CN117159747A - 一种亨廷顿舞蹈症的药物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种亨廷顿舞蹈症的药物及其制备方法。本发明提供的方法，通过构建过表达TRIM37的ssAAV‑CMV‑TRIM37‑HA质粒来制备治疗亨廷顿舞蹈症的基因药物。该亨廷顿舞蹈症的药物以TRIM37为靶点对亨廷顿舞蹈症起作用。该亨廷顿舞蹈症的药物可以介导泛素特异性靶向mHTT蛋白，该蛋白在灵长类纹状体中特异性低表达，当TRIM37在纹状体中过表达时能够促进mHTT aggregates的降解，从而缓解mHTT的神经毒性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种亨廷顿舞蹈症的药物及其制备方法。
背景技术
亨廷顿舞蹈症(Huntingtons’s Disease，HD)是一种常染色体，单基因显性遗传的神经退行性疾病，是由亨廷顿蛋白(Huntingtin，HTT)N端异常的多聚谷氨酰胺(polyglutamine，polyQ)扩增(>35)导致。突变亨廷顿蛋白(mutant huntingtin,mHTT)在大脑中广泛表达，但HD患者的纹状体是发生神经元死亡最严重的脑区。mHTT蛋白会发生错误折叠，并且在HD患者脑内的神经元中沉积形成蛋白聚集体(aggregates)。mHTT aggregates被认为与HD的神经毒性密切相关，减少mHTT aggregates沉积有可能治疗HD。
尽管从该致病基因发现至今已过去整整30年，但是目前市面上还没有一款药物能够很好地延缓HD的进展，同时针对HD疾病的药物治疗主要针对舞蹈症状、认知障碍和精神异常的症状治疗上，目前Deutetrabenazine和Tetrabenazine是美国食品药品监督管理局批准用于对症治疗的两款药物。目前还没有能够有效减缓HD疾病进程的药物。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种亨廷顿舞蹈症的药物及其制备方法。本发明提供的方法，通过构建过表达TRIM37的ssAAV-CMV-TRIM37-HA质粒来制备治疗亨廷顿舞蹈症的基因药物。该亨廷顿舞蹈症的药物以TRIM37为靶点对亨廷顿舞蹈症起作用。
本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。
本发明提供得到治疗亨廷顿舞蹈症的药物，包括TRIM37蛋白。
本发明提供的治疗亨廷顿舞蹈症的基因药物，包括表达TRIM37蛋白的基因。
进一步地，所述表达TRIM37蛋白的基因的序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明提供的一种制备治疗亨廷顿舞蹈症的基因药物的方法，包括如下步骤：
提取人源HEK293细胞的RNA，反转录构建cDNA文库，通过PCR扩增出TRIM37蛋白的cDNA(利用TRIM37特异性PCR引物扩增出全长TRIM37cDNA)，将TRIM37蛋白的cDNA通过酶切连接到质粒(ssAAV-CMV质粒)上(将全长TRIM37 cDNA和质粒经AgeI和EcoRI双酶切后纯化，然后连接)，得到载有TRIM37蛋白基因的质粒，进行病毒包装，得到所述治疗亨廷顿舞蹈症的基因药物。
进一步地，所述PCR扩增中，使用的上游引物如SEQ ID NO.1所示，具体为5’-CCGACC GGT GCCACCATG GAT GAA CAGAGC GTG GAGAG-3’；
进一步地，所述PCR扩增中，使用的下游引物如SEQ ID NO.2所示，具体为5’-CCGGAA TTC TTA AGC ATA ATC TGG AAC ATC ATA TGG ATA TCT TCCACTATT TTCATC T-3’。
进一步地，所述酶切包括：采取AgeI限制性内切酶和EcoRI限制性内切酶分别对质粒和TRIM37蛋白的cDNA进行酶切处理。
进一步地，所述质粒为ssAAV-CMV质粒，序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步地，所述载有TRIM37蛋白基因的质粒为ssAAV-CMV-TRIM37-HA质粒，序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，所述病毒为腺相关病毒。
进一步地，所述腺相关病毒的血清(AAV)型为AAV9。
所述TRIM37蛋白是一种E3泛素连接酶，能够介导泛素特异性靶向mHTT蛋白，该蛋白在灵长类纹状体中特异性低表达，当TRIM37在纹状体中过表达时能够促进mHTTaggregates的降解。
与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果：
本发明提供了一种亨廷顿舞蹈症的药物及其制备方法，该亨廷顿舞蹈症的药物可以介导泛素特异性靶向mHTT蛋白，该蛋白在灵长类纹状体中特异性低表达，当TRIM37在纹状体中过表达时能够促进mHTT aggregates的降解。
附图说明
图1为实施例中ssAAV-CMV-TRIM37-HA能够在HEK293细胞中稳定表达的结果图。
图2为TRIM37调控mHTT的泛素化水平的结果图。
图3为TRIM37调控mHTT蛋白的稳态的结果图。
图4为过表达TRIM37促进mHTT aggregates的降解的结果图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
实施例1
一种亨廷顿舞蹈症的基因药物的制备方法，包括如下步骤：
(1)引物的设计：根据目的基因的碱基序列，用primer 5设计引物，在确定引物序列后需在正反向引物两端添加酶切位点(AgeI和EcoRI)和保护碱基。
(2)待引物设计好后，在PCR仪中以HEK293细胞中提取的RNA反转录形成的cDNA为模板扩增表达TRIM37蛋白的基因(扩增体系参照表1所示)。所述表达TRIM37蛋白的基因的序列如SEQ ID NO.4所示。
表1
所述PCR扩增中，使用的上游引物(PrimerF)如SEQ ID NO.1所示，使用的下游引物(Primer R)如SEQ ID NO.2所示。
(3)PCR结束后，用PCR产物回收试剂盒回收目的片段并进行浓度测定。
(4)回收后的目的片段和待连接质粒(ssAAV-CMV)分别在37℃水浴条件下进行酶切(AgeI和EcoRI)过夜(过夜的时间为16小时)。
(5)次日，向含有质粒(ssAAV-CMV质粒)的EP管中加入1/20体积的小牛肠碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase Calf Intestinal(CIP))，涡旋混匀后继续37℃水浴10min，水浴结束后82℃，2min。
(6)水浴结束后，进行1wt％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并进行胶回收处理，并进行浓度测定。
(7)将目的片段与载体按3：1的比例混匀，将体积补充至5μL，后加入5μL的TaKaRaDNA Ligation Kit的酶溶液solution I(含有T4 DNA连接酶)，轻轻混匀后放入16℃条件下连接30min。
(8)连接结束后向EP管中加入50μL的Trans1 blue(分散蓝1)，轻轻混匀后冰上孵育30min，后转入42℃干式恒温器中进行热激处理52s。
(9)热激结束后，将EP管放入冰上孵育5min，后向EP管中加入800μL的无菌LB培养液，放置到37℃摇床处理1h。
(10)离心力500×g,室温条件下离心5min，去掉700μL LB，轻轻混匀后滴加到AMP抗性的平板上，用涂布棒将菌液均匀地涂抹在培养板中，待液体吸干后将平板放入37℃培养箱中进行过夜培养(过夜的时间为16小时)。
(11)挑选单克隆菌落，并进行菌落PCR，经过1wt％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，将阳性样品的菌液转移到含有6mL LB(AMP抗性)摇菌试管中，盖上盖子后放入到37℃摇床中进行过夜培养(过夜的时间为16小时)。
(12)取200μL菌液加入到含有200μL 60％甘油的EP管中(用作保菌处理)，剩余菌液在6000×g条件下离心3min。
(13)利用Magen的质粒小提试剂盒进行质粒的提取。
(14)提取的质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
(15)挑选测序正确的质粒的对应菌液进行扩大培养，后利用Magen的大提试剂盒进行质粒大提，得到质粒ssAAV-CMV-TRIM37-HA质粒(序列如SEQ ID NO.3所示)，并进行浓度测定。
(16)利用Invitrogen的脂质体转染试剂(Lipo3000)将质粒ssAAV-CMV-TRIM37-HA转染HEK293细胞，48h后收集细胞并提取总蛋白进行蛋白免疫印迹(Western blotting)分析，结果参照图1所示。图1为实施例中ssAAV-CMV-TRIM37-HA能够在HEK293细胞中稳定表达的结果图。图1中可以清楚地看到在anti-TRIM37和anti-HA标签的TRIM37-HA泳道中都能够在130kDa处检测到清晰的条带(TRIM37蛋白的实际分子量大小在130kDa处)，而对照组(HEK293)泳道中相应位置没有检测到对应信号，说明成功地构建了ssAAV-CMV-TRIM37-HA质粒。
(17)送广州派真生物技术有限公司进行病毒包装，得到ssAAV-CMV-TRIM37-HA病毒，即得到所述亨廷顿舞蹈症的基因药物。
实施例2
TRIM37调控mHTT的泛素化水平
(1)HEK293(120Q)细胞培养在含有DMEM培养基(10％胎牛血清，1％青霉素和链霉素，50μg/μL HYB)的10cm培养皿中，放入37℃，5％CO2孵箱中进行培养。
(2)次日，待细胞长到培养皿面积的50％时，利用Invitrogen的脂质体转染试剂将质粒(ssAAV-CMV-TRIM37-HA)和siRNA(TRIM37)分别转染HEK293(120Q)细胞，放入到37℃，5％CO2孵箱中进行培养。
(3)转染48h后，向培养皿培养基中加入10μL的MG132，继续培养12h后，用含有EDTA的0.25％的胰蛋白酶将细胞消化下来，收集细胞转入到1.5mL EP管中，500×g，离心5min。并用PBS洗涤两次，将细胞沉淀放入-80℃保存待用。
(4)用强的RIPA裂解液裂解细胞，BCA测定蛋白浓度，将不同时间点的蛋白样品溶液调整到相同浓度(2μg/μL)，加入5×SDS蛋白上样缓冲液，在涡旋仪中充分混匀后掌上离心机离心5sec，在干式恒温器中98℃煮样10min，将样品放入冰上，待样品冷却后进行超声处理。
(5)超声结束后进行Western blotting分析。
结果如图2所示。图2的A部分为敲低TRIM37蛋白后导致mHTT泛素化水平降低的结果图，从图2的A部分可知，在IP HTT组中当敲低TRIM37蛋白后导致mHTT泛素化水平降低，说明降低TRIM37蛋白的表达可以减少mHTT的泛素化水平。图2的B部分是A部分的量化分析图，从图2的B部分可知，降低TRIM37蛋白的表达对减少mHTT的泛素化水平具有显著性差异。图2的C部分为过表达TRIM37蛋白后导致mHTT泛素化水平增加的结果图，从图2的C部分可知，在IP HTT组中当过表达TRIM37蛋白时会增加mHTT的泛素化水平，图2的D部分为C部分的量化分析图，从图2的D部分可知，过表达TRIM37蛋白对增加mHTT的泛素化水平具有显著性差异。
实施例3
TRIM37调控细胞内mHTT蛋白稳态
(1)HEK293(120Q)细胞培养在含有DMEM完全培养基(10％胎牛血清，1％青霉素和链霉素，50μg/μL潮霉素(HYB))的10cm培养皿中，待细胞长到培养皿面积的80％时，用含有EDTA的0.25％的胰蛋白酶将细胞消化下来，调整细胞密度进行六孔板铺板，37℃，5％CO2孵箱中进行培养。
(2)次日，待细胞长到培养皿面积的50％时，利用Invitrogen的脂质体转染试剂将质粒(ssAAV-CMV-TRIM37-HA)和siRNA(TRIM37)分别转染HEK293(120Q)细胞，放入到37℃，5％CO2孵箱中进行培养。
(3)转染48h后，向每孔细胞中加入10μL的放线菌酮，并于指定的时间点：0h、2h、4h、6h、8h和12h收集细胞并转入到1.5mL EP管中，500×g，离心5min。并用PBS洗涤两次，将细胞沉淀放入-80℃保存待用。
(4)用RIPA裂解液裂解细胞，BCA测定蛋白浓度，将不同时间点的蛋白样品溶液调整到相同浓度(2μg/μL)，加入5×SDS蛋白上样缓冲液，在涡旋仪中充分混匀后掌上离心机离心5sec，在干式恒温器中98℃煮样10min，将样品放入冰上，待样品冷却后进行超声处理。
(5)超声结束后进行Western blotting分析。
结果参照图3所示，图3的A部分可以看出敲低TRIM37的siRNA组与对照组相比其mHTT蛋白在不同时间点(2h、4h、6h、8h和12h)具有较高水平，说明降低TRIM37蛋白的表达会增强mHTT蛋白稳态。图3的C部分是A部分的量化分析图，从图3的C部分可知，降低TRIM37蛋白的表达对增强mHTT蛋白的稳态具有显著性差异。图3的B部分可以看出过表达TRIM37蛋白组与GFP组相比其mHTT蛋白在不同时间点(2h、4h、6h、8h和12h)具有较低水平，说明过表达TRIM37蛋白会促进mHTT蛋白的降解。图3的D部分是B部分的量化分析图，从图3的D部分可知，过表达TRIM37蛋白对增强mHTT蛋白的降解具有显著性差异。
实施例4
脑立体定位注射(ssAAV-CMV-TRIM37-HA)病毒的方式过表达TRIM37基因
(1)实验动物：24周龄HD140QKI小鼠(患有亨廷顿舞蹈症的小鼠)饲养于暨南大学实验动物中心。
(2)实验分组：共9只HD140QKI小鼠，右侧注射2μL ssAAV-CMV-GFP病毒作为对照组，左侧注射2μL ssAAV-CMV-TRIM37-HA病毒作为实验组。
(3)注射过程：首先检查气麻系统中异氟烷的量，然后正确打开气麻系统，调节麻醉浓度和气流量，待小鼠麻醉结束后，将小鼠门齿扣于面罩装置中，调整面罩装置至小鼠外耳道与定位仪左右两侧耳杆位于一条直线上，将小鼠头部固定好后，这时用医用棉签涂抹75％酒精至待手术部位，并用剪刀将手术部位毛发剪掉，后用镊子轻轻提起头部皮肤并沿矢状缝将头皮剪开约1cm切口，剪刀划开脑膜，然后再用浸没3％H2O2的棉签擦拭剖开处直至Bregma处凸显出来；然后用钻孔器在左右侧纹状体(AP：+0.55mm、ML：+2.0mm或-2.0mm和DV-：3.4mm)
钻孔；后将病毒放置于冰上解冻，待病毒解冻后用微量注射器先吸取1μL空气后再吸取2μL的ssAAV-CMV-TRIM37-HA或ssAAV-CMV-GFP病毒，将微量注射器正确安装到小鼠脑立体定位仪上，按坐标DV：-3.4mm进针；当注射针推进到指定坐标后将注射速度设置为100nL/min；待纹状体两侧(左侧：ssAAV-CMV-TRIM37-HA病毒或右侧ssAAV-CMV-GFP病毒注射结束后，停针10min，后缓慢退针并用缝合针进行伤口缝合处理，同时在缝合处涂抹抗生素(青霉素和链霉素)处理，用打孔器做好耳标标记，将小鼠从固定仪中取下放入鼠笼并做保温护理，待其苏醒后观察1h无明显异常后放回鼠笼饲养。
(4)病毒注射4周后进行取样分析(蛋白免疫印迹和免疫荧光)实验组和对照组中mHTT蛋白聚集体(aggregates)。结果参照图4所示。图4为过表达TRIM37促进mHTTaggregates的降解结果图。图4的A部分为Western blotting结果，可以看出过表达TRIM37蛋白组与GFP组相比其mHTT蛋白的聚集体显著降低，说明过表达TRIM37蛋白会减少mHTT蛋白聚集体的形成。图4的B部分是A部分的量化分析图，从图4的B部分可知，过表达TRIM37蛋白对减少mHTT蛋白聚集体的形成具有显著性差异。图4的C部分为免疫荧光染色结果，可以看出过表达TRIM37蛋白组与GFP组相比其mHTT蛋白的聚集体(红色圆点)显著降低，说明过表达TRIM37蛋白会减少mHTT蛋白聚集体的形成。
总结：本发明通过克隆人源TRIM37基因构建过表达ssAAV-CMV-TRIM37-HA质粒并包装病毒，在HD的细胞和小鼠模型中，分别通过转染和脑立体定位注射的方式过表达TRIM37基因，实现对突变亨廷顿蛋白(mutant huntingtin,mHTT)聚集体(aggregates)的清除，从而缓解mHTT的神经毒性。
以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种治疗亨廷顿舞蹈症的药物，其特征在于，包括TRIM37蛋白。
2.一种治疗亨廷顿舞蹈症的基因药物，其特征在于，包括表达TRIM37蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的治疗亨廷顿舞蹈症的基因药物，其特征在于，所述表达TRIM37蛋白的基因的序列如SEQ ID NO.4所示。
4.一种制备权利要求2-3任一项所述的治疗亨廷顿舞蹈症的基因药物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
提取人源HEK293细胞的RNA，反转录构建cDNA文库，通过PCR扩增出TRIM37蛋白的cDNA，将TRIM37蛋白的cDNA通过酶切连接到质粒上，得到载有TRIM37蛋白基因的质粒，进行病毒包装，得到所述治疗亨廷顿舞蹈症的基因药物。
5.根据权利要求4所述的治疗亨廷顿舞蹈症的基因药物的制备方法，其特征在于，所述PCR扩增中，使用的上游引物如SEQ ID NO.1所示，使用的下游引物如SEQ ID NO.2所示。
6.根据权利要求4所述的治疗亨廷顿舞蹈症的基因药物的制备方法，其特征在于，所述酶切包括：采取AgeI限制性内切酶和EcoRI限制性内切酶分别对质粒和TRIM37蛋白的cDNA进行酶切处理。
7.根据权利要求4所述的治疗亨廷顿舞蹈症的基因药物的制备方法，其特征在于，所述载有TRIM37蛋白基因的质粒为ssAAV-CMV-TRIM37-HA质粒，序列如SEQ ID NO.3所示。
8.根据权利要求4所述的治疗亨廷顿舞蹈症的基因药物的制备方法，其特征在于，所述病毒为腺相关病毒。
9.根据权利要求8所述的治疗亨廷顿舞蹈症的基因药物的制备方法，其特征在于，所述腺相关病毒的血清型为AAV9。
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