JP2023534043A - ポリヌクレオチドを縮小サイズの脂質ナノ粒子に封入する方法及びその新規製剤 - Google Patents

ポリヌクレオチドを縮小サイズの脂質ナノ粒子に封入する方法及びその新規製剤 Download PDF

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Abstract

本明細書で提供されるのは、脂質及びカプシド不含非ウイルスベクター（例えば、ｃｅＤＮＡ）を含む縮小サイズの脂質製剤、並びに当該脂質製剤を製造する方法である。本開示の脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、カプシド不含非ウイルスＤＮＡベクターを目的の標的部位（例えば、細胞、組織、器官など）に送達するように使用され得る脂質製剤を含む。本明細書で提供されるのは、以前に記載されたものよりも直径が大幅に小型なＬＮＰを生成するために使用される新しい製剤プロセス及び方法である。

Description

関連出願
本出願は、２０２０年７月１７日に出願された米国仮出願第６３／０５３，２７４号及び２０２１年５月２８日に出願された米国仮出願第６３／１９４，６２０号に対する優先権を主張し、それらの各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、肝臓の肝細胞に低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）カーゴを送達するための臨床的に検証された戦略である。これらの進歩にもかかわらず、大型の剛性ポリヌクレオチドカーゴ（例えば、二本鎖直鎖ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、閉端二本鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ））のＬＮＰ媒介性送達は、小型及び／又は柔軟なカーゴ（例えば、ｓｉＲＮＡ）と比較して更なる課題が存在する。そのような課題の１つは、大型の剛性カーゴが封入された場合の得られたＬＮＰのサイズと関連する。例えば、長さ＞３０００ｂｐ（塩基対）の閉端直鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）を封入して８０～１２０ｎｍの直径を有するＬＮＰが、日常的に観察されており、平均直径９２ｎｍ（ｎ＝２８）であり、ある流れからのＨ２Ｏ中又は水性緩衝液）中の水性ｃｅＤＮＡとエタノール脂質（酸性緩衝液（ｐＨ３～４）中の別の流れからの１００％ＥｔＯＨ（例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２１３２８号を参照））との高圧マイクロ流体混合という「最先端の」プロセスを使用する。
これらのＬＮＰの比較的大きなサイズは、いくつかのメカニズム：（１）より大きなＬＮＰは、肝類洞を覆う内皮細胞の窓を効率的に迂回することができず、標的細胞（肝細胞）へのアクセスを妨げており、（２）より大きなＬＮＰは、いくつかの異なる受容体（例えば、エシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体）とのクラスリン媒介エンドサイトーシスを介して肝細胞に効率的に取り込まれることができず、（３）特定の閾値サイズを超えるＬＮＰは、細網内皮系の細胞によって優先的に取り込まれる傾向があり、用量制限免疫応答を引き起こす可能性がある、によって肝臓適応症の治療指数を低下させる。したがって、大型の剛性治療用核酸分子を比較的小型のＬＮＰ（直径７５ｎｍ未満）に封入することができる製造プロセスが緊急に必要である。
本明細書で提供されるのは、以前に記載されたものよりも直径が大幅に小型なＬＮＰを生成するために使用される新しい製剤プロセス及び方法である。本明細書に記載の新しい製剤プロセスは、アルコール性（例えば、エノール性）脂質とのマイクロ流体ナノ粒子の集合の前に、８０％～１００％の低分子量アルコール（例えば、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、又はメタノール）中でのＴＮＡの可逆圧縮を含み、これにより、平均直径が７５ｎｍ（±３ｎｍ）以下のＬＮＰとなる。
いくつかの実施形態によれば、本開示によって記載されるＬＮＰは、平均直径が約２０ｎｍ～約７５ｎｍ、約２０ｎｍ～約７０ｎｍ、約２０ｎｍ～約６０ｎｍ、約３０ｎｍ～約７５ｎｍ、約３０ｎｍ～約７０ｎｍ、約３０ｎｍ～約６０ｎｍ、約４０ｎｍ～７５ｎｍ、又は約４０ｎｍ～７０ｎｍの範囲である。小型ＬＮＰは、より効率的な組織拡散、及びより効率的な取り込み及び／又は標的化を提供する。特に肝臓では、肝臓類洞内皮細胞（ＬＳＥＣ）窓（＜１００ｎｍ）を通過し、ＡＳＧＰＲを介したエンドサイトーシス（≦７０ｎｍ）を起こすために、小型ＬＮＰが必要である。このような小型化は、免疫細胞を容易に回避できるため、望ましくない免疫応答を標的化及び回避するのにも有利である。本開示によって記載される製剤プロセス及び方法は、以前に報告されたものよりもかなり多くの治療用核酸（例えば、ｃｅＤＮＡを含む剛性二本鎖ＤＮＡ）を封入することができる。本明細書に記載のＬＮＰは、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約６０％超～約９０％を封入することができる。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載のＬＮＰは、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約６０％超、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約６５％超、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約７０％超、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約７５％超、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約８０％超、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約８５％超、又はｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約９０％超を封入することができる。
本明細書に記載の製剤プロセスは、低分子量（ＬＭＷ）アルコールの８０％～１００％を含む溶媒中でｃｅＤＮＡ圧縮が起こるという発見を利用する。圧縮に使用できるＬＭＷアルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール、又はアセトンのような他の有機溶媒が挙げられる、これらに限定されない。好ましくは、ｃｅＤＮＡのような剛性ＤＮＡの圧縮は、エタノール溶液又はエタノール－メタノール混合物（例えば、ＥｔＯＨ－ＭｅＯＨ １：１混合物）を約８０％～約９８％の最終濃度で使用して調製することができる。いくつかの実施形態によれば、溶液中の低分子量アルコールの最終濃度は、約８０％～約９８％、約８０％～約９５％、約８０％～約９２％、約８０％～約９０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９８％、約８５％～約９５％、約８５％～約９２％、約８５％～約９０％、約９０％～約９８％、約８７％～約９７％、約８７％～約９５％、約８７％～約９２％、約８７％～約９０％、約９０％～約９５％、約９０％～約９２％、約９５％～約９８％、又は約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％又は約９８％である。例えば、得られた溶液が、例えば、９０～９２％エタノール及び８～１０％水又は水性緩衝液であるような比で、９０％ＥｔＯＨ水溶液中のｃｅＤＮＡを、脂質の別のエタノール溶液（例えば、９０％ＥｔＯＨ）に添加又はそれと混合する場合、ｃｅＤＮＡは、動的光散乱によって高度に圧縮又は変性された状態で存在することが観察される。このような溶媒（例えば、９０～９２％のエタノール、８～１０％の水）では、脂質及びｃｅＤＮＡの両方が、どちらの成分も検出可能な沈殿物がなく、可溶化され、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡのより効率的な、小型ＬＮＰへの封入が成功する。
したがって、本明細書に記載の製剤プロセスは、標準プロセスと比較して、ｃｅＤＮＡのような剛性ＴＮＡの封入効率を同等又はより良好に維持しながら、ＬＮＰ直径を低減させる。理論に拘束されることを望まないが、この変化は、ＬＮＰの形成前に、エタノール溶媒などのＬＭＷアルコール溶液中で好ましくは９０～９２％又は最大９５％のｃｅＤＮＡのような剛性ＴＮＡの圧縮に起因する可能性が高い。酸性の水性緩衝液と混合することによってＬＮＰ形成が開始されると、脂質は、標準的な水性プロセスとは対照的に、より小さくコンパクトなＤＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）コアの周りに核形成することができ、その結果、粒子が大幅に小さくなる。本明細書に記載されているプロセスを使用して、ｃｅＤＮＡのような剛性ＴＮＡをより多くの数で効率的に封入することができ、その結果、サイズの制約がある様々な組織を標的とするＬＮＰの有益な属性であるはるかに小さい直径のＴＮＡ－ＬＮＰが得られる。
いくつかの実施形態では、製剤は、約７５ｎｍ（±３ｎｍ）の平均直径を有するＬＮＰに封入されたＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約７２ｎｍ（±３ｎｍ）の平均直径を有するＬＮＰに封入されたＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約７０ｎｍ（±４ｎｍ）の平均直径を有するＬＮＰに封入されたＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約６８ｎｍ（±４ｎｍ）の平均直径を有するＬＮＰに封入されたＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約６５ｎｍ（±４ｎｍ）の平均直径を有するＬＮＰに封入されたＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約６０ｎｍ（±４ｎｍ）の平均直径を有するＬＮＰに封入されたＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約５５ｎｍ（±４ｎｍ）の平均直径を有するＬＮＰに封入されたＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、約５０ｎｍ（±４ｎｍ）の平均直径を有するＬＮＰに封入されたＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）を含む。
第１の態様によれば、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む薬学的組成物を提供し、ＬＮＰは、脂質及び剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）を含み、ＬＮＰの平均直径は、約２０ｎｍ～約７５ｎｍである。
いくつかの実施形態によれば、剛性核酸治療薬は、二本鎖核酸である。いくつかの実施形態によれば、剛性核酸治療薬は、閉端ＤＮＡである。
いくつかの実施形態によれば、脂質は、イオン化脂質、非カチオン性脂質、ステロール若しくはその誘導体、コンジュゲートされた脂質、又はそれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態によれば、イオン化脂質は、カチオン性脂質である。いくつかの実施形態によれば、カチオン性脂質は、ＳＳ切断可能な脂質である。
本明細書に開示される態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、イオン化脂質は、式（Ｉ）：
又はその薬学的に許容される塩によって表され、式中、
Ｒ１及びＲ１’は、各々独立して、任意に置換された直鎖又は分岐鎖Ｃ１～３アルキレンであり、
Ｒ２及びＲ２’は、各々独立して、任意に置換された直鎖又は分岐鎖Ｃ１～６アルキレンであり、
Ｒ３及びＲ３’は、各々独立して、任意に置換された直鎖又は分岐鎖Ｃ１～６アルキルであるか、
あるいは、Ｒ２が任意に置換された分岐鎖Ｃ１～６アルキレンである場合、Ｒ２及びＲ３は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成するか、
あるいは、Ｒ２’が任意に置換された分岐鎖Ｃ１～６アルキレンである場合、Ｒ２’及びＲ３’は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成し、
Ｒ４及びＲ４’は、各々独立して、－ＣＲａ、－Ｃ（Ｒａ）２ＣＲａ、又は－［Ｃ（Ｒａ）２］２ＣＲａであり、
Ｒａは、各出現に対して、独立してＨ又はＣ１～３アルキルであるか、
あるいは、Ｒ４が－Ｃ（Ｒａ）２ＣＲａ、又は－［Ｃ（Ｒａ）２］２ＣＲａである場合、及びＲａがＣ１～３アルキルである場合、Ｒ３及びＲ４は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成するか、
あるいは、Ｒ４’が－Ｃ（Ｒａ）２ＣＲａ、又は－［Ｃ（Ｒａ）２］２ＣＲａである場合、及びＲａがＣ１～３アルキルである場合、Ｒ３’及びＲ４’は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成し、
Ｒ５及びＲ５’は、各々独立して、Ｃ１～２０アルキレン又はＣ２～２０アルケニレンであり、
Ｒ６及びＲ６’は、各出現に対して、独立して、Ｃ１～２０アルキレン、Ｃ３～２０シクロアルキレン、又はＣ２～２０アルケニレンであり、
ｍ及びｎは、各々独立して、１、２、３、４、及び５から選択される整数である。
本明細書に開示される態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、イオン化脂質は、式（ＩＩ）：
又はその薬学的に許容される塩によって表され、式中、
ａは、１～２０の範囲の整数であり、
ｂは、２～１０の範囲の整数であり、
Ｒ１は、不在であるか、又は（Ｃ２－Ｃ２０）アルケニル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ２－Ｃ２０）アルキル、及び（Ｃ２－Ｃ２０）アルキルで置換されたシクロプロピルから選択され、
Ｒ２は、（Ｃ２－Ｃ２０）アルキルである。
本明細書に開示される態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、イオン化脂質は、式（Ｖ）：
又はその薬学的に許容される塩によって表され、式中、
Ｒ１及びＲ１’は、各々独立して、Ｒａから選択される１つ以上の基で任意に置換された（Ｃ１－Ｃ６）アルキレンであり、
Ｒ２及びＲ２’は、各々独立して、（Ｃ１－Ｃ２）アルキレンであり、
Ｒ３及びＲ３’は、各々独立して、Ｒｂから選択される１つ以上の基で任意に置換された（Ｃ１－Ｃ６）アルキルであるか、
あるいは、Ｒ２及びＲ３並びに／又はＲ２’及びＲ３’は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～７員のヘテロシクリルを形成し、
Ｒ４及びＲ４’は、各々、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－によって中断された（Ｃ２－Ｃ６）アルキレンであり、
Ｒ５及びＲ５’は、各々独立して、（Ｃ２－Ｃ３０）アルキル又は（Ｃ２－Ｃ３０）アルケニルであり、これらの各々が、任意に－Ｃ（Ｏ）Ｏ－又は（Ｃ３－Ｃ６）シクロアルキルで中断され、
Ｒａ及びＲｂは、各々、ハロ又はシアノである。
いくつかの実施形態によれば、イオン化脂質は、式（ＸＶ）：
又はその薬学的に許容される塩によって表され、式中、
Ｒ’は、不在、水素、又はＣ１－Ｃ６アルキルであるが、ただし、Ｒ’が水素又はＣ１－Ｃ６アルキルである場合、Ｒ’、Ｒ１、及びＲ２が全て結合している窒素原子は、プロトン化されており、
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、水素、Ｃ１－Ｃ６アルキル、又はＣ２－Ｃ６アルケニルであり、
Ｒ３は、Ｃ１－Ｃ１２アルキレン又はＣ２－Ｃ１２アルケニレンであり、
Ｒ４は、Ｃ１－Ｃ１６非分岐鎖アルキル、Ｃ２－Ｃ１６非分岐鎖アルケニルであるか、又は
であり、式中、
Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、各々独立して、Ｃ１－Ｃ１６非分岐鎖アルキル又はＣ２－Ｃ１６非分岐鎖アルケニルであり、
Ｒ５は、不在、Ｃ１－Ｃ８アルキレン、又はＣ２－Ｃ８アルケニレンであり、
Ｒ６ａ及びＲ６ｂは、各々独立して、Ｃ７－Ｃ１６アルキル又はＣ７－Ｃ１６アルケニルであるが、ただし、Ｒ６ａ及びＲ６ｂ中の合わせた総炭素数は、１５より大きく、
Ｘ１及びＸ２は、各々独立して、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ－、－Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）－、－Ｃ（Ｒａ）＝ＮＯ－、－Ｏ－Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＳｉ（Ｒａ）２Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）（ＣＲａ ２）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、又はＯＣ（＝Ｏ）（ＣＲａ ２）Ｃ（＝Ｏ）－であり、式中、
Ｒａは、各出現に対して、独立して水素又はＣ１－Ｃ６アルキルであり、
ｎは、１、２、３、４、５、及び６から選択される整数である。
いくつかの実施形態によれば、イオン化脂質は、式（ＸＸ）：
又はその薬学的に許容される塩によって表され、式中、
Ｒ’は、不在、水素、又はＣ１－Ｃ３アルキルであるが、ただし、Ｒ’が水素又はＣ１－Ｃ３アルキルである場合、Ｒ’、Ｒ１、及びＲ２が全て結合している窒素原子は、プロトン化されており、
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、水素又はＣ１－Ｃ３アルキルであり、
Ｒ３は、Ｃ３－Ｃ１０アルキレン又はＣ３－Ｃ１０アルケニレンであり、
Ｒ４は、Ｃ１－Ｃ１６非分岐鎖アルキル、Ｃ２－Ｃ１６非分岐鎖アルケニルであるか、又は
であり、式中、
Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、各々独立して、Ｃ１－Ｃ１６非分岐鎖アルキル又はＣ２－Ｃ１６非分岐鎖アルケニルであり、
Ｒ５は、不在、Ｃ１－Ｃ６アルキレン、又はＣ２－Ｃ６アルケニレンであり、
Ｒ６ａ及びＲ６ｂは、各々独立して、Ｃ７－Ｃ１４アルキル又はＣ７－Ｃ１４アルケニルであり、
Ｘは、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ－、－Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）－、－Ｃ（Ｒａ）＝ＮＯ－、－Ｏ－Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＳｉ（Ｒａ）２Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）（ＣＲａ ２）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、又はＯＣ（＝Ｏ）（ＣＲａ ２）Ｃ（＝Ｏ）－であり、式中、
Ｒａは、各出現に対して、独立して水素又はＣ１－Ｃ６アルキルであり、
ｎは、１、２、３、４、５、及び６から選択される整数である。
いくつかの実施形態によれば、イオン化脂質は、表２、表５、表６、表７、又は表８の任意の脂質から選択される。
いくつかの実施形態によれば、イオン化脂質は、以下の構造：
又はその薬学的に許容される塩を有する脂質である。
いくつかの実施形態によれば、カチオン性脂質は、以下の構造：
を有するＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ又はＭＣ３）である。
本明細書に開示される態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、ステロールを更に含む。いくつかの実施形態によれば、ステロールは、コレステロールである。
本明細書に開示される態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を更に含む。いくつかの実施形態によれば、ＰＥＧは、ｌ－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）である。
本明細書に開示される態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、非カチオン性脂質を更に含む。いくつかの実施形態によれば、非カチオン性脂質は、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－モノメチルＰＥなど）、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－ジメチルＰＥなど）、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２－ジフィタノイル（ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＨｙＰＥ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、又はそれらの混合物からなる群から選択される。
いくつかの実施形態によれば、非カチオン性脂質は、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、及びジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態によれば、ＰＥＧ又はＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、約１．５％～約３％で存在する。
いくつかの実施形態によれば、コレステロールは、約２０％～約４０％のモルパーセンテージで存在し、脂質は、約８０％～約６０％のモルパーセンテージで存在する。
いくつかの実施形態によれば、コレステロールは、約４０％のモルパーセンテージで存在し、脂質は、約５０％のモルパーセンテージで存在する。
いくつかの実施形態によれば、組成物は、コレステロール、ＰＥＧ又はＰＥＧ－脂質コンジュゲート、及び非カチオン性脂質を更に含む。
いくつかの実施形態によれば、ＰＥＧ又はＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、約１．５％～約３％、約１．５％～約２．７５％、約１．５％～約２．５％、約１．５％～約２％、約２％～約３％、約２％～約２．７５％、約２％～約２．５％、約２．５％～約３％、約２．５％～約２．７５％、又は約２．５％～約３％で存在する。
いくつかの実施形態によれば、コレステロールは、約３０％～約５０％、約３０％～約４５％、約３０％～約４０％、約３０％～約３５％、約３５％～約４０％、約３５％～約４５％、約３５％～約５０％、約４０％～約４５％、約４０％～約５０％、又は約４５％～約５０％のモルパーセンテージで存在する。
いくつかの実施形態によれば、脂質は、約４２．５％～約６２．５％、約４２．５％～約５７．５％、約４２．５％～約５２．５％、約４２．５％～約４７．５％、約４７．５％～約６２．５％、約４７．５％～約５７．５％、約４７．５％～約５２．５％、約５２．５％～約６２．５％、約５２．５％～約５７．５％、又は約５７．５％～約６２．５％のモルパーセンテージで存在する。
いくつかの実施形態によれば、非カチオン性脂質は、約２．５％～約１２．５％、約２．５％～約１０．５％、約２．５％～約８．５％、約２．５％～約６．５％、約２．５％～約４．５％、約４．５％～約１２．５％、約４．５％～約１０．５％、約４．５％～約８．５％、約４．５％～約６．５％、約６．５％～約１２．５％、約６．５％～約１０．５％、約６．５％～約８．５％、約８．５％～約１２．５％、約８．５％～約１０．５％、又は約１０．５％～約１２．５％のモルパーセンテージで存在する。
本明細書の態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、コレステロールは、約４０％のモルパーセンテージで存在し、脂質は、約５２．５％のモルパーセンテージで存在し、非カチオン性脂質は、約７．５％のモルパーセンテージで存在し、ＰＥＧは、約３％で存在する。
本明細書に開示される態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、組成物は、パルミチン酸デキサメタゾンを更に含む。
本明細書に開示される態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、約７５ｎｍ未満のサイズである。本明細書に開示される態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、約７０ｎｍ未満のサイズ、例えば約６５ｎｍ未満、約６０ｎｍ未満、約５５ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約４５ｎｍ未満、約４０ｎｍ未満、約３５ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、約２５ｎｍ未満、約２０ｎｍ未満、約１５ｎｍ未満、又は約１０ｎｍ未満のサイズである。本明細書に開示される態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、約７０ｎｍ未満、６９ｎｍ、６８ｎｍ、６７ｎｍ、６６ｎｍ、６５ｎｍ、６４ｎｍ、６３ｎｍ、６２ｎｍ、６１ｎｍ、６０ｎｍ、５９ｎｍ、５８ｎｍ、５７ｎｍ、５６ｎｍ、５５ｎｍ、５４ｎｍ、５３ｎｍ、５２ｎｍ、５１ｎｍ又は５０ｎｍのサイズである。
本明細書に開示される態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、組成物は、約１５：１の全脂質対剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）比を有する。
本明細書に開示される態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、組成物は、約３０：１の全脂質対剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）比を有する。
本明細書に開示される態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、組成物は、約４０：１の全脂質対剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）比を有する。
本明細書に開示される態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、組成物は、約５０：１の全脂質対剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）比を有する。
本明細書に開示される態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、組成物は、約１５：１～約３０：１の全脂質対剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）比を有する。本明細書に開示される態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、組成物は、約１５：１～約４０：１の全脂質対剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）比を有する。本明細書に開示される態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、組成物は、約１５：１～約５０：１の全脂質対剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）比を有する。本明細書に開示される態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、組成物は、約３０：１～約４０：１の全脂質対剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）比を有する。本明細書に開示される態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、組成物は、約３０：１～約５０：１の全脂質対剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）比を有する。本明細書に開示される態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、組成物は、約４０：１～約５０：１の全脂質対剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）比を有する。本明細書に開示される態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、組成物は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を更に含む。いくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃは、全脂質の０．５％のモルパーセンテージでＬＮＰ中に存在する。いくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃは、全脂質の約０．３％～約０．９％、約０．４％～約０．８％、約０．５％～約０．６％のモルパーセンテージでＬＮＰ中に存在する。
本明細書に開示される態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）は、閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）である。
本明細書に開示される態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）は、プロモーター配列及び導入遺伝子を含む発現カセットを含む。
いくつかの実施形態によれば、剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）は、ポリアデニル化配列を含む発現カセットを含む。
いくつかの実施形態によれば、剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）は、当該発現カセットの５’末端又は３’末端のいずれかに隣接する少なくとも１つの逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む。
いくつかの実施形態によれば、発現カセットは、２つのＩＴＲに隣接し、２つのＩＴＲは、１つの５’ＩＴＲ及び１つの３’ＩＴＲを含む。
いくつかの実施形態によれば、発現カセットは、３’末端でＩＴＲ（３’ＩＴＲ）に連結される。いくつかの実施形態によれば、発現カセットは、５’末端でＩＴＲ（５’ＩＴＲ）に連結される。
いくつかの実施形態によれば、５’ＩＴＲ又は３’ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲである。いくつかの実施形態によれば、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、修飾型ＩＴＲである。
いくつかの実施形態によれば、剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）は、５’ＩＴＲと発現カセットとの間にスペーサー配列を更に含む。
いくつかの実施形態によれば、剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）は、３’ＩＴＲと発現カセットとの間にスペーサー配列を更に含む。
いくつかの実施形態によれば、スペーサー配列は、少なくとも５塩基対の長さである。いくつかの実施形態によれば、スペーサー配列は、少なくとも５～１００塩基対の長さである。いくつかの実施形態によれば、スペーサー配列は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００塩基対の長さである。いくつかの実施形態によれば、スペーサー配列は、長さが少なくとも５～５００塩基対である。いくつかの実施形態によれば、スペーサー配列は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、又は５００塩基対の長さである。
いくつかの実施形態によれば、剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）は、ニック又はギャップを有する。
いくつかの実施形態によれば、ＩＴＲは、ＡＡＶ血清型に由来するＩＴＲ、ガチョウウイルスのＩＴＲに由来するＩＴＲ、Ｂ１９ウイルスＩＴＲに由来するＩＴＲ、又はパルボウイルスに由来する野生型ＩＴＲから選択されるＩＴＲである。
いくつかの実施形態によれば、当該ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１及びＡＡＶ１２からなる群から選択される。
いくつかの実施形態によれば、ＩＴＲは、変異体ＩＴＲであり、ｃｅＤＮＡは、第１のＩＴＲとは異なる追加のＩＴＲを任意に含む。
いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、発現カセットの５’及び３’末端の両方に２つの変異体ＩＴＲを含み、任意に、２つの変異体ＩＴＲは、対称変異体である。
本明細書に開示される態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）は、ミニ遺伝子、プラスミド、ミニサークル、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、リボザイム、ｃｅＤＮＡ、ミニストリング、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）、プロテロメア閉端ＤＮＡ、又はダンベル直鎖状ＤＮＡ、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＤＮＡウイルスベクター、ウイルスＲＮＡベクター、非ウイルスベクター、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
本明細書に開示される態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、剛性治療用核酸は、プラスミドである。
本明細書に開示される態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤を更に含む。
別の態様によれば、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を生成する方法を提供し、ＬＮＰは、イオン化脂質及び閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）を含み、この方法は、水性ｃｅＤＮＡを、カチオン性又はイオン化脂質を含む１つ以上の低分子量アルコール（例えば、エタノール、メタノール、プロパノール、又はイソプロパノール）溶液に添加して、ｃｅＤＮＡ／脂質溶液を形成することであって、溶液中のアルコールの最終濃度が、約８０％～約９８％である、形成することと、ｃｅＤＮＡ／脂質溶液を酸性水性緩衝液と混合することと、中性ｐＨ水性緩衝液と緩衝液とを交換し、それによって、ＬＮＰ製剤を生成することと、を含む。いくつかの実施形態によれば、溶液中の低分子量アルコールの最終濃度は、約８０％～約９８％、約８０％～約９５％、約８０％～約９２％、約８０％～約９０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９８％、約８５％～約９５％、約８５％～約９２％、約８５％～約９０％、約９０％～約９８％、約８７％～約９７％、約８７％～約９５％、約８７％～約９２％、約８７％～約９０％、約９０％～約９５％、約９０％～約９２％、約９５％～約９８％、又は約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％又は約９８％である。
別の態様によれば、本開示は、イオン化脂質及び閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を生成する方法を提供し、この方法は、ｃｅＤＮＡを、１つ以上の低分子量アルコール（例えば、エタノール、メタノール、プロパノール、又はイソプロパノール）溶液に添加することであって、得られた溶液のアルコール含有量が、８０％を超える、添加することと、＞８０％のアルコール含有量の当該ｃｅＤＮＡを、８０％のアルコール中のカチオン性又はイオン化脂質に添加して、ｃｅＤＮＡ／脂質溶液を形成することであって、ｃｅＤＮＡ－脂質溶液中の低分子量アルコールの濃度が、約８０％～約９５％（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、又は９５％）である、形成することと、ｃｅＤＮＡ／脂質溶液を酸性水性緩衝液と混合することと、中性ｐＨ水性緩衝液と緩衝液とを交換し、それによって、ＬＮＰ製剤を生成することと、を含む。いくつかの実施形態によれば、溶液中の低分子量アルコールの最終濃度は、約８０％～約９８％、約８０％～約９５％、約８０％～約９２％、約８０％～約９０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９８％、約８５％～約９５％、約８５％～約９２％、約８５％～約９０％、約９０％～約９８％、約８７％～約９７％、約８７％～約９５％、約８７％～約９２％、約８７％～約９０％、約９０％～約９５％、約９０％～約９２％、約９５％～約９８％、又は約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％又は約９８％である。
いくつかの実施形態によれば、この方法は、ｃｅＤＮＡ／脂質混合溶液を酸性水性緩衝液で希釈するステップを更に含む。
いくつかの実施形態によれば、１つ以上の低分子量アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール及びイソプロパノールからなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、１つ以上の低分子量アルコールは、エタノールである。いくつかの実施形態によれば、１つ以上の低分子量アルコールは、プロパノールである。いくつかの実施形態によれば、１つ以上の低分子量アルコールは、エタノールである。いくつかの実施形態によれば、１つ以上の低分子量アルコールは、エタノール及びメタノールの混合物である。
いくつかの実施形態によれば、酸性水性緩衝液は、リンゴ酸／リンゴ酸ナトリウム又は酢酸／酢酸ナトリウムから選択される。いくつかの実施形態によれば、酸性水性緩衝液は、約１０～４０ミリモル（ｍＭ）、例えば約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、約２０ｍＭ～約３０ｍＭ、約２０ｍＭ～約４０ｍＭ、約３０ｍＭ～約４０ｍＭ、又は約１０ｍＭ～約１５ｍＭの濃度である。いくつかの実施形態によれば、酸性水性緩衝液は、約３～５のｐＨである。
いくつかの実施形態によれば、中性ｐＨ水性緩衝液は、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４である。
いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡ／脂質溶液は、マイクロ流体混合を使用して酸性水性緩衝液と混合される。
いくつかの実施形態によれば、希釈ステップ後の最終アルコール含量は、約４％～約１５％（例えば、約４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％又は１５％）である。
いくつかの実施形態によれば、酸性水性緩衝液とｃｅＤＮＡ／脂質溶液との間の流速比は、２：１、３：２、３：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１又は２０：１である。
いくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、約２０ｎｍ～約７０ｎｍ、例えば約２０ｎｍ、約２５ｎｍ、約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、約５０ｎｍ、約５５ｎｍ、約６０ｎｍ、約６５ｎｍ又は約７０ｎｍの平均直径を有する。
いくつかの実施形態によれば、カチオン性脂質は、以下の構造：
を有するＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ又はＭＣ３）である。
いくつかの実施形態によれば、イオン化脂質は、ジスルフィド結合及び三級アミンを含むＳＳ切断可能な脂質である。
いくつかの実施形態によれば、ＳＳ切断可能な脂質は、以下の式：
又はその薬学的に許容される塩のｓｓ－ＯＰ脂質を含む。
いくつかの実施形態によれば、本開示は、本明細書の態様及び実施形態に記載の方法によって生成されるＬＮＰ製剤を提供する。
別の態様によれば、本開示は、対象における遺伝性障害を治療する方法を提供し、この方法は、有効量の先行請求項のいずれか一項に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態によれば、対象は、ヒトである。
いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、鎌状赤血球貧血症、メラノーマ、血友病Ａ（凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）欠損症）及び血友病Ｂ（凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）欠損症）、嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ）、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体欠損症）、肝芽細胞腫、ウィルソン病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、先天性肝性ポルフィリン症、遺伝性肝代謝障害、レッシュナイハン症候群、鎌状赤血球貧血症、サラセミア、色素性乾皮症、ファンコニ貧血、網膜色素変性症、毛細血管拡張性運動失調症、ブルーム症候群、網膜芽細胞腫、ムコ多糖蓄積症（例えば、ハーラー症候群（ＭＰＳ Ｉ型）、シャイエ症候群（ＭＰＳ Ｉ型 Ｓ型）、ハーラーシャイエ症候群（ＭＰＳ Ｉ型 Ｈ－Ｓ型）、ハンター症候群（ＭＰＳ ＩＩ型）、サンフィリッポＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤ型（ＭＰＳ ＩＩＩ Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ型）、モルキオＡ及びＢ型（ＭＰＳ ＩＶＡ及びＭＰＳ ＩＶＢ）、マロトーラミー症候群（ＭＰＳ ＶＩ型）、スライ症候群（ＭＰＳ ＶＩＩ型）、ヒアルロニダーゼ欠損症（ＭＰＳ ＩＸ型））、ニーマンピック病Ａ／Ｂ、Ｃ１及びＣ２型、ファブリー病、シンドラー病、ＧＭ２－ガングリオシドーシスＩＩ型（サンドホフ病）、テイサックス病、異染性白質ジストロフィー、クラッベ病、ムコリピドーシスＩ、ＩＩ／ＩＩＩ及びＩＶ型、シアリドーシスＩ及びＩＩ型、グリコーゲン蓄積症Ｉ及びＩＩ型（ポンペ病）、ゴーシェ病Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ型、シスチン症、バッテン病、アスパルチルグルコサミン尿症、サラ病、ダノン病（ＬＡＭＰ－２欠損症）、リソソーム酸性リパーゼ（ＬＡＬ）欠損症、神経セロイドリポフスチン症（ＣＬＮ１－８、ＩＮＣＬ、及びＬＩＮＣＬ）、スフィンゴリピドーシス、ガラクトシアリドーシス、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症、フリードライヒ運動失調症、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、ジストロフィー表皮水疱症（ＤＥＢ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ１欠損症、乳児期の全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）、レーバー先天性黒内障、シュタルガルト黄斑ジストロフィー（ＡＢＣＡ４）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、アッシャー症候群、アルファ－１アンチトリプシン欠損症、並びにカテプシンＡ欠損症からなる群から選択される。いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）である。
いくつかの実施形態によれば、ＬＣＡは、ＬＣＡ１０である。
いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、ニーマンピック病である。いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、シュタルガルト黄斑ジストロフィーである。いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、グルコース－６－ホスファターゼ（Ｇ６Ｐａｓｅ）欠損症（グリコーゲン蓄積症Ｉ型）又はポンペ病（グリコーゲン蓄積症ＩＩ型）である。いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠損症）である。いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠損症）である。いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、ハンター症候群（ムコ多糖症ＩＩ型）である。いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、嚢胞性線維症である。いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、ジストロフィー表皮水疱症（ＤＥＢ）である。いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）である。いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、ヒアルロニダーゼ欠損症である。
本明細書に開示される態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、この方法は、免疫抑制剤を投与することを更に含む。
いくつかの実施形態によれば、免疫抑制剤は、デキサメタゾンである。
本明細書に開示される態様及び実施形態のいくつかの実施形態によれば、対象は、主要なカチオン性脂質としてＭＣ３を含むＬＮＰで観察された免疫応答レベルと比較して、薬学的組成物に対して低下した免疫応答レベルを示し、薬学的組成物に対する免疫応答レベルは、ＭＣ３を含むＬＮＰで観察されたレベルよりも少なくとも５０％低い。
いくつかの実施形態によれば、免疫応答は、炎症誘発性サイトカイン又はケモカインのレベルを検出することによって測定される。
いくつかの実施形態によれば、炎症誘発性サイトカイン又はケモカインは、ＩＬ－６、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＩＬ－１８、ＴＮＦα、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、及びＲＡＮＴＥＳからなる群から選択される。
いくつかの実施形態によれば、炎症誘発性サイトカインのうちの少なくとも１つは、薬学的組成物の投与の６時間後に対象の血清中で検出可能なレベル未満である。
いくつかの実施形態によれば、ＳＳ切断可能な脂質及び閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）を含むＬＮＰは、貪食されないか、又は同様の条件で投与された主要なカチオン性脂質としてＭＣ３を含むＬＮＰの食作用レベルと比較して、少なくとも５０％低下した食作用レベルを示す。
いくつかの実施形態によれば、ＳＳ切断可能な脂質は、以下の式：
又はその薬学的に許容される塩のｓｓＯＰ脂質を含む。
いくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、コレステロール及びＰＥＧ－脂質コンジュゲートを更に含む。
いくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、非カチオン性脂質を更に含む。
いくつかの実施形態によれば、非カチオン性脂質は、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、及びジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を更に含む。
いくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃは、全脂質の０．５％のモルパーセンテージでＬＮＰ中に存在する。
別の態様によれば、本開示は、治療を必要とする対象の肝臓への治療用核酸の標的化を増加させる方法を提供し、この方法は、有効量の先行請求項のいずれか一項に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含み、ＬＮＰは、治療用核酸、ｓｓ切断可能な脂質、ステロール、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む。
いくつかの実施形態によれば、ＰＥＧは、ｌ－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）である。
いくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、非カチオン性脂質を更に含む。
いくつかの実施形態によれば、非カチオン性脂質は、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、及びジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃは、全脂質の０．５％のモルパーセンテージでＬＮＰ中に存在する。
いくつかの実施形態によれば、対象は、遺伝性障害に罹患している。
いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠損症）である。いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠損症）である。いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）である。
いくつかの実施形態によれば、治療用核酸は、ミニ遺伝子、プラスミド、ミニサークル、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、リボザイム、ｃｅＤＮＡ、ミニストリング、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）、プロテロメア閉端ＤＮＡ、又はダンベル直鎖状ＤＮＡ、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＤＮＡウイルスベクター、ウイルスＲＮＡベクター、非ウイルスベクター、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態によれば、治療用核酸は、ｃｅＤＮＡである。
いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、プロモーター配列及び導入遺伝子を含む発現カセットを含む。
いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、当該発現カセットの５’又は３’末端のいずれかに隣接する少なくとも１つの逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む。
いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ＣＥＬｉＤ、ＭＩＤＧＥ、ミニスタリングＤＮＡ、発現カセットの５’及び３’末端にＩＴＲの２つのヘアピン構造を含むダンベル型の直鎖状二重鎖閉端ＤＮＡ、又はｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡからなる群から選択され、ｃｅＤＮＡは、カプシド不含及び直鎖状二重鎖ＤＮＡである。
いくつかの態様によれば、本開示は、治療用核酸（ＴＮＡ）による治療を必要とする対象における補体応答を軽減する方法を提供し、この方法は、有効量の先行請求項のいずれか一項に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含み、ＬＮＰは、ＴＮＡ、ｓｓ切断可能な脂質、ステロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む。
いくつかの実施形態によれば、対象は、遺伝性障害に罹患している。
いくつかの実施形態によれば、遺伝性障害は、鎌状赤血球貧血症、メラノーマ、血友病Ａ（凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）欠損症）及び血友病Ｂ（凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）欠損症）、嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ）、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体欠損症）、肝芽細胞腫、ウィルソン病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、先天性肝性ポルフィリン症、遺伝性肝代謝障害、レッシュナイハン症候群、鎌状赤血球貧血症、サラセミア、色素性乾皮症、ファンコニ貧血、網膜色素変性症、毛細血管拡張性運動失調症、ブルーム症候群、網膜芽細胞腫、ムコ多糖蓄積症（例えば、ハーラー症候群（ＭＰＳ Ｉ型）、シャイエ症候群（ＭＰＳ Ｉ型 Ｓ型）、ハーラーシャイエ症候群（ＭＰＳ Ｉ型 Ｈ－Ｓ型）、ハンター症候群（ＭＰＳ ＩＩ型）、サンフィリッポＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤ型（ＭＰＳ ＩＩＩ Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ型）、モルキオＡ及びＢ型（ＭＰＳ ＩＶＡ及びＭＰＳ ＩＶＢ）、マロトーラミー症候群（ＭＰＳ ＶＩ型）、スライ症候群（ＭＰＳ ＶＩＩ型）、ヒアルロニダーゼ欠損症（ＭＰＳ ＩＸ型））、ニーマンピック病Ａ／Ｂ、Ｃ１及びＣ２型、ファブリー病、シンドラー病、ＧＭ２－ガングリオシドーシスＩＩ型（サンドホフ病）、テイサックス病、異染性白質ジストロフィー、クラッベ病、ムコリピドーシスＩ、ＩＩ／ＩＩＩ及びＩＶ型、シアリドーシスＩ及びＩＩ型、グリコーゲン蓄積症Ｉ及びＩＩ型（ポンペ病）、ゴーシェ病Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ型、シスチン症、バッテン病、アスパルチルグルコサミン尿症、サラ病、ダノン病（ＬＡＭＰ－２欠損症）、リソソーム酸性リパーゼ（ＬＡＬ）欠損症、神経セロイドリポフスチン症（ＣＬＮ１－８、ＩＮＣＬ、及びＬＩＮＣＬ）、スフィンゴリピドーシス、ガラクトシアリドーシス、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症、フリードライヒ運動失調症、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、ジストロフィー表皮水疱症（ＤＥＢ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ１欠損症、乳児期の全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）、レーバー先天性黒内障、シュタルガルト黄斑ジストロフィー（ＡＢＣＡ４）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、アッシャー症候群、アルファ－１アンチトリプシン欠損症、並びにカテプシンＡ欠損症からなる群から選択される。
いくつかの実施形態によれば、剛性治療用核酸は、ミニ遺伝子、プラスミド、ミニサークル、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、リボザイム、ｃｅＤＮＡ、ミニストリング、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）、プロテロメア閉端ＤＮＡ、又はダンベル直鎖状ＤＮＡ、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＤＮＡウイルスベクター、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ＣＥＬｉＤ、ＭＩＤＧＥ、ミニスタリングＤＮＡ、発現カセットの５’及び３’末端にＩＴＲの２つのヘアピン構造を含むダンベル型の直鎖状二重鎖閉端ＤＮＡ、又はｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡからなる群から選択され、ｃｅＤＮＡは、カプシド不含及び直鎖状二重鎖ＤＮＡである。
いくつかの実施形態によれば、ＰＥＧは、ｌ－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）である。
いくつかの実施形態によれば、ＰＥＧは、約２～４％の分子パーセンテージでＬＮＰ中に存在する。いくつかの実施形態によれば、ＰＥＧは、約３％の分子パーセンテージでＬＮＰ中に存在する。
いくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、非カチオン性脂質を更に含む。いくつかの実施形態によれば、非カチオン性脂質は、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、及びジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃは、全脂質の約０．３～１％のモルパーセンテージでＬＮＰ中に存在する。いくつかの実施形態によれば、ＧａｌＮＡｃは、全脂質の約０．５％のモルパーセンテージでＬＮＰ中に存在する。
上記に簡単に要約され、以下により詳細に考察される本開示の実施形態は、添付の図面に描かれた本開示の例示的な実施形態を参照することによって理解することができる。しかしながら、添付の図面は、本開示の典型的な実施形態のみを示し、したがって、本開示は他の等しく有効な実施形態を認めることができるため、範囲を限定するものとみなされるべきではない。
図１Ａは、動的光散乱によって決定されるｃｅＤＮＡの凝縮を示すグラフである。動的光散乱相関関数は、エタノール含有量が増加するにつれてｃｅＤＮＡの凝縮を示す。 図１Ｂは、圧縮が再水和により可逆的であることを示すグラフである。 図２は、標準製剤プロセス及び本明細書に記載の新規製剤プロセスによって作製されたｃｅＤＮＡ ＬＮＰの直径の比較を示すグラフである。 図３Ａ及び３Ｂは、それぞれ脱イオン（ＤＩ）水に保存されたｃｅＤＮＡサンプル及びプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）サンプルの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。図３Ａは、脱イオン水中に保存されたｃｅＤＮＡのＴＥＭ画像を示す。図３Ｂは、脱イオン水中に保存されたプラスミドのＴＥＭ画像を示す。 図３Ａ及び３Ｂは、それぞれ脱イオン（ＤＩ）水に保存されたｃｅＤＮＡサンプル及びプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）サンプルの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。図３Ａは、脱イオン水中に保存されたｃｅＤＮＡのＴＥＭ画像を示す。図３Ｂは、脱イオン水中に保存されたプラスミドのＴＥＭ画像を示す。 図４Ａ及び４Ｂは、それぞれ脱イオン水中の９０．９％の１：１エタノール：メタノールの低分子量アルコール／水溶液に保存されたｃｅＤＮＡサンプル及びｐＤＮＡサンプルのＴＥＭ画像である。図４Ａは、脱イオン水中９０．９％の１：１エタノール：メタノールに保存されたｃｅＤＮＡのＴＥＭ画像を示す。図４Ｂは、脱イオン水中９０．９％の１：１エタノール：メタノールに保存されたプラスミドのＴＥＭ画像を示す。 図４Ａ及び４Ｂは、それぞれ脱イオン水中の９０．９％の１：１エタノール：メタノールの低分子量アルコール／水溶液に保存されたｃｅＤＮＡサンプル及びｐＤＮＡサンプルのＴＥＭ画像である。図４Ａは、脱イオン水中９０．９％の１：１エタノール：メタノールに保存されたｃｅＤＮＡのＴＥＭ画像を示す。図４Ｂは、脱イオン水中９０．９％の１：１エタノール：メタノールに保存されたプラスミドのＴＥＭ画像を示す。 図５は、１００％低分子量アルコール（エタノール：メタノール＝１：１、水なし）に保存されたｃｅＤＮＡサンプルのＴＥＭ画像である。 図６Ａ及び６Ｂは、それぞれ１００ｍＭ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液の塩基性変性条件で保存された、ｃｅＤＮＡ及びｐＤＮＡのＴＥＭ画像である。 図６Ａ及び６Ｂは、それぞれ１００ｍＭ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液の塩基性変性条件で保存された、ｃｅＤＮＡ及びｐＤＮＡのＴＥＭ画像である。
ウイルスベクターベースの遺伝子療法に関連する免疫原性は、既存のバックグラウンド免疫のために治療できる患者の数を制限し、かつ各患者の有効レベルまで滴定するための、又は長期にわたって効果を維持するため患者の再投与を妨げてきた。既存の免疫が欠如しているため、本明細書中に記載する治療用核酸脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、必要に応じて治療用核酸の追加用量を可能にし、組織成長に応じて後続の投与を必要とし得る小児集団を含む患者アクセスを更に拡大させる。本明細書に記載のプロセスによって生成され、特に、１つ以上の三級アミノ基を含むカチオン性又はイオン化脂質組成物を含む治療用核酸脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、従来のＬＮＰ製造プロセスから製造されたＬＮＰと比較して小型であるため、治療用核酸のより効率的な送達、より良好な忍容性及び改善された安全性プロファイルを提供する。本明細書中に記載する治療用核酸脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、ウイルスカプシド内の空間によって課されるパッケージングの制約がないため、理論的には、治療用核酸脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の唯一のサイズ制限は、宿主細胞のＤＮＡ複製効率に存在する。本明細書に記載及び例示されるように、いくつかの実施形態によれば、治療用核酸は、二本鎖ＤＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）のような治療用核酸（ＴＮＡ）である。本明細書に記載及び例示されるように、いくつかの実施形態によれば、治療用核酸は、ｃｅＤＮＡである。本明細書にも記載されるように、いくつかの実施形態によれば、治療用核酸は、ｍＲＮＡである。
特に希少疾患における治療法の開発における最も困難なハードルの１つは、多数の個々の病態である。地球上で約３億５０００万人が希少障害を抱えて生活しており、国立衛生研究所は、希少障害を、診断された人が２０万人未満の障害又は病態と定義している。これらの希少障害の約８０％は遺伝的起源であり、それらの約９５％はＦＤＡによって承認された治療を有しない（ｒａｒｅｄｉｓｅａｓｅｓ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｉｓｅａｓｅｓ／ｐａｇｅｓ／３１／ｆａｑｓ－ａｂｏｕｔ－ｒａｒｅ－ｄｉｓｅａｓｅｓ）。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の利点の中には、複数の疾患、特に多くの遺伝性障害又は疾患の治療の現在の状態を有意義に変更することができる希少な単一遺伝子疾患に迅速に適応することができるアプローチを提供することにある。
Ｉ．定義
本明細書で別途定義されない限り、本出願に関連して使用される科学的及び技術的用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。本開示は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬などに限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲を限定することを意図されない。免疫学及び分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ．，２０１１（ＩＳＢＮ９７８－０－９１１９１０－１９－３）、Ｒｏｂｅｒｔ Ｓ．Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ（２０１３）、Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．（ｅｄ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，１９９９－２０１２（ＩＳＢＮ９７８３５２７６００９０８）、及びＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ１－５６０８１－５６９－８）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｂｙ Ｗｅｒｎｅｒ Ｌｕｔｔｍａｎｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２００６、Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｍｕｒｐｈｙ，Ａｌｌａｎ Ｍｏｗａｔ，Ｃａｓｅｙ Ｗｅａｖｅｒ（ｅｄｓ．），Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，２０１４（ＩＳＢＮ０８１５３４５３０５，９７８０８１５３４５３０５）、Ｌｅｗｉｎ’ｓ Ｇｅｎｅｓ ＸＩ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２０１４（ＩＳＢＮ－１４４９６５９０５５）、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ１９３６１１３４１４）、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ０４４４６０１４９Ｘ）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ，Ｊｏｎ Ｌｏｒｓｃｈ（ｅｄ．）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１３（ＩＳＢＮ０１２４１９９５４２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＭＢ），Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２０１４（ＩＳＢＮ０４７１５０３３８Ｘ，９７８０４７１５０３３８５）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ），Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００５、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＣＰＩ）（Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ＡＤＡ Ｍ Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅ，（ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００３（ＩＳＢＮ０４７１１４２７３５，９７８０４７１１４２７３７）に見出すことができ、これらの内容は全て、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容が別途明らかに示さない限り、複数の指示対象を含む。
略語「例えば（ｅ．ｇ．）」は、ラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａに由来し、本明細書では非限定例を示すように使用される。したがって、略語「例えば（ｅ．ｇ．）」は、「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」と同義である。
代替案（例えば、「又は」）の使用は、代替案のいずれか一方、両方、又はそれらの任意の組み合わせを意味すると理解されたい。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、量、時間的持続時間などの測定可能な値を指す場合、開示された方法を実施するのに適切であるように指定の値から±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、更により好ましくは±１％、更により好ましくは±０．１％の変動を包含することを意味する。
本明細書で使用される場合、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、又は整数範囲は、別途明記しない限り、列挙された範囲内の任意の整数の値、及び適切な場合にはその端数（整数の１０分の１及び１００分の１など）を含むと理解されるべきである。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、又は「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」という用語と同義であることを意味し、例えば、構成要素に続くものの存在を指定する包括的又は自由形式の用語であり、当該技術分野において既知であるか、又はそこに開示されている、追加の、引用されていない構成要素、特徴、エレメント、メンバー、ステップの存在を除外又は排除しない。
「からなる」という用語は、実施形態の説明において列挙されていないいずれのエレメントも除いた、本明細書に記載される組成物、方法、プロセス、及びそれらのそれぞれの構成要素を指す。
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要なエレメントを指す。この用語は、本開示のその実施形態の基本的及び新規又は機能的な特徴に実質的に影響を及ぼさない追加の要素の存在を許容する。
本明細書で使用される場合、「など」、「例えば」などの用語は、例示的な実施形態を指すことを意図しており、本開示の範囲を限定するものではない。
別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料を、本開示の試験のための実施において使用することができるが、好ましい材料及び方法は、本明細書に記載される。
本明細書で使用される場合、「投与」、「投与する」という用語及びその変形は、組成物又は薬剤（例えば、核酸、特にｃｅＤＮＡ）を対象に導入することを指し、１つ以上の組成物又は薬剤の同時で連続的な導入を含む。「投与」は、例えば、治療、薬物動態、診断、研究、プラセボ、及び実験方法を指し得る。「投与」は、インビトロ及びエクスビボ治療も包含する。組成物又は薬剤の対象への導入は、経口、肺、鼻腔内、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下）、直腸、リンパ管内、腫瘍内、又は局所を含む任意の好適な経路による。投与には、自己管理及び他者による投与が含まれる。投与は、任意の好適な経路によって実行され得る。好適な投与経路は、組成物又は薬剤がその意図された機能を遂行することを可能にする。例えば、好適な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物又は薬剤を対象の静脈に導入することによって投与される。
本明細書で使用される場合、「抗治療用核酸免疫応答」、「抗転移ベクター免疫応答」、「治療用核酸に対する免疫応答」、「転移ベクターに対する免疫応答」などの句は、その起源がウイルス性又は非ウイルス性の治療用核酸に対する任意の望ましくない免疫応答を指すことを意味する。いくつかの実施形態では、望ましくない免疫応答は、ウイルス転移ベクター自体に対する抗原特異的免疫応答である。いくつかの実施形態では、免疫応答は、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、又は二本鎖ＲＮＡであり得る転移ベクターに特異的である。他の実施形態では、免疫応答は、転移ベクターの配列に特異的である。他の実施形態では、免疫応答は、転移ベクターのＣｐＧ含有量に特異的である。
本明細書で使用される場合、「水溶液」という用語は、全体又は一部に水を含む組成物を指すことを意味する。
本明細書で使用される場合、「塩基」には、プリン及びピリミジンが含まれ、それらには、天然化合物のアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、及び天然類似体、並びにプリン及びピリミジンの合成誘導体が更に含まれ、それらには、アミン、アルコール、チオール、カルボキシレート、及びアルキルハライドなどであるがこれらに限定されない新しい反応基を配置する修飾が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「担体」という用語は、任意かつ全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含むことを意味する。医薬活性物質に対するそのような媒質及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補充的活性成分を組成物に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与された場合に、毒性反応、アレルギー性反応、又は同様の不都合な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ」という用語は、合成又はその他の非ウイルス遺伝子導入のためのカプシド不含閉端直鎖状二本鎖（ｄｓ）二重鎖ＤＮＡを指すことを意味する。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、閉端直鎖状二重鎖（ＣＥＬｉＤ）ＣＥＬｉＤ ＤＮＡである。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ＤＮＡベースのミニサークルである。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクターである。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ミニスタリングＤＮＡである。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、発現カセットの５’及び３’末端にＩＴＲの２つのヘアピン構造を含むダンベル型の直鎖状二重鎖閉端ＤＮＡである。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡである。ｃｅＤＮＡの詳細な説明は、２０１７年３月３日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２０８２８号に記載されており、その全容は参照により本明細書に明示的に組み込まれる。細胞ベースの方法を使用して様々な逆位末端反復（ＩＴＲ）配列及び構成を含むｃｅＤＮＡの産生のためのある特定の方法は、２０１８年９月７日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号及び２０１８年１２月６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２の実施例１に記載されており、その各々は、その全体の参照により本明細書に組み込まれる。様々なＩＴＲ配列及び構成を含む合成ｃｅＤＮＡベクターの産生のためのある特定の方法は、例えば、２０１９年１月１８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／１４１２２号に記載されており、その全容は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「閉端ＤＮＡベクター」という用語は、少なくとも１つの共有結合性閉端を有し、ベクターの少なくとも一部が分子内二重鎖構造を有する、カプシド不含ＤＮＡベクターを指す。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡベクター」及び「ｃｅＤＮＡ」という用語は、交換可能に使用され、少なくとも１つの末端パリンドロームを含む閉端ＤＮＡベクターを指す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡは、２つの共有結合性閉端を含む。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バクミド」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてプラスミドとして伝播することができる分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含み、それによりバキュロウイルスのシャトルベクターとして作動し得る、感染性バキュロウイルスゲノムを指すことを意味する。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス」という用語は、バキュロウイルスゲノム内の分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むバキュロウイルスを指すことを意味する。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス感染昆虫細胞」及び「ｃｅＤＮＡ－ＢＩＩＣ」という用語は、交換可能に使用され、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスに感染した無脊椎動物宿主細胞（限定されないが、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）を含む）を指すことを意味する。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡゲノム」という用語は、少なくとも１つの逆位末端反復（ＩＴＲ）領域を更に組み込む発現カセットを指すことを意味する。ｃｅＤＮＡゲノムは、１つ以上のスペーサー領域を更に含み得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡゲノムは、ＤＮＡの分子間二重鎖ポリヌクレオチドとして、プラスミド又はウイルスゲノムに組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ調節配列」、「制御エレメント」、及び「調節エレメント」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナルなどの転写及び翻訳制御配列を指すことを意味し、これらは非コード配列（例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ）又はコード配列（例えば、部位特異的修飾ポリペプチド若しくはＣａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチド）の転写を提供及び／若しくは調節し、かつ／又はコードされたポリペプチドの翻訳を調節する。
本明細書で使用される場合、「剛性治療用核酸」、「剛性ＴＮＡ」又は「ｒＴＮＡ」という用語は、例えば、本明細書に記載のｒＴＮＡを含むＬＮＰ組成物の調製中のプロセスの結果として、コンパクトな構造を有する、又はコンパクトな状態にある、本明細書で定義される治療用核酸を指す。一実施形態では、調製物は、ＬＭＷアルコールベースのプロセスを含み、それによって、ｒＴＮＡ及び脂質がＬＭＷアルコール溶液中で混合され、ｒＴＮＡ及び脂質を含むＬＭＷアルコール混合物が、１つのチャネルを介してマイクロ流体合成システム（例えば、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ）に導入され、水性緩衝液が別のチャネルを介してシステムに導入され、ｒＴＮＡを封入するＬＮＰ組成物を生成する。本明細書で使用される場合、「末端反復」又は「ＴＲ」という用語は、少なくとも１つの最小限必要な複製起源、及びパリンドロームヘアピン構造を含む領域を含む、任意のウイルス又は非ウイルス末端配列又は合成配列を含む。Ｒｅｐ結合配列（「ＲＢＳ」又はＲｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）とも称される）及び末端分解部位（「ＴＲＳ」）は、一緒にＡＡＶの「最小限必要な複製起源」を構成し、したがって、ＴＲは、少なくとも１つのＲＢＳ及び少なくとも１つのＴＲＳを含む。ポリヌクレオチド配列の所与のストレッチ内で互いの逆相補体であるＴＲは、典型的に、各々「逆位末端反復」又は「ＩＴＲ」と称される。ウイルスの文脈において、ＩＴＲは、複製、ウイルス粒子及びＤＮＡのパッケージング、ＤＮＡの組み込み、並びにゲノム及びプロウイルスのレスキューを媒介するのに重要な役割を果たす。全長にわたって逆相補体（パリンドローム）ではないＴＲは、依然としてＩＴＲの従来の機能を遂行することができ、したがって、ＩＴＲという用語は、宿主細胞内の複製を媒介することができるウイルス又は非ウイルスＡＡＶベクター中のＴＲを指すために使用される。複合ＡＡＶベクター構成中、３つ以上のＩＴＲ又は非対称ＩＴＲ対が存在し得ることは、当業者によって理解されるであろう。
「ＩＴＲ」は、１つ以上の望ましい機能的配列（例えば、パリンドローム配列、ＲＢＳ）を含むオリゴヌクレオチドのセットを使用して人工的に合成することができる。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ ＩＴＲ、人工の非ＡＡＶ ＩＴＲ、又はウイルス性ＡＡＶ ＩＴＲに物理的に由来するＩＴＲ（例えば、ウイルスゲノムから除去されたＩＴＲ断片）であり得る。例えば、ＩＴＲは、パルボウイルス及びディペンドウイルス（例えば、イヌパルボウイルス、ウシパルボウイルス、マウスパルボウイルス、ブタパルボウイルス、ヒトパルボウイルスＢ－１９）を包含するパルボウイルス科に由来し得るか、又はＳＶ４０複製の起源として役立つＳＶ４０ヘアピンは、切断、置換、欠失、挿入、及び／若しくは付加によって更に修飾され得る、ＩＴＲとして使用され得る。パルボウイルス科ウイルスは、脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科及び無脊椎動物に感染するデンソウイルス亜科の２つの亜科で構成されている。ディペンドパルボウイルスは、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、ウマ、及びヒツジ種を含むが、これらに限定されない脊椎動物宿主における複製が可能である、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のウイルスファミリーを含む。典型的には、ＩＴＲ配列は、野生型、「ｄｏｇｇｙ ｂｏｎｅ」及び「ダンベル型」、対称型又は非対称型ＩＴＲ配向の構成で、ＡＡＶだけでなく、パルボウイルス、レンチウイルス、ガチョウウイルス、Ｂ１９に由来することができる。ＩＴＲは典型的にはＡＡＶベクターの５´及び３´末端の両方に存在するが、ＩＴＲは直鎖状ベクターの一方の末端にのみ存在することができる。例えば、ＩＴＲは、５’末端にのみ存在することができる。他のいくつかのケースでは、ＩＴＲは合成ＡＡＶベクターの３’末端にのみ存在することができる。本明細書では便宜上、合成ＡＡＶベクター中の発現カセットに対して５’（その上流）に位置するＩＴＲは、「５’ＩＴＲ」又は「左ＩＴＲ」と称され、ベクター又は合成ＡＡＶ中の発現カセットに対して３’（その下流）に位置するＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」又は「右ＩＴＲ」と称される。
「野生型ＩＴＲ」又は「ＷＴ－ＩＴＲ」は、例えば、Ｒｅｐ結合活性及びＲｅｐニッキング能力を維持する、ＡＡＶゲノム又は他のディペンドウイルスにおける天然に存在するＩＴＲ配列の配列を指す。任意のＡＡＶ血清型からのＷＴ－ＩＴＲのヌクレオチド配列は、遺伝コード又はドリフトの縮退に起因して天然に存在する正準配列とわずかに異なる場合があり、したがって本明細書における使用のために包含されるＷＴ－ＩＴＲ配列は、天然に存在する変化（例えば、複製エラー）の結果としてＷＴ－ＩＴＲ配列を含む。
本明細書で使用される場合、「実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲ」又は「実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲ対」という用語は、全長にわたって逆相補配列を有する両野生型ＩＴＲである合成ＡＡＶベクター内の一対のＷＴ－ＩＴＲを指す。例えば、変化が配列の物理的及び機能的特性並びに全体的な三次元構造（二次元及び三次元構造体）に影響を及ぼさない限り、天然に存在する正準配列から逸脱する１つ以上のヌクレオチドを有する場合でも、ＩＴＲが野生型の配列であるとみなすことができる。いくつかの態様では、逸脱するヌクレオチドは、保存的配列変化を表す。非限定的な一例として、配列は、正準配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性（例えば、デフォルト設定でＢＬＡＳＴを使用して測定される）を有し、またそれらの三次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、他のＷＴ－ＩＴＲに対して対称な三次元空間構成を有する。実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲは、三次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’ループを有する。実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲは、適切なＲｅｐタンパク質と対合する操作可能なＲｅｐ結合部位（ＲＢＥ又はＲＢＥ’）及び末端分解部位（ｔｒｓ）を有することを決定することによって、ＷＴとして機能的に確認することができる。任意に、許容条件下での導入遺伝子発現を含む他の機能を試験することができる。
本明細書で使用される場合、「修飾型ＩＴＲ」又は「ｍｏｄ－ＩＴＲ」又は「変異体ＩＴＲ」の語句は、交換可能に使用され、同じ血清型からのＷＴ－ＩＴＲと比較して、少なくとも１つ以上のヌクレオチドに変異を有するＩＴＲを指す。変異は、同じ血清型のＷＴ－ＩＴＲの三次元空間構成と比較して、ＩＴＲのＡ、Ｃ、Ｃ’、Ｂ、Ｂ’領域のうちの１つ以上の変化をもたらし得、三次元空間構成（すなわち、幾何学的空間におけるその三次元構造）の変化をもたらし得る。
本明細書で使用される場合、「非対称ＩＴＲ対」とも称される「非対称ＩＴＲ」という用語は、全長にわたって逆相補ではない一本鎖合成ＡＡＶゲノム内のＩＴＲの対を指す。非限定的な一例として、非対称ＩＴＲ対は、それらの三次元構造が、幾何学的空間において異なる形状であるように、それらの同族ＩＴＲに対して対称の三次元空間構成を有しない。言い換えると、非対称のＩＴＲ対は、全体的な幾何学的構造が異なり、すなわち、三次元空間でのそれらのＡ、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’ループの構成が異なる（例えば、同族ＩＴＲと比較して、１つのＩＴＲは、短いＣ－Ｃ’アーム及び／又は短いＢ－Ｂ’アームを有し得る）。２つのＩＴＲ間の配列の相違は、１つ以上のヌクレオチド付加、欠失、切断、又は点変異に起因し得る。一実施形態では、非対称ＩＴＲ対の一方のＩＴＲは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列であり得、他方のＩＴＲは、本明細書で定義される修飾型ＩＴＲ（例えば、非野生型又は合成ＩＴＲ配列）であり得る。別の実施形態では、非対称ＩＴＲ対のどちらのＩＴＲも野生型ＡＡＶ配列ではなく、２つのＩＴＲは、幾何学的空間において異なる形状（すなわち、異なる全体的な幾何学的構造）を有する修飾型ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、非対称ＩＴＲ対の一方のｍｏｄ－ＩＴＲは、短いＣ－Ｃ’アームを有することができ、他方のＩＴＲは、それらが同族の非対称ｍｏｄ－ＩＴＲと比較して、異なる三次元空間構成を有するように異なる修飾（例えば、単一アーム、又は短いＢ－Ｂ’アームなど）を有し得る。
本明細書で使用される場合、「対称ＩＴＲ」という用語は、野生型又は変異型（例えば、野生型に対して修飾型）ディペンドウイルスＩＴＲ配列であり、かつそれらの全長にわたって逆相補である、一本鎖ＡＡＶゲノム内の一対のＩＴＲを指す。非限定的な一例において、両ＩＴＲは、ＡＡＶ２からの野生型ＩＴＲ配列である。別の例では、いずれのＩＴＲも野生型ＩＴＲ ＡＡＶ２配列ではなく（すなわち、それらは、修飾型ＩＴＲであり、変異体ＩＴＲとも称される）、ヌクレオチドの付加、欠失、置換、切断、又は点変異に起因して、野生型ＩＴＲとは配列が異なり得る。本明細書では便宜上、合成ＡＡＶベクター中の発現カセットに対して５’（その上流）に位置するＩＴＲは、「５’ＩＴＲ」又は「左ＩＴＲ」と称され、合成ＡＡＶベクター中の発現カセットに対して３’（その下流）に位置するＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」又は「右ＩＴＲ」と称される。
本明細書で使用される場合、「実質的に対称な修飾型ＩＴＲ」又は「実質的に対称なｍｏｄ－ＩＴＲ対」という用語は、両方がそれらの全長にわたって逆相補配列を有する合成ＡＡＶ内の一対の修飾型ＩＴＲを指す。例えば、修飾型ＩＴＲは、変化が特性及び全体的な形状に影響を及ぼさない限り、逆相補配列から逸脱するいくつかのヌクレオチド配列がある場合でも、実質的に対称とみなすことができる。非限定的な一例として、配列は、正準配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性（デフォルト設定でＢＬＡＳＴを使用して測定される）を有し、またそれらの三次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、それらの同族の修飾型ＩＴＲに対して対称な三次元空間構成を有する。言い換えると、実質的に対称な修飾型ＩＴＲ対は、三次元空間に構成された同じＡ、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’ループを有する。いくつかの実施形態では、ｍｏｄ－ＩＴＲ対からのＩＴＲは、異なる逆相補ヌクレオチド配列を有し得るが、依然として同じ対称な三次元空間構成を有し得る。すなわち、両方のＩＴＲは、同じ全体的な三次元形状をもたらす変異を有する。例えば、ｍｏｄ－ＩＴＲ対の１つのＩＴＲ（例えば、５’ＩＴＲ）は、１つの血清型に由来し得、他方のＩＴＲ（例えば、３’ＩＴＲ）は、異なる血清型に由来し得るが、両方が同じ対応する変異を有し得（例えば、５’ＩＴＲがＣ領域に欠失を有する場合、異なる血清型の同族の修飾型３’ＩＴＲは、Ｃ’領域の対応する位置に欠失を有する）、それにより修飾型ＩＴＲ対が同じ対称な三次元空間構成を有する。そのような実施形態では、修飾型ＩＴＲ対の各ＩＴＲは、ＡＡＶ２及びＡＡＶ６の組み合わせなどの異なる血清型（例えば、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２）に由来し得、１つのＩＴＲの修飾は、異なる血清型の同族のＩＴＲの対応する位置に反映される。一実施形態では、実質的に対称な修飾型ＩＴＲ対は、ＩＴＲ間のヌクレオチド配列の相違が特性又は全体的な形状に影響を及ぼさず、それらが三次元空間で実質的に同じ形状を有する限り、一対の修飾型ＩＴＲ（ｍｏｄ－ＩＴＲ）を指す。非限定的な例として、ｍｏｄ－ＩＴＲは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）又はデフォルト設定のＢＬＡＳＴＮなどの当該技術分野において周知の標準的な手段によって決定される、正準ｍｏｄ－ＩＴＲに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有し、またそれらの三次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、対称な三次元空間構成を有する。実質的に対称なｍｏｄ－ＩＴＲ対は、三次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’及びＢ－Ｂ’ループを有する。例えば、実質的に対称なｍｏｄ－ＩＴＲ対の修飾型ＩＴＲがＣ－Ｃ’アームの欠失を有する場合、同族のｍｏｄ－ＩＴＲは、Ｃ－Ｃ’ループの対応する欠失を有し、またその同族のｍｏｄ－ＩＴＲの幾何学的空間に同じ形状の残りのＡ及びＢ－Ｂ’ループの同様の三次元構造を有する。
本明細書で使用される場合、活性剤又は治療用核酸などの治療剤の「有効量」又は「治療有効量」という語句は、治療用核酸の不在下で検出された発現レベルと比較して、所望の効果、例えば、標的配列の発現の阻害をもたらすのに十分な量である。標的遺伝子又は標的配列の発現を測定するための好適なアッセイは、例えば、ドットブロット、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、酵素機能、同様に当業者に既知の表現型アッセイなどの、当業者に既知の技法を使用するタンパク質又はＲＮＡレベルの検査を含む。
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、ＲＮＡ及びタンパク質、また必要に応じて、例えば、転写、転写処理、翻訳及びタンパク質の折りたたみ、修飾及び処理を含むがこれらに限定されない分泌タンパク質の産生に関与する細胞プロセスを指すことを意味する。本明細書で使用される場合、「発現産物」という語句は、遺伝子（例えば、導入遺伝子）から転写されたＲＮＡ、及び遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳によって得られたポリペプチドを含む。
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、ベクター上の転写調節配列に連結された配列からのＲＮＡ又はポリペプチドの発現を指示するベクターを指すことを意味する。発現される配列は、多くの場合、宿主細胞に対して異種であるが、必ずしもそうではない。発現ベクターは、追加のエレメントを含むことができ、例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有することができるため、それを２つの生物、例えば発現の場合はヒト細胞、並びにクローニング及び増幅の場合は原核生物宿主で維持することができる。発現ベクターは、組換えベクターであってもよい。
本明細書で使用される場合、「隣接する」という用語は、別の核酸配列に対するある核酸配列の相対位置を指すことを意味する。一般に、配列ＡＢＣでは、Ｂの両側にＡ及びＣが隣接している。配置Ａ×Ｂ×Ｃについても同様である。したがって、隣接する配列は、隣接される配列の前又は後に続くが、隣接される配列と連続している、又はすぐ隣である必要はない。
本明細書で使用される場合、「スペーサー領域」という用語は、ベクター又はゲノム内の機能的エレメントを分離する介在配列を指すことを意味する。いくつかの実施形態では、スペーサー領域は、最適機能性のため所望の距離で２つの機能エレメントを保持する。いくつかの実施形態では、スペーサー領域は、ベクター又はゲノムの遺伝的安定性を提供するか、又は増大させる。いくつかの実施形態では、スペーサー領域は、クローニング部位及び塩基対の設計番号のギャップに便利な位置を提供することによって、ゲノムの容易な遺伝子操作を促進する。
本明細書で使用される場合、「発現カセット」及び「発現ユニット」という用語は、交換可能に使用され、ＤＮＡベクター、例えば、合成ＡＡＶベクターの導入遺伝子の転写を指示するのに十分なプロモーター又は他のＤＮＡ調節配列に操作可能に連結される異種ＤＮＡ配列を指すことを意味する。好適なプロモーターには、例えば、組織特異的プロモーターが含まれる。プロモーターは、ＡＡＶ起源でもあり得る。
本明細書で使用される場合、「遺伝性疾患」又は「遺伝性障害」という語句は、ゲノム中の１つ以上の異常、特に出生時から存在する状態によって部分的又は完全に、直接的又は間接的に引き起こされる疾患を指すことを意味する。異常は、遺伝子における変異、挿入、又は欠失であり得る。異常は、遺伝子のコード配列又はその調節配列に影響を与える可能性がある。
本明細書で使用される場合、「脂質」という用語は、脂肪酸のエステルを含むがこれらに限定されない有機化合物群を指すことを意味し、水に不溶であるが、多くの有機溶媒に可溶であることを特徴とする。脂質は通常、少なくとも３つのクラスに分類される：（１）脂肪及び油並びにワックスを含む「単純脂質」、（２）リン脂質及び糖脂質を含む「複合脂質」、（３）ステロイドなどの「誘導脂質」。
リン脂質の代表的な例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、及びジリノレオイルホスファチジルコリンが含まれるが、これらに限定されない。スフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、及びβ－アシルオキシ酸など、リンを欠く他の化合物も両親媒性脂質と呼ばれる群に含まれる。追加的に、上記の両親媒性脂質は、トリグリセリド及びステロールを含む他の脂質と混合することができる。
一実施形態では、脂質組成物は、１つ以上の三級アミノ基、１つ以上のフェニルエステル結合、及びジスルフィド結合を含む。
本明細書で使用される場合、「脂質コンジュゲート」という用語は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の凝集を阻害するコンジュゲートされた脂質を指すことを意味する。そのような脂質コンジュゲートには、例えば、ジアルキルオキシプロピルと共役したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＡ複合体）、ジアシルグリセロールと共役したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＧ複合体）、コレステロールと共役したＰＥＧ、ホスファチジルエタノールアミンと共役したＰＥＧ、及びセラミドと共役したＰＥＧ（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号を参照）などのＰＥＧ－脂質複合体、カチオン性ＰＥＧ脂質、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質複合体（例えば、ＰＯＺ－ＤＡＡ複合体、例えば、２０１０年１月１３日出願の米国仮出願第６１／２９４，８２８号、及び２０１０年１月１４日出願の米国仮出願第６１／２９５，１４０号）、ポリアミドオリゴマー（例えば、ＡＴＴＡ－脂質複合体）、及びそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。ＰＯＺ－脂質コンジュゲートの追加例は、国際特許出願公開第２０１０／００６２８２号に記載されている。ＰＥＧ又はＰＯＺは、脂質に直接コンジュゲートするか、リンカー部分を介して脂質に結合することができる。例えば、非エステル含有リンカー部分及びエステル含有リンカー部分を含む、ＰＥＧ又はＰＯＺを脂質に結合するのに好適な任意のリンカー部分を使用することができる。ある特定の好ましい実施形態では、アミド又はカルバメートなどの非エステル含有リンカー部分が使用される。上記の各特許文書の開示内容は、あらゆる目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「脂質で封入する」という用語は、核酸（例えば、ｃｅＤＮＡ）などの活性剤又は治療剤を、完全封入、部分封入、又はその両方で提供する脂質粒子を指すことを意味する。好ましい実施形態では、核酸は脂質粒子内に完全に封入される（例えば、核酸を含有する脂質粒子を形成するため）。
本明細書で使用される場合、「脂質粒子」又は「脂質ナノ粒子」という用語は、核酸治療薬などの治療剤を目的の標的部位（例えば、細胞、組織、器官など）に送達するために使用され得る脂質製剤を指すことを意味する。一実施形態では、本開示の脂質粒子は核酸含有脂質粒子であり、これは典型的にはカチオン性脂質、非カチオン性脂質、及び任意に粒子の凝集を防止するコンジュゲートされた脂質から形成される。他の好ましい実施形態では、治療用核酸などの治療剤を粒子の脂質部分に封入し、それにより酵素分解から保護することができる。一実施形態では、脂質粒子は、核酸（例えば、ｃｅＤＮＡ）と、１つ以上の三級アミノ基、１つ以上のフェニルエステル結合及びジスルフィド結合を含む脂質とを含む。
いくつかの実施形態によれば、本開示の脂質粒子は、典型的には、約２０ｎｍ～約７５ｎｍ、約２０ｎｍ～約７０ｎｍ、約２５ｎｍ～約７５ｎｍ、約２５ｎｍ～約７０ｎｍ、約３０ｎｍ～約７５ｎｍ、約３０ｎｍ～約７０ｎｍ、約３５ｎｍ～約７５ｎｍ、約３５ｎｍ～約７０ｎｍ、約４０ｎｍ～約７５ｎｍ、約４０ｎｍ～約７０ｎｍ、約４５ｎｍ～約７５ｎｍ、約５０ｎｍ～約７５ｎｍ、約５０ｎｍ～約７０ｎｍ、約６０ｎｍ～約７５ｎｍ、約６０ｎｍ～約７０ｎｍ、約６５ｎｍ～約７５ｎｍ、約６５ｎｍ～約７０ｎｍ、又は約２０ｎｍ、約２５ｎｍ、約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、約５０ｎｍ、約５１ｎｍ、約５２ｎｍ、約５３ｎｍ、約５４ｎｍ、約５５ｎｍ、約５６ｎｍ、約５７ｎｍ、約５８ｎｍ、約５９ｎｍ約６０ｎｍ、約６１ｎｍ、約６２ｎｍ、約６３ｎｍ、約６４ｎｍ、約６５ｎｍ、約６６ｎｍ、約６７ｎｍ、約６８ｎｍ、約６９ｎｍ、約７０ｎｍ、約７１ｎｍ、約７２ｎｍ、約７３ｎｍ、約７４ｎｍ、又は約７５ｎｍ（±３ｎｍ）のサイズの平均直径を有する。
一般に、本開示の脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、意図した治療効果を提供するように選択された平均直径を有する。
いくつかの実施形態によれば、本開示の脂質粒子は、典型的には、約７５ｎｍ未満、約７０ｎｍ未満、約６５ｎｍ未満、約６０ｎｍ未満、約５５ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約４５ｎｍ未満、約４０ｎｍ未満、約３５ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、約２５ｎｍ未満、約２０ｎｍ未満のサイズの平均直径を有する。
本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」という用語は、生理学的ｐＨで正に荷電する任意の脂質を指す。脂質粒子中のカチオン性脂質は、例えば、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジ－γ－リノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（γ－ＤＬｅｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、「ＳＳ切断可能な脂質」、又はそれらの混合物などの１つ以上のカチオン性脂質を含み得る。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質はまた、イオン化脂質、すなわち、イオン化カチオン性脂質である。本明細書に記載の全てのカチオン性脂質の対応する四級脂質（すなわち、カチオン性部分の窒素原子がプロトン化され、４つの置換基を有する）は、本開示の範囲内であると考えられる。本明細書に記載の任意のカチオン性脂質は、例えば、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）及びクロロホルム（ＣＨＣｌ３）中のクロロメタン（ＣＨ３Ｃｌ）で処理することにより、対応する四級脂質に変換することができる。
本明細書で使用される場合、「アニオン性脂質」という用語は、生理学的ｐＨで負に荷電するあらゆる脂質を指す。これらの脂質には、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ－ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ－グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リジルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、及び中性脂質と結合した他のアニオン性修飾基が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「疎水性脂質」という用語は、長鎖飽和及び不飽和脂肪族炭化水素基、並びに１つ以上の芳香族、脂環式、又は複素環式基で任意に置換された基を含むがこれらに限定されない無極性基を有する化合物を指す。好適な例には、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、Ｎ－Ｎ－ジアルキルアミノ、１，２－ジアシルオキシ－３－アミノプロパン、及び１，２－ジアルキル－３－アミノプロパンが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「イオン化脂質」という用語は、脂質が生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）以下で正に帯電し、第２のｐＨ、好ましくは生理学的ｐＨ以上で中性であるように、少なくとも１つのプロトン化可能又は脱プロトン化可能基を有する脂質、例えばカチオン性脂質を指すことを意味する。ｐＨの関数としてのプロトンの付加又は除去は平衡プロセスであり、荷電又は中性脂質への言及は優勢種の性質を指し、全ての脂質が荷電又は中性の形態で存在する必要はないことは、当業者によって理解されるであろう。一般に、イオン化脂質は、約４～約７の範囲のプロトン化可能な基のｐＫａを有する。いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、「切断可能な脂質」又は「ＳＳ切断可能な脂質」を含み得る。
本明細書で使用される場合、「中性脂質」という用語は、選択されたｐＨで非荷電又は中性の双性イオン形態のいずれかで存在する多くの脂質種のいずれかを指すことを意味する。生理学的ｐＨでは、そのような脂質には、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド、及びジアシルグリセロールが含まれる。
本明細書で使用される場合、「非カチオン性脂質」という用語は、任意の両親媒性脂質、及び任意の他の中性脂質又はアニオン性脂質を指すことを意味する。
本明細書で使用される場合、「切断可能な脂質」又は「ＳＳ切断可能な脂質」という用語は、ジスルフィド結合の切断可能な単位を含む脂質を指す。切断可能な脂質には、ｐＨ感受性の三級アミン及び自己分解性フェニルエステルを含む脂質様物質を含有する切断可能なジスルフィド結合（「ｓｓ」）が含まれ得る。例えば、ＳＳ切断可能な脂質は、ｓｓ－ＯＰ脂質（ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＰ）、ｓｓ－Ｍ脂質（ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－Ｍ）、ｓｓ－Ｅ脂質（ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－Ｅ）、ｓｓ－ＥＣ脂質（ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＥＣ）、ｓｓ－ＬＣ脂質（ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＬＣ）、ｓｓ－ＯＣ脂質（ＣＯＡＴＳＯＭＥ（登録商標）ＳＳ－ＯＣ）、及びｓｓ－ＰａｌｍＥ脂質（例えば、式Ｉ～ＩＶ参照）、又はＴｏｇａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ「Ａ ｈｅｐａｔｉｃ ｐＤＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｎ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ－ｓｃａｆｆｏｌｄ ｌｉｐｉｄ－ｌｉｋｅ ｍａｔｅｒｉａｌ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｉｄ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇ」２７９：２６２－２７０によって記載された脂質であり得る。切断可能な脂質の追加の例は、米国特許第９，７０８，６２８号及び米国特許第１０，３８５，０３０号に記載されており、これらの全内容は参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態では、切断可能な脂質は、酸性区画、例えば、膜不安定化のためのエンドソーム又はリソソーム、及び細胞質などの還元環境で切断され得るジスルフィド結合に応答する三級アミンを含む。一実施形態では、切断可能な脂質は、カチオン性脂質である。一実施形態では、切断可能な脂質は、イオン化カチオン性脂質である。切断可能な脂質は、本明細書でより詳細に記載されている。
本明細書で使用される場合、「有機脂質溶液」という用語は、全体又は一部に脂質を有する有機溶媒を含む組成物を指すことを意味する。
本明細書で使用される場合、「リポソーム」という用語は、水性外部から分離された内部水性体積を封入する球形構成で組み立てられた脂質分子を指すことを意味する。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療薬送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再位置付けすることによって作用して、薬物又は活性製剤成分を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、典型的には、リン脂質、特にホスファチジルコリン基を有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。
本明細書で使用される場合、「局所送達」という用語は、干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）などの活性剤の、生物内の標的部位への直接の送達を指すことを意味する。例えば、薬剤は、腫瘍などの疾患部位、又は炎症部位などの他の標的部位、又は肝臓、心臓、膵臓、腎臓などの標的器官への直接注射によって局所的に送達することができる。
本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、一本鎖又は二本鎖のいずれかの形態で少なくとも２つのヌクレオチド（すなわち、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）を含むポリマーを指すことを意味し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらのハイブリッドを含む。ＤＮＡは、例えば、アンチセンス分子、プラスミドＤＮＡ、ＤＮＡ－ＤＮＡ二重鎖、事前に凝縮されたＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ベクター（Ｐ１、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体ＤＮＡ、又はこれらのグループの誘導体及び組み合わせの形態であり得る。ＤＮＡは、ミニサークル、プラスミド、バクミド、ミニ遺伝子、ミニストリングＤＮＡ（直鎖状の共有結合的に閉じたＤＮＡベクター）、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ＣＥＬｉＤ又はｃｅＤＮＡ）、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡ、ダンベル型ＤＮＡ、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）－ベクター、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターの形態であり得る。ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、及びそれらの組み合わせの形態であり得る。核酸としては、既知のヌクレオチド類似体又は修飾型骨格残基若しくは連結を含有する核酸が挙げられ、これらは、合成、天然に存在する、及び天然に存在しないものであり、参照核酸と同様の結合特性を有する。そのような類似体及び／又は修飾残基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（モルホリノ）、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ（商標））、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。別途限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別途明記しない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的修飾型バリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補的配列、同様に、明示的に示された配列を暗黙的に包含する。
本明細書で使用される場合、「核酸治療」、「治療用核酸」及び「ＴＮＡ」という語句は、交換可能に使用され、疾患又は障害を治療するための治療剤の活性成分として核酸を使用する治療の任意のモダリティを指す。本明細書で使用される場合、これらの語句は、ＲＮＡベースの治療薬及びＤＮＡベースの治療薬を指す。ＲＮＡベースの治療剤の非限定的な例としては、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。ＤＮＡベースの治療薬の非限定的な例としては、ミニサークルＤＮＡ、ミニ遺伝子、ウイルスＤＮＡ（例えば、レンチウイルス若しくはＡＡＶゲノム）又は非ウイルスＤＮＡベクター、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ／ＣＥＬｉＤ）、プラスミド、バクミド、ＤＯＧＧＹＢＯＮＥ（商標）ＤＮＡベクター、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）－ベクター、非ウイルスミニストリングＤＮＡベクター（直鎖状の共有結合的に閉じたＤＮＡベクター）、又はダンベル型ＤＮＡ最小ベクター（「ダンベルＤＮＡ」）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース（ＤＮＡ）又はリボース（ＲＮＡ）、塩基、及びリン酸基を含む。ヌクレオチドは、リン酸基を介してともに連結している。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水又は水／油などのエマルジョン、及び様々なタイプの湿潤剤などの標準的な薬学的担体のいずれかを含む。この用語はまた、ヒトを含む動物での使用について、米国連邦政府の規制当局によって承認された、又は米国薬局方に列挙されている薬剤、並びに対象に重大な刺激を引き起こさず、投与された化合物の生物活性及び特性を損なわない担体又は希釈剤を包含する。
本明細書で使用される場合、「ギャップ」という用語は、本開示の合成ＤＮＡベクターの中断された部分を指すことを意味し、その他の二本鎖ｃｅＤＮＡには一本鎖ＤＮＡ部分のストレッチが作成される。ギャップは、二重鎖ＤＮＡの一本鎖の長さが１塩基対～１００塩基対の長さであり得る。本明細書に記載される方法によって設計及び作成された典型的なギャップ、及び当該方法によって生成された合成ベクターは、長さが、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、又は６０ｂｐの長さであり得る。本開示における例示的なギャップは、長さが１ｂｐ～１０ｂｐの長さ、１～２０ｂｐの長さ、１～３０ｂｐの長さであり得る。
本明細書で使用される場合、「ニック」という用語は、典型的には損傷又は酵素作用による一本鎖の隣接ヌクレオチド間にホスホジエステル結合がない二本鎖ＤＮＡ分子の不連続性を指す。１つ以上のニックは、ＤＮＡ複製中に鎖のねじれの解放を可能にし、ニックはまた、転写機構の結合を促進する役割を果たすと考えられていることが理解される。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、本開示による治療用核酸での予防的治療を含む治療が提供される、ヒト又は動物を指すことを意味する。通常、動物は、限定されないが、霊長類、齧歯類、飼育動物、又は狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、及びマカク、例えば、アカゲザルが挙げられるが、これらに限定されない。げっ歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、及びハムスターが挙げられる。飼育動物及び狩猟動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えば、飼いネコ、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、並びに魚、例えば、トラウト、ナマズ、及びサケが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される態様のある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類又はヒトである。対象は、男性又は女性であり得る。追加的に、対象は、幼児又は子供であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、新生児又は胎児対象であり得、例えば、対象は、子宮内に存在する。好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、又はウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、疾患及び障害の動物モデルを代表する対象として有利に使用され得る。加えて、本明細書に記載される方法及び組成物は、飼育動物及び／又はペットに使用され得る。ヒト対象は、任意の年齢、性別、人種、又は民族グループ、例えば、コーカサス人（白人）、アジア人、アフリカ人、黒人、アフリカ系アメリカ人、アフリカ系ヨーロッパ人、ラテンアメリカ系、中東系などであり得る。いくつかの実施形態では、対象は、臨床設定において患者又は他の対象であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、既に治療を受けている。いくつかの実施形態では、対象は、胚、胎児、新生児、幼児、子供、青年、又は成人である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト胎児、ヒト新生児、ヒト幼児、ヒト子供、ヒト青年、又はヒト成人である。いくつかの実施形態では、対象は、動物胚、又は非ヒト胚若しくは非ヒト霊長類胚である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト胚である。
本明細書で使用される場合、「必要とする対象」という句は、句の文脈及び使用法が別段の指示をしない限り、（ｉ）記載された本開示に従ってｃｅＤＮＡ脂質粒子（又はｃｅＤＮＡ脂質粒子を含む薬学的組成物）を投与される予定であるか、（ｉｉ）記載された本開示に従ってｃｅＤＮＡ脂質粒子（又はａｃｅＤＮＡ脂質粒子を含む薬学的組成物）を受けているか、又は（ｉｉｉ）記載された本開示に従ってｃｅＤＮＡ脂質粒子（又はｃｅＤＮＡ脂質粒子を含む薬学的組成物）を受けた、対象を指す。
本明細書で使用される場合、「抑制する」、「減少する」、「妨害する」、「阻害する」及び／又は「低減する」という用語（並びに同様の用語）は、一般に、天然、予想若しくは平均に対して、又は対照条件に対して、直接的又は間接的に、濃度、レベル、機能、活性、又は挙動を低減する行為を指す。
本明細書で使用される場合、「全身送達」という用語は、生物内での干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）などの活性剤の広範な生体内分布をもたらす脂質粒子の送達を指すことを意味する。投与技術によっては、特定の薬剤の全身送達にいたることもあれば、そうでないものもある。全身送達とは、有用な量、好ましくは治療量の薬剤が身体のほとんどの部分にさらされることを意味する。広範な生体内分布を得るには、一般に、薬剤が、投与部位より遠位の疾患部位に到達する前に（初回通過器官（肝臓、肺など）によって、又は急速な非特異的細胞結合によって）急速に分解又は排出されないような血液寿命が必要である。脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の全身送達は、例えば静脈内、皮下、及び腹腔内を含む、当該技術分野で既知の任意の手段によることができる。好ましい実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の全身送達は、静脈内送達による。
本明細書で使用される場合、活性剤（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡ脂質粒子）の「治療量」、「治療有効量」、「有効量」、又は「薬学的有効量」という用語は交換可能に使用され、治療の意図された利益を提供するのに十分な量を指す。しかしながら、投与量レベルは、傷害の種類、年齢、体重、性別、患者の病状、病状の重症度、投与経路、及び用いられる特定の活性剤を含む、多様な因子に基づく。したがって、投与計画は、大きく異なる可能性があるが、標準的な方法を使用して医師によって常套的に決定され得る。追加的に、「治療量」、「治療有効量」及び「薬学的有効量」という用語は、記載された本開示の組成物の予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）量を含む。記載された本開示の予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）用途において、薬学的組成物又は薬剤は、疾患、障害又は状態の生化学的、組織学的及び／又は行動症状、その合併症、並びに疾患、障害又は状態の発症中に現れる中間の病理学的表現型を含む、疾患、障害又は状態に罹患しやすい患者、又はそうでなければそのリスクがある患者に、リスクを排除若しくは低減するか、重症度を減少させるか、又は疾患、障害若しくは状態の発症を遅らせるのに十分な量で投与される。いくつかの医学的判断によれば、最大用量、すなわち最高の安全用量を使用することが一般に好ましい。「用量」及び「投与量」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。
本明細書で使用される場合、「治療効果」という用語は、治療の結果を指し、その結果は、望ましくかつ有益であると判断される。治療効果としては、直接的又は間接的に、疾患症状の阻止、低減、又は排除を挙げることができる。治療効果としてはまた、直接的又は間接的に、疾患症状の進行の阻止、低減、又は排除を挙げることができる。
本明細書に記載される任意の治療剤について、治療有効量は、予備的なインビトロ研究及び／又は動物モデルから最初に決定することができる。治療有効用量はまた、ヒトのデータから決定することができる。適用される用量は、投与される化合物の相対的な生物学的利用能及び効力に基づいて調整することができる。上記の方法及び他の周知の方法に基づいて最大の効力を達成するように用量を調整することは、当業者の能力の範囲内である。参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（２００１）の第１章に見出され得る治療有効性を決定するための一般原則を以下に要約する。
薬物動態学的原理は、許容できない副作用を最小限に抑えながら、望ましい程度の治療効果を得るために投与計画を変更するための基礎を提供する。薬物の血漿濃度を測定でき、治療濃度域に関連している状況では、投与量の変更に関する追加のガイダンスを入手することができる。
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、及び／又は「治療」という用語は、状態の進行を抑制する、実質的に阻害する、遅らせる、若しくは逆転させる、状態の臨床症状を実質的に改善する、又は状態の臨床症状の出現を実質的に防ぐ、有益な若しくは望ましい臨床結果を得ることを含む。治療することは、（ａ）障害の重症度を低減すること、（ｂ）治療されている障害に特徴的な症状の発症を限定すること、（ｃ）治療されている障害に特徴的な症状の悪化を限定すること、（ｄ）以前に障害を有していた患者における障害の再発を限定すること、及び（ｅ）以前は障害に関して無症候性であった患者の症状の再発を限定することのうちの１つ以上を達成することを更に指す。
薬理学的及び／又は生理学的効果などの有益な又は所望の臨床結果は、疾患、障害又は状態の素因を有する可能性があるが、疾患の症状をまだ経験していないか、若しくは呈していない対象において疾患、障害又は状態が発生するのを防ぐこと（予防的治療）、疾患、障害又は状態の症状の緩和、疾患、障害又は状態の程度の減少、疾患、障害又は状態の安定化（すなわち、悪化させない）、疾患、障害又は状態の蔓延を防ぐこと、疾患、障害又は状態の進行を遅らせる又は遅くすること、疾患、障害又は状態の改善又は軽減、及びそれらの組み合わせ、同様に治療を受けていない場合に予想される生存と比較して生存を延長することを含むが、これらに限定されない。
薬理学的及び／又は生理学的効果などの有益な又は所望の臨床結果は、疾患、障害又は状態の素因を有する可能性があるが、疾患の症状をまだ経験していないか、若しくは呈していない対象において疾患、障害又は状態が発生するのを防ぐこと（予防的治療）、疾患、障害又は状態の症状の緩和、疾患、障害又は状態の程度の減少、疾患、障害又は状態の安定化（すなわち、悪化させない）、疾患、障害又は状態の蔓延を防ぐこと、疾患、障害又は状態の進行を遅らせる又は遅くすること、疾患、障害又は状態の改善又は軽減、及びそれらの組み合わせ、同様に治療を受けていない場合に予想される生存と比較して生存を延長することを含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、１～２０個の炭素原子の飽和一価炭化水素ラジカル（すなわち、Ｃ１～２０アルキル）を指す。「一価」とは、アルキルが分子の残りの部分に１つの結合点を有していることを意味する。一実施形態では、アルキルは、１～１２個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～１２アルキル）、又は１～１０個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～１０アルキル）を有する。一実施形態では、アルキルは、１～８個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～８アルキル）、１～７個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～７アルキル）、１～６個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～６アルキル）、１～４個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～４アルキル）、又は１～３個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～３アルキル）を有する。例としては、メチル、エチル、１－プロピル、２－プロピル、１－ブチル、２－メチル－１－プロピル、２－ブチル、２－メチル－２－プロピル、１－ペンチル、２－ペンチル、３－ペンチル、２－メチル－２－ブチル、３－メチル－２－ブチル、３－メチル－１－ブチル、２－メチル－１－ブチル、１－ヘキシル、２－ヘキシル、３－ヘキシル、２－メチル－２－ペンチル、３－メチル－２－ペンチル、４－メチル－２－ペンチル、３－メチル－３－ペンチル、２－メチル－３－ペンチル、２，３－ジメチル－２－ブチル、３，３－ジメチル－２－ブチル、１－ヘプチル、１－オクチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。「直鎖又は分岐鎖Ｃ１～６アルキル」、「直鎖又は分岐鎖Ｃ１～４アルキル」、又は「直鎖又は分岐鎖Ｃ１～３アルキル」などの直鎖又は分岐鎖アルキルは、飽和一価炭化水素ラジカルが直鎖又は分岐鎖であることを意味する。
本明細書で使用される「アルキレン」という用語は、１～２０個の炭素原子の飽和二価炭化水素ラジカル（すなわち、Ｃ１～２０アルキレン）を指し、その例には、上に例示したようなアルキル基の同じコア構造を有するものが挙げられるが、それらに限定されない。「二価」とは、アルキレンが分子の残りの部分に２つの結合点を有していることを意味する。一実施形態では、アルキレンは、１～１２個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～１２アルキレン）、又は１～１０個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～１０アルキレン）を有する。一実施形態では、アルキレンは、１～８個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～８アルキレン）、１～７個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～７アルキレン）、１～６個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～６アルキレン）、１～４個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～４アルキレン）、又は１～３個の炭素原子（すなわち、Ｃ１～３アルキレン）を有し、エチレン、又はメチレンである。「直鎖又は分岐鎖Ｃ１～６アルキレン」、「直鎖又は分岐鎖Ｃ１～４アルキレン」、又は「直鎖又は分岐鎖Ｃ１～３アルキレン」などの直鎖又は分岐鎖アルキレンは、飽和二価炭化水素ラジカルが直鎖又は分岐鎖であることを意味する。
「アルケニル」という用語は、１つ以上（例えば、１つ又は２つ）の炭素－炭素二重結合を有する直鎖又は分岐脂肪族炭化水素基を指し、アルケニル基は、「シス」及び「トランス」配向、又は別の命名法による、「Ｅ」及び「Ｚ」配向を有する基を含む。
本明細書で使用される「アルケニレン」は、１つ又は２つの炭素－炭素二重結合を有する２～２０個の炭素原子の脂肪族二価炭化水素ラジカル（すなわち、Ｃ２～２０アルケニレン）を指し、ここで、アルケニレンラジカルは、「シス」及び「トランス」配向又は別の命名法による、「Ｅ」及び「Ｚ］配向を有するラジカルを含む。「二価」とは、アルキレンが分子の残りの部分に２つの結合点を有していることを意味する。一実施形態では、アルケニレンは、２～１２個の炭素原子（すなわち、Ｃ２～１６アルケニレン）、又は２～１０個の炭素原子（すなわち、Ｃ２～１０アルケニレン）を有する。一実施形態では、アルケニレンは２～４個の炭素原子（Ｃ２～４）を有する。例としては、エチレニレン又はビニレン（－ＣＨ＝ＣＨ－）、アリル（－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ－）などが挙げられるが、これらに限定されない。「直鎖又は分岐鎖Ｃ２～６アルケニレン」、「直鎖又は分岐鎖Ｃ２～４アルケニレン」、又は「直鎖又は分岐鎖Ｃ２～３アルケニレン」などの直鎖又は分岐鎖アルケニレンは、不飽和二価炭化水素ラジカルが直鎖又は分岐鎖であることを意味する。
本明細書で使用される「シクロアルキレン」は、単環式環として３～１２個の炭素原子、又は二環式環として７～１２個の炭素原子を有する二価飽和炭素環式環ラジカルを指す。「二価」は、シクロアルキレンが分子の残りの部分に２つの結合点を有していることを意味する。一実施形態では、シクロアルキレンは、３員～７員の単環式又は３員～６員の単環式である。単環式シクロアルキル基の例としては、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレン、シクロヘプチレン、シクロオクチレン、シクロノニレン、シクロデシレン、シクロウンデシレン、シクロドデシレンなどが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、シクロアルキレンはシクロプロピレンである。
「複素環」、「ヘテロシクリル」、複素環式及び「複素環式環」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、少なくとも１個のＮ原子を含有し、ヘテロ原子、並びに任意にＮ及びＳから選択される１～３個の追加のヘテロ原子を有し、非芳香族である（すなわち、部分的又は完全に飽和している）環状基を指す。単環式又は二環式（架橋若しくは融合）にすることができる。複素環式環の例としては、アジリジニル、ジアジリジニル、チアジリジニル、アゼチジニル、ジアゼチジニル、トリアゼチジニル、チアジアゼチジニル、チアゼチジニル、ピロリジニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イソチアゾリジニル、チアゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ヘキサヒドロピリミジニル、アゼパニル、アゾカニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。複素環は、１～４個のヘテロ原子を含み、これは、Ｎ及びＳから選択され、同じであっても異なっていてもよい。一実施形態では、複素環は、１～３個のＮ原子を含有する。別の実施形態では、複素環は、１個又は２個のＮ原子を含有する。別の実施形態では、複素環は、１個のＮ原子を含有する。「４員～８員のヘテロシクリル」とは、単環式環に配置された４～８個の原子（Ｎ及びＳから選択される１～４個のヘテロ原子、又は１～３個のＮ原子、又は１個若しくは２個のＮ原子、又は１個のＮ原子を含む）を有するラジカルを意味する。「５員又は６員のヘテロシクリル」とは、単環式環に配置された５又は６個の原子（Ｎ及びＳから選択される１～４個のヘテロ原子、又は１～３個のＮ原子、又は１個若しくは２個のＮ原子、又は１個のＮ原子を含む）を有するラジカルを意味する。「複素環」という用語は、考えられる全ての異性体形態を含むことを意図している。複素環は、Ｌｅｏ Ａ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６８）、特に第１、３、４、６、７、及び９章、Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ａ Ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９５０から現在まで）、特に第１３巻、１４巻、１６巻、１９巻、及び２８巻、並びにＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９６０）８２：５５６６に記載されている。ヘテロシクリル基は、可能であれば、分子の残りの部分に結合した炭素（炭素結合）又は窒素（窒素結合）であり得る。
基が「任意に置換されている」と記載されている場合、その基は（１）置換されていないか、又は（２）置換されている場合がある。基の炭素が置換基のリストのうちの１つ以上で任意に置換されていると記載されている場合、炭素上水素原子のうちの１つ以上（存在する範囲で）を、独立して選択された任意の置換基で別々に及び／又は一緒に置き換えることができる。
アルキル、アルキレン、アルケニレン、シクロアルキレン、及びヘテロシクリルに好適な置換基は、二官能性化合物の生物学的活性に著しく悪影響を及ぼさないものである。特に明記しない限り、これらの基について例示的な置換基としては、１～１０個の炭素原子を有する直鎖、分岐鎖若しくは環状アルキル、アルケニル又はアルキニル；アリール；ヘテロアリール；ヘテロシクリル；ハロゲン；グアニジニウム［－ＮＨ（Ｃ＝ＮＨ）ＮＨ２］；－ＯＲ１００；ＮＲ１０１Ｒ１０２；－ＮＯ２；－ＮＲ１０１ＣＯＲ１０２；－ＳＲ１００；－ＳＯＲ１０１によって表されるスルホキシド；－ＳＯ２Ｒ１０１によって表されるスルホン、スルホネート－ＳＯ３Ｍ；サルフェート－ＯＳＯ３Ｍ；－ＳＯ２ＮＲ１０１Ｒ１０２によって表されるスルホンアミド；シアノ；アジド；－ＣＯＲ１０１；－ＯＣＯＲ１０１；－ＯＣＯＮＲ１０１Ｒ１０２及びポリエチレングリコール単位（－ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＲ１０１が挙げられ、ここで、Ｍは、Ｈ又はカチオン（Ｎａ＋又はＫ＋など）であり、Ｒ１０１、Ｒ１０２及びＲ１０３は各々独立して、Ｈ；１～１０個の炭素原子を有する直鎖、分岐鎖若しくは環状アルキル、アルケニル又はアルキニル；ポリエチレングリコール単位（－ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎ－Ｒ１０４（ｎは、１～２４の整数であり）；６～１０個の炭素原子を有するアリール；３～１０個の炭素原子を有する複素環式環；及び５～１０個の炭素原子を有するヘテロアリールから選択され、Ｒ１０４は、Ｈ又は１～４個の炭素原子を有する直鎖若しくは分岐鎖アルキルであり、Ｒ１００、Ｒ１０１、Ｒ１０２、Ｒ１０３及びＲ１０４によって表される基中のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール及びヘテロシクルシルは、ハロゲン、－ＯＨ、－ＣＮ、－ＮＯ２、及び１～４個の炭素原子を有する非置換の直鎖又は分岐鎖アルキルから独立して選択される１つ以上（例えば、２、３、４、５、６又はそれ以上）の置換基で任意に置換される。好ましくは、上記の任意に置換されたアルキル、アルキレン、アルケニレン、シクロアルキレン、及びヘテロシクリルについての置換基は、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＲ１０１Ｒ１０２、－ＣＦ３、－ＯＲ１００、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、－ＳＲ１０１、－ＳＯＲ１０１、－ＳＯ２Ｒ１０１、及び－ＳＯ３Ｍからなる群から選択される。代替的に、好適な置換基は、ハロゲン、－ＯＨ、－ＮＯ２、－ＣＮ、Ｃ１～４アルキル、－ＯＲ１００、ＮＲ１０１Ｒ１０２、－ＮＲ１０１ＣＯＲ１０２、－ＳＲ１００、－ＳＯ２Ｒ１０１、－ＳＯ２ＮＲ１０１Ｒ１０２、－ＣＯＲ１０１、－ＯＣＯＲ１０１、及び－ＯＣＯＮＲ１０１Ｒ１０２からなる群から選択され、Ｒ１００、Ｒ１０１及びＲ１０２は、各々独立して－Ｈ又はＣ１～４アルキルである。
本明細書で使用される「ハロゲン」は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩを指す。「シアノ」は、－ＣＮである。
本明細書で交換可能に使用される「アミン」又は「アミノ」は、孤立電子対を有する塩基性窒素原子を含有する官能基を指す。
本明細書で使用される「薬学的に許容される塩」という用語は、本開示のイオン化脂質の薬学的に許容される有機又は無機の塩を指す。例示的な塩としては、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酸性酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、糖酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩「メシレート」、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、パモエート（すなわち、１，１’－メチレン－ビス－（２－ヒドロキシ－３－ナフトエート））塩、アルカリ金属（例えば、ナトリウム及びカリウム）塩、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）塩、及びアンモニウム塩が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩は、酢酸イオン、コハク酸イオン又は他の対イオンなどの別の分子の包含を含み得る。対イオンは、親化合物の電荷を安定化させる任意の有機又は無機部分であり得る。更に、薬学的に許容される塩は、その構造中に２つ以上の荷電原子を有し得る。複数の荷電原子が薬学的に許容される塩の一部である場合、複数の対イオンを有することができる。したがって、薬学的に許容される塩は、１つ以上の荷電原子及び／又は１つ以上の対イオンを有することができる。
本明細書に開示される代替的な要素又は実施形態のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各郡のメンバーは、個別に、又は群の他のメンバー又は本明細書で見られる他のエレメントとの任意の組み合わせで参照及び主張することができる。群の１つ以上のメンバーは、利便性及び／又は特許性の理由から、群に含まれるか、又は群から削除することができる。そのような任意の包含又は削除が発生した場合、本明細書では、明細書が修正されたグループを含むとみなされ、したがって添付の特許請求の範囲で使用されている全てのマーカッシュグループの記述を満たす。
態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載される開示は、人間のクローン化プロセス、人間の生殖細胞系列の遺伝的同一性を修正するプロセス、産業若しくは商業目的でのヒト胚の使用、又は人間若しくは動物にいかなる実質的な医学的利益ももたらすことなく苦しみを引き起こす可能性が高い動物、及びそのようなプロセスから生じる動物の遺伝的同一性を修正するためのプロセスに関係しない。
本明細書では、本開示の様々な態様の説明内で他の用語が定義されている。
文献参照、発行済み特許、公開済みの特許出願、及び係属中の特許出願を含む、本出願を通して引用される全ての特許及び他の出版物は、例えば、本明細書に記載される技術に関連して使用され得るそのような刊行物に記載される方法論を説明及び開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの出版物は、本出願の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供されている。この点に関するいかなるものも、発明者が先行する開示のおかげで、又はいかなる他の理由のためにもそのような開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。日付に関する全ての記述又はこれらの文書の内容に関する表現は、出願人が入手できる情報に基づいており、これらの文書の日付又は内容の正確さに関するいかなる承認も構成するものではない。
本開示の実施形態の説明は、網羅的であること、又は本開示を開示された正確な形態に限定することを意図したものではない。本開示の特定の実施形態及び実施例が、例示の目的で本明細書で説明されているが、当業者が認識するように、本開示の範囲内で様々な同等の修正が可能である。例えば、方法のステップ又は機能は、所与の順序で提示されるが、代替的な実施形態は、異なる順序で機能を実施してもよく、又は機能は実質的に同時に実施されてもよい。本明細書で提供される開示の教示は、必要に応じて他の手順又は方法に適用することができる。本明細書に記載される様々な実施形態は、更なる実施形態を提供するために組み合わせることができる。本開示の態様は、必要に応じて、上記の参照文献及び出願の組成物、機能、及び概念を用いて本開示の更なる実施形態を提供するように修正することができる。更に、生物学的機能の同等性の考慮により、種類又は量の生物学的又は化学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造にいくつかの変更を加えることができる。詳細な説明に照らして、これらの変更及び他の変更を本開示に加えることができる。そのような修正は全て、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
前述の実施形態のいずれかの特定のエレメントは、他の実施形態のエレメントと組み合わせるか、又は置き換えることができる。更に、本開示のある特定の実施形態に関連する利点が、これらの実施形態の文脈で説明されたが、他の実施形態もそのような利点を示し得、全ての実施形態が本開示の範囲内にあるために必ずしもそのような利点を示す必要はない。
本明細書に記載される技術は、以下の実施例によって更に説明されており、決してこれらを更に限定するものと解釈されるべきではない。本開示は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬などにいかなる様式でも限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲を限定することを意図されない。
ＩＩ．脂質ナノ粒子組成物
本明細書で提供されるのは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む薬学的組成物であって、ＬＮＰは、脂質及び剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）を含み、ＬＮＰの平均直径は、約２０ｎｍ～約７０ｎｍである。本明細書に記載のＬＮＰは、大型の剛性治療用核酸分子を封入することができる小型化を含む、多数の治療上の利点を提供する。いくつかの実施形態によれば、脂質は、カチオン性脂質である。いくつかの実施形態によれば、剛性治療用核酸は、閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）である。いくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、非カチオン性脂質を更に含む。いくつかの実施形態によれば、ＬＮＰは、ステロール又はその誘導体を更に含む。いくつかの実施形態によれば、ＬＩＰは、脂質にコンジュゲートされたＰＥＧを更に含む。
カチオン性脂質
いくつかの実施形態では、２０～７４ｎｍの平均直径を有する脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、例えば、非融合性カチオン性脂質である。「非融合性カチオン性脂質」とは、ｃｅＤＮＡなどの核酸カーゴを凝縮及び／又は封入することができるが、融合性活性を有するか、又はほとんど有しないカチオン性脂質を意味する。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、以下の表１に列挙される国際及び米国特許出願公開に記載されており、例えば、膜不透過性蛍光色素排除アッセイ、例えば、本明細書の実施例セクションに記載されるアッセイによって測定されるように、非融合性であると決定される。以下の表１に列挙されたこれらの国際特許及び米国特許出願公開の全ての特許文書の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピルｌ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピルｌ－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＬＥＰＣ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＤＭＥＰＣ）、１，２－ジミリストレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（１４：１），Ｎ１－［２－（（１Ｓ）－１－［（３－アミノプロピル）アミノ］－４－［ジ（３－アミノ－プロピル）アミノルブチルカルボキサミドエチ１１－３，４－ジ［オレイルオキシ］－ベンズアミド（ＭＶＬ５）、ジオクタデシルアミド－グリシルペルミン（ＤＯＧＳ）、３ｂ－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロマイド（ＤＤＡＢ）、セント脂質（例えば、ＳＡＩＮＴ－２、Ｎ－メチ１－４－（ジオレイル）メチルピリジニウム）、１，２－ジミリスチルオキシプロピ１－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド（ＤＭＲＩＥ）、１，２－ジオレオイ１－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロマイド（ＤＯＲＩＥ）、１，２－ジオレオイルオキシプロピ１－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムクロリド（ＤＯＲＩ）、ジアルキル化アミノ酸（ＤＩＬＡ２）（例えば、Ｃ１８：１－ｎｏｒＡｒｇ－Ｃ１６）、ジオレイルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１－パルミトイ１－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＰＯＥＰＣ）、及び１，２－ジミリストレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－エチルホスホコリン（ＭＯＥＰＣ）からなる群から選択される。いくつかのバリエーションでは、縮合剤、例えばカチオン性脂質は、例えば、臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム（ＤＤＡＢ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイ１－４－（２ジメチルアミノエチル）－［１，３１－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ）、１，２－ジオレオイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２－ジオレイロキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、モルホリノコレステロール（Ｍｏ－ＣＨＯＬ）、（Ｒ）－５－（ジメチルアミノ）ペンタン－１，２－ジイ１ジオレエート塩酸塩（ＤＯＤＡＰｅｎ－Ｃ１）、（Ｒ）－５－グアニジノペンタン－１，２－ジイ１ジオレエート塩酸塩（ＤＯＰｅｎ－Ｇ）、（Ｒ）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチ１－４，５－ビス（オレオイルオキシ）ペンタン－１－アミニウムクロリド（ＤＯＴＡＰｅｎ）などの脂質である。いくつかの実施形態では、凝縮脂質は、ＤＯＴＡＰである。
イオン化脂質
いくつかの実施形態によれば、２０～７０ｎｍの平均直径を有するＬＮＰを含有する薬学的組成物も本明細書で提供され、ＬＮＰは、イオン化脂質及び非ウイルスベクター（例えば、ｃｅＤＮＡ）のような剛性治療用核酸を含む。そのようなＬＮＰは、例えば、カプシド不含非ウイルスＤＮＡベクターを目的の標的部位（例えば、細胞、組織、器官など）に送達するように使用され得る。
例示的なイオン化脂質は、国際ＰＣＴ特許公開第２０１５／０９５３４０号、同第２０１５／１９９９５２号、同第２０１８／０１１６３３号、同第２０１７／０４９２４５号、同第２０１５／０６１４６７号、同第２０１２／０４０１８４号、同第２０１２／０００１０４号、同第２０１５／０７４０８５号、同第２０１６／０８１０２９号、同第２０１７／００４１４３号、同第２０１７／０７５５３１号、同第２０１７／１１７５２８号、同第２０１１／０２２４６０号、同第２０１３／１４８５４１号、同第２０１３／１１６１２６号、同第２０１１／１５３１２０号、同第２０１２／０４４６３８号、同第２０１２／０５４３６５号、同第２０１１／０９０９６５号、同第２０１３／０１６０５８号、同第２０１２／１６２２１０号、同第２００８／０４２９７３号、同第２０１０／１２９７０９号、同第２０１０／１４４７４０号、同第２０１２／０９９７５５号、同第２０１３／０４９３２８号、同第２０１３／０８６３２２号、同第２０１３／０８６３７３号、同第２０１１／０７１８６０号、同第２００９／１３２１３１号、同第２０１０／０４８５３６号、同第２０１０／０８８５３７号、同第２０１０／０５４４０１号、同第２０１０／０５４４０６号、同第２０１０／０５４４０５号、同第２０１０／０５４３８４号、同第２０１２／０１６１８４号、同第２００９／０８６５５８号、同第２０１０／０４２８７７号、同第２０１１／０００１０６号、同第２０１１／０００１０７号、同第２００５／１２０１５２号、同第２０１１／１４１７０５号、同第２０１３／１２６８０３号、同第２００６／００７７１２号、同第２０１１／０３８１６０号、同第２００５／１２１３４８号、同第２０１１／０６６６５１号、同第２００９／１２７０６０号、同第２０１１／１４１７０４号、同第２００６／０６９７８２号、同第２０１２／０３１０４３号、同第２０１３／００６８２５号、同第２０１３／０３３５６３号、同第２０１３／０８９１５１号、同第２０１７／０９９８２３号、同第２０１５／０９５３４６号、及び同第２０１３／０８６３５４号、並びに米国特許公開第２０１６／０３１１７５９号、同第２０１５／０３７６１１５号、同第２０１６／０１５１２８４号、同第２０１７／０２１０６９７号、同第２０１５／０１４００７０号、同第２０１３／０１７８５４１号、同第２０１３／０３０３５８７号、同第２０１５／０１４１６７８号、同第２０１５／０２３９９２６号、同第２０１６／０３７６２２４号、同第２０１７／０１１９９０４号、同第２０１２／０１４９８９４号、同第２０１５／００５７３７３号、同第２０１３／００９０３７２号、同第２０１３／０２７４５２３号、同第２０１３／０２７４５０４号、同第２０１３／０２７４５０４号、同第２００９／００２３６７３号、同第２０１２／０１２８７６０号、同第２０１０／０３２４１２０号、同第２０１４／０２００２５７号、同第２０１５／０２０３４４６号、同第２０１８／０００５３６３号、同第２０１４／０３０８３０４号、同第２０１３／０３３８２１０号、同第２０１２／０１０１１４８号、同第２０１２／００２７７９６号、同第２０１２／００５８１４４号、同第２０１３／０３２３２６９号、同第２０１１／０１１７１２５号、同第２０１１／０２５６１７５号、同第２０１２／０２０２８７１号、同第２０１１／００７６３３５号、同第２００６／００８３７８０号、同第２０１３／０１２３３３８号、同第２０１５／００６４２４２号、同第２００６／００５１４０５号、同第２０１３／００６５９３９号、同第２００６／０００８９１０号、同第２００３／００２２６４９号、同第２０１０／０１３０５８８号、同第２０１３／０１１６３０７号、同第２０１０／００６２９６７号、同第２０１３／０２０２６８４号、同第２０１４／０１４１０７０号、同第２０１４／０２５５４７２号、同第２０１４／００３９０３２号、同第２０１８／００２８６６４号、同第２０１６／０３１７４５８号、及び同第２０１３／０１９５９２０号に記載されており、これら全ての内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、以下の構造を有するＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ又はＭＣ３）である。
脂質ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡは、Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ Ｅｎｇｌ．（２０１２），５１（３４）：８５２９－８５３３に記載され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＷＯ２０１５／０７４０８５（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される、脂質ＡＴＸ－００２である。
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＷＯ２０１２／０４０１８４（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミン（化合物３２）である。
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＷＯ２０１５／１９９９５２（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される、化合物６又は化合物２２である。
式（Ｉ）及び式（Ｉ’）
いくつかの実施形態によれば、イオン化脂質は、式（Ｉ）：
又はその薬学的に許容される塩によって表され、式中、
Ｒ１及びＲ１’は、各々独立して、Ｃ１～３アルキレンであり、
Ｒ２及びＲ２’は、各々独立して、直鎖若しくは分岐鎖Ｃ１～６アルキレン、又はＣ３～６シクロアルキレンであり、
Ｒ３及びＲ３’は、各々独立して、任意に置換されたＣ１～６アルキル、又は任意に置換されたＣ３～６シクロアルキルであるか、
あるいは、Ｒ２’が分岐鎖Ｃ１～６アルキレンである場合、及びＲ３がＣ１～６アルキルである場合、Ｒ２’及びＲ３’は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成し、
あるいは、Ｒ２’が分岐鎖Ｃ１～６アルキレンである場合、及びＲ３がＣ１～６アルキルである場合、Ｒ２’及びＲ３’は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成し、
Ｒ４及びＲ４’は、各々独立して、－ＣＨ、－ＣＨ２ＣＨ、又は－（ＣＨ２）２ＣＨであり、
Ｒ５及びＲ５’は、各々独立して、Ｃ１～２０アルキレン又はＣ２～２０アルケニレンであり、
Ｒ６及びＲ６’は、各出現に対して、独立して、Ｃ１～２０アルキレン、Ｃ３～２０シクロアルキレン、又はＣ２～２０アルケニレンであり、
ｍ及びｎは、各々独立して、１、２、３、４、及び５から選択される整数である。
代替的に、いくつかの実施形態によれば、イオン化脂質は、式（Ｉ’）：
又はその薬学的に許容される塩によって表され、式中、
Ｒ１及びＲ１’は、各々独立して、Ｃ１～３アルキレンであり、
Ｒ２及びＲ２’は、各々独立して、直鎖又は分岐鎖Ｃ１～６アルキレン、又はＣ３～６シクロアルキレンであり、
Ｒ３及びＲ３’は、各々独立して、任意に置換されたＣ１～６アルキル、又は任意に置換されたＣ３～６シクロアルキルであるか、
あるいは、Ｒ２’が分岐鎖Ｃ１～６アルキレンである場合、及びＲ３がＣ１～６アルキルである場合、Ｒ２’及びＲ３’は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成し、
あるいは、Ｒ２’が分岐鎖Ｃ１～６アルキレンである場合、及びＲ３がＣ１～６アルキルである場合、Ｒ２’及びＲ３’は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成し、
Ｒ４及びＲ４’は、各々独立して、－ＣＨ、－ＣＨ２ＣＨ、又は－（ＣＨ２）２ＣＨであり、
Ｒ５及びＲ５’は、各々独立して、水素、Ｃ１～２０アルキレン又はＣ２～２０アルケニレンであり、
Ｒ６及びＲ６’は、各出現に対して、独立して、Ｃ１～２０アルキレン、Ｃ３～２０シクロアルキレン、又はＣ２～２０アルケニレンであり、
ｍ及びｎは、各々独立して、１、２、３、４、及び５から選択される整数である。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ２及びＲ２’は、各々独立してＣ１～３アルキレンである。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ１又はＲ１’によって表される直鎖又は分岐鎖Ｃ１～３アルキレン、Ｒ２又はＲ２’によって表される直鎖又は分岐鎖Ｃ１～６アルキレン、及び任意に置換された直鎖又は分岐鎖Ｃ１～６アルキルは、各々任意に、１つ以上のハロ及びシアノ基で置換されている。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、一緒になったＲ１及びＲ２は、Ｃ１～３アルキレンであり、一緒になったＲ１’及びＲ２’は、Ｃ１～３アルキレン、例えば、エチレンである。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ３及びＲ３’は、各々独立して、任意に置換されたＣ１～３アルキル、例えば、メチルである。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ４及びＲ４’は各々－ＣＨである。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ２は、任意に置換された分岐鎖Ｃ１～６アルキレンであり、Ｒ２及びＲ３は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、５員又は６員のヘテロシクリルを形成する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ２は、任意に置換された分岐鎖Ｃ１～６アルキレンであり、Ｒ２及びＲ３は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、ピロリジニル又はピペリジニルなどの５員又は６員のヘテロシクリルを形成する。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ４は、－Ｃ（Ｒａ）２ＣＲａ、又は－［Ｃ（Ｒａ）２］２ＣＲａであり、Ｒａは、Ｃ１～３アルキルであり、Ｒ３及びＲ４は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、５員又は６員のヘテロシクリルを形成する。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ４は、－Ｃ（Ｒａ）２ＣＲａ、又は－［Ｃ（Ｒａ）２］２ＣＲａであり、Ｒａは、Ｃ１～３アルキルであり、Ｒ３及びＲ４は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、ピロリジニル又はピペリジニルなどの５員又は６員のヘテロシクリルを形成する。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ５及びＲ５’は、各々独立して、Ｃ１～１０アルキレン又はＣ２～１０アルケニレンである。一実施形態では、Ｒ５及びＲ５’は、各々独立して、Ｃ１～８アルキレン又はＣ１～６アルキレンである。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、Ｒ６及びＲ６’は、各出現に対して、独立して、Ｃ１～１０アルキレン、Ｃ３～１０シクロアルキレン、又はＣ２～１０アルケニレンである。一実施形態では、Ｃ１～６アルキレン、Ｃ３～６シクロアルキレン、又はＣ２～６アルケニレンである。一実施形態では、Ｃ３～１０シクロアルキレン又はＣ３～６シクロアルキレンは、シクロプロピレンである。本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、ｍ及びｎは、各々３である。
本明細書の態様又は実施形態のうちのいずれかのいくつかの実施形態によれば、イオン化脂質は、表２の脂質のうちのいずれか１つ又はその薬学的に許容される塩から選択される。
式（ＩＩ）
いくつかの態様では、イオン化脂質は、式（ＩＩ）：
又はその薬学的に許容される塩によって表され、式中、
ａが、１～２０の範囲の整数であり（例えば、ａは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０である）、
ｂが、２～１０の範囲の整数であり（例えば、ｂは、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０である）、
Ｒ１は、不在であるか、又は（Ｃ２－Ｃ２０）アルケニル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ２－Ｃ２０）アルキル、及び（Ｃ２－Ｃ２０）アルキルで置換されたシクロプロピルから選択され、
Ｒ２は、（Ｃ２－Ｃ２０）アルキルである。
第２の化学的実施形態では、式（ＩＩ）のイオン化脂質は、式（ＸＩＩＩ）：
又はその薬学的に許容される塩であり、式中、ｃ及びｄは、各々独立して、１～８の範囲の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、又は８）であり、残りの変数は、式（ＸＩＩ）について記載されるとおりである。
第３の化学的実施形態では、式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）のイオン化脂質におけるｃ及びｄは、各々独立して、２～８、３～８、３～７、３～６、３～５、４～８、４～７、４～６、５～８、５～７、又は６～８の範囲の整数であり、残りの変数は、式（ＸＩＩ）について記載されるとおりである。
第４の化学的実施形態では、式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）のイオン化脂質におけるｃは、２、３、４、５、６、７、又は８であり、残りの変数は、式（ＸＩＩ）又は第２若しくは第３の化学的実施形態について記載されるとおりである。代替的に、第４の化学的実施形態の一部として、式（ＸＩＩ）若しくは（ＸＩＩＩ）のイオン化脂質、又はその薬学的に許容される塩におけるｃ及びｄは、各々独立して、１、３、５、又は７であり、残りの変数は、式（ＸＩＩ）又は第２若しくは第３の化学的実施形態について記載されるとおりである。
第５の化学的実施形態では、式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）のイオン化脂質におけるｄは、２、３、４、５、６、７、又は８であり、残りの変数は、式（ＩＩ）又は第２若しくは第３若しくは第４の化学的実施形態について記載されるとおりである。代替的に、第４の化学的実施形態の一部として、式（ＩＩ）若しくは（ＩＩＩ）のイオン化脂質、又はその薬学的に許容される塩におけるｃ及びｄのうちの少なくとも１つは、７であり、残りの変数は、式（ＩＩ）又は第２若しくは第３若しくは第４の化学的実施形態について記載されるとおりである。
第６の化学的実施形態では、式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）のイオン化脂質は、式（ＩＶ）：
又はその薬学的に許容される塩であり、式中、残りの変数は、式（Ｉ）について記載されるとおりである。
第７の化学的実施形態では、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、又は（ＩＶ）のイオン化脂質におけるｂは、３～９の範囲の整数であり、残りの変数は、式（ＩＩ）、又は第２、第３、第４、若しくは第５の化学的実施形態について記載されるとおりである。代替的に、第７の化学的実施形態の一部として、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、又は（ＩＶ）のイオン化脂質おけるｂは、３～８、３～７、３～６、３～５、４～９、４～８、４～７、４～６、５～９、５～８、５～７、６～９、６～８、又は７～９の範囲の整数であり、残りの変数は、式（ＩＩ）、又は第２、第３、第４、若しくは第５の化学的実施形態について記載されるとおりである。別の代替では、第７の化学的実施形態の一部として、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、又は（ＩＶ）のイオン化脂質におけるｂは、３、４、５、６、７、８、又は９であり、残りの変数は、式（ＸＩＩ）、又は第２、第３、第４、若しくは第５の化学的実施形態について記載されるとおりである。
第８の化学的実施形態では、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、又は（ＩＶ）のイオン化脂質におけるａは、２～１８の範囲の整数であり、残りの変数は、式（ＩＩ）、又は第２、第３、第４、第５、若しくは第７の化学的実施形態について記載されるとおりである。代替的に、第８の実施形態の一部として、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、又は（ＩＶ）のイオン化脂質、又はその薬学的に許容される塩におけるａは、２～１８、２～１７、２～１６、２～１５、２～１４、２～１３、２～１２、２～１１、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、３～１８、３～１７、３～１６、３～１５、３～１４、３～１３、３～１２、３～１１、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、４～１８、４～１７、４～１６、４～１５、４～１４、４～１３、４～１２、４～１１、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、５～１８、５～１７、５～１６、５～１５、５～１４、５～１３、５～１２、５～１１、５～１０、５～９、２５～８、５～７、６～１８、６～１７、６～１６、６～１５、６～１４、６～１３、６～１２、６～１１、６～１０、６～９、６～８、７～１８、７～１７、７～１６、７～１５、７～１４、７～１３、７～１２、７～１１、７～１０、７～９、８～１８、８～１７、８～１６、８～１５、８～１４、８～１３、８～１２、８～１１、８～１０、９～１８、９～１７、９～１６、９～１５、９～１４、９～１３、９～１２、９～１１、１０～１８、１０～１７、１０～１６、１０～１５、１０～１４、１０～１３、１１～１８、１１～１７、１１～１６、１１～１５、１１～１４、１１～１３、１２～１８、１２～１７、１２～１６、１２～１５、１２～１４、１３～１８、１３～１７、１３～１６、１３～１５、１４～１８、１４～１７、１４～１６、１５～１８、１５～１７、又は１６～１８の範囲の整数であり、残りの変数は、式（ＩＩ）、又は第２、第３、第４、第５、若しくは第７の化学的実施形態について記載されるとおりである。別の代替では、第８の実施形態の一部として、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、又は（ＩＶ）のイオン化脂質におけるａは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８であり、残りの変数は、式（ＩＩ）、又は第２、第３、第４、第５、若しくは第７の化学的実施形態について記載されるとおりである。
第９の化学的実施形態では、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）のイオン化脂質、又はその薬学的に許容される塩におけるＲ１は、不在であるか、又は（Ｃ５－Ｃ１５）アルケニル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４－Ｃ１８）アルキル、及び（Ｃ４－Ｃ１６）アルキルで置換されたシクロプロピルから選択され、式中、残りの変数は、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）、又は第２、第３、第４、第５、第７、若しくは第８の化学的実施形態について記載されるとおりである。代替的に、第９の化学的実施形態の一部として、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）のイオン化脂質、又はその薬学的に許容される塩におけるＲ１は、不在であるか、又は（Ｃ５－Ｃ１５）アルケニル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４－Ｃ１６）アルキル、及び（Ｃ４－Ｃ１６）アルキルで置換されたシクロプロピルから選択され、式中、残りの変数は、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）、又は第２、第３、第４、第５、第７、若しくは第８の化学的実施形態について記載されるとおりである。代替的に、第９の化学的実施形態の一部として、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）のイオン化脂質、又はその薬学的に許容される塩におけるＲ１は、不在であるか、又は（Ｃ５－Ｃ１２）アルケニル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４－Ｃ１２）アルキル、及び（Ｃ４－Ｃ１２）アルキルで置換されたシクロプロピルから選択され、式中、残りの変数は、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）、又は第２、第３、第４、第５、第７、若しくは第８の化学的実施形態について記載されるとおりである。別の代替では、第９の化学的実施形態の一部として、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）のイオン化脂質、又はその薬学的に許容される塩におけるＲ１は、不在であるか、又は（Ｃ５－Ｃ１０）アルケニル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４－Ｃ１０）アルキル、及び（Ｃ４－Ｃ１０）アルキルで置換されたシクロプロピルから選択され、式中、残りの変数は、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）、又は第２、第３、第４、第５、第７、若しくは第８の化学的実施形態について記載されるとおりである。
第１０の化学的実施形態では、Ｒ１は、Ｃ１０アルケニルであり、式中、残りの変数は、前述の実施形態のうちのいずれか１つに記載されるとおりである。
第１１の化学的実施形態では、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）のイオン化脂質、又はその薬学的に許容される塩におけるＲ１のＣ（Ｏ）Ｏ（Ｃ２－Ｃ２０）アルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４－Ｃ１８）アルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４－Ｃ１２）アルキル、又は－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４－Ｃ１０）アルキルにおけるアルキルは、非分岐アルキルであり、残りの変数は、前述の実施形態のうちのいずれか１つに記載されるとおりである。一化学的実施形態では、Ｒ１は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ９アルキル）である。代替的に、第１１の化学的実施形態では、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）のイオン化脂質、又はその薬学的に許容される塩におけるＲ１の－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４－Ｃ１８）アルキル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４－Ｃ１２）アルキル、又は－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ４－Ｃ１０）アルキルにおけるアルキルは、分岐アルキルであり、残りの変数は、前述の実施形態のうちのいずれか１つに記載されるとおりである。一化学的実施形態では、Ｒ１は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１７アルキル）であり、式中、残りの変数は、前述の化学的実施形態のうちのいずれか１つに記載されるとおりである。
第１２の化学的実施形態では、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）のイオン化脂質、又はその薬学的に許容される塩におけるＲ１は、以下の表３に列挙される任意の基から選択され、基の各々における波状結合は、脂質分子の残部への基の結合点を示し、残りの変数は、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）、又は第２、第３、第４、第５、第７、若しくは第８の化学的実施形態について記載されるとおりである。本開示は更に、表４のＲ１基のうちのいずれか１つと表５のＲ２基のうちのいずれか１つとの組み合わせを企図し、残りの変数は、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、若しくは（ＩＶ）、又は第２、第３、第４、第５、第７、若しくは第８の化学的実施形態について記載されるとおりである。
第１３の化学的実施形態では、式（ＩＩ）のイオン化脂質、又はその薬学的に許容される塩におけるＲ２は、以下の表４に列挙される任意の基から選択され、基の各々における波状結合は、脂質分子の残部への基の結合点を示し、残りの変数は、式（ＩＩ）、又は第７、第８、第９、第１０、若しくは第１１の化学的実施形態について記載されるとおりである。
特定の例は、表５以下の例示セクションに提供され、式（ＩＩ）のイオン化脂質の本明細書における第１４の化学的実施形態の一部として含まれる。薬学的に許容される塩並びにイオン化及び中性形態も含まれる。
式（Ｖ）
いくつかの態様では、イオン化脂質は、式（Ｖ）：
のもの、又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｒ１及びＲ１’は、各々独立して、Ｒａから選択される１つ以上の基で任意に置換された（Ｃ１－Ｃ６）アルキレンであり、
Ｒ２及びＲ２’は、各々独立して、（Ｃ１－Ｃ２）アルキレンであり、
Ｒ３及びＲ３’は、各々独立して、Ｒｂから選択される１つ以上の基で任意に置換された（Ｃ１－Ｃ６）アルキルであるか、
あるいは、Ｒ２及びＲ３並びに／又はＲ２’及びＲ３’は、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～７員のヘテロシクリルを形成し、
Ｒ４及びＲ４’は各々、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－によって中断された（Ｃ２－Ｃ６）アルキレンであり、
Ｒ５及びＲ５’は、各々独立して、（Ｃ２－Ｃ３０）アルキル又は（Ｃ２－Ｃ３０）アルケニルであり、これらの各々は、任意に－Ｃ（Ｏ）Ｏ－又は（Ｃ３－Ｃ６）シクロアルキルで中断され、
Ｒａ及びＲｂは、各々、ハロ又はシアノである。
第２の化学的態様では、式（Ｖ）のイオン化脂質中のＲ１及びＲ１’は、各々独立して、（Ｃ１－Ｃ６）アルキレンであり、式中、残りの変数は、式（Ｖ）について上で記載されるとおりである。代替的に、第２の化学的態様の一部として、式（Ｖ）のイオン化脂質中のＲ１及びＲ１’は、各々独立して、（Ｃ１－Ｃ３）アルキレンであり、式中、残りの変数は、式（Ｖ）について上で記載されるとおりである。
第３の化学的態様では、式（Ｖ）のイオン化脂質は、
式（ＶＩ）：
のもの、又はその薬学的に許容される塩であり、式中、残りの変数は、式（Ｖ）について記載されるとおりである。
第４の化学的態様では、式（Ｖ）のイオン化脂質は、式（ＶＩＩ）又は（ＶＩＩＩ）：
のもの、又はその薬学的に許容される塩であり、式中、残りの変数は、式（Ｖ）について記載されるとおりである。
第５の化学的態様では、式（Ｖ）のイオン化脂質は、式（ＩＸ）又は（ＶＩ）：
のもの、又はその薬学的に許容される塩であり、式中、残りの変数は、式（Ｖ）について記載されるとおりである。
第６の化学的態様では、式（Ｖ）のイオン化脂質は、式（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）：
のもの、又はその薬学的に許容される塩であり、式中、残りの変数は、式（ＸＶ）について記載されるとおりである。
第７の化学的態様では、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のイオン化脂質におけるＲ５及びＲ５´のうちの少なくとも１つは、分岐鎖アルキル又は分岐鎖アルケニルである（式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）について上で記載される炭素原子の数）。別の代替では、第７の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のイオン化脂質におけるＲ５及びＲ５´のうちの１つは、分岐鎖アルキル又は分岐鎖アルケニルである。別の代替では、第７の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のイオン化脂質におけるＲ５は、分岐鎖アルキル又は分岐鎖アルケニルである。別の代替では、第７の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のイオン化脂質におけるＲ５’は、分岐鎖アルキル又は分岐鎖アルケニルである。
第８の化学的態様では、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のイオン化脂質におけるＲ５は、（Ｃ６－Ｃ２６）アルキル又は（Ｃ６－Ｃ２６）アルケニルであり、これらの各々は、任意に－Ｃ（Ｏ）Ｏ－又は（Ｃ３－Ｃ６）シクロアルキルで中断され、式中、残りの変数は、式（Ｉ）について上で記載されるとおりである。代替的に、第７の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のイオン化脂質におけるＲ５は、（Ｃ６－Ｃ２６）アルキル又は（Ｃ６－Ｃ２６）アルケニルであり、これらの各々は、任意に－Ｃ（Ｏ）Ｏ－又は（Ｃ３－Ｃ５）シクロアルキルで中断され、式中、残りの変数は、式（Ｖ）について上で記載されるとおりである。別の代替では、第８の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のイオン化脂質におけるＲ５は、（Ｃ７－Ｃ２６）アルキル又は（Ｃ７－Ｃ２６）アルケニルであり、これらの各々は、任意に－Ｃ（Ｏ）Ｏ－又は（Ｃ３－Ｃ５）シクロアルキルで中断され、式中、残りの変数は、式（Ｖ）について上で記載されるとおりである。別の代替では、第８の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のイオン化脂質におけるＲ５は、（Ｃ８－Ｃ２６）アルキル又は（Ｃ８－Ｃ２６）アルケニルであり、これらの各々は、任意に－Ｃ（Ｏ）Ｏ－又は（Ｃ３－Ｃ５）シクロアルキルで中断され、式中、残りの変数は、式（Ｖ）について上で記載されるとおりである。別の代替では、第８の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のイオン化脂質におけるＲ５は、（Ｃ６－Ｃ２４）アルキル又は（Ｃ６－Ｃ２４）アルケニルであり、これらの各々は、任意に－Ｃ（Ｏ）Ｏ－又はシクロプロピルで中断され、式中、残りの変数は、式（Ｖ）について上で記載されるとおりである。別の代替では、第８の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のイオン化脂質におけるＲ５は、（Ｃ８－Ｃ２４）アルキル又は（Ｃ８－Ｃ２４）アルケニルであり、当該（Ｃ８－Ｃ２４）アルキルは、任意に－Ｃ（Ｏ）Ｏ－又はシクロプロピルで中断され、式中、残りの変数は、式（Ｖ）について上で記載されるとおりである。別の代替では、第８の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のイオン化脂質におけるＲ５は、（Ｃ８－Ｃ１０）アルキルであり、式中、残りの変数は、式（Ｖ）について上で記載されるとおりである。別の代替では、第８の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のイオン化脂質におけるＲ５は、シクロプロピルで中断された（Ｃ１４－Ｃ１６）アルキルであり、式中、残りの変数は、式（Ｖ）について上で記載されるとおりである。別の代替では、第８の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のイオン化脂質におけるＲ５は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－で中断された（Ｃ１０－Ｃ２４）アルキルであり、式中、残りの変数は、式（Ｖ）について上で記載されるとおりである。別の代替では、第８の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のイオン化脂質におけるＲ５は、（Ｃ１６－Ｃ１８）アルキルであり、式中、残りの変数は、式（Ｖ）について上で記載されるとおりである。別の代替では、第８の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のイオン化脂質におけるＲ５は、－（ＣＨ２）３Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）８ＣＨ３、－（ＣＨ２）５Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）８ＣＨ３、－（ＣＨ２）７Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ２）８ＣＨ３、－（ＣＨ２）７Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ［（ＣＨ２）７ＣＨ３］２、－（ＣＨ２）７－Ｃ３Ｈ６－（ＣＨ２）７ＣＨ３、－（ＣＨ２）７ＣＨ３、－（ＣＨ２）９ＣＨ３、－（ＣＨ２）１６ＣＨ３、－（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３、又は－（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）４ＣＨ３であり、式中、残りの変数は、式（ＸＶ）について上で記載されるとおりである。
第９の化学的態様では、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のイオン化脂質におけるＲ５は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－で中断された（Ｃ１５－Ｃ２８）アルキルであり、式中、残りの変数は、式（Ｖ）又は第８の化学的態様について上で記載されるとおりである。代替的に、第９の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のイオン化脂質におけるＲ５は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－で中断された（Ｃ１７－Ｃ２８）アルキルであり、式中、残りの変数は、式（Ｖ）又は第８の化学的態様について上で記載されるとおりである。別の代替では、第９の実施形態の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のイオン化脂質におけるＲ５は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－で中断された（Ｃ１９－Ｃ２８）アルキルであり、式中、残りの変数は、式（Ｖ）又は第８の化学的態様について上で記載されるとおりである。別の代替では、第９の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のイオン化脂質におけるＲ５は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－で中断された（Ｃ１７－Ｃ２６）アルキルであり、式中、残りの変数は、式（Ｖ）又は第８の化学的態様について上で記載されるとおりである。別の代替では、第９の実施形態の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のイオン化脂質におけるＲ５は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－で中断された（Ｃ１９－Ｃ２６）アルキルであり、式中、残りの変数は、式（Ｖ）又は第８の化学的態様について上で記載されるとおりである。別の代替では、第９の化学的態様の一部として、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のイオン化脂質におけるＲ５は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－で中断された（Ｃ２０－Ｃ２６）アルキルであり、式中、残りの変数は、式（Ｖ）又は第８の化学的態様について上で記載されるとおりである。別の代替では、第９の実施形態の一部として、Ｒ５は、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－で中断された（Ｃ２２－Ｃ２４）アルキルであり、式中、残りの変数は、式（Ｖ）又は第８の化学的態様について上で記載されるとおりである。別の代替では、第９の実施形態の一部として、Ｒ５’は、－（ＣＨ２）５Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ［（ＣＨ２）７ＣＨ３］２、－（ＣＨ２）７Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ［（ＣＨ２）７ＣＨ３］２、－（ＣＨ２）５Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ（ＣＨ２）２［（ＣＨ２）７ＣＨ３］２、又は－（ＣＨ２）７Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ（ＣＨ２）２［（ＣＨ２）７ＣＨ３］２であり、式中、残りの変数は、式（Ｖ）又は第８の化学的態様について上で記載されるとおりである。
別の態様では、式（Ｖ）、（ＶＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、又は（ＸＩＶ）のイオン化脂質は、表６の以下の脂質又はその薬学的に許容される塩のいずれかから選択され得る。
式（ＸＶ）
いくつかの態様では、イオン化脂質は、式（ＸＶ）：
のもの、又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｒ’は、不在、水素、又はＣ１－Ｃ６アルキルであるが、ただし、Ｒ’が水素又はＣ１－Ｃ６アルキルである場合、Ｒ’、Ｒ１、及びＲ２が全て結合している窒素原子は、プロトン化されており、
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、水素、Ｃ１－Ｃ６アルキル、又はＣ２－Ｃ６アルケニルであり、
Ｒ３は、Ｃ１－Ｃ１２アルキレン又はＣ２－Ｃ１２アルケニレンであり、
Ｒ４は、Ｃ１－Ｃ１６非分岐鎖アルキル、Ｃ２－Ｃ１６非分岐鎖アルケニルであるか、又は
であり、式中、
Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、各々独立して、Ｃ１－Ｃ１６非分岐鎖アルキル又はＣ２－Ｃ１６非分岐鎖アルケニルであり、
Ｒ５は、不在、Ｃ１－Ｃ８アルキレン、又はＣ２－Ｃ８アルケニレンであり、
Ｒ６ａ及びＲ６ｂは、各々独立して、Ｃ７－Ｃ１６アルキル又はＣ７－Ｃ１６アルケニルであるが、ただし、Ｒ６ａ及びＲ６ｂ中の合わせた総炭素数は、１５より大きく、
Ｘ１及びＸ２は、各々独立して、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ－、－Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）－、－Ｃ（Ｒａ）＝ＮＯ－、－Ｏ－Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＳｉ（Ｒａ）２Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）（ＣＲａ ２）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、又はＯＣ（＝Ｏ）（ＣＲａ ２）Ｃ（＝Ｏ）－であり、式中、
Ｒａは、各出現に対して、独立して水素又はＣ１－Ｃ６アルキルであり、
ｎは、１、２、３、４、５、及び６から選択される整数である。
第２の実施形態では、第１の実施形態によるイオン化脂質又はその薬学的に許容される塩では、Ｘ１及びＸ２は同じであり、他の全ての残りの変数は、式（Ｖ）又は第１の実施形態について記載されているとおりである。
第３の実施形態では、第１若しくは第２の実施形態によるイオン化脂質又はその薬学的に許容される塩では、Ｘ１及びＸ２は、各々独立して、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、若しくは－Ｓ－Ｓ－であるか、又はＸ１及びＸ２は、各々独立して、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、若しくは－Ｓ－Ｓ－であるか、又はＸ１及びＸ２は、各々独立して、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－若しくは－Ｓ－Ｓ－であり、他の全ての残りの変数は、式Ｖ又は前述の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。
第４の実施形態では、本開示のイオン化脂質は、式（ＸＶＩ）：
又はその薬学的に許容される塩によって表され、式中、ｎは、１、２、３、及び４から選択される整数であり、他の全ての残りの変数は、式（ＸＶ）又は前述の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。
第５の実施形態では、本開示のイオン化脂質は、式（ＸＶＩＩ）：
又はその薬学的に許容される塩によって表され、式中、ｎは、１、２、及び３から選択される整数であり、他の全ての残りの変数は、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）又は前述の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。
第６の実施形態では、本開示のイオン化脂質は、式（ＸＶＩＩＩ）：
又はその薬学的に許容される塩によって表され、他の全ての残りの変数は、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）又は前述の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。
第７の実施形態では、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）若しくは前述の実施形態のいずれか１つによるイオン化脂質、又はその薬学的に許容される塩では、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、水素、Ｃ１－Ｃ６アルキル若しくはＣ２－Ｃ６アルケニル、又はＣ１－Ｃ５アルキル若しくはＣ２－Ｃ５アルケニル、又はＣ１－Ｃ４アルキル若しくはＣ２－Ｃ４アルケニル、又はＣ６アルキル、又はＣ５アルキル、又はＣ４アルキル、又はＣ３アルキル、又はＣ２アルキル、又はＣ１アルキル、又はＣ６アルケニル、又はＣ５アルケニル、又はＣ４アルケニル、又はＣ３アルケニル、又はＣ２アルケニルであり、他の全ての残りの変数は、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）又は前述の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。
第８の実施形態では、本開示のイオン化脂質は、式（ＸＩＸ）：
又はその薬学的に許容される塩によって表され、他の全ての残りの変数は、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、（ＸＶＩＩＩ）又は前述の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。
第９の実施形態では、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）、式（ＸＩＸ）若しくは前述の実施形態のいずれか１つによるイオン化脂質、又はその薬学的に許容される塩では、Ｒ３は、Ｃ１－Ｃ９アルキレン若しくはＣ２－Ｃ９アルケニレン、Ｃ１－Ｃ７アルキレン若しくはＣ２－Ｃ７アルケニレン、Ｃ１－Ｃ５アルキレン若しくはＣ２－Ｃ５アルケニレン、若しくはＣ２－Ｃ８アルキレン若しくはＣ２－Ｃ８アルケニレン、若しくはＣ３－Ｃ７アルキレン若しくはＣ３－Ｃ７アルケニレン、若しくはＣ５－Ｃ７アルキレン若しくはＣ５－Ｃ７アルケニレンであるか、又はＲ３は、Ｃ１２アルキレン、Ｃ１１アルキレン、Ｃ１０アルキレン、Ｃ９アルキレン、若しくはＣ８アルキレン、若しくはＣ７アルキレン、若しくはＣ６アルキレン、若しくはＣ５アルキレン、若しくはＣ４アルキレン、若しくはＣ３アルキレン、若しくはＣ２アルキレン、若しくはＣ１アルキレン、若しくはＣ１２アルケニレン、Ｃ１１アルケニレン、Ｃ１０アルケニレン、Ｃ９アルケニレン、若しくはＣ８アルケニレン、若しくはＣ７アルケニレン、若しくはＣ６アルケニレン、若しくはＣ５アルケニレン、若しくはＣ４アルケニレン、若しくはＣ３アルケニレン、若しくはＣ２アルケニレンであり、他の全ての残りの変数は、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）、式（ＸＩＸ）又は前述の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。代替的に、第９の実施形態では、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）、式（ＸＩＸ）若しくは前述の実施形態のいずれか１つによるカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩では、Ｒ３は、Ｃ１－Ｃ９アルキレン若しくはＣ２－Ｃ９アルケニレン、Ｃ１－Ｃ７アルキレン若しくはＣ２－Ｃ７アルケニレン、Ｃ１－Ｃ６アルキレン若しくはＣ２－Ｃ６アルケニレン、Ｃ１－Ｃ５アルキレン若しくはＣ２－Ｃ５アルケニレン、若しくはＣ２－Ｃ８アルキレン若しくはＣ２－Ｃ８アルケニレン、若しくはＣ３－Ｃ７アルキレン若しくはＣ３－Ｃ７アルケニレン、若しくはＣ５－Ｃ７アルキレン若しくはＣ５－Ｃ７アルケニレンであるか、又はＲ３は、Ｃ１２アルキレン、Ｃ１１アルキレン、Ｃ１０アルキレン、Ｃ９アルキレン、若しくはＣ８アルキレン、若しくはＣ７アルキレン、若しくはＣ６アルキレン、若しくはＣ５アルキレン、若しくはＣ４アルキレン、若しくはＣ３アルキレン、若しくはＣ２アルキレン、若しくはＣ１アルキレン、若しくはＣ１２アルケニレン、Ｃ１１アルケニレン、Ｃ１０アルケニレン、Ｃ９アルケニレン、若しくはＣ８アルケニレン、若しくはＣ７アルケニレン、若しくはＣ６アルケニレン、若しくはＣ５アルケニレン、若しくはＣ４アルケニレン、若しくはＣ３アルケニレン、若しくはＣ２アルケニレンであり、他の全ての残りの変数は、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）、式（ＸＩＸ）又は前述の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。
第１０の実施形態では、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）、式（ＸＩＸ）若しくは前述の実施形態のいずれか１つによるカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩では、Ｒ５は、不在、Ｃ１－Ｃ６アルキレン、若しくはＣ２－Ｃ６アルケニレンであるか、又はＲ５は、不在、Ｃ１－Ｃ４アルキレン、若しくはＣ２－Ｃ４アルケニレンであるか、又はＲ５は、不在であるか、又はＲ５は、Ｃ８アルキレン、Ｃ７アルキレン、Ｃ６アルキレン、Ｃ５アルキレン、Ｃ４アルキレン、Ｃ３アルキレン、Ｃ２アルキレン、Ｃ１アルキレン、Ｃ８アルケニレン、Ｃ７アルケニレン、Ｃ６アルケニレン、Ｃ５アルケニレン、Ｃ４アルケニレン、Ｃ３アルケニレン若しくはＣ２アルケニレンであり、他の全ての残りの変数は、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）、式（ＸＩＸ）又は前述の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。
第１１の実施形態では、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）、式（ＸＩＸ）若しくは前述の実施形態のいずれか１つによるカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩では、Ｒ４は、Ｃ１－Ｃ１４非分岐鎖アルキル、Ｃ２－Ｃ１４非分岐鎖アルケニル、又は
であり、Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、各々独立して、Ｃ１－Ｃ１２非分岐鎖アルキル若しくはＣ２－Ｃ１２非分岐鎖アルケニルであるか、又はＲ４は、Ｃ２－Ｃ１２非分岐鎖アルキル若しくはＣ２－Ｃ１２非分岐鎖アルケニルであるか、又はＲ４は、Ｃ５－Ｃ７非分岐鎖アルキル若しくはＣ５－Ｃ７非分岐鎖アルケニルであるか、又はＲ４は、Ｃ１６非分岐鎖アルキル、Ｃ１５非分岐鎖アルキル、Ｃ１４非分岐鎖アルキル、Ｃ１３非分岐鎖アルキル、Ｃ１２非分岐鎖アルキル、Ｃ１１非分岐鎖アルキル、Ｃ１０非分岐鎖アルキル、Ｃ９非分岐鎖アルキル、Ｃ８非分岐鎖アルキル、Ｃ７非分岐鎖アルキル、Ｃ６非分岐鎖アルキル、Ｃ５非分岐鎖アルキル、Ｃ４非分岐鎖アルキル、Ｃ３非分岐鎖アルキル、Ｃ２非分岐鎖アルキル、Ｃ１非分岐鎖アルキル、Ｃ１６非分岐鎖アルケニル、Ｃ１５非分岐鎖アルケニル、Ｃ１４非分岐鎖アルケニル、Ｃ１３非分岐鎖アルケニル、Ｃ１２非分岐鎖アルケニル、Ｃ１１非分岐鎖アルケニル、Ｃ１０非分岐鎖アルケニル、Ｃ９非分岐鎖アルケニル、Ｃ８非分岐鎖アルケニル、Ｃ７非分岐鎖アルケニル、Ｃ６非分岐鎖アルケニル、Ｃ５非分岐鎖アルケニル、Ｃ４非分岐鎖アルケニル、Ｃ３非分岐鎖アルケニル、若しくはＣ２アルケニルであるか、又はＲ４は、
であり、Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、各々独立して Ｃ２－Ｃ１０非分岐鎖アルキル若しくはＣ２－Ｃ１０非分岐鎖アルケニルであるか、又はＲ４は、
であり、Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、各々独立して、Ｃ１６非分岐鎖アルキル、Ｃ１５非分岐鎖アルキル、Ｃ１４非分岐鎖アルキル、Ｃ１３非分岐鎖アルキル、Ｃ１２非分岐鎖アルキル、Ｃ１１非分岐鎖アルキル、Ｃ１０非分岐鎖アルキル、Ｃ９非分岐鎖アルキル、Ｃ８非分岐鎖アルキル、Ｃ７非分岐鎖アルキル、Ｃ６非分岐鎖アルキル、Ｃ５非分岐鎖アルキル、Ｃ４非分岐鎖アルキル、Ｃ３非分岐鎖アルキル、Ｃ２アルキル、Ｃ１アルキル、Ｃ１６非分岐鎖アルケニル、Ｃ１５非分岐鎖アルケニル、Ｃ１４非分岐鎖アルケニル、Ｃ１３非分岐鎖アルケニル、Ｃ１２非分岐鎖アルケニル、Ｃ１１非分岐鎖アルケニル、Ｃ１０非分岐鎖アルケニル、Ｃ９非分岐鎖アルケニル、Ｃ８非分岐鎖アルケニル、Ｃ７非分岐鎖アルケニル、Ｃ６非分岐鎖アルケニル、Ｃ５非分岐鎖アルケニル、Ｃ４非分岐鎖アルケニル、Ｃ３非分岐鎖アルケニル、又はＣ２アルケニルであり、他の全ての残りの変数は、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）、式（ＸＩＸ）又は前述の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。
第１２の実施形態では、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）、式（ＸＩＸ）若しくは前述の実施形態のいずれか１つによるカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩では、Ｒ６ａ及びＲ６ｂは、各々独立して、Ｃ６－Ｃ１４アルキル若しくはＣ６－Ｃ１４アルケニルであるか、又はＲ６ａ及びＲ６ｂは、各々独立して、Ｃ８－Ｃ１２アルキル若しくはＣ８－Ｃ１２アルケニルであるか、又はＲ６ａ及びＲ６ｂは、各々独立して、Ｃ１６アルキル、Ｃ１５アルキル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１３アルキル、Ｃ１２アルキル、Ｃ１１アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ９アルキル、Ｃ８アルキル、Ｃ７アルキル、Ｃ１６アルケニル、Ｃ１５アルケニル、Ｃ１４アルケニル、Ｃ１３アルケニル、Ｃ１２アルケニル、Ｃ１１アルケニル、Ｃ１０アルケニル、Ｃ９アルケニル、Ｃ８アルケニル、若しくはＣ７アルケニルであるが、ただし、Ｒ６ａ及びＲ６ｂ中の合わせた総炭素数は、１５より大きく、他の全ての残りの変数は、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）、式（ＸＩＸ）又は前述の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。
第１３の実施形態では、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）、式（ＸＩＸ）若しくは前述の実施形態のいずれか１つによるカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩では、Ｒ６ａ及びＲ６ｂは、互いに同数の炭素原子を含有するか、又はＲ６ａ及びＲ６ｂは、同じであるか、又はＲ６ａ及びＲ６ｂは、両方とも、Ｃ１６アルキル、Ｃ１５アルキル、Ｃ１４アルキル、Ｃ１３アルキル、Ｃ１２アルキル、Ｃ１１アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ９アルキル、Ｃ８アルキル、Ｃ７アルキル、Ｃ１６アルケニル、Ｃ１５アルケニル、Ｃ１４アルケニル、Ｃ１３アルケニル、Ｃ１２アルケニル、Ｃ１１アルケニル、Ｃ１０アルケニル、Ｃ９アルケニル、Ｃ８アルケニル、若しくはＣ７アルケニルであるが、ただし、Ｒ６ａ及びＲ６ｂ中の合わせた総炭素数は、１５より大きく、他の全ての残りの変数は、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）、式（ＸＩＸ）又は前述の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。
第１４の実施形態では、式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）、式（ＸＩＸ）若しくは前述の実施形態のいずれか１つによるカチオン性脂質、又はその薬学的に許容される塩では、前述の実施形態のいずれか１つに定義されたＲ６ａ及びＲ６ｂは、各々、互いに異なる数の炭素原子を含有するか、又はＲ６ａ及びＲ６ｂの炭素原子の数は、１つ若しくは２つの炭素原子だけ異なるか、又はＲ６ａ及びＲ６ｂの炭素原子の数は、１つの炭素原子だけ異なるか、又はＲ６ａは、Ｃ７アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ８アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ８アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ７アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ８アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ９アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ９アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ８アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ９アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１０アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１０アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ９アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１０アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１０アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１２アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１２アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ７アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ９アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ９アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ７アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ８アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１０アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１０アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ８アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ９アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ９アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１０アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１２アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１２アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１０アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１３アルキルであるか、又はＲ６ａは、Ｃ１３アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１１アルキルなどであり、他の全ての残りの変数は、式Ｉ、式ＩＩ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、式Ｖ又は前述の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。
一実施形態では、本開示のカチオン性脂質又は式（ＸＶ）、式（ＸＶＩ）、式（ＸＶＩＩ）、式（ＸＶＩＩＩ）、又は式（ＸＩＸ）のカチオン性脂質は、表７の脂質又は薬学的に許容されるその塩から選択されるいずれか１つの脂質である：
式（ＸＸ）
いくつかの態様では、イオン化脂質は、式（ＸＸ）：
のもの、又はその薬学的に許容される塩であって、式中、
Ｒ’は、不在、水素、又はＣ１－Ｃ３アルキルであるが、ただし、Ｒ’が水素又はＣ１－Ｃ３アルキルである場合、Ｒ’、Ｒ１、及びＲ２が全て結合している窒素原子は、プロトン化されており、
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、水素又はＣ１－Ｃ３アルキルであり、
Ｒ３は、Ｃ３－Ｃ１０アルキレン又はＣ３－Ｃ１０アルケニレンであり、
Ｒ４は、Ｃ１－Ｃ１６非分岐鎖アルキル、Ｃ２－Ｃ１６非分岐鎖アルケニルであるか、又は
であり、式中、
Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、各々独立して、Ｃ１－Ｃ１６非分岐鎖アルキル又はＣ２－Ｃ１６非分岐鎖アルケニルであり、
Ｒ５は、不在、Ｃ１－Ｃ６アルキレン、又はＣ２－Ｃ６アルケニレンであり、
Ｒ６ａ及びＲ６ｂは、各々独立して、Ｃ７－Ｃ１４アルキル又はＣ７－Ｃ１４アルケニルであり、
Ｘは、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ－、－Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）－、－Ｃ（Ｒａ）＝ＮＯ－、－Ｏ－Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＳｉ（Ｒａ）２Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）（ＣＲａ ２）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、又はＯＣ（＝Ｏ）（ＣＲａ ２）Ｃ（＝Ｏ）－であり、式中、
Ｒａは、各出現に対して、独立して水素又はＣ１－Ｃ６アルキルであり、
ｎは、１、２、３、４、５、及び６から選択される整数である。
第２の実施形態では、第１の実施形態によるイオン化脂質又はその薬学的に許容される塩では、Ｘは、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、又は－Ｓ－Ｓであり、他の全ての残りの変数は、式（ＸＸ）又は第１の実施形態について記載されているとおりである。
第３の実施形態では、本開示のイオン化脂質は、式（ＸＸＩ）：
又はその薬学的に許容される塩によって表され、式中、ｎは、１、２、３、及び４から選択される整数であり、他の全ての残りの変数は、式（ＸＸ）又は前述の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。別の第３の実施形態では、ｎは１、２、及び３から選択される整数であり、他の全ての残りの変数は、式（ＸＸ）又は前述の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。
第４の実施形態では、本開示のイオン化脂質は、式（ＸＸＩＩ）：
又はその薬学的に許容される塩によって表され、他の全ての残りの変数は、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）又は前述の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。
第５の実施形態では、第１の実施形態によるイオン化脂質又はその薬学的に許容される塩では、Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、水素若しくはＣ１－Ｃ２アルキル、若しくはＣ２－Ｃ３アルケニルであるか、又はＲ’、Ｒ１、及びＲ２は、各々独立して、水素、Ｃ１－Ｃ２アルキルであり、他の全ての残りの変数は、式（ＸＸ）、（ＸＸＩ）又は前述の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。
第６の実施形態では、本開示のイオン化脂質は、式（ＸＸＩＩ）：
又はその薬学的に許容される塩によって表され、他の全ての残りの変数は、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）又は前述の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。
第７の実施形態では、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）若しくは前述の実施形態のいずれか１つによるイオン化脂質、又はその薬学的に許容される塩では、Ｒ５は、不在若しくはＣ１－Ｃ８アルキレンであるか、又はＲ５は、不在、Ｃ１－Ｃ６アルキレン、若しくはＣ２－Ｃ６アルケニレンであるか、又はＲ５は、不在、Ｃ１－Ｃ４アルキレン、若しくはＣ２－Ｃ４アルケニレンであるか、又はＲ５は、不在であるか、又はＲ５は、Ｃ８アルキレン、Ｃ７アルキレン、Ｃ６アルキレン、Ｃ５アルキレン、Ｃ４アルキレン、Ｃ３アルキレン、Ｃ２アルキレン、Ｃ１アルキレン、Ｃ８アルケニレン、Ｃ７アルケニレン、Ｃ６アルケニレン、Ｃ５アルケニレン、Ｃ４アルケニレン、Ｃ３アルケニレン若しくはＣ２アルケニレンであり、他の全ての残りの変数は、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）又は前述の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。
第８の実施形態では、本開示のイオン化脂質は、式（ＸＸＩＶ）：
又はその薬学的に許容される塩によって表され、他の全ての残りの変数は、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）又は前述の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。
第９の実施形態では、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）、式（ＸＸＩＶ）若しくは前述の実施形態のいずれか１つによるイオン化脂質、又はその薬学的に許容される塩では、Ｒ４は、Ｃ１－Ｃ１４非分岐鎖アルキル、Ｃ２－Ｃ１４非分岐鎖アルケニル、又は
であり、Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、各々独立して、Ｃ１－Ｃ１２非分岐鎖アルキル若しくはＣ２－Ｃ１２非分岐鎖アルケニルであるか、又はＲ４は、Ｃ２－Ｃ１２非分岐鎖アルキル若しくはＣ２－Ｃ１２非分岐鎖アルケニルであるか、又はＲ４は、Ｃ５－Ｃ１２非分岐鎖アルキル若しくはＣ５－Ｃ１２非分岐鎖アルケニルであるか、又はＲ４は、Ｃ１６非分岐鎖アルキル、Ｃ１５非分岐鎖アルキル、Ｃ１４非分岐鎖アルキル、Ｃ１３非分岐鎖アルキル、Ｃ１２非分岐鎖アルキル、Ｃ１１非分岐鎖アルキル、Ｃ１０非分岐鎖アルキル、Ｃ９非分岐鎖アルキル、Ｃ８非分岐鎖アルキル、Ｃ７非分岐鎖アルキル、Ｃ６非分岐鎖アルキル、Ｃ５非分岐鎖アルキル、Ｃ４非分岐鎖アルキル、Ｃ３非分岐鎖アルキル、Ｃ２非分岐鎖アルキル、Ｃ１非分岐鎖アルキル、Ｃ１６非分岐鎖アルケニル、Ｃ１５非分岐鎖アルケニル、Ｃ１４非分岐鎖アルケニル、Ｃ１３非分岐鎖アルケニル、Ｃ１２非分岐鎖アルケニル、Ｃ１１非分岐鎖アルケニル、Ｃ１０非分岐鎖アルケニル、Ｃ９非分岐鎖アルケニル、Ｃ８非分岐鎖アルケニル、Ｃ７非分岐鎖アルケニル、Ｃ６非分岐鎖アルケニル、Ｃ５非分岐鎖アルケニル、Ｃ４非分岐鎖アルケニル、Ｃ３非分岐鎖アルケニル、若しくはＣ２アルケニルであるか、又はＲ４は、
であり、Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、各々独立して Ｃ２－Ｃ１０非分岐鎖アルキル若しくはＣ２－Ｃ１０非分岐鎖アルケニルであるか、又はＲ４は、
であり、Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、各々独立して、Ｃ１６非分岐鎖アルキル、Ｃ１５非分岐鎖アルキル、Ｃ１４非分岐鎖アルキル、Ｃ１３非分岐鎖アルキル、Ｃ１２非分岐鎖アルキル、Ｃ１１非分岐鎖アルキル、Ｃ１０非分岐鎖アルキル、Ｃ９非分岐鎖アルキル、Ｃ８非分岐鎖アルキル、Ｃ７非分岐鎖アルキル、Ｃ６非分岐鎖アルキル、Ｃ５非分岐鎖アルキル、Ｃ４非分岐鎖アルキル、Ｃ３非分岐鎖アルキル、Ｃ２アルキル、Ｃ１アルキル、Ｃ１６非分岐鎖アルケニル、Ｃ１５非分岐鎖アルケニル、Ｃ１４非分岐鎖アルケニル、Ｃ１３非分岐鎖アルケニル、Ｃ１２非分岐鎖アルケニル、Ｃ１１非分岐鎖アルケニル、Ｃ１０非分岐鎖アルケニル、Ｃ９非分岐鎖アルケニル、Ｃ８非分岐鎖アルケニル、Ｃ７非分岐鎖アルケニル、Ｃ６非分岐鎖アルケニル、Ｃ５非分岐鎖アルケニル、Ｃ４非分岐鎖アルケニル、Ｃ３非分岐鎖アルケニル、又はＣ２アルケニルであり、他の全ての残りの変数は、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）、式（ＸＸＩＶ）又は前述の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。
第１０の実施形態では、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）、式（ＸＸＩＶ）若しくは前述の実施形態のいずれか１つによるイオン化脂質、又はその薬学的に許容される塩では、Ｒ３は、Ｃ３－Ｃ８アルキレン若しくはＣ３－Ｃ８アルケニレン、Ｃ３－Ｃ７アルキレン若しくはＣ３－Ｃ７アルケニレン、又はＣ３－Ｃ５アルキレン若しくはＣ３－Ｃ５アルケニレンであるか、又はＲ３は、Ｃ８アルキレン、若しくはＣ７アルキレン、若しくはＣ６アルキレン、若しくはＣ５アルキレン、若しくはＣ４アルキレン、若しくはＣ３アルキレン、若しくはＣ１アルキレン、若しくはＣ８アルケニレン、若しくはＣ７アルケニレン、若しくはＣ６アルケニレン、若しくはＣ５アルケニレン、若しくはＣ４アルケニレン、若しくはＣ３アルケニレンであり、他の全ての残りの変数は、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）、式（ＸＸＩＶ）又は前述の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。
第１１の実施形態では、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）、式（ＸＸＩＶ）若しくは前述の実施形態のいずれか１つによるイオン化脂質、又はその薬学的に許容される塩では、Ｒ６ａ及びＲ６ｂは、各々独立して、Ｃ７－Ｃ１２アルキル若しくはＣ７－Ｃ１２アルケニルであるか、又はＲ６ａ及びＲ６ｂは、各々独立して、Ｃ８－Ｃ１０アルキル若しくはＣ８－Ｃ１０アルケニルであるか、又はＲ６ａ及びＲ６ｂは、各々独立して、Ｃ１２アルキル、Ｃ１１アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ９アルキル、Ｃ８アルキル、Ｃ７アルキル、Ｃ１２アルケニル、Ｃ１１アルケニル、Ｃ１０アルケニル、Ｃ９アルケニル、Ｃ８アルケニル、若しくはＣ７アルケニルであり、他の全ての残りの変数は、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）、式（ＸＸＩＶ）又は前述の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。
第１２の実施形態では、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）、式（ＸＸＩＶ）若しくは前述の実施形態のいずれか１つによるイオン化脂質、又はその薬学的に許容される塩では、Ｒ６ａ及びＲ６ｂは、互いに同数の炭素原子を含有するか、又はＲ６ａ及びＲ６ｂは、同じであるか、又はＲ６ａ及びＲ６ｂは、両方とも、Ｃ１２アルキル、Ｃ１１アルキル、Ｃ１０アルキル、Ｃ９アルキル、Ｃ８アルキル、Ｃ７アルキル、Ｃ１２アルケニル、Ｃ１１アルケニル、Ｃ１０アルケニル、Ｃ９アルケニル、Ｃ８アルケニル、若しくはＣ７アルケニルであり、他の全ての残りの変数は、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）、式（ＸＸＩＶ）又は前述の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。
第１３の実施形態では、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）、式（ＸＸＩＶ）若しくは前述の実施形態のいずれか１つによるイオン化脂質、又はその薬学的に許容される塩では、前述の実施形態のいずれか１つに定義されたＲ６ａ及びＲ６ｂは、各々、互いに異なる数の炭素原子を含有するか、又はＲ６ａ及びＲ６ｂの炭素原子の数は、１つ若しくは２つの炭素原子だけ異なるか、又はＲ６ａ及びＲ６ｂの炭素原子の数は、１つの炭素原子だけ異なるか、又はＲ６ａは、Ｃ７アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ８アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ８アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ７アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ８アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ９アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ９アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ８アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ９アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１０アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１０アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ９アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１０アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１０アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１２アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１２アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ７アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ９アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ９アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ７アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ８アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１０アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１０アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ８アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ９アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ９アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１０アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１２アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１２アルキルであり、Ｒ６ａは、Ｃ１０アルキルなどであり、他の全ての残りの変数は、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）、式（ＸＸＩＶ）又は前述の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。
第１４の実施形態では、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）、式（ＸＸＩＶ）若しくは前述の実施形態のいずれか１つによるイオン化脂質、又はその薬学的に許容される塩では、Ｒ’は、不在であり、他の全ての残りの変数は、式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）、式（ＸＸＩＶ）又は前述の実施形態のいずれか１つについて記載されているとおりである。
一実施形態では、本開示のイオン化脂質又は式（ＸＸ）、式（ＸＸＩ）、式（ＸＸＩＩ）、式（ＸＸＩＩＩ）、式（ＸＸＩＶ）のイオン化脂質は、表８の脂質又は薬学的に許容されるその塩から選択されるいずれか１つの脂質である：
特定の例は、以下の例示セクションに提供され、本明細書に記載のイオン化脂質の一部として含まれる。薬学的に許容される塩及び中性形態もまた含まれる。
切断可能な脂質
いくつかの実施形態によれば、本明細書に提供されるのは、切断可能な脂質、及び目的の標的部位（例えば、細胞、組織、器官など）にカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクターを送達するために使用され得るカプシド不含非ウイルス性ベクター（例えば、ｃｅＤＮＡ）を含む薬学的組成物である。本明細書で使用される場合、「切断可能な脂質」という用語は、ジスルフィド結合（「ＳＳ」）切断可能な単位を含むカチオン性脂質を指す。一実施形態では、ＳＳ切断可能な脂質は、酸性区画、膜不安定化のための（例えば、エンドソーム又はリソソーム）、及び還元環境（例えば、細胞質）で切断され得るジスルフィド結合に応答する三級アミンを含む。ＳＳ切断可能な脂質としては、ｓｓ－ＯＰ脂質、ｓｓＰａｌｍ脂質、ｓｓ－Ｍ脂質、ｓｓ－Ｅ脂質、ｓｓ－ＥＣ脂質、ｓｓ－ＬＣ脂質、ｓｓ－ＯＣ脂質などのＳＳ切断可能及びｐＨ活性化脂質様物質が挙げられ得る。
いくつかの実施形態によれば、ＳＳ切断可能な脂質は、国際特許出願公開第２０１９／１８８８６７号に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で示されるように、切断可能な脂質を含むｃｅＤＮＡ脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、標的細胞（例えば、肝細胞を含む）へのｃｅＤＮＡのより効率的な送達を提供する。本開示は、以前に記載されたＬＮＰよりも大幅な小型ＬＮＰを生成する新しい製剤プロセス及び方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の製剤プロセス及び方法によって生成されるＬＮＰは、サイズが平均直径で約２０～約７０ｎｍの範囲であり、例えば、約２０ｎｍ～約７０ｎｍ、約２５ｎｍ～約７０ｎｍ、約３０ｎｍ～約７０ｎｍ、約３５ｎｍ～約７０ｎｍ、約４０ｎｍ～約７０ｎｍ、約４５ｎｍ～約８０ｎｍ、約５０ｎｍ～約７０ｎｍ、約６０ｎｍ～約７０ｎｍ、約６５ｎｍ～約７０ｎｍ、又は約２０ｎｍ、約２５ｎｍ、約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、約５０ｎｍ、約５５ｎｍ、約６０ｎｍ、約６５ｎｍ、約７０ｎｍの平均直径である。いくつかの実施形態によれば、ＬＮＰの平均直径は、約５０ｎｍ～約７０ｎｍである。これは非常に小型であるため、免疫応答を標的化及び回避するのに有利である。更に、本明細書に記載のＬＮＰは、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約６０％超～約９０％を封入することができる。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載のＬＮＰは、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約６０％超、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約６５％超、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約７０％超、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約７５％超、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約８０％超、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約８５％超、又はｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約９０％超を封入することができる。
本明細書に記載の脂質粒子（例えば、ナノ粒子）（例えば、ｃｅＤＮＡ脂質粒子、ｍＲＮＡ脂質粒子）は、他のプロセスによって生成されるＬＮＰと比較して、かつ他の脂質、例えば、イオン化カチオン性脂質と比較して、標的細胞／組織への核酸（例えば、ｃｅＤＮＡ、ｍＲＮＡ）の送達を増加させるために有利に使用することができる。したがって、本明細書に記載の脂質粒子（例えば、ナノ粒子）（例えば、ｃｅＤＮＡ脂質粒子、ｍＲＮＡ脂質粒子）は、当該技術分野で既知のプロセス及び方法によって調製された脂質粒子と比較して、最大の核酸送達を提供した。メカニズムはまだ決定されておらず、理論に束縛されるものではないが、本明細書に記載のプロセスによって調製される切断可能な脂質を含む脂質粒子（例えば、ナノ粒子）（例えば、ｃｅＤＮＡ脂質粒子又はｍＲＮＡ脂質粒子）は、肝細胞への送達を改善し、食作用を回避し、核へより効率的に輸送すると考えられる。本明細書に記載の切断可能な脂質を含む本明細書に記載のプロセスによって調製される脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）（例えば、ｃｅＤＮＡ脂質粒子、ｍＲＮＡ脂質粒子）の別の利点は、他の脂質（例えば、イオン化カチオン性脂質、例えば、ＭＣ３）と比較してより良好な忍容性である。
一実施形態では、切断可能な脂質は、３つの成分、すなわち、アミン先端基、リンカー基、及び疎水性テールを含み得る。一実施形態では、切断可能な脂質は、１つ以上のフェニルエステル結合、１つ以上の三級アミノ基、及びジスルフィド結合を含む。三級アミン基はｐＨ応答性を提供し、エンドソームの脱出を誘導し、フェニルエステル結合は、構造の分解性（自己分解性）を高め、ジスルフィド結合は、還元環境で切断する。
一実施形態では、切断可能な脂質は、ｓｓ－ＯＰ脂質である。一実施形態では、ｓｓ－ＯＰ脂質は、以下の式Ａに示される構造を含む。
脂質Ａ
一実施形態では、ＳＳ切断可能な脂質は、ＳＳ切断可能及びｐＨ活性化脂質様物質（ｓｓＰａｌｍ）である。ｓｓＰａｌｍ脂質は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｔｏｇａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，２７９（２０１８）２６２－２７０を参照し、これらの全内容は参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態では、ｓｓＰａｌｍは、脂質Ｂの構造を含むｓｓＰａｌｍＭ脂質である。
脂質Ｂ
一実施形態では、ｓｓＰａｌｍＥ脂質は、脂質Ｃの構造を含む、ｓｓＰａｌｍＥ－Ｐ４－Ｃ２脂質である。
脂質Ｃ
一実施形態では、ｓｓＰａｌｍＥ脂質は、脂質Ｄの構造を含むｓｓＰａｌｍＥ－Ｐａｚ４－Ｃ２脂質である。
脂質Ｄ
一実施形態では、切断可能な脂質は、ｓｓ－Ｍ脂質である。一実施形態では、ｓｓ－Ｍ脂質は、以下の脂質Ｅに示される構造を含む。
脂質Ｅ
一実施形態では、切断可能な脂質は、ｓｓ－Ｅ脂質である。一実施形態では、ｓｓ－Ｅ脂質は、以下の脂質Ｆに示される構造を含む。
脂質Ｆ
一実施形態では、切断可能な脂質は、ｓｓ－ＥＣ脂質である。一実施形態では、ｓｓ－ＥＣ脂質は、以下の脂質Ｇに示される構造を含む。
脂質Ｇ
一実施形態では、切断可能な脂質は、ｓｓ－ＬＣ脂質である。一実施形態では、ｓｓ－ＬＣ脂質は、以下の脂質Ｈに示される構造を含む。
脂質Ｈ
一実施形態では、切断可能な脂質は、ｓｓ－ＯＣ脂質である。一実施形態では、ｓｓ－ＯＣ脂質は、以下の脂質Ｊに示される構造を含む。
脂質Ｊ
一実施形態では、脂質粒子（脂質ナノ粒子）製剤は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、２０１８年９月７日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号に開示されるプロセスにより得られたｃｅＤＮＡで作製及びロードされる。これは、脂質をプロトン化し、粒子のｃｅＤＮＡ／脂質会合及び核形成に好ましいエネルギー論を提供する、低ｐＨでのエタノール脂質と水性ｃｅＤＮＡとの高エネルギー混合によって達成され得る。粒子は、水性希釈及び有機溶媒の除去によって更に安定化され得る。粒子は、所望のレベルに濃縮され得る。一実施形態では、本開示は、実施例２に記載のプロセスによって調製された式Ｉの脂質を含むｃｅＤＮＡ脂質粒子を提供する。
一般に、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、約１０：１～６０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ（質量又は重量）比で調製される。いくつかの実施形態では、脂質対ｃｅＤＮＡ比（質量／質量比、ｗ／ｗ比）は、約１：１～約６０：１、約１：１～約５５：１、約１：１～約５０：１、約１：１～約４５：１、約１：１～約４０：１、約１：１～約３５：１、約１：１～約３０：１、約１：１～約２５：１、約１０：１～約１４：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、約６：１～約９：１、約３０：１～約６０：１の範囲内であり得る。いくつかの実施形態によれば、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、約６０：１の全脂質比に対するｃｅＤＮＡ（質量又は重量）で調製される。いくつかの実施形態によれば、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、約３０：１の全脂質比に対するｃｅＤＮＡ（質量又は重量）で調製される。脂質及びｃｅＤＮＡの量を調整して、所望のＮ／Ｐ比、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０以上のＮ／Ｐ比を提供し得る。一般に、脂質粒子製剤の全体脂質含有量は、約５ｍｇ／ｍｌ～約３０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、ｃｅＤＮＡなどの核酸カーゴを凝縮及び／又は封入するための薬剤を含む。このような薬剤は、本明細書では、凝縮剤又は封入剤とも称される。制限なしに、核酸を凝縮及び／又は封入するための当該技術分野で既知の任意の化合物は、それが非融合性である限り使用することができる。言い換えれば、薬剤は、ｃｅＤＮＡなどの核酸カーゴを凝縮及び／又は封入することができるが、融合活性をほとんど又はまったく有しない。理論に拘束されることを望まないが、凝縮剤は、ｃｅＤＮＡなどの核酸を凝縮／封入しない場合、いくらかの融合活性を有する可能性があるが、当該凝縮剤で形成された脂質ナノ粒子を封入する核酸は、非融合性であり得る。本明細書に記載の製剤プロセスは、エタノール含有量の高い溶媒中でｃｅＤＮＡ圧縮が起こるという発見を利用する。得られた溶液が、９０～９２％エタノール及び８～１０％水であるような比率で、水性ｃｅＤＮＡ（９０％ＥｔＯＨ）を、脂質のエタノール溶液（例えば、９０％ＥｔＯＨ）に添加する場合、ｃｅＤＮＡは、動的光散乱によって圧縮された状態で存在することが観察される。このような溶媒（９０～９２％エタノール及び８～１０％水）では、脂質及びｃｅＤＮＡの両方が可溶化され、どちらの成分の沈殿も検出されない。
いくつかの実施形態によれば、本開示によって記載される製剤プロセス及び方法は、以前に報告されたよりもかなり多くの二本鎖ＤＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）を封入することができる。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載のＬＮＰは、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約６０％超、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約６５％超、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約７０％超、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約７５％超、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約８０％超、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約８５％超、又はｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約９０％超を封入することができる。
いくつかの実施形態によれば、溶媒は、約８０％のエタノール及び約２０％の水を含む。いくつかの実施形態によれば、溶媒は、約８１％のエタノール及び約１９％の水を含む。いくつかの実施形態によれば、溶媒は、約８２％のエタノール及び約１８％の水を含む。いくつかの実施形態によれば、溶媒は、約８３％のエタノール及び約１７％の水を含む。いくつかの実施形態によれば、溶媒は、約８４％のエタノール及び約１６％の水を含む。いくつかの実施形態によれば、溶媒は、約８５％のエタノール及び約１５％の水を含む。いくつかの実施形態によれば、溶媒は、約８６％のエタノール及び約１４％の水を含む。いくつかの実施形態によれば、溶媒は、約８７％のエタノール及び約１３％の水を含む。いくつかの実施形態によれば、溶媒は、約８８％のエタノール及び約１２％の水を含む。いくつかの実施形態によれば、溶媒は、約８９％のエタノール及び約１１％の水を含む。いくつかの実施形態によれば、溶媒は、約９０％のエタノール及び約１０％の水を含む。いくつかの実施形態によれば、溶媒は、約９１％のエタノール及び約９％の水を含む。いくつかの実施形態によれば、溶媒は、約９２％のエタノール及び約８％の水を含む。いくつかの実施形態によれば、溶媒は、約９３％のエタノール及び約７％の水を含む。いくつかの実施形態によれば、溶媒は、約９４％のエタノール及び約６％の水を含む。いくつかの実施形態によれば、溶媒は、約９５％のエタノール及び約５％の水を含む。
カチオン性脂質は、典型的に、核酸カーゴ、例えばｃｅＤＮＡを低ｐＨで凝縮させるため、及び膜会合及び膜融合性を駆動するために用いられる。一般に、カチオン性脂質は、正に電荷される、又は例えばｐＨ６．５以下の酸性条件下でプロトン化される少なくとも１つのアミノ基を含む脂質である。カチオン性脂質はまた、イオン化脂質、例えば、イオン化カチオン性脂質であり得る。「非融合性カチオン性脂質」とは、ｃｅＤＮＡなどの核酸カーゴを凝縮及び／又は封入することができるが、融合性活性を有するか、又はほとんど有しないカチオン性脂質を意味する。
一実施形態では、非カチオン性脂質は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の２０～９０％（ｍｏｌ）を含み得る。例えば、カチオン性脂質モル含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の２０～７０％（ｍｏｌ）、３０～６０％（ｍｏｌ）、４０～６０％（ｍｏｌ）、４０～５５％（ｍｏｌ）又は４５～５５％（ｍｏｌ）であり得る。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％を含む。
一実施形態では、ＳＳ切断可能な脂質は、ＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３ｌＺ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３ ｌ－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ又はＭＣ３）ではない。ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡは、Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ Ｅｎｇｌ．（２０１２），５１（３４）：８５２９－８５３３に記載され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。Ｄ－Ｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）の構造を脂質Ｋとして以下に示す。
脂質Ｋ
一実施形態では、切断可能な脂質は、脂質ＡＴＸ－００２ではない。脂質ＡＴＸ－００２は、Ｗ０２０１５／０７４０８５（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。一実施形態では、切断可能な脂質は、（１３Ｚ．１６Ｚ）－／Ｖ，／Ｖ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－ｌ－アミン（化合物３２）ではない。化合物３２は、ＷＯ２０１２／０４０１８４に記載され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一実施形態では、切断可能な脂質は、化合物６又は化合物２２ではない。化合物６及び２２は、ＷＯ２０１５／１９９９５２に記載され、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
カチオン性脂質の非限定的な例としては、ＳＳ切断可能及びｐＨ活性化脂質様物質－ＯＰ（ｓｓ－ＯＰ、式Ｉ）、ＳＳ切断可能及びｐＨ活性化脂質様物質－Ｍ（ＳＳ－Ｍ、式Ｖ）、ＳＳ切断可能及びｐＨ活性化脂質様物質－Ｅ（ＳＳ－Ｅ、式ＶＩ）、ＳＳ切断可能及びｐＨ活性化脂質様物質－ＥＣ（ＳＳ－ＥＣ、式ＶＩＩ）、ＳＳ切断可能及びｐＨ活性化脂質様物質－ＬＣ（ＳＳ－ＬＣ、式ＶＩＩＩ）、ＳＳ切断可能及びｐＨ活性化脂質様物質－ＯＣ（ＳＳ－ＯＣ、式ＩＸ）、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）スターバーストデンドリマー、リポフェクチン（ＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥの組み合わせ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｓｅ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００）、ＤＯＰＥ、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ（Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）、及びＥｕｆｅｃｔｉｎｓ（ＪＢＬ、Ｓａｎ Ｌｕｉｓ Ｏｂｉｓｐｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。例示的なカチオン性リポソームは、Ｎ－［ｌ－（２，３－ジオールオキシ）－プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ－［ｌ－（２，３－ジオールオキシ）－プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムメチルサルフェート（ＤＯＴＡＰ）、３ｂ－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、及びジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）から作製することができる。核酸（例えば、ｃｅＤＮＡ又はＣＥＬｉＤ）はまた、例えばポリ（Ｌ－リジン）又はアビジンと複合され得、脂質は、この混合物、例えばステリル－ポリ（Ｌ－リジン）に含まれ得るか、又は含まれない場合がある。
一実施形態では、カチオン性脂質は、式Ｉのｓｓ－ＯＰである。別の実施形態では、カチオン性脂質は、式ＩＩのＳＳ－ＰＡＺである。
一実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、米国特許第８，１５８，６０１号に記載されるカチオン性脂質、又は米国特許第８，０３４，３７６号に記載される脂質を使用して送達される。
非カチオン性脂質
一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、非カチオン性脂質を更に含むことができる。非カチオン性脂質は、融合性を高め、形成中のＬＮＰの安定性を高めるのに役立つことができる。非カチオン性脂質としては、両親媒性脂質、中性脂質、及びアニオン性脂質が挙げられる。したがって、非カチオン性脂質は、中性の非電荷、双性イオン性、又はアニオン性脂質であり得る。非カチオン性脂質は、典型的に、膜融合性を増強するために用いられる。
例示的な非カチオン性脂質としては、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－モノメチルＰＥなど）、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－ジメチルＰＥなど）、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２－ジフィタノイル（ｄｉｐｈｙｔａｎｏｙｌ）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＨｙＰＥ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リソレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジカシド、セレブロシド、ジセチルホスフェート、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、又はそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。他のジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミンリン脂質もまた使用され得ることを理解されたい。これらの脂質中のアシル基は、好ましくは、Ｃ１０－Ｃ２４炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、又はオレオイルである。
脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中での使用に好適な非カチオン性脂質の他の例としては、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、パルミチン酸アセチル、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリル系ポリマー、トリエタノールアミン－硫酸ラウリル、アルキル－アリールサルフェートポリエチルオキシル化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチル臭化アンモニウム、セラミド、スフィンゴミエリンなどの非亜リン脂質が挙げられる。
一実施形態では、非カチオン性脂質は、リン脂質である。一実施形態では、非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＳＭからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣである。他の実施形態では、非カチオン性脂質は、ＤＯＰＣである。他の実施形態では、非カチオン性脂質は、ＤＯＰＥである。
いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の０～２０％（ｍｏｌ）を含み得る。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の０．５～１５％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の５～１２％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の５～１０％（ｍｏｌ）である。一実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約６％（ｍｏｌ）である。一実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約７．０％（ｍｏｌ）である。一実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約７．５％（ｍｏｌ）である。一実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約８．０％（ｍｏｌ）である。一実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約９．０％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約１０％（ｍｏｌ）である。一実施形態では、非カチオン性脂質含有量は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の約１１％（ｍｏｌ）である。
例示的な非カチオン性脂質は、国際特許出願公開第２０１７／０９９８２３号及び米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号に記載されており、これら両方の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、脂質粒子の膜の統合性及び安定性を提供するために、ステロールなどの成分を更に含むことができる。一実施形態では、脂質粒子に使用することができる例示的なステロールは、コレステロール又はその誘導体である。コレステロール誘導体の非限定例としては、５α－コレスタノール、５β－コプロスタノール、コレステリル－（２’－ヒドロキシ）－エチルエーテル、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテル及び６－ケトコレスタノールなどの極性類似体、５α－コレスタン、コレステノン、５α－コレスタノン、５β－コレスタノン及びデカン酸コレステリルなどの非極性類似体、並びにそれらの混合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、コレステロール誘導体は、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテルなどの極性類似体である。いくつかの実施形態では、コレステロール誘導体は、ヘミコハク酸コレストリル（ＣＨＥＭＳ）である。
例示的なコレステロール誘導体は、国際特許出願公開第２００９／１２７０６０号及び米国特許出願公開第２０１０／０１３０５８８号に記載されており、これら両方の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、ステロールなどの膜統合性を提供する成分は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に存在する全脂質の０～５０％（ｍｏｌ）を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような成分は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の全脂質含有量の２０～５０％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、そのような成分は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の全脂質含有量の３０～４０％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、そのような成分は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の全脂質含有量の３５～４５％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、そのような成分は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の全脂質含有量の３８～４２％（ｍｏｌ）である。
一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はコンジュゲートされた脂質分子を更に含み得る。一般に、これらを使用して、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の凝集を阻害し、かつ／又は立体安定化を提供する。例示的なコンジュゲートされた脂質としては、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートなど）、カチオン性－ポリマー脂質（ＣＰＬ）コンジュゲート、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、コンジュゲートされた脂質分子は、ＰＥＧ化脂質、例えば、（メトキシポリエチレングリコール）－コンジュゲートされた脂質である。いくつかの他の実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ２０００－ＤＭＧ（ジミリストイルグリセロール）である。
例示的なＰＥＧ化脂質には、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（ｌ－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、ＰＥＧ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ－ＤＡＧ）（４－０－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－ｌ－０－（ｗ－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－ｌ，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、又はそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。追加の例示的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、例えば、ＵＳ５，８８５，６１３、ＵＳ６，２８７，５９１、ＵＳ２００３／００７７８２９、ＵＳ２００３／００７７８２９、ＵＳ２００５／０１７５６８２、ＵＳ２００８／００２００５８、ＵＳ２０１１／０１１７１２５、ＵＳ２０１０／０１３０５８８、ＵＳ２０１６／０３７６２２４、及びＵＳ２０１７／０１１９９０４に記載されており、それら全ての内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、ＰＥＧ－ＤＡＡ ＰＥＧ化脂質は、例えば、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル、又はＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピルであり得る。ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、ＰＥＧ－ジステリルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（ｌ－［８’－（コレスタ－５－エン－３［ベータ］－オキシ）カルボキシアミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、及びｌ，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］のうちの１つ以上であり得る。一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ｌ，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］
からなる群から選択することができる。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、Ｎ－（カルボニル－メトキシポ１エチ１エネグ１イコ１ン）－１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ－ＰＥＧｎ、ｎは、３５０、５００、７５０、１０００又は２０００である）、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコールｎ）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧｎ、ｎは、３５０、５００、７５０、１０００又は２０００である）、ＤＳＰＥ－ポリグリセリン－シクロヘキシル－カルボン酸、ＤＳＰＥ－ポリグリセリン－２－メチルグルタル－カルボン酸、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）共役ポリエチレングリコール（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＯＨ）、ポリエチレングリコール－ジミリストグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ポリエチレングリコール－ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＧ）、又はＮ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）２０００１１（Ｃ８ＰＥＧ２０００セラミド）からなる群から選択される。ｎが３５０、５００、７５０、１０００又は２０００であるＤＭＰＥ－ＰＥＧｎのいくつかの例では、ＰＥＧ－脂質は、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２，０００）である。ｎが３５０、５００、７５０、１０００又は２０００であるＤＳＰＥ－ＰＥＧｎのいくつかの例では、ＰＥＧ－脂質は、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２，０００）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＯＨである。いくつかの好ましい実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧである。
いくつかの実施形態では、結合脂質、例えばＰＥＧ化脂質は、組織特異的標的化リガンド、例えば第１又は第２の標的化リガンドを含む。例えば、ＧａｌＮＡｃリガンドとコンジュゲートしたＰＥＧ－ＤＭＧ。
一実施形態では、ＰＥＧ以外の分子とコンジュゲートされた脂質は、ＰＥＧ－脂質の代わりに使用することもできる。例えば、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートなど）、及びカチオン性－ポリマー脂質（ＣＰＬ）コンジュゲートを、ＰＥＧ－脂質の代わりに、又はそれに加えて使用することができる。例示的なコンジュゲートされた脂質、すなわち、ＰＥＧ－脂質、（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート、及びカチオン性ポリマー－脂質は、国際特許出願公開第１９９６／０１０３９２号、同第１９９８／０５１２７８号、同第Ｗ０２００２／０８７５４１号、同第Ｗ０２００５／０２６３７２号、同第２００８／１４７４３８号、同第Ｗ０２００９／０８６５５８号、同第Ｗ０２０１２／０００１０４号、同第２０１７／１１７５２８号、同第２０１７／０９９８２３号、同第２０１５／１９９９５２号、同第Ｗ０２０１７／００４１４３号、同第２０１５／０９５３４６号、同第２０１２／０００１０４号、同第２０１２／０００１０４号、及び同第２０１０／００６２８２号、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号、同第２００５／０１７５６８２号、同第２００８／００２００５８号、同第２０１１／０１１７１２５号、同第２０１３／０３０３５８７号、同第２０１８／００２８６６４号、同第２０１５／０３７６１１５号、同第２０１６／０３７６２２４号、同第２０１６／０３１７４５８号、同第２０１３／０３０３５８７号、同第２０１３／０３０３５８７号、及び同第２０１１／０１２３４５３号、並びに米国特許第５，８８５，６１３号、同第６，２８７，５９１号、同第６，３２０，０１７号、及び同第６，５８６，５５９号に記載されており、これらの内容は全て、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の０～２０％（ｍｏｌ）を含み得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質含有量は、０．５～１０％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質含有量は、１～５％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質含有量は、２～４％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質含有量は、２～３％（ｍｏｌ）である。一実施形態では、ＰＥＧ化脂質含有量は、約２％（ｍｏｌ）である。一実施形態では、ＰＥＧ化脂質含有量は、約２．５％（ｍｏｌ）である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ化脂質含有量は、約３％（ｍｏｌ）である。一実施形態では、ＰＥＧ化脂質含有量は、約３．５％（ｍｏｌ）である。一実施形態では、ＰＥＧ化脂質含有量は、約４％（ｍｏｌ）である。
カチオン性脂質、例えば、イオン化カチオン性脂質と、非カチオン性脂質、ステロール、及びＰＥＧ化脂質とのモル比は、必要に応じて変えることができることが理解される。例えば、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、組成物のモル又は全重量で３０～７０％のカチオン性脂質、組成物のモル又は全重量で０～６０％のコレステロール、組成物のモル又は全重量で０～３０％の非カチオン性脂質、及び組成物のモル又は全重量で２～５％のＰＥＧ化脂質を含むことができる。一実施形態では、組成物は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、組成物のモル又は全重量で４０～６０％のカチオン性脂質、組成物のモル又は全重量で３０～５０％のコレステロール、組成物のモル又は全重量で５～１５％の非カチオン性脂質、及び組成物のモル又は全重量で２～５％のＰＥＧ又はコンジュゲートされた脂質を含む。一実施形態では、組成物は、組成物のモル又は全重量で４０～６０％のイオン化脂質、組成物のモル又は全重量で３０～４０％のコレステロール、及び組成物のモル又は全重量で５～１０％の非カチオン性脂質、及び組成物のモル又は全重量で２～５％のＰＥＧ化脂質である。組成物は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、組成物のモル又は全重量で６０～７０％のカチオン性脂質、組成物のモル又は全重量で２５～３５％のコレステロール、組成物のモル又は全重量で５～１０％の非カチオン性脂質、及び組成物のモル又は全重量で２～５％のＰＥＧ化脂質を含有し得る。組成物はまた、組成物のモル又は全重量で最大４５～５５％のイオン化脂質、組成物のモル又は全重量で３５～４５％のコレステロール、及び組成物のモル又は全重量で２～１５％の非カチオン性脂質、及び組成物のモル又は全重量で２～５％のＰＥＧ化脂質を含有し得る。製剤はまた、例えば、組成物のモル若しくは全重量で８～３０％のカチオン性脂質、組成物のモル若しくは全重量で５～１５％の非カチオン性脂質、及び組成物のモル若しくは全重量で０～４０％のコレステロール；組成物のモル若しくは全重量で４～２５％のカチオン性脂質、組成物のモル若しくは全重量で４～２５％の非カチオン性脂質、組成物のモル若しくは全重量で２～２５％のコレステロール、組成物のモル若しくは全重量で１０～３５％の複合脂質、及び組成物のモル若しくは全重量で５％のコレステロール；又は組成物のモル若しくは全重量で２～３０％のカチオン性脂質、組成物のモル若しくは全重量で２～３０％の非カチオン性脂質、組成物のモル若しくは全重量で１～１５％のコレステロール、組成物のモル若しくは全重量で２～３５％のＰＥＧ化脂質、及び組成物のモル若しくは全重量で１～２０％のコレステロール；又は更には組成物のモル若しくは全重量で最大９０％のカチオン性脂質、及び組成物のモル若しくは全重量で２～１０％の非カチオン性脂質；又は更には組成物のモル若しくは全重量で１００％のカチオン性脂質を含む、脂質ナノ粒子であってもよい。いくつかの実施形態では、脂質粒子製剤は、カチオン性脂質、非カチオン性リン脂質、コレステロール、及びＰＥＧ化脂質（コンジュゲートされた脂質）を５０：９：３８．５：２．５のモル比で含む。
一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）製剤は、カチオン性脂質、非カチオン性リン脂質、コレステロール、及びＰＥＧ化脂質（コンジュゲートされた脂質）を約５０：７：４０：３のモル比で含む。
他の態様では、本開示は、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン、及びホスファチジルエタノールアミンを含む脂質ナノ粒子製剤を提供する。
一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質（例えば、リン脂質）、ステロール（例えば、コレステロール）、及びＰＥＧ化脂質（コンジュゲートされた脂質）を含み、脂質のモル比は、カチオン性脂質の場合、２０～７０モルパーセントの範囲であり（目標３０～６０）、非カチオン性脂質のモルパーセントは、０～３０の範囲であり（目標０～１５）、ステロールのモルパーセントは、２０～７０の範囲であり（目標３０～５０）、ＰＥＧ化脂質（コンジュゲートされた脂質）のモルパーセントは、１～６の範囲である（目標２～５）。
ｃｅＤＮＡを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、２０１８年９月７日に提出された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号に開示されており、これはその全体が本明細書に組み込まれ、本明細書に開示される方法及び組成物における使用が想定される。
脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）サイズは、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を使用して準弾性光散乱によって決定することができる。いくつかの実施形態によれば、光散乱によって決定されるＬＮＰ平均直径は、約７５ｎｍ未満又は約７０ｎｍ未満である。いくつかの実施形態によれば、光散乱によって決定されるＬＮＰ平均直径は、約５０ｎｍ～約７５ｎｍ又は約５０ｎｍ～約７０ｎｍである。
製剤化されたカチオン性脂質のｐＫａは、核酸の送達のためのＬＮＰの有効性と相関し得る（Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２），５１（３４），８５２９－８５３３、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８，１７２－１７６（２０１０）を参照されたく、それらの両方は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。一実施形態では、各カチオン性脂質のｐＫａは、２－（ｐ－トルイジノ）－６－ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）の蛍光に基づくアッセイを使用して、脂質ナノ粒子中で決定される。０．４ｍＭ全脂質の濃度でのＰＢＳ中のカチオン性脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－脂質（５０／１０／３８．５／１．５ｍｏｌ％）からなる脂質ナノ粒子は、本明細書及び他に記載されるインラインプロセスを使用して調製され得る。ＴＮＳは、蒸留水中の１００ｍＭストック溶液として調製され得る。小胞は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭの酢酸アンモニウム、１３０ｍＭのＮａＣｌを含有する２ｍＬの緩衝溶液中の２４ｍＭ脂質に希釈され得、ｐＨは、２．５～１１の範囲である。ＴＮＳ溶液のアリコートを添加して、１ｍＭの最終濃度にすることができ、続いて渦流混合発光強度を、３２１ｎｍの励起波長及び４４５ｎｍの発振波長を使用し、ＳＬＭ Ａｍｉｎｃｏ Ｓｅｒｉｅｓ ２発光分光光度計において室温で測定する。Ｓ字状最良適合分析は、蛍光データに適用することができ、ｐＫａは、半最適蛍光強度を生じるｐＨとして測定される。
一実施形態では、相対活性は、尾静脈注射を介した投与の４時間後に肝臓内のルシフェラーゼ発現を測定することによって決定され得る。活性は、０．３及び１．０ｍｇ ｃｅＤＮＡ／ｋｇの用量で比較され、投与の４時間後に測定された肝臓１ｇ当たりのルシフェラーゼｎｇとして表される。
無制限に、本開示の脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、カプシド不含非ウイルスＤＮＡベクターを目的の標的部位（例えば、細胞、組織、器官など）に送達するように使用され得る脂質製剤を含む。一般に、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクター及びカチオン性脂質又はその塩を含む。
一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、カチオン性脂質／非カチオン性脂質／ステロール／コンジュゲートされた脂質を５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。
一実施形態では、本開示は、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンを含む脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）製剤を提供する。
ＩＩＩ．剛性治療用核酸
本開示の態様は、一般に、閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）のような剛性治療用核酸（ＴＮＡ）及び脂質を含む脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）を提供する。
閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクター
本開示の実施形態は、導入遺伝子（例えば、治療用核酸）を発現することができる閉端直鎖状二重鎖（ｃｅＤＮＡ）ベクターを含む方法及び組成物に基づく。本明細書に記載されるようなｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスカプシド内の限定空間によって課されるパッケージング制約を有しない。ｃｅＤＮＡベクターは、封入されたＡＡＶゲノムとは対照的な原核細胞的に産生されたプラスミドＤＮＡベクターに対する可変の真核細胞的に産生された代替物を表す。これは、制御エレメント、例えば、本明細書に開示される調節スイッチ、大きな導入遺伝子、複数の導入遺伝子などの挿入を許可する。
ｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、非連続的な構造ではなく直鎖状で連続的な構造を有する。直鎖状で連続的な構造は、細胞エンドヌクレアーゼによる攻撃に対してより安定であると同時に、組換えられて変異誘発を引き起こす可能性が低いと考えられる。したがって、直鎖状で連続的な構造のｃｅＤＮＡベクターは、好ましい実施形態である。連続的な直鎖状の一本鎖分子内二重鎖ｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列なしに、終端に共有結合している可能性がある。これらのｃｅＤＮＡベクターは、細菌起源の環状二重鎖核酸分子であるプラスミド（本明細書に記載されるｃｅＤＮＡプラスミドを含む）とは構造的に異なる。プラスミドの相補鎖は、変性に続いて分離されて２つの核酸分子を産生することができるが、反対に、ｃｅＤＮＡベクターは、相補鎖を有するが、単一ＤＮＡ分子であり、したがって変性された場合でも単一分子のままであるという可能性がある。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、プラスミドとは異なり、原核細胞タイプのＤＮＡ塩基メチル化なしに産生され得る。したがって、ｃｅＤＮＡベクター及びｃｅＤＮＡ－プラスミドは、構造（特に、直鎖状対環状）並びにこれらの異なる対象物を産生及び精製するために使用される方法の両方に関して、またｃｅＤＮＡ－プラスミドの場合は原核細胞タイプ及びｃｅＤＮＡベクターの場合は真核細胞タイプのものである、それらのＤＮＡメチル化に関して異なる。
本明細書で提供されるのは、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ｃｅＤＮＡ分子（ｃｅＤＮＡ）である。これらの非ウイルスカプシド不含ｃｅＤＮＡ分子は、２つの異なる逆位末端反復（ＩＴＲ）配列の間に位置付けられた異種遺伝子（例えば、導入遺伝子、特に治療用導入遺伝子）を含有する発現構築物（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス又は統合型細胞株）からの許容宿主細胞中で産生され得、ＩＴＲは、互いに関して異なる。いくつかの実施形態では、ＩＴＲのうちの１つは、野生型ＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ）と比較した欠失、挿入、及び／又は置換によって修飾され、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、機能性末端分解部位（ｔｒｓ）及びＲｅｐ結合部位を含む。ｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、発現カセットなどの分子の少なくとも一部分にわたって二重鎖、例えば、自己相補的である（例えば、ｃｅＤＮＡは、二本鎖環状分子ではない）。ｃｅＤＮＡベクターは、共有結合性閉端を有し、したがって、例えば、１時間以上３７℃でエキソヌクレアーゼ消化（例えば、エキソヌクレアーゼＩ又はエキソヌクレアーゼＩＩＩ）に対して耐性である。
一態様では、ｃｅＤＮＡベクターは、５’から３’方向に、第１のアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、目的のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、及び第２のＡＡＶ ＩＴＲを含む。一実施形態では、第１のＩＴＲ（５’ＩＴＲ）及び第２のＩＴＲ（３’ＩＴＲ）は、互いに対して非対称である。すなわち、それらは、互いに異なる三次元空間構成を有する。例示的な実施形態として、第１のＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり得、第２のＩＴＲは、変異型又は修飾型ＩＴＲであり得るか、又はその逆であり、第１のＩＴＲは、変異型又は修飾型ＩＴＲであり得、第２のＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり得る。一実施形態では、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲは、両方とも修飾されているが、異なる配列であるか、又は異なる修飾を有するか、又は同一の修飾型ＩＴＲではなく、異なる三次元空間構成を有する。言い換えると、非対称ＩＴＲを用いるｃｅＤＮＡベクターは、ＷＴ－ＩＴＲに対する１つのＩＴＲのいかなる変更も他のＩＴＲに反映されないＩＴＲを有するか、あるいは、非対称ＩＴＲが修飾された非対称ＩＴＲ対を有する場合は、互いに対して異なる配列及び異なる三次元形状を有し得る。
一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、５’から３’方向に、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、目的のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、及び第２のＡＡＶ ＩＴＲを含み、第１のＩＴＲ（５’ＩＴＲ）及び第２のＩＴＲ（３’ＩＴＲ）は、互いに対して対称又は実質的に対称であり、すなわち、ｃｅＤＮＡベクターは、対称の三次元空間構成を有するＩＴＲ配列を含み得、それによりそれらの構造は、幾何学的空間で同じ形状であるか、又は三次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’、Ｂ－Ｂ’ループを有する。そのような実施形態では、対称のＩＴＲ対、又は実質的に対称のＩＴＲ対は、野生型ＩＴＲではない修飾型ＩＴＲ（例えば、ｍｏｄ－ＩＴＲ）であり得る。ｍｏｄ－ＩＴＲ対は、野生型ＩＴＲからの１つ以上の修飾を有し、互いに逆相補（逆位）である同じ配列を有し得る。一実施形態では、修飾型ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、修飾型ＩＴＲ対は、異なる配列を有し得るが、対応する又は同じ対称な三次元形状を有し得る。いくつかの実施形態では、対称のＩＴＲ、又は実質的に対称のＩＴＲは、本明細書に記載されるように野生型（ＷＴ－ＩＴＲ）であり得る。すなわち、両方のＩＴＲが野生型配列を有するが、必ずしも同じＡＡＶ血清型のＷＴ－ＩＴＲである必要はない。一実施形態では、一方のＷＴ－ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他方のＷＴ－ＩＴＲは、異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。そのような実施形態では、ＷＴ－ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、それらは、対称的な三次元空間構成を維持しながら、１つ以上の保存的ヌクレオチド修飾を有することができる。
本明細書に提供される野生型又は変異型又は他の方法で修飾されたＩＴＲ配列は、ｃｅＤＮＡベクターの産生のために発現構築物（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス）に含まれるＤＮＡ配列を表す。したがって、ｃｅＤＮＡ－プラスミド又は他の発現構築物から産生されたｃｅＤＮＡベクター中に実際に含有されるＩＴＲ配列は、産生プロセス中に起こる天然に存在する変化（例えば、複製エラー）の結果として、本明細書に提供されるＩＴＲ配列に対して同一であっても同一でなくてもよい。
一実施形態では、治療用核酸配列である導入遺伝子を有する発現カセットを含む本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を可能にするか又は制御する１つ以上の調節配列に作動可能に連結され得る。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、第１のＩＴＲ配列及び第２のＩＴＲ配列を含み、目的のヌクレオチド配列は、第１及び第２のＩＴＲ配列によって隣接され、第１及び第２のＩＴＲ配列は、互いに対して非対称であるか、又は互いに対して対称である。
一実施形態では、発現カセットは、２つのＩＴＲ間に位置し、導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーター、転写後調節エレメント、並びにポリアデニル化及び終結シグナルのうちの１つ以上をこの順に含む。一実施形態では、プロモーターは、調節可能－誘導可能又は抑制可能である。プロモーターは、導入遺伝子の転写を促進する任意の配列であり得る。一実施形態では、プロモーターは、ＣＡＧプロモーター又はその変形である。転写後調節エレメントは、導入遺伝子の発現を調整する配列であり、非限定的な例として、治療用核酸配列である導入遺伝子の発現を強化する三次構造を作成する任意の配列である。
一実施形態では、転写後調節エレメントは、ＷＰＲＥを含む。一実施形態では、ポリアデニル化及び終結シグナルは、ＢＧＨポリＡを含む。当該技術分野において既知の任意のシス調節エレメント、又はその組み合わせ、例えば、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー配列（ＵＳＥ）又は他の転写後処理エレメント（限定されないが、単純ヘルペスウイルス又はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のチミジンキナーゼ遺伝子を含む）が追加として使用され得る。一実施形態では、５’～３’方向の発現カセット長は、ＡＡＶビリオン中でカプシド化されることが知られている最大長を超える。一実施形態では、長さは、４．６ｋｂ超、又は５ｋｂ超、又は６ｋｂ超、又は７ｋｂ超である。様々な発現カセットが、本明細書に例示される。
一実施形態では発現カセットは、４０００ヌクレオチド超、５０００ヌクレオチド、１０，０００ヌクレオチド、若しくは２０，０００ヌクレオチド、若しくは３０，０００ヌクレオチド、若しくは４０，０００ヌクレオチド、又は５０，０００ヌクレオチド、又は約４０００～１０，０００ヌクレオチド、若しくは１０，０００～５０，０００ヌクレオチドの任意の範囲、又は５０，０００ヌクレオチド超を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００～５０，０００ヌクレオチド長の範囲の治療用核酸配列である導入遺伝子を含み得る。一実施形態では、発現カセットは、５００～７５，０００ヌクレオチド長の範囲の治療用核酸配列である導入遺伝子を含み得る。一実施形態では、発現カセットは、５００～１０，０００ヌクレオチド長の範囲の治療用核酸配列である導入遺伝子を含み得る。一実施形態では、発現カセットは、１０００～１０，０００ヌクレオチド長の範囲の治療用核酸配列である導入遺伝子を含み得る。一実施形態では、発現カセットは、５００～５，０００ヌクレオチド長の範囲の治療用核酸配列である導入遺伝子を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、カプシド化ＡＡＶベクターのサイズ制限がないため、大きなサイズの発現カセットを宿主に送達することが可能である。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、原核細胞特異的メチル化を欠いている。
一実施形態では、剛性治療用核酸は、プラスミドであり得る。
一実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、治療目的（例えば、医療、診断、若しくは獣医学的使用）又は免疫原性ポリペプチドに使用される。
発現カセットは、治療用核酸配列である任意の導入遺伝子を含むことができる。ある特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、１つ以上のポリペプチド、ペプチド、リボザイム、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉｓ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、抗体、抗原結合断片、又はそれらの任意の組み合わせを含む、対象における任意の目的の遺伝子を含む。
一実施形態では、ｃｅＤＮＡ発現カセットは、例えば、レシピエント対象において存在しない、不活性、若しくは不十分な活性であるタンパク質をコードする発現可能な外因性配列（例えば、オープンリーディングフレーム）、又は所望の生物学的若しくは治療効果を有するタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。一実施形態では、ドナー配列などの外因性配列は、欠陥遺伝子又は転写産物の発現を訂正するように機能することができる遺伝子産物をコードすることができる。一実施形態では、発現カセットはまた、訂正ＤＮＡ鎖をコードし、ポリペプチド、センス若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はＲＮＡ（コード若しくは非コード；例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、及びそれらのアンチセンス対応物（例えば、ａｎｔａｇｏＭｉＲ））をコードし得る。一実施形態では、発現カセットは、実験又は診断の目的で使用されるレポータータンパク質をコードする外因性配列、例えばｂ－ラクタマーゼ、ｂ－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、及び当該技術分野において周知の他のものを含み得る。
したがって、発現カセットは、変異のために低減若しくは欠如しているタンパク質、ポリペプチド、若しくはＲＮＡをコードする、又は過剰発現が本開示の範囲内であるとみなされる場合に治療効果をもたらす任意の遺伝子を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、ヌクレアーゼによって提供される二本鎖切断（又はニック）の後に挿入される訂正ＤＮＡ鎖として使用されるテンプレート又はドナーヌクレオチド配列を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、誘導型ＲＮＡヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、又はジンクフィンガーヌクレアーゼによって提供される二本鎖切断（又はニック）の後に挿入される訂正ＤＮＡ鎖として使用されるテンプレートヌクレオチド配列を含み得る。
治療用核酸
本開示の例示的な治療用核酸としては、ミニ遺伝子、プラスミド、ミニサークル、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、リボザイム、閉端二本鎖ＤＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ、ＣＥＬｉＤ、直鎖状の共有結合的に閉じたＤＮＡ（「ミニストリング」）、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）、プロテロメア閉端ＤＮＡ、又はダンベル直鎖状ＤＮＡ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及びＤＮＡウイルスベクター、ウイルスＲＮＡベクター、並びにそれらの任意の組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されない。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれるプロセスを通じて特定のタンパク質の細胞内レベルを下方調節することができるｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡもまた、本開示によって核酸治療薬であると企図される。ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡが宿主細胞の細胞質に導入された後、これらの二本鎖ＲＮＡ構築物はＲＩＳＣと呼ばれるタンパク質に結合することができる。ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡのセンス鎖はＲＩＳＣ複合体によって除去される。ＲＩＳＣ複合体は、相補的ｍＲＮＡと結合すると、ｍＲＮＡを切断し、切断された鎖を放出する。ＲＮＡｉは、対応するタンパク質の下方調節をもたらすｍＲＮＡの特異的破壊を誘導することによるものである。
タンパク質へのｍＲＮＡ翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）及びリボザイムは、核酸治療薬となり得る。アンチセンス構築物の場合、これらの一本鎖デオキシ核酸は、標的タンパク質ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を有し、ワトソンは、クリック塩基対合によってｍＲＮＡに結合することができる。この結合は、標的ｍＲＮＡの翻訳を防ぎ、かつ／又はｍＲＮＡ転写産物のＲＮａｓｅＨ分解を誘起する。その結果、アンチセンスオリゴヌクレオチドは作用の特異性（すなわち、特定の疾患関連タンパク質の下方調節）を高めた。
本明細書で提供される方法のいずれにおいても、治療用核酸は治療用ＲＮＡであり得る。当該治療用ＲＮＡは、ｍＲＮＡ翻訳の阻害剤、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の薬剤、触媒的に活性なＲＮＡ分子（リボザイム）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、又はｍＲＮＡ転写物（ＡＳＯ）、タンパク質若しくは他の分子リガンドに結合するＲＮＡ（アプタマー）であり得る。本明細書で提供される方法のいずれにおいても、ＲＮＡｉの薬剤は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ、又は三重らせん形成オリゴヌクレオチドであり得る。
いくつかの実施形態によれば、本開示によって記載される製剤プロセス及び方法は、以前に報告されたよりもかなり多くの二本鎖ＤＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）を封入することができる。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載のＬＮＰは、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約６０％超、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約６５％超、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約７０％超、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約７５％超、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約８０％超、ｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約８５％超、又はｃｅＤＮＡのような剛性二本鎖ＤＮＡの約９０％超を封入することができる。
ＩＶ．変性治療用核酸
本開示の態様は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）及び変性治療用核酸（ＴＮＡ）を含む薬学的組成物を更に提供し、ＴＮＡは上記で定義したとおりである。一実施形態では、変性ＴＮＡは、閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）である。「変性治療用核酸」という用語は、コンフォメーションが標準的なＢ型構造から変化した、部分的又は完全なＴＮＡを指す。コンフォメーションの変化には、二次構造の変化（すなわち、単一の核酸分子内の塩基対相互作用）及び／又は三次構造の変化（すなわち、二重らせん構造）が含まれ得る。理論に拘束されるものではないが、本発明者らは、アルコール／水溶液又は純粋なアルコール溶媒で処理されたＴＮＡが、ＬＮＰによる封入効率を高めるコンフォメーションへの核酸の変性をもたらし、より小さい直径サイズ（すなわち、７５ｎｍ未満、例えば、直径約６８～７４ｎｍの平均サイズ）を有するＬＮＰ製剤を生成すると信じられていた。本明細書に記載の全てのＬＮＰ平均直径サイズ及びサイズ範囲は、変性ＴＮＡを含有するＬＮＰに適用される。
ＤＮＡが水性環境にある場合、ＤＮＡは完全ならせんターンごとに１０．４塩基対のＢ型構造を有する。メタノールなどの適度に極性の低いアルコールを添加してこの水性環境を徐々に変化させると、らせんのねじれが緩み、円二色性（ＣＤ）分光法で可視化されるようにＤＮＡはらせんの１回転当たりわずか１０．２塩基対の形に滑らかに変化する。一実施形態では、本明細書で提供される薬学的組成物中の変性ＴＮＡは、１０．２型構造を有する。
この挙動とは対照的に、水をエタノールなどのわずかに極性の低いアルコールに置き換えると、水の約６５％がエタノールに置き換えられるまで、同じ種類の構造変化が起こる。この時点で、ＤＮＡは、ＣＤで可視化されるように、らせんの１回転当たり１１塩基対を含む、よりきつくねじれたらせんを持つＡ型構造に急激に変化する。一実施形態では、本明細書で提供される薬学的組成物中の変性ＴＮＡは、Ａ型構造を有する。
いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供される薬学的組成物中の変性ＴＮＡは、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）で可視化すると棒状構造を有する。いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供される薬学的組成物中の変性ＴＮＡは、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）で可視化すると、円形様構造を有する。これに対して、変性していないＴＮＡは、鎖状の構造を有する。
いくつかの実施形態によれば、本明細書で提供される薬学的組成物中の変性ＴＮＡは、水素結合がほとんど又は全くなく、塩基スタッキングがなく、縮合三次構造を有するＰ型構造を有する。
Ｖ．ｃｅＤＮＡベクターの産生
本開示の実施形態は、導入遺伝子（例えば、ＴＮＡ）を発現することができる閉端直鎖状二重鎖（ｃｅＤＮＡ）ベクターを含む方法及び組成物に基づく。本明細書に記載されるようなｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスカプシド内の限定空間によって課されるパッケージング制約を有しない。ｃｅＤＮＡベクターは、封入されたＡＡＶゲノムとは対照的な原核細胞的に産生されたプラスミドＤＮＡベクターに対する可変の真核細胞的に産生された代替物を表す。これは、制御エレメント、例えば、本明細書に開示される調節スイッチ、大きな導入遺伝子、複数の導入遺伝子などの挿入を許可する。
本明細書で定義される非対称ＩＴＲ対又は対称ＩＴＲ対を含む本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクターの産生のための方法は、２０１８年９月７日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６のセクションＩＶに記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるように、ｃｅＤＮＡベクターは、例えば、ａ）ポリヌクレオチド発現構築物テンプレート（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、及び／又はｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス）を内包する宿主細胞（例えば、昆虫細胞）の集団をインキュベートするステップであって、Ｒｅｐタンパク質の存在下では、宿主細胞内のｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたってウイルスカプシドコード配列を欠いており、宿主細胞が、ウイルスカプシドコード配列を含まない、インキュベートするステップと、ｂ）ｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞から採取し、単離するステップと、を含むプロセスによって取得され得る。Ｒｅｐタンパク質の存在は、修飾型ＩＴＲを有するベクターポリヌクレオチドの複製を誘導して、宿主細胞中でｃｅＤＮＡベクターを産生する。
以下は非限定的な例として提供される。
いくつかの実施形態によれば、合成ｃｅＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ分子からの切除を介して産生される。ｃｅＤＮＡベクターの合成産生は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、２０１９年１月１８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２号の実施例２～６に記載される。二本鎖ＤＮＡ分子の切除を伴う合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する１つの例示的な方法。簡潔には、ｃｅＤＮＡベクターは、二本鎖ＤＮＡ構築物を使用して生成され得る。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の図７Ａ～８Ｅを参照されたい。いくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡ構築物はｃｅＤＮＡプラスミドであり、例えば、２０１８年１２月６日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号の図６を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを作製するための構築物は、導入遺伝子の発現を調節するための追加成分、例えば、導入遺伝子の発現を調節するための調節スイッチ、又はベクターを含む細胞を殺傷し得るキルスイッチを含む。
分子調節スイッチは、シグナルに反応して、状態の測定可能な変化を生成するものである。そのような調節スイッチは、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターと有用に組み合わせて、導入遺伝子の発現の出力を制御することができる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を微調整するのに役立つ調節スイッチを含む。例えば、ｃｅＤＮＡベクターの生物学的封じ込め機能として役立ち得る。いくつかの実施形態では、スイッチは、ｃｅＤＮＡベクターにおける目的の遺伝子の、制御可能かつ調節可能な発現を開始又は停止（すなわち、シャットダウン）するように設計された「オン／オフ」スイッチである。いくつかの実施形態では、スイッチは、一旦スイッチが起動されると、合成ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞がプログラム細胞死を受けるよう指示することができる「キルスイッチ」を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターでの使用に包含される例示的な調節スイッチは、導入遺伝子の発現を調節するために使用することができ、参照により全体が本明細書に組み込まれかつ本明細書に記載される国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号においてより完全に考察されている。
様々なオリゴヌクレオチドの集成を伴う合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する別の例示的な方法は、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の実施例３に提供されており、ｃｅＤＮＡベクターは、５´オリゴヌクレオチド及び３´ＩＴＲオリゴヌクレオチドを合成し、ＩＴＲオリゴヌクレオチドを、発現カセットを含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションすることによって産生される。参照により全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の図１１Ｂは、５´ＩＴＲオリゴヌクレオチド及び３´ＩＴＲオリゴヌクレオチドを、発現カセットを含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションする例示的な方法を示す。
合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する例示的な方法は、参照により全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の実施例４において提供され、センス発現カセット配列に隣接しアンチセンス発現カセットに隣接する２つのアンチセンスＩＴＲに共有結合的に結合される２つのセンスＩＴＲを含む一本鎖の直鎖状ＤＮＡを使用し、次いで、この一本鎖の直鎖状ＤＮＡの末端をライゲーションして、閉端一本鎖分子を形成する。非限定的な一例は、一本鎖ＤＮＡ分子を合成及び／又は産生し、分子の一部をアニーリングして、二次構造の１つ以上の塩基対合領域を有する単一の直鎖状ＤＮＡ分子を形成し、次いで遊離５´及び３´末端を互いにライゲーションして、閉鎖状一本鎖分子を形成する。
更に別の態様では、本開示は、非ウイルス性ＤＮＡベクターの産生に使用するため、本明細書に記載されるＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現テンプレート（ｃｅＤＮＡテンプレート）をそれら自体のゲノムに安定して組み込んでいる宿主細胞株を提供する。そのような細胞株を産生する方法は、Ｌｅｅ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ８（８）：ｅ６９８７９に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、Ｒｅｐタンパク質は、３のＭＯＩで宿主細胞に添加される。一実施形態では、宿主細胞株は無脊椎動物の細胞株、好ましくは昆虫Ｓｆ９細胞である。宿主細胞株が哺乳動物細胞株、好ましくは２９３細胞である場合、細胞株は、安定して組み込まれたポリヌクレオチドベクターテンプレートを有し得、ヘルペスウイルスなどの第２のベクターを使用して、Ｒｅｐタンパク質を細胞に導入することができ、Ｒｅｐの存在下でのｃｅＤＮＡの切除及び増幅を可能にする。
任意のプロモーターは、ベクターポリヌクレオチドの異種核酸（例えば、レポーター核酸又は治療用導入遺伝子）に操作可能に連結することができる。発現カセットは、ＣＡＧプロモーターなどの合成調節エレメントを含有し得る。ＣＡＧプロモーターは、（ｉ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）早期エンハンサーエレメント、（ｉｉ）プロモーター、ニワトリベータアクチン遺伝子の第１のエクソン及び第１のイントロン、並びに（ｉｉ）ウサギベータグロビン遺伝子のスプライスアクセプターを含む。代替的に、発現カセットは、アルファ－１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）プロモーター、肝臓特異的（ＬＰ１）プロモーター、又はヒト伸長因子－１アルファ（ＥＦ１－α）プロモーターを含むことができる。いくつかの実施形態では、発現カセットは、１つ以上の構成的プロモーター、例えば、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター（任意にＣＭＶエンハンサーを有する）を含む。代替的に、誘導性若しくは抑制性プロモーター、導入遺伝子の未変性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は当該技術分野において既知の様々なプロモーターを使用することができる。遺伝子療法のための好適な導入遺伝子は、当業者に周知である。
カプシド不含ｃｅＤＮＡベクターはまた、シス調節エレメント、又はシス調節エレメントの組み合わせを更に含むベクターポリヌクレオチド発現構築物から産生され得、非限定的な例は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）及びＢＧＨポリＡ、又は例えば、ベータ－グロビンポリＡを含む。他の転写後処理エレメントは、例えば、単純ヘルペスウイルス、又はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のチミジンキナーゼ遺伝子を含む。発現カセットは、例えば、ウシＢＧＨｐＡ若しくはウイルスＳＶ４０ｐＡから単離された天然、又は合成などの、当該技術分野において既知の任意のポリアデニル化配列又はその変形を含み得る。いくつかの発現カセットはまた、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー（ＵＳＥ）配列を含み得る。ＵＳＥは、ＳＶ４０ｐＡ又は異種ポリＡシグナルと組み合わせて使用され得る。
本明細書に記載されるＤＮＡベクターを細胞から採取及び収集するための時間は、ｃｅＤＮＡベクターの高収率産生を達成するために選択され、最適化され得る。例えば、採取時間は、細胞生存率、細胞形態、細胞増殖などを考慮して選択され得る。一実施形態では、細胞は、十分な条件下で増殖し、ＤＮＡベクターを産生するためのバキュロウイルス感染から十分な時間が経過した後）、ただし細胞の大半がウイルスの毒性のために死滅し始める前に採取される。ＤＮＡ－ベクターは、Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏ－Ｆｒｅｅプラスミドキットなどのプラスミド精製キットを使用して単離され得る。プラスミド単離のために開発された他の方法もまた、ＤＮＡベクターに対して適合され得る。一般に、任意の核酸精製方法が採用され得る。
ＤＮＡベクターは、ＤＮＡの精製のための当業者に既知の任意の手段によって精製され得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＤＮＡ分子として精製される。別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、エキソソーム又は微粒子として精製される。
一実施形態では、カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクターは、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、目的のヌクレオチド配列（例えば、外因性ＤＮＡの発現カセット）及び修飾ＡＡＶ ＩＴＲをこの順で含むポリヌクレオチドテンプレートを含むプラスミドを含むか、又はそれから得られ、当該テンプレート核酸分子は、ＡＡＶカプシドタンパク質コードを欠いている。更なる実施形態では、本開示の核酸テンプレートは、ウイルス性カプシドタンパク質コード配列を欠いている（すなわち、ＡＡＶカプシド遺伝子だけでなく、他のウイルスのカプシド遺伝子も欠いている）。加えて、特定の実施形態では、テンプレート核酸分子はまた、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コード配列を欠いている。したがって、好ましい実施形態では、本開示の核酸分子は、機能的なＡＡＶキャップ及びＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の両方を欠いている。
一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示される野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲに関して変異したＩＴＲ構造を含み得るが、依然として操作可能なＲＢＥ、ＴＲＳ、及びＲＢＥ´部分を保持する。
ｃｅＤＮＡプラスミド
ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ｃｅＤＮＡベクターの後期産生に使用されるプラスミドである。一実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、転写方向の作動可能に連結された構成成分として、少なくとも（１）修飾型５’ＩＴＲ配列、（２）シス調節エレメントを含有する発現カセット、例えば、プロモーター、誘導性プロモーター、調節スイッチ、エンハンサーなど、及び（３）修飾型３’ＩＴＲ配列（３’ＩＴＲ配列は、５’ＩＴＲ配列に対して非対称である）を提供する既知の技法を使用して構築され得る。いくつかの実施形態では、ＩＴＲによって隣接された発現カセットは、外因性配列を導入するためのクローニング部位を含む。発現カセットは、ＡＡＶゲノムのｒｅｐ及びｃａｐコード領域を置き換える。
一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書では、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、導入遺伝子を含む発現カセット、及び変異型又は修飾型ＡＡＶ ＩＴＲをこの順序でコードする「ｃｅＤＮＡ－プラスミド」と称されるプラスミドから取得され、当該ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いている。代替実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、第１の（又は５’）修飾型又は変異型ＡＡＶ ＩＴＲ、導入遺伝子を含む発現カセット、及び第２の（又は３’）修飾型ＡＡＶ ＩＴＲをこの順序でコードし、当該ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いており、５’及び３’ＩＴＲは、互いに対して対称である。代替実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、第１の（又は５’）修飾型又は変異型ＡＡＶ ＩＴＲ、導入遺伝子を含む発現カセット、及び第２の（又は３’）変異型又は修飾型ＡＡＶ ＩＴＲをこの順序でコードし、当該ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いており、５’及び３’修飾型ＩＴＲは、同じ修飾を有する（すなわち、それらは互いに対して逆相補又は対称である）。
一実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミド系は、ウイルスカプシドタンパク質コード配列を欠いている（すなわち、ＡＡＶカプシド遺伝子だけでなく、他のウイルスのカプシド遺伝子も欠いている）。一実施形態では、ｃｅＤＮＡプラスミドはまた、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コード配列を欠いている。一実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、機能的ＡＡＶ ｃａｐ及びＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子（ＡＡＶ２の場合ＧＧ－３’）に加えて、ヘアピン形成を可能にする可変パリンドローム配列を欠いている。一実施形態では、本開示のｃｅＤＮＡ－プラスミドは、当該技術分野において周知の任意のＡＡＶ血清型のゲノムの天然ヌクレオチド配列を使用して生成され得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミド骨格は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ １０、ＡＡＶ １１、ＡＡＶ １２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈｌＯ、ＡＡＶ－ＤＪ、及びＡＡＶ－ＤＪ８ゲノムに由来し、例えば、ＮＣＢＩ：ＮＣ ００２０７７、ＮＣ ００１４０１、ＮＣ００１７２９、ＮＣ００１８２９、ＮＣ００６１５２、ＮＣ ００６２６０、ＮＣ ００６２６１、Ｋｏｔｉｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｔｈｅ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｄｅｘ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒが管理するＵＲＬで入手可能である。一実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミド骨格は、ＡＡＶ２ゲノムに由来する。一実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミド骨格は、これらのＡＡＶゲノムのうちの１つに由来する５’及び３’ＩＴＲに含まれるように遺伝子操作された合成骨格である。
一実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ｃｅＤＮＡベクター産生細胞株の確立における使用のための選択可能又は選択マーカーを任意に含み得る。一実施形態では、選択マーカーは、３’ＩＴＲ配列の下流（すなわち、３’）に挿入され得る。別の実施形態では、選択マーカーは、５’ＩＴＲ配列の上流（すなわち、５’）に挿入され得る。適切な選択マーカーは、例えば、薬物耐性を付与するものを含む。選択マーカーは、例えば、ブラスチシジンＳ耐性遺伝子、カナマイシン、ゲネチシンなどであり得る。
ＶＩ．脂質粒子の調製
脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、ｃｅＤＮＡ及び脂質の混合時に自発的に形成することができる。所望の粒子サイズ分布に応じて、得られたナノ粒子混合物は、例えば、Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）などのサーモバレル押出機を使用して、膜（例えば、１００ｎｒｎカットオフ）を通して押し出すことができる。場合によっては、押し出しステップは省略することができる。エタノール除去及び同時緩衝液交換は、例えば、透析又はタンジェンシャル・フロー・フィルトレーションによって達成され得る。一実施形態では、脂質ナノ粒子は、本明細書の実施例３に記載されているように形成される。
一般に、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、当該技術分野において既知の任意の方法によって形成することができる。例えば、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、例えば、ＵＳ２０１３／００３７９７７、ＵＳ２０１０／００１５２１８、ＵＳ２０１３／０１５６８４５、ＵＳ２０１３／０１６４４００、ＵＳ２０１２／０２２５１２９及びＵＳ２０１０／０１３０５８８に記載されている方法によって調製することができ、これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、連続混合法、直接希釈プロセス、又はインライン希釈プロセスを使用して調製することができる。直接希釈及びインライン希釈プロセスを使用して脂質ナノ粒子を調製するための装置のプロセス及び装置は、ＵＳ２００７／００４２０３１に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。段階希釈プロセスを使用して脂質ナノ粒子を調製するためのプロセス及び装置は、ＵＳ２００４／０１４２０２５に記載されており、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態によれば、本開示は、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクター及びイオン化脂質を含む剛性ＤＮＡベクターを含むＬＮＰを提供する。例えば、２０１８年９月７日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号に開示されるプロセスにより得られたｃｅＤＮＡのような剛性治療用核酸で作製及び充填される脂質ナノ粒子製剤は、内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。本開示は、ＴＮＡを脂質と混合する前に、８０％～１００％の低分子量アルコール溶液（例えば、エタノール、メタノール、プロパノール、及びイソプロパノール）中でｃｅＤＮＡのような剛性治療用核酸（ＴＮＡ）を予備圧縮するプロセスを含む。次いで、予め圧縮された治療用核酸の装填及び封入は、イオン化脂質をプロトン化し、ｃｅＤＮＡ／脂質会合及び粒子の核形成に有利なエネルギーを提供する低ｐＨで、エタノール脂質のＮａｎｏａｓｓｅｍｂｌｒ（商標）のようなマイクロ流体デバイスを水性ｃｅＤＮＡ（例えば、８０～１００％エタノール、メタノール、プロパノール、イソプロパノール、又は混合物）とともに使用することによる従来の高エネルギー混合によって達成され得る。粒子は、水性希釈及び有機溶媒の除去によって更に安定化され得る。粒子は、所望のレベルに濃縮され得る。理論に拘束されることを望まないが、ＤＮＡの封入のために脂質と混合する前の剛性ＤＮＡの予備圧縮ステップは、封入の前に低分子量アルコール溶液中でＤＮＡ分子を圧縮することにより、得られるＬＮＰのサイズを縮小するのに有益な効果をもたらすと考えられている。
いくつかの実施形態によれば、本開示は、ＬＮＰ製剤を生成する方法を提供し、ＬＮＰは、カチオン性脂質及びｃｅＤＮＡのようなＴＮＡを含み、この方法は、水性ＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）をエタノール溶液などの低分子量アルコールに添加することであって、溶液中のアルコールの濃度は、約８０％～約９５％であり、溶液中の水の濃度は、約２０％～約５％である、添加することと、ＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）を脂質溶液（例えば、８０％～１００％のＥｔＯＨ）及び酸性水性緩衝液（例えば、リンゴ酸）と混合することと、任意に、中性ｐＨ水性緩衝液と緩衝液とを交換し、それによって、ＬＮＰ製剤を生成することと、を含む。
いくつかの実施形態によれば、溶液中の低分子量アルコール（例えば、エタノール、メタノール、プロパノール、又はイソプロパノール）の濃度は、約８０％～約９５％、約８０％～約９０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９５％、約８５％～約９０％、約９０％～約９５％、又は約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％又は約９５％である。
いくつかの実施形態によれば、溶液中の水の濃度は、約２０％～約５％、約１５％～約５％、約１０％～約５％、約２０％～約１０％、約２０％～約１５％、約１５％～約５％、約１５％～約１０％、又は約２０％、約１９％、約１８％、約１７％、約１６４％、約１５％、約１４％、約１３％、約１２％、約１１％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％又は約５％である。
いくつかの実施形態によれば、低分子量アルコールは、エタノール、メタノール、プロパノール、及びイソプロパノールからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、水性ＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）は、２つ又は３つの低分子量アルコールの混合物を含む溶液中にある。一実施形態では、低分子量アルコール溶液は、エタノール及びメタノールの混合物である。別の実施形態では、低分子量アルコール溶液は、エタノール、メタノール、プロパノール、及びイソプロパノールの任意の組み合わせの混合物である。別の実施形態では、低分子量アルコール溶液は、エタノール及びプロパノールの混合物である。別の実施形態では、低分子量アルコール溶液は、エタノール４５％、メタノール４５％及び水１０％を含む。
いくつかの実施形態によれば、この方法は、ｃｅＤＮＡ／脂質混合溶液を酸性水性緩衝液で希釈するステップを更に含む。いくつかの実施形態によれば、酸性水性緩衝液は、リンゴ酸／リンゴ酸ナトリウム又は酢酸／酢酸ナトリウムから選択される。いくつかの実施形態によれば、酸性水性緩衝液は、約１０～４０ミリモル（ｍＭ）、約１０ｍＭ～約３５ｍＭ、約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２５ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５ｍＭ、約１５～４０ｍＭ、約１５ｍＭ～約３５ｍＭ、約１５ｍＭ～約３０ｍＭ、約１５ｍＭ～約２５ｍＭ、約１５ｍＭ～約２０ｍＭ、約２０～４０ｍＭ、約２０ｍＭ～約３５ｍＭ、約２１０ｍＭ～約３０ｍＭ、約２０ｍＭ～約２５ｍＭ、約２５～４０ｍＭ、約２５ｍＭ～約３５ｍＭ、約２５ｍＭ～約３０ｍＭ、約３１０～４０ｍＭ、約３０ｍＭ～約３５ｍＭ、約３５ｍＭ～約４０ｍＭ、又は約１０ｍＭ～約２５ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約１０ｍＭ～約１５ｍＭ、又は約１０ｍＭ、約１２ｍＭ、約１４ｍＭ、約１６ｍＭ、約１８ｍＭ、約２０ｍＭ、約２２ｍＭ、約２４ｍＭ、約２６ｍＭ、約２８ｍＭ、約３０ｍＭ、約３２ｍＭ、約３４ｍＭ、約３６ｍＭ、約３８ｍＭ又は約４０ｍＭの濃度である。
いくつかの実施形態によれば、酸性水性緩衝液は、約３～約５、約３～約４．５、約３～約４、約３～約３．５、約３．５～約５、約３．５～約４．５、約３．５～約４、約４～約５、約４～約４．５、約４．５～約５、又は約３、約３．２５、約３．５、約３．７５、約４、約４．２５、約４．５、約４．７５又は約５のｐＨである。
いくつかの実施形態によれば、中性ｐＨ水性緩衝液は、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４である。
いくつかの実施形態によれば、ＬＮＰを調製するプロセスは、ｃｅＤＮＡのような剛性ＴＮＡ圧縮が、高アルコール（エタノール、メタノール、プロパノール及び／又はイソプロパノール）含有量（＞８０％）を有する溶媒中で起こるという発見を利用する。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の製剤プロセスは、サイズが約５０～約７０ｎｍの範囲のＬＮＰを生成する。いくつかの実施形態によれば、本開示の脂質粒子は、一般に、約２０ｎｍ～約７０ｎｍ、約２５ｎｍ～約７０ｎｍ、約３０ｎｍ～約７０ｎｍ、約３５ｎｍ～約７０ｎｍ、約４０ｎｍ～約７０ｎｍ、約４５ｎｍ～約８０ｎｍ、約５０ｎｍ～約７０ｎｍ、約６０ｎｍ～約７０ｎｍ、約６５ｎｍ～約７０ｎｍ、又は約２０ｎｍ、約２５ｎｍ、約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、約５０ｎｍ、約５５ｎｍ、約６０ｎｍ、約６５ｎｍ、約７０ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の製剤プロセスは、二本鎖ｃｅＤＮＡのような剛性ＴＮＡの約８０％超を封入するＬＮＰを生成する。いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載のＬＮＰは、二本鎖ｃｅＤＮＡのような剛性ＴＮＡの約６０％超、二本鎖ｃｅＤＮＡのような剛性ＴＮＡの約６５％超、二本鎖ｃｅＤＮＡのような剛性ＴＮＡの約７０％超、二本鎖ｃｅＤＮＡのような剛性ＴＮＡの約７５％超、二本鎖ｃｅＤＮＡのような剛性ＴＮＡの約８０％超、二本鎖ｃｅＤＮＡのような剛性ＴＮＡの約８５％超、又は二本鎖ｃｅＤＮＡのような剛性ＴＮＡの約９０％超を封入することができる。
いくつかの実施形態によれば、低分子量アルコール中の圧縮された状態のｃｅＤＮＡのようなＴＮＡが、脂質のエタノール溶液（８０％～１００％ＥｔＯＨ）と、得られた溶液が８５～９５％エタノール及び１５～５％水であるような比率で混合される場合、ｃｅＤＮＡのようなＴＮＡは、動的光散乱によって圧縮された状態で存在することが観察される。このような溶媒では、脂質及びｃｅＤＮＡの両方が可溶化され、どちらの成分の沈殿も検出されない。圧縮されたＴＮＡの封入をもたらすＬＮＰの製剤化により、直径がはるかに小型になる。
いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡのような水性ＴＮＡを、脂質のエタノール溶液と、得られた溶液が酸性状態（リンゴ酸）で９０～９２％のエタノール及び８～１０％の水となるような比率で混合する場合、ｃｅＤＮＡのようなＴＮＡは、動的光散乱によってコンパクトな状態で存在することが観察され、得られた封入により、直径がはるかに小型のＬＮＰが得られる。
ＬＮＰ形成は、ｃｅＤＮＡ／脂質溶液のエタノール溶液と酸性水性緩衝液をマイクロ流体混合を使用して混合することによって駆動される。いくつかの実施形態によれば、酸性水性緩衝液とｃｅＤＮＡ／脂質のエタノール混合物との間の流速比は、２：１、３：２、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１又は２０：１である。いくつかの実施形態によれば、ミキサー終了後、最終エタノール含有量が約４％～約１５％になるように、最終溶液を酸性水性緩衝液で希釈する。いくつかの実施形態によれば、ミキサー終了後、最終エタノール含有量が約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％又は約１５％になるように、最終溶液を酸性水性緩衝液で希釈する。いくつかの実施形態によれば、最終エタノール含有量は、４％である。いくつかの実施形態によれば、最終エタノール含有量は、１２％である。ＬＮＰを含有するこの溶液は、中性ｐＨ水性緩衝液で緩衝液交換される。
一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、衝突ジェットプロセスによって調製することができる。一般に、粒子は、アルコール（例えば、エタノール）に溶解した脂質を、緩衝液、例えば、クエン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウム及び塩化マグネシウム緩衝液、リンゴ酸緩衝液、リンゴ酸及び塩化ナトリウム緩衝液、又はクエン酸ナトリウム及び塩化ナトリウム緩衝液、に溶解したｃｅＤＮＡと混合することによって形成される。ｃｅＤＮＡに対する脂質の混合比は、約４５～５５％の脂質及び約６５～４５％のｃｅＤＮＡであり得る。
脂質溶液は、アルコール、例えばエタノール中に、５～３０ｍｇ／ｍＬ、よりおそらく５～１５ｍｇ／ｍＬ、最もおそらく９～１２ｍｇ／ｍＬの全脂質濃度で、カチオン性脂質（例えば、イオン化カチオン性脂質）、非カチオン性脂質（例えば、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＥ、及びＤＯＰＣなどのリン脂質）、ＰＥＧ又はＰＥＧコンジュゲートされた分子（例えば、ＰＥＧ－脂質）、及びステロール（例えば、コレステロール）を含有することができる。脂質溶液において、脂質のモル比は、カチオン性脂質の場合、約２５～９８％、好ましくは約３５～６５％、非イオン化可能な脂質の場合、約０～１５％、好ましくは約０～１２％、ＰＥＧ又はＰＥＧコンジュゲートされた脂質分子の場合、約０～１５％、好ましくは約１～６％、ステロールの場合、約０～７５％、好ましくは約３０～５０％の範囲であり得る。
ｃｅＤＮＡ溶液は、３．５～５の範囲のｐＨを有する、緩衝溶液中に０．３～１．０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは、０．３～０．９ｍｇ／ｍＬの濃度範囲でｃｅＤＮＡを含むことができる。
ＬＮＰを形成するために、１つの例示的であるが非限定的な実施形態では、２つの液体は、約１５～４０℃、好ましくは約３０～４０℃の範囲の温度に加熱され、次いで、例えば、衝突ジェットミキサーにおいて混合され、即座にＬＮＰを形成する。混合流速は、１０～６００ｍＬ／分の範囲であり得る。チューブＩＤの範囲は、０．２５～１．０ｍｍ、総流速は、１０～６００ｍＬ／分を有することができる。流速及びチューブＩＤの組み合わせは、ＬＮＰの粒子サイズを３０～２００ｎｍに制御する効果を有することができる。次いで、溶液を、より高いｐＨで、１：１～１：３のｖｏｌ：ｖｏｌ、好ましくは約１：２のｖｏｌ：ｖｏｌの範囲の混合比で緩衝溶液と混合することができる。必要に応じて、この緩衝溶液は、１５～４０℃又は３０～４０℃の範囲の温度になり得る。次いで、混合されたＬＮＰは、アニオン交換濾過ステップを受けることができる。アニオン交換の前に、混合されたＬＮＰを一定期間、例えば３０分～２時間インキュベートすることができる。インキュベーション中の温度は、１５～４０℃又は３０～４０℃の範囲の温度になり得る。インキュベーション後、アニオン交換分離ステップを含む０．８μｍフィルターなどのフィルターで溶液を濾過する。このプロセスでは、１ｍｍのＩＤ～５ｍｍのＩＤの範囲のチューブＩＤ及び１０～２０００ｍＬ／分の流量を使用できる。
形成後、ＬＮＰを濃縮し、限外濾過プロセスを介して限界濾過することができ、このプロセスでは、アルコールが除去され、緩衝液が最終的な緩衝溶液、例えば、約ｐＨ７、例えば約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、又は約ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と交換される。
限外濾過プロセスでは、膜の公称分子量カットオフ範囲が３０～５００ｋＤのタンジェンシャル・フロー・フィルトレーションフォーマット（ＴＦＦ）を使用できる。膜フォーマットは中空糸又はフラットシートカセットである。適切な分子量カットオフのＴＦＦプロセスでは、保持液にＬＮＰを保持することができ、濾液又は透過液はアルコール、クエン酸緩衝液及び最終緩衝液の廃棄物を含有する。ＴＦＦプロセスは、初期濃度が１～３ｍｇ／ｍＬのｃｅＤＮＡ濃度になる複数ステップのプロセスである。濃縮後、ＬＮＰ溶液を最終緩衝液に対して１０～２０容量で限界濾過し、アルコールを除去して緩衝液交換を実施する。次いで、材料を更に１～３倍に濃縮することができる。濃縮されたＬＮＰ溶液は滅菌濾過できる。
ＶＩＩ．薬学的組成物及び製剤
本明細書で提供されるのはまた、ｃｅＤＮＡ脂質粒子のようなＴＮＡ及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む薬学的組成物である。
一実施形態では、ＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、治療用核酸の完全な封入、部分的な封入とともに提供される。一実施形態では、核酸治療薬は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に完全に封入されて、脂質粒子を含有する核酸を形成する。一実施形態では、核酸は、粒子の脂質部分内に封入され得、それによって、それを酵素分解から保護し得る。
脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の意図した使用に応じて、構成成分の割合は変化し得、特定の製剤の送達効率は、例えば、エンドソーム放出パラメータ（ＥＲＰ）アッセイを使用して測定され得る。
一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、凝集を防止するために他の部分とコンジュゲートされ得る。そのような脂質コンジュゲートには、例えば、ジアルキルオキシプロピルと共役したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＡ複合体）、ジアシルグリセロールと共役したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＧ複合体）、コレステロールと共役したＰＥＧ、ホスファチジルエタノールアミンと共役したＰＥＧ、及びセラミドと共役したＰＥＧ（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号を参照）などのＰＥＧ－脂質コンジュゲート、カチオン性ＰＥＧ脂質、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質複合体（例えば、ＰＯＺ－ＤＡＡ複合体、例えば、２０１０年１月１３日出願の米国仮出願第６１／２９４，８２８号、及び２０１０年１月１４日出願の米国仮出願第６１／２９５，１４０号）、ポリアミドオリゴマー（例えば、ＡＴＴＡ－脂質複合体）、及びそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。ＰＯＺ－脂質コンジュゲートの追加例は、ＰＣＴ公開第２０１０／００６２８２号に記載されている。ＰＥＧ又はＰＯＺは、脂質に直接コンジュゲートするか、リンカー部分を介して脂質に結合することができる。例えば、非エステル含有リンカー部分及びエステル含有リンカー部分を含む、ＰＥＧ又はＰＯＺを脂質に結合するのに好適な任意のリンカー部分を使用することができる。ある特定の好ましい実施形態では、アミド又はカルバメートなどの非エステル含有リンカー部分が使用される。上記の各特許文書の開示内容は、あらゆる目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、ＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）は、粒子の脂質部分と複合され得るか、又は脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の脂質位置に封入され得る。一実施形態では、ＴＮＡは、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の脂質位置に完全に封入され得、それによって例えば水溶液中のヌクレアーゼによる分解からそれを保護する。一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中のＴＮＡは、３７℃で少なくとも約２０、３０、４５、又は６０分間のヌクレアーゼへの脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の曝露後に実質的に分解されない。いくつかの実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中のＴＮＡは、３７℃で少なくとも約３０、４５、若しくは６０分、又は少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、若しくは３６時間の血清中の粒子のインキュベーション後に実質的に分解されない。
一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、対象、例えばヒトなどの哺乳動物に対して実質的に非毒性である。
一実施形態では、本開示の治療用核酸を含む薬学的組成物は、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）に製剤化され得る。いくつかの実施形態では、治療用核酸を含む脂質粒子は、カチオン性脂質から形成することができる。いくつかの他の実施形態では、治療用核酸を含む脂質粒子は、非カチオン性脂質から形成され得る。好ましい実施形態では、本開示の脂質粒子は、脂質粒子を含有する核酸であり、これは、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ミニサークルＤＮＡ、ミニ遺伝子、ウイルス性ＤＮＡ（例えば、レンチウイルス若しくはＡＡＶゲノム）又は非ウイルス性合成ＤＮＡベクター、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ／ＣＥＬｉＤ）、プラスミド、バクミド、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡベクター、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、非ウイルス性ミニストリングＤＮＡベクター（直鎖状共有結合性閉鎖ＤＮＡベクター）、又はダンベル型ＤＮＡ最小ベクター（「ダンベルＤＮＡ」）からなる群から選択される治療用核酸を含むカチオン性脂質から形成される。
別の好ましい実施形態では、本開示の脂質粒子は核酸含有脂質粒子であり、これは非カチオン性脂質、及び任意に粒子の凝集を防止するコンジュゲートされた脂質から形成される。
一実施形態では、脂質粒子製剤は、水溶液である。一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）製剤は、凍結乾燥粉末である。
いくつかの態様によれば、本開示は、１つ以上の薬学的賦形剤を更に含む脂質粒子製剤を提供する。一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）製剤は、スクロース、トリス、トレハロース、及び／又はグリシンを更に含む。
一実施形態では、本明細書に開示される脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、対象の細胞、組織、又は器官へのインビボ送達のために対象に投与するのに好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。典型的に、薬学的組成物は、本明細書に開示されるＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）及び薬学的に許容される担体を含む。一実施形態では、本開示のＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、治療的投与（例えば、非経口投与）の所望の経路に好適な薬学的組成物に組み込むことができる。高圧静脈内又は動脈内注入を介した受動組織形質導入、同様に、核内微量注射若しくは細胞質内注射などの細胞内注射もまた、企図される。治療目的のための薬学的組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、又は高ＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）ベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注入可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）ベクター化合物を、必要に応じて、上記で列挙した成分のうちの１つ又は組み合わせと組み込み、濾過滅菌によって調製され得る。
本明細書に開示される脂質粒子は、局所、全身、羊膜内、くも膜下腔内、頭蓋内、動脈内、静脈内、リンパ内、腹腔内、皮下、気管、組織内（例えば、筋肉内、心臓内、肝内、腎臓内、脳内）、くも膜下腔内、膀胱内、結膜（例えば、眼窩外、眼窩内、眼窩後、網膜内、網膜下、脈絡膜、脈絡膜下、間質内、房内、及び硝子体内）、蝸牛内、並びに粘膜（例えば、経口、直腸、経鼻）投与に好適な薬学的組成物に組み込むことができる。高圧静脈内又は動脈内注入を介した受動組織形質導入、同様に、核内微量注射若しくは細胞質内注射などの細胞内注射もまた、企図される。
ＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）を含む薬学的に活性な組成物は、核酸中の導入遺伝子をレシピエントの細胞に送達するように製剤化され得、その中の導入遺伝子の治療的発現をもたらす。この組成物はまた、薬学的に許容される担体を含み得る。
治療目的のための薬学的組成物は、典型的に、無菌であり、製造及び貯蔵の条件下で安定していなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、又は高ＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）ベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注射可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のｃｅＤＮＡベクター化合物を、必要に応じて、上記で列挙した成分のうちの１つ又は組み合わせと組み込み、濾過滅菌によって調製され得る。
一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、少なくとも１つの脂質二層を有する固体コア粒子である。一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、非二層構造、すなわち非ラメラ（すなわち、非二層）形態を有する。無制限に、非二層形態としては、例えば、三次元管、棒、立方対称性などを挙げることができる。脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）の非ラメラ形態（すなわち、非二層構造）は、当業者に既知であり、当業者によって使用される分析技法を使用して決定され得る。そのような技法としては、低温透過型電子顕微鏡（「Ｃｒｙｏ－ＴＥＭ」）、示差走査熱量計（「ＤＳＣ」）、Ｘ線回折などが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、脂質粒子の形態（ラメラ対非ラメラ）は、容易に評価され、例えば、ＵＳ２０１０／０１３０５８８（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるＣｒｙｏ－ＴＥＭ分析を使用して容易に評価され、特性化され得る。
一実施形態では、非ラメラ形態を有する脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、高電子密度である。
一実施形態では、本開示は、単一ラメラ構造又は多ラメラ構造のいずれかである脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）を提供する。いくつかの態様では、本開示は、多胞体粒子及び／又は発泡ベース粒子を含む脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）製剤を提供する。脂質構成成分の組成物及び濃度を制御することによって、脂質コンジュゲートが脂質粒子（脂質ナノ粒子）外で交換する速度、順に脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を制御することができる。加えて、例えば、ｐＨ、温度、又はイオン強度を含む他の変数を使用して、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）が膜融合性になる速度を変化及び／又は制御することができる。脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）が膜融合性になる速度を制御するために使用され得る他の方法は、本開示に基づいて当業者に明らかとなるであろう。脂質コンジュゲートの組成物及び濃度を制御することによって、脂質粒径を制御することができることも明らかとなるであろう。
一実施形態では、製剤化されたカチオン性脂質のｐＫａは、核酸の送達のためのＬＮＰの有効性と相関し得る（Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２），５１（３４），８５２９－８５３３、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８，１７２－１７６（２０１０）を参照。それらの両方は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。一実施形態では、ｐＫａの好ましい範囲は、約５～約７である。一実施形態では、カチオン性脂質のｐＫａは、２－（ｐ－トルイジノ）－６－ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）の蛍光に基づくアッセイを使用し、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中で決定され得る。
一実施形態では、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中のＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）の封入は、核酸と会合したときに蛍光を強化した色素を使用する、膜不透過性蛍光色素排除アッセイ、例えばＯｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイ又はＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）アッセイを実施することによって決定され得る。一般に、封入は、脂質粒子製剤に色素を添加し、得られた蛍光を測定し、それを少量の非イオン性界面活性剤の添加時に観察される蛍光と比較することによって決定される。脂質二層の界面活性剤媒介性崩壊は、封入されたＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）を放出し、それが膜不透過性色素と相互作用することを可能にする。ｃｅＤＮＡの封入は、Ｅ＝（Ｉｏ－Ｉ）／Ｉｏとして計算することができ、Ｉ及びＩｏは、界面活性剤の添加前及び添加後の蛍光強度を指す。
単位投与量
一実施形態では、薬学的組成物は、単位剤形で提示され得る。単位剤形は、典型的に、薬学的組成物の１つ以上の投与経路に適合されるであろう。いくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、噴霧器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、エアロゾル化器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、経口投与のため、頬側投与のため、又は舌下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、静脈内、筋肉内、又は皮下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、髄腔内又は脳室内投与のために適合される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、局所投与のために製剤化される。単一剤形を産生するために担体材料と組み合わされ得る活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量となるであろう。
ＶＩＩＩ．治療の方法
本明細書に記載されるＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質粒子）及び組成物を使用して、宿主細胞に核酸配列（例えば、治療用核酸配列）を導入することができる。一実施形態では、ＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）脂質粒子を使用する宿主細胞への核酸配列の導入を、治療された患者からの適切なバイオマーカーでモニタリングして、遺伝子発現を評価することができる。
本明細書に提供される薬学的組成物を使用して、様々な目的のために導入遺伝子（核酸配列）を送達することができる。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター脂質ナノ粒子）は、例えば、エクスサイチュ、インビトロ及びインビボの適用、方法論、診断手順、及び／又は遺伝子療法レジメンを含む、様々な方法で使用することができる。
本明細書で提供されるのは、治療有効量の本明細書に記載されるＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）脂質ナノ粒子を、任意に薬学的に許容される担体とともに、治療を必要とする対象の標的細胞（例えば、筋細胞若しくは組織、又は他の罹患した細胞型）に導入することを含む、対象における疾患又は障害を治療する方法である。ＴＮＡ脂質ナノ粒子は、担体の存在下で導入され得るが、そのような担体は必要とされない。実装されるＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）脂質ナノ粒子は、疾患を治療するのに有用な目的のヌクレオチド配列を含む。特に、ｃｅＤＮＡベクターは、対象に導入されたときに、外因性ＤＮＡ配列によってコードされる所望のポリペプチド、タンパク質、又はオリゴヌクレオチドの転写を指示することができる制御エレメントに作動可能に連結された所望の外因性ＤＮＡ配列を含み得る。ＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）脂質ナノ粒子は、本明細書に記載され、当該技術分野において既知の任意の好適な経路を介して投与することができる。一実施形態では、標的細胞は、ヒト対象にある。
本明細書で提供されるのは、診断的又は治療的に有効な量のｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を、それを必要とする対象に提供するための方法であり、この方法は、ある量のｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を、それを必要とする対象の細胞、組織、又は器官に、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現を可能にするのに有効な時間にわたって提供し、それによって診断的又は治療的に有効な量のｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））によって発現されるタンパク質、ペプチド、核酸を、対象に提供することを含む。一実施形態では、対象は、ヒトである。
本明細書で提供されるのは、対象における疾患、障害、機能不全、傷害、異常状態、又は外傷のうちの少なくとも１つ以上の症状を診断、予防、治療、又は改善するための方法である。一般に、この方法は、本明細書に記載される１つ以上のＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）脂質ナノ粒子を、それを必要とする対象に、対象の疾患、障害、機能不全、傷害、異常状態、又は外傷の１つ以上の症状を診断、予防、治療、又は改善するのに十分な量及び時間にわたって投与するステップを少なくとも含む。一実施形態では、対象は、ヒトである。
本明細書で提供されるのは、疾患又は疾患状態の１つ以上の症状を治療又は低減するためのツールとしての、ＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）脂質ナノ粒子を使用することを含む方法である。欠陥遺伝子が知られているいくつかの遺伝性疾患が存在し、典型的に、通常は一般に劣性的に遺伝される酵素の欠乏状態と、調節又は構造タンパク質に関与し得るが、典型的に常に優性的に遺伝されるとは限らない不均衡状態との２つのクラスに分類される。欠乏状態の疾患の場合、ｃｅＤＮＡ脂質ナノ粒子などのＴＮＡを使用し、導入遺伝子を送達して、置換療法のために正常な遺伝子を罹患した組織に運び入れるとともに、いくつかの実施形態では、アンチセンス変異を使用して、疾患の動物モデルを創り出すことができる。不均衡疾患状態の場合、ＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）脂質ナノ粒子を使用して、モデルシステムにおいて疾患状態を創り出すことができ、次いでこれを使用して、その疾患状態に反作用するように試みることができる。したがって、本明細書に開示されるＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）脂質ナノ粒子及び方法は、遺伝子疾患の治療を可能にする。本明細書で使用される場合、疾患状態は、疾患を引き起こす、又はそれをより重篤にする欠乏又は不均衡を部分的又は全体的に修繕することによって治療される。
一般に、上記の説明に従って、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡ脂質ナノ粒子などのＴＮＡを使用して任意の導入遺伝子を送達して、遺伝子発現に関する任意の障害に関連する症状を治療、予防、又は改善することができる。例示的な病態としては、嚢胞性線維症（及び他の肺の疾患）、血友病Ａ、血友病Ｂ、サラセミア、貧血症及び他の血液障害、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、癲癇及び他の神経障害、がん、糖尿病、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ型、ベッカー型）、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、代謝障害、網膜変性疾患（及び他の眼疾患）、ミトコンドリオパチー（例えば、レーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、リー症候群、及び亜急性硬化性脳炎）、ミオパチー（例えば、顔面肩甲上腕型ミオパチー（ＦＳＨＤ）及び心筋症）、固形臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓）の疾患などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるようなｃｅＤＮＡベクターは、代謝障害（例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症）を有する個人の治療において有利に使用され得る。
一実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡ脂質ナノ粒子などのＴＮＡを使用して、遺伝子又は遺伝子産物中の変異によって引き起こされる疾患又は障害を治療、改善、及び／又は予防することができる。ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））で治療され得る例示的な疾患又は障害としては、代謝疾患又は障害（例えば、ファブリー病、ゴーシェ病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、グリコーゲン蓄積疾患）；尿素サイクル疾患又は障害（例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症）；リソソーム蓄積疾患又は障害（例えば、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ、ハンター症候群））；肝疾患又は障害（例えば、進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ）；血液疾患又は障害（例えば、血友病（Ａ及びＢ）、サラセミア、及び貧血症）；がん及び腫瘍、並びに遺伝子疾患又は障害（例えば、嚢胞性線維症）が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡ脂質ナノ粒子などのＴＮＡを用いて、導入遺伝子（例えば、本明細書に記載される、ホルモン又は増殖因子をコードする導入遺伝子）の発現レベルを調節することが望ましい状況において、異種ヌクレオチド配列を送達することができる。
一実施形態では、ｃｅＤＮＡ脂質ナノ粒子などのＴＮＡを使用して、疾患又は障害をもたらす遺伝子産物の異常なレベル及び／又は機能（例えば、タンパク質中の不在又は欠損）を訂正することができる。本明細書に記載される脂質ナノ粒子のｃｅＤＮＡベクターは、機能的タンパク質を産生し、かつ／又はタンパク質のレベルを修正して、タンパク質中の不在若しくは欠損によって引き起こされる特定の疾患若しくは障害から生じる症状を緩和若しくは低減するか、又は利益を付与することができる。例えば、ＯＴＣ欠損症の治療は、機能的ＯＴＣ酵素を産生することによって達成され得る。血友病Ａ及びＢの治療は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、及び第Ｘ因子のレベルを修正することによって達成され得る。ＰＫＵの治療は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素のレベルを修正することによって達成され得る。ファブリー病又はゴーシェ病の治療は、それぞれ機能的アルファガラクトシダーゼ又はベータグルコセレブロシダーゼを産生することによって達成され得る。ＭＦＤ又はＭＰＳＩＩの治療は、それぞれ機能的アリールスルファターゼＡ又はイズロネート－２－スルファターゼを産生することによって達成され得る。嚢胞性線維症の治療は、機能的嚢胞性線維症の膜貫通コンダクタンス調節因子を産生することによって達成され得る。グリコーゲン蓄積症の治療は、機能的Ｇ６Ｐａｓｅ酵素機能を回復することによって達成され得る。ＰＦＩＣの治療は、機能的ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４、又はＴＪＰ２遺伝子を産生することによって達成され得る。
一実施形態では、本明細書に記載されるＴＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ）脂質ナノ粒子を使用して、インビトロ又はインビボで細胞にＲＮＡベースの治療薬を提供することができる。ＲＮＡベースの治療薬の例としては、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用して、インビトロ又はインビボで細胞にアンチセンス核酸を提供することができる。例えば、導入遺伝子が、ＲＮＡｉ分子である場合、標的細胞中のアンチセンス核酸又はＲＮＡｉの発現は、細胞による特定のタンパク質の発現を減少させる。したがって、ＲＮＡｉ分子又はアンチセンス核酸である導入遺伝子を投与して、それを必要とする対象における特定のタンパク質の発現を減少させることができる。アンチセンス核酸をインビトロで細胞に投与して、細胞生理学を調節する、例えば、細胞又は組織培養系を最適化することもできる。
一実施形態では、本明細書に記載のＴＮＡ脂質ナノ粒子を使用して、インビトロ又はインビボで細胞にＤＮＡベースの治療薬を提供することができる。ＤＮＡベースの治療薬の例としては、ミニサークルＤＮＡ、ミニ遺伝子、ウイルスＤＮＡ（例えば、レンチウイルス若しくはＡＡＶゲノム）又は非ウイルス合成ＤＮＡベクター、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ／ＣＥＬｉＤ）、プラスミド、バクミド、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡベクター、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）－ベクター、非ウイルスミニストリングＤＮＡベクター（直鎖状の共有結合的に閉じたＤＮＡベクター）、又はダンベル型ＤＮＡ最小ベクター（「ダンベルＤＮＡ」）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を使用して、インビトロ又はインビボで細胞にミニサークルを提供することができる。例えば、導入遺伝子が、ミニサークルＤＮＡである場合、標的細胞中のミニサークルＤＮＡの発現は、細胞による特定のタンパク質の発現を減少させる。したがって、ミニサークルＤＮＡである導入遺伝子を投与して、それを必要とする対象における特定のタンパク質の発現を減少させることができる。ミニサークルＤＮＡをインビトロで細胞に投与して、細胞生理学を調節する、例えば、細胞又は組織培養系を最適化することもできる。
一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターなどのＴＮＡによってコードされる例示的な導入遺伝子としては、リソソーム酵素（例えば、タイ・サックス病に関連するヘキソサミニダーゼＡ、又はハンター症候群／ＭＰＳ ＩＩに関連するイズロネートスルファターゼ）、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、スーパーオキシドジスムターゼ、グロビン、レプチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、並びにサイトカイン（例えば、インターフェロン、ｂ－インターフェロン、インターフェロン－ｇ、インターロイキン－２、インターロイキン－４、インターロイキン１２、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシンなど）、ペプチド増殖因子及びホルモン（例えば、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様増殖因子１及び２、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、神経栄養因子－３及び４、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来増殖因子（ＧＤＮＦ）、形質転換増殖因子－ａ及び－ｂなど）、受容体（例えば、腫瘍壊死因子受容体）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例示的な実施形態では、導入遺伝子は、１つ以上の所望の標的に特異的なモノクローナル抗体をコードする。いくつかの例示的な実施形態では、２つ以上の導入遺伝子が、ｃｅＤＮＡベクターによってコードされる。いくつかの例示的な実施形態では、導入遺伝子は、目的の２つの異なるポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、本明細書で定義されるように、全長抗体又は抗体断片を含む、抗体をコードする。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に定義されるように、抗原結合ドメイン又は免疫グロブリン可変ドメイン配列である。他の例示的な導入遺伝子配列は、自殺遺伝子産物（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、チトクロームＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、及び腫瘍壊死因子）、がん療法において使用される薬物に対する耐性を付与するタンパク質、及び腫瘍抑制因子遺伝子産物をコードする。
投与
一実施形態では、本開示のＴＮＡ脂質ナノ粒子は、インビボでの細胞の形質導入のために生物に投与することができる。一実施形態では、ＴＮＡは、エクスビボでの細胞の形質導入のために生物に投与することができる。
一般に、投与は、分子を血液又は組織細胞と最終的に接触させるために通常使用される経路のうちのいずれかによるものである。そのような核酸を投与する好適な方法は、当業者によって利用可能かつ周知であり、特定の組成物を投与するために２つ以上の経路が使用され得るが、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりも即時であり、効果的な反応を提供し得る。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡ脂質ナノ粒子）などのＴＮＡの例示的な投与形態としては、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介した）、頬側（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼内、経皮、内皮内、子宮内（又は卵内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内（骨格、横隔膜、及び／又は心筋への投与を含む）、胸膜内、脳内、及び動脈内）、局所（例えば、気道表面を含む皮膚及び粘膜表面への、並びに経皮投与）、リンパ内など、並びに直接組織又は器官注入（例えば、肝臓、眼、骨格筋、心筋、横隔膜、筋肉、若しくは脳への）が挙げられる。
本明細書に記載されるＴＮＡ脂質粒子の投与は、脳、骨格筋、平滑筋、心臓、横隔膜、気道上皮、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、皮膚、及び眼からなる群から選択される部位を含むが、これらに限定されない、対象の任意の部位に対して行われ得る。一実施形態では、本明細書に記載されるＴＮＡ脂質ナノ粒子の投与はまた、腫瘍（例えば、腫瘍又はリンパ節内又はその付近）に対するものであり得る。任意の所与の症例における最も好適な経路は、治療、改善、及び／又は予防される病態の性質及び重症度、並びに使用されている本明細書に記載される特定のｃｅＤＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ脂質ナノ粒子）の性質に依存するであろう。追加的に、ｃｅＤＮＡは、単一のベクター又は複数のｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡカクテル）中に２つ以上の導入遺伝子を投与することを可能にする。
一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））の骨格筋への投与としては、肢（例えば、上腕、下腕、上肢、及び／又は下肢）、腰、首、頭（例えば、舌）、咽頭、腹部、骨盤／会陰、及び／又は指の骨格筋への投与が挙げられるが、これらに限定されない。ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、四肢灌流（任意に、脚及び／若しくは腕の単離された四肢灌流、例えば、Ａｒｒｕｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０５：３４５８－３４６４を参照されたい）並びに／又は直接筋肉内注射によって骨格筋に送達され得る。特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子）は、対象（例えば、ＤＭＤなどの筋ジストロフィーを有する対象）の肢（腕及び／又は脚）に、四肢灌流、任意に単離された四肢灌流（例えば、静脈内又は動脈内投与による）によって投与される。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクター脂質粒子）は、「流体力学的」技法を使用せずに投与することができる。
ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））の心筋への投与としては、左心房、右心房、左心室、右心室、及び／又は中隔への投与が挙げられる。ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、静脈内投与、大動脈内投与などの動脈内投与、直接心臓注射（例えば、左心房、右心房、左心室、右心室への）、及び／又は冠動脈灌流によって心筋に送達され得る。横隔膜筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、及び／又は腹腔内投与を含む任意の好適な方法によって行われ得る。平滑筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、及び／又は腹腔内投与を含む任意の好適な方法によって行われ得る。一実施形態では、投与は、平滑筋内、その付近、及び／又はその上に存在する内皮細胞に対して行われ得る。
一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、骨格筋、横隔膜筋及び／又は心筋に投与される（例えば、筋ジストロフィー又は心臓病を治療、改善、及び／又は予防するために（例えば、ＰＡＤ又はうっ血性心不全）。
ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、ＣＮＳ（例えば、脳又は眼）に投与することができる。ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、脊髄、脳幹（延髄、脳橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、脳下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、後頭葉、側頭葉、頭頂葉、及び前頭葉、皮質、基底核、海馬、及び偏桃体（ｐｏｒｔａａｍｙｇｄａｌａ）を含む大脳）、辺縁系、新皮質、線条体、大脳、並びに下丘中に導入されてもよい。ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））はまた、網膜、角膜、及び／又は視神経などの眼の異なる領域に投与され得る。ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、（例えば、腰椎穿刺によって）脳脊髄液に送達され得る。ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、更に、血液脳関門が撹乱された状況（例えば、脳腫瘍又は脳梗塞）において、ＣＮＳに血管内投与され得る。
一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクター（本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、当該技術分野において既知の任意の経路によってＣＮＳの所望の領域に投与され得、髄腔内、眼内、脳内、脳室内、静脈内（例えば、マンニトールなどの糖の存在下）、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、前房）、及び眼周囲（例えば、テノン下領域）送達、並びに運動ニューロンへの逆行性送達を伴う筋肉内送達を含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、ＣＮＳ中の所望の領域又は区画への直接注入（例えば、定位的注入）によって、液体製剤中で投与される。他の実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、所望の領域への局所適用によって、又はエアロゾル製剤の鼻腔内投与によって提供され得る。眼への投与は、液滴の局所適用によって行われてもよい。更なる代替例として、ｃｅＤＮＡベクターは、固体の徐放性製剤として投与され得る（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許第７，２０１，８９８号を参照されたい）。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））を、逆行性輸送に使用して、運動ニューロンが関与する疾患及び障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）など）を治療、改善、及び／又は予防することができる。例えば、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子））は、筋組織に送達され、そこからニューロン中に移動し得る。
一実施形態では、適切なレベルの発現が達成されるまで、治療用製品の反復投与を行うことができる。したがって、一実施形態では、治療用核酸を複数回投与及び再投与することができる。例えば、治療用核酸は、０日目に投与することができる。０日目の初回治療に続いて、治療用核酸を用いた初回治療の約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、又は約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、又は約１年、約２年、約３年、約４年、約５年、約６年、約７年、約８年、約９年、約１０年、約１１年、約１２年、約１３年、約１４年、約１５年、約１６年、約１７年、約１８年、約１９年、約２０年、約２１年、約２２年、約２３年、約２４年、約２５年、約２６年、約２７年、約２８年、約２９年、約３０年、約３１年、約３２年、約３３年、約３４年、約３５年、約３６年、約３７年、約３８年、約３９年、約４０年、約４１年、約４２年、約４３年、約４４年、約４５年、約４６年、約４７年、約４８年、約４９年又は約５０年後に、２回目の投薬（再投与）を実施することができる。
一実施形態では、１つ以上の追加の化合物もまた含まれ得る。それらの化合物は、別々に投与され得るか、又は追加の化合物は、本開示の脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）中に含まれ得る。言い換えれば、脂質粒子（例えば、脂質ナノ粒子）は、ｃｅＤＮＡに加えて他の化合物、又は少なくとも第１のものとは異なる第２のｃｅＤＮＡを含有し得る。無制限に、他の追加の化合物は、小さい若しくは大きい有機若しくは無機分子、単糖類、二糖類、三糖類、オリゴ糖類、多糖類、ペプチド、タンパク質、ペプチド類似体及びそれらの誘導体、ペプチド模倣体、核酸、核酸類似体及び誘導体、生体物質から作製される抽出物、又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。
一実施形態では、１つ以上の追加の化合物は、治療剤であり得る。治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。したがって、治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。治療剤は、所望の治療目的及び生物作用に従って選択され得る。例えば、一実施形態では、ＬＮＰ内のｃｅＤＮＡが、がんを治療するために有用である場合、追加の化合物は、抗がん剤（例えば、化学療法剤、標的がん療法（小分子、抗体、又は抗体－薬物コンジュゲートを含むが、これらに限定されない）であり得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡを含有するＬＮＰが、感染症を治療するために有用である場合、追加の化合物は、抗微生物剤（例えば、抗生物質又は抗ウイルス化合物）であり得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡを含有するＬＮＰが、免疫疾患又は障害を治療するために有用である場合、追加の化合物は、免疫応答を調節する化合物（例えば、免疫抑制剤、免疫刺激性化合物、又は１つ以上の特定の免疫経路を調節する化合物）であり得る。一実施形態では、異なるタンパク質又は異なる化合物（治療薬など）をコードするｃｅＤＮＡなどの、異なる化合物を含有する異なる脂質粒子の異なるカクテルを、本開示の組成物及び方法で使用することができる。一実施形態では、追加の化合物は、免疫調節剤である。例えば、追加の化合物は、免疫抑制剤である。いくつかの実施形態では、追加の化合物は、免疫刺激性である。
以下の実施例は、限定ではない例証によって提供される。
実施例１：式Ｉ’の式Ｉのイオン化脂質の合成
式（Ｉ）又は式（Ｉ’）のイオン化脂質は、以下に記載する一般的な合成方法を使用して設計及び合成することができる。この方法はイオン化脂質で例示されているが、それらは式（Ｉ）又は式（Ｉ’）の下で企図される切断可能な脂質の合成に適用可能である。
一般的な合成（例えば、Ｒ４＝－Ｃ）
本明細書に記載の式（Ｉ）又は（Ｉ’）のイオン化脂質の合成は、スキーム１に示されるように、脂質酸（ａ）から開始することができ、Ｎ，Ｏ－ジメチルヒドロキシルアミンへのカップリングにより、ワインレブアミド（ｂ）が得られる。グリニャール付加によりケトン（ｃ）が生成される。チタンを介した還元的アミノ化により、タイプ（ｄ）の生成物が得られ、これは、一般構造（ｅ）のジスルフィドと反応し、両方の末端アルコールが脱離基、すなわちメタンスルホニル基を有し、一般構造（ｆ）の最終生成物を生成する。脂質１～５１の具体的な合成手順は、以下に記載されるか、又は２０２０年１１月２３日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０６１８０１号に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
スキーム１
脂質１の合成
短い手順での個々の合成ステップ
０℃に冷却したジクロロメタン（ＤＣＭ）中のオレイン酸（Ｉ）の溶液に、ＣＤＩを添加した。反応物を周囲温度に３０分間温めた後、０℃に冷却し、最初にトリエチルアミンで、次いでジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩で処理した。１時間後、反応物を水とヘプタンとの間で分配した。有機物を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空で蒸発させて、粗ワインレブアミド（ＩＩ）を得て、これを直接次の反応に運んだ。
ジクロロメタン中のジエチル亜鉛の１Ｍ溶液を－１℃に冷却し、ＴＦＡで滴下処理した。３０分後、ジヨードメタンを添加し、これを氷浴中で３０分間エージングさせた。この溶液に、ワインレブアミド（ＩＩ）を添加した。反応物を周囲温度に温め、１時間撹拌した。反応物を塩化アンモニウム溶液でクエンチし、有機層を分配し、１０％チオ硫酸ナトリウムで洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、真空中で蒸発させた。フラッシュクロマトグラフィーにより精製を行い、（ＩＩＩ）を得た。
化合物（ＩＩＩ）を乾燥ＴＨＦ中に溶解し、次いで１Ｍの臭化ノニルマグネシウムを窒素下、周囲温度で添加した。１０分後、反応を過剰の飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液でゆっくりとクエンチした。反応物をヘキサン及び水で分液漏斗中で洗浄し、振とうし、下層の水層を廃棄し、上層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させて、粗ケトンを得た。上記の粗ケトン（ＩＶ）にジメチルアミン（ＴＨＦ中２Ｍ）、続いてＴｉ（Ｏ－ｉ－Ｐｒ）４を添加し、一晩撹拌した。翌日、エタノール、続いてＮａＢＨ４を添加した。５分間撹拌した後、反応物全体を直接シリカカラムに注入して精製し、化合物（ＩＶ）を得た。
ジスルフィド（ｅ）及び４モル当量のアミン（Ｖ）を、アセトニトリルに溶解し、Ｃｓ２ＣＯ３の存在下で約４８時間加熱した。粗反応混合物をフラッシュクロマトグラフィー用のシリカに充填して、最終的な標的脂質１を得た。
実施例２：式ＩＩのイオン化脂質の合成
一般的な合成
式（ＩＩ）のイオン化脂質は、以下のスキーム２の一般手順に記載されている同様の合成方法を使用して合成された。脂質５２～７１の具体的な合成手順は、以下に記載されるか、又は２０２１年３月２６日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０２４４１３号に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
スキーム２
１－（ヘプタデカン－９－イル）９－（４－（２－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（２－（４－（オレオイルオキシ）フェニル））アセトキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）－２－オキソエチル）フェニル）ノナンジオエート（脂質５２）の合成
切断可能、イオン化可能な頭部基（（ジスルファンジイルビス（エタン－２，１－ジイル））ビス（ピペリジン－１，４－ジイル））ビス（エタン－２，１－ジイル）ビス（２－（４－ヒドロキシフェニル）アセテート）（７）の合成
ステップ－１
ジスルファンジイルビス（エタン－２，１－ジイル）ジメタンスルホネート（２）の合成。市販の２，２’－ジスルファンジイルビス（エタン－１－オール）（１）（１５ｇ、９７．２ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１４３ｍｌ）に溶解し、続いてトリエチルアミン（ＮＥｔ３）（３３．３ｇ、３２８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物にメタンスルホニルクロリド（ＭｓＣｌ）（３４．５ｇ、３００ｍｍｏｌ）を０℃で滴下した。得られた反応混合物を、室温で３時間撹拌した。反応混合物にエタノール（ＥｔＯＨ）（３９ｍｌ）を添加して反応をクエンチし、不溶性物質を濾過により除去した。濾液をジクロロメタン（ＤＣＭ）（１５０ｍｌ）と１０％重炭酸ナトリウム／水（１５０ｍｌ）との間で分配した。有機層を１００ｍｌの水で４回洗浄し、硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）で乾燥させ、蒸発させて、２を褐色の油（２５ｇ、８１％）として得、これは静置すると固化した。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム）： δ ４．４３－４．４８（ｔ，４Ｈ），３．００－３．１０（ｍ，１０Ｈ）。
ステップ－２
２，２’－（（ジスルファンジイルビス（エタン－２，１－ジイル））ビス（ピペリジン－１，４－ジイル））ビス（エタン－１－オール）（４）の合成。アセトニトリル（３１０ｍｌ）中の２（１２ｇ、３８．７ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）（１３．４ｇ、９６．６ｍｍｏｌ）、続いて２－（ピペリジン－４－イル）エタン－１－オール（３）（２０ｇ、１５５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で一晩撹拌した後、濾過を通して不溶性物質を除去した。濾液を蒸発乾固させて粗生成物を得、これをＤＣＭ（１００ｍｌ）に溶解し、水で２回（５０ｍｌ）洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発させて４を黄色の油（１１．８ｇ、７９％）として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム）： δ ３．６３－３．６８（ｔ，４Ｈ），２．７８－２．９０（ｍ，８Ｈ），２．６２－２．６５（ｔ，４Ｈ），１．９４－２．０２（ｔ，４Ｈ），１．７０（ｓ，２Ｈ），１．６５－１．７０（ｄ，４Ｈ），１．２７－１．４８（ｔ，４Ｈ），１．４０－１．５０（ｍ，２Ｈ），１．２３－１．２７（ｍ，４Ｈ）。
ステップ－３
２－（４－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）酢酸（５）の合成。０℃のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（４０ｍｌ）中の４－ヒドロキシフェニル酢酸（５ａ）（１０ｇ、６５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＮＥｔ３（１０ｇ、１００ｍｍｏｌ）、続いてｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルクロリド（ＴＢＳＣｌ）（１５ｇ、１００ｍｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合物を室温で一晩撹拌し、次いで水（２００ｍｌ）及びＤＣＭ（１５０ｍｌ）で処理した。有機相を分離した。水相をＤＣＭ（１００ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相を重炭酸ナトリウムの飽和溶液、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％メタノール（ＭｅＯＨ）を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残留物を精製した。所望の化合物を含有する画分をプールし、蒸発させて、５（４．８ｇ、２７％）及びジ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルエーテル（ジ－ＴＢＳ）副生成物（１０．５ｇ、４２％）を得た。５の１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム）： δ ７．１２（ｄ，２Ｈ），６．７８（ｄ，２Ｈ），３．５６（ｓ，２Ｈ），０．９７（ｓ，９Ｈ），０．１８（ｓ，６Ｈ）。
（（ジスルファンジイルビス（エタン－２，１－ジイル））ビス（ピペリジン－１，４－ジイル））ビス（エタン－２，１－ジイル）ビス（２－（４－（（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）オキシ）フェニル）アセテート）（６）の合成。ＤＣＭ（１００ｍｌ）中のステップ－２から得られたジスルフィド４（１．９２ｇ、５ｍｍｏｌ）及びフェニル酢酸５（３．４ｇ、１２．８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（１．５ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）、続いて１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）（２．４ｇ、１２．５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで重炭酸ナトリウムの飽和溶液（２００ｍｌ）、ブライン（１５０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって残留物を精製した。所望の化合物を含有する画分を蒸発させて、６（４．１ｇ、９２％）を得た。６の１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム）： δ ７．１２（ｄ，４Ｈ），６．７５（ｄ，４Ｈ），４．１（ｔ，４Ｈ），３．５（ｓ，４Ｈ），２．８２（ｍ，８Ｈ），２．６２（ｍ，４Ｈ），１．９３（ｔ，４Ｈ），１．６１－１．４５（ｍ，８Ｈ），１．２６（ｍ，６Ｈ），０．９７（ｓ，１８Ｈ），０．１７（ｓ，４Ｈ）。
ステップ－４
（（ジスルファンジイルビス（エタン－２，１－ジイル））ビス（ピペリジン－１，４－ジイル））ビス（エタン－２，１－ジイル）ビス（２－（４－ヒドロキシフェニル）アセテート）（７）の合成。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（４０ｍｌ）中のジスルフィド６（３．１ｇ、３．６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、フッ化水素ピリジン（１ｍｌ、３．８ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。得られた混合物を０℃で２時間、次いで室温で更に２時間撹拌した。反応混合物を重炭酸ナトリウムの飽和溶液（２００ｍｌ）で処理し、酢酸エチル（２×１５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相をブライン（１００ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残留物を精製し、所望の生成物７（１．９２ｇ、８２％）をもたらした。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム）： δ ７．１３（ｄ，４Ｈ），６．７０（ｄ，４Ｈ），４．１（ｔ，４Ｈ），３．５（ｓ，４Ｈ），２．８９（ｍ，８Ｈ），２．７０（ｍ，４Ｈ），１．９５（ｔ，４Ｈ），１．４８（ｍ，８Ｈ），１．１７（ｍ，６Ｈ）。
９－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－９－オキソノナン酸（１０）の合成
９－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－９－オキソノナン酸（１０）の合成。ジクロロメタン（１０００ｍｌ）中のノナン二酸（８）（７．３４ｇ、３９ｍｍｏｌ）及びヘプタデカン－９－オール（８ｂ）（５ｇ、１９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（２．３７ｇ、１９ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（３ｇ、１９ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで２５０ｍｌの１Ｎ ＨＣｌ及び２５０ｍｌの水で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発乾固させ、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。所望の化合物を含有する画分をプールし、蒸発させて、１０（６．２ｇ、７５％）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム）： δ ４．８０－４．９０（ｍ，１Ｈ），２．２５－２．３４（ｍ，４Ｈ），１．５５－１．７０（ｍ，４Ｈ），１．４０－１．５０（ｍ，４Ｈ），１．２０－１．４０（ｍ，３０Ｈ），０．８４－０．９０（ｔ，３Ｈ）。
１－（ヘプタデカン－９－イル）９－（４－（２－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（２－（４－ヒドロキシフェニル）アセトキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）－２－オキソエチル）フェニル）ノナンジオエートの合成
１－（ヘプタデカン－９－イル）９－（４－（２－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（２－（４－ヒドロキシフェニル）アセトキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）－２－オキソエチル）フェニル）ノナンジオエート（１１）の合成。ＤＭＦ（２０ｍｌ）中のステップ－４で生成されたジスルフィド７（５８０ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）及び酸１０（４２２ｍｇ、０．９９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（１６５ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（２５８ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで飽和重炭酸ナトリウム溶液（５０ｍｌ）を添加した。反応混合物を、ジクロロメタン（２×５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相をブライン（３０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより残留物を精製し、所望の生成物１１（４２７ｍｇ、４５％）をもたらした。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム）： δ ７．２７（ｄ，２Ｈ），７．１１（ｄ，２Ｈ），７．０３（ｄ，２Ｈ），６．６９（ｄ，２Ｈ），４．８５（ｍ，１Ｈ），４．１（ｍ，４Ｈ），３．５６（ｓ，２Ｈ），３．４８（ｓ，２Ｈ），２．９２（ｄ，２Ｈ），２．８５－２．６９（ｍ，１２Ｈ），２．７１（ｔ，２Ｈ），２．２８（ｔ，２Ｈ），１．９５（ｔ，２Ｈ），１．５２－１．０１（ｍ，５３Ｈ），０．８５（ｍ，６Ｈ）。
脂質５２の合成
１－（ヘプタデカン－９－イル）９－（４－（２－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（２－（４－（オレオイルオキシ）フェニル））アセトキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エトキシ）－２－オキソエチル）フェニル）ノナンジオエート（脂質５２）の合成。ジクロロメタン（１０ｍｌ）中のジスルフィド１１（１５１ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）及びオレイン酸１２（６１ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（２８ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（４２ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２０ｍｌ）、ブライン（２０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって残留物を精製した。所望の化合物を含有する画分を蒸発させて、脂質５２（１２６ｍｇ、６８％）を得た。脂質５２の１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム）： δ ７．２５（ｄ，４Ｈ），７．０１（ｄ，４Ｈ），５．３４（ｍ，２Ｈ），４．８６（ｍ，１Ｈ），４．１１（ｔ，４Ｈ）），３．５８（ｓ，４Ｈ），２．９１－２．７０（ｍ，８Ｈ），２．６２（ｍ，４Ｈ），２．５３（ｔ，４Ｈ），２．２８（ｔ，２Ｈ），２．０５－１．８７（ｍ，８Ｈ），１．７８－１．４６（ｍ，２２Ｈ），１．４８－１．２３（ｍ，５４Ｈ），０．８６（ｔ，９Ｈ）。ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋１３１８。
実施例３：式Ｖのイオン化脂質の合成
式（Ｖ）のイオン化脂質は、以下のスキーム３の一般手順に記載されている同様の合成方法を使用して合成された。脂質７２～７６の具体的な合成手順も以下に記載する。変数Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、Ｒ３、Ｒ３’、Ｒ４、Ｒ４’、Ｒ５及びＲ５´は、式（Ｖ）で定義されるとおりである。ＲｘはＲ４より炭素原子２つ分短く、同様に、Ｒｘ’はＲ４’より炭素原子２つ分短い。
スキーム３
ステップ１において、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中のジスルフィド１及び酸２の撹拌溶液に、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、続いて１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）を添加した。得られた混合物を室温で２日間撹拌し、次いで飽和炭酸水素ナトリウム溶液を添加した。反応混合物を、ＤＣＭで抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）上で乾燥させ、濃縮した。残留物を、溶離液としてＤＣＭ中の０～５％メタノール（ＭｅＯＨ）を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、３を得た。ステップ２の試薬及び条件は、式（Ｖ）の脂質を最終生成物として得たステップ１のものとほとんど同一であった。
スキーム４
Ｏ’１，Ｏ１－（（（ジスルファンジイルビス（エタン－２，１－ジイル））ビス（ピペリジン－１，４－ジイル））ビス（エタン－２，１－ジイル））９，９’－ジ（ヘプタデカン－９－イル）ジ（ノナンジオエート）（脂質７６）及び１－（ヘプタデカン－９－イル）９－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（オレオイルオキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エチル）ノナンジオエート（脂質７２）の合成
スキーム４を参照して、ＤＣＭ（５０ｍｌ）中のジスルフィド１ａ（実施例２に記載のその合成）（１．１７ｇ、３．１ｍｍｏｌ）及び９－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－９－オキソノナン酸（２．０ｇ、４．６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（５６５ｍｇ、４．６ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（８７８ｍｇ、４．６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で２日間撹拌し、次いで飽和炭酸水素ナトリウム溶液（６０ｍｌ）、ブライン（２０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって残留物を２回精製した。所望の化合物を含む画分を蒸発させて、脂質７６（６２０ｍｇ、２３％）及び１－（ヘプタデカン－９－イル）９－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－ヒドロキシエチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エチル）ノナンジオエート又は化合物３ａ－Ｄ（すなわち、Ｒｙ＝Ｄであるスキーム４の化合物３ａ）（３８９ｍｇ、２２％）を得た。
脂質７６の１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム）： δ ４．８５（ｍ，２Ｈ），４．０９（ｔ，４Ｈ），２．９１－２．７４（ｍ，８Ｈ），２．６３－２．６７（ｍ，４Ｈ），２．２７－２．２２（ｍ，８Ｈ），１．９７（ｔ，４Ｈ），１．７５－１．４３（ｍ，２４Ｈ），１．４５－１．１６（ｍ，６６Ｈ），０．８６（ｔ，１２Ｈ）。ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋１１９４。
３ａ－Ｄの１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム）： δ ４．８３（ｍ，１Ｈ），４．０６（ｔ，２Ｈ），３．６３（ｔ，２Ｈ），２．９７－２．６９（ｍ，９Ｈ），２．６６（ｍ，４Ｈ），２．２５（ｔ，４Ｈ），１．９３（ｔ，４Ｈ），１．７６－１．４３（ｍ，１６Ｈ），１．３９－１．２２（ｍ，３６Ｈ），０．８６（ｔ，６Ｈ）。
次に、ジクロロメタン（１０ｍｌ）中のジスルフィド３ａ－Ｄ（１８５ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）及びオレイン酸（１３１ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（５５ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（８７ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２０ｍｌ）、ブライン（２０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって残留物を精製した。所望の化合物を含有する画分を蒸発させて、脂質７２（１６５ｍｇ、６８％）を得た。
脂質７２の１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム）： δ ５．３２（ｍ，２Ｈ），４．８５（ｍ，１Ｈ），４．０９（ｔ，４Ｈ），２．９６－２．７７（ｍ，８Ｈ），２．６７－２．５３（ｍ，４Ｈ），２．２８－２．２０（ｍ，６Ｈ），２．１６－１．９２（ｔ，８Ｈ），１．７５－１．４７（ｍ，１４Ｈ），１．４１－１．１３（ｍ，６０Ｈ），０．８６（ｔ，９Ｈ）。ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋１０４９。
Ｏ’１，Ｏ１－（（（ジスルファンジイルビス（エタン－２，１－ジイル））ビス（ピペリジン－１，４－ジイル））ビス（エタン－２，１－ジイル））９，９’－ジノニルジ（ノナンジオエート）（脂質７５）の合成
スキーム４を参照して、ＤＣＭ（２５ｍｌ）中のジスルフィド１ａ（３７６ｍｇ、１ｍｍｏｌ）及び９－（オクチルオキシ）－９－オキソノナン酸（６２９ｍｇ、２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（２４４ｍｇ、２ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（３１０ｍｇ、２ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで飽和重炭酸ナトリウム溶液（２０ｍｌ）を添加した。反応混合物を、ＤＣＭ（２×５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相をブライン（３０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。残留物を、溶離液としてＤＣＭ中の０～５％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、脂質７５（２４０ｍｇ、２５％）を淡黄色固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム）： δ ４．０４－４．０９（ｍ，８Ｈ），２．５－３．０（ｍ，１０Ｈ），２．２５－２．３０（ｔ，８Ｈ），２．０（ｔ，４Ｈ）），１．５８－１．９０（ｍ，２４Ｈ），１．２０－１．４０（ｍ，４２Ｈ），０．８７（ｔ，６Ｈ）。
１－（ヘプタデカン－９－イル）９－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（（９－（ノニルオキシ）－９－オキソノナノイル）オキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エチル）ノナンジオエート（脂質７４）の合成
スキーム４を参照して、ＤＣＭ（２５ｍｌ）中のジスルフィド１ａ（３７６ｍｇ、１ｍｍｏｌ）及び９－（オクチルオキシ）－９－オキソノナン酸（６２９ｍｇ、２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（２４４ｍｇ、２ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（３１０ｍｇ、２ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで飽和重炭酸ナトリウム溶液（２０ｍｌ）を添加した。反応混合物を、ＤＣＭ（２×５０ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相をブライン（３０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。残留物を、溶離液としてジクロロメタン中０～５％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、１－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－ヒドロキシエチル））ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エチル）９－ノニルノナンジオエート又は化合物３ａ－Ｃ（すなわち、Ｒｙ＝Ｃであるスキーム４の化合物３ａ）（２５０ｍｇ、２６％）を得、これを特性評価せずに次の変換に直接使用した。
次に、ＤＣＭ（５０ｍｌ）中のジスルフィド３ａ－Ｃ（６５０ｍｇ、０．９７ｍｍｏｌ）及び９－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－９－オキソノナン酸（４１１ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（１１７ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（１４９ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で２日間撹拌し、次いで水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって残留物を精製した。所望の化合物を含有する画分を蒸発させて、脂質７４（４２０ｍｇ、４０％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム）： δ ４．９（ｍ，１Ｈ），４．０５－４．０９（ｍ，６Ｈ），２．８０－３．０（ｍ，８Ｈ），２．６０－２．７０（ｍ，４Ｈ）），２．２５－２．２７（ｍ，８Ｈ），１．９２－２．０１（ｔ，４Ｈ），１．４８－１．６２（ｍ，２５Ｈ），１．２４－１．４０（ｍ，５２Ｈ），０．８７（ｔ，９Ｈ）。
１－（ヘプタデカン－９－イル）９－（２－（１－（２－（（２－（４－（２－（（５－（ノニルオキシ）－５－オキソペンタノイル）オキシ）エチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エチル）ノナンジオエート（脂質７３）の合成
ＤＣＭ（１００ｍｌ）中のジスルフィド４（３．７６ｇ、１０ｍｍｏｌ）及び９－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－９－オキソノナン酸（２．１３ｇ、５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（７７６ｍｇ、５ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（６１０ｍｇ、５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で２日間撹拌し、次いで飽和重炭酸ナトリウム溶液（４０ｍｌ）を添加した。反応混合物を、ＤＣＭ（２×１００ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相をブライン（６０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。残留物を、溶離液としてＤＣＭ中の０～５％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、１－（ヘプタデカン－９－イル）９－（２－（１－（２－（（２－（４－（２））－ヒドロキシエチル）ピペリジン－１－イル）エチル）ジスルファネイル）エチル）ピペリジン－４－イル）エチル）ノナンジオエート又は化合物３ａ－Ｄ（すなわち、Ｒｙ＝Ｄであるスキーム４の化合物３ａ）（１．４ｇ、３６％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム）： δ ４．９０（ｍ，１Ｈ），４．０９－４．１０（ｍ，３Ｈ），３．６８（ｔ，２Ｈ），２．７９－２．９９（ｍ，８Ｈ），２．６６（ｍ，４Ｈ），２．３０（ｍ，４Ｈ），２．０３（ｔ，４Ｈ），１．２２－１．７８（ｍ，５５Ｈ），０．８６（ｓ，６Ｈ）。
次に、ＤＣＭ（２０ｍｌ）中のジスルフィド３ａ－Ｄ（３００ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）及び５－（ノニルオキシ）－５－オキソペンタン酸（１１５ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（４９ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（６２ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで飽和炭酸水素ナトリウム溶液（２０ｍｌ）、ブライン（２０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、溶離液としてＤＣＭ中の０～５％ＭｅＯＨを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって残留物を精製した。所望の化合物を含有する画分を蒸発させて、脂質７３（１６５ｍｇ、４２％）を得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム）： δ ５．８５（ｍ，１Ｈ），４．０５－４．１０（ｍ，６Ｈ），２．７９－２．８８（ｍ，８Ｈ），２．６３－２．６６（ｍ，４Ｈ）），２．３３－２．３６（ｔ，４Ｈ），２．２６－２．３３（ｔ，４Ｈ），１．９４－１．９８（ｍ，６Ｈ），１．５５－１．５９（ｍ，２２Ｈ），１．２４－１．４０（ｍ，４８Ｈ）），０．８４－０．８９（ｔ，９Ｈ）。
実施例４：式ＸＶのイオン化脂質の合成
式（ＸＶ）の脂質は、以下のスキーム５（Ｒ５は不在である）及びスキーム６（Ｒ５は、Ｃ１－Ｃ８アルキレン又はＣ２－Ｃ８アルケニレンである）に示される同様の合成方法を使用して設計及び合成された。スキーム５～６に示される化合物における他の全ての変数、すなわち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｘ１、Ｘ２、及びｎは、式（ＸＶ）で定義されるとおりである。Ｘ１’は定義されるとおりのＸ１であるが、ベンジル又はピリジンなどの保護基が追加されている。脂質７７～８７の追加の合成手順及び特定の合成手順は、２０２１年４月２０日に出願された米国特許出願第６３／１７６，９４３号に記載されているとおりであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
スキーム５
スキーム６
Ｒｘは、Ｒ５より炭素原子が１つ少ないアルキレン又はアルケニレンである。
式（ＸＶＩＩ）のジエステル脂質は、以下のスキーム７（Ｒ５は不在である）及びスキーム８（Ｒ５は、Ｃ１－Ｃ８アルキレン又はＣ２－Ｃ８アルケニレンである）に示される同様の合成方法を使用して設計及び合成された。スキーム７及びスキーム８に示される化合物における他の全ての変数、すなわち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、及びｎは、式（ＸＶＩＩ）で定義されるとおりである。
スキーム７
スキーム８
Ｒｘは、Ｒ５より炭素原子が１つ少ないアルキレン又はアルケニレンである。
スキーム５及びスキーム６
スキーム５及びスキーム６を参照すると、ステップ１において、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の酸１及びアルコール２（又は２ａ）の撹拌溶液に、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、続いて１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）を添加した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで塩酸（ＨＣｌ）及び水で洗浄した。有機層を硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４）で乾燥させ、蒸発乾固させ、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％メタノール（ＭｅＯＨ）を使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。所望の化合物を含有する画分をプールし、蒸発させて、酸３を白色固体として得た。
ステップ２において、ＤＣＭ中の酸３（又は３ａ）の溶液に、ＥＤＣＩ及びトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加し、混合物を室温で１５分間撹拌した。その後、Ｎ，Ｏ－ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩及びＤＭＡＰを添加し、室温で一晩撹拌した。翌日、反応物を塩化アンモニウム水溶液（ＮＨ４Ｃｌ（水溶液））でクエンチし、ＤＣＭで希釈した。有機層をＮＨ４Ｃｌ及びブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させた。生成物４（又は４ａ）を更に精製することなく次のステップで使用した。
ステップ３において、化合物４（又は４ａ）を無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解した。次いで、５、ジエチルエーテル（Ｅｔ２Ｏ）中の臭化マグネシウム溶液を０℃で滴下した。得られた混合物を、窒素ガス（Ｎ２）下で室温で１６時間撹拌した。反応物を飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液でクエンチし、エーテルで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させ、溶離液としてヘキサン中の０～１０％酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）を使用するカラムクロマトグラフィーにより精製して、６（又は６ａ）を得た。
ステップ４において、無水ＴＨＦ中の６（又は６ａ）の溶液に、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を０℃で添加し、混合物をＮ２雰囲気下で一晩撹拌した。反応物を飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機相をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させ、溶離液としてヘキサン中の０～１０％ＥｔＯＡｃを使用するカラムクロマトグラフィーにより精製して、７を得た。
ステップ５において、ＤＣＭ中の化合物７（又は７ａ）及び化合物８（又は８ａ）の溶液に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を添加した。次いで、ＥＤＣＩ及びＤＭＡＰ（０．０１２ｇ、０．１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をＮ２雰囲気下、室温で一晩撹拌した。翌日、反応物をＤＣＭで希釈した。有機層を重炭酸ナトリウム水溶液（ＮａＨＣＯ３（水溶液））で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させ、溶離液としてＤＣＭ中の０～５％ＭｅＯＨを使用するカラムクロマトグラフィーにより精製して、最終生成物９（又はジエステル９ａ）を得た。
スキーム７及びスキーム８
スキーム７及びスキーム８を参照すると、ステップ１において、ＴＨＦ中の３ｇ（１１．８ｍｍｏｌ）のケトン１０の氷冷溶液に、リン酸無水物溶液１１を滴加した。反応物を３０分間撹拌し、次いで水素化ナトリウム（ＮａＨ）を添加した。反応により１２を得た。
ステップ２において、ＴＨＦ中の化合物２を水素化アルミニウムリチウム溶液（ＬｉＡｌＨ４）と反応させた。４８時間後、粗生成物を水でクエンチし、エーテルで抽出してアルコール１３を得た。
スキーム６及びスキーム７のその後のステップ３からステップ７は、スキーム４及びスキーム５のステップ１からステップ５に記載されているのと同様の手順を、適切な出発物質としてアルコール１３を用い、当業者の知識範囲内にある他の変更を加えて実施した。
脂質７７、脂質７８、脂質７９、脂質８０、脂質８１の合成
脂質７７、脂質７８、脂質７９、脂質８０、及び脂質８１を合成するための手順は、同じく以下に提供されるスキーム９を参照して以下に記載される。
スキーム９
ステップ１：９－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－９－オキソノナン酸（３ｂ）の合成
ＤＣＭ（１０００ｍｌ）中のノナン二酸（２ｂアゼライン酸とも呼ばれる）（７．３４ｇ、３９ｍｍｏｌ）及びヘプタデカン－９－オール（１ａ）（５ｇ、１９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（２．３７ｇ、１９ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（３ｇ、１９ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で一晩撹拌し、次いで２５０ｍｌの１Ｎ ＨＣｌ及び２５０ｍｌの水で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発乾固させ、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％メタノールを使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。所望の化合物を含有する画分をプールし、蒸発させて、３ｂ（６．２ｇ、７５％）を白色の固体として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム）： δ ４．８０－４．９０（ｍ，１Ｈ），２．２５－２．３４（ｍ，４Ｈ），１．５５－１．７０（ｍ，４Ｈ），１．４０－１．５０（ｍ，４Ｈ），１．２０－１．４０（ｍ，３０Ｈ），０．８４－０．９０（ｔ，３Ｈ）。
ステップ２：ヘプタデカン－９－イル９－（メトキシ（メチル）アミノ）－９－オキソノナノエート（４ｂ）の合成
ＤＣＭ（６０ｍＬ）中の化合物３（５．４ｇ、１２．７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＥＤＣＩ（３．６ｇ、１９．７ｍｍｏｌ）、及びＴＥＡ（３．５ｍＬ、２５．４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１５分間撹拌した。次いで、Ｎ，Ｏ－ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩（１．３６ｇ、１３．９７ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．１５ｇ、１．２７ｍｍｏｌ）を添加し、室温で一晩撹拌した。翌日、反応物をＮＨ４Ｃｌ（水溶液）でクエンチし、ＤＣＭで希釈した。有機層をＮＨ４Ｃｌ及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させた。生成物４ｂを更に精製することなく次のステップで使用した。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム） δ ４．８５（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），３．６７（ｓ，３Ｈ），３．５８（ｓ，２Ｈ），３．１７（ｓ，３Ｈ），２．４０（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．２７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），１．６３（ｄｄ，Ｊ＝１４．８，５．５Ｈｚ，６Ｈ），１．４９（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，４Ｈ），１．３７－１．１９（ｍ，３２Ｈ），０．８６（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，６Ｈ）。
ステップ３：ヘプタデカン－９－イル９－オキソノナデカノエート（６ｂ、Ｒ４はＣ７アルキルである）、ヘプタデカン－９－イル９－オキソノナデカノエート（６ｂ、Ｒ４はＣ８アルキルである）、ヘプタデカン－９－イル９－オキソノナデカノエート（６ｂ、Ｒ４はＣ９アルキルである）、ヘプタデカン－９－イル９－オキソノナデカノエート（６ｂ、Ｒ４はＣ１０アルキルである）、又はヘプタデカン－９－イル９－オキソノナデカノエート（６ｂ、Ｒ４はＣ１１アルキルである）の合成
ヘプタデカン－９－イル９－オキソノナデカノエート（６ｂ、Ｒ４はＣ７アルキルである）
化合物４ｂ（１．０ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）を１０ｍｌの無水ＴＨＦに溶解した。次いで、Ｅｔ２Ｏ（３．２ｍｌ、３．２ｍｍｏｌ）中の１Ｍヘプチルマグネシウムブロミド溶液（化合物５ａ、Ｒ４はＣ７アルキルである）を０℃で滴下した。得られた混合物をＮ２下で室温で１６時間撹拌した。反応物を飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液でクエンチし、エーテルで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させ、溶離液としてヘキサン中の０～１０％ＥｔＯＡｃを使用するカラムクロマトグラフィーにより精製して、６ｂ（Ｒ４はＣ７アルキルである）（０．３ｇ、３０％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム） δ ４．８５（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），２．３７（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，４Ｈ），２．２７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），１．６４－１．４３（ｍ，１２Ｈ），１．２７（ｓ，３６），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，９Ｈ）。
ヘプタデカン－９－イル９－オキソノナデカノエート（６ｂ、Ｒ４はＣ８アルキルである）
化合物４ｂ（１．０ｇ、２．１３ｍｍｏｌ）を１０ｍｌの無水ＴＨＦに溶解した。次いで、Ｅｔ２Ｏ（１．６ｍｌ、３．２ｍｍｏｌ）中の１Ｍオクチルマグネシウムブロミド溶液（化合物５、Ｒ４はＣ８アルキルである）を０℃で滴下した。得られた混合物をＮ２下で室温で１６時間撹拌した。反応物を飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液でクエンチし、エーテルで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させ、溶離液としてヘキサン中の０～１０％ＥｔＯＡｃを使用するカラムクロマトグラフィーにより精製して、６ｂ（Ｒ４はＣ８アルキルである）（０．４１ｇ、４０％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム） δ ４．８５（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），２．３７（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，４Ｈ），２．２６（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），１．６５－１．３８（ｍ，８Ｈ），１．３３－１．１８（ｍ，４２Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，９Ｈ）。
ヘプタデカン－９－イル９－オキソノナデカノエート（６ｂ、Ｒ４はＣ９アルキルである）
化合物４ｂ（１．１ｇ、２．３ｍｍｏｌ）を２０ｍｌの無水ＴＨＦに溶解した。次いで、Ｅｔ２Ｏ（６．１３ｍｌ、３．２ｍｍｏｌ）中の１Ｍノニルマグネシウムブロミド溶液（化合物５、Ｒ４はＣ９アルキルである）を０℃で滴下した。得られた混合物を２時間かけて室温に戻した。反応物を飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液でクエンチし、エーテルで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させ、溶離液としてヘキサン中の０～３０％ＥｔＯＡｃを使用するカラムクロマトグラフィーにより精製して、６ｂ（Ｒ４はＣ９アルキルである）（１．２ｇ、９６％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム） δ ４．８５（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），２．３７（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，４Ｈ），２．２６（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），１．６５－１．３８（ｍ，８Ｈ），１．３３－１．１８（ｍ，４４Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，９Ｈ）。
ヘプタデカン－９－イル９－オキソノナデカノエート（６ｂ、Ｒ４はＣ１０アルキルである）
化合物４ｂ（０．３ｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を２ｍｌの無水ＴＨＦに溶解した。次いで、Ｅｔ２Ｏ（１．２８ｍｌ、０．７７ｍｍｏｌ）中の１Ｍデシルマグネシウムブロミド溶液（化合物５、Ｒ４はＣ１０アルキルである）を０℃で滴下した。得られた混合物を２時間かけて室温に戻した。反応物を飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液でクエンチし、ヘキサンで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させ、溶離液としてヘキサン中の０～１０％ＥｔＯＡｃを使用するカラムクロマトグラフィーにより精製して、６ｂ（Ｒ４はＣ１０アルキルである）（０．２ｇ、４７％）を得た。
ヘプタデカン－９－イル９－オキソノナデカノエート（６ｂ、Ｒ４はＣ１１アルキルである）
１－ブロモウンデカン（０．４７ｇ、２ｍｍｏｌ）の２ｍＬ無水エーテル溶液に、Ｍｇ（０．０７２ｇ、３ｍｍｏｌ）及び１，２－ジブロモエタン１滴を添加した。得られた混合物を１時間撹拌し、濾過し、乾燥させた。生成物の臭化ウンデシルマグネシウム（化合物５、Ｒ４はＣ１１アルキルである）を更に精製することなく次のステップで使用した。
化合物４ｂ（０．４７ｇ、１ｍｍｏｌ）を３ｍｌの無水ＴＨＦに溶解した。次いでＴＨＦ（１．１ｍｌ、１ｍｍｏｌ）中の臭化ウンデシルマグネシウム溶液を０℃で滴下した。得られた混合物を２時間かけて室温に戻した。反応物を飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液でクエンチし、ヘキサンで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させ、溶離液としてヘキサン中の０～１０％ＥｔＯＡｃを使用するカラムクロマトグラフィーにより精製して、（化合物５、Ｒ４はＣ１１アルキルである）（０．２７ｇ、４８％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム） δ ４．８６（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），２．３７（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，４Ｈ），２．２７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），１．７０－１．４５（ｍ，８Ｈ），１．２９－１．２５（ｍ，４８Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，９Ｈ）。
ステップ４：ヘプタデカン－９－イル９－ヒドロキシヘキサデカノエート（７ｂ、Ｒ４はＣ７アルキルである）、ヘプタデカン－９－イル９－ヒドロキシヘプタデカノエート（７ｂ、Ｒ４はＣ８アルキルである）、ヘプタデカン－９－イル９－ヒドロキシオクタデカノエート（７ｂ、Ｒ４はＣ９アルキルである）、ヘプタデカン－９－イル９－ヒドロキシノナデカノエート（７ｂ、Ｒ４はＣ１０アルキルである）、又はヘプタデカン－９－イル９－ヒドロキシイコサノエート（７ｂ、Ｒ４はＣ１１アルキルである）の合成
ヘプタデカン－９－イル９－ヒドロキシヘキサデカノエート（７ｂ、Ｒ４はＣ７アルキルである）
１０ｍＬの無水ＴＨＦ中のヘプタデカン－９－イル９－オキソヘキサデカノエート（６ｂ、Ｒ４はＣ７アルキルである）（０．３ｇ、０．６ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃でＮａＢＨ４（０．０９ｇ、２．４ｍｍｏｌ）を添加し、Ｎ２雰囲気下で一晩撹拌した。反応物を飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機相をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させ、溶離液としてヘキサン中の０～１０％ＥｔＯＡｃを使用するカラムクロマトグラフィーにより精製して、７ｂ（Ｒ４はＣ７アルキルである）（０．２５ｇ、８２％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム） δ ４．９２－４．７８（ｍ，１Ｈ），３．５７（ｍ，１Ｈ），２．２７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），１．６６－１．３６（ｍ，１２Ｈ），１．３１－１．２５（ｍ，４０Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，９Ｈ）。
ヘプタデカン－９－イル９－ヒドロキシヘプタデカノエート（７ｂ、Ｒ４はＣ８アルキルである）
１０ｍＬの無水ＴＨＦ中のヘプタデカン－９－イル９－オキソヘプタデカノエート（６ｂ、Ｒ４はＣ８アルキルである）（０．４ｇ、０．７７ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃でＮａＢＨ４（０．０４ｇ、１．１５ｍｍｏｌ）を添加し、Ｎ２雰囲気下で一晩撹拌した。反応物を飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機相をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させ、溶離液としてヘキサン中の０～１０％ＥｔＯＡｃを使用するカラムクロマトグラフィーにより精製して、７ｂ（Ｒ４はＣ８アルキルである）（０．２１ｇ、５２％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム） δ ４．９２－４．８０（ｍ，１Ｈ），３．５７（ｍ，１Ｈ），２．２７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），１．６４－１．４０（ｍ，１２Ｈ），１．３６－１．１８（ｍ，４２Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，９Ｈ）。
ヘプタデカン－９－イル９－ヒドロキシオクタデカノエート（７ｂ、Ｒ４はＣ９アルキルである）
４０ｍＬのＤＣＭ：ＭｅＯＨ（１：１）混合物中のヘプタデカン－９－イル９－オキソオクタデカノエート（６ｂ、Ｒ４はＣ９アルキルである）（１．１ｇ、２．０５ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃でＮａＢＨ４（０．３ｇ、８ｍｍｏｌ）を添加し、Ｎ２雰囲気下で２時間撹拌した。反応物を１ＭＨＣｌ（水溶液）溶液でクエンチし、ＤＣＭで抽出した。有機相をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させ、溶離液としてヘキサン中の５～４０％ＥｔＯＡｃを使用するカラムクロマトグラフィーにより精製して、７ｂ（Ｒ４はＣ９アルキルである）（０．９ｇ、８３％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム） δ ４．８８－４．８３（ｍ，１Ｈ），３．５７（ｍ，１Ｈ），２．２７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），１．６１（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），１．４８－１．４１（ｍ，８Ｈ），１．３６－１．１８（ｍ，４４Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，９Ｈ）。
ヘプタデカン－９－イル９－ヒドロキシノナデカノエート（７ｂ、Ｒ４はＣ１０アルキルである）
３ｍＬのＴＨＦ：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ（１：１：１）混合物中のヘプタデカン－９－イル９－オキソノナデカノエート（６ｂ、Ｒ４はＣ１０アルキルである）（０．２ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃でＮａＢＨ４（０．０３ｇ、０．８ｍｍｏｌ）を添加し、Ｎ２雰囲気下で３時間撹拌した。反応物を０．５ｍＬのＨ２Ｏでクエンチし、ＤＣＭで抽出した。有機相をブラインで洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させ、溶離液としてヘキサン中の５～４０％ＥｔＯＡｃを使用するカラムクロマトグラフィーにより精製して、７ｂ（Ｒ４はＣ１０アルキルである）（０．１６ｇ、８０％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム） δ ４．８６（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），３．５８（ｍ，１Ｈ），２．２７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），１．６１－１．３７（ｍ，１２Ｈ），１．３２－１．１８（ｍ，４６Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，９Ｈ）。
ヘプタデカン－９－イル９－ヒドロキシイコサノエート（７ｂ、Ｒ４はＣ１１アルキルである）
３ｍＬのＴＨＦ：ＤＣＭ：ＭｅＯＨ（１：１：１）混合物中のヘプタデカン－９－イル９－オキソイコサノエート（６ｂ、Ｒ４はＣ１１アルキルである）（０．２７ｇ、０．４８ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃でＮａＢＨ４（０．０５ｇ、１．３５ｍｍｏｌ）を添加し、Ｎ２雰囲気下で３時間撹拌した。反応物を０．５ｍＬのＨ２Ｏでクエンチし、ＤＣＭで抽出した。有機相をブラインで洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させ、溶離液としてヘキサン中の５～４０％ＥｔＯＡｃを使用するカラムクロマトグラフィーにより精製して、７ｂ（Ｒ４はＣ１１アルキルである）（０．２５ｇ、９２％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（３０１ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム） δ ４．８６（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），３．５７（ｓ，１Ｈ），２．２７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），１．６９－１．３７（ｍ，１２Ｈ），１．２９－１．１７（ｍ，４８Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，９Ｈ）。
ステップ５：ヘプタデカン－９－イル９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘキサデカノエート（脂質８１）、ヘプタデカン－９－イル９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカノエート（脂質７９）、ヘプタデカン－９－イル９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）オクタデカノエート（脂質７７）、ヘプタデカン－９－イル９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ノナデカノエート（脂質７８）、又はヘプタデカン－９－イル９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）イコサノエート（脂質８０）の合成
ヘプタデカン－９－イル９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘキサデカノエート（脂質８１）
ＤＣＭ（５ｍＬ）中のヘプタデカン－９－イル９－ヒドロキシヘキサデカノエート（７ｂ、Ｒ４はＣ７アルキルである）（０．２５ｇ、０．４９ｍｍｏｌ）及び４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（０．１２５ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）の溶液に、０．２７ｍＬのＤＩＰＥＡを添加した。次いで、ＥＤＣＩ（０．１４３ｇ、０．７５ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．０１２ｇ、０．１ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をＮ２雰囲気下、室温で一晩撹拌した。翌日、反応物をＤＣＭで希釈した。有機層をＮａＨＣＯ３（水溶液）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させ、溶離液としてＤＣＭ中の０～５％ＭｅＯＨを使用するカラムクロマトグラフィーにより精製して、脂質８１（０．１４ｇ、４５％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム） δ ４．９３－４．７７（ｍ，２Ｈ），２．３７－２．２３（ｍ，５Ｈ），２．２１（ｓ，６Ｈ），１．８３－１．７３（ｍ，２Ｈ），１．７０－１．４０（ｍ，１０Ｈ），１．２５（ｓ，４３Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，９Ｈ）。［Ｃ３９Ｈ７７ＮＯ４］に対するＭＳ実測値６２４．５［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値６２３．５９。
ヘプタデカン－９－イル９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカノエート（脂質７９）
ＤＣＭ（３ｍＬ）中の化合物ヘプタデカン－９－イル９－ヒドロキシヘプタデカノエート（７ｂ、Ｒ４はＣ８アルキルである）（０．２１ｇ、０．４ｍｍｏｌ）及び４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（０．０８ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）の溶液に、０．１６ｍＬのＤＩＰＥＡを添加した。次いで、ＥＤＣＩ（０．０９ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．００８ｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をＮ２雰囲気下、室温で一晩撹拌した。翌日、反応物をＤＣＭで希釈した。有機層をＮａＨＣＯ３（水溶液）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させ、溶離液としてＤＣＭ中の０～５％ＭｅＯＨを使用するカラムクロマトグラフィーにより精製して、脂質７９（０．１１２ｇ、４４％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム） δ ４．８６（ｍ，２Ｈ），２．３４－２．２４（ｍ，５Ｈ），２．２１（ｓ，６Ｈ），１．７８（ｐ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），１．６８－１．５６（ｍ，２Ｈ），１．５４－１．４０（ｍ，８Ｈ），１．２５（ｓ，４５Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，９Ｈ）。［Ｃ４０Ｈ７９ＮＯ４］に対するＭＳ実測値６３８．５［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値６３７．６０。
ヘプタデカン－９－イル９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）オクタデカノエート（脂質７７）
ＤＣＭ（２５ｍＬ）中のヘプタデカン－９－イル９－ヒドロキシオクタデカノエート（７ｂ、Ｒ４はＣ９アルキルである）（０．３ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＥＤＣＩ（０．２１ｇ、１．１２ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．０７ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を添加し、Ｎ２雰囲気下で１５分間撹拌した。次いで、４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（０．２５ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、一晩撹拌した。翌日、溶媒を蒸発させ、ＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）に再溶解した。有機層をＨ２Ｏ（３００ｍＬ）、ＮａＨＣＯ３（水溶液）（２００ｍＬ）及びブライン（２００ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させ、溶離液としてヘキサン中の５～４０％ＥｔＯＡｃを使用するカラムクロマトグラフィーにより精製して、脂質７７（０．１２４ｇ、３４％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム） δ ４．８６（ｍ，２Ｈ），２．３８－２．２３（ｍ，６Ｈ），２．２１（ｓ，６Ｈ），１．８５－１．７１（ｍ，２Ｈ），１．６７－１．５５（ｍ，２Ｈ），１．５０－１．４４（ｍ，８Ｈ），１．２４（ｓ，４６Ｈ），０．８６（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，９Ｈ）。［Ｃ４１Ｈ８１ＮＯ４］に対するＭＳ実測値６５２．７［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値６５１．６２。
ヘプタデカン－９－イル９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ノナデカノエート（脂質７８）
１ｍＬのＤＣＭ中のヘプタデカン－９－イル９－ヒドロキシヘプタデカノエート（７ｂ、Ｒ４はＣ１０アルキルである）（０．１６ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＥＤＣＩ（０．０５２ｇ、０．２７ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．０４ｇ、０．０．３３ｍｍｏｌ）を添加し、Ｎ２雰囲気下で１５分間撹拌した。次いで、４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（０．０５６ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、一晩撹拌した。翌日、反応物をＤＣＭで希釈した。有機層をＮａＨＣＯ３（水溶液）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させ、溶離液としてＤＣＭ中の０～５％ＭｅＯＨを使用するカラムクロマトグラフィーにより精製して、脂質７８（０．０７ｇ、３６％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ｄ－クロロホルム） δ ４．９３－４．８１（ｍ，２Ｈ），２．３４－２．２４（ｍ，５Ｈ），２．２２（ｓ，６Ｈ），１．８５－１．６７（ｍ，４Ｈ），１．６３－１．５７（ｍ，２Ｈ），１．４８（ｓ，７Ｈ），１．２４（ｓ，４７Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，９Ｈ）。［Ｃ４２Ｈ８３ＮＯ４］に対するＭＳ実測値６６５．６３［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値６６６．５。
ヘプタデカン－９－イル９－（（４－（ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）イコサノエート（脂質８０）
ＤＣＭ（１ｍＬ）中のヘプタデカン－９－イル９－ヒドロキシイコサノエート（７ｂ、Ｒ４はＣ１１アルキルである）（０．２５ｇ、０．４４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＥＤＣＩ（０．０６８ｇ、０．３６ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（０．０５４ｇ、０．０．４４ｍｍｏｌ）を添加し、Ｎ２雰囲気下で１５分間撹拌した。次いで４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（０．０７４ｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、一晩撹拌した。翌日、反応物をＤＣＭで希釈した。有機層をＮａＨＣＯ３（水溶液）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させ、溶離液としてＤＣＭ中の０～５％ＭｅＯＨを使用するカラムクロマトグラフィーにより精製して、脂質８０（０．１３４ｇ、４５％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ） δ ４．８７－４．８１（ｍ，２Ｈ），２．３４－２．２４（ｍ，５Ｈ），２．２３（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，６Ｈ），１．８７－１．７６（ｍ，２Ｈ），１．７４－１．７０（ｍ，２Ｈ），１．６５－１．５７（ｍ，２Ｈ），１．４８（ｓ，７Ｈ），１．２４（ｓ，５０Ｈ），０．８７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，９Ｈ）。［Ｃ４３Ｈ８５ＮＯ４］に対するＭＳ実測値６８０．６［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値６７９．６５。
実施例５：式ＸＸのイオン化脂質の合成
式（ＸＸ）の脂質は、以下のスキーム９に示される同様の合成方法を使用して設計及び合成された。スキーム９に示される化合物中の全ての変数、すなわち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｘ、及びｎは、式（ＸＸ）で定義されるとおりである。Ｒｘは定義されたＲ４であるが、脂肪族鎖中の炭素原子が１つ少ない。
スキーム９
本開示のモノエステル脂質、すなわちＸが－Ｃ（＝Ｏ））－である式（ＸＸ）は、以下のスキーム１０に示される同様の合成方法を使用して設計及び合成された。スキーム９に示される化合物中の全ての変数、すなわち、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｘ、及びｎは、式（ＸＸ）で定義されるとおりである。Ｒｘは定義されたＲ４であるが、脂肪族鎖中の炭素原子が１つ少ない。
スキーム１０
スキーム９及びスキーム１０
スキーム９及びスキーム１０を参照すると、ステップ１において、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の酸２の撹拌溶液に、４－ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、続いて１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）を添加した。得られた混合物を窒素（Ｎ２）雰囲気下、室温で１５分間撹拌した。その後、化合物１を滴下し、混合物を一晩撹拌した。翌日、反応物をＤＣＭで希釈し、水及びブラインで洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）で乾燥し、蒸発乾固した。粗原料を、ＤＣＭ中の０～１０％メタノールを溶離液として使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。所望の化合物を含有する画分をプールし、蒸発させて、化合物３（０．７８ｇ、５４％）を得た。
ステップ２において、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中の３の溶液に水素化アルミニウムリチウム（ＬｉＡｌＨ４）を添加した。混合物を５０℃で一晩加熱した。翌日、反応物を０℃に冷却し、水を滴下してクエンチした。続いて、反応物をセライトを通して濾過して、粗生成物４を得た。生成物を更に精製することなく次のステップで使用した。
ステップ３において、化合物５又は５’（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第２０１７／４９２４５号に記載の手順に従って合成）をジメチルホルムアミド／メタノール混合物ＤＭＦ：ＭｅＯＨ（１：１）に溶解し、４を添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。生成物を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で抽出し、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（ＮａＨＣＯ３（水溶液））及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させ、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％メタノールを使用するカラムクロマトグラフィーにより精製して、式（ＸＸ）のイオン化脂質（式中、Ｘは－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－であり、５’はステップ３で反応物として使用される）を得た。
脂質１０２の合成
脂質１０２を合成するための手順は、同じく以下に提供されるスキーム１１を参照して以下に記載される。
スキーム１１
ステップ１：Ｎ－（２－（ジメチルアミノ）エチル）ノナンアミド（３ａ）の合成
６０ｍＬのＤＣＭ中のノナン酸（２ａ）（１．０ｇ、６．３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＭＡＰ（０．９１ｇ、７．５ｍｍｏｌ）、続いてＥＤＣＩ（１．４４ｇ、７．５ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物をＮ２雰囲気下、室温で１５分間撹拌した。次いで、Ｎ１，Ｎ１－ジメチルエタン－１，２－ジアミン（１ａ）（０．６６ｇ、７．５ｍｍｏｌ）を滴下し、混合物を一晩撹拌した。翌日、反応物をＤＣＭで希釈し、Ｈ２Ｏ及びブラインで洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発乾固した。粗原料を、ＤＣＭ中の０～１０％メタノールを溶離液として使用するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。所望の化合物を含有する画分をプールし、蒸発させて、３ａ（０．７８ｇ、５４％）を得た。
ステップ２：Ｎ１，Ｎ１－ジメチル－Ｎ２－ノニルエタン－１，２－ジアミン（４ａ）の合成
ＴＨＦ中の３ａ（０．７８ｇ、３．４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＬｉＡｌＨ４を添加した。混合物を５０℃で一晩加熱した。翌日、反応物を０℃に冷却し、水を滴下してクエンチした。続いて、反応物をセライトを通して濾過して、粗生成物４ａ（０．６ｇ、８２％）を得た。生成物を更に精製することなく次のステップで使用した。
ステップ３：脂質１０２の合成
化合物５ａ（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第２０１７／４９２４５号に記載の手順に従って合成）（０．６ｇ、１．３ｍｍｏｌ）を２０ｍＬのＤＭＦ：ＭｅＯＨ（１：１）に溶解し、４ａ（０．３５ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で一晩撹拌した。生成物をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で抽出し、有機層を飽和ＮａＨＣＯ３（水溶液）及びブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を真空下で蒸発させ、溶離液としてＤＣＭ中の０～１０％メタノールを使用するカラムクロマトグラフィーにより精製して、脂質１０２（０．０６２ｇ、１０％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ） δ ４．８５（ｑｕｉｎｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），２．５７－２．４８（ｍ，２Ｈ），２．４３－２．３２（ｍ，６Ｈ），２．３１－２．２５（ｍ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），２．２３（ｓ，６Ｈ），１．６６－１．３４（ｍ，８Ｈ），１．２４（ｓ，４７Ｈ），０．８６（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，９Ｈ）。
実施例６：脂質ナノ粒子製剤の調製
脂質エタノールストックの調製
本明細書に記載の例示的なイオン化脂質（例えば、脂質Ａ、式（Ｉ）又は式（Ｉ’）に包含される脂質３５、脂質３７、及び脂質３９、式（ＩＩ）によって包含される脂質５７、脂質５８、脂質６１、及び脂質６２）を含むｃｅＤＮＡ脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤（０．２５ｍｇ ｃｅＤＮＡ－ルシフェラーゼ）は、以下のように調製された。
１０個のＧ２透析フィルターを３０％エタノールに１～２時間浸漬し、空にし、洗浄し、製剤が準備できるまで（＞３時間）脱イオンＨ２Ｏに浸漬した。個々の脂質エタノールストックは前の週に調製し、－２０℃で保存した。個々の脂質エタノールストックの濃度を下の表に示す。各ストックは、最終混合物の所望の濃度の５倍で調製した。したがって、基本脂質混合物を調製するために、等量の各ストックを一緒に混合した。
ＬＮＰ－ｃｅＤＮＡ－ルシフェラーゼ製剤の調製
簡単かつ一般的に、本明細書に記載のイオン化脂質のいずれかを含むＬＮＰ脂質混合物２．５ｍＬを作製するために、５つの異なる脂質すとっくの各々０．５ｍＬを添加し、一緒に混合した。ＬＮＰ脂質混合物中の各脂質成分のモルパーセンテージを表８に示す。
試験Ａの目的は、粒子サイズ及び封入効率に対する脂質Ａ ＬＮＰ製剤の標準的な水性プロセス及びエタノールベースのプロセスの効果を比較することであった。試験Ａの更なる目的は、ベースＬＮＰ製剤に更に多くの成分を添加した場合に、エタノールベースのプロセスによる改善が観察されるかどうかを評価することであった。この目的のために、溶液が透明になるまで溶液を手で穏やかにかき混ぜながら、０．２５ｍＬのｃｅＤＮＡ－ルシフェラーゼ（１．０５ｍｇ／ｍＬ）を滴下した。これにより、本明細書に記載のアルコールベースのプロセスを使用して調製された脂質／ｃｅＤＮＡベース製剤（脂質Ａを含む）が形成され、これは、表９に示すＬＮＰ３であり、強度に基づく平均流体力学的直径（Ｚａｖｅ）は６４．２ｎｍである。
上記ストックの等量混合物２．５ｍＬ（各脂質０．５ｍＬ）に、最初にＥｔＯＨ中の１０ｍｇ／ｍＬのｍＰＥＧ－Ｃ１８溶液３４ｕＬを添加し、次いで０．２５ｍＬのｃｅＤＮＡ－ルシフェラーゼ（１．０５ｍｇ／ｍＬ）を、溶液が透明になるまで溶液を手で穏やかにかき混ぜながら滴下した。これにより、脂質／ｃｅＤＮＡ製剤（脂質Ａを含む）＋２％ｍＰＥＧ－Ｃ１８が形成され、これは表９に示すようにＬＮＰ４であり、平均直径は５５．２ｎｍであった。
上記ストックの等量混合物２．５ｍＬ（各脂質０．５ｍＬ）に、最初にＥｔＯＨ中の１０ｍｇ／ｍＬのｍＰＥＧ－Ｃ１８溶液６９ｕＬを添加し、次いで０．２５ｍＬのｃｅＤＮＡ－ルシフェラーゼ（１．０５ｍｇ／ｍＬ）を、溶液が透明になるまで溶液を手で穏やかにかき混ぜながら滴下した。これにより、脂質／ｃｅＤＮＡ混合製剤（脂質Ａを含む）＋４％ｍＰＥＧ－Ｃ１８が形成され、これは表９に示すようにＬＮＰ５であり、平均直径は６２．２ｎｍであった。
１．２０ｍｇのｂ－ｓｉｔｏを小さなバイアルに量り取り、２０ｍＬバイアルに添加した。クロロホルム中のＤＯＰＥ溶液（２５ｍｇ／ｍＬ溶液の１７ｕＬ）をバイアルに添加し、Ｎ２ガスの集中気流（ピペット）下でクロロホルムを蒸発させた。その後、バイアルを真空デシケータ内で２～３時間保存した。乾燥脂質を１．０ｍＬのエタノールに溶解し、次いで０．５ｍＬのｓｓＯＰ脂質ストック、０．５ｍＬのＤＭＧ－ＰＥＧ２０００ストック、及び０．５ｍＬのＧａｌＮＡｃ４ストックを添加した。次いで、溶液を手で穏やかにかき混ぜながら、０．２５ｍＬのｃｅＤＮＡ－ルシフェラーゼ（１．０５ｍｇ／ｍＬ）を溶液に滴下した。これにより、脂質／ｃｅＤＮＡ製剤（脂質Ａを含む）＋ＤＯＰＥ／ｂ－ｓｉｔｏが形成され、これは表９に示すようにＬＮＰ６であり、平均直径は７８．７ｎｍであった。
モノＧａｌＮＡｃ（２．５ｍｇ／ｍＬ）のクロロホルム溶液４６ｕＬを２０ｍＬバイアルに添加した。Ｎ２ガスの集中気流（ピペット）下でクロロホルムを蒸発させた。その後、バイアルを真空デシケータ内で２～３時間保存した。次いで、０．５ｍＬのエタノールに溶解した。次いで、ＳＳＯＰ、ＤＯＰＣ、Ｃｈｏｌ、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２０００ストックの各々０．５ｍＬを溶液に添加した。次いで、０．２５ｍＬのｃｅＤＮＡ－ルシフェラーゼ（１．０５ｍｇ／ｍＬ）を溶液に添加した。これにより、脂質／ｃｅＤＮＡ製剤（脂質Ａを含む）＋０．２５％モノＧａｌＮＡｃが形成され、これは表１０のＬＮＰ７である。


表９に見られるように、標準水性プロセスを使用して調製された、脂質Ａをイオン化脂質及び他の脂質成分として含有する対照ＬＮＰ２製剤は、９３．３ｎｍの強度ベースの平均流体力学的直径（Ｚａｖｅ）及び封入効率の６２．９％を有した。製剤の脂質及びｃｅＤＮＡ組成がＬＮＰ２の組成と同一であるが、エタノールベースのプロセスを使用して製剤を調製したＬＮＰ３では、粒子の平均直径は６４．２ｎｍに減少し、封入効率は８８．０％に増加した。ＬＮＰ４及びＬＮＰ５のｍＰＥＧ－Ｃ１８、ＬＮＰ６のＤＯＰＥ／ｂ－ｓｉｔｏ、ＬＮＰ７のｍｏｎｏ－ＧａｌＮＡｃなど、エタノールベースのプロセスを使用して同様に調製された他のＬＮＰ製剤に追加の成分が添加された場合、より小さな平均直径の測定値も観察され、それによってＬＮＰ製剤の調製におけるアルコールの使用がｃｅＤＮＡに圧縮効果をもたらし、それによってＬＮＰの平均直径が小さくなるという仮説を裏付ける証拠が提供された。更に、封入効率の増加は、アルコールベースのプロセスを使用して調製されたＬＮＰ４、ＬＮＰ５、及びＬＮＰ７で観察された。多分散指数（ＰＤＩ）については、一般に、約０．１５以下のＰＤＩ値が満足できるものとみなされる。
実施例６～９に記載の試験Ｂ～Ｅで使用された製剤を含む、本明細書に記載の他の全てのイオン化脂質を含有するＬＮＰ－ｃｅＤＮＡ－ルシフェラーゼ製剤を、イオン化脂質として脂質Ａを含有する製剤について上述したのと同様の手順を使用して調製した。一本側鎖ＧａｌＮＡｃ（モノＧａｌＮＡｃ）、三本側鎖ＧａｌＮＡｃ（ＧａｌＮＡｃ３）又は四本側鎖ＧａｌＮＡｃ（ＧａｌＮＡｃ４）などのＧａｌＮＡｃリガンドは、当該技術分野で知られるように合成することができ（ＷＯ２０１７／０８４９８７及びＷＯ２０１３／１６６１２１を参照されたい）、当該技術分野で周知のように脂質、又はＰＥＧに化学的にコンジュゲートすることができる（Ｒｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）“Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｐｐｅｒ Ｓｉｚｅ Ｌｉｍｉｔ ｆｏｒ Ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｔｈｅ Ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｏｎ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ Ｖｉｖｏ”２７６：３７５５７７－３７５８４を参照されたい）。
実施例７：予備圧縮の新しいプロセスの特徴付け
ナノアセンブル
エタノール中の脂質のストック溶液は、表８に記載されている濃度で作製された。イオン化脂質エタノールストック中のイオン化脂質は、脂質Ａであった。
各脂質エタノールストックの３．１５ｍＬをベース脂質混合物と合わせた（合計１５．７５ｍＬ）。各ストックは、最終的な脂質混合物中の脂質の所望の濃度の５倍であった。
０．３ｍＬの１ｍｇ／ｍＬ ｃｅＤＮＡ－ルシフェラーゼ（１．０５ｍｇ／ｍＬ）を、手で穏やかに回転させながら３ｍＬの脂質混合物に添加した。最終混合物は透明であった。
次いで、この混合物を、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒで、以下に示すように様々な流量比（ＦＲＲ）でｐＨ＝４のリンゴ酸緩衝液（ＮａＣｌなし）と混合した。
ＦＲＲ＝３：２、総量１ｍＬ、８ｍＬのリザーバー、リンゴ酸緩衝液へ
ＦＲＲ＝３：１、総量１．６ｍＬ、７．４ｍＬのリザーバー、リンゴ酸緩衝液へ
ＦＲＲ＝５：１、総量２．４ｍＬ、６．６ｍＬのリザーバー、リンゴ酸緩衝液へ
ＦＲＲ＝１０：１、総量４．４ｍＬ、４．６ｍＬのリザーバー、リンゴ酸緩衝液へ
具体的には、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒを使用して、各脂質／ｃｅＤＮＡ混合物を２０ｍＭ ｐＨ＝４のリンゴ酸（ＮａＣｌなし）と混合した。脂質／ｃｅＤＮＡに対するリンゴ酸緩衝液の３：１の流速比を利用した。脂質／ｃｅＤＮＡ混合物には３ｍＬシリンジを使用し、リンゴ酸緩衝液には１０ｍＬシリンジを使用した。ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒの出口を空の１５ｍＬファルコンチューブに集め、実行直後に１０ｍＬのリンゴ酸を含む５０ｍＬファルコンチューブに添加した。各溶液の最終エタノール含有量は約１２．５％、最終容量は約２０ｍＬであった。本明細書に記載されている収集方法は、４％エタノールに希釈され、出口を直接希釈剤に分注した以前の試験から逸脱しており、より大きなスケールでは不便であった。ナノアセンブリの前に、ベース脂質混合物を使用した４０ｕｇの試行が、この修正された収集手順で実行され、透析前のＤＬＳ測定で＜７０ｎｍの粒子も生成されることがわかった。
次いで、各サンプルを２つの１０ｍＬ Ｇ２透析フィルターに分割し、１×ＤＰＢＳ（５Ｌ）で一晩透析した。翌日、透析液を更に２回交換した。
各溶液の最終的なエタノール含有量は約４％であった。透析を一晩実施し、続いて標準的なプロセス／特徴付けを行った。分析結果を以下の表１１に示す。この表から、ＤＬＳ及び様々な流量比（ＦＲＲ）で決定されたように、粒子の直径は全て７０ｎｍより小さく、封入効率は８５％より高かったことがわかる。
脂質粒子製剤の分析
動的光散乱（ＤＬＳ）によって粒径を判定した。
記載された方法を使用して生成されたＬＮＰは、長さ５．４ｋｂｐ（キロ塩基対）のｃｅＤＮＡの＞８０％を封入し、平均直径６６ｎｍを有する。新しい方法（ｎ＝４）と古い方法（ｎ＝２８）を使用して生成されたＬＮＰ直径の統計的比較は、標準的なプロセスと比較して同等又はより優れたｃｅＤＮＡ封入効率を維持しながら、この新しいプロセスがＬＮＰを正常に削減する高い信頼度（Ｐ＝１．７Ｅ～１５）につながる（図２）。図１Ａは、動的光散乱によって決定されるｃｅＤＮＡの凝縮を示すグラフである。動的光散乱相関関数は、エタノール含有量が増加するにつれてｃｅＤＮＡの凝縮を示す。図１Ｂは、再水和により圧縮が可逆的であることを示すグラフである。ＬＮＰ直径又はｃｅＤＮＡの封入効率のいずれかに対する流量比の有意な影響は観察されなかった。理論に拘束されることを望まないが、新しいプロセスで見られる改善は、ＬＮＰの形成前に９０～９２％のエタノール溶媒でｃｅＤＮＡを圧縮することによる可能性が高い。酸性の水性緩衝液と混合することによってＬＮＰ形成が開始されると、脂質は、「標準的なプロセス」とは対照的に、より小型のｃｅＤＮＡコアの周りに核形成することができ、その結果、粒子が大幅に小さくなる。
脂質粒子へのｃｅＤＮＡの封入を、Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）又はＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）キットによって決定した。Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）又はＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）は、溶液中のオリゴヌクレオチド及び一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡを定量化するための超高感度蛍光核酸染色剤である。簡単に言えば、封入は、膜不透過性蛍光色素排除アッセイを実施することによって決定された。染料を脂質粒子製剤に添加した。蛍光強度を測定し、少量の非イオン性界面活性剤を添加したときに観察された蛍光と比較した。脂質二層の界面活性剤媒介性崩壊は、封入されたｃｅＤＮＡを放出し、それが膜不透過性色素と相互作用することを可能にする。ｃｅＤＮＡの封入は、Ｅ＝（Ｉ０－Ｉ）／Ｉ０として計算し、Ｉ０は、界面活性剤を添加した場合の蛍光強度を示し、Ｉ０は、界面活性剤を添加しない場合の蛍光強度を示す。
ＬＮＰからのｃｅＤＮＡの放出を決定した。アニオン性リポソームを模倣するエンドソームはＤＯＰＳ：ＤＯＰＣ：ＤＯＰＥ（モル比１：１：２）をクロロホルム中で混合し、続いて真空で溶媒を蒸発させることによって調製した。乾燥した脂質フィルムを短時間の超音波処理でＤＰＢＳに再懸濁し、続いて０．４５μｍシリンジファイラーで濾過してアニオン性リポソームを形成した。血清をＬＮＰ溶液に１：１（ｖｏｌ／ｖｏｌ）で添加し、３７℃で２０分間インキュベートした。次いで、混合物を、ｐＨ７．４又は６．０のいずれかで、３７℃で更に１５分間、ＤＰＢＳ中の所望のアニオン性／カチオン性脂質モル比でアニオン性リポソームとともにインキュベートした。ｐＨ７．４又はｐＨ６．０での不含ｃｅＤＮＡは、封入されていないｃｅＤＮＡの含有量を判定することによって、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＬＮＰスラリー（Ｃｆｒｅｅ）に添加したときの蛍光を測定し、この値を１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００（Ｃｔｏｔａｌ）によるＬＮＰの溶解のときに得られた総ｃｅＤＮＡ含有量と比較することによって計算され、ｆｒｅｅ％＝Ｃｆｒｅｅ／Ｃｔｏｔａｌ×１００である。アニオン性リポソームとのインキュベーション後に放出されたｃｅＤＮＡ％は、以下の式に基づいて計算される。
放出されたｃｅＤＮＡ％＝アニオン性リポソームと混合された不含ｃｅＤＮＡ％－ＤＰＢＳと混合された不含ｃｅＤＮＡ％
製剤化されたカチオン性脂質のｐＫａは、核酸の送達のためのＬＮＰの有効性と相関し得る（Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２），５１（３４），８５２９－８５３３、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８，１７２－１７６（２０１０）を参照。それらの両方は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれた）。ｐＫａの好ましい範囲は、約５～約７である。各カチオン性脂質のｐＫａを、２－（ｐ－トルイジノ）－６－ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）の蛍光に基づくアッセイを使用して、脂質ナノ粒子中で決定した。０．４ｍＭ全脂質の濃度でのＤＰＢＳ中のカチオン性脂質／ＤＯＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ－脂質（５１／７．５／３８．５／３ｍｏｌ％）からなる脂質ナノ粒子は、本明細書及び他に記載されるインラインプロセスを使用して調製された。ＴＮＳは、蒸留水中の１００μＭストック溶液として調製された。小胞は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭの酢酸アンモニウム、１３０ｍＭのＮａＣｌを含有する２ｍＬの緩衝溶液中の２４μＭ脂質に希釈され、ｐＨは、２．５～１１の範囲であった。ＴＮＳ溶液のアリコートを添加して、１μＭの最終濃度にし、続いて渦流混合発光強度を、３２１ｎｍの励起波長及び４４５ｎｍの発振波長を使用し、ＳＬＭ Ａｍｉｎｃｏ Ｓｅｒｉｅｓ ２発光分光光度計において室温で測定した。Ｓ字状最良適合分析は、蛍光データに適用することができ、ｐＫａは、半最適蛍光強度を生じるｐＨとして測定される。
脂質ナノ粒子のＡｐｏＥへの結合を以下のように決定する。ＬＮＰ（ｃｅＤＮＡの１０μｇ／ｍＬ）を、ＤＰＢＳ中の等量の組換えＡｐｏＥ３（５００μｇ／ｍＬ）とともに３７℃で２０分間インキュベートする。インキュベーション後、ＬＮＰ試料を、ＤＰＢＳを使用して１０倍に希釈し、ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ １５０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのヘパリンセファロースクロマトグラフィーによって分析する。
実施例８：試験Ｂ－脂質Ａ ＬＮＰ製剤中の様々なＧａｌＮＡｃ量
試験Ｂの目的は、脂質Ａ ＬＮＰ製剤（エタノールベースのプロセスを使用して調製）中の様々な四本側鎖ＧａｌＮＡｃ（ＧａｌＮＡｃ４）の量が粒子サイズ及び封入効率に及ぼす影響を評価することであった。表１２は、試験したＬＮＰ製剤の組成及びモル比、並びにそれらの平均直径（Ｚａｖｅ）、多分散指数（ＰＤＩ）、及び封入効率（ＥＥ）を示す。
表１２の結果は、水性プロセス（すなわち、ＬＮＰ８）の代わりにエタノールベースのプロセスを用いて０．４８％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＧａｌＮＡｃ４を有するＬＮＰ９を調製した場合、平均直径が９５．８ｎｍから６７．９ｎｍに減少した一方、封入効率が７３．６％から８７．１％に増加したことを示す。０．２４％、０．１０％、及び０．０５％のＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＧａｌＮＡｃ４をそれぞれ含むＬＮＰ１０、ＬＮＰ１１、及びＬＮＰ１２では、平均直径サイズの減少及び封入効率の増加が一貫して観察された。
実施例９：試験Ｃ－エタノールベースのプロセスを使用して調製された式（Ｉ）又は式（Ｉ’）のＬＮＰ製剤
試験Ｃの目的は、実施例６に記載されているように、標準的な水性プロセス又はエタノールベースのプロセス（ＥｔＯＨ９２％）を使用して調製された代表的な式（Ｉ）又は式（Ｉ’）ＬＮＰ製剤の物理的特性を比較することであった。表１３は、試験したＬＮＰ製剤の組成及びモル比、並びにそれらの平均直径（Ｚａｖｅ）、多分散指数（ＰＤＩ）、及び封入効率（ＥＥ）を示す。
表１３の結果は、脂質３５（すなわち、ＬＮＰ１５）、脂質３７（すなわち、ＬＮＰ１７）、又は脂質３９（すなわち、ＬＮＰ１９）を有するＬＮＰ製剤を調製するためにエタノールベースのプロセスを使用した場合、水性プロセスを使用して調製された対応する製剤（すなわち、それぞれＬＮＰ１４、ＬＮＰ１６、及びＬＮＰ１８）と比較して、全ての製剤で一貫して直径が減少したことが観察された。注目すべきは、ＬＮＰ１５、ＬＮＰ１７、及びＬＮＰ１９の平均直径サイズは、全て７５ｎｍよりも小型である。更に、脂質３５及び脂質３７については、エタノールベースのプロセスを使用して調製されたＬＮＰ製剤の封入効率が大幅に改善された。
実施例１０：試験Ｄ－エタノールベースのプロセスを使用して調製された式（ＩＩ）のＬＮＰ製剤
試験Ｄの目的は、実施例６に記載されているように、標準的な水性プロセス又はエタノールベースのプロセス（ＥｔＯＨ９２％）を使用して調製された代表的な式（ＩＩ）ＬＮＰ製剤の物理的特性を比較することであった。表１４及び表１５は、試験したＬＮＰ製剤の組成及びモル比、並びにそれらの平均直径（Ｚａｖｅ）、多分散指数（ＰＤＩ）、及び封入効率（ＥＥ）を示す。
表１４及び１５の結果は、脂質５７（すなわち、ＬＮＰ２２）、脂質５８（すなわち、ＬＮＰ２４）、脂質６１（すなわち、ＬＮＰ２７）又は脂質６２（すなわち、ＬＮＰ２９）を有するＬＮＰ製剤を調製するためにエタノールベースのプロセスを使用した場合、水性プロセスを使用して調製された対応する製剤（すなわち、それぞれＬＮＰ２１、ＬＮＰ２３、ＬＮＰ２６、及びＬＮＰ２８）と比較して、全ての製剤で一貫して直径が減少し、封入効率が増加したことが観察された。注目すべきは、ＬＮＰ２２及びＬＮＰ２４の平均直径サイズは、７５ｎｍよりも小型である。
実施例１１：試験Ｅ－ＬＭＷアルコールベースのプロセスを使用して調製された式（ＸＶ）ＬＮＰ製剤
試験Ｅの目的は、実施例６の記載と同様に、標準的な水性プロセス又はＬＭＷアルコールベースのプロセス（ＥｔＯＨ：ＭｅＯＨ；総濃度９５％で１：１の比率）を使用して調製された代表的な式（ＸＶ）ＬＮＰ製剤の物理的特性を比較することであった。簡単に言えば、標準的な水性プロセスでは、ＥｔＯＨ：ＭｅＯＨ溶液中の脂質をＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ中のｃｅＤＮＡを含む水性緩衝液と混合してＬＮＰを形成した（１つのチャネルは脂質を導入し、他のチャネルは水性緩衝液にｃｅＤＮＡを導入する）。ＬＭＷアルコールベースのプロセスでは、ｃｅＤＮＡ及び脂質を、実施例６で説明した混合物形成と同様に、９５％ＬＭＷアルコール（ＥｔＯＨ：ＭｅＯＨ（１：１））の最終濃度を有する溶液で事前に混合し、ｃｅＤＮＡ及び脂質を含む得られた９５％ＬＭＷアルコール混合物を１つのチャネルを介してＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒに導入し、別のチャネルを介して水性緩衝液（２０ｍＭ ｐＨ＝４のリンゴ酸（ＮａＣｌなし））をＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒに導入して、ｃｅＤＮＡを封入するＬＮＰを作成した。表１６は、試験したＬＮＰ製剤の組成及びモル比、並びにそれらの平均直径（Ｚａｖｅ）、多分散指数（ＰＤＩ）、及び封入効率（ＥＥ）を示す。
表１６の結果は、脂質７７（すなわち、ＬＮＰ３２及びＬＮＰ３４）を有するＬＮＰ製剤を調製するためにＬＷＭアルコールベースのプロセス（ＥｔＯＨ：ＭｅＯＨ、１：１）％）を使用した場合、水性プロセスを使用して調製された対応する製剤（すなわち、ＬＮＰ３１及びＬＮＰ３３）と比較して、ＬＮＰ３２及びＬＮＰ３４において直径が減少し、封入効率が増加したことが観察された。一貫して、脂質７７及び２．３％のＤＭＧ－ＰＥＧ２０００を有し、エタノールベースのプロセスを使用して調製されたＬＮＰ製剤は、７５ｎｍ未満の平均直径サイズを有していた。
実施例１２：製剤の機能的評価のためのインビトロ食作用アッセイ
ｓｓ－ＯＰ４をカチオン性脂質成分として、任意に肝臓特異的リガンドであるＧａｌＮａｃを用いて、ＭＣ３、ＭＣ３－５％ ＤＳＧ－ＰＥＧ２０００（１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレン）（「５ＤＳＧ」と略記）を含むｃｅＤＮＡ脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を使用して、インビトロ食作用アッセイを実施する。
０．１％ＤｉＤ（ＤｉＩＣ１８（５）、１，１’－ジオクタデシル－３，３，３’，３’－テトラメチルインドジカルボシアニン、４－クロロベンゼンスルホン酸塩）親油性カルボシアニン色素で処理したｃｅＤＮＡ ＬＮＰについての食作用アッセイを実行する。１０％ヒト血清（＋血清）の存在下又は非存在下で、ＬＮＰに様々な濃度のｃｅＤＮＡを使用し、次いでＴＨＰ－１細胞から分化したマクロファージに導入する。
ｃｅＤＮＡを内在化する貪食細胞は、赤色蛍光で現れる。ｃｅＤＮＡを含むｓｓ－ＯＰ４ ＬＮＰは、最小数の蛍光貪食細胞と高度に関連していることが予想される。したがって、理論に束縛されるものではないが、ｓｓ－ＯＰ４ ＬＮＰは、ＭＣ３－５ＤＳＧ及びＭＣ３ ＬＮＰと比較して、免疫細胞による食作用をよりよく回避できると考えられる。食作用は、赤いオブジェクト数／コンフルエンスによって定量化される。
６０ｎｍ～７５ｎｍの平均直径を含むｃｅＤＮＡ－ＬＮＰは、７５ｎｍより大きい平均直径を有するｃｅＤＮＡ－ＬＮＰと比較して、より大きな肝細胞標的化を示すことが期待される。
実施例１３：ＬＮＰ製剤の前臨床インビボ試験
ｃｅＤＮＡ－ルシフェラーゼのインビボ発現及びマウスにおけるＬＮＰ製剤の忍容性を評価するために、各試験Ａ～Ｅにおいて前臨床試験も実施した。これらの前臨床試験に含まれる試験デザイン及び手順は、以下のとおりである。
材料及び方法
種（数、性別、年齢）：ＣＤ－１マウス（Ｎ＝６５及び５匹の予備、雄、到着時に約４週齢）。
ケージ側の観察：ケージ側の観察を毎日行った。
臨床観察：臨床観察は、０日目の試験物質投与の約１、約５～約６、及び約２４時間後に実施した。例外ごとに追加の観察を行った。全ての動物の体重を、該当する場合、０、１、２、３、４及び７日目（安楽死前）に記録した。必要に応じて、追加の体重を記録した。
用量投与：試験品（ＬＮＰ：ｃｅＤＮＡ－Ｌｕｃ）を、外側尾静脈への静脈内投与により、０日目に５ｍＬ／ｋｇで投与した。
インライフ画像化：４日目に、全ての動物に２．５ｍＬ／ｋｇの腹腔内（ＩＰ）注射を介して１５０ｍｇ／ｋｇ（６０ｍｇ／ｍＬ）のルシフェリンを投与した。各ルシフェリン投与後１５分以内に、以下に説明するインビボ画像化プロトコルに従って全ての動物にＩＶＩＳ画像化セッションを行った。
麻酔の回復：麻酔下の間、回復中、及び移動するまで、動物を継続的にモニタリングした。
中間採血：全ての動物は、０日目、試験の５～６時間後（５．０時間以上、６．５時間以下）に中間採血を行った。
採取後、動物は０．５～１．０ｍＬの乳酸リンゲル液を皮下に受けた。
血清のための全血を、尾静脈ニック、伏在静脈、又は眼窩洞穿刺（吸入イソフルラン下）によって採取した。全血は、凝固活性剤チューブを備えた血清分離器に採取され、１つ（１）の血清アリコートに処理された。
インビボ画像化プロトコル
●ルシフェリンストック粉末を表示上－２０℃で保存した。
●製剤化されたルシフェリンを１ｍＬのアリコート、２～８℃で保存して、光から保護した。
●製剤化されたルシフェリンは、２～８℃で最大３週間安定であり、光から保護され、室温（ＲＴ）で約１２時間安定であった。
●ルシフェリンをＰＢＳに十分な容量で６０ｍｇ／ｍＬの目標濃度に溶解し、必要に応じて５ＭのＮａＯＨ（約０．５μｌ／ｍｇルシフェリン）及びＨＣｌ（約０．５μＬ／ｍｇルシフェリン）でｐＨ＝７．４に調整した。
●少なくとも５０％の超過分を含め、プロトコルに従って適切な量を調製した。
注射及び画像化
●動物の被毛を剃った（必要に応じて）。
●プロトコルに従って、腹腔内を介して６０ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ中の１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリンを注射した。
●画像化は、投与直後又は投与後最大１５分行った。
●画像化セッション中に動物を麻酔するために、イソフルラン気化器を１～３％（通常は２．５％）に設定した。
●画像化セッションのためのイソフルラン麻酔：
○動物をイソフルランチャンバーに入れ、イソフルランが有効になるまで約２～３分待った。
○ＩＶＩＳ機器の側面の麻酔レベルが「オン」の位置にあることを確認した。
○動物をＩＶＩＳ機器に入れた。
最高感度の設定で所望の取得プロトコルを行った。
結果
エタノールベース（９２％ＥｔＯＨ）又はＬＭＷアルコールベースのプロセス（ＮａｎｏａｓｓｅｍｂｌｒでのＬＮＰ形成前のプレミックスとしてのｃｅＤＮＡ及び脂質を９５％ＥｔＯＨ：ＭｅＯＨ（１：１））を使用して調製され、試験Ａ～Ｅで使用され、実施例４及び６～９に記載の全てのＬＮＰ製剤は、標準水性プロセスを使用して調製された対応する製剤と比較して、十分な又は同等のルシフェラーゼ発現（投与後４日目に測定されたＩＶＩＳ）を示した。忍容性に関しては、エタノールベースのプロセスを使用して調製され、試験Ａ～Ｅで使用され、実施例６及び８～１１に記載される全てのＬＮＰ製剤は、優れた忍容性を示し、処置後１日目に測定したマウスの体重に有意な変化はなかった。
実施例１４：ｃｅＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用して、様々な条件（例えば、脱イオン（ＤＩ）水、ＤＩ中９１％１：１ＥｔＯＨ：ＭｅＯＨ、１００ｍＭのＮａＯＨ、１００％の５０：５０ＥｔＯＨ：ＭｅＯＨ）で保存されたｃｅＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の形態を調べた。理論に拘束されるものではないが、本発明者らは、アルコール／水溶液又は純粋なアルコール溶媒で処理されたｃｅＤＮＡ及びｐＤＮＡが、ＬＮＰによる封入効率を高めるコンフォメーションへの核酸の変性をもたらし、より小さい直径サイズ（すなわち、７５ｎｍ未満±３ｎｍ）を有するＬＮＰ製剤を生成すると仮説を立てた。簡単に言えば、各サンプルをグリッドに適用し、緩衝液で洗浄し、次いでサンプルをメタノール中の０．０６％酢酸ウラニルで染色した。次いで、グリッドをグリッドボックスに直接配置し、顕微鏡で観察する前に試した。
図３Ａ及び３Ｂに示されるＴＥＭ画像は、核酸サンプルが脱イオン水中に保存された場合、ｃｅＤＮＡ及びｐＤＮＡ（プラスミド）の両方が、いくつかの鎖様構造を有するほとんど凝集又は自己もつれ形状を示したことを示す。脱イオン水中の９０．９％の１：１エタノール：メタノールの低分子量アルコール／水溶液に保存した場合、ｃｅＤＮＡサンプルは明確な棒状構造を形成し（図４Ａを参照）、ｐＤＮＡは環状構造を形成した（図４Ｂを参照）。１００％低分子量アルコール（すなわち、水を含まない１：１エタノール：メタノール）に保存されたｃｅＤＮＡサンプルもＴＥＭによって可視化され、上記のアルコール／水溶液で保存したサンプルよりもやや太いロッド（図５参照）を示していることが確認された。更に、１００ｎＭのＮａＯＨに保存されたｃｅＤＮＡ及びｐＤＮＡサンプルはまた、顕微鏡下で調べられた。図６Ａ及び６Ｂは、両方の核酸サンプルが、脱イオン水中での保存と比較して、塩基性条件でほとんど変化しないままであることを示す。
参考文献
文献参照、発行済み特許、公開済みの特許出願、及び係属中の特許出願を含む、本出願を通して引用される全ての特許及び他の出版物は、例えば、本明細書に記載される技術に関連して使用され得るそのような刊行物に記載される方法論を説明及び開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの出版物は、本出願の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供されている。この点に関するいかなるものも、発明者が先行する開示のおかげで、又はいかなる他の理由のためにもそのような開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。日付に関する全ての記述又はこれらの文書の内容に関する表現は、出願人が入手できる情報に基づいており、これらの文書の日付又は内容の正確さに関するいかなる承認も構成するものではない。
本開示の実施形態の説明は、網羅的であること、又は本開示を開示された正確な形態に限定することを意図したものではない。本開示の特定の実施形態及び実施例が、例示の目的で本明細書で説明されているが、当業者が認識するように、本開示の範囲内で様々な同等の修正が可能である。例えば、方法のステップ又は機能は、所与の順序で提示されるが、代替的な実施形態は、異なる順序で機能を実施してもよく、又は機能は実質的に同時に実施されてもよい。本明細書で提供される開示の教示は、必要に応じて他の手順又は方法に適用することができる。本明細書に記載される様々な実施形態は、更なる実施形態を提供するために組み合わせることができる。本開示の態様は、必要に応じて、上記の参照文献及び出願の組成物、機能、及び概念を用いて本開示の更なる実施形態を提供するように修正することができる。更に、生物学的機能の同等性の考慮により、種類又は量の生物学的又は化学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造にいくつかの変更を加えることができる。詳細な説明に照らして、これらの変更及び他の変更を本開示に加えることができる。そのような修正は全て、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
前述の実施形態のいずれかの特定のエレメントは、他の実施形態のエレメントと組み合わせるか、又は置き換えることができる。更に、本開示のある特定の実施形態に関連する利点が、これらの実施形態の文脈で説明されたが、他の実施形態もそのような利点を示し得、全ての実施形態が本開示の範囲内にあるために必ずしもそのような利点を示す必要はない。
本明細書に記載される技術は、以下の実施例によって更に説明されており、決してこれらを更に限定するものと解釈されるべきではない。本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬などにいかなる様式でも限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲を限定することを意図されない。

Claims (158)

  1. 脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む薬学的組成物であって、前記ＬＮＰが、脂質及び剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）を含み、前記ＬＮＰの平均直径が、約２０ｎｍ～約７５ｎｍである、薬学的組成物。
  2. 前記剛性治療用核酸が、閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）である、請求項１に記載の薬学的組成物。
  3. 前記剛性治療用核酸が、二本鎖核酸である、請求項１に記載の薬学的組成物。
  4. 前記脂質が、イオン化脂質、非カチオン性脂質、ステロール若しくはその誘導体、ＰＥＧ化脂質、又はそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  5. 前記イオン化脂質が、カチオン性脂質である、請求項４に記載の薬学的組成物。
  6. 前記カチオン性脂質が、ＳＳ切断可能な脂質である、請求項４に記載の薬学的組成物。
  7. 前記カチオン性脂質が、式（Ｉ）：
    又はその薬学的に許容される塩によって表され、式中、
    Ｒ１及びＲ１’が、各々独立して、任意に置換された直鎖又は分岐鎖Ｃ１～３アルキレンであり、
    Ｒ２及びＲ２’が、各々独立して、任意に置換された直鎖又は分岐鎖Ｃ１～６アルキレンであり、
    Ｒ３及びＲ３’が、各々独立して、任意に置換された直鎖又は分岐鎖Ｃ１～６アルキルであるか、
    あるいは、Ｒ２が任意に置換された分岐鎖Ｃ１～６アルキレンである場合、Ｒ２及びＲ３が、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成するか、
    あるいは、Ｒ２’が任意に置換された分岐鎖Ｃ１～６アルキレンである場合、Ｒ２’及びＲ３’が、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成し、
    Ｒ４及びＲ４’が、各々独立して、－ＣＲａ、－Ｃ（Ｒａ）２ＣＲａ、又は－［Ｃ（Ｒａ）２］２ＣＲａであり、
    Ｒａが、各出現に対して、独立してＨ又はＣ１～３アルキルであるか、
    あるいは、Ｒ４が－Ｃ（Ｒａ）２ＣＲａ、又は－［Ｃ（Ｒａ）２］２ＣＲａである場合、及びＲａがＣ１～３アルキルである場合、Ｒ３及びＲ４が、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成するか、
    あるいは、Ｒ４’が－Ｃ（Ｒａ）２ＣＲａ、又は－［Ｃ（Ｒａ）２］２ＣＲａである場合、及びＲａがＣ１～３アルキルである場合、Ｒ３’及びＲ４’が、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～８員のヘテロシクリルを形成し、
    Ｒ５及びＲ５’が、各々独立して、Ｃ１～２０アルキレン又はＣ２～２０アルケニレンであり、
    Ｒ６及びＲ６’が、各出現に対して、独立して、Ｃ１～２０アルキレン、Ｃ３～２０シクロアルキレン、又はＣ２～２０アルケニレンであり、
    ｍ及びｎが、各々独立して、１、２、３、４、及び５から選択される整数である、請求項５又は６に記載の薬学的組成物。
  8. 前記カチオン性脂質が、式（ＩＩ）：
    又はその薬学的に許容される塩によって表され、式中、
    ａが、１～２０の範囲の整数であり、
    ｂが、２～１０の範囲の整数であり、
    Ｒ１が、不在であるか、又は（Ｃ２－Ｃ２０）アルケニル、－Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ２－Ｃ２０）アルキル、及び（Ｃ２－Ｃ２０）アルキルで置換されたシクロプロピルから選択され、
    Ｒ２が、（Ｃ２－Ｃ２０）アルキルである、請求項５又は６に記載の薬学的組成物。
  9. 前記脂質が、式（Ｖ）：
    又はその薬学的に許容される塩によって表され、式中、
    Ｒ１及びＲ１’が、各々独立して、Ｒａから選択される１つ以上の基で任意に置換された（Ｃ１－Ｃ６）アルキレンであり、
    Ｒ２及びＲ２’が、各々独立して、（Ｃ１－Ｃ２）アルキレンであり、
    Ｒ３及びＲ３’が、各々独立して、Ｒｂから選択される１つ以上の基で任意に置換された（Ｃ１－Ｃ６）アルキルであるか、
    あるいは、Ｒ２及びＲ３並びに／又はＲ２’及びＲ３’が、それらの介在するＮ原子と一緒になって、４員～７員のヘテロシクリルを形成し、
    Ｒ４及びＲ４’が、各々、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－によって中断された（Ｃ２－Ｃ６）アルキレンであり、
    Ｒ５及びＲ５’が、各々独立して、（Ｃ２－Ｃ３０）アルキル又は（Ｃ２－Ｃ３０）アルケニルであり、これらの各々が、任意に－Ｃ（Ｏ）Ｏ－又は（Ｃ３－Ｃ６）シクロアルキルで中断され、
    Ｒａ及びＲｂが、各々ハロ又はシアノである、請求項５又は６に記載の薬学的組成物。
  10. 前記カチオン性脂質が、式（ＸＶ）：
    又はその薬学的に許容される塩によって表され、式中、
    Ｒ’は、不在、水素、又はＣ１－Ｃ６アルキルであるが、ただし、Ｒ’が水素又はＣ１－Ｃ６アルキルである場合、Ｒ’、Ｒ１、及びＲ２が全て結合している窒素原子は、プロトン化されており、
    Ｒ１及びＲ２が、各々独立して、水素、Ｃ１－Ｃ６アルキル、又はＣ２－Ｃ６アルケニルであり、
    Ｒ３が、Ｃ１－Ｃ１２アルキレン又はＣ２－Ｃ１２アルケニレンであり、
    Ｒ４が、Ｃ１－Ｃ１６非分岐鎖アルキル、Ｃ２－Ｃ１６非分岐鎖アルケニルであるか、又は
    Figure 2023534043000121
     であり、式中、
    Ｒ４ａ及びＲ４ｂが、各々独立して、Ｃ１－Ｃ１６非分岐鎖アルキル又はＣ２－Ｃ１６非分岐鎖アルケニルであり、
    Ｒ５が、不在、Ｃ１－Ｃ８アルキレン、又はＣ２－Ｃ８アルケニレンであり、
    Ｒ６ａ及びＲ６ｂが、各々独立して、Ｃ７－Ｃ１６アルキル又はＣ７－Ｃ１６アルケニルであるが、ただし、Ｒ６ａ及びＲ６ｂ中の合わせた総炭素数が、１５より大きく、
    Ｘ１及びＸ２が、各々独立して、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ－、－Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）－、－Ｃ（Ｒａ）＝ＮＯ－、－Ｏ－Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＳｉ（Ｒａ）２Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）（ＣＲａ ２）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、又はＯＣ（＝Ｏ）（ＣＲａ ２）Ｃ（＝Ｏ）－であり、式中、
    Ｒａが、各出現に対して、独立して水素又はＣ１－Ｃ６アルキルであり、
    ｎが、１、２、３、４、５、及び６から選択される整数である、請求項５に記載の薬学的組成物。
  11. 前記カチオン性脂質が、式（ＸＸ）：
    又はその薬学的に許容される塩によって表され、式中、
    Ｒ’は、不在、水素、又はＣ１－Ｃ３アルキルであるが、ただし、Ｒ’が水素又はＣ１－Ｃ３アルキルである場合、Ｒ’、Ｒ１、及びＲ２が全て結合している前記窒素原子は、プロトン化されており、
    Ｒ１及びＲ２が、各々独立して、水素又はＣ１－Ｃ３アルキルであり、
    Ｒ３が、Ｃ３－Ｃ１０アルキレン又はＣ３－Ｃ１０アルケニレンであり、
    Ｒ４が、Ｃ１－Ｃ１６非分岐鎖アルキル、Ｃ２－Ｃ１６非分岐鎖アルケニルであるか、又は
    であり、式中、
    Ｒ４ａ及びＲ４ｂが、各々独立して、Ｃ１－Ｃ１６非分岐鎖アルキル又はＣ２－Ｃ１６非分岐鎖アルケニルであり、
    Ｒ５が、不在、Ｃ１－Ｃ６アルキレン、又はＣ２－Ｃ６アルケニレンであり、
    Ｒ６ａ及びＲ６ｂが、各々独立して、Ｃ７－Ｃ１４アルキル又はＣ７－Ｃ１４アルケニルであり、
    Ｘが、－ＯＣ（＝Ｏ）－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＯＣ（＝Ｓ）－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ－、－Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）－、－Ｃ（Ｒａ）＝ＮＯ－、－Ｏ－Ｎ＝Ｃ（Ｒａ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ－、－ＯＳｉ（Ｒａ）２Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）（ＣＲａ ２）Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－、又はＯＣ（＝Ｏ）（ＣＲａ ２）Ｃ（＝Ｏ）－であり、式中、
    Ｒａが、各出現に対して、独立して水素又はＣ１－Ｃ６アルキルであり、
    ｎが、１、２、３、４、５、及び６から選択される整数である、請求項５に記載の薬学的組成物。
  12. 前記カチオン性脂質が、表２、表５、表６、表７、又は表８の任意の脂質から選択される、請求項５又は６に記載の薬学的組成物。
  13. 前記カチオン性脂質が、以下の構造：
    又はその薬学的に許容される塩を有する脂質である、請求項５又は６に記載の薬学的組成物。
  14. 前記カチオン性脂質が、以下の構造：
    を有するＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ又はＭＣ３）である、請求項５又は６に記載の薬学的組成物。
  15. 前記ＬＮＰが、ステロールを更に含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  16. 前記ステロールが、コレステロールである、請求項１４に記載の薬学的組成物。
  17. 前記ステロールが、ｂ－シトステロールである、請求項１４に記載の薬学的組成物。
  18. 前記ＬＮＰが、ＰＥＧ化脂質を更に含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  19. 前記ＰＥＧ化脂質が、ｌ－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、又はその両方から選択される、請求項１８に記載の薬学的組成物。
  20. 前記ＬＮＰが、非カチオン性脂質を更に含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  21. 前記非カチオン性脂質が、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－モノメチルＰＥなど）、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－ジメチルＰＥなど）、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１，２－ジラウロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２－ジフィタノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＰＨｙＰＥ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リソレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジカシド、セレブロシド、ジセチルホスフェート、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、又はそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２０に記載の薬学的組成物。
  22. 前記非カチオン性脂質が、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、及びジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる群から選択される、請求項２１に記載の薬学的組成物。
  23. 前記ＬＮＰが、組織特異的標的化リガンドを更に含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  24. 前記組織特異的標的化リガンドが、一本側鎖ＧａｌＮＡｃ、三本側鎖ＧａｌＮＡｃ、及び四本側鎖ＧａｌＮＡｃから選択される、請求項２３に記載の薬学的組成物。
  25. 前記組織特異的標的化リガンドが、前記ＰＥＧ化脂質にコンジュゲートされている、請求項２３又は２４に記載の薬学的組成物。
  26. 前記ＰＥＧ化脂質が、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［アミノ（ポリエチレングリコール）（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）である、請求項２５に記載の薬学的組成物。
  27. 前記組織特異的標的化リガンドにコンジュゲートされた前記ＰＥＧ化脂質が、約０．５％のモルパーセンテージで存在する、請求項２５又は２６に記載の薬学的組成物。
  28. 前記ＰＥＧ化脂質が、約１．５％～約３％のモルパーセンテージで存在する、請求項１８～２７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  29. 前記ステロールが、約２０％～約４０％のモルパーセンテージで存在し、前記カチオン性脂質が、約８０％～約６０％のモルパーセンテージで存在する、請求項１５～２８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  30. 前記ステロールが、約４０％のモルパーセンテージで存在し、前記カチオン性脂質が、約５０％のモルパーセンテージで存在する、請求項２９に記載の薬学的組成物。
  31. 前記組成物が、コレステロール、ＰＥＧ化脂質、及び非カチオン性脂質を更に含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  32. 前記ＰＥＧ化脂質が、約１．５％～約３％のモルパーセンテージで存在する、請求項２５に記載の薬学的組成物。
  33. 前記コレステロールが、約３０％～約５０％のモルパーセンテージで存在する、請求項３１又は３２に記載の薬学的組成物。
  34. 前記脂質が、約４２．５％～約６２．５％のモルパーセンテージで存在する、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  35. 前記非カチオン性脂質が、約２．５％～約１２．５％のモルパーセンテージで存在する、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  36. 前記コレステロールが、約４０％のモルパーセンテージで存在し、前記脂質が、約５２．５％のモルパーセンテージで存在し、前記非カチオン性脂質が、約７．５％のモルパーセンテージで存在し、前記ＰＥＧが、約３％で存在する、請求項３１～３５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  37. 前記ＬＮＰが、組織特異的標的化リガンドを更に含む、請求項３１～３６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  38. 前記組織特異的標的化リガンドが、一本側鎖ＧａｌＮＡｃ、三本側鎖ＧａｌＮＡｃ、及び四本側鎖ＧａｌＮＡｃから選択される、請求項３７に記載の薬学的組成物。
  39. 前記組織特異的標的化リガンドが、前記ＰＥＧ化脂質にコンジュゲートされている、請求項３７又は３８に記載の薬学的組成物。
  40. 前記組織特異的標的化リガンドにコンジュゲートされた前記ＰＥＧ化脂質が、約０．５％のモルパーセンテージで存在する、請求項３９に記載の薬学的組成物。
  41. 前記組成物が、パルミチン酸デキサメタゾンを更に含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  42. 前記ＬＮＰが、約７５ｎｍ未満の平均直径を有する、請求項１～４１のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  43. 前記ＬＮＰが、約７０ｎｍ未満の平均直径を有する、請求項１～４２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  44. 前記組成物が、約１５：１の全脂質対剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）比を有する、請求項１～４３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  45. 前記組成物が、約３０：１の全脂質対剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）比を有する、請求項１～４３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  46. 前記組成物が、約４０：１の全脂質対剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）比を有する、請求項１～４３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  47. 前記組成物が、約５０：１の全脂質対剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）比を有する、請求項１～４６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  48. 前記ｒＴＮＡが、ミニ遺伝子、プラスミド、ミニサークル、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、リボザイム、ｃｅＤＮＡ、ミニストリング、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）、プロテロメア閉端ＤＮＡ、又はダンベル直鎖状ＤＮＡ、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＤＮＡウイルスベクター、ウイルスＲＮＡベクター、非ウイルスベクター、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１～４７のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  49. 前記剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）が、プロモーター配列及び導入遺伝子を含む発現カセットを含む、請求項１～４８のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  50. 前記剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）が、ポリアデニル化配列を含む発現カセットを含む、請求項１～４９のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  51. 前記剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）が、前記発現カセットの５’末端又は３’末端のいずれかに隣接する少なくとも１つの逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む、請求項４９又は５０に記載の薬学的組成物。
  52. 前記発現カセットが、２つのＩＴＲに隣接し、前記２つのＩＴＲが、１つの５’ＩＴＲ及び１つの３’ＩＴＲを含む、請求項５１に記載の薬学的組成物。
  53. 前記発現カセットが、前記３’末端でＩＴＲ（３’ＩＴＲ）に連結される、請求項５２に記載の薬学的組成物。
  54. 前記発現カセットが、前記５’末端でＩＴＲ（５’ＩＴＲ）に連結される、請求項５２に記載の薬学的組成物。
  55. 前記５’ＩＴＲ又は前記３’ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＡＡＶ ＩＴＲである、請求項５２に記載の薬学的組成物。
  56. 前記５’ＩＴＲ及び前記３’ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、修飾型ＩＴＲである、請求項５２に記載の薬学的組成物。
  57. 前記剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）が、前記５’ＩＴＲと前記発現カセットとの間にスペーサー配列を更に含む、請求項５２に記載の薬学的組成物。
  58. 前記剛性治療用核酸（ＲＴＮＡ）が、前記３’ＩＴＲと前記発現カセットとの間にスペーサー配列を更に含む、請求項５２に記載の薬学的組成物。
  59. 前記スペーサー配列が、少なくとも５塩基対の長さである、請求項５７又は５８に記載の薬学的組成物。
  60. 前記スペーサー配列が、約５～約１００塩基対の長さである、請求項５９に記載の薬学的組成物。
  61. 前記スペーサー配列が、約５～約５００塩基対の長さである、請求項５９に記載の薬学的組成物。
  62. 前記剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）が、ニック又はギャップを含む、請求項１～６１のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  63. 前記ＩＴＲが、ＡＡＶ血清型に由来するＩＴＲ、ガチョウウイルスのＩＴＲに由来するＩＴＲ、Ｂ１９ウイルスＩＴＲに由来するＩＴＲ、又はパルボウイルスに由来する野生型ＩＴＲから選択される、請求項５２に記載の薬学的組成物。
  64. 前記ＡＡＶ血清型が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１及びＡＡＶ１２からなる群から選択される、請求項６３に記載の薬学的組成物。
  65. 前記ｒＴＮＡが、第１及び第２のＩＴＲを含み、前記第１のＩＴＲが、変異体ＩＴＲであり、前記第２のＩＴＲが、前記第１のＩＴＲとは異なる、請求項５１に記載の薬学的組成物。
  66. 前記ｒＴＮＡが、前記発現カセットの５’及び３’末端の両方に２つの変異体ＩＴＲを含み、任意に、前記２つの変異体ＩＴＲが、互いに対して対称変異体である、請求項５１に記載の薬学的組成物。
  67. 前記ｒＴＮＡが、ｃｅＤＮＡである、請求項１に記載の薬学的組成物。
  68. 前記ｃｅＤＮＡが、ＣＥＬｉＤ、ＤＮＡベースのミニサークル、ＭＩＤＧＥ、ミニスタリングＤＮＡ、発現カセットの前記５’及び３’末端にＩＴＲの２つのヘアピン構造を含むダンベル型の直鎖状二重鎖閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）、又はｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡからなる群から選択される、請求項６７に記載の薬学的組成物。
  69. 前記剛性治療用核酸が、プラスミドである、請求項１に記載の薬学的組成物。
  70. 脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む薬学的組成物であって、前記ＬＮＰが、脂質及び変性治療用核酸（ＴＮＡ）を含み、前記ＬＮＰの平均直径が、約２０ｎｍ～約７５ｎｍである、薬学的組成物。
  71. 前記変性ＴＮＡが、Ｐ型構造を有する、請求項７０に記載の薬学的組成物。
  72. 前記変性ＴＮＡが、低分子量アルコール／水溶液又は１つ以上の低分子量アルコールを含む非水性溶媒系中で前記変性ＴＮＡを接触させることによって調製される、請求項７０又は７１に記載の薬学的組成物。
  73. 前記低分子量アルコール／水溶液又は前記非水性溶媒系が、エタノール、メタノール、及びイソプロパノールからなる群から選択される１つ以上のアルコールを含む、請求項７２に記載の薬学的組成物。
  74. 前記ＬＮＰが、約７５ｎｍ未満の平均直径を有する、請求項７０～７３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  75. 前記ＬＮＰが、約７０ｎｍ未満の平均直径を有する、請求項７０～７４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  76. 前記変性核酸治療薬が、二本鎖核酸である、請求項７０～７５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  77. 前記変性核酸治療薬が、閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）である、請求項７０～７６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  78. 脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む薬学的組成物であって、前記ＬＮＰが、脂質及び変性治療用核酸（ＴＮＡ）を含み、前記ＬＮＰが、
    カチオン性脂質又はイオン化脂質を含む１つ以上の低分子量アルコール溶液に水性ＴＮＡを添加して、ＴＮＡ／脂質溶液を形成することであって、前記溶液中の前記低分子量アルコールの最終濃度が、約８０％～約９８％である、形成することと、
    前記ＴＮＡ／脂質溶液を酸性水性緩衝液と混合することと、
    中性ｐＨ水性緩衝液と緩衝液とを交換し、
    それによって、ＬＮＰ製剤を生成することと、を含む方法によって調製される、薬学的組成物。
  79. 前記溶液中の前記低分子量アルコールの最終濃度が、約８７％～約９７％である、請求項７８に記載の薬学的組成物。
  80. 前記溶液中の前記低分子量アルコールの最終濃度が、約９０％～約９５％である、請求項７９に記載の薬学的組成物。
  81. 前記溶液中の前記低分子量アルコールの最終濃度が、約９２％～約９５％である、請求項７９に記載の薬学的組成物。
  82. 前記ＬＮＰの平均直径が、約２０ｎｍ～約７５ｎｍである、請求項７９に記載の薬学的組成物。
  83. 前記ＬＮＰが、約７５ｎｍ未満の平均直径を有する、請求項７８～８２のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  84. 前記ＬＮＰが、約７０ｎｍ未満の平均直径を有する、請求項７８～８３のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  85. 前記剛性又は変性核酸治療薬が、二本鎖核酸である、請求項７８～８４のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  86. 前記剛性又は変性核酸治療薬が、閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）である、請求項７８～８５のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  87. 薬学的に許容される賦形剤を更に含む、請求項１～８６のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  88. 脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を生成する方法であって、前記ＬＮＰが、イオン化脂質及び閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）を含み、前記方法が、
    カチオン性脂質又はイオン化脂質を含む１つ以上の低分子量アルコール溶液に水性ｃｅＤＮＡを添加して、ｃｅＤＮＡ／脂質溶液を形成することであって、前記溶液中のアルコールの最終濃度が、約８０％～約９８％である、形成することと、
    前記ｃｅＤＮＡ／脂質溶液を酸性水性緩衝液と混合することと、
    中性ｐＨ水性緩衝液と緩衝液とを交換し、
    それによって、ＬＮＰ製剤を生成することと、を含む、方法。
  89. イオン化脂質及び閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤を生成する方法であって、前記方法が、
    １つ以上の低分子量アルコール溶液にｃｅＤＮＡを添加することであって、得られた溶液のアルコール含有量が、８０％を超える、添加することと、
    ＞８０％のアルコール含有量の前記ｃｅＤＮＡを、低分子量アルコール中のカチオン性又はイオン化脂質に添加して、ｃｅＤＮＡ／脂質溶液を形成することであって、前記ｃｅＤＮＡ－脂質溶液中の前記低分子量アルコールの最終濃度が、約８０％～約９５％である、形成することと、
    前記ｃｅＤＮＡ／脂質溶液を酸性水性緩衝液と混合することと、
    中性ｐＨ水性緩衝液と緩衝液とを交換し、
    それによって、前記ＬＮＰ製剤を生成することと、を含む、方法。
  90. 前記溶液中の前記低分子量アルコールの最終濃度が、約８７％～約９７％である、請求項８９に記載の薬学的組成物。
  91. 前記溶液中の前記低分子量アルコールの最終濃度が、約９０％～約９５％である、請求項９０に記載の薬学的組成物。
  92. 前記溶液中の前記低分子量アルコールの最終濃度が、約９２％～約９５％である、請求項９０に記載の薬学的組成物。
  93. ｃｅＤＮＡ／脂質混合溶液を酸性水性緩衝液で希釈するステップを更に含む、請求項８９に記載の方法。
  94. 前記１つ以上の低分子量アルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール及び／又はイソプロパノールからなる群から選択される、請求項８９～９３のいずれか一項に記載の方法。
  95. 前記１つ以上の低分子量アルコールが、エタノールである、請求項９４に記載の方法。
  96. 前記１つ以上の低分子量アルコールが、プロパノールである、請求項９４に記載の方法。
  97. 前記１つ以上の低分子量アルコールが、メタノールである、請求項９４に記載の方法。
  98. 前記１つ以上の低分子量アルコールが、エタノール及びメタノールの混合物である、請求項９４に記載の方法。
  99. 前記酸性水性緩衝液が、リンゴ酸／リンゴ酸ナトリウム又は酢酸／酢酸ナトリウムから選択される、請求項８８～９８のいずれか一項に記載の方法。
  100. 前記酸性水性緩衝液が、約１０～４０ミリモル（ｍＭ）の濃度である、請求項８８～９９のいずれか一項に記載の方法。
  101. 前記酸性水性緩衝液が、約３～５のｐＨである、請求項８８～１００のいずれか一項に記載の方法。
  102. 前記中性ｐＨ水性緩衝液が、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４である、請求項８８～１０１のいずれか一項に記載の方法。
  103. 前記ｃｅＤＮＡ／脂質溶液が、マイクロ流体混合を使用して前記酸性水性緩衝液と混合される、請求項８８に記載の方法。
  104. 希釈ステップ後の最終アルコール含有量が、約４％～約１５％である、請求項８８に記載の方法。
  105. 前記酸性水性緩衝液と前記ｃｅＤＮＡ／脂質溶液との間の流速比が、２：１、３：２、３：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１又は２０：１である、請求項８８に記載の方法。
  106. 前記ＬＮＰが、約２０ｎｍ～約７５ｎｍの平均直径を有する、請求項８８～１０５のいずれか一項に記載の方法。
  107. 前記カチオン性脂質が、以下の構造：
    を有するＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ又はＭＣ３）である、請求項８８～１０６のいずれか一項に記載の方法。
  108. 前記イオン化脂質が、ジスルフィド結合及び三級アミンを含むＳＳ切断可能な脂質である、請求項８８～１０７のいずれか一項に記載の方法。
  109. 前記ＳＳ切断可能な脂質が、以下の構造：
    又はその薬学的に許容される塩を有する脂質である、請求項１０８に記載の方法。
  110. 請求項８８～１０９のいずれか一項に記載の方法によって生成される、ＬＮＰ製剤。
  111. 対象における遺伝性障害を治療する方法であって、前記方法が、有効量の請求項１～１１０のいずれか一項に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
  112. 前記対象が、ヒトである、請求項１１１に記載の方法。
  113. 前記遺伝性障害が、鎌状赤血球貧血症、メラノーマ、血友病Ａ（凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）欠損症）及び血友病Ｂ（凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）欠損症）、嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ）、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体欠損症）、肝芽細胞腫、ウィルソン病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、先天性肝性ポルフィリン症、遺伝性肝代謝障害、レッシュナイハン症候群、鎌状赤血球貧血症、サラセミア、色素性乾皮症、ファンコニ貧血、網膜色素変性症、毛細血管拡張性運動失調症、ブルーム症候群、網膜芽細胞腫、ムコ多糖蓄積症（例えば、ハーラー症候群（ＭＰＳ Ｉ型）、シャイエ症候群（ＭＰＳ Ｉ型 Ｓ型）、ハーラーシャイエ症候群（ＭＰＳ Ｉ型 Ｈ－Ｓ型）、ハンター症候群（ＭＰＳ ＩＩ型）、サンフィリッポＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤ型（ＭＰＳ ＩＩＩ Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ型）、モルキオＡ及びＢ型（ＭＰＳ ＩＶＡ及びＭＰＳ ＩＶＢ）、マロトーラミー症候群（ＭＰＳ ＶＩ型）、スライ症候群（ＭＰＳ ＶＩＩ型）、ヒアルロニダーゼ欠損症（ＭＰＳ ＩＸ型））、ニーマンピック病Ａ／Ｂ、Ｃ１及びＣ２型、シンドラー病、ＧＭ２－ガングリオシドーシスＩＩ型（サンドホフ病）、テイサックス病、異染性白質ジストロフィー、クラッベ病、ムコリピドーシスＩ、ＩＩ／ＩＩＩ及びＩＶ型、シアリドーシスＩ及びＩＩ型、グリコーゲン蓄積症Ｉ及びＩＩ型（ポンペ病）、ゴーシェ病Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ型、ファブリー病、シスチン症、バッテン病、アスパルチルグルコサミン尿症、サラ病、ダノン病（ＬＡＭＰ－２欠損症）、リソソーム酸性リパーゼ（ＬＡＬ）欠損症、神経セロイドリポフスチン症（ＣＬＮ１－８、ＩＮＣＬ、及びＬＩＮＣＬ）、スフィンゴリピドーシス、ガラクトシアリドーシス、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症、フリードライヒ運動失調症、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、ジストロフィー表皮水疱症（ＤＥＢ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ１欠損症、乳児期の全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）、レーバー先天性黒内障、シュタルガルト黄斑ジストロフィー（ＡＢＣＡ４）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、アッシャー症候群、アルファ－１アンチトリプシン欠損症、並びにカテプシンＡ欠損症からなる群から選択される、請求項１１１又は１１２に記載の方法。
  114. 前記遺伝性障害が、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）１０である、請求項１１３に記載の方法。
  115. 前記遺伝性障害が、シュタルガルト黄斑ジストロフィーである、請求項１１３に記載の方法。
  116. 前記遺伝性障害が、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠損症）である、請求項１１３に記載の方法。
  117. 前記遺伝性障害が、血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠損症）である、請求項１１３に記載の方法。
  118. 前記遺伝性障害が、ウィルソン病である、請求項１１３に記載の方法。
  119. 前記遺伝性障害が、ゴーシェ病である、請求項１１３に記載の方法。
  120. 前記遺伝性障害が、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）である、請求項１１３に記載の方法。
  121. 前記遺伝性障害が、ヒアルロニダーゼ欠損症である、請求項１１３に記載の方法。
  122. 免疫抑制剤を投与することを更に含む、請求項１１１～１２１のいずれか一項に記載の方法。
  123. 前記免疫抑制剤が、デキサメタゾンである、請求項１２２に記載の方法。
  124. 前記対象が、主要なカチオン性脂質としてＭＣ３を含むＬＮＰで観察された免疫応答レベルと比較して、前記薬学的組成物に対して低下した免疫応答レベルを示し、前記薬学的組成物に対する前記免疫応答レベルが、ＭＣ３を含む前記ＬＮＰで観察された前記レベルよりも少なくとも５０％低い、請求項１１１～１２３のいずれか一項に記載の方法。
  125. 前記免疫応答が、炎症誘発性サイトカイン又はケモカインの前記レベルを検出することによって測定される、請求項１２４に記載の方法。
  126. 前記炎症誘発性サイトカイン又はケモカインが、ＩＬ－６、ＩＦＮα、ＩＦＮγ、ＩＬ－１８、ＴＮＦα、ＩＰ－１０、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、及びＲＡＮＴＥＳからなる群から選択される、請求項１２５に記載の方法。
  127. 前記炎症誘発性サイトカインのうちの少なくとも１つが、前記薬学的組成物の前記投与の６時間後に前記対象の血清中で検出可能なレベル未満である、請求項１２５に記載の方法。
  128. ＳＳ切断可能な脂質及び前記閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）を含む前記ＬＮＰが、貪食されないか、又は同様の条件で投与された主要なカチオン性脂質としてＭＣ３を含むＬＮＰの食作用レベルと比較して、少なくとも５０％低下した食作用レベルを示す、請求項１１１～１２７のいずれか一項に記載の方法。
  129. 前記ＳＳ切断可能な脂質が、以下の構造：
    又はその薬学的に許容される塩を有する脂質である、請求項１２８に記載の方法。
  130. 前記ＬＮＰが、コレステロール及びＰＥＧ化脂質を更に含む、請求項１２９に記載の方法。
  131. 前記ＬＮＰが、非カチオン性脂質を更に含む、請求項１３０に記載の方法。
  132. 前記非カチオン性脂質が、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、及びジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる群から選択される、請求項１３１に記載の方法。
  133. 前記ＬＮＰが、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を更に含む、請求項１３０～１３２のいずれか一項に記載の方法。
  134. 前記ＧａｌＮＡｃが、前記ＰＥＧ化脂質にコンジュゲートされ、前記ＧａｌＮＡｃにコンジュゲートされた前記ＰＥＧ化脂質が、０．５％のモルパーセンテージで前記ＬＮＰ中に存在する、請求項１３３に記載の方法。
  135. 治療を必要とする対象の肝臓への治療用核酸の標的化を増加させる方法であって、前記方法が、有効量の請求項１～１１０のいずれか一項に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含み、前記ＬＮＰが、剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）、ｓｓ切断可能な脂質、ステロール、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む、方法。
  136. 前記ＰＥＧが、ｌ－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）である、請求項１３５に記載の方法。
  137. 前記ＬＮＰが、非カチオン性脂質を更に含む、請求項１３５に記載の方法。
  138. 前記非カチオン性脂質が、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、及びジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる群から選択される、請求項１３７に記載の方法。
  139. 前記ＧａｌＮＡｃが、前記ＰＥＧ化脂質にコンジュゲートされ、前記ＧａｌＮＡｃにコンジュゲートされた前記ＰＥＧ化脂質が、０．５％のモルパーセンテージで前記ＬＮＰ中に存在する、請求項１３５に記載の方法。
  140. 前記対象が、遺伝性障害に罹患している、請求項１３５に記載の方法。
  141. 前記遺伝性障害が、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子欠損症）である、請求項１４０に記載の方法。
  142. 前記遺伝性障害が、血友病Ｂ（第ＩＸ因子欠損症）である、請求項１４０に記載の方法。
  143. 前記遺伝性障害が、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）である、請求項１４０に記載の方法。
  144. 前記剛性治療用核酸が、ミニ遺伝子、プラスミド、ミニサークル、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、リボザイム、ｃｅＤＮＡ、ミニストリング、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）、プロテロメア閉端ＤＮＡ、又はダンベル直鎖状ＤＮＡ、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＤＮＡウイルスベクター、ウイルスＲＮＡベクター、非ウイルスベクター、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１３５に記載の方法。
  145. 前記剛性治療用核酸が、ｃｅＤＮＡである、請求項１３５に記載の方法。
  146. 前記ｃｅＤＮＡが、プロモーター配列及び導入遺伝子を含む発現カセットを含む、請求項１４５に記載の方法。
  147. 前記ｃｅＤＮＡが、前記発現カセットの５’又は３’末端のいずれかに隣接する少なくとも１つの逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む、請求項１４６に記載の方法。
  148. 前記ｃｅＤＮＡが、ＣＥＬｉＤ、ＭＩＤＧＥ、ミニスタリングＤＮＡ、発現カセットの前記５’及び３’末端にＩＴＲの２つのヘアピン構造を含むダンベル型の直鎖状二重鎖閉端ＤＮＡ、又はｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡからなる群から選択され、前記ｃｅＤＮＡが、カプシド不含及び直鎖状二重鎖ＤＮＡである、請求項１３５に記載の方法。
  149. 剛性治療用核酸（ｒＴＮＡ）による治療を必要とする対象における補体応答を軽減する方法であって、前記方法が、有効量の先行請求項のいずれか一項に記載の薬学的組成物を前記対象に投与することを含み、前記ＬＮＰが、前記ｒＴＮＡ、カチオン性脂質、ステロール、及びＰＥＧ化脂質を含む、方法。
  150. 前記対象が、遺伝性障害に罹患している、請求項１４９に記載の方法。
  151. 前記遺伝性障害が、鎌状赤血球貧血症、メラノーマ、血友病Ａ（凝固因子ＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩ）欠損症）及び血友病Ｂ（凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）欠損症）、嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ）、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体欠損症）、肝芽細胞腫、ウィルソン病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、先天性肝性ポルフィリン症、遺伝性肝代謝障害、レッシュナイハン症候群、鎌状赤血球貧血症、サラセミア、色素性乾皮症、ファンコニ貧血、網膜色素変性症、毛細血管拡張性運動失調症、ブルーム症候群、網膜芽細胞腫、ムコ多糖蓄積症（例えば、ハーラー症候群（ＭＰＳ Ｉ型）、シャイエ症候群（ＭＰＳ Ｉ型 Ｓ型）、ハーラーシャイエ症候群（ＭＰＳ Ｉ型 Ｈ－Ｓ型）、ハンター症候群（ＭＰＳ ＩＩ型）、サンフィリッポＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤ型（ＭＰＳ ＩＩＩ Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ型）、モルキオＡ及びＢ型（ＭＰＳ ＩＶＡ及びＭＰＳ ＩＶＢ）、マロトーラミー症候群（ＭＰＳ ＶＩ型）、スライ症候群（ＭＰＳ ＶＩＩ型）、ヒアルロニダーゼ欠損症（ＭＰＳ ＩＸ型））、ニーマンピック病Ａ／Ｂ、Ｃ１及びＣ２型、シンドラー病、ＧＭ２－ガングリオシドーシスＩＩ型（サンドホフ病）、テイサックス病、異染性白質ジストロフィー、クラッベ病、ムコリピドーシスＩ、ＩＩ／ＩＩＩ及びＩＶ型、シアリドーシスＩ及びＩＩ型、グリコーゲン蓄積症Ｉ及びＩＩ型（ポンペ病）、ゴーシェ病Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ型、ファブリー病、シスチン症、バッテン病、アスパルチルグルコサミン尿症、サラ病、ダノン病（ＬＡＭＰ－２欠損症）、リソソーム酸性リパーゼ（ＬＡＬ）欠損症、神経セロイドリポフスチン症（ＣＬＮ１－８、ＩＮＣＬ、及びＬＩＮＣＬ）、スフィンゴリピドーシス、ガラクトシアリドーシス、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、脊髄小脳失調症、脊髄性筋萎縮症、フリードライヒ運動失調症、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、ジストロフィー表皮水疱症（ＤＥＢ）、エクトヌクレオチドピロホスファターゼ１欠損症、乳児期の全身性動脈石灰化（ＧＡＣＩ）、レーバー先天性黒内障、シュタルガルト黄斑ジストロフィー（ＡＢＣＡ４）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、アッシャー症候群、アルファ－１アンチトリプシン欠損症、並びにカテプシンＡ欠損症からなる群から選択される、請求項１５０に記載の方法。
  152. 前記剛性治療用核酸が、ミニ遺伝子、プラスミド、ミニサークル、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、リボザイム、ｃｅＤＮＡ、ミニストリング、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）、プロテロメア閉端ＤＮＡ、又はダンベル直鎖状ＤＮＡ、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ＤＮＡウイルスベクター、ウイルスＲＮＡベクター、非ウイルスベクター、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１４９～１５１のいずれか一項に記載の方法。
  153. 前記剛性治療用核酸が、ｃｅＤＮＡであり、前記ｃｅＤＮＡが、ＣＥＬｉＤ、ＭＩＤＧＥ、ミニスタリングＤＮＡ、発現カセットの前記５’及び３’末端にＩＴＲの２つのヘアピン構造を含むダンベル型の直鎖状二重鎖閉端ＤＮＡ、又はｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡからなる群から選択され、前記ｃｅＤＮＡが、カプシド不含及び直鎖状二重鎖ＤＮＡである、請求項１５２に記載の方法。
  154. 前記ＰＥＧ化脂質が、１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）である、請求項１４９～１５３のいずれか一項に記載の方法。
  155. 前記ＰＥＧが、約２～４％のモルパーセンテージで前記ＬＮＰ中に存在する、請求項１５４に記載の方法。
  156. 前記ＰＥＧが、約３％のモルパーセンテージで前記ＬＮＰ中に存在する、請求項１５５に記載の方法。
  157. 前記ＬＮＰが、非カチオン性脂質を更に含む、請求項１４９～１５６のいずれか一項に記載の方法。
  158. 前記非カチオン性脂質が、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、及びジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）からなる群から選択される、請求項１５７に記載の方法。
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