JP2021016370A - 核酸導入キャリア、核酸導入キャリアセット、核酸導入組成物及び核酸導入方法 - Google Patents
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Abstract
Description
・核酸導入キャリア
図1は、第1の実施形態の核酸導入キャリアの一例を示す断面図である。核酸導入キャリア1は、ドナーDNA2と、RNA剤3と、ドナーDNA2及びRNA剤3を内包する脂質粒子4を備える。ドナーDNA2は、細胞のゲノムに導入される第1の配列5を含む。RNA剤3は、RNA3aとガイドRNA3bとを含む。RNA3aは、ゲノムへの第1の配列5の導入に関与するタンパク質をコードするRNAである。ガイドRNA3bは、第1の配列5が導入されるゲノム上の配列(以下、「第2の配列」と称する)に対応する配列を含むRNAである。ドナーDNA2とRNA剤3とは、例えば、核酸凝縮ペプチド6で凝縮された状態で内包されている。脂質粒子4は複数の脂質分子4aが非共有結合で隙間なく配列してできた脂質膜からなり、略球状の中空体であり、その中心の内腔4bにドナーDNA2とRNA剤3とが内包されている。
RQRQRYYRQRQRGGRRRRRR (配列番号1)
RQRQRGGRRRRRR (配列番号2)。
RRRRRRYYRQRQRGGRRRRRR (配列番号3)。
GNQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY
(M9)(配列番号4)。
1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DOPE)、
1,2−ステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DSPE)、
1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルコリン(DPPC)、
1−パルミトイル−2−オレオイル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルコリン(POPC)、
1,2−ジ−O−オクタデシル−3−トリメチルアンモニウムプロパン(DOTMA)、
1,2−ジオレオイル−3−ジメチルアンモニウムプロパン(DODAP)、
1,2−ジミリストイル−3−ジメチルアンモニウムプロパン(14:0 DAP)、
1,2−ジパルミトイル−3−ジメチルアンモニウムプロパン(16:0 DAP)、
1,2−ジステアロイル−3−ジメチルアンモニウムプロパン(18:0 DAP)、
N−(4−カルボキシベンジル)−N,N−ジメチル−2,3−ビス(オレオイロキシ)プロパン(DOBAQ)、
1,2−ジオレオイル−3−トリメチルアンモニウムプロパン(DOTAP)、
1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホクロリン(DOPC)、
1,2−ジリノレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホクロリン(DLPC)、
1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−L−セリン(DOPS)、又は
コレステロール
などを用いることが好ましい。これらは、脂質粒子4を形成する機能を有することに加え、核酸導入キャリアを細胞に導入する際、細胞膜と融合する効果が高い。
(式中、
Qは、3級窒素を2つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、
Rは、それぞれ独立に、C12〜C24の脂肪族基であり、
少なくとも一つのRは、その主鎖中または側鎖中に、−C(=O)−O−、−O−C(=O)−、−O−C(=O)−O−、−S−C(=O)−、−C(=O)−S−、−C(=O)−NH−、および−NHC(=O)−からなる群から選択される連結基LRを含む)。
(式中、
Pは、1つ以上のエーテル結合を主鎖に含むアルキレンオキシであり、
Xは、それぞれ独立に、三級アミン構造を含む2価連結基であり、
Wは、それぞれ独立に、C1〜C6アルキレンであり、
Yは、それぞれ独立に、単結合、エーテル結合、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合及び尿素結合からなる群から選ばれる2価連結基であり、
W’は、それぞれ独立に、単結合またはC1〜C6アルキレンであり、
Zは、それぞれ独立に、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、またはC12〜C22脂肪族炭化水素基である)。
以下に上記核酸導入キャリアを用いた核酸導入方法について説明する。核酸導入方法は、第1の配列を細胞のゲノムに導入する方法であって、核酸導入キャリアを細胞に接触させることを含む。
(S1)核酸導入キャリアを細胞に接触させること、
(S2)前記接触によって、細胞内で、RNA剤に含まれるRNAからタンパク質を発現させること、及び
(S3)タンパク質の活性により第1の配列を細胞のゲノムに導入すること。
実施形態によれば、核酸導入キャリア1と、担体とを含む組成物も提供される。
実施形態によれば、核酸導入キャリアを含むキットが提供される。キットは、例えば、核酸導入キャリアを含む上記組成物と、細胞に核酸導入キャリアを導入するための試薬を含む。或いは、脂質粒子4の材料を担体に分散させた分散物とドナーDNA2及びRNA剤3とを個別容器に収容したキットや、乾燥させた脂質粒子4と、ドナーDNA2及びRNA剤3と、担体とを個別容器に収容したキットなどが提供される。さらに、乾燥させた脂質粒子4又は脂質粒子4の材料の分散物と、ドナーDNA2及びRNA剤3とを個別の製品とし、利用者が各製品を目的に応じて選択できるようにすることもできる。
第2の実施形態において、ドナーDNA2及びRNA剤3がコアシェル構造を有する核酸導入キャリアが提供される。第2の実施形態の核酸導入キャリアの断面図を図3に示す。
第3の実施形態によれば、ドナーDNA2とRNA剤3とが別々に脂質粒子4内に内包された核酸導入キャリアセットが提供される。核酸導入キャリアセットの一例を図4に示す。核酸導入キャリアセット200は、第1のキャリア201と第2のキャリア202を備える。第1のキャリア201は、ドナーDNA2と、ドナーDNA2を内包する第1の脂質粒子41とを備える。第2のキャリア202は、RNA剤3と、RNA剤3を内包する第2の脂質粒子42とを備える。ドナーDNA2とRNA剤3とはそれぞれ、核酸凝縮ペプチドで凝縮された状態で内包されていてもよい。
以下に実施形態の核酸導入キャリアを製造及び使用した例について記載する。
・DNA内包キャリアの調製
DNAとして、サイトメガロウイルスプロモーターの下流にNanoLuc遺伝子を連結したプラスミドDNAを使用した。このDNAを含むDNA溶液にカチオン性ペプチドを加え、DNA‐ペプチド凝縮体を形成した。次いで、それをエタノール溶解脂溶液(FFT10(前記式(1−01)の生分解性脂質化合物)/DOTAP/コレステロール/PEG−DMG=73/44/59/4mol)に添加し、更に10mMのHEPES(pH7.3)を静かに添加した後、遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮して、DNA内包キャリアを得た。キャリアのDNA内包量は、Quant−iT(登録商標)PicoGreendsDNAAssayKit(サーモフィッシャー・サイエンティフィック製)で測定し、DNAが十分な量で内包れていることを確認した。
ヒトT細胞性白血病細胞(Jurkat、ATCC製)をTexMACS培地(ミルテニーバイオテク製)で培養し、遠心で細胞を回収した後、0.65×107細胞となるように新鮮なTexMACSに細胞を縣濁した。48ウェル培養プレートに、1.0×106細胞/ウェルとなるように、細胞縣濁液とTexMACSとを各150μL加えた。
比較対象として、リポフェクタミン3000試薬(インビトロジェン製)を用いて、上記プラスミドDNAをJurkatに導入した。導入は、当該試薬に添付されたマニュアルに従って行った。プラスミドDNAは、0.5μg/ウェルとなるようにJurkatに添加され、37℃、5%CO2雰囲気で培養した。
DNA内包キャリア又はリポフェクタミン3000と混合したプラスミドDNAの添加の48時間後、培養プレートをインキュベータから取り出し、Nano−Glo Luciferase Assay System(プロメガ製)で、NanoLucの発光強度をルミノメーター(Infinite(登録商標)F200 PRO、テカン製)で測定した。測定は、キット及び装置に添付のマニュアルに従って行った。
図5にNanoLuc発光強度の測定結果を示す。DNA内包キャリアによる導入では、リポフェクタミン3000によって導入した場合よりも発光強度が高かった。この結果から、DNA内包キャリアでDNAを導入した細胞では、DNAがよく導入され、且つNanoLuc遺伝子がよく発現していることが明らかである。このことは、DNAをキャリアに内包して導入する方法は、リポフェクタミンとDNAとの複合体を用いる方法よりもDNA導入効率及び遺伝子発現効率が高いことを示している。
次に、キャリア又はリポフェクタミン3000でDNAを添加した上記細胞を用いて、発光顕微鏡システム(LV200、オリンパス製)で発光細胞の検出を行った。添加から24時間後に、細胞培養液100μLを4ウェル培養ディッシュに移し、NanoLuc基質(LiveCellLuciferaseAssayKit、プロメガ製)を添加した。発光顕微鏡システム(LV200、オリンパス製)の所定の位置に培養ディッシュをセットした後、細胞の明視野像と発光像を撮影した。
図6に、発光細胞の撮影画像(Matamorphソフトウェアによる明視野像と発光像の重ね合わせ画像)を示す。図中矢印で示す白色の点は、発光細胞である。図6の(a)は、DNA内包キャリアを用いた細胞の顕微鏡画像を示し、図6の(b)は、リポフェクタミン3000を用いた細胞の顕微鏡画像を示す。両者を比較すると、DNA内包キャリアを用いた場合では、リポフェクタミン3000を用いた場合よりも発光した細胞の数がはるかに多いことが明らかである。この結果は、NanoLuc発光アッセイと同様に、DNA内包キャリアを用いた場合、リポフェクタミンとDNAとの複合体を用いるよりもDNA導入効率及び遺伝子発現効率が高いことを示している。
・RNA内包キャリアの調製
メッセンジャーRNA(mRNA)として、レポーター遺伝子である緑色蛍光蛋白質(GFP)のmRNA(オズバイオサイエンス製)を使用した。このmRNAを含むRNA溶液を、エタノール溶解脂質液(FFT10/DOPE/コレステロール/PEG−DMG=73/44/59/4mol)に加え、ピペッティングで縣濁した後、10mMのHEPES(pH7.3)を静かに添加し、この溶液を遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮してRNA内包キャリアを得た。キャリアのRNA内包量は、QuantiFluor(登録商標)RNASystem(プロメガ製)で測定し、mRNAが十分な量で内包れていることを確認した。
JurkatをTexMACS培地で培養し、遠心で細胞を回収した後、0.65×107細胞となるように新鮮なTexMACSに細胞を縣濁した。48ウェル培養プレートに、1.0×106細胞/ウェルとなるように、細胞縣濁液とTexMACSとを各150μL加えた。
比較対象として、リポフェクタミン3000試薬を用いて上記mRNAをJurkatに導入した。導入は、当該試薬に添付されたマニュアルに従って行った。mRNAは、0.5μg/ウェルとなるようにJurkatに添加され、37℃、5%CO2雰囲気で培養した。
RNA内包キャリア又はリポフェクタミン3000と混合したmRNAの添加の24時間後、培養プレートをインキュベータから取り出し、遠心で細胞を回収した後、1%BSA(Gibco、サーモフィッシャー・サイエンティフィック製)を含むリン酸緩衝液PBSに懸濁し、蛍光活性化セルソーター(FACS;FACSVerse(登録商標)、BDバイオサイエンス製)により、GFPの緑色蛍光を検出した。
図7に、検出結果を示す。図7の(a)はRNA内包キャリアにおける結果を示し、図7の(b)は、リポフェクタミン3000における結果を示す。グラフは、縦軸を細胞数(%)とし、横軸をGFP発現強度としたヒストグラムを示す。実線のヒストグラムはRNAを導入した細胞における分布、破線のヒストグラムはRNAを導入していない細胞(コントロール)の分布を示す。
・RNA内包キャリアの調製
mRNAとして、例2に記載のGFPのmRNAを使用した。GFPのmRNAを含むRNA溶液を、エタノール溶解脂質液(FFT10/DOPE/コレステロール/PEG−DMG=73/44/59/4mol)に加え、ピペッティングで縣濁した後、10mMのHEPES(pH7.3)を静かに添加し、この溶液を遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮してRNA内包キャリアを得た。キャリアのRNA内包量は、QuantiFluor(登録商標)RNASystemで測定し、mRNAが十分な量で内包れていることを確認した。
DNAとして、サイトメガロウイルスプロモーターの下流にGFP遺伝子を連結したプラスミドDNAを使用した。このDNAを含むDNA溶液にカチオン性ペプチドを加えてDNAを凝縮させた後、それをエタノール溶解脂溶液(FFT10/DOTAP/コレステロール/PEG−DMG=73/44/59/4mol)に添加し、更に10mMのHEPES(pH7.3)を静かに添加した後、遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮して、DNA内包キャリアを得た。キャリアのDNA内包量は、Quant−iT(登録商標)PicoGreendsDNAAssayKitで測定し、DNAが十分な量で内包れていることを確認した。
JurkatをTexMACS培地で培養し、遠心で細胞を回収した後、0.65×107細胞となるように新鮮なTexMACSに細胞を縣濁した。48ウェル培養プレートに、1.0×106細胞/ウェルとなるように、細胞縣濁液とTexMACSとを各150μL加えた。
キャリアを添加してから24時間後、培養プレートをインキュベータから取り出し、遠心で細胞を回収した後、1%BSA(Gibco、サーモフィッシャー・サイエンティフィック製)を含むリン酸緩衝液(PBS)に懸濁し、FACSにより細胞の緑色蛍光(GFP)を検出した。
図8に、検出結果を示す。図8の(a)はRNA内包キャリアにおける結果を示し、図8の(b)は、DNA内包キャリアにおける結果を示す。グラフは、縦軸を細胞数(%)とし、横軸をGFP発現強度としたヒストグラムを示す。実線のヒストグラムはそれぞれキャリアでRNA又はDNAを導入した細胞における分布を示し、破線のヒストグラムはRNA又はDNAを導入していない細胞(コントロール)の分布を示す。
・RNA/DNA共内包キャリアの調製及びJurkatへの導入
例1に記載のNanoLuc遺伝子を含むプラスミドDNAと、例2に記載のGFP遺伝子のmRNAを含む混合溶液を、エタノール溶解脂溶液(FFT10/DOPE/コレステロール/PEG−DMG=73/44/59/4mol)に添加し、更に10mMのHEPES(pH7.3)を静かに添加した後、遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮して、RNA/DNA内包キャリアを得た。キャリアのRNA内包量は、QuantiFluor(登録商標)RNASystemで、DNA内包量は、Quant−iT(登録商標)PicoGreendsDNAAssayKitで測定し、mRNA及びDNAが十分な量で含まれることを確認した。
比較対象として、リポフェクタミン3000試薬を用いて、mRNA及びプラスミドDNAをJurkatに導入した。導入は、当該試薬に添付されたマニュアルに従って行った。mRNA及びプラスミドDNAは、0.5μg/ウェルとなるようにJurkatに添加され、37℃、5%CO2雰囲気で培養した。
NanoLucDNAからのNanoLucの発現は、Nano−Glo Luciferase Assay Systemで、GFPmRNAからのGFPの発現は、FACSで検出した。検出は、それぞれ例1及び例2に記載の方法で行った。
図9にNanoLucの発現を検出した結果を示す。図9に示すグラフから、キャリアでDNA及びRNAを導入した方が、リポフェクタミン3000を用いるよりも相対発光強度がはるかに高いことが明らかとなった。この結果は、キャリアを用いた方が、DNAの導入効率がよく、DNAからの遺伝子の発現効率がよいことを示している。
・DNA内包キャリアの調製
DNAとして、サイトメガロウイルスプロモーターとNanoLuc遺伝子とを連結したNanoLuc遺伝子発現カセットを組込んだプラスミドDNAを使用した。DNA内包キャリアは、例1に記載の方法で調整した。
RNAとして、トランスポゼースRNAを使用した。RNA内包キャリアは、例2に記載の方法で調整した。
凍結した市販のヒト末梢血単核球細胞(PBMC、Lonza)を37℃の恒温槽で融解した後、遠心で細胞を回収した。細胞を2種類のサイトカイン(10ng/mLのIL−7、5ng/mLのIL−15(ミルテニー))を含むTexMACSに縣濁した後、6cm培養ディッシュに播種して、37℃、5%CO2雰囲気のインキュベータ内で培養した。1晩培養した後、インキュベータから培養ディッシュを取り出して、遠心で細胞を回収し、TexMACS(10ng/mLのIL−7、5ng/mLのIL−15を含む)に懸濁した後、CD3抗体(ミルテニー)及びCD28抗体(ミルテニー)でコーティングした48ウェル培養プレートで、37℃、5%CO2雰囲気で一晩培養した。
最初のキャリア添加から48時間後、培養プレートをそれぞれインキュベータから取り出して、Nano−Glo Luciferase Assay System(プロメガ製)で、NanoLucの発光強度をルミノメーター(Infinite(登録商標)F200 PRO、テカン製)でそれぞれ測定した。発光測定は、キットと装置に添付のマニュアルに従った。
図11に、NanoLuc発光強度の測定結果を示す。DNA内包キャリアとRNA内包キャリアとを同時に添加した場合よりも、RNA内包キャリアの添加の2時間後にDNA内包キャリアを添加した場合の方が、高いNanoLucの発光強度が測定された。この結果から、DNAの導入を補助するトランスポゼースのmRNAと導入される配列を含むDNAとの時間差導入が、DNAからのタンパク質発現量を増加させるのに有効であることが明らかになった。また、実施形態の方法によれば、一般的に核酸導入効率が低いとされているPBMCにおいてもDNAを効率よく導入及び発現させることが可能であることが明らかとなった。
・DNA/RNAコアシェル内包キャリアの調製
DNAとして、サイトメガロウイルスプロモーターとCAR遺伝子とを連結したCAR遺伝子発現カセットを組込んだプラスミドDNAを使用し、RNAとして、例2に記載のGFP mRNAを使用した。当該DNAを含むDNA溶液にカチオン性ペプチドを加えてDNAコアを形成した後、当該RNAを添加してDNAコアにRNAをシェルとして外套させたDNA/RNAコアシェルを含む溶液を調整した。これをエタノール溶解脂溶液(FFT10/DOTAP/コレステロール/PEG−DMG=73/44/59/4mol)に添加し、更に10mMのHEPES(pH7.3)を静かに添加した後、遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮してDNA/RNAコアシェル構造を有するキャリアを得た。
比較対象として、上記DNA及びRNAを含む混合溶液にカチオン性ペプチドを加えてDNA/RNA混合コアを含む溶液を調整し、これにエタノール溶解脂溶液(FFT10/DOTAP/コレステロール/PEG−DMG=73/44/59/4mol)に添加し、更に10mMのHEPES(pH7.3)を静かに添加した後、遠心式限外ろ過で洗浄及び濃縮することによりDNA/RNA混合内包キャリアを得た。
次に、得られた両キャリアにDNA及びRNAが内包されたか否かを確認するために、キャリア開裂(界面活性剤:ドデシル硫酸ナトリウムの添加)及びコア構造破壊(ポリグルタミン酸の添加)を行い、放出されたDNA/RNAをアガロース電気泳動で検出した。
DNA/RNAコアシェル内包キャリア及びDNA/RNA混合コア内包キャリアを、Jurkatに導入して20時間後、緑色蛍光を有する細胞(GFP発現細胞)を蛍光顕微鏡で検出した。図13にその結果を示す顕微鏡写真を示す。DNA/RNA混合コア内包キャリアでは、キャリア導入の20時間後の時点ではGFP発現細胞は検出されなかったが(図13の(b))、4日後にGFP発現細胞が検出された(図13の(d)の矢印)。対して、DNA/RNAコアシェル内包キャリアでは、キャリア添加から20時間後にGFP発現細胞が検出された(図13の(a)の矢印)。この結果は、DNA/RNAコアシェルにおけるRNAの発現が、DNA/RNA混合コアに比べて早いことを示唆している。したがって、DNA/RNAコアシェル内包キャリアでは、細胞内でDNA/RNAコアが時間差分解され、RNAシェルからコアDNAの順にタンパク質を発現させることが可能であることが明らかとなった。
2…ドナーDNA
3…RNA剤
3a…RNA
3b…ガイドRNA
4…脂質粒子
5…第1の配列
6…核酸凝縮ペプチド
200…核酸導入キャリアセット
201…第1のキャリア
202…第2のキャリア
Claims (30)
- 第1の配列を含むドナーDNAと、
ゲノムへの前記第1の配列の導入に関与するタンパク質をコードするRNAを少なくとも含むRNA剤と、
前記ドナーDNA及び前記RNA剤を内包する脂質粒子と
を備える、
前記第1の配列を細胞のゲノムに導入するために用いられる核酸導入キャリア。 - 前記ドナーDNA及び前記RNA剤は、前記ドナーDNAがコアであり、前記RNA剤がシェルであるコアシェル構造を有する請求項1に記載の核酸導入キャリア。
- 前記ドナーDNA及び前記RNA剤は、前記RNA剤がコアであり、前記ドナーDNAがシェルであるコアシェル構造を有する請求項1に記載の核酸導入キャリア。
- 前記タンパク質は、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素である請求項1〜3の何れか1項に記載の核酸導入キャリア。
- 前記タンパク質は、CRISPR−関連タンパク質9(Cas9)である、請求項4に記載の核酸導入キャリア。
- 前記RNA剤は、前記第1の配列を導入するための前記ゲノム上の配列に対応する配列を含むガイドRNAを更に含む請求項5に記載の核酸導入キャリア。
- 前記タンパク質は、トランスポゼースである請求項1〜3の何れか1項に記載の核酸導入キャリア。
- 前記タンパク質は、PiggyBac、SleepingBeauty、Frog Prince、Hsma、Minos、Tol1、Tol2、Passport、hAT、Ac/Ds、PIF、Harbinger、Harbinger3−DR、Himar1、Hermes、Tc3又はMos1である請求項7に記載の核酸導入キャリア。
- 前記RNA剤は、DNAをメチル化するタンパク質をコードするRNA、DNAを脱メチル化するタンパク質をコードするRNA、DNAを修復するタンパク質をコードするRNA及び/又はDNAを結合するタンパク質をコードするRNAを更に含む請求項1〜8の何れか1項に記載の核酸導入キャリア。
- 前記RNA剤に含まれるRNAは、分解に耐性を有するように修飾されている請求項1〜9の何れか1項に記載の核酸導入キャリア。
- 前記ドナーDNA及び/又は前記RNA剤は、核酸凝縮ペプチドで凝縮されている請求項1〜10の何れか1項に記載の核酸導入キャリア。
- 前記脂質粒子は、式Q−CHR2
(式中、
Qは、3級窒素を2つ以上含み、酸素を含まない含窒素脂肪族基であり、
Rは、それぞれ独立に、C12〜C24の脂肪族基であり、
少なくとも一つのRは、その主鎖中または側鎖中に、−C(=O)−O−、−O−C(=O)−、−O−C(=O)−O−、−S−C(=O)−、−C(=O)−S−、−C(=O)−NH−、および−NHC(=O)−からなる群から選択される連結基LRを含む)
で表される第1の生分解性脂質を更に含む請求項1〜11の何れか1項に記載の核酸導入キャリア。 - 前記脂質粒子は、式P−[X−W−Y−W’−Z]2
(式中、
Pは、1つ以上のエーテル結合を主鎖に含むアルキレンオキシであり、
Xは、それぞれ独立に、三級アミン構造を含む2価連結基であり、
Wは、それぞれ独立に、C1〜C6アルキレンであり、
Yは、それぞれ独立に、単結合、エーテル結合、カルボン酸エステル結合、チオカルボン酸エステル結合、チオエステル結合、アミド結合、カルバメート結合及び尿素結合からなる群から選ばれる2価連結基であり、
W’は、それぞれ独立に、単結合またはC1〜C6アルキレンであり、
Zは、それぞれ独立に、脂溶性ビタミン残基、ステロール残基、またはC12〜C22脂肪族炭化水素基である)
で表される第2の生分解性脂質を更に含む請求項1〜12の何れか1項に記載の核酸導入キャリア。 - 第1の配列を含むドナーDNAと、前記ドナーDNAを内包する第1の脂質粒子とを備える第1のキャリア、及び
ゲノムへの前記第1の配列の導入に関与するタンパク質をコードするRNAを少なくとも含むRNA剤と、前記RNA剤を内包する第2の脂質粒子とを備える第2のキャリア
を含む、
前記第1の配列を細胞のゲノムに導入するために用いられる核酸導入キャリアセット。 - 請求項1〜13の何れか1項に記載の核酸導入キャリア又は請求項14に記載の核酸導入キャリアセットと、
担体と
を含む核酸導入組成物。 - 第1の配列を含むドナーDNAと、ゲノムへの前記第1の配列の導入に関与するタンパク質をコードするRNAを少なくとも含むRNA剤と、前記ドナーDNA及び前記RNAを内包する脂質粒子とを備える核酸導入キャリアを用いて、前記第1の配列を細胞のゲノムに導入する方法であって、前記核酸導入キャリアを前記細胞に接触させることを含む核酸導入方法。
- 前記核酸導入キャリアの前記細胞への接触によって、前記細胞内で前記RNAから前記タンパク質を発現させること、及び
前記タンパク質の活性により前記第1の配列を前記細胞の前記ゲノムに導入すること
を更に含む請求項16に記載の方法。 - 前記核酸導入キャリアの前記ドナーDNA及び前記RNA剤は、前記ドナーDNAがコアであり、前記RNA剤がシェルであるコアシェル構造を有する請求項16又は17に記載の方法。
- 前記RNAから発現された前記タンパク質が、前記ドナーDNAよりも早く前記細胞の核内に到達する請求項18に記載の方法。
- 前記核酸導入キャリアの前記ドナーDNA及び前記RNA剤は、前記RNA剤がコアであり、前記ドナーDNAがシェルであるコアシェル構造を有する請求項16又は17に記載の方法。
- 前記RNAが前記細胞内で徐放される請求項20に記載の方法。
- 第1の配列を含むドナーDNAと、前記ドナーDNAを内包する脂質粒子とを備える第1のキャリア、及び
ゲノムへの前記第1の配列の導入に関与するタンパク質をコードするRNAを少なくとも含むRNA剤と、前記RNA剤を内包する脂質粒子とを備える第2のキャリア
を用いて、前記第1の配列を細胞のゲノムに導入する方法であって、
前記第1のキャリアと第2のキャリアとを前記細胞に接触させることを含む核酸導入方法。 - 前記第1のキャリアを前記細胞に接触させた後、前記第2のキャリアを前記細胞に接触させる、請求項22に記載の方法。
- 前記第2のキャリアを前記細胞に接触させた後、前記第2のキャリアを前記細胞に接触させる、請求項22に記載の方法。
- 前記第1のキャリアと前記第2のキャリアとを同時に前記細胞に接触させる、請求項23に記載の方法。
- 前記タンパク質は、エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素である請求項16〜25の何れか1項に記載の方法。
- 前記タンパク質は、CRISPR−関連タンパク質9(Cas9)である、請求項26に記載の方法。
- 前記RNA剤は、前記第1の配列を導入するための前記ゲノム上の配列に対応する配列を含むガイドRNAを更に含む請求項27に記載の方法。
- 前記タンパク質は、トランスポゼースである請求項16〜25の何れか1項に記載の方法。
- 前記タンパク質は、PiggyBac、SleepingBeauty、Frog Prince、Hsma、Minos、Tol1、Tol2、Passport、hAT、Ac/Ds、PIF、Harbinger、Harbinger3−DR、Himar1、Hermes、Tc3又はMos1である請求項29に記載の方法。
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