CN117642380A - 阳离子脂质及其组合物 - Google Patents

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Abstract

本文提供了具有式I或式Ia的阳离子脂质：或其药学上可接受的盐，其中R'、R1、R2、R3、R4、R5、R6a、R6b、X和n如本文所定义。本文还提供了脂质纳米颗粒(LNP)组合物，该LNP组合物包含具有式I或Ia的阳离子脂质和无衣壳非病毒载体(例如，ceDNA)。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个方面，这些LNP可用于将无衣壳非病毒DNA载体递送至所关注的靶位点(例如，细胞、组织、器官等)。

Description

阳离子脂质及其组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年6月14日提交的美国临时申请号63/210,204的优先权的权益，该美国临时申请的内容全文以引用方式并入本文。
背景技术
基因疗法旨在改善患有因异常基因表达谱引起的基因病症或获得性疾病的患者的临床结果。迄今为止，已经开发出各种类型的基因疗法，它们将治疗性核酸作为治疗疾病的药物递送到患者的细胞中。
可以通过多种方法在患者的靶细胞中递送和表达校正基因，这些方法包括使用工程病毒基因递送载体，以及潜在的质粒、小基因、寡核苷酸、小环或各种末端封闭的DNA。在许多可用的病毒来源载体(例如，重组逆转录病毒、重组慢病毒、重组腺病毒等)中，重组腺相关病毒(rAAV)作为基因疗法中一种通用且相对可靠的载体而获得认可。然而，病毒载体(诸如腺相关载体)可以是高免疫原性的，并引起可损害功效(特别是在再施用方面)的体液和细胞介导的免疫。
非病毒基因递送规避了与病毒转导相关的某些缺点，特别是由于对形成载体颗粒的病毒结构蛋白的体液和细胞免疫应答以及任何从头病毒基因表达所致的缺点。非病毒递送技术的优点之一是使用脂质纳米颗粒(LNP)作为载体。LNP提供了独特的机会，其允许将阳离子脂质设计为LNP组分，这可以规避与病毒基因疗法相关联的引起显著毒性的体液和细胞免疫应答。
阳离子脂质大致由阳离子胺部分、通常具有一个或两个脂族烃链的疏水结构域(即，疏水尾部，其可以是饱和的或不饱和的)、以及连接阳离子胺部分和疏水结构域的接头或可生物降解基团组成。阳离子胺部分和聚阴离子核酸静电相互作用以形成带正电荷的脂质体或脂质膜结构。因此，促进了到细胞中的摄取并且将核酸递送到细胞中。
一些广泛使用的阳离子脂质是CLinDMA、DLinDMA(DODAP)和DOTAP。这些脂质已用于核糖核酸(siRNA或mRNA)递送，但在较高剂量下具有次优的递送效率以及毒性。鉴于目前阳离子脂质的缺点，本领域需要提供不仅显示出增强的功效和降低的毒性，而且具有改善的药代动力学和细胞内动力学，诸如，细胞摄取和脂质载体的核酸释放的脂质支架。
发明内容
本公开中提供的阳离子脂质包含含有可生物降解基团的一个疏水尾部以及不含有可生物降解基团的疏水尾部。本公开中提供的一些示例性脂质包含在末端分叉以形成两个支链脂族烃链的疏水尾部和不分叉的疏水尾部。本发明人已经发现本公开的阳离子脂质可以以令人满意的产率和纯度合成。本发明人还已发现，当配制为用于携带治疗性核酸的脂质纳米颗粒(LNP)时，本公开的阳离子脂质提供了在核酸内的转基因插入物的持续优异且稳定的体内表达，并且是良好耐受的。此外，不希望受理论束缚，本发明人认为，在分叉疏水尾部中的末端支链脂族烃链的长度(即，碳原子的数量)、非分叉疏水尾部的长度以及可生物降解的基团与分叉疏水尾部之间的距离之间的微妙相互作用对于实现LNP组合物的优异包封效率、表达水平和体内耐受性尤其重要。
因此，在一个方面中，本文提供了由式I或Ia表示的阳离子脂质：
以及其药学上可接受的盐，其中R'、R1、R2、R3、R4、R5、R6a、R6b、X和n如本文分别对于式I或Ia中的每一者所定义的。
还提供了药物组合物，该药物组合物包含本文所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐；以及药学上可接受的载体。
本公开的另一方面涉及一种组合物，该组合物包含脂质纳米颗粒(LNP)和核酸，该脂质纳米颗粒(LNP)包含本文所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，核酸被包封在LNP中。在具体实施方案中，该核酸是末端封闭的DNA(ceDNA)。
本公开的另一方面涉及一种使用本文所述的公开的阳离子脂质或组合物治疗受试者的基因病症的方法。
附图说明
通过参考在附图中描绘的本公开的说明性实施方案，可以理解上面简要概述并且在下面更详细论述的本公开的实施方案。但是，附图仅示出了本公开的典型实施方案，因此不应视为对范围的限制，因为本公开可以允许其他等效的实施方案。
图1示出了如在临床前研究中观察到的(剂量＝0.25mg/kg)，与用参考脂质A(阳性对照)和PBS(阴性对照)配制的LNP 1相比，通过采用均用脂质6配制的脂质纳米颗粒LNP 2、LNP 3和LNP 4作为递送媒介物实现的第4天ceDNA-荧光素酶表达。
图2A是示出如在临床前研究(剂量＝0.5mg/kg)中观察到的，与用参考脂质A配制的LNP 5(阳性对照)、用MC3配制的LNP 6和用参考脂质B配制的LNP 7(阳性对照)以及PBS(阴性对照)相比，通过总通量测量的第4天ceDNA-荧光素酶表达的柱状图，该总通量是通过采用分别用脂质7、脂质11和脂质1配制的脂质纳米颗粒LNP 8、LNP 9和LNP 10作为递送媒介物实现的。图2B示出了同一研究中小鼠在第0天至第4天的纵向体重变化。
具体实施方式
本公开提供了用于递送治疗性核酸(TNA)的基于脂质的平台，诸如非病毒载体(例如，末端封闭的DNA)或合成病毒载体，该基于脂质的平台可被细胞吸收并保持高水平的表达。例如，与基于病毒载体的基因疗法相关的免疫原性限制了由于预先存在的背景免疫而可以治疗的患者数量，并且阻止了对患者重新施用以滴定到每个患者的有效水平，或长期维持效果。此外，由于触发级联免疫应答的先天DNA或RNA传感机制，其他核酸模式极大地受到免疫原性的影响。由于缺乏预先存在的免疫性，所以目前所述的TNA脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)允许根据需要的附加剂量的TNA，诸如mRNA、siRNA、合成病毒载体或ceDNA，并进一步扩大患者可及性，包括进入在组织生长时可能需要后续剂量的儿科群体。此外，本公开发现TNA脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)，具体包括包含一个或多个叔氨基和二硫键的脂质组合物，提供TNA(例如，ceDNA)的更有效递送、更好的耐受性和改善的安全性。因为目前所述的TNA脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)没有病毒衣壳内空间所施加的包装限制，理论上，TNA脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的唯一尺寸限制在于宿主细胞的表达(例如，DNA复制或RNA翻译)效率。
特别在罕见疾病中，治疗剂开发中的最大障碍中的一个障碍是大量的个别病状。地球上约有3.5亿人带有罕见病患生活，根据美国国立卫生研究院(National Institutesof Health)的定义为诊断患有病症或病状的人数不到200,000人。这些罕见病症中约有80％是基因起源的，其中约95％没有经过由FDA批准的治疗(rarediseases.info.nih.gov/diseases/pages/31/faqs-about-rare-diseases)。本文所述的TNA脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的优点之一在于提供了一种可以快速适应多种疾病(可用特定的TNA方式治疗)，特别是罕见的单基因疾病的方法，可以有意义地改变许多基因病症或疾病的治疗现状。
I.定义
术语“烷基”是指饱和、直链(即，非支链)或支链烃的一价基团。除非具体描述烷基是非支链的，例如C1-C16非支链烷基，否则如本文所用的术语“烷基”适用于支链和非支链烷基基团。示例性烷基基团包括但不限于C1-C16非支链烷基、C7-C12烷基、C7-C11烷基、C8-C10烷基、C2-C14非支链烷基、C2-C12非支链烷基、C2-C10非支链烷基、C2-C7非支链烷基、C1-C6烷基、C1-C4烷基、C1-C3烷基、C1-C2烷基、C7非支链烷基、C8非支链烷基、C9非支链烷基、C10非支链烷基、C11非支链烷基、C8烷基、C10烷基、C12烷基、甲基、乙基、丙基、异丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-2-丁基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2,2-二甲基-1-丁基、3,3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基等。
术语“亚烷基”是指饱和、直链或支链烃的二价基团。除非具体描述亚烷基是非支链的，例如C3-C10非支链亚烷基和C1-C8亚烷基，否则如本文所用的术语“亚烷基”适用于支链和非支链亚烷基基团两者。示例性亚烷基基团包括但不限于C3-C9亚烷基、C3-C8亚烷基、C1-C8亚烷基、C1-C6亚烷基、C1-C4亚烷基、C2-C8亚烷基、C3-C7亚烷基、C5-C7亚烷基、C7亚烷基、C5亚烷基，以及与上述任何示例性烷基基团相对应的亚烷基。
术语“烯基”是指具有一个或多个(例如，一个或两个)碳-碳双键的直链或支链烃的一价基团，其中烯基基团包括具有“顺式”和“反式”取向，或按照替代命名法，“E”和“Z”取向的基团。除非具体描述烯基是非支链的，例如C2-C16非支链烯基，否则如本文所用的术语“烯基”适用于支链和非支链烯基基团。示例性烯基基团包括但不限于C2-C16非支链烯基、C7-C16烯基、C8-C14烯基、C2-C14非支链烯基、C2-C12非支链烯基、C2-C10非支链烯基、C2-C7非支链烯基、C2-C6烯基、C2-C4烯基、C2-C3烯基、C8烯基、C10烯基、C12烯基、以及与上述含有两个及以上碳原子的示例性烷基基团相对应的烯基。
术语“亚烯基”是指具有一个或多个(例如，一个或两个)碳-碳双键的直链或支链烃的二价基团，其中烯基基团包括具有“顺式”和“反式”取向，或按照替代命名法，“E”和“Z”取向的基团。除非具体描述亚烯基是非支链的，例如C3-C10非支链亚烷基，否则如本文所用的术语“亚烯基”适用于支链和非支链亚烯基基团两者。示例性亚烯基基团包括但不限于C3-C9亚烯基、C3-C8亚烯基、C2-C8亚烯基、C2-C6亚烯基、C3-C7亚烯基、C5-C7亚烯基、C2-C4亚烯基、C1-C8亚烷基、C2-C8亚烷基、C3-C7亚烷基、C5-C7亚烷基、C7亚烷基、C5亚烷基、以及与上述含有两个及以上碳原子的示例性烷基基团相对应的烯基。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指本发明的阳离子脂质的药学上可接受的有机盐或无机盐。示例性盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸性磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐、蔗糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲基磺酸盐“甲磺酸盐”、乙基磺酸盐、苯基磺酸盐、对甲苯磺酸盐、双羟萘酸盐(即1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))盐、碱金属(例如，钠和钾)盐、碱土金属(例如，镁)盐和铵盐。药学上可接受的盐可涉及包括另一种分子，诸如，乙酸根离子、琥珀酸根离子或其他抗衡离子。该抗衡离子可以是稳定母体化合物电荷的任何有机部分或无机部分。此外，药学上可接受的盐在其结构中可以具有多于一个的带电原子。多个带电原子是药学上可接受的盐一部分的情况可以具有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可以具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。
如在本说明书和所附权利要求中使用的，术语“约”在指代诸如量、持续时间等的可测量值时，意在包括偏离指定值±20％或±10％，或±5％，或±1％，或±0.5％，并还更优选地±0.1％的偏差，因为此类偏差适合于执行所公开的方法。
如本文所用，“包括(comprise)”、“包括(comprising)”和“包括(comprises)”和“由…组成(comprisedof)”意在与“包括(include)”、“包括(including)”、“包括(includes)”或“含有(contain)”、“含有(containing)”、“含有(contains)”同义，并且是包括性或开放式术语，其指定以下内容的存在，例如，组分，并且不排除或排除本领域已知或其中公开的附加的、未列举的组分、特征、元件、成员、步骤的存在。
术语“由……组成”是指如本文所述的组合物、方法、过程和其相应组分，其排除在实施方案的描述中未叙述的任何元件。
如本文所使用的，术语“基本上由……组成”是指给定实施方案所需要的那些要素。该术语允许存在不实质上影响本发明的那个实施方案的基本和新颖或功能特征的额外元件。
如本文所用，术语“施用(administration/administering)”和其变化形式是指将组合物或药剂(例如，核酸，尤其ceDNA)引入受试者中并且包括同时和依序引入一种或多种组合物或药剂。将组合物或药剂引入受试者中是通过任何适合的途径，包括经口、经肺、经鼻、肠胃外(静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下)、经直肠、淋巴内、瘤内或局部。施用包括自我施用和由另一个人施用。可以通过任何适合的途径进行施用。适合的施用途径使得组合物或药剂执行其预期功能。例如，如果合适的途径是静脉内，则通过将组合物或药剂引入受试者的静脉中来施用组合物。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个方面，“施用”是指治疗性施用。
如本文所用，短语“抗治疗性核酸免疫应答”、“抗转移载体免疫应答”、“针对治疗性核酸的免疫应答”、“针对转移载体的免疫应答”等意指针对其来源的治疗性核酸、病毒或非病毒的任何非所要免疫应答。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，不期望的免疫应答是针对病毒转移载体本身的抗原特异性免疫应答。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，免疫应答对可以是双链DNA、单链RNA或双链RNA的转移载体是特异性的。在其它实施方案中，免疫应答对转移载体的序列是特异性的。在其它实施方案中，免疫应答对转移载体的CpG含量是特异性的。
如本文所用，术语“载体”和“赋形剂”可互换使用并且意在包括任何和所有溶剂、分散介质、媒介物、涂层、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、悬液、胶体等。此类介质和药剂用于药学上活性物质的用途是所属领域熟知的。补充性活性成分也可以并入组合物中。短语“药学上可接受的”是指当施用宿主时不会产生毒性、过敏性或类似的不良反应的分子实体和组合物。
如本文所用，术语“ceDNA”意指用于非病毒基因转移、合成或其它形式的无衣壳末端封闭的线性双链(ds)双链体DNA。ceDNA的详细描述描述于2017年3月3日提交的PCT/US2017/020828的国际申请中，该申请的全部内容以引用方式明确地并入本文。使用基于细胞的方法产生包括各种反向末端重复(ITR)序列和构型的ceDNA的某些方法描述于2018年9月7日提交的国际专利申请号PCT/US2018/049996和2018年12月6日提交的国际专利申请号PCT/US2018/064242的实施例1中，这些国际专利申请中的每一者全文以引用方式并入本文。用于产生包括各种ITR序列和构型的合成ceDNA载体的某些方法描述于例如，2019年1月18日提交的国际申请PCT/US2019/14122中，该申请的全部内容以引用方式并入本文。如本文所用，术语“ceDNA载体”和“ceDNA”可互换地使用。根据本文的方面或实施方案中的任一者的一些实施方案，ceDNA是末端封闭的线性双链体(CELiD)CELiD DNA。根据本文的方面或实施方案中的任一者的一些实施方案，ceDNA是基于DNA的小环。根据本文的方面或实施方案中的任一者的一些实施方案，ceDNA为简约的免疫学定义的基因表达(MIDGE)-载体。根据本文的方面或实施方案中的任一者的一些实施方案，ceDNA是迷你串DNA。根据本文的方面或实施方案中的任一者的一些实施方案，ceDNA为哑铃形线性双链体末端封闭的DNA，包括表达盒的5'和3'端中ITR的两个发夹结构。根据本文的方面或实施方案中的任一者的一些实施方案，ceDNA是doggyboneTMDNA。
如本文所用，术语“ceDNA-杆粒”意在是指感染性杆状病毒基因组，该感染性杆状病毒基因组包含作为分子间双链体的ceDNA基因组，该分子间双链体能够作为质粒在大肠杆菌中增殖，并且因此可以作为杆状病毒的穿梭载体操作。
如本文所用，术语“ceDNA-杆状病毒”意指一种在杆状病毒基因组内包括作为分子间双链体的ceDNA基因组的杆状病毒。
如本文所用，术语“ceDNA-杆状病毒感染的昆虫细胞”和“ceDNA-BIIC”可互换使用，意指被ceDNA-杆状病毒感染的无脊椎动物宿主细胞(包括但不限于昆虫细胞(例如，Sf9细胞))。
如本文所使用的，术语“ceDNA基因组”意指还并入了至少一个反向末端重复区域的表达盒。ceDNA基因组还可以包括一个或多个间隔区。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，ceDNA基因组作为DNA的分子间双链体多核苷酸并入质粒或病毒基因组中。
如本文所用，术语“DNA调节序列”、“控制元件”和“调节元件”在本文可互换使用，并且意指提供和/或调节非编码序列(例如，靶向DNA的RNA)或编码序列(例如，定点修饰多肽或Cas9/Csn1多肽)的转录和/或调节所编码多肽的翻译的转录和翻译控制序列，诸如，启动子、增强子、多聚腺苷酸化信号、终止子、蛋白质降解信号等。
如本文所用，术语“外源”意在是指存在于除其原生来源以外的细胞中的物质。当在本文中使用时，术语“外源”可以指已经通过涉及人手的过程被引入诸如细胞或生物体的生物系统中的核酸(例如，编码多肽的核酸)或多肽，通常在该细胞或生物体中未发现该核酸或多肽，并且希望将该核酸或多肽引入此类细胞或生物体中。可替代地，“外源”可以指已经通过涉及人手的过程被引入诸如细胞或生物体的生物系统中的核酸或多肽，在该细胞或生物体中发现核酸或多肽的量相对较低，并且希望增加细胞或生物体中核酸或多肽的量，例如，以产生异位表达或水平。相比之下，如本文所用，术语“内源”是指对生物系统或细胞天然的物质。
如本文所用，术语“表达”意指涉及产生RNA和蛋白质以及适当时分泌蛋白质的细胞过程，在适用时包括但不限于例如，转录、转录物加工、翻译和蛋白质折叠、修饰和处理。如本文所用，短语“表达产物”包括从基因(例如，转基因)转录的RNA和通过翻译从基因转录的mRNA所获得的多肽。
如本文所用，术语“表达载体”意指指导RNA或多肽从与载体上的转录调节序列连接的序列的表达的载体。表达的序列通常但不一定与宿主细胞异源。表达载体可以包括其它元件，例如，表达载体可以具有两个复制系统，从而使其可以在两种生物体中维持，例如，在人类细胞中进行表达，以及在原核宿主中进行克隆和扩增。表达载体可以是重组载体。
如本文所用，术语“表达盒”和“表达单元”可互换使用，意指与启动子或足以指导DNA载体(例如，合成AAV载体)的转基因转录的其他DNA调节序列操作地连接的异源DNA序列。合适的启动子包括例如，组织特异性启动子。启动子也可以是AAV起源的。
如本文所用，术语“侧接”是指一个核酸序列相对于另一核酸序列的相对位置。通常，在序列ABC中，B的两侧是A和C。这同样适用于布置AxBxC。因此，侧接序列在所侧接的序列之前或之后，但不必与所侧接的序列相邻或紧邻。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，术语侧接是指在线性单链合成AAV载体的每个末端处的末端重复序列。
如本文所用，术语“基因”广义上用以指与给定RNA或蛋白质的体外或体内表达相关的核酸的任何区段。因此，基因包括编码所表达的RNA的区域(其通常包括多肽编码序列)和通常其表达所需的调节序列。基因可以从多种来源获得，包括从所关注的来源克隆或从已知或预测的序列信息合成，并且可以包括设计成具有所需参数的序列。
如本文所用，短语“基因疾病”或“基因病症”是指部分或完全、直接或间接地由基因组中的一种或多种异常引起的疾病或缺陷，包括并且尤其是从出生起出现的病状。异常可以是基因中的突变、插入或缺失。异常可能影响基因的编码序列或其调节序列。
如本文所用，术语“异源”意指分别在天然核酸或蛋白质中未发现的核苷酸或多肽序列。异源核酸序列可以与天然存在的核酸序列(或其变体)连接(例如，通过基因工程)以生成编码嵌合多肽的嵌合核苷酸序列。异源核酸序列可以连接到变异多肽(例如，通过基因工程)以生成编码融合变异多肽的核苷酸序列。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指易于被本公开的核酸治疗剂转化、转染、转导等的任何细胞类型。作为非限制性示例，宿主细胞可以是分离的原代细胞、多能干细胞、CD34+细胞、诱导的多能干细胞或许多永生化细胞系(例如，HepG2细胞)中的任一种。可替代地，宿主细胞可以是组织、器官或生物体中的原位或体内细胞。此外，宿主细胞可以是例如，哺乳动物受试者(例如，需要基因疗法的人类患者)的目标细胞。
如本文所用，“诱导型启动子”意指特征在于，当存在诱导物或诱导剂或受其影响或被其接触时，启动或增强转录活性的启动子。如本文所用的“诱导物”或“诱导剂”可以是内源性的，或是以能够从诱导型启动子诱导转录活性的方式施用的通常外源的化合物或蛋白质。在本文的各方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，诱导物或诱导剂，即化学物质、化合物或蛋白质，本身可以是核酸序列转录或表达的结果(即，诱导物可以是由另一组分或模块表达的诱导蛋白)，该核酸序列本身可以在诱导型启动子的控制下。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，诱导型启动子是在不存在某些药剂，诸如阻遏子的情况下被诱导的。诱导型启动子的示例包括但不限于四环素、金属硫蛋白、蜕皮素、哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；以及小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列(MMTV-LTR))和其他类固醇反应性启动子、雷帕霉素反应性启动子等。
如本文所用，术语“体外”意指不需要存在具有完整膜的细胞(诸如，细胞提取物)的测定和方法，并且可以指在非细胞系统(诸如，不包括细胞的介质)或细胞系统(诸如，细胞提取物)中引入可编程的合成生物回路。
如本文所用，术语“体内”意指在生物体(诸如，多细胞动物)中或内部进行的测定或过程。在本文描述的一些方面中，当使用单细胞生物(诸如，细菌)时，可以说方法或用途是在“体内”发生的。术语“离体”是指使用具有完整膜的活细胞进行的方法和用途，该活细胞在多细胞动物或植物体之外，例如，外植体、培养细胞，包括原代细胞和细胞系、转化的细胞系，以及提取的组织或细胞，包括血细胞，等等。
如本文所用，术语“脂质”意指一组有机化合物，该一组有机化合物包括但不限于脂肪酸的酯，并且其特征在于具有不良水溶性，但是通常可溶于许多有机溶剂中。它们通常被分成至少三类：(1)“简单脂质”，其包括脂肪和油以及蜡；(2)“复合脂质”，其包括磷脂和糖脂；以及(3)“衍生脂质”诸如类固醇。磷脂的代表性实施例包括但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱和二亚油酰基磷脂酰胆碱。缺少磷的其他化合物，诸如，鞘脂、鞘糖脂家族、二酰基甘油和β-酰氧基酸，也在被称为两亲性脂质的组内。此外，上述两亲性脂质可与其他脂质(包括甘油三酸酯和固醇)混合。
如本文所用，术语“包封的”意在是指通过完全包封、部分包封或两者提供活性剂或治疗剂(诸如核酸(例如，ASO、mRNA、siRNA、ceDNA、病毒载体))的脂质颗粒。在优选的实施方案中，核酸被完全包封在脂质颗粒中(例如，以形成含有核酸的脂质颗粒)。
如本文所用，术语“脂质颗粒”或“脂质纳米颗粒”意指可用于将治疗剂，诸如，核酸治疗剂(TNA)递送至所关注的靶位点(例如，细胞、组织、器官等)的脂质配制物(称为“TNA脂质颗粒”、“TNA脂质纳米颗粒”或“TNA LNP”)。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，本发明的脂质颗粒是含有一种或多种治疗性核酸的LNP，其中LNP通常由阳离子脂质、固醇、非阳离子脂质和任选地防止颗粒聚集的聚乙二醇化脂质、以及另外任选地用于将LNP递送至所关注的靶位点的组织特异性靶向配体组成。在其他优选的实施方案中，可以将治疗剂诸如，治疗性核酸包封于颗粒的脂质部分中，从而保护其免于酶促降解。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，LNP包含核苷酸(例如，ceDNA)以及用本文所述的阳离子脂质配制的LNP。
如本文所用，术语“可电离脂质”意指具有至少一个可质子化或可去质子化基团的脂质，例如阳离子脂质，使得该脂质在等于或低于生理pH(例如，pH 7.4)的pH下带正电荷，并且在第二pH(优选地等于生理pH或高于生理pH)为中性。本领域普通技术人员将理解，根据pH添加或去除质子是一种平衡过程，并且提到带电脂质或中性脂质是指主要物质的性质，并不要求所有脂质都以带电或中性形式存在。通常，阳离子脂质的可质子化基团的pKa在约4至约7的范围内。因此，如本文所用，术语“阳离子”涵盖本发明脂质的离子化(或带电)和中性形式。
如本文所用，术语“中性脂质”意在是指在所选pH下以不带电或中性两性离子形式存在的任何脂质种类。在生理pH下，此类脂质包括例如，二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂和二酰基甘油。
如本文所用，术语“阴离子脂质”是指在生理pH下带负电荷的任何脂质。这些脂质包括但不限于磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰基磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰基磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰基磷脂酰乙醇胺、赖氨酰基磷脂酰甘油、棕榈酰基油酰基磷脂酰甘油(POPG)、和加入其他阴离子改性基团的中性脂质。
如本文所用，术语“非阳离子脂质”意指任何两亲性脂质以及任何其他中性脂质或阴离子脂质。
如本文所用，术语“有机脂质溶液”意在是指全部或部分包括具有脂质的有机溶剂的组合物。
如本文所用，术语“脂质体”意指组装成球形构造的脂质分子，该球形构造包封与水性外部隔离的内部水性体积。脂质体是具有至少一个脂质双层的囊泡。在医药研发的背景下，脂质体通常用作药物/治疗剂递送的载剂。其通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药物或活性药物组分来起作用。用于此类递送的脂质体组合物通常由磷脂，尤其具有磷脂酰胆碱基团的化合物构成，然而这些组合物还可以包括其它脂质。
如本文所用，术语“局部递送”意指将如干扰RNA(诸如，siRNA)的活性剂直接递送到生物体内的靶位点。例如，药剂可以通过直接注射到疾病位点(诸如肿瘤或其他目标部位，如发炎部位或目标器官，如肝脏、心脏、胰腺、肾脏等)中来局部递送。
如本文所用，术语“neDNA”或“缺口ceDNA”意指在开放阅读框架(例如，待表达的启动子和转基因)上游的茎区或间隔区5'中具有2-100个碱基对的缺口或间隙的末端封闭的DNA。
如本文所用，术语“核酸”意指含有呈单链或双链形式的至少两种核苷酸(即，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)并且包括DNA、RNA和其杂合物的聚合物。DNA可以呈例如反义分子、质粒DNA、DNA-DNA双链体、预缩合DNA、PCR产物、载体(P1、PAC、BAC、YAC、人工染色体)、表达盒、嵌合序列、染色体DNA或这些组的衍生物和组合的形式。DNA可以呈小环、质粒、杆粒、小基因、迷你串DNA(线性共价闭合DNA载体)、末端封闭的线性双螺旋DNA(CELiD或ceDNA)、doggyboneTMDNA、哑铃形DNA、简约的免疫学定义的基因表达(MIDGE)-载体、病毒载体或非病毒载体的形式。RNA可以呈小干扰RNA(siRNA)、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、mRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA(vRNA)和其组合的形式。核酸包括含有已知核苷酸类似物或经修饰主链残基或键的核酸，它们是合成的、天然存在的和非天然存在的，并且具有与参考核酸相似的结合特性。此类类似物和/或经修饰残基的示例包含(但不限于)：硫代磷酸酯、磷酰二胺吗啉代寡聚体(吗啉代)、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2'-O-甲基核糖核苷酸、锁核酸(LNATM)和肽核酸(PNA)。除非特别限定，否则该术语涵盖含有天然核苷酸已知类似物的核酸，其具有与参考核酸相似的结合特性。除非另有说明，否则特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。
如本文所使用的，短语“核酸治疗性”、“治疗性核酸”和“TNA”可互换地使用，并且是指使用核酸作为治疗疾病或病症的治疗剂的活性组分的治疗的任何模态。如本文所用，这些短语是指基于RNA的治疗剂和基于DNA的治疗剂。基于RNA的治疗剂的非限制性示例包括mRNA、反义RNA和寡核苷酸、核酶、适体、干扰RNA(RNAi)、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)和微RNA(miRNA)。基于DNA的治疗剂的非限制性示例包括小环DNA、小基因、病毒DNA(例如，慢病毒或AAV基因组)或非病毒DNA载体、末端封闭的线性双链体DNA(ceDNA/CELiD)、质粒、杆粒、狗骨TMDNA载体、简约的免疫学定义的基因表达(MIDGE)载体、非病毒迷你串DNA载体(线性-共价封闭的DNA载体)以及哑铃形DNA最小载体(“哑铃DNA”)。如本文所用，术语“TNA LNP”是指含有上述TNA至少一种的脂质颗粒。
如本文所用，“核苷酸”含有糖脱氧核苷(DNA)或核糖(RNA)、碱基和磷酸酯基。核苷酸通过磷酸酯基连接在一起。
如本文所用，“操作地连接”意指一种并置，其中如此描述的组分处于允许其以预期方式起作用的关系中。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么该启动子操作地连接到所述编码序列。启动子可以被说成驱动其调节的核酸序列的表达或驱动其转录。短语“操作地连接”、“操作性地定位”、“操作性地连接”，“在控制下”和“在转录控制下”指示启动子相对于其调节的核酸序列处于正确的功能位置和/或取向，以控制该序列的转录启动和/或表达。如本文所使用的，“反向启动子”是指核酸序列处于相反的取向，使得编码链现在成为非编码链的启动子，并且反之亦然。反向启动子序列可以在各种实施方案中用于调节开关的状态。另外，在各种实施方案中，启动子可以与增强子结合使用。
如本文所用，术语“启动子”意指通过驱动核酸序列的转录来调节另一核酸序列表达的任何核酸序列，其可以是编码蛋白质或RNA的异源靶基因。启动子可以是组成型的、诱导型的、阻遏型的、组织特异性的或其任何组合。启动子是核酸序列的控制区域，在该核酸序列的其余部分的引发和转录速率是受控的。启动子还可以含有可以结合调节蛋白和分子的遗传元件，诸如，RNA聚合酶和其他转录因子。在启动子序列内将发现转录起始位点，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白结合域。真核启动子将经常但并非总是含有“TATA”框和“CAT”框。各种启动子，包括诱导型启动子，可用于驱动本文公开的合成AAV载体中转基因的表达。启动子序列可以在其3'末端以转录起始位点为界并且向上游延伸(5'方向)以包括为了在高于背景的可检测水平上引发转录所必需的最少数目个碱基或元件。
启动子可以是与基因或序列天然结合的启动子，如可以通过分离位于编码区段上游的5'非编码序列和/或给定基因或序列的外显子来获得。此类启动子可以称为“内源性的”。类似地，在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，增强子可以是与核酸序列天然相关的增强子，位于该序列的下游或上游。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，编码核酸节段在“重组启动子”或“异源启动子”的控制下定位，该启动子均指在其天然环境中通常不与其操作地连接的编码核酸序列关联的启动子。类似地，“重组或异源增强子”是指在其天然环境中通常不与给定核酸序列关联的增强子。此类启动子或增强子可以包括其他基因的启动子或增强子；从任何其他原核、病毒或真核细胞中分离的启动子或增强子；以及非“天然存在”(即，包含不同转录调节区域的不同元件和/或通过本领域已知的遗传工程方法改变表达的突变)的合成启动子或增强子。除了合成产生启动子和增强子的核酸序列以外，还可以结合本文公开的合成生物回路和模块，使用重组克隆和/或核酸扩增技术，包括PCR，来产生启动子序列(参见，例如，美国专利号4,683,202、美国专利号5,928,906，各自以全文引用的方式并入本文中)。此外，预期也可以采用指导序列在诸如，线粒体、叶绿体等非核细胞器内的转录和/或表达的控制序列。
如本文所用，术语“Rep结合位点”(“RBS”)和“Rep结合元件”(“RBE”)可互换使用，并且意指Rep蛋白(例如，AAV Rep 78或AAV Rep 68)的结合位点，其在Rep蛋白结合后允许Rep蛋白在并入了RBS的序列上发挥其位点特异性核酸内切酶活性。RBS序列和其反向互补序列一起形成单个RBS。RBS序列本领域中是已知的，并且包括例如5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'，AAV2中所鉴定的RBS序列。
如本文所用，短语“重组载体”意指包括能够在体内表达的异源核酸序列或“转基因”的载体。应理解，在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，本文所描述的载体可以与其他适合的组合物和疗法组合。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，载体是游离型的。合适的游离型载体的使用提供了一种以高拷贝数的染色体外DNA维持受试者中的所关注的核苷酸，从而消除染色体整合的潜在影响的方式。
如本文所用，术语“报道子”意指可以用于提供可检测读数的蛋白质。报道子通常产生可测量的信号，诸如，荧光、颜色或发光。报告蛋白编码序列编码在细胞或生物体中的存在易于观察到的蛋白。
如本文所用，术语“有义”和“反义”意指多核苷酸上结构元件的取向。元件的有义和反义型式彼此反向互补。
如本文所用，术语“序列一致性”意指两个核苷酸序列之间的相关性。出于本公开的目的，使用如在EMBOSS软件包的Needle程序(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件,Rice等人,2000，同上)，优选版本3.0.0或更高版本中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch，1970，同上)确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性程度。使用的可选参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)替换矩阵。标记为“最长一致性”的Needle的输出(使用-nobrief选项获得)用作一致性百分比，并按以下计算：(相同的脱氧核糖核苷酸乘以100)/(比对长度-比对空位总数)。比对的长度优选为至少10个核苷酸、优选为至少25个核苷酸、更优选为至少50个核苷酸并且最优选为至少100个核苷酸。
如本文所用，术语“间隔区”意指分离载体或基因组中的功能元件的中间序列。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，AAV间隔区将两个功能元件保持在对于最佳功能性来说所期望的距离上。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，间隔区提供或增加了载体或基因组的基因稳定性。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，间隔区通过提供克隆位点的适宜位置和设计数目的碱基对的间隙而促进基因组的就绪基因操作。例如，在某些方面，含有若干限制性核酸内切酶位点的寡核苷酸“多酶切点接头”或“聚克隆位点”，或设计成不具有已知蛋白质(例如，转录因子)结合位点的非开放阅读框序列可以位于载体或基因组中以分离顺式作用因子，例如，插入6聚体、12聚体、18聚体、24聚体、48聚体、86聚体、176聚体等。
如本文所用，术语“受试者”是指人或动物，向其提供根据本发明的治疗性核酸的治疗，包括预防性治疗。通常，动物为脊椎动物，诸如但不限于灵长类动物、啮齿动物、家养动物或猎获的动物。灵长类动物包括但不限于：黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如，恒河猴。啮齿动物包括小鼠、大鼠、旱獭、雪貂、兔和仓鼠。家养动物和猎获的动物包括但不限于：牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科物种(例如，家猫)、犬科物种(例如，狗、狐狸、狼)、禽类物种(例如，鸡、鸸鹋、鸵鸟)，以及鱼(例如，鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。在本文所描述方面的某些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如，灵长类动物或人。受试者可以是雄性或雌性。另外，受试者可以是婴儿或儿童。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，受试者可以是新生儿或未出生受试者，例如受试者还在子宫内。优选地，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些示例。人以外的哺乳动物可以有利地用作代表疾病和病症的动物模型的受试者。另外，本文所描述的方法和组合物可以用于家养动物和/或宠物。人类受试者可以是任何年龄、性别、种族或族群，例如，高加索人(白人)、亚洲人、非洲人、黑人、非裔美国人、非裔欧洲人、西班牙人、中东人等。在本文的各方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，受试者可以是临床环境中的患者或其他受试者。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，受试者已经在接受治疗了。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，受试者是胚胎、胎儿、新生儿、婴儿、儿童、青少年或成人。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，受试者是人类胎儿、人类新生儿、人类婴儿、人类儿童、人类青少年或人类成人。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，受试者是动物胚胎，或非人类胚胎或非人类灵长类动物胚胎。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，受试者是人类胚胎。
如本文所用，短语“有需要的受试者”是指(i)将施用根据所述发明的TNA脂质颗粒(或包含TNA脂质颗粒的药物组合物)，(ii)正在接受根据所述发明的TNA脂质颗粒(或包含TNA脂质颗粒的药物组合物)；或(iii)已接受根据所述发明的TNA脂质颗粒(或包含TNA脂质颗粒的药物组合物)的受试者，除非该短语的上下文和用法另有说明。
如本文所用，术语“遏制”、“减少”、“干扰”、“抑制”和/或“降低”(以及类似术语)通常是指直接或间接地降低相对于自然条件、预期条件或平均条件，或相对控制条件的浓度、水平、功能、活动或行为的行为。
如本文所用，术语“合成AAV载体”和“AAV载体的合成产生”意指在完全无细胞环境中的AAV载体和其合成产生方法。
如本文所用，术语“全身递送”意指脂质颗粒的递送，使得活性剂诸如，干扰RNA(例如，siRNA)在生物体内的广泛生物分布。一些施用技术可导致某些药剂而非其他药剂的全身递送。全身递送意指使有用量(优选治疗量)的药剂暴露于身体的大部分部位。为了获得广泛的生物分布，通常需要血液寿命，以使药剂在到达施用位点远端的疾病位点之前不会迅速地降解或清除(例如，通过首过器官(肝脏、肺等)或通过快速、非特异性细胞结合)。脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的全身递送可以通过本领域已知的任何手段进行，包括例如，静脉内、皮下和腹膜内。在优选的实施方案中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的全身递送是通过静脉内递送进行的。
如本文所用，术语“末端解离位点”和“TRS”在本文可互换使用，意指一个区域，在此Rep与5'胸苷形成酪氨酸-磷酸二酯键，产生3'-OH，充当经由细胞DNA聚合酶，例如，DNApolδ或DNA polε进行DNA延伸的底物。可替代地，Rep-胸苷复合物可以参与配位接合反应。
如本文所用，术语“治疗量”、“治疗有效量”、活性剂(如本文所述的TNA脂质颗粒)的“有效量”或“药学有效量”可互换地用于指足以提供治疗或效果的预期益处的量，例如，与在不存在治疗性核酸的情况下检测到的表达水平相比，抑制靶序列的表达。用于测量目标基因或目标序列的表达的适合的分析包括例如，使用所属领域的技术人员已知的技术检查蛋白质或RNA水平，该技术如斑点印迹、北方印迹法、原位杂合、ELISA、免疫沉淀、酶功能以及所属领域的技术人员已知的表型分析。然而，剂量水平基于多种因素，包括损伤类型、年龄、体重、性别、患者的医学病状、病状的严重程度、施用途径和所采用的特定活性剂。因此，剂量方案可以在很大范围内变化，但可以由医师使用标准方法常规地确定。另外，术语“治疗量”、“有效量”、“治疗有效量”和“药学上有效量”包括所描述的本发明的组合物的防治或预防量。在所描述的本发明的防治性或预防性应用中，以足以消除或降低疾病、病症或病状的风险、减轻严重程度或延迟发病的量向易患有疾病、病症或病状或以其他方式处于疾病、病症或病状风险下的患者施用药物组合物或药剂，所述疾病、病症或病状包括疾病、病症或病状的生物化学、组织学和/或行为症状，其并发症和在疾病、病症或病状的发展期间呈现的中间病理学表型。在一个方面中，术语“治疗量”、“有效量”、“治疗有效量”和“药学上有效量”不包括所描述的本发明的组合物的防治或预防量。通常优选使用最大剂量，即，根据一些医学判断的最高安全剂量。术语“剂量(dose/dosage)”在本文中可互换地使用。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个方面，“治疗量”、“治疗有效量”和“药学有效量”是指非预防性或非预防性应用。
如本文所用，术语“治疗效果”是指治疗的结果，其结果被判定为合乎需要并且有益的。治疗效果可以直接或间接地包括疾病表现的遏制、减少或消除。治疗效果还可以直接或间接地包括疾病表现的进展的遏制减少或消除。
对于本文所描述的任何治疗剂，治疗有效量可以初始地根据初步的体外研究和/或动物模型来确定。治疗有效剂量也可以根据人数据来确定。可以基于相对生物利用度和施用的化合物的效力调节施用剂量。基于上述方法和其他熟知的方法调整剂量以实现最大功效在普通技术人员的能力内。下文总结了用于测定治疗有效性的一般原理，其可以在《古德曼和吉尔曼的治疗学的药理学基础》(Goodman and Gilman's The PharmacologicalBasis of Therapeutics)，第10版，麦格劳-希尔专业出版公司(McGraw-Hill)(纽约)(2001)的第1章中找到，该文献以引用的方式并入本文中。
药代动力学原理为修改剂量方案以获得期望程度的治疗功效并且具有最小的不可接受的副作用提供了基础。在可以测量药物的血浆浓度并且与治疗窗口有关的情况下，可以获得针对剂量修改的另外的指导。
如本文所用，术语“治疗(treat/treating/treatment)”包括消除、抑制、减缓或逆转病状的进展，改善病状的临床症状、或预防病状的临床症状的出现、获得有益或所需的临床结果。治疗还指完成以下一项或多项：(a)降低病症的严重程度；(b)限制被治疗病症的特征性症状的发展；(c)限制被治疗病症的特征性症状的恶化；(d)限制障碍在先前患有该病症的患者中的复发；以及(e)限制先前对病症无症状的患者的症状复发。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个方面，术语“治疗(treat/treating/treatment)”包括消除、抑制、减缓或逆转病状的进展，或改善病状的临床症状。
有益或所需的临床结果，诸如药理学和/或生理学作用，包括(但不限于)：预防可能易患有疾病、病症或病状但尚未经历或展现疾病的症状的受试者出现该疾病、病症或病状(防治性治疗)；缓解该疾病、病症或病状的症状；减轻该疾病、病症或病状的程度；稳定该疾病、病症或病状(即，不恶化)；预防该疾病、病症或病状的扩散；延迟或减缓该疾病、病症或病状进展；改善或缓和该疾病、病症或病状；以及其组合，以及与如果不接受治疗所预期的存活期相比，延长存活期。
如本文所用，术语“载体”或“表现载体”意指复制子，诸如质粒、杆粒、噬菌体、病毒、病毒粒子或粘粒，其可以附接另一个DNA区段，即“插入物”“转基因”或“表达盒”，以便实现所附接区段(“表达盒”)在细胞中的表达或复制。载体可以是设计用于递送到宿主细胞或用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。如本文所用，载体可以以最终形式起源于病毒或非病毒。然而，出于本公开的目的，“载体”通常是指合成AAV载体或缺口DNA载体。因此，术语“载体”涵盖与适当的控制元件缔合时能够复制并且可以将基因序列转移到细胞的任何基因元件。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，载体可以是重组载体或表达载体。
本文公开的本发明的替代要素或实施方案的分组不应解释为限制。每个组成员可以单独提及和要求，或呈与该组的其它成员或此处找到的其它要素的任何组合提及和要求。出于方便和/或可专利性的原因，一个组中的一个或多个成员可以包括在一个组中或从中删除。当发生任何这样的包括或删除时，在本文中认为说明书含有修改的组，从而满足所附权利要求书中使用的所有马库什组(Markush group)的书面描述。
在任何方面的一些实施方案中，本文描述的公开内容不涉及克隆人的方法、用于修饰人的种系遗传身份的方法、用于工业或商业目的的人胚胎的使用、或用于修饰动物的基因身份，可能导致其遭受痛苦而对人或动物没有任何实质性医学益处的方法，以及由这类方法产生的动物。
本文在本发明的各个方面的描述内定义了其它术语。
II.脂质
在第一实施方案中，提供了由式I表示的阳离子脂质：
或其药学上可接受的盐，其中：
R'不存在，为氢或C1-C3烷基；前提条件是当R'为氢或C1-C3烷基时，R'、R1和R2全部附接的氮原子被质子化；
R1和R2各自独立地为氢或C1-C3烷基；
R3为C3-C10亚烷基或C3-C10亚烯基；
R4为C1-C16非支链烷基、C2-C16非支链烯基、或其中：
R4a和R4b各自独立地为C1-C16非支链烷基或C2-C16非支链烯基；
R5不存在，为C1-C6亚烷基或C2-C6亚烯基；
R6a和R6b各自独立地为C7-C14烷基或C7-C14烯基；
X是-OC(＝O)-、-SC(＝O)-、-OC(＝S)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)S-、-S-S-、-C(Ra)＝N-、-N＝C(Ra)-、-C(Ra)＝NO-、-O-N＝C(Ra)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)-、-NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)O-、-OSi(Ra)2O-、-C(＝O)(CRa 2)C(＝O)O-、或OC(＝O)(CRa 2)C(＝O)-；其中：
Ra每次出现时独立地为氢或C1-6烷基；并且
n是选自1、2、3、4、5和6的整数。
在第二实施方案中，在根据第一实施方案的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中，X为-OC(＝O)-、-SC(＝O)-、-OC(＝S)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)S-或-S-S-；并且所有其他剩余变量如针对式I或第一实施方案所述。
在第三实施方案中，本公开的阳离子脂质由式II表示：
或其药学上可接受的盐，其中n是选自1、2、3和4的整数；并且所有其他剩余变量如针对式I或前述实施方案中任一项所述。在替代的第三实施方案中，n为选自1、2和3的整数；并且所有其他剩余变量如针对式I或前述实施方案中任一项所述。
在第四实施方案中，本公开的阳离子脂质由式III表示：
或其药学上可接受的盐；并且所有其他剩余变量如针对式I、式II或前述实施方案中任一项所述。
在第五实施方案中，在根据第一实施方案的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中，R1和R2各自独立地为氢或C1-C2烷基或C2-C3烯基；或R'、R1和R2各自独立地为氢、C1-C2烷基；并且所有其他剩余变量如针对式I、式II或前述实施方案中任一项所述。
在第六实施方案中，本公开的阳离子脂质由式IV表示：
或其药学上可接受的盐；并且所有其他剩余变量如针对式I、式II、式III或前述实施方案中任一项所述。
在第七实施方案中，在根据式I、式II、式III、式IV或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质，或其药学上可接受的盐中，R5不存在，或为C1-C8亚烷基；或R5不存在，为C1-C6亚烷基或C2-C6亚烯基；或R5不存在，为C1-C4亚烷基或C2-C4亚烯基；或R5不存在；或R5为C6亚烷基、C5亚烷基、C4亚烷基、C3亚烷基、C2亚烷基、C1亚烷基、C6亚烯基、C5亚烯基、C4亚烯基、C3亚烯基、或2亚烯基；并且所有其他剩余变量如针对式I、式II、式III、式IV或前述实施方案中任一项所述。
在第八实施方案中，本公开的阳离子脂质由式V表示：
或其药学上可接受的盐；并且所有其他剩余变量如针对式I、式II、式III、式IV或前述实施方案中任一项所述。
在第九实施方案中，在根据式I、式II、式III、式IV、式V或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质，或其药学上可接受的盐中，R4为C1-C14非支链烷基、C2-C14非支链烯基或其中R4a和R4b各自独立地为C1-C12非支链烷基或C2-C12非支链烯基；或R4为C2-C12非支链烷基或C2-C12非支链烯基；或R4为C5-C12非支链烷基或C5-C12非支链烯基；或R4为C16非支链烷基、C15非支链烷基、C14非支链烷基、C13非支链烷基、C12非支链烷基、C11非支链烷基、C10非支链烷基、C9非支链烷基、C8非支链烷基、C7非支链烷基、C6非支链烷基、C5非支链烷基、C4非支链烷基、C3非支链烷基、C2非支链烷基、C1非支链烷基、C16非支链烯基、C15非支链烯基、C14非支链烯基、C13非支链烯基、C12非支链烯基、C11非支链烯基、C10非支链烯基、C9非支链烯基、C8非支链烯基、C7非支链烯基、C6非支链烯基、C5非支链烯基、C4非支链烯基、C3非支链烯基或C2烯基；或R4为/>其中R4a和R4b各自独立地为C2-C10非支链烷基或C2-C10非支链烯基；或R4为/>其中R4a和R4b各自独立地为C16非支链烷基、C15非支链烷基、C14非支链烷基、C13非支链烷基、C12非支链烷基、C11非支链烷基、C10非支链烷基、C9非支链烷基、C8非支链烷基、C7非支链烷基、C6非支链烷基、C5非支链烷基、C4非支链烷基、C3非支链烷基、C2烷基、C1烷基、C16非支链烯基、C15非支链烯基、C14非支链烯基、C13非支链烯基、C12非支链烯基、C11非支链烯基、C10非支链烯基、C9非支链烯基、C8非支链烯基、C7非支链烯基、C6非支链烯基、C5非支链烯基、C4非支链烯基、C3非支链烯基或C2烯基；并且所有其他剩余变量如针对式I、式II、式III、式IV、式V或前述实施方案中任一项所述。
在第十实施方案中，在根据式I、式II、式III、式IV、式V或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质，或其药学上可接受的盐中，R3为C3-C8亚烷基或C3-C8亚烯基、C3-C7亚烷基或C3-C7亚烯基、或3-C5亚烷基或C3-C5亚烯基；或R3为C8亚烷基、或C7亚烷基、或C6亚烷基、或C5亚烷基、或C4亚烷基、或C3亚烷基、或C1亚烷基、或C8亚烯基、或C7亚烯基、或C6亚烯基、或C5亚烯基、或C4亚烯基、或C3亚烯基；并且所有其他剩余变量如针对式I、式II、式III、式IV、式V或前述实施方案中任一项所述。
在第十一实施方案中，在根据式I、式II、式III、式IV、式V或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质，或其药学上可接受的盐中，R6a和R6b各自独立地为C7-C12烷基或C7-C12烯基；或R6a和R6b各自独立地为C8-C10烷基或C8-C10烯基；或R6a和R6b各自独立地为C12烷基、C11烷基、C10烷基、C9烷基、C8烷基、C7烷基、C12烯基、C11烯基、C10烯基、C9烯基、C8烯基、或C7烯基；并且所有其他剩余变量如针对式I、式II、式III、式IV、式V或前述实施方案中任一项所述。
在第十二实施方案中，在根据式I、式II、式III、式IV、式V或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质，或其药学上可接受的盐中，R6a和R6b含有彼此相等数量的碳原子；R6a和R6b相同；或R6a和R6b均为C12烷基、C11烷基、C10烷基、C9烷基、C8烷基、C7烷基、C12烯基、C11烯基、C10烯基、C9烯基、C8烯基、或C7烯基；并且所有其他剩余变量如针对式I、式II、式III、式IV、式V或前述实施方案中任一项所述。
在第十三实施方案中，在根据式I、式II、式III、式、式V或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质，或其药学上可接受的盐中，如前述实施方案中任一项中所定义，R6a和R6b各自含有彼此不同数量的碳原子；或碳原子R6a和R6b的数量相差一个或两个碳原子；或碳原子R6a和R6b的数量相差一个碳原子；或R6a为C7烷基并且R6a为C8烷基，R6a为C8烷基并且R6a为C7烷基，R6a为C8烷基并且R6a为C9烷基，R6a为C9烷基并且R6a为C8烷基，R6a为C9烷基并且R6a为C10烷基，R6a为C10烷基并且R6a为C9烷基，R6a为C10烷基并且R6a为C11烷基，R6a为C11烷基并且R6a为C10烷基，R6a为C11烷基并且R6a为C12烷基，R6a为C12烷基并且R6a为C11烷基，R6a为C7烷基并且R6a为C9烷基，R6a为C9烷基并且R6a为C7烷基，R6a为C8烷基并且R6a为C10烷基，R6a为C10烷基并且R6a为C8烷基，R6a为C9烷基并且R6a为C11烷基，R6a为C11烷基并且R6a为C9烷基，R6a为C10烷基并且R6a为C12烷基，R6a为C12烷基并且R6a为C10烷基，等等；并且所有其他剩余变量如针对式I、式II、式III、式IV、式V或前述实施方案中任一项所述。
在第十四实施方案中，在根据式I、式II、式III、式IV、式V或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质，或其药学上可接受的盐中，R'不存在；并且所有其他剩余变量如针对式I或前述实施方案中任一项所述。在一些实施方案中，在根据式I、式II、式III、式IV、式V或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质中，其中R'为氢或C1-C6烷基，R'、R1和R2全部附接的氮原子被质子化，因为氮原子是带正电荷的。
在一些实施方案中，在根据式I、式II、式III、式IV、式V或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质中，其中R'、R1和R2各自为C1-C6烷基，并且其中R'、R1和R2与其所附接的氮原子一起形成季铵阳离子或季胺。
在第十五实施方案中，提供了由式Ia表示的阳离子脂质：
或其药学上可接受的盐，其中：
R'不存在，或者为C1-C3烷基；
R1和R2各自独立地为氢或C1-C3烷基；
R3为C3-C10亚烷基或C3-C10亚烯基；
R4为C1-C16非支链烷基、或C2-C16非支链烯基；
R5不存在，为C1-C6亚烷基或C2-C6亚烯基；
R6a和R6b各自独立地为C7-C14烷基或C7-C14烯基；
X是-OC(＝O)-、-SC(＝O)-、-OC(＝S)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)S-、-S-S-、-C(Ra)＝N-、-N＝C(Ra)-、-C(Ra)＝NO-、-O-N＝C(Ra)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)-、-NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)O-、-OSi(Ra)2O-、-C(＝O)(CRa 2)C(＝O)O-、或OC(＝O)(CRa 2)C(＝O)-；其中：
Ra每次出现时独立地为氢或C1-6烷基；并且
n是选自1、2、3、4、5和6的整数。
在第六实施方案中，在根据第五实施方案的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中，X为-OC(＝O)-、-SC(＝O)-、-OC(＝S)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)S-或-S-S-；并且所有其他剩余变量如针对式Ia或第十五实施方案所述。
在第七实施方案中，本公开的阳离子脂质由式IIa表示：
或其药学上可接受的盐，其中n是选自1、2、3和4的整数；并且所有其他剩余变量如针对式Ia或前述实施方案中任一项所述。在替代的第三实施方案中，n为选自1、2和3的整数；并且所有其他剩余变量如针对式Ia或第十六实施方案所述。
在第十八实施方案中，本公开的阳离子脂质由式IIIa表示：
或其药学上可接受的盐；并且所有其他剩余变量如针对式Ia、式IIa或第十五实施方案、第十六实施方案或第十七实施方案所述。
在第十九实施方案中，在根据第一实施方案的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中，R1和R2各自独立地为氢或C1-C2烷基或C2-C3烯基；或R'、R1和R2各自独立地为氢、C1-C2烷基；并且所有其他剩余变量如针对式Ia、式IIa或前述实施方案所述。
在第二十实施方案中，本公开的阳离子脂质由式IVa表示：
或其药学上可接受的盐；并且所有其他剩余变量如针对式Ia、式IIa、式IIIa或第十五实施方案、第十六实施方案、第十七实施方案、第十八实施方案或第十九实施方案中任一项所述。
在第二十一实施方案中，在根据式Ia、式IIa、式IIIa、式IVa或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质，或其药学上可接受的盐中，R5不存在，或为C1-C8亚烷基；或R5不存在，为C1-C6亚烷基或C2-C6亚烯基；或R5不存在，为C1-C4亚烷基或C2-C4亚烯基；或R5不存在；或R5是C6亚烷基、C5亚烷基、C4亚烷基、C3亚烷基、C2亚烷基、C1亚烷基、C6亚烯基、C5亚烯基、C4亚烯基、C3亚烯基、或2亚烯基；并且所有其他剩余变量如针对式Ia、式IIa、式IIIa、式IVa或第十五实施方案、第十六实施方案、第十七实施方案、第十八实施方案、第十九实施方案或第二十实施方案中任一项所述。
在第二十二实施方案中，本公开的阳离子脂质由式Va表示：
或其药学上可接受的盐；并且所有其他剩余变量如针对式Ia、式IIa、式IIIa、式IVa或第十五实施方案、第十六实施方案、第十七实施方案、第十八实施方案、第十九实施方案、第二十实施方案或第二十一实施方案中任一项所述。
在第二十三实施方案中，在根据式Ia、式IIa、式IIIa、式IVa、式Va或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质，或其药学上可接受的盐中，R4为C1-C14非支链烷基或C2-C14非支链烯基；或R4为C2-C12非支链烷基或C2-C12非支链烯基；或R4为C5-C12非支链烷基或C5-C12非支链烯基；或R4为C16非支链烷基、C15非支链烷基、C14非支链烷基、C13非支链烷基、C12非支链烷基、C11非支链烷基、C10非支链烷基、C9非支链烷基、C8非支链烷基、C7非支链烷基、C6非支链烷基、C5非支链烷基、C4非支链烷基、C3非支链烷基、C2非支链烷基、C1非支链烷基、C16非支链烯基、C15非支链烯基、C14非支链烯基、C13非支链烯基、C12非支链烯基、C11非支链烯基、C10非支链烯基、C9非支链烯基、C8非支链烯基、C7非支链烯基、C6非支链烯基、C5非支链烯基、C4非支链烯基、C3非支链烯基或C2烯基；并且所有其他剩余变量如针对式Ia、式IIa、式IIIa、式IVa、式Va或第十五实施方案、第十六实施方案、第十七实施方案、第十八实施方案、第十九实施方案、第二十实施方案、第二十一实施方案或第二十二实施方案中任一项所述。
在第二十四实施方案中，在根据式Ia、式IIa、式IIIa、式IVa、式Va或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质，或其药学上可接受的盐中，R3为C3-C8亚烷基或C3-C8亚烯基、C3-C7亚烷基或C3-C7亚烯基、或3-C5亚烷基或C3-C5亚烯基；或R3为C8亚烷基、或C7亚烷基、或C6亚烷基、或C5亚烷基、或C4亚烷基、或C3亚烷基、或C1亚烷基、或C8亚烯基、或C7亚烯基、或C6亚烯基、或C5亚烯基、或C4亚烯基、或C3亚烯基；并且所有其他剩余变量如针对式Ia、式IIa、式IIIa、式IVa、式Va或第十五实施方案、第十六实施方案、第十七实施方案、第十八实施方案、第十九实施方案、第二十实施方案、第二十一实施方案、第二十二实施方案或第二十三实施方案中任一项所述。
在第二十五实施方案中，在根据式Ia、式IIa、式IIIa、式IVa、式Va或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质，或其药学上可接受的盐中，R6a和R6b各自独立地为C7-C12烷基或C7-C12烯基；或R6a和R6b各自独立地为C8-C10烷基或C8-C10烯基；或R6a和R6b各自独立地为C12烷基、C11烷基、C10烷基、C9烷基、C8烷基、C7烷基、C12烯基、C11烯基、C10烯基、C9烯基、C8烯基、或C7烯基；并且所有其他剩余变量如针对式Ia、式IIa、式IIIa、式IVa、式Va或第十五实施方案、第十六实施方案、第十七实施方案、第十八实施方案、第十九实施方案、第二十实施方案、第二十一实施方案、第二十二实施方案、第二十三实施方案或第二十四实施方案中任一项所述。
在第二十六实施方案中，在根据式Ia、式IIa、式IIIa、式IVa、式Va或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质，或其药学上可接受的盐中，R6a和R6b含有彼此相等数量的碳原子；R6a和R6b相同；或R6a和R6b均为C12烷基、C11烷基、C10烷基、C9烷基、C8烷基、C7烷基、C12烯基、C11烯基、C10烯基、C9烯基、C8烯基、或C7烯基；并且所有其他剩余变量如针对式Ia、式IIa、式IIIa、式IVa、式Va或第十五实施方案、第十六实施方案、第十七实施方案、第十八实施方案、第十九实施方案、第二十实施方案、第二十一实施方案、第二十二实施方案、第二十三实施方案、第二十四实施方案或第二十五实施方案中任一项所述。
在二十七实施方案中，在根据式Ia、式IIa、式IIIa、式IVa、式Va或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质，或其药学上可接受的盐中，如前述实施方案中任一项中所定义，R6a和R6b各自含有彼此不同数量的碳原子；或碳原子R6a和R6b的数量相差一个或两个碳原子；或碳原子R6a和R6b的数量相差一个碳原子；或R6a为C7烷基并且R6a为C8烷基，R6a为C8烷基并且R6a为C7烷基，R6a为C8烷基并且R6a为C9烷基，R6a为C9烷基并且R6a为C8烷基，R6a为C9烷基并且R6a为C10烷基，R6a为C10烷基并且R6a为C9烷基，R6a为C10烷基并且R6a为C11烷基，R6a为C11烷基并且R6a为C10烷基，R6a为C11烷基并且R6a为C12烷基，R6a为C12烷基并且R6a为C11烷基，R6a为C7烷基并且R6a为C9烷基，R6a为C9烷基并且R6a为C7烷基，R6a为C8烷基并且R6a为C10烷基，R6a为C10烷基并且R6a为C8烷基，R6a为C9烷基并且R6a为C11烷基，R6a为C11烷基并且R6a为C9烷基，R6a为C10烷基并且R6a为C12烷基，R6a为C12烷基并且R6a为C10烷基，等等；并且所有其他剩余变量如针对式Ia、式IIa、式IIIa、式IVa、式Va或第十五实施方案、第十六实施方案、第十七实施方案、第十八实施方案、第十九实施方案、第二十实施方案、第二十一实施方案、第二十二实施方案、第二十三实施方案、第二十四实施方案、第二十五实施方案或第二十六实施方案中任一项所述。
在第二十八实施方案中，在根据式Ia、式IIa、式IIIa、式IVa、式Va或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质，或其药学上可接受的盐中，R'不存在；并且所有其他剩余变量如针对式Ia或第十五实施方案、第十六实施方案、第十七实施方案、第十八实施方案、第十九实施方案、第二十实施方案、第二十一实施方案、第二十二实施方案、第二十三实施方案、第二十四实施方案、第二十五实施方案、第二十六实施方案或第二十七实施方案中任一项所述。
在第二十九实施方案中，在根据式Ia、式IIa、式IIIa、式IVa、式Va或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质，或其药学上可接受的盐中，R'不存在，R'、R1、和R2全部附接的氮原子在脂质存在于例如约7.4或更低的pH，诸如约7.4的pH的生理条件下时被质子化；并且所有其他剩余变量如针对式Ia或第十五实施方案、第十六实施方案、第十七实施方案、第十八实施方案、第十九实施方案、第二十实施方案、第二十一实施方案、第二十二实施方案、第二十三实施方案、第二十四实施方案、第二十五实施方案、第二十六实施方案、第二十七实施方案或第二十八实施方案中任一项所述。
在第三十实施方案中，在根据式Ia、式IIa、式IIIa、式IVa、式Va或前述实施方案中任一项的阳离子脂质，或其药学上可接受的盐中，R'不存在，R'、R1、和R2全部附接的氮原子在脂质存在于水溶液中时被质子化；并且所有其他剩余变量如针对式Ia或第十五实施方案、第十六实施方案、第十七实施方案、第十八实施方案、第十九实施方案、第二十实施方案、第二十一实施方案、第二十二实施方案、第二十三实施方案、第二十四实施方案、第二十五实施方案、第二十六实施方案、第二十七实施方案、第二十八实施方案或第二十九实施方案中任一项所述。
在第三十一实施方案中，在根据式Ia、式IIa、式IIIa、式IVa、式Va或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质，或其药学上可接受的盐中，R'不存在，R'、R1、和R2全部附接的氮原子在脂质存在于约7.4或更低的pH下时被质子化；并且所有其他剩余变量如针对式Ia或第十五实施方案、第十六实施方案、第十七实施方案、第十八实施方案、第十九实施方案、第二十实施方案、第二十一实施方案、第二十二实施方案、第二十三实施方案、第二十四实施方案、第二十五实施方案、第二十六实施方案、第二十七实施方案、第二十八实施方案、第二十九实施方案或第三十实施方案中任一项所述。
在第三十二实施方案中，在根据式Ia、式IIa、式IIIa、式IVa、式Va或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质，或其药学上可接受的盐中，R'不存在，R'、R1、和R2全部附接的氮原子在脂质存在于水溶液中和为约7.4或更低的pH(例如，约7.4的pH)下时被质子化；并且所有其他剩余变量如针对式Ia或第十五实施方案、第十六实施方案、第十七实施方案、第十八实施方案、第十九实施方案、第二十实施方案、第二十一实施方案、第二十二实施方案、第二十三实施方案、第二十四实施方案、第二十五实施方案、第二十六实施方案、第二十七实施方案、第二十八实施方案、第二十九实施方案、第三十实施方案或第三十一实施方案中任一项所述。
在第三十三实施方案中，在根据式Ia、式IIa、式IIIa、式IVa、式Va或前述实施方案中任一项所述的阳离子脂质，或其药学上可接受的盐中，其中R'、R1和R2与其所附接的氮原子一起形成季铵阳离子或季胺；并且所有其他剩余变量如针对式Ia或第十五实施方案、第十六实施方案、第十七实施方案、第十八实施方案、第十九实施方案、第二十实施方案、第二十一实施方案、第二十二实施方案、第二十三实施方案、第二十四实施方案、第二十五实施方案、第二十六实施方案、第二十七实施方案、第二十八实施方案、第二十九实施方案、第三十实施方案、第三十一实施方案或第三十二实施方案中任一项所述。
在一些实施方案中，在根据式Ia、式IIa、式IIIa、式IVa、式Va或第十五实施方案、第十六实施方案、第十七实施方案、第十八实施方案、第十九实施方案、第二十实施方案、第二十一实施方案、第二十二实施方案、第二十三实施方案、第二十四实施方案、第二十五实施方案、第二十六实施方案、第二十七实施方案、第二十八实施方案、第二十九实施方案、第三十实施方案、第三十一实施方案、第三十二实施方案或第三十三实施方案中任一项所述的阳离子脂质中，其中R'是氢或C1-C6烷基，R'、R1和R2全部附接的氮原子被质子化，因为该氮原子带正电荷。
在一些实施方案中，在根据式Ia、式IIa、式IIIa、式IVa、式Va或第十五实施方案、第十六实施方案、第十七实施方案、第十八实施方案、第十九实施方案、第二十实施方案、第二十一实施方案、第二十二实施方案、第二十三实施方案、第二十四实施方案、第二十五实施方案、第二十六实施方案、第二十七实施方案、第二十八实施方案、第二十九实施方案、第三十实施方案、第三十一实施方案、第三十二实施方案或第三十三实施方案中任一项所述的阳离子脂质中，其中R'、R1和R2各自为C1-C6烷基，并且其中R'、R1和R2与其所附接的氮原子一起形成季铵阳离子或季胺。
在一个实施方案中，本公开的阳离子脂质或式I或式Ia的阳离子脂质是：
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或其药学上可接受的盐。
此外，式I、式II、式III、式IV、式V、式Ia、式IIa、式IIIa、式IVa、式Va的脂质或其药学上可接受的盐(例如，季铵盐)或本文公开的任何示例性脂质可转化为包含季铵或季铵阳离子的对应脂质，即R'、R1和R2各自为C1-C6烷基(全部在本公开中考虑到)，例如通过在乙腈(CH3CN)和氯仿(CHCl3)中用氯甲烷(CH3Cl)处理。此类脂质中的季铵阳离子是永久带电的，与它们的溶液的pH无关。
在一些实施方案中，当脂质存在于生理条件下，例如约7.4或更低的pH，诸如约7.4的pH下时，脂质1、脂质2、脂质3、脂质4、脂质5、脂质6、脂质7、脂质8、脂质9、脂质10或脂质11中的任一者的氮原子被质子化。
在一些实施方案中，当脂质存在于水溶液中时，脂质1、脂质2、脂质3、脂质4、脂质5、脂质6、脂质7、脂质8、脂质9、脂质10或脂质11中的任一者的氮原子被质子化。
在一些实施方案中，当脂质存在于约7.4或更低的pH(例如，约7.4的pH)下时，脂质1、脂质2、脂质3、脂质4、脂质5、脂质6、脂质7、脂质8、脂质9、脂质10或脂质11中的任一者的氮原子被质子化。
在一些实施方案中，当脂质存在于水溶液中并且在约7.4或更低的pH(例如，约7.4的pH)下时，脂质1、脂质2、脂质3、脂质4、脂质5、脂质6、脂质7、脂质8、脂质9、脂质10或脂质11中的任一者的氮原子被质子化。
III.脂质纳米颗粒(LNP)
LNP作为核酸的递送载体
包括本文所述的阳离子脂质和无衣壳非病毒载体或治疗性核酸(TNA)(例如，ceDNA)的脂质纳米颗粒(LNP)或其药物组合物可用于将无衣壳非病毒DNA载体递送至所关注的靶位点(例如，细胞、组织、器官等)。因此，本公开的另一方面涉及脂质纳米颗粒(LNP)，其包含一种或多种本文所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，以及治疗性核酸(TNA)。
一般而言，阳离子脂质通常用于在低pH条件下缩合核酸货物，如ceDNA，并驱动膜缔合和融合性。通常，阳离子脂质是包括至少一个氨基的脂质，该氨基在酸性条件下(例如，在pH 6.5或更低的条件下)带正电或被质子化以形成包含季铵的脂质。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，在脂质纳米颗粒中，如本文提供的阳离子脂质或其药学上可接受的盐以约30％至约80％，例如约35％至约80％、约40％至约80％、约45％至约80％、约50％至约80％、约55％至约80％、约60％至约80％、约65％至约80％、约70％至约80％、约75％至约80％、30％至约75％、约35％至约75％、约40％至约75％、约45％至约75％、约50％至约75％、约55％至约75％、约60％至约75％、约65％至约75％、约70％至约75％、30％至约70％、约35％至约70％、约40％至约70％、约45％至约70％、约50％至约70％、约55％至约70％、约60％至约70％、约65％至约70％、约30％至约65％、约35％至约65％、约40％至约65％、约45％至约65％、约50％至约65％、约55％至约65％、约60％至约65％、约30％至约60％、约35％至约60％、约40％至约60％、约45％至约60％、约50％至约60％、约55％至约60％、约30％至约55％、约35％至约55％、约40％至约55％、约45％至约55％、约50％至约55％、约30％至约50％、约35％至约50％、约40％至约50％、约45％至约50％、约30％至约45％、约35％至约45％、约40％至约45％、约30％至约40％或约35％至约40％的摩尔百分比存在。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，在脂质纳米颗粒中，如本文提供的阳离子脂质或其药学上可接受的盐以约40％至约60％、或约45％至约60％、或约45％至约55％、或约45％至约50％、或约50％至约55％、或约40％至约50％；诸如但不限于约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％或约60％的摩尔百分比存在。
固醇
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，除了本文所述的更多阳离子脂质或其药学上可接受的盐和TNA之外，本文所述的LNP还包含至少一种固醇，以提供膜完整性和脂质颗粒的稳定性。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，可用于所述脂质颗粒的示例性固醇是胆固醇或其衍生物。胆固醇衍生物的非限制性实例包括极性类似物，诸如5α-胆固醇、5β-粪固醇、胆固醇基-(2'-羟基)-乙醚、胆固醇基-(4'-羟基)-丁醚和6-酮胆固醇；非极性类似物诸如5α-胆甾烷、胆甾烯酮、5α-胆甾烷酮、5β-胆甾烷酮、胆固醇癸酸酯等；以及它们的混合物。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，胆固醇衍生物是极性类似物，诸如胆固醇基-(4'-羟基)-丁基醚。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，胆固醇衍生物是半琥珀酸胆固醇酯(CHEMS)。
示例性胆固醇衍生物描述于国际专利申请公开号WO2009/127060和美国专利申请公开号US2010/0130588中，这两篇专利申请公开的内容均全文以引用方式并入本文。
另外的示例性固醇包括β谷固醇、菜油固醇、豆固醇、麦角固醇、菜籽固醇、羽扇豆醇、环阿屯醇以及它们的衍生物。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，可用于脂质颗粒的示例性固醇是β谷固醇。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，在脂质纳米颗粒中，固醇以约20％至约50％，例如约25％至约50％、约30％至约50％、约35％至约50％、约40％至约50％、约45％至约50％、约20％至约45％、约25％至约45％、约30％至约45％、约35％至约45％、约40％至约45％、约20％至约40％、约25％至约40％、约30％至约40％、约35％至约40％、约20％至约35％、约25％至约35％、约30％至约35％、约20％至约30％或约25％至约35％的摩尔百分比存在。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，在脂质纳米颗粒中，固醇以约35％至约45％、或约40％至约45％、或约35％至约40％；诸如但不限于约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％或约45％的摩尔百分比存在。
非阳离子脂质
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒(LNP)还包含至少一种非阳离子脂质。非阳离子脂质也被称为结构脂质，并且可用于增加融合性并且还在形成期间增加LNP的稳定性以提供膜完整性和脂质颗粒的稳定性。非阳离子脂质包括两亲性脂质、中性脂质和阴离子脂质。因此，非阳离子脂质可以是中性不带电的、两性离子型或阴离子脂质。
示例性非阳离子脂质包括但不限于磷脂，诸如二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、单甲基磷脂酰乙醇胺(诸如16-O-单甲基PE)、二甲基磷脂酰乙醇胺(诸如16-O-二甲基PE)、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)、鞘磷脂(SM)、二肉豆酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆酰基磷脂酰甘油(DMPG)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)、二芥酰基磷脂酰胆碱(DEPC)、棕榈酰基油酰磷脂酰甘油(POPG)、二反式油酰基磷脂酰乙醇胺(DEPE)、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DLPE)；1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPHyPE)；卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷、磷酸二鲸蜡酯、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰基磷脂酰胆碱或它们的混合物。应当理解，也可以使用其他二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺磷脂。这些脂质中的酰基优选为源自具有C10-C24碳链的脂肪酸的酰基，例如，月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基或油酰基。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，非阳离子脂质是选自二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)中的任一者或多者。
适用于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的非阳离子脂质的其他示例包括非磷脂质，例如硬脂胺、十二烷基胺、十六烷基胺、乙酰基棕榈酸酯、甘油蓖麻酸酯、硬脂酸十六烷基酯、肉豆蔻酸异丙酯、两性丙烯酸聚合物、三乙醇胺-月桂基硫酸酯、烷基-芳基硫酸酯聚乙氧基化脂肪酸酰胺、双十八烷基二甲基溴化铵、神经酰胺、鞘磷脂等。
附加示例性非阳离子脂质描述于国际专利申请公开号WO2017/099823和美国专利申请公开号US2018/0028664中，这两篇专利申请公开中的内容均全文以引用方式并入本文。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，在脂质纳米颗粒中，非阳离子脂质以约2％至约20％，例如约3％至约20％、约5％至约20％、约7％至约20％、约8％至约20％、约10％至约20％、约12％至约20％、约13％至约20％、约15％至约20％、约17％至约20％、约18％至约20％、约2％至约18％、约3％至约18％、约5％至约18％、约7％至约18％、约8％至约18％、约10％至约18％、约12％至约18％、约13％至约18％、约15％至约18％、约17％至约18％、约2％至约17％、约3％至约17％、约5％至约17％、约7％至约17％、约8％至约17％、约10％至约17％、约12％至约17％、约13％至约17％、约15％至约17％、约2％至约15％、约3％至约15％、约5％至约15％、约7％至约15％、约8％至约15％、约10％至约15％、约12％至约15％、约13％至约15％、约2％至约13％、约3％至约13％、约5％至约13％、约7％至约13％、约8％至约13％、约10％至约13％、约12％至约13％、约2％至约12％、约3％至约12％、约5％至约12％、约7％至约12％、约8％至约12％、约10％至约12％、约2％至约10％、约3％至约10％、约5％至约10％、约7％至约10％、约8％至约10％、约2％至约8％、约3％至约8％、约5％至约8％、约7％至约8％、约2％至约7％、约3％至约7％、约5％至约7％、约2％至约5％、约3％至约5％或约2％至约3％的摩尔百分比存在。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，在脂质纳米颗粒中，非阳离子脂质以约5％至约15％、约7％至约15％、约8％至约15％、约10％至约15％、约12％至约15％、约13％至约15％、5％至约13％、约7％至约13％、约8％至约13％、约10％至约13％、约12％至约13％、约5％至约12％、约7％至约12％、约8％至约12％、约10％至约12％、约5％至约10％、约7％至约10％、约8％至约10％、约5％至约8％、约7％至约8％或约5％至约7％，诸如但不限于约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约11％、约12％、约13、约14％或约15％的摩尔百分比存在。
聚乙二醇化脂质
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒(LNP)还包含至少一种聚乙二醇化脂质(例如，一种、两种或三种)。聚乙二醇化脂质是如本文所定义的脂质，该脂质与一个或多个聚乙二醇(PEG)聚合物链共价或非共价连接，并且因此是一类缀合脂质。通常，将聚乙二醇化脂质掺入LNP中以抑制颗粒的聚集和/或提供空间稳定。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，脂质与一个或多个PEG聚合物链共价连接。
用于聚乙二醇化脂质的合适的PEG分子包括但不限于分子量在约500和约10,000之间、或在约1,000和约7,500之间、或在约1,000和约5,000之间、或在约2,000和约5,000之间、或在约2,000和约4,000之间、或在约2,000和约3,500之间、或在约2,000和约3,000之间的那些PEG分子；例如，PEG2000、PEG2500、PEG3000、PEG3350、PEG3500和PEG4000。
一个或多个PEG链所连接的脂质可以是固醇、非阳离子脂质或磷脂。示例性聚乙二醇化脂质包括(但不限于)：PEG-二酰基甘油(DAG)(诸如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG))、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG丁二酸酯二酰基甘油(PEGS-DAG)(诸如4-0-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-l-0-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG))、PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐，或它们的混合物。附加示例性聚乙二醇化脂质描述于例如美国专利号5,885,613和US6,287,591，以及美国专利申请公开号US2003/0077829、US2003/0077829、US2005/0175682、US2008/0020058、US2011/0117125、US2010/0130588、US2016/0376224和US2017/0119904中，全部这些申请的内容全文以引用方式并入本文。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，本文提供的脂质纳米颗粒(LNP)中的至少一种聚乙二醇化脂质选自由以下组成的组：PEG-二月桂基氧基丙基；PEG-二肉豆蔻基氧基丙基；PEG-二棕榈基氧基丙基、PEG-二硬脂基氧基丙基；l-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油-PEG(DMG-PEG)；二硬脂酰-外消旋-甘油-PEG(DSG-PEG)；PEG-二月桂基甘油；PEG-二棕榈酰甘油；PEG-二硬脂酰甘油；PEG-二月桂酰糖酰胺；PEG-二肉豆蔻酰糖酰胺；PEG-二棕榈酰糖酰胺；PEG-二硬脂酰糖酰胺；(l-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3',6'-二氧辛酰基]氨基甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)(PEG-胆固醇)；3,4-双十四烷氧基苄基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚(PEG-DMB)、l,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N[甲氧基(聚乙二醇)(DSPE-PEG)、和l,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-聚(乙二醇)-羟基(DSPE-PEG-OH)。在本文的各方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，该至少一种聚乙二醇化脂质是DMG-PEG、DSPE-PEG、DSPE-PEG-OH、DSG-PEG或它们的组合。在本文的各方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，该至少一种聚乙二醇化脂质是DMG-PEG2000、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-OH、DSG-PEG2000或它们的组合。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，本文提供的脂质纳米颗粒(LNP)包含DMG-PEG2000和DSPE-PEG2000。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，本文提供的脂质纳米颗粒(LNP)包含DMG-PEG2000和DSG-PEG2000。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，本文提供的脂质纳米颗粒(LNP)包含DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-OH。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，在脂质纳米颗粒中，至少一种聚乙二醇化脂质以约1％至10％，例如约1.5％至约10％、约2％至约10％、约2.5％至约10％、约3％至约10％、约3.5％至约10％、约4％至约10％、约4.5％至约10％、约5％至约10％、约5.5％至约10％、约6％至约10％、约6.5％至约10％、约7％至约10％、约7.5％至约10％、约8％至约10％、约8.5％至约10％、约9％至约10％、约9.5％至约10％、约1％至约5％、约1.5％至约5％、约2％至约5％、约2.5％至约5％、约3％至约5％、约3.5％至约5％、约4％至约5％、约4.5％至约5％、约1％至约4％、约1.5％至约4％、约2％至约4％、约2.5％至约4％、约3％至约4％、约3.5％至约4％、约1％至约3.5％、约1.5％至约3.5％、约2％至约3.5％、约2.5％至约3.5％、约3％至约3.5％、约1％至约3％、约1.5％至约3％、约2％至约3％、约2.5％至约3％、约1％至约2.5％、约1.5％至约2.5％、约2％至约2.5％、约1％至约2％、约1.5％至约2％或约1％至约1.5％的摩尔百分比存在。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，在脂质纳米颗粒中，至少一种聚乙二醇化脂质总共以约1％至约2％、约1.5％至约2％、或约1％至约1.5％；诸如但不限于约1％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％或约2％的摩尔百分比存在。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，在脂质纳米颗粒中，至少一种聚乙二醇化脂质以约2.1％至10％，例如约2.5％至约10％、约3％至约10％、约3.5％至约10％、约4％至约10％、约4.5％至约10％、约5％至约10％、约5.5％至约10％、约6％至约10％、约6.5％至约10％、约7％至约10％、约7.5％至约10％、约8％至约10％、约8.5％至约10％、约9％至约10％、约9.5％至约10％、约2.1％至约7％、约2.5％至约7％、约3％至约7％、约3.5％至约7％、约4％至约7％、约4.5％至约7％、约5％至约7％、约5.5％至约7％、约6％至约7％、约6.5％至约7％、约2.1％至约5％、约2.5％至约5％、约3％至约5％、约3.5％至约5％、约4％至约5％、约4.5％至约5％、约2.1％至约4％、约2.5％至约4％、约3％至约4％、约3.5％至约4％、约2.1％至约3.5％、约2.5％至约3.5％、约3％至约3.5％、约2.1％至约3％、约2.5％至约3％或约2.1％至约2.5％的摩尔百分比存在。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，在脂质纳米颗粒中，至少一种聚乙二醇化脂质总共以约2.1％至约5％、约2.5％至约5％、约3％至约5％、约3.5％至约5％、约4％至约5％、约4.5％至约5％、约2.1％至约4％、约2.5％至约4％、约3％至约4％、约3.5％至约4％、约2.1％至约3.5％、约2.5％至约3.5％、约3％至约3.5％、约2.1％至约3％、约2.5％至约3％或约2.1％至约2.5％；诸如但不限于约2.1％、约2.2％、约2.3％、约2.4％、约2.5％、约2.6％、约2.7％、约2.8％、约2.9％、约3％、约3.1％、约3.2％、约3.3％、约3.4％、约3.5％、约3.6％、约3.7％、约3.8％、约3.9％、约4％、约4.1％、约4.2％、约4.3％、约4.4％、约4.5％、约4.6％、约4.7％、约4.8％、约4.9％或约5％的摩尔百分比存在。
组织特异性靶向配体和聚乙二醇化脂质缀合物
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒(LNP)还包含至少一种组织特异性靶向配体，用于帮助、增强和/或增加LNP到所关注的靶位点的递送的目的。配体可以是任何生物分子，诸如肽、蛋白质、抗体、聚糖、糖、核酸、脂质或包含任何前述物质的缀合物，其识别特定细胞和组织所特有的受体或表面抗原。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，至少一种组织特异性靶向配体是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或GalNAc衍生物。术语“GalNAc衍生物”涵盖经修饰的GalNAc、官能化的GalNAc和GalNAc缀合物，其中一个或多个GalNAc分子(天然的或经修饰的)共价连接至一个或多个官能团或一类或多类示例性生物分子，诸如但不限于肽、蛋白质、抗体、聚糖、糖、核酸、脂质)。一种或多种GalNAc分子可与其缀合的生物分子本身通常有助于增加稳定性和/或抑制聚集。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，组织特异性靶配体(诸如GalNAc)与该配体所缀合的生物分子之间的摩尔比为1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9和1:10。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，组织特异性靶配体(诸如GalNAc)与该配体所缀合的生物分子之间的摩尔比为1:1(例如，单触角GalNAc)、2:1(双触角GalNAc)、3:1(三触角GalNAc)和4:1(四触角GalNAc)。缀合GalNAc诸如三触角GalNAc(GalNAc3)或四触角GalNAc(GalNAc4)可如本领域已知的那样合成(参见WO2017/084987和WO2013/166121)并如本领域熟知的那样化学缀合至脂质或PEG(参见Resen等人，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)(2001年)“体外和体内肝细胞上的脱唾液酸糖蛋白受体摄取和加工配体的大小上限的确定(Determination of the Upper Size Limit for Uptake andProcessing of Ligands by the Asialoglycoprotein Receptor on Hepatocytes inVitro and in Vivo)”第276卷，第375577-37584页)。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，组织特异性靶向配体与如本文定义和描述的聚乙二醇化脂质共价连接以形成聚乙二醇化脂质缀合物。示例性聚乙二醇化脂质如上所述，并且包括PEG-二月桂基氧基丙基；PEG-二肉豆蔻基氧基丙基；PEG-二棕榈基氧基丙基、PEG-二硬脂基氧基丙基；l-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(DMG-PEG)；PEG-二月桂基甘油；PEG-二棕榈酰甘油；PEG-二硬脂酰甘油；PEG-二月桂酰糖酰胺；PEG-二肉豆蔻酰糖酰胺；PEG-二棕榈酰糖酰胺；PEG-二硬脂酰糖酰胺；(l-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3',6'-二氧辛酰基]氨基甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)(PEG-胆固醇)；3,4-双十四烷基苄基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚(PEG-DMB)；l,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)(DSPE-PEG)；和1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-聚(乙二醇)-羟基(DSPE-PEG-OH)。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，本文提供的脂质纳米颗粒(LNP)包含DMG-PEG2000和DSPE-PEG2000。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，组织特异性靶向配体与GalNAc或GalNAc衍生物共价连接。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，聚乙二醇化脂质缀合物是单触角、双触角、三触角或四触角GalNAc-DSPE-PEG。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，聚乙二醇化脂质缀合物是单触角、双触角、三触角或四触角GalNAc-DSG-PEG。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，聚乙二醇化脂质缀合物是单触角、双触角、三触角或四触角GalNAc-DSPE-PEG2000。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，聚乙二醇化脂质缀合物是单触角、双触角、三触角或四触角GalNAc-DSG-PEG2000。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，聚乙二醇化脂质缀合物是三触角GalNAc-DSPE-PEG2000。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，聚乙二醇化脂质缀合物是三触角GalNAc-DSG-PEG2000。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，聚乙二醇化脂质缀合物是四触角GalNAc-DSPE-PEG2000。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，聚乙二醇化脂质缀合物是四触角GalNAc-DSG-PEG2000。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，在脂质纳米颗粒中，聚乙二醇化脂质缀合物以约0.1％至约10％，例如约0.2％至约10％、约0.3％至约10％、约0.4％至约10％、约0.5％至约10％、约0.6％至约10％、约0.7％至约10％、约0.8％至约10％、约0.9％至约10％、约1％至约10％、约1.5％至约10％、约2％至约10％、约2.5％至约10％、约3％至约10％、约3.5％至约10％、约4％至约10％、约4.5％至约10％、约5％至约10％、约5.5％至约10％、约6％至约10％、约6.5％至约10％、约7％至约10％、约7.5％至约10％、约8％至约10％、约8.5％至约10％、约9％至约10％、约9.5％至约10％、约0.1％至约5％、约0.2％至约5％、约0.3％至约5％、约0.4％至约5％、约0.5％至约5％、约0.6％至约5％、约0.7％至约5％、约0.8％至约5％、约0.9％至约10％、约1％至约5％、约1.5％至约5％、约2％至约5％、约2.5％至约5％、约3％至约5％、约3.5％至约5％、约4％至约5％、约4.5％至约5％、约0.1％至约3％、约0.2％至约3％、约0.3％至约3％、约0.4％至约3％、约0.5％至约3％、约0.6％至约3％、约0.7％至约3％、约0.8％至约3％、约0.9％至约3％、约1％至约3％、约1.5％至约3％、约2％至约3％、约2.5％至约3％、约0.1％至约2％、约0.2％至约2％、约0.3％至约2％、约0.4％至约2％、约0.5％至约2％、约0.6％至约2％、约0.7％至约2％、约0.8％至约2％、约0.9％至约2％、约1％至约2％、约1.5％至约2％、约0.1％至约1.5％、0.2％至约1.5％、约0.3％至约1.5％、约0.4％至约1.5％、约0.5％至约1.5％、约0.6％至约1.5％、约0.7％至约1.5％、约0.8％至约1.5％、约0.9％至约1.5％、约1％至约1.5％、约0.1％至约1％、0.2％至约1％、约0.3％至约1％、约0.4％至约1％、约0.5％至约1％、约0.6％至约1％、约0.7％至约1％、约0.8％至约1％或约0.9％至约1％的摩尔百分比存在。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，在脂质纳米颗粒中，聚乙二醇化脂质缀合物以约0.1％至约1.5％、约0.2％至约1.5％、约0.3％至约1.5％、约0.4％至约1.5％、约0.5％至约1.5％、约0.6％至约1.5％、约0.7％至约1.5％、约0.8％至约1.5％、约0.9％至约1.5％、约1％至约1.5％、约0.1％至约1％、约0.2％至约1％、约0.3％至约1％、约0.4％至约1％、约0.5％至约1％、约0.6％至约1％、约0.7％至约1％、约0.8％至约1％、或约0.9％至约1％；诸如但不限于至约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％或约1.5％的摩尔百分比存在。
脂质纳米颗粒(LNP)的其他组分
LNP的附加组分诸如缀合脂质也在本公开中考虑到。示例性缀合脂质包括但不限于聚唑啉(POZ)-脂质缀合物、聚酰胺-脂质缀合物(诸如ATTA-脂质缀合物)、阳离子聚合物脂质(CPL)缀合物以及其混合物。
此外，在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒(LNP)还包含免疫调节化合物，例如，通过共包封在LNP内或通过与治疗性核酸或上述LNP的任何一种组分缀合。免疫调节化合物，诸如地塞米松或经修饰地塞米松，可以帮助最小化免疫反应。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒(LNP)还包含地塞米松棕榈酸酯。
在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，除了阳离子脂质之外，脂质纳米颗粒还包含用于浓缩和/或包封核酸货物的试剂，诸如ceDNA。这种试剂在本文中也称为缩合剂或包封剂。没有限制，可以使用本领域已知的用于缩合和/或包封核酸的任何化合物，只要它是非融合的。换言之，能够缩合和/或包封核酸货物(例如，ceDNA)的试剂，但几乎没有或没有融合活性。不希望受理论束缚，缩合剂在不缩合/包封核酸(例如，ceDNA)时可能具有一些融合活性，但是用所述缩合剂形成的包封核酸的脂质纳米颗粒可以是非融合的。
总脂质与核酸比率
通常，制备脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)使得最终颗粒的总脂质与治疗性核酸(质量或重量)比率为约10:1至60:1，例如约15:1至约60:1、约20:1至约60:1、约25:1至约60:1、约30:1至约60:1、约35:1至约60:1、约40:1至约60:1、约45:1至约60:1、约50:1至约60:1、约55:1至约60:1、约10:1至约55:1、约15:1至约55:1、约20:1至约55:1、约25:1至约55:1、约30:1至约55:1、约35:1至约55:1、约40:1至约55:1、约45:1至约55:1、约50:1至约55:1、约10:1至约50:1、约15:1至约50:1、约20:1至约50:1、约25:1至约50:1、约30:1至约50:1、约35:1至约50:1、约40:1至约50:1、约45:1至约50:1、约10:1至约45:1、约15:1至约45:1、约20:1至约45:1、约25:1至约45:1、约30:1至约45:1、约35:1至约45:1、约40:1至约45:1、约10:1至约40:1、约15:1至约40:1、约20:1至约40:1、约25:1至约40:1、约30:1至约40:1、约35:1至约40:1、约10:1至约35:1、约15:1至约35:1、约20:1至约35:1、约25:1至约35:1、约30:1至约35:1、约10:1至约30:1、约15:1至约30:1、约20:1至约30:1、约25:1至约30:1、约10:1至约25:1、约15:1至约25:1、约20:1至约25:1、约10:1至约20:1、约15:1至约20:1或约10:1至约15:1。
克调节脂质和核酸的量以提供所需的N/P比率(即，可带正电荷的聚合物胺(N＝氮)基团与带负电荷的核酸磷酸(P)基团的比率)，例如，N/P比率为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更高。通常，脂质颗粒配制物的总脂质含量能够在约5mg/mL至约30mg/mL的范围内。
脂质纳米颗粒(LNP)的大小
根据本文的方面或实施方案中的任一者的一些实施方案，LNP的直径范围为约40nm至约120nm，例如约45nm至约120nm、约50nm至约120nm、约55nm至约120nm、约60nm至约120nm、约65nm至约120nm、约70nm至约120nm、约75nm至约120nm、约80nm至约120nm、约85nm至约120nm、约90nm至约120nm、约95nm至约120nm、约100nm至约120nm、约105nm至约120nm、约110nm至约120nm、约115nm至约120nm、约40nm至约110nm、约45nm至约110nm、约50nm至约110nm、约55nm至约110nm、约60nm至约110nm、约65nm至约110nm、约70nm至约110nm、约75nm至约110nm、约80nm至约110nm、约85nm至约110nm、约90nm至约110nm、约95nm至约110nm、约100nm至约110nm、约105nm至约110nm、约40nm至约100nm、约45nm至约100nm、约50nm至约100nm、约55nm至约100nm、约60nm至约100nm、约65nm至约100nm、约70nm至约100nm、约75nm至约100nm、约80nm至约100nm、约85nm至约100nm、约90nm至约100nm或约95nm至约100nm。
根据本文的方面或实施方案中的任一者的一些实施方案，LNP的直径小于约100nm，例如约40nm至约90nm、约45nm至约90nm、约50nm至约90nm、约55nm至约90nm、约60nm至约90nm、约65nm至约90nm、约70nm至约90nm、约75nm至约90nm、约80nm至约90nm、约85nm至约90nm、约40nm至约85nm、约45nm至约85nm、约50nm至约85nm、约55nm至约85nm、约60nm至约85nm、约65nm至约85nm、约70nm至约85nm、约75nm至约85nm、约80nm至约85nm、约40nm至约80nm、约45nm至约80nm、约50nm至约80nm、约55nm至约80nm、约60nm至约80nm、约65nm至约80nm、约70nm至约80nm、约75nm至约80nm、约40nm至约75nm、约45nm至约75nm、约50nm至约75nm、约55nm至约75nm、约60nm至约75nm、约65nm至约75nm、约70nm至约75nm、约40nm至约70nm、约45nm至约70nm、约50nm至约70nm、约55nm至约70nm、约60nm至约70nm或约65nm至约70nm。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，LNP的直径为约60nm至约85nm、约65nm至约85nm、约70nm至约85nm、约75nm至约85nm、约80nm至约85nm、约60nm至约80nm、约65nm至约80nm、约70nm至约80nm、约75nm至约80nm、约60nm至约75nm、约65nm至约75nm、约70nm至约75nm、约60nm至约70nm或约65nm至约70nm；诸如但不限于约60mm、约61mm、约62mm、约63mm、约64mm、约65mm、约66mm、约67mm、约68mm、约69mm、约70mm、约71mm、约72mm、约73mm、约74mm、约75mm、约76mm、约77mm、约78mm、约79mm、约80mm、约81mm、约82mm、约83mm、约84mm或约85mm。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的尺寸可以使用例如，Malvern Zetasizer Nano ZS(英国莫尔文(Malvern,UK))系统通过准弹性光散射来确定。
包含阳离子脂质、固醇、非阳离子脂质、聚乙二醇化脂质和任选组织特异性靶向配 体的LNP
根据本文的方面或实施方案中的任一者的一些实施方案，本文提供的脂质纳米颗粒包含至少一种如本文所述的阳离子脂质、至少一种固醇、至少一种非阳离子脂质和至少一种聚乙二醇化脂质。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，本文提供的脂质纳米颗粒基本上由至少一种本文所述的阳离子脂质、至少一种固醇、至少一种非阳离子脂质和至少一种聚乙二醇化脂质组成。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，本文提供的脂质纳米颗粒由至少一种如本文所述的阳离子脂质、至少一种固醇、至少一种非阳离子脂质和至少一种聚乙二醇化脂质组成。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，阳离子脂质:固醇:非阳离子脂质:聚乙二醇化脂质的摩尔比为约48(±5):10(±3):41(±5):2(±2)，例如约47.5:10.0:40.7:1.8或约47.5:10.0:40.7:3.0。
根据本文的方面或实施方案中的任一者的一些实施方案，本文提供的脂质纳米颗粒包含至少一种如本文所述的阳离子脂质、至少一种固醇、至少一种非阳离子脂质、至少一种聚乙二醇化脂质和组织特异性靶向配体。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，组织特异性靶向配体是GalNAc。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，本文提供的脂质纳米颗粒基本上由至少一种本文所述的阳离子脂质、至少一种固醇、至少一种非阳离子脂质、至少一种聚乙二醇化脂质和组织特异性靶向配体组成。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，本文提供的脂质纳米颗粒由至少一种如本文所述的阳离子脂质、至少一种固醇、至少一种非阳离子脂质、至少一种聚乙二醇化脂质和组织特异性靶向配体组成。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，组织特异性靶向配体与聚乙二醇化脂质缀合以形成聚乙二醇化脂质缀合物。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，聚乙二醇化脂质缀合物是单触角、双触角、三触角或四触角GalNAc-DSPE-PEG2000。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，聚乙二醇化脂质缀合物是四触角GalNAc-DSPE-PEG2000。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，阳离子脂质:固醇:非阳离子脂质:聚乙二醇化脂质:聚乙二醇化脂质缀合物的摩尔比为约48(±5):10(±3):41(±5):2(±2):1.5(±1)，例如47.5:10.0:40.2:1.8:0.5或47.5:10.0:39.5:2.5:0.5。
IV.治疗性核酸(TNA)
本公开提供了一种用于递送治疗性核酸(TNA)的基于脂质的平台。基于RNA的治疗剂的非限制性示例包含mRNA、反义RNA和寡核苷酸、核酶、适体、干扰RNA(RNAi)、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)。基于DNA的疗法的非限制性示例包括小环DNA、小基因、病毒DNA(例如，慢病毒或AAV基因组)或非病毒合成DNA载体、末端封闭的线性双链体DNA(ceDNA/CELiD)、质粒、杆粒、狗骨TMDNA载体、简约的免疫学定义的基因表达(MIDGE)-载体、非病毒迷你串DNA载体(线性-共价封闭的DNA载体)或哑铃形DNA最小载体(“哑铃DNA”)。因此，本公开的方面一般提供包括TNA的可电离脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)。
本发明还预期可以通过称作RNA干扰(RNAi)的过程下调特定蛋白质的细胞内水平的siRNA或miRNA为核酸治疗剂。在将siRNA或miRNA引入宿主细胞的胞质中之后，这些双链RNA构建体可以结合到称为RISC的蛋白质。siRNA或miRNA的有义链通过RISC复合物去除。RISC复合物当与互补mRNA组合时，切割mRNA并且释放切割的链。RNAi是通过诱导mRNA的特异性破坏而导致相应蛋白质的下调。
抑制mRNA翻译到蛋白质中的反义寡核苷酸(ASO)和核酶可以是核酸治疗剂。对于反义构建体，这些单链脱氧核酸具有与靶蛋白mRNA序列互补的序列，并且能够通过沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对与mRNA结合。这一结合阻止目标mRNA的翻译，和/或触发mRNA转录物的RNaseH降解。因此，反义寡核苷酸具有增加的作用特异性(即，特定疾病相关蛋白的下调)。
在本文所提供的任何方法和组合物中，治疗性核酸(TNA)可以是治疗性RNA。该治疗性RNA可以是mRNA翻译的抑配制物、RNA干扰的药剂(RNAi)、催化活性RNA分子(核酶)、转移RNA(tRNA)或结合mRNA转录物(ASO)的RNA、蛋白质或其它分子配体(适体)。在本文提供的任何方法中，RNAi的药剂可以是双链RNA、单链RNA、微RNA、短干扰RNA、短发夹RNA或三链体形成寡核苷酸。
在本文提供的任何方法组合物中，治疗性核酸(TNA)是治疗性DNA，诸如末端封闭的双链DNA(例如，ceDNA、CELiD、线性共价封闭的DNA(“迷你串”)、doggyboneTM、末端经前端粒封闭的DNA、哑铃状线性DNA、质粒、小环等)。本公开的一些实施方案基于包括可表达转基因(例如，治疗性核酸)的末端封闭的线性双链体(ceDNA)的方法和组合物。如本文所描述的ceDNA载体不存在由病毒衣壳内的有限空间所强加的封装局限。ceDNA载体是活真核生物产生的，其代表着原核生物产生的质粒DNA载体的替代方案。
ceDNA载体优选地具有线性和连续结构而不是非连续结构。相信线性和连续结构在受到细胞核酸内切酶攻击时更稳定，并且不太可能重组并引起诱变。因此，线性和连续结构的ceDNA载体是优选的实施方案。连续、线性、单链的分子内双链体ceDNA载体可以具有共价结合的末端，而不具有编码AAV衣壳蛋白的序列。这些ceDNA载体在结构上不同于质粒(包括本文所描述的ceDNA质粒)，该质粒是细菌来源的环状双链体核酸分子。质粒的互补链在变性后可以分离，从而产生两个核酸分子，而相比之下，ceDNA载体虽具有互补链，却是单个DNA分子，并且因此即使变性，也仍保持是单个分子。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，与质粒不同，ceDNA载体的产生可以没有原核类型的DNA碱基甲基化。因此，在结构方面(特别是线性对比环形)以及还根据用于产生和提纯这些不同物体的方法方面，以及还根据它们的DNA甲基化方面，即ceDNA-质粒属于原核类型而ceDNA载体属于真核类型，ceDNA载体和ceDNA质粒是不同的。
本文提供了具有共价封闭的末端的非病毒无衣壳ceDNA分子(ceDNA)。这些非病毒无衣壳ceDNA分子可以在许可宿主细胞中由含有定位在两个不同的反向末端重复(ITR)序列之间的异源基因(例如，转基因，尤其是治疗性转基因)的表达构建体(例如，ceDNA质粒、ceDNA-杆粒、ceDNA-杆状病毒或整合细胞系)产生，其中该ITR彼此不同。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，与野生型ITR序列(例如，AAV ITR)相比，通过缺失、插入和/或取代修饰ITR中的一者；并且ITR中的至少一者包含功能末端解析位点(TRS)和Rep结合位点。ceDNA载体优选地是双链体，例如，相对于分子的至少一部分是自互补的，诸如，表达盒(例如，ceDNA不是双链环状分子)。ceDNA载体具有共价封闭的末端，并且因此抵抗核酸外切酶消化(例如，核酸外切酶I或核酸外切酶III)，例如在37℃下维持超过一小时。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个方面，ceDNA载体在5'到3'方向上包括：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、所关注的核苷酸序列(例如，如本文所描述的表达盒)和第二AAV ITR。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，第一ITR(5'ITR)和第二ITR(3'ITR)相对于彼此不对称，也就是说，其彼此具有不同的3D空间构型。作为示例性实施方案，第一ITR可以是野生型ITR，并且第二ITR可以是突变或修饰ITR，或反过来，其中第一ITR可以是经突变的或经修饰的ITR，第二ITR可以是野生型ITR。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，第一ITR和第二ITR都经修饰但为不同的序列，或具有不同的修饰，或不是相同的经修饰的ITR并且具有不同的3D空间构型。换句话说，具有不对称ITR的ceDNA载体具有这样的ITR：其中一个ITR相对于WT-ITR的任何变化不反映在另一个ITR中；或可替代地，其中具有经修饰的不对称ITR对的不对称ITR可以具有相对于彼此不同的序列和不同的三维形状。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，ceDNA载体按照5'到3'方向包括：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复序列(ITR)、所关注的核苷酸序列(例如，如本文所述的表达盒)和第二AAV ITR，其中第一ITR(5'ITR)和第二ITR(3'ITR)相对于彼此是对称的或基本对称的，也就是说，ceDNA载体能够包括具有对称三维空间组构的ITR序列，使得其结构在几何空间中具有相同形状，或在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环。在这样的实施方案中，对称的ITR对或基本上对称的ITR对可以是修饰的ITR(例如，mod-ITR)，它不是野生型ITR。一个mod-ITR对可以具有相同的相对于野生型ITR具有一个或多个修饰的序列，并且彼此反向互补(反向)。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，经修饰的ITR对如本文所定义是大体上对称的，也就是说，经修饰的ITR对可以具有不同的序列，但具有对应或相同的对称三维形状。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，对称的ITR或基本上对称的ITR可以是如本文所述的野生型(WT-ITR)。也就是说，两个ITR都具有野生型序列，但不一定必须为来自相同AAV血清型的WT-ITR。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，一个WT-ITR可以来自一种AAV血清型，而另一个WT-ITR可以来自不同的AAV血清型。在这样的实施方案中，WT-ITR对如本文所定义是基本上对称的，即，它们可以具有一个或多个保守核苷酸修饰，同时仍然保留对称的三维空间组织。
本文提供的野生型或突变的或以其它方式修饰的ITR序列代表了用于产生ceDNA载体的表达构建体(例如，ceDNA-质粒、ce-DNA杆粒、ceDNA-杆状病毒)中包括的DNA序列。因此，从ceDNA-质粒或其它表达构建体产生的ceDNA载体中实际含有的ITR序列与由于在产生过程期间发生天然发生的变化(例如，复制误差)而产生的本文中提供的ITR序列可能相同或可能不同。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，本文所述的包括具有作为治疗性核酸序列的转基因的表达盒ceDNA载体可以操作性地连接到允许或控制转基因的表达的一或多个调节序列。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，多核苷酸包括第一ITR序列和第二ITR序列，其中所关注的核苷酸序列侧接第一和第二ITR序列，并且第一和第二ITR序列彼此不对称，或彼此对称。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，表达盒位于两个ITR之间，按以下顺序包括以下中的一种或多种：与转基因操作性连接的启动子、转录后调节元件以及聚腺苷酸化和终止信号。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，启动子是可调节-可诱导的或可抑制的。启动子可以是促进转基因转录的任何序列。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，启动子是CAG启动子或其变体。转录后调节元件是调节转基因表达的序列，作为非限制性示例，是产生增强作为治疗性核酸序列的转基因的表达的三级结构的任何序列。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，转录后调节元件包含WPRE。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，聚腺苷酸化和终止信号包括BGHpolyA。可以另外使用本领域已知的任何顺式调节元件或其组合，例如，SV40晚期多聚腺苷酸化信号上游增强子序列(USE)或其它转录后处理元件，包括但不限于单纯疱疹病毒或乙型肝炎病毒(HBV)的胸苷激酶基因。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，表达盒在5'到3'方向上的长度大于已知在AAV病毒粒子中被衣壳化的最大长度。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，长度大于4.6kb，或大于5kb，或大于6kb，或大于7kb。本文中举例说明了各种表达盒。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，表达盒可包括大于4000个核苷酸，诸如约5000个核苷酸，约10,000个核苷酸或约20,000个核苷酸、或约30,000个核苷酸、或约40,000个核苷酸或约50,000个核苷酸，或在约4000-10,000个核苷酸或10,000-50,000个核苷酸之间的任何范围，或大于50,000个核苷酸。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，表达盒还可包括内部核糖体进入位点(IRES)和/或2A元件。顺式调节元件包括(但不限于)：启动子、核糖开关、隔离子、mir可调节元件、转录后调节元件、组织和细胞类型特异性启动子以及增强子。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，ITR可以充当转基因的启动子。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，ceDNA载体包括调节转基因表达的附加组分，例如，用于控制和调节转基因的表达的调节开关，并且如果需要，可以包括作为杀灭开关的调节开关，从而能够使包括ceDNA载体的细胞实现可控的细胞死亡。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，ceDNA载体无衣壳，并且可以由依次对第一ITR、可表达的转基因盒和第二ITR进行编码的质粒获得，其中第一和/或第二ITR序列中的至少一个相对于对应的野生型AAV2 ITR序列突变。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，本文所公开的ceDNA载体用于治疗目的(例如，用于医学、诊断或兽医学用途)或免疫原性多肽。
表达盒可以包括作为治疗性核酸序列的任何转基因。在某些实施方案中，ceDNA载体包括受试者所关注的任何基因，包括一种或多种多肽、肽、核酶、肽核酸、siRNA、RNAi、反义寡核苷酸、反义多核苷酸、抗体、抗原结合片段、或其任何组合。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，本文所述的ceDNA载体的表达盒、表达构建体或供体序列中提供的序列可以针对宿主细胞进行密码子优化。如本文所用，术语“进行密码子优化”或“密码子优化”是指通过用如小鼠或人等所关注的脊椎动物的基因中使用频率较高或最高的密码子替换天然序列(例如，原核序列)的至少一个、超过一个或大量密码子来修饰核酸序列以增强其在该脊椎动物的细胞中的表达的过程。各种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定的偏好。
通常，密码子优化不会改变原始翻译蛋白的氨基酸序列。能够使用例如，Aptagen的Gene密码子优化和定制基因合成平台(Aptagen公司，2190 Fox Mill Rd.Suite300，Herndon，Va.20171)或其它公共数据库确定优化密码子。
许多生物体偏向于使用特定密码子编码以便特定氨基酸插入生长的肽链中。密码子偏好或密码子偏向(密码子使用在生物体之间的差异)是由遗传密码的简并性提供的，并且在许多生物体中都有据可查。密码子偏向通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，而信使RNA的翻译效率又被认为除其他外取决于被翻译密码子的特性和特定转移RNA(tRNA)分子的可用性。所选tRNA在细胞中的优势大体上反映了在肽合成中最常使用的密码子。因此，能够基于密码子优化来定制基因以使指定生物体中的基因表达最优。
考虑到可用于多种动物、植物和微生物物种的基因序列数量庞大，因此能计算出密码子使用的相对频率(Nakamura,Y.等人。《来自国际DNA序列数据库的密码子使用表：2000年状况》(Codon usage tabulated from the internationalDNA sequencedatabases:status for the year 2000)《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)第28卷，第292页(2000年))。
反向末端重复序列(ITR)
如本文所描述，ceDNA载体为无衣壳线性双链体DNA分子，其由具有共价封闭的末端的的互补DNA(线性、连续和非衣壳化结构)的连续链形成，其包括不同的或相对于彼此不对称的5'反向末端重复(ITR)序列和3'ITR序列。至少一个ITR包括功能性末端解链位点和复制蛋白结合位点(RPS)(有时称为复制性蛋白结合位点)，例如Rep结合位点。通常，ceDNA载体包括至少一个修饰的AAV反向末端重复序列(ITR)，即相对于另一个ITR的缺失、插入和/或替换，以及可表达的转基因。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，ITR中的至少一个是AAVITR，例如野生型AAV ITR。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，ITR中的至少一个相对于另一个ITR是经修饰的ITR-也就是说，ceDNA包含相对于彼此不对称的ITR。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，至少一种ITR是非功能ITR。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，ceDNA载体包含：(1)包含顺式调节元件、启动子和至少一种转基因的表达盒；或(2)与至少一个转基因操作地连接的启动子，以及(3)侧接所述表达盒的两个自身互补序列，例如ITR，其中ceDNA载体不与衣壳蛋白缔合。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，ceDNA载体包括在AAV基因组中发现的两个自互补序列，其中至少一个包括AAV的操作性Rep结合元件(RBE)和末端解链位点(TRS)或RBE的功能性变体，以及与转基因操作性地连接的一个或多个顺式调节元件。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，ceDNA载体包含调节转基因表达的附加组分，例如，用于控制和调节转基因的表达的调节开关，并且可以包括调节开关，该调节开关是能够使包含ceDNA载体的细胞发生受控细胞死亡的杀伤开关。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，两个自互补序列可以是来自任何已知的细小病毒、例如，依赖病毒诸如AAV(例如，AAV1-AAV12)的ITR序列。可以使用任何AAV血清型，包括(但不限于)经修饰的AAV2 ITR序列，其除了允许发夹二级结构形成的可变回文序列外，还保留了Rep结合位点(RBS)，诸如5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'和末端解链位点(TRS)。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，ITR可以是合成的。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，合成的ITR基于来自多于一种AAV血清型的ITR序列。在另一个实施方案中，合成ITR不包括基于AAV的序列。在又一个实施方案中，合成的ITR尽管仅具有一些或不具有源自AAV的序列，但是保留了上述的ITR结构。在一些方面中，合成ITR可以优先与野生型Rep或特定血清型的Rep相互作用，或者在一些情况下，将不被野生型Rep识别并且仅被突变的Rep识别。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，ITR是合成的ITR序列，其除了允许发夹二级结构形成的可变回文序列之外，还保留了功能性Rep结合位点(RBS)诸如5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3'和末端解链位点(TRS)。在一些示例中，经修饰的ITR序列从野生型AAV2 ITR的对应序列中保留RBS、TRS的序列以及Rep结合元件的结构和位置，形成ITR发夹二级结构中的一个ITR发夹二级结构的末端环部分。用于ceDNA载体的示例性ITR序列公开于表2至表9、表10A和表10B、SEQ ID NO：2、52、101-449和545-547中，并且部分ITR序列示于2018年9月7日提交的国际专利申请号PCT/US2018/049996的图26A至图26B中。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，ceDNA载体可包括ITR，其具有对应于2018年9月7日提交的国际专利申请号PCT/US2018/049996的表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、表10A和表10B中的任何一者或多者中所示的ITR序列或ITR部分序列中的修饰中的任一者的ITR中的修饰。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，ceDNA载体可以由还包括顺式调节元件的特定组合的表达构建体产生。顺式调节元件包括(但不限于)：启动子、核糖开关、隔离子、mir可调节元件、转录后调节元件、组织和细胞类型特异性启动子以及增强子。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，ITR可以充当转基因的启动子。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，ceDNA载体包括调节转基因表达的附加组分，例如如2018年9月7日提交的国际专利申请号PCT/US2018/049996中描述的用以调节转基因表达的调节开关，或可以杀死包括ceDNA载体的细胞的杀伤开关。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，表达盒还可以包括转录后元件以增强转基因的表达。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调节元件(WPRE)用于增强转基因的表达。可以使用其它转录后处理元件，诸如来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因或乙型肝炎病毒(HBV)的转录后元件。分泌序列可以连接到转基因，例如，VH-02和VK-A26序列。表达盒可以包括本领域中已知的多聚腺苷酸化序列或其变体，如，从牛BGHpA或病毒SV40pA分离的天然存在的序列，或合成序列。一些表达盒还可以包括SV40晚期聚A信号上游增强子(USE)序列。USE可以与SV40pA或异源聚A信号组合使用。
2018年9月7日提交的并且以全文引用的方式并入本文中的国际申请第PCT/US2018/050042号的图1A-1C展示非限制性的示例性ceDNA载体或ceDNA质粒的对应序列的示意图。ceDNA载体无衣壳，并且可以从按以下次序编码的质粒获得：第一ITR、可表达的转基因盒和第二ITR，其中第一和/或第二ITR序列中的至少一者相对于相应的野生型AAV2ITR序列突变。可表达的转基因盒优选依次包括以下中的一者或多者：增强子/启动子、ORF报告子(转基因)、转录后调节元件(例如，WPRE)以及聚腺苷酸化和终止信号(例如，BGH多聚腺苷酸)。
启动子
适合的启动子，包括上文所描述的那些启动子，可以来源于病毒并因此可以称为病毒启动子，或其可以来源于任何生物体，包括原核或真核生物体。适合的启动子可以用于通过任何RNA聚合酶(例如，pol I、pol II、pol III)来驱动表达。示例性启动子包括但不限于SV40早期启动子、小鼠乳房肿瘤病毒长末端重复(LTR)启动子；腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)；单纯疱疹病毒(HSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子(诸如CMV即刻早期启动子区(CMVTE)、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、人类U6小核启动子(U6，例如(Miyagishi等人，《自然·生物技术》(Nature Biotechnology)，第20卷，第497-500页(2002年))、增强的U6启动子(例如，Xia等人，《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)2003年9月1日；第31卷，第17期)、人类H1启动子(H1)、CAG启动子、人累α1-抗胰蛋白酶(HAAT)启动子(例如，等)。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，这些启动子在其下游含内含子的末端处被改变以包括一个或多个核酸酶切割位点。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，含有核酸酶切割位点的DNA与启动子DNA是无关的。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，启动子可以包括一个或多个特异性转录调节序列以进一步增强表达和/或更改其空间表达和/或暂时表达。启动子还可以包括末端增强子或阻遏子元件，其可以位于来自转录起始位点的多达几千个碱基对。启动子可以来源于包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子可以相对于发生表达的细胞、组织或器官或相对于发生表达的发育阶段，或响应于外部刺激((诸如生理学压力、病原体、金属离子或诱发剂)组成性或有差异地调节基因组分的表达。启动子的代表性示例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子和CMV IE启动子，以及下文所列的启动子。此类启动子和/或增强子可以用于表达任何所关注的基因，例如，治疗性蛋白)。例如，载体可以包括操作地连接到编码治疗性蛋白的核酸序列的启动子。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，操作地连接到编码序列的治疗性蛋白的所述启动子可以是来自猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子(诸如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复(LTR)启动子)、莫洛尼病毒启动子、禽白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子(诸如CMV即刻早期启动子)、埃-巴二氏病毒(EBV)启动子或劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，启动子还可以是来自人基因的启动子，诸如人泛素C(hUbC)、人肌动蛋白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白。启动子还可以是组织特异性启动子，诸如肝脏特异性启动子，诸如天然或合成的人α1-抗胰蛋白酶(HAAT)或转甲状腺素蛋白(TTR)。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，使用内源性ApoE经由存在于肝细胞表面上的低密度脂蛋白(LDL)受体将包括ceDNA载体的组合物特异性靶向肝细胞能够实现向肝脏的递送。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，使用的启动子是编码治疗性蛋白的基因的天然启动子。编码治疗性蛋白的相应基因的启动子和其他调节序列是已知的并且已被表征。所用的启动子区域还可包括一个或多个附加调节序列(例如，天然的)，诸如本领域中已知的增强子(例如，丝氨酸蛋白酶抑制剂增强子)。
根据本发明使用的合适启动子的非限制性示例包括例如，HAAT启动子、人EF1-α启动子或EF1-α启动子和大鼠EF1-α启动子的片段的CAG启动子。
聚腺苷酸化序列
该ceDNA载体中可包括编码多聚腺苷酸化序列的序列，以稳定由ceDNA载体表达的所述mRNA，并有助于核输出和翻译。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，ceDNA载体不包括聚腺苷酸化序列。在其它实施方案中，该载体包括至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少45个、至少50个或更多个腺嘌呤二核苷酸。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，聚腺苷酸化序列包括约43个核苷酸、约40-50个核苷酸、约40-55个核苷酸、约45-50个核苷酸、约35-50个核苷酸或它们之间的任何范围。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，可以从载体多核苷酸获得ceDNA，该载体多核苷酸编码可操作地定位在两个不同的反向末端重复序列(ITR)(例如，AAV ITR)之间的异源核酸，其中至少一个ITR包括末端解链位点和复制蛋白结合位点(RPS)，例如Rep结合位点(例如，wt AAV ITR)，并且其中一个ITR包括相对于另一个ITR(例如，功能性ITR)的缺失、插入和/或替换。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，宿主细胞并不表达病毒衣壳蛋白并且多核苷酸载体模板不含任何病毒衣壳编码序列。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，多核苷酸载体模板不含AAV衣壳基因，而且不含其他病毒的衣壳基因)。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，核酸分子还不含AAVRep蛋白编码序列。因此，在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，本发明的核酸分子不含功能性AAV cap和AAV rep基因二者。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，ceDNA载体不具有经修饰的ITR。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，ceDNA载体包括如本文所公开的调节开关(或在2018年9月7日提交的国际专利申请号PCT/US2018/049996中)。
V.ceDNA载体的产生
用于产生如本文所述的包含如本文所定义的不对称ITR对或对称ITR对的ceDNA载体的方法描述于2018年9月7日提交的PCT/US2018/049996的第IV部分中，该专利以引用方式整体并入本文。如本文所述，ceDNA载体可以例如通过包括以下步骤的方法获得：a)在能有效诱导在宿主细胞内产生ceDNA载体的条件下并持续足以诱导在宿主细胞内产生ceDNA载体的时间，在Rep蛋白的存在下孵育具有不含病毒衣壳编码序列的多核苷酸表达构建体模板(例如，ceDNA质粒、ceDNA杆粒和/或ceDNA杆状病毒)的宿主细胞(例如，昆虫细胞)群体，并且其中宿主细胞不包含病毒衣壳编码序列；以及b)从宿主细胞中收获并分离ceDNA载体。Rep蛋白的存在诱导具有经修饰的ITR的载体多核苷酸复制，从而在宿主细胞中产生ceDNA载体。
然而，没有表达病毒粒子(例如，AAV病毒粒子)。因此，没有大小限制，诸如在AAV或其它基于病毒的载体中天然强加的大小限制。
可以通过以下来确认从宿主细胞分离的所述ceDNA载体的存在：用在ceDNA载体上具有单个识别位点的限制酶来消化从宿主细胞分离的DNA，并在非变性凝胶上分析消化的DNA材料，以与线性和非连续DNA相比确认线性和连续DNA的特征带的存在。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，本发明提供了已将DNA载体多核苷酸表达模板(ceDNA模板)稳定地整合至其自身基因组中的宿主细胞系在非病毒DNA载体的生产中的用途，例如如在Lee,L.等人(2013)Plos One 8(8):e69879所述。优选地，Rep以约3的MOI加入宿主细胞中。当该宿主细胞系是哺乳动物细胞系，例如，HEK293细胞时，该细胞系可以具有稳定整合的多核苷酸载体模板，并且可以使用第二载体，诸如疱疹病毒将Rep蛋白引入细胞中，使得在Rep和辅助病毒存在下切除和扩增ceDNA。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，用于制备本文所描述的所述ceDNA载体的宿主细胞是昆虫细胞，并使用杆状病毒递送编码Rep蛋白的多核苷酸和用于ceDNA的非病毒DNA载体多核苷酸表达构建体模板。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，宿主细胞被工程化以表达Rep蛋白。
然后从宿主细胞中收获和分离ceDNA载体。从细胞采集和收集本文所描述的ceDNA载体的时间可以进行选择和优化，以实现高产率地产生ceDNA载体。例如，可以根据细胞活力、细胞形态、细胞生长等选择收取时间。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，细胞在足以产生ceDNA载体的条件下生长，并在杆状病毒感染后足以产生ceDNA载体的时间、但在大多数细胞因杆状病毒毒性而开始死亡之前进行收取。可以使用质粒纯化试剂盒，诸如，Qiagen Endo-Free Plasmid试剂盒分离DNA载体。为分离质粒而开发的其它方法也适用于DNA载体。通常，可以采用任何核酸纯化方法。
DNA载体可以通过所属领域的技术人员已知用于纯化DNA的任何手段来纯化。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，将ceDNA载体纯化为DNA分子。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，ceDNA载体被纯化为外泌体或微粒。ceDNA载体的存在可以如下证实：使用对DNA载体具有单个识别位点的限制酶消化从细胞中分离出的载体DNA，并且使用凝胶电泳术分析已消化和未消化的DNA材料，从而相较于线性和非连续DNA来证实线性和连续DNA的特征带的存在。
VI.脂质颗粒的制备
脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可以在TNA(例如，ceDNA)和脂质混合时自发形成。根据所需的粒度分布，可以使用例如，热桶挤出机，诸如，Lipex Extruder(北方脂质公司(Northern Lipids,Inc)，将所得纳米颗粒混合物挤出通过膜(例如，100nm截留值)。在某些情况下，可以省略挤出步骤。可以通过例如，透析或切向流过滤来实现乙醇去除和同时进行缓冲液交换。
通常，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可以通过本领域已知的任何方法形成。例如，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可以通过例如在美国专利申请公开号US2013/0037977、US2010/0015218、US2013/0156845、US2013/0164400、US2012/0225129和US2010/0130588中所述的方法制备，这些美国专利申请公开中的每一者的内容全文以引用方式并入本文。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，可以使用连续混合方法、直接稀释法或在线稀释法来制备脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)。US2007/0042031中描述了用于使用直接稀释法和在线稀释法制备脂质纳米颗粒的装置的方法和装置，其内容通过引用整体并入本文。美国专利申请公开号US2004/0142025中描述了使用逐步稀释法制备脂质纳米颗粒的方法和装置，该美国专利申请公开的内容全文以引用方式并入本文。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可以通过冲击喷射方法制备。通常，颗粒是通过将溶解在醇(例如乙醇)中的脂质与溶解在缓冲液，例如柠檬酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液、乙酸钠和氯化镁缓冲液、苹果酸缓冲液、苹果酸和氯化钠缓冲液或柠檬酸钠和氯化钠缓冲液的ceDNA混合形成的。脂质与ceDNA的混合比率可以是约45％-55％的脂质和约65％-45％的ceDNA。
脂质溶液可以含有公开的阳离子脂质、非阳离子脂质(例如，磷脂，诸如DSPC、DOPE和DOPC)、一种或多种聚乙二醇化脂质以及固醇(例如，胆固醇)，其在醇(例如，乙醇)中的总脂质浓度为5mg/mL-30mg/mL、更可能为5mg/mL-15mg/mL、最可能为9mg/mL-12mg/mL。在脂质溶液中，脂质的摩尔比对于阳离子脂质可在约25％-98％，诸如约35％-65％的范围内；对于非离子脂质为约0％-15％，诸如约0％-12％；对于聚乙二醇化脂质为约0％-15％，诸如约1％-6％；并且对于固醇为约％0-75％，诸如约30％-50％。
ceDNA溶液可以包括浓度范围为0.3mg/mL-1.0mg/mL，优选0.3mg/mL-0.9mg/mL的ceDNA缓冲溶液，pH范围为3.5-5。
为了形成LNP，在一个示例性但非限制性实施方案中，将两种液体加热到约15℃-40℃，优选地约30℃-40℃的温度，然后例如，在冲击射流混合器中混合，立即形成LNP。混合流速可在10mL/min-600mL/min的范围内。管ID可具有0.25mm至1.0mm的范围和10mL/min-600mL/min的总流速。流速和管ID的组合可具有将LNP的粒径控制在30nm和200nm之间的效果。然后可以将溶液与较高pH的缓冲溶液混合，混合比在1:1至1:3vol:vol范围内，优选地约1:2vol:vol。如果需要，这种缓冲溶液的温度可以在15℃-40℃或30℃-40℃范围内。然后混合的LNP可以进行阴离子交换过滤步骤。在阴离子交换之前，可以将混合的LNP孵育一段时间，例如，30min至2小时。孵育期间的温度可以在15℃-40℃或30-40℃的范围内。在孵育后，溶液通过过滤器过滤，诸如0.8μm过滤器，包含阴离子交换分离步骤。该过程可以使用1mmID到5mmID的管内径和10到2000mL/min的流速。
在形成之后，可以通过超滤过程浓缩和渗滤LNP，其中除去醇并将缓冲液更换为最终缓冲溶液，例如约pH 7(例如，约pH 6.9、约pH 7.0、约pH 7.1、约pH 7.2、约pH 7.3或约pH7.4)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
超滤过程可以使用切向流过滤形式(TFF)，使用30kD-500kD的膜标称分子量截留范围。膜形式是中空纤维或平板盒。具有适当截留分子量的TFF过程可以将LNP保留在渗余液中，并且滤液或渗透液含有醇；柠檬酸盐缓冲液废液和最终缓冲液废液。TFF过程是多步骤过程，初始浓度为1mg/mL-3mg/mL的ceDNA浓度。浓缩后，将LNP溶液对最终缓冲液进行10体积-20体积的渗滤，以去除醇并进行缓冲液交换。然后可以将材料再浓缩1倍-3倍。浓缩的LNP溶液可以无菌过滤。
VII.药物组合物和配制物
本文还提供了包括TNA脂质颗粒和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，本发明还涉及药物组合物，其包含如本文的方面或实施方案中的任一者的任何实施方案中所述的阳离子脂质，或如本文的方面或实施方案中的任一者的任何实施方案中所述的脂质纳米颗粒，以及药学上可接受的赋形剂。
通常，选择本发明的所述脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的平均直径以实现预期的治疗效果。
取决于所述脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的预期用途，可以改变组分的比例，并且可以使用例如内体释放参数(ERP)测定法来测量特定配制物的递送效率。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，ceDNA可以与颗粒的脂质部分复合或包封在脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的脂质位置。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，ceDNA可以完全包封在脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的脂质位置，从而保护它免于被核酸酶降解，例如在水溶液中。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，脂质颗粒(例如脂质纳米颗粒)中的ceDNA在脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)于37℃暴露于核酸酶至少约20分钟、30分钟、45分钟或60分钟后基本上没有降解。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中的ceDNA在该颗粒于血清中在37℃下孵育至少约30分钟、45分钟或60分钟或至少约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约22小时、约24小时、约26小时、约28小时、约30小时、约32小时、约34小时或约36小时后基本上不降解。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)对受试者，例如对哺乳动物诸如人类基本上是无毒的。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，包括本公开治疗性核酸的药物组合物可以配制在脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，包括治疗性核酸的脂质颗粒可以由所公开的阳离子脂质形成。在一些其他实施方案中，包括治疗性核酸的脂质颗粒可以由非阳离子脂质形成。在优选的实施方案中，本发明的脂质颗粒是含核酸的脂质颗粒，其由包含选自由以下组成的组的治疗性核酸的所公开的阳离子脂质形成：mRNA、反义RNA和寡核苷酸、核酶、适体、干扰RNA(RNAi)、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微小RNA(miRNA)、小环DNA、小基因、病毒DNA(例如慢病毒或AAV基因组)或非病毒合成DNA载体、末端封闭的线性双螺旋DNA(ceDNA/CELiD)、质粒、杆粒、doggyboneTMDNA载体、简约的免疫学定义的基因表达(MIDGE)载体、非病毒迷你串DNA载体(线性共价封闭的DNA载体)或哑铃形DNA最小载体(“哑铃DNA”)。
在另一个优选的实施方案中，本发明的脂质颗粒是含有核酸的脂质颗粒，其由非阳离子脂质和任选聚乙二醇化脂质或防止颗粒聚集的其他形式的缀合脂质形成。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，脂质颗粒配制物是水性溶液。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)配制物是冻干粉末。
根据一些方面，本公开提供了一种还包括一种或多种药物赋形剂的脂质颗粒配制物。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)配制物还包括蔗糖、tris、海藻糖和/或甘氨酸。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，本文公开的脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可掺入适合施用于受试者的药物组合物中，以体内递送至受试者的细胞、组织或器官。通常，该药物组合物包括本文公开的所述TNA脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)和药学上可接受的载体。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，本公开所述的TNA脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可以掺入适合于治疗性施用的期望途径(例如，肠胃外施用)的药物组合物中。还涵盖通过高压静脉内或动脉内输注以及如核内显微注射或胞质内注射的细胞内注射进行的被动组织转导。用于治疗目的的药物组合物能够配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合高ceDNA载体浓度的有序结构。无菌注射溶液可以通过将所需量的ceDNA载体化合物根据需要与上文列举的成分中的一种或组合一起并入适当的缓冲液中，接着进行过滤灭菌来制备。
如本文所公开的脂质颗粒可以并入适合于局部、全身、羊膜内、鞘内、颅内、动脉内、静脉内、淋巴内、腹膜内、皮下、气管、组织内(例如，肌肉内、心内、肝内、肾内、脑内)、鞘内、膀胱内、结膜(例如，眼眶外、眼眶内、眼眶后、视网膜内、视网膜下、脉络膜、脉络膜下、基质内、前房内和玻璃体内)、耳蜗内和粘膜(例如，口腔、直肠、鼻)施用的药物组合物。还涵盖通过高压静脉内或动脉内输注以及如核内显微注射或胞质内注射的细胞内注射进行的被动组织转导。
包括TNA脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的药物活性组合物可以被配制成将核酸中的转基因递送到接受者的细胞，从而引起所述转基因在其中进行治疗表达。组合物还可以包括药学上可接受的载剂。
用于治疗目的的药物组合物通常在制造和存储条件下是无菌的和稳定的。组合物可以配制成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合于高ceDNA载体浓度的有序结构。无菌注射溶液可以通过将所需量的ceDNA载体化合物根据需要与上文列举的成分中的一种或组合一起并入适当的缓冲液中，接着进行过滤灭菌来制备。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)是具有至少一个脂质双层的固体心颗粒。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)具有非双层结构，即非层状(即非双层)形态。不受限制地，该非双层形态可包括例如三维管、棒、立方对称等。脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的非层状形态(即，非双层结构)可以使用本领域的技术人员已知并使用的分析技术来确定。此类技术包括(但不限于)：低温透射电子显微镜(“Cryo-TEM”)、差示扫描量热法(“DSC”)、X射线衍射等。例如，脂质颗粒的形态(层状相对于非层状)可以很容易地进行评估，并使用例如Cryo-TEM分析如内容US2010/0130588中所描述来表征，该文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，具有非片层形态的脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)是电子致密的。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，本公开提供了结构上为单层或多层的脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)。在一些方面，本公开提供了包括多囊泡颗粒和/或基于泡沫的颗粒的脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)配制物。通过控制脂质组分的组成和浓度，可以控制缀合脂质从脂质颗粒中交换出来的速率，进而可以控制脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)融合的速率。此外，包括例如pH、温度或离子强度的其他变量可用于改变和/或控制脂质颗粒(例如脂质纳米颗粒)融合的速率。基于本公开，本领域普通技术人员将清楚可以用于控制脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)融合速率的其他方法。同样显而易见，通过控制该缀合脂质的组合物和浓度，可以控制脂质颗粒的大小。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，配制的阳离子脂质的pKa可以与LNP递送核酸的效力相关(参见Jayaraman等人，《应用化学》(AngewandteChemie)，国际版(2012年)，第51卷，第期34，第8529-8533页；Semple等人，《自然生物技术》，第28卷，第172-176页(2010年)，这两篇文献全文以引用方式并入)。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，pKa的优选范围为约5至约8。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，pKa的优选范围为约6至约7。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，优选pKa为约6.5。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，可以使用基于2-(p-甲苯胺)-6-萘磺酸(TNS)的荧光的测定法在脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中测定阳离子脂质的pKa。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，ceDNA在脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中包封可以通过进行膜不可渗透的荧光染料排除测定法来确定，例如测定法或/>测定法，该测定法使用与核酸缔合时荧光增强的染料。通常，通过将染料添加到脂质颗粒配制物中，测量所得的荧光，并与添加少量非离子清洁剂后观察到的荧光进行比较来确定包封。清洁剂介导的对脂质双层的破坏释放了包封的ceDNA，使其与不可渗透膜的染料相互作用。ceDNA的包封可以计算为E＝(Io-I)/Io，其中I和Io是指添加清洁剂之前和之后的荧光强度。
单位剂量
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，药物组合物可以单位剂型存在。单位剂量通常将适于药物组合物的一种或多种特定施用途径。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，单位剂型适于通过吸入施用。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，单位剂型适于通过汽化器施用。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，单位剂型适于通过喷雾器施用。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，单位剂型适于通过气雾器施用。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，单位剂量适于口服施用、经颊施用或舌下施用。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，单位剂型适于静脉内、肌肉内或皮下施用。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，单位剂型适于鞘内或脑室内施用。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，药物组合物被配制用于局部施用。可以与载剂材料组合以产生单个剂量的活性成分的量将通常是化合物产生治疗效果的量。
VIII.治疗方法
本文所述的脂质纳米颗粒和方法(例如，如本文所述的TNA脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))可用于将核酸序列(例如，治疗性核酸序列)引入宿主细胞。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，可以用来自治疗患者的适当生物标志物监测使用TNALNP(例如，本文所述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))将核酸序列引入宿主细胞以评估基因表达。
本文提供的LNP组合物可用于递送转基因(核酸序列)以用于各种目的。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，ceDNA载体(例如，本文所述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))可以多种方式使用，包括例如非原位、体外和体内应用、方法、诊断程序和/或基因治疗方案。
本文提供了治疗受试者的疾病或病症的方法，该方法包括将治疗有效量的TNALNP(例如，本文所述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))，任选地与药学上可接受的载体，引入受试者有需要的靶细胞(例如，肝细胞、肌肉细胞、肾细胞、神经元细胞或其他受影响的细胞类型)。实施的TNA LNP(例如，本文所述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))包含用于治疗疾病所关注的核苷酸序列。具体地，TNA可以包括与控制元件操作地连接的期望的外源DNA序列，当引入受试者中时，该控制元件能够指导由外源DNA序列编码的期望的多肽、蛋白质或寡核苷酸的转录。TNA LNP(例如，本文所述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))可以通过本文所述和本领域已知的任何合适的途径施用。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，靶细胞在人类受试者中。
本文提供了向有需要的受试者提供诊断或治疗有效量的TNA LNP(例如，如本文所述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))的方法，该方法包括向有需要的受试者的细胞内、组织或器官提供一定量的TNA LNP(例如，如本文所述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))；并且持续一段时间以使转基因能够从TNA LNP表达，从而向受试者提供诊断或治疗有效量的由TNA LNP表达的蛋白质、肽、核苷酸(例如，如本文所述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，受试者是人类。
本文提供了用于诊断、预防、治疗或改善受试者的疾病、病症、功能障碍、损伤、异常状况或创伤的至少一种或多种症状的方法。通常，该方法至少包括向有需要的受试者施用TNA LNP(例如，本文所述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))的步骤，其量和时间足以诊断、预防、治疗或改善该受试者的疾病、病症、功能障碍、损伤、异常状况或创伤的一种或多种症状。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，受试者是人类。
本文提供了方法，其使用TNA LNP作为工具来治疗一种或多种疾病或疾病状态的症状。有许多遗传疾病中的缺陷基因是已知的，并且通常分为两类：缺陷状态，通常是酶，一般以隐性方式遗传；和不平衡状态，其可以涉及调节蛋白或结构蛋白，并且通常但不总是以显性方式遗传。对于缺陷状态疾病，TNA LNP(例如，本文所述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))可用于递送转基因以将正常基因引入受影响的组织中进行替代疗法，以及在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，使用反义突变建立动物疾病模型。对于不平衡的疾病状态而言，TNA LNP(例如，本文所述的ceDNA载体脂质颗粒)可用于在模型系统中确立疾病状态，然后可用于抵消该疾病状态。因此，本文公开的TNA LNP(例如，ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))和方法能够治疗基因疾病。如本文所使用的，通过部分或完全拯救导致疾病或使其更严重的缺陷或不平衡，可以治疗疾病状态。
一般而言，TNA LNP(例如，ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))可用于递送根据上文描述的任何转基因，以治疗、预防或改善与涉及基因表达的任何病症相关的症状。说明性疾病状态包括但不限于：囊性纤维化(和肺的其它疾病)、A型血友病、B型血友病、地中海贫血、贫血和其它血液病症、AIDS、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩性侧索硬化、癫痫症和其它神经病症、癌症、糖尿病、肌营养不良症(例如，杜兴氏、贝克尔)、赫尔勒氏病、腺苷脱氨酶缺陷、代谢障碍、视网膜变性疾病(和眼部的其它疾病)、线粒体病(例如，莱博氏遗传性视神经病变(LHON)、雷氏综合征和亚急性硬化性脑病变)、肌病(例如，面肩胛肱骨型肌病(FSHD)和心肌病)、实体器官(例如，脑、肝脏、肾脏、心脏)的疾病等等。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，如本文公开的ceDNA载体可以有利地用于治疗患有代谢病症(例如，鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症)的受试者。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，本文所描述的TNA LNP可以用于治疗、改善和/或预防由基因或基因产物突变引起的疾病或病症。可用TNA LNP(例如，如本文所述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))治疗的示例性疾病或病症包括但不限于代谢疾病或病症(例如，法布里病、戈谢病、苯丙酮尿症(PKU)、糖原贮积病)；尿素循环疾病或病症(例如，鸟氨酸氨甲酰基转移酶(OTC)缺乏症)；溶酶体贮积疾病或病症(例如，异染性脑白质营养不良(MLD)、黏多糖贮积症II型(MPSII；亨特综合征))；肝脏疾病或病症(例如，进行性家族性肝内胆汁淤积症(PFIC))；血液疾病或病症(例如，血友病A和B、地中海贫血和贫血)；癌症和肿瘤，以及基因疾病或病症(例如，囊性纤维化)。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，TNA LNP(例如，ceDNA载体脂质颗粒)可用于在需要调节转基因(例如，编码激素或生长因子的转基因)表达水平的情况下递送异源核苷酸序列。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，TNA LNP(例如，ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))可用于校正导致疾病或病症的基因产物的异常水平和/或功能(例如，蛋白质的缺失或缺陷)。TNA LNP(例如，ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))可以产生功能性蛋白质和/或改变蛋白质的水平，用以减轻或减少由蛋白质缺乏或缺陷造成的特定疾病或病症引起的症状或赋予其益处。例如，OTC缺乏症的治疗可以通过产生功能性OTC酶来实现；血友病A和B的治疗可以通过改变因子VIII、因子IX和因子X的水平来实现；PKU的治疗可以通过改变苯丙氨酸羟化酶的水平来实现；法布里病或戈谢病的治疗可以通过分别产生功能性α半乳糖苷酶或β葡萄糖脑苷脂酶来实现；MFD或MPSII的治疗可以通过分别产生功能性芳基硫酸酯酶A或艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶来实现；囊性纤维化的治疗可以通过产生功能性囊性纤维化跨膜传导调节剂来实现；糖原贮积病的治疗可通过恢复功能性G6Pase酶功能来实现；并且PFIC的治疗可通过产生功能性ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2基因来实现。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，TNA LNP(例如，ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))可用于在体外或体内向细胞提供基于RNA的治疗剂。基于RNA的疗法的示例包括但不限于mRNA、反义RNA和寡核苷酸、核酶、适体、干扰RNA(RNAi)、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微小RNA(miRNA)。例如，TNA LNP(例如，ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))可用于在体外或体内向细胞提供反义核酸。例如，在转基因是RNAi分子的情况下，靶细胞中反义核酸或RNAi的表达会削弱细胞对特定蛋白质的表达。因此，为了减少特定蛋白质在有需要的受试者中的表达，可以施用作为RNAi分子或反义核酸的转基因。还可以将反义核酸在细胞体外施用以调节细胞生理，例如，优化细胞或组织培养系统。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，TNA LNP(例如，ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))可用于在体外或体内向细胞提供基于DNA的治疗剂。基于DNA的治疗剂的示例包括但不限于小环DNA、小基因、病毒DNA(例如，慢病毒或AAV基因组)或非病毒合成DNA载体、末端封闭的线性双链体DNA(ceDNA/CELiD)、质粒、杆粒、狗骨TMDNA载体、简约的免疫学定义的基因表达(MIDGE)-载体、非病毒迷你串DNA载体(线性-共价封闭的DNA载体)或哑铃形DNA最小载体(“哑铃DNA”)。例如，在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，ceDNA载体(例如，ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))可用于在体外或体内向细胞提供小环。例如，在转基因是小环DNA的情况下，靶细胞中小环DNA的表达会削弱细胞对特定蛋白质的表达。因此，为了减少特定蛋白质在有需要的受试者中的表达，可以施用作为小环DNA的转基因。小环DNA也可以在体外施用于细胞以调节细胞生理，例如，优化细胞或组织培养系统。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，由包括表达盒的TNA载体编码的示例性转基因包括但不限于：X、溶酶体酶(例如，与泰-萨氏病相关的己糖胺酶A或与亨特综合征/MPS II相关的艾杜糖醛酸硫酸酯酶)、促红细胞生成素、血管抑素、内皮抑素、超氧化物歧化酶、球蛋白、瘦蛋白、过氧化氢酶、酪氨酸羟化酶以及细胞因子(例如，干扰素、β-干扰素、干扰素-γ、白介素-2、白介素-4、白介素12、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、淋巴毒素等)、肽生长因子和激素(例如，生长激素、胰岛素、胰岛素样生长因子1和2、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子-3和4、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经胶质衍生生长因子(GDNF)、转化生长因子-a和-b等)、受体(例如，肿瘤坏死因子受体)。在一些示例性实施方案中，转基因编码对一个或多个期望的目标具有特异性的单克隆抗体。在一些示例性实施方案中，ceDNA载体编码超过一种转基因。在一些示例性实施方案中，转基因编码包括两种不同的所关注的多肽的融合蛋白。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，转基因编码如本文定义的抗体，包括全长抗体或抗体片段。在本文的方面和实施方案中的任一者的一些实施方案中，抗体是如本文所定义的抗原结合域或免疫球蛋白可变域序列。其他说明性的转基因序列编码自杀基因产物(胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素、细胞色素P450、氧胞苷激酶和肿瘤坏死因子)、将抗性赋予癌症疗法中所用的药物的蛋白质，以及肿瘤抑制基因产物。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，本公开涉及治疗受试者(例如，人类)的基因病症的方法，该方法包括向受试者施用有效量的如本文的方面或实施方案中的任一者所述的脂质纳米颗粒或其药物组合物。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，基因病症选自由以下组成的组：镰状细胞性贫血，黑色素瘤，血友病A(凝血因子VIII(FVIII)缺乏症)和血友病B(凝血因子IX(FIX)缺乏症)，囊性纤维化(CFTR)，家族性高胆固醇血症(LDL受体缺陷)，肝母细胞瘤，威尔逊病，苯丙酮尿症(PKU)，先天性肝卟啉症，遗传性肝代谢疾病，Lesch Nyhan综合征，镰状细胞性贫血，地中海贫血，色素性干皮病，范可尼贫血，色素性视网膜炎，共济失调毛细血管扩张症，布鲁姆综合征，视网膜母细胞瘤，粘多糖贮积病(例如，Hurler综合征(MPS I型)，Scheie综合征(MPS I S型)，Hurler-Scheie综合征(MPS I H-S型)，亨特综合征(MPS II型)，Sanfilippo A、B、C和D型(MPS IIIA、B、C和D型)，Morquio A和B型(MPS IVA和MPS IVB)，Maroteaux-Lamy综合征(MPS VI型)，Sly综合征(MPS VII型)，透明质酸酶缺乏症(MPS IX型))，Niemann-Pick病A/B、C1和C2型，法布里病，Schindler病，GM2-神经节苷脂沉积症II型(Sandhoff病)，Tay-Sachs病，异染性脑白质营养不良，Krabbe病，粘脂沉积症I、II/III和IV型，唾液酸贮积症I和II型，糖原贮积病I和II型(庞贝病)，戈谢病I、II和III型，胱氨酸病，巴顿病，天冬氨酰氨基葡萄糖尿症，Salla病，达农病(LAMP-2缺乏症)，溶酶体酸性脂肪酶(LAL)缺乏症，神经元蜡样脂褐质沉积症(CLN1-8、INCL和LINCL)，鞘脂症，半乳糖唾液酸中毒，肌萎缩侧索硬化症(ALS)，帕金森病，阿尔茨海默病，亨廷顿病，脊髓小脑共济失调，脊髓性肌萎缩症，弗里德赖希共济失调，杜氏肌营养不良症(DMD)，贝克尔肌营养不良症(BMD)，营养不良性大疱性表皮松解症(DEB)，外核苷酸焦磷酸酶1缺乏症，婴儿全身性动脉钙化(GACI)，利伯先天性黑矇(LeberCongenital Amaurosis)，Stargardt黄斑营养不良(ABCA4)，鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症，Usher综合征，年龄相关性黄斑变性(AMD)，α-1抗胰蛋白酶缺乏症，进行性家族性肝内胆汁淤积症(PFIC)I型(ATP8B1缺乏症)、II型(ABCB11)、III型(ABCB4)或IV型(TJP2)和组织蛋白酶A缺乏症。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，基因病症是血友病A。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，基因病症是血友病B。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，基因病症是苯丙酮尿症(PKU)。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，基因病症是威尔逊病。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，基因病症是戈谢病I、II或III型。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，基因病症是Stargardt黄斑营养不良。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，基因病症是LCA10。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，基因病症是Usher综合征。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，基因病症是湿性AMD。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，本公开涉及如本文的方面或实施方案中的任一者所述的脂质纳米颗粒或其药物组合物用于制造用于治疗受试者(例如，人类)的基因病症的药物的用途。示例性基因病症如上所述。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，通过药物治疗的基因病症是Stargardt黄斑营养不良。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，通过药物治疗的基因病症是LCA10。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，通过药物治疗的基因病症是Usher综合征。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，通过药物治疗的基因病症是湿性AMD。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，本公开涉及用于治疗受试者(例如，人类)的基因病症的如本文的方面或实施方案中的任一者所述的脂质纳米颗粒或其药物组合物。示例性基因病症如上所述。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，通过上述用途治疗的基因病症是Stargardt黄斑营养不良。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，通过上述用途治疗的基因病症是LCA10。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，通过上述用途治疗的基因病症是Usher综合征。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，通过上述用途治疗的基因病症是湿性AMD。
施用
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，可以将TNA LNP(例如，如本文所述的ceDNA载体脂质颗粒)施用于生物体以在体内转导细胞。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，可以将TNA LNP(例如，ceDNA载体脂质颗粒)施用于生物体以在体外转导细胞。
一般地，通过通常用于使分子最终与血液或组织细胞接触的任何途径施用。合适的施用此类核酸的方法是可获得的并且是本领域的技术人员公知的，并且虽然可以使用超过一种途径来施用特定的组合物，但特定的途径通常可以提供比另一途径更直接和更有效的反应。TNALNP(例如，ceDNA载体脂质颗粒)的示例性施用模式包括口服、经直肠、经粘膜、鼻内、吸入(例如，通过气雾剂)、经颊(例如，舌下)、经阴道、鞘内、眼内、经皮、内皮内、子宫内(或，卵内)、肠胃外(例如，静脉内、皮下、皮内、颅内、肌肉内[包括施用骨骼肌、隔膜肌和/或心肌)、胸膜内、大脑内和关节内)、表面(例如，皮肤和粘膜表面二者，包括气道表面和经皮施用)、淋巴管内等，以及直接组织或器官注射(例如，对肝脏、眼睛、骨骼肌、心肌、隔膜肌或脑)。
可以向受试者的任何部位施用TNA LNP，如ceDNA载体(例如，ceDNA LNP)，包括但不限于选自由以下组成的组的部位：脑、骨骼肌、平滑肌、心脏、膈膜、气道上皮、肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、皮肤和眼睛。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，也可以对肿瘤(例如，肿瘤或淋巴结内或附近)施用ceDNA LNP。在任何给定情况下最适合的途径将取决于所治疗、改善和/或预防的病状的性质和严重程度，以及所使用的特定ceDNA LNP的性质。另外，ceDNA允许通过单个载体或多个ceDNA载体(例如，ceDNA混合物)施用超过一种转基因。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，向骨骼肌施用ceDNALNP包括但不限于向四肢(例如，上臂、下臂、大腿和/或小腿)、背部、颈部、头部(例如，舌头)、胸部、腹部、骨盆/会阴和/或手指中的骨骼肌施用。ceDNA载体(例如，ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))可以通过静脉内施用、动脉内施用、腹膜内施用、肢体灌注(任选地，腿和/或手臂的隔离肢体灌注；参见例如Arruda等人，(2005年)《血液》(Blood)，第105卷，第3458-3464页)和/或直接肌肉内注射而递送到骨骼肌。在特定实施方案中，ceDNA LNP通过肢体灌注、任选地隔离肢体灌注(例如，静脉内或关节内施用)来施用受试者(例如，患有诸如DMD之类的肌营养不良症的受试者)的肢体(臂和/或腿)。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，ceDNA LNP可在不采用“流体动力学”技术的情况下施用。
将TNA LNP(例如，ceDNA LNP)施用于心肌包括施用于左心房、右心房、左心室、右心室和/或隔膜。TNA LNP(例如，ceDNA LNP)可以通过静脉内施用、动脉内施用诸如主动脉内施用、直接心脏注射(例如，进入左心房、右心房、左心室、右心室)和/或冠状动脉灌注递送至心肌。施用隔膜肌可以采用任何适合的方法，包括静脉内施用、动脉内施用和/或腹膜内施用。对平滑肌的施用可以通过任何适合的方法，包括静脉内施用、动脉内施用和/或腹膜内施用。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，可以施用于存在于平滑肌内、附近和/或平滑肌上的内皮细胞。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，将TNA LNP(例如，ceDNALNP)施用于骨骼肌、膈肌和/或心肌(例如，以治疗、改善和/或预防肌营养不良症或心脏病(例如，PAD或充血性心力衰竭)。
TNA LNP(例如，ceDNA LNP)可以施用于CNS(例如，施用于脑或眼睛)。可以将TNALNP(例如，ceDNA LNP)引入脊髓、脑干(延髓、脑桥)、中脑(下丘脑、丘脑、上丘脑、垂体腺、黑质、松果体)、小脑、端脑(纹状体，包括枕叶、颞叶、顶叶和额叶的大脑，皮质，基底神经节，海马和杏仁核)、边缘系统、新皮质、纹状体、大脑和下丘。也可以将TNA LNP(例如，ceDNA LNP)施用于眼睛的不同区域，诸如视网膜、角膜和/或视神经。可以将TNA LNP(例如，ceDNA LNP)递送到脑脊髓液中(例如，通过腰椎穿刺)。在血脑屏障已被扰动(例如，脑瘤或大脑梗塞)的情况下，TNA LNP(例如，ceDNA载体脂质颗粒)可以进一步通过血管内施用至CNS。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，TNA LNP(例如，ceDNALNP)可以通过本领域中已知的任何途径施用至CNS的所需区域，该途径包括但不限于：鞘内、眼内、大脑内、脑室内、静脉内(例如，在诸如甘露糖醇之类的糖的存在下)、鼻内、耳内、眼内(例如，玻璃体内、视网膜下、前房)和眼周(例如，眼球筋膜囊下区)递送，以及逆行递送到运动神经元的肌肉内递送。
根据本文的方面或实施方案中的任一者的一些实施方案，TNA LNP(例如，ceDNALNP)通过直接注射(例如，立体定向注射)以液体配制物施用至CNS中的所需区域或区室中。根据其他实施方案，TNA LNP(例如，ceDNA LNP)可以通过局部施加至所需区域或通过气雾剂配制物的鼻内施用来提供。可以通过局部施加液滴来施用眼睛。作为另一替代方案，ceDNA载体能够作为固体、缓释型配制物施用(参见例如美国专利号7,201,898，其全文以引用方式并入本文)。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，TNA LNP(例如，ceDNA LNP)可用于逆行转运，以治疗、改善和/或预防涉及运动神经元的疾病和病症(例如，肌萎缩性侧索硬化(ALS)；脊髓性肌萎缩(SMA)等)。例如，TNA LNP(例如，ceDNA LNP)可以被递送到肌肉组织，它可以从肌肉组织迁移到神经元中。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，可以重复施用治疗产品，直到达到适当的表达水平。因此，在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，可以多次施用和重复施用治疗性核酸。例如，治疗性核酸可以在第0天施用。在第0天进行初始治疗后，可以在用治疗性核酸进行初始治疗之后约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、或约3月、约4月、约5月、约6月、约7月、约8月、约9月、约10月、约11月、或约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年、约11年、约12年、约13年、约14年、约15年、约16年、约17年、约18年、约19年、约20年、约21年、约22年、约23年、约24年、约25年、约26年、约27年、约28年、约29年、约30年、约31年、约32年、约33年、约34年、约35年、约36年、约37年、约38年、约39年、约40年、约41年、约42年、约43年、约44年、约45年、约46年、约47年、约48年、约49年或约50年内进行第二次施用(重复剂量)。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，还可以包括一种或多种附加化合物。可以单独施用那些化合物，或另外的化合物可以包括在本发明的脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)。换句话说，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可以包括除TNA之外的其他化合物或至少不同于第一TNA的第二TNA。不受限制地，其它另外的化合物可以选自由以下组成的组：有机或无机的小分子或大分子、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、肽、蛋白质、肽类似物和其衍生物、拟肽、核酸、核酸类似物和衍生物、由生物材料制成的提取物或其任何组合。
在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，一种或多种附加化合物可以是治疗剂。治疗剂可以选自适合于治疗目的的任何类别。因此，可以从适合于治疗目的的任何类别中选择治疗剂。治疗剂可以根据治疗目的和所需的生物作用进行选择。例如，在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，如果LNP内的TNA可用于治疗癌症，则附加化合物可以是抗癌剂(例如，化学治疗剂、靶向癌症疗法(包括但不限于小分子、抗体或抗体-药物缀合物)。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，如果含有TNA的LNP可用于治疗感染，则附加化合物可为抗菌剂(例如，抗生素化合物或抗病毒化合物)。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，如果含有TNA的LNP可用于治疗免疫疾病或病症，则附加化合物可为调节免疫应答的化合物(例如，免疫抑制剂、免疫刺激化合物或调节一种或多种特定免疫途径的化合物)。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，含有诸如编码不同蛋白质的TNA之类的不同化合物或诸如治疗剂之类的不同化合物的不同脂质颗粒的不同混合物可以用于本发明的组合物和方法中。在本文的方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，附加化合物是免疫调节剂。例如，另外的化合物是免疫抑配制物。在本文的任何方面或实施方案的一些实施方案，附加化合物是免疫刺激性的。
实施例
通过说明而非限制的方式提供了以下实施例。本领域普通技术人员将理解，可使用下文描述的一般合成方法设计和合成本公开中设想到的脂质的范围。
实施例1：一般合成
使用以下方案1中描绘的类似合成方法设计和合成式I的脂质。化合物中的所有变量示于方案1中，即R1、R2、R3、R4、R5、R6a、R6b、X和n如式I中所定义。Rx是如所定义的R4，但在脂族链中少一个碳原子。
方案1
本公开的单酯脂质，即式I，是使用以下方案2中描绘的类似合成方法设计和合成的，其中X是-C(＝O))-。化合物中的所有变量示于方案1中，即R1、R2、R3、R4、R5、R6a、R6b、X和n如式I中所定义。Rx是如所定义的R4，但在脂族链中少一个碳原子。
方案2
方案1和方案2
参见方案1和方案2，在步骤1处，向酸2在二氯甲烷(DCM)中的搅拌溶液中添加4-二甲氨基吡啶(DMAP)，然后添加1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDCI)。将所得混合物在氮气(N2)气氛下在室温下搅拌15min。然后，滴加化合物1并将混合物搅拌过夜。在第二天，将反应用DCM稀释并用水和盐水洗涤。将有机层经无水硫酸钠(Na2SO4)干燥，并蒸发至干。使用0％-10％甲醇的DCM溶液作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法来纯化粗品。合并含有所需化合物的级分并蒸发，以得到化合物3(0.78g，54％)。
在步骤2处，向3的四氢呋喃(THF)溶液中添加氢化铝锂(LiAlH4)。将反应混合物在50℃加热过夜。在第二天，将反应冷却至0℃并滴加水以猝灭。随后，将反应滤过硅藻土，以得到粗产物4。将产物用于下一步而无需进一步纯化。
在步骤3中，将化合物5或5'(根据国际专利申请公开号WO2017/049245中所述的工序合成，该国际专利申请公开全文以引用方式并入本文)溶解在二甲基甲酰胺/甲醇混合物DMF:MeOH(1:1)中并加入4。将反应在室温下搅拌过夜。将产物用乙酸乙酯(EtOAc)萃取，并且将有机层用饱和碳酸氢钠水溶液(NaHCO3(水溶液))和盐水洗涤，并经无水Na2SO4干燥。将溶剂在真空下蒸发，并使用0％-10％ MeOH的DCM溶液作为洗脱剂通过柱色谱法纯化，以得到式I的阳离子脂质。
化合物5或5'可替代地根据以下在方案3中所描绘的工序来合成。Ry是如所定义的R5，但在脂族链中少一个碳原子。
方案3
参考方案3，向9-十七碳烯6在四氢呋喃(无水)中的冰冷溶液中滴加纯磷酸酐溶液7。将反应物搅拌30min，然后分批添加NaH。将反应混合物回流，冷却至0℃，用水猝灭，并用醚萃取。将有机层用水、盐水洗涤数次，经Na2SO4干燥并浓缩。将粗产物通过柱色谱法纯化，从而提供得到7.1g(93％产率)的纯品8。
将化合物8溶于EtOAc/MeOH混合物中，并使用湿的10％Pd/C-催化剂用H2还原。清洁转化提供化合物9。
化合物9(THF，冷却，并滴加LiAlH4。将反应混合物搅拌过夜，使其升温至室温，并且然后使用THF/H2O混合物(按体积1:1)猝灭。将反应混合物用EtOAc萃取并通过硅藻土过滤。将有机相用水、盐水洗涤两次，经Na2SO4干燥并浓缩。通过柱色谱法(CH2Cl2-EtOAc)纯化提供了化合物10。
将化合物10和链烷酸11溶解在DCM中，并且然后在室温下向这种溶液中添加DMAP和EDCI。在搅拌过夜后，将反应用水猝灭，用DCM稀释，并用NaHCO3(饱和水溶液)和盐水洗涤。将有机相经Na2SO4干燥并浓缩。柱色谱法纯化(己烷-EtOAc)提供了3.8g的化合物5或5'。
实施例2：脂质6的合成
下文还参考也在下文提供的方案4描述了用于合成脂质6的工序。
方案4
步骤1：N-(2-(二甲基氨基)乙基)壬酰胺(3a)的合成
向壬酸(2a)(1.0g，6.3mmol)在60mL的DCM中的搅拌溶液中添加DMAP(0.91g，7.5mmol)，然后添加EDCI(1.44g，7.5mmol)。将所得混合物在N2气氛下在室温下搅拌15min。然后，滴加N1,N1-二甲基乙烷-1,2-二胺(1a)(0.66g，7.5mmol)并将混合物搅拌过夜。在第二天，将反应用DCM稀释并用H2O和盐水洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥，并蒸发至干。使用0％-10％甲醇的DCM溶液作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法来纯化粗品。合并含有所需化合物的级分并蒸发，以得到化合物3a(0.78g，54％)。
步骤2：N1,N1-二甲基-N2-壬基乙烷-1,2-二胺(4a)的合成
向3a(0.78g，3.4mmol)的THF溶液中添加LiAlH4。将反应混合物在50℃加热过夜。在第二天，将反应冷却至0℃并滴加水以猝灭。随后，将反应滤过硅藻土，以得到粗产物4a(0.6g，82％)。将产物用于下一步而无需进一步纯化。
步骤3：8-((2-(二甲氨基)乙基)(壬基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯或脂质6的合成
将化合物5a(根据国际专利申请公开号WO2017/049245中所述的工序合成，该国际专利申请公开全文以引用方式并入本文)(0.6g，1.3mmol)溶解在20mL的DMF:MeOH(1:1)中并添加4a(0.35g，1.5mmol)。将反应在室温下搅拌过夜。将产物用EtOAc(200mL)萃取，并将有机层用饱和NaHCO3(水溶液)和盐水洗涤，并经无水Na2SO4干燥。将溶剂在真空下蒸发，并使用0％-10％甲醇的DCM溶液作为洗脱剂通过柱色谱法纯化，以得到脂质6(0.062g，10％)。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ4.85(五重峰,J＝6.2Hz,1H),2.57–2.48(m,2H),2.43–2.32(m,6H),2.31–2.25(m,J＝7.5Hz,2H),2.23(s,6H),1.66–1.34(m,8H),1.24(s,47H),0.86(t,J＝6.6Hz,9H)。
实施例3：脂质1的合成
下文还参考也在下文提供的方案5描述了用于合成脂质1的工序。
方案5
方案5的步骤1和步骤2如实施例2中所述。
8-溴辛酸二十一烷-11-基酯(5b)的合成
向二十一碳-11-醇(10.0g，32.0mmol)和8-溴辛酸(7.1g，44.8mmol)(二者均可商购获得)在250mL二氯甲烷(DCM)中的搅拌溶液中添加EDCI(6.1g，32.1mmol)，然后添加DMAP(392mg，3.21mmol)。将所得混合物在室温下在N2气氛下继续搅拌过夜。在第二天，将反应用DCM稀释，并用NaHCO3水溶液(250mL)和盐水洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥，并蒸发至干。使用0％-10％ EtOAc的己烷溶液作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法来纯化粗品。合并含有所需化合物的级分并蒸发，以得到5b(6.3g，38％)。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ4.84-4.88(m,1H),3.39(t,J＝6.0Hz,2H),2.28(t,J＝6.0Hz,2H),1.80–1.89(m,2H),1.25-1.62(m,43H),0.86(t,J＝6.0Hz,6H)。
步骤3：8-((2-(二甲基氨基)乙基)(壬基)氨基)辛酸二十一烷-11-基酯或脂质1的 合成
将化合物5b(4.34g，8.41mmol)溶解在5.0mL的DMF:MeOH(1:1)中并加入4a(2.0g，9.35mmol)。将反应在室温下搅拌过夜。将溶剂在真空下蒸发，并使用0％-10％甲醇的DCM溶液作为洗脱剂通过柱色谱法纯化，以得到脂质1(330mg，11％)。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ4.84-4.93m,1H),3.51-3.55(m,4H),2.98–3.03(m,4H),2.83(s,6H),2.26(t,J＝6.0Hz,2H),1.48–1.77(m,8H),1.23-1.44(m,57H),0.86(t,J＝6.0Hz,9H)。
实施例4：脂质3的合成
下文还参考也在下文提供的方案6描述了用于合成脂质3的工序。
方案6
方案6的步骤1和步骤2如实施例3中所述。
8-溴辛酸二十五烷-13-基酯(5c)的合成
使用与上面针对8-溴辛酸二十一烷-11-基酯(5b)的合成所述的类似工序，通过用可商购获得的二十五碳-13-醇替代起始材料二十一碳-11-醇，来合成化合物5c。
步骤3：8-((2-(二甲氨基)乙基)(壬基)氨基)辛酸二十五烷-13-基酯或脂质3的合 成
使用与上文针对脂质1的合成所述的类似工序，通过用化合物5c替代起始材料5b来制备脂质3。
实施例5：脂质7的合成
下文还参考也在下文提供的方案7描述了用于合成脂质7的工序。
方案7
步骤1：N-(2-(二甲基氨基)乙基)庚酰胺(3b)的合成
向庚酸(2b)(7.0g，80mmol)在20mL的DCM中的搅拌溶液中添加EDCI(20g，104mmol)。将所得混合物在N2气氛下在室温下搅拌15min。然后，添加溶解在10mL的DCM中的1a(7.1g，80mmol)，随后添加DMAP(0.3g，2.5mmol)并继续搅拌过夜。在第二天，将反应用DCM稀释并用H2O和盐水洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥，并蒸发至干。使用0％-10％甲醇的DCM溶液作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法来纯化粗品。合并含有所需化合物的级分并蒸发，以得到化合物3b(9.5g，59％)。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ6.0(宽s,1H),3.3(dd,2H),2.4(dd,J＝6,2H),2.2(s,6H),2.16(dd,J＝6,2H),1.9-1.5(m,4H),1.3-1.2(m,7H),087(t,3H)。
步骤2：N1-庚基-N2,N2-二甲基乙烷-1,2-二胺(4b)的合成
向3b(3g，15mmol)在THF(80mL)中的溶液中添加0℃的LiAlH42M在THF(15mL，30mmol)中的溶液。将反应混合物加热至回流过夜。在第二天，将反应冷却至0℃并滴加水(3mL)以猝灭。随后，将反应滤过硅藻土，以得到粗产物4b。使用0％-10％甲醇/NH3(0.1％)的DCM溶液作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法来纯化粗品。合并含有所需化合物的级分并蒸发，以得到4b(1.3g，46％)。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ2.67(dd,J＝6,2H),2.59(dd,J＝7,2H),2.40(dd,J＝6,2H),2.20(s,6H),1.50-1.40(m,3H),1.30-1.15(m,9H),0.87(t,3H)。[C11H26N2]的MS实测值为187.2[M+H]+，计算值为186.3。
步骤3：8-((2-(二甲基氨基)乙基)(庚基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯或脂质7的合 成
将化合物5a(6g，13mmol)溶解在20mL的DMF:MeOH(1:1)中，并添加4b(2.65g，14mmol)。将反应在室温下搅拌过夜。将溶剂在真空下蒸发，并使用0％-10％甲醇的DCM溶液作为洗脱剂通过柱色谱法纯化，以得到脂质7(0.5g，6％)。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ4.85(五重峰,J＝6.2Hz,1H),3.10-2.90(m,2H),2.88-2.80(m,6H),2.43(s,6H),2.27(dd,2H),1.67-1.34(m,8H),1.30-1.2(m,45H),0.86(t,9H)。[C36H74NO2]的MS实测值为567.5[M+H]+，计算值为566.6。
实施例6：脂质10的合成
下文还参考也在下文提供的方案8描述了用于合成脂质10的工序。
方案8
步骤1：N-(2-(二甲基氨基)乙基)十一酰胺(3c)的合成
向十一烷酸(2c)(5.27g，28.3mmol)在250mL的DCM的搅拌溶液中添加DMAP(4.49g，36.8mmol)，然后添加EDCI(6.3g，36.0mmol)。将所得混合物在N2气氛下在室温下搅拌15min。然后，滴加1a(3.03g，34.4mmol)并继续搅拌过夜。在第二天，将反应用DCM稀释并用H2O和盐水洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥，并蒸发至干。使用0％-10％甲醇的DCM溶液作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法来纯化粗品。合并含有所需化合物的级分并蒸发，以得到3(6.94g，95％产率)。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δppm:3.25-3.35(m,2H),2.38–2.44(m,2H),2.22(s,6H),2.12-2.22(m,2H),1.55-1.62(m,2H),1.18–1.32(br s,14H),0.80–0.90(m,3H)。
步骤2：N1,N1-二甲基-N2-十一烷基乙烷-1,2-二胺(4c)的合成
向3c(5.97g，23.3mmol)在90mL的THF中的冰冷溶液中添加23.3mL的2N LiAlH4在THF(46.6mmol)中的溶液。将反应混合物在80℃搅拌过夜。将反应冷却至0℃并滴加水以猝灭。随后，将反应滤过硅藻土，将滤液浓缩并通过色谱法(DMC-MeOH-NH3)纯化以提供4.2g的化合物4c(4.2g，75％产率)。1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ:2.66(t,J＝6.3Hz,2H),2.58(t,J＝7.14Hz,2H),2.40(t,J＝6.3Hz,2H),2.21(s,6H),1.42–1.54(m,2H),1.41–1.54(m,16H),1.24(0.86(t,J＝6.3Hz,3H)。
步骤3：脂质10的8-((2-(二甲基氨基)乙基)(壬基)氨基)辛酸二十一烷-11-基酯 的合成
将化合物5a(0.91g，2.0mmol)溶解在50mL的EtOH中，并添加4c(1.6g，7.0mmol)。将反应在65℃-75℃下搅拌过夜。将反应混合物浓缩并使用DCM-MeOH-NH3作为洗脱剂通过柱色谱法纯化，以得到脂质10(142mg，12％)。1H NMR(300MHz,dmso-d6)δ:4.70–4.82(m,1H),2.90–3.0(m,2H),2.78-2.88(m,2H),2.52–2.62(m,10H),2.20–2.30(m,2H),1.55–1.35(m,10H),1.15–1.35(m,46H),0.75–0.90(9H)。[C40H82N2O2]的MS实测值为623.6[M+H]+，计算值为622.6(精确质量)。
实施例7：脂质11的合成
下文还参考也在下文提供的方案9描述了用于合成脂质11的工序。
方案9
方案9的步骤1和步骤2如实施例3中所述。
步骤3：6-((2-(二甲基氨基)乙基)(壬基)氨基)己酸3-辛基十一烷基酯或脂质11 的合成
将化合物5d(1.36g，2.95mmol-合成如下所述)溶解在13mL的EtOH中并添加4a(1.21g，5.89mmol)。将反应在65℃-75℃下搅拌过夜。将反应混合物浓缩并使用DCM-MeOH-NH3作为洗脱剂通过柱色谱法纯化两次，以得到纯的脂质11(142mg，12％)。1H NMR(300MHz,dmso-d6)δ:4.02(t,J＝6.6Hz,2H),2.90–3.00(m,2H),2.75–2.85(m,2H),2.61(s,6H),2.50-2.60(m,4H),2.27(t,J＝7.4Hz,2H),1.15-1.60(m,53H),0.80-0.90(m,9H)。[C38H78N2O2]的MS实测值为595.2[M+H]+，计算值为594.61(精确质量)。
3-辛基十一碳-2-烯酸乙酯(8a)的合成
向9-十七烷酮(6a，5.98g，23.5mmol)在200mL的THF(无水)中的冰冷溶液中滴加纯2-(二乙氧基磷酰基)乙酸乙酯(7a)(40.0g，178mmol)。将反应搅拌30min，然后分批添加NaH(6.25g，157mmol，60％，呈油状物)。将反应混合物回流18小时，冷却至0℃，用300mL水淬灭，并用醚萃取。将有机层用水、盐水洗涤数次，经Na2SO4干燥并浓缩。将粗产物通过柱色谱法纯化，从而提供7.1g(93％产率)的纯品8a。1H NMR(300MHz,d-氯仿)δppm:5.60(s,1H),4.14(q,J＝7.1Hz,2H),2.60-2.54(m,2H),2.12-2.08(m,2H),1.50-1.20(m,27H),0.95-0.82(m,6H)。
3-辛基十一烷酸乙酯9a的合成
将化合物9a(7.05g，21.7mmol)溶解在220mL的EtOAc和100mL的MeOH中，并使用1.2g湿的10％Pd/C催化剂用H2(1atm)还原。清洁转化提供7.0g(99％产率)的化合物7。1HNMR(300MHz,d-氯仿)δ(ppm),J(Hz):4.12(q,J＝7.1Hz,2H),2.20(d,J＝6.9,2H),1.90–1.80(m,1H),1.35–1.20(m,33H),1.90-1.81(m,6H)。
3-辛基十一碳-1-醇(10a)的合成
将化合物9a(7.0g，21.4mmol)溶解在16mL的THF中，冷却至0℃，并滴加LiAlH4(16mL，2M的THF溶液，32.2mmol)。将反应混合物搅拌过夜，使其升温至室温，并且然后通过添加30mL的THF/H2O混合物(按体积1:1)在0℃下猝灭。将反应混合物用EtOAc萃取并通过硅藻土过滤。将有机相用水、盐水洗涤两次，经Na2SO4干燥并浓缩。通过柱色谱法(CH2Cl2-EtOAc)纯化以97％产率提供了6.0g的化合物10a。1H NMR(300MHz,d-氯仿)δppm:3.66(t,J＝6.9Hz,2H),1.51(m,2H),1.41(br s,1H),1.10-1.29(m,29H),1.81-1.90(m,6H)。
6-溴己酸3-辛基十一烷基酯(5d)的合成
将化合物10a(3.5g，12.3mmol)和11a(2.9g，14.9mmol—商购可得)溶解在25mL的二氯甲烷中，并且然后在室温下向此溶液中添加DMAP(190mg，1.55mmol)和EDCI(2.95g，15.4mmol)。在搅拌过夜后，将反应用水猝灭，用二氯甲烷稀释，并用NaHCO3(饱和水溶液)和盐水洗涤。将有机相经Na2SO4干燥并浓缩。柱色谱法纯化(己烷-EtOAc)以67％的产率提供3.8g的化合物5d。1H NMR(300MHz,d-氯仿)δppm:4.08(t,J＝7.14Hz,2H),3.40(t,J＝6.6Hz,2H),2.30(t,J＝7.14Hz,2H),1.92–1.80(m,2H),1.70-1.20(m,36H),1.92–1.80(m,6H)
实施例8：包含季胺或季铵阳离子的阳离子脂质的合成
通过在乙腈(CH3CN)和氯仿(CHCl3)中用氯甲烷(CH3Cl)处理，可将如上所述的脂质1至11中的每一者和式I的脂质转化为其对应的包含季胺或季铵阳离子的脂质。
实施例9：脂质纳米颗粒的制备
以大约10:1到30:1的总脂质与ceDNA重量比制备脂质纳米颗粒(LNP)。简而言之，本公开的阳离子脂质、非阳离子脂质(例如，二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC))、提供膜完整性的组分(例如，固醇，例如，胆固醇)和缀合脂质分子(例如，聚乙二醇化脂质缀合物)例如，1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油，平均PEG分子量为2000(“PEG-DMG”))以例如，47.5:10.0:40.7:1.8、47.5:10.0:39.5:3.0或47.5:10.0:40.2:2.3的摩尔比溶解在醇(例如，乙醇)中。在缓冲溶液中将ceDNA稀释至所需浓度。例如，将ceDNA在包括乙酸钠、乙酸钠和氯化镁、柠檬酸、苹果酸或苹果酸和氯化钠的缓冲溶液中稀释至0.1mg/mL至0.25mg/mL的浓度。在一个示例中，将ceDNA在10mM至50mM柠檬酸盐缓冲液(pH4)中稀释至0.2mg/mL。使用例如注射器泵或撞击喷射混合器，将含醇脂质溶液与ceDNA水性溶液以约1:5至1:3(体积/体积)的比率混合，总流速高于10ml/min。在一个示例中，将含醇脂质溶液与ceDNA水性溶液以约1:3(体积/体积)的比率混合，流速为12ml/min。去除醇，并且通过透析将缓冲液替换为PBS。可替代地，使用离心管将缓冲液替换为PBS。通过例如，透析或切向流过滤实现醇去除和同时交换缓冲液。将获得的脂质纳米颗粒通过0.2μm孔径无菌过滤器过滤。
在一项研究中，使用包括摩尔比47.5:10.0:40.7:1.8的参考脂质A、DSPC、胆固醇和DMG-PEG2000的脂质溶液作为对照制备包括示例性ceDNA的脂质纳米颗粒。在一些研究中，组织特异性靶配体如N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)包括在本公开的包含参考脂质A、参考脂质B、MC3或阳离子脂质的配制物中。MC3是(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯，也称为DLin-MC3-DMA并且具有以下结构：
GalNAc配体诸如三触角GalNAc(GalNAc3)或四触角GalNAc(GalNAc4)可如本领域已知的那样合成(参见例如WO2017/084987和WO2013/166121)并如本领域熟知的那样化学缀合至脂质或PEG(参见Resen等人，《生物化学杂志》(2001年)“体外和体内肝细胞上的脱唾液酸糖蛋白受体摄取和加工配体的大小上限的确定(Determination of the Upper SizeLimit for Uptake and Processing of Ligands by the Asialoglycoprotein Receptoron Hepatocytes in Vitro and in Vivo)”第276卷，第375577-37584页)。制备缓冲溶液中的ceDNA水溶液。脂质溶液和ceDNA溶液在NanoAssembler上使用内部程序以12mL/min的总流速和1:3(v/v)的脂质与ceDNA比率混合。
表1A：测试材料施用-研究1比较式(I)阳离子脂质与参考脂质A
表1B：测试材料施用-将多种式(I)阳离子脂质彼此进行比较以及与参考脂质A、B 和MC3进行比较的研究
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No.＝数目；IV＝静脉内；ROA＝施用途径；LNP＝脂质纳米颗粒；IVIS＝体内成像阶段；BW＝体重
表2A：LNP组合物的描述-研究1比较式(I)阳离子脂质与参考脂质A
DSPC＝二硬脂酰基磷脂酰胆碱；Chol＝胆固醇；DMG-PEG2000＝l-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG2000-DMG)；GalNAc＝N-乙酰半乳糖胺；GalNAc4＝四触角GalNAc
表2B：LNP组合物的描述-研究2将多种式(I)阳离子脂质彼此进行比较以及与参考 脂质A、B和MC3进行比较
DSPC＝二硬脂酰基磷脂酰胆碱；Chol＝胆固醇；DMG-PEG2000＝l-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG2000-DMG)；GalNAc＝N-乙酰半乳糖胺；GalNAc4＝四触角GalNAc
包含参考脂质A、参考脂质B和MC3的LNP用作阳性对照。
实施例10：脂质纳米颗粒的临床前体内研究
进行临床前研究以评估用LNP配制的ceDNA-荧光素酶在小鼠中的体内表达和耐受性。这些LNP包含参考脂质A、参考脂质B或作为阳性对照的MC3，或本公开的阳离子脂质。这些临床前研究中涉及的研究设计和程序如下所述。
材料和方法
物种(数量、性别、年龄)：CD-1雄性小鼠，在研究1中约4周龄并且在研究2中约6-8周龄。
笼侧观察：每天进行笼侧观察。
临床观察：在研究1和研究2两者中在第0天、第1天、第2天、第3天、第4天和第7天(安乐死前)进行临床观察。每个例外都进行了额外的观察。如果适用的话，在与上述相同的日子记录所有动物的体重。根据需要记录额外的体重。
剂量施用：所有组的测试制品(LNP:ceDNA-Luc)在第0天通过静脉施用至尾侧静脉，以5mL/kg的体积投配。剂量水平在研究1中为0.25mg/kg，并且在研究2中为0.5mg/kg。
生命成像：在第4天，通过2.5mL/kg的腹腔内(IP)注射，将150mg/kg(60mg/mL)的荧光素施用给所有动物。每次荧光素给药后≤15分钟；根据下文所述的体内成像方案，所有动物都进行了IVIS成像阶段。
体内IVIS成像方案
·荧光素储备粉末在标称-20℃下储存。
·将配制的荧光素于2℃-8℃下避光储存在1mL等分试样中。
·配制的荧光素在2℃-8℃下避光可稳定长达3周，并且在室温(RT)下可稳定约12小时。
·将足够体积的荧光素溶解在PBS中，达到60mg/mL的目标浓度，并根据需要用5-MNaOH(约0.5μl/mg荧光素)和HCl(约0.5μl/mg荧光素)将其调节至pH＝7.4。
·根据方案制备适当的量，包括至少约50％的过量。
注射和成像
·剃掉动物的毛发(根据需要)。
·根据方案，经由IP以60mg/mL在PBS中注射150mg/kg荧光素。
·可以在施用后即刻或至多15分钟进行成像。
·将异氟醚蒸发器设置为1％-3％(通常为2.5％)，以便在成像阶段期间麻醉动物。
·成像阶段的异氟醚麻醉：
ο将动物放入异氟醚室，等待异氟醚生效，约2分钟-3分钟。
ο确保IVIS机器侧面的麻醉水平位于“开启”位置。
ο将动物放入IVIS机器
使用最高灵敏度设置执行所需的采集方案。
结果和讨论
研究1
研究1进行的目的是评价本公开的示例性脂质(即脂质6)被配制为LNP的能力，以及当LNP-ceDNA-荧光素酶组合物以0.25mg/kg的剂量施用于小鼠时的体内表达和耐受性。
作为一般规则，0.15或更低的多分散性指数(PDI)表明形成的LNP的大小具有良好的均匀性，并且90％的包封效率(EE)指示令人满意的包封率。均用脂质6但以不同的DMG-PEG2000量配制并且具有相应调整的胆固醇量的LNP 2、LNP 3和LNP 4表现出低于0.1的优异PDI值和大于95％的EE值。
如图1所示，LNP 2、LNP 3和LNP 4(即，包含作为阳离子脂质的脂质6和作为核苷酸货物的ceDNA-荧光素酶的LNP)在第4天表现出与用参考脂类A和ceDNA-荧光素酶配制的LNP1的表达等同的良好体内荧光素酶表达水平。
研究2
研究2的目的是评价本公开的几种示例性脂质，即，待配制为LNP(即，分别为LNP10、LNP 8和LNP 9)的脂质1、脂质7和脂质11的能力，以及当以0.5mg/kg的剂量将LNP-ceDNA-荧光素酶组合物施用于小鼠时的体内表达和耐受性。还将本发明的这些LNP组合物的表达和耐受性与用参考脂质A、参考脂质B和MC3(均具有与式(I)脂质不同的头基)配制的LNP组合物进行比较。所有配制的LNP组合物具有令人满意的包封效率和多分散指数。
如图2A所示，LNP 8、LNP 9和LNP 10(即，分别包含脂质7、脂质11和脂质1的LNP)在第4天表现出良好的体内荧光素酶表达水平。值得注意的是，分别用脂质7和脂质11配制的LNP 8和LNP 9的荧光素酶表达水平高于用MC3配制的LNP 6的荧光素酶表达水平。此外，图2B显示，即使在0.5mg/kg(其为研究1中施加的剂量水平的两倍)下，各自用本公开的阳离子脂质配制的LNP 8、LNP 9和LNP 10在治疗后第4天都实现了完全体重恢复，从而表明这些LNP组合物在小鼠中是良好耐受的。
参考文献和等效文献
本申请全文中引用的所有专利和其他出版物(包括参考文献、授权的专利、公开的专利申请和共同未决的专利申请)以引用的方式明确地并入本文，以描述和公开例如在此类出版物中描述的可以与本文所述的技术结合使用的方法。提供这些出版物仅仅是出于其在本申请的提交日期之前的公开内容而提供。关于这一点，任何内容都不应被解释为承认发明者由于在先发明或任何其他原因而无权早于这种公开内容。关于这些文件的日期的所有声明或关于内容的陈述都是基于申请人可获得的信息，并且不等同于承认这些文件的日期或内容的正确性。
本公开的实施方案的描述并非旨在穷举或将本公开限制于所公开的精确形式。尽管本文出于说明性目的描述了本公开的特定实施方案和实施例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开的范围内可以进行各种等效修改。例如，虽然方法步骤或功能以给定的次序呈现，但是替代的实施方案可以以不同的次序执行功能，或者功能可以基本上同时执行。本文提供的本公开的教导可以适当地应用于其他程序或方法。本文描述的各种实施方案可以进行组合以提供其他实施方案。如果需要，可以修改本公开的各方面以采用上述参考文献和申请的组合物、功能和概念来提供本公开的又一实施方案。而且，由于生物学功能等效性的考虑，可以在不影响生物学或化学作用的种类或数量的情况下对蛋白结构进行一些改变。可以根据详细描述对本公开进行这些和其他改变。意图所有这些修改包括在所附权利要求书的范围内。
任何前述实施方案的特定要素都可以进行组合或替代其他实施方案中的要素。此外，尽管已经在这些实施方案的上下文中描述了与本公开的某些实施方案相关联的优点，但是其他实施方案也可以表现出这样的优点，并且并非所有实施方案都需要为了落入本公开的范围内而表现出这样的优点。
通过以下实施例进一步说明本文所述的技术，这些实施例决不应解释为进一步限制。应当理解，本发明不以任何方式限制于本文所述的特定方法、方案和试剂等，因此可以变化。本文中所用的术语仅是出于描述特定实施方案的目的，而无意于限制本发明的范围，本发明的范围仅仅由权利要求限定。

Claims (93)

1.一种由式I表示的阳离子脂质：
或其药学上可接受的盐，其中：
R'不存在，为氢或C1-C3烷基；前提条件是当R'为氢或C1-C3烷基时，R'、R1和R2全部附接的氮原子被质子化；
R1和R2各自独立地为氢或C1-C3烷基；
R3为C3-C10亚烷基或C3-C10亚烯基；
R4为C1-C16非支链烷基、C2-C16非支链烯基、或其中：
R4a和R4b各自独立地为C1-C16非支链烷基或C2-C16非支链烯基；
R5不存在，为C1-C8亚烷基或C2-C8亚烯基；
R6a和R6b各自独立地为C7-C14烷基或C7-C14烯基；
X是-OC(＝O)-、-SC(＝O)-、-OC(＝S)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)S-、-S-S-、-C(Ra)＝N-、-N＝C(Ra)-、-C(Ra)＝NO-、-O-N＝C(Ra)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)-、-NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)O-、-OSi(Ra)2O-、-C(＝O)(CRa 2)C(＝O)O-、或OC(＝O)(CRa 2)C(＝O)-；其中：
Ra每次出现时独立地为氢或C1-6烷基；并且
n是选自1、2、3、4、5和6的整数。
2.根据权利要求1所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中X是-OC(＝O)-、-SC(＝O)-、-OC(＝S)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)S-或-S-S-。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的阳离子脂质，其中所述脂质由式II表示：
或其药学上可接受的盐，其中n是选自1、2、3和4的整数。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的阳离子脂质，其中所述脂质由式III表示：
或其药学上可接受的盐。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中R1和R2各自独立地为氢、C1-C2烷基、或C2-C3烯基。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中R'、R1和R2各自独立地为氢或C1-C2烷基。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的阳离子脂质，其中所述脂质由式IV表示：
或其药学上可接受的盐。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中R5不存在或为C1-C8亚烷基。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中R5不存在或为C2亚烷基。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的阳离子脂质，其中所述脂质由式V表示：
或其药学上可接受的盐。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中R4为C1-C14非支链烷基、C2-C14非支链烯基或
其中R4a和R4b各自独立地为C1-C12非支链烷基或C2-C12非支链烯基。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中R4为C2-C12非支链烷基或C2-C12非支链烯基。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中R4为C5-C12非支链烷基。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中R4为C6非支链烷基、C7非支链烷基、C8非支链烷基、C9非支链烷基、C10非支链烷基、C11非支链烷基或C12非支链烷基。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中R4为C9非支链烷基。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中R3为C3-C8亚烷基或C3-C8亚烯基。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中R3为C3-C7亚烷基。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中R3为C7亚烷基。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中R3为C5亚烷基。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中R6a和R6b各自独立地为C7-C12烷基或C7-C12烯基。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中R6a和R6b各自独立地为C7烷基、C8烷基、C9烷基、C10烷基、C11烷基、C12烷基、C8烯基、C10烯基、C11烯基或C12烯基。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中R6a和R6b各自独立地为C7烷基、C8烷基、C9烷基、C10烷基、C11烷基或C12烷基。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中R6a和R6b含有彼此相等数量的碳原子。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中R6a和R6b是相同的。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中R6a和R6b两者均为C7烷基、或C8烷基、或C9烷基、或C10烷基、或C11烷基、或C12烷基。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中R6a和R6b两者均为C8烷基。
27.根据权利要求1至25中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中R6a和R6b两者均为C9烷基。
28.根据权利要求1至25中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中R6a和R6b两者均为C10烷基。
29.根据权利要求1至25中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中R6a和R6b两者均为C11烷基。
30.根据权利要求1至25中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中R6a和R6b两者均为C12烷基。
31.根据权利要求1至22中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中R6a和R6b各自含有彼此不同数量的碳原子。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐，其中R'不存在。
33.根据权利要求1所述的阳离子脂质，其中所述脂质是：
或其药学上可接受的盐。
34.一种脂质纳米颗粒(LNP)，所述脂质纳米颗粒包含根据权利要求1至33中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐；以及治疗性核酸。
35.根据权利要求34所述的脂质纳米颗粒，其中所述治疗性核酸被包封在所述脂质中。
36.根据权利要求34或权利要求35所述的脂质纳米颗粒，其中所述治疗性核酸选自由以下组成的组：小基因、质粒、小环、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、核酶、ceDNA、迷你串、doggyboneTM、末端经前端粒封闭的DNA或哑铃状线性DNA、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微小RNA(miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA、DNA病毒载体、病毒RNA载体、非病毒载体以及它们的任何组合。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述治疗性核酸是末端封闭的DNA(ceDNA)。
38.根据权利要求34至36中任一项所述的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒进一步包含固醇。
39.根据权利要求38所述的脂质纳米颗粒，其中所述固醇是胆固醇或β-谷固醇。
40.根据权利要求34至39中任一项所述的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒进一步包含非阳离子脂质。
41.根据权利要求40所述的脂质纳米颗粒，其中所述非阳离子脂质选自由以下组成的组：二硬脂酰基-sn-甘油-磷酸乙醇胺(DSPE)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰基磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、单甲基磷脂酰乙醇胺(诸如16-O-单甲基PE)、二甲基磷脂酰乙醇胺(诸如16-O-二甲基PE)、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)、鞘磷脂(SM)、二肉豆酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆酰基磷脂酰甘油(DMPG)、二硬脂酰基磷脂酰甘油(DSPG)、二芥酰基磷脂酰胆碱(DEPC)、棕榈酰基油酰磷脂酰甘油(POPG)、二反式油酰基磷脂酰乙醇胺(DEPE)、1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DLPE)；1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPHyPE)；卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷、磷酸二鲸蜡酯、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰基磷脂酰胆碱以及它们的混合物。
42.根据权利要求40或权利要求41所述的脂质纳米颗粒，其中所述非阳离子脂质选自由以下组成的组：二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。
43.根据权利要求34至42中任一项所述的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒进一步包含至少一种聚乙二醇化脂质。
44.根据权利要求43所述的脂质纳米颗粒，其中所述至少一种聚乙二醇化脂质选自由以下组成的组：PEG-二月桂氧基丙基；PEG-二肉豆蔻基氧基丙基；PEG-二棕榈基氧基丙基、PEG-二硬脂基氧基丙基；l-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰甘油-PEG(DMG-PEG)；二硬脂酰-外消旋-甘油-PEG(DSG-PEG)；
PEG-二月桂基甘油；PEG-二棕榈酰甘油；PEG-二硬脂酰甘油；
PEG-二月桂酰糖酰胺；PEG-二肉豆蔻酰糖酰胺；PEG-二棕榈酰糖酰胺；PEG-二硬脂酰糖酰胺；(l-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3',6'-二氧辛酰基]氨基甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)(PEG-胆固醇)；3,4-双十四烷氧基苄基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚(PEG-DMB)、l,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N[甲氧基(聚乙二醇)(DSPE-PEG)、和l,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-聚(乙二醇)-羟基(DSPE-PEG-OH)。
45.根据权利要求43或权利要求44所述的脂质纳米颗粒，其中所述至少一种聚乙二醇化脂质是DMG-PEG、DSPE-PEG、DSPE-PEG-OH、DSG-PEG或它们的组合。
46.根据权利要求43至45中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述至少一种聚乙二醇化脂质是DMG-PEG2000、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-OH、DSG-PEG2000或它们的组合。
47.根据权利要求34至46中任一项所述的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒进一步包含组织特异性靶向配体。
48.根据权利要求47所述的脂质纳米颗粒，其中所述组织特异性靶向配体是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)或GalNAc衍生物。
49.根据权利要求47或权利要求48所述的脂质纳米颗粒，其中所述组织特异性靶向配体与所述至少一种聚乙二醇化脂质共价连接以形成聚乙二醇化脂质缀合物。
50.根据权利要求49所述的脂质纳米颗粒，其中所述聚乙二醇化脂质缀合物包含与DSPE-PEG2000共价连接的四触角GalNAc。
51.根据权利要求34至50中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述阳离子脂质以约30％至约80％的摩尔百分比存在。
52.根据权利要求38至51中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述固醇以约20％至约50％的摩尔百分比存在。
53.根据权利要求40至52中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述非阳离子脂质以约2％至约20％的摩尔百分比存在。
54.根据权利要求43至53中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述至少一种聚乙二醇化脂质以约2.1％至约10％的摩尔百分比存在。
55.根据权利要求49至54中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述聚乙二醇化脂质缀合物以约0.1％至约10％的摩尔百分比存在。
56.根据权利要求34所述的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒进一步包含固醇、非阳离子脂质、聚乙二醇化脂质和聚乙二醇化脂质缀合物。
57.根据权利要求34至56中任一项所述的脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒进一步包含地塞米松棕榈酸酯。
58.根据权利要求34至57中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述颗粒的总脂质与ceDNA的比率为约10:1至约40:1。
59.根据权利要求34至58中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的直径范围为约40nm至约120nm。
60.根据权利要求34至59中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的直径小于约100nm。
61.根据权利要求34至60中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述纳米颗粒的直径为约60nm至约80nm。
62.根据权利要求34至61中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述ceDNA是末端封闭的线性双链体DNA。
63.根据权利要求62所述的脂质纳米颗粒，其中所述ceDNA包含表达盒，并且其中所述表达盒包含启动子序列和转基因。
64.根据权利要求63所述的脂质纳米颗粒，其中所述表达盒包含聚腺苷酸化序列。
65.根据权利要求62至64中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述ceDNA包含至少一个反向末端重复序列(ITR)，所述ITR侧接于所述表达盒的5'或3'端。
66.根据权利要求65所述的脂质纳米颗粒，其中所述表达盒侧接两个ITR，其中所述两个ITR包括一个5'ITR和一个3'ITR。
67.根据权利要求65所述的脂质纳米颗粒，其中所述表达盒连接至3'端的ITR(3'ITR)。
68.根据权利要求65所述的脂质纳米颗粒，其中所述表达盒连接至5'端的ITR(5'ITR)。
69.根据权利要求65所述的脂质纳米颗粒，其中所述至少一个ITR是源自AAV血清型的ITR、源自鹅病毒的ITR、源自B19病毒的ITR、源自细小病毒的野生型ITR。
70.根据权利要求69所述的脂质纳米颗粒，其中所述AAV血清型选自由以下组成的组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。
71.根据权利要求66至70中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述5'ITR和所述3'ITR中的至少一者是野生型AAV ITR。
72.根据权利要求66至71中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述5'ITR和所述3'ITR中的至少一者是经修饰或突变的ITR。
73.根据权利要求66至72中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述5'ITR和所述3'ITR是对称的。
74.根据权利要求66至73中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述5'ITR和所述3'ITR是不对称的。
75.根据权利要求66至74中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述ceDNA进一步包含在5'ITR与所述表达盒之间的间隔序列。
76.根据权利要求66至75中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述ceDNA进一步包含在3'ITR与所述表达盒之间的间隔序列。
77.根据权利要求75或权利要求76所述的脂质纳米颗粒，其中所述间隔序列的长度为至少5个碱基对长。
78.根据权利要求37至77中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述ceDNA具有切口或空位。
79.根据权利要求37至78中任一项所述的脂质纳米颗粒，其中所述ceDNA是CELiD、基于DNA的小环、MIDGE、迷你串DNA、在表达盒的5'端和3'端包含两个ITR发夹结构的哑铃形线性双链体末端封闭的DNA、或doggyboneTMDNA。
80.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至34中任一项所述的阳离子脂质或根据权利要求34至79中任一项所述的脂质纳米颗粒，以及药学上可接受的赋形剂。
81.一种治疗受试者的基因病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求34至79中任一项所述的脂质纳米颗粒，或有效量的根据权利要求80所述的药物组合物。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述受试者是人类。
83.根据权利要求81或权利要求82所述的方法，其中所述基因病症选自由以下组成的组：镰状细胞性贫血，黑色素瘤，血友病A(凝血因子VIII(FVIII)缺乏症)和血友病B(凝血因子IX(FIX)缺乏症)，囊性纤维化(CFTR)，家族性高胆固醇血症(LDL受体缺陷)，肝母细胞瘤，威尔逊病，苯丙酮尿症(PKU)，先天性肝卟啉症，遗传性肝代谢疾病，Lesch Nyhan综合征，镰状细胞性贫血，地中海贫血，色素性干皮病，范可尼贫血，色素性视网膜炎，共济失调毛细血管扩张症，布鲁姆综合征，视网膜母细胞瘤，粘多糖贮积病(例如，Hurler综合征(MPS I型)，Scheie综合征(MPS I S型)，Hurler-Scheie综合征(MPS I H-S型)，亨特综合征(MPS II型)，Sanfilippo A、B、C和D型(MPS III A、B、C和D型)，Morquio A和B型(MPS IVA和MPSIVB)，Maroteaux-Lamy综合征(MPS VI型)，Sly综合征(MPS VII型)，透明质酸酶缺乏症(MPSIX型))，Niemann-Pick病A/B、C1和C2型，法布里病，Schindler病，GM2-神经节苷脂沉积症II型(Sandhoff病)，Tay-Sachs病，异染性脑白质营养不良，Krabbe病，粘脂沉积症I、II/III和IV型，唾液酸贮积症I和II型，糖原贮积病I和II型(庞贝病)，戈谢病I、II和III型，胱氨酸病，巴顿病，天冬氨酰氨基葡萄糖尿症，Salla病，达农病(LAMP-2缺乏症)，溶酶体酸性脂肪酶(LAL)缺乏症，神经元蜡样脂褐质沉积症(CLN1-8、INCL和LINCL)，鞘脂症，半乳糖唾液酸中毒，肌萎缩侧索硬化症(ALS)，帕金森病，阿尔茨海默病，亨廷顿病，脊髓小脑共济失调，脊髓性肌萎缩症，弗里德赖希共济失调，杜氏肌营养不良症(DMD)，贝克尔肌营养不良症(BMD)，营养不良性大疱性表皮松解症(DEB)，外核苷酸焦磷酸酶1缺乏症，婴儿全身性动脉钙化(GACI)，利伯先天性黑矇(Leber Congenital Amaurosis)，Stargardt黄斑营养不良(ABCA4)，鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症，Usher综合征，年龄相关性黄斑变性(AMD)，α-1抗胰蛋白酶缺乏症，进行性家族性肝内胆汁淤积症(PFIC)I型(ATP8B1缺乏症)、II型(ABCB11)、III型(ABCB4)或IV型(TJP2)和组织蛋白酶A缺乏症。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述基因病症是血友病A。
85.根据权利要求83所述的方法，其中所述基因病症是血友病B。
86.根据权利要求83所述的方法，其中所述基因病症是苯丙酮尿症(PKU)。
87.根据权利要求83所述的方法，其中所述基因病症是威尔逊病。
88.根据权利要求83所述的方法，其中所述基因病症是戈谢病I型、II型或III型。
89.根据权利要求83所述的方法，其中所述基因病症是Stargardt黄斑营养不良。
90.根据权利要求83所述的方法，其中所述基因病症是LCA10。
91.根据权利要求83所述的方法，其中所述基因病症是Usher综合征。
92.根据权利要求83所述的方法，其中所述基因病症是湿性AMD。
93.根据权利要求83所述的方法，其中所述基因病症是营养不良性大疱性表皮松解症(DEB)。
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