CN113599523B

CN113599523B - GPx8作为分子靶点在制备预防和/或治疗脂肪肝的药物中的应用

Info

Publication number: CN113599523B
Application number: CN202111000808.6A
Authority: CN
Inventors: 秦绪军; 周健; 张薇; 王枫; 李影娜; 柏桦; 杜凤
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2021-08-30
Filing date: 2021-08-30
Publication date: 2023-02-03
Anticipated expiration: 2041-08-30
Also published as: CN113599523A

Abstract

本发明提供了GPx8作为分子靶点在制备预防和/或治疗脂肪肝的药物中的应用，属于生物药物技术领域。采用高脂膳食(HFD)诱导的大鼠和小鼠MAFLD模型和游离脂肪酸诱导的脂肪肝细胞模型，通过病毒转染过表达GPx8的方法，证明了提高GPx8的表达水平，可以显著改善脂肪的累积，对脂肪肝的防治具有很好的效果。表明GPx8可以作为防治脂肪肝的分子靶点在临床治疗中进行开发应用。

Description

GPx8作为分子靶点在制备预防和/或治疗脂肪肝的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物药物技术领域，具体涉及GPx8作为分子靶点在制备预防和/或治疗脂肪肝的药物中的应用。

背景技术

代谢相关脂肪肝病(metabolic associated fatty liver disease，MAFLD)，又称为非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)，由于其命名的不确定性以及对其发病机制的深入研究和临床诊断治疗的需要，被国际专家小组正式更名为MAFLD来更精确的描述其代谢障碍特点。其最主要的特点在于肝脏脂质的过度沉积及全身代谢障碍。最新的命名方式也表明，MAFLD不同于以往NAFLD的分类方法，将不再刻意强调是否具有脂肪肝炎的发生而被划分为单纯性的脂肪肝与非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis，NASH)，而是通过其肝脏活性与纤维化的严重程度进行分级。MAFLD是代谢综合征(metabolic syndrome，MetS)的肝脏表现，其发展的关键就在于最初的脂质积累以及后续的炎性反应。不仅如此，MAFLD还受性别、年龄、是否患有糖尿病、情绪、遗传多态性以及肠道微生物群的影响。MAFLD不仅仅作为心血管疾病发病的独立危害因素，还且还可以提高死亡的风险，包含了肝性和非肝性疾病的原因，如糖尿病、恶性肿瘤、冠状动脉疾病等。

MAFLD已成为全世界人们在慢性病领域的关注焦点。其发病率呈现逐年升高的趋势。全球总体平均患病率约为25％，不同地区的患病率不尽相同。研究MAFLD发生的机制以及做出及时的干预更具意义。但到目前为止，MAFLD发病机制仍未明确，也未有特效药物批准上市。因此，对MAFLD的发病机制进行深入地探索研究，寻找可能的干预靶点，对MAFLD的治疗具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种GPx8作为分子靶点在制备预防和/或治疗脂肪肝的药物中的应用。

本发明提供了GPx8作为分子靶点在制备预防和/或治疗脂肪肝的药物中的应用。

优选的，所述GPx8包括GPx8基因和GPx8蛋白。

优选的，所述GPx8基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选的，所述药物包括GPx8过表达试剂或者促进GPx8过表达的试剂。

优选的，所述GPx8过表达试剂包括含GPx8基因的病毒过表达载体或者含GPx8基因的病毒。

优选的，所述含GPx8基因的病毒过表达载体包括含GPx8基因的慢病毒过表达载体或含GPx8基因的腺病毒过表达载体；

所述含GPx8基因的病毒包括含GPx8基因的慢病毒或含GPx8基因的腺病毒。

优选的，所述脂肪肝包括高脂膳食引起的脂肪肝。

优选的，所述预防和/或治疗脂肪肝包括降低肝脏组织或肝细胞中脂质累积。

本发明提供了一种防治脂肪肝的药物，包括GPx8过表达试剂或者促进GPx8过表达的试剂。

本发明提供了GPx8作为分子靶点在制备预防和/或治疗脂肪肝的药物中的应用。本发明采用高脂膳食(high fat diet，HFD)成功诱导得到大鼠和小鼠MAFLD模型，采用游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)成功诱导得到脂肪肝细胞模型，检测肝组织或肝细胞中抗氧化酶表达情况，结果表明HFD组大鼠的GPx8的基因水平和蛋白水平均比对照组组大鼠显著降低。本发明通过病毒转染过表达GPx8的方法，提高肝组织或肝细胞中GPx8的表达水平，可以显著改善脂质的累积，对脂肪肝的防治具有很好的效果。表明GPx8可以作为防治脂肪肝的分子靶点在将来的临床治疗中进行开发应用。

附图说明

图1为本发明中涉及的慢病毒过表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro的谱图；

图2为本发明实施例中HFD对大鼠肝组织中TG水平的影响，*p<0.05；

图3为本发明实施例中HFD对大鼠肝组织ER内GPx8(A)、GPx7(B)和Prx4(C)三种抗氧化酶的mRNA的表达量的影响；*p<0.05；

图4为本发明实施例中HFD对大鼠肝组织内质网(ER)内三种抗氧化酶蛋白的影响；图4A为不同处理组三种抗氧化酶蛋白的WesternBlot条带图；图4B是GPx8蛋白量化图；*p<0.05；

图5为本发明实施例中FFA诱导L-02细胞内脂质累积水平改变；其中图5A为油红O染色结果，标尺＝100μm；图5B.BODIPY染色结果，标尺＝100μm；图5C为BODIPY染色量化图；*p<0.05；

图6为本发明实施例中FFA对L-02细胞TG水平的影响；*p<0.05；

图7为本发明实施例中HFD对L-02细胞内质网内GPx8(A)、GPx7(B)和Prx4(C)三种抗氧化酶的mRNA的表达量的影响；*p<0.05；

图8为本发明实施例中FFA对L-02细胞内质网内抗氧化酶蛋白的影响；图8A为WesternBlot条带图；图8B、图8C、图8D分别为GPx8、GPx7、Prx4蛋白量化图；*p<0.05；

图9为本发明实施例中GPx8过表达后GPx8mRNA水平；*p<0.05；

图10为本发明实施例中GPx8过表达后GPx8蛋白水平；其中图10A为WesternBlot条带图；图10B为GPx8蛋白量化图；*p<0.05；

图11为本发明实施例中GPx8过表达对L-02细胞内脂质累积水平的影响；其中图11A为油红O染色结果，标尺＝100μm；图11B为BODIPY染色，标尺＝100μm；图11C为BODIPY染色量化图；*p<0.05。

图12为本发明实施例中GPx8过表达对L-02细胞TG水平的影响；*p<0.05。

图13为本发明实施例中小鼠注射AAV包装的GPx8基因小鼠肝脏GPx8表达水平；

图14为本发明实施例中小鼠高表达GPx8基因后对小鼠肝脏TG水平的影响。

具体实施方式

在本发明中，所述药物优选包括GPx8过表达试剂或者促进GPx8过表达的试剂。所述GPx8优选包括GPx8基因和GPx8蛋白。所述GPx8基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1(ATGGAGCCTCTTGCAGCTTACCCGCTAAAATGTTCCGGGCCCAGAGCAAAGGTATTTGCAGTTTTGCTGTCTATAGTTCTATGCACAGTAACGCTATTTCTTCTACAACTAAAATTCCTCAAACCTAAAATCAACAGCTTTTATGCCTTTGAAGTGAAGGATGCAAAAGGAAGAACTGTTTCTCTGGAAAAGTATAAAGGCAAAGTTTCACTAGTTGTAAACGTGGCCAGTGACTGCCAACTCACAGACAGAAATTACTTAGGGCTGAAGGAACTGCACAAAGAGTTTGGACCATCCCACTTCAGCGTGTTGGCTTTTCCCTGCAATCAGTTTGGAGAATCGGAGCCCCGCCCAAGCAAGGAAGTAGAATCTTTTGCAAGAAAAAACTACGGAGTAACTTTCCCCATCTTCCACAAGATTAAGATTCTAGGATCTGAAGGAGAACCTGCATTTAGATTTCTTGTTGATTCTTCAAAGAAGGAACCAAGGTGGAATTTTTGGAAGTATCTTGTCAACCCTGAGGGTCAAGTTGTGAAGTTCTGGAAGCCAGAGGAGCCCATTGAAGTCATCAGGCCTGACATAGCAGCTCTGGTTAGACAAGTGATCATAAAAAAGAAAGAGGATCTATGA)所示。所述GPx8过表达试剂包括含GPx8基因的病毒过表达载体或者含GPx8基因的病毒。所述含GPx8基因的病毒过表达载体优选包括含GPx8基因的慢病毒过表达载体或含GPx8基因的腺病毒过表达载体。所述含GPx8基因的病毒包括含GPx8基因的慢病毒或含GPx8基因的腺病毒。本发明以慢病毒过表达载体及其包装的慢病毒为例，说明在肝细胞或肝组织中过表达GPx8基因和蛋白的方法。在本发明中，所述含GPx8基因的病毒过表达载体的构建方法，包括以下步骤：

1)以人cDNA为模板采用hGPX8-EcoR I-For和hGPX8-BamH I-Rev引物进行PCR扩增，得到带有双酶切位点的GPx8基因片段；

2)将慢病毒载体和所述带有双酶切位点的GPx8基因片段分别进行BamHI和EcoR I双酶切，得到GPx8基因酶切片段和线性慢病毒载体；

3)将所述GPx8基因酶切片段和线性慢病毒载体进行连接，得到连接产物，经筛选验证得到含GPx8基因的慢病毒过表达载体。

在本发明中，所述hGPX8-EcoR I-For的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:2(TCAGAATTCGCCACCATGGAGCCTCTTGCAGCTTAC)所示；所述hGPX8-BamH I-Rev引物的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:3(CGCGGATCCTCATAGATCCTCTTTCTTTTTTATG)所示。PCR扩增的反应体系优选为50μl：10μl 5phusion HF buffer、1μl 10mM dNTPs、2.5μl 10μM hGPX8-EcoR I-For、2.5μl10μM hGPX8-BamH I-Rev、1μl模板(100ng/μl)、1.5μl DMSO、0.5μl Phusion DNApolymerase、31μl ddH₂O₂。PCR扩增的反应程序优选如下：98℃60s；35(98℃10s，55℃30s，72℃30s/kb；72℃10min；4℃保温。

在本发明中，所述双酶切的反应体系的总体积优选为20μl：2μg(体积2μl)载体或基因片段，每种内切酶1μl，10×FastDigestbuffer2μl，去离子水14μl。所述载体优选为pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro。本发明对所述pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的商品购买途径获得即可。在本发明实施例中，所述pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro购自优宝生物(http://www.youbio.cn/)，谱图见图1。所述双酶切的反应条件优选如下：37℃，20min，加1μl CIP，37℃，继续10min。所述双酶切后，优选对得到的GPx8基因酶切片段和线性慢病毒载体分别进行纯化。所述纯化优选采用PCR纯化试剂盒进行。所述连接的反应体系优选如下：10μl 2buffer、1μl载体、3～6μl PCR产物、1μl quick ligase(NEB，Cat：M2200)，加水到20μl。所述连接的条件优选为室温(20～28℃)下放置5～15min。

在本发明中，所述连接后，优选将所述连接产物转化到大肠杆菌感受态中，经筛选培养，挑取单菌落进行测序，得到连接有GPx8基因的慢病毒过表达载体。所述转化优选采用42℃热激法进行。所述筛选培养优选采用含100μg/ml氨苄抗生素的LB的琼脂糖平板上进行，所述筛选培养的温度优选为36～38℃，更优选为37℃，所述筛选培养的时间优选为10～14h，更优选为12h。含GPx8基因的腺病毒过表达载体的构建方法基本与上述一致，不同之处在于腺病毒过表达载体不同，根据常规选择选择合适的腺病毒过表达载体按照上述构建方法操作即可。

在本发明中，所述含GPx8基因的慢病毒的包装方法，优选包括以下步骤：

A.将复苏的293lenti细胞在转染前一天进行酶解，得到单细胞293lenti细胞进行培养；

B.待培养至单细胞293lenti细胞的密度长至80％～90％时，加入含所述GPx8基因的慢病毒过表达载体、慢病毒包装载体、转染试剂和opti-MEM培养基的混合物进行转染；

C.转染后，经高糖培养基培养后更换完全培养基培养，转染后5d收集病毒颗粒，得到含GPx8基因的慢病毒。所述含GPx8基因的腺病毒的包装方法同慢病毒的包装方法，在此不做赘述。

在本发明中，所述脂肪肝是指代谢相关脂肪肝病(MAFLD)。所述脂肪肝优选包括高脂膳食引起的脂肪肝。构建脂肪肝小鼠和大鼠模型以及脂肪肝细胞模型，检测GPx8基因表达以及蛋白表达情况，结果表明，与空白对照组相比，模型组中GPx8基因表达以及蛋白表达显著降低。而通过在小鼠模型以及细胞模型中过表达GPx8基因和/或蛋白，能够有效降低肝脏组织或肝细胞中脂质累积，可见，本发明提供的药物是通过过表达GPx8基因和/或蛋白来降低肝脏组织或肝细胞中脂质累积，从而实现脂肪肝的预防和/或治疗目的，因此GPx8可以作为分子靶点来治疗脂肪肝。

本发明提供了一种防治脂肪肝的药物，包括GPx8过表达试剂或者促进GPx8过表达的试剂。所述GPx8过表达试剂优选包括含GPx8基因的病毒过表达载体或者含GPx8基因的病毒。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的生物药物的制备方法即可。所述药物优选为注射剂。所述注射剂中含GPx8基因的慢病毒的滴度优选为5.12×10⁷～1.08×10⁸TU/ml。含GPx8基因的AAV病毒优选为1.0～1.5×10¹²vg/ml。所述慢病毒注射剂量优选为10μl/10⁵cell，AAV病毒注射剂量优选为1.0×10¹¹vg/只，共注射1次。

下面结合实施例对本发明提供的GPx8作为分子靶点在制备预防和/或治疗脂肪肝的药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

pCDH-Puro-GPx8质粒构建方法

1.设计PCR引物，以小鼠cDNA为模板进行PCR克隆，得到GPx8片段序列。

引物序列：hGPX8-EcoRI-For：

TCAGAATTCGCCACCATGGAGCCTCTTGCAGCTTAC(SEQ ID NO:2)；

hGPX8-BamHI-Rev：

CGCGGATCCTCATAGATCCTCTTTCTTTTTTATG(SEQ ID NO:3)；

PCR方案(PCR酶用phusionhigh-fidelity DNApolymerase)：

10μl 5phusion HF buffer、1μl 10mM dNTPs、2.5μl 10μM hGPX8-EcoRI-For、2.5μl 10μM hGPX8-BamHI-Rev、1μl小鼠cDNA模板(100ng/μl)、1.5μl DMSO、0.5μl PhusionDNApolymerase、31μl ddH₂O₂，总体积50μl。

PCR的反应程序：98℃60s；35个循环(98℃10s，55℃30s，

72℃30s/kb)；72℃10min；4℃。

2.载体质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro的BamHI和EcoR I双酶切。

双酶切的反应体系：2μg(体积2μl)载体，每个内切酶1μl，10×FastDigestbuffer2μl，去离子水14μl，总体积20μl；

双酶切的反应程序：37℃，20min，加1μl CIP，37℃，继续10min。双酶切结束后，酶切产物采用PCR纯化试剂盒进行纯化。

3.酶切产物回收大片段与目的片段连接

连接的反应体系：10μl 2buffer、1μl载体、3～6μl PCR产物、1μl quick ligase(NEB，Cat：M2200)，加水到20μl，室温放置5～15min，得到连接产物。

4.连接产物转化

取50μl stbl3感受态细胞，加入连接产物混匀，冰上放置30min，42℃，45s后立即置于冰上2min。将此转化后感受态细胞接种于500μl无抗生素LB培养基中45min，后接种于含100μg/ml氨苄抗生素的LB的琼脂糖平板上，37℃，过夜。

5.各挑取3个单菌落接种于含5ml，100μg/ml Ampicillin抗性的LB培养液中，250rpm，37℃恒温摇床培养过夜，进行测序验证。

测序结果分析：经比对结果表明pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-GPx8测序结果与设计序列一致。

实施例2

pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-GPx8慢病毒包装方法

1.293lenti细胞复苏后，在转染的前一天，传代准备细胞：用0.25％胰蛋白酶消化5min，以含10％血清的DMEM培养基调整细胞密度后，按照每10cm细胞培养皿接种6～8×10⁶cells到10cm细胞培养皿中，置于37℃，5％CO₂培养箱培养，16～24h后待细胞密度生长到80％～90％时即可用于转染。

2.按照以下实验步骤来进行转染，其中转染试剂购自Thermo公司。

A、加入500μl opti-MEM培养基到一支洁净的1.5ml EP管中，依次加入以下试剂，加入量见表1，得到稀释好的DNA质粒。

表1转染试剂的配制

B、向新的EP管加入500μl opti-MEM培养基中，加入lipofectamin 200075μl，得到稀释好的转染试剂。将A步骤得到的稀释好的DNA质粒和稀释好的转染试剂将用移液器轻轻混匀，放置5min。

C、然后将步骤B得到的混合物逐滴均匀加入到10cm细胞培养皿中，再加入9mlDMEM高糖培养基轻微混匀。置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。

3.培养6h后弃去培养基，用10ml新鲜的完全培养基换液(DMEM+10％FBS+P/S)。

4.第四天，收集上清液，置于4℃冰箱保存，然后加入10ml新鲜的完全培养基(DMEM+10％FBS+P/S)至10cm细胞培养皿中，置于37℃，5％CO₂培养箱继续培养。

5.第五天：再一次收集上清，与第一次收集的上清液混合，1000rpm离心5min，弃去细胞碎片，上清液以0.45μm PVDF滤器过滤至50ml圆底离心管中。

6.在4℃、50000g下高速离心2h，离心后可用记号笔对病毒沉淀做好标记。小心弃去上清，晾干，按200ul/10cm培养皿的量加入PBS重悬病毒沉淀，室温静置2h，然后用移液器轻轻地吹匀(避免产生气泡)，继续室温放置30min，按每次使用的病毒量分装到洁净的1.5ml EP管中，-80℃冰箱保存。

实施例3

高脂膳食诱导的脂肪肝大鼠模型的构建及相关指标的检测

1)SD大鼠(购买于空军军医大学实验动物中心)先以基础饲料喂养一周，再随机分为普通膳食(对照，Chow)组与高脂膳食(high fat diet，HFD)喂养组，每组8只。普通膳食组给予基础饲料继续喂养；HFD组给与高脂饲料(脂肪含量为45％，美国Research Diets CatNo.D12451)进行喂养。两组大鼠均自由饮水。

2)喂养3个月后，脱颈处死后取肝组织用于检测。甘油三酯(TG)的累积是MAFLD的重要表现之一，也是MAFLD的发病基础。当发生MAFLD时，大量的脂滴(LDs)累积于肝细胞中，这些LDs便是TG在肝细胞中的储存形式^[4]。通过检测HFD组中TG水平与普通膳食组呈显著性差异则表示大鼠模型构建成功。大鼠肝组织TG检测方法如下：

对大鼠肝组织裂解研磨，在4℃，14000g的条件下离心20min后取上清获得待检测样品。通过GPO-DAOS法，将TG检测试剂盒中的检测液A与B按1:1混合。2μL样品+300μL检测液进行冲击，37℃孵育至少30min，在600nm测定OD值。

本实施例中，通过TG检测试剂盒分别对对照饲料(Chow)组与HFD组大鼠肝组织中的TG水平进行定量检测。如图2所示，HFD组大鼠的肝脏组织中的TG水平比对照组的TG水平有显著的升高。表明HFD组大鼠肝组织比对照组大鼠肝组织有更多TG累积，进一步提示HFD可以诱导大鼠肝脏TG累积增加，形成MAFLD。

3)脂肪肝大鼠模型内质网内抗氧化酶表达情况

A.通过qPCR测定大鼠肝组织GPx8、GPx7和Prx4的mRNA水平，具体步骤如下：

取对照组和HFD组大鼠肝组织提取RNA，经逆转录得到大鼠cDNA。

大鼠GPx8引物：

For：TAGTGACTGCCGGTTCACAG(SEQ ID NO:4)；

Rev：ATAGGGCCCAAACTCCTTGT(SEQ ID NO:5)；

大鼠GPx7引物：

For：TAGCGAATGTGGCTTCACAG(SEQ ID NO:6)；

Rev：AAGGGAAAGCAAGCACGTTA(SEQ ID NO:7)；

大鼠Prx4引物：

For：AGTGCCACTTCTACGCTGGT(SEQ ID NO:8)；

Rev：TTTGCTTAGGTGCAGGGAGT(SEQ ID NO:9)；

内参actin引物：

For：AGATCCTGACCGAGCGTGGC(SEQ ID NO:10)；

Rev：CCAGGGAGGAAGAGGATGCG(SEQ ID NO:11)；

反应体系：引物各1μl(浓度10μM)，cDNA模板4μl(浓度20ng/μl)，去离子水4μl，SYBRMasterMix(2×)10μl。

反应程序：94℃预变性5～10min；94℃变性30s～2min；退火30s～2min72℃延伸1～5min；共40个循环；72℃延伸5～10min。

GPx8是内质网(ER)中重要抗氧化蛋白。通过qPCR测定大鼠肝组织GPx8的mRNA水平，如图3所示，HFD组大鼠的GPx8的基因水平比对照组大鼠显著减少。

B.测定大鼠肝组织GPx8、GPx7和Prx4的蛋白表达水平

组织蛋白样品提取：

1)称取大鼠的肝脏组织100mg，冰上操作，放置于装有中等强度的RIPA裂解液的EP管中，EP管中再加入3个小钢珠。使用高通量研磨机以55Hz研磨匀浆1min，共进行3次，每一次间隔2min。

2)将匀浆好的组织以4℃，14000g离心20min。取离心后的中间层液体至新的EP管中，再次在4℃，14000g的条件下离心20min，吸取中层液体至新的EP管即蛋白液。

3)通过BCA蛋白定量测得蛋白液的浓度，按照需要用中等强度RIPA裂解液对蛋白液进行稀释。

4)2×Loadingbuffer、1M DTT、稀释后蛋白液按9:1:10的比例混合均匀，置于100℃加热5min。冰上冷却后混匀并冻存于-80℃。

BCA蛋白定量

将蛋白定量试剂盒中的2种试剂以50:1比例混合均匀，以200μL工作液+20μL样品或标准品进行检测，蛋白定量标准品浓度设置为1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL。在37℃孵育30min，测定其在562nm的OD值，计算出的样品蛋白的实际浓度。

WesternBlot检测

1)选择合适的电泳板，在制胶架上卡好。按照所需浓度分别将UP水、30％Acr-Bis、1.5M Tris-HCL(pH 8.8)、10％SDS、10％APS和TEMED混合均匀制备分离胶，灌入电泳板并用UP水进行压胶，25℃静置约20min。当胶与水层之间明显分离，倒掉上层的水，分离胶即制备成功。

2)将UP水、30％Acr-Bis、1M Tris-HCL(pH6.8)、10％SDS、10％APS和TEMED混合均匀制备压缩胶，倒进制备好分离胶的电泳板，并将梳子插入电泳板中，25℃静置约10min至压缩胶凝结成型。

3)转移电泳板至电泳槽内，两电泳板间加入新配制1×Running Buffer，电泳板与电泳槽间加入回收1×Running Buffer后拔出梳子，依次加入蛋白Marker和待测样品，恒压120V约60min，电泳结束后回收1×Running Buffer。

4)将胶从电泳板中取出，切成适当大小，按照滤纸、PVDF膜、胶以及滤纸的顺序从最下依次往上摆放，确保每层之间无气泡生成。其中PVDF膜要用甲醇浸泡活化至少3min，滤纸用1×Transfer buffer浸泡约10min。用转膜仪恒压25V转膜30min。

5)转膜完成后，根据目的蛋白的大小切割膜成适当的大小，再用1×TBST洗净膜上残存留下的Transferbuffer。每个切好的膜加入5mL5％脱脂牛奶进行封闭。25℃，摇床低速孵育2h。

6)倒掉牛奶，1×TBST洗净残存的牛奶，分别加入相对应蛋白稀释后的一抗，4℃摇床低速孵育一晚。第二日将不同的一抗进行分别回收，并用1×TBST洗涤膜共计3次，每次洗涤5min。洗净后每个切好的膜放入5mL 5％的脱脂牛奶中，再分别用对应的二抗1μL，25℃，摇床低速孵育2h。

7)倒掉二抗及牛奶，用1×TBST洗涤4次，每次5min。将发光液A与发光液B按1:1比例配制发光液，将配制好的发光液均匀的滴在每个膜的表面，采用Bio-Rad化学发光成像进行曝光和成像，并用系统自带软件对目的条带进行量化分析。

统计学分析

数据结果用均数±标准差

表示，并通过SPSS 27.0统计软件对数据进行分析。采用ANOVA方差分析比较多组间统计学差异，采用Dunnett’s t检验比较2组之间的统计学差异，P<0.05认为有统计学意义。

通过Western Blot测定大鼠肝组织ER内的抗氧化酶蛋白水平，结果同样显示相较于Chow组，HFD组大鼠肝组织GPx8的水平显著降低(见图4)。

实施例4

游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)诱导的脂肪肝细胞模型的构建及相关指标的检测方法

L-02细胞分为BSA组、FFA组。FFA组给予终浓度为600μmol/L的FFA(油酸：棕榈酸＝2:1，摩尔比，以BSA为溶剂，油酸的浓度为400μmol/L，棕榈酸的浓度为200μmol/L)，BSA组给予相同剂量BSA。连续处理7天后，收集样品进行相关指标的检测。

A.TG检测

人肝L-02细胞(购买于中科院上海细胞库)从液氮里面取出来后立刻移至37℃的水浴锅中，通过不断晃动使其快速解冻，待完全解冻后将细胞置于装有培养基的离心管中，1000g离心5min，弃上层液。用DMEM培养基将细胞进行重悬后更换培养瓶进行培养，放于37℃含5％CO₂的孵育箱，次日观察细胞状态及生长情况。

B.细胞油红O染色

弃6孔板或12孔板中的原培养基，用1×PBS进行洗涤。用4％的多聚甲醛液将细胞固定30min，再用UP水清洗。60％的异丙醇孵育3min，再用油红O的工作液继续孵育5min，自来水洗涤干净。苏木素染液孵育1min后用自来水清洗至细胞呈现紫蓝色，最后镜下观察。

C.细胞BODIPY染色

先用培养基稀释BODIPY 493/503储存液至2μg/mL，在每个6孔板或12孔板中加入稀释后的BODIPY，加入相同体积的培养基，使BODIPY最终浓度为1μg/mL。37℃条件下孵育30min。荧光显微镜下观察。

D.脂肪肝细胞模型内质网内抗氧化酶表达情况

分别采用Q-PCR测定L-02细胞中GPx7、GPx8、Prx4等抗氧化酶基因的表达，采用Western Blot法检测L-02细胞中GPx7、GPx8、Prx4等抗氧化酶蛋白的表达，具体操作同实施例3记载。

E.统计学分析

数据结果用均数±标准差

结果表明，FFA诱导人肝L-02细胞发生脂质累积。分别将对照组(BSA溶剂对照组)与游离脂肪酸组(FFA)组细胞固定进行油红O染色，细胞中的LDs可被油红O浸染呈现红色的斑点及斑块状，可以定性反映脂质累积的水平。红色斑点及斑块所占比例越多，表明LDs累积的越多。结果显示相较于BSA组，FFA组中红色的斑点与斑块显著增加，表明FFA组中的脂质累积水平显著提高(图5A)。除此之外，通过BODIPY493/503荧光染色，LDs可呈现绿色荧光，通过对比荧光强度同样可以定性反映脂质累积的水平。结果显示FFA组荧光强度显著高于BSA组荧光强度，同样表明FFA组LDs水平显著高于BSA组(图5B，图5C)。上述结果进一步提示FFA可诱导人肝L-02细胞发生明显的脂质累积，形成脂肪肝的细胞模型。

FFA诱导人肝L-02细胞TG累积增加。在本实施例中，同样采用TG检测试剂盒对人肝L-02细胞中的TG水平进行定量检测。如图6所示，与BSA组相比，FFA组L-02细胞中的TG水平发生显著的提高。进一步表明FFA可以诱导人肝L-02细胞发生脂质累积，形成高脂细胞模型，可以作为研究MAFLD的体外模型。

FFA抑制人肝L-02细胞内质网内抗氧化酶GPx8的表达。在本实施例中，同样采用Q-PCR测定L-02细胞中GPx7、GPx8、Prx4等抗氧化酶基因的表达，如图7所示，FFA组的GPx8的mRNA水平比BSA组显著降低。Western Blot测定人肝L-02细胞内质网内抗氧化酶蛋白，同样显示FFA组比BSA组的GPx8蛋白水平显著下降(图8)。进一步提示FFA同样可以抑制体外模型内质网内的抗氧化酶GPx8。

实施例5

为深入研究内质网GPx8对MAFLD的影响，通过慢病毒感染L-02细胞，建立稳定的GPx8过表达的细胞系。

稳转细胞株的构建方法

1.复苏L-02(或HUVEC)细胞，等细胞生长至80％～90％密度时传代细胞，连续传代2～3次；

2.培养L-02(或HUVEC)细胞，待细胞生长至80％～90％消化细胞并计数，5×10⁵cells/孔的细胞密度接种细胞到6孔板中；

3.第二天按照MOI＝50分别加入实施例2构建的慢病毒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro-GPx8和空载体对照病毒(慢病毒的给药剂量为10μl/10⁵cell)；在37℃、5％CO₂培养箱中培养过夜；

4.加入病毒24h后用1640+10％FBS+1％P/S完全培养基换液；

5.加入病毒48h后按照5μg/ml的终浓度加入puromycin做药物筛选，每2～3天换液(含5μg/ml puromycin的完全培养基)；

6.待细胞生长至80％～90％时消化细胞，接种到T-25cm²细胞培养瓶中继续培养；

7.连续传代2～3代获得混合克隆稳转细胞系。

上述制备的稳转细胞系分为空病毒感染表达组(empty vector，EV)，GPx8过表达组(GPx8overexpression，GPx8)，同时设置对照组为野生型组(wild type，WT)，铺12或6孔板。每组细胞各自分为BSA组与FFA组共6组。所有的FFA组给予终浓度为600μmol/L的FFA(油酸：棕榈酸＝2:1，摩尔比，以BSA为溶剂)，所有BSA组给予相同剂量的BSA。连续处理7天后，收集样品并进行指标检测。

通过qPCR和Western Blot测定各组细胞中GPx8的mRNA水平和GPx8的蛋白水平(检测方法同实施例3)。结果如图9所示，GPx8过表达组的GPx8的mRNA水平比野生型(WT)和空载体对照(EV)组显著提高。Western Blot测定L-02细胞内的GPx8水平。结果不论是经BSA干预还是FFA干预，GPx8过表达组的GPx8水平都显著高于WT与EV组(图10)。

实施例6

油红O染色与BODIPY荧光染色测定实施例5制备的各组细胞。同时采用TG检测试剂盒检测各组细胞中TG水平。

GPx8过表达缓解了FFA诱导L-02细胞发生的脂质累积。本实施例通过油红O染色与BODIPY荧光染色来定性验证GPx8过表达后对L-02细胞脂质累积的影响。油红O染色结果显示，GPx8+FFA组中的红色斑点与斑块比WT+FFA组和EV+FFA组显著减少。EV+FFA组比EV+BSA组的红色斑点和斑块显著增加。WT+BSA组、EV+BSA组和GPx8+BSA组之间无明显差异(图11A)。BODIPY荧光染色显示GPx8+FFA组的荧光强度比WT+FFA组和EV+FFA组显著降低。EV+FFA组比EV+BSA组的荧光强度显著增加。WT+BS组、EV+BSA组以及GPx8+BSA组之间的荧光强度无明显差异(图11B和图11C)。这些结果表明GPx8过表达可以有效减轻FFA诱导的L-02细胞中LDs的水平，缓解FFA对L-02细胞造成的脂质累积。

GPx8过表达缓解了FFA诱导L-02细胞中的TG水平。除了油红O染色和BODIPY染色可以定性判断GPx8过表达对脂质累积的影响外，还可以通过TG检测试剂盒定量检测L-02细胞中的TG水平，来验证GPx8过表达对细胞内TG的影响。由图12可知GPx8+FFA组TG水平比WT+FFA组和EV+FFA组明显降低，EV+FFA组比EV+BSA组的TG水平明显升高。WT+BSA组、EV+BSA组、GPx8+BSA组之间没有明显的差别(图12)。表明GPx8过表达可以显著降低FFA对L-02细胞造成的TG累积。

实施例7

一种pAAV-TBG-PI-bGH-GPx8过表达载体的构建方法

1.全基因合成小鼠GPx8序列。

atggagcctttcgctgcctacccattaaaatgttccgggcccaaagcaaagatatttgcagttttgctctctatggttctgtgcaccgtgatgctttttctccttcagttaaaattcctgaagccgagaaccaacagcttctactcctttgaagtaaaggatgccaaaggaaggaccgtgtctctggaaaagttcaaaggcaaagcttccctggttgtaaacgtggctagtgactgccgcttcacagacaagagttaccagactctcagggagctacacaaggagttcgggccctatcacttcaacgtcctggcttttccgtgcaatcagtttggagaatcggagcccaagtccagcaaggaggtagaatcttttgcgagacagaactacggagtcacattccccatcttccacaagattaagattttagggccggaagcagaacctgcgtttagatttattgttgattcttccaagaaggagccaaggtggaatttttggaagtatctggtcaaccctgagggacaagtcgtgaagttctggaggccagaagaaccccttgaagccatcagacctcatgtatcacaaatgattgggcaaattattcttaaaaagaaagaggatctatga(SEQ ID NO:12)。

2.载体质粒TBG-PI-bGH的SalI和BamHI双酶切。

双酶切的反应体系：2μg(体积2μl)载体，每个内切酶1μl，10×FastDigestbuffer2μl，去离子水14μl，总体积20μl。双酶切的反应条件：37℃，20min，加1μl CIP，37℃，继续10min。PCR纯化试剂盒纯化酶切产物。

3.酶切产物回收大片段与目的片段连接

连接的反应体系：10μl 2buffer、1μl载体、3-6μl GPx8片段、1μl quick ligase(NEB，Cat：M2200)，加水到20μl，室温放置5～15min。

4.连接产物转化。

取50μl stbl3感受态细胞，加入连接产物混匀，冰上放置30min，在42℃处理45s后立即置于冰上2min。将此转化后感受态细胞接种于500μl无抗生素LB培养基中45min，后接种于含100μg/ml氨苄抗生素的LB的琼脂糖平板上，37℃，过夜。

5.各挑取3个单菌落接种于5ml的含100μg/mlAmpicillin抗性的LB培养液中，在250rpm、37℃下恒温摇床培养过夜，进行测序验证。

实验结果：经比对结果表明TBG-PI-bGH-GPx8测序结果与设计序列一致。

实施例8

一种TBG-PI-bGH-GPx8腺相关病毒包装方法

1.293AAV细胞复苏后，在转染的前一天，传代准备细胞：用0.25％胰蛋白酶消化293AAV细胞，以含10％血清的DMEM培养基调整细胞密度后，按照每15cm细胞培养皿接种3～4×10⁷cells到15cm细胞培养皿中，置于37℃、5％CO₂培养箱培养，16～24h后待细胞密度生长到80％～90％时即可用于转染。

2.按照以下实验步骤来进行转染：

A、加入500μl opti-MEM培养基到一支洁净的1.5ml EP管中，依次加入表1试剂，得到稀释好的DNA质粒，具体加入量见表1。

表1转染试剂的配制

试剂名称	试剂数量
		Vector(含目的基因的质粒)	10μl(1.0μg/μl)
LentiviralpackagingVector	15μl(1.0μg/μl)

B、加入500μl opti-MEM培养基到一支洁净的1.5ml EP管中，加入lipofectamin200075μl，得到稀释好的转染试剂。将A步骤得到的稀释好的DNA质粒与稀释好的转染试剂用移液器轻轻混匀，放置5min。

3.培养6h后弃去培养基，用25ml新鲜的完全培养基换液(DMEM+10％FBS+P/S)。

4.第六天，吹打收集细胞，1000rpm离心5min，弃上清，得到细胞沉淀。

5.细胞沉淀加入15ml AAV裂解液，反复冻融3次，加入Benzonase，37C孵育45min后3000g离心15min，收集上清。

采用AAV纯化试剂盒(NGB-63250)纯化AAV病毒。

实施例9

C57小鼠(购买于空军军医大学实验动物中心)采用AAV病毒包裹GPx8尾静脉注射方法(AAV病毒的注射剂量为1.0×10¹¹vg/只)，使小鼠肝脏高表达GPx8，然后将小鼠随机分组，对照病毒普通膳食组，对照病毒高脂膳食组，高表达GPx8普通膳食组，和高表达GPx8高脂膳食组。普通膳食组给予基础饲料继续喂养；HFD组给与高脂饲料(脂肪含量为45％，美国Research Diets Cat No.D12451)进行喂养。两组大鼠均自由饮水。喂养3个月后，脱颈处死后取肝组织用于检测。

采用实施例3记载的qPCR方法检测上述两组小鼠的GPx8基因表达水平以及TG含量。

GPx8过表达缓解了高脂膳食诱导的C57小鼠脂肪肝

对照组小鼠在给予高脂膳食喂养后，肝脏脂肪累积明显，甘油三酯(TG)含量显著增加。而通过注射AAV病毒包裹的GPx8基因高表达后，可以显著提高GPx8的表达水平(见图13)。

同时观察高表达GPx8对肝脏脂质累积的影响，结果发现高表达GPx8可以显著抑制肝脏脂肪的累积，表现为甘油三酯含量显著降低。如下图14所示。本实施例在活体动物身上进一步验证了GPx8过表达可以显著改善脂肪肝，是防治脂肪肝的有效分子干预靶点。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 秦绪军

<120> GPx8作为分子靶点在制备预防和/或治疗脂肪肝的药物中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 630

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggagcctc ttgcagctta cccgctaaaa tgttccgggc ccagagcaaa ggtatttgca 60

gttttgctgt ctatagttct atgcacagta acgctatttc ttctacaact aaaattcctc 120

aaacctaaaa tcaacagctt ttatgccttt gaagtgaagg atgcaaaagg aagaactgtt 180

tctctggaaa agtataaagg caaagtttca ctagttgtaa acgtggccag tgactgccaa 240

ctcacagaca gaaattactt agggctgaag gaactgcaca aagagtttgg accatcccac 300

ttcagcgtgt tggcttttcc ctgcaatcag tttggagaat cggagccccg cccaagcaag 360

gaagtagaat cttttgcaag aaaaaactac ggagtaactt tccccatctt ccacaagatt 420

aagattctag gatctgaagg agaacctgca tttagatttc ttgttgattc ttcaaagaag 480

gaaccaaggt ggaatttttg gaagtatctt gtcaaccctg agggtcaagt tgtgaagttc 540

tggaagccag aggagcccat tgaagtcatc aggcctgaca tagcagctct ggttagacaa 600

gtgatcataa aaaagaaaga ggatctatga 630

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcagaattcg ccaccatgga gcctcttgca gcttac 36

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgcggatcct catagatcct ctttcttttt tatg 34

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tagtgactgc cggttcacag 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atagggccca aactccttgt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tagcgaatgt ggcttcacag 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aagggaaagc aagcacgtta 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agtgccactt ctacgctggt 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tttgcttagg tgcagggagt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agatcctgac cgagcgtggc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccagggagga agaggatgcg 20

<210> 12

<211> 630

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atggagcctt tcgctgccta cccattaaaa tgttccgggc ccaaagcaaa gatatttgca 60

gttttgctct ctatggttct gtgcaccgtg atgctttttc tccttcagtt aaaattcctg 120

aagccgagaa ccaacagctt ctactccttt gaagtaaagg atgccaaagg aaggaccgtg 180

tctctggaaa agttcaaagg caaagcttcc ctggttgtaa acgtggctag tgactgccgc 240

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ttcaacgtcc tggcttttcc gtgcaatcag tttggagaat cggagcccaa gtccagcaag 360

gaggtagaat cttttgcgag acagaactac ggagtcacat tccccatctt ccacaagatt 420

aagattttag ggccggaagc agaacctgcg tttagattta ttgttgattc ttccaagaag 480

gagccaaggt ggaatttttg gaagtatctg gtcaaccctg agggacaagt cgtgaagttc 540

tggaggccag aagaacccct tgaagccatc agacctcatg tatcacaaat gattgggcaa 600

attattctta aaaagaaaga ggatctatga 630

Claims

1.一种GPx8基因过表达试剂在制备预防和/或治疗脂肪肝的药物中的应用，所述GPx8基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述GPx8基因过表达试剂包括含GPx8基因的病毒过表达载体或者含GPx8基因的病毒。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述含GPx8基因的病毒包括含GPx8基因的慢病毒或含GPx8基因的腺相关病毒。

3.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述脂肪肝包括高脂膳食引起的脂肪肝。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述预防和/或治疗脂肪肝包括降低肝脏组织或肝细胞中脂质累积。