CN116437964A

CN116437964A - 用于将多核苷酸封装成减小尺寸的脂质纳米颗粒以及其新型调配物的方法

Info

Publication number: CN116437964A
Application number: CN202180063144.XA
Authority: CN
Inventors: N·加拉格; M·G·斯坦顿; G·范斯坦
Original assignee: Generational Biology Co
Current assignee: Generational Biology Co
Priority date: 2020-07-17
Filing date: 2021-07-16
Publication date: 2023-07-14
Also published as: IL299896A; US20230320993A1; EP4181948A2; AU2021307952A1; WO2022016089A3; MX2023000806A; KR20230052895A; JP2023534043A; WO2022016089A2; CA3186033A1

Abstract

本文提供了减小尺寸的脂质调配物，其包括脂质和无衣壳非病毒载体(例如，ceDNA)，以及产生所述脂质调配物的方法。本公开的脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)包含脂质调配物，所述脂质调配物可以用于将无衣壳非病毒DNA载体递送到所关注的靶位点(例如，细胞、组织、器官等)。

Description

用于将多核苷酸封装成减小尺寸的脂质纳米颗粒以及其新型调配物的方法

相关申请

本申请要求于2020年7月17日提交的美国临时申请第63/053,274号以及于2021年5月28日提交的美国临时申请第63/194,620号的优先权，这些美国临时申请中的每一个的内容特此通过引用整体并入。

背景技术

脂质纳米颗粒(LNP)是一种临床验证的向肝细胞递送小干扰RNA(siRNA)货物的策略。尽管取得了这些进展，但与较小和/或柔性货物(例如，siRNA)相比，LNP介导的较大、刚性多核苷酸货物(例如，双链线性DNA、质粒DNA、末端封闭式双链DNA(ceDNA))的递送带来了另外的挑战。一种此类挑战涉及封装大型刚性货物时产生的LNP的尺寸。例如，已经常规观察到封装长度>3000bp(碱基对)的末端封闭式线性DNA(ceDNA)以具有80nm至120nm直径的LNP，直径平均值为92nm(n＝28)，使用“现有技术”方法，所述方法涉及在H₂O中或在来自一个流的水性缓冲液中的水性ceDNA与来自另一个流(参见例如，国际申请第PCT/US2020/021328号)的乙醇脂质(100％ EtOH)在酸性缓冲液(pH 3至4)中的高压微流体混合。

这些LNP的相对较大尺寸通过以下若干种机制降低了肝脏适应症的治疗指数：(1)较大的LNP不能有效绕过排列肝窦的内皮细胞的窗孔，从而阻止进入靶细胞(肝细胞)；(2)较大的LNP不能通过与若干种不同受体(例如去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)、低密度脂蛋白(LDL)受体)的网格蛋白介导的内吞作用被肝细胞有效地内化；以及(3)超过一定阈值尺寸的LNP易于被网状内皮系统的细胞优先摄取，这可以引起剂量限制性免疫应答。因此，迫切需要能够将大的、刚性治疗性核酸分子封装成相对较小尺寸的LNP(<75nm直径)的制造过程。

发明内容

本文提供了用于产生直径比先前描述的LNP小得多的LNP的新调配过程和方法。本文所描述的新调配过程包括在用醇(例如，邻苯二甲酸酯)脂质组装微流体纳米颗粒之前，将TNA在80％至100％低分子量醇(例如，乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或甲醇)中可逆压实，这会产生平均直径为75nm(±3nm)或更小的LNP。

根据一些实施例，本公开所描述的LNP的平均直径范围为约20nm至约75nm、约20nm至约70nm、约20nm至约60nm、约30nm至约75nm、约30nm至约70nm、约30nm至约60nm、约40nm至75nm或约40nm至70nm。较小尺寸的LNP提供更有效的组织扩散，以及更有效的摄取和/或靶向。特别是在肝脏中，需要较小尺寸的LNP来通过肝窦内皮细胞(LSEC)窗孔(<100nm)并进行ASGPR介导的内吞作用(<70nm)。此类较小的尺寸也有利于靶向和规避不期望的免疫应答，因为其可以容易地避开免疫细胞。本公开所描述的调配工艺和方法可以封装比先前报道的多得多的治疗性核酸(例如，包含ceDNA的刚性双链DNA)。本文所描述的LNP可以封装大于约60％至约90％的刚性双链DNA，如ceDNA。根据一些实施例，本文所描述的LNP可以封装大于约60％的刚性双链DNA(如ceDNA)、大于约65％的刚性双链DNA(如ceDNA)、大于约70％的刚性双链DNA(如ceDNA)、大于约75％的刚性双链DNA(如ceDNA)、大于约80％的刚性双链DNA(如ceDNA)、大于约85％的刚性双链DNA(如ceDNA)或大于约90％的刚性双链DNA(如ceDNA)。

本文所描述的调配过程利用了ceDNA压实在具有80％至100％低分子量(LMW)醇的溶剂中发生的发现。可以用于压实的LMW醇包含但不限于甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或其它有机溶剂，如丙酮。优选地，可以使用最终浓度为约80％至约98％的乙醇溶液或乙醇-甲醇混合物(例如，EtOH-MeOH 1:1混合物)制备刚性DNA(如ceDNA)的压实。根据一些实施例，所述溶液中所述低分子量醇的最终浓度为约80％至约98％、约80％至约95％、约80％至约92％、约80％至约90％、约80％至约85％、约85％至约98％、约85％至约95％、约85％至约92％、约85％至约90％、约90％至约98％、约87％至约97％、约、约87％至约95％、约87％至约92％、约87％至约90％、约90％至约95％、约90％至约92％、约95％至约98％，或约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％或约98％。例如，当将90％ EtOH水溶液中的ceDNA以此类比例添加到脂质的另一种乙醇溶液(例如，90％ EtOH)中或与其混合时，得到的溶液是例如90％至92％乙醇和8％至10％水或水性缓冲液，通过动态光散射观察到ceDNA以高度压实或变性的状态存在。在此类溶剂(例如，90％至92％乙醇、8％至10％水)中，脂质和ceDNA两者都被溶解，没有可检测到任何一种组分的沉淀，导致将刚性双链DNA(如ceDNA)成功且更有效地封装成更小尺寸的LNP。

因此，本文所描述的调配过程减少了LNP直径，同时相对于标准过程维持了刚性TNA(如ceDNA)的类似或更好的封装效率。不希望受到理论的束缚，这种变化可以归因于在LNP形成之前，刚性TNA(如ceDNA)在LMW醇溶液(如乙醇溶剂)中优选地以90％至92％或至多95％压实。当LNP形成随后通过与酸性水性缓冲溶液混合而开始时，与标准水性过程相反，脂质能够在更小且紧凑的DNA(例如，ceDNA)核周围成核，从而产生显著较小的颗粒。使用本文所描述的过程，可以以更高的数量有效地封装刚性TNA(如ceDNA)，从而产生具有小得多的直径的TNA-LNP，这是LNP的有益属性，以靶向构成尺寸限制的各种组织。

在一些实施例中，调配物包括封装在平均直径为约75nm(±3nm)的LNP中的TNA(例如，ceDNA)。在一些实施例中，调配物包括封装在平均直径为约72nm(±3nm)的LNP中的TNA(例如，ceDNA)。在一些实施例中，调配物包括封装在平均直径为约70nm(±4nm)的LNP中的TNA(例如，ceDNA)。在一些实施例中，调配物包括封装在平均直径为约68nm(±4nm)的LNP中的TNA(例如，ceDNA)。在一些实施例中，调配物包括封装在平均直径为约65nm(±4nm)的LNP中的TNA(例如，ceDNA)。在一些实施例中，调配物包括封装在平均直径为约60nm(±4nm)的LNP中的TNA(例如，ceDNA)。在一些实施例中，调配物包括封装在平均直径为约55nm(±4nm)的LNP中的TNA(例如，ceDNA)。在一些实施例中，调配物包括封装在平均直径为约50nm(±4nm)的LNP中的TNA(例如，ceDNA)。

根据第一方面，本公开提供了一种包括脂质纳米颗粒(LNP)的药物组合物，其中所述LNP包括脂质和刚性核酸治疗剂(rTNA)，其中所述LNP的平均直径介于约20nm与约75nm之间。

根据一些实施例，所述刚性核酸治疗剂是双链核酸。根据一些实施例，所述刚性核酸治疗剂是末端封闭式DNA。

根据一些实施例，所述脂质选自可电离脂质、非阳离子脂质、甾醇或其衍生物、缀合的脂质或其任何组合。根据一些实施例，所述可电离脂质是阳离子脂质。根据一些实施例，所述阳离子脂质是SS-可切割脂质。

根据本文所公开的方面的一些实施例和实施例，所述可电离脂质由以下表示：式(I)：

或其药学上可接受的盐，其中：

R¹和R¹'各自独立地为任选取代的直链或支链C_1-3亚烷基；

R²和R²'各自独立地为任选取代的直链或支链C_1-6亚烷基；

R³和R³'各自独立地为任选取代的直链或支链C_1-6烷基；

或可替代地，当R²是任选取代的支链C_1-6亚烷基时，R²和R³与其居间N原子一起形成4元至8元杂环基；

或可替代地，当R²'是任选取代的支链C_1-6亚烷基时，R²'和R³'与其居间N原子一起形成4元至8元杂环基；

R⁴和R⁴'各自独立地为–CR^a、–C(R^a)₂CR^a或–[C(R^a)₂]₂CR^a；

R^a每次出现时独立地为H或C_1-3烷基；

或可替代地，当R⁴是–C(R^a)₂CR^a或–[C(R^a)₂]₂CR^a并且当R^a是C_1-3烷基时，R³和R⁴与其居间N原子形成4元至8元杂环基；

或可替代地，当R⁴'是–C(R^a)₂CR^a或–[C(R^a)₂]₂CR^a并且当R^a是C_1-3烷基时，R³'和R⁴'与其居间N原子形成4元至8元杂环基；

R⁵和R⁵'各自独立地为C_1-20亚烷基或C_2-20亚烯基；

R⁶和R⁶'每次出现时独立地为C_1-20亚烷基、C_3-20亚环烷基或C_2-20亚烯基；并且

m和n各自独立地是选自1、2、3、4和5的整数。

根据本文所公开的方面的一些实施例和实施例，所述可电离脂质由以下表示：式(II)：

或其药学上可接受的盐，其中：

a是范围为1至20的整数；

b是范围为2至10的整数；

R¹不存在或选自(C₂-C₂₀)烯基、-C(O)O(C₂-C₂₀)烷基和被(C₂-C₂₀)烷基取代的环丙基；并且

R²是(C₂-C₂₀)烷基。

根据本文所公开的方面的一些实施例和实施例，所述可电离脂质由以下表示：式(V)：

或其药学上可接受的盐，其中：

R¹和R¹'各自独立地为任选地被一个或多个选自R^a的基团取代的(C₁-C₆)亚烷基；

R²和R²'各自独立地为(C₁-C₂)亚烷基；

R³和R³'各自独立地为任选地被一个或多个选自R^b的基团取代的(C₁-C₆)烷基；

或可替代地，R²和R³和/或R²'和R³'与其居间N原子一起形成4元至7元杂环基；

R⁴和R⁴'各自为被–C(O)O-中断的(C₂-C₆)亚烷基；

R⁵和R⁵'各自独立地为(C₂-C₃₀)烷基或(C₂-C₃₀)烯基，其各自任选地被–C(O)O-或(C₃-C₆)环烷基中断；并且

R^a和R^b各自为卤基或氰基。

根据一些实施例，所述可电离脂质由以下表示：式(XV)：

或其药学上可接受的盐，其中：

R'不存在、为氢或C₁-C₆烷基；前提是当R'为氢或C₁-C₆烷基时，与R'、R¹和R²都连接的氮原子被质子化；

R¹和R²各自独立地为氢、C₁-C₆烷基或C₂-C₆烯基；

R³为C₁-C₁₂亚烷基或C₂-C₁₂亚烯基；

R⁴为C₁-C₁₆非支链烷基、C₂-C₁₆非支链烯基或

其中：

R^4a和R^4b各自独立地为C₁-C₁₆非支链烷基或C₂-C₁₆非支链烯基；

R⁵不存在、为C₁-C₈亚烷基或C₂-C₈亚烯基；

R^6a和R^6b各自独立地为C₇-C₁₆烷基或C₇-C₁₆烯基；前提是组合的R^6a和R^6b中的碳原子总数大于15；

X¹和X²各自独立地为-OC(＝O)-、-SC(＝O)-、-OC(＝S)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)S-、-S-S-、-C(R^a)＝N-、-N＝C(R^a)-、-C(R^a)＝NO-、-O-N＝C(R^a)-、-C(＝O)NR^a-、-NR^aC(＝O)-、-NR^aC(＝O)NR^a-、-OC(＝O)O-、-OSi(R^a)₂O-、-C(＝O)(CR^a ₂)C(＝O)O-或OC(＝O)(CR^a ₂)C(＝O)-；其中：

R^a每次出现时独立地为氢或C₁-C₆烷基；并且

n是选自1、2、3、4、5和6的整数。

根据一些实施例，所述可电离脂质由以下表示：式(XX)：

或其药学上可接受的盐，其中：

R'不存在、为氢或C₁-C₃烷基；前提是当R'为氢或C₁-C₃烷基时，与R'、R¹和R²都连接的氮原子被质子化；

R¹和R²各自独立地为氢或C₁-C₃烷基；

R³为C₃-C₁₀亚烷基或C₃-C₁₀亚烯基；

R⁴为C₁-C₁₆非支链烷基、C₂-C₁₆非支链烯基或

其中：

R⁵不存在、为C₁-C₆亚烷基或C₂-C₆亚烯基；

R^6a和R^6b各自独立地为C₇-C₁₄烷基或C₇-C₁₄烯基；

X为-OC(＝O)-、-SC(＝O)-、-OC(＝S)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)S-、-S-S-、-C(R^a)＝N-、-N＝C(R^a)-、-C(R^a)＝NO-、-O-N＝C(R^a)-、-C(＝O)NR^a-、-NR^aC(＝O)-、-NR^aC(＝O)NR^a-、-OC(＝O)O-、-OSi(R^a)₂O-、-C(＝O)(CR^a ₂)C(＝O)O-或OC(＝O)(CR^a ₂)C(＝O)-；其中：

R^a每次出现时独立地为氢或C₁-C₆烷基；并且

n是选自1、2、3、4、5和6的整数。

根据一些实施例，所述可电离脂质选自表2、表5、表6、表7或表8中的任何脂质。

根据一些实施例，所述可电离脂质是具有以下结构的脂质：

或其药学上可接受的盐。

根据一些实施例，所述阳离子脂质是具有以下结构的MC3(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)：

根据本文所公开的方面的一些实施例和实施例，所述LNP进一步包括甾醇。根据一些实施例，所述甾醇是胆固醇。

根据本文所公开的方面的一些实施例和实施例，所述LNP进一步包括聚乙二醇(PEG)。根据一些实施例，PEG是l-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG)。

根据本文所公开的方面的一些实施例和实施例，所述LNP进一步包括非阳离子脂质。根据一些实施例，所述非阳离子脂质选自由以下组成的组：二硬脂酰-sn-甘油-磷酸乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸二油酰磷脂酰乙醇胺酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、单甲基-磷脂酰乙醇胺(如16-O-单甲基PE)、二甲基-磷脂酰乙醇胺(如16-O-二甲基PE)、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、鸡蛋磷脂酰胆碱(EPC)、二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、鞘磷脂(SM)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二芥酰磷脂酰胆碱(DEPC)、棕榈酰磷脂酰甘油(POPG)、二月桂酰-磷脂酰乙醇胺(DEPE)、1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DLPE)；1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPHyPE)；卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、二十六烷基磷酸酯、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰基磷脂酰胆碱或其混合物。

根据一些实施例，所述非阳离子脂质选自由以下组成的组：二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。

根据一些实施例，所述PEG或PEG-脂质缀合物以约1.5％至约3％存在。

根据一些实施例，所述胆固醇以约20％至约40％的摩尔百分比存在，并且其中所述脂质以约80％至约60％的摩尔百分比存在。

根据一些实施例，所述胆固醇以约40％的摩尔百分比存在，并且其中所述脂质以约50％的摩尔百分比存在。

根据一些实施例，所述组合物进一步包括胆固醇、PEG或PEG-脂质缀合物和非阳离子脂质。

根据一些实施例，所述PEG或PEG-脂质缀合物以约1.5％至约3％、约1.5％至约2.75％、约1.5％至约2.5％、约1.5％至约2％、约2％至约3％、约2％至约2.75％、约2％至约2.5％、约2.5％至约3％、约2.5％至约2.75％或约2.5％至约3％存在。

根据一些实施例，所述胆固醇以约30％至约50％、约30％至约45％、约30％至约40％、约30％至约35％、约35％至约40％、约35％至约45％、约35％至约50％、约40％至约45％、约40％至约50％或约45％至约50％的摩尔百分比存在。

根据一些实施例，所述脂质以约42.5％至约62.5％、约42.5％至约57.5％、约42.5％至约52.5％、约42.5％至约47.5％、约47.5％至约62.5％、约47.5％至约57.5％、约47.5％至约52.5％、约52.5％至约62.5％、约52.5％至约57.5％或约57.5％至约62.5％的摩尔百分比存在。

根据一些实施例，所述非阳离子脂质以约2.5％至约12.5％、约2.5％至约10.5％、约2.5％至约8.5％、约2.5％至约6.5％、约2.5％至约4.5％、约4.5％至约12.5％、约4.5％至约10.5％、约4.5％至约8.5％、约4.5％至约6.5％、约6.5％至约12.5％、约6.5％至约10.5％、约6.5％至约8.5％、约8.5％至约12.5％、约8.5％至约10.5％或约10.5％至约12.5％的摩尔百分比存在。

根据本文的方面的一些实施例或实施例，所述胆固醇以约40％的摩尔百分比存在，所述脂质以约52.5％的摩尔百分比存在，所述非阳离子脂质以约7.5％的摩尔百分比存在，并且其中所述PEG以约3％存在。

根据本文所公开的方面的一些实施例和实施例，所述组合物进一步包括地塞米松棕榈酸酯(dexamethasone palmitate)。

根据本文所公开的方面的一些实施例和实施例，所述LNP的尺寸小于约75nm。根据本文所公开的方面的一些实施例和实施例，所述LNP的尺寸小于约70nm，例如尺寸小于约65nm、小于约60nm、小于约55nm、小于约50nm、小于约45nm、小于约40nm、小于约35nm、小于约30nm、小于约25nm、小于约20nm、小于约15nm或小于约10nm。根据本文所公开的方面的一些实施例和实施例，所述LNP的尺寸小于约70nm、69nm、68nm、67nm、66nm、65nm、64nm、63nm、62nm、61nm、60nm、59nm、58nm、57nm、56nm、55nm、54nm、53nm、52nm、51nm或50nm。

根据本文所公开的方面的一些实施例和实施例，所述组合物具有约15:1的总脂质与刚性治疗性核酸(rTNA)的比率。

根据本文所公开的方面的一些实施例和实施例，所述组合物具有约30:1的总脂质与刚性治疗性核酸(rTNA)的比率。

根据本文所公开的方面的一些实施例和实施例，所述组合物具有约40:1的总脂质与刚性治疗性核酸(rTNA)的比率。

根据本文所公开的方面的一些实施例和实施例，所述组合物具有约50:1的总脂质与刚性治疗性核酸(rTNA)的比率。

根据本文所公开的方面的一些实施例和实施例，所述组合物具有介于以下之间的总脂质与刚性治疗性核酸(rTNA)的比率：约15:1至约30:1。根据本文所公开的方面的一些实施例和实施例，所述组合物具有介于以下之间的总脂质与刚性治疗性核酸(rTNA)的比率：约15:1至约40:1。根据本文所公开的方面的一些实施例和实施例，所述组合物具有介于以下之间的总脂质与刚性治疗性核酸(rTNA)的比率：约15:1至约50:1。根据本文所公开的方面的一些实施例和实施例，所述组合物具有介于以下之间的总脂质与刚性治疗性核酸(rTNA)的比率：约30:1至约40:1。根据本文所公开的方面的一些实施例和实施例，所述组合物具有介于以下之间的总脂质与刚性治疗性核酸(rTNA)的比率：约30:1至约50:1。根据本文所公开的方面的一些实施例和实施例，所述组合物具有介于以下之间的总脂质与刚性治疗性核酸(rTNA)的比率：约40:1至约50:1。根据本文所公开的方面的一些实施例和实施例，所述组合物进一步包括N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。根据一些实施例，所述GalNAc以总脂质的0.5％的摩尔百分比存在于所述LNP中。根据一些实施例，所述GalNAc以总脂质的约0.3％至约0.9％、约0.4％至约0.8％、约0.5％至约0.6％的摩尔百分比存在于所述LNP中。

根据本文所公开的方面的一些实施例和实施例，所述刚性治疗性核酸(rTNA)是末端封闭式DNA(ceDNA)。

根据本文所公开的方面的一些实施例和实施例，所述刚性治疗性核酸(rTNA)包括表达盒，所述表达盒包括启动子序列和转基因。

根据一些实施例，所述刚性治疗性核酸(rTNA)包括表达盒，所述表达盒包括聚腺苷酸化序列。

根据一些实施例，所述刚性治疗性核酸(rTNA)包括至少一个侧接所述表达盒的5'或3'端的反向末端重复(ITR)。

根据一些实施例，所述表达盒侧接两个ITR，其中所述两个ITR包括一个5'ITR和一个3'ITR。

根据一些实施例，所述表达盒在3'端与ITR(3'ITR)连接。根据一些实施例，所述表达盒在5'端与ITR(5'ITR)连接。

根据一些实施例，所述5'ITR或所述3'ITR中的至少一个是野生型AAV ITR。根据一些实施例，5'ITR和3'ITR中的至少一个是经修饰的ITR。

根据一些实施例，所述刚性治疗性核酸(rTNA)进一步包括5'ITR与所述表达盒之间的间隔子序列。

根据一些实施例，所述刚性治疗性核酸(rTNA)进一步包括3'ITR与所述表达盒之间的间隔子序列。

根据一些实施例，所述间隔子序列为至少为5个碱基对长。根据一些实施例，所述间隔子序列为5个至100个碱基对长。根据一些实施例，所述间隔子序列为5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个碱基对长。根据一些实施例，所述间隔子序列为5个至500个碱基对长。根据一些实施例，所述间隔子序列为10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、160个、170个、180个、190个、200个、210个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个500个碱基对长。

根据一些实施例，所述刚性治疗性核酸(rTNA)具有切口或间隙。

根据一些实施例，所述ITR是选自以下的ITR：源自AAV血清型的ITR、源自鹅病毒的ITR的ITR、源自B19病毒ITR的ITR或源自细小病毒的野生型ITR。

根据一些实施例，所述AAV血清型选自由以下组成的组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。

根据一些实施例，所述ITR是突变体ITR，并且所述ceDNA任选地包括不同于第一ITR的另外的ITR。

根据一些实施例，所述ceDNA在所述表达盒的5'和3'端均包括两个突变ITR，任选地其中所述两个突变ITR是对称突变体。

根据本文所公开的方面的一些实施例和实施例，所述刚性治疗性核酸(rTNA)选自由以下组成的组：小基因、质粒、小环、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、核酶、ceDNA、迷你串(ministring)、doggybone^TM、原端粒末端封闭式DNA或哑铃线性DNA、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、非对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA、DNA病毒载体、病毒RNA载体、非病毒载体以及其任何组合。

根据本文所公开的方面的一些实施例和实施例，所述刚性治疗性核酸是质粒。

根据本文所公开的方面的一些实施例和实施例，所述药物组合物进一步包括药学上可接受的赋形剂。

根据另一方面，本公开提供了一种产生脂质纳米颗粒(LNP)调配物的方法，其中所述LNP包括可电离脂质和末端封闭式DNA(ceDNA)，所述方法包括向一种或多种包括阳离子或可电离脂质的低分子量醇(例如，乙醇、甲醇、丙醇或异丙醇)溶液中添加水性ceDNA，其中所述溶液中醇的最终浓度介于约80％至约98％之间，形成ceDNA/脂质溶液；将所述ceDNA/脂质溶液与酸性水性缓冲液混合；并且与中性pH水性缓冲液进行缓冲液交换，由此产生LNP调配物。根据一些实施例，所述溶液中所述低分子量醇的最终浓度为约80％至约98％、约80％至约95％、约80％至约92％、约80％至约90％、约80％至约85％、约85％至约98％、约85％至约95％、约85％至约92％、约85％至约90％、约90％至约98％、约87％至约97％、约、约87％至约95％、约87％至约92％、约87％至约90％、约90％至约95％、约90％至约92％、约95％至约98％，或约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％或约98％。

根据另一方面，本公开提供了一种产生脂质纳米颗粒(LNP)调配物的方法，所述调配物包括可电离脂质和末端封闭式DNA(ceDNA)，所述方法包括将ceDNA添加到一种或多种低分子量醇(例如，乙醇、甲醇、丙醇或异丙醇)溶液中，其中所得溶液的醇含量大于80％，将>80％醇含量的所述ceDNA添加到80％的醇中的阳离子或可电离脂质中，其中所述低分子量醇在所述ceDNA脂质溶液中的浓度介于约80％至约95％之间(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％)，以形成ceDNA/脂质溶液；将所述ceDNA/脂质溶液与酸性水性缓冲液混合；并且与中性pH水性缓冲液进行缓冲液交换，由此产生LNP调配物。根据一些实施例，所述溶液中所述低分子量醇的最终浓度为约80％至约98％、约80％至约95％、约80％至约92％、约80％至约90％、约80％至约85％、约85％至约98％、约85％至约95％、约85％至约92％、约85％至约90％、约90％至约98％、约87％至约97％、约、约87％至约95％、约87％至约92％、约87％至约90％、约90％至约95％、约90％至约92％、约95％至约98％，或约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％或约98％。

根据一些实施例，所述方法进一步包括用酸性水性缓冲液稀释混合的ceDNA/脂质溶液的步骤。

根据一些实施例，所述一种或多种低分子量醇选自由以下组成的组：甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。根据一些实施例，所述一种或多种低分子量醇是乙醇。根据一些实施例，所述一种或多种低分子量醇是丙醇。根据一些实施例，所述一种或多种低分子量醇是甲醇。根据一些实施例，所述一种或多种低分子量醇是乙醇和甲醇的混合物。

根据一些实施例，所述酸性水性缓冲液选自苹果酸/苹果酸钠或乙酸/乙酸钠。根据一些实施例，所述酸性水性缓冲液的浓度介于约10至40毫摩尔(mM)之间，例如，约10mM至约20mM、约10mM至约30mM、约20mM至约30mM、约20mM至约40mM、约30mM至约40mM或约10mM至约15mM。根据一些实施例，所述酸性水性缓冲液的pH介于约3至5之间。

根据一些实施例，所述中性pH水性缓冲液是pH 7.4的杜尔贝氏磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco's phosphate buffered saline)。

根据一些实施例，使用微流体混合将所述ceDNA/脂质溶液与所述酸性水性缓冲液混合。

根据一些实施例，所述稀释步骤后的最终醇含量介于约4％至约15％之间(例如，约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％)。

根据一些实施例，所述酸性水性缓冲液与所述ceDNA/脂质溶液之间的流速比为2:1、3:2、3:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1或20:1。

根据一些实施例，所述LNP的平均直径介于约20nm与约70nm之间，例如约20nm、约25nm、约30nm、约35nm、约40nm、约45nm、约50nm、约55nm、约60nm、约65nm或约70nm。

根据一些实施例，所述可电离脂质是包括二硫键和叔胺的SS-可切割脂质。

根据一些实施例，所述SS-可切割脂质包括以下的ss-OP脂质：式：

或其药学上可接受的盐。

根据一些实施例，本公开提供了通过本文的方面和实施例中所描述的方法产生的LNP调配物。

根据另一方面，本公开提供了一种治疗受试者的遗传病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物。

根据一些实施例，所述受试者是人。

根据一些实施例，所述遗传病症选自由以下组成的组：镰状细胞性贫血、黑色素瘤、血友病A(凝血因子VIII(FVIII)缺乏症)和血友病B(凝血因子IX(FIX)缺乏症)、囊性纤维化(CFTR)、家族性高胆固醇血症(LDL受体缺陷)、肝母细胞瘤、威尔逊氏病(Wilson'sdisease)、苯丙酮尿症(PKU)、先天性肝卟啉症、遗传性肝代谢障碍、莱施-奈恩综合征(Lesch Nyhan syndrome)、镰状细胞性贫血、地中海贫血、色素性干皮病、范可尼贫血(Fanconi'sanemia)、色素性视网膜炎、共济失调毛细血管扩张症、布鲁姆综合征(Bloom'ssyndrome)、视网膜母细胞瘤、粘多糖贮积病(例如，赫勒氏综合征(Hurler syndrome)(MPSI型)、施艾氏综合征(Scheie syndrome)(MPS IS型)、赫勒-施艾氏综合征(Hurler-Scheiesyndrome)(MPS IH-IS型)、亨特氏综合征(Hunter syndrome)(MPS II型)、A型、B型、C型和D型Sanfilippo(MPS IIIA、IIIB、IIIC和IIID型)、A型和B型Morquio(MPS IVA和MPS IVB)、马-拉综合征(Maroteaux-Lamy syndrome)(MPS VI型)、斯里综合征(Sly syndrome)(MPSVII型)、透明质酸酶缺乏症(MPS IX型))、A/B型、C1型和C2型尼曼-匹克氏病(Niemann-PickDisease)、法布里病(Fabry disease)、辛德勒病(Schindler disease)、II型GM2-神经节苷脂贮积(桑德霍夫病(Sandhoff Disease))、泰萨氏病(Tay-Sachs disease)、异染性脑白质营养不良、克拉伯病(Krabbe disease)、I型、II/III型和IV型粘脂贮积症、I型和II型唾液酸贮积症、I型和II型糖原贮积病(庞贝氏症(Pompe disease))、I型、II型和III型戈谢病(Gaucher disease)、胱氨酸病、巴顿病(Batten disease)、天冬氨酰氨基葡萄糖尿症、萨拉病(Salla disease)、Danon病(LAMP-2缺乏症)、溶酶体酸性脂肪酶(LAL)缺乏症、神经元蜡样脂褐质沉积症(CLN1-8、INCL和LINCL)、鞘脂沉积病、半乳糖唾液酸贮积症、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer'sdisease)、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、脊髓小脑共济失调、脊髓性肌萎缩症、弗里德赖希氏共济失调(Friedreich's ataxia)、杜氏肌营养不良症(Duchenne musculardystrophy)(DMD)、贝克尔肌营养不良症(Becker muscular dystrophies)(BMD)、营养不良性大疱性表皮松解症(DEB)、外核苷酸焦磷酸酶1缺乏症、婴儿全身性动脉钙化(GACI)、莱伯氏先天性黑蒙症(Leber Congenital Amaurosis)、斯特格氏黄斑营养不良(Stargardtmacular dystrophy)(ABCA4)、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症、Usher综合征、α-1抗胰蛋白酶缺乏症和组织蛋白酶A缺乏症。根据一些实施例，所述遗传病症是莱伯氏先天性黑蒙症(LCA)。

根据一些实施例，所述LCA是LCA10。

根据一些实施例，所述遗传病症是尼曼-匹克氏病。根据一些实施例，所述遗传病症是斯特格氏黄斑营养不良。根据一些实施例，所述遗传病症是葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)缺乏症(I型糖原贮积病)或庞贝氏症(II型糖原贮积病)。根据一些实施例，所述遗传病症是血友病A(因子VIII缺乏症)。根据一些实施例，所述遗传病症是血友病B(因子IX缺乏症)。根据一些实施例，所述遗传病症是亨特氏综合征(粘多糖贮积症II)。根据一些实施例，所述遗传病症是囊性纤维化。根据一些实施例，所述遗传病症是营养不良性大疱性表皮松解症(DEB)。根据一些实施例，所述遗传病症是苯丙酮尿症(PKU)。根据一些实施例，其中所述遗传病症是透明质酸酶缺乏症。

根据本文所公开的方面的一些实施例和实施例，所述方法进一步包括施用免疫抑制剂。

根据一些实施例，所述免疫抑制剂是地塞米松(dexamethasone)。

根据本文所公开的方面的一些实施例和实施例，与用包括MC3作为主要阳离子脂质的LNP观察到的免疫应答水平相比，所述受试者表现出针对所述药物组合物的免疫应答水平降低，其中针对所述药物组合物的所述免疫应答水平比用包括MC3的所述LNP观察到的水平低至少50％。

根据一些实施例，通过检测促炎细胞因子或趋化因子的水平来测量所述免疫应答。

根据一些实施例，所述促炎细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-6、IFNα、IFNγ、IL-18、TNFα、IP-10、MCP-1、MIP1α、MIP1β和RANTES。

根据一些实施例，在施用所述药物组合物后6小时，至少一种促炎细胞因子在所述受试者的血清中低于可检测水平。

根据一些实施例，包括所述SS-可切割脂质和所述末端封闭式DNA(ceDNA)的LNP不被吞噬；或与在类似条件下施用的包括MC3作为主要阳离子脂质的LNP的吞噬水平相比，表现出至少50％的吞噬水平降低。

根据一些实施例，所述SS-可切割脂质包括以下的ssOP脂质：式：

或其药学上可接受的盐。

根据一些实施例，所述LNP进一步包括胆固醇和PEG-脂质缀合物。

根据一些实施例，所述LNP进一步包括非阳离子脂质。

根据一些实施例，所述LNP进一步包括N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。

根据一些实施例，所述GalNAc以总脂质的0.5％的摩尔百分比存在于所述LNP中。

根据另一方面，本公开提供了一种增加靶向需要治疗的受试者的肝脏的治疗性核酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述LNP包括治疗性核酸、ss-可切割脂质、甾醇和聚乙二醇(PEG)以及N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。

根据一些实施例，PEG是l-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG)。

根据一些实施例，所述LNP进一步包括非阳离子脂质。

根据一些实施例，所述受试者患有遗传病症。

根据一些实施例，所述遗传病症是血友病A(因子VIII缺乏症)。根据一些实施例，所述遗传病症是血友病B(因子IX缺乏症)。根据一些实施例，所述遗传病症是苯丙酮尿症(PKU)。

根据一些实施例，所述治疗性核酸选自由以下组成的组：小基因、质粒、小环、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、核酶、ceDNA、迷你串、doggybone^TM、原端粒末端封闭式DNA或哑铃线性DNA、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、非对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA、DNA病毒载体、病毒RNA载体、非病毒载体以及其任何组合。

根据一些实施例，所述治疗性核酸是ceDNA。

根据一些实施例，所述ceDNA包括表达盒，所述表达盒包括启动子序列和转基因。

根据一些实施例，所述ceDNA包括至少一个侧接所述表达盒的5'或3'端的反向末端重复(ITR)。

根据一些实施例，ceDNA选自由以下组成的组：CELiD、MIDGE、辅助DNA、哑铃形线性双螺旋末端封闭式DNA，其在表达盒的5'和3'端中包括两个ITR的发夹结构，或doggybone^TMDNA，其中所述ceDNA是无衣壳和线性双螺旋DNA。

根据一些方面，本公开提供了一种减轻需要用治疗性核酸(TNA)治疗的受试者的补体应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述LNP包括所述TNA、ss-可切割脂质、甾醇、聚乙二醇(PEG)和N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。

根据一些实施例，所述受试者患有遗传病症。

根据一些实施例，所述遗传病症选自由以下组成的组：镰状细胞性贫血、黑色素瘤、血友病A(凝血因子VIII(FVIII)缺乏症)和血友病B(凝血因子IX(FIX)缺乏症)、囊性纤维化(CFTR)、家族性高胆固醇血症(LDL受体缺陷)、肝母细胞瘤、威尔逊氏病、苯丙酮尿症(PKU)、先天性肝卟啉症、遗传性肝代谢障碍、莱施-奈恩综合征、镰状细胞性贫血、地中海贫血、色素性干皮病、范可尼贫血、色素性视网膜炎、共济失调毛细血管扩张症、布鲁姆综合征、视网膜母细胞瘤、粘多糖贮积病(例如，赫勒氏综合征(MPS I型)、施艾氏综合征(MPS IS型)、赫勒-施艾氏综合征(MPS IH-IS型)、亨特氏综合征(MPS II型)、A型、B型、C型和D型Sanfilippo(MPS IIIA、IIIB、IIIC和IIID型)、A型和B型Morquio(MPS IVA和MPS IVB)、马-拉综合征(MPS VI型)、斯里综合征(Sly syndrome)(MPS VII型)、透明质酸酶缺乏症(MPSIX型))、A/B型、C1型和C2型尼曼-匹克氏病、法布里病、辛德勒病、II型GM2-神经节苷脂贮积(桑德霍夫病)、泰萨氏病、异染性脑白质营养不良、克拉伯病、I型、II/III型和IV型粘脂贮积症、I型和II型唾液酸贮积症、I型和II型糖原贮积病(庞贝氏症)、I型、II型和III型戈谢病、胱氨酸病、巴顿病、天冬氨酰氨基葡萄糖尿症、萨拉病、Danon病(LAMP-2缺乏症)、溶酶体酸性脂肪酶(LAL)缺乏症、神经元蜡样脂褐质沉积症(CLN1-8、INCL和LINCL)、鞘脂沉积病、半乳糖唾液酸贮积症、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、脊髓小脑共济失调、脊髓性肌萎缩症、弗里德赖希氏共济失调、杜氏肌营养不良症(DMD)、贝克尔肌营养不良症(BMD)、营养不良性大疱性表皮松解症(DEB)、外核苷酸焦磷酸酶1缺乏症、婴儿全身性动脉钙化(GACI)、莱伯氏先天性黑蒙症、斯特格氏黄斑营养不良(ABCA4)、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症、Usher综合征、α-1抗胰蛋白酶缺乏症和组织蛋白酶A缺乏症。

根据一些实施例，所述刚性治疗性核酸选自由以下组成的组：小基因、质粒、小环、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、核酶、ceDNA、迷你串、doggybone^TM、原端粒末端封闭式DNA或哑铃线性DNA、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、非对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA、DNA病毒载体、病毒载体、非病毒载体以及其任何组合。

根据一些实施例，所述PEG以约2％至4％的分子百分比存在于所述LNP中。根据一些实施例，所述PEG以约3％的分子百分比存在于所述LNP中。

根据一些实施例，所述LNP进一步包括非阳离子脂质。根据一些实施例，所述非阳离子脂质选自由以下组成的组：二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。

根据一些实施例，所述GalNAc以总脂质的约0.3％至1％的摩尔百分比存在于所述LNP中。根据一些实施例，所述GalNAc以总脂质的约0.5％的摩尔百分比存在于所述LNP中。

附图说明

可以通过参考在附图中描绘的本公开的说明性实施例来理解上文简要概括并在下文更详细讨论的本公开的实施例。然而，附图仅展示了本公开的典型实施例并且因此不应被视为对范围的限制，因为本公开可以承认其它同等有效的实施例。

图1A是示出如通过动态光散射确定的ceDNA的凝聚的图。动态光散射相关函数显示，随着乙醇含量的增加的ceDNA的凝聚。图1B是示出再水合时压实是可逆的图。

图2是示出由本文所描述的标准调配过程和新调配过程产生的ceDNA LNP的直径的比较的图。

图3A和3B分别是储存在去离子(DI)水中的ceDNA样品和质粒DNA(pDNA)样品的透射电子显微镜(TEM)图像。图3A描绘了储存在去离子水中的ceDNA的TEM图像。图3B描绘了储存在去离子水中的质粒的TEM图像。

图4A和4B分别是ceDNA样品和pDNA样品的TEM图像，其储存在去离子水中的90.9％的1:1乙醇:甲醇的低分子量醇/水溶液中。图4A描绘了储存在去离子水中的90.9％的1:1乙醇:甲醇中的ceDNA的TEM图像。图4B描绘了储存去离子水中的90.9％的1:1乙醇:甲醇中的质粒的TEM图像。

图5是储存在100％低分子量醇(即1:1乙醇:甲醇，无水)中的ceDNA样品的TEM图像。i.e

图6A和6B分别是储存在100mM氢氧化钠(NaOH)水溶液的基本变性条件下的ceDNA和pDNA的TEM图像。

具体实施方式

与基于病毒载体的基因疗法相关的免疫原性限制了由于预先存在的背景免疫而可以治疗的患者数量，并且阻止患者的重新给药，以滴定到每个患者的有效水平，或长期维持效果。由于缺乏预先存在的免疫力，目前描述的治疗性核酸的脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)必要时允许另外剂量的治疗性核酸，并进一步扩大患者的可及性，包含在组织生长时可能需要后续剂量的儿科人群。通过本文所描述的过程产生的治疗性核酸脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)，并且特别包括包含一个或多个叔氨基的阳离子或可电离脂质组合物，以提供与由常规LNP制备过程产生的LNP相比，由于其较小的尺寸的治疗性核酸的更有效递送、更好的耐受性和改进的安全特性。因为目前描述的治疗性核酸脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)没有病毒衣壳内的空间所施加的包装限制，所以理论上，治疗性核酸脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的唯一大小限制在于宿主细胞的DNA复制效率。如本文所描述和例示的，根据一些实施例，所述治疗性核酸是治疗性核酸(TNA)样双链DNA(例如，ceDNA)。如本文所描述和例示的，根据一些实施例，所述治疗性核酸是ceDNA。同样如本文所描述的，根据一些实施例，所述治疗性核酸是mRNA。

治疗学发展中最困难的障碍之一(特别是在罕见病中)是大量的个体病状。地球上约有3.5亿人患有罕见病症，美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)将其定义为确诊人数少于200,000人的病症或病状。这些罕见病症中约80％是遗传起源的，并且其中约95％没有获得FDA批准的治疗(rarediseases.info.nih.gov/diseases/pages/31/faqs-about-rare-diseases)。本文所描述的ceDNA脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的优点之一是提供了一种可以快速适应多种疾病的方法，特别是可以有意义地改变许多遗传病症或疾病的治疗现状的罕见单基因疾病。

I.定义

除非本文另有定义，否则结合本申请使用的科学和技术术语应具有本公开本领域的普通技术人员通常所了解的含义。应当理解，本公开不限于本文所描述的特定方法、方案和试剂等并且因此可以变化。本文中所使用的术语仅是出于描述特定实施例的目的，并且并不旨在限制本公开的范围，本公开的范围仅仅由权利要求限定。免疫学和分子生物学中常用术语的定义能够在下列文献中找到：《默克诊疗手册(The Merck Manual ofDiagnosis and Therapy)》,第19版,默克夏普公司(Merck Sharp&Dohme Corp.)出版,2011(ISBN 978-0-911910-19-3)；Robert S.Porter等人,(编辑),《病毒学领域(FieldsVirology)》,第6版,利平科特威廉姆斯威尔金斯公司(Lippincott Williams&Wilkins)出版,美国宾夕法尼亚州费城(Philadelphia,PA,USA)(2013)；Knipe,D.M.和Howley,P.M.(编辑),《分子细胞生物学与分子医学百科全书(The Encyclopedia of Molecular CellBiology and Molecular Medicine)》,布莱克威尔科学有限公司(Blackwell ScienceLtd.)出版,1999-2012(ISBN 9783527600908)；以及Robert A.Meyers(编辑),《分子生物学与生物技术：综合案头参考(Molecular Biology and Biotechnology:aComprehensiveDesk Reference)》,VCH出版社有限公司(VCH Publishers,Inc.)出版,1995(ISBN 1-56081-569-8)；Werner Luttmann的《免疫学(Immunology)》,爱思唯尔(Elsevier)出版,2006；《詹韦氏免疫生物学(Janeway's Immunobiology)》,Kenneth Murphy,Allan Mowat,Casey Weaver(编辑),泰勒弗朗西斯有限公司(Taylor&Francis Limited)出版,2014(ISBN0815345305,9780815345305)；《勒温基因XI(Lewin's Genes XI)》,琼斯和巴特利特出版社(Jones&Bartlett Publishers)出版,2014(ISBN-1449659055)；Michael RichardGreen和Joseph Sambrook,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A LaboratoryManual)》,第4版,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),美国纽约州冷泉港(Cold Spring Harbor,N.Y.,USA)(2012)(ISBN 1936113414)；Davis等人,《分子生物学的基本方法(Basic Methods in Molecular Biology)》,爱思唯尔科学出版有限公司(Elsevier Science Publishing,Inc.),美国纽约(2012)(ISBN 044460149X)；《酶学实验室方法：DNA(Laboratory Methods in Enzymology:DNA)》,Jon Lorsch(编辑),爱思唯尔,2013(ISBN 0124199542)；《分子生物学现代方法(Current Protocols in MolecularBiology，CPMB)》,Frederick M.Ausubel(编辑),约翰威利父子出版社(John Wiley andSons),2014(ISBN047150338X,9780471503385),《蛋白质科学现代方法(CurrentProtocols in Protein Science，CPPS)》,John E.Coligan(编辑),约翰威利父子出版公司(John Wiley and Sons,Inc.),2005；以及《免疫学现代方法(CPI)(Current Protocols inImmunology(CPI))》(John E.Coligan,ADAM Kruisbeek,David H Margulies,Ethan MShevach,Warren Strobe(编辑)约翰威利父子出版公司,2003(ISBN 0471142735,9780471142737)，所述文献的内容通过引用整体并入本文。

如在本说明书和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另外明确指明，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包含复数指示物。

缩写“例如(e.g.)”源自于拉丁文exempli gratia，并且在本文中用于指示非限制性实例。因此，缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”同义。

替代方案(例如，“或”)的使用应理解为意指替代方案中的任一个、两个或其任何组合。

如本文所使用的，当提及如量、持续时间等可测量的值时，术语“约”旨在涵盖与指定值的±20％或±10％(更优选地±5％，甚至更优选地±1％，以及还更优选地±0.1％)的偏差，因为此类偏差适合于执行所公开的方法。

如本文所使用的，除非另外说明，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应被理解为包含所述范围内的任何整数的值，以及在适当时包含其分数(如，整数的十分之一和百分之一)。

如本文所使用的，“包括(comprise、comprising和comprises)”以及“由...组成(comprised of)”旨在与“包含(include、including、includes)”或“含有(contain、containing、contains)”同义并且是包容性或开放式术语，用于指定以下内容的存在，例如组分，并且不排除或排除本领域已知或其中公开的附加的、未列举的组分、特征、元件、构件、步骤的存在。

术语“由……组成”是指如本文所述的组合物、方法、过程和其相应组分，其排除在所述实施例的描述中未叙述的任何要素。

如本文所使用的，术语“基本上由……组成”是指给定实施例所需要的那些要素。所述术语允许并不实质影响本公开内容的那个实施例的(多个)基本且新颖或功能特性的另外要素存在。

如本文所使用的，术语“如”、“例如”等意图指代示例性实施例，而不限制本公开的范围。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。尽管与本文所描述的任何方法和材料相似或等效的那些方法和材料可以用于实施以测试本公开内容，但在本文中描述优选的材料和方法。

如本文所使用的，术语“施用(administration/administering)”和其变化形式是指将组合物或药剂(例如，核酸，具体地说，ceDNA)引入个体中并且包含同时和依序引入一种或多种组合物或药剂。“施用”可以指代例如治疗、药代动力学、诊断、研究、安慰剂以及实验方法。“施用”还涵盖体外和离体治疗。通过任何合适的途径将组合物或药剂引入个体中，所述途径包含经口、经肺、经鼻、肠胃外(静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下)、经直肠、淋巴内、瘤内或局部。施用包含自我施用和由另一个人施用。可以通过任何合适的途径进行施用。合适的施用途径允许组合物或药剂执行其预期功能。例如，如果合适的途径是静脉内，则通过将组合物或药剂引入个体的静脉中来施用组合物。

如本文所使用的，短语“抗治疗性核酸免疫应答”、“抗转移载体免疫应答”、“针对治疗性核酸的免疫应答”、“针对转移载体的免疫应答”等意指“免疫应答”意指针对治疗性核酸、病毒或非病毒来源的任何不期望的免疫应答。在一些实施例中，不期望的免疫应答是针对病毒转移载体自身的抗原特异性免疫应答。在一些实施例中，免疫应答对转移载体具有特异性，所述转移载体可以是双链DNA、单链RNA或双链RNA。在其它实施例中，免疫应答对转移载体的序列具有特异性。在其它实施例中，免疫应答对转移载体的CpG含量具有特异性。

如本文所使用的，术语“水溶液”意指包括全部或部分水的组合物。

如本文所使用的，术语“碱基”包含嘌呤和嘧啶，其进一步包含天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷和天然类似物，以及嘌呤和嘧啶的合成衍生物，包含但不限于，放置新反应性基团(如但不限于胺、醇、硫醇、羧酸盐和卤代烷)的修饰。

如本文所使用的，术语“载体”旨在包含任何和所有溶剂、分散介质、媒剂、涂层、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲液、载体溶液、悬浮液、胶质物等。此类介质和药剂用于药学上活性物质的用途是本领域公知的。补充性活性成分也可以并入组合物中。短语“药学上可接受的”是指当施用于宿主时不会产生毒性、过敏性或类似的不良反应的分子实体和组合物。

如本文所使用的，术语“ceDNA”意指用于非病毒基因转移、合成或其它形式的无衣壳末端封闭式线性双链(ds)双螺旋DNA。根据一些实施例，ceDNA是末端封闭式线性双螺旋(CELiD)CELiD DNA。根据一些实施例，ceDNA是基于DNA的小环。根据一些实施例，ceDNA是简约的免疫学定义的基因表达(MIDGE)-载体。根据一些实施例，ceDNA是辅助DNA。根据一些实施例，ceDNA是哑铃形线性双螺旋末端封闭式DNA，其在表达盒的5'和3'端中包括ITR的两个发夹结构。根据一些实施例，ceDNA是doggybone^TM DNA。ceDNA的详细描述在于2017年3月3日提交的国际专利申请第PCT/US2017/020828号中进行了描述，所述申请的全部内容以引用的方式明确地并入本文中。使用基于细胞的方法产生包括各种反向末端重复(ITR)序列和构型的ceDNA的某些方法在于2018年9月7日提交的国际专利申请第PCT/US18/49996号和于2018年12月6日提交的PCT/US2018/064242的实例1中进行了描述，所述申请中的每一个以全文引用的方式并入本文中。用于产生包括各种ITR序列和构型的合成ceDNA载体的某些方法描述于例如于2019年1月18日提交的国际申请PCT/US2019/14122中，所述国际申请的全部内容以引用的方式并入本文中。

如本文所使用的，术语“末端封闭式DNA载体”是指具有至少一个共价封闭端的无衣壳DNA载体，其中所述载体的至少一部分具有分子内双螺旋结构。

如本文所使用的，术语“ceDNA载体”与“ceDNA”可互换地使用并且指包括至少一个末端回文结构的末端封闭式DNA载体。在一些实施例中，ceDNA包括两个共价封闭端。

如本文所使用的，术语“ceDNA-杆粒”意指一种包括作为分子间双螺旋的ceDNA基因组的感染性杆状病毒基因组，其能够作为质粒在大肠杆菌中增殖，因此可以作为杆状病毒的穿梭载体操作。

如本文所使用的，术语“ceDNA-杆状病毒”意指一种在杆状病毒基因组内包括作为分子间双螺旋的ceDNA基因组的杆状病毒。

如本文所使用的，术语“ceDNA-杆状病毒感染的昆虫细胞”和“ceDNA-BIIC”可互换使用，并且意指被ceDNA-杆状病毒感染的无脊椎动物宿主细胞(包含但不限于昆虫细胞(例如Sf9细胞))。

如本文所使用的，术语“ceDNA基因组”意指还并入了至少一个反向末端重复(ITR)区域的表达盒。ceDNA基因组还可以包括一个或多个间隔区。在一些实施例中，ceDNA基因组作为DNA的分子间双螺旋多核苷酸并入质粒或病毒基因组中。

如本文所使用的，术语“DNA调控序列”、“控制元件”和“调控元件”在本文中可互换使用，并且意指提供和/或调控非编码序列(例如，靶向DNA的RNA)或编码序列(例如，定点修饰多肽，或Cas9/Csn1多肽)的转录和/或调控编码多肽的翻译的转录和翻译控制序列，如启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、终止子、蛋白质降解信号等。

如本文所使用的，术语“刚性治疗性核酸”、“刚性TNA”或“rTNA”是指如本文所定义的具有紧凑结构或处于紧凑状态的治疗性核酸，例如，作为制备包括如本文所描述rTNA的LNP组合物期间的过程的结果。在一个实施例中，所述制备包含基于LMW醇的过程，其中rTNA和脂质在LMW醇溶液中混合，并且将含有rTNA和脂质的LMW醇混合物通过一个通道引入微流体合成系统(例如，NanoAssemblr)，并且将水性缓冲液通过单独的通道引入以产生封装rTNA的LNP组合物。如本文所使用的，术语“末端重复”或“TR”包含任何包括至少一个最低需要的复制起点和包括回文发夹结构的区域的病毒或非病毒末端重复或合成序列。Rep结合序列(“RBS”或也被称为Rep结合元件(RBE))和末端解链位点(“TRS”)共同构成AAV的“最低需要的复制起点”，并且因此TR包括至少一个RBS和至少一个TRS。在给定的一段多核苷酸序列内彼此反向互补的TR通常各自被称为“反向末端重复”或“ITR”。在病毒的背景下，ITR在介导复制、病毒颗粒和DNA包装、DNA整合以及基因组和前病毒拯救方面发挥着关键作用。在全长上并非反向互补(回文)的TR仍然可以执行ITR的传统功能，因此术语ITR用于指病毒或非病毒AAV载体中能够介导宿主细胞中的复制的TR。本领域普通技术人员将理解，在复杂的AAV载体构型中，可能存在两个以上ITR或非对称ITR对。

“ITR”可以使用包括一个或多个所需功能序列(例如回文序列，RBS)的一组寡核苷酸人工合成。ITR序列可以是AAV ITR、人工非AAV ITR或从病毒AAV ITR物理衍生的ITR(例如，从病毒基因组中去除的ITR片段)。例如，ITR可以源自细小病毒科，其涵盖细小病毒和依赖病毒(例如犬细小病毒、牛细小病毒、小鼠细小病毒、猪细小病毒、人细小病毒B-19)，或者可以将充当SV40复制起点的SV40发夹用作ITR，其可以通过截断、取代、缺失、插入和/或添加而被进一步修饰。细小病毒科病毒由两个亚科组成：感染脊椎动物的细小病毒亚科(Parvovirinae)以及感染无脊椎动物的浓病毒亚科(Densovirinae)。依赖病毒属包含腺相关病毒(AAV)的病毒家族，其能够在脊椎动物宿主中复制，所述宿主包含但不限于人、灵长类、牛、犬、马和羊物种。一般而言，ITR序列不仅可以源自AAV，还可以源自细小病毒、慢病毒、鹅病毒、B19，呈野生型、“狗骨”和“哑铃形”、对称或甚至非对称ITR取向的构型。虽然ITR通常存在于AAV载体的5'端和3'端，但ITR只能存在于线性载体的一端。例如，ITR只能出现在5'端。在一些其它情况下，ITR只能出现在合成AAV载体的3'端。本文中为方便起见，将位于合成AAV载体中的表达盒的5'(“上游”)的ITR称为“5'ITR”或“左ITR”，并将位于载体或合成AAV中的表达盒的3'(“下游”)的ITR称为“3'ITR”或“右ITR”。

如本文所使用的，“野生型ITR”或“WT-ITR”是指AAV基因组或其它依赖病毒中天然存在的ITR序列的序列，其保留例如Rep结合活性和Rep切口产生能力。由于遗传密码的简并性或漂移，来自任何AAV血清型的WT-ITR的核苷酸序列可能与典型的天然存在的序列略有不同，并且因此，本文涵盖使用的WT-ITR序列包含由于天然存在的变化(例如复制错误)而产生的WT-ITR序列。

如本文所使用的，术语“基本上对称的WT-ITR”或“基本上对称的WT-ITR对”是指合成AAV载体内的一对WT-ITR，它们都是野生型ITR，在其整个长度上具有反向互补序列。例如，即使ITR具有一个或多个偏离规范的天然存在的规范序列的核苷酸，只要这些变化不影响所述序列的物理和功能性质以及整体三维结构(二级和三级结构)，所述ITR也可以被认为是野生型序列。在一些方面，偏离的核苷酸代表保守的序列变化。作为一个非限制性实例，序列与典型序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性(如使用默认设置下的BLAST测量)，并且还与另一WT-ITR具有对称的三维空间组构，使得其3D结构在几何空间中具有相同的形状。基本上对称的WT-ITR在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环。通过确定基本上对称的WT-ITR具有与适当的Rep蛋白配对的可操作的Rep结合位点(RBE或RBE')和末端解链位点(trs)，可以在功能上将其确认为WT。可以任选地测试其它功能，包含在许可条件下的转基因表达。

如本文所使用的，短语“经修饰的ITR”或“mod-ITR”或“突变体ITR”可互换使用，并且是指与来自相同血清型的WT-ITR相比在至少一个或多个核苷酸中具有突变的ITR。所述突变可以引起ITR中的A、C、C'、B、B'区中的一个或多个发生变化，并且可以使得三维空间组构(即，其几何空间中的3D结构)相较于相同血清型的WT-ITR的3D空间组构发生变化。

如本文所使用的，术语“非对称ITR”，也被称为“非对称ITR对”，是指单个合成AAV基因组内的一对ITR，它们在其全长上不是反向互补的。作为一个非限制性实例，非对称ITR与其同源ITR不具有对称的三维空间组构，使得其3D结构在几何空间中具有不同的形状。换句话说，非对称ITR对具有不同的整体几何结构，即它们在3D空间中具有不同的A、C-C'和B-B'环组构(例如，一个ITR与同源ITR相比可能具有短的C-C'臂和/或短的B-B'臂)。两个ITR之间的序列差异可能是由于一个或多个核苷酸添加、缺失、截断或点突变引起的。在一个实施例中，非对称ITR对中的一个ITR可以是野生型AAV ITR序列，并且另一个ITR是如本文定义的修饰ITR(例如，非野生型或合成ITR序列)。在另一个实施例中，非对称ITR对中的ITR皆不是野生型AAV序列，并且两个ITR是在几何空间中具有不同形状的经修饰的ITR(即，不同的整体几何结构)。在一些实施例中，非对称ITR对中的一个mod-ITR可以具有短C-C'臂，并且另一个ITR可以具有不同修饰(例如，单臂或短B-B'臂等)，使得它们具有不同于同源非对称mod-ITR的三维空间组构。

如本文所使用的，术语“对称ITR”是指单链AAV基因组内的一对ITR，它们是野生型或突变的(例如，相对于野生型修饰)依赖病毒ITR序列并且在其全长上是反向互补的。在一个非限制性实例中，两个ITR都是来自AAV2的野生型ITR序列。在另一个实例中，这两个ITR都不是野生型ITR AAV2序列(即，它们是经修饰的ITR，也被称为突变体ITR)，并且由于核苷酸的添加、缺失、取代、截断或点突变而在序列上与野生型ITR不同。本文中为方便起见，将位于合成AAV载体中表达盒的5'(上游)的ITR称为“5'ITR”或“左ITR”，并将位于合成AAV载体中表达盒的3'(下游)的ITR称为“3'ITR”或“右ITR”。

如本文所使用的，术语“基本上对称的经修饰ITR”或“基本上对称的mod-ITR对”是指合成AAV内的一对经修饰的ITR，它们在其整个长度上都具有反向互补序列。例如，修饰ITR即使具有一些偏离反向互补序列的核苷酸序列，只要变化不影响特性和整体形状，也可以认为是基本上对称的。作为一个非限制性实例，序列与典型序列具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性(如使用默认设置下的BLAST测量)，并且还与其同源经修饰的ITR具有对称的三维空间组构，使得其3D结构在几何空间中具有相同的形状。换句话说，基本上对称的经修饰的ITR对具有在3D空间中组织的相同的A、C-C'和B-B'环。在一些实施例中，来自mod-ITR对的ITR可以具有不同的反向互补核苷酸序列，但仍具有相同的对称三维空间组构，即两个ITR都具有产生相同的整体3D形状的突变。例如，mod-ITR对中的一个ITR(例如5'ITR)可以来自一种血清型，而另一个ITR(例如3'ITR)可以来自不同的血清型，但是，两种都可以具有相同的对应突变(例如，如果5'ITR在C区中具有缺失，那么来自不同血清型的同源修饰的3'ITR在C'区的对应位置处也具有缺失)，以使得经修饰的ITR对具有相同的对称三维空间组构。在此类实施例中，经修饰的ITR对中的每个ITR可以来自不同血清型(例如，AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12)，如AAV2与AAV6的组合，其中一个ITR中的修饰反映在来自不同血清型的同源ITR中的对应位置中。在一个实施例中，基本上对称的经修饰的ITR对是指一对经修饰的ITR(mod-ITR)，只要ITR之间的核苷酸序列的差异不影响特性或整体形状并且其在3D空间中具有基本上相同的形状即可。作为非限制性实例，如通过本领域中公知的标准方法，如默认设置下的BLAST(基本局部比对搜索工具)或BLASTN测定，mod-ITR与典型的mod-ITR具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且还具有对称的三维空间组构，以使其3D结构在几何空间中的形状相同。基本上对称的mod-ITR对在3D空间中具有相同的A、C-C'和B-B'环，例如，如果基本上对称的mod-ITR对中的经修饰的ITR缺失C-C'臂，那么同源mod-ITR对应缺失C-C'环，并且还具有在其同源mod-ITR的几何空间中呈相同形状的剩余A和B-B'环的类似3D结构。

如本文所使用的，短语活性剂或治疗剂(如治疗性核酸)的“有效量”或“治疗有效量”是足以产生期望效果(例如，相比于在不存在治疗性核酸的情况下检测到的表达水平抑制目标序列的表达)的量。用于测量目标基因或目标序列的表达的合适的测定法包含例如使用本领域的技术人员已知的技术(如斑点印迹法、Northern印迹法、原位杂交、ELISA、免疫沉淀、酶功能)以及本领域的技术人员已知的表型测定法检查蛋白质或RNA水平。

如本文所使用的，术语“表达”意指参与产生RNA和蛋白质以及适当时分泌蛋白质的细胞过程，在适用时，其包含但不限于例如转录、转录物加工、翻译和蛋白质折叠、修饰和加工。如本文所使用的，短语“表达产物”包含从基因(例如，转基因)转录的RNA，以及通过翻译从基因转录的mRNA获得的多肽。

如本文所使用的，术语“表达载体”意指指导来自与载体上的转录调控序列连接的序列的RNA或多肽的表达的载体。表达的序列通常但不一定对宿主细胞是异源的。表达载体可以包括另外的元件，例如，表达载体可以具有两个复制系统，从而允许其维持在两种生物体中，例如在人类细胞中进行表达并在原核宿主中进行克隆和扩增。表达载体可以是重组载体。

如本文所使用的，术语“侧接”意指一个核酸序列相对于另一核酸序列的相对位置。通常，在序列ABC中，B的两侧是A和C。对于A×B×C排列，情况也是如此。因此，位于两侧的序列在被侧接的序列之前或之后，但不必与被侧接的序列相邻或紧邻。

如本文所使用的，术语“间隔区”意指分离载体或基因组中的功能元件的中间序列。在一些实施例中，间隔区将两个功能元件保持在对于最佳功能性来说所期望的距离上。在一些实施例中，间隔区提供或增加了载体或基因组的基因稳定性。在一些实施例中，间隔区通过提供克隆位点的适宜位置和设计数目的碱基对的间隙而促进基因组的就绪基因操作。

如本文所使用的，术语“表达盒”和“表达单元”可互换使用，并且意指可操作地连接至启动子或足以指导DNA载体(例如，合成的AAV载体)的转基因转录的其它DNA调控序列的异源DNA序列。合适的启动子包含例如组织特异性启动子。启动子也可以是AAV起源的。

如本文所使用的，短语“遗传疾病”或“遗传病症”意指部分或完全、直接或间接地由基因组中的一种或多种异常引起的疾病，包含并且尤其是从出生起出现的病状。异常可以是基因中的突变、插入或缺失。异常可能影响基因的编码序列或其调控序列。

如本文所使用的，术语“脂质”意指一组有机化合物，包含但不限于脂肪酸酯，其特征在于不溶于水，但可溶于许多有机溶剂。它们通常分为至少三类：(1)“简单脂质”，其包含脂肪和油以及蜡；(2)“化合物脂质”，其包含磷脂和糖脂；以及(3)“衍生脂质”，如类固醇。

磷脂的代表性实例包含但不限于磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱和二亚油酰基磷脂酰胆碱。缺少磷的其它化合物，如鞘脂、鞘糖脂家族、二酰基甘油和β-酰氧基酸，也在被称为两亲性脂质的组内。此外，上述两亲性脂质可与其它脂质(包含甘油三酸酯和固醇)混合。

在一个实施例中，脂质组合物包括一个或多个叔氨基、一个或多个苯基酯键和二硫键。

如本文所使用的，术语“脂质缀合物”意指抑制脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)聚集的缀合脂质。此类脂质缀合物包含但不限于PEG化脂质，例如，与二烷氧基丙基偶联的PEG(例如，PEG-DAA缀合物)、与二酰基甘油偶联的PEG(例如，PEG-DAG缀合物)、与胆固醇偶联的PEG、与磷脂酰乙醇胺偶联的PEG和与神经酰胺偶联的PEG(参见例如，美国专利第5,885,613号)、阳离子PEG脂质、聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物(例如，POZ-DAA缀合物，参见例如，于2010年1月13日提交的美国临时申请第61/294,828号和于2010年1月14日提交的美国临时申请第61/295,140号)、聚酰胺寡聚物(例如，ATTA-脂质缀合物)以及其混合物。在国际专利申请公开第WO 2010/006282号中描述了POZ-脂质缀合物的另外的实例。PEG或POZ可以直接与脂质缀合，或者可以通过接头部分与脂质连接。可以使用适合于将PEG或POZ与脂质偶联的任何接头部分，包含例如不含酯的接头部分和含酯的接头部分。在某些优选的实施例中，使用不含酯的接头部分，如酰胺或氨基甲酸酯。出于所有目的，将每个上述专利文件的公开内容以全文引用的方式并入本文。

如本文所使用的，术语“脂质封装”意指提供具有完全封装、部分封装或两者的活性剂或治疗剂，如核酸(例如，ceDNA)的脂质颗粒。在优选的实施例中，核酸被完全封装在脂质颗粒中(例如，以形成含有核酸的脂质颗粒)。

如本文所使用的，术语“脂质颗粒”或“脂质纳米颗粒”意指可用于将治疗剂(如核酸治疗剂)递送至所关注的目标位点(例如，细胞、组织、器官等)的脂质调配物。在一个实施例中，本公开的脂质颗粒是含有核酸的脂质颗粒，其通常由阳离子脂质、非阳离子脂质和任选地防止颗粒聚集的缀合脂质形成。在其它优选的实施例中，如治疗性核酸等治疗剂可以包封在颗粒的脂质部分中，从而保护其免于酶促降解。在一个实施例中，脂质颗粒包括核酸(例如，ceDNA)和包括一个或多个叔氨基、一个或多个苯基酯键和二硫键的脂质。

根据一些实施例，本公开的脂质颗粒通常具有约20nm至约75nm、约20nm至约70nm、约25nm至约75nm、约25nm至约70nm、约30nm至约75nm、约30nm至约70nm、约35nm至约75nm、约35nm至约70nm、约40nm至约75nm、约40nm至约70nm、约45nm至约75nm、约50nm至约75nm、约50nm至约70nm、约60nm至约75nm、约60nm至约70nm、约65nm至约75nm、约65nm至约70nm，或约20nm、约25nm、约30nm、约35nm、约40nm、约45nm、约50nm、约51nm、约52nm、约53nm、约54nm、约55nm、约56nm、约57nm、约58nm、约59nm、约60nm、约61nm、约62nm、约63nm、约64nm、约65nm、约66nm、约67nm、约68nm、约69nm、约70nm、约71nm、约72nm、约73nm、约74nm或75nm(±3nm)大小的平均直径。

一般而言，本公开的脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)具有被选择以提供预期治疗效果的平均直径。

根据一些实施例，本公开的脂质颗粒通常具有小于约75nm、小于约70nm、小于约65nm、小于约60nm、小于约55nm、小于约50nm、小于约45nm、小于约40nm、小于约35nm、小于约30nm、小于约25nm、小于约20nm大小的平均直径。

如本文所使用的，术语“阳离子脂质”是指在生理pH下带正电荷的任何脂质。脂质颗粒中的阳离子脂质可以包括，例如一种或多种阳离子脂质，如1,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲氨基丙烷(DLenDMA)、1,2-二-γ-亚麻氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(γ-DLenDMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-C2-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、“SS-可切割脂质”或其混合物。在一些实施例中，阳离子脂质也是可电离脂质，即，可电离阳离子脂质。本文所描述的所有阳离子脂质的对应的季脂质(即，阳离子部分中的氮原子被质子化并具有四个取代基)都在本公开的范围内。本文所描述的任何阳离子脂质可以例如通过在乙腈(CH₃CN)和氯仿(CHCl₃)中用氯甲烷(CH₃Cl)处理而转化为对应的季脂质。

如本文所使用的，术语“阴离子脂质”是指在生理pH下带负电荷的任何脂质。这些脂质包含但不限于磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二烷酰基磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰基磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰基磷脂酰乙醇胺、赖氨酰基磷脂酰甘油、棕榈酰基油酰基磷脂酰甘油(POPG)和加入其它阴离子改性基团的中性脂质。

如本文所使用的，术语“疏水性脂质”是指具有非极性基团的化合物，所述非极性基团包含但不限于长链饱和和不饱和脂肪族烃基以及任选地被一个或多个芳香族、环脂族或杂环基取代的此类基团。合适的实例包含但不限于二酰基甘油、二烷基甘油、N-N-二烷基氨基、1,2-二酰氧基-3-氨基丙烷和1,2-二烷基-3-氨基丙烷。

如本文所使用的，术语“可电离脂质”意指具有至少一个可质子化或可去质子化基团的脂质，例如阳离子脂质，使得脂质在等于或低于生理pH(例如，pH 7.4)的pH下带正电荷，并且在第二pH下为中性，所述第二pH优选地等于或高于生理pH。本领域普通技术人员将理解，作为pH的函数的质子的添加或去除是一种平衡过程，并且对带电或中性脂质的提及是指占优势物种的性质，而不要求所有的脂质都以带电或中性形式存在。一般而言，可电离脂质的可质子化基团的pKa在约4到约7的范围内。在一些实施例中，可电离脂质可以包含“可切割脂质”或“SS-可切割脂质”。

如本文所使用的，术语“中性脂质”意指在选定的pH下以不带电或中性两性离子形式存在的多种脂质物种中的任何一种。在生理pH下，此类脂质包含例如二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂和二酰基甘油。

如本文所使用的，术语“非阳离子脂质”意指任何两亲性脂质以及任何其它中性脂质或阴离子脂质。

如本文所使用的，术语“可切割脂质”或“SS-可切割脂质”是指包括二硫键可切割单元的脂质。可切割脂质可以包含可切割的二硫键(“ss”)，其含有类脂材料，所述类脂材料包括pH敏感性叔胺和可自降解的苯基酯。例如，SS-可切割脂质可以是ss-OP脂质(

SS-OP)、ss-M脂质(

SS-M)、ss-E脂质(

SS-E)、ss-EC脂质

ss-LC脂质(

SS-LC)、ss-OC脂质

和ss-PalmE脂质(参见例如，式I-IV)，或以下文献中描述的脂质：Togashi等人,(2018),《控释杂志(Journal of Controlled Release)》,“一种基于细胞内环境敏感性维生素E支架类脂材料并辅以抗炎药的肝脏pDNA递送系统(A hepatic pDNA delivery system based on anintracellular environment sensitive vitamin E-scaffold lipid-like materialwith the aid of an anti-inflammatory drug)”,279:262-270。美国专利第9,708,628号和美国专利第10,385,030号中描述了可切割脂质的另外的实例，所述美国专利的全部内容通过引用并入本文。在一个实施例中，可切割脂质包括叔胺，其响应酸性区室，例如，用于膜去稳定化的内体或溶酶体和可在还原环境(如细胞质)中切割的二硫键。在一个实施例中，可切割脂质是阳离子脂质。在一个实施例中，可切割脂质是可电离阳离子脂质。本文更详细地描述了可切割脂质。

如本文所使用的，术语“有机脂质溶液”意指完全或部分包括具有脂质的有机溶剂的组合物。

如本文所使用的，术语“脂质体”意指组装成球形构型的脂质分子，所述球形构型封装与水性外部隔离的内部水性体积。脂质体是具有至少一个脂质双层的囊泡。在医药研发的背景下，脂质体通常用作药物/治疗剂递送的载体。脂质体通过与细胞膜融合并重新定位其脂质结构以递送药物或活性药物成分来起作用。用于此类递送的脂质体组合物由常由磷脂(具体地说，具有磷脂酰胆碱基团的化合物)构成，然而这些组合物还可以包含其它脂质。

如本文所使用的，术语“局部递送”意指将如干扰RNA(例如，siRNA)等活性剂直接递送至生物体内的目标位点。例如，药剂可以通过直接注射到疾病位点(如肿瘤或其它目标位点，如发炎位点或目标器官，如肝脏、心脏、胰腺、肾脏等)中来局部递送。

如本文所使用的，术语“核酸”意指含有呈单链或双链形式的至少两种核苷酸(即，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)并且包含DNA、RNA和其杂合物的聚合物。DNA可以呈例如反义分子、质粒DNA、DNA-DNA双链体、预缩合DNA、PCR产物、载体(P1、PAC、BAC、YAC、人工染色体)、表达盒、嵌合序列、染色体DNA或这些组的衍生物和组合的形式。DNA可以呈小环、质粒、杆粒、小基因、迷你串DNA(线性共价闭合DNA载体)、末端封闭式线性双螺旋DNA(CELiD或ceDNA)、doggybone^TM DNA、哑铃形DNA、简约的免疫学定义的基因表达(MIDGE)-载体、病毒载体或非病毒载体的形式。RNA可以呈小干扰RNA(siRNA)、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、非对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、mRNA、rRNA、tRNA、病毒RNA(vRNA)和其组合的形式。核酸包含含有已知核苷酸类似物或经修饰的主链残基或键联的核酸，其是合成的、天然存在的以及非天然存在的，并且其具有与参考核酸类似的结合性质。此类类似物和/或经修饰的残基的实例包含(但不限于)：硫代磷酸酯、二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(吗啉基)、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2'-O-甲基核糖核苷酸、锁核酸(LNA^TM)和肽核酸(PNA)。除非特别限制，否则所述术语涵盖含有与参考核酸具有类似结合特性的天然核苷酸的已知类似物的核酸。除非另外指出，否则特定核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。

如本文所使用的，短语“核酸治疗剂”、“治疗性核酸”和“TNA”可互换地使用，并且是指使用核酸作为治疗疾病或病症的治疗剂的活性组分的治疗的任何模态。如本文所使用的，这些短语是指基于RNA的治疗剂和基于DNA的治疗剂。基于RNA的治疗剂的非限制性实例包含mRNA、反义RNA和寡核苷酸、核酶、适体、干扰RNA(RNAi)、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、非对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)。基于DNA的治疗剂的非限制性实例包含小环DNA、小基因、病毒DNA(例如，慢病毒或AAV基因组)或非病毒合成DNA载体、末端封闭式线性双螺旋DNA(ceDNA/CELiD)、质粒、杆粒、DOGGYBONE^TM DNA载体、简约的免疫学定义的基因表达(MIDGE)-载体、非病毒迷你串DNA载体(线性-共价封闭的DNA载体)或哑铃形DNA最小载体(“哑铃DNA”)。

如本文所使用的，“核苷酸”含有糖脱氧核苷(DNA)或核糖(RNA)、碱基和磷酸酯基。核苷酸通过磷酸酯基连接在一起。

如本文所使用的，术语“药学上可接受的载体”包含任何标准药学载体，如磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳液(如油/水或水/油)以及各种类型的润湿剂。该术语还涵盖美国联邦政府监管机构批准的或美国药典中列出的用于动物(包含人类)的任何药剂，以及不会对受试者造成显著刺激并且不会消除所施用化合物的生物活性和性质的任何载体或稀释剂。

如本文所使用的，术语“间隙”意指本公开内容的合成DNA载体的中断部分，其在另外的双链ceDNA中产生单链DNA部分的一段。在双螺旋DNA的一个链中，间隙的长度可以是1个碱基对至100个碱基对。由本文所描述的方法以及由所述方法产生的合成载体设计和产生的典型间隙的长度可以是例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60bp。本公开中的示例性间隙的长度可以是1bp到10bp、1bp到20bp、1bp到30bp。

如本文所使用的，术语“切口”是指双链DNA分子中的不连续性，其中通常通过损伤或酶作用在一条链的相邻核苷酸之间不存在磷酸二酯键。应当理解，一个或多个切口允许在DNA复制期间释放链中的扭转，并且切口也被认为在促进转录机制结合方面发挥作用。

如本文所使用的，术语“受试者”意指人或动物，向其提供了用根据本公开的治疗性核酸进行的治疗，包含防治性治疗。一般而言，动物是脊椎动物，如但不限于灵长类动物、啮齿动物、家养动物或野生动物。灵长类动物包含但不限于黑猩猩、食蟹猴、蜘蛛猴和猕猴，例如恒河猴。啮齿动物包含小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔和仓鼠。家养和野生动物包含但不限于：牛、马、猪、鹿、野牛、水牛、猫科物种(例如，家猫)、犬科物种(例如，狗、狐狸、狼)、禽类物种(例如，鸡、鸸鹋、鸵鸟)，以及鱼(例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼)。在本文所描述方面的某些实施例中，受试者是哺乳动物，例如灵长类动物或人。受试者可以是雄性或雌性。另外，受试者可以是婴儿或儿童。在一些实施例中，受试者可以是新生儿或未出生受试者，例如，受试者还在子宫内。优选地，受试者是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。人以外的哺乳动物可以有利地用作代表疾病和病症的动物模型的受试者。另外，本文所描述的方法和组合物可以用于家养动物和/或宠物。人受试者可以具有任何年龄、性别、种族或族群，例如，高加索人(白种人)、亚洲人、非洲人、黑种人、非裔美洲人、非裔欧洲人、西班牙人、中东人等。在一些实施例中，受试者可以是临床环境中的患者或其它受试者。在一些实施例中，受试者已进行治疗。在一些实施例中，受试者是胚胎、胎儿、新生儿、婴儿、儿童、青少年或成人。在一些实施例中，受试者是人类胎儿、人类新生儿、人类婴儿、人类儿童、人类青少年或人类成人。在一些实施例中，受试者是动物胚胎，或非人类胚胎或非人类灵长类动物胚胎。在一些实施例中，受试者是人胚胎。

如本文所使用的，短语“有需要的受试者”是指这样的受试者，其(i)将被施用根据所描述的本公开的ceDNA脂质颗粒(或包括ceDNA脂质颗粒的药物组合物)、(ii)正在接受根据所描述的本公开的aceDNA脂质颗粒(或包括ceDNA脂质颗粒的药物组合物)；或(iii)已经接受根据所描述的本公开的ceDNA脂质颗粒(或包括ceDNA脂质颗粒的药物组合物)，除非所述短语的上下文和用法另有说明。

如本文所使用的，术语“遏制”、“减少”、“干扰”、“抑制”和/或“降低”(以及类似术语)通常是指直接或间接地降低相对于自然条件、预期条件或平均条件，或相对于对照条件的浓度、水平、功能、活动或行为的行为。

如本文所使用的，术语“全身递送”意指脂质颗粒的递送，其导致如干扰RNA(例如，siRNA)等活性剂在生物体内的广泛生物分布。一些施用技术可导致某些药剂而非其它药剂的全身递送。全身递送意指使有用量(优选地，治疗量)的药剂暴露于身体的大部分部位。为了获得广泛的生物分布，通常需要血液寿命，以使药剂在到达施用位点远端的疾病位点之前不会迅速地降解或清除(诸如通过首过器官(肝、肺等)或通过快速、非特异性细胞结合)。脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的全身递送可以通过本领域已知的任何方式进行，包含例如静脉内、皮下和腹膜内。在优选的实施例中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的全身递送是通过静脉内递送。

如本文所使用的，术语活性剂(例如，如本文所描述的ceDNA脂质颗粒)的“治疗量”、“治疗有效量”、“有效量”或“药学上有效量”可互换地使用以指代足以提供治疗的预期益处的量。然而，剂量水平基于多种因素，包含损伤类型、年龄、体重、性别、患者的医学病状、病状的严重程度、施用途径和所采用的特定活性剂。因此，给药方案可以在很大范围内变化，但可以由医生使用标准方法常规确定。另外，术语“治疗量”、“治疗有效量”和“药学上有效量”包含所描述的本公开的组合物的防治或预防量。在所描述的本公开的防治性或预防性应用中，以足以消除或降低疾病、病症或病状的风险、减轻严重程度或延迟发病的量向易患有疾病、病症或病状或以其它方式处于疾病、病症或病状风险下的患者施用药物组合物或药剂，所述疾病、病症或病状包含疾病、病症或病状的生物化学、组织学和/或行为症状，其并发症和在疾病、病症或病状的发展期间呈现的中间病理学表型。通常优选使用最大剂量，即，根据一些医学判断的最高安全剂量。术语“剂量(dose/dosage)”在本文中可互换地使用。

如本文所使用的，术语“治疗效果”是指治疗的结果，其结果被判定为合乎需要并且有益的。治疗效果可以直接或间接地包含疾病表现的遏制、减少或消除。治疗效果还可以直接或间接地包含疾病表现的进展的遏制减少或消除。

对于本文所描述的任何治疗剂，治疗有效量可以初始地根据初步的体外研究和/或动物模型来确定。治疗有效剂量也可以根据人数据来确定。可以基于相对生物利用度和施用的化合物的效力调节施用的剂量。基于上述方法和其它公知的方法调节剂量以实现最大功效在普通技术人员的能力内。下文总结了用于测定治疗有效性的一般原理，其可以在《古德曼和吉尔曼的治疗学的药理学基础(Goodman and Gilman's The PharmacologicalBasis of Therapeutics)》,第10版,麦格劳-希尔专业出版公司(McGraw-Hill)(纽约)(2001)的第1章中找到，所述文献以引用的方式并入本文中。

药代动力学原理为修改剂量方案以获得期望程度的治疗功效并且具有最小的不可接受的副作用提供了基础。在可以测量药物的血浆浓度并且与治疗窗口有关的情况下，可以获得针对剂量修改的另外的指导。

如本文所使用的，术语“治疗(treat/treating和/或treatment)”包含减轻、基本上抑制、减缓或逆转病状的进展，基本上改善病状的临床症状或基本上预防病状的临床症状的出现、获得有益或期望的临床结果。治疗进一步指代实现以下中的一个或多个：(a)降低病症的严重程度；(b)限制所治疗的一种或多种病症的症状特征的发展；(c)限制所治疗的一种或多种病症的症状特征的恶化；(d)限制先前患有病症的患者中的一种或多种病症的复发；以及(e)限制先前对于一种或多种病症无症状的患者中的症状的复发。

有益或期望的临床结果，如药理学和/或生理学作用，包含但不限于：预防可能易患有疾病、病症或病状但尚未经历或展现疾病的症状的个体出现所述疾病、病症或病状(防治性治疗)；缓解所述疾病、病症或病状的症状；减轻所述疾病、病症或病状的程度；稳定所述疾病、病症或病状(即，不恶化)；预防所述疾病、病症或病状的扩散；延迟或减缓所述疾病、病症或病状进展；改善或缓和所述疾病、病症或病状；以及其组合，以及与如果不接受治疗所预期的存活期相比，延长存活期。

如本文所使用的，术语“烷基”是指1个至20个碳原子的饱和一价烃基(即C_1-20烷基)。“一价”是指烷基与分子其余部分有一个连接点。在一个实施例中，烷基具有1至12个碳原子(即C_1-12烷基)或1至10个碳原子(即C_1-10烷基)。在一个实施例中，烷基具有1至8个碳原子(即C_1-8烷基)、1至7个碳原子(即C_1-7烷基)、1至6个碳原子(即C_1-6烷基)、1至4个碳原子(即C_1-4烷基)，或1至3个碳原子(即C_1-3烷基)。实例包含但不限于甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-丁基、2-甲基-1-丙基、2-丁基、2-甲基-2-丙基、1-戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基、3,3-二甲基-2-丁基、1-庚基、1-辛基等。直链或支链烷基，例如“直链或支链C_1-6烷基”、“直链或支链C_1-4烷基”，或“直链或支链C_1-3烷基”是指饱和一价烃基是直链或支链的。

如本文所用，术语“亚烷基”是指1至20个碳原子的饱和二价烃基(即C_1-20亚烷基)，其实例包含但不限于与上述示例烷基核心结构相同的饱和二价烃基。“二价”是指亚烷基与分子其余部分有两个连接点。在一个实施例中，亚烷基具有1至12个碳原子(即C_1-12亚烷基)或1至10个碳原子(即C_1-10亚烷基)。在一个实施例中，亚烷基具有1至8个碳原子(即C_1-8亚烷基)、1至7个碳原子(即C_1-7亚烷基)、1至6个碳原子(即C_1-6亚烷基)、1至4个碳原子(即C_1-4亚烷基)，或1至3个碳原子(即C_1-3亚烷基)、、亚乙基或亚甲基。直链或支链亚烷基，例如“直链或支链C_1-6亚烷基”、“直链或支链C_1-4亚烷基”，或“直链或支链C_1-3亚烷基”是指饱和二价烃基是直链或支链的。

术语“烯基”是指具有一个或多个(例如，一个或两个)碳-碳双键的直链或支链脂肪族烃基，其中所述烯基包含具有“顺式”和“反式”方向的基团，或通过替代命名法，“E”和“Z”方向。

如本文所使用的，“亚烯基”是指具有一个或两个碳-碳双键的2个至20个碳原子的脂肪族二价烃基(即C_2-20亚烯基)，其中所述亚烯基包含具有“顺式”和“反式”方向的基团，或通过替代命名法，“E”和“Z”方向。“二价”是指亚烯基与分子其余部分有两个连接点。在一个实施例中，亚烯基具有2至12个碳原子(即C_2-16亚烯基)、2至10个碳原子(即C_2-10亚烯基)。在一个实施例中，亚烯基具有2个至四个碳原子(C_2-4)。实例包含但不限于亚乙烯基(ethylenylene)或亚乙烯基(vinylene)(-CH＝CH-)、烯丙基(-CH₂CH＝CH-)等。直链或支链亚烯基，例如“直链或支链C_2-6亚烯基”、“直链或支链C_2-4亚烯基”或“直链或支链C_2-3亚烯基”是指不饱和二价烃基是直链或支链的。

如本文所使用的，“亚环烷基”是指具有3个至12个碳原子作为单环或7个至12个碳原子作为双环的二价饱和碳环基团。“二价”是指亚环烷基与分子其余部分具有两个连接点。在一个实施例中，亚环烷基是3元至7元单环或3元至6元单环。单环环烷基的实例包含但不限于亚环丙基、亚环丁基、亚环戊基、亚环己基、亚环庚基、亚环辛基、亚环壬基、亚环癸基、亚环十一烷基、亚环十二烷基等。在一个实施例中，亚环烷基是亚环丙基。

术语“杂环(heterocycle)”、“杂环基”、杂环的和“杂环(heterocyclic ring)”在本文中可互换使用，并且是指含有至少一个N原子、具有杂原子和任选地1个至3个选自N和S的另外的杂原子的环状基团，并且是非芳香族的(即，部分或完全饱和)。其可以是单环或双环的(桥接的或稠合的)。杂环的实例包含但不限于氮丙啶基、二氮丙啶基、噻氮丙啶基、氮杂环丁烷基、二氮杂环丁烷基、三氮杂环丁烷基、噻二氮杂环丁烷基、噻氮杂环丁烷基、吡咯烷基、吡唑烷基、咪唑啉基、异噻唑烷基、噻唑烷基、哌啶基、哌嗪基、六氢嘧啶基、氮杂环庚烷基、氮杂环辛烷基等。杂环含有1个至4个选自N和S的可相同或不同的杂原子。在一个实施例中，杂环含有个1至3个N原子。在另一个实施例中，杂环含有1个或2个N原子。在另一个实施例中，杂环含有1个N原子。“4元至8元杂环基”意指具有以单环排列的4个至8个原子(包含1个至4个选自N和S的杂原子，或1个至3个N原子，或1个或2个N原子，或1个N原子)的基团。“5元或6元杂环基”意指具有以单环排列的5个或6个原子(包含1个至4个选自N和S的杂原子，或1个至3个N原子，或1个或2个N原子，或1个N原子)的基团。术语“杂环”旨在包含所有可能的异构形式。杂环在以下中有所描述Paquette,Leo A.,《现代杂环化学原理(Principlesof Modern Heterocyclic Chemistry)》(W.A.Benjamin,纽约,1968)，特别是第1章、第3章、第4章、第6章、第7章和第9章；《杂环化合物的化学:一系列专著(The Chemistry ofHeterocyclic Compounds,ASeries of Monographs)》(纽约约翰威利父子出版公司，1950年至今)，特别是第13卷、第14卷、第16卷、第19卷和第28卷；以及《美国化学社会杂志(J.Am.Chem.Soc.)》(1960)82:5566。在可能的情况下，杂环基可以是连接到分子其余部分的碳(碳连接)或氮(氮连接)。

如果基团被描述为“任选取代的”，则所述基团可以是(1)未经取代的或(2)经取代的。如果基团的碳被描述为任选地被一系列取代基中的一个或多个取代基取代，则所述碳上的氢原子中的一个或多个氢原子(如果有的话)可以分别和/或一起被独立选择的任选取代基取代。

烷基、亚烷基、亚烯基、亚环烷基和杂环基的合适取代基是不会明显不利地影响双官能团化合物的生物活性的取代基。除非另有说明，这些基团的示例性取代基包含具有1个至10个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基，芳基、杂芳基、杂环基、卤素、胍基[-NH(C＝NH)NH₂]、-OR₁₀₀、NR₁₀₁R₁₀₂、-NO₂、-NR₁₀₁COR₁₀₂、-SR₁₀₀，-SOR₁₀₁表示的亚砜、-SO₂R₁₀₁表示的砜、磺酸盐-SO₃M、硫酸盐-OSO₃M、-SO₂NR₁₀₁R₁₀₂表示的磺酰胺、氰基、叠氮基、-COR₁₀₁、-OCOR₁₀₁、-OCONR₁₀₁R₁₀₂和聚乙二醇单元(-OCH₂CH₂)_nR₁₀₁，其中M是H或阳离子(如Na⁺或K⁺)；R₁₀₁、R₁₀₂和R₁₀₃各自独立地选自H，具有1个至10个碳原子的直链、支链或环状烷基、烯基或炔基，聚乙二醇单元(-OCH₂CH₂)_n-R₁₀₄(其中n是1至24的整数)，具有6个至10个碳原子的芳基，具有3个至10个碳原子的杂环和具有5个至10个碳原子的杂芳基；并且R₁₀₄为H或具有1个至4个碳原子的直链或支链烷基，其中R₁₀₀、R₁₀₁、R₁₀₂、R₁₀₃和R₁₀₄表示的基团中的烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基和杂环基任选地被一个或多个(例如，2个、3个、4个、5个、6个或更多个)取代基取代，所述取代基独立地选自卤素、-OH、-CN、-NO₂和具有1个至4个碳原子的未经取代的直链或支链烷基。优选地，上述任选取代的烷基、亚烷基、亚烯基、亚环烷基和杂环基的取代基选自由以下组成的组：卤素、-CN、-NR₁₀₁R₁₀₂、-CF₃、-OR₁₀₀、芳基、杂芳基、杂环基、-SR₁₀₁、-SOR₁₀₁、-SO₂R₁₀₁和-SO₃M。可替代地，合适的取代基选自由以下组成的组：卤素、-OH、-NO₂、-CN,C_1-4烷基、-OR₁₀₀、NR₁₀₁R₁₀₂、-NR₁₀₁COR₁₀₂、-SR₁₀₀、-SO₂R₁₀₁、-SO₂NR₁₀₁R₁₀₂、-COR₁₀₁、-OCOR₁₀₁和-OCONR₁₀₁R₁₀₂，其中R₁₀₀、R₁₀₁和R₁₀₂各自独立地为-H或C_1-4烷基。

如本文所使用的，“卤素”是指F、Cl、Br或I。“氰基”是-CN。

如本文所使用的，“胺”或“氨基”可互换地指含有具有孤对的碱性氮原子的官能团。

如本文所使用的，术语“药学上可接受的盐”是指本公开的可电离脂质的药学上可接受的有机或无机盐。示例性盐包含但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸性磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、丹宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、蔗糖盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐(methanesulfonate，mesylate)、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、双羟萘酸盐(即，1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))、碱金属(例如，钠和钾)盐、碱土金属(例如，镁)盐和铵盐。药学上可接受的盐可以涉及包含另一种分子，如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其它抗衡离子。抗衡离子可以是能稳定母体化合物上电荷的任何有机或无机部分。此外，药学上可接受的盐可以在其结构中具有多于一个的带电原子。多个带电原子是药学上可接受的盐的一部分的实例可以具有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可以具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。

本文公开的替代要素或实施例的分组不应解释为限制。每个组成员可以被单独地或者与所述组中的其它成员或本文发现的其它要素以任何组合的方式被引用和保护。出于便利性和/或可专利性的原因，一个组中的一个或多个成员可以包含在一个组中或从中删除。当发生任何这种包含或删除时，在本文中所述说明书被认为含有修改的组，从而满足所附权利要求书中使用的所有马库什群组(Markush group)的书面描述。

在任何方面的一些实施例中，本文描述的公开内容不涉及用于克隆人类的工艺、用于修饰人类的种系遗传身份的工艺、用于工业或商业目的的人胚胎的用途、或用于修饰动物的基因身份，从而可能导致其遭受痛苦而对人或动物没有任何实质性医学益处的工艺，以及由这类工艺产生的动物。

本文在本公开的各个方面的描述内定义了其它术语。

本申请全文中引用的所有专利和其它出版物，包含参考文献、授权专利、已发布的专利申请和共同待决的专利申请，以引用的方式明确地并入本文中，以描述和公开例如，在这些出版物中描述的可以与本文所述的技术结合使用的方法。提供这些出版物仅仅是出于其在本申请的提交日期之前的公开内容而提供。关于这一点，任何内容都不应被解释为承认发明者无权借助先前公开或出于任何其它原因而提前所述公开。关于这些文件的日期或内容的所有陈述均基于申请人可获得的信息，并且不构成对这些文件的日期或内容的正确性的承认。

对本公开的实施例的描述不旨在是详尽的或将本公开限制为所公开的精确形式。尽管本文出于说明性目的描述了本公开的特定实施例和实例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开的范围内可以进行各种等效修改。例如，虽然以给定的顺序呈现了方法步骤或功能，但是替代性实施例可以以不同的顺序执行功能，或者可以基本上同时执行功能。本文提供的本公开的教导可以适当地应用于其它过程或方法。可以将本文所描述的各个实施例进行组合以提供另外的实施例。如有必要，可以对本公开的各方面进行修改，以利用上述参考文献和申请中的组合物、功能及概念来提供本公开的又一实施例。此外，由于生物功能等效性的考虑，可以在不影响生物作用的种类或数量的情况下在蛋白质结构中进行一些改变。可以根据详细描述对本公开做出这些和其它改变。所有这种修改旨在包含在所附权利要求书的范围内。

前述实施例中任一个的特定元件可以与其它实施例中的元件组合或替代其它实施例中的元件。此外，尽管已经在这些实施例的上下文中描述了与本公开的某些实施例相关联的优点，但是其它实施例也可以展现出此些优点并且并非所有的实施例都必需展现出此些优点才能落入本公开的范围内。

通过以下实例进一步说明了本文所描述的技术，但是这些实例决不应被解释为进一步的限制。应理解，本公开不以任何方式限制于本文所描述的特定方法、方案和试剂等，并且因此可以变化。本文中所使用的术语仅是出于描述特定实施例的目的，并且并不旨在限制本公开的范围，本公开的范围仅仅由权利要求限定。

II.脂质纳米颗粒组合物

本文提供了包括脂质纳米颗粒(LNP)的药物组合物，其中所述LNP包括脂质和刚性治疗性核酸(rTNA)，其中所述LNP的平均直径介于约20nm与约70nm之间。本文所描述的LNP提供了许多治疗优点，包含可以封装大的刚性治疗性核酸分子的较小尺寸。根据一些实施例，所述脂质是阳离子脂质。根据一些实施例，所述刚性治疗性核酸是末端封闭式DNA(ceDNA)。根据一些实施例，所述LNP进一步包括非阳离子脂质。根据一些实施例，所述LNP进一步包括甾醇或其衍生物。根据一些实施例，所述LIP进一步包括与脂质缀合的PEG。

阳离子脂质

在一些实施例中，平均直径为20nm至74nm的脂质纳米颗粒包括阳离子脂质。在一些实施例中，所述阳离子脂质是例如非融合阳离子脂质。“非融合阳离子脂质”是指可以缩合和/或封装核酸货物(如ceDNA)但不具有融合活性或具有非常小的融合活性的阳离子脂质。

在一些实施例中，所述阳离子脂质在下方表1中列出的国际和美国专利申请公开中描述，并且通过例如不可渗透膜荧光染料排除测定(例如，本文实例部分中描述的测定)确定为非融合的。以下表1中列出的所有这些专利文件国际和美国专利申请公开的内容通过全文引用的方式并入本文。

表1.描述阳离子或可电离脂质的示例性专利文件

在一些实施例中，阳离子脂质选自由以下组成的组：N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)；N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)；1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DLEPC)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆(DMEPC)；1,2-二甲基苯乙烯基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(14:1)、N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基丙基)氨基丁基甲酰胺基乙基11-3、4-二-[油氧基]-苯甲酰胺(MVL5)；二十八烷基酰胺基甘氨酰精胺(DOGS)；3b-[N-(N',N'-二甲氨基乙基)碳甲酰基]胆固醇(DC-Chol)；双十八烷基二甲基溴化铵(DDAB)；Saint脂质(例如，SAINT-2，N-甲基1-4-(二醇基)甲基吡啶)；1,2-二甲基乙氧基丙基1-3-二甲基羟乙基溴化铵(DMRIE)；1,2-二羟基1-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORIE)；1,2-二乙氧基丙基1-3-二甲基羟乙基氯化铵(DORI)；二烷基化氨基酸(DILA2)(例如C18:1-norArg-C16)；二氧二甲基氯化铵(DODAC)；1-棕榈酰基1-2-油酰基-sn-甘油-3-乙基磷胆碱(POEPC)；和1,2-二甲基苯乙烯基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(MOEPC)。在一些变型中，缩合剂，例如阳离子脂质是脂质，例如，双十八烷基二甲基溴化铵(DDAB)、1,2-二亚油酰氧基-3-二甲基氨丙烷(DLinDMA)、2,2-二亚油基1-4-(2二甲氨基甲基)-[1,31-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、1,2-二油酰基-3-二甲基氨丙烷(DODAP)，1,2-二油酰氧基-3-二甲基氨丙烷(DODMA)，吗啉胆固醇(Mo-CHOL)、(R)-5-(二甲基氨基)戊烷-1,2-二基1二醇酯盐酸盐(DODAPen-C1)、(R)-5-胍戊烷-1,2-双y1二醇酸酯盐酸盐(DOPen-G)、(R)-N,N,N-三甲基1-4,5-双(油酰基氧基)戊烷-1-氯化铵(DOTAPen)。

在一些实施例中，缩合脂质是DOTAP。

可电离脂质

根据一些实施例，本文还提供了含有平均直径为20nm至70nm的LNP的药物组合物，所述LNP包括可电离脂质和刚性治疗性核酸样非病毒载体(例如，ceDNA)。此类LNP可以用于将例如无衣壳的非病毒DNA载体递送到所关注的靶位点(例如，细胞、组织、器官等)。

示例性可电离脂质描述于国际PCT专利公开WO2015/095340、WO2015/199952、WO2018/011633、WO2017/049245、WO2015/061467、WO2012/040184、WO2012/000104、WO2015/074085、WO2016/081029、WO2017/004143、WO2017/075531、WO2017/117528、WO2011/022460、WO2013/148541、WO2013/116126、WO2011/153120、WO2012/044638、WO2012/054365、WO2011/090965、WO2013/016058、WO2012/162210、WO2008/042973、WO2010/129709、WO2010/144740、WO2012/099755、WO2013/049328、WO2013/086322、WO2013/086373、WO2011/071860、WO2009/132131、WO2010/048536、WO2010/088537、WO2010/054401、WO2010/054406、WO2010/054405、WO2010/054384、WO2012/016184、WO2009/086558、WO2010/042877、WO2011/000106、WO2011/000107、WO2005/120152、WO2011/141705、WO2013/126803、WO2006/007712、WO2011/038160、WO2005/121348、WO2011/066651、WO2009/127060、WO2011/141704、WO2006/069782、WO2012/031043、WO2013/006825、WO2013/033563、WO2013/089151、WO2017/099823、WO2015/095346和WO2013/086354；以及美国专利公开US2016/0311759、US2015/0376115、US2016/0151284、US2017/0210697、US2015/0140070、US2013/0178541、US2013/0303587、US2015/0141678、US2015/0239926、US2016/0376224、US2017/0119904、US2012/0149894、US2015/0057373、US2013/0090372、US2013/0274523、US2013/0274504、US2013/0274504、US2009/0023673、US2012/0128760、US2010/0324120、US2014/0200257、US2015/0203446、US2018/0005363、US2014/0308304、US2013/0338210、US2012/0101148、US2012/0027796、US2012/0058144、US2013/0323269、US2011/0117125、US2011/0256175、US2012/0202871、US2011/0076335、US2006/0083780、US2013/0123338、US2015/0064242、US2006/0051405、US2013/0065939、US2006/0008910、US2003/0022649、US2010/0130588、US2013/0116307、US2010/0062967、US2013/0202684、US2014/0141070、US2014/0255472、US2014/0039032、US2018/0028664、US2016/0317458和US2013/0195920，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。

在一些实施例中，所述可电离脂质是具有以下结构的MC3(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)：

脂质DLin-MC3-DMA描述于以下文献中：Jayaraman等人,《化学应用英文国际版(Angew.Chem.Int.Ed Engl.)》(2012),51(34):8529-8533，所述文献内容通过全文引用的方式并入本文。

在一些实施例中，可电离脂质是如WO2015/074085中所描述的脂质ATX-002，所述文献内容通过全文引用的方式并入本文。

在一些实施例中，可电离脂质是如WO2012/040184中所描述的(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺(化合物32)，所述文献内容通过全文引用的方式并入本文。

在一些实施例中，可电离脂质是如WO2015/199952中所描述的化合物6或化合物22，所述文献内容通过全文引用的方式并入本文。

式(I)和式(I')

根据一些实施例，所述可电离脂质由以下表示：式(I)：

或其药学上可接受的盐，其中：

R¹和R¹'各自独立地为C_1-3亚烷基；

R²和R²'各自独立地为直链或支链C_1-6亚烷基或C_3-6亚环烷基；

R³和R³'各自独立地为任选取代的C_1-6烷基或任选取代的C_3-6环烷基；

或可替代地，当R²为支链C_1-6亚烷基并且当R³为C_1-6烷基时，R²和R³与其居间N原子一起形成4元至8元杂环基；

或可替代地，当R²'为支链C_1-6亚烷基并且当R³'为C_1-6烷基时，R²'和R³'与其居间N原子一起形成4元至8元杂环基；

R⁴和R⁴'各自独立地为–CH、–CH₂CH或–(CH₂)₂CH；

R⁵和R⁵'各自独立地为C_1-20亚烷基或C_2-20亚烯基；

m和n各自独立地是选自1、2、3、4和5的整数。

可替代地，根据一些实施例，所述可电离脂质由以下表示：式(I')：

或其药学上可接受的盐，其中：

R¹和R¹'各自独立地为C_1-3亚烷基；

R⁴和R⁴'各自独立地为–CH、–CH₂CH或–(CH₂)₂CH；

R⁵和R⁵'各自独立地为氢、C_1-20亚烷基或C_2-20亚烯基；

m和n各自独立地是选自1、2、3、4和5的整数。

根据本文任何方面的一些实施例或实施例，R²和R²'各自独立地为C_1-3亚烷基。

根据本文任何方面的一些实施例或实施例，由R¹或R¹'表示的直链或支链C_1-3亚烷基、由R²或R²'表示的直链或支链C_1-6亚烷基和任选取代的直链或支链C_1-6烷基各自任选地被一个或多个卤基和氰基取代。

根据本文任何方面的一些实施例或实施例，R¹和R²合在一起为C_1-3亚烷基，并且R¹'和R²'合在一起为C_1-3亚烷基，例如乙烯。

根据本文任何方面的一些实施例或实施例，R³和R³'各自独立地为任选取代的C_1-3烷基，例如，甲基。

根据本文任何方面的一些实施例或实施例，R⁴和R⁴'各自为-CH。

根据本文任何方面的一些实施例或实施例，R²为任选取代的支链C_1-6亚烷基；并且R²和R³与其居间N原子一起形成5元或6元杂环基。根据本文任何方面的一些实施例或实施例，R²'为任选取代的支链C_1-6亚烷基；并且R²'和R³'与其居间N原子一起形成5元或6元杂环基，如吡咯烷基或哌啶基。

根据本文任何方面的一些实施例或实施例，R⁴为–C(R^a)₂CR^a或–[C(R^a)₂]₂CR^a，并且R^a为C_1-3烷基；并且R³和R⁴与其居间N原子一起形成5元或6元杂环基。根据本文任何方面的一些实施例或实施例，R⁴'为–C(R^a)₂CR^a或–[C(R^a)₂]₂CR^a，并且R^a为C_1-3烷基；并且R³'和R⁴'与其居间N原子一起形成5元或6元杂环基，如吡咯烷基或哌啶基。

根据本文任何方面的一些实施例或实施例，R⁵和R⁵'各自独立地为C_1-10亚烷基或C_2-10亚烯基。在一个实施例中，R⁵和R⁵'各自独立地为C_1-8亚烷基或C_1-6亚烷基。

根据本文任何方面的一些实施例或实施例，R⁶和R⁶'每次出现时独立地为C_1-10亚烷基、C_3-10亚环烷基或C_2-10亚烯基。在一个实施例中，C_1-6亚烷基、C_3-6亚环烷基或C_2-6亚烯基。在一个实施例中，C_3-10亚环烷基或C_3-6亚环烷基为亚环丙基。根据本文任何方面的一些实施例或实施例，m和n各自为3。

根据本文任何方面的一些实施例或实施例，可电离脂质选自表2中的脂质或其药学上可接受的盐中的任何一种。

表2.式(I)或(I')的示例性可电离脂质

式(II)

在一些方面，可电离脂质为：式(II)：

或其药学上可接受的盐，其中：

a是范围为1至20的整数(例如，a是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)；

b是范围为2至10的整数(例如，b是2、3、4、5、6、7、8、9或10)；

R²是(C₂-C₂₀)烷基。

在第二化学实施例中，式(II)的可电离脂质具有式(XIII)：

或其药学上可接受的盐，其中c和d各自独立地为范围为1至8的整数(例如1、2、3、4、5、6、7或8)，并且其中剩余变量如针对式(XII)所描述的。

在第三化学实施例中，式(II)或(III)的可电离脂质中的c和d各自独立地为范围为2至8、3至8、3至7、3至6、3至5、4至8、4至7、4至6、5至8、5至7或6至8的整数，其中剩余变量如针对式(XII)所描述的。

在第四化学实施例中，式(II)或(III)的可电离脂质中的c为2、3、4、5、6、7或8，其中剩余变量如针对式(XII)或第二或第三化学实施例所描述的。可替代地，作为第四化学实施例的一部分，式(XII)或(XIII)或其药学上可接受的盐的可电离脂质中的c和d各自独立地为1、3、5或7，其中剩余变量如针对式(XII)或第二或第三化学实施例所描述的。

在第五化学实施例中，式(II)或(III)的可电离脂质中的d为2、3、4、5、6、7或8，其中剩余变量如针对式(II)或第二或第三或第四化学实施例所描述的。可替代地，作为第四化学实施例的一部分，式(II)或(III)或其药学上可接受的盐的可电离脂质中的c和d中的至少一个为7，其中剩余变量如针对式(II)或第二或第三或第四化学实施例所描述的。

在第六化学实施例中，式(II)或(III)的可电离脂质具有式(IV)：

或其药学上可接受的盐，其中剩余变量如针对式(I)所描述的。

在第七化学实施例中，式(II)、(III)或(IV)的可电离脂质中的b是范围为3至9的整数，其中剩余变量如针对式(II)或第二、第三、第四或第五化学实施例所描述的。可替代地，作为第七化学实施例的一部分，式(II)、(III)或(IV)的可电离脂质中的b是范围为3至8、3至7、3至6、3至5、4至9、4至8、4至7、4至6、5至9、5至8、5至7、6至9、6至8或7至9的整数，其中剩余变量如针对式(II)或第二、第三、第四或第五化学实施例所描述的。在另一个替代方案中，作为第七化学实施例的一部分，式(II)、(III)或(IV)的可电离脂质中的b是3、4、5、6、7、8或9，其中剩余变量如针对式(XII)或第二、第三、第四或第五化学实施例所描述的。

在第八化学实施例中，式(II)、(III)或(IV)的可电离脂质中的a是范围为2至18的整数，其中剩余变量如针对式(II)或第二、第三、第四、第五或第七化学实施例所描述的。可替代地，作为第八实施例的一部分，在式(II)、(III)或(IV)的可电离脂质中，a是范围为2至18、2至17、2至16、2至15、2至14、2至13、2至12、2至11、2至10、2至9、2至8、2至7、2至6、2至5、2至4、3至18、3至17、3至16、3至15、3至14、3至13、3至12、3至11、3至10、3至9、3至8、3至7、3至6、3至5、4至18、4至17、4至16、4至15、4至14、4至13、4至12、4至11、4至10、4至9、4至8、4至7、4至6、5至18、5至17、5至16、5至15、5至14、5至13、5至12、5至11、5至10、5至9、25至8、5至7、6至18、6至17、6至16、6至15、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、6至9、6至8、7至18、7至17、7至16、7至15、7至14、7至13、7至12、7至11、7至10、7至9、8至18、8至17、8至16、8至15、8至14、8至13、8至12、8至11、8至10、9至18、9至17、9至16、9至15、9至14、9至13、9至12、9至11、10至18、10至17、10至16、10至15、10至14、10至13、11至18、11至17、11至16、11至15、11至14、11至13、12至18、12至17、12至16、12至15、12至14、13至18、13至17、13至16、13至15、14至18、14至17、14至16、15至18、15至17或16至18的整数，其中剩余变量如针对式(II)或第二、第三、第四、第五或第七化学实施例所描述的。在另一个替代方案中，作为第八实施例的一部分，式(II)、(III)或(IV)的可电离脂质中的a是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18，其中剩余变量如针对式(II)或第二、第三、第四、第五或第七化学实施例所描述的。

在第九化学实施例中，式(II)、(III)或(IV)或其药学上可接受的盐的可电离脂质中的R¹不存在或为选自(C₅-C₁₅)烯基、-C(O)O(C₄-C₁₈)烷基和被(C₄-C₁₆)烷基取代的环丙基，其中剩余变量如针对式(II)、(III)或(IV)或第二、第三、第四、第五、第七或第八化学实施例所描述的。可替代地，作为第九化学实施例的一部分，式(II)、(III)或(IV)或其药学上可接受的盐的可电离脂质中的R¹不存在或为选自(C₅-C₁₅)烯基、-C(O)O(C₄-C₁₆)烷基和被(C₄-C₁₆)烷基取代的环丙基，其中剩余变量如针对式(II)、(III)或(IV)或第二、第三、第四、第五、第七或第八化学实施例所描述的。可替代地，作为第九化学实施例的一部分，式(II)、(III)或(IV)或其药学上可接受的盐的可电离脂质中的R¹不存在或为选自(C₅-C₁₂)烯基、-C(O)O(C₄-C₁₂)烷基和被(C₄-C₁₂)烷基取代的环丙基，其中剩余变量如针对式(II)、(III)或(IV)或第二、第三、第四、第五、第七或第八化学实施例所描述的。在另一个替代方案中，作为第九化学实施例的一部分，式(II)、(III)或(IV)或其药学上可接受的盐的可电离脂质中的R¹不存在或为选自(C₅-C₁₀)烯基、-C(O)O(C₄-C₁₀)烷基和被(C₄-C₁₀)烷基取代的环丙基，其中剩余变量如针对式(II)、(III)或(IV)或第二、第三、第四、第五、第七或第八化学实施例所描述的。

在第十化学实施例中，R¹为C₁₀烯基，其中剩余变量如前述实施例中任一项所描述的。

在第十一化学实施例中，式(II)、(III)或(IV)或其药学上可接受的盐的可电离脂质中的R¹的C(O)O(C₂-C₂₀)烷基、-C(O)O(C₄-C₁₈)烷基、-C(O)O(C₄-C₁₂)烷基或-C(O)O(C₄-C₁₀)烷基中的烷基是非支链烷基，其中剩余变量如前述实施例中任一项所描述的。在一个化学实施例中，R¹为-C(O)O(C₉烷基)。可替代地，在第十一化学实施例中，式(II)、(III)或(IV)或其药学上可接受的盐的可电离脂质中的R¹的-C(O)O(C₄-C₁₈)烷基、-C(O)O(C₄-C₁₂)烷基或-C(O)O(C₄-C₁₀)烷基中的烷基是支链烷基，其中剩余变量如前述化学实施例中任一项所描述的。在一个化学实施例中，R¹为-C(O)O(C₁₇烷基)，其中剩余变量如前述化学实施例中任一项所描述的。

在第十二化学实施例中，式(II)、(III)或(IV)或其药学上可接受的盐的可电离脂质中的R¹选自下表3中列出的任何基团，其中每个基团中的波浪键表示所述基团与脂质分子的其余部分的连接点，并且其中剩余变量如针对式(II)、(III)或(IV)或第二、第三、第四、第五、第七或第八化学实施例所描述的。本公开进一步设想表4中的R¹基团中的任何一个与表5中的R²基团中的任何一个的组合，其中剩余变量如针对式(II)、(III)或(IV)或第二、第三、第四、第五、第七或第八化学实施例所描述的。

表3.式(II)、(III)或(IV)中的示例性R¹基团

在第十三化学实施例中，式(II)或其药学上可接受的盐的可电离脂质中的R²选自下表4中列出的任何基团，其中每个基团中的波浪键表示所述基团与脂质分子的其余部分的连接点，并且其中剩余变量如针对式(II)或第七、第八、第九、第十或第十一化学实施例所描述的。

表4.式(II)中的示例性R²基团

具体实例在下面的例示部分的表5中提供，并且作为式(II)的可电离脂质的第十四化学实施例的一部分包含在本文中。还包含药学上可接受的盐以及电离和中性形式。

表5.式(II)、(III)或(IV)的示例性可电离脂质

式(V)

在一些方面，可电离脂质为：式(V)：

或其药学上可接受的盐，其中：

R²和R²'各自独立地为(C₁-C₂)亚烷基；

R⁴和R⁴'各自为被–C(O)O-中断的(C₂-C₆)亚烷基；

R^a和R^b各自为卤基或氰基。

在第二化学方面中，式(V)的可电离脂质中的R¹和R¹'各自独立地为(C₁-C₆)亚烷基，其中剩余变量如上文针对式(V)所描述的。可替代地，作为第二化学方面的一部分，式(V)的可电离脂质中的R¹和R¹'各自独立地为(C₁-C₃)亚烷基，其中剩余变量如上文针对式(V)所描述的。

在第三化学方面，式(V)的可电离脂质为

式(VI)：

或其药学上可接受的盐，其中剩余变量如上文针对式(V)所描述的。

在第四化学方面中，式(V)的可电离脂质为式(VII)或(VIII)：

在第五化学方面中，式(V)的可电离脂质为式(IX)或(VI)：

在第六化学方面中，式(V)的可电离脂质为式(XI)、(XII)、(XIII)或(XIV)：

或其药学上可接受的盐，其中剩余变量如上文针对式(XV)所描述的。

在第七化学方面中，式(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)或(XIV)的可电离脂质中的R⁵和R⁵'中的至少一个为支链烷基或支链烯基(碳原子数量如上文针对式(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)或(XIV)所描述的)。在另一个替代方案中，作为第七化学方面的一部分，式(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)或(XIV)的可电离脂质中的R⁵和R⁵'中的一个为支链烷基或支链烯基。在另一个替代方案中，作为第七化学方面的一部分，式(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)或(XIV)的可电离脂质中的R⁵为支链烷基或支链烯基。在另一个替代方案中，作为第七化学方面的一部分，式(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)或(XIV)的可电离脂质中的R⁵'为支链烷基或支链烯基。

在第八化学方面中，式(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)或(XIV)的可电离脂质中的R⁵为(C₆-C₂₆)烷基或(C₆-C₂₆)烯基，其中的每一个任选地被–C(O)O-或(C₃-C₆)环烷基中断，其中剩余变量如上文针对式(I)所描述的。可替代地，作为第七化学方面的一部分，式(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)或(XIV)的可电离脂质中的R⁵为(C₆-C₂₆)烷基或(C₆-C₂₆)烯基，其中的每一个任选地被–C(O)O-或(C₃-C₅)环烷基中断，其中剩余变量如上文针对式(V)所描述的。在另一个替代方案中，作为第八化学方面的一部分，式(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)或(XIV)的可电离脂质中的R⁵为(C₇-C₂₆)烷基或(C₇-C₂₆)烯基，其中的每一个任选地被–C(O)O-或(C₃-C₅)环烷基中断，其中剩余变量如上文针对式(V)所描述的。在另一个替代方案中，作为第八化学方面的一部分，式(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)或(XIV)的可电离脂质中的R⁵为(C₈-C₂₆)烷基或(C₈-C₂₆)烯基，其中的每一个任选地被–C(O)O-或(C₃-C₅)环烷基中断，其中剩余变量如上文针对式(V)所描述的。在另一个替代方案中，作为第八化学方面的一部分，式(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)或(XIV)的可电离脂质中的R⁵为(C₆-C₂₄)烷基或(C₆-C₂₄)烯基，其中的每一个任选地被–C(O)O-或环丙基中断，其中剩余变量如上文针对式(V)所描述的。在另一个替代方案中，作为第八化学方面的一部分，式(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)或(XIV)的可电离脂质中的R⁵为(C₈-C₂₄)烷基或(C₈-C₂₄)烯基，其中所述(C₈-C₂₄)烷基任选地被–C(O)O-或环丙基中断，其中剩余变量如上文针对式(V)所描述的。在另一个替代方案中，作为第八化学方面的一部分，式(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)或(XIV)的可电离脂质中的R⁵为(C₈-C₁₀)烷基，其中剩余变量如上文针对式(V)所描述的。在另一个替代方案中，作为第八化学方面的一部分，式(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)或(XIV)的可电离脂质中的R⁵为被环丙基中断的(C₁₄-C₁₆)烷基，其中剩余变量如上文针对式(V)所描述的。在另一个替代方案中，作为第八化学方面的一部分，式(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)或(XIV)的可电离脂质中的R⁵为被–C(O)O-中断的(C₁₀-C₂₄)烷基，其中剩余变量如上文针对式(V)所描述的。在另一个替代方案中，作为第八化学方面的一部分，式(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)或(XIV)的可电离脂质中的R⁵为(C₁₆-C₁₈)烯基，其中剩余变量如上文针对式(V)所描述的。在另一个替代方案中，作为第八化学方面的一部分，式(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)或(XIV)的可电离脂质中的R⁵为–(CH₂)₃C(O)O(CH₂)₈CH₃、–(CH₂)₅C(O)O(CH₂)₈CH₃、–(CH₂)₇C(O)O(CH₂)₈CH₃、–(CH₂)₇C(O)OCH[(CH₂)₇CH₃]₂、–(CH₂)₇-C₃H₆-(CH₂)₇CH₃、–(CH₂)₇CH₃、–(CH₂)₉CH₃、–(CH₂)₁₆CH₃、–(CH₂)₇CH＝CH(CH₂)₇CH₃或–(CH₂)₇CH＝CHCH₂CH＝CH(CH₂)₄CH₃，其中剩余变量如上文针对式(XV)所描述的。

在第九化学方面中，式(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)或(XIV)的可电离脂质中的R⁵'为被–C(O)O-中断的(C₁₅-C₂₈)烷基，其中剩余变量如上文针对式(V)或第八化学方面所描述的。可替代地，作为第九化学方面的一部分，式(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)或(XIV)的可电离脂质中的R⁵'为被–C(O)O-中断的(C₁₇-C₂₈)烷基，其中剩余变量如上文针对式(V)或第八化学方面所描述的。在另一个替代方案中，作为第九实施例的一部分，式(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)或(XIV)的可电离脂质中的R⁵'为被–C(O)O-中断的(C₁₉-C₂₈)烷基，其中剩余变量如上文针对式(V)或第八化学方面所描述的。在另一个替代方案中，作为第九化学方面的一部分，式(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)或(XIV)的可电离脂质中的R⁵'为被–C(O)O-中断的(C₁₇-C₂₆)烷基，其中剩余变量如上文针对式(V)或第八化学方面所描述的。在另一个替代方案中，作为第九实施例的一部分，式(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)或(XIV)的可电离脂质中的R⁵'为被–C(O)O-中断的(C₁₉-C₂₆)烷基，其中剩余变量如上文针对式(V)或第八化学方面所描述的。在另一个替代方案中，作为第九化学方面的一部分，式(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XI)、(XII)、(XIII)或(XIV)的可电离脂质中的R⁵'为被–C(O)O-中断的(C₂₀-C₂₆)烷基，其中剩余变量如上文针对式(V)或第八化学方面所描述的。在另一个替代方案中，作为第九实施例的一部分，R⁵'为被–C(O)O-中断的(C₂₂-C₂₄)烷基，其中剩余变量如上文针对式(V)或第八化学方面所描述的。在另一个替代方案中，作为第九实施例的一部分，R⁵'为–(CH₂)₅C(O)OCH[(CH₂)₇CH₃]₂、–(CH₂)₇C(O)OCH[(CH₂)₇CH₃]₂、–(CH₂)₅C(O)OCH(CH₂)₂[(CH₂)₇CH₃]₂或–(CH₂)₇C(O)OCH(CH₂)₂[(CH₂)₇CH₃]₂，其中剩余变量如上文针对式(V)或第八化学方面所描述的。

另一方面，式(V)、(VI)、(VIII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XII)、(XIII)或(XIV)的可电离脂质可以选自表6中的以下脂质中的任何一种或其药学上可接受的盐。

表6.式(V)、(VI)、(VIII)、(VIII)、(IX)、(X)、(XII)、(XIII)或(XIV)的示例性可电离脂质

式(XV)

在一些方面，可电离脂质为：式(XV)：

或其药学上可接受的盐，其中：

R¹和R²各自独立地为氢、C₁-C₆烷基或C₂-C₆烯基；

R³为C₁-C₁₂亚烷基或C₂-C₁₂亚烯基；

R⁴为C₁-C₁₆非支链烷基、C₂-C₁₆非支链烯基或

其中：

R⁵不存在、为C₁-C₈亚烷基或C₂-C₈亚烯基；

R^a每次出现时独立地为氢或C₁-C₆烷基；并且

n是选自1、2、3、4、5和6的整数。

在第二实施例中，在根据第一实施例的可电离脂质或其药学上可接受的盐中，X¹和X²是相同的；并且所有其它剩余变量如针对式(V)或第一实施例所描述的。

在第三实施例中，在根据第一或第二实施例的可电离脂质或其药学上可接受的盐中，X¹和X²各自独立地为-OC(＝O)-、-SC(＝O)-、-OC(＝S)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)S-或-S-S-；或X¹和X²各自独立地为-C(＝O)O-、-C(＝O)S-或-S-S-；或X¹和X²各自独立地为-C(＝O)O-或-S-S-；并且所有其它剩余变量如针对式V或前述实施例中任一项所描述的。

在第四实施例中，本公开的可电离脂质由以下表示：式(XVI)：

或其药学上可接受的盐，其中n是选自1、2、3和4的整数；并且所有其它剩余变量如针对式(XV)或前述实施例中任一项所描述的。

在第五实施例中，本公开的可电离脂质由以下表示：式(XVII)：

或其药学上可接受的盐，其中n是选自1、2和3的整数；并且所有其它剩余变量如针对式(XV)、式(XVI)或前述实施例中任一项所描述的。

在第六实施例中，本公开的可电离脂质由以下表示：式(XVIII)：

或其药学上可接受的盐，并且所有其它剩余变量如针对式(XV)、式(XVI)、式(XVII)或前述实施例中任一项所描述的。

在第七实施例中，在根据式(XV)、式(XVI)、式(XVII)或式(XVIII)或前述实施例中任一项所述的可电离脂质或其药学上可接受的盐中，R¹和R²各自独立地为氢、C₁-C₆烷基或C₂-C₆烯基、或C₁-C₅烷基或C₂-C₅烯基、或C₁-C₄烷基或C₂-C₄烯基、或C₆烷基、或C₅烷基、或C₄烷基、或C₃烷基、或C₂烷基、或C₁烷基、或C₆烯基、或C₅烯基、或C₄烯基、或C₃烯基、或C₂烯基；并且所有其它剩余变量如针对式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)或前述实施例中任一项所描述的。

在第八实施例中，本公开的可电离脂质由以下表示：式(XIX)：

或其药学上可接受的盐，并且所有其它剩余变量如针对式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)或前述实施例中任一项所描述的。

在第九实施例中，在根据式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)或前述实施例中任一项所述的可电离脂质或其药学上可接受的盐中，R³为C₁-C₉亚烷基或C₂-C₉亚烯基、C₁-C₇亚烷基或C₂-C₇亚烯基、C₁-C₅亚烷基或C₂-C₅亚烯基、或C₂-C₈亚烷基或C₂-C₈亚烯基、或C₃-C₇亚烷基或C₃-C₇亚烯基、或C₅-C₇亚烷基或C₅-C₇亚烯基；或R³为C₁₂亚烷基、C₁₁亚烷基、C₁₀亚烷基、C₉亚烷基、或C₈亚烷基、或C₇亚烷基、或C₆亚烷基、或C₅亚烷基、或C₄亚烷基、或C₃亚烷基、或C₂亚烷基、或C₁亚烷基、或C₁₂亚烯基、C₁₁亚烯基、C₁₀亚烯基、C₉亚烯基、或C₈亚烯基、或C₇亚烯基、或C₆亚烯基、或C₅亚烯基、或C₄亚烯基、或C₃亚烯基、或C₂亚烯基；并且所有其它剩余变量如针对式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)或前述实施例中任一项所描述的。可替代地，作为第九实施例的一部分，在根据式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)或前述实施例中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中，R³为C₁-C₉亚烷基或C₂-C₉亚烯基、C₁-C₇亚烷基或C₂-C₇亚烯基、C₁-C₆亚烷基或C₂-C₆亚烯基、C₁-C₅亚烷基或C₂-C₅亚烯基、或C₂-C₈亚烷基或C₂-C₈亚烯基、或C₃-C₇亚烷基或C₃-C₇亚烯基、或C₅-C₇亚烷基或C₅-C₇亚烯基；或R³为C₁₂亚烷基、C₁₁亚烷基、C₁₀亚烷基、C₉亚烷基、或C₈亚烷基、或C₇亚烷基、或C₆亚烷基、或C₅亚烷基、或C₄亚烷基、或C₃亚烷基、或C₂亚烷基、或C₁亚烷基、或C₁₂亚烯基、C₁₁亚烯基、C₁₀亚烯基、C₉亚烯基、或C₈亚烯基、或C₇亚烯基、或C₆亚烯基、或C₅亚烯基、或C₄亚烯基、或C₃亚烯基、或C₂亚烯基；并且所有其它剩余变量如针对式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)或前述实施例中任一项所描述的。

在第十实施例中，在根据式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)或前述实施例中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中，R⁵不存在，为C₁-C₆亚烷基或C₂-C₆亚烯基；或R⁵不存在，为C₁-C₄亚烷基或C₂-C₄亚烯基；或R⁵不存在；或R⁵为C₈亚烷基、C₇亚烷基、C₆亚烷基、C₅亚烷基、C₄亚烷基、C₃亚烷基、C₂亚烷基、C₁亚烷基、C₈亚烯基、C₇亚烯基、C₆亚烯基、C₅亚烯基、C₄亚烯基、C₃亚烯基或C₂亚烯基；并且所有其它剩余变量如针对式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)或前述实施例中任一项所描述的。

在第十一实施例中，在根据式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)或前述实施例中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中，R⁴为C₁-C₁₄非支链烷基、C₂-C₁₄非支链烯基或

其中R^4a和R^4b各自独立地为C₁-C₁₂非支链烷基或C₂-C₁₂非支链烯基；或R⁴为C₂-C₁₂非支链烷基或C₂-C₁₂非支链烯基；或R⁴为C₅-C₇非支链烷基或C₅-C₇非支链烯基；或R⁴为C₁₆非支链烷基、C₁₅非支链烷基、C₁₄非支链烷基、C₁₃非支链烷基、C₁₂非支链烷基、C₁₁非支链烷基、C₁₀非支链烷基、C₉非支链烷基、C₈非支链烷基、C₇非支链烷基、C₆非支链烷基、C₅非支链烷基、C₄非支链烷基、C₃非支链烷基、C₂非支链烷基、C₁非支链烷基、C₁₆非支链烯基、C₁₅非支链烯基、C₁₄非支链烯基、C₁₃非支链烯基、C₁₂非支链烯基、C₁₁非支链烯基、C₁₀非支链烯基、C₉非支链烯基、C₈非支链烯基、C₇非支链烯基、C₆非支链烯基、C₅非支链烯基、C₄非支链烯基、C₃非支链烯基或C₂烯基；或R⁴为

其中R^4a和R^4b各自独立地为C₂-C₁₀非支链烷基或C₂-C₁₀非支链烯基；或R⁴为

其中R^4a和R^4b各自独立地为C₁₆非支链烷基、C₁₅非支链烷基、C₁₄非支链烷基、C₁₃非支链烷基、C₁₂非支链烷基、C₁₁非支链烷基、C₁₀非支链烷基、C₉非支链烷基、C₈非支链烷基、C₇非支链烷基、C₆非支链烷基、C₅非支链烷基、C₄非支链烷基、C₃非支链烷基、C₂烷基、C₁烷基、C₁₆非支链烯基、C₁₅非支链烯基、C₁₄非支链烯基、C₁₃非支链烯基、C₁₂非支链烯基、C₁₁非支链烯基、C₁₀非支链烯基、C₉非支链烯基、C₈非支链烯基、C₇非支链烯基、C₆非支链烯基、C₅非支链烯基、C₄非支链烯基、C₃非支链烯基、或C₂烯基；并且所有其它剩余变量如针对式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)或前述实施例中任一项所描述的。

在第十二实施例中，在根据式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)或前述实施例中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中，R^6a和R^6b各自独立地为C₆-C₁₄烷基或C₆-C₁₄烯基；或R^6a和R^6b各自独立地为C₈-C₁₂烷基或C₈-C₁₂烯基；或R^6a和R^6b各自独立地为C₁₆烷基、C₁₅烷基、C₁₄烷基、C₁₃烷基、C₁₂烷基、C₁₁烷基、C₁₀烷基、C₉烷基、C₈烷基、C₇烷基、C₁₆烯基、C₁₅烯基、C₁₄烯基、C₁₃烯基、C₁₂烯基、C₁₁烯基、C₁₀烯基、C₉烯基、C₈烯基或C₇烯基；前提是组合的R^6a和R^6b中的碳原子总数大于15；并且所有其它剩余变量如针对式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)或前述实施例中任一项所描述的。

在第十三实施例中，在根据式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)或前述实施例中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中，R^6a和R^6b彼此含有相等数量的碳原子；或R^6a和R^6b相同；或R^6a和R^6b两者均为C₁₆烷基、C₁₅烷基、C₁₄烷基、C₁₃烷基、C₁₂烷基、C₁₁烷基、C₁₀烷基、C₉烷基、C₈烷基、C₇烷基、C₁₆烯基、C₁₅烯基、C₁₄烯基、C₁₃烯基、C₁₂烯基、C₁₁烯基、C₁₀烯基、C₉烯基、C₈烯基或C₇烯基；前提是组合的R^6a和R^6b中的碳原子总数大于15；并且所有其它剩余变量如针对式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)或前述实施例中任一项所描述的。

在第十四实施例中，在根据式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)或前述实施例中任一项所述的阳离子脂质或其药学上可接受的盐中，如前述实施例中任一项所定义的R^6a和R^6b含有彼此数量不同的碳原子；或碳原子R^6a和R^6b的数量相差一个或两个碳原子；或碳原子R^6a和R^6b的数量相差一个碳原子；或R^6a为C₇烷基并且R^6a为C₈烷基，R^6a为C₈烷基并且R^6a为C₇烷基，R^6a为C₈烷基并且R^6a为C₉烷基，R^6a为C₉烷基并且R^6a为C₈烷基，R^6a为C₉烷基并且R^6a为C₁₀烷基，R^6a为C₁₀烷基并且R^6a为C₉烷基，R^6a为C₁₀烷基并且R^6a为C₁₁烷基，R^6a为C₁₁烷基并且R^6a为C₁₀烷基，R^6a为C₁₁烷基并且R^6a为C₁₂烷基，R^6a为C₁₂烷基并且R^6a为C₁₁烷基，R^6a为C₇烷基并且R^6a为C₉烷基，R^6a为C₉烷基并且R^6a为C₇烷基，R^6a为C₈烷基并且R^6a为C₁₀烷基，R^6a为C₁₀烷基并且R^6a为C₈烷基，R^6a为C₉烷基并且R^6a为C₁₁烷基，R^6a为C₁₁烷基并且R^6a为C₉烷基，R^6a为C₁₀烷基并且R^6a为C₁₂烷基，R^6a为C₁₂烷基并且R^6a为C₁₀烷基，R^6a为C₁₁烷基并且R^6a为C₁₃烷基，或R^6a为C₁₃烷基并且R^6a为C₁₁烷基等；并且所有其它剩余变量如针对式I、式II、式III、式IV、式V或前述实施例中任一项所描述的。

在一个实施例中，本公开的阳离子脂质或式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)或式(XIX)的阳离子脂质是选自表7中脂质的任何一种脂质或其药学上可接受的盐：

表7.式(XV)、式(XVI)、式(XVII)、式(XVIII)、式(XIX)的示例性脂质

式(XX)

在一些方面，可电离脂质为：式(XX)：

或其药学上可接受的盐，其中：

R¹和R²各自独立地为氢或C₁-C₃烷基；

R³为C₃-C₁₀亚烷基或C₃-C₁₀亚烯基；

R⁴为C₁-C₁₆非支链烷基、C₂-C₁₆非支链烯基或

其中：

R⁵不存在、为C₁-C₆亚烷基或C₂-C₆亚烯基；

R^6a和R^6b各自独立地为C₇-C₁₄烷基或C₇-C₁₄烯基；

R^a每次出现时独立地为氢或C₁-C₆烷基；并且

n是选自1、2、3、4、5和6的整数。

在第二实施例中，在根据第一实施例的可电离脂质或其药学上可接受的盐中，X为-OC(＝O)-、-SC(＝O)-、-OC(＝S)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)S-或-S-S-；并且所有其它剩余变量如针对式(XX)或第一实施例所描述的。

在第三实施例中，本公开的可电离脂质由以下表示：式(XXI)：

或其药学上可接受的盐，其中n是选自1、2、3和4的整数；并且所有其它剩余变量如针对式(XX)或前述实施例中任一项所描述的。在替代性第三实施例中，n是选自1、2和3的整数；并且所有其它剩余变量如针对式(XX)或前述实施例中任一项所描述的。

在第四实施例中，本公开的可电离脂质由以下表示：式(XXII)：

或其药学上可接受的盐，并且所有其它剩余变量如针对式(XX)、式(XXI)或前述实施例中任一项所描述的。

在第五实施例中，在根据第一实施例的可电离脂质或其药学上可接受的盐中，R¹和R²各自独立地为氢或C₁-C₂烷基或C₂-C₃烯基；R'、R¹和R²各自独立地为氢、C₁-C₂烷基；并且所有其它剩余变量如针对式(XX)、式(XXI)或前述实施例中任一项所描述的。

在第六实施例中，本公开的可电离脂质由以下表示：式(XXII)：

或其药学上可接受的盐，并且所有其它剩余变量如针对式(XX)、式(XXI)、式(XXII)或前述实施例中任一项所描述的。

在第七实施例中，在根据式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)或前述实施例中任一项所述的可电离脂质或其药学上可接受的盐中，R⁵不存在或为C₁-C₈亚烷基；或R⁵不存在，为C₁-C₆亚烷基或C₂-C₆亚烯基；或R⁵不存在，为C₁-C₄亚烷基或C₂-C₄亚烯基；或R⁵不存在；或R⁵为C₈亚烷基、C₇亚烷基、C₆亚烷基、C₅亚烷基、C₄亚烷基、C₃亚烷基、C₂亚烷基、C₁亚烷基、C₈亚烯基、C₇亚烯基、C₆亚烯基、C₅亚烯基、C₄亚烯基、C₃亚烯基或C₂亚烯基；并且所有其它剩余变量如针对式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)或前述实施例中任一项所描述的。

在第八实施例中，本公开的可电离脂质由以下表示：式(XXIV)：

或其药学上可接受的盐，并且所有其它剩余变量如针对式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)或前述实施例中任一项所描述的。

在第九实施例中，在根据式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)或前述实施例中任一项所述的可电离脂质或其药学上可接受的盐中，R⁴为C₁-C₁₄非支链烷基、C₂-C₁₄非支链烯基或

其中R^4a和R^4b各自独立地为C₁-C₁₂非支链烷基或C₂-C₁₂非支链烯基；或R⁴为C₂-C₁₂非支链烷基或C₂-C₁₂非支链烯基；或R⁴为C₅-C₁₂非支链烷基或C₅-C₁₂非支链烯基；或R⁴为C₁₆非支链烷基、C₁₅非支链烷基、C₁₄非支链烷基、C₁₃非支链烷基、C₁₂非支链烷基、C₁₁非支链烷基、C₁₀非支链烷基、C₉非支链烷基、C₈非支链烷基、C₇非支链烷基、C₆非支链烷基、C₅非支链烷基、C₄非支链烷基、C₃非支链烷基、C₂非支链烷基、C₁非支链烷基、C₁₆非支链烯基、C₁₅非支链烯基、C₁₄非支链烯基、C₁₃非支链烯基、C₁₂非支链烯基、C₁₁非支链烯基、C₁₀非支链烯基、C₉非支链烯基、C₈非支链烯基、C₇非支链烯基、C₆非支链烯基、C₅非支链烯基、C₄非支链烯基、C₃非支链烯基或C₂烯基；或R⁴为

其中R^4a和R^4b各自独立地为C₁₆非支链烷基、C₁₅非支链烷基、C₁₄非支链烷基、C₁₃非支链烷基、C₁₂非支链烷基、C₁₁非支链烷基、C₁₀非支链烷基、C₉非支链烷基、C₈非支链烷基、C₇非支链烷基、C₆非支链烷基、C₅非支链烷基、C₄非支链烷基、C₃非支链烷基、C₂烷基、C₁烷基、C₁₆非支链烯基、C₁₅非支链烯基、C₁₄非支链烯基、C₁₃非支链烯基、C₁₂非支链烯基、C₁₁非支链烯基、C₁₀非支链烯基、C₉非支链烯基、C₈非支链烯基、C₇非支链烯基、C₆非支链烯基、C₅非支链烯基、C₄非支链烯基、C₃非支链烯基、或C₂烯基；并且所有其它剩余变量如针对式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)或前述实施例中任一项所描述的。

在第十实施例中，在根据式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)或前述实施例中任一项所述的可电离脂质或其药学上可接受的盐中，R³为C₃-C₈亚烷基或C₃-C₈亚烯基、C₃-C₇亚烷基或C₃-C₇亚烯基，或C₃-C₅亚烷基或C₃-C₅亚烯基；或R³为C₈亚烷基或C₇亚烷基、或C₆亚烷基、或C₅亚烷基、或C₄亚烷基、或C₃亚烷基、或C₁亚烷基、或C₈亚烯基、或C₇亚烯基、或C₆亚烯基、或C₅亚烯基、或C₄亚烯基、或C₃亚烯基；并且所有其它剩余变量如针对式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)或前述实施例中任一项所描述的。

在第十一实施例中，在根据式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)或前述实施例中任一项所述的可电离脂质或其药学上可接受的盐中，R^6a和R^6b各自独立地为C₇-C₁₂烷基或C₇-C₁₂烯基；或R^6a和R^6b各自独立地为C₈-C₁₀烷基或C₈-C₁₀烯基；或R^6a和R^6b各自独立地为C₁₂烷基、C₁₁烷基、C₁₀烷基、C₉烷基、C₈烷基、C₇烷基、C₁₂烯基、C₁₁烯基、C₁₀烯基、C₉烯基、C₈烯基或C₇烯基；并且所有其它剩余变量如针对式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)或前述实施例中任一项所描述的。

在第十二实施例中，在根据式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)或前述实施例中任一项所述的可电离脂质或其药学上可接受的盐中，R^6a和R^6b彼此含有相等数量的碳原子；或R^6a和R^6b相同；或R^6a和R^6b两者均为C₁₂烷基、C₁₁烷基、C₁₀烷基、C₉烷基、C₈烷基、C₇烷基、C₁₂烯基、C₁₁烯基、C₁₀烯基、C₉烯基、C₈烯基或C₇烯基；并且所有其它剩余变量如针对式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)或前述实施例中任一项所描述的。

在第十三实施例中，在根据式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)或前述实施例中任一项所述的可电离脂质或其药学上可接受的盐中，如前述实施例中任一项所定义的R^6a和R^6b含有彼此数量不同的碳原子；或碳原子R^6a和R^6b的数量相差一个或两个碳原子；或碳原子R^6a和R^6b的数量相差一个碳原子；或R^6a为C₇烷基并且R^6a为C₈烷基，R^6a为C₈烷基并且R^6a为C₇烷基，R^6a为C₈烷基并且R^6a为C₉烷基，R^6a为C₉烷基并且R^6a为C₈烷基，R^6a为C₉烷基并且R^6a为C₁₀烷基，R^6a为C₁₀烷基并且R^6a为C₉烷基，R^6a为C₁₀烷基并且R^6a为C₁₁烷基，R^6a为C₁₁烷基并且R^6a为C₁₀烷基，R^6a为C₁₁烷基并且R^6a为C₁₂烷基，R^6a为C₁₂烷基并且R^6a为C₁₁烷基，R^6a为C₇烷基并且R^6a为C₉烷基，R^6a为C₉烷基并且R^6a为C₇烷基，R^6a为C₈烷基并且R^6a为C₁₀烷基，R^6a为C₁₀烷基并且R^6a为C₈烷基，R^6a为C₉烷基并且R^6a为C₁₁烷基，R^6a为C₁₁烷基并且R^6a为C₉烷基，R^6a为C₁₀烷基并且R^6a为C₁₂烷基，R^6a为C₁₂烷基并且R^6a为C₁₀烷基等；并且所有其它剩余变量如针对式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)或前述实施例中任一项所描述的。

在第十四实施例中，在根据式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)或前述实施例中任一项所述的可电离脂质或其药学上可接受的盐中，R'不存在；并且所有其它剩余变量如针对式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)或前述实施例中任一项所描述的。

在一个实施例中，本公开的可电离脂质或式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)的可电离脂质是选自表8中脂质的任何一种脂质或其药学上可接受的盐：

表8.式(XX)、式(XXI)、式(XXII)、式(XXIII)、式(XXIV)的示例性脂质

具体实例在例示部分提供，并且作为本文所描述的可电离脂质的一部分包含。还包含药学上可接受的盐以及中性形式。

可切割脂质

根据一些实施例，本文提供了药物组合物，其包括可切割脂质和可用于将无衣壳非病毒DNA载体递送到所关注的靶位点(例如，细胞、组织、器官等)的无衣壳非病毒载体(例如，ceDNA)。如本文所使用的，术语“可切割脂质”是指包括二硫键(“SS”)可切割单元的阳离子脂质。在一个实施例中，SS-可切割脂质包括叔胺，其响应用于膜去稳定化的酸性区室(例如，内体或溶酶体)和可在还原环境(例如，细胞质)中切割的二硫键。SS-可切割脂质可以包含SS-可切割和pH活化脂质样物质，如ss-OP脂质、ssPalm脂质、ss-M脂质、ss-E脂质、ss-EC脂质、ss-LC脂质和ss-OC脂质等。

根据一些实施例，SS-可切割脂质在国际专利申请公开第WO 2019188867号中进行了描述，所述文献通过全文引用的方式并入本文。

如本文所证明的，包括可切割脂质的ceDNA脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)提供了更有效的ceDNA到靶细胞(包含例如，肝细胞)的递送。本公开提供了一种新型调配过程和方法，其产生尺寸比先前描述的LNP小得多的LNP。根据一些实施例，通过本文所描述的调配过程和方法产生的LNP的尺寸的平均直径范围为约20nm至约70nm，例如，平均直径为约20nm至约70nm、约25nm至约70nm、约30nm至约70nm、约35nm至约70nm、约40nm至约70nm、约45nm至约80nm、约50nm至约70nm、约60nm至约70nm、约65nm至约70nm或约20nm、约25nm、约30nm、约35nm、约40nm、约45nm、约50nm、约55nm、约60nm、约65nm、约70nm。根据一些实施例，LNP的平均直径为约50nm至约70nm。其显著更小，并且因此有利于靶向和规避免疫应答。此外，本文所描述的LNP可以封装大于约60％至约90％的刚性双链DNA，如ceDNA。根据一些实施例，本文所描述的LNP可以封装大于约60％的刚性双链DNA(如ceDNA)、大于约65％的刚性双链DNA(如ceDNA)、大于约70％的刚性双链DNA(如ceDNA)、大于约75％的刚性双链DNA(如ceDNA)、大于约80％的刚性双链DNA(如ceDNA)、大于约85％的刚性双链DNA(如ceDNA)或大于约90％的刚性双链DNA(如ceDNA)。

与通过其它过程产生的LNP相比，以及与其它脂质(例如，可电离阳离子脂质)相比，本文所描述的脂质颗粒(例如，纳米颗粒)(例如，ceDNA脂质颗粒、mRNA脂质颗粒)可以有利地用于增加核酸(例如，ceDNA、mRNA)向靶细胞/组织的递送。因此，与通过本领域已知的过程和方法制备的脂质颗粒相比，本文所描述的脂质颗粒(例如，纳米颗粒)(例如，ceDNA脂质颗粒、mRNA脂质颗粒)提供了最大的核酸递送。尽管机制尚未确定，并且不受理论限制，但认为包括通过本文所描述的过程制备的可切割脂质的脂质颗粒(例如，纳米颗粒)(例如，ceDNA脂质颗粒、mRNA脂质颗粒)提供了对肝细胞的改善的递送，以逃避吞噬作用，并且更有效地转运到细胞核。通过本文所描述的过程制备的包括本文所描述的可切割脂质的脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)(例如，ceDNA脂质颗粒、mRNA脂质颗粒)的另一优点是与其它脂质(例如，可电离阳离子脂质，例如，MC3)相比具有更好的耐受性。

在一个实施例中，可切割脂质可以包括三种组分：胺端基、接头基团和疏水尾。在一个实施例中，可切割脂质包括一个或多个苯基酯键、多个叔氨基中的一个和二硫键。叔胺基提供pH响应性并诱导内体逃逸，苯基酯键增强结构的可降解性(自降解性)，并且二硫键在还原环境中切割。

在一个实施例中，可切割脂质是ss-OP脂质。在一个实施例中，ss-OP脂质包括以下式A中所示的结构：

脂质A

在一个实施例中，SS-可切割脂质是SS-可切割的和pH活化的类脂材料(ssPalm)。ssPalm脂质在本领域中公知的。例如，参见Togashi等人,《控释期刊(Journal ofControlled Release)》,279(2018)262-270，其全部内容通过引用并入本文。在一个实施例中，ssPalm是包括脂质B的结构的ssPalmM脂质。

脂质B

在一个实施例中，ssPalmE脂质是ssPalmE-P4-C2脂质，其包括脂质C的结构。

脂质C

在一个实施例中，ssPalmE脂质是ssPalmE-Paz4-C2脂质，其包括脂质D的结构。

脂质D

在一个实施例中，可切割脂质是ss-M脂质。在一个实施例中，ss-M脂质包括以下脂质E中所示的结构：

脂质E

在一个实施例中，可切割脂质是ss-E脂质。在一个实施例中，ss-E脂质包括以下脂质F中所示的结构：

脂质F

在一个实施例中，可切割脂质是ss-EC脂质。在一个实施例中，ss-EC脂质包括以下脂质G中所示的结构：

脂质G

在一个实施例中，可切割脂质是ss-LC脂质。在一个实施例中，ss-LC脂质包括以下脂质H中所示的结构：

脂质H

在一个实施例中，可切割脂质是ss-OC脂质。在一个实施例中，ss-OC脂质包括以下脂质J中所示的结构：

脂质J

在一个实施例中，制备脂质颗粒(例如脂质纳米颗粒)调配物并用通过如于2018年9月7日提交的国际专利申请第PCT/US2018/050042号中公开的工艺获得的ceDNA装载，所述申请通过引用整体并入本文。这可以通过在低pH下将乙醇脂质与水性ceDNA进行高能混合来实现，这使脂质质子化并为ceDNA/脂质缔合和颗粒的成核提供有利的能量。通过水稀释和去除有机溶剂可以进一步稳定颗粒。颗粒可以浓缩到期望的水平。在一个实施例中，本公开提供了一种ceDNA脂质颗粒，其包括通过实例2中描述的工艺制备的式I脂质。

一般而言，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)以约10:1到60:1的总脂质与ceDNA(质量或重量)比率制备。在一些实施例中，脂质与ceDNA的比率(质量/质量比率；w/w比率)可以在以下范围内：约1:1至约60:1、约1:1至约55:1、约1:1至约50:1、约1:1至约45:1、约1:1至约40:1、约1:1至约35:1、约1:1至约30:1、约1:1至约25:1、约10:1至约14:1、约3:1至约15:1、约4:1至约10:1、约5:1至约9:1、约6:1至约9:1；约30:1至约60:1。根据一些实施例，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)以约60:1的ceDNA(质量或重量)与总脂质比率制备。根据一些实施例，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)以约30:1的ceDNA(质量或重量)与总脂质比率制备。可以调节脂质和ceDNA的量以提供期望的N/P比，例如3、4、5、6、7、8、9、10或更高的N/P比。一般而言，脂质颗粒调配物的总脂质含量可以在约5mg/ml到约30mg/mL的范围内。

在一些实施例中，脂质纳米颗粒包括用于缩合和/或封装核酸货物(如ceDNA)的药剂。这种药剂在本文中也被称为缩合剂或封装剂。不受限制地，可以使用本领域已知的用于缩合和/或封装核酸的任何化合物，只要它是非融合的。换言之，能够缩合和/或封装核酸货物(如ceDNA)但具有很少融合活性或没有融合活性的药剂。不希望受理论束缚，缩合剂在不缩合/封装核酸(如ceDNA)时可能具有一些融合活性，但是用所述缩合剂形成的封装脂质纳米颗粒的核酸可以是非融合的。本文所描述的调配过程利用了ceDNA压实在具有高乙醇含量的溶剂中发生的发现。当水性ceDNA(90％ EtOH)以使所得溶液为90％至92％的乙醇和8％至10％的水的比率添加到脂质的乙醇溶液(例如，90％ EtOH)中时，通过动态光散射观察到ceDNA以压实状态存在。在此类溶剂(90％至92％乙醇，8％至10％水)中，脂质和ceDNA两者都被溶解，没有任何一种组分的可检测沉淀。

根据一些实施例，本公开所描述的调配过程和方法可以封装比先前报道的多得多的双链DNA(例如，ceDNA)。根据一些实施例，本文所描述的LNP可以封装大于约60％的刚性双链DNA(如ceDNA)、大于约65％的刚性双链DNA(如ceDNA)、大于约70％的刚性双链DNA(如ceDNA)、大于约75％的刚性双链DNA(如ceDNA)、大于约80％的刚性双链DNA(如ceDNA)、n大于约85％的刚性双链DNA(如ceDNA)或大于约90％的刚性双链DNA(如ceDNA)。

根据一些实施例，溶剂包括约80％的乙醇和约20％的水。根据一些实施例，溶剂包括约81％的乙醇和约19％的水。根据一些实施例，溶剂包括约82％的乙醇和约18％的水。根据一些实施例，溶剂包括约83％的乙醇和约17％的水。根据一些实施例，溶剂包括约84％的乙醇和约16％的水。根据一些实施例，溶剂包括约85％的乙醇和约15％的水。根据一些实施例，溶剂包括约86％的乙醇和约14％的水。根据一些实施例，溶剂包括约87％的乙醇和约13％的水。根据一些实施例，溶剂包括约88％的乙醇和约12％的水。根据一些实施例，溶剂包括约89％的乙醇和约11％的水。根据一些实施例，溶剂包括约90％的乙醇和约10％的水。根据一些实施例，溶剂包括约91％的乙醇和约9％的水。根据一些实施例，溶剂包括约92％的乙醇和约8％的水。根据一些实施例，溶剂包括约93％的乙醇和约7％的水。根据一些实施例，溶剂包括约94％的乙醇和约6％的水。根据一些实施例，溶剂包括约95％的乙醇和约5％的水。

阳离子脂质通常用于在低pH条件下缩合核酸货物，如ceDNA，并驱动膜缔合和融合性。一般而言，阳离子脂质是包括至少一个氨基的脂质，所述氨基带正电或在酸性条件下(例如在6.5或更低的pH下)质子化。阳离子脂质也可以是可电离脂质，例如，可电离阳离子脂质。“非融合阳离子脂质”是指可以缩合和/或封装核酸货物(如ceDNA)但不具有融合活性或具有非常小的融合活性的阳离子脂质。

在一个实施例中，阳离子脂质可以包括存在于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质的20-90％(mol)。例如，阳离子脂质摩尔含量可以是存在于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质的20-70％(mol)、30-60％(mol)、40-60％(mol)、40-55％(mol)或45-55％(mol)。在一些实施例中，阳离子脂质包括存在于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质的约50mol％至约90mol％。

在一个实施例中，SS-可切割脂质不是MC3(6Z,9Z,28Z,3lZ)-三十七烷-6,9,28,3l-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)。DLin-MC3-DMA描述于以下文献中：Jayaraman等人,《化学应用英文国际版》(2012),51(34):8529-8533，所述文献内容通过全文引用的方式并入本文。D-Lin-MC3-DMA(MC3)的结构如以下脂质K所示：

脂质K

在一个实施例中，可切割脂质不是脂质ATX-002。脂质ATX-002描述于W02015/074085中，其内容通过引用整体并入本文。在一个实施例中，可切割脂质不是(13Z.16Z)-/V,/V-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-l-胺(化合物32)。化合物32描述于WO2012/040184中，其内容通过引用整体并入本文。在一个实施例中，可切割脂质不是化合物6或化合物22。化合物6和22描述于WO2015/199952中，其内容通过引用整体并入本文。

阳离子脂质的非限制性实例包含SS-可切割的和pH活化的类脂材料-OP(ss-OP；式I)、SS-可切割的和pH活化的类脂材料-M(SS-M；式V)、SS-可切割的和pH活化的类脂材料-E(SS-E；式VI)、SS-可切割的和pH活化的类脂材料-EC(SS-EC；式VII)、SS-可切割的和pH活化的类脂材料-LC(SS-LC；式VIII)、SS-可切割的和pH活化的类脂材料-OC(SS-OC；式IX)、聚乙烯亚胺、聚酰胺基胺(PAMAM)星放射状树枝状分子、Lipofectin(DOTMA和DOPE的组合)、Lipofectase、LIPOFECTAMINE^TM(例如，LIPOFECTAMINE^TM 2000)、DOPE、Cytofectin(加利福尼亚州福斯特城的吉利德科学公司(Gilead Sciences,Foster City,CA))和Eufectins(加利福尼亚州圣路易斯奥比斯波的JBL公司(JBL,San Luis Obispo,CA))。示例性阳离子脂质体可以由以下制成：N-[l-(2,3-二油醇氧基)-丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、N-[l-(2,3-二油醇氧基)-丙基]-N,N,N-三甲基甲基硫酸铵(DOTAP)、3b-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇(DC-Chol)、2,3,-二油酰氧基-N-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-l-三氟乙酸丙胺(DOSPA)、1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵；以及二甲基二十八烷基溴化铵(DDAB)。核酸(例如，ceDNA或CELiD)也可以与例如聚(L-赖氨酸)或亲和素形成复合物，并且脂质可以或可以不包含在这一混合物中，例如甾基-聚(L-赖氨酸)。

在一个实施例中，阳离子脂质是式I的ss-OP。在另一个实施例中，阳离子脂质是式II的SS-PAZ。

在一些实施例中，如本文公开的ceDNA载体使用美国专利第8,158,601号中所描述的阳离子脂质或如美国专利第8,034,376号中所描述的多元胺化合物或脂质进行递送。

非阳离子脂质

在一个实施例中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可以进一步包括非阳离子脂质。非阳离子脂质可以用于增加融合性并且还可以增加LNP在形成过程中的稳定性。非阳离子脂质包含两亲性脂质、中性脂质和阴离子脂质。因此，非阳离子脂质可以是中性不带电、两性离子或阴离子脂质。非阳离子脂质通常用于增强融合性。

示例性非阳离子脂质包含但不限于二硬脂酰-sn-甘油-磷酸乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸二油酰磷脂酰乙醇胺酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、单甲基-磷脂酰乙醇胺(如16-O-单甲基PE)、二甲基-磷脂酰乙醇胺(如16-O-二甲基PE)、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、鸡蛋磷脂酰胆碱(EPC)、二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、鞘磷脂(SM)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二芥酰磷脂酰胆碱(DEPC)、棕榈酰磷脂酰甘油(POPG)、二月桂酰-磷脂酰乙醇胺(DEPE)、1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DLPE)；1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPHyPE)；卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、二十六烷基磷酸酯、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰基磷脂酰胆碱或其混合物。应当理解，也可以使用其它二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺磷脂。这些脂质中的酰基优选地为源自具C₁₀-C₂₄碳链的脂肪酸的酰基，例如月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基或油酰基。

适用于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的非阳离子脂质的其它实例包含非磷脂质，如例如硬脂胺、十二烷胺、十六烷胺、乙酰棕榈酸酯、甘油蓖麻酸酯、硬脂酸十六烷酯、肉豆蔻酸异丙酯、两性丙烯酸聚合物、三乙醇胺-月桂基硫酸盐、烷基-芳基硫酸盐聚乙氧基化脂肪酸酰胺、双十八烷基二甲基溴化铵、神经酰胺、鞘磷脂等。

在一个实施例中，非阳离子脂质是磷脂。在一个实施例中，非阳离子脂质选自由DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM组成的组。在一些实施例中，非阳离子脂质是DSPC。在其它实施例中，非阳离子脂质是DOPC。在其它实施例中，非阳离子脂质是DOPE。

在一些实施例中，非阳离子脂质可以包括存在于脂质纳米颗粒中的总脂质的0％至20％(mol)。在一些实施例中，非阳离子脂质含量是存在于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质的0.5％至15％(mol)。在一些实施例中，非阳离子脂质含量是存在于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质的5％至12％(mol)。在一些实施例中，非阳离子脂质含量是存在于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质的5％至10％(mol)。在一个实施例中，非阳离子脂质含量是存在于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质的约6％(mol)。在一个实施例中，非阳离子脂质含量是存在于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质的约7.0％(mol)。在一个实施例中，非阳离子脂质含量是存在于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质的约7.5％(mol)。在一个实施例中，非阳离子脂质含量是存在于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质的约8.0％(mol)。在一个实施例中，非阳离子脂质含量是存在于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质的约9.0％(mol)。在一些实施例中，非阳离子脂质含量是存在于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质的约10％(mol)。在一个实施例中，非阳离子脂质含量是存在于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质的约11％(mol)。

示例性非阳离子脂质描述于国际专利申请公开第WO2017/099823号和美国专利公开第US2018/0028664号中，两者的内容以全文引用的方式并入本文中。

在一个实施例中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可以进一步包括一种组分，如甾醇，以提供脂质颗粒的膜完整性和稳定性。在一个实施例中，可用于脂质颗粒的示例性甾醇是胆固醇或其衍生物。非限制性胆固醇衍生物的实施例包含：极性类似物，如5α-胆甾烷醇、5β-粪醇、胆固醇基-(2'-羟基)-乙基醚、胆固醇基-(4'-羟基)-丁基醚和6-酮胆甾烷醇；非极性类似物，如5α-胆甾烷、胆甾烯酮、5α-胆甾酮、5β-胆甾酮和胆固醇癸酸酯；以及其混合物。在一些实施例中，胆固醇衍生物是极性类似物，如胆固醇-(4'-羟基)-丁醚。在一些实施例中，胆固醇衍生物是半琥珀酸胆甾醇酯(CHEMS)。

示例性胆固醇衍生物描述于国际专利申请公开第WO2009/127060号和美国专利公开第US2010/0130588号中，两者的内容以全文引用的方式并入本文中。

在一个实施例中，如甾醇等提供膜完整性的组分可以包括存在于脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中的总脂质的0％至50％(mol)。在一些实施例中，此类组分是脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的总脂质含量的20％至50％(mol)。在一些实施例中，此类组分是脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的总脂质含量的30％至40％(mol)。在一些实施例中，此类组分是脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的总脂质含量的35％至45％(mol)。在一些实施例中，此类组分是脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的总脂质含量的38％至42％(mol)。

在一个实施例中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可以进一步包括聚乙二醇(PEG)或缀合的脂质分子。一般而言，这些用于抑制脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的聚集和/或提供空间稳定性。示例性缀合脂质包含但不限于PEG-脂质缀合物、聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物、聚酰胺-脂质缀合物(如ATTA-脂质缀合物)、阳离子聚合物脂质(CPL)缀合物及其混合物。在一些实施例中，缀合的脂质分子是PEG化脂质缀合物，例如，(甲氧基聚乙二醇)-缀合的脂质。在其它一些实施例中，PEG化脂质是PEG₂₀₀₀-DMG(二肉豆蔻酰基甘油)。

示例性PEG化脂质包含但不限于PEG-二酰基甘油(DAG)(如l-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG))、PEG-二烷氧基丙基(DAA)、PEG-磷脂、PEG-神经酰胺(Cer)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸二酰基甘油(PEGS-DAG)(如4-0-(2',3'-二(十四烷酰氧基)丙基-l-0-(w-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG))、PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-l,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐，或其混合物。另外的示例性PEG-脂质缀合物描述于例如US5,885,613、US6,287,591、US2003/0077829、US2003/0077829、US2005/0175682、US2008/0020058、US2011/0117125、US2010/0130588、US2016/0376224和US2017/0119904中，其全部内容通过引用整体并入本文。

在一个实施例中，PEG-DAAPEG化脂质物可以是例如PEG-二月桂氧基丙基、PEG-二肉豆蔻氧基丙基、PEG-二棕榈氧基丙基或PEG-二硬脂氧基丙基。PEG-脂质可以是以下中的一种或多种：PEG-DMG、PEG-二月桂酰甘油、PEG-二棕榈酰甘油、PEG-二叔酰甘油、PEG-二月桂酰甘油酰胺、PEG-二肉豆蔻酰甘油酰胺、PEG-二棕榈酰甘油酰胺、PEG-二甘油二酯、PEG-胆固醇(l-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3',6'-二氧杂辛基]氨基甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇))、PEG-DMB(3,4-二十四氧基苄基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)和l,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。在一个实施例中，PEG-脂质可以选自由以下组成的组：PEG-DMG、l,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]、

以及

在一些实施例中，PEG化脂质选自由以下组成的组：N-(羰基-甲氧基聚1乙基1聚1乙二醇1)-1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE-PEG_n，其中N为350、500、750、1000或2000)、N-(羰基-甲氧基聚乙二醇_n)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇酰胺(DSPE-PEG_n，其中N为350、500、750、1000或2000)、DSPE-聚甘油-环己基-羧酸、DSPE-聚甘油-2-甲基戊二酸-羧酸、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)缀合聚乙二醇(DSPE-PEG-OH)、聚乙二醇-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG)、聚乙二醇-二硬脂酰甘油(PEG-DSG)或N-辛酰基-鞘氨醇-1-{琥珀酰[甲氧基(聚乙二醇)200011(C8 PEG2000神经酰胺)。在DMPE-PEG_n的一些实例中，其中n为350、500、750、1000或2000，PEG脂质为N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE-PEG 2,000)。在DSPE-PEG_n的一些实例中，其中n为350、500、750、1000或2000，PEG脂质为N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE-PEG 2,000)。在一些实施例中，PEG脂质是DSPE-PEG-OH。在一些优选的实施例中，PEG脂质是PEG-DMG。

在一些实施例中，缀合脂质(例如，PEG化脂质)包含组织特异性靶向配体，例如第一或第二靶向配体。例如，与GalNAc配体缀合的PEG-DMG。

在一个实施例中，与除PEG之外的分子缀合的脂质也可用于代替PEG-脂质。例如，聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物、聚酰胺-脂质缀合物(如ATTA-脂质缀合物)和阳离子-聚合物脂质(CPL)缀合物可用于代替或补充PEG-脂质。示例性缀合脂质，即PEG-脂质、(POZ)-脂质缀合物、ATTA-脂质缀合物和阳离子聚合物-脂质描述于国际专利申请公开第WO 1996/010392号、第WO1998/051278号、第W02002/087541号、第W02005/026372号、第WO2008/147438号、第W02009/086558号、第W02012/000104号、第WO2017/117528号、第WO2017/099823号、第WO2015/199952号、第W02017/004143号、第WO2015/095346号、第WO2012/000104号、第WO2012/000104号和第WO2010/006282号，美国专利申请公开第US2003/0077829号、第US2005/0175682号、第US2008/0020058号、第US2011/0117125号、第US2013/0303587号、第US2018/0028664号、第US2015/0376115号、第US2016/0376224号、第US2016/0317458号、第US2013/0303587号、第US2013/0303587号和第US20110123453号，以及美国专利第US5,885,613号、第US6,287,591号、第US6,320,017号和第US6,586,559号中，所述文献通过全文引用的方式并入本文。

在一些实施例中，PEG化脂质可以包括存在于脂质纳米颗粒中的总脂质的0％至20％(mol)。在一些实施例中，PEG化脂质含量为0.5％至10％(mol)。在一些实施例中，PEG化脂质含量为1％至5％(mol)。在一些实施例中，PEG化脂质含量为2％至4％(mol)。在一些实施例中，PEG化脂质含量为2％至3％(mol)。在一个实施例中，PEG化脂质含量为约2％(mol)。在一个实施例中，PEG化脂质含量为约2.5％(mol)。在一些实施例中，PEG化脂质含量为约3％(mol)。在一个实施例中，PEG化脂质含量为约3.5％(mol)。在一个实施例中，PEG化脂质含量为约4％(mol)。

应当理解，阳离子脂质(例如，可离子化的阳离子脂质)与非阳离子脂质、甾醇和PEG化脂质的摩尔比可以根据需要而变化。例如，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可以包括按摩尔或按组合物总重量计30％至70％的阳离子脂质、按摩尔或按组合物总重量计0％至60％的胆固醇、按摩尔或按组合物总重量计0％至30％的非阳离子脂质以及按摩尔或按组合物总重量计2％至5％的PEG化脂质。在一个实施例中，组合物包括按摩尔或按组合物总重量计40％至60％的阳离子脂质、按摩尔或按组合物总重量计30-50％的胆固醇、按摩尔或按组合物总重量计5％至15％的非阳离子脂质以及按摩尔或按组合物总重量计2％至5％的PEG或缀合脂质。在一个实施例中，组合物是按摩尔或按组合物总重量计40％至60％的阳离子脂质、按摩尔或按组合物总重量计30％至40％的胆固醇、按摩尔或按组合物总重量计5％至10％的非阳离子脂质以及按摩尔或按组合物总重量计2％至5％的PEG化脂质。组合物可以含有按摩尔或按组合物总重量计60％至70％的阳离子脂质、按摩尔或按组合物总重量计25％至35％的胆固醇、按摩尔或按组合物总重量计5％至10％的非阳离子脂质以及按摩尔或按组合物总重量计2％至5％的PEG化脂质。组合物还可以含有按摩尔或按组合物总重量计至多45％至55％的阳离子脂质、按摩尔或按组合物总重量计35％至45％的胆固醇、按摩尔或按组合物总重量计2％至15％的非阳离子脂质以及按摩尔或按组合物总重量计2％至5％的PEG化脂质。所述调配物也可以是脂质纳米颗粒调配物，例如包括按摩尔或按组合物总重量计8％至30％的阳离子脂质、按摩尔或按组合物总重量计5％至15％的非阳离子脂质以及按摩尔或按组合物总重量计0％至40％的胆固醇；按摩尔或按组合物总重量计4％至25％的阳离子脂质、按摩尔或按组合物总重量计4％至25％的非阳离子脂质、按摩尔或按组合物总重量计2％至25％的胆固醇、按摩尔或按组合物总重量计10％至35％的缀合物脂质以及按摩尔或按组合物总重量计5％的胆固醇；或按摩尔或按组合物总重量计2％至30％的阳离子脂质、按摩尔或按组合物总重量计2％至30％的非阳离子脂质、按摩尔或按组合物总重量计1％至15％的胆固醇、按摩尔或按组合物总重量计2％至35％的PEG化脂质以及按摩尔或按组合物总重量计1％至20％的胆固醇；或按摩尔或按组合物总重量计甚至至多90％的阳离子脂质和按摩尔或按组合物总重量计2％至10％的非阳离子脂质，或按摩尔或按组合物总重量计甚至100％的阳离子脂质.在一些实施例中，脂质颗粒调配物包括摩尔比为约50:9:38.5:2.5的阳离子脂质、非阳离子磷脂、胆固醇和PEG化脂质(缀合脂质)。

在一个实施例中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)调配物包括摩尔比为约50:7:40:3的阳离子脂质、非阳离子磷脂、胆固醇和PEG化脂质(缀合脂质)。

在其它方面，本公开提供了一种包括磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的脂质纳米颗粒调配物。

在一个实施例中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)包括阳离子脂质、非阳离子脂质(例如磷脂)、甾醇(例如，胆固醇)和PEG化脂质(缀合脂质)，其中，对于阳离子脂质，脂质的摩尔比范围为20到70摩尔百分比，靶标为30至60，非阳离子脂质的摩尔百分比范围为0至30，靶标为0至15，甾醇的摩尔百分比范围为20至70，靶标为30至50，并且PEG化脂质(缀合脂质)的摩尔百分比为1至6，靶标为2至5。

包括ceDNA的脂质纳米颗粒(LNP)公开于2018年9月7日提交的国际专利申请第PCT/US2018/050042号中，其全部内容并入本文并设想用于本文公开的方法和组合物。

脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的大小可以通过准弹性光散射使用MalvernZetasizer Nano ZS(英国马尔文公司(Malvern,UK))系统来确定。根据一些实施例，如通过光散射确定的LNP平均直径小于约75nm或小于约70nm。根据一些实施例，如通过光散射确定的LNP平均直径介于约50nm至约75nm或约50nm至约70nm之间。

调配的阳离子脂质的pKa可以与LNP递送核酸的有效性相关(参见Jayaraman等人,《化学应用国际版(Angewandte Chemie,International Edition)》(2012),51(34),8529-8533；Semple等人,《自然生物技术(Nature Biotechnology)》28,172-176(20 1 0)，两者均通过引用整体并入)。在一个实施例中，使用基于2-(对甲苯胺)-6-萘磺酸(TNS)的荧光的测定法在脂质纳米颗粒中测定每种阳离子脂质的pKa。可以使用如本文和别处所述的在线过程制备在PBS中包括浓度为0.4mM总脂质的阳离子脂质/DSPC/胆固醇/PEG-脂质(50/10/38.5/1.5mol％)的脂质纳米颗粒。TNS可以在蒸馏水中制备为100mM储备溶液。囊泡可以在2mL含有10mM HEPES、10mM MES、10mM乙酸铵、130mM NaCl的缓冲溶液中稀释至24mM脂质，其中pH范围为2.5到11。可以将TNS溶液的等分试样添加至最终浓度为1mM，然后涡旋混合后，在SLM Aminco系列2发光分光光度计中使用321nm和445nm的激发和发射波长在室温下测量荧光强度。可以将S型最佳拟合分析应用于荧光数据，并测量pKa作为产生半最大荧光强度的pH。

在一个实施例中，可以通过在通过尾静脉注射施用后4小时测量肝脏中的萤光素酶表达来确定相对活性。在0.3和1.0mg ceDNA/kg的剂量下比较活性，并表示为施用后4小时测量的ng荧光素酶/g肝脏。

不受限制地，本公开的脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)包含脂质调配物，其可用于将无衣壳非病毒DNA载体递送至所关注的靶位点(例如，细胞、组织、器官等)。一般而言，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)包括无衣壳非病毒DNA载体和阳离子脂质或其盐。

在一个实施例中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)包括摩尔比为50:10:38.5:1.5的阳离子脂质/非阳离子脂质/甾醇/缀合脂质。

在一个实施例中，本公开提供了一种包括磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)调配物。

III.刚性治疗性核酸

本公开的方面通常提供脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)，其包括刚性治疗性核酸(TNA)样末端封闭式DNA(ceDNA)和脂质。

末端封闭式DNA(ceDNA)载体

本公开的实施例基于包括可表达转基因(例如治疗性核酸)的末端封闭式线性双螺旋(ceDNA)载体的方法和组合物。如本文所述的ceDNA载体没有由病毒衣壳内的有限空间所强加的包装局限。与囊封的AAV基因组相反，ceDNA载体代表了一种可行的真核生物生产的替代原核生物生产的质粒DNA载体。这允许插入控制元件，例如，如本文所公开的调控开关、大的转基因、多个转基因等。

ceDNA载体优选地具有线性和连续结构而不是非连续结构。相信线性和连续结构在受到细胞核酸内切酶攻击时更稳定，并且不太可能重组并引起诱变。因此，线性和连续结构的ceDNA载体是优选的实施例。连续、线性、单链的分子内双螺旋ceDNA载体可以具有共价结合的末端，而不具有编码AAV衣壳蛋白的序列。这些ceDNA载体在结构上不同于质粒(包含本文所描述的ceDNA质粒)，所述质粒是细菌来源的环状双螺旋核酸分子。质粒的互补链在变性后可以分离，从而产生两个核酸分子，而与此相反，ceDNA载体虽具有互补链，却是单个DNA分子，并且因此即使变性，也可能仍保持是单个分子。在一些实施例中，与质粒不同，可以在没有原核类型的DNA碱基甲基化的情况下产生ceDNA载体。因此，在结构方面(具体地说，线性对比环状)以及还根据用于产生和纯化这些不同物体的方法方面，以及还根据它们的DNA甲基化方面，ceDNA载体和ceDNA质粒是不同的，即ceDNA-质粒属于原核类型而ceDNA载体属于真核类型。

本文提供了具有共价封闭端的非病毒、无衣壳的ceDNA分子(ceDNA)。这些非病毒的无衣壳ceDNA分子可以在许可宿主细胞中由含有定位在两个不同的反向末端重复(ITR)序列之间的异源基因(例如，转基因，具体地说，治疗性转基因)的表达构建体(例如，ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒、ceDNA-杆状病毒或整合细胞系)产生，其中ITR彼此不同。在一些实施例中，与野生型ITR序列(例如AAV ITR)相比，ITR之一通过缺失、插入和/或取代而被修饰；并且ITR中的至少一个包括功能性末端解链位点(trs)和Rep结合位点。ceDNA载体优选地在分子的至少一部分(如表达盒)上是双螺旋，例如是自互补的(例如，ceDNA不是双链环状分子)。ceDNA载体具有共价封闭端，并且因此抵抗核酸外切酶(例如，核酸外切酶I或核酸外切酶III)消化，例如在37℃下维持超过一个小时。

一方面，ceDNA载体在5'到3'方向上包括：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)、所关注的核苷酸序列(例如，如本文所述的表达盒)和第二AAV ITR。在一个实施例中，第一ITR(5'ITR)和第二ITR(3'ITR)相对于彼此非对称，也就是说，其彼此具有不同的3D空间构型。作为示例性实施例，第一ITR可以是野生型ITR，并且第二ITR可以是经突变或修饰的ITR，或反过来，其中第一ITR可以是经突变或修饰的ITR，并且第二ITR可以是野生型ITR。在一个实施例中，第一ITR和第二ITR都被修饰，但是序列不同，或者具有不同的修饰，或者不是相同的经修饰的ITR并且具有不同的3D空间构型。换言之，具有不对称ITR的ceDNA载体具有如下ITR：其中一个ITR相对于WT-ITR的任何变化均未反映于另一个ITR中；或可替代地，其中不对称ITR具有经修饰的不对称ITR对，可以具有相对于彼此不同的序列和不同的三维形状。

在一个实施例中，ceDNA载体在5'到3'方向上包括：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)、所关注的核苷酸序列(例如，如本文所述的表达盒)和第二AAV ITR，其中第一ITR(5'ITR)和第二ITR(3'ITR)是对称的，或彼此基本上对称–也就是说，ceDNA载体可以包括具有对称三维空间组构的ITR序列，使得它们的结构在几何空间中具有相同的形状，或者具有3D空间中的相同A、C-C'和B-B'环。在此类实施例中，对称的ITR对或基本上对称的ITR对可以是经修饰的ITR(例如，mod-ITR)，其并非野生型ITR。mod-ITR对可以具有相同的相对于野生型ITR具有一个或多个修饰的序列，并且是彼此的反向补体(反向)。在一个实施例中，如本文所定义的，经修饰的ITR对是基本上对称的，也就是说，经修饰的ITR对可以具有不同的序列，但具有对应或相同的对称三维形状。在一些实施例中，对称的ITR或基本上对称的ITR可以是如本文所述的野生型(WT-ITR)。也就是说，两个ITR都具有野生型序列，但不一定必须是来自同一AAV血清型的WT-ITR。在一个实施例中，一个WT-ITR可以来自一种AAV血清型，而另一个WT-ITR可以来自不同的AAV血清型。在此类实施例中，如本文所定义的，WT-ITR对是基本上对称的，也就是说，它们可以具有一个或多个保守核苷酸修饰，同时仍然保留对称的三维空间组构。

本文提供的野生型或突变的或以其它方式经修饰的ITR序列表示用于产生ceDNA载体的表达构建体(例如，ceDNA-质粒、ceDNA杆粒、ceDNA-杆状病毒)中包含的DNA序列。因此，从ceDNA-质粒或其它表达构建体产生的ceDNA载体中实际含有的ITR序列与由于在产生过程期间发生天然发生的变化(例如，复制误差)而产生的本文中提供的ITR序列可能相同或可能不同。

在一个实施例中，本文所述的包括具有作为治疗性核酸序列的转基因的表达盒的ceDNA载体可以操作性地连接至允许或控制转基因表达的一个或多个调控序列。在一个实施例中，多核苷酸包括第一ITR序列和第二ITR序列，其中所关注的核苷酸序列侧接第一和第二ITR序列，并且第一和第二ITR序列彼此非对称，或彼此对称。

在一个实施例中，表达盒位于两个ITR之间，按以下顺序包括以下中的一种或多种：与转基因操作性地连接的启动子、转录后调控元件以及聚腺苷酸化和终止信号。在一个实施例中，启动子是可调控的-可诱导的或可抑制的。启动子可以是促进转基因转录的任何序列。在一个实施例中，启动子是CAG启动子或其变体。转录后调控元件是调控转基因表达的序列，作为非限制性实例，是产生增强作为治疗性核酸序列的转基因的表达的三级结构的任何序列。

在一个实施例中，转录后调控元件包括WPRE。在一个实施例中，聚腺苷酸化和终止信号包括BGHpolyA。可以另外使用本领域已知的任何顺式调控元件或其组合，例如SV40晚期polyA信号上游增强子序列(USE)或其它转录后处理元件，包含但不限于单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因，或乙型肝炎病毒(HBV)。在一个实施例中，表达盒在5'到3'方向上的长度大于已知在AAV病毒粒子中被衣壳化的最大长度。在一个实施例中，长度大于4.6kb、或大于5kb、或大于6kb、或大于7kb。本文中举例说明了各种表达盒。

在一个实施例中，表达盒可以包括超过4000个核苷酸、5000个核苷酸、10,000个核苷酸或20,000个核苷酸、或30,000个核苷酸、或40,000个核苷酸或50,000个核苷酸，或约4000-10,000个核苷酸或10,000-50,000个核苷酸之间的任何范围，或超过50,000个核苷酸。在一些实施例中，表达盒可以包括转基因，所述转基因是长度在500到50,000个核苷酸范围内的治疗性核酸序列。在一些实施例中，表达盒可以包括转基因，所述转基因是长度在500到75,000个核苷酸范围内的治疗性核酸序列。在一些实施例中，表达盒可以包括转基因，所述转基因是长度在500到10,000个核苷酸范围内的治疗性核酸序列。在一些实施例中，表达盒可以包括转基因，所述转基因是长度在1000到10,000个核苷酸范围内的治疗性核酸序列。在一些实施例中，表达盒可以包括转基因，所述转基因是长度在500到5,000个核苷酸范围内的治疗性核酸序列。ceDNA载体不具有衣壳化AAV载体的大小限制，因此能够将大尺寸的表达盒递送给宿主。在一个实施例中，ceDNA载体缺乏原核生物特异性甲基化。

在一个实施例中，刚性治疗性核酸可以是质粒。

在一个实施例中，本文公开的ceDNA载体用于治疗目的(例如，用于医学、诊断或兽医用途)或免疫原性多肽。

表达盒可以包括作为治疗性核酸序列的任何转基因。在某些实施例中，ceDNA载体包括受试者中任何所关注的基因，其包含一种或多种多肽、肽、核酶、肽核酸、siRNA、RNAi、反义寡核苷酸、反义多核苷酸、抗体、抗原结合片段或其任何组合。

在一个实施例中，ceDNA表达盒可以包含例如可表达的外源序列(例如，开放阅读框)，其编码在接受者受试者中不存在、无活性或活性不足的蛋白质或编码具有期望的生物学或治疗作用的蛋白质的基因。在一个实施例中，如供体序列等外源序列可以编码一种基因产物，所述基因产物可以起到校正缺陷基因或转录物表达的作用。在一个实施例中，表达盒还可以编码矫正型DNA链、编码多肽、有义或反义寡核苷酸或RNA(编码或非编码；例如，siRNA、shRNA、微RNA和其反义对应物(例如，antagoMiR))。在一个实施例中，表达盒可以包含编码用于实验或诊断目的的报告蛋白的外源序列，如b-内酰胺酶、b-半乳糖苷酶(LacZ)、碱性磷酸酶、胸苷激酶、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、荧光素酶和本领域中公知的其它报告蛋白。

因此，表达盒可以包含编码蛋白质、多肽或RNA的任何基因，所述蛋白质、多肽或RNA由于突变而减少或缺失，或者当过表达时传递治疗益处被认为在本公开的范围内。ceDNA载体可以包括模板或供体核苷酸序列，其用作在核酸酶提供的双链断裂(或切口)后插入的矫正DNA链。ceDNA载体可以包含模板核苷酸序列，其用作在由指导RNA核酸酶、大范围核酸酶或锌指核酸酶提供的双链断裂(或切口)后插入的矫正DNA链。

治疗性核酸

本公开的说明性治疗性核酸可以包含但不限于小基因、质粒、小环、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、核酶、末端封闭式双链DNA(例如，ceDNA、CELiD、线性共价闭合DNA(“迷你串”)、doggybone^TM、原端粒末端封闭式DNA或哑铃线性DNA、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、非对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA和DNA病毒载体、病毒RNA载体以及其任何组合。

可以通过被称为RNA干扰(RNAi)的过程下调特定蛋白质的细胞内水平的siRNA或miRNA也被本公开考虑为核酸治疗剂。在将siRNA或miRNA引入宿主细胞的细胞质后，这些双链RNA构建体可以与被称为RISC的蛋白质结合。通过RISC复合物去除siRNA或miRNA的有义链。RISC复合物与互补mRNA结合时，会切割mRNA并释放切割链。RNAi是通过诱导mRNA的特异性破坏，从而导致相应蛋白质的下调。

抑制mRNA翻译成蛋白质的反义寡核苷酸(ASO)和核酶可以作为核酸治疗剂。对于反义构建体，这些单链脱氧核酸具有与目标蛋白mRNA序列互补的序列，并且能够通过沃森-克里克碱基配对与mRNA结合。这种结合防止目标mRNA的翻译，和/或触发mRNA转录物的RNaseH降解。因此，反义寡核苷酸具有增加的作用特异性(即，特定疾病相关蛋白的下调)。

在本文提供的任何方法中，治疗性核酸可以是治疗性RNA。所述治疗性RNA可以是mRNA翻译抑制剂、RNA干扰剂(RNAi)、催化活性RNA分子(核酶)、转移RNA(tRNA)或结合mRNA转录物(ASO)、蛋白质或其它分子配体(适体)的RNA。在本文提供的任何方法中，RNAi药剂可以是双链RNA、单链RNA、微RNA、短干扰RNA、短发夹RNA或形成三链体的寡核苷酸。

IV.变性治疗性核酸

本公开的方面进一步提供包括脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)和变性治疗性核酸(TNA)的药物组合物，其中TNA如上文所定义的。在一个实施例中，变性TNA是末端封闭式DNA(ceDNA)。术语“变性治疗性核酸”是指部分或完全TNA，其中构象已从标准B型结构改变。构象变化可以包含二级结构(即单个核酸分子内的碱基对相互作用)的变化和/或三级结构(即双螺旋结构)的变化。不受理论的束缚，本发明人认为，用醇/水溶液或纯醇溶剂处理的TNA导致核酸变性为通过LNP提高封装效率的构象，并且产生具有较小直径尺寸(即小于75nm，例如，平均尺寸直径为约68nm至74nm)的LNP调配物。本文所描述的所有LNP平均直径尺寸和尺寸范围适用于含有变性TNA的LNP。

当DNA在水性环境中时，其具有B型结构，每个完整的螺旋圈中有10.4个碱基对。如果通过添加适度较低极性的醇(如甲醇)来逐渐改变这种水性环境，则螺旋的扭曲松弛，由此DNA平滑地改变为每螺旋圈只有10.2个碱基对的形式，如通过圆二色性(CD)光谱可视化的。在一个实施例中，本文提供的药物组合物中的变性TNA具有10.2型结构。

与这种行为相反，如果用极性稍低的醇(如乙醇)替换水，则只有在约65％的水被乙醇替换之前才会发生相同的构象变化。此时，DNA突然变为A型结构，其具有更紧密的扭曲螺旋，每个螺旋圈含有11个碱基对，如通过CD可视化的。在一个实施例中，本文提供的药物组合物中的变性TNA具有A型结构。

根据一些实施例，当在透射电子显微镜(TEM)下可视化时，本文提供的药物组合物中的变性TNA具有杆状结构。根据一些实施例，当在透射电子显微镜(TEM)下可视化时，本文提供的药物组合物中的变性TNA具有圆形结构。相比之下，未变性的TNA具有链状结构。

根据一些实施例，本文提供的药物组合物中的变性TNA具有P型结构，其具有很少的氢键或没有氢键、缺乏碱堆叠，并且具有缩合的三级结构。

V.ceDNA载体的生产

本公开的实施例基于包括可表达转基因(例如，TNA)的末端封闭式线性双螺旋(ceDNA)载体的方法和组合物。如本文所述的ceDNA载体没有由病毒衣壳内的有限空间所强加的包装局限。与囊封的AAV基因组相反，ceDNA载体代表了一种可行的真核生物生产的替代原核生物生产的质粒DNA载体。这允许插入控制元件，例如，如本文所公开的调控开关、大的转基因、多个转基因等。

用于产生如本文所述的包括本文定义的非对称ITR对或对称ITR对的ceDNA载体的方法描述于2018年9月7日提交的PCT/US 18/49996的第IV部分中，所述文献通过引用整体并入本文。如本文所描述的，ceDNA载体可以由例如，包括以下步骤的过程获得：a)在Rep蛋白存在的情况下在有效条件下将携带所述载体多核苷酸表达构建体模板(例如，ceDNA-质粒、ceDNA-杆粒和/或ceDNA-杆状病毒)的宿主细胞(例如，昆虫细胞)群温育足以诱导所述ceDNA在所述宿主细胞内产生的时间，所述宿主细胞群缺乏病毒衣壳编码序列，并且其中所述宿主细胞不包括病毒衣壳编码序列；以及b)从宿主细胞中采集并分离ceDNA载体。Rep蛋白的存在诱导具有经修饰的ITR的载体多核苷酸复制，从而在宿主细胞中产生ceDNA载体。

以下提供作为非限制性实例。

根据一些实施例，合成ceDNA通过从双链DNA分子切除而产生。ceDNA载体的合成产生描述于2019年1月18日提交的国际申请PCT/US19/14122的实例2-6中，所述国际申请通过引用整体并入本文。使用合成方法产生ceDNA载体的一种示例性方法涉及切除双链DNA分子。简而言之，可以使用双链DNA构建体产生ceDNA载体，例如，参见PCT/US19/14122的图7A-8E。在一些实施例中，双链DNA构建体是ceDNA质粒，例如，参见例如于2018年12月6日提交的国际专利申请PCT/US2018/064242的图6。

在一些实施例中，制备ceDNA载体的构建体包括调控转基因表达的另外的组分，例如调控转基因表达的调控开关，或可以杀灭包括载体的细胞的杀灭开关。

分子调控开关是一种响应信号而产生可测量的状态变化的开关。此类调控开关可以与本文所述的ceDNA载体有用地组合以控制转基因表达的输出。在一些实施例中，ceDNA载体包括用以微调转基因的表达的调控开关。例如，其可以发挥ceDNA载体的生物封存功能。在一些实施例中，开关是“ON/OFF”型开关，其被设计成以可控和可调控方式来启动或终止(即，关闭)所关注基因在ceDNA载体中的表达。在一些实施例中，开关可以包含“杀灭开关”，一旦所述开关被活化，其就可以指示包括合成ceDNA载体的细胞经历细胞程序性死亡。涵盖在ceDNA载体中使用的示例性调控开关可用于调控转基因的表达，并且在国际申请PCT/US18/49996中更充分地讨论，所述国际申请通过引用整体并入本文并在本文中描述。

使用涉及组装不同寡核苷酸的合成方法产生ceDNA载体的另一种示例性方法提供于PCT/US19/14122的实例3中，其中ceDNA载体是通过合成5'寡核苷酸和3'ITR寡核苷酸并且将ITR寡核苷酸与包括表达盒的双链多核苷酸接合来产生的。图11B(PCT/US19/14122的，通过引用整体并入本文)示出了将5'ITR寡核苷酸和3'ITR寡核苷酸与包括表达盒的双链多核苷酸接合的示例性方法。

PCT/US19/14122(通过引用整体并入本文)的实例4中提供了使用合成方法产生ceDNA载体的示例性方法，所述方法使用包括两个有义ITR的单链线性DNA，所述有义ITR位于有义表达盒序列的两侧并共价连接到两个反义ITR，所述反义ITR位于反义表达盒的两侧，然后将其单链线性DNA的末端接合，以形成末端封闭式单链分子。一个非限制性实例包括合成和/或产生单链DNA分子，将该分子的各部分退火以形成具有一个或多个二级结构碱基配对区域的单一线性DNA分子，然后使游离的5'和3'端彼此接合，以形成封闭的单链分子。

在又另一方面，本公开提供了宿主细胞系，所述宿主细胞系已将本文所述的DNA载体多核苷酸表达模板(ceDNA模板)稳定整合到其自身的基因组中，用于生产非病毒DNA载体。产生这种细胞系的方法描述于以下文献中：Lee,L.等人,(2013)《公共科学图书馆·综合(Plos One)》8(8):e69879，所述文献通过全文引用的方式并入本文。例如，Rep蛋白以3的MOI添加到宿主细胞中。在一个实施例中，宿主细胞系是无脊椎动物细胞系，优选地，昆虫Sf9细胞。当宿主细胞系是哺乳动物细胞系(优选地，293细胞)时，所述细胞系可以具有稳定整合的多核苷酸载体模板，并且可以使用第二载体(如疱疹病毒)将Rep蛋白引入细胞中，从而允许在存在Rep的情况下切除和扩增ceDNA。

任何启动子都可以与载体多核苷酸的异源核酸(例如报告核酸或治疗性转基因)可操作地连接。表达盒可以含有合成调控元件，如CAG启动子。CAG启动子包括(i)巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件，(ii)鸡β-肌动蛋白基因的启动子、第一外显子和第一内含子，以及(ii)兔β珠蛋白基因的剪接受体。可替代地，表达盒可以含有α-1-抗胰蛋白酶(AAT)启动子、肝脏特异性(LP1)启动子或人延长因子-1α(EF1-α)启动子。在一些实施例中，表达盒包含一种或多种组成型启动子，例如，逆转录病毒劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地带有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子(任选地带有CMV增强子)。可替代地，可以使用诱导型或抑制型启动子、转基因的天然启动子、组织特异性启动子或本领域已知的各种启动子。用于基因疗法的合适转基因对于本领域技术人员是公知的。

无衣壳的ceDNA载体也可以由载体多核苷酸表达构建体产生，所述载体多核苷酸表达构建体进一步包括顺式调控元件或顺式调控元件的组合，非限制性实例包含土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)和BGH polyA，或者例如β-珠蛋白polyA。其它转录后处理元件包含例如单纯疱疹病毒或乙型肝炎病毒(HBV)的胸苷激酶基因。表达盒可以包含本领域已知的任何聚腺苷酸化序列或其变体，如从牛BGHpA或病毒SV40pA分离的天然存在的，或合成的。一些表达盒还可以包含SV40晚期polyA信号上游增强子(USE)序列。USE可以与SV40pA或异源poly-A信号组合使用。

可以选择和优化从细胞中收获和收集本文所述的DNA载体的时间，以实现ceDNA载体的高产率生产。例如，可以根据细胞活力、细胞形态、细胞生长等选择采集时间。在一个实施例中，细胞在足够的条件下生长，并在杆状病毒感染后足以产生DNA载体但在大多数细胞因病毒毒性而开始死亡之前的时间进行采集。可以使用质粒纯化试剂盒(如Qiagen Endo-Free Plasmid试剂盒)分离DNA载体。为分离质粒而开发的其它方法也可适用于DNA载体。一般而言，可以采用任何核酸纯化方法。

DNA载体可以通过本领域的技术人员已知用于纯化DNA的任何手段来纯化。在一个实施例中，ceDNA载体被纯化为DNA分子。在另一个实施例中，将ceDNA载体作为外泌体或微粒进行纯化。

在一个实施例中，无衣壳非病毒DNA载体包括包含多核苷酸模板的质粒或从所述包含多核苷酸模板的质粒获得，所述多核苷酸模板按顺序包括：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)、所关注的核苷酸序列(例如，外源DNA的表达盒)和经修饰的AAV ITR，其中所述模板核酸分子缺乏AAV衣壳蛋白编码。在另外的实施例中，本公开的核酸模板缺乏病毒衣壳蛋白编码序列(即，其缺乏AAV衣壳基因，也缺乏其它病毒的衣壳基因)。另外，在特定的实施例中，核酸分子还缺乏AAV Rep蛋白编码序列。因此，在优选的实施例中，本公开的核酸分子缺乏功能性AAV cap和AAV rep基因。

在一个实施例中，ceDNA可以包含这样一种ITR结构，其相对于本文公开的野生型AAV2ITR发生突变，但仍保留可操作的RBE、TRS和RBE'部分。

ceDNA质粒

ceDNA-质粒是用于后来产生的ceDNA载体的质粒。在一个实施例中，ceDNA-质粒可以使用已知的技术构建，以在转录方向上提供以下至少一项作为操作性连接的组分：(1)经修饰的5'ITR序列；(2)含有例如启动子、诱导型启动子、调控开关、增强子等顺式调控元件的表达盒；以及(3)经修饰的3'ITR序列，其中3'ITR序列相对于5'ITR序列是对称的。在一些实施例中，侧接ITR的表达盒包括用于引入外源序列的克隆位点。表达盒替换了AAV基因组的rep和cap编码区。

在一个实施例中，ceDNA载体是从质粒获得，该质粒在本文中称为“ceDNA-质粒”，其依次编码：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)、包括转基因的表达盒、以及突变或修饰AAV ITR，其中所述ceDNA-质粒缺乏AAV衣壳蛋白编码序列。在替代性实施例中，ceDNA-质粒按顺序编码：第一(或5')经修饰的或突变的AAV ITR、包括转基因的表达盒、以及第二(或3')经修饰的AAV ITR，其中所述ceDNA-质粒缺乏AAV衣壳蛋白编码序列，并且其中5'和3'ITR彼此对称。在替代性实施例中，ceDNA-质粒按顺序编码：第一(或5')经修饰的或突变AAV ITR、包括转基因的表达盒、以及第二(或3')突变的或经修饰的AAV ITR，其中所述ceDNA-质粒缺乏AAV衣壳蛋白编码序列，并且其中5'和3'经修饰的ITR具有相同的修饰(即，它们是反向互补或相对于彼此对称)。

在一个实施例中，ceDNA-质粒系统缺乏病毒衣壳蛋白编码序列(即，其缺乏AAV衣壳基因，也缺乏其它病毒的衣壳基因)。在一个实施例中，ceDNA-质粒还不含AAV Rep蛋白编码序列。在一个实施例中，ceDNA-质粒缺乏AAV2的功能性AAV cap和AAV rep基因GG-3'加上允许发夹形成的可变回文序列。在一个实施例中，可以使用本领域公知的任何AAV血清型的基因组的天然核苷酸序列来产生本公开的ceDNA-质粒。在一个实施例中，ceDNA-质粒主链源自于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV 5、AAV7、AAV8、AAV9、AAV 10、AAV 11、AAV 12、AAVrh8、AAVrhlO、AAV-DJ和AAV-DJ8基因组，例如NCBI：NC 002077；NC 001401；NC001729；NC001829；NC006152；NC 006260；NC 006261；Kotin和Smith，《病毒的斯普林格指数(Springer Index of Viruses)》，可从Springer维护的URL获得。在一个实施例中，ceDNA-质粒主链源自AAV2基因组。在一个实施例中，ceDNA-质粒主链是合成的主链，其被基因工程化为在其5'和3'ITR处包含源自于这些AAV基因组之一。

在一个实施例中，ceDNA-质粒可以任选地包含用于建立产生ceDNA载体的细胞系的选择性或选择标志物。在一个实施例中，选择标志物可以插入3'ITR序列的下游(即，3')。在另一个实施例中，选择标志物可以插入5'ITR序列的上游(即，5')。适当的选择标志物包含例如赋予耐药性的那些标志物。选择标志物可以是例如杀稻瘟菌素S抗性基因、卡那霉素(kanamycin)、遗传霉素(geneticin)等。

VI.脂质颗粒的制备

脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可以在将ceDNA与脂质混合时自发形成。取决于期望的粒度分布，可以使用例如热桶挤出机，如Lipex挤出机(北方脂质公司(NorthernLipids,Inc))，经膜(例如，100nrn截止值)挤出所得的纳米颗粒混合物。在一些情况下，可以省略挤出步骤。可以通过例如透析或切向流过滤实现乙醇去除和同时缓冲液交换。在一个实施例中，脂质纳米颗粒如本文实例3中所述形成。

一般而言，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可以通过本领域已知的任何方法形成。例如，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可以通过例如US2013/0037977、US2010/0015218、US2013/0156845、US2013/0164400、US2012/0225129和US2010/0130588中描述的方法制备，其中每一个的内容均通过引用整体并入本文。在一些实施例中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可以使用连续混合方法、直接稀释工艺或在线稀释工艺来制备。用于使用直接稀释和在线稀释工艺制备脂质纳米颗粒的设备的工艺和设备描述于US2007/0042031中，所述文献的内容通过引用整体并入本文。用于使用逐步稀释法制备脂质纳米颗粒的方法和设备描述于US2004/0142025中，所述文献的内容通过引用整体并入本文。

根据一些实施例，本公开提供了一种LNP，其包括刚性DNA载体，所述载体包含本文所描述的ceDNA载体和可电离脂质。例如，制备了一种脂质纳米颗粒调配物并装载有通过于2018年9月7日提交的国际专利申请第PCT/US2018/050042号中公开的方法获得的刚性治疗性核酸样ceDNA，所述文献通过全文引用的方式并入本文。本公开涉及在将TNA与脂质混合之前在80％至100％低分子量醇溶液(例如，乙醇、甲醇、丙醇和异丙醇)中预压实刚性治疗性核酸(TNA)样ceDNA的方法。然后，装载和封装预压实的治疗性核酸可以通过传统的高能量混合来完成，使用像Nanoassemblr^TM的微流体装置，在低pH值下将乙醇脂质与水性ceDNA(例如，80％至100％的乙醇、甲醇、丙醇、异丙醇或其混合物)混合，使可电离脂质质子化，并且为ceDNA/脂质缔合和颗粒成核提供有利的能量学。通过水稀释和去除有机溶剂可以进一步稳定颗粒。颗粒可以浓缩到期望的水平。不希望受理论束缚，据信在与脂质混合以封装DNA之前，刚性DNA的预压实步骤通过在封装之前在低分子量醇溶液中压实DNA分子，对减小所得LNP的尺寸提供了有益的效果。

根据一些实施例，本公开提供了一种生产LNP调配物的方法，其中所述LNP包括阳离子脂质和TNA(如ceDNA)，所述方法包括：向低分子量醇(如乙醇溶液)中添加水性TNA(例如，ceDNA)，其中所述溶液中醇的浓度介于约80％至约95％之间，并且所述溶液中水的浓度在介于约20％至约5％之间；将TNA(例如，ceDNA)与脂质溶液(例如，80％至100％ EtOH)混合；以及酸性水性缓冲液(例如，苹果酸)；并且任选地与中性pH水性缓冲液进行缓冲液交换，由此产生LNP调配物。

根据一些实施例，溶液中的低分子量醇(例如，乙醇、甲醇、丙醇或异丙醇)的浓度介于约80％至约95％之间、介于约80％至90％之间、介于约80％至85％之间、介于约85％至约95％之间、介于约85％至90％之间、介于约90％至约95％之间，或为约80％、约81％、约82％、约83％、，约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％或约95％。

根据一些实施例，溶液中的水的浓度介于约20％至约5％之间、介于约15％至约5％之间、介于约10％至约5％之间、介于约20％至约10％之间、介于约20％至约15％之间、介于约15％至约5％之间，介于约15％至约10％之间，或为约20％、约19％、约18％、约17％、约164％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％或约5％。

根据一些实施例，所述低分子量醇选自由以下组成的组：乙醇、甲醇、丙醇和异丙醇。在一些实施例中，水性TNA(例如，ceDNA)在包括两种或三种低分子量醇的混合物的溶液中。在一个实施例中，低分子量醇溶液是乙醇和甲醇的混合物。在另一个实施例中，低分子量醇溶液是乙醇、甲醇、丙醇和异丙醇的任何组合的混合物。在另一个实施例中，低分子量醇溶液是乙醇和丙醇的混合物。在另一个实施例中，低分子量醇溶液包括45％的乙醇、45％的甲醇和10％的水。

根据一些实施例，所述方法进一步包括用酸性水性缓冲液稀释混合的ceDNA/脂质溶液的步骤。根据一些实施例，所述酸性水性缓冲液选自苹果酸/苹果酸钠或乙酸/乙酸钠。根据一些实施例，酸性水性缓冲液的浓度介于约10至40毫摩尔(mM)之间，介于约10mM至约35mM之间、介于约10mM至约30mM之间、介于约10mM至约25mM之间、介于约10mM至约20mM之间、介于约10mM至约15mM之间、介于约15mM至40mM之间、介于约15mM至约35mM之间、介于约15mM至约30mM之间、介于约15mM至约25mM之间、介于约15mM至约20mM之间、介于约20to40mM之间、介于约20mM至约35mM之间、介于约210mM至约30mM之间、介于约20mM至约25mM之间、介于约25mM至40mM之间、介于约25mM至约35mM之间、介于约25mM至约30mM之间、介于约310mM至40mM之间、介于约30mM至约35mM之间、介于约35mM至约40mM之间、或约、介于约10mM至约25mM之间、介于约10mM至约20mM之间、介于约10mM至约15mM之间，或约10mM、约12mM、约14mM、约16mM、约18mM、约20mM、约22mM、约24mM、约26mM、约28mM、约30mM、约32mM、约34mM、约36mM、约38mM或约40mM。

根据一些实施例，酸性水性缓冲液的pH值介于约3至约5之间、介于3至约4.5之间、介于约3至约4之间、介于约3至约3.5之间、介于约3.5至约5之间、介于约3.5至约4.5之间、介于约3.5至约4之间、介于约4至约5之间、介于约4至约4.5之间、介于约4.5至约5之间，或为约3、约3.25、约3.5、约3.75、约4、约4.25、约4.5、约4.75或约5。

根据一些实施例，所述中性pH水性缓冲液是pH 7.4的杜尔贝氏磷酸盐缓冲盐水。

根据一些实施例，制备LNP的过程利用了刚性TNA(如ceDNA)压实发生在具有高醇(乙醇、甲醇、丙醇和/或异丙醇)含量(>80％)的溶剂中的发现。根据一些实施例，本文所描述的调配过程产生尺寸范围为约50nm至约70nm的LNP。根据一些实施例，本公开的脂质颗粒的平均直径通常为约20nm至约70nm、约25nm至约70nm、约30nm至约70nm、约35nm至约70nm、约40nm至约70nm、约45nm至约80nm、约50nm至约70nm、约60nm至约70nm、约65nm至约70nm，或约20nm、约25nm、约30nm、约35nm、约40nm、约45nm、约50nm、约55nm、约60nm、约65nm、约70nm。根据一些实施例，本文所描述的调配过程产生LNP，其封装大于约80％的刚性TNA(如双链ceDNA)。根据一些实施例，本文所描述的LNP可以封装大于约60％的刚性TNA(如双链ceDNA)、大于约65％的刚性TNA(如双链ceDNA)、大于约70％的刚性TNA(如双链ceDNA)、大于约75％的刚性TNA(如双链ceDNA)、大于约80％的刚性TNA(如双链ceDNA)、大于约85％的刚性TNA(如双链ceDNA)或大于约90％的刚性TNA(如双链ceDNA)。

根据一些实施例，当在低分子量醇中处于压实状态的TNA(如ceDNA)与脂质(80％至100％ EtOH)的乙醇溶液以使所得溶液为85％至95％的乙醇和15％至5％的水的比率混合时，通过动态光散射观察到TNA(如ceDNA)以压实状态存在。在此类溶剂中，脂质和ceDNA两者都被溶解，没有任何一种组分的可检测沉淀。LNP的调配导致压缩TNA的封装，导致直径小得多。

根据一些实施例，当水性TNA(如ceDNA)与脂质的乙醇溶液以使所得溶液在酸性条件下(苹果酸)为90％至92％的乙醇和8％至10％的水的比率混合时，通过动态光散射观察到TNA(如ceDNA)以压实状态存在，并且得到的封装导致LNP具有小得多的直径尺寸。

然后通过使用微流体混合将ceDNA/脂质溶液的乙醇溶液与酸性水性缓冲液混合来驱动LNP的形成。根据一些实施例，酸性水性缓冲液与ceDNA/脂质的乙醇混合物之间的流速比可以为2:1、3:2、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1或20:1。根据一些实施例，在离开混合器之后，用酸性水性缓冲液稀释最终溶液，使得最终乙醇含量为约4％至约15％。根据一些实施例，在离开混合器之后，用酸性水性缓冲液稀释最终溶液，使得最终乙醇含量为约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％或约15％。根据一些实施例，最终乙醇含量为4％。根据一些实施例，最终乙醇含量为12％。然后将含有LNP的此溶液与中性pH水性缓冲液进行缓冲液交换。

在一个实施例中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可以通过冲击喷射工艺制备。一般而言，通过将溶解在醇(例如，乙醇)中的脂质与溶解在缓冲液(例如，柠檬酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液、乙酸钠和氯化镁缓冲液、苹果酸缓冲液、苹果酸和氯化钠缓冲液或柠檬酸钠和氯化钠缓冲液)中的ceDNA混合来形成颗粒。脂质与ceDNA的混合比率可以是约45-55％的脂质和约65-45％的ceDNA。

脂质溶液可以含有阳离子脂质(例如可离子化的阳离子脂质)、非阳离子脂质(例如，磷脂，如DSPC、DOPE和DOPC)、PEG或PEG缀合分子(例如，PEG-脂质)以及甾醇(例如，胆固醇)，其在醇(例如，乙醇)中的总脂质浓度为5-30mg/mL、更可能为5-15mg/mL、最可能为9-12mg/mL。在脂质溶液中，脂质的摩尔比范围，对于阳离子脂质可以是约25-98％，优选约35-65％；对于非离子脂质，可以是约0-15％，优选约0-12％；对于PEG或PEG缀合脂质分子，可以是约0-15％，优选约1-6％；对于甾醇，可以是约0-75％，优选约30-50％。

ceDNA溶液可以包括在缓冲溶液中浓度范围为0.3-1.0mg/mL，优选地0.3-0.9mg/mL的ceDNA，pH范围为3.5-5。

为了形成LNP，在一个示例性但非限制性的实施例中，将两种液体加热至约15-40℃，优选地约30-40℃的温度，然后例如在冲击式喷射混合器中混合，从而立即形成LNP。混合流速范围为10-600毫升/分钟。管ID的范围为0.25到1.0mm，并且总流速为10-600毫升/分钟。流速和管道ID的组合可以将LNP的粒度控制在30到200nm之间。然后可以将溶液与较高pH的缓冲溶液混合，混合比在1:1至1:3vol:vol范围内，优选约1:2vol:vol。如果需要，这种缓冲溶液的温度可以在15-40℃或30-40℃的范围内。然后可以对混合的LNP进行阴离子交换过滤步骤。在阴离子交换之前，可以将混合的LNP孵育一段时间，例如30分钟到2小时。孵育期间的温度可以在15-40℃或30-40℃的范围内。孵育后，将溶液通过过滤器过滤，如0.8μm过滤器，其含有阴离子交换分离步骤。这个过程可以使用1mm ID到5mm ID的管道ID和10到2000毫升/分钟的流速。

在形成之后，可以通过超滤工艺浓缩和渗滤LNP，在所述工艺中，去除醇并将缓冲液更换为最终缓冲溶液，例如，约pH 7(例如，约pH 6.9、约pH 7.0、约pH 7.1、约pH 7.2、约pH 7.3或约pH 7.4)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

超滤工艺可以使用切向流过滤形式(TFF)，所述形式使用30-500kD的膜标称分子量截止范围。膜形式是中空纤维或平板盒。具有适当截留分子量的TFF过程可以将LNP保留在渗余液中，而滤液或渗透液中含有醇、柠檬酸盐缓冲液废液和最终缓冲液废液。TFF工艺是一个多步骤工艺，从初始浓度到1-3mg/mL的ceDNA浓度。浓缩后，针对最终缓冲液，对LNP溶液进行10-20体积的渗滤，以去除醇并进行缓冲液交换。然后可以将材料再浓缩1-3倍。浓缩的LNP溶液可以无菌过滤。

VII.药物组合物和调配物

本文还提供了一种药物组合物，其包括TNA(如ceDNA)脂质颗粒和药学上可接受的载体或赋形剂。

在一个实施例中，TNA(例如，ceDNA)脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)被提供有治疗性核酸的完全封装、部分封装。在一个实施例中，核酸治疗剂完全封装在脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中以形成含有核酸的脂质颗粒。在一个实施例中，核酸可以封装在颗粒的脂质部分内，从而保护其免于酶促降解。

根据脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的预期用途，可以改变组分的比例，并且可以使用例如内体释放参数(ERP)测定法来测量特定调配物的递送效率。

在一个实施例中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可以与其它部分缀合以防止聚集。此类脂质缀合物包含但不限于PEG-脂质缀合物，例如，与二烷氧基丙基偶联的PEG(例如，PEG-DAA缀合物)、与二酰基甘油偶联的PEG(例如，PEG-DAG缀合物)、与胆固醇偶联的PEG、与磷脂酰乙醇胺偶联的PEG和与神经酰胺偶联的PEG(参见例如，美国专利第5,885,613号)、阳离子PEG脂质、聚噁唑啉(POZ)-脂质缀合物(例如，POZ-DAA缀合物，参见例如，于2010年1月13日提交的美国临时申请第61/294,828号和于2010年1月14日提交的美国临时申请第61/295,140号)、聚酰胺寡聚物(例如，ATTA-脂质缀合物)以及其混合物。POZ-脂质缀合物的另外的实例在PCT公开第WO 2010/006282号中描述。PEG或POZ可以直接与脂质缀合，或者可以通过接头部分与脂质连接。可以使用适合于将PEG或POZ与脂质偶联的任何接头部分，包含例如不含酯的接头部分和含酯的接头部分。在某些优选的实施例中，使用不含酯的接头部分，如酰胺或氨基甲酸酯。出于所有目的，将每个上述专利文件的公开内容以全文引用的方式并入本文。

在一个实施例中，TNA(例如，ceDNA)可以与颗粒的脂质部分复合或封装在脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的脂质位置中。在一个实施例中，TNA可以完全封装在脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的脂质位置中，从而保护其免于被核酸酶降解，例如在水溶液中。在一个实施例中，在脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)暴露于37℃的核酸酶至少约20分钟、30分钟、45分钟或60分钟后，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中的TNA基本上没有降解。在一些实施例中，在将颗粒在血清中于37℃下温育至少约30分钟、45分钟或60分钟或至少约2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、28小时、30小时、32小时、34小时或36小时后，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中的TNA基本上没有降解。

在一个实施例中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)对受试者，例如对哺乳动物(如人)基本上是无毒的。

在一个实施例中，包括本公开的治疗性核酸的药物组合物可以调配在脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中。在一些实施例中，包括治疗性核酸的脂质颗粒可以由阳离子脂质形成。在一些其它实施例中，包括治疗性核酸的脂质颗粒可以由非阳离子脂质形成。在优选的实施例中，本公开的脂质颗粒是含有核酸的脂质颗粒，其由阳离子脂质形成，所述阳离子脂质包括选自由以下组成的组的治疗性核酸：mRNA、反义RNA和寡核苷酸、核酶、适体、干扰RNA(RNAi)、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、非对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、小环DNA、小基因、病毒DNA(例如，慢病毒或AAV基因组)或非病毒合成DNA载体、末端封闭式线性双螺旋DNA(ceDNA/CELiD)、质粒、杆粒、doggybone^TMDNA载体、简约的免疫学定义的基因表达(MIDGE)-载体、非病毒迷你串DNA载体(线性-共价封闭的DNA载体)或哑铃形DNA最小载体(“哑铃DNA”)。

在另一个优选的实施例中，本公开的脂质颗粒是含有核酸的脂质颗粒，其由非阳离子脂质和任选地防止颗粒聚集的缀合脂质形成。

在一个实施例中，脂质颗粒调配物是水溶液。在一个实施例中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)调配物是冻干粉末。

根据一些方面，本公开提供了一种脂质颗粒调配物，其进一步包括一种或多种药物赋形剂。在一个实施例中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)调配物进一步包括蔗糖、tris、海藻糖和/或甘氨酸。

在一个实施例中，本文公开的脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可以并入适合施用于受试者的药物组合物中，以体内递送至受试者的细胞、组织或器官。一般而言，药物组合物包括如本文公开的TNA(例如，ceDNA)脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)和药学上可接受的载体。在一个实施例中，本公开的TNA(例如，ceDNA)脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可以并入适合于期望的治疗性施用途径(例如，肠胃外施用)的药物组合物中。还涵盖通过高压静脉内或动脉内输注以及如核内显微注射或胞质内注射的细胞内注射进行的被动组织转导。用于治疗目的的药物组合物可以被调配成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合于高TNA(例如，ceDNA)载体浓度的有序结构。无菌注射溶液可以通过将所需量的TNA(例如，ceDNA)载体化合物根据需要与上文列举的成分中的一种或组合一起并入适当的缓冲液中，接着进行过滤灭菌来制备。

如本文所公开的脂质颗粒可以并入适合于局部、全身、羊膜内、鞘内、颅内、动脉内、静脉内、淋巴内、腹膜内、皮下、气管、组织内(例如肌肉内、心内、肝内、肾内、脑内)、鞘内、膀胱内、结膜(例如眼眶外、眼眶内、眼眶后、视网膜内、视网膜下、脉络膜、脉络膜下、基质内、前房内和玻璃体内)、耳蜗内和粘膜(例如口腔、直肠、鼻)施用的药物组合物。还涵盖通过高压静脉内或动脉内输注以及如核内显微注射或胞质内注射的细胞内注射进行的被动组织转导。

包括TNA(例如，ceDNA)脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的药物活性组合物可以被调配成将核酸中的转基因递送到接受者的细胞，从而引起转基因在其中发生治疗性表达。组合物还可以包含药学上可接受的载体。

用于治疗目的的药物组合物通常必须在制造和存储条件下是无菌的和稳定的。组合物可以调配成溶液、微乳液、分散液、脂质体或其它适合于高TNA(例如，ceDNA)载体浓度的有序结构。无菌注射溶液可以通过将所需量的ceDNA载体化合物根据需要与上文列举的成分中的一种或组合一起并入适当的缓冲液中，接着进行过滤灭菌来制备。

在一个实施例中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)是具有至少一个脂质双层的实心核心颗粒。在一个实施例中，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)具有非双层结构，即非层状(即，非双层)形态。不受限制地，非双层形态可以包含，例如，三维管、棒、立方对称等。可以使用本领域技术人员已知和使用的分析技术来确定脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)的非层状形态(即，非双层结构)。此类技术包含但不限于低温透射电子显微镜(“Cryo-TEM”)、差示扫描量热法(“DSC”)、X射线衍射等。例如，可以使用例如US2010/0130588中描述的Cryo-TEM分析容易地评估和表征脂质颗粒的形态(层状与非层状)，所述文献的内容通过引用整体并入本文。

在一个实施例中，具有非层状形态的脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)是电子致密的。

在一个实施例中，本公开提供了一种脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)，其结构为单层或多层。在一些方面，本公开提供了一种包括多囊泡颗粒和/或泡沫基颗粒的脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)调配物。通过控制脂质组分的组成和浓度，可以控制脂质缀合物交换出脂质颗粒的速率，进而控制脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)融合的速率。另外，包含例如pH、温度或离子强度的其它变量可用于改变和/或控制脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)融合的速率。基于本公开，可用于控制脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)变得融合的速率的其它方法对于本领域普通技术人员将是显而易见的。同样显而易见的是，通过控制脂质缀合物的组成和浓度，可以控制脂质颗粒的大小。

在一个实施例中，调配的阳离子脂质的pKa可以与LNP递送核酸的有效性相关(参见Jayaraman等人,《化学应用国际版》(2012),51(34),8529-8533；Semple等人,《自然生物技术》28,172-176(2010)，两者均通过引用整体并入)。在一个实施例中，pKa的优选范围为约5至约7。在一个实施例中，可以使用基于2-(p-甲苯胺)-6-萘磺酸(TNS)的荧光的测定法在脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中测定阳离子脂质的pKa。

在一个实施例中，TNA(例如，ceDNA)在脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中的封装可以通过进行膜不可渗透的荧光染料排除测定法来确定，所述测定法使用在与核酸相关时具有增强的荧光的染料，例如，

测定法或

测定法。一般而言，通过将染料添加到脂质颗粒调配物中，测量所得的荧光，并与添加少量非离子清洁剂后观察到的荧光进行比较来确定封装。清洁剂介导的对脂质双层的破坏释放了封装的TNA(例如，ceDNA)，使其与不可渗透膜的染料相互作用。ceDNA的封装可以计算为E＝(Io-I)/Io，其中I和Io是指添加清洁剂前后的荧光强度。

单位剂量

在一些实施例中，药物组合物可以以单位剂型呈现。单位剂型通常将适于药物组合物的一种或多种特定施用途径。在一些实施例中，单位剂型适合于通过吸入施用。在一些实施例中，单位剂型适合于通过汽化器施用。在一些实施例中，单位剂型适合于通过喷雾器施用。在一些实施例中，单位剂型适合于通过气雾器施用。在一些实施例中，单位剂型适合于口服施用、经颊施用或舌下施用。在一些实施例中，单位剂型适合于静脉内、肌肉内或皮下施用。在一些实施例中，单位剂型适合于鞘内或脑室内施用。在一些实施例中，调配药物组合物以供局部施用。可以与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常是产生治疗效果的化合物的量。

VIII.治疗方法

如本文所描述的TNA(例如，ceDNA载体脂质颗粒)可以用于将核酸序列(例如，治疗性核酸序列)引入宿主细胞。在一个实施例中，可以用来自经治疗患者的适当生物标志物监测使用TNA(例如，ceDNA载体)脂质颗粒将核酸序列引入宿主细胞，以评估基因表达。

本文提供的药物组合物可以用于递送转基因(核酸序列)用于各种目的。在一个实施例中，ceDNA载体(例如，ceDNA载体脂质纳米颗粒)可以以多种方式使用，包含，例如，异位、体外和体内应用、方法、诊断程序和/或基因疗法方案。

本文提供了治疗受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括将治疗有效量的如本文所描述的TNA(例如，ceDNA)脂质纳米颗粒任选地与药学上可接受的载体一起引入受试者的有需要的靶细胞(例如，肌肉细胞或组织，或其它受影响的细胞类型)中。虽然TNA脂质纳米颗粒可以在载体存在下引入，但此类载体不是必需的。所建构的TNA(例如，ceDNA)脂质纳米颗粒包括可用于治疗疾病的所关注的核苷酸序列。具体地说，ceDNA载体可以包括与控制元件可操作地连接的期望的外源DNA序列，当引入受试者中时，所述控制元件能够指导由外源DNA序列编码的期望的多肽、蛋白质或寡核苷酸的转录。TNA(例如，ceDNA)脂质纳米颗粒可以通过本文所述和本领域已知的任何合适途径施用。在一个实施例中，靶细胞在人类受试者中。

本文提供了用于向有需要的受试者提供诊断或治疗有效量的ceDNA载体(例如，如本文所描述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))的方法，所述方法包括向有需要的受试者的细胞、组织或器官提供一定量的ceDNA载体(例如，如本文所描述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))；并且持续有效的时间以使转基因能够从ceDNA载体表达，由此向受试者提供由ceDNA载体(例如，如本文所描述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))表达的诊断有效量或治疗有效量的蛋白质、肽、核酸。在一个实施例中，所述受试者是人类。

本文提供了用于诊断、预防、治疗或改善受试者的疾病、病症、功能障碍、损伤、异常状况或创伤的至少一种或多种症状的方法。一般而言，所述方法至少包含以下步骤：向有需要的受试者施用一种或多种如本文所描述的TNA(例如，ceDNA)脂质纳米颗粒，施用的量和时间足以诊断、预防、治疗或改善受试者的疾病、病症、功能障碍、损伤、异常病状或创伤的一种或多种症状。在一个实施例中，所述受试者是人类。

本文提供了包括使用TNA(例如，ceDNA)脂质纳米颗粒作为治疗或减轻疾病或疾病状态的一种或多种症状的工具的方法。有许多遗传性疾病中的缺陷基因是已知的，并且通常分为两类：缺陷状态，通常是酶，一般以隐性方式遗传；和不平衡状态，其可以涉及调节蛋白或结构蛋白，并且通常但不总是以显性方式遗传。对于缺陷状态疾病来说，TNA(如ceDNA)脂质纳米颗粒可以用于递送转基因以将正常基因引入受影响的组织中进行替代疗法，在一些实施例中，还使用反义突变建立动物模型。对于不平衡的疾病状态来说，TNA(例如，ceDNA)脂质纳米颗粒可以用于在模型系统中确立疾病状态，然后可以尝试用于抵消所述疾病状态。因此，本文公开的TNA(例如，ceDNA)脂质纳米颗粒和方法允许治疗遗传性疾病。如本文所使用的，通过部分或完全拯救导致疾病或使其更严重的缺陷或不平衡，可以治疗疾病状态。

通常，如本文所描述的TNA(如ceDNA)脂质纳米颗粒可以用于根据上文的描述递送任何转基因，以治疗、预防或改善与任何与基因表达相关的病症相关的症状。说明性疾病状态包含但不限于：囊性纤维化(和其它肺部疾病)、A型血友病、B型血友病、地中海贫血、贫血和其它血液疾病、AIDS、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、肌萎缩侧索硬化、癫痫和其它神经系统疾病、癌症、糖尿病、肌营养不良症(例如，杜氏、贝克尔)、赫勒氏病(Hurler's disease)、腺苷脱氨酶缺乏症、代谢缺陷、视网膜退行性疾病(和其它眼部疾病)、线粒体病(例如，莱伯氏遗传性视神经病(LHON)、Leigh综合征和亚急性硬化性脑病)、肌病(例如，面肩肱肌病(FSHD)和心肌病)、实体器官疾病(例如，脑、肝、肾、心脏)等。在一些实施例中，本文公开的ceDNA载体可以有利地用于治疗患有代谢紊乱(例如，鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症)的个体。

在一个实施例中，本文所描述的TNA(如ceDNA)脂质纳米颗粒可以用于治疗、改善和/或预防由基因或基因产物中的突变引起的疾病或病症。可以用ceDNA载体(例如，本文所述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))治疗的示例性疾病或病症包含但不限于代谢疾病或病症(例如，法布里病、戈谢病、苯丙酮尿症(PKU)、糖原贮积病)；尿素循环疾病或紊乱(例如，鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症)；溶酶体贮积病或病症(例如，异染性脑白质营养不良(MLD)、II型粘多糖贮积症(MPSII；亨特氏综合征))；肝脏疾病或病症(例如，进行性家族性肝内胆汁淤积症(PFIC)；血液疾病或病症(例如，血友病(A和B)、地中海贫血和贫血)；癌症和肿瘤，以及遗传疾病或病症(例如，囊性纤维化)。

在一个实施例中，如本文所描述的TNA(如ceDNA)脂质纳米颗粒可以用于在需要调控转基因表达水平(例如，编码激素或生长因子的转基因，如本文所述)的情况下递送异源核苷酸序列。

在一个实施例中，TNA(如ceDNA)脂质纳米颗粒可以用于矫正导致疾病或病症的异常基因产物的水平和/或功能(例如蛋白质缺乏或缺陷)。如本文所描述的脂质纳米颗粒中的ceDNA载体可以产生功能性蛋白质和/或调控蛋白质的水平，以减轻或减少由所述蛋白质的缺乏或缺陷引起的特定疾病或病症所产生的症状或为所述疾病或病症带来益处。例如，可以通过产生功能性OTC酶来实现OTC缺乏症的治疗；可以通过调节因子VIII、因子IX和因子X的水平来实现A型和B型血友病的治疗；可以通过调节苯丙氨酸羟化酶的水平来实现PKU的治疗；可以分别通过产生功能性α半乳糖苷酶或β葡糖脑苷脂酶来实现法布里病或戈谢病的治疗；可以分别通过产生功能性芳基硫酸酯酶A或艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶来实现MFD或MPSII的治疗；可以通过产生功能性囊性纤维化跨膜传导调节因子来实现囊性纤维化的治疗；可以通过恢复功能性G6Pase酶功能来实现糖原贮积病的治疗；并且可以通过产生功能性ATP8B1、ABCB11、ABCB4或TJP2基因来实现PFIC的治疗。

在一个实施例中，如本文所描述的TNA(例如，ceDNA)脂质纳米颗粒可以用于在体外或体内向细胞提供基于RNA的治疗剂。基于RNA的治疗剂的实例包含但不限于mRNA、反义RNA和寡核苷酸、核酶、适体、干扰RNA(RNAi)、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、非对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)。例如，在一个实施例中，ceDNA载体(例如，如本文所描述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))可以用于在体外或体内向细胞提供反义核酸。例如，在转基因是RNAi分子的情况下，靶细胞中反义核酸或RNAi的表达会削弱细胞对特定蛋白质的表达。因此，为了减少特定蛋白质在有需要的受试者中的表达，可以施用作为RNAi分子或反义核酸的转基因。还可以将反义核酸体外施用于细胞以调控细胞生理，例如优化细胞或组织培养系统。

在一个实施例中，如本文所描述的TNA脂质纳米颗粒可以用于在体外或体内向细胞提供基于DNA的治疗剂。基于DNA的治疗剂的实例包含但不限于小环DNA、小基因、病毒DNA(例如，慢病毒或AAV基因组)或非病毒合成DNA载体、末端封闭式线性双螺旋DNA(ceDNA/CELiD)、质粒、杆粒、doggybone^TM DNA载体、简约的免疫学定义的基因表达(MIDGE)-载体、非病毒迷你串DNA载体(线性-共价封闭的DNA载体)或哑铃形DNA最小载体(“哑铃DNA”)。例如，在一个实施例中，ceDNA载体(例如，如本文所描述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))可以用于在体外或体内向细胞提供小环。例如，在转基因是小环DNA的情况下，靶细胞中小环DNA的表达会削弱细胞对特定蛋白质的表达。因此，为了减少特定蛋白质在有需要的受试者中的表达，可以施用作为小环DNA的转基因。还可以将小环DNA体外施用于细胞以调控细胞生理，例如优化细胞或组织培养系统。

在一个实施例中，由TNA(如ceDNA载体)编码的示例性转基因包含但不限于：、溶酶体酶(例如与泰萨氏病相关的己糖胺酶A或与亨特综合征/MPS II相关的艾杜糖醛酸硫酸酯酶)、促红细胞生成素、血管抑素、内皮抑素、超氧化物歧化酶、球蛋白、瘦蛋白、过氧化氢酶、酪氨酸羟化酶以及细胞因子(例如干扰素、b-干扰素、干扰素-g、白介素-2、白介素-4、白介素12、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、淋巴毒素等)、肽生长因子和激素(例如生长激素、胰岛素、胰岛素样生长因子1和2、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子-3和4、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经胶质衍生生长因子(GDNF)、转化生长因子-a和-b等)、受体(例如肿瘤坏死因子受体)。在一些示例性实施例中，转基因编码对一个或多个期望的目标具有特异性的单克隆抗体。在一些示例性实施例中，ceDNA载体编码超过一种转基因。在一些示例性实施例中，转基因编码包括两种不同的所关注多肽的融合蛋白。在一些实施例中，转基因编码如本文定义的抗体，包含全长抗体或抗体片段。在一些实施例中，抗体是如本文所定义的抗原结合结构域或免疫球蛋白可变结构域序列。其它说明性的转基因序列编码自杀基因产物(胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、白喉毒素、细胞色素P450、脱氧胞苷激酶和肿瘤坏死因子)、将抗性赋予癌症疗法中所用的药物的蛋白质，以及肿瘤抑制基因产物。

施用

在一个实施例中，本公开的TNA脂质纳米颗粒可以向生物体施用，用于体内细胞的转导。在一个实施例中，可以向生物体施用TNA，用于离体细胞的转导。

一般而言，通过通常用于将分子引入最终与血液或组织细胞接触的任何途径进行施用。合适的施用此类核酸的方法是可获得的并且是本领域的技术人员公知的，并且虽然可以使用超过一种途径来施用特定的组合物，但特定的途径通常可以提供比另一途径更直接和更有效的反应。如本文所描述的TNA(如ceDNA载体)(例如，ceDNA脂质纳米颗粒)的示例性施用方式包含口服、经直肠、经粘膜、鼻内、吸入(例如，通过气雾剂)、经颊(例如，舌下)、经阴道、鞘内、眼内、经皮、内皮内、子宫内(或卵内)、肠胃外(例如，静脉内、皮下、皮内、颅内、肌肉内[包含施用骨骼肌、隔膜肌和/或心肌]、胸膜内、大脑内和关节内)、局部(例如，皮肤和粘膜表面二者，包含气道表面和经皮施用)、淋巴管内等，以及直接组织或器官注射(例如，对肝脏、眼睛、骨骼肌、心肌、隔膜肌或脑)。

可以向受试者的任何部位施用如本文所描述的TNA脂质颗粒，包含(但不限于)选自由以下组成的组的部位：脑、骨骼肌、平滑肌、心脏、膈膜、气道上皮、肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、皮肤和眼睛。在一个实施例中，也可以对肿瘤(例如，在肿瘤或淋巴结内或附近)施用如本文所描述的TNA脂质纳米颗粒。在任何给定情况下，最合适的途径将取决于所治疗、改善和/或预防的病状的性质和严重程度，以及所使用的如本文所描述的特定ceDNA(例如，ceDNA脂质纳米颗粒)的性质。另外，ceDNA允许通过单个载体或多个ceDNA载体(例如ceDNA混合物)施用超过一种转基因。

在一个实施例中，向骨骼肌施用ceDNA载体(例如，如本文所描述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))包含但不限于向四肢(例如，上臂、下臂、大腿和/或小腿)、背部、颈部、头部(例如舌头)、胸部、腹部、骨盆/会阴和/或手指中的骨骼肌施用。ceDNA载体(例如，如本文所描述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))可以通过静脉内施用、动脉内施用、腹膜内施用、肢体灌注(任选地，腿和/或手臂的分离肢体灌注；参见例如，Arruda等人,(2005)《血液学(Blood)》105:3458-3464)和/或直接肌内注射而被递送到骨骼肌。在特定实施例中，通过肢体灌注，任选地，分离肢体灌注(例如，通过静脉内或关节内施用)将ceDNA载体(例如，本文所述的ceDNA载体脂质颗粒)施用至受试者(例如，患有如DMD等肌营养不良症的受试者)的肢体(手臂和/或腿)。在一个实施例中，可以在不采用“流体动力学”技术的情况下施用ceDNA载体(例如，本文所述的ceDNA载体脂质颗粒)。

将ceDNA载体(例如，如本文所描述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))施用于心肌包含施用于左心房、右心房、左心室、右心室和/或隔膜。ceDNA载体(例如，如本文所描述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))可以通过静脉内施用、动脉内施用(如主动脉内施用)、直接心脏注射(例如，注入左心房、右心房、左心室、右心室)，和/或冠状动脉灌注而被递送到心肌。可以通过任何合适的方法施用于隔膜肌，包含静脉内施用、动脉内施用和/或腹膜内施用。可以通过任何合适的方法施用于平滑肌，包含静脉内施用、动脉内施用和/或腹膜内施用。在一个实施例中，可以施用于存在于平滑肌内、平滑肌附近和/或平滑肌上的内皮细胞。

在一个实施例中，ceDNA载体(例如，如本文所描述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))被施用至骨骼肌、隔膜肌和/或心肌(例如，以治疗、改善和/或预防肌营养不良或心脏病(例如，PAD或充血性心力衰竭)。

ceDNA载体(例如，如本文所描述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))可以施用于CNS(例如，施用于脑或眼睛)。ceDNA载体(例如，如本文所描述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))可以被引入脊髓、脑干(延髓、脑桥)、中脑(下丘脑、丘脑、上丘脑、垂体、黑质、松果体)、小脑、端脑(纹状体、大脑，包含枕叶、颞叶、顶叶和额叶、皮质、基底神经节、海马和杏仁核)、边缘系统、新皮质、纹状体、大脑和下丘。ceDNA载体(例如，如本文所描述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))也可以施用于眼睛的不同区域，如视网膜、角膜和/或视神经。ceDNA载体(例如，如本文所描述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))可以被递送到脑脊液中(例如，通过腰椎穿刺)。在血脑屏障受到干扰的情况下(例如，脑肿瘤或脑梗塞)，ceDNA载体(例如，本文所述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))可以进一步被血管内施用至CNS。

在一个实施例中，可以通过本领域已知的任何途径将ceDNA载体(例如，如本文所描述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))施用至CNS的期望区域，包含但不限于鞘内、眼内、脑内、心室内、静脉内(例如，在存在甘露醇等糖的情况下)、鼻内、耳内、眼内(例如，玻璃体内、视网膜下、前房)和眼周(例如，眼球筋膜囊下区域(sub-Tenon's region))递送以及逆行递送至运动神经元的肌肉内递送。

根据一些实施例，ceDNA载体(例如，如本文所描述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))通过直接注射(例如，立体定向注射)以液体调配物形式施用至CNS中的期望区域或区室。根据其它实施例，ceDNA载体(例如，如本文所描述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))可以通过局部施用至期望区域或通过气溶胶调配物的鼻内施用来提供。可以通过局部施加液滴来施用于眼睛。作为进一步的替代方案，ceDNA载体可以作为固体缓释调配物施用(参见例如，美国专利第7,201,898号，其通过引用整体并入本文)。在一个实施例中，ceDNA载体(例如，如本文所描述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))可以用于逆行运输以治疗、改善和/或预防涉及运动神经元的疾病和病症(例如，肌萎缩侧索硬化症(ALS)；脊髓性肌萎缩症(SMA)等)。例如，ceDNA载体(例如，如本文所描述的ceDNA载体脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒))可以被递送至肌肉组织，其可以从所述肌肉组织迁移到神经元中。

在一个实施例中，可以重复施用治疗性产物直到达到适当的表达水平。因此，在一个实施例中，可以多次施用和重新给药治疗性核酸。例如，可以在第0天施用治疗性核酸。在第0天进行初始治疗后，可以在用治疗性核酸进行初始治疗后约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周或约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月、约11个月或约1年、约2年、约3年、约4年、约5年、约6年、约7年、约8年、约9年、约10年、约11年、约12年、约13年、约14年、约15年、约16年、约17年、约18年、约19年、约20年、约21年、约22年、约23年、约24年、约25年、约26年、约27年、约28年、约29年、约30年、约31年、约32年、约33年、约34年、约35年、约36年、约37年、约38年、约39年、约40年、约41年、约42年、约43年、约44年、约45年、约46年、约47年、约48年、约49年或约50内进行第二次给药(重新给药)。

在一个实施例中，还可以包含一种或多种另外的化合物。那些化合物可以单独施用，或者所述另外的化合物可以包含在本公开的脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)中。换言之，脂质颗粒(例如，脂质纳米颗粒)可以含有除了ceDNA或至少第二ceDNA之外的其它化合物，其不同于第一种化合物。不受限制地，其它另外的化合物可以选自由以下组成的组：有机或无机的小分子或大分子、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、肽、蛋白质、肽类似物及其衍生物、拟肽、核酸、核酸类似物和衍生物、由生物材料制成的提取物或其任何组合。

在一个实施例中，一种或多种另外的化合物可以是治疗剂。治疗剂可以选自适合于治疗目的的任何类别。因此，治疗剂可以选自适合于治疗目的的任何类别。治疗剂可以根据治疗目的和期望的生物作用进行选择。例如，在一个实施例中，如果LNP内的ceDNA可用于治疗癌症，则另外的化合物可以是抗癌剂(例如，化疗剂、靶向癌症疗法(包含但不限于小分子、抗体或抗体-药物缀合物)。在一个实施例中，如果含有ceDNA的LNP可用于治疗感染，则另外的化合物可以是抗微生物剂(例如，抗生素或抗病毒化合物)。在一个实施例中，如果含有ceDNA的LNP可用于治疗免疫疾病或病症，则另外的化合物可以是调控免疫应答的化合物(例如，免疫抑制剂、免疫刺激化合物或调控一种或多种特异性免疫通路的化合物)。在一个实施例中，含有不同化合物的不同脂质颗粒的不同混合物，如编码不同蛋白质或不同化合物的ceDNA，如治疗剂，可用于本公开的组合物和方法。在一个实施例中，另外的化合物是免疫调控剂。例如，另外的化合物是免疫抑制剂。在一些实施例中，另外的化合物是免疫刺激性的。

实例

通过说明而非限制的方式提供了以下实例。

实例1：式I'的式I可电离脂质的合成

式(I)或式(I')的可电离脂质可以使用以下描述的一般合成方法设计和合成。虽然所述方法用可电离脂质为例示，但其适用于根据式(I)或式(I')设想的可切割脂质的合成。

一般合成(例如，R⁴＝-C)

如方案1所展示的，本文所描述的式(I)或(I')的可电离脂质的合成可以从脂质酸(a)开始，并且与N,O-二甲基羟胺偶联得到Weinreb酰胺(b)。格氏加成(Grignardaddition)产生酮(c)。钛介导的还原胺化得到类型(d)的产物，其与具有一般结构(e)的二硫化物反应，两种末端醇均具有离去基团，即甲磺酰基，以得到一般结构(f)的最终产物。脂质1至51的具体合成方法如下所述或如于2020年11月23日提交的国际专利申请第PCT/US2020/061801号中所述，所述文献通过全文引用的方式并入本文。

方案1

脂质1的合成

使用短程序的单个合成步骤

向冷却至0℃的油酸(I)的二氯甲烷(DCM)溶液中添加CDI。将反应升温到环境温度并保持30分钟，然后冷却到0℃并先用三乙胺处理，然后用二甲基羟胺盐酸盐处理。1小时后，将反应在水和庚烷之间分配。将有机物用硫酸镁干燥，过滤并真空蒸发，得到粗Weinreb酰胺(II)，将其直接用于下一步反应。

将1M的二乙基锌的二氯甲烷溶液冷却至-1℃并用TFA逐滴处理。30分钟后，添加二碘甲烷并将其在冰浴中熟化30分钟。向此溶液中添加Weinreb酰胺(II)。将反应升温到环境温度并搅拌1小时。用氯化铵溶液淬灭反应，分离有机层，用10％硫代硫酸钠洗涤，用硫酸镁干燥，过滤并真空蒸发。通过快速色谱法完成纯化，得到(III)。

将化合物(III)溶解在无水THF中，然后在环境温度和氮气下添加1M壬基溴化镁。10分钟后，用过量饱和NH₄Cl水溶液缓慢淬灭反应。将反应用己烷和水洗涤到分液漏斗中，振摇，弃去下层水层，将上层用硫酸钠干燥，过滤，蒸发得到粗酮。向上述粗酮(IV)中添加二甲胺(2M于THF中)，然后添加Ti(O-i-Pr)₄并搅拌过夜。第二天，添加乙醇，然后添加NaBH₄。搅拌5分钟后，将整个反应直接注入硅胶柱上进行纯化，得到化合物(IV)。

将二硫化物(e)和4摩尔当量的胺(V)溶解在乙腈中，并且在Cs₂CO₃存在下加热约48小时。将粗反应混合物上样到二氧化硅上用于快速色谱法，以产生最终目标脂质1。

实例2：式II的可电离脂质的合成

一般合成

式(II)的可电离脂质是使用以下方案2中的一般程序中描述的类似合成方法设计和合成的。脂质52至71的具体合成方法如下所述或如于2021年3月26日提交的国际专利申请第PCT/US2021/024413号中所述，所述文献通过全文引用的方式并入本文。

方案2

9-(4-(2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-(油酰基氧基)苯基)乙酰氧基)乙基)哌啶-1-基)乙基)二硫烷基)乙基)哌啶-4-基)乙氧基)-2-氧代乙基)苯基)壬二酸1-(十七烷-9-基酯)(脂质52)的合成

可切割、可电离头基双(2-(4-羟基苯基)乙酸)((二硫烷二基双(乙烷-2,1-二基))双(哌啶-1,4-二基))双(乙烷-2,1-二酯)(7)的合成

步骤-1

二甲磺酸二硫烷二基双(乙烷-2,1-二基)酯(2)的合成。将可商购获得的2,2'-二硫烷二基双(乙烷-1-醇)(1)(15g，97.2mmol)溶解在乙腈(143ml)中，然后添加三乙胺(NEt₃)(33.3g，328mmol)。在0℃下向反应混合物中逐滴添加甲磺酰氯(MsCl)(34.5g，300mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌3小时。向反应混合物添加乙醇(EtOH)(39ml)以淬灭反应，并且通过过滤去除不溶性材料。将滤液在二氯甲烷(DCM)(150ml)与10％碳酸氢钠/水(150ml)之间分配。有机层用100ml水洗涤四次，用硫酸镁(MgSO₄)干燥，并且蒸发得到呈棕色油状物的2(25g，81％)，其在静置后固化。¹H-NMR(300MHz,d-氯仿):δ4.43-4.48(t,4H),3.00-3.10(m,10H)。

步骤-2

2,2'-((二硫烷二基双(乙烷-2,1-二基))双(哌啶-1,4-二基))双(乙烷-1-醇)(4)的合成。向2(12g，38.7mmol)于乙腈(310ml)的溶液中添加碳酸钾(K₂CO₃)(13.4g，96.6mmol)，然后添加2-(哌啶-4-基)乙烷-1-醇(3)(20g，155mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜，然后通过过滤除去不溶性材料。将滤液蒸发到干以得到粗产物，将其溶解在DCM(100ml)中，用水洗涤两次(50ml)，用MgSO₄干燥，并且蒸发得到呈黄色油状物的4(11.8g，79％)。¹H-NMR(300MHz,d-氯仿):δ3.63-3.68(t,4H),2.78-2.90(m,8H),2.62-2.65(t,4H),1.94-2.02(t,4H),1.70(s,2H),1.65-1.70(d,4H),1.27-1.48(t,4H),1.40-1.50(m,2H),1.23-1.27(m,4H)。

步骤-3

2-(4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基)乙酸(5)的合成。向0℃下4-羟基苯乙酸(5a)(10g，65mmol)于二甲基甲酰胺(DMF)(40ml)中的搅拌溶液中添加NEt₃(10g，100mmol)，然后添加叔丁基二甲基氯硅烷(TBSCl)(15g，100mmol)。将所得反应混合物在室温下搅拌过夜，然后用水(200ml)和DCM(150ml)处理。分离有机相。用DCM(100ml)萃取水相。将合并的有机相用碳酸氢钠饱和溶液、盐水洗涤，并且用硫酸钠(Na₂SO₄)干燥。在减压下去除溶剂，并且使用于DCM中的0％至10％甲醇(MeOH)作为洗脱剂，将残余物通过硅胶柱色谱法纯化。将含有期望的化合物的馏分汇集并蒸发，得到5(4.8g，27％)和二叔丁基二甲基甲硅烷基醚(di-TBS)副产物(10.5g，42％)。5的¹H-NMR(300MHz,d-氯仿):δ7.12(d,2H),6.78(d,2H),3.56(s,2H),0.97(s,9H),0.18(s,6H)。

双(2-(4-((二叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)苯基乙酸)((二硫烷二基双(乙烷-2,1-二基))双(哌啶-1,4-二基))双(乙烷-2,1-二酯)(6)的合成。向步骤-2得到的二硫化物4(1.92g，5mmol)和苯乙酸5(3.4g，12.8mmol)于DCM(100ml)中的搅拌溶液中添加4-二甲基氨基吡啶(DMAP)(1.5g，12.5mmol)，然后添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI)(2.4g，12.5mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜，然后用碳酸氢钠饱和溶液(200ml)、盐水(150ml)洗涤，并且用Na₂SO₄干燥。在减压下去除溶剂，并且使用于DCM中的0％至10％MeOH作为洗脱剂，将残余物通过硅胶柱色谱法纯化。将含有期望的化合物的馏分蒸发，得到6(4.1g，92％)。6的¹H-NMR(300MHz,d-氯仿):δ7.12(d,4H),6.75(d,4H),4.1(t,4H),3.5(s,4H),2.82(m,8H),2.62(m,4H),1.93(t,4H),1.61-1.45(m,8H),1.26(m,6H),0.97(s,18H),0.17(s,4H)。

步骤-4

双(2-(4-羟基苯基)乙酸)((二硫烷二基双(乙烷-2,1-二基))双(哌啶-1,4-二基))双(乙烷-2,1-二酯)(7)的合成。在0℃下，向二硫化物6(3.1g，3.6mmol)于四氢呋喃(THF)(40ml)中的搅拌溶液中添加氟化氢吡啶(1ml，3.8mmol)。将所得混合物在0℃下搅拌2小时，然后在室温下搅拌另外2小时。反应混合物用饱和碳酸氢钠溶液(200ml)处理，并且用乙酸乙酯(2×150ml)萃取。将合并的有机相用盐水(100ml)洗涤，用Na₂SO₄干燥并浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，使用于DCM中的0％至10％ MeOH作为洗脱剂，得到期望的产物7(1.92g，82％)。¹H-NMR(300MHz,d-氯仿):δ7.13(d,4H),6.70(d,4H),4.1(t,4H),3.5(s,4H),2.89(m,8H),2.70(m,4H),1.95(t,4H),1.48(m,8H),1.17(m,6H)。

9-(十七烷-9-基氧基)-9-氧代壬酸(10)的合成

9-(十七烷-9-基氧基)-9-氧代壬酸(10)的合成。向壬二酸(8)(7.34g，39mmol)和十七烷-9-醇(8b)(5g，19mmol)于二氯甲烷(1000ml)中的搅拌溶液中添加DMAP(2.37g，19mmol)，然后添加EDCI(3g，19mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜，然后用250ml1NHCl和250ml水洗涤。将有机层通过MgSO₄干燥，蒸发到干并使用于DCM中的0％至10％MeOH作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法纯化。将含有期望的化合物的馏分汇集并蒸发，得到呈白色固体的10(6.2g，75％)。¹H-NMR(300MHz,d-氯仿):δ4.80-4.90(m,1H),2.25-2.34(m,4H),1.55-1.70(m,4H),1.40-1.50(m,4H),1.20-1.40(m,30H),0.84-0.90(t,3H)。

9-(4-(2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-羟基苯基)乙酰氧基)乙基)哌啶-1-基)乙基)二硫烷基)乙基)哌啶

-4-基)乙氧基)-2-氧代乙基)苯基)壬二酸1-(十七烷-9-基酯)的合成

9-(4-(2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-羟基苯基)乙酰氧基)乙基)哌啶-1-基)乙基)二硫烷基)乙基)哌啶-4-基)乙氧基)-2-氧代乙基)苯基)壬二酸1-(十七烷-9-基酯)(11)的合成。向步骤-4中产生的二硫化物7(580mg，0.9mmol)和酸10(422mg，0.99mmol)于DMF(20ml)中的搅拌溶液中添加DMAP(165mg，1.35mmol)，然后添加EDCI(258mg，1.35mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜，然后添加饱和碳酸氢钠溶液(50ml)。将反应混合物用二氯甲烷(2×50ml)萃取。将合并的有机相用盐水(30ml)洗涤，用Na₂SO₄干燥并浓缩。使用于DCM中的0％至10％ MeOH作为洗脱剂，将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，得到期望的产物11(427mg，45％)。¹H-NMR(300MHz,d-氯仿):δ7.27(d,2H),7.11(d,2H),7.03(d,2H),6.69(d,2H),4.85(m,1H),4.1(m,4H),3.56(s,2H),3.48(s,2H),2.92(d,2H),2.85-2.69(m,12H),2.71(t,2H),2.28(t,2H),1.95(t,2H),1.52-1.01(m,53H),0.85(m,6H)。

脂质52的合成

9-(4-(2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-(油酰基氧基)苯基)乙酰氧基)乙基)哌啶-1-基)乙基)二硫烷基)乙基)哌啶-4-基)乙氧基)-2-氧代乙基)苯基)壬二酸1-(十七烷-9-基酯)(脂质52)的合成。向二硫化物11(151mg，0.14mmol)和油酸12(61mg，0.22mmol)于二氯甲烷(10ml)中的搅拌溶液中添加DMAP(28mg，0.22mmol)，然后添加EDCI(42mg，0.22mol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜，然后用饱和碳酸氢钠溶液(20ml)、盐水(20ml)洗涤，并且通过Na₂SO₄干燥。在减压下去除溶剂，并且使用于DCM中的0％至10％ MeOH作为洗脱剂，将残余物通过硅胶柱色谱法纯化。将含有期望的化合物的馏分蒸发，得到脂质52(126mg，68％)。脂质52的¹H-NMR(300MHz,d-氯仿):δ7.25(d,4H),7.01(d,4H),5.34(m,2H),4.86(m,1H),4.11(t,4H),3.58(s,4H),2.91-2.70(m,8H),2.62(m,4H),2.53(t,4H),2.28(t,2H),2.05-1.87(m,8H),1.78-1.46(m,22H),1.48-1.23(m,54H),0.86(t,9H)。MS[M+H]⁺1318。

实例3：式V的可电离脂质的合成

式(V)的可电离脂质是使用以下方案3中的一般程序中描述的类似合成方法设计和合成的。下文还描述了脂质72至76的具体合成程序。变量R¹、R¹'、R²、R²'、R³、R³'、R⁴、R⁴'、R⁵和R⁵'如式(V)所定义。R^x比R⁴短2个碳原子，并且类似地，R^x'比R⁴'短2个碳原子。

方案3

在步骤1中，向二硫化物1和酸2于二氯甲烷(DCM)中的搅拌溶液中添加4-二甲基氨基吡啶(DMAP)，然后添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI)。将所得混合物在室温下搅拌2天，然后添加饱和碳酸氢钠溶液。用DCM萃取反应混合物。将合并的有机相用盐水洗涤，通过硫酸钠(Na₂SO₄)干燥并浓缩。将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，使用于DCM中的0％至5％甲醇(MeOH)作为洗脱剂以得到3。步骤2试剂和条件基本上与步骤1中的相同，其产生式(V)的脂质作为最终产物。

方案4

9,9'-二(十七烷-9-基)二(壬二酸)O'1,O1-(((二硫烷二基双(乙烷-2,1-二基))双(哌啶-1,4-二基))双(乙烷-2,1-二酯))(脂质76)和9-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(油酰基氧基)甲基)哌啶-1-基)乙基)二硫烷基)乙基)哌啶-4-基)乙基)壬二酸1-(十七烷-9-基酯)(脂质72)的合成

参考方案4，向二硫化物1a(实例2中描述了其合成)(1.17g，3.1mmol)和9-(十七烷-9-基氧基)-9-氧代壬酸(2.0g，4.6mmol)于DCM(50ml)中的搅拌溶液中添加DMAP(565mg，4.6mmol)，然后添加EDCI(878mg，4.6mmol)。将所得混合物在室温下搅拌2天，然后用饱和碳酸氢钠溶液(60ml)、盐水(20ml)洗涤，并且通过Na₂SO₄干燥。在减压下去除溶剂，并且使用于DCM中的0％至10％ MeOH作为洗脱剂，将残余物通过硅胶柱色谱法纯化两次。将含有期望的化合物的馏分蒸发，得到脂质76(620mg，23％)和9-(2-(1-(2-((2-(4-(2-羟乙基)哌啶-1-基)乙基)二硫烷基)乙基)哌啶-4-基)乙基)壬二酸1-(十七烷-9-基酯)或化合物3a-D(即方案4中的化合物3a，其中R^y＝D)(389mg，22％)。

脂质76的¹H-NMR(300MHz,d-氯仿):δ4.85(m,2H),4.09(t,4H),2.91-2.74(m,8H),2.63-2.67(m,4H),2.27-2.22(m,8H),1.97(t,4H),1.75-1.43(m,24H),1.45-1.16(m,66H),0.86(t,12H)。MS[M+H]⁺1194。

3a-D的¹H-NMR(300MHz,d-chloroform):δ4.83(m,1H),4.06(t,2H),3.63(t,2H),2.97-2.69(m,9H),2.66(m,4H),2.25(t,4H),1.93(t,4H),1.76-1.43(m,16H),1.39-1.22(m,36H),0.86(t,6H)。

接下来，向二硫化物3a-D(185mg，0.23mmol)和油酸(131mg，0.46mmol)于二氯甲烷(10ml)中的搅拌溶液中添加DMAP(55mg，0.46mmol)，然后添加EDCI(87mg，0.46mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜，然后用饱和碳酸氢钠溶液(20ml)、盐水(20ml)洗涤，并且通过Na₂SO₄干燥。在减压下去除溶剂，并且使用于DCM中的0％至10％ MeOH作为洗脱剂，将残余物通过硅胶柱色谱法纯化。将含有期望的化合物的馏分蒸发，得到脂质72(165mg，68％)。

脂质72的¹H-NMR(300MHz,d-氯仿):δ5.32(m,2H),4.85(m,1H),4.09(t,4H),2.96-2.77(m,8H),2.67-2.53(m,4H),2.28-2.20(m,6H),2.16-1.92(t,8H),1.75-1.47(m,14H),1.41-1.13(m,60H),0.86(t,9H)。MS[M+H]⁺1049。

9,9'-二壬基二(壬二酸)O'1,O1-(((二硫烷二基双(乙烷-2,1-二基))双(哌啶-1,4-二基))双(乙烷-2,1-二酯))(脂质75)的合成

参考方案4，向二硫化物1a(376mg，1mmol)和9-(辛氧基)-9-氧代壬酸(629mg，2mmol)于DCM(25ml)中的搅拌溶液中添加DMAP(244mg，2mmol)，然后添加EDCI(310mg，2mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜，然后添加饱和碳酸氢钠溶液(20ml)。将反应混合物用DCM(2×50ml)萃取。将合并的有机相用盐水(30ml)洗涤，用Na₂SO₄干燥并浓缩。使用于DCM中的0％至5％ MeOH作为洗脱剂，将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，得到呈淡黄色固体的脂质75(240mg，25％)。¹H-NMR(300MHz,d-氯仿):δ4.04-4.09(m,8H),2.5-3.0(m,10H),2.25-2.30(t,8H),2.0(t,4H),1.58-1.90(m,24H),1.20-1.40(m,42H),0.87(t,6H)。

9-(2-(1-(2-((2-(4-(2-((9-(壬氧基)-9-氧壬酰基)氧基)乙基)哌啶-1-基)乙基)二硫烷基)乙基)哌啶-4-基)乙基)壬二酸1-(十七烷-9-基酯)(脂质74)的合成

参考方案4，向二硫化物1a(376mg，1mmol)和9-(辛氧基)-9-氧代壬酸(629mg，2mmol)于DCM(25ml)中的搅拌溶液中添加DMAP(244mg，2mmol)，然后添加EDCI(310mg，2mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜，然后添加饱和碳酸氢钠溶液(20ml)。将反应混合物用DCM(2×50ml)萃取。将合并的有机相用盐水(30ml)洗涤，用Na₂SO₄干燥并浓缩。使用于二氯甲烷中的0％至5％ MeOH作为洗脱剂，将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，得到9-壬基壬二酸1-(2-(1-(2-((2-(4-(2-羟乙基)哌啶-1-基)乙基)二硫烷基)乙基)哌啶-4-基)乙酯)或化合物3a-C(即方案4中的化合物3a，其中R^y＝C)(250mg，26％)，其直接用于下一次转化而不进行表征。

接下来，向二硫化物3a(650mg，0.97mmol)和9-(十七烷-9-基氧基)-9-氧代壬酸(411mg，0.96mmol)于DCM(50ml)中的搅拌溶液中添加DMAP(117mg，0.96mmol)，然后添加EDCI(149mg，0.96mmol)。将所得混合物在室温下搅拌2天，然后用水洗涤并通过Na₂SO₄干燥。在减压下去除溶剂，并且使用于DCM中的0％至10％ MeOH作为洗脱剂，将残余物通过硅胶柱色谱法纯化。将含有期望的化合物的馏分蒸发，得到脂质74(420mg，40％)。¹H-NMR(300MHz,d-氯仿):δ4.9(m,1H),4.05-4.09(m,6H),2.80-3.0(m,8H),2.60-2.70(m,4H),2.25-2.27(m,8H),1.92-2.01(t,4H),1.48-1.62(m,25H),1.24-1.40(m,52H),0.87(t,9H)。

9-(2-(1-(2-((2-(4-(2-((5-(壬氧基)-5-氧代戊酰基)氧基)乙基)哌啶-1-基)乙基)二硫烷基)乙基)哌啶-4-基)乙基)壬二酸1-(十七烷-9-基酯)(脂质73)的合成

向二硫化物4(3.76g，10mmol)和9-(十七烷-9-基氧基)-9-氧代壬酸(2.13g，5mmol)于DCM(100ml)中的搅拌溶液中添加DMAP(776mg，5mmol)，然后添加EDCI(610mg，5mmol)。将所得混合物在室温下搅拌2天，然后添加饱和碳酸氢钠溶液(40ml)。将反应混合物用DCM(2×100ml)萃取。将合并的有机相用盐水(60ml)洗涤，用Na₂SO₄干燥并浓缩。使用于DCM中的0％至5％ MeOH作为洗脱剂，将残余物通过硅胶柱色谱法纯化，得到9-(2-(1-(2-((2-(4-(2-羟乙基)哌啶-1-基)乙基)二硫烷基)乙基)哌啶-4-基)乙基)壬二酸1-(十七烷-9-基酯)或化合物3a-D(即方案4中的化合物3a，其中R^y＝D)(1.4g，36％)。¹H-NMR(300MHz,d-氯仿):δ4.90(m,1H),4.09-4.10(m,3H),3.68(t,2H),2.79-2.99(m,8H),2.66(m,4H),2.30(m,4H),2.03(t,4H),1.22-1.78(m,55H),0.86(s,6H)。

接下来，向二硫化物3a-D(300mg，0.38mmol)和5-(壬氧基)-5-氧代戊酸(115mg，0.45mmol)于DCM(20ml)中的搅拌溶液中添加DMAP(49mg，0.4mmol)，然后添加EDCI(62mg，0.4mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜，然后用饱和碳酸氢钠溶液(20ml)、盐水(20ml)洗涤，并且通过Na₂SO₄干燥。在减压下去除溶剂，并且使用于DCM中的0％至5％ MeOH作为洗脱剂，将残余物通过硅胶柱色谱法纯化。将含有期望的化合物的馏分蒸发，得到脂质73(165mg，42％)。¹H-NMR(300MHz,d-氯仿):δ5.85(m,1H),4.05-4.10(m,6H),2.79-2.88(m,8H),2.63-2.66(m,4H),2.33-2.36(t,4H),2.26-2.33(t,4H),1.94-1.98(m,6H),1.55-1.59(m,22H),1.24-1.40(m,48H),0.84-0.89(t,9H)。

实例4：式XV的可电离脂质的合成

使用以下方案5(R⁵不存在)和方案6(R⁵为C₁-C₈亚烷基或C₂-C₈亚烯基)中描述的类似合成方法设计和合成式(XV)的脂质。方案5-6所示的化合物中的所有其它变量，即R¹、R²、R³、R⁴、R^6a、R^6b、X¹、X²和n如式(XV)所定义。X¹'是如定义的X¹，但具有另外的保护基，如苄基或吡啶。脂质77至87另外的合成程序和具体合成程序在于2021年4月20日提交的美国专利申请第63/176,943号中进行了描述，所述文献通过全文引用的方式并入本文。

方案5

方案6

R^x是具有比R⁵少一个的碳原子的亚烷基或亚烯基。

使用以下方案7(R⁵不存在)和方案8(R⁵为C₁-C₈亚烷基或C₂-C₈亚烯基)中描述的类似合成方法设计和合成式(XVII)的二酯脂质。方案7和方案8所示的化合物中的所有其它变量，即R¹、R²、R³、R⁴、R^6a、R^6b和n如式(XVII)所定义。

方案7

方案8

R^x是具有比R⁵少一个的碳原子的亚烷基或亚烯基。

方案5和方案6

参考方案5和方案6，在步骤1中，向酸1和醇2(或2a)于二氯甲烷(DCM)中的搅拌溶液中添加4-二甲基氨基吡啶(DMAP)，然后添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI)。将所得混合物在室温下搅拌过夜，然后用盐酸(HCl)和水洗涤。将有机层通过硫酸镁(MgSO₄)干燥，蒸发到干并使用于DCM中的0％至10％甲醇(MeOH)作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法纯化。将含有期望的化合物的馏分汇集并蒸发，得到呈白色固体的酸3。

在步骤2中，向酸3(或3a)于DCM中的溶液中添加EDCI和三乙胺(TEA)，并且将混合物在室温下搅拌15分钟。然后，添加N,O-二甲基羟胺盐酸盐和DMAP，并且将混合物在室温下搅拌过夜。第二天，用氯化铵水溶液(NH₄Cl(水溶液))淬灭反应，并且用DCM稀释。将有机层用NH₄Cl和盐水洗涤，并且通过无水硫酸钠(Na₂SO₄)干燥。在真空下蒸发溶剂。将产物4(或4a)在不进行进一步纯化的情况下用于下一步骤。

在步骤3中，将化合物4(或4a)溶解在无水四氢呋喃(THF)中。然后在0℃下逐滴添加5，溴化镁于二乙醚(Et₂O)中的溶液。将所得混合物在氮气(N₂)下在室温下搅拌16小时。将反应用饱和NH₄Cl溶液淬灭，并且用乙醚萃取。将有机层用盐水洗涤并通过无水Na₂SO₄干燥。在真空下蒸发溶剂，并且使用于己烷中的0％至10％乙酸乙酯(EtOAc)作为洗脱剂，通过柱色谱法纯化，得到6(或6a)。

在步骤4中，在0℃下向6(或6a)于无水THF的溶液中添加硼氢化钠(NaBH₄)，并且在N₂气氛下将混合物搅拌过夜。将反应用饱和NH₄Cl溶液淬灭，并且用EtOAc萃取。将有机相用盐水洗涤并通过无水Na₂SO₄干燥。在真空下蒸发溶剂，并且使用于己烷中的0％至10％EtOAc作为洗脱剂，通过柱色谱法纯化，得到7。

在步骤5中，将N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)添加到化合物7(或7a)和化合物8(或8a)于DCM中的溶液中。然后添加EDCI和DMAP(0.012g，0.1mmol)，并且将混合物在室温下在N₂气氛下搅拌过夜。第二天，用DCM稀释反应。将有机层用碳酸氢钠水溶液(NaHCO₃(水溶液))洗涤，并且通过无水Na₂SO₄干燥。在真空下蒸发溶剂，并且使用于DCM中的0％至5％ MeOH作为洗脱剂，通过柱色谱法纯化，得到最终产物9(或二酯9a)。

方案7和方案8

参考方案7和方案8，在步骤1中，向3g(11.8mmol)酮10于THF中的冰冷溶液中逐滴添加磷酸酐溶液11。将反应物搅拌30分钟，然后添加氢化钠(NaH)。反应得到12。

在步骤2中，将THF中的化合物2与氢化铝锂溶液(LiAlH₄)反应。48小时后，将粗产物用水淬灭并用乙醚萃取，得到醇13。

随后的方案6和方案7的步骤3至步骤7与方案4和方案5的步骤1至步骤5中所描述的程序类似，以醇13作为合适的起始材料，并且进行本领域普通技术人员所知的其它修改。

脂质77、脂质78、脂质79、脂质80和脂质81的合成

下文参考同样在下文提供的方案9描述合成脂质77、脂质78、脂质79、脂质80和脂质81的程序。

方案9

步骤1：9-(十七烷-9-基氧基)-9-氧代壬酸(3b)的合成

向壬二酸(2b，也称为杜鹃花酸)(7.34g，39mmol)和十七烷-9-醇(1a)(5g，19mmol)于DCM(1000ml)中的搅拌溶液中添加DMAP(2.37g，19mmol)，然后添加EDCI(3g，19mmol)。将所得混合物在室温下搅拌过夜，然后用250ml 1N HCl和250ml水洗涤。将有机层通过MgSO₄干燥，蒸发到干并使用于DCM中的0％至10％甲醇作为洗脱剂，通过硅胶柱色谱法纯化。将含有期望的化合物的馏分汇集并蒸发，得到呈白色固体的3b(6.2g，75％)。¹H-NMR(300MHz,d-氯仿):δ4.80-4.90(m,1H),2.25-2.34(m,4H),1.55-1.70(m,4H),1.40-1.50(m,4H),1.20-1.40(m,30H),0.84-0.90(t,3H)。

步骤2：9-(甲氧基(甲基)氨基)-9-氧代壬酸十七烷-9-基酯(4b)的合成

向化合物3(5.4g，12.7mmol)于DCM(60mL)中的溶液中添加EDCI(3.6g，19.7mmol)和TEA(3.5mL，25.4mmol)，并且在室温下将混合物搅拌15分钟。然后添加N,O-二甲基羟胺盐酸盐(1.36g，13.97mmol)和DMAP(0.15g，1.27mmol)，并且在室温下搅拌过夜。第二天，将反应用NH₄Cl(水溶液)淬灭并用DCM稀释。将有机层用NH₄Cl和盐水洗涤，并且通过无水Na₂SO₄干燥。在真空下蒸发溶剂。将产物4b在不进行进一步纯化的情况下用于下一步骤。¹H NMR(300MHz,d-氯仿)δ4.85(t,J＝6.2Hz,1H),3.67(s,3H),3.58(s,2H),3.17(s,3H),2.40(t,J＝7.6Hz,2H),2.27(t,J＝7.5Hz,2H),1.63(dd,J＝14.8,5.5Hz,6H),1.49(d,J＝5.4Hz,4H),1.37–1.19(m,32H),0.86(d,J＝6.8Hz,6H)。

步骤3：9-氧代十六烷酸十七烷-9-基酯(6b，其中R⁴为C₇烷基)、9-氧代十七烷酸十七烷-9-基酯(6b，其中R⁴为C₈烷基)、9-氧代十八烷酸十七烷-9-基酯(6b，其中R⁴为C₉烷基)、9-氧代十九烷酸十七烷-9-基酯(6b，其中R⁴为C₁₀烷基)或9-氧代二十烷酸十七烷-9-基酯(6b，其中R⁴为C₁₁烷基)的合成

9-氧代十六烷酸十七烷-9-基酯(6b，其中R⁴为C₇烷基)

将化合物4b(1.0g，2.13mmol)溶解在10ml无水THF中。然后，在0℃下逐滴添加1M庚基溴化镁(化合物5a，其中R⁴为C₇烷基)于Et₂O(3.2ml，3.2mmol)中的溶液。将所得混合物在室温下在N₂下搅拌16小时。将反应用饱和NH₄Cl溶液淬灭，并且用乙醚萃取。将有机层用盐水洗涤并通过无水Na₂SO₄干燥。在真空下蒸发溶剂，并且使用于己烷中的0％至10％ EtOAc作为洗脱剂，通过柱色谱法纯化，得到6b，其中R⁴为C₇烷基(0.3g，30％)。¹H NMR(300MHz,d-氯仿)δ4.85(t,J＝6.2Hz,1H),2.37(t,J＝7.4Hz,4H),2.27(t,J＝7.5Hz,2H),1.64-1.43(m,12H),1.27(s,36),0.87(t,J＝6.7Hz,9H)。

9-氧代十七烷酸十七烷-9-基酯(6b，其中R⁴为C₈烷基)

将化合物4b(1.0g，2.13mmol)溶解在10ml无水THF中。然后在0℃下逐滴添加1M辛基溴化镁(化合物5，其中R⁴为C₈烷基)于Et₂O(1.6ml，3.2mmol)中的溶液。将所得混合物在室温下在N₂下搅拌16小时。将反应用饱和NH₄Cl溶液淬灭，并且用乙醚萃取。将有机层用盐水洗涤并通过无水Na₂SO₄干燥。在真空下蒸发溶剂，并且使用于己烷中的0％至10％ EtOAc作为洗脱剂，通过柱色谱法纯化，得到6b，其中R⁴为C₈烷基(0.41g，40％)。¹HNMR(300MHz,d-氯仿)δ4.85(t,J＝6.2Hz,1H),2.37(t,J＝7.4Hz,4H),2.26(t,J＝7.5Hz,2H),1.65–1.38(m,8H),1.33–1.18(m,42H),0.87(t,J＝6.5Hz,9H)。

9-氧代十八烷酸十七烷-9-基酯(6b，其中R⁴为C₉烷基)

将化合物4b(1.1g，2.3mmol)溶解在20ml无水THF中。然后在0℃下逐滴添加1M壬基溴化镁(化合物5，其中R⁴为C₉烷基)于Et₂O(6.13ml，3.2mmol)中的溶液。使所得混合物达到室温并经过2小时。将反应用饱和NH₄Cl溶液淬灭，并且用乙醚萃取。将有机层用盐水洗涤并通过无水Na₂SO₄干燥。在真空下蒸发溶剂，并且使用于己烷中的0％至30％ EtOAc作为洗脱剂，通过柱色谱法纯化，得到6b，其中R⁴为C₉烷基(1.2g，96％)。¹H NMR(300MHz,d-氯仿)δ4.85(t,J＝6.2Hz,1H),2.37(t,J＝7.4Hz,4H),2.26(t,J＝7.5Hz,2H),1.65–1.38(m,8H),1.33–1.18(m,44H),0.87(t,J＝6.5Hz,9H)。

9-氧代十九烷酸十七烷-9-基酯(6b，其中R⁴为C₁₀烷基)

将化合物4b(0.3g，0.64mmol)溶解在2ml无水THF中。然后在0℃下逐滴添加1M癸基溴化镁(化合物5，其中R⁴为C₁₀烷基)于Et₂O(1.28ml，0.77mmol)中的溶液。使所得混合物达到室温并经过2小时。将反应用饱和NH₄Cl溶液淬灭，并且用己烷萃取。将有机层用盐水洗涤并通过无水Na₂SO₄干燥。在真空下蒸发溶剂，并且使用于己烷中的0％至10％EtOAc作为洗脱剂，通过柱色谱法纯化，得到6b，其中R⁴为C₁₀烷基(0.2g，47％)。

9-氧代二十烷酸十七烷-9-基酯(6b，其中R⁴为C₁₁烷基)

向1-溴十一烷(0.47g，2mmol)和2mL无水醚的溶液中添加Mg(0.072g，3mmol)和1滴1,2-二溴乙烷。将所得混合物搅拌1小时，并且过滤并干燥。将产物十一烷基溴化镁(化合物5，其中R⁴是C₁₁烷基)在不进行进一步纯化的情况下用于下一步骤。

将化合物4b(0.47g，1mmol)溶解在3ml无水THF中。然后在0℃下逐滴添加十一烷基溴化镁于THF(1.1ml，1mmol)中的溶液。使所得混合物达到室温并经过2小时。将反应用饱和NH₄Cl溶液淬灭，并且用己烷萃取。将有机层用盐水洗涤并通过无水Na₂SO₄干燥。在真空下蒸发溶剂，并且使用于己烷中的0％至10％ EtOAc作为洗脱剂，通过柱色谱法纯化，得到化合物5，其中R⁴为C₁₁烷基(0.27g，48％)。¹H NMR(300MHz,d-氯仿)δ4.86(t,J＝6.2Hz,1H),2.37(t,J＝7.4Hz,4H),2.27(t,J＝7.5Hz,2H),1.70–1.45(m,8H),1.29-1.25(m,48H),0.87(t,J＝6.6Hz,9H)。

步骤4：9-羟基十六烷酸十七烷-9-基酯(7b，其中R⁴为C₇烷基)、9-羟基十七烷酸十七烷-9-基酯(7b，其中R⁴为C₈烷基)、9-羟基十八烷酸十七烷-9-基酯(7b，其中R⁴为C₉烷基)、9-羟基十九烷酸十七烷-9-基酯(7b，其中R⁴为C₁₀烷基)或9-羟基二十烷酸十七烷-9-基酯(7b，其中R⁴为C₁₁烷基)的合成

9-羟基十六烷酸十七烷-9-基酯(7b，其中R⁴为C₇烷基)

在0℃下向9-氧代十六烷酸十七烷-9-基酯(6b，其中R⁴为C₇烷基)(0.3g，0.6mmol)于10mL无水THF中的溶液添加NaBH₄(0.09g，2.4mmol)，并且在N₂气氛下搅拌过夜。将反应用饱和NH₄Cl溶液淬灭，并且用EtOAc萃取。将有机相用盐水洗涤并通过无水Na₂SO₄干燥。在真空下蒸发溶剂，并且使用于己烷中的0％至10％ EtOAc作为洗脱剂，通过柱色谱法纯化，得到7b，其中R⁴为C₇烷基(0.25g，82％)。¹H NMR(300MHz,d-氯仿)δ4.92–4.78(m,1H),3.57(m,1H),2.27(t,J＝7.5Hz,2H),1.66–1.36(m,12H),1.31-1.25(m,40H),0.87(t,J＝6.1Hz,9H)。

9-羟基十七烷酸十七烷-9-基酯(7b，其中R⁴为C₈烷基)

在0℃下向9-氧代十七烷酸十七烷-9-基酯(6b，其中R⁴为C₈烷基)(0.4g，0.77mmol)于10mL无水THF中的溶液添加NaBH₄(0.04g，1.15mmol)，并且在N₂气氛下搅拌过夜。将反应用饱和NH₄Cl溶液淬灭，并且用EtOAc萃取。将有机相用盐水洗涤并通过无水Na₂SO₄干燥。在真空下蒸发溶剂，并且使用于己烷中的0％至10％ EtOAc作为洗脱剂，通过柱色谱法纯化，得到7b，其中R⁴为C₈烷基(0.21g，52％)。¹H NMR(300MHz,d-氯仿)δ4.92–4.80(m,1H),3.57(m,1H),2.27(t,J＝7.5Hz,2H),1.64–1.40(m,12H),1.36–1.18(m,42H),0.87(t,J＝6.5Hz,9H)。

9-羟基十八烷酸十七烷-9-基酯(7b，其中R⁴为C₉烷基)

在0℃下向9-氧代十八烷酸十七烷-9-基酯(6b，其中R⁴为C₉烷基)(1.1g，2.05mmol)于40mL DCM:MeOH(1:1)混合物中的溶液添加NaBH₄(0.3g，8mmol)，并且在N₂气氛下搅拌2小时。将反应用1M HCl(水溶液)溶液淬灭，并且用DCM萃取。将有机相用盐水洗涤并通过无水Na₂SO₄干燥。在真空下蒸发溶剂，并且使用于己烷中的5％至40％ EtOAc作为洗脱剂，通过柱色谱法纯化，得到7b，其中R⁴为C₉烷基(0.9g，83％)。¹H NMR(300MHz,d-氯仿)δ4.88–4.83(m,1H),3.57(m,1H),2.27(t,J＝7.5Hz,2H),1.61(t,J＝7.5Hz,2H),1.48–1.41(m,8H),1.36–1.18(m,44H),0.87(t,J＝6.5Hz,9H)。

9-羟基十九烷酸十七烷-9-基酯(7b，其中R⁴为C₁₀烷基)

在0℃下向9-氧代十九烷酸十七烷-9-基酯(6b，其中R⁴为C₁₀烷基)(0.2g，0.36mmol)于3mL THF:DCM:MeOH(1:1:1)混合物中的溶液添加NaBH₄(0.03g，0.8mmol)，并且在N₂气氛下搅拌3小时。将反应用0.5mL H₂O淬灭，并且用DCM萃取。将有机相用盐水洗涤并通过无水MgSO₄干燥。在真空下蒸发溶剂，并且使用于己烷中的5％至40％ EtOAc作为洗脱剂，通过柱色谱法纯化，得到7b，其中R⁴为C₁₀烷基(0.16g，80％)。¹H NMR(300MHz,d-氯仿)δ4.86(t,J＝6.2Hz,1H),3.58(m,1H),2.27(t,J＝7.5Hz,2H),1.61-1.37(m,12H),1.32–1.18(m,46H),0.87(t,J＝6.6Hz,9H)。

9-羟基二十烷酸十七烷-9-基酯(7b，其中R⁴为C₁₁烷基)

在0℃下向9-氧代二十烷酸十七烷-9-基酯(6b，其中R⁴为C₁₁烷基)(0.27g，0.48mmol)于3mL THF:DCM:MeOH(1:1:1)混合物中的溶液添加NaBH₄(0.05g，1.35mmol)，并且在N₂气氛下搅拌3小时。将反应用0.5mL H₂O淬灭，并且用DCM萃取。将有机相用盐水洗涤并通过无水MgSO₄干燥。在真空下蒸发溶剂，并且使用于己烷中的5％至40％ EtOAc作为洗脱剂，通过柱色谱法纯化，得到7b，其中R⁴为C₁₁烷基(0.25g，92％)。¹H NMR(301MHz,d-氯仿)δ4.86(t,J＝6.2Hz,1H),3.57(s,1H),2.27(t,J＝7.5Hz,2H),1.69–1.37(m,12H),1.29-1.17(m,48H),0.87(t,J＝6.5Hz,9H)。

步骤5：9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十六烷酸十七烷-9-基酯(脂质81)、9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷酸十七烷-9-基酯(脂质79)、9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十八烷酸十七烷-9-基酯(脂质77)、9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十九烷酸十七烷-9-基酯(脂质78)或9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)二十烷酸十七烷-9-基酯(脂质80)的合成

9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十六烷酸十七烷-9-基酯(脂质81)

向9-羟基十六烷酸十七烷-9-基酯(7b，其中R⁴为C₇烷基)(0.25g，0.49mmol)和4-(二甲基氨基)丁酸(0.125g，0.75mmol)于DCM(5mL)中的溶液添加0.27mL的DIPEA。然后添加EDCI(0.143g，0.75mmol)和DMAP(0.012g，0.1mmol)，并且将混合物在室温下在N₂气氛下搅拌过夜。第二天，用DCM稀释反应。将有机层用NaHCO₃(水溶液)洗涤并通过无水Na₂SO₄干燥。在真空下蒸发溶剂，并且使用于DCM中的0％至5％ MeOH作为洗脱剂，通过柱色谱法纯化，得到脂质81(0.14g，45％)。¹H NMR(300MHz,d-氯仿)δ4.93–4.77(m,2H),2.37–2.23(m,5H),2.21(s,6H),1.83-1.73(m,2H),1.70–1.40(m,10H),1.25(s,43H),0.87(t,J＝6.6Hz,9H)。MS发现624.5[M+H]⁺，[C₃₉H₇₇NO₄]的计算值为623.59。

9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷酸十七烷-9-基酯(脂质79)

向化合物9-羟基十七烷酸十七烷-9-基酯(7b，其中R⁴为C₈烷基)(0.21g，0.4mmol)和4-(二甲基氨基)丁酸(0.08g，0.45mmol)于DCM(3mL)中的溶液添加0.16mL的DIPEA。然后添加EDCI(0.09g，0.45mmol)和DMAP(0.008g,0.06mmol)，并且将混合物在室温下在N₂气氛下搅拌过夜。第二天，用DCM稀释反应。将有机层用NaHCO₃(水溶液)洗涤并通过无水Na₂SO₄干燥。在真空下蒸发溶剂，并且使用于DCM中的0％至5％ MeOH作为洗脱剂，通过柱色谱法纯化，得到脂质79(0.112g，44％)。¹H NMR(300MHz,d-氯仿)δ4.86(m,2H),2.34-2.24(m,5H),2.21(s,6H),1.78(p,J＝7.6Hz,2H),1.68–1.56(m,2H),1.54–1.40(m,8H),1.25(s,45H),0.87(t,J＝6.7Hz,9H)。MS发现638.5[M+H]⁺，[C₄₀H₇₉NO₄]的计算值为637.60。

9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十八烷酸十七烷-9-基酯(脂质77)

向9-羟基十八烷酸十七烷-9-基酯(7b，其中R⁴为C₉烷基)(0.3g，0.56mmol)于DCM(25mL)的溶液添加EDCI(0.21g，1.12mmol)和DMAP(0.07g，0.56mmol)，并且在N₂气氛下搅拌15分钟。然后，向反应混合物添加4-(二甲基氨基)丁酸(0.25g，1.5mmol)并搅拌过夜。第二天，将溶剂蒸发并在EtOAc(300mL)中重新溶解。将有机层用H₂O(300mL)、NaHCO₃(水溶液)(200mL)和盐水(200mL)洗涤，并且通过无水Na₂SO₄干燥。在真空下蒸发溶剂，并且使用于己烷中的5％至40％ EtOAc作为洗脱剂，通过柱色谱法纯化，得到脂质77(0.124g，34％)。¹HNMR(300MHz,d-氯仿)δ4.86(m,2H),2.38–2.23(m,6H),2.21(s,6H),1.85–1.71(m,2H),1.67–1.55(m,2H),1.50-1.44(m,8H),1.24(s,46H),0.86(t,J＝6.5Hz,9H)。MS发现652.7[M+H]⁺，[C₄₁H₈₁NO₄]的计算值为651.62。

9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十九烷酸十七烷-9-基酯(脂质78)

向9-羟基十九烷酸十七烷-9-基酯(7b，其中R⁴为C₁₀烷基)(0.16g，0.29mmol)于1mLDCM的溶液添加EDCI(0.052g，0.27mmol)和DMAP(0.04g，0.0.33mmol)，并且在N₂气氛下搅拌15分钟。然后，向反应混合物添加4-(二甲基氨基)丁酸(0.056g，0.33mmol)并搅拌过夜。第二天，用DCM稀释反应。将有机层用NaHCO₃(水溶液)洗涤并通过无水MgSO₄干燥。在真空下蒸发溶剂，并且使用于DCM中的0％至5％ MeOH作为洗脱剂，通过柱色谱法纯化，得到脂质78(0.07g，36％)。¹H NMR(300MHz,d-氯仿)δ4.93–4.81(m,2H),2.34-2.24(m,5H),2.22(s,6H),1.85–1.67(m,4H),1.63-1.57(m,2H),1.48(s,7H),1.24(s,47H),0.87(t,J＝6.6Hz,9H)。MS发现665.63[M+H]⁺，[C₄₂H₈₃NO₄]的计算值为666.5。

9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)二十烷酸十七烷-9-基酯(脂质80)

向化合物9-羟基二十烷酸十七烷-9-基酯(7b，其中R⁴为C₁₁烷基)(0.25g，0.44mmol)于DCM(1mL)中的溶液添加EDCI(0.068g，0.36mmol)和DMAP(0.054g,0.0.44mmol)，并且在N₂气氛下搅拌15分钟。然后向反应混合物添加4-(二甲基氨基)丁酸(0.074g，0.44mmol)并搅拌过夜。第二天，用DCM稀释反应。将有机层用NaHCO₃(水溶液)洗涤并通过无水MgSO₄干燥。在真空下蒸发溶剂，并且使用于DCM中的0％至5％ MeOH作为洗脱剂，通过柱色谱法纯化，得到脂质80(0.134g，45％)。¹H NMR(300MHz,d-氯仿)δ4.87-4.81(m,2H),2.34-2.24(m,5H),2.23(d,J＝7.2Hz,6H),1.87–1.76(m,2H),1.74-1.70(m,2H),1.65-1.57(m,2H),1.48(s,7H),1.24(s,50H),0.87(t,J＝6.6Hz,9H)。MS发现680.6[M+H]⁺，[C₄₃H₈₅NO₄]的计算值为679.65。

实例5：式XX的可电离脂质的合成

式(XX)的脂质是使用以下方案9中描述的类似合成方法设计和合成的。方案9所示的化合物中的所有变量，即R¹、R²、R³、R⁴、R^6a、R^6b、X和n如式(XX)所定义。R^x是如所定义的R⁴，但在脂肪族链中具有少一个的碳原子。

方案9

本公开的单酯脂质(即式(XX)，其中X为-C(＝O))-)使用以下方案10中描述的类似合成方法设计和合成。方案9所示的化合物中的所有变量，即R¹、R²、R³、R⁴、R^6a、R^6b、X和n如式(XX)所定义。R^x是如所定义的R⁴，但在脂肪族链中具有少一个的碳原子。

方案10

方案9和方案10

参考方案9和方案10，在步骤1中，向酸2于二氯甲烷(DCM)中的搅拌溶液中添加4-二甲基氨基吡啶(DMAP)，然后添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI)。将所得混合物在氮气(N₂)气氛下在室温下搅拌15分钟。然后，逐滴添加化合物1，并且将混合物搅拌过夜。第二天，将反应用DCM稀释，并且用水和盐水洗涤。将有机层通过无水硫酸钠(Na₂SO₄)干燥并蒸发到干。使用于DCM中的0％至10％甲醇作为洗脱剂，将粗产物通过硅胶柱色谱法纯化。将含有期望的化合物的馏分汇集并蒸发，得到化合物3(0.78g，54％)。

在步骤2中，向3于四氢呋喃(THF)中的溶液添加氢化铝锂(LiAlH₄)。将反应混合物在50℃下加热过夜。第二天，将反应冷却到0℃，并且逐滴添加水以淬灭。随后，将反应通过硅藻土过滤，得到粗产物4。将产物在不进行进一步纯化的情况下用于下一步骤。

在步骤3中，将化合物5或5'(根据国际专利申请公开第WO2017/49245号中描述的方法合成，所述文献通过全文引用的方式并入本文)溶解在二甲基甲酰胺/甲醇混合物DMF:MeOH(1:1)中，并且添加4。将反应在室温下搅拌过夜。用乙酸乙酯(EtOAc)萃取产物，并且用饱和碳酸氢钠水溶液(NaHCO₃(水溶液))和盐水洗涤有机层，并且通过无水Na₂SO₄干燥。将溶剂在真空下蒸发，并且使用于DCM中的0％至10％甲醇作为洗脱剂，通过柱色谱法纯化，得到式(XX)的可电离脂质(其中X为-C(＝O)O)-为5'，其在步骤3中用作反应剂)。

脂质102的合成

下文参考同样在下文中提供的方案11描述合成脂质102的程序。

方案11

步骤1：N-(2-(二甲基氨基)乙基)壬酰胺(3a)的合成

向壬酸(2a)(1.0g，6.3mmol)于60mL的DCM中的搅拌溶液添加DMAP(0.91g，7.5mmol)，然后添加EDCI(1.44g，7.5mmol)。将所得混合物在N₂气氛下在室温下搅拌15分钟。然后，逐滴添加N¹,N¹-二甲基乙烷-1,2-二胺(1a)(0.66g，7.5mmol)，并且将混合物搅拌过夜。第二天，将反应用DCM稀释，并且用H₂O和盐水洗涤。将有机层通过无水Na₂SO₄干燥并蒸发到干。使用于DCM中的0％至10％甲醇作为洗脱剂，将粗产物通过硅胶柱色谱法纯化。将含有期望的化合物的馏分汇集并蒸发，得到化合物3a(0.78g，54％)。

步骤2：N¹,N¹-二甲基-N2-壬基乙烷-1,2-二胺(4a)的合成

向3a(0.78g，3.4mmol)于THF中溶液添加LiAlH₄。将反应混合物在50℃下加热过夜。第二天，将反应冷却到0℃，并且逐滴添加水以淬灭。随后，将反应通过硅藻土过滤，得到粗产物4a(0.6g，82％)。将产物在不进行进一步纯化的情况下用于下一步骤。

步骤3：脂质102的合成

将化合物5a(根据国际专利申请公开第WO2017/49245号中描述的方法合成，所述文献通过全文引用的方式并入本文)(0.6g，1.3mmol)溶解在20mL DMF:MeOH(1:1)中，并且添加4a(0.35g，1.5mmol)。将反应在室温下搅拌过夜。用EtOAc(200mL)萃取产物，并且用饱和NaHCO₃(水溶液)和盐水洗涤有机层，并且通过无水Na₂SO₄干燥。在真空下蒸发溶剂，并且使用于DCM中的0％至10％甲醇作为洗脱剂，通过柱色谱法纯化，得到脂质102(0.062g，10％)。¹H NMR(300MHz,氯仿-d)δ4.85(quint,J＝6.2Hz,1H),2.57–2.48(m,2H),2.43–2.32(m,6H),2.31–2.25(m,J＝7.5Hz,2H),2.23(s,6H),1.66–1.34(m,8H),1.24(s,47H),0.86(t,J＝6.6Hz,9H)。

实例6：脂质纳米颗粒调配物的制备

脂质乙醇储备物的制备

包括本文所描述的示例性可电离脂质(例如，由式(I)或式(I')涵盖的脂质A；脂质35、脂质37和脂质39；由式(II)涵盖的脂质57、脂质58、脂质61和脂质62)的ceDNA脂质纳米颗粒(LNP)调配物(0.25mg ceDNA-荧光素酶)如下制备。

将十个G2透析过滤器在30％乙醇中浸泡1小时至2小时，然后排空、洗涤并浸泡在去离子H₂O中，直到调配物准备好(>3小时)。前一周准备了单独的脂质乙醇储备物，并且在-20℃下储存。下表示出了单个脂质乙醇储备物的浓度。每种储备物以最终混合物期望的浓度的5x制备。因此，为了制备基础脂质混合物，将等体积的每种储备物混合在一起。

表9.单个脂质乙醇储备物的制备

可电离脂质＝本文所描述的任何可电离脂质(例如，脂质A、脂质35、脂质37、脂质39、脂质57、脂质58、脂质61、脂质62等)；DOPC＝二油酰磷脂酰胆碱；Chol＝胆固醇；DMG-PEG₂₀₀₀＝1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000；DSPE-PEG₂₀₀₀＝1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000]。

LNP-ceDNA-荧光素酶调配物的制备

简言之且一般而言，为了制备含有本文所描述任何可电离脂质的2.5mL LNP脂质混合物，添加0.5mL的五种不同脂质储备物中的每一种并将其混合在一起。LNP脂质混合物中各脂质组分的摩尔百分比如表8所示。

研究A的目的是比较制备脂质ALNP调配物的标准水性过程和基于乙醇的过程对颗粒尺寸和封装效率的影响。研究A的另外的目的是评估如果在基础LNP调配物中添加更多组分，是否会观察到基于乙醇的过程所带来的改进(如果有的话)。为此，逐滴添加0.25mLceDNA-荧光素酶(1.05mg/mL)，同时用手轻轻旋转溶液直至溶液澄清。这形成了使用本文所描述的基于醇的过程制备的脂质/ceDNA基础调配物(具有脂质A)，其为表9所示的LNP 3，具有64.2nm的基于强度的平均流体动力学直径(Zave)。

首先向2.5mL上述储备物的等体积混合物(每种脂质0.5mL)中添加34uL的10mg/mLmPEG-C18于EtOH中的溶液，然后逐滴添加0.25mL的ceDNA-荧光素酶(1.05mg/mL)，同时用手轻轻旋转溶液直到溶液澄清。这形成了脂质/ceDNA调配物(具有脂质A)+2％mPEG-C18，如表9所示，其为LNP 4，平均直径为55.2nm。

首先向2.5mL上述储备物的等体积混合物(每种脂质0.5mL)中添加69uL的10mg/mLmPEG-C18于EtOH中的溶液，然后逐滴添加0.25mL的ceDNA-荧光素酶(1.05mg/mL)，同时用手轻轻旋转溶液直到溶液澄清。这形成了脂质/ceDNA混合物调配物(具有脂质A)+4％mPEG-C18，如表9所示，其为LNP 5，平均直径为62.2nm。

在小型小瓶中称量1.20mg的b-sito，并将其添加到20mL小瓶中。将DOPE于氯仿中的溶液(17uL的25mg/mL溶液)添加到小瓶中，并且在聚焦的N₂气流(移液管)下蒸发氯仿。然后将小瓶在真空干燥器中储存2小时至3小时。将干燥的脂质溶解在1.0mL乙醇中，然后添加0.5mLssOP脂质储备物、0.5mLDMG-PEG₂₀₀₀储备物和0.5mL GalNAc4储备物。然后将0.25mLceDNA-荧光素酶(1.05mg/mL)逐滴添加到溶液中，同时用手轻轻旋转溶液。这形成了脂质/ceDNA调配物(具有脂质A)+DOPE/b-sito，如表9所示，其为LNP 6，平均直径为78.7nm。

将46uL单GalNAc氯仿溶液(2.5mg/mL)添加到20mL小瓶中。将氯仿在聚焦的N₂气流(移液管)下蒸发。然后将小瓶在真空干燥器中储存2小时至3小时。然后将其溶解在0.5mL乙醇中。然后向溶液中添加0.5mL的SSOP、DOPC、Chol和DMG-PEG₂₀₀₀储备物种的每种。然后向溶液中添加0.25mL ceDNA-荧光素酶(1.05mg/mL)。这形成了脂质/ceDNA调配物(具有脂质A)+0.25％单GalNAc，其为表10中的LNP 7。

表10.研究A的LNP-ceDNA-荧光素酶调配物的制备

DOPC＝二油酰磷脂酰胆碱；Chol＝胆固醇；DMG-PEG2000＝1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000；DSPE-PEG₂₀₀₀＝-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000]；mPEG-C18＝(单)十八烷聚乙二醇酯；b-sito＝β谷甾醇；GalNAc＝N-乙酰半乳糖胺；单GalNAc＝单触角GalNAc。

如表9中可以看到的，使用标准水性过程制备的含有脂质A作为可电离脂质和其它脂质组分的对照LNP 2调配物具有93.3nm的基于强度的平均流体动力学直径(Zave)和62.9％的封装效率。在LNP 3中，调配物的脂质和ceDNA组成与LNP 2相同，但使用基于乙醇的方法制备调配物，颗粒的平均直径减小到64.2nm，并且封装效率提高到88.0％。当将另外的组分添加到也使用基于乙醇的方法制备的其它LNP调配物中时(如LNP 4和LNP 5中的mPEG-C18、LNP 6中的DOPE/b-sito和LNP 7中的单GalNAc)，也观察到更小的平均直径测量值，由此为以下假设提供了佐证：在LNP调配物的制备中使用醇对ceDNA具有压实作用，由此导致LNP具有更小的平均直径。此外，在使用基于醇的过程制备的LNP 4、LNP5和LNP7中观察到封装效率提高。对于多分散性指数(PDI)，通常认为PDI值约为0.15或更低是令人满意的。

含有本文所描述的所有其它可电离脂质的LNP-ceDNA-荧光素酶调配物包含实例6至9中所描述的研究B-E中使用的调配物，使用与上述含有脂质A作为可电离脂质调配物的类似程序制备。如单触角GalNAc(单GalNAc)、三触角GalNAc(GalNAc3)或四触角GalNAc(GalNAc4)等GalNAc配体可以如本领域已知的方式合成(参见，WO2017/084987和WO2013/166121)，并且与脂质或PEG化学缀合，如本领域众所周知的(参见Resen等人,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》(2001)“体外和体内肝细胞上去唾液酸糖蛋白受体摄取和处理配体的尺寸上限的测定(Determination of the Upper Size Limit for Uptake andProcessing of Ligands by the Asialoglycoprotein Receptor on Hepatocytes inVitro and in Vivo)”276:375577-37584)。

实例7：预压实新过程的表征

纳米组装

以表8中所描述的浓度制备脂质于乙醇中的储备物溶液。可电离脂质乙醇储备物中的可电离脂质为脂质A。

将3.15mL的每种脂质乙醇储备物合并作为基础脂质混合物(总计15.75mL)。每种储备物是最终脂质混合物中脂质的期望浓度的5x。

向3mL脂质混合物中添加0.3mL的1mg/mL ceDNA荧光素酶(1.05mg/mL)。缓慢地用手轻轻旋转。最终混合物是透明的。

然后将此混合物与pH＝4的苹果酸缓冲液(无NaCl)在NanoAssemblr上以各种流速比(FRR)混合，如下所示：

FRR＝3:2，总体积1mL，放入8mL储器中，苹果酸缓冲液

FRR＝3:1，总体积1.6mL，放入7.4mL储器中，苹果酸缓冲液

FRR＝5:1，总体积2.4mL，放入6.6mL储器中，苹果酸缓冲液

FRR＝10:1，总体积4.4mL，放入4.6mL储器中，苹果酸缓冲液

具体地，然后使用NanoAssemblr将每种脂质/ceDNA混合物与20mM pH＝4的苹果酸(无NaCl)混合。使用3:1的苹果酸缓冲液与脂质/ceDNA的流速比。脂质/ceDNA混合物使用3mL注射器，苹果酸缓冲液使用10mL注射器。将NanoAssemblr出口收集在15mL的空falcon管中，然后在运行后立即添加到含有10mL苹果酸的50mL falcon管中。每种溶液的最终乙醇含量为约12.5％，最终体积为约20mL。本文所描述的收集方法与先前的试验有所不同，所述试验将乙醇稀释到4％，并且出口直接分配到稀释剂中，这不便于大规模使用。在纳米组装之前，使用这种修改的收集程序对基础脂质混合物进行了40ug的试验，并且发现在透析前DLS测量中也会产生<70nm的颗粒。

然后将每个样品分入两个10mLG2透析过滤器，并且透析过夜到1xDPBS(5L)中。第二天，透析介质更换另外两次。

每种溶液的最终乙醇含量为约4％。透析过夜，然后进行标准过程/表征。分析如下表11所示。从此表可以看出，如通过DLS确定的，在不同的流速比(FRR)下，颗粒直径均小于70nm，并且封装效率高于85％。

表11.预压实的LNP调配物的动态光散射(DLS)分析

脂质颗粒调配物的分析

通过动态光散射(DLS)确定颗粒尺寸。

使用所述方法产生的LNP封装了>80％的ceDNA，其长度为5.4kbp(千碱基对)，并且平均直径为66nm。使用新方法(n＝4)和旧方法(n＝28)产生的LNP直径的统计比较导致了高度的置信度(P＝1.7E-15)，即此新方法成功地减小了LNP直径，同时维持了与标准过程相似或更好的ceDNA封装效率(图2)。图1A是示出如通过动态光散射确定的ceDNA的凝聚的图。动态光散射相关函数显示，随着乙醇含量的增加的ceDNA的凝聚。图1B是示出再水合时压实是可逆的图。没有观察到流速比对LNP直径或ceDNA的封装效率的显著影响。不希望受到理论的束缚，新过程的改进可能是由于在形成LNP之前在90％至92％乙醇溶剂中压实ceDNA。当LNP形成随后通过与酸性水性缓冲溶液混合而开始时，与‘标准’过程相反，脂质能够在小得多的ceDNA核周围成核，从而产生显著较小的颗粒。

通过

(英杰公司(Invitrogen Corporation)；加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,Calif.))或

(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific))试剂盒测定ceDNA在脂质颗粒中的封装。

或

是一种超灵敏的荧光核酸染料，用于定量溶液中的寡核苷酸和单链DNA或RNA。简而言之，通过进行膜不可渗透的荧光染料排除测定法来确定封装。将染料添加到脂质颗粒调配物中。测量荧光强度并与将其添加少量非离子清洁剂后观察到的荧光进行比较。清洁剂介导的对脂质双层的破坏释放了封装的ceDNA，使其与不可渗透膜的染料相互作用。将ceDNA的封装计算为E＝(I₀-I)/I₀，其中I₀是指添加清洁剂的荧光强度，并且I₀是指不添加清洁剂的荧光强度。

确定ceDNA从LNP中的释放。通过混合氯仿中的DOPS:DOPC:DOPE(摩尔比为1:1:2)制备内体模拟阴离子脂质体，然后在真空下蒸发溶剂。将干燥的脂质膜重新悬浮在DPBS中并进行短暂的超声处理，然后通过0.45μm注射器过滤器过滤以形成阴离子脂质体。将血清以1:1(体积/体积)添加到LNP溶液中，并且在37℃下温育20分钟。然后将混合物与阴离子脂质体一起以期望的阴离子/阳离子脂质摩尔比在DPBS中在pH 7.4或6.0在37℃下温育另外15分钟。通过以下方式计算pH 7.4或pH 6.0下的游离ceDNA：通过在将PicoGreen(赛默飞世尔科技公司)添加到LNP浆液时测量荧光(C_游离))并将此值与通过1％ Triton X-100裂解LNP时获得的总ceDNA含量(C_总)进行比较来确定未封装的ceDNA含量，其中游离％＝C_游离/C_总×100。与阴离子脂质体一起温育后释放的ceDNA百分比基于以下等式计算：

释放的ceDNA百分比＝游离ceDNA百分比_{与阴离子脂质体混合}-游离ceDNA百分比_{与DPBS混合}

调配的阳离子脂质的pKa可以与LNP递送核酸的有效性相关(参见Jayaraman等人,《化学应用国际版》(2012),51(34),8529-8533；Semple等人,《自然生物技术》28,172-176(2010)，两者均通过引用整体并入)。pKa的优选范围为约5至约7。使用基于2-(对甲苯胺)-6-萘磺酸(TNS)的荧光的测定法在脂质纳米颗粒中测定每种阳离子脂质的pKa。可以使用如本文和别处所述的在线过程制备在DPBS中包括浓度为0.4mM总脂质的阳离子脂质/DOPC/胆固醇/PEG-脂质(51/7.5/38.5/3摩尔％)的脂质纳米颗粒。TNS在蒸馏水中制备为100μM储备物溶液。囊泡在2mL含有10mM HEPES、10mM MES、10mM乙酸铵、130mM NaCl的缓冲溶液中稀释到24μM脂质，其中pH范围为2.5至11。将TNS溶液的等分试样添加到最终浓度为1μM然后涡旋混合后，在SLM Aminco系列2发光分光光度计中使用321nm和445nm的激发和发射波长在室温下测量荧光强度。可以将S型最佳拟合分析应用于荧光数据，并测量pKa作为产生半最大荧光强度的pH。

将如下测定脂质纳米颗粒与ApoE的结合。将LNP(10μg/mL ceDNA)与等体积的重组ApoE3(500μg/mL)一起在DPBS中在37℃下温育20分钟。温育后，使用DPBS将LNP样品稀释10倍，并且将在AKTApure 150(通用电气医疗集团(GE Healthcare))上通过肝素琼脂糖色谱进行分析。

实例8：研究B——脂质ALNP调配物中的不同GalNAc含量

研究B的目的是评估脂质A LNP调配物(使用基于乙醇的过程制备)中不同的四触角GalNAc(GalNAc4)量对颗粒尺寸和封装效率的影响。表12示出了所研究的LNP调配物的组成和摩尔比以及其平均直径(Zave)、多分散性指数(PDI)和封装效率(EE)。

表12.研究B中的LNP调配物

DOPC＝二油酰磷脂酰胆碱；Chol＝胆固醇；DMG-PEG₂₀₀₀＝1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000；DSPE-PEG₂₀₀₀＝-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000]；GalNAc＝N-乙酰半乳糖胺；GalNAc4＝四触角GalNAc。

注：LNP 9、LNP 10、LNP 11和LNP 12各自具有约9.3的N/P比率。

表12中的结果表明，当使用基于乙醇的过程，而不是水性过程(即LNP 8)来制备具有0.48％ DSPE-PEG₂₀₀₀-GalNAc4的LNP 9而时，平均直径从95.8nm减小到67.9nm，而封装效率从73.6％增加到87.1％。在分别含有0.24％、0.10％和0.05％ DSPE-PEG₂₀₀₀-GalNAc4的LNP 10、LNP 11和LNP 12中一致观察到平均直径尺寸的减小和封装效率的提高。

实例9：研究C——使用基于乙醇的过程制备的式(I)或式(I')LNP调配物

研究C的目的是比较使用实例6中所描述的标准水性过程或基于乙醇的过程(EtOH92％)制备的代表性式(I)或式(I')LNP调配物的物理特性。表13示出了所研究的LNP调配物的组成和摩尔比以及其平均直径(Zave)、多分散性指数(PDI)和封装效率(EE)。

表13.研究C中的LNP调配物

表13中的结果表明，当使用基于乙醇的过程制备具有脂质35(即LNP 15)、脂质37(即LNP 17)或脂质39(即LNP 19)的LNP调配物时，与使用水性过程制备的其对应调配物(即分别为LNP 14、LNP 16和LNP 18)相比，在所有调配物中一致地观察到直径减小。值得注意的是，LNP 15、LNP 17和LNP 19的平均直径尺寸均小于75nm。另外，对于脂质35和脂质37，在使用基于乙醇的过程制备的LNP调配物中，封装效率显著提高。

实例10：研究D——使用基于乙醇的过程制备的式(II)LNP调配物

研究D的目的是比较使用实例6中所描述的标准水性过程或基于乙醇的过程(EtOH92％)制备的代表性式(II)LNP调配物的物理特性。表14和表15示出了所研究的LNP调配物的组成和摩尔比以及其平均直径(Zave)、多分散性指数(PDI)和封装效率(EE)。

表14.研究D中的LNP调配物(第I部分)

DOPC＝二油酰磷脂酰胆碱；Chol＝胆固醇；DMG-PEG₂₀₀₀＝1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000；DSPE-PEG₂₀₀₀＝-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000]；GalNAc＝N-乙酰半乳糖胺；GalNAc4＝四触角GalNAc

表15.研究D中的LNP调配物(第II部分)

表14和表15中的结果表明，当使用基于乙醇的过程制备具有脂质57(即LNP 22)、脂质58(即LNP 24)、脂质61(即LNP 27)或脂质62(即LNP 29)的LNP调配物时，与使用水性过程制备的其对应调配物(即分别为LNP 21、LNP 23、LNP 26和LNP 28)相比，在所有调配物中一致地观察到直径减小和封装效率提高。值得注意的是、LNP 22和LNP 24的平均直径尺寸小于75nm。

实例11：研究E——使用基于LMW醇的过程制备的式(XV)LNP调配物

研究E的目的是比较使用类似实例6中所描述的标准水性过程或基于LMW醇的过程(EtOH:MeOH；95％的总浓度中比率为1:1)制备的代表性式(XV)LNP调配物的物理特性。简而言之，在标准水性过程中，将EtOH:MeOH溶液中的脂质与NanoAssemblr中含有ceDNA的水性缓冲液混合以形成LNP(在水性缓冲液中，一个通道引入脂质，并且另一个通道引入ceDNA)。在基于LMW醇的过程中，将ceDNA和脂质在最终浓度为95％LMW醇(EtOH:MeOH(1:1))的溶液中预混合，与实例6中所述的混合物形成类似，并且通过一个通道将所得的含有ceDNA和脂质的95％ LMW醇混合物引入NanoAssemblr，并且通过另一个通道向NanoAssemblr引入水性缓冲液(20mM pH＝4苹果酸(无NaCl))。表16示出了所研究的LNP调配物的组成和摩尔比以及其平均直径(Zave)、多分散性指数(PDI)和封装效率(EE)。

表16.研究E中的LNP调配物

DSPC＝二硬脂酰磷脂酰胆碱；Chol＝胆固醇；DMG-PEG₂₀₀₀＝1,2-二肉豆蔻酰基-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000。

表16中的结果表明，当使用基于LWM醇的过程((EtOH:MeOH；1:1)％)制备具有脂质77的LNP调配物(即LNP 32和LNP 34)时，与使用水性过程制备的对应调配物(即LNP31和LNP33)相比，在LNP 32和LNP 34中观察到直径尺寸减小和封装效率提高。一致地，具有脂质77和2.3％的DMG-PEG₂₀₀₀并且使用基于乙醇的过程制备的LNP调配物具有小于75nm的平均直径尺寸。

实例12：用于调配物功能评估的体外吞噬作用测定

将使用包括MC3、MC3-5％ DSG-PEG2000(1,2-二硬脂酰-rac-甘油-3-甲基聚氧乙烯)(缩写为“5DSG”)的ceDNA脂质纳米颗粒(LNP)调配物进行体外吞噬测定，其中ss-OP4作为阳离子脂质组分，并且任选地为肝脏特异性配体GalNac。

将对用0.1％ DiD(DiIC18(5)；1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚二羰花青、4-氯苯磺酸盐)亲脂性羰花青染料处理的ceDNA LNP进行吞噬测定。在存在或不存在10％人血清(+血清)的情况下，LNP中将使用不同浓度的ceDNA，然后将其引入从THP-1细胞分化的巨噬细胞。

内化ceDNA的吞噬细胞将出现红色荧光。预期包括ceDNA的ss-OP4 LNP将与最低数量的荧光吞噬细胞高度相关。因此，不受理论束缚，认为与MC3-5DSG和MC3 LNP相比，ss-OP4LNP将能够更好地避免免疫细胞的吞噬作用。吞噬作用将通过红色物体计数/汇合％来定量。

与平均直径大于75nm的ceDNA-LNP相比，预期包括60nm至75nm的平均直径的ceDNA-LNP将表现出更大的肝细胞靶向。

实例13：LNP调配物的临床前体内研究

在每个研究A-E中也进行了临床前研究，以评估小鼠体内ceDNA-荧光素酶的表达以及LNP调配物的耐受性。这些临床前研究涉及的研究设计和程序如下所述。

材料和方法

表17：血液收集

^a将全血收集到带有凝块活化剂的血清分离管中

物种(数量、性别、年龄)：CD-1小鼠(N＝65，并且5只备用，雄性，到达时约4周龄)。

笼侧观察：每天进行笼侧观察。

临床观察：在第0天测试材料给药后约1小时、约5小时至约6小时和约24小时进行临床观察。每个例外都进行了额外的观察。如适用，在第0天、第1天、第2天、第3天、第4天和第7天(安乐死前)记录所有动物的体重。根据需要记录另外的体重。

剂量施用：在第0天通过静脉内施用向尾侧静脉给药5mL/kg的测试制品(LNP:ceDNA-Luc)。

存活期成像：在第4天，通过腹膜内(IP)注射以2.5mL/kg向所有动物给药150mg/kg(60mg/mL)的荧光素。每次荧光素使用后≤15分钟；所有动物都根据下文描述的体内成像方案进行IVIS成像会话。

麻醉恢复：在麻醉下、恢复期间并且直到移动时连续监测动物。

临时血液收集：所有动物在第0天临时收集血液；测试后5小时至6小时(不少于5.0小时，不超过6.5小时)。

收集后，动物在皮下接受0.5mL至1.0mL乳酸林格氏液(lactated Ringer's)。

通过尾静脉切口、大隐静脉或眶窦穿刺(在吸入异氟醚下)收集用于血清的全血。将全血收集到带有凝块活化剂管的血清分离器中，并加工成一(1)份血清。

体内成像方案

●荧光素原粉通常储存在-20℃下。

●将调配的荧光素于2℃至8℃下避光储存在1mL等分试样中。

●调配的荧光素在2℃至8℃下避光可稳定至多3周，并且在室温(RT)下可稳定约12小时。

●将荧光素溶解在PBS中，以达到60mg/mL的目标浓度，并且根据需要用5-M NaOH(约0.5μl/mg荧光素)和HCl(约0.5μL/mg荧光素)将其调节到pH＝7.4。

●根据方案制备适当的量，包含至少约50％的过量。

注射和成像

●剃掉动物的毛发(根据需要)。

●根据方案，通过IP以60mg/mL在PBS中注射150mg/kg荧光素。

●在给药后即刻或至多15分钟进行成像。

●将异氟醚蒸发器设置为1％至3％(通常为2.5％)，以便在成像期间麻醉动物。

●用于成像会话的异氟醚麻醉：

○将动物放入异氟醚室，等待异氟醚生效，约2分钟至3分钟。

○确保IVIS机器侧面的麻醉级别位于“开启”位置。

○将动物放入IVIS机器

使用最高灵敏度的设置执行期望的采集方案。

结果

使用基于乙醇的(92％ EtOH)或基于LMW醇的过程(95％ EtOH:MeOH(1:1)，用于ceDNA和脂质，作为在Nanoassemblr中形成LNP之前的预混合物)制备并用于研究A-E中的所有LNP调配物，如实例4和6至9中所述，与其使用标准水性过程制备的对应调配物相比，显示出令人满意的或等效的荧光素酶表达(施用后第4天测量的IVIS)。就耐受性而言，使用基于乙醇的过程制备并用于研究A-E和如实例6和8至11中所描述的所有LNP调配物表现出优异的耐受性，治疗后第1天测得的小鼠体重没有显著变化。

实例14：ceDNA和质粒DNA的透射电子显微镜(TEM)

透射电子显微镜(TEM)用于探索在不同条件下(例如，去离子(DI)水、DI中的91％1:1EtOH:MeOH；100mM NaOH；100％50:50EtOH:MeOH)储存的ceDNA和质粒DNA(pDNA)的形态。不受理论的束缚，本发明人假设用醇/水溶液或纯醇溶剂处理的ceDNA和pDNA导致核酸变性为通过LNP提高封装效率的构象，并且产生具有较小直径尺寸(即小于75nm±3nm)的LNP调配物。简而言之，将每个样品施加到网格上，用缓冲液洗涤，然后用于甲醇中的0.06％乙酸铀酰对样品进行染色。然后将网格直接放入网格盒中，在显微镜下观察之前进行尝试。

图3A和3B中所示的TEM图像显示当核酸样品储存在去离子水中时，ceDNA和pDNA(质粒)都表现出大部分聚集或具有一些带状结构的自缠结的形状。当储存在90.9％1:1乙醇:甲醇于去离子水中的低分子量乙醇/水溶液中时，ceDNA样品形成明显的棒状结构(参见图4A)，并且pDNA形成圆形结构(参见图4B)。还通过TEM可视化了储存在100％低分子量醇(即1:1乙醇:甲醇，无水)中的ceDNA样品，并且观察到ceDNA显示出比储存在上述醇/水溶液中的样品稍厚的棒(参见图5)。此外，在显微镜下还检查了储存在100nM NaOH中的ceDNA和pDNA样品。图6A和6B表明，与在去离子水中储存相比，两种核酸样品在基本条件下基本保持不变。

参考文献

Claims

1.一种包括脂质纳米颗粒(LNP)的药物组合物，其中所述LNP包括脂质和刚性治疗性核酸(rTNA)，其中所述LNP的平均直径介于约20nm与约75nm之间。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述刚性治疗性核酸是末端封闭式DNA(ceDNA)。

3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述刚性治疗性核酸是双链核酸。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质选自可电离脂质、非阳离子脂质、甾醇或其衍生物、PEG化脂质或其任何组合。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述可电离脂质是阳离子脂质。

6.根据权利要求4所述的药物组合物，其中所述阳离子脂质是SS-可切割脂质。

7.根据权利要求5或权利要求6所述的药物组合物，其中所述阳离子脂质由以下表示：式(I)：

或其药学上可接受的盐，其中：

R¹和R¹'各自独立地为任选取代的直链或支链C_1-3亚烷基；

R²和R²'各自独立地为任选取代的直链或支链C_1-6亚烷基；

R³和R³'各自独立地为任选取代的直链或支链C_1-6烷基；

R^a每次出现时独立地为H或C_1-3烷基；

或可替代地，当R^4'是–C(R^a)₂CR^a或–[C(R^a)₂]₂CR^a并且当R^a是C_1-3烷基时，R^3'和R^4'与其居间N原子形成4元至8元杂环基；

R⁵和R^5'各自独立地为C_1-20亚烷基或C_2-20亚烯基；

R⁶和R^6'每次出现时独立地为C_1-20亚烷基、C_3-20亚环烷基或C_2-20亚烯基；并且

m和n各自独立地是选自1、2、3、4和5的整数。

8.根据权利要求5或权利要求6所述的药物组合物，其中所述阳离子脂质由以下表示：式(II)：

或其药学上可接受的盐，其中：

a是范围为1至20的整数；

b是范围为2至10的整数；

R²是(C₂-C₂₀)烷基。

9.根据权利要求5或权利要求6所述的药物组合物，其中所述脂质由以下表示：式(V)：

或其药学上可接受的盐，其中：

R¹和R^1'各自独立地为任选地被一个或多个选自R^a的基团取代的(C₁-C₆)亚烷基；

R²和R^2'各自独立地为(C₁-C₂)亚烷基；

R³和R^3'各自独立地为任选地被一个或多个选自R^b的基团取代的(C₁-C₆)烷基；

或可替代地，R²和R³和/或R^2'和R^3'与其居间N原子一起形成4元至7元杂环基；

R⁴和R⁴'各自为被–C(O)O-中断的(C₂-C₆)亚烷基；

R^a和R^b各自为卤基或氰基。

10.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述阳离子脂质由以下表示：式(XV)：

或其药学上可接受的盐，其中：

R¹和R²各自独立地为氢、C₁-C₆烷基或C₂-C₆烯基；

R³为C₁-C₁₂亚烷基或C₂-C₁₂亚烯基；

R⁴为C₁-C₁₆非支链烷基、C₂-C₁₆非支链烯基或

其中：

R⁵不存在、为C₁-C₈亚烷基或C₂-C₈亚烯基；

R^a每次出现时独立地为氢或C₁-C₆烷基；并且

n是选自1、2、3、4、5和6的整数。

11.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述阳离子脂质由以下表示：式(XX)：

或其药学上可接受的盐，其中：

R¹和R²各自独立地为氢或C₁-C₃烷基；

R³为C₃-C₁₀亚烷基或C₃-C₁₀亚烯基；

R⁴为C₁-C₁₆非支链烷基、C₂-C₁₆非支链烯基或

其中：

R⁵不存在、为C₁-C₆亚烷基或C₂-C₆亚烯基；

R^6a和R^6b各自独立地为C₇-C₁₄烷基或C₇-C₁₄烯基；

X为-OC(＝O)-、-SC(＝O)-、-OC(＝S)-、-C(＝O)O-、-C(＝O)S-、-S-S-、-C(R^a)＝N-、-N＝C(R^a)-、

-C(R^a)＝NO-、-O-N＝C(R^a)-、-C(＝O)NR^a-、-NR^aC(＝O)-、-NR^aC(＝O)NR^a-、-OC(＝O)O-、

-OSi(R^a)₂O-、-C(＝O)(CR^a ₂)C(＝O)O-或OC(＝O)(CR^a ₂)C(＝O)-；其中：

R^a每次出现时独立地为氢或C₁-C₆烷基；并且

n是选自1、2、3、4、5和6的整数。

12.根据权利要求5或权利要求6所述的药物组合物，其中所述阳离子脂质选自表2、表5、表6、表7或表8中的任何脂质。

13.根据权利要求5或权利要求6所述的药物组合物，其中所述阳离子脂质是具有以下结构的脂质：

或其药学上可接受的盐。

14.根据权利要求5或权利要求6所述的药物组合物，其中所述阳离子脂质是具有以下结构的MC3(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)：

15.根据权利要求1至14中任一项所述的药物组合物，其中所述LNP进一步包括甾醇。

16.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述甾醇是胆固醇。

17.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述甾醇是b-谷甾醇。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的药物组合物，其中所述LNP进一步包括PEG化脂质。

19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述PEG化脂质选自l-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)(PEG-DSPE)或两者。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的药物组合物，其中所述LNP进一步包括非阳离子脂质。

21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述非阳离子脂质选自由以下组成的组：二硬脂酰-sn-甘油-磷酸乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸二油酰磷脂酰乙醇胺酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、单甲基-磷脂酰乙醇胺(如16-O-单甲基PE)、二甲基-磷脂酰乙醇胺(如16-O-二甲基PE)、18-1-反式PE、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、鸡蛋磷脂酰胆碱(EPC)、二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、鞘磷脂(SM)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二芥酰磷脂酰胆碱(DEPC)、棕榈酰磷脂酰甘油(POPG)、二月桂酰-磷脂酰乙醇胺(DEPE)、1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DLPE)；1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPHyPE)；卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、二十六烷基磷酸酯、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰基磷脂酰胆碱或其混合物。

22.根据权利要求21所述的药物组合物，其中所述非阳离子脂质选自由以下组成的组：二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。

23.根据权利要求1至22中任一项所述的药物组合物，其中所述LNP进一步包括组织特异性靶向配体。

24.根据权利要求23所述的药物组合物，其中所述组织特异性靶向配体选自单触角GalNAc、三触角GalNAc和四触角GalNAc。

25.根据权利要求23或权利要求24所述的药物组合物，其中所述组织特异性靶向配体与所述PEG化脂质缀合。

26.根据权利要求25所述的药物组合物，其中所述PEG化脂质是1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)(PEG-DSPE)。

27.根据权利要求25或权利要求26所述的药物组合物，其中与所述组织特异性靶向配体缀合的所述PEG化脂质以约0.5％的摩尔百分比存在。

28.根据权利要求18至27中任一项所述的药物组合物，其中所述PEG化脂质以约1.5％至约3％的摩尔百分比存在。

29.根据权利要求15至28中任一项所述的药物组合物，其中所述甾醇以约20％至约40％的摩尔百分比存在，并且其中所述阳离子脂质以约80％至约60％的摩尔百分比存在。

30.根据权利要求29所述的药物组合物，其中所述甾醇以约40％的摩尔百分比存在，并且其中所述阳离子脂质以约50％的摩尔百分比存在。

31.根据权利要求1至30中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物进一步包括胆固醇、PEG化脂质和非阳离子脂质。

32.根据权利要求25所述的药物组合物，其中所述PEG化脂质以约1.5％至约3％的摩尔百分比存在。

33.根据权利要求31或权利要求32所述的药物组合物，其中所述胆固醇以约30％至约50％的摩尔百分比存在。

34.根据权利要求31至33中任一项所述的药物组合物，其中所述脂质以约42.5％至约62.5％的摩尔百分比存在。

35.根据权利要求31至34中任一项所述的药物组合物，其中所述非阳离子脂质以约2.5％至约12.5％的摩尔百分比存在。

36.根据权利要求31至35中任一项所述的药物组合物，其中所述胆固醇以约40％的摩尔百分比存在，所述脂质以约52.5％的摩尔百分比存在，所述非阳离子脂质以约7.5％的摩尔百分比存在，并且其中所述PEG以约3％存在。

37.根据权利要求31至36中任一项所述的药物组合物，其中所述LNP进一步包括组织特异性靶向配体。

38.根据37所述的药物组合物，其中所述组织特异性靶向配体选自单触角GalNAc、三触角GalNAc和四触角GalNAc。

39.根据权利要求37或权利要求38所述的药物组合物，其中所述组织特异性靶向配体与所述PEG化脂质缀合。

40.根据权利要求39所述的药物组合物，其中与所述组织特异性靶向配体缀合的所述PEG化脂质以约0.5％的摩尔百分比存在。

41.根据权利要求1至40中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物进一步包括地塞米松棕榈酸酯(dexamethasone palmitate)。

42.根据权利要求1至41中任一项所述的药物组合物，其中所述LNP的平均直径小于约75nm。

43.根据权利要求1至42中任一项所述的药物组合物，其中所述LNP的平均直径小于约70nm。

44.根据权利要求1至43中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物具有约15:1的总脂质与刚性治疗性核酸(rTNA)比率。

45.根据权利要求1至43中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物具有约30:1的总脂质与刚性治疗性核酸(rTNA)比率。

46.根据权利要求1至43中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物具有约40:1的总脂质与刚性治疗性核酸(rTNA)比率。

47.根据权利要求1至46中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物具有约50:1的总脂质与刚性治疗性核酸(rTNA)比率。

48.根据权利要求1至47中任一项所述的药物组合物，其中所述rTNA选自由以下组成的组：小基因、质粒、小环、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、核酶、ceDNA、迷你串(ministring)、doggybone^TM、原端粒末端封闭式DNA或哑铃线性DNA、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、非对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA、DNA病毒载体、病毒RNA载体、非病毒载体以及其任何组合。

49.根据权利要求1至48中任一项所述的药物组合物，其中所述刚性治疗性核酸(rTNA)包括表达盒，所述表达盒包括启动子序列和转基因。

50.根据权利要求1至49中任一项所述的药物组合物，其中所述刚性治疗性核酸(rTNA)包括表达盒，所述表达盒包括聚腺苷酸化序列。

51.根据权利要求49或权利要求50所述的药物组合物，其中所述刚性治疗性核酸(rTNA)包括至少一个侧接所述表达盒的5'端或3'端的反向末端重复(ITR)。

52.根据权利要求51所述的药物组合物，其中所述表达盒侧接两个ITR，其中所述两个ITR包括一个5'ITR和一个3'ITR。

53.根据权利要求52所述的药物组合物，其中所述表达盒在3'端处与ITR连接(3'ITR)。

54.根据权利要求52所述的药物组合物，其中所述表达盒在5'端处与ITR连接(5'ITR)。

55.根据权利要求52所述的药物组合物，其中所述5'ITR或所述3'ITR中的至少一个是野生型AAV ITR。

56.根据权利要求52所述的药物组合物，其中所述5'ITR和所述3'ITR中的至少一个是经修饰的ITR。

57.根据权利要求52所述的药物组合物，其中所述刚性治疗性核酸(rTNA)进一步包括所述5'ITR与所述表达盒之间的间隔子序列。

58.根据权利要求52所述的药物组合物，其中所述刚性治疗性核酸(rTNA)进一步包括所述3'ITR与所述表达盒之间的间隔子序列。

59.根据权利要求57或权利要求58所述的药物组合物，其中所述间隔子序列为至少为5个碱基对长。

60.根据权利要求59所述的药物组合物，其中所述间隔子序列为约5个碱基对长至约100个碱基对长。

61.根据权利要求59所述的药物组合物，其中所述间隔子序列为约5个碱基对长至约500个碱基对长。

62.根据权利要求1至61中任一项所述的药物组合物，其中所述刚性治疗性核酸(rTNA)包括切口或间隙。

63.根据权利要求52所述的药物组合物，其中所述ITR选自：源自AAV血清型的ITR、源自鹅病毒的ITR的ITR、源自B19病毒ITR的ITR或源自细小病毒的野生型ITR。

64.根据权利要求63所述的药物组合物，其中所述AAV血清型选自由以下组成的组：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。

65.根据权利要求51所述的药物组合物，其中所述rTNA包括第一和第二ITR，其中所述第一ITR是突变体ITR，并且所述第二ITR与所述第一ITR不同。

66.根据权利要求51所述的药物组合物，其中所述rTNA在所述表达盒的5'和3'端都包括两个突变体ITR，任选地其中所述两个突变体ITR是彼此的对称突变体。

67.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述rTNA是ceDNA。

68.根据权利要求67所述的药物组合物，其中所述ceDNA选自由以下组成的组：CELiD、基于DNA的小环、MIDGE、辅助DNA、哑铃形线性双螺旋末端封闭式DNA(ceDNA)，其在表达盒的5'和3'端中包括两个ITR的发夹结构，或doggybone^TMDNA。

69.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述刚性治疗性核酸是质粒。

70.一种包括脂质纳米颗粒(LNP)的药物组合物，其中所述LNP包括脂质和变性治疗性核酸(TNA)，其中所述LNP的平均直径介于约20nm与约75nm之间。

71.根据权利要求70所述的药物组合物，其中所述变性TNA具有P型结构。

72.根据权利要求70或权利要求71所述的药物组合物，其中通过使所述变性的TNA在低分子量醇/水溶液或包括一种或多种低分子量醇的非水性溶剂系统中接触来制备所述变性TNA。

73.根据权利要求72所述的药物组合物，其中所述低分子量醇/水溶液或所述非水性溶剂系统包括一种或多种选自由以下组成的组的醇：乙醇、甲醇和异丙醇。

74.根据权利要求70至73中任一项所述的药物组合物，其中所述LNP的平均直径小于约75nm。

75.根据权利要求70至74中任一项所述的药物组合物，其中所述LNP的平均直径小于约70nm。

76.根据权利要求70至75中任一项所述的药物组合物，其中所述变性核酸治疗剂是双链核酸。

77.根据权利要求70至76中任一项所述的药物组合物，其中所述变性核酸治疗剂是末端封闭式DNA(ceDNA)。

78.一种包括脂质纳米颗粒(LNP)的药物组合物，其中所述LNP包括脂质和变性治疗性核酸(TNA)，其中所述LNP通过包括以下的方法制备：

将水性TNA添加到一种或多种包括阳离子或可电离脂质的低分子量醇溶液中以形成TNA/脂质溶液，其中所述溶液中的所述低分子量醇的最终浓度介于约80％至约98％之间；

将所述TNA/脂质溶液与酸性水性缓冲液混合；以及

与中性pH水性缓冲液进行缓冲液交换，

由此产生所述LNP调配物。

79.根据权利要求78所述的药物组合物，其中所述溶液中的所述低分子量醇的最终浓度介于约87％至约97％之间。

80.根据权利要求79所述的药物组合物，其中所述溶液中的所述低分子量醇的最终浓度介于约90％至约95％之间。

81.根据权利要求79所述的药物组合物，其中所述溶液中的所述低分子量醇的最终浓度介于约92％至约95％之间。

82.根据权利要求79所述的药物组合物，其中所述LNP的平均直径介于约20nm与约75nm之间。

83.根据权利要求78至82中任一项所述的药物组合物，其中所述LNP的平均直径小于约75nm。

84.根据权利要求78至83中任一项所述的药物组合物，其中所述LNP的平均直径小于约70nm。

85.根据权利要求78至84中任一项所述的药物组合物，其中所述刚性或变性核酸治疗剂是双链核酸。

86.根据权利要求78至85中任一项所述的药物组合物，其中所述刚性或变性核酸治疗剂是末端封闭式DNA(ceDNA)。

87.根据权利要求1至86中任一项所述的药物组合物，其进一步包括药学上可接受的赋形剂。

88.一种产生脂质纳米颗粒(LNP)调配物的方法，其中所述LNP包括可电离脂质和末端封闭式DNA(ceDNA)，所述方法包括：

将水性ceDNA添加到一种或多种包括阳离子或可电离脂质的低分子量醇溶液中，其中所述溶液中醇的最终浓度介于约80％至约98％之间以形成ceDNA/脂质溶液；

将所述ceDNA/脂质溶液与酸性水性缓冲液混合；以及

与中性pH水性缓冲液进行缓冲液交换，

由此产生LNP调配物。

89.一种产生脂质纳米颗粒(LNP)调配物的方法，所述调配物包括可电离脂质和末端封闭式DNA(ceDNA)，所述方法包括：

将ceDNA添加到一种或多种低分子量醇溶液中，其中所得溶液的醇含量大于80％，

将>80％醇含量的所述ceDNA添加到于低分子量醇中的阳离子或可电离脂质中以形成ceDNA/脂质溶液，其中所述ceDNA-脂质溶液中的所述低分子量醇的最终浓度介于约80％至约95％之间；

将所述ceDNA/脂质溶液与酸性水性缓冲液混合；以及

与中性pH水性缓冲液进行缓冲液交换，

由此产生所述LNP调配物。

90.根据权利要求89所述的药物组合物，其中所述溶液中的所述低分子量醇的最终浓度介于约87％至约97％之间。

91.根据权利要求90所述的药物组合物，其中所述溶液中的所述低分子量醇的最终浓度介于约90％至约95％之间。

92.根据权利要求90所述的药物组合物，其中所述溶液中的所述低分子量醇的最终浓度介于约92％至约95％之间。

93.根据权利要求89所述的方法，其进一步包括用酸性水性缓冲液稀释混合的ceDNA/脂质溶液的步骤。

94.根据权利要求89至93中任一项所述的方法，其中所述一种或多种低分子量醇选自由以下组成的组：甲醇、乙醇、丙醇和/或异丙醇。

95.根据权利要求94所述的方法，其中所述一种或多种低分子量醇是乙醇。

96.根据权利要求94所述的方法，其中所述一种或多种低分子量醇是丙醇。

97.根据权利要求94所述的方法，其中所述一种或多种低分子量醇是甲醇。

98.根据权利要求94所述的方法，其中所述一种或多种低分子量醇是乙醇和甲醇的混合物。

99.根据权利要求88至98中任一项所述的方法，其中所述酸性水性缓冲液选自苹果酸/苹果酸钠或乙酸/乙酸钠。

100.根据权利要求88至99中任一项所述的方法，其中所述酸性水性缓冲液的浓度介于约10至40毫摩尔(mM)之间。

101.根据权利要求88至100中任一项所述的方法，其中所述酸性水性缓冲液的pH介于约3至5之间。

102.根据权利要求88至101中任一项所述的方法，其中所述中性pH水性缓冲液是pH7.4的杜尔贝氏磷酸盐缓冲盐水(Dulbecco's phosphate buffered saline)。

103.根据权利要求88所述的方法，其中使用微流体混合将所述ceDNA/脂质溶液与所述酸性水性缓冲液混合。

104.根据权利要求88所述的方法，其中所述稀释步骤后的最终醇含量介于约4％至约15％之间。

105.根据权利要求88所述的方法，其中所述酸性水性缓冲液与所述ceDNA/脂质溶液之间的流速比为2:1、3:2、3:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1或20:1。

106.根据权利要求88至105中任一项所述的方法，其中所述LNP的平均直径介于约20nm与约75nm之间。

107.根据权利要求88至106中任一项所述的方法，其中所述阳离子脂质是具有以下结构的MC3(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA或MC3)：

108.根据权利要求88至107中任一项所述的方法，其中所述可电离脂质是包括二硫键和叔胺的SS-可切割脂质。

109.根据权利要求108所述的方法，其中所述SS-可切割脂质是具有以下结构的脂质：

或其药学上可接受的盐。

110.一种通过根据权利要求88至109中任一项所述的方法产生的LNP调配物。

111.一种治疗受试者的遗传病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至110中任一项所述的药物组合物。

112.根据权利要求111所述的方法，其中所述受试者是人。

113.根据权利要求111或权利要求112所述的方法，其中所述遗传病症选自由以下组成的组：镰状细胞性贫血、黑色素瘤、血友病A(凝血因子VIII(FVIII)缺乏症)和血友病B(凝血因子IX(FIX)缺乏症)、囊性纤维化(CFTR)、家族性高胆固醇血症(LDL受体缺陷)、肝母细胞瘤、威尔逊氏病(Wilson's disease)、苯丙酮尿症(PKU)、先天性肝卟啉症、遗传性肝代谢障碍、莱施-奈恩综合征(Lesch Nyhan syndrome)、镰状细胞性贫血、地中海贫血、色素性干皮病、范可尼贫血(Fanconi's anemia)、色素性视网膜炎、共济失调毛细血管扩张症、布鲁姆综合征(Bloom's syndrome)、视网膜母细胞瘤、粘多糖贮积病(例如，赫勒氏综合征(Hurlersyndrome)(MPS I型)、施艾氏综合征(Scheie syndrome)(MPS IS型)、赫勒-施艾氏综合征(Hurler-Scheie syndrome)(MPS IH-IS型)、亨特氏综合征(Hunter syndrome)(MPS II型)、A型、B型、C型和D型Sanfilippo(MPS IIIA、IIIB、IIIC和IIID型)、A型和B型Morquio(MPS IVA和MPS IVB)、马-拉综合征(Maroteaux-Lamy syndrome)(MPS VI型)、斯里综合征(Sly syndrome)(MPS VII型)、透明质酸酶缺乏症(MPS IX型))、A/B型、C1型和C2型尼曼-匹克氏病(Niemann-Pick Disease)、辛德勒病(Schindler disease)、II型GM2-神经节苷脂贮积(桑德霍夫病(Sandhoff Disease))、泰萨氏病(Tay-Sachs disease)、异染性脑白质营养不良、克拉伯病(Krabbe disease)、I型、II/III型和IV型粘脂贮积症、I型和II型唾液酸贮积症、I型和II型糖原贮积病(庞贝氏症(Pompe disease))、I型、II型和III型戈谢病(Gaucher disease)、法布里病(Fabry disease)、胱氨酸病、巴顿病(Batten disease)、天冬氨酰氨基葡萄糖尿症、萨拉病(Salla disease)、Danon病(LAMP-2缺乏症)、溶酶体酸性脂肪酶(LAL)缺乏症、神经元蜡样脂褐质沉积症(CLN1-8、INCL和LINCL)、鞘脂沉积病、半乳糖唾液酸贮积症、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、脊髓小脑共济失调、脊髓性肌萎缩症、弗里德赖希氏共济失调(Friedreich's ataxia)、杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy)(DMD)、贝克尔肌营养不良症(Becker musculardystrophies)(BMD)、营养不良性大疱性表皮松解症(DEB)、外核苷酸焦磷酸酶1缺乏症、婴儿全身性动脉钙化(GACI)、莱伯氏先天性黑蒙症(Leber Congenital Amaurosis)、斯特格氏黄斑营养不良(Stargardt macular dystrophy)(ABCA4)、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症、Usher综合征、α-1抗胰蛋白酶缺乏症和组织蛋白酶A缺乏症。

114.根据权利要求113所述的方法，其中所述遗传病症是莱伯氏先天性黑蒙症(LCA)10。

115.根据权利要求113所述的方法，其中所述遗传病症是斯特格氏黄斑营养不良。

116.根据权利要求113所述的方法，其中所述遗传病症是血友病A(因子VIII缺乏症)。

117.根据权利要求113所述的方法，其中所述遗传病症是血友病B(因子IX缺乏症)。

118.根据权利要求113所述的方法，其中所述遗传病症是威尔逊氏病。

119.根据权利要求113所述的方法，其中所述遗传病症是戈谢病。

120.根据权利要求113所述的方法，其中所述遗传病症是苯丙酮尿症(PKU)。

121.根据权利要求113所述的方法，其中所述遗传病症是透明质酸酶缺乏症。

122.根据权利要求111至121中任一项所述的方法，其进一步包括施用免疫抑制剂。

123.根据权利要求122所述的方法，其中所述免疫抑制剂是地塞米松(dexamethasone)。

124.根据权利要求111至123中任一项所述的方法，其中与用包括MC3作为主要阳离子脂质的LNP观察到的免疫应答水平相比，所述受试者表现出针对所述药物组合物的免疫应答水平降低，其中针对所述药物组合物的所述免疫应答水平比用包括MC3的所述LNP观察到的水平低至少50％。

125.根据权利要求124所述的方法，其中通过检测促炎细胞因子或趋化因子的水平来测量所述免疫应答。

126.根据权利要求125所述的方法，其中所述促炎细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-6、IFNα、IFNγ、IL-18、TNFα、IP-10、MCP-1、MIP1α、MIP1β和RANTES。

127.根据权利要求125所述的方法，其中在施用所述药物组合物后6小时，所述促炎细胞因子中的至少一种在所述受试者的血清中低于可检测水平。

128.根据权利要求111至127中任一项所述的方法，其中包括SS-可切割脂质和所述末端封闭式DNA(ceDNA)的所述LNP不被吞噬；或与在类似条件下施用的包括MC3作为主要阳离子脂质的LNP的吞噬水平相比，表现出至少50％的吞噬水平降低。

129.根据权利要求128所述的方法，其中所述SS-可切割脂质是具有以下结构的脂质：

或其药学上可接受的盐。

130.根据权利要求129所述的方法，其中所述LNP进一步包括胆固醇和PEG化脂质。

131.根据权利要求130所述的方法，其中所述LNP进一步包括非阳离子脂质。

132.根据权利要求131所述的方法，其中所述非阳离子脂质选自由以下组成的组：二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。

133.根据权利要求130至132中任一项所述的方法，其中所述LNP进一步包括N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。

134.根据权利要求133所述的方法，其中所述GalNAc与所述PEG化脂质缀合，并且与所述GalNAc缀合的所述PEG化脂质以0.5％的摩尔百分比存在于所述LNP中。

135.一种增加靶向需要治疗的受试者的肝脏的治疗性核酸的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至110中任一项所述的药物组合物，其中所述LNP包括刚性治疗性核酸(rTNA)、ss-可切割脂质、甾醇和聚乙二醇(PEG)以及N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。

136.根据权利要求135所述的方法，其中所述PEG是l-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG)。

137.根据权利要求135所述的方法，其中所述LNP进一步包括非阳离子脂质。

138.根据权利要求137所述的方法，其中所述非阳离子脂质选自由以下组成的组：二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。

139.根据权利要求135所述的方法，其中所述GalNAc与所述PEG化脂质缀合，并且与所述GalNAc缀合的所述PEG化脂质以0.5％的摩尔百分比存在于所述LNP中。

140.根据权利要求135所述的方法，其中所述受试者患有遗传病症。

141.根据权利要求140所述的方法，其中所述遗传病症是血友病A(因子VIII缺乏症)。

142.根据权利要求140所述的方法，其中所述遗传病症是血友病B(因子IX缺乏症)。

143.根据权利要求140所述的方法，其中所述遗传病症是苯丙酮尿症(PKU)。

144.根据权利要求135所述的方法，其中所述刚性治疗性核酸选自由以下组成的组：小基因、质粒、小环、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、核酶、ceDNA、迷你串、doggybone^TM、原端粒末端封闭式DNA或哑铃线性DNA、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、非对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA、DNA病毒载体、病毒RNA载体、非病毒载体以及其任何组合。

145.根据权利要求135所述的方法，其中所述刚性治疗性核酸是ceDNA。

146.根据权利要求145所述的方法，其中所述ceDNA包括表达盒，所述表达盒包括启动子序列和转基因。

147.根据权利要求146所述的方法，其中所述ceDNA包括至少一个侧接所述表达盒的5'或3'端的反向末端重复(ITR)。

148.根据权利要求135所述的方法，其中所述ceDNA选自由以下组成的组：CELiD、MIDGE、辅助DNA、哑铃形线性双螺旋末端封闭式DNA，其在表达盒的5'和3'端中包括两个ITR的发夹结构，或doggybone^TMDNA，其中所述ceDNA是无衣壳和线性双螺旋DNA。

149.一种减轻需要用刚性治疗性核酸(rTNA)治疗的受试者的补体应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据前述权利要求中任一项所述的药物组合物，其中所述LNP包括所述rTNA、阳离子脂质、甾醇、和PEG化脂质。

150.根据权利要求149所述的方法，其中所述受试者患有遗传病症。

151.根据权利要求150所述的方法，其中所述遗传病症选自由以下组成的组：镰状细胞性贫血、黑色素瘤、血友病A(凝血因子VIII(FVIII)缺乏症)和血友病B(凝血因子IX(FIX)缺乏症)、囊性纤维化(CFTR)、家族性高胆固醇血症(LDL受体缺陷)、肝母细胞瘤、威尔逊氏病、苯丙酮尿症(PKU)、先天性肝卟啉症、遗传性肝代谢障碍、莱施-奈恩综合征、镰状细胞性贫血、地中海贫血、色素性干皮病、范可尼贫血、色素性视网膜炎、共济失调毛细血管扩张症、布鲁姆综合征、视网膜母细胞瘤、粘多糖贮积病(例如，赫勒氏综合征(MPS I型)、施艾氏综合征(MPS IS型)、赫勒-施艾氏综合征(MPS IH-IS型)、亨特氏综合征(MPS II型)、A型、B型、C型和D型Sanfilippo(MPS IIIA、IIIB、IIIC和IIID型)、A型和B型Morquio(MPS IVA和MPSIVB)、马-拉综合征(MPS VI型)、斯里综合征(MPS VII型)、透明质酸酶缺乏症(MPS IX型))、A/B型、C1型和C2型尼曼-匹克氏病、辛德勒病、II型GM2-神经节苷脂贮积(桑德霍夫病)、泰萨氏病、异染性脑白质营养不良、克拉伯病、I型、II/III型和IV型粘脂贮积症、I型和II型唾液酸贮积症、I型和II型糖原贮积病(庞贝氏症)、I型、II型和III型戈谢病、法布里病、胱氨酸病、巴顿病、天冬氨酰氨基葡萄糖尿症、萨拉病、Danon病(LAMP-2缺乏症)、溶酶体酸性脂肪酶(LAL)缺乏症、神经元蜡样脂褐质沉积症(CLN1-8、INCL和LINCL)、鞘脂沉积病、半乳糖唾液酸贮积症、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病、脊髓小脑共济失调、脊髓性肌萎缩症、弗里德赖希氏共济失调、杜氏肌营养不良症(DMD)、贝克尔肌营养不良症(BMD)、营养不良性大疱性表皮松解症(DEB)、外核苷酸焦磷酸酶1缺乏症、婴儿全身性动脉钙化(GACI)、莱伯氏先天性黑蒙症、斯特格氏黄斑营养不良(ABCA4)、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症、Usher综合征、α-1抗胰蛋白酶缺乏症和组织蛋白酶A缺乏症。

152.根据权利要求149至151中任一项所述的方法，其中所述刚性治疗性核酸选自由以下组成的组：小基因、质粒、小环、小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、反义寡核苷酸(ASO)、核酶、ceDNA、迷你串、doggybone^TM、原端粒末端封闭式DNA或哑铃线性DNA、切丁酶-底物dsRNA、小发夹RNA(shRNA)、非对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、mRNA、tRNA、rRNA、DNA病毒载体、病毒RNA载体、非病毒载体以及其任何组合。

153.根据权利要求152所述的方法，其中所述刚性治疗性核酸是ceDNA，其中所述ceDNA选自由以下组成的组：CELiD、MIDGE、辅助DNA、哑铃形线性双螺旋末端封闭式DNA，其在表达盒的5'和3'端中包括两个ITR的发夹结构，或doggybone^TMDNA，其中所述ceDNA是无衣壳和线性双螺旋DNA。

154.根据权利要求149至153中任一项所述的方法，其中所述PEG化脂质是l-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG)。

155.根据权利要求154所述的方法，其中所述PEG以约2％至4％的摩尔百分比存在于所述LNP中。

156.根据权利要求155所述的方法，其中所述PEG以约3％的摩尔百分比存在于所述LNP中。

157.根据权利要求149至156中任一项所述的方法，其中所述LNP进一步包括非阳离子脂质。

158.根据权利要求157所述的方法，其中所述非阳离子脂质选自由以下组成的组：二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)。