KR20230052895A - 폴리뉴클레오타이드를 감소된 크기의 지질 나노입자로 캡슐화하는 방법 및 신규한 지질 나노입자 제형 - Google Patents

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놀란 갤러허
매튜 지. 스탠튼
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Abstract

지질과 캡시드 미함유 비바이러스성 벡터(예를 들어, ceDNA)를 포함하는 감소된 크기의 지질 제형, 및 상기 지질 제형을 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 본 개시내용의 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 캡시드 미함유 비바이러스성 DNA 벡터를 관심 표적 부위(예를 들어, 세포, 조직, 기관 등)에 전달하는 데 사용될 수 있는 지질 제형을 포함한다.

Description

폴리뉴클레오타이드를 감소된 크기의 지질 나노입자로 캡슐화하는 방법 및 신규한 지질 나노입자 제형
관련 출원
본 출원은 2020년 7월 17일자 출원된 미국 임시 출원 제63/053,274호와 2021년 5월 28일자 출원된 미국 임시 출원 제63/194,620호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 각 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
지질 나노입자(LNP)는 소형 간섭 RNA(siRNA) 카고(cargo)를 간의 간세포로 전달하는 임상적으로 검증된 전략이다. 이러한 발전에도 불구하고, 더 크고 강성인(rigid) 폴리뉴클레오타이드 카고(예를 들어, 이중가닥 선형 DNA, 플라스미드 DNA, 폐쇄형 이중가닥 DNA(ceDNA))의 LNP 매개 전달은 더 작고/작거나 가요성인(flexible) 카고(예를 들어, siRNA)에 비해 추가적인 문제를 나타낸다. 이러한 문제 중 하나는 크고 강성인 카고가 캡슐화될 때 생성되는 LNP의 크기와 관련이 있다. 예를 들어, 하나의 스트림으로부터의 수성 ceDNA(H2O 또는 수성 완충액 중)를 산성 완충액(pH 3 내지 4) 중에서 또 다른 스트림으로부터의 에탄올성 지질(100% EtOH)과 고압 미세유체 혼합하는 것(예를 들어, 국제 출원 PCT/US2020/021328 참조)을 포함하는 '최신' 공정을 사용하여, 길이가 > 3000 bp(염기쌍)인 폐쇄형 선형 DNA(ceDNA)를 직경 80 nm 내지 120 nm로(여기서, 직경 평균은 92 nm(n = 28)임) 캡슐화하는 LNP가 통상적으로 관찰되었다.
이러한 LNP의 비교적 큰 크기는 다음과 같은 몇 가지 메커니즘에 의해 간 적응증에 대한 치료 지수를 감소시킨다: (1) 더 큰 LNP는 간 시누소이드(sinusoid)를 정렬하는 내피 세포의 창을 효율적으로 우회할 수 없어, 표적 세포(간세포)에 대한 접근을 방해할 수 있음; (2) 더 큰 LNP는 몇 가지 상이한 수용체(예를 들어, 아시알로당단백질 수용체(ASGPR), 저밀도 지질단백질(LDL) 수용체)와 함께 클라트린 매개 세포내이입을 통해 간세포에 의해 효율적으로 내재화될 수 없음; 및 (3) 특정 크기 임계값을 초과하는 LNP는 용량 제한 면역 반응을 유발할 수 있는 망상내피계 세포에 의해 우선적으로 흡수되는 경향이 있음. 따라서, 크고 강성인 치료용 핵산 분자를 비교적 작은 크기의 LNP(직경 < 75 nm)로 캡슐화할 수 있는 제작 공정이 절실하게 요구된다.
이전에 기재된 것 보다 직경이 유의하게 더 작은 LNP를 제조하는 데 사용되는 신규한 제형화 공정 및 방법이 본원에 제공된다. 본원에 기재된 신규한 제형화 공정은 알코올성(예를 들어, 에탄올성) 지질과의 미세유체 나노입자 조립 전 80% 내지 100%의 저분자량 알코올(예를 들어, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 또는 메탄올) 중에서의 TNA의 가역적 콤팩트화(compaction)를 포함하며, 이는 평균 직경이 75 nm(± 3 nm) 이하인 LNP를 생성한다.
일부 구현예에 따르면, 본 개시내용에 기재된 LNP의 평균 직경은 약 20 nm 내지 약 75 nm, 약 20 nm 내지 약 70 nm, 약 20 nm 내지 약 60 nm, 약 30 nm 내지 약 75 nm, 약 30 nm 내지 약 70 nm, 약 30 nm 내지 약 60 nm, 약 40 nm 내지 75 nm, 또는 약 40 nm 내지 70 nm 범위이다. 더 작은 크기의 LNP는 더 효율적인 조직 확산, 및 더 효율적인 흡수 및/또는 표적화를 제공한다. 특히 간에서, 간 시누소이드 내피 세포(LSEC) 창을 통과하고(< 100 nm) ASGPR 매개 세포내이입을 거치기 위해서는(< 70 nm) 더 작은 크기의 LNP가 필요하다. 이러한 더 작은 크기는 면역 세포를 용이하게 피할 수 있기 때문에, 원치 않는 면역 반응을 표적화하고 회피하는 데에도 유리하다. 본 개시내용에 기재된 제형화 공정 및 방법은 이전에 보고된 것보다 상당히 더 많은 치료용 핵산(예를 들어, ceDNA를 포함하는 강성 이중가닥 DNA)을 캡슐화할 수 있다. 본원에 기재된 LNP는 ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 60% 초과 내지 약 90%를 캡슐화할 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 본원에 기재된 LNP는 ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 60% 초과, ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 65% 초과, ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 70% 초과, ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 75% 초과, ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 80% 초과, ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 85% 초과, 또는 ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 90% 초과를 캡슐화할 수 있다.
본원에 기재된 제형화 공정은, ceDNA 콤팩트화가 저분자량(LMW) 알코올을 80% 내지 100% 포함하는 용매에서 일어난다는 발견을 이용한다. 콤팩트화에 사용될 수 있는 LMW 알코올에는, 비제한적으로, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 또는 아세톤과 같은 다른 유기 용매가 포함된다. 바람직하게는, ceDNA와 같은 강성 DNA의 콤팩트화는 최종 농도 약 80% 내지 약 98%의 에탄올성 용액 또는 에탄올-메탄올 혼합물(예를 들어, EtOH-MeOH 1:1 혼합물)을 사용하여 이루어질 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 용액 중 저분자량 알코올의 최종 농도는 약 80% 내지 약 98%, 약 80% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 92%, 약 80% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 85%, 약 85% 내지 약 98%, 약 85% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 92%, 약 85% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 98%, 약 87% 내지 약 97%, 약 87% 내지 약 95%, 약 87% 내지 약 92%, 약 87% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 92%, 약 95% 내지 약 98%, 또는 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97% 또는 약 98%이다. 예를 들어, 90% EtOH 수용액 중 ceDNA가, 생성되는 용액이, 예를 들어 에탄올 90% 내지 92%와 물 또는 수성 완충액 8% 내지 10%가 되도록 하는 비로, 지질의 또 다른 에탄올성 용액(예를 들어, 90% EtOH)에 첨가되거나 이와 혼합되는 경우, ceDNA는 동적 광산란에 의해 고도로 콤팩트화되거나 변성된 상태로 존재하는 것으로 관찰된다. 이러한 용매(예를 들어, 에탄올 90% 내지 92%, 물 8% 내지 10%)에서, 지질과 ceDNA는 이러한 구성요소 중 어느 하나의 검출 가능한 침전 없이 모두 가용화되어, ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 더 작은 크기의 LNP로의 성공적이고 더 효율적인 캡슐화로 이어진다.
따라서, 본원에 기재된 제형화 공정은 표준 공정에 비해 ceDNA와 같은 강성 TNA에 대해 유사하거나 더 우수한 캡슐화 효율을 유지하면서, LNP 직경을 감소시킨다. 이론에 구애됨 없이, 이러한 변화는 LNP의 형성 전 에탄올 용매와 같은 LMW 알코올 용액, 바람직하게는 90% 내지 92% 또는 최대 95%의 알코올 용액 중에서의 ceDNA와 같은 강성 TNA의 콤팩트화에 기인한 것일 수 있다. 이어서, 산성 수성 완충액과의 혼합에 의해 LNP가 형성되기 시작할 때, 지질은 표준 수성 공정과 달리 더 작고 콤팩트한 DNA(예를 들어, ceDNA) 코어 주변에 핵을 생성하여, 유의하게 더 작은 입자를 생성할 수 있다. 본원에 기재된 공정을 사용하면, ceDNA와 같은 강성 TNA가 더 많은 수로 효율적으로 캡슐화되어, 크기 제약이 있는 다양한 조직을 표적으로 하는 LNP의 유익한 속성인 훨씬 더 작은 직경의 TNA-LNP를 생성할 수 있다.
일부 구현예에서, 제형은 평균 직경이 약 75 nm(± 3 nm)인 LNP에 캡슐화된 TNA(예를 들어, ceDNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 제형은 평균 직경이 약 72 nm(± 3 nm)인 LNP에 캡슐화된 TNA(예를 들어, ceDNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 제형은 평균 직경이 약 70 nm(± 4 nm)인 LNP에 캡슐화된 TNA(예를 들어, ceDNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 제형은 평균 직경이 약 68 nm(± 4 nm)인 LNP에 캡슐화된 TNA(예를 들어, ceDNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 제형은 평균 직경이 약 65 nm(± 4 nm)인 LNP에 캡슐화된 TNA(예를 들어, ceDNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 제형은 평균 직경이 약 60 nm(± 4 nm)인 LNP에 캡슐화된 TNA(예를 들어, ceDNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 제형은 평균 직경이 약 55 nm(± 4 nm)인 LNP에 캡슐화된 TNA(예를 들어, ceDNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, 제형은 평균 직경이 약 50 nm(± 4 nm)인 LNP에 캡슐화된 TNA(예를 들어, ceDNA)를 포함한다.
제1 양태에 따르면, 본 개시내용은 지질 나노입자(LNP)를 포함하는 약학적 조성물로서, 여기서 LNP는 지질과 강성 핵산 치료제(rTNA)를 포함하고, 여기서 LNP의 평균 직경은 약 20 nm 내지 약 75 nm인 약학적 조성물을 제공한다.
일부 구현예에 따르면, 강성 핵산 치료제는 이중가닥 핵산이다. 일부 구현예에 따르면, 강성 핵산 치료제는 폐쇄형 DNA이다.
일부 구현예에 따르면, 지질은 이온화 가능한 지질, 비(非)양이온성 지질, 스테롤 또는 이의 유도체, 접합된 지질, 또는 이들의 임의의 조합에서 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 이온화 가능한 지질은 양이온성 지질이다. 일부 구현예에 따르면, 양이온성 지질은 SS-절단 가능한 지질이다.
본원에 기재된 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, 이온화 가능한 지질은 화학식 (I) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
Figure pct00001
(I)
[식 중,
R1 및 R1'는, 각각 독립적으로, 선택적으로 치환된 선형 또는 분지형 C1-3 알킬렌이고;
R2 및 R2'는, 각각 독립적으로, 선택적으로 치환된 선형 또는 분지형 C1-6 알킬렌이고;
R3 및 R3'는, 각각 독립적으로, 선택적으로 치환된 선형 또는 분지형 C1-6 알킬이거나;
또는 대안적으로, R2가 선택적으로 치환된 분지형 C1-6 알킬렌인 경우, R2와 R3은, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 8원 헤테로시클릴을 형성하거나;
또는 대안적으로, R2'가 선택적으로 치환된 분지형 C1-6 알킬렌인 경우, R2'와 R3'는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 8원 헤테로시클릴을 형성하고;
R4 및 R4'는, 각각 독립적으로, -CRa, -C(Ra)2CRa 또는 -[C(Ra)2]2CRa이고;
Ra는, 각각의 경우 독립적으로, H 또는 C1-3 알킬이거나;
또는 대안적으로, R4가 -C(Ra)2CRa 또는 -[C(Ra)2]2CRa이고 Ra가 C1-3 알킬인 경우, R3과 R4는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 8원 헤테로시클릴을 형성하거나;
또는 대안적으로, R4'가 -C(Ra)2CRa 또는 -[C(Ra)2]2CRa이고 Ra가 C1-3 알킬인 경우, R3'와 R4'는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 8원 헤테로시클릴을 형성하고;
R5 및 R5'는, 각각 독립적으로, C1-20 알킬렌 또는 C2-20 알케닐렌이고;
R6 및 R6'는, 각각의 경우 독립적으로, C1-20 알킬렌, C3-20 시클로알킬렌 또는 C2-20 알케닐렌이고;
m 및 n은, 각각 독립적으로, 1, 2, 3, 4 및 5에서 선택되는 정수임].
본원에 기재된 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, 이온화 가능한 지질은 화학식 (II) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
Figure pct00002
(II)
[식 중,
a는 1 내지 20 범위의 정수이고;
b는 2 내지 10 범위의 정수이고;
R1은 존재하지 않거나, (C2-C20)알케닐, -C(O)O(C2-C20)알킬, 및 (C2-C20)알킬로 치환된 시클로프로필에서 선택되고;
R2는 (C2-C20)알킬임].
본원에 기재된 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, 이온화 가능한 지질은 화학식 (V) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
Figure pct00003
(V)
[식 중,
R1 및 R1'는, 각각 독립적으로, Ra에서 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬렌이고;
R2 및 R2'는, 각각 독립적으로, (C1-C2)알킬렌이고;
R3 및 R3'는, 각각 독립적으로, Rb에서 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬이거나;
또는 대안적으로, R2와 R3 및/또는 R2'와 R3'는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 7원 헤테로시클릴을 형성하고;
R4 및 R4'는 각각 -C(O)O-가 개재된 (C2-C6)알킬렌이고;
R5 및 R5'는, 각각 독립적으로, -C(O)O- 또는 (C3-C6)시클로알킬이 각각 선택적으로 개재된 (C2-C30)알킬 또는 (C2-C30)알케닐이고;
Ra 및 Rb는 각각 할로 또는 시아노임].
일부 구현예에 따르면, 이온화 가능한 지질은 화학식 (XV) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
Figure pct00004
(XV)
[식 중,
R'는 존재하지 않거나, 수소 또는 C1-C6 알킬이며; 단, R'가 수소 또는 C1-C6 알킬인 경우, R', R1 및 R2가 모두 부착된 질소 원자는 양성자화되고;
R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 수소, C1-C6 알킬 또는 C2-C6 알케닐이고;
R3은 C1-C12 알킬렌 또는 C2-C12 알케닐렌이고;
R4는 C1-C16 비분지형 알킬, C2-C16 비분지형 알케닐 또는
Figure pct00005
이며; 여기서
R4a 및 R4b는, 각각 독립적으로, C1-C16 비분지형 알킬 또는 C2-C16 비분지형 알케닐이고;
R5는 존재하지 않거나, C1-C8 알킬렌 또는 C2-C8 알케닐렌이고;
R6a 및 R6b는, 각각 독립적으로, C7-C16 알킬 또는 C7-C16 알케닐이며; 단, 결합된 R6a와 R6b의 총 탄소 원자 수는 15 초과이고;
X1 및 X2는, 각각 독립적으로, -OC(=O)-, -SC(=O)-, -OC(=S)-, -C(=O)O-, -C(=O)S-, -S-S-, -C(Ra)=N-, -N=C(Ra)-, -C(Ra)=NO-, -O-N=C(Ra)-, -C(=O)NRa-, -NRaC(=O)-, -NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)O-, -OSi(Ra)2O-, -C(=O)(CRa 2)C(=O)O- 또는 OC(=O)(CRa 2)C(=O)-이며; 여기서
Ra는, 각각의 경우 독립적으로, 수소 또는 C1-C6 알킬이고;
n은 1, 2, 3, 4, 5 및 6에서 선택되는 정수임].
일부 구현예에 따르면, 이온화 가능한 지질은 화학식 (XX) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
Figure pct00006
(XX)
[식 중,
R'는 존재하지 않거나, 수소 또는 C1-C3 알킬이며; 단, R'가 수소 또는 C1-C3 알킬인 경우, R', R1 및 R2가 모두 부착된 질소 원자는 양성자화되고;
R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 수소 또는 C1-C3 알킬이고;
R3은 C3-C10 알킬렌 또는 C3-C10 알케닐렌이고;
R4는 C1-C16 비분지형 알킬, C2-C16 비분지형 알케닐 또는
Figure pct00007
이며; 여기서
R4a 및 R4b는, 각각 독립적으로, C1-C16 비분지형 알킬 또는 C2-C16 비분지형 알케닐이고;
R5는 존재하지 않거나, C1-C6 알킬렌 또는 C2-C6 알케닐렌이고;
R6a 및 R6b는, 각각 독립적으로, C7-C14 알킬 또는 C7-C14 알케닐이고;
X는 -OC(=O)-, -SC(=O)-, -OC(=S)-, -C(=O)O-, -C(=O)S-, -S-S-, -C(Ra)=N-, -N=C(Ra)-, -C(Ra)=NO-, -O-N=C(Ra)-, -C(=O)NRa-, -NRaC(=O)-, -NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)O-, -OSi(Ra)2O-, -C(=O)(CRa 2)C(=O)O- 또는 OC(=O)(CRa 2)C(=O)-이며; 여기서
Ra는, 각각의 경우 독립적으로, 수소 또는 C1-C6 알킬이고;
n은 1, 2, 3, 4, 5 및 6에서 선택되는 정수임].
일부 구현예에 따르면, 이온화 가능한 지질은 표 2, 표 5, 표 6, 표 7 또는 표 8의 임의의 지질에서 선택된다.
일부 구현예에 따르면, 이온화 가능한 지질은 하기 구조 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 갖는 지질이다:
Figure pct00008
.
일부 구현예에 따르면, 양이온성 지질은 하기 구조를 갖는 MC3, 즉 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-MC3-DMA 또는 MC3)이다:
Figure pct00009
.
본원에 기재된 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, LNP는 스테롤을 추가로 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 스테롤은 콜레스테롤이다.
본원에 기재된 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, LNP는 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에 따르면, PEG는 1-(모노메톡시폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG)이다.
본원에 기재된 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, LNP는 비양이온성 지질을 추가로 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 비양이온성 지질은 디스테아로일-sn-글리세로포스포에탄올아민, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 모노메틸포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-모노메틸 PE), 디메틸포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-디메틸 PE), 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일포스파티딜에탄올아민(SOPE), 수소첨가된 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 달걀 포스파티딜콜린(EPC), 디올레오일포스파티딜세린(DOPS), 스핑고미엘린(SM), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디에루코일포스파티딜콜린(DEPC), 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 디엘라이도일포스파티딜에탄올아민(DEPE), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPHyPE); 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소레시틴, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 달걀 스핑고미엘린(ESM), 세팔린, 카디오리핀(cardiolipin), 포스파티드산, 세레브로시드, 디세틸포스페이트, 리소포스파티딜콜린, 디리놀레오일포스파티딜콜린, 또는 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택된다.
일부 구현예에 따르면, 비양이온성 지질은 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로 이루어지는 군에서 선택된다.
일부 구현예에 따르면, PEG 또는 PEG-지질 접합체는 약 1.5% 내지 약 3%로 존재한다.
일부 구현예에 따르면, 콜레스테롤은 약 20% 내지 약 40%의 몰 백분율로 존재하고, 지질은 약 80% 내지 약 60%의 몰 백분율로 존재한다.
일부 구현예에 따르면, 콜레스테롤은 약 40%의 몰 백분율로 존재하고, 지질은 약 50%의 몰 백분율로 존재한다.
일부 구현예에 따르면, 상기 조성물은 콜레스테롤, PEG 또는 PEG-지질 접합체, 및 비양이온성 지질을 추가로 포함한다.
일부 구현예에 따르면, PEG 또는 PEG-지질 접합체는 약 1.5% 내지 약 3%, 약 1.5% 내지 약 2.75%, 약 1.5% 내지 약 2.5%, 약 1.5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 3%, 약 2% 내지 약 2.75%, 약 2% 내지 약 2.5%, 약 2.5% 내지 약 3%, 약 2.5% 내지 약 2.75%, 또는 약 2.5% 내지 약 3%로 존재한다.
일부 구현예에 따르면, 콜레스테롤은 약 30% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 45%, 약 30% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 35%, 약 35% 내지 약 40%, 약 35% 내지 약 45%, 약 35% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 45%, 약 40% 내지 약 50%, 또는 약 45% 내지 약 50%의 몰 백분율로 존재한다.
일부 구현예에 따르면, 지질은 약 42.5% 내지 약 62.5%, 약 42.5% 내지 약 57.5%, 약 42.5% 내지 약 52.5%, 약 42.5% 내지 약 47.5%, 약 47.5% 내지 약 62.5%, 약 47.5% 내지 약 57.5%, 약 47.5% 내지 약 52.5%, 약 52.5% 내지 약 62.5%, 약 52.5% 내지 약 57.5%, 또는 약 57.5% 내지 약 62.5%의 몰 백분율로 존재한다.
일부 구현예에 따르면, 비양이온성 지질은 약 2.5% 내지 약 12.5%, 약 2.5% 내지 약 10.5%, 약 2.5% 내지 약 8.5%, 약 2.5% 내지 약 6.5%, 약 2.5% 내지 약 4.5%, 약 4.5% 내지 약 12.5%, 약 4.5% 내지 약 10.5%, 약 4.5% 내지 약 8.5%, 약 4.5% 내지 약 6.5%, 약 6.5% 내지 약 12.5%, 약 6.5% 내지 약 10.5%, 약 6.5% 내지 약 8.5%, 약 8.5% 내지 약 12.5%, 약 8.5% 내지 약 10.5%, 또는 약 10.5% 내지 약 12.5%의 몰 백분율로 존재한다.
본원의 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, 콜레스테롤은 약 40%의 몰 백분율로 존재하고, 지질은 약 52.5%의 몰 백분율로 존재하고, 비양이온성 지질은 약 7.5%의 몰 백분율로 존재하고, PEG는 약 3%로 존재한다.
본원에 기재된 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, 상기 조성물은 덱사메타손 팔미테이트를 추가로 포함한다.
본원에 기재된 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, LNP의 크기는 약 75 nm 미만이다. 본원에 개시된 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, LNP의 크기는 약 70 nm 미만, 예를 들어 약 65 nm 미만, 약 60 nm 미만, 약 55 nm 미만, 약 50 nm 미만, 약 45 nm 미만, 약 40 nm 미만, 약 35 nm 미만, 약 30 nm 미만, 약 25 nm 미만, 약 20 nm 미만, 약 15 nm 미만 또는 약 10 nm 미만이다. 본원에 기재된 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, LNP의 크기는 약 70 nm, 69 nm, 68 nm, 67 nm, 66 nm, 65 nm, 64 nm, 63 nm, 62 nm, 61 nm, 60 nm, 59 nm, 58 nm, 57 nm, 56 nm, 55 nm, 54 nm, 53 nm, 52 nm, 51 nm 또는 50 nm 미만이다.
본원에 기재된 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, 상기 조성물의 총 지질 대 강성 치료용 핵산(rTNA)의 비는 약 15:1이다.
본원에 기재된 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, 상기 조성물의 총 지질 대 강성 치료용 핵산(rTNA)의 비는 약 30:1이다.
본원에 기재된 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, 상기 조성물의 총 지질 대 강성 치료용 핵산(rTNA)의 비는 약 40:1이다.
본원에 기재된 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, 상기 조성물의 총 지질 대 강성 치료용 핵산(rTNA)의 비는 약 50:1이다.
본원에 기재된 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, 상기 조성물의 총 지질 대 강성 치료용 핵산(rTNA)의 비는 약 15:1 내지 약 30:1이다. 본원에 기재된 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, 상기 조성물의 총 지질 대 강성 치료용 핵산(rTNA)의 비는 약 15:1 내지 약 40:1이다. 본원에 기재된 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, 상기 조성물의 총 지질 대 강성 치료용 핵산(rTNA)의 비는 약 15:1 내지 약 50:1이다. 본원에 기재된 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, 상기 조성물의 총 지질 대 강성 치료용 핵산(rTNA)의 비는 약 30:1 내지 약 40:1이다. 본원에 기재된 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, 상기 조성물의 총 지질 대 강성 치료용 핵산(rTNA)의 비는 약 30:1 내지 약 50:1이다. 본원에 기재된 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, 상기 조성물의 총 지질 대 강성 치료용 핵산(rTNA)의 비는 약 40:1 내지 약 50:1이다. 본원에 기재된 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, 상기 조성물은 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)을 추가로 포함한다. 일부 구현예에 따르면, GalNAc는 총 지질의 0.5%의 몰 백분율로 LNP에 존재한다. 일부 구현예에 따르면, GalNAc는 총 지질의 약 0.3% 내지 약 0.9%, 약 0.4% 내지 약 0.8%, 약 0.5% 내지 약 0.6%의 몰 백분율로 LNP에 존재한다.
본원에 기재된 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, 강성 치료용 핵산(rTNA)은 폐쇄형 DNA(ceDNA)이다.
본원에 기재된 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, 강성 치료용 핵산(rTNA)은 프로모터 서열과 전이유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 강성 치료용 핵산(rTNA)은 폴리아데닐화 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 강성 치료용 핵산(rTNA)은 상기 발현 카세트의 5' 말단 또는 3' 말단을 플랭킹하는 적어도 하나의 역말단반복서열(ITR: inverted terminal repeat)을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 발현 카세트는 2개의 ITR에 의해 플랭킹되어 있으며, 여기서 2개의 ITR은 하나의 5' ITR과 하나의 3' ITR을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 발현 카세트는 3' 말단에 있는 ITR(3' ITR)에 연결되어 있다. 일부 구현예에 따르면, 발현 카세트는 5' 말단에 있는 ITR(5' ITR)에 연결되어 있다.
일부 구현예에 따르면, 5' ITR 또는 3' ITR 중 적어도 하나는 야생형 AAV ITR이다. 일부 구현예에 따르면, 5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 변형된 ITR이다.
일부 구현예에 따르면, 강성 치료용 핵산(rTNA)은 5' ITR과 발현 카세트 사이에 스페이서 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 강성 치료용 핵산(rTNA)은 3' ITR과 발현 카세트 사이에 스페이서 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 스페이서 서열은 적어도 5개 염기쌍 길이이다. 일부 구현예에 따르면, 스페이서 서열은 5개 내지 100개 염기쌍 길이이다. 일부 구현예에 따르면, 스페이서 서열은 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개 또는 100개 염기쌍 길이이다. 일부 구현예에 따르면, 스페이서 서열은 5개 내지 500개 염기쌍 길이이다. 일부 구현예에 따르면, 스페이서 서열은 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 210개, 220개, 230개, 240개, 250개, 260개, 270개, 280개, 290개, 300개, 310개, 320개, 330개, 340개, 350개, 360개, 370개, 380개, 390개, 400개, 410개, 420개, 430개, 440개, 450개, 460개, 470개, 480개, 490개 또는 500개 염기쌍 길이이다.
일부 구현예에 따르면, 강성 치료용 핵산(rTNA)은 닉(nick) 또는 갭(gap)을 갖는다.
일부 구현예에 따르면, ITR은 AAV 혈청형에서 유도된 ITR, 거위바이러스의 ITR에서 유도된 ITR, B19 바이러스 ITR에서 유도된 ITR, 또는 파르보바이러스(parvovirus) 유래의 야생형 ITR에서 선택되는 ITR이다.
일부 구현예에 따르면, 상기 AAV 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12로 이루어지는 군에서 선택된다.
일부 구현예에 따르면, ITR은 돌연변이 ITR이고, ceDNA는 선택적으로 제1 ITR과 상이한 추가의 ITR을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, ceDNA는 발현 카세트의 5' 말단과 3' 말단 모두에 2개의 돌연변이 ITR을 포함하며, 선택적으로 여기서 2개의 돌연변이 ITR은 대칭 돌연변이이다.
본원에 기재된 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, 강성 치료용 핵산(rTNA)은 미니유전자(minigene), 플라스미드, 미니서클(minicircle), 소형 간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO), 리보자임, ceDNA, 미니스트링(ministring), doggybone™, 프로텔로미어 폐쇄형 DNA 또는 덤벨 선형 DNA, 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), mRNA, tRNA, rRNA, DNA 바이러스성 벡터, 바이러스성 RNA 벡터, 비(非)바이러스성 벡터, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된다.
본원에 기재된 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, 강성 치료용 핵산은 플라스미드이다.
본원에 기재된 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, 약학적 조성물 약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 개시내용은 이온화 가능한 지질과 폐쇄형 DNA(ceDNA)를 포함하는 지질 나노입자(LNP) 제형을 제조하는 방법으로서, 수성 ceDNA를 양이온성 또는 이온화 가능한 지질을 포함하는 하나 이상의 저분자량 알코올(예를 들어, 에탄올, 메탄올, 프로판올 또는 이소프로판올) 용액에 첨가하여 ceDNA/지질 용액을 형성하는 단계(여기서, 용액 중 알코올의 최종 농도는 약 80% 내지 약 98%임); ceDNA/지질 용액을 산성 수성 완충액과 혼합하는 단계; 및 중성 pH 수성 완충액으로 완충액 교환하여 LNP 제형을 생성하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에 따르면, 용액 중 저분자량 알코올의 최종 농도는 약 80% 내지 약 98%, 약 80% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 92%, 약 80% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 85%, 약 85% 내지 약 98%, 약 85% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 92%, 약 85% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 98%, 약 87% 내지 약 97%, 약 87% 내지 약 95%, 약 87% 내지 약 92%, 약 87% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 92%, 약 95% 내지 약 98%, 또는 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97% 또는 약 98%이다.
또 다른 양태에 따르면, 본 개시내용은 이온화 가능한 지질과 폐쇄형 DNA(ceDNA)를 포함하는 지질 나노입자(LNP) 제형을 제조하는 방법으로서, ceDNA를 하나 이상의 저분자량 알코올(예를 들어, 에탄올, 메탄올, 프로판올 또는 이소프로판올) 용액에 첨가하는 단계(여기서, 생성되는 용액의 알코올 함량은 80% 초과임), >80% 알코올 함량 중 상기 ceDNA를 80% 알코올 중 양이온성 또는 이온화 가능한 지질에 첨가하여 ceDNA/지질 용액을 형성하는 단계(여기서, ceDNA-지질 용액 중 저분자량 알코올의 농도는 약 80% 내지 약 95%(예를 들어, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95%)임); ceDNA/지질 용액을 산성 수성 완충액과 혼합하는 단계; 및 중성 pH 수성 완충액으로 완충액 교환하여 LNP 제형을 생성하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에 따르면, 용액 중 저분자량 알코올의 최종 농도는 약 80% 내지 약 98%, 약 80% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 92%, 약 80% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 85%, 약 85% 내지 약 98%, 약 85% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 92%, 약 85% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 98%, 약 87% 내지 약 97%, 약 87% 내지 약 95%, 약 87% 내지 약 92%, 약 87% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 95%, 약 90% 내지 약 92%, 약 95% 내지 약 98%, 또는 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97% 또는 약 98%이다.
일부 구현예에 따르면, 상기 방법은 혼합된 ceDNA/지질 용액을 산성 수성 완충액으로 희석하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 하나 이상의 저분자량 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 이소프로판올로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 하나 이상의 저분자량 알코올은 에탄올이다. 일부 구현예에 따르면, 하나 이상의 저분자량 알코올은 프로판올이다. 일부 구현예에 따르면, 하나 이상의 저분자량 알코올은 메탄올이다. 일부 구현예에 따르면, 하나 이상의 저분자량 알코올은 에탄올과 메탄올의 혼합물이다.
일부 구현예에 따르면, 산성 수성 완충액은 말산/말산소듐 또는 아세트산/아세트산소듐에서 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 산성 수성 완충액의 농도는 약 10 mM(밀리몰농도) 내지 40 mM, 예를 들어 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 10 mM 내지 약 30 mM, 약 20 mM 내지 약 30 mM, 약 20 mM 내지 약 40 mM, 약 30 mM 내지 약 40 mM, 또는 약 10 mM 내지 약 15 mM이다. 일부 구현예에 따르면, 산성 수성 완충액의 pH는 약 3 내지 5이다.
일부 구현예에 따르면, 중성 pH 수성 완충액은 Dulbecco 인산염 완충 식염수(pH 7.4)이다.
일부 구현예에 따르면, ceDNA/지질 용액은 미세유체 혼합을 사용하여 산성 수성 완충액과 혼합된다.
일부 구현예에 따르면, 희석 단계 후 최종 알코올 함량은 약 4% 내지 약 15%(예를 들어, 약 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% 또는 15%)이다.
일부 구현예에 따르면, 산성 수성 완충액과 ceDNA/지질 용액 사이의 유량비는 2:1, 3:2, 3:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1 또는 20:1이다.
일부 구현예에 따르면, LNP의 평균 직경은 약 20 nm 내지 약 70 nm, 예를 들어 약 20 nm, 약 25 nm, 약 30 nm, 약 35 nm, 약 40 nm, 약 45 nm, 약 50 nm, 약 55 nm, 약 60 nm, 약 65 nm 또는 약 70 nm이다.
일부 구현예에 따르면, 양이온성 지질은 하기 구조를 갖는 MC3, 즉 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-MC3-DMA 또는 MC3)이다:
Figure pct00010
.
일부 구현예에 따르면, 이온화 가능한 지질은 디설파이드 결합과 3차 아민을 포함하는 SS-절단 가능한 지질이다.
일부 구현예에 따르면, SS-절단 가능한 지질은 하기 화학식 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 ss-OP 지질을 포함한다:
Figure pct00011
.
일부 구현예에 따르면, 본 개시내용은 본원의 양태 및 구현예에 기재된 방법에 따라 제조된 LNP 제형을 제공한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 개시내용은 대상에서 유전적 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 청구범위 중 임의의 것에 따른 약학적 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에 따르면, 대상은 인간이다.
일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 겸상적혈구빈혈, 흑색종, A형 혈우병(응고인자 VIII(FVIII) 결핍증) 및 B형 혈우병(응고인자 IX(FIX) 결핍증), 낭성섬유증(CFTR), 가족성 고콜레스테롤혈증(LDL 수용체 결함), 간모세포종, 윌슨병(Wilson disease), 페닐케톤뇨증(PKU), 선천성 간 포르피린증, 유전성 간 대사장애, 레쉬-니한증후군(Lesch Nyhan syndrome), 겸상적혈구빈혈, 지중해빈혈, 색소성 건피증, 판코니빈혈(Fanconi's anemia), 색소성망막염, 모세혈관확장성 운동실조증, 블룸증후군(Bloom's syndrome), 망막모세포종, 점액다당류축적질환(예를 들어, 헐러증후군(Hurler syndrome)(MPS I형), 샤이에증후군(Scheie syndrome)(MPS I형 S), 헐러-샤이에증후군(MPS I형 H-S), 헌터증후군(Hunter syndrome)(MPS II형), 산필리포(Sanfilippo)증후군 A형, B형, C형 및 D형(MPS III형 A, B, C 및 D), 모르키오(Morquio)증후군 A형 및 B형(MPS IVA 및 MPS IVB), 마로토-라미증후군(Maroteaux-Lamy syndrome)(MPS VI형), 슬라이증후군(Sly syndrome)(MPS VII형), 히알루로니다아제 결핍증(MPS IX형)), 니만-피크병(Niemann-Pick Disease) A/B형, C1형 및 C2형, 파브리병(Fabry disease), 쉰들러병(Schindler disease), GM2-강글리오시드증 II형(샌드호프병(Sandhoff Disease)), 테이-삭스병(Tay-Sachs disease), 이염성 백질디스트로피(Metachromatic Leukodystrophy), 크라베병(Krabbe disease), 점액지질증 I형, II/III형 및 IV형, 시알산증 I형 및 II형, 글리코겐축적질환 I형 및 II형(폼페병(Pompe disease)), 고셰병(Gaucher disease) I형, II형 및 III형, 시스틴증, 바텐병(Batten disease), 아스파르틸글루코사민뇨증(Aspartylglucosaminuria), 살라병(Salla disease), 다논병(Danon disease)(LAMP-2 결핍증), 리소좀 산 리파아제(LAL) 결핍증, 신경원성 세로이드 리포푸신증(neuronal ceroid lipofuscinoses)(CLN1-8, INCL 및 LINCL), 스핑고리피드증, 갈락토시알산증, 근위축측삭경화증(ALS), 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 척수소뇌성 실조증, 척수근위축증, 프리드리히 운동실조증(Friedreich's ataxia), 뒤시엔느 근위축증(DMD: Duchenne muscular dystrophy), 베커 근위축증(BMD: Becker muscular dystrophy), 이영양성 수포성 표피박리증(DEB: dystrophic epidermolysis bullosa), 엑토뉴클레오타이드 피로포스파타아제 1 결핍증, 유아기의 전신동맥석회화(GACI: generalized arterial calcification of infancy), 레베르 선천성 흑암시(Leber Congenital Amaurosis), 스타가르트 황반이양증(Stargardt macular dystrophy)(ABCA4), 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC: ornithine transcarbamylase) 결핍증, 어셔증후군(Usher syndrome), 알파-1 항트립신 결핍증, 및 카텝신(Cathepsin) A 결핍증으로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 레베르 선천성 흑암시(LCA)이다.
일부 구현예에 따르면, LCA는 LCA10이다.
일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 니만-피크병이다. 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 스타가르트 황반이양증이다. 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 글루코오스-6-포스파타아제(G6Pase) 결핍증(글리코겐축적질환 I형) 또는 폼페병(글리코겐축적질환 II형)이다. 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 A형 혈우병(인자 VIII 결핍증)이다. 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 B형 혈우병(인자 IX 결핍증)이다. 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 헌터증후군(점액다당류증 II형)이다. 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 낭성섬유증이다. 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 이영양성 수포성 표피박리증(DEB)이다. 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 페닐케톤뇨증(PKU)이다. 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 히알루로니다아제 결핍증이다.
본원에 기재된 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, 상기 방법은 면역억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 면역억제제는 덱사메타손이다.
본원에 기재된 양태 및 구현예의 일부 구현예에 따르면, 대상은 주요 양이온성 지질로서 MC3을 포함하는 LNP를 이용하여 관찰된 면역 반응 수준과 비교하여, 상기 약학적 조성물에 대해 감소된 면역 반응 수준을 나타내며, 여기서 상기 약학적 조성물에 대한 면역 반응 수준은 MC3을 포함하는 LNP를 이용하여 관찰된 수준보다 적어도 50% 더 낮다.
일부 구현예에 따르면, 면역 반응은 전염증성 사이토카인 또는 케모카인의 수준을 검출하는 방식으로 측정된다.
일부 구현예에 따르면, 전염증성 사이토카인 또는 케모카인은 IL-6, IFNα, IFNγ, IL-18, TNFα, IP-10, MCP-1, MIP1α, MIP1β 및 RANTES로 이루어지는 군에서 선택된다.
일부 구현예에 따르면, 전염증성 사이토카인 중 적어도 하나는 약학적 조성물을 투여하고 6시간 후 대상의 혈청에서 검출 가능한 수준 미만이다.
일부 구현예에 따르면, SS-절단 가능한 지질과 폐쇄형 DNA(ceDNA)를 포함하는 LNP는 포식되지 않거나; 유사한 조건 하에서 투여된 주요 양이온성 지질로서 MC3을 포함하는 LNP의 포식세포 수준(phagocytic level)과 비교하여 적어도 50% 감소된 포식세포 수준을 나타낸다.
일부 구현예에 따르면, SS-절단 가능한 지질은 하기 화학식 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 ssOP 지질을 포함한다:
Figure pct00012
.
일부 구현예에 따르면, LNP는 콜레스테롤과 PEG-지질 접합체를 추가로 포함한다.
일부 구현예에 따르면, LNP는 비양이온성 지질을 추가로 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 비양이온성 지질은 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로 이루어지는 군에서 선택된다.
일부 구현예에 따르면, LNP는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)을 추가로 포함한다.
일부 구현예에 따르면, GalNAc는 총 지질의 0.5%의 몰 백분율로 LNP에 존재한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 개시내용은 대상의 간에 대한 치료용 핵산의 표적화를 증가시키는 방법으로서, 상기 청구범위 중 임의의 것에 따른 약학적 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 LNP는 치료용 핵산, ss-절단 가능한 지질, 스테롤, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)을 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에 따르면, PEG는 1-(모노메톡시폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG)이다.
일부 구현예에 따르면, LNP는 비양이온성 지질을 추가로 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 비양이온성 지질은 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로 이루어지는 군에서 선택된다.
일부 구현예에 따르면, GalNAc는 총 지질의 0.5%의 몰 백분율로 LNP에 존재한다.
일부 구현예에 따르면, 대상은 유전적 장애를 앓고 있다.
일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 A형 혈우병(인자 VIII 결핍증)이다. 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 B형 혈우병(인자 IX 결핍증)이다. 일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 페닐케톤뇨증(PKU)이다.
일부 구현예에 따르면, 치료용 핵산은 미니유전자, 플라스미드, 미니서클, 소형 간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO), 리보자임, ceDNA, 미니스트링, doggybone™, 프로텔로미어 폐쇄형 DNA 또는 덤벨 선형 DNA, 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), mRNA, tRNA, rRNA, DNA 바이러스성 벡터, 바이러스성 RNA 벡터, 비바이러스성 벡터, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된다.
일부 구현예에 따르면, 치료용 핵산은 ceDNA이다.
일부 구현예에 따르면, ceDNA는 프로모터 서열과 전이유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
일부 구현예에 따르면, ceDNA는 상기 발현 카세트의 5' 말단 또는 3' 말단을 플랭킹하는 적어도 하나의 역말단반복서열(ITR)을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, ceDNA는 CELiD, MIDGE, 미니스트링 DNA, 발현 카세트의 5' 말단과 3' 말단에 있는 ITR의 2개의 헤어핀 구조를 포함하는 덤벨형 선형 이중체 폐쇄형 DNA, 또는 doggybone™ DNA로 이루어지는 군에서 선택되며, 여기서 ceDNA는 캡시드 미함유 선형 이중체 DNA이다.
일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 치료용 핵산(TNA)으로 치료를 필요로 하는 대상에서 보체 반응을 완화시키는 방법으로서, 상기 청구범위 중 임의의 것에 따른 약학적 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 LNP는 TNA, ss-절단 가능한 지질, 스테롤, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)을 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에 따르면, 대상은 유전적 장애를 앓고 있다.
일부 구현예에 따르면, 유전적 장애는 겸상적혈구빈혈, 흑색종, A형 혈우병(응고인자 VIII(FVIII) 결핍증) 및 B형 혈우병(응고인자 IX(FIX) 결핍증), 낭성섬유증(CFTR), 가족성 고콜레스테롤혈증(LDL 수용체 결함), 간모세포종, 윌슨병, 페닐케톤뇨증(PKU), 선천성 간 포르피린증, 유전성 간 대사장애, 레쉬-니한증후군, 겸상적혈구빈혈, 지중해빈혈, 색소성 건피증, 판코니빈혈, 색소성망막염, 모세혈관확장성 운동실조증, 블룸증후군, 망막모세포종, 점액다당류축적질환(예를 들어, 헐러증후군(MPS I형), 샤이에증후군(MPS I형 S), 헐러-샤이에증후군(MPS I형 H-S), 헌터증후군(MPS II형), 산필리포증후군 A형, B형, C형 및 D형(MPS III형 A, B, C 및 D), 모르키오증후군 A형 및 B형(MPS IVA 및 MPS IVB), 마로토-라미증후군(MPS VI형), 슬라이증후군(MPS VII형), 히알루로니다아제 결핍증(MPS IX형)), 니만-피크병 A/B형, C1형 및 C2형, 파브리병, 쉰들러병, GM2-강글리오시드증 II형(샌드호프병), 테이-삭스병, 이염성 백질디스트로피, 크라베병, 점액지질증 I형, II/III형 및 IV형, 시알산증 I형 및 II형, 글리코겐축적질환 I형 및 II형(폼페병), 고셰병 I형, II형 및 III형, 시스틴증, 바텐병, 아스파르틸글루코사민뇨증, 살라병, 다논병(LAMP-2 결핍증), 리소좀 산 리파아제(LAL) 결핍증, 신경원성 세로이드 리포푸신증(CLN1-8, INCL 및 LINCL), 스핑고리피드증, 갈락토시알산증, 근위축측삭경화증(ALS), 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 척수소뇌성 실조증, 척수근위축증, 프리드리히 운동실조증, 뒤시엔느 근위축증(DMD), 베커 근위축증(BMD), 이영양성 수포성 표피박리증(DEB), 엑토뉴클레오타이드 피로포스파타아제 1 결핍증, 유아기의 전신동맥석회화(GACI), 레베르 선천성 흑암시, 스타가르트 황반이양증(ABCA4), 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC) 결핍증, 어셔증후군, 알파-1 항트립신 결핍증, 및 카텝신 A 결핍증으로 이루어지는 군에서 선택된다.
일부 구현예에 따르면, 강성 치료용 핵산은 미니유전자, 플라스미드, 미니서클, 소형 간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO), 리보자임, ceDNA, 미니스트링, doggybone™, 프로텔로미어 폐쇄형 DNA 또는 덤벨 선형 DNA, 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), mRNA, tRNA, rRNA, DNA 바이러스성 벡터, 바이러스성 벡터, 비바이러스성 벡터, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된다.
일부 구현예에 따르면, ceDNA는 CELiD, MIDGE, 미니스트링 DNA, 발현 카세트의 5' 말단과 3' 말단에 있는 ITR의 2개의 헤어핀 구조를 포함하는 덤벨형 선형 이중체 폐쇄형 DNA, 또는 doggybone™ DNA로 이루어지는 군에서 선택되며, 여기서 ceDNA는 캡시드 미함유 선형 이중체 DNA이다.
일부 구현예에 따르면, PEG는 1-(모노메톡시폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG)이다.
일부 구현예에 따르면, PEG는 약 2% 내지 4%의 몰 백분율로 LNP에 존재한다. 일부 구현예에 따르면, PEG는 약 3%의 몰 백분율로 LNP에 존재한다.
일부 구현예에 따르면, LNP는 비양이온성 지질을 추가로 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 비양이온성 지질은 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로 이루어지는 군에서 선택된다.
일부 구현예에 따르면, GalNAc는 총 지질의 약 0.3% 내지 1%의 몰 백분율로 LNP에 존재한다. 일부 구현예에 따르면, GalNAc는 총 지질의 약 0.5%의 몰 백분율로 LNP에 존재한다.
상기 간략하게 개략되어 있고 하기 보다 상세하게 논의되는 본 개시내용의 구현예는, 첨부된 도면에 도시된 본 개시내용의 예시적인 구현예를 참조로 이해될 수 있다. 하지만, 첨부된 도면은 본 개시내용의 단지 전형적인 구현예를 예시하는 것으로, 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안 되며, 본 개시내용은 다른 동등하게 효과적인 구현예를 허용할 수 있다.
도 1a는, 동적 광산란으로 측정된 ceDNA의 응축을 보여주는 그래프이다. 동적 광산란 상관 함수는 에탄올 함량 증가에 따른 ceDNA의 응축을 보여준다. 도 1b는, 재수화 시 콤팩트화가 가역적임을 보여주는 그래프이다.
도 2는, 표준 제형화 공정과 본원에 기재된 신규한 제형화 공정에 따라 제조된 ceDNA LNP의 직경을 비교한 것을 보여주는 그래프이다.
도 3a 및 도 3b는, 각각, 탈이온수(DI water) 중에 보관된 ceDNA 샘플 및 플라스미드 DNA(pDNA) 샘플의 투과 전자 현미경검사법(TEM) 이미지이다. 도 3a는, 탈이온수 중에 보관된 ceDNA의 TEM 이미지이다. 도 3b는, 탈이온수 중에 보관된 플라스미드의 TEM 이미지이다.
도 4a 및 도 4b는, 각각, 탈이온수 중 90.9% 1:1 에탄올:메탄올의 저분자량 알코올/물 용액 중에 보관된 ceDNA 샘플 및 pDNA 샘플의 TEM 이미지이다. 도 4a는, 탈이온수 중 90.9% 1:1 에탄올:메탄올 중에 보관된 ceDNA의 TEM 이미지를 도시한 것이다. 도 4b는, 탈이온수 중 90.9% 1:1 에탄올:메탄올 중에 보관된 플라스미드의 TEM 이미지를 도시한 것이다.
도 5는, 100% 저분자량 알코올(즉, 1:1 에탄올:메탄올(물 미함유)) 중에 보관된 ceDNA 샘플의 TEM 이미지이다.
도 6a 및 도 6b는, 각각, 100 mM 염화소듐(NaOH) 수용액의 염기성 변성 조건 하에 보관된 ceDNA 및 pDNA의 TEM 이미지이다.
바이러스성 벡터 기반 유전자 요법과 관련된 면역원성은 기존 배경 면역으로 인해 치료될 수 있는 환자의 수를 제한할 뿐 아니라, 각 환자의 유효 수준으로 적정하거나 장기간에 걸쳐 효과를 유지하기 위해 환자에게 재투여하는 것을 막는다. 기존 면역의 결여로 인해, 본원에서 기재된 치료용 핵산 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는, 필요한 경우, 치료용 핵산의 추가 용량을 허용하며, 조직 성장 시 후속 용량이 필요할 수 있는 소아 집단을 포함하여 환자 접근을 추가로 확장시킨다. 본원에 기재된 공정에 따라 제조되고, 특히 하나 이상의 3차 아미노기를 포함하는 양이온성 또는 이온화 가능한 지질 조성물을 포함하는 치료용 핵산 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는, 통상의 LNP 제조 공정에 의해 생성된 LNP에 비해 더 작은 크기로 인해 치료용 핵산의 더 효율적인 전달, 더 우수한 내약성 및 개선된 안전성 프로파일을 제공한다. 본원에 기재된 치료용 핵산 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 바이러스 캡시드 내 공간에 의해 부가되는 패키징 제약이 없기 때문에, 이론상, 치료용 핵산 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 유일한 크기 제한은 숙주세포의 DNA 복제 효율에 있다. 본원에 기재되고 예시된 바와 같이, 일부 구현예에 따르면, 치료용 핵산은 이중가닥 DNA(예를 들어, ceDNA)와 같은 치료용 핵산(TNA)이다. 본원에 기재되고 예시된 바와 같이, 일부 구현예에 따르면, 치료용 핵산은 ceDNA이다. 또한, 본원에 기재된 바와 같이, 일부 구현예에 따르면, 치료용 핵산은 mRNA이다.
특히 희귀 질환 치료제 개발에 있어서 가장 어려운 장애물 중 하나는, 많은 수의 개별 병태이다. 지구 상에서 대략 3억 5천만명의 사람들이, 진단받은 사람이 200,000명 미만인 장애 또는 병태로 미국국립보건원(National Institutes of Health)에서 정의한, 희귀 장애를 갖고 살고 있다. 이러한 희귀 장애 중 약 80%는 유전적 기원이며, 이 중 약 95%는 FDA가 승인한 치료법이 없다(rarediseases.info.nih.gov/diseases/pages/31/faqs-about-rare-diseases). 본원에 기재된 ceDNA 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 이점 중 하나는, 다수의 유전적 장애 또는 질환을 위한 치료의 현재 상태를 유의미하게 변경시킬 수 있는, 다수의 질환, 특히 희귀 단일유전자 질환에 신속하게 적용될 수 있는 접근법을 제공한다는 것이다.
I. 정의
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 본 개시내용이 속하는 당업자가 통상적으로 이해하는 의미를 가질 것이다. 본 개시내용이 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않고, 달라질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 목적이며, 청구범위에 의해서만 한정되는 본 개시내용의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 면역학 및 분자생물학에서의 상용 용어 정의는, 하기 문헌에서 확인할 수 있다: 문헌[The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19th Edition, Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3)]; 문헌[Robert S. Porter et al. (eds.), Fields Virology, 6th Edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA (2013)]; 문헌[Knipe, D.M. and Howley, P.M. (ed.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908)]; 문헌[Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)]; 문헌[Immunology by Werner Luttmann, Elsevier, 2006]; 문헌[Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305)]; 문헌[Lewin's Genes XI, Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055)]; 문헌[Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414)]; 문헌[Davis et al. Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X)]; 문헌[Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542)]; 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385)]; 문헌[Current Protocols in 단백질 Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005]; 및 문헌[Current Protocols in Immunology (CPI), John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737)](상기 문헌들의 내용은 모두 그 전체가 본원에 참조로 인용됨).
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태의 표현은, 문맥에서 달리 명백하게 지시하지 않는 한, 복수의 언급 대상을 포함한다.
"e.g."라는 약어는, 라틴어 예를 들어(exempli gratia)에서 유도된 것이며, 이는 본원에서 비제한적인 예를 나타내기 위해 사용된다. 따라서, "e.g."라는 약어는, "예를 들어"라는 용어와 동의어이다.
대안의 사용(예를 들어, "또는")은 대안들 중 하나, 둘, 또는 이들의 임의의 조합을 의미한다는 것을 이해해야 한다.
본원에 사용된 "약"이라는 용어는, 양, 시간적 지속기간 등과 같은 측정 가능한 값을 나타낼 때, 명시된 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 더욱 바람직하게는 ±5%, 보다 더욱 바람직하게는 ±1%, 및 더 더욱 바람직하게는 ±0.1%의 차이를 포함하는 것으로 여겨지는 데, 이러한 차이가 본원에 개시된 방법을 수행하는 데 적합하기 때문이다.
본원에 사용된 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비 범위 또는 정수 범위는, 달리 지시되지 않는 한, 인용된 범위 내 임의의 정수의 값, 및 적절한 경우 이의 분수(예컨대, 정수의 1/10 및 1/100)를 포함한다는 것을 이해해야 한다.
본원에 사용된 "포함하다", "포함하는" 및 "~으로 구성된"은, "포함되다", "포함하여" 또는 "함유하다", "함유하는"과 동의어임을 의미하는 것으로, 다음에 오는 것, 예를 들어 구성요소의 존재를 명시하는 포괄적이거나 개방적인 용어이며, 당업계에 공지된 또는 본원에 개시된 추가의 인용되지 않은 구성요소, 특징, 요소, 구성원, 단계의 존재를 배제하거나 제외시키지 않는다.
"~로 이루어진"이라는 용어는, 구현예의 설명에 인용되지 않은 임의의 요소를 배제하는, 본원에 기재된 바와 같은 조성물, 방법, 공정 및 이의 각 구성요소를 나타낸다.
본원에 사용된 "본질적으로 ~로 이루어진"이라는 용어는, 주어진 구현예에 필요한 요소를 나타낸다. 상기 용어는, 본 개시내용의 구현예의 기본적인 및 신규한 또는 기능적 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가 요소의 존재를 허용한다.
본원에 사용된 "예컨대", "예를 들어" 등과 같은 용어는, 예시적인 구현예를 나타내기 위해 의도된 것으로, 본 개시내용의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용과 관련된 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 바와 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료가 하기에 기재된다.
본원에 사용된 "투여", "투여하는"이라는 용어 및 이의 변형은, 대상에게 조성물 또는 작용제(예를 들어, 핵산, 특히 ceDNA)를 도입하는 것을 나타내며, 하나 이상의 조성물 또는 작용제의 동시 및 순차적 도입을 포함한다. "투여"는, 예를 들어 치료, 약동학, 진단, 연구, 위약 및 실험 방법을 나타낼 수 있다. "투여"는 또한 시험관내 및 생체외 처리를 포함한다. 대상으로의 조성물 또는 작용제의 도입은, 경구, 폐, 비강, 비경구(정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하), 직장, 림프내, 종양내 또는 국소를 포함하는 임의의 적합한 경로로 이루어진다. 투여는 자가 투여와 다른 이에 의한 투여를 포함한다. 투여는 임의의 적합한 경로로 수행될 수 있다. 적합한 투여 경로는 조성물 또는 작용제가 이의 의도된 기능을 수행하는 것을 가능하게 한다. 예를 들어, 적합한 경로가 정맥내인 경우, 상기 조성물은 조성물 또는 작용제를 대상의 정맥에 도입하는 방식으로 투여된다.
본원에 사용된 "항-치료용 핵산 면역반응", "항-전달 벡터 면역반응", "치료용 핵산에 대한 면역반응", "전달 벡터에 대한 면역반응" 등의 구절은, 바이러스 또는 비바이러스 기원의 치료용 핵산에 대한 임의의 목적하지 않는 면역반응을 나타내는 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, 목적하지 않는 면역반응은 바이러스성 전달 벡터 자체에 대한 항원 특이적 면역반응이다. 일부 구현예에서, 면역반응은 이중가닥 DNA, 단일가닥 RNA 또는 이중가닥 RNA일 수 있는 전달 벡터에 특이적이다. 다른 구현예에서, 면역반응은 전달 벡터의 서열에 특이적이다. 다른 구현예에서, 면역반응은 전달 벡터의 CpG 함량에 특이적이다.
본원에 사용된 "수용액"이라는 용어는, 전체적으로 또는 부분적으로 물을 포함하는 조성물을 나타내는 것으로 여겨진다.
본원에 사용된 "염기"라는 용어는, 퓨린 및 피리미딘(이에는 천연 화합물인 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신, 우라실, 이노신, 및 천연 유사체가 추가로 포함됨) 및 퓨린 및 피리미딘의 합성 유도체(이에는, 비제한적으로, 아민, 알코올, 티올, 카르복실레이트 및 알킬할라이드와 같은 새로운 반응성기가 대체된 변형이 포함됨)를 포함한다.
본원에 사용된 "담체"라는 용어는, 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅제, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함하는 것으로 여겨진다. 약학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 보충 활성 성분이 또한 조성물에 혼입될 수 있다. "약학적으로 허용 가능한"이라는 구절은, 숙주에게 투여될 때 독성, 알레르기 또는 유사한 유해 반응을 생성하지 않는 분자 엔티티 및 조성물을 나타낸다.
본원에 사용된 "ceDNA"라는 용어는, 합성 또는 그 이외의 다른 비바이러스성 유전자 전달을 위한 캡시드 미함유 폐쇄형 선형 이중가닥(ds) 이중체 DNA를 나타내는 것으로 여겨진다. 일부 구현예에 따르면, ceDNA는 폐쇄형 선형 이중체(CELiD) CELiD DNA이다. 일부 구현예에 따르면, ceDNA는 DNA 기반 미니서클이다. 일부 구현예에 따르면, ceDNA는 최소한으로 면역학적으로 정의된 유전자 발현(MIDGE: minimalistic immunological-defined gene expression) 벡터이다. 일부 구현예에 따르면, ceDNA는 미니스트링 DNA이다. 일부 구현예에 따르면, ceDNA는 발현 카세트의 5' 말단과 3' 말단에 있는 ITR의 2개의 헤어핀 구조를 포함하는 덤벨형 선형 이중체 폐쇄형 DNA이다. 일부 구현예에 따르면, ceDNA는 doggybone™ DNA이다. ceDNA에 대한 상세한 설명은, 2017년 3월 3일자 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2017/020828에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 전체 내용은 명백하게 본원에 참조로 인용된다. 세포 기반 방법을 사용하여 다양한 역말단반복(ITR) 서열 및 구성을 포함하는 ceDNA의 생산을 위한 특정 방법은, 2018년 9월 7일자 출원된 국제 특허 출원 PCT/US18/49996 및 2018년 12월 6일자 출원된 PCT/US2018/064242의 실시예 1에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 각각 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 다양한 ITR 서열 및 구성을 포함하는 합성 ceDNA 벡터의 생산을 위한 특정 방법은, 예를 들어 2019년 1월 18일자 출원된 국제 출원 PCT/US2019/14122에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 전체 내용은 본원에 참조로 인용된다.
본원에 사용된 "폐쇄형 DNA 벡터"라는 용어는, 적어도 하나의 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖고 벡터의 적어도 일부가 분자내 이중체 구조를 갖는 캡시드 미함유 DNA 벡터를 나타낸다.
본원에 사용된 "ceDNA 벡터" 및 "ceDNA"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, 적어도 하나의 말단 회문구조를 포함하는 폐쇄형 DNA 벡터를 나타낸다. 일부 구현예에서, ceDNA는 2개의 공유결합으로 폐쇄된 말단을 포함한다.
본원에 사용된 "ceDNA-박미드"라는 용어는, 플라스미드로서 대장균에서 증식할 수 있고, 따라서 바큐로바이러스에 대한 셔틀 벡터로서 작용할 수 있는, 분자간 이중체로서 ceDNA 게놈을 포함하는 감염성 바큐로바이러스 게놈을 나타내는 것으로 여겨진다.
본원에 사용된 "ceDNA-바큐로바이러스"라는 용어는, 바큐로바이러스 게놈 내에 분자간 이중체로서 ceDNA 게놈을 포함하는 바큐로바이러스를 나타내는 것으로 여겨진다.
본원에 사용된 "ceDNA-바큐로바이러스 감염된 곤충 세포" 및 "ceDNA-BIIC"라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, ceDNA-바큐로바이러스로 감염된 무척추동물 숙주세포(비제한적으로, 곤충 세포(예를 들어, Sf9 세포) 포함)를 나타낸다.
본원에 사용된 "ceDNA 게놈"이라는 용어는, 적어도 하나의 역말단반복서열(ITR) 영역을 추가로 포함하는 발현 카세트를 나타내는 것으로 여겨진다. ceDNA 게놈은 하나 이상의 스페이서 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 게놈은 DNA의 분자간 이중체 폴리뉴클레오타이드로서 플라스미드 또는 바이러스 게놈에 혼입된다.
본원에 사용된 "DNA 조절 서열", "제어 요소" 및 "조절 요소"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 비(非)코딩 서열(예를 들어, DNA 표적화 RNA) 또는 코딩 서열(예를 들어, 부위 지정 변형 폴리펩타이드 또는 Cas9/Csn1 폴리펩타이드)을 제공하고/하거나 이의 전사를 조절하고/하거나, 인코딩된 폴리펩타이드의 전사를 조절하는, 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 종결인자, 단백질 분해 신호 등과 같은 전사 및 번역 제어 서열을 나타낸다.
본원에 사용된 "강성 치료용 핵산", "강성 TNA" 또는 "rTNA"라는 용어는, 본원에 기재된 바와 같은 rTNA를 포함하는 LNP 조성물의 제조 동안 공정의 결과로서, 콤팩트한 구조를 갖거나 콤팩트한 상태로 존재하는 본원에 정의된 바와 같은 치료용 핵산을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 상기 제조는 rTNA와 지질을 LMW 알코올 용액 중에서 혼합하고, rTNA와 지질을 함유하는 LMW 알코올 혼합물을 하나의 채널을 통해 미세유체 합성 시스템(예를 들어, NanoAssemblr)에 도입하고, 수성 완충액을 별도의 채널을 통해 시스템에 도입하여 rTNA를 캡슐화하는 LNP 조성물을 생성하는 LMW 알코올 기반 공정을 포함한다. 본원에 사용된 "말단반복서열" 또는 "TR"이라는 용어는, 적어도 하나의 최소 필수 복제 기점과 회문 헤어핀 구조를 포함하는 영역을 포함하는, 임의의 바이러스성 또는 비바이러스성 말단반복 또는 합성 서열을 포함한다. Rep-결합 서열("RBS" 또는 Rep-결합 요소(RBE)로도 지칭됨)과 말단 분해 부위("TRS")는 함께 AAV에 대한 "최소 필수 복제 기점"을 구성하기 때문에, TR은 적어도 하나의 RBS와 적어도 하나의 TRS를 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 서열의 주어진 스트레치 내에서 서로 역 보체인 TR은, 전형적으로 "역말단반복" 또는 "ITR"로 지칭된다. 바이러스의 맥락에서, ITR은 복제, 바이러스 입자 및 DNA 패키징, DNA 통합, 및 게놈 및 프로바이러스 구제를 매개하는 데 있어서 중요한 역할을 한다. 전체 길이에 걸쳐 역 보체(회문구조)가 아닌 TR은 여전히 ITR의 전형적인 기능을 수행할 수 있기 때문에, ITR이라는 용어는 숙주세포의 복제를 매개할 수 있는 바이러스성 또는 비바이러스성 AAV 벡터의 TR을 나타내는 데 사용된다. 당업자는, 복잡한 AAV 벡터 구성에서, 2개 초과의 ITR 또는 비대칭 ITR 쌍이 존재할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
"ITR"은 하나 이상의 바람직한 기능성 서열(예를 들어, 회문구조 서열, RBS)을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 세트를 사용하여 인공적으로 합성될 수 있다. ITR 서열은 AAV ITR, 인공적 비(非)AAV ITR, 또는 바이러스성 AAV ITR에서 물리적으로 유도된 ITR(예를 들어, 바이러스 게놈에서 제거된 ITR 단편)일 수 있다. 예를 들어, ITR은 파르보바이러스 및 데펜도바이러스(예를 들어, 개 파르보바이러스, 소 파르보바이러스, 마우스 파르보바이러스, 돼지 파르보바이러스, 인간 파르보바이러스 B-19)를 포함하는 파르보바이러스과에서 유도될 수 있거나, 또는 SV40 복제 기점으로 작용하는 SV40 헤어핀(이는 절단, 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가에 의해 추가로 변형될 수 있음)이 ITR로서 사용될 수 있다. 파르보바이러스과 바이러스는 척추동물을 감염시키는 파르보바이러스아과(Parvovirinae)와 무척추동물을 감염시키는 덴소바이러스아과(Densovirinae)의 2개의 아과로 이루어진다. 데펜도파르보바이러스에는, 비제한적으로, 인간, 영장류, 소, 개, 말 및 양 종을 포함하는 척추동물 숙주에서 복제 가능한 아데노연관바이러스(AAV)의 바이러스과가 포함된다. 전형적으로, ITR 서열은 야생형, "개뼈형(doggy bone)" 및 "덤벨형", 대칭형 또는 심지어 비대칭형 ITR 배향 구성으로, AAV뿐 아니라, 파르보바이러스, 렌티바이러스, 거위 바이러스, B19에서 유도될 수 있다. ITR은 전형적으로 AAV 벡터의 5' 말단과 3' 말단 모두에 존재하지만, ITR은 선형 벡터의 말단 중 하나에만 존재할 수 있다. 예를 들어, ITR은 5' 말단에만 존재할 수 있다. 일부 다른 경우, ITR은 합성 AAV 벡터에서 3' 말단에만 존재할 수 있다. 본원에서 편의를 위해, 합성 AAV 벡터 내 발현 카세트의 5'("업스트림")에 위치한 ITR은 "5' ITR" 또는 "좌측 ITR"로 지칭되고, 벡터 또는 합성 AAV 내 발현 카세트의 3'("다운스트림")에 위치한 ITR은 "3' ITR" 또는 "우측 ITR"로 지칭된다.
본원에 사용된 "야생형 ITR" 또는 "WT-ITR"은, 예를 들어 Rep 결합 활성 및 Rep 닉킹 능력을 보유하는, AAV 게놈 또는 다른 데펜도바이러스 내 자연 발생 ITR 서열의 서열을 나타낸다. 임의의 AAV 혈청형의 WT-ITR의 뉴클레오타이드 서열은 유전자 코드 또는 드리프트의 축퇴로 인해 기본형 자연 발생 서열에서 약간 달라질 수 있기 때문에, 본원에의 사용을 위해 포함된 WT-ITR 서열은 자연적으로 발생하는 변화(예를 들어, 복제 오류)의 결과로서의 WT-ITR 서열을 포함한다.
본원에 사용된 "실질적으로 대칭인 WT-ITR" 또는 "실질적으로 대칭인 WT-ITR 쌍"이라는 용어는, 둘 모두 이의 전체 길이에 걸쳐 역 보체 서열을 갖는 야생형 ITR인, 합성 AAV 벡터 내 WT-ITR의 쌍을 나타낸다. 예를 들어, ITR은, 자연 발생 기본형 서열에서 벗어난 하나 이상의 뉴클레오타이드를 갖더라도, 변화가 서열의 물리적 및 기능적 특성과, 전체 3차원 구조(2차 및 3차 구조)에 영향을 미치지 않는 한, 야생형 서열인 것으로 간주될 수 있다. 일부 양태에서, 벗어난 뉴클레오타이드는 보존적 서열 변화를 나타낸다. 하나의 비제한적인 예로서, 기본형 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖고(기본 설정으로 BLAST를 사용하여 측정 시), 또한 기하학적 공간에서의 3D 구조가 동일한 형상이 되도록 다른 WT-ITR에 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는 서열. 실질적으로 대칭인 WT-ITR은 3D 공간에 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 갖는다. 실질적으로 대칭인 WT-ITR은, 이것이 적절한 Rep 단백질과 쌍을 이루는 작동 가능한 Rep 결합 부위(RBE 또는 RBE')와 말단 분해 부위(trs)를 가지고 있음을 결정하는 방식으로 WT로서 기능적으로 확인될 수 있다. 선택적으로, 허용 조건 하에서의 전이유전자 발현을 포함하는 다른 기능을 시험할 수 있다.
본원에 사용된 "변형된 ITR" 또는 "mod-ITR" 또는 "돌연변이 ITR"이라는 구절은 상호교환적으로 사용되며, 동일한 혈청형의 WT-ITR과 비교하여 적어도 하나 또는 그 이상의 뉴클레오타이드에 돌연변이를 갖는 ITR을 나타낸다. 돌연변이는 ITR 내 A 영역, C 영역, C' 영역, B 영역, B' 영역 중 하나 이상을 변경시킬 수 있으며, 동일한 혈청형의 WT-ITR의 3D 공간 구성과 비교하여 3차원 공간 구성(즉, 기하학적 공간에서의 3D 구조)을 변경시킬 수 있다.
본원에 사용된 "비대칭인 ITR"이라는 용어(이는 "비대칭인 ITR 쌍"으로도 지칭됨)는, 전체 길이에 걸쳐 역 보체가 아닌 단일 합성 AAV 게놈 내 ITR의 쌍을 나타낸다. 하나의 비제한적인 예로서, 비대칭인 ITR 쌍은 3D 구조가 기하학적 공간에서 상이한 형상이 되도록 이의 동족 ITR과 대칭인 3차원 공간 구성을 갖지 않는다. 달리 말하면, 비대칭 ITR 쌍은 전체적인 기하 구조가 상이하며, 즉, 이들은 3D 공간에서 A, C-C' 및 B-B' 루프의 구성이 상이하다(예를 들어, 하나의 ITR은 동족 ITR과 비교하여 짧은 C-C' 아암 및/또는 짧은 B-B' 아암을 가질 수 있음). 2개의 ITR 사이의 서열 차이는 뉴클레오타이드 부가, 결실, 절단 또는 점 돌연변이 중 하나 이상으로 인한 것일 수 있다. 하나의 구현예에서, 비대칭 ITR 쌍 중 하나의 ITR은 야생형 AAV ITR 서열일 수 있고, 다른 하나의 ITR은 본원에 정의된 바와 같이 변형된 ITR(예를 들어, 비야생형 또는 합성 ITR 서열)일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 비대칭 ITR 쌍 중 어느 ITR도 야생형 AAV 서열이 아니며, 2개의 ITR은 기하학적 공간에서 상이한 형상을 갖는(즉, 전체 기하 구조가 상이한) 변형된 ITR이다. 일부 구현예에서, 비대칭 ITR 쌍 중 하나의 mod-ITR은 짧은 C-C' 아암을 가질 수 있고, 다른 하나의 ITR은 동족 비대칭 mod-ITR과 비교하여 상이한 3차원 공간 구성을 갖도록 상이한 변형(예를 들어, 단일 또는 짧은 B-B' 아암 등)을 가질 수 있다.
본원에 사용된 "대칭인 ITR"이라는 용어는, 야생형 또는 돌연변이된(예를 들어, 야생형에 비해 변형된) 데펜도바이러스 ITR 서열이고 전체 길이에 걸쳐 역 보체인, 단일가닥 AAV 게놈 내 ITR의 쌍을 나타낸다. 하나의 비제한적인 예에서, 두 개의 ITR은 모두 AAV2 유래의 야생형 ITR 서열이다. 또 다른 예에서, ITR 중 어느 것도 야생형 ITR AAV2 서열이 아니며(즉, 이는 변형된 ITR이며, 돌연변이 ITR로도 지칭됨), 뉴클레오타이드 부가, 결실, 치환, 절단 또는 점 돌연변이로 인해 야생형 ITR의 서열과 차이가 있을 수 있다. 본원에서 편의를 위해, 합성 AAV 벡터 내 발현 카세트의 5'(업스트림)에 위치한 ITR은 "5' ITR" 또는 "좌측 ITR"로 지칭되고, 합성 AAV 벡터 내 발현 카세트의 3'(다운스트림)에 위치한 ITR은 "3' ITR" 또는 "우측 ITR"로 지칭된다.
본원에 사용된 "실질적으로 대칭인 변형된 ITR" 또는 "실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍"이라는 용어는, 둘 모두 이의 전체 길이에 걸쳐 역 보체 서열을 갖는 합성 AAV 내 변형된 ITR의 쌍을 나타낸다. 예를 들어, 변형된 ITR은, 역 보체 서열에서 벗어난 일부 뉴클레오타이드 서열을 갖더라도, 변화가 특성 및 전체 형상에 영향을 미치지 않는 한, 실질적으로 대칭인 것으로 간주될 수 있다. 하나의 비제한적인 예로서, 기본형 서열과 적어도 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖고(기본 설정으로 BLAST를 사용하여 측정 시), 또한 기하학적 공간에서의 3D 구조가 동일한 형상이 되도록 동족 변형된 ITR에 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는 서열. 달리 말하면, 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍은 3D 공간에 구성된 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 갖는다. 일부 구현예에서, mod-ITR 쌍으로부터의 ITR은 상이한 역 보체 뉴클레오타이드 서열을 갖지만, 여전히 동일한 대칭인 3차원 공간 구성을 가질 수 있으며, 즉, 두 개의 ITR은 동일한 전체 3D 형상을 생성하는 돌연변이를 갖는다. 예를 들어, mod-ITR 쌍에서 하나의 ITR(예를 들어, 5' ITR)은 하나의 혈청형에서 유래할 수 있고, 다른 하나의 ITR(예를 들어, 3' ITR)은 상이한 혈청형에서 유래할 수 있지만, 두 가지 모두 동일한 상응하는 돌연변이를 가질 수 있으므로(예를 들어, 5' ITR이 C 영역에 결실을 갖는 경우, 상이한 혈청형으로부터의 동족의 변형된 3' ITR은 C' 영역의 상응하는 위치에 결실을 가짐), 변형된 ITR 쌍은 동일한 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는다. 이러한 구현예에서, 변형된 ITR 쌍의 각각의 ITR은 상이한 혈청형(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12), 예컨대 AAV2와 AAV6의 조합에서 유래할 수 있으며, 여기서 하나의 ITR에서의 변형은 상이한 혈청형의 동족 ITR 내 상응하는 위치에 반영된다. 하나의 구현예에서, 실질적으로 대칭인 변형된 ITR 쌍은, ITR 사이의 뉴클레오타이드 서열 차이가 특성 또는 전체 형상에 영향을 미치지 않고 이들이 3D 공간에서 실질적으로 동일한 형상을 갖는 한, 변형된 ITR(mod-ITR)의 쌍을 나타낸다. 비제한적인 예로서, mod-ITR은 기본 설정의 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)(BLASTN)와 같은 당업계에 널리 공지된 표준 수단에 의해 측정 시 기본형 mod-ITR과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖고, 또한 기하학적 공간에서의 3D 구조가 동일한 형상이 되도록 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는다. 실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍은 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 가지며, 예를 들어 실질적으로 대칭인 mod-ITR 쌍에서 변형된 ITR이 C-C' 아암의 결실을 갖는 경우, 동족 mod-ITR은 C-C' 루프의 상응하는 결실을 갖고, 또한 이의 동족 mod-ITR의 기하학적 공간에서 동일한 형상으로 나머지 A 및 B-B' 루프의 유사한 3D 구조를 갖는다.
본원에 사용된 활성제 또는 치료제, 예컨대 치료용 핵산의 "유효량" 또는 "치료적 유효량"이라는 구절은, 목적하는 효과, 예를 들어 치료용 핵산의 부재 하에서 검출된 발현 수준과 비교하여 표적 서열의 발현 저해를 생성하는 데 충분한 양이다. 표적 유전자 또는 표적 서열의 발현을 측정하는 데 적합한 검정에는, 예를 들어 도트 블롯(dot blot), 노던 블롯(northern blot), 제자리 혼성화, ELISA, 면역침강, 효소 기능과 같은 당업자에게 공지된 기술뿐 아니라, 당업자에게 공지된 표현형 검정을 사용하는 단백질 또는 RNA 수준의 검사가 포함된다.
본원에 사용된 "발현"이라는 용어는, 적용 가능한 경우, 비제한적으로, 예를 들어 전사, 전사체 처리, 번역 및 단백질 폴딩, 변형 및 처리를 포함하는, RNA 및 단백질의 생산, 및 적절한 경우, 단백질 분비에 관여하는 세포 과정을 나타내는 것으로 여겨진다. 본원에 사용된 "발현 산물"이라는 구절에는, 유전자에서 전사된 RNA(예를 들어, 전이유전자), 및 유전자에서 전사된 mRNA의 번역에 의해 수득된 폴리펩타이드가 포함된다.
본원에 사용된 "발현 벡터"라는 용어는, 벡터 상의 전사 조절 서열에 연결된 서열로부터 RNA 또는 폴리펩타이드의 발현을 지시하는 벡터를 나타내는 것으로 여겨진다. 발현된 서열은 종종, 반드시는 아니지만, 숙주세포에 대해 이종성일 수 있다. 발현 벡터는 추가 요소를 포함할 수 있으며, 예를 들어 발현 벡터는 2개의 복제 시스템을 가질 수 있기 때문에, 2가지 유기체에서, 예를 들어 인간 세포에서 발현을 위해, 원핵 숙주에서 클로닝 및 증폭을 위해 유지될 수 있다. 발현 벡터는 재조합 벡터일 수 있다.
본원에 사용된 "플랭킹"이라는 용어는, 또 다른 핵산 서열에 대한 하나의 핵산 서열의 상대적인 위치를 나타내는 것으로 여겨진다. 일반적으로, 서열 ABC에서, B에는 A와 C가 플랭킹되어 있다. 이는 배열 AxBxC에 대해서도 동일하게 적용된다. 따라서, 플랭킹 서열은 플랭킹된 서열의 앞에 있거나 뒤에 있지만, 플랭킹된 서열에 인접하거나 바로 근접할 필요는 없다.
본원에 사용된 "스페이서 영역"이라는 용어는, 벡터 또는 게놈에서 기능성 요소를 분리하는 개재 서열을 나타내는 것으로 여겨진다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 최적의 기능을 위해 2개의 기능성 요소를 목적하는 거리로 유지시킨다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 벡터 또는 게놈의 유전적 안정성을 제공하거나 부가한다. 일부 구현예에서, 스페이서 영역은 클로닝 부위를 위한 편리한 위치 및 염기쌍의 디자인 번호의 갭을 제공하여 게놈의 준비된 유전자 조작을 용이하게 한다.
본원에 사용된 "발현 카세트" 및 "발현 유닛"이라는 용어는 상호교환적으로 사용되며, DNA 벡터, 예를 들어 합성 AAV 벡터의 전이유전자의 전사를 지시하는 데 충분한 프로모터 또는 다른 DNA 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 이종 DNA 서열을 나타낸다. 적합한 프로모터에는, 예를 들어 조직 특이적 프로모터가 포함된다. 프로모터는 또한 AAV 기원일 수 있다.
본원에 사용된 "유전 질환" 또는 "유전적 장애"라는 구절은, 부분적으로 또는 완전히, 직접적으로 또는 간접적으로, 게놈 내 하나 이상의 비정상에 의해 유발된 질환으로, 특히 출생 시부터 존재한 병태를 포함하는 질환을 나타내는 것으로 여겨진다. 비정상은 유전자에서의 돌연변이, 삽입 또는 결실일 수 있다. 비정상은 유전자의 코딩 서열 또는 이의 조절 서열에 영향을 미칠 수 있다.
본원에 사용된 "지질"이라는 용어는, 비제한적으로, 지방산의 에스테르를 포함하고, 물에서는 불용성이지만, 다수의 유기 용매에서는 가용성인 것을 특징으로 하는 유기 화합물의 군을 나타내는 것으로 여겨진다. 이는 통상적으로 적어도 3가지 부류로 분류된다: (1) 지방 및 오일뿐 아니라 왁스를 포함하는 "단순 지질"; (2) 인지질 및 당지질을 포함하는 "복합 지질"; 및 (3) 스테로이드와 같은 "유도된 지질".
인지질의 대표적인 예에는, 비제한적으로, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티드산, 팔미토일올레오일포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린 및 디리놀레오일포스파티딜콜린이 포함된다. 스핑고지질, 글리코스핑고지질 패밀리, 디아실글리세롤 및 β-아실옥시산과 같은 인이 결여된 다른 화합물도, 양친매성 지질로 지정된 군에 속한다. 또한, 상기 기재된 양친매성 지질은 트리글리세리드와 스테롤을 비롯한 다른 지질과 혼합될 수 있다.
하나의 구현예에서, 지질 조성물은 하나 이상의 3차 아미노기, 하나 이상의 페닐 에스테르 결합 및 디설파이드 결합을 포함한다.
본원에 사용된 "지질 접합체"라는 용어는, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 응집을 저해하는 접합된 지질을 나타내는 것으로 여겨진다. 이러한 지질 접합체에는, 비제한적으로, 예를 들어 디알킬옥시프로필에 커플링된 PEG(예를 들어, PEG-DAA 접합체), 디아실글리세롤에 커플링된 PEG(예를 들어, PEG-DAG 접합체), 콜레스테롤에 커플링된 PEG, 포스파티딜에탄올아민에 커플링된 PEG 및 세라미드에 접합된 PEG(예를 들어, 미국 특허 제5,885,613호 참조)와 같은 PEG화된 지질, 양이온성 PEG 지질, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 접합체(예를 들어, POZ-DAA 접합체; 예를 들어 2010년 1월 13일자 출원된 미국 임시 출원 제61/294,828호 및 2010년 1월 14일자 출원된 미국 임시 출원 제61/295,140호 참조), 폴리아미드 올리고머(예를 들어, ATTA-지질 접합체), 및 이들의 혼합물이 포함된다. POZ-지질 접합체의 추가의 예는, 국제 특허 출원 공개공보 WO 2010/006282에 기재되어 있다. PEG 또는 POZ는 지질에 직접 접합되거나, 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. PEG 또는 POZ를 지질에 커플링시키는 데 적합한 임의의 링커 모이어티가 사용될 수 있으며, 이에는, 예를 들어 비에스테르 함유 링커 모이어티와 에스테르 함유 링커 모이어티가 포함된다. 특정 바람직한 구현예에서, 아미드 또는 카르바메이트와 같은 비에스테르 함유 링커 모이어티가 사용된다. 상기 특허 문헌 각각의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
본원에 사용된 "지질 캡슐화(된)"라는 용어는, 핵산(예를 들어, ceDNA)과 같은 활성제 또는 치료제가 완전 캡슐화, 부분 캡슐화, 또는 둘 모두가 되도록 하는 지질 입자를 나타낸다. 바람직한 구현예에서, 핵산은 지질 입자에 완전히 캡슐화되어 있다(예를 들어, 핵산 함유 지질 입자를 형성함).
본원에 사용된 "지질 입자" 또는 "지질 나노입자"라는 용어는, 핵산 치료제와 같은 치료제를 관심 표적 부위(예를 들어, 세포, 조직, 기관 등)로 전달하는 데 사용될 수 있는 지질 제형을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 본 개시내용의 지질 입자는 전형적으로 양이온성 지질, 비양이온성 지질, 및 선택적으로 입자의 응집을 방지하는 접합된 지질로 형성된 핵산 함유 지질 입자이다. 다른 바람직한 구현예에서, 치료용 핵산과 같은 치료제는 입자의 지질 부분에 캡슐화되어, 효소적 분해로부터 보호될 수 있다. 하나의 구현예에서, 지질 입자는 핵산(예를 들어, ceDNA)과, 하나 이상의 3차 아미노기, 하나 이상의 페닐 에스테르 결합 및 디설파이드 결합을 포함하는 지질을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 본 개시내용의 지질 입자의 크기는 전형적으로 평균 직경이 약 20 nm 내지 약 75 nm, 약 20 nm 내지 약 70 nm, 약 25 nm 내지 약 75 nm, 약 25 nm 내지 약 70 nm, 약 30 nm 내지 약 75 nm, 약 30 nm 내지 약 70 nm, 약 35 nm 내지 약 75 nm, 약 35 nm 내지 약 70 nm, 약 40 nm 내지 약 75 nm, 약 40 nm 내지 약 70 nm, 약 45 nm 내지 약 75 nm, 약 50 nm 내지 약 75 nm, 약 50 nm 내지 약 70 nm, 약 60 nm 내지 약 75 nm, 약 60 nm 내지 약 70 nm, 약 65 nm 내지 약 75 nm, 약 65 nm 내지 약 70 nm, 또는 약 20 nm, 약 25 nm, 약 30 nm, 약 35 nm, 약 40 nm, 약 45 nm, 약 50 nm, 약 51 nm, 약 52 nm, 약 53 nm, 약 54 nm, 약 55 nm, 약 56 nm, 약 57 nm, 약 58 nm, 약 59 nm 약 60 nm, 약 61 nm, 약 62 nm, 약 63 nm, 약 64 nm, 약 65 nm, 약 66 nm, 약 67 nm, 약 68 nm, 약 69 nm, 약 70 nm, 약 71 nm, 약 72 nm, 약 73 nm, 약 74 nm 또는 약 75 nm(± 3 nm)이다.
일반적으로, 본 개시내용의 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 의도된 치료 효과를 제공하도록 선택된 평균 직경을 갖는다.
일부 구현예에 따르면, 본 개시내용의 지질 입자의 크기는 전형적으로 평균 직경이 약 75 nm 미만, 약 70 nm 미만, 약 65 nm 미만, 약 60 nm 미만, 약 55 nm 미만, 약 50 nm 미만, 약 45 nm 미만, 약 40 nm 미만, 약 35 nm 미만, 약 30 nm 미만, 약 25 nm 미만, 약 20 nm 미만이다.
본원에 사용된 "양이온성 지질"이라는 용어는, 생리학적 pH에서 양으로 하전되는 임의의 지질을 나타낸다. 지질 입자 내 양이온성 지질은, 예를 들어 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLenDMA), 1,2-디-γ-리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(γ-DLenDMA), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-C2-DMA), 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-K-DMA), "SS-절단 가능한 지질", 또는 이들의 혼합물과 같은 하나 이상의 양이온성 지질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 또한 이온화 가능한 지질, 즉, 이온화 가능한 양이온성 지질이다. 본원에 기재된 모든 양이온성 지질의 상응하는 4차 지질(즉, 양이온성 모이어티 내 질소 원자가 양성자화되고, 4개의 치환기를 가짐)은 본 개시내용의 범위 내에서 고려된다. 본원에 기재된 임의의 양이온성 지질은, 예를 들어 아세토니트릴(CH3CN) 및 클로로포름(CHCl3) 중 클로로메탄(CH3Cl)으로의 처리에 의해 상응하는 4차 지질로 전환될 수 있다.
본원에 사용된 "음이온성 지질"이라는 용어는, 생리학적 pH에서 음으로 하전된 임의의 지질을 나타낸다. 이러한 지질에는, 비제한적으로, 포스파티딜글리세롤, 카디오리핀, 디아실포스파티딜세린, 디아실포스파티드산, N-도데카노일포스파티딜에탄올아민, N-숙시닐포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴포스파티딜에탄올아민, 리실포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 및 중성 지질에 연결된 기타 음이온성 변형기가 포함된다.
본원에 사용된 "소수성 지질"이라는 용어는, 비제한적으로, 장쇄 포화 및 불포화 지방족 탄화수소기, 및 하나 이상의 방향족, 지환족 또는 헤테로시클릭 기(들)로 선택적으로 치환된 이러한 기를 포함하는 비(非)극성기를 갖는 화합물을 나타낸다. 적합한 예에는, 비제한적으로, 디아실글리세롤, 디알킬글리세롤, N,N-디알킬아미노, 1,2-디아실옥시-3-아미노프로판 및 1,2-디알킬-3-아미노프로판이 포함된다.
본원에 사용된 "이온화 가능한 지질"이라는 용어는, 지질이 생리학적 pH(예를 들어, pH 7.4) 이하에서는 양으로 하전되고, 제2 pH, 바람직하게는 생리학적 pH 이상에서는 중성이 되도록, 적어도 하나의 양성자화 가능한 또는 탈양성자화 가능한 기를 갖는 지질, 예를 들어 양이온성 지질을 나타내는 것으로 여겨진다. 당업자는, pH의 함수로서 양성자의 부가 또는 제거가 평형 과정이고, 하전된 또는 중성 지질에 대한 언급은 우세한 종의 성질을 나타내며, 모든 지질이 하전된 또는 중성 형태로 존재할 필요가 없다는 것을 이해할 것이다. 일반적으로, 이온화 가능한 지질의 양성자화 가능한 기의 pKa는 약 4 내지 약 7 범위이다. 일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 "절단 가능한 지질" 또는 "SS-절단 가능한 지질"을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "중성 지질"이라는 용어는, 선택된 pH에서 하전되지 않은 또는 중성의 쯔비터이온(zwitterionic) 형태로 존재하는 다수의 지질 종 중 임의의 것을 나타내는 것으로 여겨진다. 생리학적 pH에서, 이러한 지질에는, 예를 들어 디아실포스파티딜콜린, 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라미드, 스핑고미엘린, 세팔린, 콜레스테롤, 세레브로시드 및 디아실글리세롤이 포함된다.
본원에 사용된 "비양이온성 지질"이라는 용어는, 임의의 양친매성 지질뿐 아니라, 임의의 다른 중성 지질 또는 음이온성 지질을 나타내는 것으로 여겨진다.
본원에 사용된 "절단 가능한 지질" 또는 "SS-절단 가능한 지질"이라는 용어는, 디설파이드 결합 절단 가능한 단위를 포함하는 지질을 나타낸다. 절단 가능한 지질은 pH 민감성 3차 아민과 자가 분해 가능한 페닐 에스테르를 포함하는, 절단 가능한 디설파이드 결합("ss") 함유 지질 유사 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, SS-절단 가능한 지질은 ss-OP 지질(COATSOME® SS-OP), ss-M 지질(COATSOME® SS-M), ss-E 지질(COATSOME® SS-E), ss-EC 지질(COATSOME® SS-EC), ss-LC 지질(COATSOME® SS-LC), ss-OC 지질(COATSOME® SS-OC) 및 ss-PalmE 지질(예를 들어, 화학식 I 내지 화학식 IV 참조), 또는 문헌[Togashi et al., (2018) Journal of Controlled Release "A hepatic pDNA delivery system based on an intracellular environment sensitive vitamin E -scaffold lipid-like material with the aid of an anti-inflammatory drug" 279:262-270]에 기재된 지질일 수 있다. 절단 가능한 지질의 추가 예는 미국 특허 제9,708,628호와 미국 특허 제10,385,030호에 기재되어 있으며, 상기 문헌들의 모든 내용은 본원에 참조로 인용된다. 하나의 구현예에서, 절단 가능한 지질은 막 불안정화를 위해 산성 구획, 예를 들어 엔도솜 또는 리소좀에 반응하는 3차 아민과, 세포질과 같은 환원 환경에서 절단될 수 있는 디설파이드 결합을 포함한다. 하나의 구현예에서, 절단 가능한 지질은 양이온성 지질이다. 하나의 구현예에서, 절단 가능한 지질은 이온화 가능한 양이온성 지질이다. 절단 가능한 지질은 본원에 보다 상세하게 기재되어 있다.
본원에 사용된 "유기 지질 용액"이라는 용어는, 지질을 갖는 유기 용매를, 전체적으로 또는 부분적으로, 포함하는 조성물을 나타내는 것으로 여겨진다.
본원에 사용된 "리포솜"이라는 용어는, 수성 외부와 분리된 내부 수성 용적을 캡슐화하는 구형 구성으로 어셈블링된 지질 분자를 나타내는 것으로 여겨진다. 리포솜은 적어도 하나의 지질 이중층을 보유하는 소포이다. 리포솜은 의약품 개발의 맥락에서 약물/치료제 전달을 위한 담체로서 전형적으로 사용된다. 이는, 세포막과 융합하고 지질 구조를 재배치하여 약물 또는 활성 약학 성분을 전달하는 방식으로 작동한다. 이러한 전달을 위한 리포솜 조성물은 전형적으로 인지질, 특히 포스파티딜콜린기를 갖는 화합물로 구성되지만, 이러한 조성물은 다른 지질을 또한 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "국소 전달"이라는 용어는, 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)와 같은 활성제를 유기체 내 표적 부위에 직접 전달하는 것을 나타내는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 작용제는 종양과 같은 질환 부위 또는 염증 부위와 같은 다른 표적 부위, 또는 간, 심장, 췌장, 신장 등과 같은 표적 기관에 직접 주사하는 방식으로 국소적으로 전달될 수 있다.
본원에 사용된 "핵산"이라는 용어는, 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 적어도 2개의 뉴클레오타이드를 함유하는 중합체(즉, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드)를 나타내는 것으로 여겨지며, 이에는 DNA, RNA 및 이의 혼성체가 포함된다. DNA는, 예를 들어 안티센스 분자, 플라스미드 DNA, DNA-DNA 이중체, 사전 축합된 DNA, PCR 산물, 벡터(P1, PAC, BAC, YAC, 인공 염색체), 발현 카세트, 키메라 서열, 염색체 DNA, 또는 이러한 그룹의 유도체 및 조합의 형태일 수 있다. DNA는 미니서클, 플라스미드, 박미드, 미니유전자, 미니스트링 DNA(선형의 공유결합으로 폐쇄된 DNA 벡터), 폐쇄형 선형 이중체 DNA(CELiD 또는 ceDNA), doggybone™ DNA, 덤벨형 DNA, 최소 면역학적으로 정의된 유전자 발현(MIDGE) 벡터, 바이러스성 벡터 또는 비바이러스성 벡터의 형태일 수 있다. RNA는 소형 간섭 RNA(siRNA), 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), mRNA, rRNA, tRNA, 바이러스성 RNA(vRNA) 및 이들의 조합의 형태일 수 있다. 핵산에는, 합성, 자연 발생 및 비자연 발생이고, 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는, 공지된 뉴클레오타이드 유사체, 또는 변형된 백본 잔기 또는 연결을 함유하는 핵산이 포함된다. 이러한 유사체 및/또는 변형된 잔기의 예에는, 비제한적으로, 포스포로티오에이트, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(모르폴리노), 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2'-O-메틸 리보뉴클레오타이드, 잠금 핵산(LNA™) 및 펩타이드 핵산(PNA)이 포함된다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는 천연 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 퇴화 코돈 치환), 대립유전자, 동원체(ortholog), SNP 및 상보적 서열뿐 아니라, 명백하게 제시된 서열을 암시적으로 포함한다.
본원에 사용된 "핵산 치료제", "치료용 핵산" 및 "TNA"라는 구절은 상호교환적으로 사용되며, 질환 또는 장애를 치료하기 위한 치료제의 활성 성분으로서 핵산을 사용하는 임의의 치료 양식을 나타낸다. 본원에 사용된 이러한 구절은 RNA 기반 치료제와 DNA 기반 치료제를 나타낸다. RNA 기반 치료제의 비제한적인 예에는, mRNA, 안티센스 RNA 및 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 압타머, 간섭 RNA(RNAi), 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA)가 포함된다. DNA 기반 치료제의 비제한적인 예에는, 미니서클 DNA, 미니유전자, 바이러스성 DNA(예를 들어, 렌티바이러스 또는 AAV 게놈) 또는 비바이러스성 합성 DNA 벡터, 폐쇄형 선형 이중체 DNA(ceDNA/CELiD), 플라스미드, 박미드, DOGGYBONE™ DNA 벡터, 최소한으로 면역학적으로 정의된 유전자 발현(MIDGE) 벡터, 비바이러스성 미니스트링 DNA 벡터(선형의 공유결합으로 폐쇄된 DNA 벡터) 또는 덤벨형 DNA 최소 벡터("덤벨 DNA")가 포함된다.
본원에 사용된 "뉴클레오타이드"는, 당 옥시리보오스(DNA) 또는 리보오스(RNA), 염기, 및 포스페이트기를 함유한다. 뉴클레오타이드는 포스페이트기를 통해 함께 연결된다.
본원에 사용된 "약학적으로 허용 가능한 담체"라는 용어는, 인산염 완충 식염수 용액, 물, 수중유 또는 유중수 에멀젼과 같은 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤화제와 같은 표준 약학적 담체 중 임의의 것을 포함한다. 상기 용어는 또한 인간을 포함하는 동물에 사용하기 위해 미국 연방 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전에 열거된 작용제 중 임의의 것뿐 아니라, 대상에게 유의한 자극을 유발하지 않고, 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 없애지 않는 임의의 담체 또는 희석제를 포함한다.
본원에 사용된 "갭"이라는 용어는, 다르게는 이중가닥 ceDNA에서 단일가닥 DNA 부분의 스트레치를 형성하는, 본 개시내용의 합성 DNA 벡터의 중단된 부분을 나타내는 것으로 여겨진다. 갭은 이중체 DNA의 하나의 가닥에서 1개 염기쌍 내지 100개 염기쌍 길이일 수 있다. 본원에 기재된 방법에 의해 설계되고 형성된 전형적인 갭, 및 이러한 방법에 의해 생성된 합성 벡터는, 예를 들어 길이가 1 bp, 2 bp, 3 bp, 4 bp, 5 bp, 6 bp, 7 bp, 8 bp, 9 bp, 10 bp, 11 bp, 12 bp, 13 bp, 14 bp, 15 bp, 16 bp, 17 bp, 18 bp, 19 bp, 20 bp, 21 bp, 22 bp, 23 bp, 24 bp, 25 bp, 26 bp, 27 bp, 28 bp, 29 bp, 30 bp, 31 bp, 32 bp, 33 bp, 34 bp, 35 bp, 36 bp, 37 bp, 38 bp, 39 bp, 40 bp, 41 bp, 42 bp, 43 bp, 44 bp, 45 bp, 46 bp, 47 bp, 48 bp, 49 bp, 50 bp, 51 bp, 52 bp, 53 bp, 54 bp, 55 bp, 56 bp, 57 bp, 58 bp, 59 bp, 또는 60 bp일 수 있다. 본 개시내용에 예시된 갭은 길이가 1 bp 내지 10 bp, 1 bp 내지 20 bp, 1 bp 내지 30 bp일 수 있다.
본원에 사용된 "닉"이라는 용어는, 전형적으로 손상 또는 효소 작용을 통해 하나의 가닥의 인접한 뉴클레오타이드들 사이에 포스포디에스테르 결합이 없는 이중가닥 DNA 분자 내 불연속 부분을 나타낸다. 하나 이상의 닉은 DNA 복제 동안 가닥 내 비틀림의 해제를 가능하게 하고, 닉은 또한 전사 기구의 결합을 용이하게 하는 역할을 하는 것으로 여겨진다.
본원에 사용된 "대상"이라는 용어는, 본 개시내용에 따른 치료용 핵산으로 치료(예방적 치료 포함)가 제공되는 인간 또는 동물을 나타내는 것으로 여겨진다. 통상적으로, 동물은, 비제한적으로, 영장류, 설치류, 가축 또는 사냥감 동물과 같은 척추동물이다. 영장류에는, 비제한적으로, 침팬지, 시노몰구스 원숭이, 스파이더 원숭이, 및 마카크(macaque), 예를 들어 레서스(Rhesus)가 포함된다. 설치류에는, 마우스, 래트, 마멋(woodchuck), 페럿(ferret), 토끼 및 햄스터가 포함된다. 가축 및 사냥감 동물에는, 비제한적으로, 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 버팔로, 고양이과 종류(예를 들어, 집고양이), 갯과 종류(예를 들어, 개, 여우, 늑대), 조류(예를 들어, 닭, 에뮤, 타조) 및 어류(송어, 메기 및 연어)가 포함된다. 본원에 기재된 양태의 특정 구현예에서, 대상은 포유류, 예를 들어 영장류 또는 인간이다. 대상은 남성 또는 여성일 수 있다. 또한, 대상은 유아 또는 어린이일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상은 신생아 또는 태어나지 않은 대상, 예를 들어 자궁에 있는 대상일 수 있다. 바람직하게는, 대상은 포유류이다. 포유류는 인간, 비인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있지만, 이러한 예에 제한되지 않는다. 인간 이외의 포유류는 질환 및 장애의 동물 모델을 나타내는 대상으로 유리하게 사용될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 가축 및/또는 애완동물에 대해 사용될 수 있다. 인간 대상은 임의의 연령, 성별, 인종 또는 민족, 예를 들어 코카시안(백인), 아시아인, 아프리카인, 흑인, 아프리카계 미국인, 아프리카계 유럽인, 히스패닉계, 중동인 등일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상은 임상 설정에서의 환자 또는 다른 대상일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상은 이미 치료를 받고 있다. 일부 구현예에서, 대상은 배아, 태아, 신생아, 유아, 아동, 청소년 또는 성인이다. 일부 구현예에서, 대상은 인간 태아, 인간 신생아, 인간 유아, 인간 아동, 인간 청소년 또는 인간 성인이다. 일부 구현예에서, 대상은 동물 배아, 또는 비인간 배아 또는 비인간 영장류 배아이다. 일부 구현예에서, 대상은 인간 배아이다.
본원에 사용된 "이를 필요로 하는 대상"이라는 구절은, 이러한 구절의 맥락 및 용법이 달리 지시되지 않는 한, (i) 본원에 기재된 개시내용에 따른 ceDNA 지질 입자(또는ceDNA 지질 입자를 포함하는 약학적 조성물)를 투여받게 되는 대상, (ii) 본원에 기재된 개시내용에 따른 ceDNA 지질 입자(또는 ceDNA 지질 입자를 포함하는 약학적 조성물)를 투여받고 있는 대상; 또는 (iii) 본원에 기재된 개시내용에 따른 ceDNA 지질 입자(또는 ceDNA 지질 입자를 포함하는 약학적 조성물)를 투여받은 적이 있는 대상을 나타낸다.
본원에 사용된 "억제하다", "감소시키다", "방해하다", "저해하다" 및/또는 "줄이다" (및 유사 용어)라는 용어는, 일반적으로, 본래 값, 예측 값 또는 평균 값에 비해, 또는 대조군 조건에 비해, 농도, 수준, 기능, 활성 또는 거동을, 직접적으로 또는 간접적으로, 감소시키는 작용을 나타낸다.
본원에 사용된 "전신 전달"이라는 용어는, 유기체 내 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)와 같은 활성제의 광범위한 생체분포를 유도하는 지질 입자의 전달을 나타내는 것으로 여겨진다. 일부 투여 기술은 특정 작용제의 전신 전달로 이어질 수 있지만, 다른 것들은 그렇지 않다. 전신 전달은, 작용제의 유용한, 바람직하게는 치료적 양이 신체의 대부분에 노출되는 것을 의미한다. 광범위한 생체분포를 달성하기 위해서는, 일반적으로 작용제가 투여 부위에서 먼 질환 부위에 도달하기 전에 (예컨대, 일차 통과 기관(간, 폐 등)에 의해 또는 신속하고 비특이적인 세포 결합에 의해) 신속하게 분해되거나 제거되지 않도록 하는 혈액 수명을 필요로 한다. 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 전신 전달은, 예를 들어 정맥내, 피하 및 복강내를 포함하는 당업계에 공지된 임의의 수단을 통해 이루어질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 전신 전달은 정맥내 전달로 이루어진다.
본원에 사용된 활성제(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 지질 입자)의 "치료량", "치료적 유효량", "유효량" 또는 "약학적 유효량"이라는 용어는, 치료의 의도된 유익을 제공하는 데 충분한 양을 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 하지만, 투여량 수준은 질환의 유형, 환자의 연령, 체중, 성별 및 의학적 상태, 병태의 중증도, 투여 경로, 및 이용되는 특정 활성제를 포함하는 다양한 인자를 기반으로 한다. 따라서, 투여 요법은 광범위하게 달라질 수 있으나, 의사가 표준 방법을 사용하여 통상적으로 결정할 수 있다. 또한, "치료량", "치료적 유효량" 및 "약학적 유효량"이라는 용어는, 본원에 기재된 개시내용의 조성물의 예방적 또는 예방용 양을 포함한다. 본원에 기재된 개시내용의 예방적 또는 예방용 적용에서, 약학적 조성물 또는 약제는 질환, 장애 또는 병태에 걸리기 쉽거나 다르게는 이의 위험이 있는 환자에게, 질환, 장애 또는 병태, 이의 합병증, 및 질환, 장애 또는 병태의 발달 동안 나타나는 중간 병리학적 표현형의 생화학적, 조직학적 및/또는 거동적 증상을 포함하는, 질환, 장애 또는 병태의 위험을 제거 또는 감소시키거나, 이의 중증도를 감소시키거나, 또는 이의 발병을 지연시키는 데 충분한 양으로 투여된다. 최대 용량, 즉, 일부 의학적 판단에 따라 가장 안전한 용량이 사용되는 것이 일반적으로 바람직하다. "용량" 및 "투여량"이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 "치료 효과"라는 용어는, 바람직하고 유익한 것으로 판단되는 치료 결과를 나타낸다. 치료 효과는, 직접적으로 또는 간접적으로, 질환 발현의 억제, 감소 또는 제거를 포함할 수 있다. 치료 효과는 또한, 직접적으로 또는 간접적으로, 질환 발현 진행의 억제, 감소 또는 제거를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 임의의 치료제의 경우, 치료적 유효량은 초기에 예비 시험관내 연구 및/또는 동물 모델에서 결정될 수 있다. 치료적 유효 용량은 또한 인간 데이터로부터 결정될 수 있다. 적용되는 용량은 투여된 화합물의 상대적인 생체이용률 및 효능을 기반으로 조정될 수 있다. 상기 기재된 방법 및 다른 널리 공지된 방법을 기반으로 최대 효능을 달성하기 위해 용량을 조정하는 것은, 당업자의 능력에 속한다. 문헌[Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th Edition, McGraw-Hill (New York) (2001)](상기 문헌은 본원에 참조로 인용됨)의 챕터 1에서 확인할 수 있는 치료 효과를 결정하는 일반 원리가 하기에 요약되어 있다.
약동학적 원리는, 허용 가능하지 않은 부작용을 최소화하면서 목적하는 정도의 치료 효능을 얻기 위해 투여 요법을 변경하는 기반을 제공한다. 약물의 혈장 농도가 측정될 수 있고 이것이 치료 범위와 관련이 있는 상황에서, 투여량 변경을 위한 추가 지침을 얻을 수 있다.
본원에 사용된 "치료하다", "치료하는" 및/또는 "치료"라는 용어는, 병태의 진행을 중단시키거나, 실질적으로 저해하거나, 느리게 하거나 또는 역전시키는 것; 병태의 임상 증상을 실질적으로 개선하는 것; 또는 병태의 임상 증상의 출현을 실질적으로 예방하는 것을 통해 유익하거나 목적하는 임상 결과를 수득하는 것을 포함한다. 치료는 나아가 다음 중 하나 이상을 달성하는 것을 나타낸다: (a) 장애의 중증도를 감소시키는 것; (b) 치료하고자 하는 장애(들)의 특징적인 증상의 발달을 제한하는 것; (c) 치료하고자 하는 장애(들)의 특징적인 증상의 악화를 제한하는 것; (d) 이전에 장애(들)를 앓았던 환자에서 장애(들)의 재발을 제한하는 것; 및 (e) 장애(들)에 대해 이전에 증상이 없었던 환자에서 증상의 재발을 제한하는 것.
약리학적 및/또는 생리학적 효과와 같은 유익하거나 목적하는 임상 결과에는, 비제한적으로, 질환, 장애 또는 병태에 걸리기 쉬울 수 있지만, 질환의 증상을 아직 경험하지 않았거나 나타내지 않은 대상에서 질환, 장애 또는 병태의 발생을 예방하는 것(예방적 치료), 질환, 장애 또는 병태의 증상 경감, 질환, 장애 또는 병태의 정도 감소, 질환, 장애 또는 병태의 안정화(즉, 악화시키지 않음), 질환, 장애 또는 병태의 확산 예방, 질환, 장애 또는 병태 진행의 지연 또는 늦추기, 질환, 장애 또는 병태의 개선 또는 완화, 및 이들의 조합뿐 아니라, 치료를 받지 않은 경우 예상되는 생존기간에 비해 생존기간을 연장시키는 것.
약리학적 및/또는 생리학적 효과와 같은 유익하거나 목적하는 임상 결과에는, 비제한적으로, 질환, 장애 또는 병태에 걸리기 쉬울 수 있지만, 질환의 증상을 아직 경험하지 않았거나 나타내지 않은 대상에서 질환, 장애 또는 병태의 발생을 예방하는 것(예방적 치료), 질환, 장애 또는 병태의 증상 경감, 질환, 장애 또는 병태의 정도 감소, 질환, 장애 또는 병태의 안정화(즉, 악화시키지 않음), 질환, 장애 또는 병태의 확산 예방, 질환, 장애 또는 병태 진행의 지연 또는 늦추기, 질환, 장애 또는 병태의 개선 또는 완화, 및 이들의 조합뿐 아니라, 치료를 받지 않은 경우 예상되는 생존기간에 비해 생존기간을 연장시키는 것.
본원에 사용된 "알킬"이라는 용어는, 탄소수 1 내지 20의 포화된 1가 탄화수소 라디칼(즉, C1-20 알킬)을 나타낸다. "1가"는, 알킬이 분자의 나머지 부분에 대해 하나의 부착점을 갖는다는 것을 의미한다. 하나의 구현예에서, 알킬은 1개 내지 12개의 탄소 원자(즉, C1-12 알킬) 또는 1개 내지 10개의 탄소 원자(즉, C1-10 알킬)를 갖는다. 하나의 구현예에서, 알킬은 1개 내지 8개의 탄소 원자(즉, C1-8 알킬), 1개 내지 7개의 탄소 원자(즉, C1-7 알킬), 1개 내지 6개의 탄소 원자(즉, C1-6 알킬), 1개 내지 4개의 탄소 원자(즉, C1-4 알킬), 또는 1개 내지 3개의 탄소 원자(즉, C1-3 알킬)를 갖는다. 이의 예에는, 비제한적으로, 메틸, 에틸, 1-프로필, 2-프로필, 1-부틸, 2-메틸-1-프로필, 2-부틸, 2-메틸-2-프로필, 1-펜틸, 2-펜틸, 3-펜틸, 2-메틸-2-부틸, 3-메틸-2-부틸, 3-메틸-1-부틸, 2-메틸-1-부틸, 1-헥실, 2-헥실, 3-헥실, 2-메틸-2-펜틸, 3-메틸-2-펜틸, 4-메틸-2-펜틸, 3-메틸-3-펜틸, 2-메틸-3-펜틸, 2,3-디메틸-2-부틸, 3,3-디메틸-2-부틸, 1-헵틸, 1-옥틸 등이 포함된다. "선형 또는 분지형 C1-6 알킬", "선형 또는 분지형 C1-4 알킬" 또는 "선형 또는 분지형 C1-3 알킬"과 같은 선형 또는 분지형 알킬은, 포화된 1가 탄화수소 라디칼이 선형 또는 분지형 사슬이라는 것을 의미한다.
본원에 사용된 "알킬렌"이라는 용어는, 탄소수 1 내지 20의 포화된 2가 탄화수소 라디칼(즉, C1-20 알킬렌)을 나타내며, 이의 예에는, 비제한적으로, 상기 예시된 바와 같은 알킬기의 동일한 코어 구조를 갖는 것들이 포함된다. "2가"는, 알킬렌이 분자의 나머지 부분에 대해 2개의 부착점을 갖는다는 것을 의미한다. 하나의 구현예에서, 알킬렌은 1개 내지 12개의 탄소 원자(즉, C1-12 알킬렌) 또는 1개 내지 10개의 탄소 원자(즉, C1-10 알킬렌)를 갖는다. 하나의 구현예에서, 알킬렌은 1개 내지 8개의 탄소 원자(즉, C1-8 알킬렌), 1개 내지 7개의 탄소 원자(즉, C1-7 알킬렌), 1개 내지 6개의 탄소 원자(즉, C1-6 알킬렌), 1개 내지 4개의 탄소 원자(즉, C1-4 알킬렌), 1개 내지 3개의 탄소 원자(즉, C1-3 알킬렌), 에틸렌, 또는 메틸렌을 갖는다. "선형 또는 분지형 C1-6 알킬렌", "선형 또는 분지형 C1-4 알킬렌" 또는 "선형 또는 분지형 C1-3 알킬렌"과 같은 선형 또는 분지형 알킬렌은, 포화된 2가 탄화수소 라디칼이 선형 또는 분지형 사슬이라는 것을 의미한다.
"알케닐"이라는 용어는, 하나 이상(예를 들어, 1개 또는 2개)의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 직쇄 또는 분지형 지방족 탄화수소 라디칼을 나타내며, 여기서 알케닐 라디칼은 "시스" 및 "트랜스" 배향, 또는 대안적인 명명법에 따라 "E" 및 "Z" 배향을 갖는 라디칼을 포함한다.
본원에 사용된 "알케닐렌"은, 1개 또는 2개의 탄소-탄소 이중결합을 갖는 탄소수 2 내지 20의 지방족 2가 탄화수소 라디칼(즉, C2-20 알케닐렌)을 나타내며, 여기서 알케닐렌 라디칼에는 "시스" 및 "트랜스" 배향, 또는 대안적인 명명법에 따라, "E" 및 "Z" 배향을 갖는 라디칼이 포함된다. "2가"는, 알케닐렌이 분자의 나머지 부분에 대해 2개의 부착점을 갖는다는 것을 의미한다. 하나의 구현예에서, 알케닐렌은 2개 내지 12개의 탄소 원자(즉, C2-16 알케닐렌), 2개 내지 10개의 탄소 원자(즉, C2-10 알케닐렌)를 갖는다. 하나의 구현예에서, 알케닐렌은 2개 내지 4개의 탄소 원자(C2-4)를 갖는다. 이의 예에는, 비제한적으로, 에틸레닐렌 또는 비닐렌(-CH=CH-), 알릴(-CH2CH=CH-) 등이 포함된다. "선형 또는 분지형 C2-6 알케닐렌", "선형 또는 분지형 C2-4 알케닐렌" 또는 "선형 또는 분지형 C2-3 알케닐렌"과 같은 선형 또는 분지형 알케닐렌은, 불포화된 2가 탄화수소 라디칼이 선형 또는 분지형 사슬이라는 것을 의미한다.
본원에 사용된 "시클로알킬렌"은, 모노시클릭 고리로서 탄소수 3 내지 12, 또는 바이시클릭 고리로서 탄소수 7 내지 12의 2가 포화된 카르보시클릭 고리 라디칼을 나타낸다. "2가"는, 시클로알킬렌이 분자의 나머지 부분에 대해 2개의 부착점을 갖는다는 것을 의미한다. 하나의 구현예에서, 시클로알킬렌은 3원 내지 7원 모노시클릭 또는 3원 내지 6원 모노시클릭이다. 모노시클릭 시클로알킬기의 예에는, 비제한적으로, 시클로프로필렌, 시클로부틸렌, 시클로펜틸렌, 시클로헥실렌, 시클로헵틸렌, 시클로옥틸렌, 시클로노닐렌, 시클로데실렌, 시클로운데실렌, 시클로도데실렌 등이 포함된다. 하나의 구현예에서, 시클로알킬렌은 시클로프로필렌이다.
"헤테로사이클", "헤테로시클릴", "헤테로시클릭" 및 "헤테로시클릭 고리"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 적어도 하나의 N 원자를 함유하고, 헤테로원자 및 선택적으로 N 및 S에서 선택되는 1개 내지 3개의 추가의 헤테로원자를 갖고, 비(非)방향족인(즉, 부분적으로 또는 완전히 포화된) 시클릭기를 나타낸다. 이는 모노시클릭 또는 바이시클릭(브릿지형 또는 융합형)일 수 있다. 헤테로시클릭 고리의 예에는, 비제한적으로, 아지리디닐, 디아지리디닐, 티아지리디닐, 아제티디닐, 디아제티디닐, 트리아제티디닐, 티아디아제티디닐, 티아제티디닐, 피롤리디닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이소티아졸리디닐, 티아졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 헥사히드로피리미디닐, 아제파닐, 아조카닐 등이 포함된다. 헤테로사이클은 N 및 S에서 선택되는 동일하거나 상이할 수 있는 1개 내지 4개의 헤테로원자를 함유한다. 하나의 구현예에서, 헤테로사이클은 1개 내지 3개의 N 원자를 함유한다. 또 다른 구현예에서, 헤테로사이클은 1개 또는 2개의 N 원자를 함유한다. 또 다른 구현예에서, 헤테로사이클은 1개의 N 원자를 함유한다. "4원 내지 8원 헤테로시클릴"은, 모노시클릭 고리로 배열된 4개 내지 8개의 원자(N 및 S에서 선택되는 1개 내지 4개의 헤테로원자, 또는 1개 내지 3개의 N 원자, 또는 1개 또는 2개의 N 원자, 또는 1개의 N 원자를 포함함)를 갖는 라디칼을 의미한다. "5원 또는 6원 헤테로시클릴"은, 모노시클릭 고리로 배열된 5개 또는 6개의 원자(N 및 S에서 선택되는 1개 내지 4개의 헤테로원자, 또는 1개 내지 3개의 N 원자, 또는 1개 또는 2개의 N 원자, 또는 1개의 N 원자를 포함함)를 갖는 라디칼을 의미한다. "헤테로사이클"이라는 용어는, 모든 가능한 이성질체 형태를 포함하는 것으로 의도된다. 헤테로사이클은 문헌[Paquette, Leo A., Principles of Modern Heterocyclic Chemistry (W. A. Benjamin, New York, 1968)], 특히 챕터 1, 3, 4, 6, 7 및 9; 문헌[The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A Series of Monographs (John Wiley & Sons, New York, 1950에서 현재)], 특히 13권, 14권, 16권, 19권 및 28권; 및 문헌[ J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566]에 기재되어 있다. 헤테로시클릴기는, 가능한 경우, 분자의 나머지에 부착된 탄소(탄소 결합) 또는 질소(질소 결합)일 수 있다.
특정 기가 "선택적으로 치환된" 것으로 기재되는 경우, 해당 기는 (1) 치환되지 않거나, (2) 치환될 수 있다. 특정 기의 탄소가 치환기의 목록 중 하나 이상으로 선택적으로 치환된 것으로 기재되는 경우, 탄소 상의 수소 원자 중 하나 이상(존재하는 정도까지)은 별도로 및/또는 함께 독립적으로 선택된 선택적 치환기로 대체될 수 있다.
알킬, 알킬렌, 알케닐렌, 시클로알킬렌 및 헤테로시클릴에 적합한 치환기는, 이관능성 화합물의 생물학적 활성에 유의하게 부정적인 영향을 미치지 않는 것들이다. 달리 명시되지 않는 한, 이러한 기의 예시적인 치환기에는, 탄소수 1 내지 10의 선형, 분지형 또는 시클릭 알킬, 알케닐 또는 알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 할로겐, 구아니디늄 [-NH(C=NH)NH2], -OR100, NR101R102, -NO2, -NR101COR102, -SR100, -SOR101로 표시되는 설폭시드, -SO2R101로 표시되는 설폰, 설포네이트 -SO3M, 설페이트 -OSO3M, -SO2NR101R102로 표시되는 설폰아미드, 시아노, 아지도, -COR101, -OCOR101, -OCONR101R102, 및 폴리에틸렌글리콜 단위 (-OCH2CH2)nR101가 포함되며, 여기서, M은 H 또는 양이온(예컨대, Na+ 또는 K+)이고; R101, R102 및 R103은, 각각 독립적으로, H, 탄소수 1 내지 10의 선형, 분지형 또는 시클릭 알킬, 알케닐 또는 알키닐, 폴리에틸렌글리콜 단위 (-OCH2CH2)n-R104(여기서, n은 1 내지 24의 정수임), 탄소수 6 내지 10의 아릴, 탄소수 3 내지 10의 헤테로시클릭 고리, 및 탄소수 5 내지 10의 헤테로아릴에서 선택되고; R104는 H, 또는 탄소수 1 내지 4의 선형 또는 분지형 알킬이며, 여기서 R100, R101, R102, R103 및 R104로 표시되는 기에서 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로아릴 및 헤테로시클릴은 할로겐, -OH, -CN, -NO2, 및 탄소수 1 내지 4의 미치환된 선형 또는 분지형 알킬에서 독립적으로 선택되는 하나 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 그 이상)의 치환기로 선택적으로 치환된다. 바람직하게는, 상기 기재된 선택적으로 치환된 알킬, 알킬렌, 알케닐렌, 시클로알킬렌 및 헤테로시클릴에 대한 치환기는, 할로겐, -CN, -NR101R102, -CF3, -OR100, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, -SR101, -SOR101, -SO2R101 및 -SO3M으로 이루어지는 군에서 선택된다. 대안적으로, 적합한 치환기는 할로겐, -OH, -NO2, -CN, C1-4 알킬, -OR100, NR101R102, -NR101COR102, -SR100, -SO2R101, -SO2NR101R102, -COR101, -OCOR101 및 -OCONR101R102로 이루어지는 군에서 선택되며, 여기서 R100, R101 및 R102는, 각각 독립적으로, -H 또는 C1-4 알킬이다.
본원에 사용된 "할로겐"은, F, Cl, Br, 또는 I를 나타낸다. "시아노"는 -CN이다.
본원에 사용된 "아민" 또는 "아미노"는 상호교환적으로 사용되며, 고립 원자쌍(lone pair)을 갖는 염기성 질소 원자를 함유하는 관능기를 나타낸다.
본원에 사용된 "약학적으로 허용 가능한 염"이라는 용어는, 본 개시내용의 이온화 가능한 지질의 약학적으로 허용 가능한 유기 또는 무기 염을 나타낸다. 예시적인 염에는, 비제한적으로, 설페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 니트레이트, 바이설페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레에이트, 탄네이트, 판토테네이트, 바이타르트레이트, 아스코르베이트, 숙시네이트, 말레에이트, 겐티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄설포네이트 "메실레이트", 에탄설포네이트, 벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트, 파모에이트(즉, 1,1'-메틸렌비스(2-히드록시-3-나프토에이트)) 염, 알칼리 금속(예를 들어, 소듐 및 포타슘) 염, 알칼리 토금속(예를 들어, 마그네슘) 염 및 암모늄 염이 포함된다. 약학적으로 허용 가능한 염은 아세테이트 이온, 숙시네이트 이온 또는 다른 반대이온과 같은 또 다른 분자의 혼입을 포함할 수 있다. 반대이온은 모(parent) 화합물 상의 전하를 안정화시키는 임의의 유기 또는 무기 모이어티일 수 있다. 나아가, 약학적으로 허용 가능한 염은 이의 구조에 하나 초과의 하전된 원자를 가질 수 있다. 다수의 하전된 원자가 약학적으로 허용 가능한 염의 일부인 경우에는, 다수의 반대이온을 가질 수 있다. 따라서, 약학적으로 허용 가능한 염은 하나 이상의 하전된 원자 및/또는 하나 이상의 반대이온을 가질 수 있다.
본원에 개시된 대안적인 요소 또는 구현예의 그룹화는 제한으로 해석되어서는 안 된다. 각각의 그룹 구성원은 개별적으로, 또는 그룹의 다른 구성원 또는 본원에서 확인되는 다른 요소와 조합으로 참조되고 청구될 수 있다. 그룹의 하나 이상의 구성원은 편의성 및/또는 특허성의 이유로 그룹에 포함되거나, 그룹에서 결실될 수 있다. 임의의 이러한 포함 또는 결실이 발생하는 경우, 본 명세서는 본원에 변형된 그룹을 포함하는 것으로 간주되어 첨부된 청구범위에 사용된 모든 마쿠쉬(Markush) 그룹에 대한 서면 기재를 충족시킨다.
임의의 양태의 일부 구현예에서, 본원에 기재된 개시내용은 인간을 클로닝하는 방법, 인간의 생식계열 유전자 정체성을 변형시키는 방법, 산업적 또는 상업적 목적을 위한 인간 배아의 사용, 또는 인간 또는 동물에게의 임의의 실질적인 의학적 유익 없이 고통을 야기할 수 있는 동물의 유전적 정체성을 변형시키는 방법, 및 또한 이러한 방법의 결과로서의 동물에 관한 것이 아니다.
다른 용어는 본 개시내용의 다양한 양태의 설명 내에서 본원에 정의된 바와 같다.
본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 특허 및 다른 간행물(문헌 참조, 등록된 특허, 공개된 특허 출원 및 동시 계류중인 특허 출원 포함)은, 예를 들어 본원에 기재된 기술과 관련하여 사용될 수 있는 이러한 간행물에 기재된 방법론을 설명 및 개시하기 위한 목적으로 명백하게 본원에 참조로 인용된다. 이러한 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 개시내용에 대해서만 제공된다. 이와 관련하여, 선행 개시내용으로 인해 또는 임의의 다른 이유로, 본 발명자가 그러한 개시내용보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이러한 문서의 내용에 대한 날짜 또는 표현에 대한 모든 진술은 출원인이 이용 가능한 정보를 기반으로 하며, 이러한 문헌의 날짜 또는 내용의 정확성에 대한 승인을 구성하는 것으로 여겨지지 않는다.
본 개시내용의 구현예의 설명은 개시된 정확한 형태로 본 개시내용을 제한하거나, 완전한 것으로서 의도되지 않는다. 본 개시내용의 특정 구현예 및 이에 대한 예는 예시의 목적으로 본원에 기재되었으며, 당업자가 이해하는 바와 같이 본 개시내용의 범위 내에서 다양한 등가의 변형이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 방법 단계 또는 기능이 주어진 순서로 제시되어 있지만, 대안적인 구현예는 상이한 순서로 기능을 수행할 수 있거나, 기능들이 실질적으로 동시에 수행될 수 있다. 본원에 제공된 개시내용의 교시는 적절하게 다른 절차 또는 방법에 적용될 수 있다. 본원에 기재된 다양한 구현예는 조합되어 추가 구현예를 제공할 수 있다. 본 개시내용의 양태는, 필요한 경우, 본 개시내용의 추가의 구현예를 제공하기 위해 상기 참고문헌 및 적용의 조성물, 기능 및 개념을 이용하도록 변형될 수 있다. 나아가, 생물학적 기능 동등성을 고려할 때, 생물학적 또는 화학적 작용의 종류 또는 양에 영향을 미치지 않는 한 단백질 구조에 약간의 변경이 이루어질 수 있다. 이러한 및 다른 변경은 상세한 설명을 고려하여 이루어질 수 있다. 모든 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
전술한 구현예 중 임의의 것의 특정 요소는 조합되거나, 다른 구현예의 요소로 치환될 수 있다. 나아가, 본 개시내용의 특정 구현예와 관련된 이점이 이러한 구현예의 맥락에서 기재되어 있지만, 다른 구현예 또한 이러한 이점을 나타낼 수 있으며, 모든 구현예가 본 개시내용의 범위 내에 속하기 위해 반드시 이러한 이점을 나타낼 필요가 있는 것은 아니다.
본원에 기재된 기술은 하기 예에 의해 추가로 예시되며, 이러한 예는 어떠한 방식으로든 추가적인 제한으로 해석되어서는 안 된다. 본 개시내용이 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 어떠한 방식으로든 제한되지 않고, 달라질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 목적이며, 청구범위에 의해서만 한정되는 본 개시내용의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
II. 지질 나노입자 조성물
지질 나노입자(LNP)를 포함하는 약학적 조성물로서, 여기서 LNP는 지질과 강성 치료용 핵산(rTNA)을 포함하고, 여기서 LNP의 평균 직경은 약 20 nm 내지 약 70 nm인 약학적 조성물이 본원에 제공된다. 본원에 기재된 LNP는 크고 강성인 치료용 핵산 분자를 캡슐화할 수 있는 더 작은 크기를 포함하여 다수의 치료적 이점을 제공한다. 일부 구현예에 따르면, 지질은 양이온성 지질이다. 일부 구현예에 따르면, 강성 치료용 핵산은 폐쇄형 DNA(ceDNA)이다. 일부 구현예에 따르면, LNP는 비양이온성 지질을 추가로 포함한다. 일부 구현예에 따르면, LNP는 스테롤 또는 이의 유도체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에 따르면, LIP는 지질에 접합된 PEG를 추가로 포함한다.
양이온성 지질
일부 구현예에서, 평균 직경이 20 nm 내지 약 74 nm인 지질 나노입자는 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은, 예를 들어 비(非)융합원성(fusogenic) 양이온성 지질이다. "비융합원성 양이온성 지질"이란, ceDNA와 같은 핵산 카고를 응축 및/또는 캡슐화할 수 있지만, 융합 활성이 없거나 거의 없는 양이온성 지질을 의미한다.
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 하기 표 1에 열거된 국제 및 미국 특허 출원 공개공보에 기재되어 있으며, 예를 들어 막불투과성 형광 염료 배제 검정, 예를 들어 본원의 실시예 섹션에 기재된 검정으로 측정 시 비융합원성인 것으로 결정된다. 모든 이러한 특허 문헌, 즉, 하기 표 1에 열거된 국제 및 미국 특허 출원 공개공보의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
Figure pct00013
Figure pct00014
일부 구현예에서, 양이온성 지질은 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA); N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTAP); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DOEPC); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DLEPC); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(DMEPC); 1,2-디미리스톨레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(14:1), N1-[2-((1S)-1-[(3-아미노프로필)아미노]-4-[디(3-아미노프로필)아미노]부틸카르복사미도)에틸]-3,4-디[올레일옥시]벤즈아미드(MVL5); 디옥타데실아미도글리실스페르민(DOGS); 3b-[N-(N',N'-디메틸아미노에틸)카르바모일]콜레스테롤(DC-Chol); 디옥타데실디메틸암모늄 브로마이드(DDAB); Saint 지질(예를 들어, SAINT-2, N-메틸-4-(디올레일)메틸피리디늄); 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸히드록시에틸암모늄 브로마이드(DMRIE); 1,2-디올레오일-3-디메틸히드록시에틸암모늄 브로마이드(DORIE); 1,2-디올레오일옥시프로필-3-디메틸히드록시에틸암모늄 클로라이드(DORI); 이중알킬화 아미노산(DILA2)(예를 들어, C18:1-norArg-C16); 디올레일디메틸암모늄 클로라이드(DODAC); 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(POEPC); 및 1,2-디미리스톨레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(MOEPC)으로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 변형에서, 응축제, 예를 들어 양이온성 지질은, 예를 들어 디옥타데실디메틸암모늄 브로마이드(DDAB), 1,2-디리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 2,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLin-KC2-DMA), 헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-MC3-DMA), 1,2-디올레오일옥시-3-디메틸아미노프로판(DODAP), 1,2-디올레일옥시-3-디메틸아미노프로판(DODMA), 모르폴리노콜레스테롤(Mo-CHOL), (R)-5-(디메틸아미노)펜탄-1,2-디일 디올레에이트 히드로클로라이드(DODAPen-Cl), (R)-5-구아니디노펜탄-1,2-디일 디올레에이트 히드로클로라이드(DOPen-G), (R)-N,N,N-트리메틸-4,5-비스(올레오일옥시)펜탄-1-아미늄 클로라이드(DOTAPen)와 같은 지질이다.
일부 구현예에서, 응축성 지질은 DOTAP이다.
이온화 가능한 지질
일부 구현예에 따르면, 이온화 가능한 지질과 강성 치료용 핵산, 예컨대 비바이러스성 벡터(예를 들어, ceDNA)를 포함하며 평균 직경이 20 nm 내지 70 nm인 LNP를 함유하는 약학적 조성물이 또한 본원에 제공된다. 이러한 LNP는, 예를 들어 캡시드 미함유 비바이러스성 DNA 벡터를 관심 표적 부위(예를 들어, 세포, 조직, 기관 등)에 전달하는 데 사용될 수 있다.
예시적인 이온화 가능한 지질은 국제 PCT 특허 공개공보 WO2015/095340, WO2015/199952, WO2018/011633, WO2017/049245, WO2015/061467, WO2012/040184, WO2012/000104, WO2015/074085, WO2016/081029, WO2017/004143, WO2017/075531, WO2017/117528, WO2011/022460, WO2013/148541, WO2013/116126, WO2011/153120, WO2012/044638, WO2012/054365, WO2011/090965, WO2013/016058, WO2012/162210, WO2008/042973, WO2010/129709, WO2010/144740, WO2012/099755, WO2013/049328, WO2013/086322, WO2013/086373, WO2011/071860, WO2009/132131, WO2010/048536, WO2010/088537, WO2010/054401, WO2010/054406, WO2010/054405, WO2010/054384, WO2012/016184, WO2009/086558, WO2010/042877, WO2011/000106, WO2011/000107, WO2005/120152, WO2011/141705, WO2013/126803, WO2006/007712, WO2011/038160, WO2005/121348, WO2011/066651, WO2009/127060, WO2011/141704, WO2006/069782, WO2012/031043, WO2013/006825, WO2013/033563, WO2013/089151, WO2017/099823, WO2015/095346 및 WO2013/086354, 및 미국 특허 공개공보 US2016/0311759, US2015/0376115, US2016/0151284, US2017/0210697, US2015/0140070, US2013/0178541, US2013/0303587, US2015/0141678, US2015/0239926, US2016/0376224, US2017/0119904, US2012/0149894, US2015/0057373, US2013/0090372, US2013/0274523, US2013/0274504, US2013/0274504, US2009/0023673, US2012/0128760, US2010/0324120, US2014/0200257, US2015/0203446, US2018/0005363, US2014/0308304, US2013/0338210, US2012/0101148, US2012/0027796, US2012/0058144, US2013/0323269, US2011/0117125, US2011/0256175, US2012/0202871, US2011/0076335, US2006/0083780, US2013/0123338, US2015/0064242, US2006/0051405, US2013/0065939, US2006/0008910, US2003/0022649, US2010/0130588, US2013/0116307, US2010/0062967, US2013/0202684, US2014/0141070, US2014/0255472, US2014/0039032, US2018/0028664, US2016/0317458 및 US2013/0195920에 기재되어 있으며, 모든 상기 문헌들의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 하기 구조를 갖는 MC3, 즉 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-MC3-DMA 또는 MC3)이다:
Figure pct00015
지질 DLin-MC3-DMA는 문헌[Jayaraman et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. (2012), 51(34): 8529-8533]에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 WO2015/074085에 기재된 바와 같은 지질 ATX-002이며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 WO2012/040184에 기재된 바와 같은 (13Z,16Z)-N,N-디메틸-3-노닐도코사-13,16-디엔-1-아민(화합물 32)이며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
일부 구현예에서, 이온화 가능한 지질은 WO2015/199952에 기재된 바와 같은 화합물 6 또는 화합물 22이며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
화학식 (I) 및 화학식 (I')
일부 구현예에 따르면, 이온화 가능한 지질은 화학식 (I) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
Figure pct00016
(I)
[식 중,
R1 및 R1'는, 각각 독립적으로, C1-3 알킬렌이고;
R2 및 R2'는, 각각 독립적으로, 선형 또는 분지형 C1-6 알킬렌 또는 C3-6 시클로알킬렌이고;
R3 및 R3'는, 각각 독립적으로, 선택적으로 치환된 C1-6 알킬 또는 선택적으로 치환된 C3-6 시클로알킬이거나;
또는 대안적으로, R2가 분지형 C1-6 알킬렌이고 R3이 C1-6 알킬인 경우, R2와 R3은, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 8원 헤테로시클릴을 형성하거나;
또는 대안적으로, R2'가 분지형 C1-6 알킬렌이고 R3'가 C1-6 알킬인 경우, R2'와 R3'는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 8원 헤테로시클릴을 형성하고;
R4 및R4'는, 각각 독립적으로, -CH, -CH2CH 또는 -(CH2)2CH이고;
R5 및 R5'는, 각각 독립적으로, C1-20 알킬렌 또는 C2-20 알케닐렌이고;
R6 및 R6'는, 각각의 경우 독립적으로, C1-20 알킬렌, C3-20 시클로알킬렌 또는 C2-20 알케닐렌이고;
m 및 n은, 각각 독립적으로, 1, 2, 3, 4 및 5에서 선택되는 정수임].
대안적으로, 일부 구현예에 따르면, 이온화 가능한 지질은 화학식 (I') 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
Figure pct00017
(I')
[식 중,
R1 및 R1'는, 각각 독립적으로, C1-3 알킬렌이고;
R2 및 R2'는, 각각 독립적으로, 선형 또는 분지형 C1-6 알킬렌 또는 C3-6 시클로알킬렌이고;
R3 및 R3'는, 각각 독립적으로, 선택적으로 치환된 C1-6 알킬 또는 선택적으로 치환된 C3-6 시클로알킬이거나;
또는 대안적으로, R2가 분지형 C1-6 알킬렌이고 R3이 C1-6 알킬인 경우, R2와 R3은, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 8원 헤테로시클릴을 형성하거나;
또는 대안적으로, R2'가 분지형 C1-6 알킬렌이고 R3'가 C1-6 알킬인 경우, R2'와 R3'는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 8원 헤테로시클릴을 형성하고;
R4 및R4'는, 각각 독립적으로, -CH, -CH2CH 또는 -(CH2)2CH이고;
R5 및 R5'는, 각각 독립적으로, 수소, C1-20 알킬렌 또는 C2-20 알케닐렌이고;
R6 및 R6'는, 각각의 경우 독립적으로, C1-20 알킬렌, C3-20 시클로알킬렌 또는 C2-20 알케닐렌이고;
m 및 n은, 각각 독립적으로, 1, 2, 3, 4 및 5에서 선택되는 정수임].
본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, R2 및 R2'는, 각각 독립적으로, C1-3 알킬렌이다.
본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, R1 또는 R1'로 표시되는 선형 또는 분지형 C1-3 알킬렌, R2 또는 R2'로 표시되는 선형 또는 분지형 C1-6 알킬렌, 및 선택적으로 치환된 선형 또는 분지형 C1-6 알킬은, 각각 하나 이상의 할로기 및 시아노기로 선택적으로 치환된다.
본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, R1과 R2는 함께 취해져 C1-3 알킬렌이고, R1'와 R2'는 함께 취해져 C1-3 알킬렌, 예를 들어 에틸렌이다.
본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, R3 및 R3'는, 각각 독립적으로, 선택적으로 치환된 C1-3 알킬, 예를 들어 메틸이다.
본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, R4 및 R4'는 각각 -CH이다.
본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, R2는 선택적으로 치환된 분지형 C1-6 알킬렌이고; R2와 R3은, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 5원 또는 6원 헤테로시클릴을 형성한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, R2'는 선택적으로 치환된 분지형 C1-6 알킬렌이고; R2'와 R3'는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 5원 또는 6원 헤테로시클릴, 예컨대 피롤리디닐 또는 피페리디닐을 형성한다.
본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, R4는 -C(Ra)2CRa 또는 -[C(Ra)2]2CRa이고, Ra는 C1-3 알킬이고; R3과 R4는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 5원 또는 6원 헤테로시클릴을 형성한다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, R4'는 -C(Ra)2CRa 또는 -[C(Ra)2]2CRa이고, Ra는 C1-3 알킬이고; R3'와 R4'는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 5원 또는 6원 헤테로시클릴, 예컨대 피롤리디닐 또는 피페리디닐을 형성한다.
본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, R5 및 R5'는, 각각 독립적으로, C1-10 알킬렌 또는 C2-10 알케닐렌이다. 하나의 구현예에서, R5 및 R5'는, 각각 독립적으로, C1-8 알킬렌 또는 C1-6 알킬렌이다.
본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, R6 및 R6'는, 각각의 경우 독립적으로, C1-10 알킬렌, C3-10 시클로알킬렌 또는 C2-10 알케닐렌이다. 하나의 구현예에서, C1-6 알킬렌, C3-6 시클로알킬렌 또는 C2-6 알케닐렌. 하나의 구현예에서, C3-10 시클로알킬렌 또는 C3-6 시클로알킬렌은 시클로프로필렌이다. 본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, m 및 n은 각각 3이다.
본원의 양태 또는 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에 따르면, 이온화 가능한 지질은 표 2의 지질 중 어느 하나 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서 선택된다.
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
화학식 (II)
일부 양태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (II) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 갖는다:
Figure pct00031
(XII)
[식 중,
a는 1 내지 20 범위의 정수이고(예를 들어, a는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20임);
b는 2 내지 10 범위의 정수이고(예를 들어, b는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10임);
R1은 존재하지 않거나, (C2-C20)알케닐, -C(O)O(C2-C20)알킬, 및 (C2-C20)알킬로 치환된 시클로프로필에서 선택되고;
R2는 (C2-C20)알킬임].
제2 화학적 구현예에서, 화학식 (II)의 이온화 가능한 지질은 화학식 (XIII) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 갖는다:
Figure pct00032
(III)
[식 중, c 및 d는 각각 독립적으로1 내지 8 범위의 정수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8)이고, 나머지 변수는 화학식 (XII)에 대해 기재된 바와 같음].
제3 화학적 구현예에서, 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 이온화 가능한 지질에서 c 및 d는, 각각 독립적으로, 2 내지 8, 3 내지 8, 3 내지 7, 3 내지 6, 3 내지 5, 4 내지 8, 4 내지 7, 4 내지 6, 5 내지 8, 5 내지 7, 또는 6 내지 8 범위의 정수이고, 나머지 변수는 화학식 (XII)에 대해 기재된 바와 같다.
제4 화학적 구현예에서, 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 이온화 가능한 지질에서 c는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이고, 나머지 변수는 화학식 (XII), 또는 제2 또는 제3 화학적 구현예에 대해 기재된 바와 같다. 대안적으로, 제4 화학적 구현예의 일부로서, 화학식 (XII) 또는 화학식 (XIII)의 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서 c 및 d는, 각각 독립적으로, 1, 3, 5 또는 7이고, 나머지 변수는 화학식 (XII), 또는 제2 또는 제3 화학적 구현예에 대해 기재된 바와 같다.
제5 화학적 구현예에서, 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 이온화 가능한 지질에서 d는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8이고, 나머지 변수는 화학식 (II), 또는 제2 또는 제3 또는 제4 화학적 구현예에 대해 기재된 바와 같다. 대안적으로, 제4 화학적 구현예의 일부로서, 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서 c 및 d 중 적어도 하나는 7이고, 나머지 변수는 화학식 (II), 또는 제2 또는 제3 또는 제4 화학적 구현예에 대해 기재된 바와 같다.
제6 화학적 구현예에서, 화학식 (II) 또는 화학식 (III)의 이온화 가능한 지질은 화학식 (IV) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 갖는다:
Figure pct00033
(IV)
[식 중, 나머지 변수는 화학식 (I)에 대해 기재된 바와 같음].
제7 화학적 구현예에서, 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)의 이온화 가능한 지질에서 b는 3 내지 9 범위의 정수이고, 나머지 변수는 화학식 (II), 또는 제2, 제3, 제4 또는 제5 화학적 구현예에 대해 기재된 바와 같다. 대안적으로, 제7 화학적 구현예의 일부로서, 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)의 이온화 가능한 지질에서 b는 3 내지 8, 3 내지 7, 3 내지 6, 3 내지 5, 4 내지 9, 4 내지 8, 4 내지 7, 4 내지 6, 5 내지 9, 5 내지 8, 5 내지 7, 6 내지 9, 6 내지 8, 또는 7 내지 9 범위의 정수이고, 나머지 변수는 화학식 (II), 또는 제2, 제3, 제4 또는 제5 화학적 구현예에 대해 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제7 화학적 구현예의 일부로서, 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)의 이온화 가능한 지질에서 b는 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9이고, 나머지 변수는 화학식 (XII), 또는 제2, 제3, 제4 또는 제5 화학적 구현예에 대해 기재된 바와 같다.
제8 화학적 구현예에서, 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)의 이온화 가능한 지질에서 a는 2 내지 18 범위의 정수이고, 나머지 변수는 화학식 (II), 또는 제2, 제3, 제4, 제5 또는 제7 화학적 구현예에 대해 기재된 바와 같다. 대안적으로, 제8 구현예의 일부로서, 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)의 이온화 가능한 지질에서 a는 2 내지 18, 2 내지 17, 2 내지 16, 2 내지 15, 2 내지 14, 2 내지 13, 2 내지 12, 2 내지 11, 2 내지 10, 2 내지 9, 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 3 내지 18, 3 내지 17, 3 내지 16, 3 내지 15, 3 내지 14, 3 내지 13, 3 내지 12, 3 내지 11, 3 내지 10, 3 내지 9, 3 내지 8, 3 내지 7, 3 내지 6, 3 내지 5, 4 내지 18, 4 내지 17, 4 내지 16, 4 내지 15, 4 내지 14, 4 내지 13, 4 내지 12, 4 내지 11, 4 내지 10, 4 내지 9, 4 내지 8, 4 내지 7, 4 내지 6, 5 내지 18, 5 내지 17, 5 내지 16, 5 내지 15, 5 내지 14, 5 내지 13, 5 내지 12, 5 내지 11, 5 내지 10, 5 내지 9, 25 내지 8, 5 내지 7, 6 내지 18, 6 내지 17, 6 내지 16, 6 내지 15, 6 내지 14, 6 내지 13, 6 내지 12, 6 내지 11, 6 내지 10, 6 내지 9, 6 내지 8, 7 내지 18, 7 내지 17, 7 내지 16, 7 내지 15, 7 내지 14, 7 내지 13, 7 내지 12, 7 내지 11, 7 내지 10, 7 내지 9, 8 내지 18, 8 내지 17, 8 내지 16, 8 내지 15, 8 내지 14, 8 내지 13, 8 내지 12, 8 내지 11, 8 내지 10, 9 내지 18, 9 내지 17, 9 내지 16, 9 내지 15, 9 내지 14, 9 내지 13, 9 내지 12, 9 내지 11, 10 내지 18, 10 내지 17, 10 내지 16, 10 내지 15, 10 내지 14, 10 내지 13, 11 내지 18, 11 내지 17, 11 내지 16, 11 내지 15, 11 내지 14, 11 내지 13, 12 내지 18, 12 내지 17, 12 내지 16, 12 내지 15, 12 내지 14, 13 내지 18, 13 내지 17, 13 내지 16, 13 내지 15, 14 내지 18, 14 내지 17, 14 내지 16, 15 내지 18, 15 내지 17, 또는 16 내지 18 범위의 정수이고, 나머지 변수는 화학식 (II), 또는 제2, 제3, 제4, 제5 또는 제7 화학적 구현예에 대해 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제8 구현예의 일부로서, 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)의 이온화 가능한 지질에서 a는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18이고, 나머지 변수는 화학식 (II), 또는 제2, 제3, 제4, 제5 또는 제7 화학적 구현예에 대해 기재된 바와 같다.
제9 화학적 구현예에서, 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)의 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서 R1은 존재하지 않거나, (C5-C15)알케닐, -C(O)O(C4-C18)알킬, 및 (C4-C16)알킬로 치환된 시클로프로필에서 선택되고, 나머지 변수는 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV), 또는 제2, 제3, 제4, 제5, 제7 또는 제8 화학적 구현예에 대해 기재된 바와 같다. 대안적으로, 제9 화학적 구현예의 일부로서, 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)의 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서 R1은 존재하지 않거나, (C5-C15)알케닐, -C(O)O(C4-C16)알킬, 및 (C4-C16)알킬로 치환된 시클로프로필에서 선택되고, 나머지 변수는 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV), 또는 제2, 제3, 제4, 제5, 제7 또는 제8 화학적 구현예에 대해 기재된 바와 같다. 대안적으로, 제9 화학적 구현예의 일부로서, 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)의 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서 R1은 존재하지 않거나, (C5-C12)알케닐, -C(O)O(C4-C12)알킬, 및 (C4-C12)알킬로 치환된 시클로프로필에서 선택되고, 나머지 변수는 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV), 또는 제2, 제3, 제4, 제5, 제7 또는 제8 화학적 구현예에 대해 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제9 화학적 구현예의 일부로서, 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)의 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서 R1은 존재하지 않거나, (C5-C10)알케닐, -C(O)O(C4-C10)알킬, 및 (C4-C10)알킬로 치환된 시클로프로필에서 선택되고, 나머지 변수는 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV), 또는 제2, 제3, 제4, 제5, 제7 또는 제8 화학적 구현예에 대해 기재된 바와 같다.
제10 화학적 구현예에서, R1은 C10 알케닐이고, 나머지 변수는 전술한 구현에 중 어느 하나에 기재된 바와 같다.
제11 화학적 구현예에서, 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)의 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서 R1의 C(O)O(C2-C20)알킬, -C(O)O(C4-C18)알킬, -C(O)O(C4-C12)알킬 또는 -C(O)O(C4-C10)알킬 중 알킬은 비분지형 알킬이고, 나머지 변수는 전술한 구현예 중 어느 하나에 기재된 바와 같다. 하나의 화학적 구현예에서, R1은 -C(O)O(C9 알킬)이다. 대안적으로, 제11 화학적 구현예에서, 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)의 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서 R1의 -C(O)O(C4-C18)알킬, -C(O)O(C4-C12)알킬 또는 -C(O)O(C4-C10)알킬 중 알킬은 분지형 알킬이고, 나머지 변수는 전술한 화학적 구현예 중 어느 하나에 기재된 바와 같다. 하나의 화학적 구현예에서, R1은 -C(O)O(C17 알킬)이고, 나머지 변수는 전술한 화학적 구현예 중 어느 하나에 기재된 바와 같다.
제12 화학적 구현예에서, 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV)의 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서 R1은 하기 표 3에 열거된 임의의 기에서 선택되고, 여기서 각 기에서 물결 모양 결합은 지질 분자의 나머지 부분에의 해당 기의 부착 지점을 나타내고, 나머지 변수는 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV) 또는 제2, 제3, 제4, 제5, 제7 또는 제8 화학적 구현예에 대해 기재된 바와 같다. 본 개시내용은 표 4의 R1 기 중 어느 하나와 표 5의 R2 기 중 어느 하나의 조합을 추가로 고려하며, 나머지 변수는 화학식 (II), 화학식 (III) 또는 화학식 (IV) 또는 제2, 제3, 제4, 제5, 제7 또는 제8 화학적 구현예에 대해 기재된 바와 같다.
Figure pct00034
제13 화학적 구현예에서, 화학식 (II)의 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서 R2는 하기 표 4에 열거된 임의의 기에서 선택되고, 여기서 각 기에서 물결 모양 결합은 지질 분자의 나머지 부분에의 해당 기의 부착 지점을 나타내고, 나머지 변수는 화학식 (II), 또는 제7, 제8, 제9, 제10 또는 제11 화학적 구현예에 대해 기재된 바와 같다.
Figure pct00035
특정예가 하기 예시 섹션의 표 5에 제공되어 있으며, 이는 화학식 (II)의 이온화 가능한 지질에 대한 본원의 제14 화학적 구현예의 일부로 포함된다. 약학적으로 허용 가능한 염뿐 아니라, 이온화된 형태와 중성 형태도 포함된다.
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
화학식 (V )
일부 양태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (V) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 갖는다:
Figure pct00042
(V)
[식 중,
R1 및 R1'는, 각각 독립적으로, Ra에서 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬렌이고;
R2 및 R2'는, 각각 독립적으로, (C1-C2)알킬렌이고;
R3 및 R3'는, 각각 독립적으로, Rb에서 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬이거나;
또는 대안적으로, R2와 R3 및/또는 R2'와 R3'는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 7원 헤테로시클릴을 형성하고;
R4 및 R4'는 각각 -C(O)O-가 개재된 (C2-C6)알킬렌이고;
R5 및 R5'는, 각각 독립적으로, -C(O)O- 또는 (C3-C6)시클로알킬이 각각 선택적으로 개재된 (C2-C30)알킬 또는 (C2-C30)알케닐이고;
Ra 및 Rb는 각각 할로 또는 시아노임].
제2 화학적 양태에서, 화학식 (V)의 이온화 가능한 지질에서 R1 및 R1'는, 각각 독립적으로, (C1-C6)알킬렌이고, 나머지 변수는 화학식 (V)에 대해 상기 기재된 바와 같다. 대안적으로, 제2 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V)의 이온화 가능한 지질에서 R1 및 R1'는, 각각 독립적으로, (C1-C3)알킬렌이고, 나머지 변수는 화학식 (V)에 대해 상기 기재된 바와 같다.
제3 화학적 양태에서, 화학식 (V)의 이온화 가능한 지질은 화학식 (VI) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 갖는다:
Figure pct00043
(VI)
[식 중, 나머지 변수는 화학식 (V)에 대해 상기 기재된 바와 같음].
제4 화학적 양태에서, 화학식 (V)의 이온화 가능한 지질은 화학식 (VII) 또는 화학식 (VIII), 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 갖는다:
Figure pct00044
(VII); 또는
Figure pct00045
(VIII)
[식 중, 나머지 변수는 화학식 (V)에 대해 상기 기재된 바와 같음].
제5 화학적 양태에서, 화학식 (V)의 이온화 가능한 지질은 화학식 (IX) 또는 화학식 (VI), 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 갖는다:
Figure pct00046
(IX); 또는
Figure pct00047
(X)
[식 중, 나머지 변수는 화학식 (V)에 대해 상기 기재된 바와 같음].
제6 화학적 양태에서, 화학식 (V)의 이온화 가능한 지질은 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV), 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 갖는다:
Figure pct00048
(XI);
Figure pct00049
(XII);
Figure pct00050
(XIII); 또는
Figure pct00051
(XIV)
[식 중, 나머지 변수는 화학식 (XV)에 대해 상기 기재된 바와 같음].
제7 화학적 양태에서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 이온화 가능한 지질에서 R5 및 R5' 중 적어도 하나는 분지형 알킬 또는 분지형 알케닐(화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)에 대해 기재된 바와 같은 탄소 원자 수)이다. 또 다른 대안에서, 제7 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 이온화 가능한 지질에서 R5 및 R5' 중 하나는 분지형 알킬 또는 분지형 알케닐이다. 또 다른 대안에서, 제7 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 이온화 가능한 지질에서 R5는 분지형 알킬 또는 분지형 알케닐이다. 또 다른 대안에서, 제7 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 이온화 가능한 지질에서 R5'는 분지형 알킬 또는 분지형 알케닐이다.
제8 화학적 양태에서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 이온화 가능한 지질에서 R5는 -C(O)O- 또는 (C3-C6)시클로알킬이 각각 선택적으로 개재된 (C6-C26)알킬 또는 (C6-C26)알케닐이고, 나머지 변수는 화학식 (I)에 대해 상기 기재된 바와 같다. 대안적으로, 제7 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 이온화 가능한 지질에서 R5는 -C(O)O- 또는 (C3-C5)시클로알킬이 각각 선택적으로 개재된 (C6-C26)알킬 또는 (C6-C26)알케닐이고, 나머지 변수는 화학식 (V)에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제8 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 이온화 가능한 지질에서 R5는 -C(O)O- 또는 (C3-C5)시클로알킬이 각각 선택적으로 개재된 (C7-C26)알킬 또는 (C7-C26)알케닐이고, 나머지 변수는 화학식 (V)에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제8 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 이온화 가능한 지질에서 R5는 -C(O)O- 또는 (C3-C5)시클로알킬이 각각 선택적으로 개재된 (C8-C26)알킬 또는 (C8-C26)알케닐이고, 나머지 변수는 화학식 (V)에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제8 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 이온화 가능한 지질에서 R5는 -C(O)O- 또는 시클로프로필이 각각 선택적으로 개재된 (C6-C24)알킬 또는 (C6-C24)알케닐이고, 나머지 변수는 화학식 (V)에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제8 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 이온화 가능한 지질에서 R5는 (C8-C24)알킬 또는 (C8-C24)알케닐이며, 여기서 상기 (C8-C24)알킬에는 -C(O)O- 또는 시클로프로필이 선택적으로 개재되고, 나머지 변수는 화학식 (V)에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제8 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 이온화 가능한 지질에서 R5는 (C8-C10)알킬이고, 나머지 변수는 화학식 (V)에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제8 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 이온화 가능한 지질에서 R5는 시클로프로필이 개재된 (C14-C16)알킬이고, 나머지 변수는 화학식 (V)에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제8 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 이온화 가능한 지질에서 R5는 -C(O)O-이 개재된 (C10-C24)알킬이고, 나머지 변수는 화학식 (V)에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제8 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 이온화 가능한 지질에서 R5는 (C16-C18)알케닐이고, 나머지 변수는 화학식 (V)에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제8 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 이온화 가능한 지질에서 R5는 -(CH2)3C(O)O(CH2)8CH3, -(CH2)5C(O)O(CH2)8CH3, -(CH2)7C(O)O(CH2)8CH3, -(CH2)7C(O)OCH[(CH2)7CH3]2, -(CH2)7-C3H6-(CH2)7CH3, -(CH2)7CH3, -(CH2)9CH3, -(CH2)16CH3, -(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3 또는 -(CH2)7CH=CHCH2CH=CH(CH2)4CH3이고, 나머지 변수는 화학식 (XV)에 대해 상기 기재된 바와 같다.
제9 화학적 양태에서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 이온화 가능한 지질에서 R5'는 -C(O)O-이 개재된 (C15-C28)알킬이고, 나머지 변수는 화학식 (V) 또는 제8 화학적 양태에 대해 상기 기재된 바와 같다. 대안적으로, 제9 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 이온화 가능한 지질에서 R5'는 -C(O)O-이 개재된 (C17-C28)알킬이고, 나머지 변수는 화학식 (V) 또는 제8 화학적 양태에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제9 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 이온화 가능한 지질에서 R5'는 -C(O)O-이 개재된 (C19-C28)알킬이고, 나머지 변수는 화학식 (V) 또는 제8 화학적 양태에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제9 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 이온화 가능한 지질에서 R5'는 -C(O)O-이 개재된 (C17-C26)알킬이고, 나머지 변수는 화학식 (V) 또는 제8 화학적 양태에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제9 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 이온화 가능한 지질에서 R5'는 -C(O)O-이 개재된 (C19-C26)알킬이고, 나머지 변수는 화학식 (V) 또는 제8 화학적 양태에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제9 화학적 양태의 일부로서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XI), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 이온화 가능한 지질에서 R5'는 -C(O)O-이 개재된 (C20-C26)알킬이고, 나머지 변수는 화학식 (V) 또는 제8 화학적 양태에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제9 화학적 양태의 일부로서, R5'는 -C(O)O-이 개재된 (C22-C24)알킬이고, 나머지 변수는 화학식 (V) 또는 제8 화학적 양태에 대해 상기 기재된 바와 같다. 또 다른 대안에서, 제9 화학적 양태의 일부로서, R5'는 -(CH2)5C(O)OCH[(CH2)7CH3]2, -(CH2)7C(O)OCH[(CH2)7CH3]2, -(CH2)5C(O)OCH(CH2)2[(CH2)7CH3]2 또는 -(CH2)7C(O)OCH(CH2)2[(CH2)7CH3]2이고, 나머지 변수는 화학식 (V) 또는 제8 화학적 양태에 대해 상기 기재된 바와 같다.
또 다른 양태에서, 화학식 (V), 화학식 (VI), 화학식 (VIII), 화학식 (VIII), 화학식 (IX), 화학식 (X), 화학식 (XII), 화학식 (XIII) 또는 화학식 (XIV)의 이온화 가능한 지질은 하기 표 6의 지질 중 임의의 것 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서 선택될 수 있다.
Figure pct00052
Figure pct00053
화학식 (XV)
일부 양태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (XV) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 갖는다:
Figure pct00054
(XV)
[식 중,
R'는 존재하지 않거나, 수소 또는 C1-C6 알킬이며; 단, R'가 수소 또는 C1-C6 알킬인 경우, R', R1 및 R2가 모두 부착된 질소 원자는 양성자화되고;
R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 수소, C1-C6 알킬 또는 C2-C6 알케닐이고;
R3은 C1-C12 알킬렌 또는 C2-C12 알케닐렌이고;
R4는 C1-C16 비분지형 알킬, C2-C16 비분지형 알케닐 또는
Figure pct00055
이며; 여기서
R4a 및 R4b는, 각각 독립적으로, C1-C16 비분지형 알킬 또는 C2-C16 비분지형 알케닐이고;
R5는 존재하지 않거나, C1-C8 알킬렌 또는 C2-C8 알케닐렌이고;
R6a 및 R6b는, 각각 독립적으로, C7-C16 알킬 또는 C7-C16 알케닐이며; 단, 결합된 R6a와 R6b의 총 탄소 원자 수는 15 초과이고;
X1 및 X2는, 각각 독립적으로, -OC(=O)-, -SC(=O)-, -OC(=S)-, -C(=O)O-, -C(=O)S-, -S-S-, -C(Ra)=N-, -N=C(Ra)-, -C(Ra)=NO-, -O-N=C(Ra)-, -C(=O)NRa-, -NRaC(=O)-, -NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)O-, -OSi(Ra)2O-, -C(=O)(CRa 2)C(=O)O- 또는 OC(=O)(CRa 2)C(=O)-이며; 여기서
Ra는, 각각의 경우 독립적으로, 수소 또는 C1-C6 알킬이고;
n은 1, 2, 3, 4, 5 및 6에서 선택되는 정수임].
제2 구현예에서, 제1 구현예에 따른 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서, X1과 X2는 동일하고; 나머지 모든 변수는 화학식 (V) 또는 제1 구현예에 대해 기재된 바와 같다.
제3 구현예에서, 제1 또는 제2 구현예에 따른 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서, X1 및 X2는, 각각 독립적으로, -OC(=O)-, -SC(=O)-, -OC(=S)-, -C(=O)O-, -C(=O)S- 또는 -S-S-이거나; X1 및 X2는, 각각 독립적으로, -C(=O)O-, -C(=O)S- 또는 -S-S-이거나; 또는 X1 및 X2는, 각각 독립적으로, -C(=O)O- 또는 -S-S-이고; 나머지 모든 변수는 화학식 (V) 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제4 구현예에서, 본 개시내용의 이온화 가능한 지질은 화학식 (XVI) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
Figure pct00056
(XVI)
[식 중, n은 1, 2, 3 및 4에서 선택되는 정수이고; 나머지 모든 변수는 화학식 (XV) 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같음].
제5 구현예에서, 본 개시내용의 이온화 가능한 지질은 화학식 (XVII) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
Figure pct00057
(XVII)
[식 중, n은 1, 2 및 3에서 선택되는 정수이고; 나머지 모든 변수는 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같음].
제6 구현예에서, 본 개시내용의 이온화 가능한 지질은 화학식 (XVIII) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
Figure pct00058
(XVIII)
[식 중, 나머지 모든 변수는 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같음].
제7 구현예에서, 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 따른 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서, R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 수소, C1-C6 알킬 또는 C2-C6 알케닐, 또는 C1-C5 알킬 또는 C2-C5 알케닐, 또는 C1-C4 알킬 또는 C2-C4 알케닐, 또는 C6 알킬, 또는 C5 알킬, 또는 C4 알킬, 또는 C3 알킬, 또는 C2 알킬, 또는 C1 알킬, 또는 C6 알케닐, 또는 C5 알케닐, 또는 C4 알케닐, 또는 C3 알케닐, 또는 C2 알케닐이고; 나머지 모든 변수는 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제8 구현예에서, 본 개시내용의 이온화 가능한 지질은 화학식 (XIX) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
Figure pct00059
(XIX)
[식 중, 나머지 모든 변수는 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같음].
제9 구현예에서, 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII), 화학식 (XIX), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 따른 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서, R3은 C1-C9 알킬렌 또는 C2-C9 알케닐렌, C1-C7 알킬렌 또는 C2-C7 알케닐렌, C1-C5 알킬렌 또는 C2-C5 알케닐렌, 또는 C2-C8 알킬렌 또는 C2-C8 알케닐렌, 또는 C3-C7 알킬렌 또는 C3-C7 알케닐렌, 또는 C5-C7 알킬렌 또는 C5-C7 알케닐렌이거나; R3은 C12 알킬렌, C11 알킬렌, C10 알킬렌, C9 알킬렌, 또는 C8 알킬렌, 또는 C7 알킬렌, 또는 C6 알킬렌, 또는 C5 알킬렌, 또는 C4 알킬렌, 또는 C3 알킬렌, 또는 C2 알킬렌, 또는 C1 알킬렌, 또는 C12 알케닐렌, C11 알케닐렌, C10 알케닐렌, C9 알케닐렌, 또는 C8 알케닐렌, 또는 C7 알케닐렌, 또는 C6 알케닐렌, 또는 C5 알케닐렌, 또는 C4 알케닐렌, 또는 C3 알케닐렌, 또는 C2 알케닐렌이고; 나머지 모든 변수는 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII), 화학식 (XIX), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다. 대안적으로, 제9 구현예의 일부로서, 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII), 화학식 (XIX), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 따른 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서, R 3 은 C1-C9 알킬렌 또는 C2-C9 알케닐렌, C1-C7 알킬렌 또는 C2-C7 알케닐렌, C1-C6 알킬렌 또는 C2-C6 알케닐렌, C1-C5 알킬렌 또는 C2-C5 알케닐렌, 또는 C2-C8 알킬렌 또는 C2-C8 알케닐렌, 또는 C3-C7 알킬렌 또는 C3-C7 알케닐렌, 또는 C5-C7 알킬렌 또는 C5-C7 알케닐렌이거나; R 3 은 C12 알킬렌, C11 알킬렌, C10 알킬렌, C9 알킬렌, 또는 C8 알킬렌, 또는 C7 알킬렌, 또는 C6 알킬렌, 또는 C5 알킬렌, 또는 C4 알킬렌, 또는 C3 알킬렌, 또는 C2 알킬렌, 또는 C1 알킬렌, 또는 C12 알케닐렌, C11 알케닐렌, C10 알케닐렌, C9 알케닐렌, 또는 C8 알케닐렌, 또는 C7 알케닐렌, 또는 C6 알케닐렌, 또는 C5 알케닐렌, 또는 C4 알케닐렌, 또는 C3 알케닐렌, 또는 C2 알케닐렌이고; 나머지 모든 변수는 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII), 화학식 (XIX), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제10 구현예에서, 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII), 화학식 (XIX), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 따른 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서, R5는 존재하지 않거나, C1-C6 알킬렌 또는 C2-C6 알케닐렌이거나; R5는 존재하지 않거나, C1-C4 알킬렌 또는 C2-C4 알케닐렌이거나; R5는 존재하지 않거나; 또는 R5는 C8 알킬렌, C7 알킬렌, C6 알킬렌, C5 알킬렌, C4 알킬렌, C3 알킬렌, C2 알킬렌, C1 알킬렌, C8 알케닐렌, C7 알케닐렌, C6 알케닐렌, C5 알케닐렌, C4 알케닐렌, C3 알케닐렌 또는 C2 알케닐렌이고; 나머지 모든 변수는 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII), 화학식 (XIX), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제11 구현예에서, 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII), 화학식 (XIX), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 따른 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서, R4는 C1-C14 비분지형 알킬, C2-C14 비분지형 알케닐 또는
Figure pct00060
이며, 여기서 R4a 및 R4b는, 각각 독립적으로, C1-C12 비분지형 알킬 또는 C2-C12 비분지형 알케닐이거나; R4는 C2-C12 비분지형 알킬 또는 C2-C12 비분지형 알케닐이거나; R 4 는 C5-C7 비분지형 알킬 또는 C5-C7 비분지형 알케닐이거나; R4는 C16 비분지형 알킬, C15 비분지형 알킬, C14 비분지형 알킬, C13 비분지형 알킬, C12 비분지형 알킬, C11 비분지형 알킬, C10 비분지형 알킬, C9 비분지형 알킬, C8 비분지형 알킬, C7 비분지형 알킬, C6 비분지형 알킬, C5 비분지형 알킬, C4 비분지형 알킬, C3 비분지형 알킬, C2 비분지형 알킬, C1 비분지형 알킬, C16 비분지형 알케닐, C15 비분지형 알케닐, C14 비분지형 알케닐, C13 비분지형 알케닐, C12 비분지형 알케닐, C11 비분지형 알케닐, C10 비분지형 알케닐, C9 비분지형 알케닐, C8 비분지형 알케닐, C7 비분지형 알케닐, C6 비분지형 알케닐, C5 비분지형 알케닐, C4 비분지형 알케닐, C3 비분지형 알케닐 또는 C2 알케닐이거나; R4는
Figure pct00061
이며, 여기서 R4a 및 R4b는, 각각 독립적으로, C2-C10 비분지형 알킬 또는 C2-C10 비분지형 알케닐이거나; 또는 R4는
Figure pct00062
이며, 여기서 R4a 및 R4b는, 각각 독립적으로, C16 비분지형 알킬, C15 비분지형 알킬, C14 비분지형 알킬, C13 비분지형 알킬, C12 비분지형 알킬, C11 비분지형 알킬, C10 비분지형 알킬, C9 비분지형 알킬, C8 비분지형 알킬, C7 비분지형 알킬, C6 비분지형 알킬, C5 비분지형 알킬, C4 비분지형 알킬, C3 비분지형 알킬, C2 알킬, C1 알킬, C16 비분지형 알케닐, C15 비분지형 알케닐, C14 비분지형 알케닐, C13 비분지형 알케닐, C12 비분지형 알케닐, C11 비분지형 알케닐, C10 비분지형 알케닐, C9 비분지형 알케닐, C8 비분지형 알케닐, C7 비분지형 알케닐, C6 비분지형 알케닐, C5 비분지형 알케닐, C4 비분지형 알케닐, C3 비분지형 알케닐 또는 C2 알케닐이고; 나머지 모든 변수는 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII), 화학식 (XIX), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제12 구현예에서, 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII), 화학식 (XIX), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 따른 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서, R6a 및 R6b는, 각각 독립적으로, C6-C14 알킬 또는 C6-C14 알케닐이거나; R6a 및 R6b는, 각각 독립적으로, C8-C12 알킬 또는 C8-C12 알케닐이거나; 또는 R6a 및 R6b는, 각각 독립적으로, C16 알킬, C15 알킬, C14 알킬, C13 알킬, C12 알킬, C11 알킬, C10 알킬, C9 알킬, C8 알킬, C7 알킬, C16 알케닐, C15 알케닐, C14 알케닐, C13 알케닐, C12 알케닐, C11 알케닐, C10 알케닐, C9 알케닐, C8 알케닐 또는 C7 알케닐이며; 단, 결합된 R6a와 R6b의 총 탄소 원자 수는 15 초과이고; 나머지 모든 변수는 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII), 화학식 (XIX), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제13 구현예에서, 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII), 화학식 (XIX), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 따른 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서, R6a와 R6b는 서로 동일한 탄소 원자 수를 함유하거나; R6a와 R6b는 동일하거나; 또는 R6a와 R6b는 모두 C16 알킬, C15 알킬, C14 알킬, C13 알킬, C12 알킬, C11 알킬, C10 알킬, C9 알킬, C8 알킬, C7 알킬, C16 알케닐, C15 알케닐, C14 알케닐, C13 알케닐, C12 알케닐, C11 알케닐, C10 알케닐, C9 알케닐, C8 알케닐 또는 C7 알케닐이며; 단, 결합된 R6a와 R6b의 총 탄소 원자 수는 15 초과이고; 나머지 모든 변수는 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII), 화학식 (XIX), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제14 구현예에서, 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII), 화학식 (XIX), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 따른 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서, 전술한 구현예 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 R6a와 R6b는 각각 서로 상이한 탄소 원자 수를 함유하거나; R6a와 R6b의 탄소 원자 수는 1개 또는 2개의 탄소 원자만큼 다르거나; R6a와 R6b의 탄소 원자 수는 1개 탄소 원자만큼 다르거나; R6a는 C7 알킬이고 R6a는 C8 알킬이거나, R6a는 C8 알킬이고 R6a는 C7 알킬이거나, R6a는 C8 알킬이고 R6a는 C9 알킬이거나, R6a는 C9 알킬이고 R6a는 C8 알킬이거나, R6a는 C9 알킬이고 R6a는 C10 알킬이거나, R6a는 C10 알킬이고 R6a는 C9 알킬이거나, R6a는 C10 알킬이고 R6a는 C11 알킬이거나, R6a는 C11 알킬이고 R6a는 C10 알킬이거나, R6a는 C11 알킬이고 R6a는 C12 알킬이거나, R6a는 C12 알킬이고 R6a는 C11 알킬이거나, R6a는 C7 알킬이고 R6a는 C9 알킬이거나, R6a는 C9 알킬이고 R6a는 C7 알킬이거나, R6a는 C8 알킬이고 R6a는 C10 알킬이고, R6a는 C10 알킬이고 R6a는 C8 알킬이고, R6a는 C9 알킬이고 R6a는 C11 알킬이거나, R6a는 C11 알킬이고 R6a는 C9 알킬이거나, R6a는 C10 알킬이고 R6a는 C12 알킬이거나, R6a는 C12 알킬이고 R6a는 C10 알킬이거나, R6a는 C11 알킬이고 R6a는 C13 알킬이거나, R6a는 C13 알킬이고 R6a는 C11 알킬인 것 등이고; 나머지 모든 변수는 화학식 (I), 화학식 (II), 화학식 (III), 화학식 (IV), 화학식 (V), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
하나의 구현예에서, 본 개시내용의 양이온성 지질, 또는 화학식 (XV), 화학식 (XVI), 화학식 (XVII), 화학식 (XVIII) 또는 화학식 (XIX)의 양이온성 지질은, 표 7의 지질에서 선택되는 어느 하나의 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
화학식 (XX)
일부 양태에서, 이온화 가능한 지질은 화학식 (XX) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 갖는다:
Figure pct00067
(XX)
[식 중,
R'는 존재하지 않거나, 수소 또는 C1-C3 알킬이며; 단, R'가 수소 또는 C1-C3 알킬인 경우, R', R1 및 R2가 모두 부착된 질소 원자는 양성자화되고;
R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 수소 또는 C1-C3 알킬이고;
R3은 C3-C10 알킬렌 또는 C3-C10 알케닐렌이고;
R4는 C1-C16 비분지형 알킬, C2-C16 비분지형 알케닐 또는
Figure pct00068
이며; 여기서
R4a 및 R4b는, 각각 독립적으로, C1-C16 비분지형 알킬 또는 C2-C16 비분지형 알케닐이고;
R5는 존재하지 않거나, C1-C6 알킬렌 또는 C2-C6 알케닐렌이고;
R6a 및 R6b는, 각각 독립적으로, C7-C14 알킬 또는 C7-C14 알케닐이고;
X는 -OC(=O)-, -SC(=O)-, -OC(=S)-, -C(=O)O-, -C(=O)S-, -S-S-, -C(Ra)=N-, -N=C(Ra)-, -C(Ra)=NO-, -O-N=C(Ra)-, -C(=O)NRa-, -NRaC(=O)-, -NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)O-, -OSi(Ra)2O-, -C(=O)(CRa 2)C(=O)O- 또는 OC(=O)(CRa 2)C(=O)-이며; 여기서
Ra는, 각각의 경우 독립적으로, 수소 또는 C1-C6 알킬이고;
n은 1, 2, 3, 4, 5 및 6에서 선택되는 정수임].
제2 구현예에서, 제1 구현예에 따른 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서, X는 -OC(=O)-, -SC(=O)-, -OC(=S)-, -C(=O)O-, -C(=O)S- 또는 -S-S-이고; 나머지 모든 변수는 화학식 (XX) 또는 제1 구현예에 대해 기재된 바와 같다.
제3 구현예에서, 본 개시내용의 이온화 가능한 지질은 화학식 (XXI) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
Figure pct00069
(XXI)
[식 중, n은 1, 2, 3 및 4에서 선택되는 정수이고; 나머지 모든 변수는 화학식 (XX) 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같음]. 대안적인 제3 구현예에서, n은 1, 2 및 3에서 선택되는 정수이고; 나머지 모든 변수는 화학식 (XX) 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제4 구현예에서, 본 개시내용의 이온화 가능한 지질은 화학식 (XXII) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
Figure pct00070
(XXII)
[식 중, 나머지 모든 변수는 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같음].
제5 구현예에서, 제1 구현예에 따른 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서, R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 수소 또는 C1-C2 알킬 또는 C2-C3 알케닐이거나; R', R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 수소, C1-C2 알킬이고; 나머지 모든 변수는 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제6 구현예에서, 본 개시내용의 이온화 가능한 지질은 화학식 (XXII) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
Figure pct00071
(XXIII)
[식 중, 나머지 모든 변수는 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같음].
제7 구현예에서, 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 따른 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서, R5는 존재하지 않거나, C1-C8 알킬렌이거나; R5는 존재하지 않거나, C1-C6 알킬렌 또는 C2-C6 알케닐렌이거나; R5는 존재하지 않거나, C1-C4 알킬렌 또는 C2-C4 알케닐렌이거나; R5는 존재하지 않거나; 또는 R5는 C8 알킬렌, C7 알킬렌, C6 알킬렌, C5 알킬렌, C4 알킬렌, C3 알킬렌, C2 알킬렌, C1 알킬렌, C8 알케닐렌, C7 알케닐렌, C6 알케닐렌, C5 알케닐렌, C4 알케닐렌, C3 알케닐렌 또는 C2 알케닐렌이고; 나머지 모든 변수는 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제8 구현예에서, 본 개시내용의 이온화 가능한 지질은 화학식 (XXIV) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로 표시된다:
Figure pct00072
(XXIV)
[식 중, 나머지 모든 변수는 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같음].
제9 구현예에서, 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 화학식 (XXIV), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 따른 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서, R4는 C1-C14 비분지형 알킬, C2-C14 비분지형 알케닐 또는
Figure pct00073
이며, 여기서 R4a 및 R4b는, 각각 독립적으로, C1-C12 비분지형 알킬 또는 C2-C12 비분지형 알케닐이거나; R4는 C2-C12 비분지형 알킬 또는 C2-C12 비분지형 알케닐이거나; R4는 C5-C12 비분지형 알킬 또는 C5-C12 비분지형 알케닐이거나; R4는 C16 비분지형 알킬, C15 비분지형 알킬, C14 비분지형 알킬, C13 비분지형 알킬, C12 비분지형 알킬, C11 비분지형 알킬, C10 비분지형 알킬, C9 비분지형 알킬, C8 비분지형 알킬, C7 비분지형 알킬, C6 비분지형 알킬, C5 비분지형 알킬, C4 비분지형 알킬, C3 비분지형 알킬, C2 비분지형 알킬, C1 비분지형 알킬, C16 비분지형 알케닐, C15 비분지형 알케닐, C14 비분지형 알케닐, C13 비분지형 알케닐, C12 비분지형 알케닐, C11 비분지형 알케닐, C10 비분지형 알케닐, C9 비분지형 알케닐, C8 비분지형 알케닐, C7 비분지형 알케닐, C6 비분지형 알케닐, C5 비분지형 알케닐, C4 비분지형 알케닐, C3 비분지형 알케닐 또는 C2 알케닐이거나; R4는
Figure pct00074
이며, 여기서 R4a 및 R4b는, 각각 독립적으로, C2-C10 비분지형 알킬 또는 C2-C10 비분지형 알케닐이거나; 또는 R4는
Figure pct00075
이며, 여기서 R4a 및 R4b는, 각각 독립적으로, C16 비분지형 알킬, C15 비분지형 알킬, C14 비분지형 알킬, C13 비분지형 알킬, C12 비분지형 알킬, C11 비분지형 알킬, C10 비분지형 알킬, C9 비분지형 알킬, C8 비분지형 알킬, C7 비분지형 알킬, C6 비분지형 알킬, C5 비분지형 알킬, C4 비분지형 알킬, C3 비분지형 알킬, C2 알킬, C1 알킬, C16 비분지형 알케닐, C15 비분지형 알케닐, C14 비분지형 알케닐, C13 비분지형 알케닐, C12 비분지형 알케닐, C11 비분지형 알케닐, C10 비분지형 알케닐, C9 비분지형 알케닐, C8 비분지형 알케닐, C7 비분지형 알케닐, C6 비분지형 알케닐, C5 비분지형 알케닐, C4 비분지형 알케닐, C3 비분지형 알케닐 또는 C2 알케닐이고; 나머지 모든 변수는 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 화학식 (XXIV), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제10 구현예에서, 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 화학식 (XXIV), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 따른 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서, R3은 C3-C8 알킬렌 또는 C3-C8 알케닐렌, C3-C7 알킬렌 또는 C3-C7 알케닐렌, 또는 C3-C5 알킬렌 또는 C3-C5 알케닐렌이거나; R3은 C8 알킬렌, 또는 C7 알킬렌, 또는 C6 알킬렌, 또는 C5 알킬렌, 또는 C4 알킬렌, 또는 C3 알킬렌, 또는 C1 알킬렌, 또는 C8 알케닐렌, 또는 C7 알케닐렌, 또는 C6 알케닐렌, 또는 C5 알케닐렌, 또는 C4 알케닐렌, 또는 C3 알케닐렌이고; 나머지 모든 변수는 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 화학식 (XXIV), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제11 구현예에서, 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 화학식 (XXIV), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 따른 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서, R6a 및 R6b는, 각각 독립적으로, C7-C12 알킬 또는 C7-C12 알케닐이거나; R6a 및 R6b는, 각각 독립적으로, C8-C10 알킬 또는 C8-C10 알케닐이거나; 또는 R6a 및 R6b는, 각각 독립적으로, C12 알킬, C11 알킬, C10 알킬, C9 알킬, C8 알킬, C7 알킬, C12 알케닐, C11 알케닐, C10 알케닐, C9 알케닐, C8 알케닐 또는 C7 알케닐이고; 나머지 모든 변수는 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 화학식 (XXIV), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제12 구현예에서, 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 화학식 (XXIV), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 따른 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서, R6a와 R6b는 서로 동일한 탄소 원자 수를 함유하거나; R6a와 R6b는 동일하거나; 또는 R6a와 R6b는 모두 C12 알킬, C11 알킬, C10 알킬, C9 알킬, C8 알킬, C7 알킬, C12 알케닐, C11 알케닐, C10 알케닐, C9 알케닐, C8 알케닐 또는 C7 알케닐이고; 나머지 모든 변수는 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 화학식 (XXIV), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제13 구현예에서, 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 화학식 (XXIV), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 따른 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서, 전술한 구현예 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 R6a와 R6b는 각각 서로 상이한 탄소 원자 수를 함유하거나; R6a와 R6b의 탄소 원자 수는 1개 또는 2개의 탄소 원자만큼 다르거나; R6a와 R6b의 탄소 원자 수는 1개 탄소 원자만큼 다르거나; R6a는 C7 알킬이고 R6a는 C8 알킬이거나, R6a는 C8 알킬이고 R6a는 C7 알킬이거나, R6a는 C8 알킬이고 R6a는 C9 알킬이거나, R6a는 C9 알킬이고 R6a는 C8 알킬이거나, R6a는 C9 알킬이고 R6a는 C10 알킬이거나, R6a는 C10 알킬이고 R6a는 C9 알킬이거나, R6a는 C10 알킬이고 R6a는 C11 알킬이거나, R6a는 C11 알킬이고 R6a는 C10 알킬이거나, R6a는 C11 알킬이고 R6a는 C12 알킬이거나, R6a는 C12 알킬이고 R6a는 C11 알킬이거나, R6a는 C7 알킬이고 R6a는 C9 알킬이거나, R6a는 C9 알킬이고 R6a는 C7 알킬이거나, R6a는 C8 알킬이고 R6a는 C10 알킬이고, R6a는 C10 알킬이고 R6a는 C8 알킬이고, R6a는 C9 알킬이고 R6a는 C11 알킬이거나, R6a는 C11 알킬이고 R6a는 C9 알킬이거나, R6a는 C10 알킬이고 R6a는 C12 알킬이거나, R6a는 C12 알킬이고 R6a는 C10 알킬인 것 등이고; 나머지 모든 변수는 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 화학식 (XXIV), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
제14 구현예에서, 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 화학식 (XXIV), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 따른 이온화 가능한 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에서, R'는 존재하지 않고; 나머지 모든 변수는 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 화학식 (XXIV), 또는 전술한 구현예 중 어느 하나에 대해 기재된 바와 같다.
하나의 구현예에서, 본 개시내용의 이온화 가능한 지질, 또는 화학식 (XX), 화학식 (XXI), 화학식 (XXII), 화학식 (XXIII), 화학식 (XXIV)의 이온화 가능한 지질은, 표 8의 지질에서 선택되는 어느 하나의 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
특정예가 하기 예시 섹션에 제공되어 있으며, 이는 본원에 기재된 이온화 가능한 지질의 일부로 포함된다. 약학적으로 허용 가능한 염뿐 아니라, 중성 형태도 포함된다.
절단 가능한 지질
일부 구현예에 따르면, 캡시드 미함유 비바이러스성 DNA 벡터를 관심 표적 부위(예를 들어, 세포, 조직, 기관 등)에 전달하는 데 사용될 수 있는, 절단 가능한 지질과 캡시드 미함유 비바이러스성 벡터(예를 들어, ceDNA)를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 제공된다. 본원에 사용된 "절단 가능한 지질"이라는 용어는, 디설파이드 결합("SS") 절단 가능한 단위를 포함하는 양이온성 지질을 나타낸다. 하나의 구현예에서, SS-절단 가능한 지질은 막 불안정화를 위해 산성 구획(예를 들어, 엔도솜 또는 리소좀)에 반응하는 3차 아민과, 환원 환경(예를 들어, 세포질)에서 절단될 수 있는 디설파이드 결합을 포함한다. SS-절단 가능한 지질은 SS-절단 가능한 pH 활성화 지질 유사 물질, 예컨대 ss-OP 지질, ssPalm 지질, ss-M 지질, ss-E 지질, ss-EC 지질, ss-LC 지질 및 ss-OC 지질 등을 포함할 수 있다.
일부 구현예에 따르면, SS-절단 가능한 지질은 국제 특허 출원 공개공보 WO2019188867에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
본원에 입증된 바와 같이, 절단 가능한 지질을 포함하는 ceDNA 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 ceDNA의 표적 세포(예를 들어, 간세포 포함)로의 더 효율적인 전달을 제공한다. 본 개시내용은 이전에 기재된 LNP보다 크기가 상당히 작은 LNP를 제조하는 신규한 제형화 공정 및 방법을 제공한다. 일부 구현예에 따르면, 본원에 기재된 제형화 공정 및 방법에 따라 제조된 LNP의 크기는 평균 직경이 약 20 내지 약 70 nm 범위이며, 예를 들어 평균 직경이 약 20 nm 내지 약 70 nm, 약 25 nm 내지 약 70 nm, 약 30 nm 내지 약 70 nm, 약 35 nm 내지 약 70 nm, 약 40 nm 내지 약 70 nm, 약 45 nm 내지 약 80 nm, 약 50 nm 내지 약 70 nm, 약 60 nm 내지 약 70 nm, 약 65 nm 내지 약 70 nm, 또는 약 20 nm, 약 25 nm, 약 30 nm, 약 35 nm, 약 40 nm, 약 45 nm, 약 50 nm, 약 55 nm, 약 60 nm, 약 65 nm, 약 70 nm이다. 일부 구현예에 따르면, LNP의 평균 직경은 약 50 nm 내지 약 70 nm인데, 이는 유의하게 더 작은 크기이기 때문에, 면역 반응을 표적화하고 회피하는 데 유리하다. 나아가, 본원에 기재된 LNP는 ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 60% 초과 내지 약 90%를 캡슐화할 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 본원에 기재된 LNP는 ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 60% 초과, ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 65% 초과, ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 70% 초과, ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 75% 초과, ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 80% 초과, ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 85% 초과, 또는 ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 90% 초과를 캡슐화할 수 있다.
본원에 기재된 지질 입자(예를 들어, 나노입자)(예를 들어, ceDNA 지질 입자, mRNA 지질 입자)는, 다른 공정에 따라 제조된 LNP, 및 다른 지질, 예를 들어 이온화 가능한 양이온성 지질과 비교하여, 핵산(예를 들어, ceDNA, mRNA)의 표적 세포/조직으로의 전달을 증가시키는 데 유리하게 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 지질 입자(예를 들어, 나노입자)(예를 들어, ceDNA 지질 입자, mRNA 지질 입자)는 당업계에 공지된 공정 및 방법에 따라 제조된 지질 입자와 비교하여 최대 핵산 전달을 제공하였다. 메커니즘이 아직 결정되지 않았지만, 이론에 구애됨 없이, 본원에 기재된 공정에 따라 제조된 절단 가능한 지질을 포함하는 지질 입자(예를 들어, 나노입자)(예를 들어, ceDNA 지질 입자, mRNA 지질 입자)는 포식작용을 피하는 간세포로의 개선된 전달, 및 핵으로의 더 효율적인 트래피킹(trafficking)을 제공하는 것으로 여겨진다. 본원에 기재된 절단 가능한 지질을 포함하는 본원에 기재된 공정에 따라 제조된 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)(예를 들어, ceDNA 지질 입자, mRNA 지질 입자)의 또 다른 이점은 다른 지질, 예를 들어 이온화 가능한 양이온성 지질, 예를 들어 MC3에 비해 더 우수한 내약성을 나타낸다는 점이다.
하나의 구현예에서, 절단 가능한 지질은 아민 헤드기, 링커기 및 소수성 테일(들)의 3가지 구성요소를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 절단 가능한 지질은 하나 이상의 페닐 에스테르 결합, 하나 이상의 3차 아미노기 및 디설파이드 결합을 포함한다. 3차 아민기는 pH 반응성을 제공하고 엔도솜 탈출을 유도하며, 페닐 에스테르 결합은 구조의 분해성(자가 분해성)을 증강시키고, 디설파이드 결합은 환원 환경에서 절단된다.
하나의 구현예에서, 절단 가능한 지질은 ss-OP 지질이다. 하나의 구현예에서, ss-OP 지질은 하기 화학식 A에 제시된 구조를 포함한다:
지질 A
Figure pct00079
하나의 구현예에서, SS-절단 가능한 지질은 SS-절단 가능한 pH 활성화 지질 유사 물질(ssPalm)이다. ssPalm 지질은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Togashi et al., Journal of Controlled Release, 279 (2018) 262-270] 참조(상기 문헌의 전체 내용은 본원에 참조로 인용됨). 하나의 구현예에서, ssPalm은 지질 B의 구조를 포함하는 ssPalmM 지질이다.
지질 B
Figure pct00080
하나의 구현예에서, ssPalmE 지질은 지질 C의 구조를 포함하는 ssPalmE-P4-C2 지질이다.
지질 C
Figure pct00081
하나의 구현예에서, ssPalmE 지질은 지질 D의 구조를 포함하는 ssPalmE-Paz4-C2 지질이다.
지질 D
Figure pct00082
하나의 구현예에서, 절단 가능한 지질은 ss-M 지질이다. 하나의 구현예에서, ss-M 지질은 하기 지질 E에 제시된 구조를 포함한다:
지질 E
Figure pct00083
하나의 구현예에서, 절단 가능한 지질은 ss-E 지질이다. 하나의 구현예에서, ss-E 지질은 하기 지질 F에 제시된 구조를 포함한다:
지질 F
Figure pct00084
하나의 구현예에서, 절단 가능한 지질은 ss-EC 지질이다. 하나의 구현예에서, ss-EC 지질은 하기 지질 G에 제시된 구조를 포함한다:
지질 G
Figure pct00085
하나의 구현예에서, 절단 가능한 지질은 ss-LC 지질이다. 하나의 구현예에서, ss-LC 지질은 하기 지질 H에 제시된 구조를 포함한다:
지질 H
Figure pct00086
하나의 구현예에서, 절단 가능한 지질은 ss-OC 지질이다. 하나의 구현예에서, ss-OC 지질은 하기 지질 J에 제시된 구조를 포함한다:
지질 J
Figure pct00087
하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 제형은 2018년 9월 7일자 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2018/050042에 개시된 바와 같은 방법으로 수득된 ceDNA로 제조되고 로딩되며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 이는, 지질을 양성자화하고 ceDNA/지질 회합 및 입자의 핵형성에 유용한 에너지를 제공하는, 낮은 pH에서의 에탄올성 지질과 수성 ceDNA의 고에너지 혼합에 의해 달성될 수 있다. 상기 입자는 수성 희석 및 유기 용매의 제거를 통해 추가로 안정화될 수 있다. 상기 입자는 목적하는 수준으로 농축될 수 있다. 하나의 구현예에서, 본 개시내용은 실시예 2에 기재된 바와 같은 공정에 따라 제조된 화학식 I의 지질을 포함하는 ceDNA 지질 입자를 제공한다.
일반적으로, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 약 10:1 내지 60:1의 총 지질 대 ceDNA의 (질량 또는 중량)비로 제조된다. 일부 구현예에서, 지질 대 ceDNA 비(질량/질량 비; w/w 비)는 약 1:1 내지 약 60:1, 약 1:1 내지 약 55:1, 약 1:1 내지 약 50:1, 약 1:1 내지 약 45:1, 약 1:1 내지 약 40:1, 약 1:1 내지 약 35:1, 약 1:1 내지 약 30:1, 약 1:1 내지 약 25:1, 약 10:1 내지 약 14:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1, 약 6:1 내지 약 9:1; 약 30:1 내지 약 60:1 범위일 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 약 60:1의 ceDNA(질량 또는 중량) 대 총 지질의 비로 제조된다. 일부 구현예에 따르면, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 약 30:1의 ceDNA(질량 또는 중량) 대 총 지질의 비로 제조된다. 지질과 ceDNA의 양은 목적하는 N/P 비, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 N/P 비를 제공하도록 조정될 수 있다. 일반적으로, 지질 입자 제형의 전체 지질 함량은 약 5 mg/ml 내지 약 30 mg/mL 범위일 수 있다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자는 ceDNA와 같은 핵산 카고를 응축 및/또는 캡슐화하는 작용제를 포함한다. 이러한 작용제는 본원에서 응축제 또는 캡슐화제로도 지칭된다. 비제한적으로, 핵산을 응축 및/또는 캡슐화하는 당업계에 공지된 임의의 화합물은, 이것이 비융합원성인 한, 사용될 수 있다. 다시 말해서, ceDNA와 같은 핵산 카고를 응축 및/또는 캡슐화할 수 있지만, 융합 활성이 거의 없거나 없는 작용제. 이론에 구애됨 없이, 응축제는 ceDNA와 같은 핵산을 응축/캡슐화하지 않을 때 어느 정도 융합 활성을 나타낼 수 있지만, 상기 응축제를 이용하여 형성된 핵산 캡슐화 지질 나노입자는 비융합원성일 수 있다. 본원에 기재된 제형화 공정은, ceDNA 콤팩트화가 에탄올 함량이 높은 용매에서 일어난다는 발견을 이용한다. 수성 ceDNA(90% EtOH)가, 생성되는 용액이 에탄올 90% 내지 92%와 물 8% 내지 10%가 되도록 하는 비로, 지질의 에탄올성 용액(예를 들어, 90% EtOH)에 첨가되는 경우, ceDNA는 동적 광산란에 의해 콤팩트화된 상태로 존재하는 것으로 관찰된다. 이러한 용매(에탄올 90% 내지 92%, 물 8% 내지 10%)에서, 지질과 ceDNA는 이러한 구성요소 중 어느 하나의 검출 가능한 침전 없이 모두 가용화된다.
일부 구현예에 따르면, 본 개시내용에 기재된 제형화 공정 및 방법은 이전에 보고된 것보다 상당히 더 많은 이중가닥 DNA(예를 들어, ceDNA)를 캡슐화할 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 본원에 기재된 LNP는 ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 60% 초과, ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 65% 초과, ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 70% 초과, ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 75% 초과, ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 80% 초과, ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 85% 초과, 또는 ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 90% 초과를 캡슐화할 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 용매는 에탄올 약 80%와 물 약 20%를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 용매는 에탄올 약 81%와 물 약 19%를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 용매는 에탄올 약 82%와 물 약 18%를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 용매는 에탄올 약 83%와 물 약 17%를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 용매는 에탄올 약 84%와 물 약 16%를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 용매는 에탄올 약 85%와 물 약 15%를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 용매는 에탄올 약 86%와 물 약 14%를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 용매는 에탄올 약 87%와 물 약 13%를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 용매는 에탄올 약 88%와 물 약 12%를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 용매는 에탄올 약 89%와 물 약 11%를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 용매는 에탄올 약 90%와 물 약 10%를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 용매는 에탄올 약 91%와 물 약 9%를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 용매는 에탄올 약 92%와 물 약 8%를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 용매는 에탄올 약 93%와 물 약 7%를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 용매는 에탄올 약 94%와 물 약 6%를 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 용매는 에탄올 약 95%와 물 약 5%를 포함한다.
양이온성 지질은 전형적으로 낮은 pH에서 핵산 카고, 예를 들어 ceDNA를 응축시키고, 막 회합과 융합원성을 유도하는 데 이용된다. 일반적으로, 양이온성 지질은 산성 조건 하에서, 예를 들어 6.5 이하의 pH에서 양으로 하전되거나 양성자화되는 적어도 하나의 아미노기를 포함하는 지질이다. 양이온성 지질은 또한 이온화 가능한 지질, 예를 들어 이온화 가능한 양이온성 지질일 수 있다. "비융합원성 양이온성 지질"이란, ceDNA와 같은 핵산 카고를 응축 및/또는 캡슐화할 수 있지만, 융합 활성이 없거나 거의 없는 양이온성 지질을 의미한다.
하나의 구현예에서, 양이온성 지질은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 20%(몰) 내지 90%(몰)를 차지할 수 있다. 예를 들어, 양이온성 지질의 몰 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 20%(몰) 내지 70%(몰), 30%(몰) 내지 60%(몰), 40%(몰) 내지 60%(몰), 40% 내지 55%(몰), 또는 45%(몰) 내지 55%(몰)일 수 있다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 약 50 몰% 내지 약 90 몰%를 차지한다.
하나의 구현예에서, SS-절단 가능한 지질은 MC3, 즉 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-MC3-DMA 또는 MC3)가 아니다. DLin-MC3-DMA는 문헌[Jayaraman et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. (2012), 51(34): 8529-8533]에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다. D-Lin-MC3-DMA(MC3)의 구조는 하기에 지질 K로 제시되어 있다:
지질 K
Figure pct00088
하나의 구현예에서, 절단 가능한 지질은 지질 ATX-002가 아니다. 지질 ATX-002는 WO2015/074085에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다. 하나의 구현예에서, 절단 가능한 지질은 (13Z,16Z)-N,N-디메틸-3-노닐도코사-13,16-디엔-1-아민(화합물 32)이 아니다. 화합물 32는 WO2012/040184에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다. 하나의 구현예에서, 절단 가능한 지질은 화합물 6 또는 화합물 22가 아니다. 화합물 6과 화합물 22는 WO2015/199952에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
양이온성 지질의 비제한적인 예에는, SS-절단 가능한 pH 활성화 지질 유사 물질-OP(ss-OP; 화학식 I), SS-절단 가능한 pH 활성화 지질 유사 물질-M(SS-M; 화학식 V), SS-절단 가능한 pH 활성화 지질 유사 물질-E(SS-E; 화학식 VI), SS-절단 가능한 pH 활성화 지질 유사 물질-EC(SS-EC; 화학식 VII), SS-절단 가능한 pH 활성화 지질 유사 물질-LC(SS-LC; 화학식 VIII), SS-절단 가능한 pH 활성화 지질 유사 물질-OC(SS-OC; 화학식 IX), 폴리에틸렌이민, 폴리아미도아민(PAMAM) 별모양(starburst) 덴드리머, 리포펙틴(Lipofectin)(DOTMA와 DOPE의 조합물), 리포펙타아제(Lipofectase), LIPOFECTAMINE™(예를 들어, LIPOFECTAMINE™ 2000), DOPE, 사이토펙틴(Cytofectin)(Gilead Sciences, Foster City, Calif.) 및 유펙틴(Eufectin)(JBL, San Luis Obispo, Calif.)이 포함된다. 예시적인 양이온성 리포솜은 N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA), N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸설페이트(DOTAP), 3b-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카르바모일]콜레스테롤(DC-Chol), 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민카르복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트(DOSPA), 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸히드록시에틸암모늄 브로마이드; 및 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드(DDAB)로부터 제조될 수 있다. 핵산(예를 들어, ceDNA 또는 CELiD)은 또한, 예를 들어 폴리(L-리신) 또는 아비딘과 복합체화될 수 있으며, 지질은 이러한 혼합물, 예를 들어 스테릴-폴리(L-리신)에 포함되거나 포함되지 않을 수 있다.
하나의 구현예에서, 양이온성 지질은 화학식 I의ss-OP이다. 또 다른 구현예에서, 양이온성 지질은 화학식 II의 SS-PAZ이다.
하나의 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 미국 특허 제8,158,601호 기재된 양이온성 지질, 또는 미국 특허 제8,034,376호 기재된 바와 같은 폴리아민 화합물 또는 지질을 사용하여 전달된다.
비양이온성 지질
하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 비양이온성 지질을 추가로 포함할 수 있다. 비양이온성 지질은 융합원성을 증가시키고, 또한 형성 동안 LNP의 안정성을 증가시키는 역할을 할 수 있다. 비양이온성 지질에는, 양친매성 지질, 중성 지질 및 음이온성 지질이 포함된다. 따라서, 비양이온성 지질은 중성의 하전되지 않은 지질, 쯔비터이온성 지질 또는 음이온성 지질일 수 있다. 비양이온성 지질은 전형적으로 융합원성을 증강시키는 데 이용된다.
예시적인 비양이온성 지질에는, 비제한적으로, 디스테아로일-sn-글리세로포스포에탄올아민, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 모노메틸포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-모노메틸 PE), 디메틸포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-디메틸 PE), 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일포스파티딜에탄올아민(SOPE), 수소첨가된 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 달걀 포스파티딜콜린(EPC), 디올레오일포스파티딜세린(DOPS), 스핑고미엘린(SM), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디에루코일포스파티딜콜린(DEPC), 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 디엘라이도일포스파티딜에탄올아민(DEPE), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPHyPE); 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소레시틴, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 달걀 스핑고미엘린(ESM), 세팔린, 카디오리핀, 포스파티드산, 세레브로시드, 디세틸포스페이트, 리소포스파티딜콜린, 디리놀레오일포스파티딜콜린, 또는 이들의 혼합물이 포함된다. 다른 디아실포스파티딜콜린과 디아실포스파티딜에탄올아민 인지질도 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 이러한 지질 내 아실기는 바람직하게는 C10-C24 탄소 사슬을 갖는 지방산, 예를 들어 라우로일, 미리스토일, 팔미토일, 스테아로일 또는 올레오일에서 유도된 아실기이다.
지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 사용하기에 적합한 비양이온성 지질의 다른 예에는, 예를 들어 스테아릴아민, 도데실아민, 헥사데실아민, 아세틸 팔미테이트, 글리세롤리시놀레에이트, 헥사데실 스테아레이트, 이소프로필 미리스테이트, 양쪽성 아크릴계 중합체, 트리에탄올아민-라우릴 설페이트, 알킬-아릴 설페이트 폴리에틸옥실화 지방산 아미드, 디옥사데실디메틸 암모늄 브로마이드, 세라미드, 스핑고미엘린 등과 같은 인을 함유하지 않는 지질이 포함된다.
하나의 구현예에서, 비양이온성 지질은 인지질이다. 하나의 구현예에서, 비양이온성 지질은 DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE 및 SM으로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 구현예에서, 비양이온성 지질은 DSPC이다. 다른 구현예에서, 비양이온성 지질은 DOPC이다. 다른 구현예에서, 비양이온성 지질은 DOPE이다.
일부 구현예에서, 비양이온성 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 0%(몰) 내지 20%(몰)를 차지할 수 있다. 일부 구현예에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 0.5%(몰) 내지 15%(몰)이다. 일부 구현예에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 5%(몰) 내지 12%(몰)이다. 일부 구현예에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 5%(몰) 내지 10%(몰)이다. 하나의 구현예에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 약 6%(몰)이다. 하나의 구현예에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 약 7.0%(몰)이다. 하나의 구현예에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 약 7.5%(몰)이다. 하나의 구현예에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 약 8.0%(몰)이다. 하나의 구현예에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 약 9.0%(몰)이다. 일부 구현예에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 약 10%(몰)이다. 하나의 구현예에서, 비양이온성 지질 함량은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 약 11%(몰)이다.
예시적인 비양이온성 지질은 국제 출원 특허 공개공보 WO2017/099823 및 미국 특허 출원 공개공보 US2018/0028664에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 모두 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 지질 입자의 막 온전성과 안정성을 제공하기 위해 스테롤과 같은 구성요소를 추가로 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 지질 입자에 사용될 수 있는 예시적인 스테롤은 콜레스테롤 또는 이의 유도체이다. 콜레스테롤 유도체의 비제한적인 예에는, 5α-콜레스탄올, 5β-코프로스탄올, 콜레스테릴-(2'-히드록시)에틸 에테르, 콜레스테릴-(4'-히드록시)부틸 에테르 및 6-케토콜레스탄올과 같은 극성 유사체; 5α-콜레스탄, 콜레스테논, 5α-콜레스타논, 5β-콜레스타논 및 콜레스테릴 데카노에이트와 같은 비극성 유사체; 및 이들의 혼합물이 포함된다. 일부 구현예에서, 콜레스테롤 유도체는 콜레스테릴-(4'-히드록시)부틸 에테르와 같은 극성 유사체이다. 일부 구현예에서, 콜레스테롤 유도체는 콜레스테릴 헤미숙시네이트(CHEMS)이다.
예시적인 콜레스테롤 유도체는 국제 특허 출원 공개공보 WO2009/127060 및 미국 특허 출원 공개공보 US2010/0130588에 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 모두 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
하나의 구현예에서, 스테롤과 같은 막 온전성을 제공하는 구성요소는, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 존재하는 총 지질의 0%(몰) 내지 50%(몰)를 차지할 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 구성요소는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 총 지질 함량의 20%(몰) 내지 50%(몰)이다. 일부 구현예에서, 이러한 구성요소는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 총 지질 함량의 30%(몰) 내지 40%(몰)이다. 일부 구현예에서, 이러한 구성요소는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 총 지질 함량의 35%(몰) 내지 45%(몰)이다. 일부 구현예에서, 이러한 구성요소는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 총 지질 함량의 38%(몰) 내지 42%(몰)이다.
하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 접합된 지질 분자를 추가로 포함할 수 있다. 일반적으로, 이들은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 응집을 저해하고/하거나 입체 안정화를 제공하기 위해 사용된다. 예시적인 접합된 지질에는, 비제한적으로, PEG-지질 접합체, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 접합체, 폴리아미드-지질 접합체(예컨대, ATTA-지질 접합체), 양이온성 중합체-지질(CPL) 접합체, 및 이들의 혼합물이 포함된다. 일부 구현예에서, 접합된 지질 분자는 PEG화된 지질, 예를 들어 (메톡시 폴리에틸렌글리콜)-접합된 지질이다. 일부 다른 구현예에서, PEG화된 지질은 PEG2000-DMG(디미리스토일글리세롤)이다.
예시적인 PEG화된 지질에는, 비제한적으로, PEG-디아실글리세롤(DAG)(예컨대, 1-(모노메톡시폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG)), PEG-디알킬옥시프로필(DAA), PEG-인지질, PEG-세라미드(Cer), PEG화 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE), PEG 숙시네이트 디아실글리세롤(PEGS-DAG)(예컨대, 4-O-(2',3'-디(테트라데카노일옥시)프로필-1-O-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)부탄디오에이트(PEG-S-DMG)), PEG 디알콕시프로필카르밤, N-(카르보닐메톡시폴리에틸렌글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 소듐 염, 또는 이들의 혼합물이 포함된다. 추가의 예시적인 PEG-지질 접합체는, 예를 들어 US5,885,613, US6,287,591, US2003/0077829, US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2010/0130588, US2016/0376224 및 US2017/0119904에 기재되어 있으며, 모든 상기 문헌들의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
하나의 구현예에서, PEG-DAA PEG화된 지질은, 예를 들어 PEG-디라우릴옥시프로필, PEG-디미리스틸옥시프로필, PEG-디팔미틸옥시프로필 또는 PEG-디스테아릴옥시프로필일 수 있다. PEG-지질은 PEG-DMG, PEG-디라우릴글리세롤, PEG-디팔미토일글리세롤, PEG-디스테릴글리세롤, PEG-디라우릴글리카미드, PEG-디미리스틸글리카미드, PEG-디팔미토일글리카미드, PEG-디스테릴글리카미드, PEG-콜레스테롤(1-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카르복사미도-3',6'-디옥사옥타닐]카르바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜), PEG-DMB(3,4-디테트라데콕시벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜)에테르) 및 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000] 중 하나 이상일 수 있다. 하나의 구현예에서, PEG-지질은 PEG-DMG, 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000],
Figure pct00089
,
Figure pct00090
,
Figure pct00091
및
Figure pct00092
로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, PEG화된 지질은 N-(카르보닐메톡시폴리에틸렌글리콜n)-1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DMPE-PEGn, 여기서 n은 350, 500, 750, 1000 또는 2000임), N-(카르보닐메톡시폴리에틸렌글리콜n)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEGn, 여기서 n은 350, 500, 750, 1000 또는 2000임), DSPE-폴리글리세린시클로헥실카르복실산, DSPE-폴리글리세린-2-메틸글루타르카르복실산, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE) 접합된 폴리에틸렌글리콜(DSPE-PEG-OH), 폴리에틸렌글리콜-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG), 폴리에틸렌글리콜-디스테아로일글리세롤(PEG-DSG), 또는 N-옥타노일스핑고신-1-{숙시닐[메톡시(폴리에틸렌글리콜)2000]}(C8 PEG2000 세라미드)로 이루어지는 군에서 선택된다. DMPE-PEG n (여기서, n은 350, 500, 750, 1000 또는 2000임)의 일부 예에서, PEG-지질은 N-(카르보닐메톡시폴리에틸렌글리콜 2000)-1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DMPE-PEG 2000)이다. DSPE-PEG n (여기서, n은 350, 500, 750, 1000 또는 2000임)의 일부 예에서, PEG-지질은 N-(카르보닐메톡시폴리에틸렌글리콜 2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE-PEG 2000)이다. 일부 구현예에서, PEG-지질은 DSPE-PEG-OH이다. 일부 바람직한 구현예에서, PEG-지질은 PEG-DMG이다.
일부 구현예에서, 접합된 지질, 예를 들어 PEG화된 지질에는 조직 특이적 표적화 리간드, 예를 들어 제1 또는 제2 표적화 리간드가 포함된다. 예를 들어, GalNAc 리간드와 접합된 PEG-DMG.
하나의 구현예에서, PEG 이외의 분자와 접합된 지질이 또한 PEG-지질 대신 사용될 수 있다. 예를 들어, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 접합체, 폴리아미드-지질 접합체(예컨대, ATTA-지질 접합체) 및 양이온성 중합체-지질(CPL) 접합체가 PEG-지질 대신 또는 이에 더하여 사용될 수 있다. 예시적인 접합된 지질, 즉, PEG-지질, (POZ)-지질 접합체, ATTA-지질 접합체 및 양이온성 중합체-지질은 국제 특허 출원 공개공보 WO 1996/010392, WO1998/051278, WO2002/087541, WO2005/026372, WO2008/147438, WO2009/086558, WO2012/000104, WO2017/117528, WO2017/099823, WO2015/199952, WO2017/004143, WO2015/095346, WO2012/000104, WO2012/000104 및 WO2010/006282, 미국 특허 출원 공개공보 US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2013/0303587, US2018/0028664, US2015/0376115, US2016/0376224, US2016/0317458, US2013/0303587, US2013/0303587 및 US20110123453, 및 미국 특허 US5,885,613호, US6,287,591호, US6,320,017호 및 US6,586,559호에 기재되어 있으며, 상기 모든 문헌들의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
일부 구현예에서, PEG화된 지질은 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 0%(몰) 내지 20%(몰)를 차지할 수 있다. 일부 구현예에서, PEG화된 지질 함량은 0.5%(몰) 내지 10%(몰)이다. 일부 구현예에서, PEG화된 지질 함량은 1%(몰) 내지 5%(몰)이다. 일부 구현예에서, PEG화된 지질 함량은 2%(몰) 내지 4%(몰)이다. 일부 구현예에서, PEG화된 지질 함량은 2%(몰) 내지 3%(몰)이다. 하나의 구현예에서, PEG화된 지질 함량은 약 2%(몰)이다. 하나의 구현예에서, PEG화된 지질 함량은 약 2.5%(몰)이다. 일부 구현예에서, PEG화된 지질 함량은 약 3%(몰)이다. 하나의 구현예에서, PEG화된 지질 함량은 약 3.5%(몰)이다. 하나의 구현예에서, PEG화된 지질 함량은 약 4%(몰)이다.
양이온성 지질, 예를 들어 이온화 가능한 양이온성 지질과, 비양이온성 지질, 스테롤 및 PEG화된 지질의 몰비는 필요에 따라 달라질 수 있다고 이해된다. 예를 들어, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 30% 내지 70%의 양이온성 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 0% 내지 60%의 콜레스테롤, 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 0% 내지 30%의 비양이온성 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량 기준으로 2% 내지 5%의 PEG화된 지질을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 조성물은 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 40% 내지 60%의 양이온성 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 30% 내지 50%의 콜레스테롤, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 5% 내지 15%의 비양이온성 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 2% 내지 5%의 PEG 또는 접합된 지질을 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 조성물은 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 40% 내지 60% 양이온성 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 30% 내지 40%의 콜레스테롤, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 5% 내지 10%의 비양이온성 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 2% 내지 5%의 PEG화된 지질이다. 상기 조성물은 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 60% 내지 70%의 양이온성 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 25% 내지 35%의 콜레스테롤, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 5% 내지 10% 비양이온성 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 2% 내지 5%의 PEG화된 지질을 함유할 수 있다. 상기 조성물은 또한 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 최대 45% 내지 55%의 양이온성 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 35% 내지 45%의 콜레스테롤, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 2% 내지 15%의 비양이온성 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 2% 내지 5%의 PEG화된 지질을 함유할 수 있다. 상기 제형은 또한, 예를 들어 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 8% 내지 30%의 양이온성 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 5% 내지 15%의 비양이온성 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 0% 내지 40%의 콜레스테롤; 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 4% 내지 25% 양이온성 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 4% 내지 25%의 비양이온성 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 2% 내지 25%의 콜레스테롤, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 10% 내지 35%의 접합된 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 5%의 콜레스테롤; 또는 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 2% 내지 30%의 양이온성 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 2% 내지 30%의 비양이온성 지질, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 1% 내지 15%의 콜레스테롤, 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 2% 내지 35%의 PEG화된 지질, 및 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 1% 내지 20%의 콜레스테롤; 또는 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 심지어 최대 90%의 양이온성 지질과 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 2% 내지 10%의 비양이온성 지질, 또는 조성물의 몰 또는 총 중량을 기준으로 심지어 100%의 양이온성 지질을 포함하는 지질 나노입자 제형일 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 입자 제형은 양이온성 지질, 비양이온성 인지질, 콜레스테롤 및 PEG화된 지질(접합된 지질)을 약 50:9:38.5:2.5의 몰비로 포함한다.
하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 제형은 양이온성 지질, 비양이온성 인지질, 콜레스테롤 및 PEG화된 지질(접합된 지질)을 약 50:7:40:3의 몰비로 포함한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 인지질, 레시틴, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 나노입자 제형을 제공한다.
하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 양이온성 지질, 비양이온성 지질(예를 들어, 인지질), 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤) 및 PEG화된 지질(접합된 지질)을 포함하며, 여기서 양이온성 지질의 몰비는 20 몰% 내지 70 몰% 범위(여기서, 목표는 30 몰% 내지 60 몰%임)이고, 비양이온성 지질의 몰%는 0 몰% 내지 30 몰% 범위(여기서, 목표는 0 몰% 내지 15 몰%임)이고, 스테롤의 몰%는 20 몰% 내지 70 몰% 범위(여기서, 목표는 30 몰% 내지 50 몰%임)이고, PEG화된 지질(접합된 지질)의 몰%는 1 몰% 내지 6 몰% 범위(여기서, 목표는 2 몰% 내지 5 몰%임)이다.
ceDNA를 포함하는 지질 나노입자(LNP)는 2018년 9월 7일자 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2018/050042에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용되고, 본원에 개시된 바와 같은 방법 및 조성물에의 사용을 위해 고려된다.
지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 크기는 Malvern Zetasize Nano ZS(Malvern, UK)를 사용하여 준탄성 광산란에 의해 측정될 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 광산란에 의해 측정된 LNP 평균 직경은 약 75 nm 미만 또는 약 70 nm 미만이다. 일부 구현예에 따르면, 광산란에 의해 측정된 LNP 평균 직경은 약 50 nm 내지 약 75 nm 또는 약 50 nm 내지 약 70 nm이다.
제형화된 양이온성 지질의 pKa는 핵산의 전달을 위한 LNP의 효과와 상관관계가 있을 수 있다(문헌[Jayaraman et al, Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51(34), 8529-8533]; 문헌[Semple et al, Nature Biotechnology 28, 172-176 (2010)] 참조, 상기 문헌들은 모두 그 전문이 본원에 참조로 인용됨). 하나의 구현예에서, 각각의 양이온성 지질의 pKa는 2-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌 설폰산(TNS)의 형광을 기반으로 하는 검정을 사용하여 지질 나노입자에서 결정된다. PBS 중에 총 지질 농도 0.4 mM로 양이온성 지질/DSPC/콜레스테롤/PEG-지질(50/10/38.5/1.5(몰%))을 포함하는 지질 나노입자는, 본원 및 다른 곳에 기재된 바와 같은 인라인(in-line) 공정을 사용하여 제조될 수 있다. TNS는 증류수 중에 100 mM 스톡 용액으로 제조될 수 있다. 소포는 10 mM HEPES, 10 mM MES, 10 mM 암모늄 아세테이트, 130 mM NaCl을 함유하는 완충액 2 mL 중에 24 mM 지질로 희석될 수 있으며, 여기서 pH는 2.5 내지 11 범위이다. 분취량의 TNS 용액을 첨가하여 최종 농도 1 mM을 제공하고, 볼텍싱 혼합 후, 실온에서 SLM Aminco 시리즈 2 발광 분광광도계로 321 nm 및 445 nm의 여기 및 방출 파장을 사용하여 형광 광도를 측정한다. 시그모이드 최적합(sigmoidal best fit) 분석을 형광 데이터에 적용할 수 있으며, pKa는 최대 형광 강도의 절반이 되는 pH로 측정한다.
하나의 구현예에서, 상대 활성은 꼬리 정맥 주사를 통한 투여 4시간 후 간에서의 루시퍼라아제 발현을 측정하여 결정할 수 있다. 활성을 0.3 mg ceDNA/kg 및 1.0 mg ceDNA/kg 용량에서 비교하고, 투여 4시간 후에 측정된 루시퍼라아제 ng/간 g으로 표시한다.
비제한적으로, 본 개시내용의 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 캡시드 미함유 비바이러스성 DNA 벡터를 관심 표적 부위(예를 들어, 세포, 조직, 기관 등)에 전달하는 데 사용될 수 있는 지질 제형을 포함한다. 일반적으로, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 캡시드 미함유 비바이러스성 DNA 벡터와, 양이온성 지질 또는 이의 염을 포함한다.
하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 양이온성 지질/비양이온성 지질/스테롤/접합된 지질을 50:10:38.5:1.5의 몰비로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본 개시내용은 인지질, 레시틴, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 제형을 제공한다.
III. 강성 치료용 핵산
본 개시내용의 양태는 일반적으로 폐쇄형 DNA(ceDNA)와 같은 강성 치료용 핵산(TNA)과 지질을 포함하는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)를 제공한다.
폐쇄형 DNA(ceDNA) 벡터
본 개시내용의 구현예는 전이유전자(예를 들어, 치료용 핵산)를 발현시킬 수 있는 폐쇄형 선형 이중체(ceDNA) 벡터를 포함하는 방법 및 조성물을 기반으로 한다. 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터는 바이러스 캡시드 내 제한적인 공간에 의해 부과되는 패키징 제약이 없다. ceDNA 벡터는, 캡슐화된 AAV 게놈과 대조적으로, 원핵생물에서 생산된 플라스미드 DNA 벡터에 대한 실행 가능한 진핵생물에서 생산된 대안을 나타낸다. 이는, 제어 요소, 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 조절 스위치, 대형 전이유전자, 다중 전이유전자 등의 삽입을 허용한다.
ceDNA 벡터는 바람직하게는 비연속 구조라기보다는 선형 및 연속 구조이다. 선형 및 연속 구조는 세포 엔도뉴클레아제에 의한 공격으로부터 보다 안정적일 뿐 아니라, 재조합되어 돌연변이를 유발할 가능성이 적은 것으로 여겨진다. 따라서, 선형 및 연속 구조의 ceDNA 벡터가 바람직한 구현예이다. 연속, 선형, 단일가닥 분자내 이중체 ceDNA 벡터는, AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 서열 없이, 공유결합으로 결합된 말단을 가질 수 있다. 이러한 ceDNA 벡터는 박테리아 기원의 원형 이중체 핵산 분자인 플라스미드(본원에 기재된 ceDNA 플라스미드 포함)와 구조적으로 구별된다. 플라스미드의 상보적 가닥은 변성 후 분리되어 2개의 핵산 분자를 생성하지만, 대조적으로, 상보적 가닥을 갖는 ceDNA 벡터는, 단일 DNA 분자이기 때문에, 변성되더라도 단일 분자로 남아있을 가능성이 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는, 플라스미드와 달리, 원핵생물 유형의 DNA 염기 메틸화 없이 생산될 수 있다. 따라서, ceDNA 벡터와 ceDNA-플라스미드는 구조(특히, 선형 대 원형)의 측면에서, 또한 이러한 상이한 대상을 생산하고 정제하는 데 사용되는 방법의 측면에서, 또한 ceDNA-플라스미드의 경우 원핵생물 유형이고 ceDNA 벡터의 경우 진핵생물 유형인 이의 DNA 메틸화의 측면에서 모두 상이하다.
공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖는 비바이러스성 캡시드 미함유 ceDNA 분자(ceDNA)가 본원에 제공된다. 이러한 비바이러스성 캡시드 미함유 ceDNA 분자는 2개의 상이한 역말단반복(ITR) 서열 사이에 배치된 이종 유전자(예를 들어, 전이유전자, 특히 치료용 전이유전자)를 함유하는 발현 구조체(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드, ceDNA-바큐로바이러스 또는 통합된 세포주)로부터의 허용 숙주세포에서 생산될 수 있으며, 여기서 ITR은 서로 상이하다. 일부 구현예에서, ITR 중 하나는 야생형 ITR 서열(예를 들어, AAV ITR)과 비교하여 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형된 것이며; ITR 중 적어도 하나는 기능성 말단 분해 부위(trs)와 Rep 결합 부위를 포함한다. ceDNA 벡터는 바람직하게는 이중체이며, 예를 들어 발현 카세트와 같은 분자의 적어도 일부에 걸쳐 자가 상보적이다(예를 들어, ceDNA는 이중가닥 원형 분자가 아님). ceDNA 벡터는 공유결합으로 폐쇄된 말단을 갖기 때문에, 예를 들어 37℃에서 1시간 초과 동안 엑소뉴클레아제 소화(예를 들어, 엑소뉴클레아제 I 또는 엑소뉴클레아제 III)에 대한 내성이 있다.
하나의 양태에서, ceDNA 벡터는, 5'→3' 방향으로, 제1 아데노연관바이러스(AAV) 역말단반복서열(ITR), 관심 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 발현 카세트) 및 제2 AAV ITR을 포함한다. 하나의 구현예에서, 제1 ITR(5' ITR)과 제2 ITR(3' ITR)은 서로 비대칭이며, 즉, 서로 상이한 3D 공간 구성을 갖는다. 예시적인 구현예로서, 제1 ITR은 야생형 ITR이고, 제2 ITR은 돌연변이되거나 변형된 ITR일 수 있거나, 또는 그 반대로 제1 ITR은 돌연변이되거나 변형된 ITR이고, 제2 ITR은 야생형 ITR일 수 있다. 하나의 구현예에서, 제1 ITR과 제2 ITR은 모두 변형된 것이지만, 상이한 서열이거나, 상이한 변형을 갖거나, 또는 동일한 변형된 ITR이 아니며, 상이한 3D 공간 구성을 갖는다. 달리 말하면, 비대칭인 ITR을 갖는 ceDNA 벡터는, WT-ITR에 대한 하나의 ITR에서의 임의의 변화가 다른 하나의 ITR에 반영되지 않거나; 또는 대안적으로, 비대칭인 ITR이 변형된 비대칭 ITR 쌍을 갖고 서로에 대해 상이한 서열과 상이한 3차원 형상을 가질 수 있는 ITR을 갖는다.
하나의 구현예에서, ceDNA 벡터는, 5'→3' 방향으로, 제1 아데노연관바이러스(AAV) 역말단반복서열(ITR), 관심 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 발현 카세트) 및 제2 AAV ITR을 포함하고, 여기서 제1 ITR(5' ITR)과 제2 ITR(3' ITR)은 서로에 대해 대칭이거나 실질적으로 대칭이며, 즉, ceDNA 벡터는, 이의 구조가 기하학적 공간에서 동일한 형상이거나, 3D 공간에서 동일한 A, C-C' 및 B-B' 루프를 갖도록, 대칭인 3차원 공간 구성을 갖는 ITR 서열을 포함할 수 있다. 이러한 구현예에서, 대칭인 ITR 쌍 또는 실질적으로 대칭인 ITR 쌍은, 야생형 ITR이 아닌 변형된 ITR(예를 들어, mod-ITR)일 수 있다. mod-ITR 쌍은 야생형 ITR로부터 하나 이상의 변형을 갖고, 서로 역 보체(역상)인 동일한 서열을 가질 수 있다. 하나의 구현예에서, 변형된 ITR 쌍은 본원에 정의된 바와 같이 실질적으로 대칭이며, 즉, 변형된 ITR 쌍은 상이한 서열을 갖지만, 상응하거나 동일한 대칭인 3차원 형상을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 대칭인 ITR 또는 실질적으로 대칭인 ITR은 본원에 기재된 바와 같은 야생형(WT-ITR)일 수 있다. 즉, 2개의 ITR은 야생형 서열을 갖지만, 반드시 동일한 AAV 혈청형의 WT-ITR일 필요는 없다. 하나의 구현예에서, 하나의 WT-ITR은 하나의 AAV 혈청형에서 유래할 수 있고, 다른 하나의 WT-ITR은 상이한 AAV 혈청형에서 유래할 수 있다. 이러한 구현예에서, WT-ITR 쌍은 본원에 정의된 바와 같이 실질적으로 대칭이며, 즉, 이들은 대칭인 3차원 공간 구성을 여전히 유지하면서, 하나 이상의 보존적 뉴클레오타이드 변형을 가질 수 있다.
본원에 제공된 야생형 또는 돌연변이된 또는 달리 변형된 ITR 서열은 ceDNA 벡터의 생산을 위한 발현 구조체(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드, ceDNA-바큐로바이러스)에 포함된 DNA 서열을 나타낸다. 따라서, ceDNA-플라스미드 또는 다른 발현 구조체로부터 생산된 ceDNA 벡터에 실제로 함유된 ITR 서열은, 생산 과정 동안 일어나는 자연 발생적인 변화(예를 들어, 복제 오류)의 결과로, 본원에 제공된 ITR 서열과 동일할 수도 동일하지 않을 수도 있다.
하나의 구현예에서, 치료용 핵산 서열인 전이유전자를 갖는 발현 카세트를 포함하는 본원에 기재된 ceDNA 벡터는, 전이유전자의 발현을 가능하게 하거나 제어하는 하나 이상의 조절 서열(들)에 작동적으로 연결될 수 있다. 하나의 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드는 제1 ITR 서열과 제2 ITR 서열을 포함하고, 여기서 관심 뉴클레오타이드 서열은 제1 ITR 서열과 제2 ITR 서열에 의해 플랭킹되어 있으며, 제1 ITR 서열과 제2 ITR 서열은 서로 비대칭이거나 서로 대칭이다.
하나의 구현예에서, 발현 카세트는 전이유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 전사 후 조절 요소, 및 폴리아데닐화 및 종결 신호 중 하나 이상을 이러한 순서로 포함하는 2개의 ITR 사이에 위치한다. 하나의 구현예에서, 프로모터는 조절 가능하며, 즉 유도성 또는 억제성이다. 프로모터는 전이유전자의 전사를 용이하게 하는 임의의 서열일 수 있다. 하나의 구현예에서, 프로모터는 CAG 프로모터 또는 이의 변이체이다. 전사 후 조절 요소는 전이유전자의 발현을 조절하는 서열, 비제한적인 예로서, 치료용 핵산 서열인 전이유전자의 발현을 증강시키는 3차 구조를 형성하는 임의의 서열이다.
하나의 구현예에서, 전사 후 조절 요소는 WPRE를 포함한다. 하나의 구현예에서, 폴리아데닐화 및 종열 신호는 BGHpolyA를 포함한다. 당업계에 공지된 임의의 시스 조절 요소 또는 이의 조합, 예를 들어 SV40 후기 polyA 신호 업스트림 인핸서 서열(USE), 또는 비제한적으로, 단순헤르페스바이러스의 티미딘 키나아제 유전자, 또는 B형 간염 바이러스(HBV)를 포함하는 다른 전사 후 처리 요소가 추가로 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 5'→3' 방향으로의 발현 카세트 길이는, AAV 비리온에 캡시드화되는 것으로 공지된 최대 길이보다 더 크다. 하나의 구현예에서, 상기 길이는 4.6 kb 초과, 또는 5 kb 초과, 또는 6 kb 초과, 또는 7 kb 초과이다. 다양한 발현 카세트가 본원에 예시된다.
하나의 구현예에서, 발현 카세트는 4000개 초과의 뉴클레오타이드, 5000개 뉴클레오타이드, 10,000개 뉴클레오타이드 또는 20,000개 뉴클레오타이드, 또는 30,000 뉴클레오타이드, 또는 40,000개 뉴클레오타이드 또는 50,000개 뉴클레오타이드, 또는 약 4000개 내지 10,000개 뉴클레오타이드, 또는 10,000개 내지 50,000개 뉴클레오타이드 사이의 임의의 범위, 또는 50,000개 초과의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트는 길이가 500개 내지 50,000개 뉴클레오타이드 범위인 치료용 핵산 서열인 전이유전자를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 발현 카세트는 길이가 500개 내지 75,000개 뉴클레오타이드 범위인 치료용 핵산 서열인 전이유전자를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 발현 카세트는 길이가 500개 내지 10,000개 뉴클레오타이드 범위인 치료용 핵산 서열인 전이유전자를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 발현 카세트는 길이가 1,000개 내지 10,000개 뉴클레오타이드 범위인 치료용 핵산 서열인 전이유전자를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 발현 카세트는 길이가 500개 내지 5,000개 뉴클레오타이드 범위인 치료용 핵산 서열인 전이유전자를 포함할 수 있다. ceDNA 벡터는 캡시드화된 AAV 벡터의 크기 제한이 없기 때문에, 대형 발현 카세트를 숙주로 전달할 수 있다. 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터에는 원핵생물 특이적 메틸화가 없다.
하나의 구현예에서, 강성 치료용 핵산은 플라스미드일 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 개시된 ceDNA 벡터는 치료 목적을 위해(예를 들어, 의학적, 진단적 또는 수의학적 용도로) 또는 면역원성 폴리펩타이드를 위해 사용된다.
발현 카세트는 치료용 핵산 서열인 임의의 전이유전자를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, ceDNA 벡터는 대상에서의 임의의 관심 유전자를 포함하며, 이러한 관심 유전자에는, 하나 이상의 폴리펩타이드, 펩타이드, 리보자임, 펩타이드 핵산, siRNA, RNAi, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 항체, 항원 결합 단편, 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다.
하나의 구현예에서, ceDNA 발현 카세트는, 예를 들어 수용 대상에 존재하지 않거나, 이에서 불활성이거나 불충분한 활성을 갖는 단백질을 인코딩하는 발현 가능한 외인성 서열(예를 들어, 오픈리딩프레임), 또는 목적하는 생물학적 또는 치료 효과를 갖는 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 공여체 서열과 같은 외인성 서열은 결함 유전자 또는 전사체의 발현을 교정하는 기능을 할 수 있는 유전자 산물을 인코딩할 수 있다. 하나의 구현예에서, 발현 카세트는 또한 교정 DNA 가닥을 인코딩하고, 폴리펩타이드, 센스 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 또는 RNA(코딩 또는 비코딩; 예를 들어, siRNA, shRNA, 마이크로RNA, 및 이들의 안티센스 대응물(예를 들어, antagoMiR))를 인코딩할 수 있다. 하나의 구현예에서, 발현 카세트는 또한, b-락타마아제, b-갈락토시다아제(LacZ), 알칼리성 포스파타아제, 티미딘 키나아제, 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), 루시퍼라아제 및 당업계에 널리 공지된 다른 것들과 같은, 실험 또는 진단 목적으로 사용되는 리포터 단백질을 인코딩하는 외인성 서열을 포함할 수 있다.
따라서, 발현 카세트는 돌연변이로 인해 존재하지 않거나 감소된 단백질, 폴리펩타이드 또는 RNA를 인코딩하거나, 과발현될 때 치료적 유익을 전달하는 것이 본 개시내용의 범위에 속하는 것으로 간주되는 임의의 유전자를 포함할 수 있다. ceDNA 벡터는 뉴클레아제에 의해 제공되는 이중가닥 절단부(또는 닉) 이후에 삽입되게 되는 교정 DNA 가닥으로 사용되는 주형 또는 공여체 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. ceDNA 벡터는 가이드 RNA 뉴클레아제, 메가뉴클레아제 또는 아연 핑거 뉴클레아제에 의해 제공되는 이중가닥 절단부(또는 닉) 이후에 삽입되게 되는 교정 DNA 가닥으로 사용되는 주형 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
치료용 핵산
본 개시내용의 예시적인 치료용 핵산은, 비제한적으로, 미니유전자, 플라스미드, 미니서클, 소형 간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO), 리보자임, 폐쇄형 이중가닥 DNA(예를 들어, ceDNA, CELiD, 선형의 공유결합으로 폐쇄된 DNA("미니스트링"), doggybone™, 프로텔로미어 폐쇄형 DNA 또는 덤벨 선형 DNA), 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), mRNA, tRNA, rRNA, 및 DNA 바이러스성 벡터, 바이러스성 RNA 벡터, 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
RNA 간섭(RNAi)으로 불리는 과정을 통해 특정 단백질의 세포내 수준을 하향조절할 수 있는 siRNA 또는 miRNA가 또한 본 개시내용에서 핵산 치료제로 고려된다. siRNA 또는 miRNA가 숙주세포의 세포질에 도입된 후, 이러한 이중가닥 RNA 구조체는 RISC로 불리는 단백질에 결합할 수 있다. siRNA 또는 miRNA의 센스 가닥은 RISC 복합체에 의해 제거된다. RISC 복합체는, 상보적 mRNA와 조합될 때, mRNA를 절단하고 절단된 가닥을 방출한다. RNAi는 mRNA의 특이적 파괴를 유도하여, 상응하는 단백질을 하향조절한다.
단백질로의 mRNA 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO)와 리보자임은, 핵산 치료제일 수 있다. 안티센스 구조체의 경우, 이러한 단일가닥 데옥시핵산은 표적 단백질 mRNA의 서열에 상보적인 서열, 및 mRNA에 결합할 수 있는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍을 갖는다. 이러한 결합은 표적 mRNA의 번역을 방지하고/하거나 mRNA 전사체의 RNaseH 분해를 촉발시킨다. 그 결과, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 작용의 특이성(즉, 특정 질환 관련 단백질의 하향조절)이 증가했다.
본원에 제공된 임의의 방법에서, 치료용 핵산은 치료용 RNA일 수 있다. 상기 치료용 RNA는 mRNA 번역의 저해제, RNA 간섭 작용제(RNAi), 촉매 활성 RNA 분자(리보자임), 전달 RNA(tRNA), mRNA 전사체에 결합하는 RNA(ASO), 또는 단백질이나 다른 분자 리간드(압타머)에 결합하는 RNA일 수 있다. 본원에 제공된 임의의 방법에서, RNAi 작용제는 이중가닥 RNA, 단일가닥 RNA, 마이크로RNA, 짧은 간섭 RNA, 짧은 헤어핀 RNA 또는 삼중체 형성 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 본 개시내용에 기재된 제형화 공정 및 방법은 이전에 보고된 것보다 상당히 더 많은 이중가닥 DNA(예를 들어, ceDNA)를 캡슐화할 수 있다. 일부 구현예에 따르면, 본원에 기재된 LNP는 ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 60% 초과, ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 65% 초과, ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 70% 초과, ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 75% 초과, ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 80% 초과, ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 85% 초과, 또는 ceDNA와 같은 강성 이중가닥 DNA의 약 90% 초과를 캡슐화할 수 있다.
IV. 변성된 치료용 핵산
본 개시내용의 양태는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)와 변성된 치료용 핵산(TNA)(여기서, TNA는 상기 정의된 바와 같음)을 포함하는 약학적 조성물을 추가로 제공한다. 하나의 구현예에서, 변성 TNA는 폐쇄형 DNA(ceDNA)이다. "변성된 치료용 핵산"이라는 용어는, 입체형태가 표준 B형 구조로부터 변경된 부분적인 또는 전체적인 TNA를 나타낸다. 입체형태 변화는 2차 구조(즉, 단일 핵산 분자 내 염기쌍 상호작용)의 변화 및/또는 3차 구조(즉, 이중 나선 구조)의 변화를 포함할 수 있다. 이론에 구애됨 없이, 본 발명자들은, 알코올/물 용액 또는 순수한 알코올 용매로 처리된 TNA가, LNP에 의한 캡슐화 효율을 증강시키고 직경 크기가 더 작은(즉, 75 nm 미만, 예를 들어, 직경 평균 크기 약 68 nm 내지 74 nm) LNP 제형을 생성하는 입체형태로 핵산을 변성시킨다고 여겼다. 본원에 기재된 모든 LNP 평균 직경 크기와 크기 범위는 변성된 TNA를 함유하는 LNP에 적용된다.
DNA가 수성 환경에 있는 경우, 각각의 완전한 나선형 회전에 10.4개의 염기쌍이 있는 B형 구조를 갖는다. 메탄올과 같은 중간정도로 덜 극성인 알코올의 첨가에 의해 이러한 수성 환경이 점진적으로 변경되는 경우, 나선의 꼬임이 완화되어, 원편광 이색성(CD) 분광법에 의해 가시화되는 바와 같이, DNA가 나선형 회전당 10.2개의 염기쌍만을 갖는 형태로 순조롭게 변경된다. 하나의 구현예에서, 본원에 제공된 약학적 조성물 내 변성된 TNA는 10.2형 구조를 갖는다.
이러한 거동과 대조적으로, 물이 에탄올과 같은 약간 덜 극성인 알코올로 대체되는 경우, 물의 약 65%가 에탄올로 대체될 때까지만, 동일한 유형의 입체형태 변화가 일어날 것이다. 이 시점에서, DNA는, CD에 의해 가시화되는 바와 같이, 나선형 회전당 11개 염기쌍을 함유하는 더 단단하게 꼬인 나선을 갖는 A형 구조로 갑자기 변경된다. 하나의 구현예에서, 본원에 제공된 약학적 조성물 내 변성된 TNA는 A형 구조를 갖는다.
일부 구현예에 따르면, 본원에 제공된 약학적 조성물 내 변성된 TNA는 투과 전자 현미경검사법(TEM)으로 가시화될 때 막대형 구조를 갖는다. 일부 구현예에 따르면, 본원에 제공된 약학적 조성물 내 변성된 TNA는 투과 전자 현미경검사법(TEM)으로 가시화될 때 원형 구조를 갖는다. 이에 비해, 변성되지 않은 TNA는 가닥형 구조를 갖는다.
일부 구현예에 따르면, 본원에 제공된 약학적 조성물 내 변성된 TNA는 수소 결합이 없거나 거의 없고, 염기 중첩(base stacking)이 없으며, 응축된 3차 구조를 갖는 P형 구조를 갖는다.
V. ceDNA 벡터의 생산
본 개시내용의 구현예는 전이유전자(예를 들어, TNA)를 발현시킬 수 있는 폐쇄형 선형 이중체(ceDNA) 벡터를 포함하는 방법 및 조성물을 기반으로 한다. 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터는 바이러스 캡시드 내 제한적인 공간에 의해 부과되는 패키징 제약이 없다. ceDNA 벡터는, 캡슐화된 AAV 게놈과 대조적으로, 원핵생물에서 생산된 플라스미드 DNA 벡터에 대한 실행 가능한 진핵생물에서 생산된 대안을 나타낸다. 이는, 제어 요소, 예를 들어 본원에 개시된 바와 같은 조절 스위치, 대형 전이유전자, 다중 전이유전자 등의 삽입을 허용한다.
본원에 정의된 바와 같은 비대칭인 ITR 쌍 또는 대칭인 ITR 쌍을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터의 생산 방법은, 2018년 9월 7일자 출원된 국제출원 PCT/US 18/49996의 섹션 IV에 기재되어 있고, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 본원에 기재된 바와 같이, ceDNA 벡터는, 예를 들어 하기 단계를 포함하는 공정에 따라 수득될 수 있다: a) 바이러스 캡시드 코딩 서열이 없는 폴리뉴클레오타이드 발현 구조체 주형(예를 들어, ceDNA-플라스미드, ceDNA-박미드 및/또는 ceDNA-바큐로바이러스)을 보유하는 숙주세포(예를 들어, 곤충 세포) 집단을, Rep 단백질의 존재 하에서, 숙주세포 내에서 ceDNA 벡터의 생산을 유도하는 데 효과적인 조건 하에서 충분한 시간 동안 인큐베이션하는 단계로서, 여기서 숙주세포는 바이러스 캡시드 코딩 서열을 포함하지 않는 단계; 및 b) 숙주세포에서 ceDNA 벡터를 수거하고 단리하는 단계. Rep 단백질의 존재는 변형된 ITR을 갖는 벡터 폴리뉴클레오타이드의 복제를 유도하여, 숙주 세포에서 ceDNA 벡터를 생산한다.
하기는 비제한적인 예로 제공된다.
일부 구현예에 따르면, 합성 ceDNA는 이중가닥 DNA 분자로부터의 절단을 통해 생성된다. ceDNA 벡터의 합성 생산은 2019년 1월 18일자 출원된 국제 출원 PCT/US19/14122의 실시예 2 내지 실시예 6에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 이중가닥 DNA 분자의 절제를 포함하는 합성 방법을 사용하여 ceDNA 벡터를 생산하는 하나의 예시적인 방법. 간략하게, ceDNA 벡터는 이중가닥 DNA 구조체를 사용하여 생성할 수 있다(예를 들어, PCT/US19/14122의 도 7a 내지 도 8e 참조). 일부 구현예에서, 이중가닥 DNA 구조체는 ceDNA 플라스미드이다(예를 들어, 2018년 12월 6일자 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2018/064242의 도 6 참조).
일부 구현예에서, ceDNA 벡터를 제조하기 위한 구조체는 전이유전자의 발현을 조절하는 추가 구성요소, 예를 들어 전이유전자의 발현을 조절하는 조절 스위치, 또는 벡터를 포함하는 세포를 사멸시킬 수 있는 사멸 스위치를 포함한다.
분자 조절 스위치는 신호에 반응하여 측정 가능한 상태 변화를 생성하는 스위치이다. 이러한 조절 스위치는 전이유전자의 발현 출력을 제어하기 위해 본원에 기재된 ceDNA 벡터와 유용하게 조합될 수 있다. 일부 구현예에서, ceDNA 벡터는 전이유전자의 발현을 미세조정하는 역할을 하는 조절 스위치를 포함한다. 예를 들어, 이는 ceDNA 벡터의 생물학적 봉쇄(biocontainment) 기능으로 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 스위치는 제어 가능하고 조절 가능한 방식으로 ceDNA 벡터에서 관심 유전자의 발현을 개시 또는 중단(즉, 셧다운)하도록 설계된 "ON/OFF" 스위치이다. 일부 구현예에서, 상기 스위치는 스위치가 활성화되면 합성 ceDNA 벡터를 포함하는 세포가 세포의 프로그래밍된 사멸을 거치도록 지시할 수 있는 "사멸 스위치"를 포함할 수 있다. ceDNA 벡터에 사용하기 위해 포함된 예시적인 조절 스위치는, 전이유전자의 발현을 조절하는 데 사용될 수 있으며, 이는 국제 출원 PCT/US18/49996(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)에 보다 충분히 논의되어 있으며, 본원에 기재되어 있다.
다양한 올리고뉴클레오타이드의 어셈블리를 포함하는 합성 방법을 사용하여 ceDNA 벡터를 생산하는 또 다른 예시적인 방법이, PCT/US19/14122의 실시예 3에 제공되어 있으며, 여기서 ceDNA 벡터는 5' 올리고뉴클레오타이드와 3' ITR 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 단계, 및 ITR 올리고뉴클레오타이드를 발현 카세트를 포함하는 이중가닥 폴리뉴클레오타이드에 결찰시키는 단계를 통해 생산된다. PCT/US19/14122(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)의 도 11b는, 5' ITR 올리고뉴클레오타이드와 3' ITR 올리고뉴클레오타이드를 발현 카세트를 포함하는 이중가닥 폴리뉴클레오타이드에 결찰시키는 예시적인 방법을 보여준다.
합성 방법을 사용하여 ceDNA 벡터를 생산하는 예시적인 방법이 PCT/US19/14122(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)의 실시예 4에 제공되어 있으며, 이는 센스 발현 카세트 서열을 플랭킹하고, 안티센스 발현 카세트를 플랭킹하는 2개의 안티센스 ITR에 공유결합으로 부착된 2개의 센스 ITR을 포함하는 단일가닥 선형 DNA를 사용하며, 이러한 단일가닥 선형 DNA의 말단을 결찰시켜 폐쇄형 단일가닥 분자를 형성한다. 하나의 비제한적인 예는, 단일가닥 DNA 분자를 합성 및/또는 생산하는 단계, 분자의 일부를 어닐링하여 하나 이상의 2차 구조 염기쌍 영역을 갖는 단일 선형 DNA 분자를 형성하는 단계, 및 유리된 5' 및 3' 말단을 서로 결찰시켜 폐쇄형 단일가닥 분자를 형성하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 비바이러스성 DNA 벡터의 생산에 사용하기 위해 본원에 기재된 DNA 벡터 폴리뉴클레오타이드 발현 주형(ceDNA 주형)을 이의 자체 게놈에 안정적으로 통합시킨 숙주 세포주를 제공한다. 이러한 세포주를 생산하는 방법은 문헌[Lee, L. et al. (2013) Plos One 8(8): e69879]에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다. 예를 들어, Rep 단백질은 약 3의 MOI로 숙주세포에 첨가된다. 하나의 구현예에서, 숙주 세포주는 무척추동물 세포주, 바람직하게는 곤충 Sf9 세포이다. 숙주 세포주가 포유류 세포주, 바람직하게는 293 세포인 경우, 상기 세포주는 안정적으로 통합된 폴리뉴클레오타이드 벡터 주형을 가질 수 있고, 헤르페스바이러스와 같은 제2 벡터를 사용하여 Rep 단백질을 세포에 도입하여, Rep의 존재 하에서 ceDNA의 절제 및 증폭을 가능하게 할 수 있다.
임의의 프로모터가 벡터 폴리뉴클레오타이드의 이종 핵산(예를 들어, 리포터 핵산 또는 치료용 전이유전자)에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 발현 카세트는 CAG 프로모터와 같은 합성 조절 요소를 함유할 수 있다. CAG 프로모터는 (i) 시토메갈로바이러스(CMV) 초기 인핸서 요소, (ii) 닭 베타-액틴 유전자의 프로모터, 제1 엑손 및 제1 인트론, 및 (iii) 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 수용체를 포함한다. 대안적으로, 발현 카세트는 알파-1-항트립신(AAT) 프로모터, 간 특이적(LP1) 프로모터 또는 인간 신장 인자-1 알파(EF1-α) 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 카세트에는 하나 이상의 구성적 프로모터, 예를 들어 레트로바이러스 라우스육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(선택적으로 RSV 인핸서를 가짐), 시토메갈로바이러스(CMV) 극초기 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서를 가짐)가 포함된다. 대안적으로, 유도성 또는 억제성 프로모터, 전이유전자에 대한 천연 프로모터, 조직 특이적 프로모터 또는 당업계에 공지된 다양한 프로모터가 사용될 수 있다. 유전자 요법에 적합한 전이유전자는 당업자에게 널리 공지되어 있다.
캡시드 미함유 ceDNA 벡터는 또한, 비제한적으로, 우드척 간염바이러스 전사 후 조절 요소(WPRE) 및 BGH polyA, 또는 예를 들어 베타-글로빈 polyA를 포함하는 시스-조절 요소, 또는 시스-조절 요소들의 조합을 추가로 포함하는 벡터 폴리뉴클레오타이드 발현 구조체로부터 생성될 수 있다. 다른 전사 후 처리 요소에는, 예를 들어 단순헤르페스바이러스의 티미딘 키나아제 유전자, 또는 B형 간염 바이러스(HBV)가 포함된다. 발현 카세트는 당업계에 공지된 임의의 폴리아데닐화 서열 또는 이의 변이체, 예컨대 소 BGHpA 또는 바이러스 SV40pA에서 단리된 자연 발생 서열, 또는 합성 서열을 포함할 수 있다. 일부 발현 카세트는 또한 SV40 후기 polyA 신호 업스트림 인핸서(USE) 서열을 포함할 수 있다. USE는 SV40pA 또는 이종 polyA 신호와 조합하여 사용될 수 있다.
상기 세포에서 본원에 기재된 DNA 벡터를 수거하고 수집하는 시간은, ceDNA 벡터의 고수율 생산을 달성하기 위해 선택 및 최적화될 수 있다. 예를 들어, 수거 시간은 세포 생존율, 세포 형태, 세포 성장 등의 관점에서 선택될 수 있다. 하나의 구현예에서, 세포를 충분한 조건 하에서 성장시키고, 바큐로바이러스 감염 후 DNA 벡터를 생산하기에 충분한 시간이지만 바이러스 독성으로 인해 세포의 대부분이 사멸되기 시작하기 전에 수거한다. DNA 벡터는 Qiagen Endo-Free Plasmid 키트와 같은 플라스미드 정제 키트를 사용하여 단리될 수 있다. 플라스미드 단리를 위해 개발된 다른 방법이 또한 DNA 벡터에 적용될 수 있다. 일반적으로, 임의의 핵산 정제 방법이 채택될 수 있다.
DNA 벡터는 DNA의 정제에 대해 당업자에게 공지된 임의의 수단을 통해 정제될 수 있다. 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터는 DNA 분자로 정제된다. 또 다른 구현예에서, ceDNA 벡터는 엑소좀 또는 미세입자로 정제된다.
하나의 구현예에서, 캡시드 미함유 비바이러스성 DNA 벡터는 제1 아데노연관바이러스(AAV) 역말단반복서열(ITR), 관심 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 외인성 DNA의 발현 카세트) 및 변형된 AAV ITR을 순서대로 포함하는 폴리뉴클레오타이드 주형을 포함하는 플라스미드를 포함하거나 이로부터 수득되며, 여기서 상기 주형 핵산 분자에는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 없다. 추가의 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 주형에는 바이러스 캡시드 단백질 코딩 서열이 없다(즉, AAV 캡시드 유전자뿐 아니라 다른 바이러스의 캡시드 유전자가 없음). 또한, 특정 구현예에서, 주형 핵산 분자에는 또한 AAV Rep 단백질 코딩 서열이 없다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 개시내용의 핵산 분자에는 기능성 AAV cap 유전자와 AAV rep 유전자 둘 모두가 없다.
하나의 구현예에서, ceDNA는 본원에 개시된 야생형 AAV2 ITR에 대해 돌연변이되었지만, 여전히 작동 가능한 RBE, TRS 및 RBE' 부분을 보유하는 ITR 구조를 포함할 수 있다.
ceDNA 플라스미드
ceDNA-플라스미드는 ceDNA 벡터의 이후의 생산에 사용되는 플라스미드이다. 하나의 구현예에서, ceDNA-플라스미드는 적어도 다음과 같은 요소를 전사 방향으로 작동적으로 연결된 구성요소로서 제공하기 위해 공지된 기술을 사용하여 구축될 수 있다: (1) 변형된 5' ITR 서열; (2) 시스-조절 요소, 예를 들어 프로모터, 유도성 프로모터, 조절 스위치, 인핸서 등을 함유하는 발현 카세트; 및 (3) 변형된 3' ITR 서열(여기서, 3' ITR 서열은 5' ITR 서열에 대칭임). 일부 구현예에서, ITR이 플랭킹된 발현 카세트는 외인성 서열을 도입하기 위한 클로닝 부위를 포함한다. 발현 카세트는 AAV 게놈의 rep 및 cap 코딩 영역을 대체한다.
하나의 구현예에서, ceDNA 벡터는 제1 아데노연관바이러스(AAV) 역말단반복(ITR), 전이유전자를 포함하는 발현 카세트, 및 돌연변이되거나 변형된 AAV ITR을 이러한 순서로 인코딩하는 "ceDNA-플라스미드"로 본원에 지칭되는 플라스미드로부터 수득되며, 여기서 상기 ceDNA-플라스미드에는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 없다. 대안적인 구현예에서, ceDNA-플라스미드는 제1(또는 5') 변형되거나 돌연변이된 AAV ITR, 전이유전자를 포함하는 발현 카세트, 및 제2(또는 3') 변형된 AAV ITR을 이러한 순서로 인코딩하며, 여기서 상기 ceDNA-플라스미드에는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 없고, 5' 및 3' ITR은 서로 대칭이다. 대안적인 구현예에서, ceDNA-플라스미드는 제1(또는 5') 변형되거나 돌연변이된 AAV ITR, 전이유전자를 포함하는 발현 카세트, 및 제2(또는 3') 돌연변이되거나 변형된 AAV ITR을 이러한 순서로 인코딩하며, 여기서 상기 ceDNA-플라스미드에는 AAV 캡시드 단백질 코딩 서열이 없고, 5' 및 3' 변형된 ITR은 동일한 변형을 갖는다(즉, 이들은 서로에 대해 역 보체 또는 대칭임).
하나의 구현예에서, ceDNA-플라스미드 시스템에는 바이러스 캡시드 단백질 코딩 서열이 없다(즉, AAV 캡시드 유전자뿐 아니라 다른 바이러스의 캡시드 유전자가 없음). 하나의 구현예에서, ceDNA-플라스미드에는 또한 AAV Rep 단백질 코딩 서열이 없다. 하나의 구현예에서, ceDNA-플라스미드에는 AAV2에 대한 기능성 AAV cap 및 AAV rep 유전자 GG-3', 및 헤어핀 형성을 가능하게 하는 가변 회문구조 서열이 없다. 하나의 구현예에서, 본 개시내용의 ceDNA-플라스미드는 당업계에 널리 공지된 임의의 AAV 혈청형의 게놈의 천연 뉴클레오타이드 서열을 사용하여 생성될 수 있다. 하나의 구현예에서, ceDNA-플라스미드 백본은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV 5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ 및 AAV-DJ8 게놈, 예를 들어 NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261(Kotin and Smith, The Springer Index of Viruses, Springer에서 유지 관리하는 URL에서 이용 가능함)에서 유도된다. 하나의 구현예에서, ceDNA-플라스미드 백본은 AAV2 게놈에서 유도된다. 하나의 구현예에서, ceDNA-플라스미드 백본은 이러한 AAV 게놈 중 하나에서 유도된 5' 및 3' ITR을 포함하도록 유전자 조작된 합성 백본이다.
하나의 구현예에서, ceDNA-플라스미드는 선택적으로 ceDNA 벡터 생산 세포주의 확립에 사용하기 위한 선별 가능한 또는 선별 마커를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 선별 마커는 3' ITR 서열의 다운스트림(즉, 3')에 삽입될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 선별 마커는 5' ITR 서열의 업스트림(즉, 5')에 삽입될 수 있다. 적절한 선별 마커에는, 예를 들어 약물 내성을 부여하는 것들이 포함된다. 선별 마커, 예를 들어 블라스티시딘(blasticidin) S 내성 유전자, 카나마이신(kanamycin), 제네티신(geneticin) 등일 수 있다.
VI. 지질 입자의 제조
지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 ceDNA와 지질(들)의 혼합 시 자발적으로 형성될 수 있다. 목적하는 입자 크기 분포에 따라, 예를 들어 Lipex 압출기(Northern Lipids, Inc)와 같은 써모배럴(thermobarrel) 압출기를 사용하여 생성된 나노입자 혼합물을 막을 통해 압출할 수 있다(예를 들어, 100 nm 컷오프). 일부 경우에, 압출 단계는 생략될 수 있다. 에탄올 제거와 동시 완충액 교환은, 예를 들어 투석 또는 접선 유동 여과(tangential flow filtration)에 의해 달성될 수 있다. 하나의 구현예에서, 지질 나노입자는 본원의 실시예 3에 기재된 바와 같이 형성된다.
일반적으로, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 형성될 수 있다. 예를 들어, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는, 예를 들어 US2013/0037977, US2010/0015218, US2013/0156845, US2013/0164400, US2012/0225129 및 US2010/0130588에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있으며, 상기 문헌들 각각의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다. 일부 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 연속 혼합 방법, 직접 희석 방법, 또는 인라인 희석 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 직접 희석 및 인라인 희석 방법을 사용하여 지질 나노입자를 제조하는 공정 및 장치는 US2007/0042031에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다. 단계적 희석 방법을 사용하여 지질 나노입자를 제조하는 공정 및 장치는 US2004/0142025에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
일부 구현예에 따르면, 본 개시내용은 강성 DNA 벡터(본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 포함)와 이온화 가능한 지질을 포함하는 LNP를 제공한다. 예를 들어, 2018년 9월 7일자 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2018/050042에 개시된 바와 같은 공정에 따라 수득된 ceDNA와 같은 강성 치료용 핵산으로 제조되고 로딩된 지질 나노입자 제형(상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용됨). 본 개시내용은, ceDNA와 같은 강성 치료용 핵산(TNA)을, TNA를 지질과 혼합하기 전, 80% 내지 100%의 저분자량 알코올 용액(예를 들어, 에탄올, 메탄올, 프로판올 및 이소프로판올) 중에서 사전 콤팩트화하는 공정을 포함한다. 이어서, 사전 콤팩트화된 치료용 핵산을 로딩하고 캡슐화하는 것은, Nanoassemblr™와 같은 미세유체 장치를 사용하여, 이온화 가능한 지질을 양성자화하고 ceDNA/지질 회합 및 입자의 핵형성에 유용한 에너지를 제공하는 낮은 pH에서, 에탄올성 지질과 수성 ceDNA(예를 들어, 80% 내지 100%의 에탄올, 메탄올, 프로판올, 이소프로판올, 또는 이들의 혼합물)의 통상적인 고에너지 혼합에 의해 달성될 수 있다. 상기 입자는 수성 희석 및 유기 용매의 제거를 통해 추가로 안정화될 수 있다. 상기 입자는 목적하는 수준으로 농축될 수 있다. 이론에 구애됨 없이, DNA의 캡슐화를 위해 지질과 혼합하기 전 강성 DNA를 사전 콤팩트화하는 단계는, 캡슐화 전 DNA 분자를 저분자량 알코올 용액 중에서 콤팩트화하여 생성되는 LNP의 크기를 감소시키는 데 유익한 효과를 제공하는 것으로 여겨진다.
일부 구현예에 따르면, 본 개시내용은 양이온성 지질과 TNA(예컨대, ceDNA)를 포함하는 LNP 제형을 제조하는 방법으로서, 수성 TNA(예를 들어, ceDNA)를 에탄올과 같은 저분자량 알코올 용액에 첨가하는 단계(여기서, 용액 중 알코올의 농도는 약 80% 내지 약 95%이고, 용액 중 물의 농도는 약 20% 내지 약 5%임); TNA(예를 들어, ceDNA)를 지질 용액(예를 들어, 80% 내지 100%의 EtOH) 및 산성 수성 완충액(예를 들어, 말산)과 혼합하는 단계; 및 선택적으로 중성 pH 수성 완충액으로 완충액 교환하여 LNP 제형을 생성하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에 따르면, 용액 중 저분자량 알코올(예를 들어, 에탄올, 메탄올, 프로판올 또는 이소프로판올)의 농도는 약 80% 내지 약 95%, 약 80% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 85%, 약 85% 내지 약 95%, 약 85% 내지 약 90%, 약 90% 내지 약 95%, 또는 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94% 또는 약 95%이다.
일부 구현예에 따르면, 용액 중 물의 농도는 약 20% 내지 약 5%, 약 15% 내지 약 5%, 약 10% 내지 약 5%, 약 20% 내지 약 10%, 약 20% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 5%, 약 15% 내지 약 10%, 또는 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 164%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6% 또는 약 5%이다.
일부 구현예에 따르면, 저분자량 알코올은 에탄올, 메탄올, 프로판올 및 이소프로판올로 이루어지는 군에서 선택된다. 일부 구현예에서, 수성 TNA(예를 들어, ceDNA)는 2가지 또는 3가지 저분자량 알코올의 혼합물을 포함하는 용액 중에 있다. 하나의 구현예에서, 저분자량 알코올성 용액은 에탄올과 메탄올의 혼합물이다. 또 다른 구현예에서, 저분자량 알코올성 용액은 에탄올, 메탄올, 프로판올 및 이소프로판올의 임의의 조합의 혼합물이다. 또 다른 구현예에서, 저분자량 알코올성 용액은 에탄올과 프로판올의 혼합물이다. 또 다른 구현예에서, 저분자량 알코올성 용액은 에탄올 45%, 메탄올 45% 및 물 10%로 구성된다.
일부 구현예에 따르면, 상기 방법은 혼합된 ceDNA/지질 용액을 산성 수성 완충액으로 희석하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에 따르면, 산성 수성 완충액은 말산/말산소듐 또는 아세트산/아세트산소듐에서 선택된다. 일부 구현예에 따르면, 산성 수성 완충액의 농도는 약 10 mM 내지 40 mM, 약 10 mM 내지 약 35 mM, 약 10 mM 내지 약 30 mM, 약 10 mM 내지 약 25 mM, 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 10 mM 내지 약 15 mM, 약 15 mM 내지 40 mM, 약 15 mM 내지 약 35 mM, 약 15 mM 내지 약 30 mM, 약 15 mM 내지 약 25 mM, 약 15 mM 내지 약 20 mM, 약 20 mM 내지 40 mM, 약 20 mM 내지 약 35 mM, 약 210 mM 내지 약 30 mM, 약 20 mM 내지 약 25 mM, 약 25 mM 내지 40 mM, 약 25 mM 내지 약 35 mM, 약 25 mM 내지 약 30 mM, 약 310 mM 내지 40 mM, 약 30 mM 내지 약 35 mM, 약 35 mM 내지 약 40 mM, 또는 약 10 mM 내지 약 25 mM, 약 10 mM 내지 약 20 mM, 약 10 mM 내지 약 15 mM, 또는 약 10 mM, 약 12 mM, 약 14 mM, 약 16 mM, 약 18 mM, 약 20 mM, 약 22 mM, 약 24 mM, 약 26 mM, 약 28 mM, 약 30 mM, 약 32 mM, 약 34 mM, 약 36 mM, 약 38 mM 또는 약 40 mM이다.
일부 구현예에 따르면, 산성 수성 완충액의 pH는 약 3 내지 약 5, 약 3 내지 약 4.5, 약 3 내지 약 4, 약 3 내지 약 3.5, 약 3.5 내지 약 5, 약 3.5 내지 약 4.5, 약 3.5 내지 약 4, 약 4 내지 약 5, 약 4 내지 약 4.5, 약 4.5 내지 약 5, 또는 약 3, 약 3.25, 약 3.5, 약 3.75, 약 4, 약 4.25, 약 4.5, 약 4.75 또는 약 5이다.
일부 구현예에 따르면, 중성 pH 수성 완충액은 Dulbecco 인산염 완충 식염수(pH 7.4)이다.
일부 구현예에 따르면, ceDNA와 같은 강성 TNA 콤팩트화가 알코올(에탄올, 메탄올, 프로판올 및/또는 이소프로판올) 함량이 높은(>80%) 용매에서 일어난다는 발견을 이용하는 LNP를 제조하는 공정. 일부 구현예에 따르면, 본원에 기재된 제형화 공정은 크기가 약 50 nm 내지 약 70 nm범위인 LNP를 생성한다. 일부 구현예에 따르면, 본 개시내용의 지질 입자는 전형적으로 평균 직경이 약 20 nm 내지 약 70 nm, 약 25 nm 내지 약 70 nm, 약 30 nm 내지 약 70 nm, 약 35 nm 내지 약 70 nm, 약 40 nm 내지 약 70 nm, 약 45 nm 내지 약 80 nm, 약 50 nm 내지 약 70 nm, 약 60 nm 내지 약 70 nm, 약 65 nm 내지 약 70 nm, 또는 약 20 nm, 약 25 nm, 약 30 nm, 약 35 nm, 약 40 nm, 약 45 nm, 약 50 nm, 약 55 nm, 약 60 nm, 약 65 nm, 약 70 nm이다. 일부 구현예에 따르면, 본원에 기재된 제형화 공정은 이중가닥 ceDNA와 같은 강성 TNA의 약 80% 초과를 캡슐화하는 LNP를 생성한다. 일부 구현예에 따르면, 본원에 기재된 LNP는 이중가닥 ceDNA와 같은 강성 TNA의 약 60% 초과, 이중가닥 ceDNA와 같은 강성 TNA의 약 65% 초과, 이중가닥 ceDNA와 같은 강성 TNA의 약 70% 초과, 이중가닥 ceDNA와 같은 강성 TNA의 약 75% 초과, 이중가닥 ceDNA와 같은 강성 TNA의 약 80% 초과, 이중가닥 ceDNA와 같은 강성 TNA의 약 85% 초과, 또는 이중가닥 ceDNA와 같은 강성 TNA의 약 90% 초과를 캡슐화할 수 있다.
일부 구현예에 따르면, 저분자량 알코올 중 콤팩트화된 상태의 ceDNA와 같은 TNA가, 생성되는 용액이 에탄올 85% 내지 95%와 물 15% 내지 5%가 되도록 하는 비로, 지질의 에탄올성 용액(80% 내지 100% EtOH)과 혼합되는 경우, ceDNA와 같은 TNA는 동적 광산란에 의해 콤팩트화된 상태로 존재하는 것으로 관찰된다. 이러한 용매에서, 지질과 ceDNA는 이러한 구성요소 중 어느 하나의 검출 가능한 침전 없이 모두 가용화된다. 콤팩트화된 TNA의 캡슐화를 유도하는 LNP의 제형화는 직경을 훨씬 더 작은 크기로 만든다.
일부 구현예에 따르면, ceDNA와 같은 수성 TNA가, 생성되는 용액이 에탄올 90% 내지 92%와 물 8% 내지 10%가 되도록 하는 비로, 산성 조건(말산) 하에서 지질의 에탄올성 용액과 혼합되는 경우, ceDNA와 같은 TNA는 동적 광산란에 의해 콤팩트화된 상태로 존재하는 것으로 관찰되고, 결과적인 캡슐화는 직경의 크기가 훨씬 더 작은 LNP를 만든다.
이어서, LNP 형성은 미세유체 혼합을 사용하여 ceDNA/지질 용액의 에탄올성 용액과 산성 수성 완충액의 혼합에 의해 이루어진다. 일부 구현예에 따르면, 산성 수성 완충액과 ceDNA/지질의 에탄올성 혼합물 사이의 유량비는 2:1, 3:2, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1 또는 20:1이다. 일부 구현예에 따르면, 믹서에서 배출된 후, 최종 에탄올 함량이 약 4% 내지 약 15%가 되도록, 최종 용액을 산성 수성 완충액으로 희석한다. 일부 구현예에 따르면, 믹서에서 배출된 후, 최종 에탄올 함량이 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14% 또는 약 15%가 되도록, 최종 용액을 산성 수성 완충액으로 희석한다. 일부 구현예에 따르면, 최종 에탄올 함량은 4%이다. 일부 구현예에 따르면, 최종 에탄올 함량은 12%이다. 이어서, LNP를 함유하는 이러한 용액을 중성 pH 수성 완충액으로 완충액 교환한다.
하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 충돌 제트(impinging jet) 방법에 따라 제조될 수 있다. 일반적으로, 알코올(예를 들어, 에탄올)에 용해된 지질을, 완충액, 예를 들어 시트르산염 완충액, 아세트산소듐 완충액, 아세트산소듐과 염화마그네슘 완충액, 말산 완충액, 말산과 염화소듐 완충액, 또는 시트르산소듐과 염화소듐 완충액에 용해된 ceDNA와 혼합하여 입자를 형성한다. 지질 대 ceDNA의 혼합 비는 약 45% 내지 55%의 지질과 약 65% 내지 45%의 ceDNA이다.
지질 용액은 양이온성 지질(예를 들어, 이온화 가능한 양이온성 지질), 비양이온성 지질(예를 들어, 인지질, 예컨대 DSPC, DOPE 및 DOPC), PEG 또는 PEG 접합된 분자(예를 들어, PEG-지질), 및 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤)을, 알코올, 예를 들어 에탄올 중에 5 mg/mL 내지 30 mg/mL, 보다 가능성 있게는 5 mg/mL 내지 15 mg/mL, 가장 가능성 있게는 9 mg/mL 내지 12 mg/mL의 총 지질 농도로 함유할 수 있다. 지질 용액에서, 지질의 몰비는 양이온성 지질의 경우 약 25% 내지 98%, 바람직하게는 약 35% 내지 65%; 비이온성 지질의 경우 약 0% 내지 15%, 바람직하게는 약 0% 내지 12%; PEG 또는 PEG 접합된 지질 분자의 경우 약 0% 내지 15%, 바람직하게는 약 1% 내지 6%; 및 스테롤의 경우 약 0% 내지 75%, 바람직하게는 약 30% 내지 50% 범위일 수 있다.
ceDNA 용액은 pH가 3.5 내지 5 범위인 완충 용액 중에 0.3 mg/mL 내지 1.0 mg/mL, 바람직하게는 0.3 mg/mL 내지 0.9 mg/mL 범위의 농도로 ceDNA를 포함할 수 있다.
LNP 형성의 경우, 하나의 예시적인 비제한적인 구현예에서, 2개의 지질을 약 15℃ 내지 40℃, 바람직하게는 약 30℃ 내지40℃ 범위의 온도까지 가열한 후, 예를 들어 충돌 제트 혼합기에서 혼합하여 즉시 LNP를 형성한다. 혼합 유량은 10 mL/분 내지 600 mL/분 범위일 수 있다. 튜브 ID는 0.25 mm 내지 1.0 mm 범위일 수 있고, 총 유량은 10 mL/분 내지 600 mL/분일 수 있다. 유량과 튜브 ID의 조합은 LNP의 입자 크기를 30 nm 내지 200 nm로 제어하는 효과를 나타낼 수 있다. 이어서, 용액을 더 높은 pH에서 1:1 내지 1:3 vol:vol 범위, 바람직하게는 약 1:2 vol:vol의 혼합비로 완충 용액과 혼합할 수 있다. 필요한 경우, 이러한 완충 용액은 15℃ 내지 40℃ 또는 30℃ 내지 40℃ 범위의 온도에 있을 수 있다. 이어서, 혼합된 LNP를 음이온 교환 여과 단계에 적용시킬 수 있다. 음이온 교환 전, 혼합된 LNP를 일정 시간, 예를 들어 30분 내지 2시간 동안 인큐베이션할 수 있다. 인큐베이션 동안의 온도는 15℃ 내지 40℃ 또는 30℃ 내지 40℃ 범위일 수 있다. 인큐베이션 후, 필터, 예컨대 0.8 μm 필터를 통해 용액을 여과한다(음이온 교환 분리 단계 포함). 이러한 공정은 1 mm ID 내지 5 mm ID 범위의 튜브 ID와 10 mL/분 내지 2000 mL/분의 유량을 사용할 수 있다.
형성 후, LNP를 농축시키고, 알코올을 제거하고, 완충액을 약 pH 7, 예를 들어 약 pH 6.9, 약 pH 7.0, 약 pH 7.1, 약 pH 7.2, 약 pH 7.3 또는 약 pH 7.4의 최종 완충 용액, 예를 들어 포스페이트 완충 식염수(PBS)로 교환하는 한외여과 공정을 통해 투석여과할 수 있다.
한외여과 공정은 30 kD 내지 500 kD 범위의 막 공칭 분자량 컷오프를 사용하는 접선 유동 여과 형식(TFF)을 사용할 수 있다. 막 형식은 중공 섬유 또는 평판 카세트이다. 적절한 분자량 컷오프를 이용한 TFF 공정은 잔류물에 LNP를 보유할 수 있고, 여과액 또는 투과물에는 알코올; 시트레이트 완충액 및 최종 완충액 폐기물이 함유되어 있다. TFF 공정은 초기 농도에서 1 mg/mL 내지 3 mg/mL의 ceDNA 농도까지의 다단계 공정이다. 농축 후, LNP 용액을 최종 완충액에 대해 10 부피 내지 20 부피로 투석여과하여 알코올을 제거하고, 완충액 교환을 수행한다. 이어서, 물질을 1배 내지 3배 추가로 농축시킬 수 있다. 농축된 LNP 용액을 멸균여과할 수 있다.
VII. 약학적 조성물 및 제형
ceDNA와 같은 TNA 지질 입자와, 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 또한 본원에 제공된다.
하나의 구현예에서, TNA(예를 들어, ceDNA) 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 치료용 핵산의 완전 캡슐화, 부분 캡슐화를 제공한다. 하나의 구현예에서, 핵산 치료제는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 완전히 캡슐화되어 핵산 함유 지질 입자를 형성한다. 하나의 구현예에서, 핵산은 입자의 지질 부분에 캡슐화되어, 효소적 분해로부터 보호될 수 있다.
(예를 들어, 지질 나노입자)의 의도된 용도에 따라, 구성요소의 비율이 달라질 수 있으며, 특정 제형의 전달 효율은, 예를 들어 엔도솜 방출 매개변수(ERP) 검정을 사용하여 측정될 수 있다.
하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 응집을 방지하기 위해 다른 모이어티와 접합될 수 있다. 이러한 지질 접합체에는, 비제한적으로, 예를 들어 디알킬옥시프로필에 커플링된 PEG(예를 들어, PEG-DAA 접합체), 디아실글리세롤에 커플링된 PEG(예를 들어, PEG-DAG 접합체), 콜레스테롤에 커플링된 PEG, 포스파티딜에탄올아민에 커플링된 PEG 및 세라미드에 접합된 PEG(예를 들어, 미국 특허 제5,885,613호 참조)와 같은 PEG-지질 접합체, 양이온성 PEG 지질, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 접합체(예를 들어, POZ-DAA 접합체; 예를 들어 2010년 1월 13일자 출원된 미국 임시 출원 제61/294,828호 및 2010년 1월 14일자 출원된 미국 임시 출원 제61/295,140호 참조), 폴리아미드 올리고머(예를 들어, ATTA-지질 접합체), 및 이들의 혼합물이 포함된다. POZ-지질 접합체의 추가의 예는, PCT 공개공보 WO 2010/006282에 기재되어 있다. PEG 또는 POZ는 지질에 직접 접합되거나, 링커 모이어티를 통해 지질에 연결될 수 있다. PEG 또는 POZ를 지질에 커플링시키는 데 적합한 임의의 링커 모이어티가 사용될 수 있으며, 이에는, 예를 들어 비에스테르 함유 링커 모이어티와 에스테르 함유 링커 모이어티가 포함된다. 특정 바람직한 구현예에서, 아미드 또는 카르바메이트와 같은 비에스테르 함유 링커 모이어티가 사용된다. 상기 특허 문헌 각각의 개시내용은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
하나의 구현예에서, TNA(예를 들어, ceDNA)는 입자의 지질 부분과 복합체화되거나, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 지질 위치에서 캡슐화될 수 있다. 하나의 구현예에서, TNA는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 지질 위치에서 완전히 캡슐화되어, 예를 들어 수용액에서 뉴클레아제에 의한 분해로부터 보호될 수 있다. 하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 내 TNA는, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)를 37℃에서 적어도 약 20분, 30분, 45분 또는 60분 동안 뉴클레아제에 노출시킨 후, 실질적으로 분해되지 않는다. 일부 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 내 TNA는 상기 입자를 혈청에서 37℃에서 적어도 약 30분, 45분 또는 60분, 또는 적어도 약 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 12시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 22시간, 24시간, 26시간, 28시간, 30시간, 32시간, 34시간, 또는 36시간 동안 인큐베이션한 후 실질적으로 분해되지 않는다.
하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 대상, 예를 들어 인간과 같은 포유류에 실질적으로 비독성이다.
하나의 구현예에서, 본 개시내용의 치료용 핵산을 포함하는 약학적 조성물은 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)로 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 치료용 핵산을 포함하는 지질 입자는 양이온성 지질로 형성될 수 있다. 일부 다른 구현예에서, 치료용 핵산을 포함하는 지질 입자는 비양이온성 지질로 형성될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 개시내용의 지질 입자는 mRNA, 안티센스 RNA 및 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 압타머, 간섭 RNA(RNAi), 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), 미니서클 DNA, 미니유전자, 바이러스성 DNA(예를 들어, 렌티바이러스 또는 AAV 게놈) 또는 비바이러스성 합성 DNA 벡터, 폐쇄형 선형 이중체 DNA(ceDNA/CELiD), 플라스미드, 박미드, doggybone™ DNA 벡터, 최소 면역학적으로 정의된 유전자 발현(MIDGE) 벡터, 비바이러스성 미니스트링 DNA 벡터(선형의 공유결합으로 폐쇄된 DNA 벡터), 또는 덤벨형 DNA 최소 벡터("덤벨 DNA")로 이루어지는 군에서 선택되는 치료용 핵산을 포함하는 양이온성 지질로 형성된 핵산 함유 지질 입자이다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 본 개시내용의 지질 입자는 비양이온성 지질, 및 선택적으로 입자의 응집을 방지하는 접합된 지질로 형성된 핵산 함유 지질 입자이다.
하나의 구현예에서, 지질 입자 제형은 수용액이다. 하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 제형은 동결건조된 분말이다.
일부 양태에 따르면, 본 개시내용은 1종 이상의 약학적 부형제를 추가로 포함하는 지질 입자 제형을 제공한다. 하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 제형은 수크로오스, 트리스(tris), 트레할로오스, 및/또는 글리신을 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 본원에 개시된 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 대상의 세포, 조직, 또는 기관으로의 생체내 전달을 위해 대상에게의 투여에 적합한 약학적 조성물에 혼입될 수 있다. 전형적으로, 약학적 조성물은 본원에 개시된 TNA(예를 들어, ceDNA) 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 하나의 구현예에서, 본 개시내용의 TNA(예를 들어, ceDNA) 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 치료용 투여(예를 들어, 비경구 투여)의 목적하는 경로에 적합한 약학적 조성물에 혼입될 수 있다. 고압 정맥내 또는 동맥내 주입뿐 아니라, 핵내 미세주사 또는 세포질내 주사와 같은 세포내 주사를 통한 수동적 조직 전달이 또한 고려된다. 치료 목적의 약학적 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포솜, 또는 높은 TNA(예를 들어, ceDNA) 벡터 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다. 멸균 주사액은, 필요한 경우 상기 열거된 성분 중 하나 또는 이들의 조합을 갖는 적절한 완충액 중에 필요한 양의 TNA(예를 들어, ceDNA) 벡터 화합물을 혼입시킨 후, 여과 멸균하는 방식으로 제조될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 지질 입자는 국소, 전신, 양막내, 경막내, 두개내, 동맥내, 정맥내, 림프내, 복강내, 피하, 기관, 조직내(예를 들어, 근육내, 심장내, 간내, 신장내, 뇌내), 경막내, 방광내, 결막(예를 들어, 안와외, 안와내, 안와후방, 망막내, 망막하, 맥락막, 맥락막하, 간질내, 전방내 및 유리체내), 달팽이관내 및 점막(예를 들어, 구강, 설하, 비강) 투여에 적합한 약학적 조성물에 혼입될 수 있다. 고압 정맥내 또는 동맥내 주입뿐 아니라, 핵내 미세주사 또는 세포질내 주사와 같은 세포내 주사를 통한 수동적 조직 전달이 또한 고려된다.
TNA(예를 들어, ceDNA) 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)를 포함하는 약학적 활성 조성물은 핵산의 전이유전자를 수용체의 세포로 전달하여, 그 안에서 전이유전자의 치료적 발현을 유도하도록 제형화될 수 있다. 상기 조성물은 또한 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
치료 목적을 위한 약학적 조성물은 전형적으로 제조 및 저장 조건 하에서 멸균되고 안정해야 한다. 상기 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포솜, 또는 높은 TNA(예를 들어, ceDNA) 벡터 농도에 적합한 다른 정렬된 구조로 제형화될 수 있다. 멸균 주사액은, 필요한 경우 상기 열거된 성분 중 하나 또는 이들의 조합을 갖는 적절한 완충액 중에 필요한 양의 ceDNA 벡터 화합물을 혼입시킨 후, 여과 멸균하는 방식으로 제조될 수 있다.
하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 적어도 하나의 지질 이중층을 보유하는 고체 코어 입자이다. 하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 비(非)이중층 구조, 즉, 비(非)라멜라(즉, 비이중층) 형태를 갖는다. 비제한적으로, 비이중층 형태는, 예를 들어 3차원 튜브, 막대, 입방 대칭 등을 포함할 수 있다. 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)의 비라멜라 형태(즉, 비이중층 구조)는 당업자에게 공지되어 있고 당업자에 의해 사용되는 분석 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 기술에는, 비제한적으로, 저온 투과 전자 현미경검사법(Cryo-Transmission Electron Microscopy)("Cryo-TEM"), 시차 주사 열량측정법("DSC"), X-선 회절 등이 포함된다. 예를 들어, 지질 입자의 형태(라멜라 대 비라멜라)는, 예를 들어 US2010/0130588에 기재된 바와 같은 Cryo-TEM 분석을 사용하여 용이하게 평가 및 특징분석될 수 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
하나의 구현예에서, 비라멜라 형태를 갖는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 전자 밀도가 높다.
하나의 구현예에서, 본 개시내용은 단일라멜라 또는 다중라멜라 구조의 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)를 제공한다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 다소포성 입자 및/또는 발포체 기반 입자를 포함하는 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 제형을 제공한다. 지질 구성요소의 조성 및 농도를 제어하는 방식으로, 지질 접합체가 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)로부터 교환되는 속도, 및 결국, 지질 나노입자가 융합원성이 되는 속도를 제어할 수 있다. 또한, 예를 들어 pH, 온도 또는 이온 강도를 포함하는 다른 변수를 사용하여, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)가 융합원성이 되는 속도를 변화시키고/시키거나 제어할 수 있다. 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)가 융합원성이 되는 속도를 제어하는 데 사용될 수 있는 다른 방법이, 본 개시내용을 기반으로 당업자에게 명백할 것이다. 지질 접합체의 조성 및 농도를 제어하여 지질 입자 크기를 제어할 수 있다는 것이 또한 명백할 것이다.
하나의 구현예에서, 제형화된 양이온성 지질의 pKa는 핵산의 전달을 위한 LNP의 효과와 상관관계가 있을 수 있다(문헌[Jayaraman et al., Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51(34), 8529-8533]; 문헌[Semple et al., Nature Biotechnology 28, 172-176 (2010)] 참조, 상기 문헌들은 모두 그 전문이 본원에 참조로 인용됨). 하나의 구현예에서, pKa의 바람직한 범위는 약 5 내지 약 7이다. 하나의 구현예에서, 양이온성 지질의 pKa는 2-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌 설폰산(TNS)의 형광을 기반으로 하는 검정을 사용하여 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에서 결정될 수 있다.
하나의 구현예에서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자) 내 TNA(예를 들어, ceDNA)의 캡슐화는, 핵산과 회합될 때 형광이 증강되는 염료를 사용하는 막 불투과성 형광 염료 배제 검정, 예를 들어 Oligreen® 검정 또는 PicoGreen® 검정을 수행하는 방식으로 결정될 수 있다. 일반적으로, 캡슐화는 염료를 지질 입자 제형에 첨가하고, 생성된 형광을 측정하고, 소량의 비이온성 세제의 첨가 시 관찰된 형광과 비교하는 방식으로 결정된다. 지질 이중층의 세제 매개 파괴는 캡슐화된 TNA(예를 들어, ceDNA)를 방출하여, 막 불투과성 염료와의 상호작용을 가능하게 한다. ceDNA의 캡슐화는 다음과 같이 계산될 수 있다: E= (I0 - I)/I0(여기서, I 및 I0는 세제 첨가 전후의 형광 강도를 나타냄).
단위 투여량
하나의 구현예에서, 약학적 조성물은 단위 투여 형태로 존재할 수 있다. 단위 투여 형태는 전형적으로 약학적 조성물의 하나 이상의 특정 투여 경로에 맞게 조정될 수 있다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 흡입에 의한 투여에 맞게 조정된다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 기화기에 의한 투여에 맞게 조정된다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 분무기에 의한 투여에 맞게 조정된다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 에어로졸 생성기에 의한 투여에 맞게 조정된다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 경구 투여, 협측 투여 또는 설하 투여에 맞게 조정된다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 정맥내, 근육내 또는 피하 투여에 맞게 조정된다. 일부 구현예에서, 단위 투여 형태는 경막내 또는 뇌실내 투여에 맞게 조정된다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 국소 투여용으로 제형화된다. 단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은, 일반적으로 치료 효과를 생성하는 화합물의 양일 수 있다.
VIII. 치료 방법
본원에 기재된 바와 같은 TNA(예를 들어, ceDNA 벡터 지질 입자)는 숙주세포에 핵산 서열(예를 들어, 치료용 핵산 서열)을 도입하는 데 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, TNA(예를 들어, ceDNA 벡터) 지질 입자를 사용한 숙주세포에의 핵산 서열의 도입은, 유전자 발현을 평가하기 위해 치료된 환자로부터의 적절한 바이오마커를 이용하여 모니터링될 수 있다.
본원에 제공된 약학적 조성물은 다양한 목적을 위해 전이유전자(핵산 서열)를 전달하는 데 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터(예를 들어, ceDNA 벡터 지질 나노입자)는, 예를 들어 현장외, 시험관내 및 생체내 적용, 방법론, 진단 절차, 및/또는 유전자 치료 요법을 포함하는 다양한 방식으로 사용될 수 있다.
대상에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 선택적으로 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 치료적 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 TNA(예를 들어, ceDNA) 지질 나노입자를, 대상의 이를 필요로 하는 표적세포(예를 들어, 근육 세포 또는 조직, 다른 병든 세포 유형)에 도입하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. TNA 지질 나노입자는 담체의 존재 하에서 도입될 수 있지만, 이러한 담체는 필요하지 않다. 구현된 TNA(예를 들어, ceDNA) 지질 나노입자는 질환을 치료하는 데 유용한 관심 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특히, ceDNA 벡터는, 대상에게 도입될 때 외인성 DNA 서열에 의해 인코딩된 목적하는 폴리펩타이드, 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드의 전사를 지시할 수 있는 제어 요소에 작동 가능하게 연결된 목적하는 외인성 DNA 서열을 포함할 수 있다. TNA(예를 들어, ceDNA) 지질 나노입자는 본원에 기재되고 당업계에 공지된 바와 같은 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 표적세포는 인간 대상에 있다.
진단적 또는 치료적 유효량의 ceDNA 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))를 이를 필요로 하는 대상에게 제공하는 방법으로서, 일정량의 ceDNA 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))를, ceDNA 벡터로부터 전이유전자의 발현을 가능하게 하는 데 효과적인 시간 동안 이를 필요로 하는 대상의 세포, 조직 또는 기관에 제공하여, 대상에게 ceDNA 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))에 의해 발현된 진단적 또는 치료적 유효량의 단백질, 펩타이드, 핵산을 제공하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 하나의 구현예에서, 대상은 인간이다.
대상에서 질환, 장애, 기능장애, 손상, 비정상적인 병태 또는 외상의 적어도 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 개선하는 방법이 본원에 제공된다. 일반적으로, 상기 방법은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 TNA(예를 들어, ceDNA) 지질 나노입자를, 이를 필요로 하는 대상에게, 대상에서 질환, 장애, 기능장애, 손상, 비정상적인 병태 또는 외상의 하나 이상의 증상을 진단, 예방, 치료 또는 개선하는 데 충분한 양으로 충분한 시간 동안 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 대상은 인간이다.
질환 또는 질환 상태의 하나 이상의 증상을 치료하거나 감소시키는 도구로서 TNA(예를 들어, ceDNA) 지질 나노입자를 사용하는 것을 포함하는 방법이 본원에 제공된다. 결함이 있는 유전자가 공지된 다수의 유전병이 존재하며, 이는 전형적으로 2개의 부류로 분류된다: 일반적으로 열성 방식으로 유전되는 효소의 결핍 상태, 및 조절 또는 구조 단백질이 관여할 수 있으며, 전형적으로 우성 방식으로 유전되지만, 항상 우성 방식으로 유전되는 것은 아닌 불균형 상태. 결핍 상태 질환의 경우, ceDNA와 같은 TNA 지질 나노입자는 대체 요법을 위해 병든 조직에 정상 유전자를 가져오기 위해, 일부 구현예에서는, 안티센스 돌연변이를 사용하여 질환에 대한 동물 모델을 생성하기 위해 전이유전자를 전달하는 데 사용될 수 있다. 불균형 질환 상태의 경우, TNA(예를 들어, ceDNA) 지질 나노입자는 모델 시스템에서 질환 상태를 생성하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 질환 상태에 대응하기 위한 노력으로 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 TNA(예를 들어, ceDNA) 지질 나노입자 및 방법은 유전 질환의 치료를 가능하게 한다. 본원에 사용된 질환 상태는, 질환을 유발하거나 이를 더 중증으로 만드는 결핍 또는 불균형을 부분적으로 또는 전체적으로 개선하는 방식으로 치료된다.
일반적으로, 본원에 기재된 ceDNA와 같은 TNA 지질 나노입자는 유전자 발현과 관련된 임의의 장애와 연관된 증상을 치료, 예방, 또는 개선하기 위해 상기 기재된 바에 따라 임의의 전이유전자를 전달하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 질환 상태에는, 비제한적으로, 낭성섬유증(및 다른 폐의 질환), A형 혈우병, B형 혈우병, 지중해빈혈, 빈혈 및 다른 혈액 장애, AIDS, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 근위축성 측삭경화증, 뇌전증, 및 다른 신경계 장애, 암, 진성 당뇨병, 근디스트로피(예를 들어, 뒤시엔느(Duchenne)형, 베커(Becker)형), 헐러병(Hurler's disease), 아데노신 데아미나아제 결핍증, 대사 결함, 망막 퇴행성 질환(및 다른 눈의 질환), 미토콘드리아병증(예를 들어, 레버 유전성 시신경 위축증(LHON: Leber's hereditary optic neuropathy), 리증후군(Leigh syndrome), 및 아급성 경화성 뇌병증), 근병증(예를 들어, 안면견갑상완 근병증(FSHD) 및 심근병증), 고형 기관(예를 들어, 뇌, 간, 신장, 심장)의 질환 등이 포함된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 ceDNA 벡터는 대사장애(예를 들어, 오르니틴 트랜스카르바밀라아제 결핍증)을 앓고 있는 개체의 치료에 유리하게 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 기재된 ceDNA와 같은 TNA 지질 나노입자는 유전자 또는 유전자 산물에서 돌연변이에 의해 유발되는 질환 또는 장애를 치료, 개선, 및/또는 예방하는 데 사용될 수 있다. ceDNA 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))로 치료될 수 있는 예시적인 질환 또는 장애에는, 비제한적으로, 대사 질환 또는 장애(예를 들어, 파브리병, 고셰병, 페닐케톤뇨증(PKU), 글리코겐축적질환); 요소회로 질환 또는 장애(예를 들어, 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC) 결핍증); 리소좀 축적 질환 또는 장애(예를 들어, 이염성 백질디스트로피(MLD), 점액다당류증 II형(MPSII; 헌터증후군)); 간 질환 또는 장애(예를 들어, 진행성 가족성 간내 담즙정체증(PFIC)); 혈액 질환 또는 장애(예를 들어, 혈우병(A형 및 B형), 지중해빈혈 및 빈혈); 암 및 종양, 및 유전 질환 또는 장애(예를 들어, 낭성섬유증)가 포함된다.
하나의 구현예에서, 본원에 기재된 ceDNA와 같은 TNA 지질 나노입자는 전이유전자 발현 수준(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 호르몬 또는 성장인자를 인코딩하는 전이유전자)을 조절하는 것이 바람직한 상황에서 이종 뉴클레오타이드 서열을 전달하는 데 이용될 수 있다.
하나의 구현예에서, ceDNA와 같은 TNA 지질 나노입자는 질환 또는 장애를 초래하는 유전자 산물의 비정상적인 수준 및/또는 기능(예를 들어, 단백질의 부재 또는 이의 결함)을 교정하는 데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 지질 나노입자 내 ceDNA 벡터는 기능성 단백질을 생성하고/하거나 단백질 수준을 변경시켜, 단백질의 부재 또는 결함에 의해 유발되는 특정 질환 또는 장애로 인해 발생한 증상을 완화 또는 감소시키거나, 이러한 질환 또는 장애에 유익을 부여할 수 있다. 예를 들어, OTC 결핍증의 치료는 기능성 OTC 효소를 생성하는 방식으로 달성될 수 있고; A형 및 B형 혈우병의 치료는 인자 VIII, 인자 IX 및 인자 X의 수준을 변경하는 방식으로 달성될 수 있고; PKU의 치료는 페닐알라닌 히드록실라아제 효소의 수준을 변경하는 방식으로 달성될 수 있고; 파브리병 또는 고셰병의 치료는, 각각, 기능성 알파 갈락토시다아제 또는 베타 글루코세레브로시다아제를 생성하는 방식으로 달성될 수 있고; MFD 또는 MPSII의 치료는, 각각, 기능성 아릴설파타아제 A 또는 이두로네이트-2-설파타아제를 생성하는 방식으로 달성될 수 있고; 낭성섬유증의 치료는 기능성 낭성섬유증 막관통 전도 조절제를 생성하는 방식으로 달성될 수 있고; 글리코겐축적질환의 치료는 기능성 G6Pase 효소 기능을 회복시키는 방식으로 달성될 수 있고; PFIC의 치료는 기능성 ATP8B1, ABCB11, ABCB4 또는 TJP2 유전자를 생성하는 방식으로 달성될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 TNA(예를 들어, ceDNA) 지질 나노입자는 RNA 기반 치료제를 시험관내 또는 생체내 세포에 제공하는 데 사용될 수 있다. RNA 기반 치료제의 예에는, 비제한적으로, mRNA, 안티센스 RNA 및 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, 압타머, 간섭 RNA(RNAi), 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA)가 포함된다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는 안티센스 핵산을 시험관내 또는 생체내 세포에 제공하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 전이유전자가 RNAi 분자인 경우, 표적세포 내 안티센스 핵산 또는 RNAi의 발현은 세포에 의한 특정 단백질의 발현을 감소시킨다. 따라서, RNAi 분자 또는 안티센스 핵산인 전이유전자는 이를 필요로 하는 대상에서 특정 단백질의 발현을 감소시키기 위해 투여될 수 있다. 안티센스 핵산은 또한 세포 생리학을 조절하기 위해, 예를 들어 세포 또는 조직 배양 시스템을 최적화하기 위해 시험관내 세포에 투여될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 TNA 지질 나노입자는 DNA 기반 치료제를 시험관내 또는 생체내 세포에 제공하는 데 사용될 수 있다. DNA 기반 치료제의 예에는, 비제한적으로, 미니서클 DNA, 미니유전자, 바이러스성 DNA(예를 들어, 렌티바이러스 또는 AAV 게놈) 또는 비바이러스성 합성 DNA 벡터, 폐쇄형 선형 이중체 DNA(ceDNA/CELiD), 플라스미드, 박미드, doggybone™ DNA 벡터, 최소 면역학적으로 정의된 유전자 발현(MIDGE) 벡터, 비바이러스성 미니스트링 DNA 벡터(선형의 공유결합으로 폐쇄된 DNA 벡터) 또는 덤벨형 DNA 최소 벡터("덤벨 DNA")가 포함된다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는 미니서클을 시험관내 또는 생체내 세포에 제공하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 전이유전자가 미니서클 DNA인 경우, 표적세포 내 미니서클 DNA의 발현은 세포에 의한 특정 단백질의 발현을 감소시킨다. 따라서, 미니서클 DNA인 전이유전자는 이를 필요로 하는 대상에서 특정 단백질의 발현을 감소시키기 위해 투여될 수 있다. 미니서클 DNA는 또한 세포 생리학을 조절하기 위해, 예를 들어 세포 또는 조직 배양 시스템을 최적화하기 위해 시험관내 세포에 투여될 수 있다.
하나의 구현예에서, ceDNA와 같은 TNA 벡터에 의해 인코딩되는 예시적인 전이유전자에는, 비제한적으로, 리소좀 효소(예를 들어, 테이-삭스병과 연관된 헥소사미니다아제 A, 또는 헌터증후군/MPS II와 연관된 이두로네이트 설파타아제), 에리트로포이에틴, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 수퍼옥시드 디스뮤타아제, 글로빈, 렙틴, 카탈라아제, 티로신 히드록실라아제뿐 아니라, 사이토카인(예를 들어, 인터페론, b-인터페론, 인터페론-g, 인터류킨-2, 인터류킨-4, 인터류킨-12, 과립구-대식세포 집락자극인자, 림프독소 등), 펩타이드 성장인자 및 호르몬(예를 들어, 소마토트로핀, 인슐린, 인슐린 유사 성장인자-1 및 2, 혈소판유래성장인자(PDGF), 표피성장인자(EGF), 섬유아세포성장인자(FGF), 신경성장인자(NGF), 신경영양인자-3 및 4, 뇌유래신경영양인자(BDNF), 신경교유래성장인자(GDNF), 형질전환성장인자-a 및 -b, 등), 수용체(예를 들어, 종양괴사인자 수용체)가 포함된다. 일부 예시적인 구현예에서, 전이유전자는 하나 이상의 목적하는 표적에 특이적인 단클론 항체를 인코딩한다. 일부 예시적인 구현예에서, 하나 초과의 전이유전자가 ceDNA 벡터에 의해 인코딩된다. 일부 예시적인 구현예에서, 전이유전자는 2개의 상이한 관심 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 전이유전자는 본원에 정의된 바와 같은 전장 항체 또는 항체 단편을 포함하는 항체를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 항체는 본원에 정의된 바와 같은 항원-결합 도메인 또는 면역글로불린 가변 도메인 서열이다. 다른 예시적인 전이유전자 서열은 자살 유전자 산물(티미딘 키나아제, 시토신 데아미나아제, 디프테리아 독소, 시토크롬 P450, 데옥시시티딘 키나아제 및 종양괴사인자), 암 치료에 사용되는 약물에 내성을 부여하는 단백질, 및 종양 억제 유전자 산물을 인코딩한다.
투여
하나의 구현예에서, 본 개시내용의 TNA 지질 나노입자는 생체내 세포의 형질도입을 위해 유기체에 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, TNA는 생체외 세포의 형질도입을 위해 유기체에 투여될 수 있다.
일반적으로, 투여는 분자를 혈액 또는 조직 세포와의 궁극적 접촉에 도입하는 데 통상적으로 사용되는 임의의 경로를 통해 이루어진다. 이러한 핵산을 투여하는 적합한 방법이 이용 가능하고 당업자에 널리 공지되어 있으며, 하나 초과의 경로가 특정 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있지만, 특정 경로가 종종 또 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터(예를 들어, ceDNA 지질 나노입자)와 같은 TNA의 예시적인 투여 방식에는, 경구, 직장, 경점막, 비강내, 흡입(예를 들어, 에어로졸을 통해), 협측(예를 들어, 설하), 질, 경막내, 안구내, 경피, 내피내, 자궁내(또는 알내(in ovo)), 비경구(예를 들어, 정맥내, 피하, 피내, 두개내, 근육내[골격, 횡격막 및/또는 심장 근육에의 투여 포함], 흉막내, 뇌내 및 관절내), 국소(예를 들어, 기도 표면을 포함한 피부 및 점막 표면, 및 경피 투여), 림프내 등뿐 아니라, (예를 들어, 간, 눈, 골격근, 심장근, 횡격막근, 또는 뇌에의) 직접적인 조직 또는 기관 주사가 포함된다.
본원에 기재된 바와 같은 TNA 지질 입자의 투여는, 비제한적으로, 뇌, 골격근, 평활근, 심장, 횡격막, 기도 상피, 간, 신장, 비장, 췌장, 피부, 및 눈으로 이루어지는 군에서 선택되는 부위를 포함하는 대상의 임의의 부위에 이루어질 수 있다. 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 TNA 지질 나노입자의 투여는 또한 종양에(예를 들어, 종양 또는 림프절에 또는 이의 근처에) 이루어질 수 있다. 임의의 주어진 경우에서 가장 적합한 경로는 치료, 개선 및/또는 예방하고자 하는 병태의 특성 및 중증도에 따라, 및 사용되는 본원에 기재된 바와 같은 특정 ceDNA(예를 들어, ceDNA 지질 나노입자)의 특성에 따라 달라질 것이다. 또한, ceDNA는 하나 초과의 전이유전자를 단일 벡터 또는 다수의 ceDNA 벡터(예를 들어, ceDNA 칵테일)로 투여하는 것을 가능하게 한다.
하나의 구현예에서, 골격근에의 ceDNA 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))의 투여는, 비제한적으로, 사지(예를 들어, 상완(upper arm), 하완(lower arm), 상각(upper leg) 및/또는 하각(lower leg)), 등, 목, 머리(예를 들어, 혀), 흉곽, 복부, 골반/회음, 및/또는 손(발)가락의 골격근에의 투여를 포함한다. ceDNA 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는 정맥내 투여, 동맥내 투여, 복강내 투여, 사지 관류(선택적으로, 다리 및/또는 팔의 격리된 사지 관류; 예를 들어 문헌[Arruda et al., (2005) Blood 105: 3458-3464] 참조), 및/또는 직접 근육내 주사에 의해 골격근에 전달될 수 있다. 특정 구현예에서, ceDNA 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자)는 사지 관류, 선택적으로 격리된 사지 관류에 의해(예를 들어, 정맥내 또는 관절내 투여에 의해), 대상(예를 들어, DMD와 같은 근디스트로피를 앓고 있는 대상)의 사지(팔 및/또는 다리)에 투여된다. 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자)는 "유체역학적" 기술을 이용하지 않고 투여될 수 있다.
심장근에의 ceDNA 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))의 투여는, 좌심방, 우심방, 좌심실, 우심실, 및/또는 격막에의 투여를 포함한다. ceDNA 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는 정맥내 투여, 대동맥내 투여와 같은 동맥내 투여, 직접 심장 주사(예를 들어, 좌심방, 우심방, 좌심실, 우심실에), 및/또는 관상동맥 관류에 의해 심장근에 전달될 수 있다. 횡격막근에의 투여는, 정맥내 투여, 동맥내 투여 및/또는 복강내 투여를 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 평활근에의 투여는, 정맥내 투여, 동맥내 투여 및/또는 복강내 투여를 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 이루어질 수 있다. 하나의 구현예에서, 투여는 평활근에, 근처에 및/또는 위에 존재하는 내피세포에 이루어질 수 있다.
하나의 구현예에서, ceDNA 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는 (예를 들어, 근디스트로피 또는 심장질환(예를 들어, PAD 또는 울혈성 심부전)을 치료, 개선 및/또는 예방하기 위해) 골격근, 횡격막근, 및/또는 심장근에 투여된다.
ceDNA 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는 CNS(예를 들어, 뇌 또는 눈)에 투여된다. ceDNA 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는 척수, 뇌간(연수, 교뇌), 중뇌(시상하부, 시상, 시상상부, 뇌하수체, 흑색질, 송과체), 소뇌, 종뇌(선조체, 후두엽, 측두엽, 두정엽 및 전두엽을 포함하는 대뇌, 피질, 기저핵, 해마 및 편도체), 변연계, 신피질, 선조체, 대뇌, 및 하구(inferior colliculus)에 도입될 수 있다. ceDNA 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는 망막, 각막, 및/또는 시신경과 같은 눈의 다양한 영역에 투여될 수 있다. ceDNA 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는 (예를 들어, 요추천자에 의해) 뇌척수액에 전달될 수 있다. ceDNA 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는 나아가 혈액-뇌 장벽이 교란된 상황(예를 들어, 뇌종양 또는 뇌경색)에서 CNS에 혈관내 투여될 수 있다.
하나의 구현예에서, ceDNA 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는, 비제한적으로, 경막내, 안구내, 뇌내, 심실내, 정맥내(예를 들어, 만니톨과 같은 당의 존재 하에서), 비강내, 이내, 안구내(예를 들어, 유리체내, 망막하, 전방) 및 안구주위(예를 들어, 테논낭하(sub-Tenon's region)) 전달뿐 아니라, 운동 뉴런으로의 역행 전달을 통한 근육내 전달을 포함하는, 당업계에 공지된 임의의 경로를 통해 CNS의 목적하는 영역(들)에 투여될 수 있다.
일부 구현예에 따르면, ceDNA 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는 직접 주사(예를 들어, 정위주사)를 통해 액체 제형으로 CNS 내 목적하는 영역 또는 구획에 투여된다. 다른 구현예에 따르면, ceDNA 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는 목적하는 영역에의 국소 적용 또는 에어로졸 제형의 비강내 투여를 통해 제공될 수 있다. 눈에의 투여는 액체 방울의 국소 적용을 통해 이루어질 수 있다. 추가의 대안으로서, ceDNA 벡터는 고체 서방형 제형으로 투여될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제7,201,898호(이는 그 전문이 본원에 참조로 인용됨) 참조). 하나의 구현예에서, ceDNA 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는 운동 뉴런과 관련된 질환 및 장애(예를 들어, 근위축측삭경화증(ALS); 척수근위축증(SMA) 등)를 치료, 개선 및/또는 예방하기 위한 역행 수송에 사용될 수 있다. 예를 들어, ceDNA 벡터(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ceDNA 벡터 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자))는 뉴런으로 이동할 수 있는 근육 조직에 전달될 수 있다.
하나의 구현예에서, 치료제의 반복 투여는 적절한 발현 수준이 달성될 때까지 이루어질 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 치료용 핵산은 다회 투여 및 재투여될 수 있다. 예를 들어, 치료용 핵산은 0일차에 투여될 수 있다. 0일차의 초기 치료 후, 두 번째 투여(재투여)는, 치료용 핵산을 이용한 초기 치료 후, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 5주, 약 6주, 약 7주, 약 8주, 또는 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 11개월, 또는 약 1년, 약 2년, 약 3년, 약 4년, 약 5년, 약 6년, 약 7년, 약 8년, 약 9년, 약 10년, 약 11년, 약 12년, 약 13년, 약 14년, 약 15년, 약 16년, 약 17년, 약 18년, 약 19년, 약 20년, 약 21년, 약 22년, 약 23년, 약 24년, 약 25년, 약 26년, 약 27년, 약 28년, 약 29년, 약 30년, 약 31년, 약 32년, 약 33년, 약 34년, 약 35년, 약 36년, 약 37년, 약 38년, 약 39년, 약 40년, 약 41년, 약 42년, 약 43년, 약 44년, 약 45년, 약 46년, 약 47년, 약 48년, 약 49년, 또는 약 50년 내에 수행될 수 있다.
하나의 구현예에서, 1종 이상의 추가 화합물이 또한 포함될 수 있다. 이러한 화합물은 별도로 투여될 수 있거나, 추가 화합물은 본 개시내용의 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)에 포함될 수 있다. 다시 말해서, 지질 입자(예를 들어, 지질 나노입자)는 ceDNA 이외의 다른 화합물, 또는 적어도 제1 ceDNA와 상이한 제2 ceDNA를 함유할 수 있다. 비제한적으로, 다른 추가 화합물은 소형 또는 대형 유기 또는 무기 분자, 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당류, 다당류, 펩타이드, 단백질, 펩타이드 유사체 및 유도체, 펩타이드 모방체, 핵산, 핵산 유사체 및 유도체, 생물학적 물질로 제조된 추출물, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.
하나의 구현예에서, 1종 이상의 추가 화합물은 치료제일 수 있다. 치료제는 치료 목적에 적합한 임의의 부류에서 선택될 수 있다. 따라서, 치료제는 치료 목적에 적합한 임의의 부류에서 선택될 수 있다. 치료제는 치료 목적 및 목적하는 생물학적 작용에 따라 선택될 수 있다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, LNP 내 ceDNA가 암 치료에 유용한 경우, 추가 화합물은 항암제(예를 들어, 화학요법제, 표적화 암치료(비제한적으로, 소분자, 항체, 또는 항체-약물 접합체 포함)일 수 있다. 하나의 구현예에서, ceDNA를 함유하는 LNP가 감염의 치료에 유용한 경우, 추가 화합물은 항미생물제(예를 들어, 항생제 또는 항바이러스 화합물)일 수 있다. 하나의 구현예에서, ceDNA를 함유하는 LNP가 면역 질환 또는 장애의 치료에 유용한 경우, 추가 화합물은 면역반응을 조절하는 화합물(예를 들어, 면역억제제, 면역자극 화합물, 또는 하나 이상의 특정 면역 경로를 조절하는 화합물)일 수 있다. 하나의 구현예에서, 상이한 단백질 또는 상이한 화합물, 예컨대 치료제를 인코딩하는 ceDNA와 같은 상이한 화합물을 함유하는 상이한 지질 입자의 상이한 칵테일이, 본 개시내용의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 추가 화합물은 면역조절제이다. 예를 들어, 추가 화합물은 면역억제제이다. 일부 구현예에서, 추가 화합물은 면역자극제이다.
실시예
하기 실시예는 제한이 아닌 예시로서 제공된다.
실시예 1: 화학식 I 또는 화학식 I'의 이온화 가능한 지질의 합성
화학식 (I) 또는 화학식 (I')의 이온화 가능한 지질은 하기에 기재되는 일반 합성 방법을 사용하여 설계되고 합성될 수 있다. 상기 방법이 이온화 가능한 지질을 이용하는 것으로 예시되어 있지만, 이는 화학식 (I) 또는 화학식 (I')에서 고려되는 절단 가능한 지질의 합성에 적용 가능하다.
일반 합성(예를 들어, R 4 = -C)
반응식 1에 예시된 바와 같이, 본원에 기재된 화학식 (I) 또는 화학식 (I')의 이온화 가능한 지질의 합성은, 지질 산(a)에 출발하고, N,O-디메틸 히드록실아민에 커플링하여 와인랩(Weinreb) 아미드(b)를 제공할 수 있다. 그리냐르(Grignard) 첨가반응으로 케톤(c)을 생성한다. 티타늄 매개 환원적 아민화로 유형 (d)의 생성물을 수득하고, 이를 이탈기, 즉 메탄설포닐기를 갖는 양쪽 말단 알코올을 포함하는 일반 구조 (e)의 이황화물과 반응시켜, 일반 구조 (f)의 최종 생성물을 생성한다. 지질 1 내지 51에 대한 특정 합성 절차는 하기에 기재되는 바와 같거나, 2020년 11월 23일자 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2020/061801에 기재된 바와 같으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
반응식 1
Figure pct00093
지질 1의 합성
Figure pct00094
짧은 절차를 이용한 개별 합성 단계
Figure pct00095
0℃로 냉각시킨 디클로로메탄(DCM) 중 올레산(I)의 용액에, CDI를 첨가하였다. 반응액을 30분 동안 주위 온도까지 가온시킨 후, 0℃까지 냉각시키고, 먼저 트리에틸아민으로 처리한 후, 디메틸히드록실아민 히드로클로라이드로 처리하였다. 1시간 후, 반응액을 물과 헵탄 사이에 분배하였다. 유기물을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공에서 증발시켜 미정제 와인랩 아미드(II)를 수득하고, 이를 바로 다음 반응에 사용하였다.
Figure pct00096
디클로로메탄 중 1 M 디에틸아연 용액을 -1℃까지 냉각시키고, TFA를 적가하여 처리하였다. 30분 후, 디요오도메탄을 첨가하고, 아이스 배쓰에서 30분 동안 숙성시켰다. 이러한 용액에, 와인랩 아미드(II)를 첨가하였다. 반응액을 주위 온도까지 가온시키고, 1시간 동안 교반하였다. 염화암모늄 용액으로 반응을 켄칭하고, 유기층을 분리해내고, 10% 티오황산소듐으로 세정하고, 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공에서 증발시켰다. 플래시 크로마토그래피로 정제하여 (III)을 수득하였다.
Figure pct00097
화합물 (III)을 무수 THF에 용해시킨 후, 질소 하에 주위 온도에서 1 M 노닐마그네슘 브로마이드를 첨가하였다. 10분 후, 과량의 NH4Cl 포화 수용액으로 반응을 서서히 켄칭하였다. 반응액을 헥산과 물을 이용하여 분별 깔대기로 세정하고, 진탕시키고, 하부 수성층을 폐기하고, 상부 층을 황산소듐으로 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 미정제 케톤을 수득하였다. 상기 미정제 케톤(IV)에 디메틸아민(THF 중 2 M)을 첨가하고, 이어서 Ti(O-i-Pr)4를 첨가한 후, 밤새 교반하였다. 다음날, 에탄올을 첨가하고, 이어서 NaBH4를 첨가하였다. 5분 동안 교반한 후, 전체 반응액을 정제를 위해 바로 실리카 컬럼에 주입하여 화합물 (IV)를 수득하였다.
Figure pct00098
지질 1
이황화물(e)과 4 몰 당량의 아민(V)을 아세토니트릴에 용해시키고, Cs2CO3의 존재 하에서 약 48시간 동안 가열하였다. 미정제 반응 혼합물을 플래시 크로마토그래피용 실리카 상에 로딩하여 최종 목표 지질 1을 수득하였다.
실시예 2: 화학식 II의 이온화 가능한 지질의 합성
일반 합성
화학식 (II)의 이온화 가능한 지질은 하기 반응식 2의 일반 절차에 기재된 바와 유사한 합성 방법을 사용하여 설계하고 합성하였다. 지질 52 내지 71에 대한 특정 합성 절차는 하기에 기재되는 바와 같거나, 2021년 3월 26일자 출원된 국제 특허 출원 PCT/US2021/024413에 기재된 바와 같으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
반응식 2
Figure pct00099
1-(헵타데칸-9-일) 9-(4-(2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-(올레오일옥시)페닐)아세톡시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에톡시)-2-옥소에틸)페닐) 노난디오에이트(지질 52)의 합성
절단 가능하고 이온화 가능한 헤드기 ((디설판디일비스(에탄-2,1-디일))비스(피페리딘-1,4-디일))비스(에탄-2,1-디일)비스(2-(4-히드록시페닐)아세테이트)(7)의 합성
단계-1
Figure pct00100
디설판디일비스(에탄-2,1-디일) 디메탄설포네이트(2)의 합성. 상업적으로 입수 가능한 2,2'-디설판디일비스(에탄-1-올)(1)(15 g, 97.2 mmol)을 아세토니트릴(143 ml)에 용해시킨 후, 트리에틸아민(NEt3)(33.3 g, 328 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물에, 0℃에서 메탄설포닐 클로라이드(MsCl)(34.5 g, 300 mmol)를 적가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물에 에탄올(EtOH)(39 ml)을 첨가하여 반응을 켄칭하고, 여과하여 불용성 물질을 제거하였다. 여과액을 디클로로메탄(DCM)(150 ml)과 10% 탄산수소소듐 수용액(150 ml) 사이에 분배하였다. 유기층을 물(100 ml)로 4회 세정하고, 황산마그네슘(MgSO4) 상에서 건조시키고, 증발시켜 2(25 g, 81%)를 갈색 오일로 수득하고, 이를 정치시켜 고체화시켰다. 1H-NMR (300 MHz, d-클로로포름): δ 4.43-4.48 (t, 4H), 3.00-3.10 (m, 10H).
단계-2
Figure pct00101
2,2'-((디설판디일비스(에탄-2,1-디일))비스(피페리딘-1,4-디일))비스(에탄-1-올)(4)의 합성. 아세토니트릴(310 ml) 중 2(12 g, 38.7 mmol)의 용액에, 탄산포타슘(K2CO3)(13.4 g, 96.6 mmol), 이어서 2-(피페리딘-4-일)에탄-1-올(3)(20 g, 155 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 여과하여 불용성 물질을 제거하였다. 여과액을 건조될 때까지 증발시켜 미정제 생성물을 수득하고, 이를 DCM(100 ml)에 용해시키고, 물(50 ml)로 2회 세정하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 증발시켜 4를 황색 오일(11.8 g, 79%)로 수득하였다. 1H-NMR (300 MHz, d-클로로포름): δ 3.63-3.68 (t, 4H), 2.78-2.90 (m, 8H), 2.62-2.65 (t, 4H), 1.94-2.02 (t, 4H), 1.70 (s, 2H), 1.65-1.70 (d, 4H), 1.27-1.48 (t, 4H), 1.40-1.50 (m, 2H), 1.23-1.27 (m, 4H).
단계-3
Figure pct00102
2-(4-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)페닐)아세트산(5)의 합성. 디메틸포름아미드(DMF)(40 ml) 중 4-히드록시페닐아세트산(5a)(10 g, 65 mmol)의 교반된 용액에, 0℃에서 NEt3(10 g, 100 mmol), 이어서 tert-부틸디메틸실릴클로라이드(TBSCl)(15 g, 100 mmol)를 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 물(200 ml) 및 DCM(150 ml)으로 처리하였다. 유기상을 분리하였다. 수성상을 DCM(100 ml)으로 추출하였다. 조합한 유기상을 탄산수소소듐 포화 용액과 염수로 세정하고, 황산소듐(Na2SO4) 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→10% 메탄올(MeOH)을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 풀링하고, 증발시켜 5(4.8 g, 27%) 및 디-tert-부틸디메틸실릴 에테르(di-TBS) 부산물(10.5 g, 42%)을 수득하였다. 5의 1H-NMR(300 MHz, d-클로로포름): δ 7.12 (d, 2H), 6.78 (d, 2H), 3.56 (s, 2H), 0.97 (s, 9H), 0.18 (s, 6H).
Figure pct00103
((디설판디일비스(에탄-2,1-디일))비스(피페리딘-1,4-디일))비스(에탄-2,1-디일)비스(2-(4-((tert-부틸디메틸실릴)옥시)페닐)아세테이트)(6)의 합성. DCM(100 ml) 중 단계-2에서 얻은 디설파이드 4(1.92 g, 5 mmol)와 페닐아세트산 5(3.4 g, 12.8 mmol)의 교반된 용액에, 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)(1.5 g, 12.5 mmol), 이어서 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDCI)(2.4 g, 12.5 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 탄산수소소듐 포화 용액(200 ml)과 염수(150 ml)로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→10% MeOH을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 증발시켜 6(4.1 g, 92%)을 수득하였다. 6의 1H-NMR(300 MHz, d-클로로포름): δ 7.12 (d, 4H), 6.75 (d, 4H), 4.1 (t, 4H), 3.5 (s, 4H), 2.82 (m, 8H), 2.62 (m, 4H), 1.93 (t, 4H), 1.61-1.45 (m, 8H), 1.26 (m, 6H), 0.97 (s, 18H), 0.17 (s, 4H).
단계-4
Figure pct00104
((디설판디일비스(에탄-2,1-디일))비스(피페리딘-1,4-디일))비스(에탄-2,1-디일)비스(2-(4-히드록시페닐)아세테이트)(7)의 합성. 테트라히드로푸란(THF)(40 ml) 중 디설파이드 6(3.1 g, 3.6 mmol)의 교반된 용액에, 0℃에서 플루오린화수소 피리딘(1 ml, 3.8 mmol)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 0℃에서 2시간 동안, 이어서 실온에서 추가 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 탄산수소소듐 포화 용액(200 ml)으로 처리하고, 에틸 아세테이트(2 × 150 ml)로 추출하였다. 조합한 유기상을 염수(100 ml)로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→10% MeOH을 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적하는 생성물 7(1.92 g, 82%)을 제공하였다. 1H-NMR (300 MHz, d-클로로포름): δ 7.13 (d, 4H), 6.70 (d, 4H), 4.1 (t, 4H), 3.5 (s, 4H), 2.89 (m, 8H), 2.70 (m, 4H), 1.95 (t, 4H), 1.48 (m, 8H), 1.17 (m, 6H).
9-(헵타데칸-9-일옥시)-9-옥소노난산(10)의 합성
Figure pct00105
9-(헵타데칸-9-일옥시)-9-옥소노난산(10)의 합성. 디클로로메탄(1000 ml) 중 노난디오산(8)(7.34 g, 39 mmol)과 헵타데칸-9-올(8b)(5 g, 19 mmol)의 교반된 용액에, DMAP(2.37 g, 19 mmol), 이어서 EDCI(3 g, 19 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 1 N HCl(250 ml)과 물(250 ml)로 세정하였다. 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 건조될 때까지 증발시키고, 용리액으로 DCM 중 0%→10% MeOH을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 풀링하고, 증발시켜 10(6.2 g, 75%)을 백색 고체로 수득하였다. 1H-NMR (300 MHz, d-클로로포름): δ 4.80-4.90 (m, 1H), 2.25-2.34 (m, 4H), 1.55-1.70 (m, 4H), 1.40-1.50 (m, 4H), 1.20-1.40 (m, 30H), 0.84-0.90 (t, 3H).
1-(헵타데칸-9-일) 9-(4-(2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-히드록시페닐)아세톡시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에톡시)-2-옥소에틸)페닐) 노난디오에이트의 합성
Figure pct00106
1-(헵타데칸-9-일) 9-(4-(2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-히드록시페닐)아세톡시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에톡시)-2-옥소에틸)페닐) 노난디오에이트(11)의 합성. DMF(20 ml) 중 단계-4에서 제조된 디설파이드 7(580 mg, 0.9 mmol)과 산 10(422 mg, 0.99 mmol)의 교반된 용액에, DMAP(165 mg, 1.35 mmol), 이어서 EDCI(258 mg, 1.35 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 탄산수소소듐 포화 용액(50 ml)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 디클로로메탄(2 × 50 ml)으로 추출하였다. 조합한 유기상을 염수(30 ml)로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→10% MeOH을 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목적하는 생성물 11(427 mg, 45%)을 수득하였다. 1H-NMR (300 MHz, d-클로로포름): δ 7.27 (d, 2H), 7.11 (d, 2H), 7.03 (d, 2H), 6.69 (d, 2H), 4.85 (m, 1H), 4.1 (m, 4H), 3.56 (s, 2H), 3.48 (s, 2H), 2.92 (d, 2H), 2.85-2.69 (m, 12H), 2.71 (t, 2H), 2.28 (t, 2H), 1.95 (t, 2H), 1.52-1.01 (m, 53H), 0.85 (m, 6H).
지질 52의 합성
Figure pct00107
1-(헵타데칸-9-일) 9-(4-(2-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(2-(4-(올레오일옥시)페닐)아세톡시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에톡시)-2-옥소에틸)페닐) 노난디오에이트(지질 52)의 합성. 디클로로메탄(10 ml) 중 디설파이드 11(151 mg, 0.14 mmol)과 올레산 12(61 mg, 0.22 mmol)의 교반된 용액에, DMAP(28 mg, 0.22 mmol), 이어서 EDCI(42 mg, 0.22 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 탄산수소소듐 포화 용액(20 ml)과 염수(20 ml)로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→10% MeOH을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 증발시켜 지질 52(126 mg, 68%)를 수득하였다. 지질 52의 1H-NMR(300 MHz, d-클로로포름): δ 7.25 (d, 4H), 7.01 (d, 4H), 5.34 (m, 2H), 4.86 (m, 1H), 4.11 (t, 4H), 3.58 (s, 4H), 2.91-2.70 (m, 8H), 2.62 (m, 4H), 2.53 (t, 4H), 2.28 (t, 2H), 2.05-1.87 (m, 8H), 1.78-1.46 (m, 22H), 1.48-1.23 (m, 54H), 0.86 (t, 9H). MS [M+H]+ 1318.
실시예 3: 화학식 V의 이온화 가능한 지질의 합성
화학식 (V)의 이온화 가능한 지질은 하기 반응식 3의 일반 절차에 기재된 바와 유사한 합성 방법을 사용하여 설계하고 합성하였다. 지질 72 내지 76에 대한 특정 합성 절차 또한 하기에 기재되어 있다. 변수 R1, R1', R2, R2', R3, R3', R4, R4', R5 및 R5'는 화학식 (V)에 정의된 바와 같다. Rx는 R4보다 2개의 탄소 원자만큼 짧고, 유사하게, Rx'는 R4'보다 2개의 탄소 원자만큼 짧다.
반응식 3
Figure pct00108
단계 1에서, 디클로로메탄(DCM) 중 디설파이드 1 및 산 2의 교반된 용액에, 4-디메틸아미노피리딘(DMAP), 이어서 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDCI)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2일 동안 교반한 후, 탄산수소소듐 포화 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 DCM으로 추출하였다. 조합한 유기상을 염수로 세정하고, 황산소듐(Na2SO4) 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→5% 메탄올(MeOH)을 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 3을 수득하였다. 단계 2 시약 및 조건은 단계 1에서와 거의 동일하였으며, 최종 생성물로 화학식 (V)의 지질을 수득하였다.
반응식 4
Figure pct00109
O'1,O1-(((디설판디일비스(에탄-2,1-디일))비스(피페리딘-1,4-디일))비스(에탄-2,1-디일)) 9,9'-디(헵타데칸-9-일) 디(노난디오에이트)(지질 76) 및 1-(헵타데칸-9-일) 9-(2-(1-(2-((2-(4-(2-(올레오일옥시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에틸) 노난디오에이트(지질 72)의 합성
반응식 4를 참조하여, DCM(50 ml) 중 디설파이드 1a(이의 합성은 실시예 2에 기재되어 있음)(1.17 g, 3.1 mmol)와 9-(헵타데칸-9-일옥시)-9-옥소노난산(2.0 g, 4.6 mmol)의 교반된 용액에, DMAP(565 mg, 4.6 mmol), 이어서 EDCI(878 mg, 4.6 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2일 동안 교반한 후, 탄산수소소듐 포화 용액(60 ml)과 염수(20 ml)로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→10% MeOH을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 2회 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 증발시켜 지질 76(620 mg, 23%)과, 1-(헵타데칸-9-일) 9-(2-(1-(2-((2-(4-(2-히드록시에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에틸) 노난디오에이트 또는 화합물 3a-D(즉, 반응식 4의 화합물 3a(여기서, Ry = D))(389 mg, 22%)를 수득하였다.
지질 76의 1H-NMR(300 MHz, d-클로로포름): δ 4.85 (m, 2H), 4.09 (t, 4H), 2.91-2.74 (m, 8H), 2.63-2.67 (m, 4H), 2.27-2.22 (m, 8H), 1.97 (t, 4H), 1.75-1.43 (m, 24H), 1.45-1.16 (m, 66H), 0.86 (t, 12H). MS [M+H]+ 1194.
3a-D의 1H-NMR(300 MHz, d-클로로포름): δ 4.83 (m, 1H), 4.06 (t, 2H), 3.63 (t, 2H), 2.97-2.69 (m, 9H), 2.66 (m, 4H), 2.25 (t, 4H), 1.93 (t, 4H ), 1.76-1.43 (m,16H), 1.39-1.22 (m, 36H), 0.86 (t, 6H).
다음으로, 디클로로메탄(10 ml) 중 디설파이드 3a-D(185 mg, 0.23 mmol)와 올레산(131 mg, 0.46 mmol)의 교반된 용액에, DMAP(55 mg, 0.46 mmol), 이어서 EDCI(87 mg, 0.46 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 탄산수소소듐 포화 용액(20 ml)과 염수(20 ml)로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→10% MeOH을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 증발시켜 지질 72(165 mg, 68%)를 수득하였다.
지질 72의 1H-NMR(300 MHz, d-클로로포름): δ 5.32 (m, 2H), 4.85 (m, 1H), 4.09 (t, 4H), 2.96-2.77 (m, 8H), 2.67-2.53 (m, 4H), 2.28-2.20 (m, 6H), 2.16-1.92 (t, 8H), 1.75-1.47 (m, 14H), 1.41-1.13 (m, 60H), 0.86 (t, 9H). MS [M+H]+ 1049.
O'1,O1-(((디설판디일비스(에탄-2,1-디일))비스(피페리딘-1,4-디일))비스(에탄-2,1-디일)) 9,9'-디노닐 디(노난디오에이트)(지질 75)의 합성
반응식 4를 참조하여, DCM(25 ml) 중 디설파이드 1a(376 mg, 1 mmol)와 9-(옥틸옥시)-9-옥소노난산(629 mg, 2 mmol)의 교반된 용액에, DMAP(244 mg, 2 mmol), 이어서 EDCI(310 mg, 2 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 탄산수소소듐 포화 용액(20 ml)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 DCM(2 × 50 ml)으로 추출하였다. 조합한 유기상을 염수(30 ml)로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→5% MeOH을 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 지질 75(240 mg, 25%)를 연황색 고체로 수득하였다. 1H-NMR (300 MHz, d-클로로포름): δ 4.04-4.09 (m, 8 H), 2.5-3.0 (m, 10 H), 2.25-2.30 (t, 8 H), 2.0 (t, 4 H), 1.58-1.90 (m, 24 H), 1.20-1.40 (m, 42 H), 0.87 (t, 6 H).
1-(헵타데칸-9-일) 9-(2-(1-(2-((2-(4-(2-((9-(노닐옥시)-9-옥소노나노일)옥시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에틸) 노난디오에이트(지질 74)의 합성
반응식 4를 참조하여, DCM(25 ml) 중 디설파이드 1a(376 mg, 1 mmol)와 9-(옥틸옥시)-9-옥소노난산(629 mg, 2 mmol)의 교반된 용액에, DMAP(244 mg, 2 mmol), 이어서 EDCI(310 mg, 2 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 탄산수소소듐 포화 용액(20 ml)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 DCM(2 × 50 ml)으로 추출하였다. 조합한 유기상을 염수(30 ml)로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물을 용리액으로 디클로로메탄 중 0%→5% MeOH을 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 1-(2-(1-(2-((2-(4-(2-히드록시에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에틸) 9-노닐 노난디오에이트 또는 화합물 3a-C(즉, 반응식 4의 화합물 3a(여기서, Ry = C))(250 mg, 26%)를 수득하고, 이를 특징분석 없이 바로 다음 전환에 사용하였다.
다음으로, DCM(50 ml) 중 디설파이드 3a-C(650 mg, 0.97 mmol)와 9-(헵타데칸-9-일옥시)-9-옥소노난산(411 mg, 0.96 mmol)의 교반된 용액에, DMAP(117 mg, 0.96 mmol), 이어서 EDCI(149 mg, 0.96 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2일 동안 교반한 후, 물로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→10% MeOH을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 증발시켜 지질 74(420 mg, 40%)를 수득하였다. 1H-NMR (300 MHz, d-클로로포름): δ 4.9 (m, 1 H), 4.05-4.09 (m, 6 H), 2.80-3.0 (m, 8 H), 2.60-2.70 (m, 4 H), 2.25-2.27 (m, 8 H), 1.92-2.01 (t, 4 H), 1.48-1.62 (m, 25 H), 1.24-1.40 (m, 52 H), 0.87 (t, 9 H).
1-(헵타데칸-9-일) 9-(2-(1-(2-((2-(4-(2-((5-(노닐옥시)-5-옥소펜타노일)옥시)에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에틸) 노난디오에이트(지질 73)의 합성
DCM(100 ml) 중 디설파이드 4(3.76 g, 10 mmol)와 9-(헵타데칸-9-일옥시)-9-옥소노난산(2.13 g, 5 mmol)의 교반된 용액에, DMAP(776 mg, 5 mmol), 이어서 EDCI(610 mg, 5 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2일 동안 교반한 후, 탄산수소소듐 포화 용액(40 ml)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 DCM(2 × 100 ml)으로 추출하였다. 조합한 유기상을 염수(60 ml)로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→5% MeOH을 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 1-(헵타데칸-9-일) 9-(2-(1-(2-((2-(4-(2-히드록시에틸)피페리딘-1-일)에틸)디설파닐)에틸)피페리딘-4-일)에틸) 노난디오에이트 또는 화합물 3a-D(즉, 반응식 4의 화합물 3a(여기서, Ry = D))(1.4 g, 36%)를 수득하였다. 1H-NMR (300 MHz, d-클로로포름): δ 4.90 (m, 1 H), 4.09-4.10 (m, 3 H), 3.68 (t, 2 H), 2.79-2.99 (m, 8 H), 2.66 (m, 4 H), 2.30 (m, 4 H), 2.03 (t, 4H ), 1.22-1.78 (m, 55 H), 0.86 (s, 6 H).
다음으로, DCM(20 ml) 중 디설파이드 3a-D(300 mg, 0.38 mmol)와 5-(노닐옥시)-5-옥소펜탄산(115 mg, 0.45 mmol)의 교반된 용액에, DMAP(49 mg, 0.4 mmol), 이어서 EDCI(62 mg, 0.4 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 탄산수소소듐 포화 용액(20 ml)과 염수(20 ml)로 세정하고, Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→5% MeOH을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 증발시켜 지질 73(165 mg, 42%)을 수득하였다. 1H-NMR (300 MHz, d-클로로포름): δ 5.85 (m, 1 H), 4.05-4.10 (m, 6 H), 2.79-2.88 (m, 8 H), 2.63-2.66 (m, 4 H), 2.33-2.36 (t, 4 H), 2.26-2.33 (t, 4 H), 1.94-1.98 (m, 6 H), 1.55-1.59 (m, 22 H), 1.24-1.40 (m, 48 H), 0.84-0.89 (t, 9 H).
실시예 4: 화학식 XV의 이온화 가능한 지질의 합성
화학식 (XV)의 지질은 하기 반응식 5(R5는 존재하지 않음) 및 반응식 6(R5는 C1-C8 알킬렌 또는 C2-C8 알케닐렌임)에 도시된 유사한 합성 방법을 사용하여 설계하고 합성하였다. 반응식 5 및 반응식 6에 도시된 화합물 내 모든 다른 변수, 즉, R1, R2, R3, R4, R6a, R6b, X1, X2 및 n은 화학식 (XV)에 정의된 바와 같다. X1'는 정의된 바와 같은 X1이지만, 벤질 또는 피리딘과 같은 추가 보호기가 있다. 지질 77 내지 87에 대한 추가적인 합성 절차 및 특정 합성 절차는 2021년 4월 20일자 출원된 미국 특허 출원 제63/176,943호에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용된다.
반응식 5
Figure pct00110
반응식 6
Figure pct00111
R x 는 R 5 보다 탄소 원자가 하나 적은 알킬렌 또는 알케닐렌이다.
화학식 (XVII)의 디에스테르 지질은 하기 반응식 7(R5는 존재하지 않음) 및 반응식 8(R5는 C1-C8 알킬렌 또는 C2-C8 알케닐렌임)에 도시된 유사한 합성 방법을 사용하여 설계하고 합성하였다. 반응식 7 및 반응식 8에 도시된 화합물 내 모든 다른 변수, 즉, R1, R2, R3, R4, R6a, R6b 및 n은 화학식 (XVII)에 정의된 바와 같다.
반응식 7
Figure pct00112
반응식 8
Figure pct00113
R x 는 R 5 보다 탄소 원자가 하나 적은 알킬렌 또는 알케닐렌이다.
반응식 5 및 반응식 6
반응식 5 및 반응식 6을 참조하여, 단계 1에서, 디클로로메탄(DCM) 중 산 1 및 알코올 2(또는 2a)의 교반된 용액에, 4-디메틸아미노피리딘(DMAP), 이어서 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDCI)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 염산(HCl)과 물로 세정하였다. 유기층을 황산마그네슘(MgSO4) 상에서 건조시키고, 건조될 때까지 증발시키고, 용리액으로 DCM 중 0%→10% 메탄올(MeOH)을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 풀링하고, 증발시켜 산 3을 백색 고체로 수득하였다.
단계 2에서, DCM 중 산 3(또는 3a)의 용액에, EDCI와 트리에틸아민(TEA)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 이어서, N,O-디메틸히드록실아민 히드로클로라이드와 DMAP를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 다음날, 염화암모늄 수용액(NH4Cl(aq))으로 반응을 켄칭하고, DCM으로 희석하였다. 유기층을 NH4Cl과 염수로 세정하고, 무수 황산소듐(Na2SO4) 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 하에서 증발시켰다. 생성물 4(또는 4a)를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
단계 3에서, 화합물 4(또는 4a)를 무수 테트라히드로푸란(THF)에 용해시켰다. 이어서, 0℃에서 5, 즉 디에틸 에테르(Et2O) 중 브롬화마그네슘 용액을 적가하였다. 생성된 혼합물을 질소 가스(N2) 하 실온에서 16시간 동안 교반하였다. NH4Cl 포화 용액으로 반응을 켄칭하고, 에테르로 추출하였다. 유기층을 염수로 세정하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 하에서 증발시키고, 용리액으로 헥산 중 0%→10% 에틸 아세테이트(EtOAc)를 사용하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 6(또는 6a)을 수득하였다.
단계 4에서, 무수 THF 중 6(또는 6a)의 용액에, 0℃에서 소듐 보로히드라이드(NaBH4)를 첨가하고, 혼합물을 N2 분위기 하에서 밤새 교반하였다. NH4Cl 포화 용액으로 반응을 켄칭하고, EtOAc로 추출하였다. 유기상을 염수로 세정하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 하에서 증발시키고, 용리액으로 헥산 중 0%→10% EtOAc를 사용하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 7을 수득하였다.
단계 5에서, DCM 중 화합물 7(또는 7a) 및 화합물 8(또는 8a)의 용액에, N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA)을 첨가하였다. 이어서, EDCI 및 DMAP(0.012 g, 0.1 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 N2 분위기 하 실온에서 밤새 교반하였다. 다음날, 반응액을 DCM으로 희석하였다. 유기층을 탄산수소소듐 수용액(NaHCO3(aq))으로 세정하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 하에서 증발시키고, 용리액으로 DCM 중 0%→5% MeOH을 사용하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 최종 생성물 9(또는 디에스테르 9a)를 수득하였다.
반응식 7 및 반응식 8
반응식 7 및 반응식 8을 참조하여, 단계 1에서, THF 중 케톤 10(3 g, 11.8 mmol)의 얼음 냉각된 용액에, 인산 무수물 용액 11을 적가하였다. 반응액을 30분 동안 교반한 후, 수소화소듐(NaH)을 첨가하였다. 반응을 통해 12를 수득하였다.
단계 2에서, THF 중 화합물 2를 수소화알루미늄리튬 용액(LiAlH4)과 반응시켰다. 48시간 후, 미정제물을 물로 켄칭하고, 에테르로 추출하여 알코올 13을 수득하였다.
반응식 6 및 반응식 7의 후속 단계 3 내지 단계 7은, 적절한 출발 물질로서 알코올 13 및 당업자의 지식에 속할 수 있는 기타 변형을 이용하여, 반응식 4 및 반응식 5의 단계 1 내지 단계 5에 기재된 바와 유사한 절차에 따라 수행하였다.
지질 77, 지질 78, 지질 79, 지질 80 및 지질 81의 합성
지질 77, 지질 78, 지질 79, 지질 80 및 지질 81의 합성 절차는 하기에 제공되어 있는 반응식 9를 참조로 하기에 기재되어 있다.
반응식 9
Figure pct00114
단계 1: 9-(헵타데칸-9-일옥시)-9-옥소노난산( 3b )의 합성
DCM(1000 ml) 중 노난디오산(2b, 아젤라산으로 불림)(7.34 g, 39 mmol)과 헵타데칸-9-올(1a)(5 g, 19 mmol)의 교반된 용액에, DMAP(2.37 g, 19 mmol), 이어서 EDCI(3 g, 19 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 밤새 교반한 후, 1 N HCl(250 ml)과 물(250 ml)로 세정하였다. 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 건조될 때까지 증발시키고, 용리액으로 DCM 중 0%→10% 메탄올을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 풀링하고, 증발시켜 3b(6.2 g, 75%)를 백색 고체로 수득하였다. 1H-NMR (300 MHz, d-클로로포름): δ 4.80-4.90 (m, 1H), 2.25-2.34 (m, 4H), 1.55-1.70 (m, 4H), 1.40-1.50 (m, 4H), 1.20-1.40 (m, 30H), 0.84-0.90 (t, 3H).
단계 2: 헵타데칸-9-일 9-(메톡시(메틸)아미노)-9-옥소노나노에이트( 4b )의 합성
DCM(60 mL) 중 화합물 3(5.4 g, 12.7 mmol)의 용액에, EDCI(3.6 g, 19.7 mmol)와 TEA(3.5 mL, 25.4 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반하였다. 이어서, N,O-디메틸히드록실아민 히드로클로라이드(1.36 g, 13.97 mmol)와 DMAP(0.15 g, 1.27 mmol)를 첨가하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 다음날, NH4Cl(aq)으로 반응을 켄칭하고, DCM으로 희석하였다. 유기층을 NH4Cl과 염수로 세정하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 하에서 증발시켰다. 생성물 4b를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. 1H NMR (300 MHz, d-클로로포름) δ 4.85 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 3.67 (s, 3H), 3.58 (s, 2H), 3.17 (s, 3H), 2.40 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.27 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.63 (dd, J = 14.8, 5.5 Hz, 6H), 1.49 (d, J = 5.4 Hz, 4H), 1.37 - 1.19 (m, 32H), 0.86 (d, J = 6.8 Hz, 6H).
단계 3: 헵타데칸-9-일 9-옥소헥사데카노에이트( 6b , 여기서 R 4 는 C 7 알킬임), 헵타데칸-9-일 9-옥소헵타데카노에이트( 6b , 여기서 R 4 는 C 8 알킬임), 헵타데칸-9-일 9-옥소옥타데카노에이트( 6b , 여기서 R 4 는 C 9 알킬임), 헵타데칸-9-일 9-옥소노나데카노에이트( 6b , 여기서 R 4 는 C 10 알킬임) 또는 헵타데칸-9-일 9-옥소이코사노에이트( 6b , 여기서 R 4 는 C 11 알킬임)의 합성
헵타데칸-9-일 9-옥소헥사데카노에이트( 6b , 여기서 R 4 는 C 7 알킬임)
화합물 4b(1.0 g, 2.13 mmol)를 무수 THF(10 ml)에 용해시켰다. 이어서, 0℃에서 Et2O(3.2 ml, 3.2 mmol) 중 1 M 헵틸 마그네슘 브로마이드 용액(화합물 5a, 여기서 R 4 는 C7 알킬임)을 적가하였다. 생성된 혼합물을 N2 하 실온에서 16시간 동안 교반하였다. NH4Cl 포화 용액으로 반응을 켄칭하고, 에테르로 추출하였다. 유기층을 염수로 세정하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 하에서 증발시키고, 용리액으로 헥산 중 0%→10% EtOAc를 사용하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 6b(여기서, R 4 는 C7 알킬임)(0.3 g, 30%)를 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, d-클로로포름) δ 4.85 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 2.37 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 2.27 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.64-1.43 (m, 12H), 1.27 (s, 36), 0.87 (t, J = 6.7 Hz, 9H).
헵타데칸-9-일 9-옥소헵타데카노에이트( 6b , 여기서 R 4 는 C 8 알킬임)
화합물 4b(1.0 g, 2.13 mmol)를 무수 THF(10 ml)에 용해시켰다. 이어서, 0℃에서 Et2O(1.6 ml, 3.2 mmol) 중 1 M 옥틸 마그네슘 브로마이드 용액(화합물 5, 여기서 R 4 는 C8 알킬임)을 적가하였다. 생성된 혼합물을 N2 하 실온에서 16시간 동안 교반하였다. NH4Cl 포화 용액으로 반응을 켄칭하고, 에테르로 추출하였다. 유기층을 염수로 세정하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 하에서 증발시키고, 용리액으로 헥산 중 0%→10% EtOAc를 사용하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 6b(여기서, R 4 는 C8 알킬임)(0.41 g, 40%)를 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, d-클로로포름) δ 4.85 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 2.37 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 2.26 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.65 - 1.38 (m, 8H), 1.33- 1.18 (m, 42H), 0.87 (t, J = 6.5 Hz, 9H).
헵타데칸-9-일 9-옥소옥타데카노에이트( 6b , 여기서 R 4 는 C 9 알킬임)
화합물 4b(1.1 g, 2.3 mmol)를 무수 THF(20 ml)에 용해시켰다. 이어서, 0℃에서 Et2O(6.13 ml, 3.2 mmol) 중 1 M 노닐 마그네슘 브로마이드 용액(화합물 5, 여기서 R 4 는 C9 알킬임)을 적가하였다. 생성된 혼합물을 2시간에 걸쳐 실온에 이르게 하였다. NH4Cl 포화 용액으로 반응을 켄칭하고, 에테르로 추출하였다. 유기층을 염수로 세정하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 하에서 증발시키고, 용리액으로 헥산 중 0%→30% EtOAc를 사용하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 6b(여기서, R 4 는 C9 알킬임)(1.2 g, 96%)를 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, d-클로로포름) δ 4.85 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 2.37 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 2.26 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.65 - 1.38 (m, 8H), 1.33- 1.18 (m, 44H), 0.87 (t, J = 6.5 Hz, 9H).
헵타데칸-9-일 9-옥소노나데카노에이트( 6b , 여기서 R 4 는 C 10 알킬임)
화합물 4b(0.3 g, 0.64 mmol)를 무수 THF(2 ml)에 용해시켰다. 이어서, 0℃에서 Et2O(1.28 ml, 0.77 mmol) 중 1 M 데실 마그네슘 브로마이드 용액(화합물 5, 여기서 R 4 는 C10 알킬임)을 적가하였다. 생성된 혼합물을 2시간에 걸쳐 실온에 이르게 하였다. NH4Cl 포화 용액으로 반응을 켄칭하고, 헥산으로 추출하였다. 유기층을 염수로 세정하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 하에서 증발시키고, 용리액으로 헥산 중 0%→10% EtOAc를 사용하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 6b(여기서, R 4 는 C10 알킬임)(0.2 g, 47%)를 수득하였다.
헵타데칸-9-일 9-옥소이코사노에이트( 6b , 여기서 R 4 는 C 11 알킬임)
무수 에테르(2 mL) 중 1-브로모운데칸(0.47 g, 2 mmol)의 용액에, Mg(0.072 g, 3 mmol)과 1,2-디브로에탄(1 방울)을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 1시간 동안 교반하고, 여과하고, 건조시켰다. 생성물 운데실마그네슘 브로마이드(화합물 5, 여기서 R 4 는 C11 알킬임)를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
화합물 4b(0.47 g, 1 mmol)를 무수 THF(3 ml)에 용해시켰다. 이어서, 0℃에서 THF(1.1 ml, 1 mmol) 중 운데실마그네슘 브로마이드 용액을 적가하였다. 생성된 혼합물을 2시간에 걸쳐 실온에 이르게 하였다. NH4Cl 포화 용액으로 반응을 켄칭하고, 헥산으로 추출하였다. 유기층을 염수로 세정하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 하에서 증발시키고, 용리액으로 헥산 중 0%→10% EtOAc를 사용하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 5(여기서, R 4 는 C11 알킬임)(0.27 g, 48%)를 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, d-클로로포름) δ 4.86 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 2.37 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 2.27 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.70 - 1.45 (m, 8H), 1.29-1.25 (m, 48H), 0.87 (t, J = 6.6 Hz, 9H).
단계 4: 헵타데칸-9-일 9-히드록시헥사데카노에이트( 7b , 여기서 R 4 는 C 7 알킬임), 헵타데칸-9-일 9-히드록시헵타데카노에이트( 7b , 여기서 R 4 는 C 8 알킬임), 헵타데칸-9-일 9-히드록시옥타데카노에이트( 7b , 여기서 R 4 는 C 9 알킬임), 헵타데칸-9-일 9-히드록시노나데카노에이트( 7b , 여기서 R 4 는 C 10 알킬임) 또는 헵타데칸-9-일 9-히드록시이코사노에이트( 7b , 여기서 R 4 는 C 11 알킬임)의 합성
헵타데칸-9-일 9-히드록시헥사데카노에이트( 7b , 여기서 R 4 는 C 7 알킬임)
무수 THF(10 mL) 중 헵타데칸-9-일 9-옥소헥사데카노에이트(6b, 여기서 R 4 는 C7 알킬임)(0.3 g, 0.6 mmol)의 용액에, 0℃에서 NaBH4(0.09 g, 2.4 mmol)을 첨가하고, N2 분위기 하에서 밤새 교반하였다. NH4Cl 포화 용액으로 반응을 켄칭하고, EtOAc로 추출하였다. 유기상을 염수로 세정하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 하에서 증발시키고, 용리액으로 헥산 중 0%→10% EtOAc를 사용하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 7b(여기서, R 4 는 C7 알킬임)(0.25 g, 82%)를 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, d-클로로포름) δ 4.92 - 4.78 (m, 1H), 3.57 (m, 1H), 2.27 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.66 - 1.36 (m, 12H), 1.31-1.25 (m, 40H), 0.87 (t, J = 6.1 Hz, 9H).
헵타데칸-9-일 9-히드록시헵타데카노에이트( 7b , 여기서 R 4 는 C 8 알킬임)
무수 THF(10 mL) 중 헵타데칸-9-일 9-옥소헵타데카노에이트(6b, 여기서 R 4 는 C8 알킬임)(0.4 g, 0.77 mmol)의 용액에, 0℃에서 NaBH4(0.04 g, 1.15 mmol)을 첨가하고, N2 분위기 하에서 밤새 교반하였다. NH4Cl 포화 용액으로 반응을 켄칭하고, EtOAc로 추출하였다. 유기상을 염수로 세정하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 하에서 증발시키고, 용리액으로 헥산 중 0%→10% EtOAc를 사용하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 7b(여기서, R 4 는 C8 알킬임)(0.21 g, 52%)를 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, d-클로로포름) δ 4.92 - 4.80 (m, 1H), 3.57 (m, 1H), 2.27 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.64 - 1.40 (m, 12H), 1.36 - 1.18 (m, 42H), 0.87 (t, J = 6.5 Hz, 9H).
헵타데칸-9-일 9-히드록시옥타데카노에이트( 7b , 여기서 R 4 는 C 9 알킬임)
DCM:MeOH(1:1) 혼합물(40 mL) 중 헵타데칸-9-일 9-옥소옥타데카노에이트(6b, 여기서 R 4 는 C9 알킬임)(1.1 g, 2.05 mmol)의 용액에, 0℃에서 NaBH4(0.3 g, 8 mmol)을 첨가하고, N2 분위기 하에서 2시간 동안 교반하였다. 1 M HCl(aq) 용액으로 반응을 켄칭하고, DCM으로 추출하였다. 유기상을 염수로 세정하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 하에서 증발시키고, 용리액으로 헥산 중 5%→40% EtOAc를 사용하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 7b(여기서, R 4 는 C9 알킬임)(0.9 g, 83%)를 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, d-클로로포름) δ 4.88 - 4.83 (m, 1H), 3.57 (m, 1H), 2.27 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.61 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.48 - 1.41 (m, 8H), 1.36 - 1.18 (m, 44H), 0.87 (t, J = 6.5 Hz, 9H).
헵타데칸-9-일 9-히드록시노나데카노에이트( 7b , 여기서 R 4 는 C 10 알킬임)
THF:DCM:MeOH(1:1:1) 혼합물(3 mL) 중 헵타데칸-9-일 9-옥소노나데카노에이트(6b, 여기서 R 4 는 C10 알킬임)(0.2 g, 0.36 mmol)의 용액에, 0℃에서 NaBH4(0.03 g, 0.8 mmol)을 첨가하고, N2 분위기 하에서 3시간 동안 교반하였다. H2O(0.5 mL)로 반응을 켄칭하고, DCM으로 추출하였다. 유기상을 염수로 세정하고, 무수 MgSO4 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 하에서 증발시키고, 용리액으로 헥산 중 5%→40% EtOAc를 사용하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 7b(여기서, R 4 는 C10 알킬임)(0.16 g, 80%)를 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, d-클로로포름) δ 4.86 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 3.58 (m, 1H), 2.27 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.61-1.37 (m, 12H), 1.32 - 1.18 (m, 46H), 0.87 (t, J = 6.6 Hz, 9H).
헵타데칸-9-일 9-히드록시이코사노에이트( 7b , 여기서 R 4 는 C 11 알킬임)
THF:DCM:MeOH(1:1:1) 혼합물(3 mL) 중 헵타데칸-9-일 9-옥소이코사노에이트(6b, 여기서 R 4 는 C11 알킬임)(0.27 g, 0.48 mmol)의 용액에, 0℃에서 NaBH4(0.05 g, 1.35 mmol)을 첨가하고, N2 분위기 하에서 3시간 동안 교반하였다. H2O(0.5 mL)로 반응을 켄칭하고, DCM으로 추출하였다. 유기상을 염수로 세정하고, 무수 MgSO4 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 하에서 증발시키고, 용리액으로 헥산 중 5%→40% EtOAc를 사용하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 7b(여기서, R 4 는 C11 알킬임)(0.25 g, 92%)를 수득하였다. 1H NMR (301 MHz, d-클로로포름) δ 4.86 (t, J = 6.2 Hz, 1H), 3.57 (s, 1H), 2.27 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.69 - 1.37 (m, 12H), 1.29-1.17 (m, 48H), 0.87 (t, J = 6.5 Hz, 9H).
단계 5: 헵타데칸-9-일 9-((4-(디메틸아미노)부타노일)옥시)헥사데카노에이트( 지질 81 ), 헵타데칸-9-일 9-((4-(디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데카노에이트( 지질 79 ), 헵타데칸-9-일 9-((4-(디메틸아미노)부타노일)옥시)옥타데세노에이트( 지질 77 ), 헵타데칸-9-일 9-((4-(디메틸아미노)부타노일)옥시)노나데카노에이트( 지질 78 ) 또는 헵타데칸-9-일 9-((4-(디메틸아미노)부타노일)옥시)이코사노에이트( 지질 80 )의 합성
헵타데칸-9-일 9-((4-(디메틸아미노)부타노일)옥시)헥사데카노에이트( 지질 81 )
DCM(5 mL) 중 헵타데칸-9-일 9-히드록시헥사데카노에이트(7b, 여기서 R 4 는 C7 알킬임)(0.25 g, 0.49 mmol)와 4-(디메틸아미노)부탄산(0.125 g, 0.75 mmol)의 용액에, DIPEA(0.27 mL)를 첨가하였다. 이어서, EDCI(0.143 g, 0.75 mmol)와 DMAP(0.012 g, 0.1 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 N2 분위기 하 실온에서 밤새 교반하였다. 다음날, 반응액을 DCM으로 희석하였다. 유기층을 NaHCO3(aq)로 세정하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 하에서 증발시키고, 용리액으로 DCM 중 0%→5% MeOH을 사용하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 지질 81(0.14 g, 45%)을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, d-클로로포름) δ 4.93- 4.77 (m, 2H), 2.37 - 2.23 (m, 5H), 2.21 (s, 6H), 1.83-1.73 (m, 2H), 1.70 - 1.40 (m, 10H), 1.25 (s, 43H), 0.87 (t, J = 6.6 Hz, 9H). [C39H77NO4]에 대한 MS 실측치 624.5 [M+H]+, 계산치 623.59.
헵타데칸-9-일 9-((4-(디메틸아미노)부타노일)옥시)헵타데카노에이트( 지질 79 )
DCM(3 mL) 중 화합물 헵타데칸-9-일 9-히드록시헵타데카노에이트(7b, 여기서 R 4 는 C8 알킬임)(0.21 g, 0.4 mmol)와 4-(디메틸아미노)부탄산(0.08 g, 0.45 mmol)의 용액에, DIPEA(0.16 mL)를 첨가하였다. 이어서, EDCI(0.09 g, 0.45 mmol)와 DMAP(0.008 g, 0. 06 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 N2 분위기 하 실온에서 밤새 교반하였다. 다음날, 반응액을 DCM으로 희석하였다. 유기층을 NaHCO3(aq)로 세정하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 하에서 증발시키고, 용리액으로 DCM 중 0%→5% MeOH을 사용하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 지질 79(0.112 g, 44%)를 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, d-클로로포름) δ 4.86 (m, 2H), 2.34-2.24 (m, 5H), 2.21 (s, 6H), 1.78 (p, J = 7.6 Hz, 2H), 1.68 - 1.56 (m, 2H), 1.54 - 1.40 (m, 8H), 1.25 (s, 45H), 0.87 (t, J = 6.7 Hz, 9H). [C40H79NO4]에 대한 MS 실측치 638.5 [M+H]+, 계산치 637.60.
헵타데칸-9-일 9-((4-(디메틸아미노)부타노일)옥시)옥타데세노에이트( 지질 77 )
DCM(25 mL) 중 헵타데칸-9-일 9-히드록시옥타데카노에이트(7b, 여기서 R 4 는 C9 알킬임)(0.3 g, 0.56 mmol)의 용액에, EDCI(0.21 g, 1.12 mmol)와 DMAP(0.07 g, 0.56 mmol)를 첨가하고, N2 분위기 하에서 15분 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물에 4-(디메틸아미노)부탄산(0.25 g, 1.5 mmol)을 첨가하고, 밤새 교반하였다. 다음날, 용매를 증발시키고, EtOAc(300 mL)에 재용해시켰다. 유기층을 H2O(300 mL), NaHCO3(aq)(200 mL) 및 염수(200 mL)로 세정하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 하에서 증발시키고, 용리액으로 헥산 중 5%→40% EtOAc를 사용하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 지질 77(0.124 g, 34%)을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, d-클로로포름) δ 4.86 (m, 2H), 2.38 - 2.23 (m, 6H), 2.21 (s, 6H), 1.85 - 1.71 (m, 2H), 1.67 - 1.55 (m, 2H), 1.50-1.44 (m, 8H), 1.24 (s, 46H), 0.86 (t, J = 6.5 Hz, 9H). [C41H81NO4]에 대한 MS 실측치 652.7 [M+H]+, 계산치 651.62.
헵타데칸-9-일 9-((4-(디메틸아미노)부타노일)옥시)노나데카노에이트( 지질 78 )
DCM(1 mL) 중 헵타데칸-9-일 9-히드록시노나데카노에이트(7b, 여기서 R 4 는 C10 알킬임)(0.16 g, 0.29 mmol)의 용액에, EDCI(0.052 g, 0.27 mmol)와 DMAP(0.04 g, 0. 0.33 mmol)를 첨가하고, N2 분위기 하에서 15분 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물에 4-(디메틸아미노)부탄산(0.056 g, 0.33 mmol)을 첨가하고, 밤새 교반하였다. 다음날, 반응액을 DCM으로 희석하였다. 유기층을 NaHCO3(aq)로 세정하고, 무수 MgSO4 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 하에서 증발시키고, 용리액으로 DCM 중 0%→5% MeOH을 사용하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 지질 78(0.07 g, 36%)을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, d-클로로포름) δ 4.93- 4.81 (m, 2H), 2.34-2.24 (m, 5H), 2.22 (s, 6H), 1.85 - 1.67 (m, 4H), 1.63-1.57 (m, 2H), 1.48 (s, 7H), 1.24 (s, 47H), 0.87 (t, J = 6.6 Hz, 9H). [C42H83NO4]에 대한 MS 실측치 665.63 [M+H]+, 계산치 666.5.
헵타데칸-9-일 9-((4-(디메틸아미노)부타노일)옥시)이코사노에이트( 지질 80 )
DCM(1 mL) 중 화합물 헵타데칸-9-일 9-히드록시이코사노에이트(7b, 여기서 R 4 는 C11 알킬임)(0.25 g, 0.44 mmol)의 용액에, EDCI(0.068 g, 0.36 mmol)와 DMAP(0.054 g, 0. 0.44 mmol)를 첨가하고, N2 분위기 하에서 15분 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물에 4-(디메틸아미노)부탄산(0.074 g, 0.44 mmol)을 첨가하고, 밤새 교반하였다. 다음날, 반응액을 DCM으로 희석하였다. 유기층을 NaHCO3(aq)로 세정하고, 무수 MgSO4 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 하에서 증발시키고, 용리액으로 DCM 중 0%→5% MeOH을 사용하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 지질 80(0.134 g, 45%)을 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, d-클로로포름) δ 4.87-4.81 (m, 2H), 2.34-2.24 (m, 5H), 2.23 (d, J = 7.2 Hz, 6H), 1.87 - 1.76 (m, 2H), 1.74-1.70 (m, 2H), 1.65-1.57 (m, 2H), 1.48 (s, 7H), 1.24 (s, 50H), 0.87 (t, J = 6.6 Hz, 9H). [C43H85NO4]에 대한 MS 실측치 680.6 [M+H]+, 계산치 679.65.
실시예 5: 화학식 XX의 이온화 가능한 지질의 합성
화학식 (XX)의 지질은 하기 반응식 9에 도시된 바와 유사한 합성 방법을 사용하여 설계하고 합성하였다. 반응식 9에 도시된 화합물 내 모든 다른 변수, 즉, R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 6a , R 6b , X 및 n은 화학식 (XX)에 정의된 바와 같다. R x 는 정의된 바와 같은 R 4 이지만, 지방족 사슬에 탄소 원자가 하나 더 적다.
반응식 9
Figure pct00115
본 개시내용의 모노에스테르 지질, 즉, 화학식 (XX)(여기서, X는 -C(=O))-임)는 하기 반응식 10에 도시된 바와 유사한 합성 방법을 사용하여 설계하고 합성하였다. 반응식 9에 도시된 화합물 내 모든 다른 변수, 즉, R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 6a , R 6b , X 및 n은 화학식 (XX)에 정의된 바와 같다. R x 는 정의된 바와 같은 R 4 이지만, 지방족 사슬에 탄소 원자가 하나 더 적다.
반응식 10
Figure pct00116
반응식 9 및 반응식 10
반응식 9 및 반응식 10을 참조하여, 단계 1에서, 디클로로메탄(DCM) 중 산 2의 교반된 용액에, 4-디메틸아미노피리딘(DMAP), 이어서 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDCI)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 질소(N2) 분위기 하 실온에서 15분 동안 교반하였다. 이어서, 화합물 1을 적가하고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 다음날, 반응액을 DCM으로 희석하고, 물과 염수로 세정하였다. 유기층을 무수 황산소듐(Na2SO4) 상에서 건조시키고, 건조될 때까지 증발시켰다. 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→10% 메탄올을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 풀링하고, 증발시켜 화합물 3(0.78 g, 54%)을 수득하였다.
단계 2에서, 테트라히드로푸란(THF) 중 3의 용액에, 수소화알루미늄리튬(LiAlH4)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 밤새 가열하였다. 다음날, 반응을 0°C까지 냉각시키고, 물을 적가하여 켄칭하였다. 이어서, 반응액을 셀리트를 통해 여과하여 미정제 생성물 4를 수득하였다. 생성물을 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
단계 3에서, 화합물 5 또는 화합물 5'(국제 특허 출원 공개공보 WO2017/49245에 기재된 절차에 따라 합성됨, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)를 디메틸포름아미드/메탄올 혼합물 DMF:MeOH(1:1)에 용해시키고, 4를 첨가하였다. 반응액을 실온에서 밤새 교반하였다. 생성물을 에틸 아세테이트(EtOAc)로 추출하고, 유기층을 탄산수소소듐 포화 수용액(NaHCO3(aq))과 염수로 세정하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 하에서 증발시키고, 용리액으로 DCM 중 0%→10% 메탄올을 사용하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화학식 (XX)의 이온화 가능한 지질(여기서, X는 -C(=O)O)-이고, 5'는 단계 3에서 반응물로 사용됨)을 수득하였다.
지질 102 의 합성
지질 102의 합성 절차는 하기에 제공되어 있는 반응식 11을 참조로 하기에 기재되어 있다.
반응식 11
Figure pct00117
단계 1: N-(2-(디메틸아미노)에틸)노난아미드( 3a )의 합성
DCM(60 mL) 중 노난산(2a)(1.0 g, 6.3 mmol)의 교반된 용액에, DMAP(0.91 g, 7.5 mmol), 이어서 EDCI(1.44 g, 7.5 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 N2 분위기 하 실온에서 15분 동안 교반하였다. 이어서, N1,N1-디메틸에탄-1,2-디아민(1a)(0.66 g, 7.5 mmol)을 적가하고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 다음날, 반응액을 DCM으로 희석하고, H2O과 염수로 세정하였다. 유기층을 무수 Na2SO4 상에서 건조시키고, 건조될 때까지 증발시켰다. 잔류물을 용리액으로 DCM 중 0%→10% 메탄올을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 목적하는 화합물이 함유된 분획을 풀링하고, 증발시켜 3a(0.78 g, 54%)를 수득하였다.
단계 2: N 1 ,N 1 -디메틸-N2-노닐에탄-1,2-디아민( 4a )의 합성
THF 중 3a(0.78 g, 3.4 mmol)의 용액에, LiAlH4을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 밤새 가열하였다. 다음날, 반응을 0°C까지 냉각시키고, 물을 적가하여 켄칭하였다. 이어서, 반응액을 셀리트를 통해 여과하여 미정제 생성물 4a(0.6 g, 82%)를 수득하였다. 생성물을 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다.
단계 3: 지질 102의 합성
화합물 5a(국제 특허 출원 공개공보 WO2017/49245에 기재된 절차에 따라 합성됨, 상기 문헌은 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)(0.6 g, 1.3 mmol)를 DMF:MeOH(1:1)(20 mL)에 용해시키고, 4a(0.35 g, 1.5 mmol)를 첨가하였다. 반응액을 실온에서 밤새 교반하였다. 생성물을 EtOAc(200 mL)로 추출하고, 유기층을 포화 NaHCO3(aq)과 염수로 세정하고, 무수 Na2SO4 상에서 건조시켰다. 용매를 진공 하에서 증발시키고, 용리액으로 DCM 중 0%→10% 메탄올을 사용하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 지질 102(0.062 g, 10%)를 수득하였다. 1H NMR (300 MHz, 클로로포름-d) δ 4.85 (quint, J = 6.2 Hz, 1H), 2.57 - 2.48 (m, 2H), 2.43- 2.32 (m, 6H), 2.31 - 2.25 (m, J = 7.5 Hz, 2H), 2.23 (s, 6H), 1.66 - 1.34 (m, 8H), 1.24 (s, 47H), 0.86 (t, J = 6.6 Hz, 9H).
실시예 6: 지질 나노입자 제형의 제조
지질 에탄올 스톡의 제조
본원에 기재된 예시적인 이온화 가능한 지질(예를 들어, 지질 A; 화학식 (I) 또는 화학식 (I')에 포함되는 지질 35, 지질 37 및 지질 39; 화학식 (II)에 포함되는 지질 57, 지질 58, 지질 61 및 지질 62)을 포함하는 ceDNA 지질 나노입자(LNP) 제형(0.25 mg ceDNA-루시퍼라아제)을 하기와 같이 제조하였다.
10개의 G2 투석 필터를 30% 에탄올에 1시간 내지 2시간 동안 침지시킨 후, 비우고, 세정하고, 제형이 준비될 때까지(> 3시간) 탈이온화된 H2O에 침지시켰다. 개별 지질 에탄올 스톡은 지난 주에 준비하여 -20℃에 보관하였다. 개별 지질 에탄올 스톡의 농도는 하기 표에 제시되어 있다. 각각의 스톡을 목적하는 최종 혼합물 농도의 5x로 제조하였다. 따라서, 베이스(base) 지질 혼합물을 제조하기 위해, 각각의 스톡을 동일한 부피로 함께 혼합하였다.
Figure pct00118
LNP-ceDNA-루시퍼라아제 제형의 제조
간략하고 일반적으로, 본원에 기재된 이온화 가능한 지질 중 임의의 것을 함유하는 LNP 지질 혼합물(2.5 mL)을 제조하기 위해, 5개의 상이한 지질 스톡을 각각 0.5 mL 첨가하고, 함께 혼합하였다. LNP 지질 혼합물 내 각각의 지질 구성요소의 몰 백분율은 표 8에 제시되어 있다.
연구 A의 목적은, 입자 크기 및 캡슐화 효율에 대한 지질 A LNP 제형을 제조하는 표준 수성 공정 및 에탄올 기반 공정의 영향을 비교하는 것이었다. 연구 A의 추가의 목적은, 베이스 LNP 제형에 더 많은 구성요소가 첨가되는 경우, 에탄올 기반 공정에 의한 개선이 관찰되는지 여부를 평가하는 것이었다. 이를 위해, 용액이 투명해질 때까지 용액을 수동으로 온건하게 휘저으면서 ceDNA-루시퍼라아제(1.05 mg/mL)(0.25 mL)를 적가하였다. 이에 따라 본원에 기재된 알코올 기반 공정을 사용하여 제조된 지질/ceDNA 베이스 제형(지질 A 포함)이 형성되었으며, 이는 강도 기반 평균 유체역학적 직경(Zave)이 64.2 nm인 표 9에 제시된 바와 같은 LNP 3이었다.
상기 스톡의 등량 혼합물(각각의 지질 0.5 mL)(2.5 mL)에, 먼저 EtOH 중 mPEG-C18 용액(10 mg/mL)(34 uL)을 첨가하고, 이어서 용액이 투명해질 때까지 용액을 수동으로 온건하게 휘저으면서 ceDNA-루시퍼라아제(1.05 mg/mL)(0.25 mL)를 적가하였다. 이에 따라 지질/ceDNA 제형(지질 A 포함) + 2% mPEG-C18이 형성되었으며, 이는 평균 직경이 55.2 nm인 표 9에 제시된 LNP 4였다.
상기 스톡의 등량 혼합물(각각의 지질 0.5 mL)(2.5 mL)에, 먼저 EtOH 중 mPEG-C18 용액(10 mg/mL)(69 uL)을 첨가하고, 이어서 용액이 투명해질 때까지 용액을 수동으로 온건하게 휘저으면서 ceDNA-루시퍼라아제(1.05 mg/mL)(0.25 mL)를 적가하였다. 이에 따라 지질/ceDNA 혼합물 제형(지질 A 포함) + 4% mPEG-C18이 형성되었으며, 이는 평균 직경이 62.2 nm인 표 9에 제시된 LNP 5였다.
b-sito(1.20 mg)를 작은 바이알에 칭량하고, 20 mL 바이알에 첨가하였다. 바이알에 클로로포름 중 DOPE의 용액(17 uL, 25 mg/mL 용액)을 첨가하고, 클로로포름을 N2 가스의 집중 스트림(피펫) 하에서 증발시켰다. 이어서, 바이알을 진공 데시케이터에서 2시간 내지 3시간 동안 보관하였다. 건조된 지질을 에탄올(1.0 mL)에 용해시킨 후, ssOP 지질 스톡(0.5 mL), DMG-PEG2000 스톡(0.5 mL) 및 GalNAc4 스톡(0.5 mL)을 첨가하였다. 이어서, 용액을 수동으로 온건하게 휘저으면서 상기 용액에 ceDNA-루시퍼라아제(1.05 mg/mL)(0.25 mL)를 적가하였다. 이에 따라 지질/ceDNA 제형(지질 A 포함) + DOPE/b-sito가 형성되었으며, 이는 평균 직경이 78.7 nm인 표 9에 제시된 LNP 6이었다.
20 mL 바이알에 모노-GalNAc의 클로로포름 용액(2.5 mg/mL)(46 uL)을 첨가하였다. 클로로포름을 N2 가스의 집중 스트림(피펫) 하에서 증발시켰다. 이어서, 바이알을 진공 데시케이터에서 2시간 내지 3시간 동안 보관하였다. 이어서, 에탄올(0.5 mL)에 재용해시켰다. 이어서, 상기 용액에 SSOP, DOPC, Chol 및 DMG-PEG2000 스톡 각각 0.5 mL를 첨가하였다. 이어서, 상기 용액에 ceDNA-루시퍼라아제(1.05 mg/mL)(0.25 mL)를 첨가하였다. 이에 따라 지질/ceDNA 제형(지질 A 포함) + 0.25% 모노-GalNAc가 형성되었으며, 이는 표 10의 LNP 7이었다.
Figure pct00119
표 9에서 볼 수 있는 바와 같이, 표준 수성 공정을 사용하여 제조된, 이온화 가능한 지질로서 지질 A와 다른 지질 구성요소를 함유하는 대조군 LNP 2 제형은 강도 기반 평균 유체역학적 직경(Zave)이 93.3 nm이고, 캡슐화 효율이 62.9%였다. 제형의 지질 조성과 ceDNA 조성이 LNP 2와 동일하지만, 에탄올 기반 공정을 사용하여 제형을 제조한 LNP 3에서, 입자의 평균 직경은 64.2 nm로 감소되었고, 캡슐화 효율은 88.0%로 증가하였다. 에탄올 기반 공정을 사용하여 제조된 다른 LNP 제형에 추가의 구성요소, 예컨대 LNP 4 및 LNP 5에서 mPEG-C18, LNP 6에서 DOPE/b-sito, 및 LNP 7에서 모노-GalNAc를 첨가했던 경우에도 더 작은 평균 직경 측정치가 관찰되었으며, 이에 따라, LNP 제형의 제조에서 알코올의 사용이 ceDNA의 콤팩트화에 영향을 미쳐 평균 직경이 더 작은 LNP가 생성되었다는 가설에 보강 증거를 제공한다. 나아가, 알코올 기반 공정을 사용하여 제조된 LNP 4, LNP 5 및 LNP 7에서 증가된 캡슐화 효율이 관찰되었다. 다분산도 지수(PDI)의 경우, 일반적으로 약 0.15 이하인 PDI 값이 만족스러운 것으로 간주된다.
본원에 기재된 모든 다른 이온화 가능한 지질을 함유하는 LNP-ceDNA-루시퍼라아제 제형(실시예 6 내지 실시예 9에 기재된 연구 B 내지 연구 E에 사용된 제형 포함)은, 이온화 가능한 지질로 지질 A를 함유하는 제형에 대해 상기 기재된 바와 유사한 절차를 사용하여 제조하였다. 모노 안테나 GalNAc(모노-GalNAc), 트리 안테나 GalNAc(GalNAc3) 또는 테트라 안테나 GalNAc(GalNAc4)와 같은 GalNAc 리간드를 당업계에 공지된 바와 같이(WO2017/084987 및 WO2013/166121 참고) 합성하여, 당업계에 널리 공지된 바와 같이(문헌[Resen et al., J. Biol. Chem. (2001) "Determination of the Upper Size Limit for Uptake and Processing of Ligands by the Asialoglycoprotein Receptor on Hepatocytes in Vitro and in Vivo" 276:375577-37584] 참고) 지질 또는 PEG에 화학적으로 접합시킬 수 있다.
실시예 7: 신규한 사전 콤팩트화 공정의 특징분석
나노조립
에탄올 중 지질의 스톡 용액을 표 8에 기재된 농도로 제조하였다. 이온화 가능한 지질 에탄올 스톡 중 이온화 가능한 지질은 지질 A였다.
베이스 지질 혼합물(총 15.75 mL)을 위해 각각의 지질 에탄올 스톡 3.15 mL를 조합하였다. 각각의 스톡은 최종 지질 혼합물 중 목적하는 지질 농도의 5x였다.
수동으로 온건하게 휘저으면서, 지질 혼합물(3 mL)에 ceDNA-루시퍼라아제(1.05 mg/mL)(0.3 mL, 1 mg/mL)를 첨가하였다. 최종 혼합물은 투명했다.
이어서, 이러한 혼합물을 하기 제시되는 바와 같은 다양한 유량비(FRR)로, NanoAssemblr에서 pH=4 말산 완충액(NaCl 미함유)과 혼합하였다:
FRR = 3:2, 총 부피 1 mL, 8 mL 저장소로, 말산 완충액
FRR = 3:1, 총 부피 1.6 mL, 7.4 mL 저장소로, 말산 완충액
FRR = 5:1, 총 부피 2.4 mL, 6.6 mL 저장소로, 말산 완충액
FRR = 10:1, 총 부피 4.4 mL, 4.6 mL 저장소로, 말산 완충액
구체적으로, 각각의 지질/ceDNA 혼합물을 NanoAssemblr을 사용하여 20 mM pH=4 말산(NaCl 미함유)과 혼합하였다. 말산 완충액 대 지질/ceDNA 유량비 3:1을 사용하였다. 지질/ceDNA 혼합물의 경우 3 mL 시린지를 사용하고, 말산 완충액의 경우 10 mL 시린지를 사용하였다. NanoAssemblr 배출구를 빈 15 mL 팔콘 튜브에 수집하고, 실행 직후, 말산(10 mL)이 함유된 50 mL 팔콘 튜브에 첨가하였다. 각각의 용액의 최종 에탄올 함량은 약 12.5%였고, 최종 부피는 약 20 mL였다. 본원에 기재된 수집 방법은 4% 에탄올로 희석되고, 배출구가 희석액에 바로 분배되어 대규모에 편리하지 않았던 이전의 방법과 차이가 있다. 나노조립 전, 베이스 지질 혼합물 40 ug을 이용한 시험을 이러한 변형된 수집 절차로 수행하였으며, 투석 전 DLS 측정에서 < 70 nm인 입자를 생성하는 것으로 확인되었다.
이어서, 각각의 샘플을 2개의 10 mL G2 투석 필터에 나누고, 1x DPBS(5 L)로 밤새 투석하였다. 다음날, 투석 매질을 2회 더 교체하였다.
각각의 용액의 최종 에탄올 함량은 약 4%였다. 밤새 투석을 수행한 후, 표준 공정/특징분석을 수행하였다. 분석 결과는 하기 표 11에 제시되어 있다. 이러한 표를 통해, 상이한 유량비(FRR)에서 DLS로 측정 시, 입자 직경이 모두 70 nm 미만이고, 캡슐화 효율이 85% 초과였다는 것을 알 수 있다.
Figure pct00120
지질 입자 제형의 분석
입자 크기는 동적 광산란(DLS)으로 측정하였다.
상기 기재된 방법을 사용하여 제조된 LNP는 길이가 5.4 kbp(킬로 염기쌍)이고 평균 직경이 66 nm인 ceDNA의 > 80%를 캡슐화한다. 신규한 방법(n = 4) 및 이전 방법(n = 28)을 사용하여 제조된 LNP 직경의 통계적 비교는, 표준 공정과 유사하거나 이보다 우수한 ceDNA 캡슐화 효율을 유지하면서 LNP 직경을 성공적으로 감소시킨다는 것을 의미하는 높은 신뢰도(P = 1.7 E -15)로 이어진다(도 2). 도 1a는, 동적 광산란으로 측정된 ceDNA의 응축을 보여주는 그래프이다. 동적 광산란 상관 함수는 에탄올 함량 증가에 따른 ceDNA의 응축을 보여준다. 도 1b는, 재수화 시 콤팩트화가 가역적임을 보여주는 그래프이다. LNP 직경 또는 ceDNA의 캡슐화 효율에 대한 유량비의 유의한 영향은 관찰되지 않았다. 이론에 구애됨 없이, 신규한 공정에서 볼 수 있는 개선은, LNP의 형성 전 90% 내지 92% 에탄올 용매에서의 ceDNA의 콤팩트화에 기인한 것일 수 있다. 이어서, 산성 수성 완충액과의 혼합에 의해 LNP가 형성되기 시작할 때, 지질은 '표준' 공정과 달리 훨씬 더 작은 ceDNA 코어 주변에 핵을 생성하여, 유의하게 더 작은 입자를 생성할 수 있다.
지질 입자 내 ceDNA의 캡슐화는 Oligreen®(Invitrogen Corporation; Carlsbad, Calif.) 또는 PicoGreen®(Thermo Scientific) 키트로 결정하였다. Oligreen® 또는 PicoGreen®는 용액에서 올리고뉴클레오타이드와 단일가닥 DNA 또는 RNA를 정량화하기 위한 초고감도 형광 핵산 염색제이다. 간략하게, 막불투과성 형광 염료 배제 검정을 수행하여 캡슐화를 결정하였다. 지질 입자 제형에 염료를 첨가하였다. 형광 강도를 측정하고, 소량의 비이온성 세제의 첨가 시 관찰된 형광과 비교하였다. 지질 이중층의 세제 매개 파괴는 캡슐화된 ceDNA를 방출하여, 막 불투과성 염료와의 상호작용을 가능하게 한다. ceDNA의 캡슐화는 다음과 같이 계산하였다: E= (I0 - I)/I0(여기서, I0는 세제를 첨가한 형광 강도를 나타내고, I0는 세제를 첨가하지 않은 형광 강도를 나타냄).
LNP로부터 ceDNA의 방출을 측정하였다. 클로로포름 중에 DOPS:DOPC:DOPE(몰비 1:1:2)를 혼합하고, 진공에서 용매를 증발시켜 엔도솜 모방 음이온성 리포솜을 제조하였다. 건조된 지질 필름을 짧은 초음파 처리를 이용하여 DPBS에 재현탁시킨 후, 0.45 μm 시린지 필터를 통해 여과하여 음이온성 리포솜을 형성하였다. LNP 용액에 1:1(vol/vol)로 혈청을 첨가하고, 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 혼합물을 DPBS 중에서 목적하는 음이온성/양이온성 지질 몰비로 음이온성 리포솜과 함께 pH 7.4 또는 6.0에서 37℃에서 추가 15분 동안 인큐베이션하였다. pH 7.4 또는 pH 6.0에서의 유리 ceDNA는 PicoGreen(Thermo Scientific)을 LNP 슬러리에 첨가할 때의 형광(Cfree)을 측정하고, 이러한 값을 1% Triton X-100에 의한 LNP의 용해 시 얻은 총 ceDNA 함량(Ctotal)과 비교하는 방식으로 캡슐화되지 않은 ceDNA 함량을 결정하여 계산하였다(여기서, 유리% = Cfree/Ctotal × 100). 음이온성 리포솜과의 인큐베이션 후 방출된 ceDNA%는 하기 방정식에 기반하여 계산하였다:
방출된 ceDNA% =유리 ceDNA%음이온성 리포솜과 혼합된 경우 - 유리 ceDNA%DPBS와 혼합된 경우
제형화된 양이온성 지질의 pKa는 핵산의 전달에 대한 LNP의 유효성과 상관관계가 있을 수 있다(문헌[Jayaraman et al., Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51(34), 8529-8533]; 문헌[Semple et al., Nature Biotechnology 28, 172-176 (2010)] 참조, 상기 문헌은 모두 그 전문이 본원에 참조로 인용됨). pKa의 바람직한 범위는 약 5 내지 약 7이다. 각각의 양이온성 지질의 pKa는 2-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌 설폰산(TNS)의 형광을 기반으로 하는 검정을 사용하여 지질 나노입자에서 결정하였다. DPBS 중에 총 지질 농도 0.4 mM로 양이온성 지질/DOPC/콜레스테롤/PEG-지질(51/7.5/38.5/3 (몰%))을 포함하는 지질 나노입자를 본원 및 다른 곳에 기재된 바와 같은 인라인(in-line) 공정을 사용하여 제조하였다. TNS는 증류수 중에 100 μM 스톡 용액으로 제조하였다. 소포를 10 mM HEPES, 10 mM MES, 10 mM 암모늄 아세테이트, 130 mM NaCl을 함유하는 완충액 2 mL 중에 24 μM 지질로 희석하였으며, 여기서 pH는 2.5 내지 11 범위였다. TNS 용액의 분취액을 첨가하여 최종 농도 1 μM을 제공하고, 볼텍싱 혼합한 후, 실온에서 SLM Aminco 시리즈 2 발광 분광광도계로 321 nm 및 445 nm의 여기 및 방출 파장을 사용하여 형광 광도를 측정하였다. 시그모이드 최적합(sigmoidal best fit) 분석을 형광 데이터에 적용할 수 있으며, pKa는 최대 형광 강도의 절반이 되는 pH로 측정한다.
지질 나노입자의 ApoE에의 결합은 하기와 같이 측정한다. LNP(ceDNA 10 μg/mL)를 DPBS 중에서 동일한 부피의 재조합 ApoE3(500 μg/mL)과 함께 37°C에서 20분 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, DPBS를 사용하여 LNP 샘플을 10배 희석하고, AKTA pure 150(GE Healthcare)에서 헤파린 세파로오스 크로마토그래피로 분석한다.
실시예 8: 연구 B - 지질 A LNP 제형에서 GalNAc 양의 변화
연구 B의 목적은, 입자 크기 및 캡슐화 효율에 대한 지질 A LNP 제형(에탄올 기반 공정을 사용하여 제조됨) 중 테트라 안테나 GalNAc(GalNAc4) 양의 변화에 대한 영향을 평가하는 것이었다. 표 12에는, 연구된 LNP 제형의 조성 및 몰비, 및 이의 평균 직경(Zave), 다분산도 지수(PDI) 및 캡슐화 효율(EE)이 제시되어 있다.
Figure pct00121
표 12의 결과는, 수성 공정(즉, LNP 8) 대신 에탄올 기반 공정을 사용하여 0.48% DSPE-PEG2000-GalNAc4를 갖는 LNP 9를 제조한 경우, 평균 직경은 95.8 nm에서 67.9 nm로 감소된 반면, 캡슐화 효율은 73.6%에서 87.1%로 증가했음을 나타낸다. 평균 직경 크기의 감소와 캡슐화 효율의 증가는 LNP 10, LNP 11 및 LNP 12(각각 DSPE-PEG2000-GalNAc4를 0.24%, 0.10% 및 0.05% 함유함)에서 일관되게 관찰되었다.
실시예 9: 연구 C - 에탄올 기반 공정을 사용하여 제조된 화학식 (I) 또는 화학식 (I') LNP 제형
연구 C의 목적은, 표준 수성 공정 또는 실시예 6에 기재된 바와 같은 에탄올 기반 공정(EtOH 92%)을 사용하여 제조된 대표적인 화학식 (I) 또는 화학식 (I') LNP 제형의 물리적 특성을 비교하기 위한 것이었다. 표 13에는, 연구된 LNP 제형의 조성 및 몰비, 및 이의 평균 직경(Zave), 다분산도 지수(PDI) 및 캡슐화 효율(EE)이 제시되어 있다.
Figure pct00122
표 13의 결과는, 에탄올 기반 공정을 사용하여 지질 35(즉, LNP 15), 지질 37(즉, LNP 17) 또는 지질 39(즉, LNP 19)를 갖는 LNP 제형을 제조한 경우, 수성 공정을 사용하여 제조된 상응하는 제형(즉, 각각 LNP 14, LNP 16 및 LNP 18)과 비교하여, 모든 제형에서 일관되게 감소된 직경 크기가 관찰되었음을 나타낸다. LNP 15, LNP 17 및 LNP 19의 평균 직경 크기가 모두 75 nm 미만이었다는 점에 주목한다. 추가로, 지질 35 및 지질 37의 경우, 에탄올 기반 공정을 사용하여 제조된 LNP 제형에서 캡슐화 효율이 유의하게 개선되었다.
실시예 10: 연구 D - 에탄올 기반 공정을 사용하여 제조된 화학식 (II) LNP 제형
연구 D의 목적은, 표준 수성 공정 또는 실시예 6에 기재된 바와 같은 에탄올 기반 공정(EtOH 92%)을 사용하여 제조된 대표적인 화학식 (II) LNP 제형의 물리적 특성을 비교하기 위한 것이었다. 표 14 및 표 15에는, 연구된 LNP 제형의 조성 및 몰비, 및 이의 평균 직경(Zave), 다분산도 지수(PDI) 및 캡슐화 효율(EE)이 제시되어 있다.
Figure pct00123
Figure pct00124
표 14 및 표 15의 결과는, 에탄올 기반 공정을 사용하여 지질 57(즉, LNP 22), 지질 58(즉, LNP 24), 지질 61(즉, LNP 27) 또는 지질 62(즉, LNP 29)를 갖는 LNP 제형을 제조한 경우, 수성 공정을 사용하여 제조된 상응하는 제형(즉, 각각 LNP 21, LNP 23, LNP 26 및 LNP 28)과 비교하여, 모든 제형에서 일관되게 감소된 직경 크기와 증가된 캡슐화 효율이 관찰되었음을 나타낸다. LNP 22 및 LNP 24의 평균 직경 크기가 모두 75 nm 미만이었다는 점에 주목한다.
실시예 11: 연구 E - LMW 알코올 기반 공정을 사용하여 제조된 화학식 (XV) LNP 제형
연구 E의 목적은, 표준 수성 공정 또는 실시예 6의 설명과 유사한 LMW 알코올 기반 공정(EtOH:MeOH; 1:1 비, 총 농도의 95%)을 사용하여 제조된 대표적인 화학식 (XV) LNP 제형의 물리적 특성을 비교하기 위한 것이었다. 간략하게, 표준 수성 공정에서, EtOH:MeOH 중 지질 용액을 NanoAssemblr에서 ceDNA를 함유하는 수성 완충액과 혼합하여 LNP를 형성하였다(하나의 채널은 지질을 도입하고, 다른 하나의 채널은 수성 완충액 중 ceDNA를 도입함). LMW 알코올 기반 공정에서, ceDNA와 지질을 실시예 6에 기재된 혼합물 형성과 유사하게 최종 농도가 95% LMW 알코올(EtOH:MeOH(1:1))인 용액 중에서 사전 혼합하고, ceDNA와 지질을 함유하는 생성된 95% LMW 알코올 혼합물을 하나의 채널을 통해 NanoAssemblr에 도입하고, 수성 완충액(20 mM, pH=4 말산(NaCl 미함유))을 또 다른 채널을 통해 NanoAssemblr에 도입하여 ceDNA를 캡슐화하는 LNP를 생성하였다. 표 16에는, 연구된 LNP 제형의 조성 및 몰비, 및 이의 평균 직경(Zave), 다분산도 지수(PDI) 및 캡슐화 효율(EE)이 제시되어 있다.
Figure pct00125
표 16의 결과는, LWM 알코올 기반 공정(EtOH:MeOH; 1:1(%))을 사용하여 지질 77을 갖는 LNP 제형(즉, LNP 32 및 LNP 34)을 제조한 경우, 수성 공정을 사용하여 제조된 상응하는 제형(즉, LNP 31 및 LNP 33)과 비교하여, LNP 32 및 LNP 34에서 감소된 직경 크기와 증가된 캡슐화 효율이 관찰되었음을 나타낸다. 일관되게, 에탄올 기반 공정을 사용하여 제조된 지질 77 및 2.3%의 DMG-PEG2000를 갖는 LNP 제형의 평균 직경 크기는 75 nm 미만이었다.
실시예 12: 제형의 기능성 평가를 위한 시험관내 포식작용 검정
시험관내 포식작용 검정은 양이온성 지질 구성요소로서 ss-OP4, 및 선택적으로 간 특이적 리간드인 GalNac와 함께 본원에 기재된 공정을 사용하여 제조된 MC3, MC3-5% DSG-PEG2000(1,2-디스테아로일-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌)("5DSG"로 약어화됨)을 포함하는 ceDNA 지질 나노입자(LNP) 제형을 사용하여 수행한다.
0.1% DiD(DiIC18(5); 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도디카르보시아닌, 4-클로로벤젠설포네이트 염) 친유성 카르보시아닌 염료로 처리된 ceDNA LNP에 대해 포식작용 검정을 수행한다. 다양한 농도의 ceDNA를 10% 인간 혈청(+ 혈청) 존재 또는 부재 하에서 LNP에 사용하고, 이를 THP-1 세포에서 분화된 대식세포에 도입한다.
ceDNA를 내재화시키는 포식세포는 적색 형광으로 나타나게 된다. ceDNA를 포함하는 ss-OP4 LNP가 가장 적은 수의 형광 포식세포와 밀접한 관련이 있을 것이라고 예상된다. 따라서, 이론에 구애됨 없이, ss-OP4 LNP가 MC3-5DSG 및 MC3 LNP와 비교하여 면역 세포에 의한 포식작용을 더 잘 회피할 것이라고 여겨진다. 적색 개체 수/합류(confluence)%로 포식작용을 정량화한다.
평균 직경이 60 nm 내지 75 nm인 ceDNA-LNP가 평균 직경이 75 nm 초과인 ceDNA-LNP와 비교하여 더 우수한 간세포 표적화를 나타낼 것이라고 예상된다.
실시예 13: LNP 제형의 전임상 생체내 연구
ceDNA-루시퍼라아제의 생체내 발현 및 마우스에서 LNP 제형의 내약성을 평가하기 위해 연구 A 내지 E 각각에서 전임상 연구를 또한 수행하였다. 이러한 전임상 연구와 관련된 연구 설계 및 절차는 하기 기재되는 바와 같다.
재료 및 방법
Figure pct00126
종(수, 성별, 연령): CD-1 마우스(N = 65마리와 예비용 5마리, 수컷, 도착 시 약 4주령).
케이지 관찰: 케이지 관찰은 매일 수행하였다.
임상 관찰: 임상 관찰은 0일차에 시험 물질을 투여하고 약 1시간, 약 5시간 내지 약 6시간, 및 약 24시간 후에 수행하였다. 예외에 따라 추가 관찰이 이루어졌다. 모든 동물의 체중을, 해당되는 경우, 0일차, 1일차, 2일차, 3일차, 4일차 및 7일차(안락사 전)에 기록하였다. 필요에 따라 추가 체중을 기록하였다.
용량 투여: 0일차에, 측면 꼬리 정맥으로의 정맥내 투여로 시험 물품(LNP: ceDNA-Luc)을 5 mL/kg으로 투여하였다.
생전 이미지화(In-life Imaging): 4일차에, 2.5 mL/kg의 복강내(IP) 주사를 통해 모든 동물에게 루시페린을 150 mg/kg(60 mg/mL)으로 투여하였다. 각 루시페린 투여 후 15분 이내에; 모든 동물은 하기 기재된 생체내 이미지화 프로토콜에 따라 IVIS 이미지화 세션을 거쳤다.
마취 회복: 동물을 마취 하에 있는 동안, 회복하는 동안 및 움직일 때까지 지속적으로 모니터링하였다.
중간 혈액 채취: 0일차에, 시험 후 5시간 내지 6시간(5.0시간 이상, 6.5시간 이하) 후 모든 동물에서 중간 혈액을 채취하였다.
채취 후, 동물에게 젖산 링거액 0.5 mL 내지 1.0 mL를 피하 투여하였다.
꼬리정맥 닉, 복재정맥 또는 안와정맥굴 천자를 통해 (흡입용 이소플루란 하에서) 혈청용 전혈을 채취하였다. 전혈을 혈전 활성화제가 포함된 혈청 분리기 튜브에 채취하고, 1개의 혈청 분취량으로 처리하였다.
생체내 이미지화 프로토콜
ㆍ 루시페린 스톡 분말을 공칭 -20℃에서 보관하였다.
ㆍ 2℃ 내지 8℃에서 1 mL 분취량으로 보관한 제형화된 루시페린을 빛으로부터 보호하였다.
ㆍ 제형화된 루시페린은 빛이 차단된 2℃ 내지 8℃에서 최대 3주 동안 안정하고, 실온에서(RT) 약 12시간 동안 안정하였다.
ㆍ 루시페린을 PBS 중에 60 mg/mL의 목표 농도로 충분한 부피로 용해시키고, 필요한 경우 5 M NaOH(약 0.5 μl/mg 루시페린) 및 HCl(약 0.5 μL/mg 루시페린)을 이용하여 pH=7.4로 조정하였다.
ㆍ 프로토콜에 따라 적어도 약 50% 과량을 포함하는 적절한 양으로 제조하였다.
주사 및 이미지화
ㆍ (필요한 경우) 동물의 털을 면도하였다.
ㆍ 프로토콜에 따라, PBS 중 루시페린 150 mg/kg을 IP를 통해 60 mg/mL로 주사하였다.
ㆍ 투여 즉시 또는 투여 후 최대 15분 이내에 이미지화를 수행하였다.
ㆍ 이소플루란 기화기를 1% 내지 3%(통상적으로 2.5%)로 설정하여 이미지화 세션 동안 동물을 마취시켰다.
ㆍ 이미지화 세션 동안 이소플루란 마취:
○ 동물을 이소플루란 챔버 내에 위치시키고, 이소플루란 효과가 나타날 때까지 약 2분 내지 3분 동안 기다린다.
○ IVIS 기계 측면의 마취 수준이 "켜짐(on)" 위치에 위치해 있는지를 확인한다.
○ 동물(들)을 IVIS 기계에 위치시킨다.
최고 감도에 대한 설정으로 목적하는 획득 프로토콜을 수행하였다.
결과
연구 A 내지 E에 사용되고, 실시예 4, 및 6 내지 9에 기재된 바와 같이 에탄올 기반(92% EtOH) 또는 LMW 알코올 기반 공정(95% EtOH:MeOH(1:1), Nanoassemblr에서 LNP 형성 전 프리믹스로서의 ceDNA 및 지질의 경우)을 사용하여 제조된 모든 LNP 제형은, 표준 수성 공정을 사용하여 제조된 상응하는 제형과 비교하여 만족스럽거나 동등한 루시퍼라아제 발현(투여 후 4일차에 측정된 IVIS)을 나타냈다. 내약성의 맥락에서, 연구 A 내지 E에 사용되고, 실시예 6, 및 8 내지 11에 기재된 바와 같이 에탄올 기반 공정을 사용하여 제조된 모든 LNP 제형은, 처리 후 1일차에 측정 시 마우스 체중의 유의한 변화 없이 탁월한 내약성을 나타냈다.
실시예 14: ceDNA와 플라스미드 DNA의 투과 전자 현미경검사법(TEM)
투과 전자 현미경검사법(TEM)을 사용하여 상이한 조건(예를 들어, 탈이온(DI)수, DI 중 91% 1:1 EtOH:MeOH; 100 mM NaOH; 100% 50:50 EtOH:MeOH)에서 보관한 ceDNA와 플라스미드 DNA(pDNA)의 형태를 탐구하였다. 이론에 구애됨 없이, 본 발명자들은, 알코올/물 용액 또는 순수한 알코올 용매로 처리된 ceDNA와 pDNA가, 핵산을 LNP에 의한 캡슐화 효율을 증강시키고 직경 크기가 더 작은(즉, 75 nm ± 3 nm 미만) LNP 제형을 생성하는 입체형태로 변성시킨다고 가정하였다. 간략하게, 각각의 샘플을 그리드(grid)에 적용하고, 완충액으로 세정한 후, 샘플을 메탄올 중 0.06% 우라닐 아세테이트로 염색하였다. 이어서, 그리드를 현미경 하에서의 관찰 전 시도할 수 있도록, 그리드 박스 안에 바로 위치시켰다.
도 3a 및 도 3b에 제시된 TEM 이미지는, 핵산 샘플이 탈이온수 중에 보관된 경우, ceDNA와 pDNA(플라스미드)가 모두 일부 가닥 유사 구조와 함께 대부분 응집되거나 자체적으로 얽힌 형상을 나타냈음을 보여준다. 탈이온수 중 90.9% 1:1 에탄올:메탄올의 저분자량 알코올/물 용액 중에 보관된 경우, ceDNA 샘플은 뚜렷한 막대형 구조(도 4a 참조)를 형성하였고, pDNA는 원형 구조(도 4b 참조)를 형성하였다. 100% 저분자량 알코올(즉, 1:1 에탄올:메탄올, 물 없음) 중에 보관된 ceDNA 샘플을 또한 TEM으로 가시화하였으며, ceDNA는 상기 기재된 알코올/물 용액 중에 보관된 샘플보다 약간 더 두꺼운 막대(도 5 참조)를 나타내는 것으로 확인되었다. 나아가, 100 nM NaOH 중에 보관된 ceDNA 및 pDNA 샘플을 또한 현미경 하에서 검사하였다. 도 6a 및 도 6b는, 두 가지 핵산 샘플이 모두 탈이온수에서의 보관과 비교하여 염기성 조건 하에서 거의 변화가 없었음을 나타낸다.
참고문헌
본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 특허 및 다른 간행물(문헌 참조, 등록된 특허, 공개된 특허 출원 및 동시 계류중인 특허 출원 포함)은, 예를 들어 본원에 기재된 기술과 관련하여 사용될 수 있는 이러한 간행물에 기재된 방법론을 설명 및 개시하기 위한 목적으로 명백하게 본원에 참조로 인용된다. 이러한 간행물은 본 출원의 출원일 이전의 개시내용에 대해서만 제공된다. 이와 관련하여, 선행 개시내용으로 인해 또는 임의의 다른 이유로, 본 발명자가 그러한 개시내용보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 이러한 문서의 내용에 대한 날짜 또는 표현에 대한 모든 진술은 출원인이 이용 가능한 정보를 기반으로 하며, 이러한 문헌의 날짜 또는 내용의 정확성에 대한 승인을 구성하는 것으로 여겨지지 않는다.
본 개시내용의 구현예의 설명은 개시된 정확한 형태로 본 개시내용을 제한하거나, 완전한 것으로서 의도되지 않는다. 본 개시내용의 특정 구현예 및 이에 대한 예는 예시의 목적으로 본원에 기재되었으며, 당업자가 이해하는 바와 같이 본 개시내용의 범위 내에서 다양한 등가의 변형이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 방법 단계 또는 기능이 주어진 순서로 제시되어 있지만, 대안적인 구현예는 상이한 순서로 기능을 수행할 수 있거나, 기능들이 실질적으로 동시에 수행될 수 있다. 본원에 제공된 개시내용의 교시는 적절하게 다른 절차 또는 방법에 적용될 수 있다. 본원에 기재된 다양한 구현예는 조합되어 추가 구현예를 제공할 수 있다. 본 개시내용의 양태는, 필요한 경우, 본 개시내용의 추가의 구현예를 제공하기 위해 상기 참고문헌 및 적용의 조성물, 기능 및 개념을 이용하도록 변형될 수 있다. 나아가, 생물학적 기능 동등성을 고려할 때, 생물학적 또는 화학적 작용의 종류 또는 양에 영향을 미치지 않는 한 단백질 구조에 약간의 변경이 이루어질 수 있다. 이러한 및 다른 변경은 상세한 설명을 고려하여 이루어질 수 있다. 모든 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
전술한 구현예 중 임의의 것의 특정 요소는 조합되거나, 다른 구현예의 요소로 치환될 수 있다. 나아가, 본 개시내용의 특정 구현예와 관련된 이점이 이러한 구현예의 맥락에서 기재되어 있지만, 다른 구현예 또한 이러한 이점을 나타낼 수 있으며, 모든 구현예가 본 개시내용의 범위 내에 속하기 위해 반드시 이러한 이점을 나타낼 필요가 있는 것은 아니다.
본원에 기재된 기술은 하기 예에 의해 추가로 예시되며, 이러한 예는 어떠한 방식으로든 추가적인 제한으로 해석되어서는 안 된다. 본 개시내용이 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 어떠한 방식으로든 제한되지 않고, 달라질 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 목적이며, 청구범위에 의해서만 한정되는 본 개시내용의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.

Claims (158)

  1. 지질 나노입자(LNP)를 포함하는 약학적 조성물로서, 여기서 LNP는 지질과 강성 치료용 핵산(rTNA: rigid therapeutic nucleic acid)을 포함하고, 여기서 LNP의 평균 직경은 약 20 nm 내지 약 75 nm인 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 강성 치료용 핵산이 폐쇄형 DNA(ceDNA)인, 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 강성 치료용 핵산이 이중가닥 핵산인, 약학적 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 지질이 이온화 가능한 지질, 비(非)양이온성 지질, 스테롤 또는 이의 유도체, PEG화된 지질, 또는 이들의 임의의 조합에서 선택되는, 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 이온화 가능한 지질이 양이온성 지질인, 약학적 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 양이온성 지질이 SS-절단 가능한 지질인, 약학적 조성물.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 양이온성 지질이 화학식 (I) 또는 이의 약?적으로 허용 가능한 염으로 표시되는, 약학적 조성물:
    Figure pct00127
    (I)
    [식 중,
    R1 및 R1'는, 각각 독립적으로, 선택적으로 치환된 선형 또는 분지형 C1-3 알킬렌이고;
    R2 및 R2'는, 각각 독립적으로, 선택적으로 치환된 선형 또는 분지형 C1-6 알킬렌이고;
    R3 및 R3'는, 각각 독립적으로, 선택적으로 치환된 선형 또는 분지형 C1-6 알킬이거나;
    또는 대안적으로, R2가 선택적으로 치환된 분지형 C1-6 알킬렌인 경우, R2와 R3은, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 8원 헤테로시클릴을 형성하거나;
    또는 대안적으로, R2'가 선택적으로 치환된 분지형 C1-6 알킬렌인 경우, R2'와 R3'는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 8원 헤테로시클릴을 형성하고;
    R4 및 R4'는, 각각 독립적으로, -CRa, -C(Ra)2CRa 또는 -[C(Ra)2]2CRa이고;
    Ra는, 각각의 경우 독립적으로, H 또는 C1-3 알킬이거나;
    또는 대안적으로, R4가 -C(Ra)2CRa 또는 -[C(Ra)2]2CRa이고 Ra가 C1-3 알킬인 경우, R3과 R4는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 8원 헤테로시클릴을 형성하거나;
    또는 대안적으로, R4'가 -C(Ra)2CRa 또는 -[C(Ra)2]2CRa이고 Ra가 C1-3 알킬인 경우, R3'와 R4'는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 8원 헤테로시클릴을 형성하고;
    R5 및 R5'는, 각각 독립적으로, C1-20 알킬렌 또는 C2-20 알케닐렌이고;
    R6 및 R6'는, 각각의 경우 독립적으로, C1-20 알킬렌, C3-20 시클로알킬렌 또는 C2-20 알케닐렌이고;
    m 및 n은, 각각 독립적으로, 1, 2, 3, 4 및 5에서 선택되는 정수임].
  8. 제5항 또는 제6항에 있어서, 양이온성 지질이 화학식 (II) 또는 이의 약?적으로 허용 가능한 염으로 표시되는, 약학적 조성물:
    Figure pct00128
    (II)
    [식 중,
    a는 1 내지 20 범위의 정수이고;
    b는 2 내지 10 범위의 정수이고;
    R1은 존재하지 않거나, (C2-C20)알케닐, -C(O)O(C2-C20)알킬, 및 (C2-C20)알킬로 치환된 시클로프로필에서 선택되고;
    R2는 (C2-C20)알킬임].
  9. 제5항 또는 제6항에 있어서, 지질이 화학식 (V) 또는 이의 약?적으로 허용 가능한 염으로 표시되는, 약학적 조성물:
    Figure pct00129
    (V)
    [식 중,
    R1 및 R1'는, 각각 독립적으로, Ra에서 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬렌이고;
    R2 및 R2'는, 각각 독립적으로, (C1-C2)알킬렌이고;
    R3 및 R3'는, 각각 독립적으로, Rb에서 선택되는 하나 이상의 기로 선택적으로 치환된 (C1-C6)알킬이거나;
    또는 대안적으로, R2와 R3 및/또는 R2'와 R3'는, 이들 사이에 개재된 N 원자와 함께 취해져, 4원 내지 7원 헤테로시클릴을 형성하고;
    R4 및 R4'는 각각 -C(O)O-가 개재된 (C2-C6)알킬렌이고;
    R5 및 R5'는, 각각 독립적으로, -C(O)O- 또는 (C3-C6)시클로알킬이 각각 선택적으로 개재된 (C2-C30)알킬 또는 (C2-C30)알케닐이고;
    Ra 및 Rb는 각각 할로 또는 시아노임].
  10. 제5항에 있어서, 양이온성 지질이 화학식 (XV) 또는 이의 약?적으로 허용 가능한 염으로 표시되는, 약학적 조성물:
    Figure pct00130

    (XV)
    [식 중,
    R'는 존재하지 않거나, 수소 또는 C1-C6 알킬이며; 단, R'가 수소 또는 C1-C6 알킬인 경우, R', R1 및 R2가 모두 부착된 질소 원자는 양성자화되고;
    R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 수소, C1-C6 알킬 또는 C2-C6 알케닐이고;
    R3은 C1-C12 알킬렌 또는 C2-C12 알케닐렌이고;
    R4는 C1-C16 비분지형 알킬, C2-C16 비분지형 알케닐 또는
    Figure pct00131
    이며; 여기서
    R4a 및 R4b는, 각각 독립적으로, C1-C16 비분지형 알킬 또는 C2-C16 비분지형 알케닐이고;
    R5는 존재하지 않거나, C1-C8 알킬렌 또는 C2-C8 알케닐렌이고;
    R6a 및 R6b는, 각각 독립적으로, C7-C16 알킬 또는 C7-C16 알케닐이며; 단, 결합된 R6a와 R6b의 총 탄소 원자 수는 15 초과이고;
    X1 및 X2는, 각각 독립적으로, -OC(=O)-, -SC(=O)-, -OC(=S)-, -C(=O)O-, -C(=O)S-, -S-S-, -C(Ra)=N-, -N=C(Ra)-, -C(Ra)=NO-, -O-N=C(Ra)-, -C(=O)NRa-, -NRaC(=O)-, -NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)O-, -OSi(Ra)2O-, -C(=O)(CRa 2)C(=O)O- 또는 OC(=O)(CRa 2)C(=O)-이며; 여기서
    Ra는, 각각의 경우 독립적으로, 수소 또는 C1-C6 알킬이고;
    n은 1, 2, 3, 4, 5 및 6에서 선택되는 정수임].
  11. 제5항에 있어서, 양이온성 지질이 화학식 (XX) 또는 이의 약?적으로 허용 가능한 염으로 표시되는, 약학적 조성물:
    Figure pct00132

    (XX)
    [식 중,
    R'는 존재하지 않거나, 수소 또는 C1-C3 알킬이며; 단, R'가 수소 또는 C1-C3 알킬인 경우, R', R1 및 R2가 모두 부착된 질소 원자는 양성자화되고;
    R1 및 R2는, 각각 독립적으로, 수소 또는 C1-C3 알킬이고;
    R3은 C3-C10 알킬렌 또는 C3-C10 알케닐렌이고;
    R4는 C1-C16 비분지형 알킬, C2-C16 비분지형 알케닐 또는
    Figure pct00133
    이며; 여기서
    R4a 및 R4b는, 각각 독립적으로, C1-C16 비분지형 알킬 또는 C2-C16 비분지형 알케닐이고;
    R5는 존재하지 않거나, C1-C6 알킬렌 또는 C2-C6 알케닐렌이고;
    R6a 및 R6b는, 각각 독립적으로, C7-C14 알킬 또는 C7-C14 알케닐이고;
    X는 -OC(=O)-, -SC(=O)-, -OC(=S)-, -C(=O)O-, -C(=O)S-, -S-S-, -C(Ra)=N-, -N=C(Ra)-, -C(Ra)=NO-, -O-N=C(Ra)-, -C(=O)NRa-, -NRaC(=O)-, -NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)O-, -OSi(Ra)2O-, -C(=O)(CRa 2)C(=O)O- 또는 OC(=O)(CRa 2)C(=O)-이며; 여기서
    Ra는, 각각의 경우 독립적으로, 수소 또는 C1-C6 알킬이고;
    n은 1, 2, 3, 4, 5 및 6에서 선택되는 정수임].
  12. 제5항 또는 제6항에 있어서, 양이온성 지질이 표 2, 표 5, 표 6, 표 7 또는 표 8의 임의의 지질에서 선택되는, 약학적 조성물.
  13. 제5항 또는 제6항에 있어서, 양이온성 지질이 하기 구조 또는 이의 약?적으로 허용 가능한 염을 갖는 지질인, 약학적 조성물:
    Figure pct00134
    .
  14. 제5항 또는 제6항에 있어서, 양이온성 지질이 하기 구조를 갖는 MC3, 즉 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-MC3-DMA 또는 MC3)인, 약학적 조성물:
    Figure pct00135
    .
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, LNP가 스테롤을 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 스테롤이 콜레스테롤인, 약학적 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 스테롤이 b-시토스테롤인, 약학적 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, LNP가 PEG화된 지질을 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, PEG화된 지질이 1-(모노메톡시폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)](PEG-DSPE), 또는 둘 모두에서 선택되는, 약학적 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, LNP가 비양이온성 지질을 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 비양이온성 지질이 디스테아로일-sn-글리세로포스포에탄올아민, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 모노메틸포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-모노메틸 PE), 디메틸포스파티딜에탄올아민(예컨대, 16-O-디메틸 PE), 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일포스파티딜에탄올아민(SOPE), 수소첨가된 대두 포스파티딜콜린(HSPC), 달걀 포스파티딜콜린(EPC), 디올레오일포스파티딜세린(DOPS), 스핑고미엘린(SM), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디미리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디에루코일포스파티딜콜린(DEPC), 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 디엘라이도일포스파티딜에탄올아민(DEPE), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DLPE); 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPHyPE); 레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소레시틴, 리소포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 달걀 스핑고미엘린(ESM), 세팔린, 카디오리핀(cardiolipin), 포스파티드산, 세레브로시드, 디세틸포스페이트, 리소포스파티딜콜린, 디리놀레오일포스파티딜콜린, 또는 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는, 약학적 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 비양이온성 지질이 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로 이루어지는 군에서 선택되는, 약학적 조성물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, LNP가 조직 특이적 표적화 리간드를 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 조직 특이적 표적화 리간드가 모노 안테나(mono-antennary) GalNAc, 트리 안테나 GalNAc 및 테트라 안테나 GalNAc에서 선택되는, 약학적 조성물.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 조직 특이적 표적화 리간드가 PEG화된 지질에 접합된 것인, 약학적 조성물.
  26. 제25항에 있어서, PEG화된 지질이 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노(폴리에틸렌글리콜)](PEG-DSPE)인, 약학적 조성물.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 조직 특이적 표적화 리간드에 접합된 PEG화된 지질이 약 0.5%의 몰 백분율로 존재하는, 약학적 조성물.
  28. 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, PEG화된 지질이 약 1.5% 내지 약 3%의 몰 백분율로 존재하는, 약학적 조성물.
  29. 제15항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 스테롤이 약 20% 내지 약 40%의 몰 백분율로 존재하고, 양이온성 지질이 약 80% 내지 약 60%의 몰 백분율로 존재하는, 약학적 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 스테롤이 약 40%의 몰 백분율로 존재하고, 양이온성 지질이 약 50%의 몰 백분율로 존재하는, 약학적 조성물.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 콜레스테롤, PEG화된 지질 및 비양이온성 지질을 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  32. 제25항에 있어서, PEG화된 지질이 약 1.5% 내지 약 3%의 몰 백분율로 존재하는, 약학적 조성물.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 콜레스테롤이 약 30% 내지 약 50%의 몰 백분율로 존재하는, 약학적 조성물.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 지질이 약 42.5% 내지 약 62.5%의 몰 백분율로 존재하는, 약학적 조성물.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 비양이온성 지질이 약 2.5% 내지 약 12.5%의 몰 백분율로 존재하는, 약학적 조성물.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 콜레스테롤이 약 40%의 몰 백분율로 존재하고, 지질이 약 52.5%의 몰 백분율로 존재하고, 비양이온성 지질이 약 7.5%의 몰 백분율로 존재하고, PEG가 약 3%로 존재하는, 약학적 조성물.
  37. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, LNP가 조직 특이적 표적화 리간드를 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 조직 특이적 표적화 리간드가 모노 안테나 GalNAc, 트리 안테나 GalNAc 및 테트라 안테나 GalNAc에서 선택되는, 약학적 조성물.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 조직 특이적 표적화 리간드가 PEG화된 지질에 접합된 것인, 약학적 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 조직 특이적 표적화 리간드에 접합된 PEG화된 지질이 약 0.5%의 몰 백분율로 존재하는, 약학적 조성물.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 덱사메타손 팔미테이트를 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, LNP의 평균 직경이 약 75 nm 미만인, 약학적 조성물.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, LNP의 평균 직경이 약 70 nm 미만인, 약학적 조성물.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 총 지질 대 강성 치료용 핵산(rTNA)의 비가 약 15:1인, 약학적 조성물.
  45. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 총 지질 대 강성 치료용 핵산(rTNA)의 비가 약 30:1인, 약학적 조성물.
  46. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 총 지질 대 강성 치료용 핵산(rTNA)의 비가 약 40:1인, 약학적 조성물.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 총 지질 대 강성 치료용 핵산(rTNA)의 비가 약 50:1인, 약학적 조성물.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, rTNA가 미니유전자(minigene), 플라스미드, 미니서클(minicircle), 소형 간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO), 리보자임, ceDNA, 미니스트링(ministring), doggybone™, 프로텔로미어 폐쇄형 DNA 또는 덤벨 선형 DNA, 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), mRNA, tRNA, rRNA, DNA 바이러스성 벡터, 바이러스성 RNA 벡터, 비(非)바이러스성 벡터, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는, 약학적 조성물.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 강성 치료용 핵산(rTNA)이 프로모터 서열과 전이유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 약학적 조성물.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 강성 치료용 핵산(rTNA)이 폴리아데닐화 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 약학적 조성물.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 강성 치료용 핵산(rTNA)이 상기 발현 카세트의 5' 말단 또는 3' 말단을 플랭킹하는 적어도 하나의 역말단반복서열(ITR: inverted terminal repeat)을 포함하는, 약학적 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 상기 발현 카세트가 2개의 ITR에 의해 플랭킹되어 있으며, 여기서 2개의 ITR은 하나의 5' ITR과 하나의 3' ITR을 포함하는, 약학적 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 발현 카세트가 3' 말단에 있는 ITR(3' ITR)에 연결되어 있는, 약학적 조성물.
  54. 제52항에 있어서, 발현 카세트가 5' 말단에 있는 ITR(5' ITR)에 연결되어 있는, 약학적 조성물.
  55. 제52항에 있어서, 5' ITR 또는 3' ITR 중 적어도 하나가 야생형 AAV ITR인, 약학적 조성물.
  56. 제52항에 있어서, 5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나가 변형된 ITR인, 약학적 조성물.
  57. 제52항에 있어서, 강성 치료용 핵산(rTNA)이 5' ITR과 발현 카세트 사이에 스페이서 서열을 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  58. 제52항에 있어서, 강성 치료용 핵산(rTNA)이 3' ITR과 발현 카세트 사이에 스페이서 서열을 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 스페이서 서열이 적어도 5개 염기쌍 길이인, 약학적 조성물.
  60. 제59항에 있어서, 스페이서 서열이 약 5개 내지 약 100개 염기쌍 길이인, 약학적 조성물.
  61. 제59항에 있어서, 스페이서 서열이 약 5개 내지 약 500개 염기쌍 길이인, 약학적 조성물.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 강성 치료용 핵산(rTNA)이 닉(nick) 또는 갭(gap)을 포함하는, 약학적 조성물.
  63. 제52항에 있어서, ITR이 AAV 혈청형에서 유도된 ITR, 거위바이러스의 ITR에서 유도된 ITR, B19 바이러스 ITR에서 유도된 ITR, 또는 파르보바이러스(parvovirus) 유래의 야생형 ITR에서 선택되는 ITR인, 약학적 조성물.
  64. 제63항에 있어서, 상기 AAV 혈청형이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 및 AAV12로 이루어지는 군에서 선택되는, 약학적 조성물.
  65. 제51항에 있어서, rTNA가 제1 ITR과 제2 ITR를 포함하며, 여기서 제1 ITR은 돌연변이 ITR이고, 제2 ITR은 제1 ITR과 상이한 것인, 약학적 조성물.
  66. 제51항에 있어서, rTNA가 발현 카세트의 5' 말단과 3' 말단 모두에 2개의 돌연변이 ITR을 포함하며, 선택적으로 여기서 2개의 돌연변이 ITR은 서로에 대해 대칭 돌연변이인, 약학적 조성물.
  67. 제1항에 있어서, rTNA가 ceDNA인, 약학적 조성물.
  68. 제67항에 있어서, ceDNA가 CELiD, DNA 기반 미니서클, MIDGE, 미니스트링 DNA, 발현 카세트의 5' 말단과 3' 말단에 있는 ITR의 2개의 헤어핀 구조를 포함하는 덤벨형 선형 이중체 폐쇄형 DNA(ceDNA), 또는 doggybone™ DNA로 이루어지는 군에서 선택되는, 약학적 조성물.
  69. 제1항에 있어서, 강성 치료용 핵산이 플라스미드인, 약학적 조성물.
  70. 지질 나노입자(LNP)를 포함하는 약학적 조성물로서, 여기서 LNP는 지질과 변성된 치료용 핵산(TNA)을 포함하고, 여기서 LNP의 평균 직경은 약 20 nm 내지 약 75 nm인 약학적 조성물.
  71. 제70항에 있어서, 변성된 TNA가 P형 구조인, 약학적 조성물.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서, 변성된 TNA가 저분자량 알코올/수용액, 또는 하나 이상의 저분자량 알코올을 포함하는 비수성 용매 시스템 중에서 변성된 TNA를 접촉시키는 방식으로 제조된 것인, 약학적 조성물.
  73. 제72항에 있어서, 저분자량 알코올/수용액 또는 비수성 용매 시스템이 에탄올, 메탄올 및 이소프로판올로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 알코올을 포함하는, 약학적 조성물.
  74. 제70항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, LNP의 평균 직경이 약 75 nm 미만인, 약학적 조성물.
  75. 제70항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, LNP의 평균 직경이 약 70 nm 미만인, 약학적 조성물.
  76. 제70항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 변성된 핵산 치료제가 이중가닥 핵산인, 약학적 조성물.
  77. 제70항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 변성된 핵산 치료제가 폐쇄형 DNA(ceDNA)인, 약학적 조성물.
  78. 지질 나노입자(LNP)를 포함하는 약학적 조성물로서, 여기서 LNP는 지질과 변성된 치료용 핵산(TNA)을 포함하고, LNP는 하기를 포함하는 방법에 의해 제조된 것인 약학적 조성물:
    수성 TNA를 양이온성 또는 이온화 가능한 지질을 포함하는 하나 이상의 저분자량 알코올 용액에 첨가하여 TNA/지질 용액을 형성하는 단계(여기서, 용액 중 저분자량 알코올의 최종 농도는 약 80% 내지 약 98%임);
    TNA/지질 용액을 산성 수성 완충액과 혼합하는 단계; 및
    중성 pH 수성 완충액으로 완충액 교환하여
    LNP 제형을 생성하는 단계.
  79. 제78항에 있어서, 용액 중 저분자량 알코올의 최종 농도가 약 87% 내지 약 97%인, 약학적 조성물.
  80. 제79항에 있어서, 용액 중 저분자량 알코올의 최종 농도가 약 90% 내지 약 95%인, 약학적 조성물.
  81. 제79항에 있어서, 용액 중 저분자량 알코올의 최종 농도가 약 92% 내지 약 95%인, 약학적 조성물.
  82. 제79항에 있어서, LNP의 평균 직경이 약 20 nm 내지 약 75 nm인, 약학적 조성물.
  83. 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, LNP의 평균 직경이 약 75 nm 미만인, 약학적 조성물.
  84. 제78항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, LNP의 평균 직경이 약 70 nm 미만인, 약학적 조성물.
  85. 제78항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 강성 또는 변성된 핵산 치료제가 이중가닥 핵산인, 약학적 조성물.
  86. 제78항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 강성 또는 변성된 핵산 치료제가 폐쇄형 DNA(ceDNA)인, 약학적 조성물.
  87. 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함하는, 약학적 조성물.
  88. 하기 단계를 포함하는, 이온화 가능한 지질과 폐쇄형 DNA(ceDNA)를 포함하는 지질 나노입자(LNP) 제형을 제조하는 방법:
    수성 ceDNA를 양이온성 또는 이온화 가능한 지질을 포함하는 하나 이상의 저분자량 알코올 용액에 첨가하여 ceDNA/지질 용액을 형성하는 단계(여기서, 용액 중 알코올의 최종 농도는 약 80% 내지 약 98%임);
    ceDNA/지질 용액을 산성 수성 완충액과 혼합하는 단계; 및
    중성 pH 수성 완충액으로 완충액 교환하여
    LNP 제형을 생성하는 단계.
  89. 하기 단계를 포함하는, 이온화 가능한 지질과 폐쇄형 DNA(ceDNA)를 포함하는 지질 나노입자(LNP) 제형을 제조하는 방법:
    ceDNA를 하나 이상의 저분자량 알코올 용액에 첨가하는 단계(여기서, 생성되는 용액의 알코올 함량은 80% 초과임);
    알코올 함량이 >80%인 상기 ceDNA를 저분자량 알코올 중 양이온성 또는 이온화 가능한 지질에 첨가하여 ceDNA/지질 용액을 형성하는 단계(여기서, ceDNA-지질 용액 중 저분자량 알코올의 최종 농도는 약 80% 내지 약 95%임);
    ceDNA/지질 용액을 산성 수성 완충액과 혼합하는 단계; 및
    중성 pH 수성 완충액으로 완충액 교환하여
    LNP 제형을 생성하는 단계.
  90. 제89항에 있어서, 용액 중 저분자량 알코올의 최종 농도가 약 87% 내지 약 97%인, 약학적 조성물.
  91. 제90항에 있어서, 용액 중 저분자량 알코올의 최종 농도가 약 90% 내지 약 95%인, 약학적 조성물.
  92. 제90항에 있어서, 용액 중 저분자량 알코올의 최종 농도가 약 92% 내지 약 95%인, 약학적 조성물.
  93. 제89항에 있어서, 혼합된 ceDNA/지질 용액을 산성 수성 완충액으로 희석하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  94. 제89항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 저분자량 알코올이 메탄올, 에탄올, 프로판올 및/또는 이소프로판올로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
  95. 제94항에 있어서, 하나 이상의 저분자량 알코올이 에탄올인, 방법.
  96. 제94항에 있어서, 하나 이상의 저분자량 알코올이 프로판올인, 방법.
  97. 제94항에 있어서, 하나 이상의 저분자량 알코올이 메탄올인, 방법.
  98. 제94항에 있어서, 하나 이상의 저분자량 알코올이 에탄올과 메탄올의 혼합물인, 방법.
  99. 제88항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 산성 수성 완충액이 말산/말산소듐 또는 아세트산/아세트산소듐에서 선택되는, 방법.
  100. 제88항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 산성 수성 완충액의 농도가 약 10 mM(밀리몰농도) 내지 40 mM인, 방법.
  101. 제88항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 산성 수성 완충액의 pH가 약 3 내지 5인, 방법.
  102. 제88항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 중성 pH 수성 완충액이 Dulbecco 인산염 완충 식염수(pH 7.4)인, 방법.
  103. 제88항에 있어서, 미세유체 혼합을 사용하여 ceDNA/지질 용액을 산성 수성 완충액과 혼합하는, 방법.
  104. 제88항에 있어서, 희석 단계 후 최종 알코올 함량이 약 4% 내지 약 15%인, 방법.
  105. 제88항에 있어서, 산성 수성 완충액과 ceDNA/지질 용액 사이의 유량비가 2:1, 3:2, 3:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1 또는 20:1인, 방법.
  106. 제88항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, LNP의 평균 직경이 약 20 nm 내지 약 75 nm인, 방법.
  107. 제88항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 지질이 하기 구조를 갖는 MC3, 즉 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일-4-(디메틸아미노)부타노에이트(DLin-MC3-DMA 또는 MC3)인, 방법:
    Figure pct00136
    .
  108. 제88항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 이온화 가능한 지질이 디설파이드 결합과 3차 아민을 포함하는 SS-절단 가능한 지질인, 방법.
  109. 제108항에 있어서, SS-절단 가능한 지질이 하기 구조 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 갖는 지질인, 방법:
    Figure pct00137
    .
  110. 제88항 내지 제109항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 LNP 제형.
  111. 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상에서 유전적 장애를 치료하는 방법.
  112. 제111항에 있어서, 대상이 인간인, 방법.
  113. 제111항 또는 제112항에 있어서, 유전적 장애가 겸상적혈구빈혈, 흑색종, A형 혈우병(응고인자 VIII(FVIII) 결핍증) 및 B형 혈우병(응고인자 IX(FIX) 결핍증), 낭성섬유증(CFTR), 가족성 고콜레스테롤혈증(LDL 수용체 결함), 간모세포종, 윌슨병(Wilson disease), 페닐케톤뇨증(PKU), 선천성 간 포르피린증, 유전성 간 대사장애, 레쉬-니한증후군(Lesch Nyhan syndrome), 겸상적혈구빈혈, 지중해빈혈, 색소성 건피증, 판코니빈혈(Fanconi's anemia), 색소성망막염, 모세혈관확장성 운동실조증, 블룸증후군(Bloom's syndrome), 망막모세포종, 점액다당류축적질환(예를 들어, 헐러증후군(Hurler syndrome)(MPS I형), 샤이에증후군(Scheie syndrome)(MPS I형 S), 헐러-샤이에증후군(MPS I형 H-S), 헌터증후군(Hunter syndrome)(MPS II형), 산필리포(Sanfilippo)증후군 A형, B형, C형 및 D형(MPS III형 A, B, C 및 D), 모르키오(Morquio)증후군 A형 및 B형(MPS IVA 및 MPS IVB), 마로토-라미증후군(Maroteaux-Lamy syndrome)(MPS VI형), 슬라이증후군(Sly syndrome)(MPS VII형), 히알루로니다아제 결핍증(MPS IX형)), 니만-피크병(Niemann-Pick Disease) A/B형, C1형 및 C2형, 쉰들러병(Schindler disease), GM2-강글리오시드증 II형(샌드호프병(Sandhoff Disease)), 테이-삭스병(Tay-Sachs disease), 이염성 백질디스트로피(Metachromatic Leukodystrophy), 크라베병(Krabbe disease), 점액지질증 I형, II/III형 및 IV형, 시알산증 I형 및 II형, 글리코겐축적질환 I형 및 II형(폼페병(Pompe disease)), 고셰병(Gaucher disease) I형, II형 및 III형, 파브리병(Fabry disease), 시스틴증, 바텐병(Batten disease), 아스파르틸글루코사민뇨증(Aspartylglucosaminuria), 살라병(Salla disease), 다논병(Danon disease)(LAMP-2 결핍증), 리소좀 산 리파아제(LAL) 결핍증, 신경원성 세로이드 리포푸신증(neuronal ceroid lipofuscinoses)(CLN1-8, INCL 및 LINCL), 스핑고리피드증, 갈락토시알산증, 근위축측삭경화증(ALS), 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 척수소뇌성 실조증, 척수근위축증, 프리드리히 운동실조증(Friedreich's ataxia), 뒤시엔느 근위축증(DMD: Duchenne muscular dystrophy), 베커 근위축증(BMD: Becker muscular dystrophy), 이영양성 수포성 표피박리증(DEB: dystrophic epidermolysis bullosa), 엑토뉴클레오타이드 피로포스파타아제 1 결핍증, 유아기의 전신동맥석회화(GACI: generalized arterial calcification of infancy), 레베르 선천성 흑암시(Leber Congenital Amaurosis), 스타가르트 황반이양증(Stargardt macular dystrophy)(ABCA4), 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC: ornithine transcarbamylase) 결핍증, 어셔증후군(Usher syndrome), 알파-1 항트립신 결핍증, 및 카텝신(Cathepsin) A 결핍증으로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
  114. 제113항에 있어서, 유전적 장애가 레베르 선천성 흑암시(LCA) 10인, 방법.
  115. 제113항에 있어서, 유전적 장애가 스타가르트 황반이양증인, 방법.
  116. 제113항에 있어서, 유전적 장애가 A형 혈우병(인자 VIII 결핍증)인, 방법.
  117. 제113항에 있어서, 유전적 장애가 B형 혈우병(인자 IX 결핍증)인, 방법.
  118. 제113항에 있어서, 유전적 장애가 윌슨병인, 방법.
  119. 제113항에 있어서, 유전적 장애가 고셰병인, 방법.
  120. 제113항에 있어서, 유전적 장애가 페닐케톤뇨증(PKU)인, 방법.
  121. 제113항에 있어서, 유전적 장애가 히알루로니다아제 결핍증인, 방법.
  122. 제111항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 면역억제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  123. 제122항에 있어서, 면역억제제가 덱사메타손인, 방법.
  124. 제111항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 대상이 주요 양이온성 지질로서 MC3을 포함하는 LNP를 이용하여 관찰된 면역 반응 수준과 비교하여, 상기 약학적 조성물에 대해 감소된 면역 반응 수준을 나타내며, 여기서 상기 약학적 조성물에 대한 면역 반응 수준은 MC3을 포함하는 LNP를 이용하여 관찰된 수준보다 적어도 50% 더 낮은, 방법.
  125. 제124항에 있어서, 면역 반응이 전염증성 사이토카인 또는 케모카인의 수준을 검출하는 방식으로 측정되는, 방법.
  126. 제125항에 있어서, 전염증성 사이토카인 또는 케모카인이 IL-6, IFNα, IFNγ, IL-18, TNFα, IP-10, MCP-1, MIP1α, MIP1β 및 RANTES로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
  127. 제125항에 있어서, 전염증성 사이토카인 중 적어도 하나가 약학적 조성물을 투여하고 6시간 후 대상의 혈청에서 검출 가능한 수준 미만인, 방법.
  128. 제111항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, SS-절단 가능한 지질과 폐쇄형 DNA(ceDNA)를 포함하는 LNP가 포식되지 않거나; 유사한 조건 하에서 투여된 주요 양이온성 지질로서 MC3을 포함하는 LNP의 포식세포 수준(phagocytic level)과 비교하여 적어도 50% 감소된 포식세포 수준을 나타내는, 방법.
  129. 제128항에 있어서, SS-절단 가능한 지질이 하기 구조 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 갖는 지질인, 방법:
    Figure pct00138
    .
  130. 제129항에 있어서, LNP가 콜레스테롤과 PEG화된 지질을 추가로 포함하는, 방법.
  131. 제130항에 있어서, LNP가 비양이온성 지질을 추가로 포함하는, 방법.
  132. 제131항에 있어서, 비양이온성 지질이 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
  133. 제130항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, LNP가 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)을 추가로 포함하는, 방법.
  134. 제133항에 있어서, GalNAc가 PEG화된 지질에 접합된 것이고, GalNAc에 접합된 PEG화된 지질이 0.5%의 몰 백분율로 LNP에 존재하는, 방법.
  135. 간에 대한 치료용 핵산의 표적화를 증가시키는 방법으로서, 제1항 내지 제110항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 LNP는 강성 치료용 핵산(rTNA), ss-절단 가능한 지질, 스테롤, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)을 포함하는, 간에 대한 치료용 핵산의 표적화를 증가시키는 방법.
  136. 제135항에 있어서, PEG가 1-(모노메톡시폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG)인, 방법.
  137. 제135항에 있어서, LNP가 비양이온성 지질을 추가로 포함하는, 방법.
  138. 제137항에 있어서, 비양이온성 지질이 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
  139. 제135항에 있어서, GalNAc가 PEG화된 지질에 접합된 것이고, GalNAc에 접합된 PEG화된 지질이 0.5%의 몰 백분율로 LNP에 존재하는, 방법.
  140. 제135항에 있어서, 대상이 유전적 장애를 앓고 있는 대상인, 방법.
  141. 제140항에 있어서, 유전적 장애가 A형 혈우병(인자 VIII 결핍증)인, 방법.
  142. 제140항에 있어서, 유전적 장애가 B형 혈우병(인자 IX 결핍증)인, 방법.
  143. 제140항에 있어서, 유전적 장애가 페닐케톤뇨증(PKU)인, 방법.
  144. 제135항에 있어서, 강성 치료용 핵산이 미니유전자, 플라스미드, 미니서클, 소형 간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO), 리보자임, ceDNA, 미니스트링, doggybone™, 프로텔로미어 폐쇄형 DNA 또는 덤벨 선형 DNA, 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), mRNA, tRNA, rRNA, DNA 바이러스성 벡터, 바이러스성 RNA 벡터, 비바이러스성 벡터, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
  145. 제135항에 있어서, 강성 치료용 핵산이 ceDNA인, 방법.
  146. 제145항에 있어서, ceDNA가 프로모터 서열과 전이유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는, 방법.
  147. 제146항에 있어서, ceDNA가 상기 발현 카세트의 5' 말단 또는 3' 말단을 플랭킹하는 적어도 하나의 역말단반복서열(ITR)을 포함하는, 방법.
  148. 제135항에 있어서, ceDNA가 CELiD, MIDGE, 미니스트링 DNA, 발현 카세트의 5' 말단과 3' 말단에 있는 ITR의 2개의 헤어핀 구조를 포함하는 덤벨형 선형 이중체 폐쇄형 DNA, 또는 doggybone™ DNA로 이루어지는 군에서 선택되며, 여기서 ceDNA는 캡시드 미함유 선형 이중체 DNA인, 방법.
  149. 강성 치료용 핵산(rTNA)으로 치료를 필요로 하는 대상에서 보체 반응을 완화시키는 방법으로서, 제1항 내지 제148항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 LNP는 rTNA, 양이온성 지질, 스테롤 및 PEG화된 지질을 포함하는, 강성 치료용 핵산(rTNA)으로 치료를 필요로 하는 대상에서 보체 반응을 완화시키는 방법.
  150. 제149항에 있어서, 대상이 유전적 장애를 앓고 있는 대상인, 방법.
  151. 제150항에 있어서, 유전적 장애가 겸상적혈구빈혈, 흑색종, A형 혈우병(응고인자 VIII(FVIII) 결핍증) 및 B형 혈우병(응고인자 IX(FIX) 결핍증), 낭성섬유증(CFTR), 가족성 고콜레스테롤혈증(LDL 수용체 결함), 간모세포종, 윌슨병, 페닐케톤뇨증(PKU), 선천성 간 포르피린증, 유전성 간 대사장애, 레쉬-니한증후군, 겸상적혈구빈혈, 지중해빈혈, 색소성 건피증, 판코니빈혈, 색소성망막염, 모세혈관확장성 운동실조증, 블룸증후군, 망막모세포종, 점액다당류축적질환(예를 들어, 헐러증후군(MPS I형), 샤이에증후군(MPS I형 S), 헐러-샤이에증후군(MPS I형 H-S), 헌터증후군(MPS II형), 산필리포증후군 A형, B형, C형 및 D형(MPS III형 A, B, C 및 D), 모르키오증후군 A형 및 B형(MPS IVA 및 MPS IVB), 마로토-라미증후군(MPS VI형), 슬라이증후군(MPS VII형), 히알루로니다아제 결핍증(MPS IX형)), 니만-피크병 A/B형, C1형 및 C2형, 파브리병, 쉰들러병, GM2-강글리오시드증 II형(샌드호프병), 테이-삭스병, 이염성 백질디스트로피, 크라베병, 점액지질증 I형, II/III형 및 IV형, 시알산증 I형 및 II형, 글리코겐축적질환 I형 및 II형(폼페병), 고셰병 I형, II형 및 III형, 시스틴증, 바텐병, 아스파르틸글루코사민뇨증, 살라병, 다논병(LAMP-2 결핍증), 리소좀 산 리파아제(LAL) 결핍증, 신경원성 세로이드 리포푸신증(CLN1-8, INCL 및 LINCL), 스핑고리피드증, 갈락토시알산증, 근위축측삭경화증(ALS), 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 척수소뇌성 실조증, 척수근위축증, 프리드리히 운동실조증, 뒤시엔느 근위축증(DMD), 베커 근위축증(BMD), 이영양성 수포성 표피박리증(DEB), 엑토뉴클레오타이드 피로포스파타아제 1 결핍증, 유아기의 전신동맥석회화(GACI), 레베르 선천성 흑암시, 스타가르트 황반이양증(ABCA4), 오르니틴 트랜스카르바밀라아제(OTC) 결핍증, 어셔증후군, 알파-1 항트립신 결핍증, 및 카텝신 A 결핍증으로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
  152. 제149항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서, 강성 치료용 핵산이 미니유전자, 플라스미드, 미니서클, 소형 간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA), 안티센스 올리고뉴클레오타이드(ASO), 리보자임, ceDNA, 미니스트링, doggybone™, 프로텔로미어 폐쇄형 DNA 또는 덤벨 선형 DNA, 다이서-기질 dsRNA, 소형 헤어핀 RNA(shRNA), 비대칭 간섭 RNA(aiRNA), 마이크로RNA(miRNA), mRNA, tRNA, rRNA, DNA 바이러스성 벡터, 바이러스성 RNA 벡터, 비바이러스성 벡터, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
  153. 제152항에 있어서, 강성 치료용 핵산이 ceDNA이며, 여기서 ceDNA는 CELiD, MIDGE, 미니스트링 DNA, 발현 카세트의 5' 말단과 3' 말단에 있는 ITR의 2개의 헤어핀 구조를 포함하는 덤벨형 선형 이중체 폐쇄형 DNA, 또는 doggybone™ DNA로 이루어지는 군에서 선택되고, ceDNA는 캡시드 미함유 선형 이중체 DNA인, 방법.
  154. 제149항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, PEG화된 지질이 1-(모노메톡시폴리에틸렌글리콜)-2,3-디미리스토일글리세롤(PEG-DMG)인, 방법.
  155. 제154항에 있어서, PEG가 약 2% 내지 4%의 몰 백분율로 LNP에 존재하는, 방법.
  156. 제155항에 있어서, PEG가 약 3%의 몰 백분율로 LNP에 존재하는, 방법.
  157. 제149항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, LNP가 비양이온성 지질을 추가로 포함하는, 방법.
  158. 제157항에 있어서, 비양이온성 지질이 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로 이루어지는 군에서 선택되는, 방법.
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