CN111560432A - Icam-1作为肺鳞癌标志物及治疗靶点的应用 - Google Patents

Icam-1作为肺鳞癌标志物及治疗靶点的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种ICAM‑1作为肺鳞癌标志物、治疗靶点及制备抑制肺鳞癌转移的产品的应用。其包括检测来自可能患有肺鳞癌的对象的肺支气管细胞样品中胞膜和胞浆中ICAM‑1表达量，其中出现ICAM‑1由胞浆向胞膜转移现象的与所述对象患有肺鳞癌的可能性增加相关。本发明通过实验研究发现，ICAM‑1会明显的影响肿瘤细胞的迁移能力，在肺鳞癌中有向膜转移的现象，据此，本发明提供了ICAM‑1作为肺鳞癌标志物及治疗靶点的应用，并进一步提供了ICAM‑1作为制备抑制肺鳞癌转移的产品中的应用，通过相关产品抑制ICAM‑1的表达，能实现抑制肺鳞癌转移的目的，并能应用于设计可靠的治疗方案来防治肿瘤转移的发生。

Description

ICAM-1作为肺鳞癌标志物及治疗靶点的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种ICAM-1作为肺鳞癌标志物、治疗靶点及制备抑制肺鳞癌转移的产品的应用。
背景技术
肺癌是世界上发病率和致死率最高的癌症。通过临床病理学特征它们可被分为小细胞癌(SCLC)和非小细胞癌(NSCLC)。其中，肺腺癌和肺鳞癌是非小细胞癌中最常见的类型。肺癌会向不同脏器的转移，对人造成极大的伤害，甚至威胁生命。肺癌的基本治疗方案是手术、放疗、化疗以及靶向治疗，手术治疗复发率很高，化疗和放疗也不能很好的控制肿瘤的复发和转移，针对不同的靶点有不同靶向药物，虽然有了一定的进展，但是同样会有耐药复发转移的情况，因此对肿瘤转移的标志物的进一步研究对治疗癌症有很好的帮助。
ICAM-1是免疫球蛋白超家族的成员之一，作为跨膜蛋白广泛存在于内皮细胞、淋巴细胞、单核细胞以及多种癌细胞表面。ICAM-1参与免疫细胞的趋化运动、肿瘤细胞的侵袭和转移、细胞信号的传导、神经系统发育等多种重要的生物学功能。ICAM-1基因位于染色体的19pl3.3-13.2区，其编码蛋白含533个氨基酸残基，因为具有不同形式的糖基化，从而使得其分子量大小会在80kDa与114kDa之间变动。在多种恶性肿瘤里，ICAM-1都有不同程度的表达且与肿瘤细胞的侵袭转移密切相关。但现在，对于ICAM-1的表达与肺鳞癌的关系的研究，以及ICAM-1在制备抑制肺鳞癌转移的产品中的应用的研究很少出现。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种ICAM-1作为肺鳞癌标志物及治疗靶点的应用。
本发明的一方面在于：提供ICAM-1作为肺鳞癌标志物的应用。
优选的是，该ICAM-1作为肺鳞癌标志物的应用包括检测来自可能患有肺鳞癌的对象的肺支气管细胞样品中胞膜和胞浆中ICAM-1表达量，其中出现ICAM-1由胞浆向胞膜转移现象的与所述对象患有肺鳞癌的可能性增加相关。
优选的是，其中在，对于胞浆，ICAM-1在肺支气管的正常组织中表达量明显高于癌组织；对于胞膜，ICAM-1在肺支气管的正常组织中表达量明显低于癌组织。
本发明的另一方面在于：提供ICAM-1作为肺鳞癌治疗靶点的应用。
本发明的另一方面还在于：提供ICAM-1作为制备抑制肺鳞癌转移的产品中的应用。
优选的是，所述产品包括药物/组合物，所述药物或组合物的有效成分可抑制ICAM-1的表达。
本发明的另一方面还在于：提供一种ICAM-1基因敲除试剂盒，其用于对ICAM-1基因的靶位点进行敲除。
优选的是，所述靶位点在ICAM-1CDS区的第一个外显子，所述靶位点包括：
ICAM-1-gRNA1：TTGCAACCTCAGCCTCGCTATGG；
ICAM-1-gRNA2：CTGGGAACAGAGCCCCGAGCAGG；
ICAM-1-gRNA3：ACCAGGAGTGCGGGCAGCGCGGG。
优选的是，所述试剂盒包括载体质粒以及可与所述三个靶位点分别配对的oligoDNA。
优选的是，所述试剂盒用于对ICAM-1基因的靶位点进行敲除的步骤包括：将可与所述三个靶位点分别配对的三对oligo DNA克隆到载体质粒中，得到3个敲除质粒，通过电转染的方法将构建好的敲除质粒转入Calu-1细胞中，然后将Calu-1细胞置于培养箱中培养。该基因敲除方法用于非疾病诊断和治疗，主要是用于体外研究。
上述试剂盒用于体外研究，通过对ICAM-1基因的靶位点进行敲除来研究ICAM-1蛋白的功能，以用于研究制备抑制ICAM-1蛋白表达的产品，通过抑制ICAM-1蛋白表达起到抑制体内的肺鳞癌转移的效果。例如用于制备针对ICAM-1这个蛋白的抗体来阻断这个蛋白的作用，从而起到抑制体内的肺鳞癌转移。
本发明的有益效果是：本发明通过实验研究发现，ICAM-1会明显的影响肿瘤细胞的迁移能力，在肺鳞癌中有向膜转移的现象，据此，本发明提供了ICAM-1作为肺鳞癌标志物及治疗靶点的应用，并进一步提供了ICAM-1作为制备抑制肺鳞癌转移的产品中的应用，通过产品抑制ICAM-1的表达，能实现抑制肺鳞癌转移的目的，并能应用于设计可靠的治疗方案来防治肿瘤转移的发生。
附图说明
图1为本发明的ICAM-1在正常组织和肺鳞癌组织中的表达情况示意图；
图2A为本发明的1#的
Figure BDA0002469057780000031
酶切检测电泳结果；
图2B为本发明的18#的
Figure BDA0002469057780000032
酶切检测电泳结果；
图3为本发明的ICAM-1过量表达和敲除结果；
图4为本发明的肺鳞癌细胞系Calu-1迁移能力测定结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
ICAM-1是免疫球蛋白超家族的成员之一，作为跨膜蛋白广泛存在于内皮细胞、淋巴细胞、单核细胞以及多种癌细胞表面。ICAM-1参与免疫细胞的趋化运动、肿瘤细胞的侵袭和转移、细胞信号的传导、神经系统发育等多种重要的生物学功能。ICAM-1基因位于染色体的19pl3.3-13.2区，其编码蛋白含533个氨基酸残基，因为具有不同形式的糖基化，从而使得其分子量大小会在80kDa与114kDa之间变动。在多种恶性肿瘤里，ICAM-1都有不同程度的表达且与肿瘤细胞的侵袭转移密切相关，对于肿瘤诊断和治疗有着重要的意义。
本申请发明人通过相关研究发现：
1、对于胞浆ICAM-1在正常肺支气管上皮中表达明显高于癌组织，但是对于胞膜，正常肺支气管上皮中ICAM-1的表达却明显低于癌组织。
2、ICAM-1在体外对肺鳞癌细胞具有促进迁移的作用。
所以，ICAM-1可作为肺鳞癌标志物进行相关应用，并可作为肺鳞癌治疗靶点，应用于制备抑制肺鳞癌转移的相关产品，以设计更好的治疗方案来防治肿瘤转移的发生。
以下实施例中，使用的都是常用的分子生物学和细胞生物学相关的试剂和耗材。细胞购自上海生命科学研究院细胞所，肺鳞癌组织芯片购自上海芯超生物科技有限公司。
实施例1 ICAM-1在正常组织和肺鳞癌组织中的表达情况
免疫组化染色实验(S-P法)：将正常组织细胞(N)和肺鳞癌组织芯片(T)分别进行以下实验：
放入60℃烘箱烘蜡1h，脱蜡，EDTA热修复20min，过氧化氢处理30min，滴加一抗，4℃过夜，滴加二抗，37℃孵育30min，使用二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色法，苏木精复染，脱水，封片。H-SCORE得分为染色强度与阳性率的乘积。
用组织化学评分(histochemistry score，H-Score)对免疫组化实验结果进行评判的得分，结果如图1所示。其中，图1A和图1B中图形表示的0、0-1、1-2、2是用组织化学评分(histochemistry score，H-Score)对免疫组化实验结果进行评判的得分，N表示正常组织细胞，T表示肺鳞癌组织芯片。
图1A为胞浆ICAM-1的表达判读结果统计图；图1B为胞浆ICAM-1表达的代表图；图1C为胞膜ICAM-1的表达判读结果统计图；图1D为是胞膜ICAM-1表达的代表图。从图1的结果可以看出：对于胞浆，ICAM-1在正常肺支气管上皮中表达明显高于肺鳞癌组织；但是对于胞膜，正常肺支气管上皮中ICAM-1的表达却明显低于癌组织；即肺鳞癌组织中，出现ICAM-1由胞浆向胞膜转移现象。
一种实施例中，ICAM-1作为肺鳞癌标志物的应用，其包括检测来自可能患有肺鳞癌的对象的肺支气管细胞样品中胞膜和胞浆中ICAM-1表达量，其中出现ICAM-1由胞浆向胞膜转移现象的与所述对象患有肺鳞癌的可能性增加相关。也即，通过检测ICAM-1是否出现由胞浆向胞膜转移现象来判断患有肺鳞癌的可能性。
实施例2过量表达ICAM-1
使用Lenti-XTM293T细胞系进行慢病毒包装，包装质粒为PMD2G和PSPAX2，过量表达质粒载体为pLVX-IRES-neo，步骤为：
将ICAM-1基因CDS区克隆进该载体；
将包装质粒以及包含ICAM-1基因CDS区的pLVX-IRES-neo载体转染进Lenti-XTM293T，同时设置对照组，对照组是不含ICAM-1基因CDS区的pLVX-IRES-neo载体(图3中，NC是对照组，ICAM-1组是实验组)；
转染后48h收取含有慢病毒的细胞培养基上清，用该上清去感染目的细胞Calu-1(肺癌细胞)，感染完成后收取目的细胞，并提RNA以及收取蛋白验证过量表达是否成功。
使用Trizol法提取RNA，利用荧光实时定量PCR技术测定ICAM-1 mRNA水平(结果如图3F)，结果发现，在实验组中ICAM-1 mRNA水平显著提高，利用蛋白质免疫印迹实验(Western blot)测定ICAM-1蛋白水平是否提高(结果如图3G)，结果发现，在实验组中ICAM-1蛋白水平显著提高(图3G),证明过量表达成功。图3F是qRT-PCR检测ICAM-1过量表达效果，图3G是Western blot法检测ICAM-1过量表达效果。
实施例3
本实施例中，提供一种ICAM-1基因敲除试剂盒。通过在ICAM-1基因蛋白质编码区的第一个外显子区域进行敲除靶点设计,该试剂盒用于对ICAM-1基因的靶位点进行敲除，所述靶位点在ICAM-1CDS区的第一个外显子，所述靶位点包括：
ICAM-1-gRNA1：TTGCAACCTCAGCCTCGCTATGG；
ICAM-1-gRNA2：CTGGGAACAGAGCCCCGAGCAGG；
ICAM-1-gRNA3：ACCAGGAGTGCGGGCAGCGCGGG。
该试剂盒包括载体质粒以及可与所述三个靶位点分别配对的oligo DNA。
具体步骤包括：
设计三对20bp左右的gRNA并分别将对应的oligo DNA(可与所述三个靶位点分别配对)克隆到pGK1.1载体中，得到3个敲除载体，通过电转染的方法将构建好的敲除质粒转入Calu-1细胞(通过上述实施例2得到)中；
72h之后，将目的细胞制成细胞悬液进行计数，取一定量的悬液进行稀释，使96孔板中每个孔细胞数为1个，最后将96孔板置于5％CO2,37℃培养箱中静置培养；
15天左右观察细胞是否能形成细胞簇，提取能形成细胞簇的细胞DNA，在敲除靶点附近设计高特异性的引物，扩增产物长度约为334bp，利用Genloci
Figure BDA0002469057780000061
基因敲除检测试剂盒进行敲除效果检测，检测结果显示1#克隆和18#克隆的DNA电泳条带大小明显变小(图2)，认为敲除成功；并对于可能的阳性克隆进行TA克隆并测序(图3A、3B、3C)，通过测序结果对比分析确认阳性克隆之后(图3D)，对阳性克隆进行Western blot试验检测敲除效果(图3E)，说明1#克隆和18#克隆ICAM-1敲除成功。该基因敲除方法用于非疾病诊断和治疗，主要是用于体外研究。
蛋白质免疫印迹实验：收取目的细胞(步骤2得到的实验组ICAM-1和对照组NC，以及未进行敲除的Calu-1和本实施例中ICAM-1敲除成功的1#克隆和18#克隆)，加RIPA冰上裂解30min，12000r/min、4℃离心20min，取上清于新管中，BCA法测定蛋白浓度，加5×的loading buffer混匀后，95℃变性10min，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，200mA转膜1.5h，5％脱脂牛奶室温封闭1h，加入一抗4℃过夜孵育，TBST洗膜3遍，在室温孵育二抗2h，TBST洗膜3遍，显影。实验结果如图3E。
图2A和2B分别是1#克隆和18#克隆
Figure BDA0002469057780000062
酶切检测电泳结果，图中最右侧是清晰的DN Amarker的大小指示图，单位是bp，3000bp往下依次减小。
图3中，图3A、3B为1#克隆细胞的TA克隆测序鉴定图，黑色箭头为CRISPR/Cas9系统开始剪切的位置；
图3C是18#克隆细胞的TA克隆测序鉴定图，黑色箭头为CRISPR/Cas9系统开始剪切的位置；
图3D是敲除细胞株TA克隆测序的比对结果汇总；
图3E是Western blot法检测ICAM-1敲除效果；
图3F是qRT-PCR检测ICAM-1过量表达效果；
图3G是Western blot法检测ICAM-1过量表达效果。
需要理解的是，该试剂盒主要用于体外研究，通过对ICAM-1基因的靶位点进行敲除来研究ICAM-1蛋白的功能，以用于研究制备抑制ICAM-1蛋白表达的产品，通过抑制ICAM-1蛋白表达起到抑制体内的肺鳞癌转移的效果。例如用于制备针对ICAM-1这个蛋白的抗体来阻断这个蛋白的作用，从而起到抑制体内的肺鳞癌转移。
实施例4肺鳞癌细胞系Calu-1迁移能力测定
设置实验组和对照组，实验组的细胞悬液为实施例3得到的ICAM-1敲除成功后的细胞(1#和18#)以及实施例2得到的过量表达ICAM-1后的细胞(图中ICAM-1)，对照组的细胞悬液为未进行ICAM-1敲除的肺鳞癌细胞(图中Calu-1)和实施例2中的对照组得到的细胞(不含ICAM-1基因CDS区，图中NC)，分别按以下步骤进行测定：
采用Transwell小室，下室加入600μL培养液(含10％胎牛血清)；取80μL细胞悬液加入上室，放入CO2孵箱培养24h。用棉花擦去未迁移的细胞(小室顶部)，用95％乙醇固定，0.5％结晶紫染色，对实验结果镜像拍摄代表图(图4A上图，图4B上图)，染色结束后用500ul33％乙酸脱色，取200ul脱色液在570nm处测定吸光度。
图4A是敲除ICAM-1对Calu-1(肺鳞癌细胞)的细胞迁移能力的影响(上图)及定量结果(下图)，图中显示敲除ICAM-1之后，细胞迁移能力变弱了
图4B是过量表达ICAM-1对Calu-1细胞迁移能力的影响(上图)及定量结果(下图)，过量表达ICAM-1之后，细胞迁移能力变强了。
图中的柱状图是根据脱色液的OD值绘制的，OD值越高，表明迁移能力越强。
图4A中，1#和18#，敲除了靶点基因，转移能力下降，说明通过对ICAM-1基因CDS区进行靶点基因敲除能降低肺癌细胞的转移能力。
图4B，NC对照组为不含ICAM-1基因CDS区，其转移能力弱，ICAM-1过量表达后，转移能力强，说明ICAM-1能促进肺癌细胞转移。
通过实施例4的结论可知，ICAM-1能促进肺癌细胞转移，说明通过制备抑制ICAM-1表达的产品，可以预期其能到达实现抑制肺鳞癌转移的目的。在一种实施例中，提供ICAM-1作为制备抑制肺鳞癌转移的产品中的应用，所述产品包括药物或组合物，所述药物或组合物的有效成分可抑制ICAM-1的表达。在一种更为具体的实施例中，提供一种ICAM-1基因敲除试剂盒，通过ICAM-1基因敲除实现抑制肺鳞癌转移。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (10)

1.ICAM-1作为肺鳞癌标志物的应用。
2.根据权利要求1所述的ICAM-1作为肺鳞癌标志物的应用，其特征在于，其包括检测来自可能患有肺鳞癌的对象的肺支气管细胞样品中胞膜和胞浆中ICAM-1表达量，其中出现ICAM-1由胞浆向胞膜转移现象的与所述对象患有肺鳞癌的可能性增加相关。
3.根据权利要求1所述的ICAM-1作为肺鳞癌标志物的应用，其特征在于，其中在，对于胞浆，ICAM-1在肺支气管的正常组织中表达量明显高于癌组织；对于胞膜，ICAM-1在肺支气管的正常组织中表达量明显低于癌组织。
4.ICAM-1作为肺鳞癌治疗靶点的应用。
5.ICAM-1在制备抑制肺鳞癌转移的产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的ICAM-1在制备抑制肺鳞癌转移的产品中的应用，其特征在于，所述产品包括药物或组合物，所述药物或组合物的有效成分可抑制ICAM-1的表达。
7.一种ICAM-1基因敲除试剂盒，其特征在于，其用于对ICAM-1基因的靶位点进行敲除。
8.根据权利要求7所述的ICAM-1基因敲除试剂盒，其特征在于，所述靶位点设计在ICAM-1的第一个外显子，所述靶位点包括：
ICAM-1-gRNA1：TTGCAACCTCAGCCTCGCTATGG；
ICAM-1-gRNA2：CTGGGAACAGAGCCCCGAGCAGG；
ICAM-1-gRNA3：ACCAGGAGTGCGGGCAGCGCGGG。
9.根据权利要求8所述的ICAM-1基因敲除试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括载体质粒以及可与所述三个靶位点分别配对的oligo DNA。
10.根据权利要求9所述的ICAM-1基因敲除试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于对ICAM-1基因的靶位点进行敲除的步骤包括：将可与所述三个靶位点分别配对的三对oligoDNA克隆到载体质粒中，得到3个敲除质粒，通过电转染的方法将构建好的敲除质粒转入Calu-1细胞中，然后将Calu-1细胞置于培养箱中培养。
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