由纳米沉淀形成含有核酸试剂的聚乙二醇化的粒子。
在Tris-EDTA缓冲液∶乙腈(2∶8)的溶剂混合物中将阳离子-PLGA(60mg，60％，Mw)(实施例68)和缀合核酸的mPEG10k(实施例27)(40mg，40wt％，Mw为约26.7kDa)溶解以形成1.0％聚合物的总浓度。在另一溶液中，制备0.5％w/v PVA(80％水解，粘度2.5至3.5cP，Sigma-Aldrich)的水溶液。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至水溶液(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中。通过将溶液搅拌2至3小时来去除有机溶剂。然后用10体积TE缓冲液洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。在一些情况下，将粒子冻干成粉末形式。
实施例45.有阳离子部分的情况下经由预配制中间粒子的表面生物缀合形成含有核酸试剂的聚乙二醇化的粒子。
在丙酮中将2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙氨基-5050-PLGA-O-乙酰基(90mg，90wt.％)和mPEG2k-PLGA(10mg，10wt％，Mw11kDa)溶解以形成1.0％聚合物的总浓度。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至水(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中。通过将溶液搅拌2至3小时来去除有机溶剂。在缓冲液(PBS，pH8，0.4mL)中将经过C6-硫醇修饰的寡核苷酸(如实施例22中所使用)(siRNA或DNA，2mg，0.13μmol)缀合到2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙氨基-5050-PLGA-O-乙酰基预成型粒子(4mg，0.625μmol)，所述粒子可以未聚乙二醇化或≤10wt.％聚乙二醇化。在室温下于氩气中将反应混合物搅拌48小时。通过阴离子型交换和反相HPLC来分析反应混合物。将粒子(60mg，60wt.％)冻干成粉末形式。将粒子(60mg，60wt.％)和mPEG2k-PLGA(40mg，40wt.％)溶解于丙酮或Tris-EDTA缓冲液∶乙腈(2∶8)的适当水性/有机溶剂混合物中以形成1％聚合物的浓度。在另一溶液中，制备0.5％w/v PVA(80％水解，粘度2.5至3.5cP，Sigma-Aldrich)的水溶液，所述水溶液含有0.1mM至50mM的阳离子部分(例如，四盐酸精胺、己基癸醇三甲基氯化铵、海美溴铵、硫酸鱼精蛋白或阳离子聚合物，例如聚组氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚乙烯亚胺或壳聚糖)。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至水溶液(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中。通过将溶液搅拌2至3小时来去除有机溶剂。然后用10体积水洗涤核酸试剂官能化的粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。在一些情况下，将粒子冻干成粉末形式。
实施例46.含有脂质包覆核酸试剂的聚乙二醇化的粒子的形成。
在丙酮或Tris-EDTA缓冲液∶乙腈(2∶8)的溶剂混合物中将阳离子-PLGA(60mg，60％)(实施例68)和缀合核酸的5050-O-乙酰基-PLGA(40mg，40wt％，Mw为约23.7kDa)溶解以形成1.0％聚合物的总浓度。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至水(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中以形成粒子悬浮液。通过将溶液搅拌2至3小时来去除有机溶剂。经由注射泵以1mL/min的速率将DOTAP、胆固醇以及DOPE-PEG2k在乙醇中的脂质混合物添加至粒子悬浮液中以形成70％乙醇的最终浓度。用水将最终制剂稀释10倍并且用5体积水洗涤并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。在一些情况下，将粒子冻干成粉末形式。
实施例47.含有核酸试剂的聚乙二醇化的粒子的形成。
在丙酮或Tris-EDTA缓冲液∶乙腈(2∶8)的溶剂混合物中将缀合核酸的5050-O-乙酰基-PLGA(Mw为约23.7kDa)溶解以形成1.0％聚合物的总浓度。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至水(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中以形成粒子悬浮液。通过将溶液搅拌2至3小时来去除有机溶剂。将阳离子聚合物(例如，聚组氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚乙烯亚胺或壳聚糖，60wt.％)和mPEG2k-PLGA(40wt.％)溶解于水混溶性溶剂如丙酮中以形成1％聚合物的溶液并且经由注射泵以1mL/min的速率添加至粒子悬浮液中。用水将最终制剂稀释10倍并且用5体积水洗涤并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。在一些情况下，将粒子冻干成粉末形式。
实施例48.使用PVA作为表面活性剂经由纳米沉淀配制包括阳离子部分的含有siRNA的聚乙二醇化的粒子。
在Tris-EDTA缓冲液∶乙腈(2∶8)的溶剂混合物中，将5050PLGA(60mg，54.5％)、mPEG2k-PLGA9k(40mg，36.4wt％，Mw11kDa)、siRNA(10mg，Mw14.9kDa)以及阳离子部分(例如，四盐酸精胺、己基癸醇三甲基氯化铵、海美溴铵、胍基丁胺(agamatine)或阳离子脂质，例如DOTAP)溶解以形成1.0％聚合物的总浓度。在另一溶液中，制备0.5％w/v PVA(80％水解，粘度2.5至3.5cP，Sigma-Aldrich)的水溶液。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至水溶液(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中。通过将溶液搅拌2至3小时来去除有机溶剂。然后用10体积TE缓冲液洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。在一些情况下，将粒子冻干成粉末形式。
实施例49.使用PVA作为表面活性剂经由纳米沉淀配制包括阳离子部分的含有核酸试剂的聚乙二醇化的粒子。
在Tris-EDTA缓冲液∶乙腈(2∶8)的溶剂混合物中将5050PLGA(60mg，54.5％)、mPEG2k-PLGA9k(40mg，36.4wt％，Mw11kDa)以及缀合核酸的5050PLGA(10mg，Mw为约23.7kDa)溶解以形成1.0％聚合物的总浓度。在另一溶液中，制备0.5％w/v PVA(80％水解，粘度2.5至3.5cP，Sigma-Aldrich)的水溶液，所述水溶液含有0.1％w/v的阳离子部分(例如，四盐酸精胺、己基癸醇三甲基氯化铵、海美溴铵、胍基丁胺或阳离子聚合物，例如聚组氨酸、聚赖氨酸、聚精氨酸、聚乙烯亚胺或壳聚糖)。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至水溶液(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中。通过将溶液搅拌2至3小时来去除有机溶剂。然后用10体积TE缓冲液洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。在一些情况下，将粒子冻干成粉末形式。
实施例50.使用PVA作为表面活性剂经由纳米沉淀形成包括阳离子部分的含有核酸试剂的聚乙二醇化的粒子。
在Tris-EDTA缓冲液∶乙腈(2∶8)的溶剂混合物中，将5050PLGA(60mg，54.5％)、mPEG2k-PLGA9k(40mg，36.4wt％，Mw11kDa)、缀合核酸的5050PLGA(10mg，Mw为约23.7kDa)以及阳离子部分(例如胍基丁胺、四盐酸精胺、己基癸醇三甲基氯化铵、海美溴铵或阳离子脂质如DOTAP)溶解以形成1.0％聚合物的总浓度。在另一溶液中，制备0.5％w/v PVA(80％水解，粘度2.5至3.5cP，Sigma-Aldrich)的水溶液。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至水溶液(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中。通过将溶液搅拌2至3小时来去除有机溶剂。然后用10体积TE缓冲液洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。在一些情况下，将粒子冻干成粉末形式。
实施例51.丙烯酸酯5050PLGA的合成、纯化以及表征。
将5050PLGA(5.0g，0.94mmol，MW5.3kDa)和吡啶(200mg，2.5mmol)溶解于二氯甲烷(DCM，20mL)中。在1/2小时内逐滴添加丙烯酰氯(230mg，2.5mmol)并且再搅拌3小时。然后将上述溶液倒入乙醚(50mL)中以沉淀出聚合物。用乙醚(25mL)冲洗聚合物并且在真空下干燥得到白色粉末。通过将固体溶解于丙酮(20mL)中并且在1/2小时内沉淀至5℃的冷水(400mL)中来进一步纯化白色粉末。然后将混合物再搅拌2小时。通过过滤来去除聚合物并且冻干得到白色固体(3.8g，76％产率)。通过1H NMR来确认产物。
实施例52.2-(2-氨基乙氧基)乙醇丙烯酸酯5050PLGA-O-乙酰基的合成、纯化以及表征。
Boc-2-(2-氨基乙氧基)乙醇的合成
将2-(2-氨基乙氧基)乙醇(5.0g，48mmol)溶解于四氢呋喃(THF，50mL)中。将2N氢氧化钠(24mL)添加至混合物中并且在冰浴中冷却整个溶液。将二碳酸二叔丁酯(10g，48mmol)溶解于THF(50mL)中并且在1小时内将所得溶液逐滴添加至冰浴中的混合物中。使反应上升到室温并且搅拌2.5天。在真空下去除THF。用浓硫酸将水溶液调节至pH3。然后用乙酸乙酯(EtOAc，75mL)对所述水溶液进行两次提取。用水(25mL)洗涤有机层两次并且用盐水(25mL)洗涤一次。然后用硫酸镁(MgSO4)来干燥有机层。在真空下去除EtOAc得到透明油(4.1g，42％产率)。通过1H NMR来确认产物。
Figure BDA00002844406901991
2-(2-氨基乙氧基)乙醇丙烯酸酯TFA的合成
将2-(2-氨基乙氧基)乙醇(1.0g，4.9mmol)和三乙醇胺(TEA，0.54g，5.4mmol)溶解于DCM(50mL)中。在冰浴中冷却混合物。将丙烯酰氯(0.49g，5.4mmol)溶解于DCM(10mL)中并且在1/2小时内将所得溶液逐滴添加至冰浴中的混合物中。使反应上升到室温并且搅拌过夜。反应混合物变为黄色。然后用0.1N盐酸(15mL)洗涤反应混合物两次，用盐水(15mL)洗涤两次并且用MgSO4干燥。然后泵出反应混合物得到黄色的油(0.54g，43％产率)。黄色的油不用进一步纯化就可使用。将黄色的油溶解于DCM∶TFA(1∶1，10mL)的混合物中并且在室温下搅拌1小时。在真空下去除溶剂得到黄色的油(0.50g，94％产率)。通过1H NMR来确认产物。
Figure BDA00002844406901992
2-(2-氨基乙氧基)乙醇丙烯酸酯5050PLGA-O-乙酰基的合成
将5050PLGA-O-乙酰基(2.0g，0.37mmol，MW5.3kDa)和2-(2-氨基乙氧基)乙醇丙烯酸酯TFA(190mg，0.75mmol)、EDC(120mg，0.75mmol)、NHS(87mg，0.75mmol)以及TEA(76mg，0.75mmol)溶解于DCM(10mL)中并且在室温下搅拌3小时。在所述过程期间，去除溶剂DCM。将聚合物溶解于丙酮(10mL)中，然后添加至5℃的冷水(400mL)中得到沉淀物。将聚合物冻干得到白色固体(1.2g，60％产率)。通过1H NMR来确认产物。
Figure BDA00002844406902001
实施例53.N-(2-氨乙基)顺丁烯二酰亚胺5050PLGA-O-乙酰基的合成、纯化以及表征。
将5050PLGA-O-乙酰基(3.0g，0.57mmol，MW5.3kDa)、NHS(100mg，0.91mmol)以及DCC(190mg，0.91mmol)添加至DCM(15mL)中。在1小时搅拌之后，添加N-(2-氨乙基)顺丁烯二酰亚胺三氟乙酸盐(230mg，0.91mmol)以及TEA(180mg，1.8mmol)并且再搅拌3小时。通过过滤来去除沉淀物并且在真空下去除DCM。然后将沉淀物重新溶解于丙酮(30mL)中并且在5℃水(400mL)中沉淀出来。将沉淀物冻干得到白色固体(2.3g，77％产率)。通过1H NMR来确认产物。
Figure BDA00002844406902011
实施例54.寡核苷酸-C6-S-N-(2-氨乙基)顺丁烯二酰亚胺5050PLGA-O-乙酰基的合成。
在DMSO∶TE缓冲液(95∶5，10mL)的溶剂混合物中将经过C6-硫醇修饰的寡核苷酸(如实施例22中所使用)(siRNA，5.0mg，0.37μmol，3wt.％，Mw13.6kDa)缀合到N-(2-氨乙基)顺丁烯二酰亚胺5050PLGA-O-乙酰基(100mg，18.9μmol，57wt.％，Mw5.3kDa)，所述寡核苷酸含有具有与萤光素酶序列的一部分大致上相同的核苷酸序列的有义链，所述有义链的长度为19个碱基对，具有UU悬突并且具有互补反义链。在65℃下于氩气中将反应混合物搅拌3小时。将所述混合物冷却至室温。
实施例54a.寡核苷酸-C6-S-N-(2-氨乙基)顺丁烯二酰亚胺5050PLGA-O-乙酰基的合成。
在DMSO∶TE缓冲液(95∶5，10mL)的溶剂混合物中将经过C6-硫醇修饰的寡核苷酸(siRNA，20mg，1.51μmol，Mw13.2kDa)缀合到N-(2-氨乙基)顺丁烯二酰亚胺5050PLGA-O-乙酰基(85mg，16.1μmol，Mw5.3kDa)，所述寡核苷酸含有具有与EGFP序列的一部分至少90％相同的核苷酸序列的有义链，所述有义链的长度为19个碱基对，具有UU悬突并且具有互补反义链。在65℃下于氩气中将反应混合物搅拌3小时。将混合物冷却至室温。
实施例55.使用PVA和阳离子PVA的共混物作为表面活性剂经由纳米沉淀配制和表征含有siRNA的聚乙二醇化的粒子。
在DMSO(6.7mL)中，将Si-RNA-C6-S-N-(2-氨乙基)顺丁烯二酰亚胺5050PLGA-O-乙酰基(实施例54)与mPEG2k-5050PLGA9k(67mg，40wt％，Mw11kDa)混合。在另一溶液中，制备0.3％w/v PVA(80％水解，粘度2.5至3.5cP，Sigma-Aldrich)和0.2％w/v阳离子PVACM-318(86％至91％水解，粘度17至27cP，Kuraray)的水溶液(167mL)。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至PVA/阳离子PVA溶液，进而添加至水溶液(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中。然后用10体积TE缓冲液洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。负载被确定为是0.92％siRNA w/w。
通过使用上述方法中制得的所得多个粒子所评估的粒子特性：
Zavg：103.3nm
PDI：0.229
Dv50：83.3nm
Dv90：157nm
ζ电位：+16.6mV
实施例55a.使用PVA和阳离子PVA的共混物作为表面活性剂经由纳米沉淀配制和表征含有siRNA的聚乙二醇化的粒子。
在DMSO(6.7mL)中，将缀合到N-(2-氨乙基)顺丁烯二酰亚胺5050PLGA-O-乙酰基(如在实施例54a中)的经过C6-硫醇修饰的寡核苷酸(siRNA，20mg，1.51μmol，Mw13.2kDa)与mPEG2k-5050PLGA9k(67mg，40wt％，Mw11kDa)混合。在另一溶液中，制备0.3％w/v PVA(80％水解，粘度2.5至3.5cP，Sigma-Aldrich)和0.2％w/v阳离子PVACM-318(86％至91％水解，粘度17至27cP，Kuraray)的水溶液(167mL)。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至C6-S-N-(2-氨乙基)顺丁烯二酰亚胺5050PLGA-O-乙酰基(实施例54)溶液，进而添加至水溶液(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中。然后用10体积TE缓冲液洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。负载被确定为是3％siRNA w/w。通过使用上述方法中制得的所得多个粒子所评估的粒子特性：
Zavg＝127nm
PDI＝0.244
Dv50＝76.5nm
Dv90＝222nm
ζ电位＝10.7mV
实施例56.寡核苷酸-C6-SS-DSPE-PEG2k的合成、纯化以及表征。
在TE缓冲液(1mL)中，将经过C6-硫醇修饰的寡核苷酸(如实施例22中所使用)(siRNA，0.2mg，14.7nmol)缀合到1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[PDP(聚乙二醇)-2k](4mg，1.36μmol)。在65℃下将反应混合物搅拌2小时。通过反相HPLC和凝胶电泳来分析寡核苷酸-C6-SS-DSPE-PEG2k缀合物。
Figure BDA00002844406902041
实施例57.寡核苷酸-C6-硫醚-DSPE-PEG2k的合成、纯化以及表征。
在PBS缓冲液(1mL)中，将经过C6-硫醇修饰的寡核苷酸(如实施例22中所使用)(siRNA，0.2mg，14.7nmol)缀合到1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[顺丁烯二酰亚胺(聚乙二醇)-2k](4mg，1.36μmol)，所述寡核苷酸含有具有与荧光素酶序列的一部分大致上相同的核苷酸序列的有义链，所述有义链的长度是19个碱基对，具有UU悬突并且具有互补反义链。在65℃下将反应混合物搅拌2小时。通过反相HPLC和凝胶电泳来分析寡核苷酸-C6-硫醚-DSPE-PEG(2000)缀合物。
实施例58.用包括阳离子PVA的聚乙二醇化的粒子中的siRNA处理的细胞的活力。
为了确定包括阳离子PVA的聚乙二醇化的粒子(参见实施例32)中的siRNA是否引起细胞死亡，使用
Figure BDA00002844406902052
发光细胞活力测定(CTG)。测定是基于对所存在的ATP的定量，这表明存在新陈代谢活跃的细胞。在37℃下5％CO2下在完全培养基(DMEM，高糖，10％HI-FBS，0.1mM MEM非必需氨基酸，2mM L-谷氨酰胺以及1％抗菌/抗霉菌溶液)中，使MDA-MB-231EGFP细胞在75cm2烧瓶(传代＜20次)中生长至85％至90％的汇合度。在200μL/孔中以1500细胞/孔的浓度将MDA-MB-231EGFP细胞添加至96孔不透明-透明底的平板。在37℃下5％CO2下将细胞孵育24小时。第二天，在具有完全培养基的12孔贮液器中制备2倍浓缩的包括阳离子PVA的聚乙二醇化粒子中的siRNA的连续稀释液，至最终浓度在5000nM与0.05nMsiRNA之间。平板中的培养基置换为100μL新鲜的完全培养基和100μL对应的连续稀释处理，一式两份。用复制处理制备三组平板。在37℃下5％CO2下孵育24、48以及72小时之后，平板中的培养基置换为100μL新鲜的完全培养基和100μLCTG溶液，然后在室温下在设定为450rpm的平板振荡仪上孵育5分钟，并且静置15分钟。在设定为发光的微量滴定板读取器中测量有活力的细胞。数据绘示为％活力与浓度的曲线图并且如下所示根据未处理细胞进行标准化。
实施例59.包括阳离子PVA的聚乙二醇化PVA粒子中的siRNA的敲低活性。
为了测量包括阳离子PVA的聚乙二醇化粒子(实施例32)中的siRNA的敲低活性，在37℃下5％CO2下在完全培养基(DMEM，高糖，10％HI-FBS，0.1mM MEM非必需氨基酸，2mM L-谷氨酰胺以及1％抗菌/抗霉菌溶液)中，使MDA-MB-231EGFP细胞在75cm2烧瓶(传代＜20次)中生长至85％至90％的汇合度。将100μL/孔的每个孔的三千个细胞添加至96孔不透明-透明底平板并且在37℃下5％CO2下生长24小时。第二天，使用1000与0.1nM siRNA之间的浓度，将培养基置换为100μL连续稀释的包括阳离子PVA的粒子中的siRNA，一式两份。在37℃下5％CO2下将处理过的细胞孵育48小时。然后用PBS对细胞洗涤一次并且用60μL/孔的补充有完全蛋白酶抑制剂混合液的M-Per哺乳动物蛋白提取试剂在冰上溶解20分钟。上下吸取细胞裂解液4至5次，随后在设定为488nm激发和535nm发射的荧光计上测量。将处理过的细胞的EGFP敲低百分比与下文所示的未处理对照物进行比较。
Figure BDA00002844406902062
Figure BDA00002844406902071
实施例60.含有siRNA的聚乙二醇化粒子对荧光素酶活性的敲低。
在37℃下5％CO2下在完全培养基(RPMI1640，10％HI-FBS以及1％抗菌/抗霉菌溶液)中培养表达荧光素酶的B16F10-luc2细胞。将100μL/孔的每个孔五千个细胞添加至96孔平板并且在37℃下5％CO2下生长24小时。在另一反应中，用包埋于聚乙二醇化粒子中的siRNA，或用siRNA-PLGA(0.01μM至7.5μM)缀合物聚乙二醇化粒子各自处理细胞48小时。使用
Figure BDA00002844406902072
荧光素酶测定系统(Promega)分析细胞的荧光素酶活性。具有荧光素酶敲低活性的细胞百分比与未处理细胞的荧光素酶活性进行比较。根据细胞活力调整荧光素酶敲低活性。
实施例60中使用的粒子如下：
1基本上按照实施例32中所述来制备这些粒子，除了核酸试剂靶向荧光素酶(不是EGFP)以外(按照本文描述测量的粒子特性：Zavg＝131，Dv90＝232，ζ＝+15.1)。
2基本上按照实施例33中所述来制备这些粒子(按照本文描述测量的粒子特性：Zavg＝130，Dv90＝231，ζ＝+15.9)。
3按照实施例55中所述来制备这些粒子。
4按照实施例62中所述来制备这些粒子(与1∶1的N/P比率相对应)。
5按照实施例62中所述来制备这些粒子(与1.5∶1的N/P比率相对应)。
6按照实施例68中所述。
下文提供了本文描述的粒子的敲低实验的结果。
Figure BDA00002844406902081
Figure BDA00002844406902082
实施例61.经由纳米沉淀配制和表征包括PVA和阳离子PVA的共混物作为表面活性剂的含有siRNA的聚乙二醇化的粒子。
在具有mPEG2k-5050PLGA9k(70mg，40wt.％，Mw11kDa)的95∶5DMSO∶TE的溶剂混合物(10mL)中，将经过C6-硫醇修饰的寡核苷酸(如实施例22中所使用)(siRNA，5mg，0.37μmol，3wt.％，Mw13.6kDa)缀合到2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙氨基-5050-PLGA-O-乙酰基(100mg，15.8μmol，57wt.％，Mw6.3kDa)(实施例16)。在另一溶液中，制备0.3％w/v PVA(80％水解，粘度2.5至3.5cP)和0.2％w/v阳离子PVA(86％至91％水解，粘度17至27cP)的水溶液。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至水溶液(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中。然后用10体积TE缓冲液洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。
通过使用上述方法中制得的所得多个粒子所评估的粒子特性：
Zavg＝94.0nm
PDI＝0.17
Dv50＝79.8nm
Dv90＝139nm
ζ电位＝+9mV
实施例61a.经由纳米沉淀配制和表征包括PVA和阳离子PVA的共混物作为表面活性剂的含有siRNA的聚乙二醇化的粒子。
在具有mPEG2k-5050PLGA9k(67mg，39wt.％，Mw11kDa)的95∶5DMSO∶TE的溶剂混合物(10mL)中，将经过C6-硫醇修饰的寡核苷酸(siRNA，20mg，1.51μmol，11.6wt.％，Mw13.2kDa)(如实施例22a中所使用)缀合到2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙氨基-5050-PLGA-O-乙酰基(85mg，12μmol，49.4wt.％，Mw6.9kDa)(实施例16)。在另一溶液中，制备0.3％w/v PVA(80％水解，粘度2.5至3.5cP)和0.2％w/v阳离子PVA(86％至91％水解，粘度17至27cP)的水溶液。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至水溶液(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中。然后用10体积TE缓冲液洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDaMW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。以RNA为标准品，使用荧光测定来定量siRNA的负载。在480nm激发波长和520nm发射波长下测量siRNA的荧光。
通过使用上述方法中制得的所得多个粒子所评估的粒子特性：
Zavg＝84.09nm
PDI＝0.23
Dv50＝64.3nm
Dv90＝96.8nm
ζ电位＝+7.78mV
siRNA负载：4.2wt％
实施例61b.经由纳米沉淀配制和标准包括PVA和阳离子PVA的共混物作为表面活性剂的含有siRNA的聚乙二醇化的粒子。
在具有mPEG2k-5050PLGA9k(67mg，39wt.％，Mw11kDa)的95∶5DMSO∶TE的溶剂混合物(10mL)中，将经过C6-硫醇修饰的寡核苷酸(siRNA，20mg，1.51μmol，11.6wt.％，Mw13617Da)(如实施例22b中所使用)缀合到2-(2-(吡啶-2-基)二硫基)乙氨基-5050-PLGA-O-乙酰基(85mg，12μmol，49.4wt.％，Mw6.9kDa)(实施例16)。在另一溶液中，制备0.3％w/v PVA(80％水解，粘度2.5至3.5cP)和0.2％w/v阳离子PVA(86％至91％水解，粘度17至27cP)的水溶液。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至水溶液(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中。然后用10体积TE缓冲液洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDaMW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。以RNA为标准品，使用
Figure BDA00002844406902101
荧光测定来定量siRNA的负载。在480nm激发波长和520nm发射波长下测量siRNA的荧光。
通过使用上述方法中制得的所得多个粒子所评估的粒子特性：
Zavg＝82.42nm
PDI＝0.167
Dv50＝62.8nm
Dv90＝112nm
ζ电位＝+10.5mV
siRNA负载：2.97wt％
实施例62.使用两步法配制和表征包括N1-PLGA-N5，N10，N14-四甲基化精胺的含有siRNA的聚乙二醇化的粒子。
在丙酮中将PLGA-O-乙酰基(11wt％至19wt％，Mw10kDa)、mPEG2k-5050PLGA9k(38wt％至48wt％，Mw11kDa)以及N1-PLGA-N5，N10，N14-四甲基化精胺(37wt％至38wt％，Mw8.3kDa)(实施例68中)溶解以形成1.0％聚合物的总浓度。在另一溶液中，将具有22个碱基对和dTdT悬突的siRNA(5wt.％至6wt.％，Mw14929.06)溶解于水中。通过改变所使用的N1-PLGA-N5，N10，N14-四甲基化精胺和siRNA的量来将阳离子氨基与siRNA磷酸根基团的摩尔比(N/P比)从1∶1调节到1.5∶1。经由纳米沉淀以335mL/min的总流速在搅拌下添加聚合物丙酮溶液(有机相与水相的v/v比率等于1∶10)，。通过将溶液搅拌2至3小时来去除丙酮。然后用10体积水洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝50cm2)进行浓缩。将PVA(粘度2.5至3.5cp，Sigma-Aldrich)添加至粒子中并且搅拌2至3小时。
通过使用上述方法中制得的所得多个粒子所评估的粒子特性：
Figure BDA00002844406902111
实施例62a.用包括N1-PLGA-N5，N10，N14-四甲基化精胺的聚乙二醇化粒子中的siRNA处理的细胞的活力。
为了测量包括N1-PLGA-N5，N10，N14-四甲基化精胺的含有siRNA的聚乙二醇化粒子的细胞活力，以每个孔10,000个细胞的密度将MDA-MB-231/GFP细胞涂铺于(2)96孔白色不透明-透明底的平板。在用粒子处理之前，将细胞在37℃下5％CO2下在改良的完全培养基；DMEM，10％胎牛血清，0.1mM MEM非必需氨基酸，2mM L-谷氨酰胺以及1％青霉素链霉素(均来自Life Technologies)培养过夜。然后用5至0.01μM包括N1-PLGA-N5，N10，N14-四甲基化精胺的含有包裹的siRNA的聚乙二醇化粒子处理细胞，一式三份，并且分别在37℃下5％CO2下孵育24小时和48小时。在孵育之后，将20μL
Figure BDA00002844406902121
AQueous OneTM活力试剂(Promega)添加至含有100μL培养基±包裹的CPX1310/PLGA/PEG的每个孔中。然后在37℃下将平板孵育2小时。通过使用
Figure BDA00002844406902122
M5(Molecular Devices)平板读取器测量490nm下的吸光度来测定活力。将处理过的有活力细胞的百分比直接与相似时间点未处理细胞的百分比进行比较，如下所示。
Figure BDA00002844406902123
实施例62b.包括N1-PLGA-N5，N10，N14-四甲基化精胺的聚乙二醇化粒子中的siRNA的siRNA敲低活性。
为了测量包括N1-PLGA-N5，N10，N14-四甲基化精胺的含有siRNA的聚乙二醇化粒子的siRNA的EGFP敲低活性，以每个孔10,000个细胞的密度将MDA-MB-231EGFP细胞涂铺于(2)96孔白色不透明-透明底的平板。将MDA-MB-231EGFP细胞在37℃下5％CO2下在改良的完全培养基；DMEM，10％胎牛血清，0.1mM MEM非必需氨基酸，2mM L-谷氨酰胺以及1％青霉素链霉素(均来自LifeTechnologies)中培养过夜。第二天，将与制剂体积相对应的体积的培养基从各个孔中去除。然后用5至0.01μM包括N1-PLGA-N5，N10，N14-四甲基化精胺的含有siRNA的聚乙二醇化粒子处理细胞，一式三份。分别在37℃下5％CO2下孵育处理过的细胞24小时和48小时。在指定时间点(24小时和48小时)，用PBS洗涤细胞一次并且用补充有
Figure BDA00002844406902131
蛋白酶抑制剂混合液(Thermo Fisher)的M-PER(哺乳动物蛋白提取剂，Thermo Fisher)在冰上溶解15分钟，接着在室温下在轨道板振荡仪(200rpm)上孵育10分钟。使用
Figure BDA00002844406902132
M5(Molecular Devices)荧光板读取器来完成EGFP测量，所述荧光板读取器设置如下：488nm激发和535nm发射，截断值指定为535nm。处理过的细胞的敲低百分比由在与如下文所示的来自相似时间点的未处理对照孔相比较EGFP信号的减少产生。
Figure BDA00002844406902133
实施例62c.用包括N1-PLGA-N5，N10，N14-四甲基化精胺和O-乙酰基PLGA的聚乙二醇化粒子中的siRNA处理的细胞的活力。
为了测量包括N1-PLGA-N5，N10，N14-四甲基化精胺和O-乙酰基PLGA的含有siRNA的聚乙二醇化粒子的siRNA的细胞活力，以每个孔10,000个细胞的密度将MDA-MB-231EGFP细胞涂铺于(2)96孔白色不透明-透明底的平板。在处理粒子之前，将细胞在37℃下5％CO2下在改良的完全培养基；DMEM，10％胎牛血清，0.1mM MEM非必需氨基酸，2mM L-谷氨酰胺以及1％青霉素链霉素(均来自LifeTechnologies)中培养过夜。然后用5至0.01μM包括N1-PLGA-N5，N10，N14-四甲基化精胺和O-乙酰基PLGA的含有siRNA的聚乙二醇化粒子处理细胞，一式三份，并且分别在37℃下5％CO2下孵育24小时和48小时。在孵育之后，将20μLAQueous OneTM活力试剂(Promega)添加至含有100μL培养基±包裹的CPX1310/CPX1025/PLGA-mPEG的每个孔中。然后在37℃下将平板孵育2小时。通过使用
Figure BDA00002844406902141
M5(Molecular Devices)平板读取器测量490nm下的吸光度来测定活力。将处理过的有活力细胞的百分比直接与相似时间点未处理细胞的百分比进行比较，如下所示。
Figure BDA00002844406902142
实施例62d.通过包括N1-PLGA-N5，N10，N14-四甲基化精胺和O-乙酰基PLGA的聚乙二醇化粒子中的siRNA的siRNA的敲低活性。
为了测量包括N1-PLGA-N5，N10，N14-四甲基化精胺和O-乙酰基PLGA的聚乙二醇化粒子中的siRNA的EGFP敲低活性，以每个孔10,000个细胞的密度将MDA-MB-231EGFP细胞涂铺于(2)96孔白色不透明-透明底的平板上。将MDA-MB-231EGFP细胞在37℃下5％CO2下在改良的完全培养基；DMEM，10％胎牛血清，0.1mM MEM非必需氨基酸，2mM L-谷氨酰胺以及1％青霉素链霉素(均来自LifeTechnologies)中培养过夜。第二天，将与制剂体积相对应的体积的培养基从各个孔中去除。然后用5至0.01μM包括N1-PLGA-N5，N10，N14-四甲基化精胺和O-乙酰基PLGA的聚乙二醇化粒子中的siRNA处理细胞，一式三份。分别在37℃下5％CO2下将处理过的细胞孵育24小时和48小时。在指定时间点(24小时和48小时)，用PBS洗涤细胞一次并且用补充有
Figure BDA00002844406902143
蛋白酶抑制剂混合液(Thermo Fisher)的M-PER(哺乳动物蛋白提取剂，Thermo Fisher)在冰上溶解15分钟，接着在室温下在轨道板振荡仪(200rpm)上孵育10分钟。使用
Figure BDA00002844406902144
M5(Molecular Devices)荧光板读取器来完成EGFP测量，所述荧光板读取器设置如下：488nm激发和535nm发射，截断值指定为535nm。处理过的细胞的敲低百分比由与如下文所示的来自相似时间点的未处理对照孔相比较EGFP信号的减少产生。
Figure BDA00002844406902151
实施例63.经由纳米沉淀配制和表征包括PVA和阳离子PVA的共混物作为表面活性剂的含有siRNA的聚乙二醇化的粒子。
在8∶2乙腈∶TE的溶剂混合物(14mL)中，将经过C6-硫醇修饰的寡核苷酸(如实施例22中所使用)(siRNA，5mg，0.37μmol，3wt.％，Mw13.6kDa)缀合到添加有mPEG2k-5050PLGA9k(60mg，28wt％，Mw11kDa)和5050PLGA-O-乙酰基(40mg，41wt.％)的Tris-EDTA缓冲液中的1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[PDP(聚乙二醇)-2k](40mg，13.4kμmol，28wt.％，Mw2.98kDa)(如实施例56已完成)。在另一溶液中，制备0.3％w/v PVA(80％水解，粘度2.5至3.5cP)和0.2％w/v阳离子PVA CM-318(86％至91％水解，粘度17至27cP)的水溶液。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至水溶液(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中。通过将溶液搅拌2至3小时来去除有机溶剂。然后用10体积TE缓冲液洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。
通过使用上述方法中制得的所得多个粒子所评估的粒子特性：
Zavg＝124.9nm
PDI＝0.118
Dv50＝112nm
Dv90＝196nm
ζ电位＝+8mV
实施例64.使用PVA作为表面活性剂经由纳米沉淀形成包括阳离子聚合物的含有核酸试剂的聚乙二醇化的粒子。
在Tris-EDTA∶DMSO(5∶95)或者Tris-EDTA∶乙腈的溶剂混合物中，将5050-O-乙酰基-PLGA(60mg，60wt.％)和缀合核酸的mPEG2kPLGA(实施例23)(40mg，40wt％，Mw为约25.7kDa)溶解以形成1.0％聚合物的总浓度。在另一溶液中，制备0.3％w/v PVA(80％水解，粘度2.5至3.5cP，Sigma-Aldrich)和0.2％w/v阳离子PVA(86％至91％水解，粘度17至27cP，Kuraray)的水溶液。使用注射泵以1mL/min的速率在500rpm搅拌下将聚合物溶液添加至水溶液(聚合物溶液与水相的v/v比率等于1∶10)中。然后用10体积TE缓冲液洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝150cm2)进行浓缩。
实施例65.经由纳米沉淀配制包括1-己基三乙基-磷酸铵(Q6)和PVA作为表面活性剂的含有siRNA的聚乙二醇化的粒子。
在丙酮中将PLGA-O-乙酰基(11wt％至19wt％，Mw10kDa)、mPEG2k-5050PLGA9k(38wt％至48wt％，Mw11kDa)以及1-己基三乙基-磷酸铵(37wt％至38wt％，Mw8.3kDa)溶解以形成1.0％聚合物的总浓度。在另一溶液中，将具有22个碱基对和dTdT悬突的siRNA(5wt.％至6wt.％，Mw14929.06)溶解于水中。阳离子氨基与siRNA磷酸根基团的摩尔比(N/P比)是15∶1，具体来说是所使用的1-己基三乙基-磷酸铵与siRNA的量。经由纳米沉淀以335mL/min的总流速在搅拌下添加聚合物丙酮溶液(有机相与水相的v/v比率等于1∶10)。通过将溶液搅拌2至3小时来去除丙酮。然后用10体积水洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝50cm2)进行浓缩。将PVA(粘度2.5至3.5cp，Sigma-Aldrich)添加至粒子中并且搅拌2至3小时。
通过使用上述方法中制得的所得多个粒子所评估的粒子特性：
Zavg＝98nm
PDI＝0.41
Dv50＝34nm
Dv90＝68nm
ζ电位＝-11.5mV
siRNA药物负载＝1.51wt％
实施例66.使用酶消化测定表征包埋于具有阳离子PVA的聚乙二醇化粒子(非缀合)中的siRNA。
在37℃下将含有0.5μg siRNA(实施例32)的聚乙二醇化粒子的等分部分与RNA酶A(1μg)一起孵育四个时间段(30分钟，1小时，4小时以及18小时)的每个时间段。用蛋白酶K(0.07mg)和SDS(0.2mg)在37℃下进一步孵育30分钟淬灭每个反应。然后冷冻样品并通过20％PAGE和溴化乙锭染色进行分析。用游离siRNA重复相同的方案。结果提供于图2中。
在第2泳道至第5泳道中，观察到材料的模糊条带，因为siRNA被RNA酶消化成较短长度的产物。在siRNA与RNA酶一起孵育30分钟之后，观察到siRNA完全消化成较短物质，参见第2泳道。
在第7泳道至第10泳道中，在具有与在第2泳道至第5泳道中消化产物的迁移相似的迁移的模糊扩散条带上方观察到具有与在第1泳道中未消化siRNA的迁移相似的迁移的具有较强强度的条带。针对第7泳道至第10泳道的含于粒子中的siRNA而言，在所有时间段上均观察到了具有与第1泳道的未消化siRNA的迁移相似的迁移的高分子量条带。在用RNA酶A消化18小时，即第7泳道至第10泳道之后，仍然观察到了高分子量条带。
实施例67.使用酶消化测定表征具有阳离子PVA的siRNA-聚合物缀合物粒子。
在37℃下将含有26μg siRNA-S-S-PLGA(实施例58)的聚乙二醇化粒子的等分部分与RNA酶A(50μg)一起孵育四个时间段(30分钟，1小时，4小时以及18小时)的每个时间段。用蛋白酶K(0.28mg)和SDS(0.8mg)在37℃下进一步孵育30分钟淬灭每个反应。然后冷冻样品并通过20％PAGE和溴化乙锭染色进行分析。用游离siRNA重复相同的方案。结果提供于图3中。
第3泳道至第6泳道的与RNA酶A一起孵育的游离siRNA显示在各个孵育时间上所有的siRNA都被消化。在siRNA-SS-PLGA粒子的情况下，第7泳道至第10泳道的与siRNA对应的模糊条带仍然可见，表明粒子减缓了RNA酶A对siRNA的消化。
实施例68.N1-PLGA-N5，N10，N14-四甲基化精胺的合成、纯化以及表征。
Figure BDA00002844406902191
用氮气净化配备有内部温度探头、机械搅拌器以及加料漏斗的3-L三颈圆底烧瓶并且装入精胺(9.60g，47.44mmol)和MeOH(670mL)。将溶液冷却至-20℃。此后，经由加料漏斗逐滴添加三氯乙酸乙酯(6.74g，47.44mmol)于MeOH(100mL)中的溶液持续90分钟。将混合物搅拌14小时，使温度上升至室温。通过MS[直接注射ESI(+)]来监测反应过程。混合物含有精胺、N1-三氟乙酸盐-精胺和化合物1。N1-三氟乙酸盐-精胺是主峰。
此后，在真空下去除有机溶剂得到油残余物，油残余物作为1，2-二氯乙烷(DCE，950mL)中的溶液添加至配备有内部温度探头、机械搅拌器以及加料漏斗的3-L三颈圆底烧瓶中。将混合物冷却至0℃并且在15分钟内添加37％wt甲酰胺水溶液(19.2g，237.3mmol)。在0℃下将混合物搅拌30分钟然后在15分钟内分三次添加固体形式的三乙酰氧基硼氢化钠(60.3g，281.5mmol)。将混合物搅拌14小时，使温度上升至室温。通过MS[直接注射ESI(+)]来监测反应过程。混合物含有N1-三氟乙酸盐-N5，N10，N14-四甲基化精胺、化合物2、化合物3并且不含有来自前述步骤的材料。
将反应混合物移到1-L分液漏斗中并且用饱和碳酸氢钠(150mL)洗涤。分离各层，用二氯甲烷(3×100mL)提取水层。用硫酸钠干燥合并的有机层，过滤并且在真空中浓缩。将水层装到500-mL圆底烧瓶中并且冷冻干燥过夜。用二氯甲烷(250mL)和三乙胺(25mL)的溶液稀释残余物并且用机械搅拌器将残余物搅拌30分钟。此后，过滤混合物，并且将滤饼移回到烧瓶中并且用二氯甲烷(250mL)和三乙胺(25mL)的溶液稀释。将所描述的过程重复两次。
将二氯甲烷/TEA提取物与来自分离的二氯甲烷提取物组合，并且用硫酸钠干燥，过滤并且在真空中浓缩成约15g残余物。通过硅胶(350g)上的柱色谱法，使用DCM/MeOH/TEA(6/3/1(v/v/v))的混合物作为洗脱液(溶剂总共使用2L)纯化残余物。通过磷钼酸染色显现各部分。取出含有产物[Rf＝0.41]的部分，并且在真空下浓缩得到N1-三氟乙酸盐-N5，N10，N14-四甲基化精胺[约7g]。将N1-三氟乙酸盐-N5，N10，N14-四甲基化精胺(7.00g，19.7mmol)、MeOH(70mL)以及NH4OH(浓，210mL)装入配备有磁力搅拌器的500-mL单颈圆底烧瓶中。在室温下将混合物搅拌14小时。此后，[直接注射ESI(+)]显示反应完成。在真空中浓缩混合物并且干负载到硅胶柱(350g硅胶)上。
用比率为7/2/1的THF/MeOH/浓NH4OH(1.5L)洗脱柱。用2％水合茚三酮乙醇染色液来显现各部分。取出含有产物[Rf＝0.6]的部分并且在真空中浓缩得到N1-氨基-N5，N10，N14-四甲基化精胺[740mg]，N1-氨基-N5，N10，N14-四甲基化精胺的结构通过1H NMR和MS(ESI+)来确认。浓缩合并的混合部分并且负载和干负载到硅胶柱(350g硅胶)上。用比率为3/1/1的THF/MeOH/浓NH4OH(1.5L)洗脱柱。
将乙酰基-PLGA5050-7K(15.00g，基于5300Da的Mn是2.83mmol)、DCM(40mL)以及甲苯(100mL)装入500-mL圆底烧瓶中。在真空下浓缩内容物以去除残余的水。此后，将DCC(877mg，4.25mmol，1.5当量)、DMAP(69mg，0.57mmol，0.2当量)、N1-氨基-N5，N10，N14-四甲基化精胺(1.10g，4.25mmol，1.5当量)以及DCM(125mL)装入相同的烧瓶中。混合物慢慢变混浊。在搅拌7小时之后，用DCM(100mL)稀释混合物并且过滤。用新鲜的DCM(30mL)洗涤滤饼。合并DCM溶液，转移到500-mL分液漏斗中并且用0.0001NNaOH溶液(100mL，pH＝10)轻缓洗涤。观察到形成一些乳液。将乳液静置30分钟并且分离各层。分离有机层，并且用DCM(2×50mL)提取水层。合并有机层，并且用Na2SO4干燥，通过
Figure BDA00002844406902211
垫过滤并且在真空下浓缩。
将残余物溶解于丙酮(100mL)中并且在真空下浓缩。使用配备有机械搅拌器的2-L三颈圆底烧瓶，将残余物重新溶解于丙酮(100mL)中，通过0.2μm PTFE过滤器进行过滤并且沉淀至MTBE中，并且冷却至0℃。在恒定搅拌下将粗N1-PLGA-N5，N10，N14-四甲基化精胺的丙酮溶液逐滴添加至烧瓶中。聚合物开始立即作为粘性材料沉淀。在0℃下将所得悬浮液搅拌30分钟，然后在室温下搅拌30分钟。缓慢倾析液体，并且将残余物重新溶解于丙酮中以允许转移固体材料，然后在真空中浓缩得到所需的产物[12.0g，80％]。1H NMR分析显示N1-氨基-N5，N10，N14-四甲基化精胺缀合到聚合物并且不存在DMAP。N1-PLGA-N5，N10，N14-四甲基化精胺的负载如由1H NMR分析所估测为4.3wt％(基于5.3kDa的MW，理论负载的92％)。HPLC分析显示96.9％纯度(AUC，230nm)。
实施例69.N1-PLGA-N5，N10，N14-三-Cbz-精胺的合成、纯化以及表征。
Figure BDA00002844406902221
将乙酰基-PLGA5050-7K(8.7g，1.65mmol)溶解于DCM(22mL，2.5体积)中并且用甲苯(61mL，7.0体积)稀释。在40℃的浴温下，使用旋转蒸发器将粘稠混合物浓缩至干燥得到白色固体材料。将固体溶解于DCM(70mL，8.0体积)和DCC(0.51g，2.48mmol)中，接着添加DMAP(40mg，0.33)。然后在观察到形成沉淀时添加N1-氨基-N5，N10，N14-三-Cbz-精胺(1.5g，2.48mmol)的DCM(9mL)溶液。在20℃至25℃下将批料搅拌16.5小时。通过HPLC监测多相反应混合物，所述反应混合物与上述制备的批料的反应混合物相似。用DCM(61mL)稀释批料并且通过0.3μm在线过滤器进行过滤以去除DCU。用DCM(15mL)冲洗过滤器。用冷却的2M HCl溶液(0℃至5℃，2×61.0mL)洗涤滤液。(废水流的HPLC分析表明并未使N1-氨基-N5，N10，N14-三-Cbz-精胺得到净化。)用DCM(61mL)稀释混合物并且与活化DowexTM50WX8(湿重20g)一起搅拌3小时。过滤批料并且通过HPLC进行，它显示N1-氨基-N5，N10，N14-三-Cbz-精胺的浓度显著降低。N1-氨基-N5，N10，N14-三-Cbz-精胺存在于35.8％AUC中，而产物存在于64.1％AUC的205nm处。
将滤液浓缩至干燥得到呈灰白色泡沫状的粗物质(10.0g)。将粗物质溶解于丙酮(150mL)中。将
Figure BDA00002844406902231
(40g，4体积)添加至批料。然后添加MTBE(400mL)，同时用置顶式搅拌器搅拌批料。将浆料搅拌2小时并且过滤。将滤液搁置一旁并且用DCM(350mL)冲洗与
Figure BDA00002844406902232
混合的产物。通过HPLC分析滤液，它显示痕量的N1-氨基-N5，N10，N14-三-Cbz-精胺将滤液浓缩至干并且将N1-PLGA-N5，N10，N14-三-Cbz-精胺。将滤液浓缩至干燥并且将N1-氨基-N5，N10，N14-三-Cbz-精胺提交通过在存在下在丙酮/MTBE混合物中沉淀进行第二次纯化。第二次沉淀完全去除了N1-氨基-N5，N10，N14-三-Cbz-精胺。过滤批料并且丢弃滤液。用DCM(350mL)冲洗
Figure BDA00002844406902234
并且然后将滤液浓缩至干燥并且在高真空下干燥过夜得到呈白色泡沫状的产物(5.4g)。批料的HPLC分析显示N1-氨基-N5，N10，N14-三-Cbz-精胺已被完全净化。基于1H NMR，负载是84％(8.5％wt负载)。批料的GPC分析显示11.9Da的MP(分子量峰值)。
实施例70.N14-乙酰基PLGA-精胺的合成、纯化以及表征。
Figure BDA00002844406902235
在250mL高压釜中，添加N1-PLGA-N5，N10，N14-三-Cbz-精胺(5.1g)、DCM(76.5mL，15体积)，MeOH(38mL)、2M HCl(1.7mL)以及10％Pd/C(1.0g)。先后用N2(3×15psig)、H2(25psig)净化反应混合物。然后于20℃至25℃和25psig H2压力下开始氢化。在4小时和6.5小时之后监测反应，但还剩余少量起始材料。在8.5小时之后，只剩余痕量的起始材料。然后通过垫来过滤混合物并且用DCM(2×20mL)冲洗。将滤液浓缩至干燥得到呈灰白色泡沫状的粗产物(5.08g)。粗物质的GPC分析显示MP(分子量峰值)是10.6Da。N14-乙酰基PLGA-精胺通过DCM/MTBE中沉淀进行纯化。
实施例70a.使用PVA作为表面活性剂经由纳米沉淀形成和表征包括N14-乙酰基PLGA-精胺的含有siRNA的聚乙二醇化的粒子。
在丙酮中将N14-乙酰基PLGA-精胺(68wt.％，Mw10.7kDa)和mPEG2k-PLGA(29wt％，Mw11kDa)溶解以形成1.0％聚合物的总浓度。在另一溶液中，将具有22个碱基对和dTdT悬突的siRNA(3wt.％，Mw14929.06)溶解于0.5％w/v PVA(80％水解，粘度2.5至3.5cP，Sigma-Aldrich)的水溶液中。阳离子氨基与siRNA磷酸根基团的摩尔比(N/P比)是1.8∶1，例如，分别N14-乙酰基PLGA-精胺与siRNA的比率。经由纳米沉淀以335mL/min的总流速在搅拌下添加聚合物丙酮溶液(有机相与水相的v/v比率等于1∶8)。通过将溶液搅拌2至3小时来去除丙酮。然后用10体积水洗涤粒子并且使用切向流过滤系统(300kDa MW截断值，膜面积＝50cm2)进行浓缩。
通过使用上述方法中制得的所得多个粒子所评估的粒子特性：
Zavg＝69nm
PDI＝0.24
Dv50＝43nm
Dv90＝78nm
ζ电位＝-7.8mV
药物负载＝1.27wt％
实施例70b.表征mPEG-PLGA/PVA粒子中的siRNA负载的方法。
mPEG-PLGA分析：在90℃下用氢氧化钠(1N)将作为物标准和冻干样品的mPEG2k-PLGA消化2.5小时，接着用甲酸(1N)中和所述溶液，以用于HPLC分析。所有的分析都使用ELSD检测器。基于这一分析方法，siRNA粒子中mPEG-PLGA范围是处于8wt.％至15wt.％的范围。
PVA测定：用比色测定(碘测定)分析粒子制剂和PVA标准品。在60℃下用2ml氢氧化钠(0.5N)消化样品20分钟。然后用0.9ml盐酸(1N)来中和所述溶液。将3ml硼酸(0.65M)和0.5ml碘/碘化钾(0.05M/0.15M)添加至被中和的样品中。用水稀释分析物，然后用UV分光光度计在690nm下测量分析物。基于这一分析方法，siRNA粒子中的PVA范围是处于35wt.％至55wt.％的范围。
用于siRNA负载的
Figure BDA00002844406902251
测定：以RNA为标准品，使用测定来定量RNA-阳离子PVA粒子的RNA含量。在TE缓冲液中，将RNA标准品稀释成不同的浓度(2ug/ml至0.01ug/ml)。样品在480nm下激发并且在520nm下测量荧光发射强度。用缓冲液稀释粒子样品，用于荧光分析。
实施例71至75的粒子中组分的Wt.％。
Figure BDA00002844406902253
实施例71.EGFP的活体内siRNA敲低。
将经过遗传工程改造以表达EGFP的培养MDA-MB-231乳腺癌细胞移植到裸小鼠的乳腺脂肪垫上。在植入后的第8天，对六组(第1组至第6组，每组9只小鼠)中每组的小鼠施用对照制剂或siEGFP制剂，如表AA中所述。对第1组中的小鼠施用媒介物(10％蔗糖)制剂，从而提供未敲低的“阳性”对照。对第2组中的小鼠施用根据实施例32b制备的粒子，从而提供针对非靶向荧光素酶基因的对照siRNA粒子。对第6组中的小鼠施用脂多糖(LPS0111：B4，Sigma-Aldrich)制剂，这刺激了细胞因子释放，以作为另外的对照组。对第3组、第4组和第5组中的小鼠施用siEGFP粒子制剂，以使得10mL/kg推注剂进入尾静脉中。
每隔一天静脉内施用制剂(针对每只小鼠来说总共施用两次)。表AA中给出了所施用制剂的剂量(mg/kg)和体积。在第1组至第6组的每组中，在第二次(最终)施用之后，每隔24小时、72小时和168小时从3只小鼠收集肿瘤样品。将收集的肿瘤材料切片成3个个别切片以用于分析。将切片直接置于干冰上，放入
Figure BDA00002844406902261
(LifeTechnologies)中或者用补充有5％胎牛血清和0.1％叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水离解成单细胞。
表AA：给药方案。
Figure BDA00002844406902262
通过FACS分析、EGFP荧光以及EGFP RNA水平来分析对肿瘤细胞中EGFP敲低的处理的效果。
使用FACScanTM细胞计数来测量与收集的肿瘤样品分离的个别细胞中的荧光。FACScanTM流式细胞仪利用CellQuestTM作为采集软件，其中所需的事件数被设为10,000。考虑到收集数据内的细胞的特定群体，创建两个门。使用非EGFP细胞系来确定非荧光门，同时使用媒介物控制分离的细胞来选择荧光门。门的性质将细胞划分成处理后不再有荧光的细胞或未受处理影响的细胞。
在EGFP荧光分析中，首先针对总蛋白对收集的肿瘤样品中的EGFP荧光水平进行标准化。使用BCA测定试剂盒(ThermoFisher)来测定总蛋白。在计算总蛋白之后，通过荧光板读取器来测量(激发波长＝488，发射波长＝535)50μg蛋白的荧光。通过与媒介物对照比较测定荧光输出的减少百分比来计算EGFP荧光的％敲低值。
在RNA分析中，通过与EGFP特异性探针杂交和用与分支探针的夹心核酸杂交进行检测来测定从收集的肿瘤中提取的RNA样品中的EGFP mRNA水平。通过测定由与标记探针的杂交而产生的发光减少％来计算的EGFP mRNA的％敲低值。在此之前，针对人GAPDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶)对样品进行正规化，这与EGFP杂交步骤同时完成。人基因允许比较注入的肿瘤细胞并且预防来自小鼠的任何污染。表BB中示出了结果。
表BB：活体内敲低结果。
Figure BDA00002844406902271
Figure BDA00002844406902281
**未观察到敲低。
使用5′-RLM-RACE PCR来确认EGFP mRNA的降低是归因于位点特异性siRNA引导的裂解。siEGFP导致的siRNA引导的裂解通过激活RNA酶并且裂解RNA的多蛋白复合体造成了基因的核苷酸414与核苷酸415之间的特异性裂解。然后将从肿瘤样品(24小时时间点)中提取的纯化的RNA用于GeneRacerTM Advanced RACE试剂盒(Invitrogen，L1502-01)中。使用基因特异性引物(5’TCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGG-3’)来逆转录样品，从而允许使用正向GeneRacerTM5’引物(被设计用于特异性连接的RNA寡核苷酸)(5’CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’)和反向基因特异性引物(5’CGCCGATGGGGGTGTTCTGC-3’)进行PCR扩增。使用标准PCR条件并且完成25个扩增循环。
图4中示出了扩增产物，该图描绘了PCE产物的4％琼脂糖胶，并且示出了通过5’RLM RACE-PCR对第24小时时间点样品的敲低确认。预测的引物长度是333个碱基对。泳道如下：1，标记(100bpDNA梯度；Promega)；2，媒介物；3，LPS；4，siLUC；5，根据实施例61a制备的粒子；6，根据实施例55a制备的粒子；以及7，根据实施例32a制备的粒子。第5泳道、第6泳道以及第7泳道显示具有与第1泳道(标记泳道)中300个碱基对条带迁移率相同的迁移率的显著条带。因此，第5泳道、第6泳道以及第7泳道中主条带与具有300bp预测长度的条带的对齐证实了粒子结构中存在RNAi裂解位点，如实施例61a、55a以及32a中分别所述。
实施例71中所使用的方法
MDA-MB-231/GFP细胞
使用慢病毒载体(不在质粒上)将MDA-MB-231/GFP人类乳腺癌细胞系(Cell Biolabs，Inc.)稳定转染到具有增强型EGFP基因的染色体组中。
细胞培养
使MDA-MB-231/EGFP细胞在37℃下5％CO2下在完全培养基(DMEM，10％FBS，青霉素/链霉素溶液，0.1mM MEM非必需氨基酸，2mM L-谷氨酰胺)中生长。将第七次传代代移植到裸小鼠的乳腺脂肪垫上，所述第七次传代即是由于烧瓶变得汇合而进行细胞的第七次胰酶消化来将细胞从细胞培养烧瓶去除以放入新的烧瓶中。
流式细胞术
在对肿瘤切片之后，使用由磷酸盐缓冲盐水(PBS)、5％胎牛血清(FBS)以及0.1％叠氮化钠组成的解离缓冲液来完成组织解离。使用足够完整细胞通过的间隙的手持式研棒和研钵来解离组织。添加等体积的冰冷的2％多聚甲醛溶液以用于固定分离的细胞并且在4℃下储存直到进行FACS分析。利用Becton Dickinson FACScanTM流式细胞仪分析2x106个细胞。与EGFP细胞相比较，使用MDA-MB-231亲本细胞(非EGFP)来确定非EGFP细胞的合适闸控。
荧光蛋白分析
在存在T-PER(Thermo Fisher)下使在干冰上立即冷冻的肿瘤样品解冻并且补充
Figure BDA00002844406902291
蛋白酶抑制剂(Thermo Fisher)。然后在2mLT-PER中利用Tissuemiser(Thermo Fisher)来均质化样品。使用如由生产厂商所述使用微板程序来完成的BCA蛋白测定(Thermo Fisher)来测量总蛋白浓度。通过由2mg/mL储备液浓度绘制白蛋白标准曲线来测定蛋白浓度。使用
Figure BDA00002844406902292
M5(Molecular Devices)来检测EGFP荧光，其中每个孔添加50μg总蛋白。
RNA提取和定量
肿瘤样品在-20℃下储存于1.5mL
Figure BDA00002844406902301
(Life Technologies)中直到进行处理。在裂解缓冲液中使用手持式微离心管研棒来均质化组织，接着于12000g离心1分钟以去除任何碎片。然后将上清液移到微离心管中。然后利用PureLinkTM RNA小型试剂盒(LifeTechnologies)从裂解液中提取RNA，如生产厂商建议方案中所述。然后在-80℃下储存纯化的RNA样品直到进行进一步的定量和下游分析。
使用
Figure BDA00002844406902302
RNA定量试剂盒(Life Technologies)来完成定量，这是基于荧光的96孔平板的RNA定量测定。RNA测定是基于提供的RNA标准品产生标准曲线。用背景减除针对RNA浓度绘制荧光信号。
所有样品都以一式三份完成。建议方案的修改限于减少的总体积，并且按照生产厂商所述来绘制高范围标准曲线。利用
Figure BDA00002844406902303
M5来测量荧光。
Figure BDA00002844406902304
2.0
使用2.0试剂系统和测定试剂盒(Affymetrix)来定量靶标特异性RNA，尤其是EGFP和GAPDH。然后使用来自管家基因的信号正规化收集的所有数据样品范围内的基因表达。使用EGFP与GAPDH的比率来分别正规化每个样品。根据在与时间点相比较时各个样品的变化百分比来计算敲低百分比。
5’RLM RACE-PCR
按照Invitrogen GeneRacerTM手册所述进行cDNA末端聚合酶链式反应(5’RLM RACE-PCR)的5’RNA配体介导的快速扩增，其中进行了少许修改。简言之，在37℃下，经历1小时，使用T4RNA连接酶(5U)将100ng总分离RNA直接连接至GeneRacerTM RNA接头(5’-CGACUGGAGCACGAGGACACUGACAUGGACUGAAGGAGUAGAAA-3’)。牛小肠磷酸酶的RNA脱磷酸作用与mRNA帽结构的去除一起省略。在苯酚提取和沉淀之后，使用GeneRacerTM试剂盒的SuperScriptTM III模块和EGFP基因特异性反向引物(5’-TCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGG-3’)对样品进行逆转录。为了检测裂解产物，使用与RNA接头(GR5’：5’-CTCTAGAGCGACTGGAGCACG-3’)互补的引物并且用EGFP引物(EGFP#1：5’-AGCCCCTCTAGAGTCGCGGC-3’)(EGFP#2：5’-CGCCGATGGGGGTGTTCTGC-3’)(EGFP#3：5’-CGGTTCACCAGGGTGTCGCC-3’)来进行PCR。通过4％EX(Life Technologies)电泳来解析扩增产物并且用
Figure BDA00002844406902312
加样缓冲液(Life Technologies)来观测。
实施例72.EGFP的活体内siRNA敲低。
将经过遗传工程改造以表达EGFP的培养MDA-MB-231乳腺癌细胞(MDA-MB-231/GFP，Cell Biolabs，Inc.)移植到裸小鼠的乳腺脂肪垫中。对13组(每组9只小鼠)中每组小鼠施用对照制剂或siEGFP制剂，如表WWW中所述。对第1组中的小鼠施用媒介物(10％蔗糖)制剂，从而提供未敲低的对照。对第2组中的小鼠施用根据实施例61b制备的粒子，从而提供针对非靶向荧光素酶基因的对照siRNA粒子。对第3组至第13组中的小鼠施用按照表WWW中所参考的实施例所述来制备的siEGFP粒子制剂，以使得10mL/kg推注剂进入尾静脉中。
下表VVV中示出了粒子的特性。使用相同组分和方法来制备根据实施例61a的两批粒子，例外的是siRNA(针对EGFP)是从生产厂商的两个不同批次获得。
表VVV：用于敲低和耐受性研究的粒子特性。
Figure BDA00002844406902313
Figure BDA00002844406902321
在施用之后每24小时、72小时和120小时自3只小鼠收集肿瘤样品。然后将收集的肿瘤材料切片为3个个别切片以用于分析。将切片放入1.5mL
Figure BDA00002844406902322
(Life Technologies)中，或立即在干冰上冷冻或用补充有5％胎牛血清和0.1％叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水解离成细胞。
表WWW：组、剂量以及方案。
Figure BDA00002844406902323
通过EGFP荧光分析来确定对EGFP敲低的处理效果。在EGFP荧光分析中，利用补充有蛋白酶抑制剂混合液(ThermoFisher)的T-PER(组织蛋白提取试剂，ThermoFisher)从肿瘤样品中提取总蛋白。在存在1.5mL T-PER下使冷冻的肿瘤解冻，随后均质化。使用BCA测定试剂盒(ThermoFisher)来测定总蛋白。在计算总蛋白之后，使用
Figure BDA00002844406902332
M5(Molecular Devices)荧光板读取器来测量50μg总蛋白的EGFP荧光，其中过滤器设置如下：488nm激发和535nm发射，截断值指定为535nm。肿瘤蛋白的敲低百分比由与相同时间点的未处理(媒介物)蛋白样品直接相比较EGFP信号的减少产生，如下表XXX中所示。
表XXX：活体内敲低数据。
Figure BDA00002844406902333
**表明未观察到敲低。n/a＝未获得数据点。
与用对照粒子处理的第2组的小鼠相比较，第3组至第13组的所有粒子都展示出敲低的增加，例如，在72小时时与媒介物对照组和对照粒子的第2组相比较。根据实施例61a制备的粒子显示最大敲低百分比。
实施例72a.EGFP的活体内siRNA敲低。
在RPMI-1640/10％FBS/1％Penn/Strep抗生素(均来自Invitrogen)中培养MDA-MB-468/GFP细胞(Cell Biolabs，Inc.)直到第10代。即与实施例72中所使用的生长较快的肿瘤模型MDA-MB-231/GFP相比较，MDA-MB-468/GFP模型是生长缓慢的肿瘤模型。
以下活体内研究是在纯合的雌性NCR nu/nu裸小鼠(TaconicFarms)上进行：在第1天，将5x106个细胞(MDA-MB-468/GFP-第10代，参见上文)混入100μL50％RPMI-1640/50％Matrigel(BDBiosciences，Inc.)并且移植到每只小鼠的乳腺脂肪垫上。在第13天，将称重20.4至26.4g并且具有57至69mm3平均肿瘤体积的小鼠放入两个组(媒介物和粒子)中，每组在三个时间点即24小时、72小时和120小时的每一个时间点测量小鼠。每只携带肿瘤的小鼠接受以10mL/kg剂量体积静脉内施用到尾静脉中的媒介物(Tris EDTA缓冲液中10％蔗糖)或根据实施例61a制备的粒子(2.2mg/kg)的单次处理。在24小时(第14天)，72小时(第16天)以及120小时(第18天)时间点，将肿瘤从每个处理组中去除。然后将收集的肿瘤材料切片3个个别切片以用于分析。将切片直接放入1.5mL
Figure BDA00002844406902342
(LifeTechnologies)，或立即在干冰上冷冻或用补充有5％胎牛血清和0.1％叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水解离成细胞。在-80℃下储存冷冻的样品直到进行处理用于蛋白和EGFP测定。
然后通过分析EGFP荧光来确定根据实施例61a制备的粒子的处理效果。在存在T-PER(ThermoFisher)下解冻各肿瘤样品并且补充
Figure BDA00002844406902351
蛋白酶抑制剂混合液(ThermoFisher)。然后在400μL补充的T-PER中使用手持式研棒和研钵来均质化样品。使用BCA测定试剂盒(ThermoFisher)来测定总蛋白，其中通过由2mg/mL储备液浓度绘制白蛋白标准曲线来测定蛋白浓度。在计算总蛋白之后，将50μg蛋白稀释到100μLPBS中并且使用
Figure BDA00002844406902352
M5(Molecular Devices)荧光板读取器(激发波长＝488nm，发射波长＝535nm)来测量蛋白的荧光。通过与相同时间点的媒介物对照比较确定EGFP荧光信号的减少百分比来计算EGFP荧光的敲低百分比值，如下表YYY中所示。
表YYY：MDA-MB-468/GFP肿瘤中的活体内EGFP敲低数据。
Figure BDA00002844406902353
如表YYY中可见，用根据实施例61a制备的粒子处理的MDA-MB-468/GFP小鼠展示出扩大的EGFP敲低，例如，在施用120小时后，敲低所处的水平远远高于相同时间点MDA-MB-231/GFP肿瘤(比较参见实施例72)中所见的敲低水平。
所述结果可能具有生理学基础，因为在暴露于根据实施例61a制备的粒子之后，细胞的活体内活力研究中MDA-MB-231/GFP细胞系与MDA-MB-468/GFP细胞系之间不存在可测量的变化。此外，MDA-MB-468/GFP模型中的总肿瘤体积似乎是与处理无关，即，媒介物处理的肿瘤和粒子处理的肿瘤在0小时与72小时之间体积增加，然后在120小时时间点上体积减小。媒介物组和粒子组预期具有相似的肿瘤生长特征，这是因为EGFP敲低与肿瘤生长是不相关的。
实施例73.小鼠体内siRNA粒子的耐受性。
对雄性C57BL/6小鼠施用游离siEGFP溶液、实施例61b中所述的siLUC二硫化物粒子、实施例32a中所述的siEGFP粒子、实施例55a中所述的siEGFP粒子或实施例61a中所述的siEGFP粒子(也参见表VVV)。施用是按照q2dx2方案静脉内施用3mg/kg的剂量(即，在第1研究日和第3研究日进行处理，即，在第1天和第3天，即，间隔两天2次处理)。
在第2次(最终)处理之后的48小时收集血液。分析血液的白血球数目、红血球数目、血红蛋白、血细胞比容、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白浓度、(白细胞数目的)嗜中性球百分比、淋巴球百分比、单核球百分比、嗜酸性球百分比、嗜碱性球百分比、血小板估计、多染性、红细胞大小不均、绝对嗜中性球数目、绝对淋巴球数目、绝对单核球数目、绝对嗜酸性球数目、绝对嗜碱性球数目。在接受游离siEGFP溶液或任何siEGFP粒子制剂的小鼠体内，这些参数没有发生显著的变化。
将血清与血液分离并且分析碱性磷酸酶、SGPT、SGOT、CPK、白蛋白、总蛋白、球蛋白、总胆红素、直接胆红素、间接胆红素、BUN、肌酐、胆固醇、葡萄糖、钙、磷以及碳酸氢盐。在接受游离siEGFP溶液或任何siEGFP粒子制剂的小鼠体内，这些参数没有发生显著的变化。在处理的动物血清中通常分析的其它参数是氯化物、钾和钠，但是从小鼠收集的血清不够用于分析这些参数。鉴于血清化学缺少变化，所以并不认为siEGFP粒子制剂会对氯化物、钾和钠产生任何影响。
实施例74.小鼠体内的循环细胞因子浓度。
对雄性C57BL/6小鼠施用实施例32a中所述的siEGFP粒子、实施例55a中所述的siEGFP粒子、或实施例61a中所述的siEGFP粒子(也参见表VVV)。处理是以3mg/kg剂量进行单次静脉内施用。
静脉内施用0.1mg/kg剂量的阳性对照物脂多糖(LPS0111：B4，Sigma-Aldrich)。粒子对照物是游离(非聚合物结合)siEGFP溶液和实施例61b中所述的siLUC粒子，各自静脉内施用3mg/kg的剂量。
在处理2小时和6小时之后收集血液。
分析2小时时间点上血清的肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6、白细胞介素-10、白细胞介素-12、角质化细胞衍生的细胞因子以及干扰素-γ。表EEE中示出了这一研究的结果。阳性对照物脂多糖处理伴随着测量的所有细胞因子的显著增加。粒子对照物(游离(非聚合物结合)siEGFP溶液和61b中所述的siLUC粒子)和粒子制剂(即，实施例32a中所述的siEGFP粒子、实施例55a中所述的siEGFP粒子或61a中所述的siEGFP粒子)未刺激测量的任何细胞因子的增加。
分析6小时时间点上血清的相同细胞因子。阳性对照物脂多糖处理伴随着6小时时间点上测量的所有细胞因子的显著增加，但是浓度却小于2小时时间点上的浓度。游离(非粒子结合)siEGFP溶液、实施例32a中所述的siEGFP粒子、实施例55a中所述的siEGFP粒子或实施例61a中所述的siEGFP粒子未刺激测量的任何细胞因子的增加。实施例61b中所述的粒子siLUC仅刺激了6小时时间点上干扰素-γ的显著增加，而未刺激测量的其它细胞因子中任一者的增加。由实施例61b中所述的siLUC粒子刺激的循环干扰素-γ的增加可能是siLUC的脱靶效应。
表EEE：注射后2小时和6小时的小鼠血清细胞因子浓度。
Figure BDA00002844406902371
Figure BDA00002844406902381
实施例75.小鼠体内siRNA粒子制剂的耐受性。
经由尾静脉对不携带肿瘤的体重范围在22.5至26.5g/小鼠的雄性C57BL/6小鼠静脉内注射表FFF中的制剂。评定在注射后第1天、第3天以及第5天时小鼠体重的变化。表FFF描述了组、所施用的制剂、剂量、方案以及每组的小鼠数目。
表FFF：组、剂量以及方案。
Figure BDA00002844406902382
Figure BDA00002844406902391
如表GGG中所示，按照3mg/kg剂量以及q2dx2方案(在第1天和第3天施用)的siEGFP粒子制剂的施用没有引起小鼠体重的减轻。
表GGG：注射后体重变化。
Figure BDA00002844406902392
Figure BDA00002844406902401
实施例76.siRNA粒子制剂对人血液中的补体活化的测定。
将人全血暴露于根据实施例61a和实施例32a制备的粒子中以确定粒子是否活化了血液中的补体(C3a或Bb)。从Bioreclamation LLC(Westbury，NY)获得肝素化人全血的三个样品，并且大致在取出1天之后分析样品。受试者都是年龄为36、49以及52的男性。将血液放入12孔细胞培养板上的各孔中，每个板用于各个别血液。将2mL血液放入每个板8个孔的每个孔中(即，未使用所有的板孔)。根据下表HHH处理每个2mL血液等分部分，以使得每个处理组具有n＝3。使用脂多糖(LPS)作为阳性对照物。
表HHH.用于人血液的处理方案。
在将处理液添加至各个对应孔中之后，覆盖板并且将板放在台式孵育器/振荡仪中并且在37℃下适度缓慢振荡(150rpm)。在1小时之后，将每个孔的1mL血液移到1.5mL Eppendorf管中并且以10,000rpm离心10分钟。用MicroVueTM补体EIA试剂盒(Quidel Corp.，SanDiego，CA)立即分析血浆，其中C3a作为补体活化的经典和可替代路径的标记，并且Bb作为补体活化的可替代路径的标记。根据对应MicroVueTM补体EIA试剂盒所包括的说明来测量C3a和Bb。
如图5中所示，C3a和Bb的水平未发生变化，并且保持在正常的生理学范围内。粒子制剂活化补体(C3a或Bb)也未表明siEGFP粒子不会活化人全血中的补体。
其它实施方案在权利要求中。

Claims (50)

1.一种粒子，其包含：
a)多个疏水部分；
b)多个亲水-疏水聚合物；
c)任选地，多个阳离子部分；以及
d)多个核酸试剂，其中所述多个核酸试剂中的至少一部分是
(i)共价连接至以下中的任一者：
a)的疏水部分，例如，疏水聚合物或
b)的亲水-疏水聚合物，或
(ii)与共价连接至a)的疏水部分或b)的亲水-疏水聚合物中任一者的核酸形成双链体。
2.如权利要求1所述的粒子，其中所述粒子包含多个阳离子部分。
3.如权利要求1所述的粒子，其中所述疏水部分是疏水聚合物。
4.如权利要求1所述的粒子，其中所述疏水部分是疏水聚合物，并且a)的所述疏水聚合物中的至少一部分各自共价连接至d)的核酸试剂。
5.如权利要求4所述的粒子，其中d)的所述核酸试剂中的至少一部分经由连接基共价连接至所述疏水聚合物。
6.如权利要求4所述的粒子，其中a)的所述疏水聚合物中的至少一部分各自通过所述核酸试剂的5’位置共价连接至d)的核酸试剂。
7.一种粒子，其包含：
a)多个核酸试剂-聚合物缀合物，每个所述缀合物包含核酸试剂，所述核酸试剂
(i)连接至疏水聚合物或
(ii)与共价连接至疏水聚合物的核酸形成双链体；
b)多个亲水-疏水聚合物；以及
c)任选地，多个阳离子部分。
8.如权利要求7所述的粒子，其中所述粒子包含多个阳离子部分。
9.如权利要求7所述的粒子，其中所述粒子进一步包含疏水聚合物，其中所述疏水聚合物未连接至核酸试剂。
10.如权利要求7所述的粒子，其中所述核酸试剂经由连接基共价连接至疏水聚合物。
11.一种粒子，其包含：
a)多个疏水部分；
b)多个核酸试剂-亲水-疏水聚合物缀合物，其中所述多个的每个核酸试剂-亲水-疏水聚合物缀合物的核酸试剂
(i)共价连接至所述亲水-疏水聚合物或
(ii)与共价连接至所述亲水-疏水聚合物的核酸形成双链体；以及
c)任选地，多个阳离子部分。
12.如权利要求11所述的粒子，其中所述粒子包含多个阳离子部分。
13.一种粒子，其包含：
a)多个疏水聚合物；
b)多个亲水-疏水聚合物；
c)多个阳离子部分，其中所述多个阳离子部分中的至少一部分连接至a)的疏水聚合物或b)的亲水-疏水聚合物；以及
d)多个核酸试剂。
14.如权利要求13所述的粒子，其中a)的所述多个疏水聚合物中的至少一部分未共价连接至c)的阳离子部分或d)的核酸试剂。
15.如权利要求13所述的粒子，其中a)的所述多个疏水聚合物中的至少一部分各自共价连接至c)的阳离子部分。
16.如权利要求13所述的粒子，其中所述阳离子部分是精胺或四甲基化精胺。
17.一种粒子，其包含：
a)多个疏水聚合物；
b)任选地，多个亲水-疏水聚合物；
c)多个阳离子部分；以及
d)多个核酸试剂，其中所述多个核酸试剂中的至少一部分共价连接至疏水聚合物或与共价连接至亲水聚合物的核酸形成双链体。
18.如权利要求17所述的粒子，其中所述核酸试剂共价连接至亲水聚合物。
19.如权利要求17所述的粒子，其中所述亲水聚合物是聚乙二醇(PEG)。
20.如权利要求17所述的粒子，其中所述亲水聚合物共价连接至脂质。
21.如权利要求17所述的粒子，其中所述粒子大致上不含疏水-亲水聚合物。
22.一种粒子，其包含：
a)多个疏水聚合物；
b)多个亲水-疏水聚合物；以及
c)多个核酸试剂-阳离子聚合物缀合物。
23.如权利要求22所述的粒子，其中所述阳离子聚合物是PVA。
24.如权利要求22所述的粒子，其中所述核酸试剂-阳离子聚合物缀合物是siRNA-阳离子PVA缀合物。
25.一种粒子，其包含：
a)多个疏水聚合物；
b)多个亲水-疏水聚合物；
c)任选地，多个阳离子部分；以及
d)多个核酸试剂；
其中c)的所述阳离子部分的大部分和d)的所述核酸试剂的大部分未共价连接至疏水聚合物或亲水-疏水聚合物。
26.如权利要求25所述的离子，其中所述核酸试剂或阳离子部分包埋于所述粒子中。
27.如权利要求25所述的粒子，其中所述粒子包含多个阳离子部分。
28.如权利要求27所述的粒子，其中所述阳离子部分是阳离子聚合物。
29.如权利要求1至28中任一项所述的粒子，其中所述疏水部分或疏水聚合物是PLGA。
30.如权利要求29所述的粒子，其中所述PLGA在末端上被反应性基团修饰。
31.如权利要求1至20和22至29中任一项所述的粒子，其中所述亲水-疏水聚合物是PEG-PLGA。
32.如权利要求1至31中任一项所述的粒子，其中所述阳离子部分包括至少一个伯胺、仲胺、叔胺或季胺。
33.如权利要求1至32中任一项所述的粒子，其中所述核酸试剂是siRNA。
34.如权利要求1至33中任一项所述的粒子，其中所述粒子进一步包含表面活性剂。
35.如权利要求1至34中任一项所述的粒子，其中所述粒子的ζ电位是约-20mV至约+20mV
36.一种组合物，其包含如权利要求1至35中任一项所述的多个粒子。
37.如权利要求36所述的组合物，其中所述组合物是药物组合物。
38.如权利要求36所述的组合物，其中所述粒子具有小于200nm的Dv90。
39.一种试剂盒，其包含如权利要求1至35中任一项所述的多个粒子或权利要求36至39中任一项所述的组合物。
40.一种单一剂量单位，其包含如权利要求1至35中任一项所述的多个粒子或权利要求36至39中任一项所述的组合物。
41.一种治疗患有病症的受试者的方法，其包括将有效量的如权利要求1至35中任一项所述的粒子或权利要求36至39中任一项所述的组合物施用至所述受试者，由此治疗受试者。
42.一种核酸试剂-疏水聚合物缀合物，其包含共价连接至疏水聚合物的核酸试剂，其中所述核酸试剂是经由有义链的5’末端连接至所述聚合物的siRNA。
43.如权利要求42所述的缀合物，其中所述核酸试剂经由连接基共价连接至所述疏水聚合物。
44.一种核酸试剂-亲水-疏水聚合物缀合物，其包含共价连接至亲水-疏水聚合物的核酸试剂。
45.如权利要求44所述的缀合物，其中所述核酸试剂连接至所述亲水-疏水聚合物的亲水部分。
46.如权利要求44所述的缀合物，其中所述核酸试剂连接至所述亲水-疏水聚合物的疏水部分。
47.一种制备包含核酸试剂的粒子的方法，所述方法包括在极性溶剂中在允许形成粒子的条件下组合(a)核酸试剂-疏水聚合物缀合物，各核酸试剂-疏水聚合物缀合物包含共价连接至疏水聚合物的核酸试剂，其中所述核酸试剂-疏水聚合物缀合物与阳离子部分缔合，
b)多个亲水-疏水聚合物；以及
(c)多个疏水聚合物
由此形成粒子。
48.一种如权利要求36至39中任一项所述的组合物，所述组合物当施用至受试者时使得靶基因的表达的减少程度与(a)用以不同于粒子或缀合物的制剂施用至受试者的核酸试剂观察到的靶基因的表达的减少程度或(b)在不存在施用核酸试剂或其它治疗剂的情况下观察到的靶基因的表达的减少程度相比高至少10％、20％、50％、75％、80％、90％、100％、200％或500％。
49.一种储存如权利要求42至46中任一项所述的缀合物、如权利要求1至29中任一项所述的粒子、或如权利要求36至39中任一项所述的组合物的方法，所述方法包括：
(a)提供安置于容器中的所述缀合物、粒子或组合物；
(b)储存所述缀合物、粒子或组合物；以及
(c)将所述容器移至第二位置或从所述容器移除所述缀合物、粒子或组合物的全部或等分部分。
50.如权利要求49所述的方法，其中储存的所述缀合物、粒子或组合物是复原制剂。
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