JP2024516376A - Ｄｎａ依存性プロテインキナーゼの阻害剤ならびにその組成物及び使用 - Google Patents

Ｄｎａ依存性プロテインキナーゼの阻害剤ならびにその組成物及び使用 Download PDF

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ジェニー シー，シン
フォーゲット，アンソニー
プロデウス，アーロン
ヤジンスキー，ステファニー
パーマー，ルビナ，ギアレ
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インテリア セラピューティクス，インコーポレーテッド
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Abstract

本開示は、ＤＮＡプロテインキナーゼの阻害剤、ならびにその組成物及び使用方法に関する。いくつかの実施形態では、阻害剤は、式Ｉ：【化１】TIFF2024516376000199.tif55170の構造またはその塩を有し、式中、ｘ１は、Ｃ-Ｒ３またはＮであり、Ｒ１は、Ｃ１-Ｃ３アルキルであり、Ｒ２は、シクロアルキルまたはヘテロシクリルであり、シクロアルキル及びヘテロシクリルが１つ以上のＲ６で任意に置換されており、Ｒ３は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルであり、Ｒ４は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルであり、Ｒ５は、Ｃ１-Ｃ３アルキルであり、各Ｒ６は、独立して、ヒドロキシ、ハロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アミノ、及びシアノから選択されるか、または２つのＲ６が、それらが結合している原子（複数可）と一緒になって、スピロ環もしくは縮合環を形成し、かつＲ７は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルである。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年４月１７日に出願された米国仮特許出願第６３／１７６２２５号に対する優先権の利益を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
任意の細胞のゲノムを正確な位置で改変する能力は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集技術の最近の発見と導入により改善されてきている。しかしながら、所与の遺伝子座において特異的かつ指向的な変更を導入できる能力は、Ｃａｓ９媒介性ＤＮＡ切断に続いて起こる主な細胞修復経路が、誤りのある非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路であるという事実によって妨げられてしまう。相同組換え（ＨＤＲ）はＮＨＥＪよりも効率が悪く、真核細胞における編集効率を低下させる。
ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ-ＰＫ）は核内セリン／スレオニンキナーゼであり、これはＤＮＡ二本鎖切断修復機構において欠かせないことが示されている。哺乳類では、二本鎖ＤＮＡ切断の修復の主要経路は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路であり、細胞周期の期にかかわらず機能するものであり、ライゲートできない（ｎｏｎ-ｌｉｇａｔａｂｌｅ）末端を除去して二本鎖切断の末端をライゲートすることによって作用する。ＤＮＡ-ＰＫ阻害剤（ＤＮＡ-ＰＫＩ）は、ＤＮＡ-ＰＫ及びＮＨＥＪ経路の、構造的に多様なクラスの阻害剤である。
ゲノムを改変するための効率的なシステム及び技術が大きく必要とされている。また、鋳型核酸を用いて核酸分子の編集を行うための効率的な方法も必要とされている。
本開示は、ＤＮＡ-ＰＫＩ、ならびにその組成物及び使用方法に関する。
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ-ＰＫＩは、式Ｉ：
Figure 2024516376000002
 の構造を有する化合物またはその塩であり、
式中、
ｘ１は、Ｃ-Ｒ３またはＮであり、
Ｒ１は、Ｃ１-Ｃ３アルキルであり、
Ｒ２は、シクロアルキルまたはヘテロシクリルであり、シクロアルキル及びヘテロシクリルが１つ以上のＲ６で任意に置換されており、
Ｒ３は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルであり、
Ｒ４は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルであり、
Ｒ５は、Ｃ１-Ｃ３アルキルであり、
各Ｒ６は、独立して、ヒドロキシ、ハロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アミノ、及びシアノから選択されるか、または２つのＲ６が、それらが結合している原子（複数可）と一緒になって、スピロ環もしくは縮合環を形成し、かつ
Ｒ７は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルであるが、
但し、以下のうちの少なくとも１つが当てはまることを条件とする：
（ａ）ｘ１がＣ-Ｒ３である、
（ｂ）Ｒ１がＣ２-Ｃ３アルキルである、
（ｃ）Ｒ４がＣ１-Ｃ３アルキルである、
（ｄ）Ｒ２が１つのＲ６で置換されており、Ｒ６がハロである、
（ｅ）結合している原子（複数可）と一緒になってスピロ環式または縮合環を形成する２つのＲ６でＲ２が置換されている、及び
（ｆ）Ｒ２が、１つ以上のＲ６で任意に置換されているＣ３-Ｃ５シクロアルキルである。
好ましい実施形態では、本開示は、
Figure 2024516376000003
Figure 2024516376000004
 またはそれらの塩から選択される化合物に関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、
ａ）ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤（ＤＮＡ-ＰＫＩ）、
ｂ）ＤＮＡ切断物質、
ｃ）任意に、細胞、及び
ｄ）任意に、ドナーＤＮＡ、
を含むＤＮＡ-ＰＫＩ組成物に関し、ＤＮＡ-ＰＫＩが、式Ｉ
Figure 2024516376000005
 の化合物またはその塩であり、
式中、
ｘ１は、Ｃ-Ｒ３またはＮであり、
Ｒ１は、Ｃ１-Ｃ３アルキルであり、
Ｒ２は、シクロアルキルまたはヘテロシクリルであり、シクロアルキル及びヘテロシクリルが１つ以上のＲ６で任意に置換されており、
Ｒ３は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルであり、
Ｒ４は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルであり、
Ｒ５は、Ｃ１-Ｃ３アルキルであり、
各Ｒ６は、独立して、ヒドロキシ、ハロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アミノ、及びシアノから選択されるか、または２つのＲ６が、それらが結合している原子（複数可）と一緒になって、スピロ環もしくは縮合環を形成し、かつ
Ｒ７は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルである。
ある特定の実施形態では、本開示は、細胞を、ＤＮＡ切断物質及びＤＮＡ-ＰＫＩと接触させることを含む、細胞において標的ゲノム編集を行うための方法または細胞のゲノムにおける二本鎖ＤＮＡ切断を修復する方法または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介した細胞のＤＮＡ切断の修復を阻害もしくは抑制する方法に関し、ＤＮＡ-ＰＫＩが、式Ｉ
Figure 2024516376000006
 の化合物またはその塩であり、
式中、
ｘ１は、Ｃ-Ｒ３またはＮであり、
Ｒ１は、Ｃ１-Ｃ３アルキルであり、
Ｒ２は、シクロアルキルまたはヘテロシクリルであり、シクロアルキル及びヘテロシクリルが１つ以上のＲ６で任意に置換されており、
Ｒ３は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルであり、
Ｒ４は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルであり、
Ｒ５は、Ｃ１-Ｃ３アルキルであり、
各Ｒ６は、独立して、ヒドロキシ、ハロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アミノ、及びシアノから選択されるか、または２つのＲ６が、それらが結合している原子（複数可）と一緒になって、スピロ環もしくは縮合環を形成し、かつ
Ｒ７は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルである。
ＴＲＡＣ遺伝子座へのＧＦＰ挿入に対するＤＮＡ-ＰＫＩ化合物の効果を示す。化合物（化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物８、及び化合物９）を用いたＴＲＡＣ遺伝子座へのＧＦＰ挿入後のＣＤ３-細胞の割合（％）を示す。 ＴＲＡＣ遺伝子座へのＧＦＰ挿入に対するＤＮＡ-ＰＫＩ化合物の効果を示す。ＧＦＰ＋であったＣＤ３-細胞の割合（％）としての挿入効率を示す。 化合物、化合物１、化合物３、及び化合物４を用いたＴＲＡＣ遺伝子座での編集を示す。ＣＤ８＋細胞パーセントを示す。 化合物、化合物１、化合物３、及び化合物４を用いたＴＲＡＣ遺伝子座での編集を示す。編集後の残存ＴＣＲ＋細胞を示す。 化合物、化合物１、化合物３、及び化合物４を用いたＴＲＡＣ遺伝子座での編集を示す。編集後のＷＴ１-ＴＣＲ＋細胞パーセントを示す。 化合物１または化合物３の化合物を用いて操作されたＷＴ１-Ｔ細胞の細胞傷害性を示す。ドナー００７ＨＤから操作したＷＴ１-Ｔ細胞とインキュベートされたルシフェラーゼ発現６９７ ＡＬＬ細胞の特異的溶解を示す。 化合物１または化合物３の化合物を用いて操作されたＷＴ１-Ｔ細胞の細胞傷害性を示す。ドナー００８ＨＤから操作したＷＴ１-Ｔ細胞とインキュベートされたルシフェラーゼ発現６９７ ＡＬＬ細胞の特異的溶解を示す。 化合物１または化合物３の化合物を用いて操作されたＷＴ１-Ｔ細胞の細胞傷害性を示す。ドナー００７ＨＤから操作したＷＴ１-Ｔ細胞とのインキュベーション後の、ＨＬＡ-Ａ＊０２：０１を発現するよう形質導入されたＫ５６２-ｌｕｃ２細胞の特異的溶解を示す。 化合物１または化合物３の化合物を用いて操作されたＷＴ１-Ｔ細胞の細胞傷害性を示す。ドナー００８ＨＤから操作したＷＴ１-Ｔ細胞とのインキュベーション後の、ＨＬＡ-Ａ＊０２：０１を発現するよう形質導入されたＫ５６２-ｌｕｃ２細胞の特異的溶解を示す。 標的細胞とのインキュベーション後の、化合物１または化合物３を用いて操作されたＴ細胞によるサイトカインの放出を示す。６９７ ＡＬＬ細胞とのインキュベーション後のグランザイムＢの放出を示す。 標的細胞とのインキュベーション後の、化合物１または化合物３を用いて操作されたＴ細胞によるサイトカインの放出を示す。ＨＬＡ-Ａ＊０２：０１を発現するよう形質導入されたＫ５６２-ｌｕｃ２細胞とのインキュベーション後のグランザイムＢの放出を示す。 標的細胞とのインキュベーション後の、化合物１または化合物３を用いて操作されたＴ細胞によるサイトカインの放出を示す。６９７ ＡＬＬ細胞とのインキュベーション後のインターフェロン-ガンマ（ＩＦＮｇ）の放出を示す。 標的細胞とのインキュベーション後の、化合物１または化合物３を用いて操作されたＴ細胞によるサイトカインの放出を示す。ＨＬＡ-Ａ＊０２：０１を発現するよう形質導入されたＫ５６２-ｌｕｃ２細胞とのインキュベーション後のインターフェロン-ガンマ（ＩＦＮｇ）の放出を示す。 標的細胞とのインキュベーション後の、化合物１または化合物３を用いて操作されたＴ細胞によるサイトカインの放出を示す。６９７ ＡＬＬ細胞とのインキュベーション後のインターロイキン-２（ＩＬ-２）の放出を示す。 標的細胞とのインキュベーション後の、化合物１または化合物３を用いて操作されたＴ細胞によるサイトカインの放出を示す。ＨＬＡ-Ａ＊０２：０１を発現するよう形質導入されたＫ５６２-ｌｕｃ２細胞とのインキュベーション後のインターロイキン-２（ＩＬ-２）の放出を示す。 標的細胞とのインキュベーション後の、化合物１または化合物３を用いて操作されたＴ細胞によるサイトカインの放出を示す。６９７ ＡＬＬ細胞及びとのインキュベーション後のＴＮＦ-αの放出を示す。 標的細胞とのインキュベーション後の、化合物１または化合物３を用いて操作されたＴ細胞によるサイトカインの放出を示す。ＨＬＡ-Ａ＊０２：０１を発現するよう形質導入されたＫ５６２-ｌｕｃ２細胞とのインキュベーション後のＴＮＦ-αの放出を示す。 化合物１または化合物４を用いた編集後に有効な遺伝子破壊を有するＢ細胞の集団を表すＢ２Ｍ陰性細胞の割合（％）を示す。 ＬＮＰ組成物及び様々な用量の化合物１または化合物４による処理後の、ＮＧＳにより評価したＡＡＶＳ１における平均編集パーセントを示す。 化合物１または化合物４を用いてＡＡＶＳ１遺伝子座にＧＦＰを挿入するよう編集した後の、ＧＦＰ高発現の（ＧＦＰ＋＋）ＮＫ細胞の割合（％）を示す。 ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ１／２遺伝子座における遺伝子破壊のないＴ細胞の集団を表すＣＤ３ｅｔａ＋、Ｖｂ８-細胞の割合（％）を示す。 ＴＲＡＣにＷＴ１ ＴＣＲ挿入を有するＴ細胞の集団を表すＣＤ３ｅｔａ＋、Ｖｂ８＋細胞の割合（％）を示す。 ＨＬＡ遺伝子座に有効な遺伝子破壊を有するＴ細胞の集団を表すＨＬＡ-Ａ２-細胞の割合（％）を示す。 ＣＩＩＴＡ遺伝子座に有効な遺伝子破壊を有するＴ細胞の集団を表すＨＬＡ-ＤＲＤＰＤＱ-細胞の割合（％）を示す。 ＡＡＶＳ１遺伝子座にＧＦＰ挿入を有するＴ細胞の集団を表すＧＦＰ＋細胞の割合（％）を示す。 ５つのゲノム編集を有するＴ細胞の集団を表すＶｂ８＋ＧＦＰ＋ＨＬＡ-Ａ-ＨＬＡ-ＤＲＤＰＤＱ-細胞の割合（％）を示す。 Ａ及びＢは、２つのＬＮＰ組成物の代替的培地条件で編集した後のＴ細胞の集団を表すＧＦＰ＋細胞の割合（％）を示す。Ａは、脂質モル比が、５０％のイオン化可能脂質／３８．５％のコレステロール／１０％のＤＳＰＣ／１．５％のＰＥＧ脂質であるＬＮＰ組成物で処理した細胞を示す。Ｂは、脂質モル比が、３５％のイオン化可能脂質／４７．５％のコレステロール／１５％のＤＳＰＣ／２．５％のＰＥＧ脂質であるＬＮＰ組成物で処理した細胞を示す。 Ａ及びＢは、２つのＬＮＰ組成物の代替的培地条件で編集した後のＴ細胞の集団を表すＧＦＰ＋細胞の割合（％）を示す。Ａは、脂質モル比が、５０％のイオン化可能脂質／３８．５％のコレステロール／１０％のＤＳＰＣ／１．５％のＰＥＧ脂質であるＬＮＰ組成物で処理した細胞を示す。Ｂは、脂質モル比が、３５％のイオン化可能脂質／４７．５％のコレステロール／１５％のＤＳＰＣ／２．５％のＰＥＧ脂質であるＬＮＰ組成物で処理した細胞を示す。 化合物３及び化合物４を用いた編集後の意図しない構造上の差異の割合（％）を示す。 化合物３及び化合物４を用いた編集後のＧＦＰ陽性細胞の割合（％）を示す。 Ａ及びＢは、ｓｇＲＮＡの用量の異なるＤＮＡｐｋｉ化合物４の存在下及び非存在下における、インデルの割合（％）及びＨＤ３ ＴＣＲ挿入の割合（％）を示す。Ａは、ＴＲＡＣ編集の割合（％）を示す。Ｂは、ＣＤ３＋Ｖβ７．２＋Ｔ細胞の割合（％）を示す。 Ａ及びＢは、ｓｇＲＮＡの用量の異なるＤＮＡｐｋｉ化合物４の存在下及び非存在下における、インデルの割合（％）及びＨＤ３ ＴＣＲ挿入の割合（％）を示す。Ａは、ＴＲＡＣ編集の割合（％）を示す。Ｂは、ＣＤ３＋Ｖβ７．２＋Ｔ細胞の割合（％）を示す。
本明細書では、Ｃａｓ９切断により生じる二本鎖切断（ＤＳＢ）生成後の、ＮＨＥＪ媒介性変異誘発イベントを減少させるかまたはＨＤＲの比率もしくは確率を増加させるために有用である、ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＤＮＡ-ＰＫＩ）の低分子阻害剤について記載する。例示的ＤＮＡ-ＰＫＩは、例えば、ＷＯ２０１８／１１４９９９、ＷＯ２０１４／１８３８５０、ＷＯ０３／０２４９４９、Ｆｏｋ，Ｊ．Ｈ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ，Ｃｏｍｍｕｎ，１０，５０６５（２０１９）、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００５，４８，５６９-５８５、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｆ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０２０，６３，３４６１-３４７１、及び米国特許第１０，７８６，５１２号に提供されている。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡＰＫ阻害剤（ＤＮＡ-ＰＫＩ）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ成分ＲＮＡ及び／またはｇＲＮＡ（「カーゴ」）のような核酸等の生物活性物質を細胞に送達するための組成物及び方法において使用される。
本明細書に記載のＤＮＡ-ＰＫＩを使用した、遺伝子編集の方法及び操作された細胞を作製する方法、ならびにそれらを含む組成物もまた提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物及び方法により、約８０％超、約９０％超、または約９５％超の編集効率がもたらされる。いくつかの実施形態では、組成物及び方法により、約８０～９５％、約９０～９５％、約８０～９９％、約９０～９９％、または約９５～９９％の編集効率がもたらされる。
ＤＮＡ ＰＫ阻害剤
本開示は、ＤＮＡ-ＰＫＩ、ならびにその組成物及び使用方法に関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、式Ｉ：
Figure 2024516376000007
 の構造を有する化合物またはその塩に関し、
式中、
ｘ１は、Ｃ-Ｒ３またはＮであり、
Ｒ１は、Ｃ１-Ｃ３アルキルであり、
Ｒ２は、シクロアルキルまたはヘテロシクリルであり、シクロアルキル及びヘテロシクリルが１つ以上のＲ６で任意に置換されており、
Ｒ３は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルであり、
Ｒ４は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルであり、
Ｒ５は、Ｃ１-Ｃ３アルキルであり、
各Ｒ６は、独立して、ヒドロキシ、ハロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アミノ、及びシアノから選択されるか、または２つのＲ６が、それらが結合している原子（複数可）と一緒になって、スピロ環もしくは縮合環を形成し、かつ
Ｒ７は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルであるが、
但し、以下のうちの少なくとも１つが当てはまることを条件とする：
（ａ）ｘ１がＣ-Ｒ３である、
（ｂ）Ｒ１がＣ２-Ｃ３アルキルである、
（ｃ）Ｒ４がＣ１-Ｃ３アルキルである、
（ｄ）Ｒ２が１つのＲ６で置換されており、Ｒ６がハロである、
（ｅ）結合している原子（複数可）と一緒になってスピロ環式または縮合環を形成する２つのＲ６でＲ２が置換されている、及び
（ｆ）Ｒ２が、１つ以上のＲ６で任意に置換されているＣ３-Ｃ５シクロアルキルである。
ある特定の実施形態では、本開示は、ｘ１がＣ-Ｒ３である、本明細書に記載の化合物のうちのいずれかに関する。例えば、Ｒ３は、Ｈまたはメチルであり得る。他の実施形態では、化合物は、ｘ１がＮである本明細書に記載の化合物のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、Ｒ１がＣ２-Ｃ３アルキルであり、例えば、Ｒ１はメチル及びエチルから選択され、好ましくはＲ１はメチルである、本明細書に記載の化合物のうちのいずれかに関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｒ４がＣ１-Ｃ３アルキルであり、例えば、Ｒ４はＨまたはメチルであり、好ましくはＲ４はＨである、本明細書に記載の化合物のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、Ｒ２がシクロアルキルであり、例えば、Ｒ２はＣ３-Ｃ７シクロアルキルであり、好ましくは、Ｒ２がシクロヘキシルまたはＣ３-Ｃ５シクロアルキルである、本明細書に記載の化合物のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、Ｒ２がヘテロシクリルであり、例えば、Ｒ２は５～７員のヘテロシクリルであり、好ましくは、Ｒ２がテトラヒドロピラニルまたはテトラヒドロフラニルである、本明細書に記載の化合物のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、Ｒ２が、独立してヒドロキシ、ハロ、及びシクロアルキルから選択される、１つ以上のＲ６で任意に置換されているか、または結合している原子（複数可）と一緒になってスピロ環式もしくは縮合環を形成する２つのＲ６で任意に置換されており、例えば、Ｒ２は、１つ以上のＲ６で置換されており、各Ｒ６がハロまたはヒドロキシルであり、例えば、Ｒ２が１つのＲ６で置換されており、Ｒ６がハロである、本明細書に記載の化合物のうちのいずれかに関する。いくつかの実施形態では、各Ｒ６はフルオロである。いくつかの実施形態では、本開示は、結合している原子（複数可）と一緒になってスピロ環式または縮合環を形成する２つのＲ６でＲ２が置換されている、本明細書に記載の化合物のうちのいずれかに関する。特定の実施形態では、Ｒ２は、独立してヒドロキシ、メトキシ、及びメチルから選択される、１つ以上のＲ６で任意に置換されている。
ある特定の実施形態では、本開示は、Ｒ５がメチルである本明細書に記載の化合物のうちのいずれかに関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｒ７がＨまたはメチルである、本明細書に記載の化合物のうちのいずれかに関する。
好ましい実施形態では、本開示は、

Figure 2024516376000008
Figure 2024516376000009
 またはそれらの塩から選択される化合物に関する。
具体的な実施形態では、化合物は、
Figure 2024516376000010
 またはその塩である。
具体的な実施形態では、化合物は、
Figure 2024516376000011
 またはその塩である。
具体的な実施形態では、化合物は、
Figure 2024516376000012
 またはその塩である。
具体的な実施形態では、化合物は、
Figure 2024516376000013
 またはその塩である。
具体的な実施形態では、化合物は、
Figure 2024516376000014
 またはその塩である。
具体的な実施形態では、化合物は、
Figure 2024516376000015
 またはその塩である。
具体的な実施形態では、化合物は、
Figure 2024516376000016
 またはその塩である。
ある特定の実施形態では、本開示は、化合物が遊離塩基である、本明細書に記載の化合物のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、化合物が塩、例えば、トリフラート塩である、本明細書に記載の化合物のうちのいずれかに関する。
ＤＮＡ-ＰＫＩ組成物
本明細書では、
ａ）ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤（ＤＮＡ-ＰＫＩ）、
ｂ）ＤＮＡ切断物質、
ｃ）任意に、細胞、及び
ｄ）任意に、ドナーＤＮＡ、
を含むＤＮＡ-ＰＫＩ組成物について記載し、ＤＮＡ-ＰＫＩは、式Ｉ
Figure 2024516376000017
 の化合物またはその塩であり、
式中、
ｘ１は、Ｃ-Ｒ３またはＮであり、
Ｒ１は、Ｃ１-Ｃ３アルキルであり、
Ｒ２は、シクロアルキルまたはヘテロシクリルであり、シクロアルキル及びヘテロシクリルが１つ以上のＲ６で任意に置換されており、
Ｒ３は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルであり、
Ｒ４は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルであり、
Ｒ５は、Ｃ１-Ｃ３アルキルであり、
各Ｒ６は、独立して、ヒドロキシ、ハロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アミノ、及びシアノから選択されるか、または２つのＲ６が、それらが結合している原子（複数可）と一緒になって、スピロ環もしくは縮合環を形成し、かつ
Ｒ７は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルである。
ある特定の実施形態では、本開示は、ｘ１がＮである、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、Ｒ１がメチルである、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、Ｒ４がＨである、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、Ｒ２がシクロヘキシルである、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。他の実施形態では、Ｒ２はテトラヒドロピラニルである。さらに他の実施形態では、Ｒ２はテトラヒドロフラニルである。ある特定の実施形態では、本開示は、Ｒ２が、独立してヒドロキシ、メトキシ、及びメチルから選択される、１つ以上のＲ６で任意に置換されている、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、Ｒ５がメチルである、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、Ｒ７がＨまたはメチルである、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、ＤＮＡ-ＰＫＩが、本明細書に記載の化合物のうちのいずれかである、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、
ａ）ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤（ＤＮＡ-ＰＫＩ）、
ｂ）ＤＮＡ切断物質、
ｃ）任意に、細胞、及び
ｄ）任意に、ドナーＤＮＡ、
を含む組成物に関し、ＤＮＡ-ＰＫＩは、

Figure 2024516376000018
Figure 2024516376000019
 またはそれらの塩から選択される。
具体的な実施形態では、組成物中のＤＮＡ-ＰＫＩは、
Figure 2024516376000020
 またはその塩である。
具体的な実施形態では、組成物中のＤＮＡ-ＰＫＩは、

Figure 2024516376000021
 またはその塩である。
具体的な実施形態では、組成物中のＤＮＡ-ＰＫＩは、
Figure 2024516376000022
 またはその塩である。
具体的な実施形態では、組成物中のＤＮＡ-ＰＫＩは、
Figure 2024516376000023
 またはその塩である。
具体的な実施形態では、組成物中のＤＮＡ-ＰＫＩは、
Figure 2024516376000024
 またはその塩である。
具体的な実施形態では、組成物中のＤＮＡ-ＰＫＩは、
Figure 2024516376000025
 またはその塩である。
具体的な実施形態では、組成物中のＤＮＡ-ＰＫＩは、
Figure 2024516376000026
 またはその塩である。
具体的な実施形態では、組成物中のＤＮＡ-ＰＫＩは、
Figure 2024516376000027
 またはその塩である。
ある特定の実施形態では、本開示は、組成物中のＤＮＡ-ＰＫＩの濃度が約１μＭ以下、例えば約０．２５μＭ以下であり、例えば、約０．１～１μＭ、好ましくは約０．１～０．５μＭである、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞、例えば、肝細胞または免疫細胞等の真核細胞を含む、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。いくつかの実施形態では、本開示は、細胞が養子細胞療法（ＡＣＴ）において有用である、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。ＡＣＴの例には、自家細胞療法及び同種細胞療法が含まれる。いくつかの実施形態では、本開示は、細胞が幹細胞である、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。いくつかの実施形態では、本開示は、細胞が幹細胞である、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。いくつかの実施形態では、本開示は、細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、免疫細胞が、白血球またはリンパ球である、例えば、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞等のリンパ球であり、好ましくは、リンパ球がＴ細胞である、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｔ細胞が初代Ｔ細胞である、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞が制御性Ｔ細胞である、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、リンパ球が、活性化Ｔ細胞または非活性化Ｔ細胞である、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、細胞がヒト細胞である、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＤＮＡ切断物質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ成分及び任意にガイドＲＮＡ成分を含む、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＤＮＡ切断物質またはＤＮＡ切断物質をコードする核酸、例えば、ＤＮＡ切断物質をコードするｍＲＮＡを含み、ＤＮＡ切断物質は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥエフェクタードメインヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ成分、及びそれらの組み合わせから選択され、好ましくは、ＤＮＡ切断物質がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ成分である、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ切断物質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ成分及びガイドＲＮＡ成分である。いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ成分が、ＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ成分が、クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ等のＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼ等のＣａｓ９ヌクレアーゼである、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、ＣａｓヌクレアーゼがＮｍｅ２Ｃａｓ９である、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、ＣａｓヌクレアーゼがＣａｓ１２ａヌクレアーゼである、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、修飾ＲＮＡを含む、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡ等のガイドＲＮＡ核酸を含む、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、ガイドＲＮＡ核酸が、二重ガイドＲＮＡ（ｄｕａｌ-ｇｕｉｄｅ：ｄｇＲＮＡ）であるか、またはそれをコードする、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、ガイドＲＮＡ核酸が、単一ガイド（ｓｉｎｇｌｅ-ｇｕｉｄｅ：ｓｇＲＮＡ）であるか、またはそれをコードする、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡが修飾ｇＲＮＡである、例えば、修飾ｇＲＮＡが、５’末端の最初の５ヌクレオチドのうちの１つ以上において修飾を含むか、または修飾ｇＲＮＡが、３’末端の最後の５ヌクレオチドのうちの１つ以上において修飾を含む、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ等のＣａｓヌクレアーゼと複合体を形成している。
ある特定の実施形態では、本開示は、ガイドＲＮＡ核酸及びクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含み、ｍＲＮＡとガイドＲＮＡ核酸との重量比が約２：１～１：４である、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＤＮＡ切断物質を含み、ＤＮＡ切断物質が脂質核酸集合体組成物中に存在する、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、ドナーＤＮＡを含む、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、ドナーＤＮＡ（本明細書では「鋳型核酸」または「外因性核酸」とも呼ばれる）が、タンパク質をコードする配列、制御配列、または構造ＲＮＡをコードする配列を含む、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、脂質核酸集合体組成物が脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物である、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、本明細書に記載のＬＮＰ組成物のうちのいずれかである。
ある特定の実施形態では、本開示は、ＬＮＰが、直径が約１０～２００ｎｍ、約２０～１５０ｎｍ、約５０～１５０ｎｍ、約５０～１００ｎｍ、約５０～１２０ｎｍ、約６０～１００ｎｍ、約７５～１５０ｎｍ、約７５～１２０ｎｍ、または約７５～１００ｎｍである、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、平均直径が約１０～２００ｎｍ、約２０～１５０ｎｍ、約５０～１５０ｎｍ、約５０～１００ｎｍ、約５０～１２０ｎｍ、約６０～１００ｎｍ、約７５～１５０ｎｍ、約７５～１２０ｎｍ、または約７５～１００ｎｍであるＬＮＰの集団を含む、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。例えば、平均直径は、Ｚ平均直径であり得る。
ある特定の実施形態では、本開示は、脂質核酸集合体組成物がリポプレックスである、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、脂質核酸集合体組成物が、イオン化可能脂質、例えば、本明細書に記載のイオン化可能脂質のうちのいずれかを含む、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、イオン化可能脂質が、ｐＫａが約５．１～約８．０であり、例えば、約５．５～約７．６、または約５．１～７．４、例えば、約５．５～６．６、約５．６～６．４、約５．８～６．２、もしくは約５．８～６．５である、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、脂質核酸集合体組成物がヘルパー脂質を含む、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、脂質核酸集合体組成物が中性脂質を含む、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、脂質核酸集合体組成物がＰＥＧ脂質を含む、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、脂質核酸集合体組成物のＮ／Ｐ比が、約３～１０、例えば、約５～７、好ましくは約６である、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、例えばベクターをさらに含み、ベクターが、ＤＮＡ切断物質またはドナーＤＮＡをコードする、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、ベクターがウイルスベクターである、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。他の実施形態では、本開示は、ベクターが非ウイルスベクターである、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、ベクターがレンチウイルスベクターである、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ベクターがレトロウイルスベクターである、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、ベクターがＡＡＶである、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、例えば細胞を含み、細胞が、がん細胞ではない、本明細書に記載の組成物のうちのいずれかに関する。
ＤＮＡ-ＰＫＩ法
ある特定の実施形態では、本開示は、細胞を、ＤＮＡ切断物質及びＤＮＡ-ＰＫＩと接触させることを含む、細胞において標的ゲノム編集を行うための方法に関し、ＤＮＡ-ＰＫＩが、式Ｉ
Figure 2024516376000028
 の化合物またはその塩であり、
式中、
ｘ１は、Ｃ-Ｒ３またはＮであり、
Ｒ１は、Ｃ１-Ｃ３アルキルであり、
Ｒ２は、シクロアルキルまたはヘテロシクリルであり、シクロアルキル及びヘテロシクリルが１つ以上のＲ６で任意に置換されており、
Ｒ３は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルであり、
Ｒ４は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルであり、
Ｒ５は、Ｃ１-Ｃ３アルキルであり、
各Ｒ６は、独立して、ヒドロキシ、ハロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アミノ、及びシアノから選択されるか、または２つのＲ６が、それらが結合している原子（複数可）と一緒になって、スピロ環もしくは縮合環を形成し、かつ
Ｒ７は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルである。
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞を、ＤＮＡ切断物質及びＤＮＡ-ＰＫＩと接触させることを含む、細胞のゲノムにおける二本鎖ＤＮＡ切断を修復する方法に関し、ＤＮＡ-ＰＫＩが、式Ｉ

Figure 2024516376000029
 の化合物またはその塩であり、
式中、
ｘ１は、Ｃ-Ｒ３またはＮであり、
Ｒ１は、Ｃ１-Ｃ３アルキルであり、
Ｒ２は、シクロアルキルまたはヘテロシクリルであり、シクロアルキル及びヘテロシクリルが１つ以上のＲ６で任意に置換されており、
Ｒ３は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルであり、
Ｒ４は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルであり、
Ｒ５は、Ｃ１-Ｃ３アルキルであり、
各Ｒ６は、独立して、ヒドロキシ、ハロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アミノ、及びシアノから選択されるか、または２つのＲ６が、それらが結合している原子（複数可）と一緒になって、スピロ環もしくは縮合環を形成し、かつ
Ｒ７は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルである。
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞を、ＤＮＡ切断物質及びＤＮＡ-ＰＫＩと接触させることを含む、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介した細胞のＤＮＡ切断の修復を阻害または抑制する方法に関し、ＤＮＡ-ＰＫＩが、式Ｉ
Figure 2024516376000030
 の化合物またはその塩であり、
式中、
ｘ１は、Ｃ-Ｒ３またはＮであり、
Ｒ１は、Ｃ１-Ｃ３アルキルであり、
Ｒ２は、シクロアルキルまたはヘテロシクリルであり、シクロアルキル及びヘテロシクリルが１つ以上のＲ６で任意に置換されており、
Ｒ３は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルであり、
Ｒ４は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルであり、
Ｒ５は、Ｃ１-Ｃ３アルキルであり、
各Ｒ６は、独立して、ヒドロキシ、ハロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アミノ、及びシアノから選択されるか、または２つのＲ６が、それらが結合している原子（複数可）と一緒になって、スピロ環もしくは縮合環を形成し、かつ
Ｒ７は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルである。
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞を、ＤＮＡ切断物質、ドナーＤＮＡ、及びＤＮＡ-ＰＫＩと接触させることを含む、標的を定めた、細胞のゲノムへのドナーＤＮＡの挿入方法に関し、ＤＮＡ-ＰＫＩが、式Ｉ
Figure 2024516376000031
 の化合物またはその塩であり、
式中、
ｘ１は、Ｃ-Ｒ３またはＮであり、
Ｒ１は、Ｃ１-Ｃ３アルキルであり、
Ｒ２は、シクロアルキルまたはヘテロシクリルであり、シクロアルキル及びヘテロシクリルが１つ以上のＲ６で任意に置換されており、
Ｒ３は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルであり、
Ｒ４は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルであり、
Ｒ５は、Ｃ１-Ｃ３アルキルであり、
各Ｒ６は、独立して、ヒドロキシ、ハロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アミノ、及びシアノから選択されるか、または２つのＲ６が、それらが結合している原子（複数可）と一緒になって、スピロ環もしくは縮合環を形成し、かつ
Ｒ７は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルである。
いくつかの実施形態では、本記載は、腫瘍免疫学等の、養子細胞移植（ＡＣＴ）療法のための方法に関する。例えば、ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法により、ゲノムが１つ以上の特定標的配列において修飾されている細胞がもたらされ、これには、当該標的配列を標的とするｇＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲシステムの導入により修飾されているものが含まれる。ある特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲシステム、細胞、及び方法であって、免疫細胞のゲノム編集に有用なもの、例えば、ＴＣＲの内因的発現を欠くよう操作されたＴ細胞、例えば、目的の核酸を挿入するためのさらなる操作に好適なＴ細胞、例えば、トランスジェニックＴＣＲ（ｔｇＴＣＲ）等のＴＣＲを発現するようさらに操作されたＴ細胞であり、かつ、ＡＣＴ療法に有用なもの、ならびに、Ｂ細胞のゲノム編集に有用である、例えば、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）の内因的発現を欠くよう操作されたＢ細胞、例えば、目的の核酸を挿入するためのさらなる操作に好適なＢ細胞、例えば、トランスジェニックＢＣＲ（ｔｇＢＣＲ）等のＢＣＲを発現するようさらに操作されたＢ細胞に有用であるか、または抗体の発現に有用であり、かつ、ＡＣＴ療法に有用なものを提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、ＬＮＰ組成物を、動物、例えばヒトに投与することを含む、本明細書に記載の遺伝子編集のいずれかの方法に関する。ある特定の実施形態では、方法は、ＬＮＰ組成物を、細胞、例えば、真核細胞、特にヒト細胞に投与することを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、治療法、例えば、養子細胞療法（ＡＣＴ）に有用な種類の細胞である。ＡＣＴの例には、自家細胞療法及び同種細胞療法が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞は、造血幹細胞、人工多能性幹細胞、または別の複能性もしくは多能性の細胞等の幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は幹細胞であり、例えば、骨、軟骨、筋肉、または脂肪細胞に発達することができる間葉系幹細胞である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、眼幹細胞を含む。ある特定の実施形態では、細胞は、間葉系幹細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、単核球、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、角膜輪部幹細胞（ＬＳＣ）、組織特異的初代細胞もしくはそれに由来する細胞（ＴＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、眼幹細胞、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、及び器官または組織の移植のための細胞から選択される。
ある特定の実施形態では、本開示は、細胞を、ＤＮＡ-ＰＫＩを含まない細胞培地中で増殖させること、及び細胞培地にＤＮＡ-ＰＫＩを加えることを含む、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、細胞をＤＮＡ切断物質と接触させてから、例えば、細胞をＤＮＡ切断物質と接触させてから約６時間以内に、好ましくは、細胞をＤＮＡ切断物質と接触させてから約３時間以内に、細胞をＤＮＡ-ＰＫＩと接触させることを含む、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
他の実施形態では、本開示は、細胞を、ＤＮＡ-ＰＫＩと同時にＤＮＡ切断物質と接触させることを含む、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
さらに他の実施形態では、本開示は、細胞をＤＮＡ-ＰＫＩと接触させた後に、例えば、細胞をＤＮＡ-ＰＫＩと接触させてから約３時間以内に、細胞をＤＮＡ切断物質と接触させることを含む、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、細胞を、ＤＮＡ-ＰＫＩを含む細胞培地中で増殖させることを含む、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞を、ＤＮＡ切断物質及びＤＮＡ-ＰＫＩと少なくとも約１日、例えば、約１日～１週間、好ましくは約５日間接触させる、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、ｘ１がＮである、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、Ｒ１がメチルである、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、Ｒ４がＨである、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｒ２が、シクロヘキシル、テトラヒドロピラニル、またはテトラヒドロフラニルである、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、Ｒ２が、独立してヒドロキシ、メトキシ、及びメチルから選択される、１つ以上のＲ６で任意に置換されている、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、Ｒ５がメチルである、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、Ｒ７がＨまたはメチルである、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
好ましい実施形態では、本開示は、ＤＮＡ-ＰＫＩが、本明細書に記載の化合物のうちのいずれかである、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、細胞を、ＤＮＡ切断物質及びＤＮＡ-ＰＫＩと接触させることを含む、細胞において標的ゲノム編集を行うための方法に関し、ＤＮＡ-ＰＫＩは、

Figure 2024516376000032
Figure 2024516376000033
 またはそれらの塩から選択される。
ある特定の実施形態では、本開示は、細胞を、ＤＮＡ切断物質及びＤＮＡ-ＰＫＩと接触させることを含む、細胞のゲノムにおける二本鎖ＤＮＡ切断を修復する方法に関し、ＤＮＡ-ＰＫＩは、

Figure 2024516376000034
Figure 2024516376000035
 またはそれらの塩から選択される。
ある特定の実施形態では、本開示は、細胞を、ＤＮＡ切断物質及びＤＮＡ-ＰＫＩと接触させることを含む、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介した細胞のＤＮＡ切断の修復を阻害または抑制する方法に関し、ＤＮＡ-ＰＫＩは、

Figure 2024516376000036
Figure 2024516376000037
 またはそれらの塩から選択される。
ある特定の実施形態では、本開示は、細胞を、ＤＮＡ切断物質、ドナーＤＮＡ、及びＤＮＡ-ＰＫＩと接触させることを含む、標的を定めた、細胞のゲノムへのドナーＤＮＡの挿入方法に関し、ＤＮＡ-ＰＫＩは、

Figure 2024516376000038
Figure 2024516376000039
 またはそれらの塩から選択される。
具体的な実施形態では、方法に使用されるＤＮＡ-ＰＫＩは、
Figure 2024516376000040
 またはその塩である。
具体的な実施形態では、方法に使用されるＤＮＡ-ＰＫＩは、

Figure 2024516376000041
 またはその塩である。
具体的な実施形態では、方法に使用されるＤＮＡ-ＰＫＩは、
Figure 2024516376000042
 またはその塩である。
具体的な実施形態では、方法に使用されるＤＮＡ-ＰＫＩは、
Figure 2024516376000043
 またはその塩である。
具体的な実施形態では、方法に使用されるＤＮＡ-ＰＫＩは、
Figure 2024516376000044
 またはその塩である。
具体的な実施形態では、方法に使用されるＤＮＡ-ＰＫＩは、
Figure 2024516376000045
 またはその塩である。
具体的な実施形態では、方法に使用されるＤＮＡ-ＰＫＩは、
Figure 2024516376000046
 またはその塩である。
具体的な実施形態では、方法に使用されるＤＮＡ-ＰＫＩは、
Figure 2024516376000047
 またはその塩である。
ある特定の実施形態では、本開示は、細胞を細胞培地中でＤＮＡ-ＰＫＩと接触させ、細胞培地中のＤＮＡ-ＰＫＩの濃度が、約１μＭ以下、例えば、約０．２５μＭ以下、例えば、約０．１～１μＭ、好ましくは約０．１～０．５μＭである、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、細胞が真核細胞である、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、組成物が、細胞、例えば、肝細胞または免疫細胞等の真核細胞を含む、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、細胞は、養子細胞療法（ＡＣＴ）に有用である。ＡＣＴの例には、自家細胞療法及び同種細胞療法が含まれる。ある特定の実施形態では、細胞は幹細胞である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。ある特定の実施形態では、細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。ある特定の実施形態では、本開示は、免疫細胞が、白血球またはリンパ球である、例えば、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞等のリンパ球であり、好ましくは、リンパ球がＴ細胞である、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｔ細胞が初代Ｔ細胞である、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、Ｔ細胞が制御性Ｔ細胞である、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、リンパ球が、活性化Ｔ細胞または非活性化Ｔ細胞である、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、細胞がヒト細胞である、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、例えばＤＮＡ切断物質を含み、ＤＮＡ切断物質が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥエフェクタードメインヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ成分、及びそれらの組み合わせから選択され、好ましくは、ＤＮＡ切断物質がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ成分である、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ成分が、ＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ成分が、クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ等のＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼ等のＣａｓ９ヌクレアーゼである、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、ＣａｓヌクレアーゼがＮｍｅ２Ｃａｓ９である、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、ＣａｓヌクレアーゼがＣａｓ１２ａヌクレアーゼである、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、修飾ＲＮＡを含む、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡ等のガイドＲＮＡ核酸を含む、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、ガイドＲＮＡ核酸が、二重ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）であるか、またはそれをコードする、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、ガイドＲＮＡ核酸が、単一ガイド（ｓｇＲＮＡ）であるか、またはそれをコードする、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ｇＲＮＡが修飾ｇＲＮＡである、例えば、修飾ｇＲＮＡが、５’末端の最初の５ヌクレオチドのうちの１つ以上において修飾を含むか、または修飾ｇＲＮＡが、３’末端の最後の５ヌクレオチドのうちの１つ以上において修飾を含む、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、組成物が、ガイドＲＮＡ核酸及びクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含み、ｍＲＮＡとガイドＲＮＡ核酸との重量比が約２：１～１：４である、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。いくつかの実施形態では、組成物は、クラス２ＣａｓヌクレアーゼとガイドＲＮＡの複合体を含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、ＤＮＡ切断物質を含み、ＤＮＡ切断物質が脂質核酸集合体組成物中に存在する、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、ドナーＤＮＡを含む、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、ドナーＤＮＡが、タンパク質をコードする配列、制御配列、または構造ＲＮＡをコードする配列を含む、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、鋳型配列が、相同組換え修復（ＨＤＲ）を介して細胞のゲノムに組み込まれる、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、細胞を、ＤＮＡ切断物質を含む脂質核酸集合体組成物と接触させることを含む、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、脂質核酸集合体組成物が脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物である、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、本明細書に記載のＬＮＰ組成物のうちのいずれかである。
ある特定の実施形態では、本開示は、ＬＮＰが、直径が約１０～２００ｎｍ、約２０～１５０ｎｍ、約５０～１５０ｎｍ、約５０～１００ｎｍ、約５０～１２０ｎｍ、約６０～１００ｎｍ、約７５～１５０ｎｍ、約７５～１２０ｎｍ、または約７５～１００ｎｍである、本明細書に記載される組成物及び方法のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、組成物が、平均直径が約１０～２００ｎｍ、約２０～１５０ｎｍ、約５０～１５０ｎｍ、約５０～１００ｎｍ、約５０～１２０ｎｍ、約６０～１００ｎｍ、約７５～１５０ｎｍ、約７５～１２０ｎｍ、または約７５～１００ｎｍであるＬＮＰの集団を含む、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。例えば、平均直径は、Ｚ平均直径であり得る。
ある特定の実施形態では、本開示は、脂質核酸集合体組成物がリポプレックスである、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、脂質核酸集合体組成物が、イオン化可能脂質、例えば、本明細書に記載のイオン化可能脂質のうちのいずれかを含む、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、イオン化可能脂質が、ｐＫａが約５．１～７．４、例えば、約５．５～６．６、約５．６～６．４、約５．８～６．２、または約５．８～６．５である、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、脂質核酸集合体組成物がヘルパー脂質を含む、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、脂質核酸集合体組成物が中性脂質を含む、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、脂質核酸集合体組成物がＰＥＧ脂質を含む、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、脂質核酸集合体組成物のＮ／Ｐ比が、約３～１０、例えば、約５～７、好ましくは約６である、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
いくつかの実施形態では、本開示は、例えばベクターをさらに含み、ベクターが、ＤＮＡ切断物質またはドナーＤＮＡをコードする、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、ベクターがウイルスベクターである、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。他の実施形態では、本開示は、ベクターが非ウイルスベクターである、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、ベクターがレンチウイルスベクターである、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。いくつかの実施形態では、本開示は、ベクターがレトロウイルスベクターである、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、ベクターがＡＡＶである、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、細胞が、がん細胞ではない、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、ＤＮＡ切断物質が、細胞のゲノム内の標的配列と相互作用して二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を生じさせる、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
いくつかの好ましい実施形態では、本開示は、遺伝子ノックアウトをもたらす、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
いくつかの好ましい実施形態では、本開示は、遺伝子修正をもたらす、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。
ある特定の実施形態では、本開示は、挿入をもたらす、本明細書に記載の遺伝子編集のいずれかの方法に関する。いくつかの実施形態では、挿入は、遺伝子挿入である。
ある特定の実施形態では、本開示は、ドナーＤＮＡが、タンパク質をコードする外因性核酸を含む鋳型を含む、本明細書に記載の方法のうちのいずれかに関する。ある特定の実施形態では、タンパク質は、サイトカイン、免疫抑制物質、抗体、受容体、及び酵素から選択される。ある特定の実施形態では、タンパク質は受容体である。ある特定の実施形態では、受容体は、免疫受容体、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、及びキメラ抗原受容体から選択される。ある特定の実施形態では、受容体は、免疫受容体である。ある特定の実施形態では、受容体は、ＴＣＲである。ある特定の実施形態では、外因性核酸は、ＴＣＲのＴＣＲα鎖及び／またはＴＣＲβ鎖をコードする。ある特定の実施形態では、受容体は、キメラ抗原受容体である。
ある特定の実施形態では、本開示は、ＤＮＡ切断物質が、細胞のゲノム内の標的配列と相互作用して二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を生じさせる、本明細書に記載の遺伝子編集のいずれかの方法に関する。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ切断物質は、Ｔ細胞のＴＲＡＣ遺伝子内の標的配列と相互作用する。ある特定の実施形態では、鋳型は、Ｔ細胞のＴＲＡＣ遺伝子に組み込まれる。ある特定の実施形態では、鋳型は、切断部位の上流及び下流に位置する配列にそれぞれ相補的な第１のホモロジーアーム及び第２のホモロジーアームを含む。
タンパク質、ＲＮＡ、またはそれらをコードする核酸等のＤＮＡ切断物質は、電気穿孔、脂質を用いた送達、例えば、脂質ナノ粒子等の脂質核酸集合体を介したもの、または当該技術分野で知られている他の送達技術によって細胞に送達され得る。
イオン化可能脂質
いくつかの実施形態では、核酸集合体が、ＤＮＡ切断物質を含み、かつ、ＤＮＡ切断物質を細胞に送達する役割を果たす、方法及び組成物が提供される。本明細書に記載の脂質核酸集合体における使用に好適なイオン化可能脂質及び他の「生分解性脂質」は、インビボまたはエクスビボで生分解性である。イオン化可能脂質は毒性が低い（例えば、動物モデルにおいて忍容性があり、１０ｍｇ／ｋｇ以上の量で有害作用を伴わない）。本明細書に記載の脂質核酸集合体における使用に好適な生分解性脂質としては、例えば、ＷＯ／２０２０／２１９８７６、ＷＯ／２０２０／１１８０４１、ＷＯ／２０２０／０７２６０５、ＷＯ／２０１９／０６７９９２、ＷＯ／２０１７／１７３０５４、ＷＯ２０１５／０９５３４０、及びＷＯ２０１４／１３６０８６の生分解性脂質が挙げられ、それらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、具体的には、各々に記載のイオン化可能脂質及び組成物が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、脂質核酸集合体組成物は、脂質Ａ等のイオン化可能脂質またはその同等物、例えば、脂質Ａのアセタール類似体を含む。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は脂質Ａであり、これは、（９Ｚ，１２Ｚ）-３-（（４，４-ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）-２-（（（（３-（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ-９，１２-ジエノアートであり、また３-（（４，４-ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）-２-（（（（３-（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）-オクタデカ-９，１２-ジエノアートとも呼ばれる。脂質Ａは、以下のように描くことができる：
Figure 2024516376000048
脂質Ａは、ＷＯ２０１５／０９５３４０（例えば、ｐｐ．８４～８６）に従って合成され得る。
いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は脂質Ｄであり、これは、８-（（７，７-ビス（オクチルオキシ）ヘプチル）（２-ヒドロキシエチル）アミノ）オクタン酸ノニルである。脂質Ｄは、以下のように描くことができる：

Figure 2024516376000049
脂質Ｄは、ＷＯ２０２０／０７２６０５に従って合成され得る。
本開示のイオン化可能脂質は、それらが入っている培地のｐＨに応じて塩を形成し得る。例えば、わずかに酸性の培地中では、イオン化可能脂質はプロトン化され、したがって、正電荷を持ち得る。逆に、例えば、ｐＨがおおよそ７．３５である血液のような、わずかに塩基性の培地中では、イオン化可能脂質はプロトン化されず、したがって、電荷を持たない場合がある。いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能脂質は、少なくとも約９のｐＨで大部分がプロトン化され得る。いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能脂質は、少なくとも約１０のｐＨで大部分がプロトン化され得る。
イオン化可能脂質が大部分においてプロトン化されるｐＨは、その固有のｐＫａに関連している。いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能脂質の塩は、ｐＫａが約５．１～約８．０、よりさらに好ましくは約５．５～約７．６の範囲である。いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能脂質の塩は、ｐＫａが約５．７～約８、約５．７～約７．６、約６～約８、約６～約７．５、約６～約７、または約６～約６．５の範囲である。いくつかの実施形態では、本開示のイオン化可能脂質の塩は、ｐＫａが約６．０、約６．１、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．６、または約６．６である。別法として、本開示のイオン化可能脂質の塩は、ｐＫａが約６～約８の範囲である。ｐＫａが約５．５～約７．０の範囲の特定の脂質を用いて製剤化されたＬＮＰが、例えば肝臓への、インビボでのカーゴ送達に有効であることが見出されたことから、ｐＫａは、ＬＮＰを製剤化する際の重要な考慮事項であり得る。さらに、ｐＫａが約５．３～約６．４の範囲の特定の脂質を用いて製剤化されたＬＮＰが、例えば腫瘍への、インビボでの送達に有効であることが見出されている。例えば、ＷＯ２０１４／１３６０８６を参照のこと。いくつかの実施形態では、イオン化可能脂質は、酸性ｐＨでは正電荷を持つが、血液中では中性である。
追加の脂質
本開示の脂質組成物における使用に好適な「中性脂質」としては、例えば、様々な中性脂質、非荷電脂質または双性イオン脂質が挙げられる。本開示における使用に好適な中性リン脂質の例としては、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２-ジステアロイル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（ｄｉｌａｕｒｙｌｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１-ミリストイル-２-パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１-パルミトイル-２-ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１-パルミトイル-２-ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１，２-ジアラキドイル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１-ステアロイル-２-パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２-ジエイコセノイル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リゾホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、リゾホスファチジルエタノールアミン及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）及びジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）から選択され得、好ましくは、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）であり得る。
「ヘルパー脂質」には、ステロイド、ステロール、及びアルキルレソルシノールが含まれる。本開示における使用に好適なヘルパー脂質としては、コレステロール、５-ヘプタデシルレソルシノール、及びコレステロールヘミスクシナートが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、ヘルパー脂質は、コレステロールまたはその誘導体、例えば、コレステロールヘミスクシナートであり得る。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物には、ナノ粒子がインビボまたはエクスビボ（例えば、血液中または培地中）で存在できる時間の長さに影響を与え得るＰＥＧ脂質等のポリマー脂質が含まれる。ＰＥＧ脂質は、例えば、粒子凝集を抑制し、粒径を制御することにより、製剤工程を補助し得る。本明細書で使用されるＰＥＧ脂質は、ＬＮＰ組成物の薬物動態学的特性を調節し得る。典型的には、ＰＥＧ脂質は、脂質部分及びＰＥＧ（ポリ（エチレンオキシド）と呼ばれる場合もある）に基づくポリマー部分（ＰＥＧ部分）を含む。本開示の脂質組成物における使用に好適なＰＥＧ脂質及びそのような脂質の生化学に関する情報は、Ｒｏｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５（１），２００８，ｐｐ．５５-７１及びＨｏｅｋｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １６６０（２００４）４１-５２に見出すことができる。追加の好適なＰＥＧ脂質は、例えば、ＷＯ２０１５／０９５３４０（ｐ．３１、１４行目～ｐ．３７、６行目）、ＷＯ２００６／００７７１２、及びＷＯ２０１１／０７６８０７（「ｓｔｅａｌｔｈ ｌｉｐｉｄｓ」）に開示されており、それらは、参照により組み込まれる。
いくつかの実施形態では、脂質部分は、ジアシルグリセロールまたはジアシルグリカミド、例えば、独立して、アルキル鎖長に約Ｃ４～約Ｃ４０の飽和もしくは不飽和の炭素原子を含むジアルキルグリセロール基またはジアルキルグリカミド基を含むもの、に由来してよく、鎖は、例えばアミドまたはエステルのような、１つ以上の官能基を含み得る。いくつかの実施形態では、アルキル鎖長には、約Ｃ１０～Ｃ２０を含む。ジアルキルグリセロール基またはジアルキルグリカミド基はさらに、１つ以上の置換アルキル基を含むことができる。鎖長は、対称であっても非対称であってもよい。
別段に示されていない限り、本明細書で使用される「ＰＥＧ」という用語は、任意のポリエチレングリコールまたは他のポリアルキレンエーテルポリマー、例えば、エチレングリコールまたはエチレンオキシドの、任意に置換された直鎖状または分岐状のポリマーを意味する。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ部分は非置換である。別法として、ＰＥＧ部分は、例えば、１つ以上のアルキル基、アルコキシ基、アシル基、ヒドロキシ基、またはアリール基によって置換されていてよい。例えば、ＰＥＧ部分は、ＰＥＧ-ポリウレタンまたはＰＥＧ-ポリプロピレン等のＰＥＧコポリマー（例えば、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９２）を参照のこと）を含んでよく、別法として、ＰＥＧ部分は、ＰＥＧホモポリマーであってよい。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ部分は、分子量が約１３０～約５０，０００、例えば、約１５０～約３０，０００、または約１５０～約２０，０００である。同様に、ＰＥＧ部分は、分子量が約１５０～約１５，０００、約１５０～約１０，０００、約１５０～約６，０００、または約１５０～約５，０００であり得る。ある特定の好ましい実施形態では、ＰＥＧ部分は、分子量が約１５０～約４，０００、約１５０～約３，０００、約３００～約３，０００、約１，０００～約３，０００、または約１，５００～約２，５００である。
ある特定の好ましい実施形態では、ＰＥＧ部分は、「ＰＥＧ ２０００」とも呼ばれる「ＰＥＧ-２Ｋ」であり、平均分子量は約２，０００ダルトンである。ＰＥＧ-２Ｋは、本明細書では以下の式（ＩＩＩ）、
Figure 2024516376000050
 で表され、式中、ｎは約４５であり、数平均重合度が約４５のサブユニットを含むことを意味する。しかしながら、当該技術分野で知られている他のＰＥＧの実施形態を使用してもよく、これには、例えば、数平均重合度が約２３のサブユニット（ｎ＝２３）、及び／または６８のサブユニット（ｎ＝６８）を含むものが含まれる。いくつかの実施形態では、ｎは、約３０～約６０の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ｎは、約３５～約５５の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ｎは、約４０～約５０の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ｎは、約４２～約４８の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ｎは４５であり得る。いくつかの実施形態では、Ｒは、Ｈ、置換アルキル、及び非置換アルキルから選択され得る。いくつかの実施形態では、Ｒは、メチル等の非置換アルキルであり得る。
本明細書に記載される実施形態のうちのいずれかでは、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ-ジラウロイルグリセロール、ＰＥＧ-ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ-ＤＭＧ）（カタログ番号ＧＭ-０２０、ＮＯＦ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）製）、ＰＥＧ-ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ-ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ-ＤＳＰＥ）（カタログ番号ＤＳＰＥ-０２０ＣＮ、ＮＯＦ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、ＰＥＧ-ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ-ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ-ジパルミトイルグリカミド、及びＰＥＧ-ジステアロイルグリカミド、ＰＥＧ-コレステロール（１-［８’-（コレスタ-５-エン-３［ベータ］-オキシ）カルボキサミド-３’，６’-ジオキサオクタニル］カルバモイル-［オメガ］-メチル-ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ-ＤＭＢ（３，４-ジテトラデコキシルベンジル-［オメガ］-メチル-ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２-ジミリストイル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスホエタノールアミン-Ｎ-［メトキシ（ポリエチレングリコール）-２０００］（ＰＥＧ２ｋ-ＤＭＰＥ）、または１，２-ジミリストイル-ｒａｃ-グリセロ-３-メトキシポリエチレングリコール-２０００（ＰＥＧ２ｋ-ＤＭＧ）、１，２-ジステアロイル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスホエタノールアミン-Ｎ-［メトキシ（ポリエチレングリコール）-２０００］（ＰＥＧ２ｋ-ＤＳＰＥ）（カタログ番号８８０１２０Ｃ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａｂａｍａ，ＵＳＡ）製）、１，２-ジステアロイル-ｓｎ-グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２ｋ-ＤＳＧ；ＧＳ-０２０、ＮＯＦ Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、ポリ（エチレングリコール）-２０００-ジメタクリラート（ＰＥＧ２ｋ-ＤＭＡ）、及び１，２-ジステアリルオキシプロピル-３-アミン-Ｎ-［メトキシ（ポリエチレングリコール）-２０００］（ＰＥＧ２ｋ-ＤＳＡ）から選択され得る。ある特定のそのような実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ-ＤＭＧであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ-ＤＳＧであり得る。他の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ-ＤＳＰＥであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ-ＤＭＡであり得る。さらに別の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ-Ｃ-ＤＭＡであり得る。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＷＯ２０１６／０１０８４０に開示されている（段落［００２４０］～［００２４４］）化合物Ｓ０２７であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ-ＤＳＡであり得る。他の実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ-Ｃ１１であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ-Ｃ１４であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ-Ｃ１６であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ-Ｃ１８であり得る。
好ましい実施形態では、ＰＥＧ脂質には、グリセロール基が含まれる。好ましい実施形態では、ＰＥＧ脂質には、ジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ）基が含まれる。好ましい実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ-２ｋを含む。好ましい実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ-ＤＭＧである。好ましい実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ-２ｋ-ＤＭＧである。好ましい実施形態では、ＰＥＧ脂質は、１，２-ジミリストイル-ｒａｃ-グリセロ-３-メトキシポリエチレングリコール-２０００である。好ましい実施形態では、ＰＥＧ-２ｋ-ＤＭＧは、１，２-ジミリストイル-ｒａｃ-グリセロ-３-メトキシポリエチレングリコール-２０００である。
いくつかの実施形態では、核酸集合体が、カチオン性脂質組成物及びＤＮＡ切断物質を含み、かつ、ＤＮＡ切断物質を細胞に送達する役割を果たす、方法及び組成物が提供される。本明細書に記載される脂質組成物における使用に好適なカチオン性脂質としては、Ｎ，Ｎ-ジオレイル-Ｎ，Ｎ-ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ-ジステアリル-Ｎ，Ｎ-ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ-（１-（２，３-ジオレオイルオキシ）プロピル）-Ｎ，Ｎ，Ｎ-トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、１，２-ジオレオイル-３-ジメチルアンモニウム-プロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ-（１-（２，３-ジオレイルオキシ）プロピル）-Ｎ，Ｎ，Ｎ-トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１，２-ジオレオイルカルバミル-３-ジメチルアンモニウム-プロパン（ＤＯＣＤＡＰ）、１，２-ジリネオイル-３-ジメチルアンモニウム-プロパン（ＤＬＩＮＤＡＰ）、ジラウリル（Ｃ１２：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＬＴＡＰ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、ＤＣ-Ｃｈｏｉ、ジオレオイルオキシ-Ｎ-［２-（スペルミンカルボキサミド）エチル］-Ｎ，Ｎ-ジメチル-１-プロパンアミニウムトリフルオロアセタート（ＤＯＳＰＡ）、１，２-ジミリスチルオキシプロピル-３-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、３-ジメチルアミノ-２-（コレスタ-５-エン-３-ベータ-オキシブタン-４-オキシ）-１-（シス，シス-９，１２-オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ-ジメチル-２，３-ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、２-［５’-（コレスタ-５-エン-３［ベータ］-オキシ）-３’-オキサペントキシ）-３-ジメチル-１-（シス，シス-９’，１-２’-オクタデカジエンオキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ-ジメチル-３，４-ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、及び１，２-Ｎ，Ｎ’-ジオレイルカルバミル-３-ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰまたはＤＬＴＡＰである。
さらなる実施形態では、核酸集合体が、アニオン性脂質組成物及びＤＮＡ切断物質を含み、かつ、ＤＮＡ切断物質を細胞に送達する役割を果たす、方法及び組成物が提供される。本明細書に記載される組成物における使用に好適なアニオン性脂質としては、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ-ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ-スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ-グルタリルホスファチジルエタノールアミン、コレステロールヘミスクシナート（ＣＨＥＭＳ）、及びリシルホスファチジルグリセロールが挙げられるが、これらに限定されない。
脂質組成物
本明細書では、少なくとも１つの、イオン化可能脂質、カチオン性脂質、もしくはアニオン性脂質、例えば、イオン化可能脂質、またはそれらの塩（例えば、その薬学的に許容される塩）を含み、任意に、少なくとも１つのヘルパー脂質、少なくとも１つの中性脂質、及び少なくとも１つのポリマー脂質を含む、脂質組成物について記載する。いくつかの実施形態では、脂質組成物は、イオン化可能脂質、またはその塩、中性脂質、ヘルパー脂質、及びＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、中性脂質は、ＤＳＰＣまたはＤＰＭＥである。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、コレステロール、５-ヘプタデシルレソルシノール、またはコレステロールヘミスクシナートである。
好ましい実施形態では、イオン化可能脂質は

Figure 2024516376000051
 である。好ましい実施形態では、中性脂質はＤＳＰＣである。好ましい実施形態では、ヘルパー脂質はコレステロールである。好ましい実施形態では、ＰＥＧ脂質は、１，２-ジミリストイル-ｒａｃ-グリセロ-３-メトキシポリエチレングリコール-２０００である。特に好ましい実施形態では、イオン化可能脂質は
Figure 2024516376000052
 であり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ヘルパー脂質はコレステロールであり、ＰＥＧ脂質は１，２-ジミリストイル-ｒａｃ-グリセロ-３-メトキシポリエチレングリコール-２０００である。
好ましい実施形態では、イオン化可能脂質は
Figure 2024516376000053
 である。好ましい実施形態では、中性脂質はＤＳＰＣである。好ましい実施形態では、ヘルパー脂質はコレステロールである。好ましい実施形態では、ＰＥＧ脂質は、１，２-ジミリストイル-ｒａｃ-グリセロ-３-メトキシポリエチレングリコール-２０００である。
特に好ましい実施形態では、イオン化可能脂質は

Figure 2024516376000054
 であり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ヘルパー脂質はコレステロールであり、ＰＥＧ脂質は１，２-ジミリストイル-ｒａｃ-グリセロ-３-メトキシポリエチレングリコール-２０００である。
いくつかの実施形態では、脂質組成物はさらに、１つ以上の追加の脂質成分を含む。いくつかの実施形態では、脂質組成物はさらに、少なくとも１つのカチオン性脂質及び／または少なくとも１つのアニオン性脂質を含む。さらなる実施形態では、脂質組成物はさらに、カチオン性脂質を、任意に、１つ以上の追加の脂質成分と共に含む。さらなる実施形態では、脂質組成物はさらに、アニオン性脂質を、任意に、１つ以上の追加の脂質成分と共に含む。
いくつかの実施形態では、脂質組成物はリポソーム形態にある。好ましい実施形態では、脂質組成物は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物形態にある。「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」とは、意味を限定することなく、分子間力により互いに物理的に会合している複数の（すなわち、１より多い）ＬＮＰ構成成分を含む粒子を指す。ある特定の実施形態では、脂質組成物は、インビボ送達に好適である。ある特定の実施形態では、脂質組成物は、肝臓等の器官への送達に好適である。ある特定の実施形態では、脂質組成物は、エクスビボで組織への送達に好適である。ある特定の実施形態では、脂質組成物は、インビトロで細胞への送達に好適である。
脂質組成物は様々な形態であってよく、様々な分子を細胞に送達するのに有用な微粒子、ナノ粒子及びトランスフェクション剤等の粒子形成送達物質が含まれるが、これらに限定されない。特定の組成物は、生物活性物質をトランスフェクトまたは送達するのに有効である。好ましい生物活性物質は、ＲＮＡ及びＤＮＡである。さらなる実施形態では、生物活性物質は、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、及びＤＮＡから選択される。ｇＲＮＡは、ｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡであり得る。ある特定の実施形態では、カーゴには、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ、もしくはＣａｓ９）をコードするｍＲＮＡ、ｇＲＮＡもしくはｇＲＮＡをコードする核酸、またはｍＲＮＡとｇＲＮＡの組み合わせが含まれる。
化合物または組成物には、必ずというわけではないが、一般には、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤が含まれる。「賦形剤」という用語には、本開示の化合物（複数可）以外の任意の成分、他の脂質成分（複数可）及び生物活性物質が含まれる。賦形剤は、機能的特性（例えば、薬物放出速度制御）及び／または機能以外の（例えば、加工助剤または希釈剤）特性のいずれをも組成物に付与し得る。賦形剤の選択は、特定の投与方法、溶解性及び安定性に対する賦形剤の影響、及び剤形の性質等の因子に大きく左右される。
非経口製剤は典型的には、水性または油性の溶液または懸濁液である。製剤が水性の場合、賦形剤は、糖（グルコース、マンニトール、ソルビトール等が含まれるが、これらに限定されない）、塩、炭水化物及び緩衝剤（好ましくはｐＨが３～９）等であるが、一部の用途では、それらは、滅菌非水性溶液を用いて、または滅菌発熱性物質不含水（ＷＦＩ）等の好適なビヒクルと併用される乾燥形態として、より好適に製剤化され得る。
ＬＮＰ組成物
脂質組成物はＬＮＰ組成物として提供され得、本明細書に記載のＬＮＰ組成物は、脂質組成物として提供され得る。脂質ナノ粒子は、例えば、ミクロスフェア（これには、単層小胞及び多層小胞、例えば、「リポソーム」というラメラ相脂質二重層が含まれ、このラメラ相脂質二重層は、実施形態によっては実質的に球状であり、さらに特定の実施形態では、例えばＲＮＡ分子のかなりの部分を含む、水性核を含むことができる）、エマルジョンの分散相、ミセル、または懸濁液の内相であり得る。
本明細書では、少なくとも１つのイオン化可能脂質、またはその塩（例えば、その薬学的に許容される塩）、少なくとも１つのヘルパー脂質、少なくとも１つの中性脂質、及び少なくとも１つのポリマー脂質を含むＬＮＰ組成物について記載する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、少なくとも１つのイオン化可能脂質、またはその薬学的に許容される塩、少なくとも１つの中性脂質、少なくとも１つのヘルパー脂質、及び少なくとも１つのＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、中性脂質は、ＤＳＰＣまたはＤＰＭＥである。いくつかの実施形態では、ヘルパー脂質は、コレステロール、５-ヘプタデシルレソルシノール、またはコレステロールヘミスクシナートである。
好ましい実施形態では、イオン化可能脂質は
Figure 2024516376000055
 である。好ましい実施形態では、中性脂質はＤＳＰＣである。好ましい実施形態では、ヘルパー脂質はコレステロールである。好ましい実施形態では、ＰＥＧ脂質は、１，２-ジミリストイル-ｒａｃ-グリセロ-３-メトキシポリエチレングリコール-２０００である。特に好ましい実施形態では、イオン化可能脂質は

Figure 2024516376000056
 であり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ヘルパー脂質はコレステロールであり、ＰＥＧ脂質は１，２-ジミリストイル-ｒａｃ-グリセロ-３-メトキシポリエチレングリコール-２０００である。
好ましい実施形態では、イオン化可能脂質は
Figure 2024516376000057
 である。好ましい実施形態では、中性脂質はＤＳＰＣである。好ましい実施形態では、ヘルパー脂質はコレステロールである。好ましい実施形態では、ＰＥＧ脂質は、１，２-ジミリストイル-ｒａｃ-グリセロ-３-メトキシポリエチレングリコール-２０００である。
特に好ましい実施形態では、イオン化可能脂質は
Figure 2024516376000058
 であり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ヘルパー脂質はコレステロールであり、ＰＥＧ脂質は１，２-ジミリストイル-ｒａｃ-グリセロ-３-メトキシポリエチレングリコール-２０００である。
本開示の実施形態では、組成物中の成分脂質のそれぞれのモル比に従って表される脂質組成物が提供される。ある特定の実施形態では、イオン化可能脂質の量は約２５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％であり、中性脂質の量は約５ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％であり、ヘルパー脂質の量は約２０ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％であり、ＰＥＧ脂質の量は約０．５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％である。ｍｏｌ％のすべての数字は、脂質組成物、またはより具体的にはＬＮＰ組成物の、脂質成分の割合として与えられる。いくつかの実施形態では、ある脂質の脂質成分に対する脂質ｍｏｌ％は、特定のｍｏｌ％、名目上のｍｏｌ％、または実際のｍｏｌ％の、±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、もしくは±２．５％となる。いくつかの実施形態では、ある脂質の脂質成分に対する脂質ｍｏｌ％は、その脂質成分の特定のｍｏｌ％、名目上のｍｏｌ％、または実際のｍｏｌ％の、±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１．５ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、もしくは±０．０５ｍｏｌ％となる。ある特定の実施形態では、脂質ｍｏｌ％は、脂質の特定のｍｏｌ％、名目上のｍｏｌ％、または実際のｍｏｌ％から、１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、または０．５％未満変動する。いくつかの実施形態では、ｍｏｌ％の数字は、名目上濃度に基づく。本明細書で使用される場合、「名目上濃度」とは、結果として生じる組成物を形成させるために合わせられる物質のインプット量に基づく濃度を指す。例えば、１Ｌの水に１００ｍｇの溶質を加える場合、その名目上濃度は１００ｍｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、ｍｏｌ％の数字は、実際の濃度、例えば、分析法によって決定される濃度に基づく。いくつかの実施形態では、脂質成分の脂質の実際の濃度は、例えば、液体クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー、その後の荷電化粒子検出等の検出法から決定され得る。いくつかの実施形態では、脂質成分の脂質の実際の濃度は、脂質分析、ＡＦ４-ＭＡＬＳ、ＮＴＡ、及び／または低温ＥＭによって特徴付けされ得る。ｍｏｌ％のすべての数字は、ＬＮＰ組成物の脂質成分の脂質のパーセンテージとして与えられる。
いくつかの実施形態では、水性成分は、ＤＮＡ切断物質を含む。いくつかの実施形態では、水性成分は、任意に核酸と組み合わせた、ポリペプチドＤＮＡ切断物質を含む。いくつかの実施形態では、水性成分は、ヌクレアーゼまたはニッカーゼをコードするＲＮＡ等の、核酸ＤＮＡ切断物質を含む。いくつかの実施形態では、水性成分は核酸成分である。いくつかの実施形態では、核酸成分はＤＮＡを含み、ＤＮＡ成分と呼ばれ得る。いくつかの実施形態では、核酸成分はＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ成分等の水性成分は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質をコードするｍＲＮＡ等のｍＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質はＣａｓヌクレアーゼである。ある特定の実施形態では、水性成分は、Ｃａｓ９等のＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含み得る。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ切断物質は、ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡである。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ切断物質は、クラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡである。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ切断物質は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼｍＲＮＡである。ある特定の実施形態では、水性成分は、修飾ＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、水性成分は、ガイドＲＮＡ核酸を含み得る。ある特定の実施形態では、水性成分は、ｇＲＮＡを含み得る。ある特定の実施形態では、水性成分は、ｄｇＲＮＡを含み得る。ある特定の実施形態では、水性成分は、修飾ｇＲＮＡを含み得る。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質をコードするｍＲＮＡを含むいくつかの組成物では、組成物はさらに、ｇＲＮＡ等のｇＲＮＡ核酸を含む。いくつかの実施形態では、水性成分は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質及びｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、水性成分は、ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、水性成分は、クラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む。
ある特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物等の脂質組成物は、クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ等のＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、イオン化可能脂質またはその薬学的に許容される塩、ヘルパー脂質、任意に中性脂質、及びＰＥＧ脂質を含み得る。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ等のＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、ある特定の組成物では、ヘルパー脂質はコレステロールである。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ等のＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む他の組成物では、中性脂質はＤＳＰＣである。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）等のＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む追加の実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ-ＤＭＧである。特定の組成物では、クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ等のＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、及びイオン化可能脂質またはその薬学的に許容される塩を含むこと。ある特定の組成物では、組成物はさらに、ｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ等のｇＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物等の脂質組成物は、ｇＲＮＡを含み得る。ある特定の実施形態では、組成物は、イオン化可能脂質またはその薬学的に許容される塩、ｇＲＮＡ、ヘルパー脂質、任意に中性脂質、及びＰＥＧ脂質を含み得る。ｇＲＮＡを含む、ある特定のＬＮＰ組成物では、ヘルパー脂質はコレステロールである。ｇＲＮＡを含むいくつかの組成物では、中性脂質はＤＳＰＣである。ｇＲＮＡを含む追加の実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ-ＤＭＧである。ある特定の組成物では、ｇＲＮＡは、ｄｇＲＮＡ及びｓｇＲＮＡから選択される。
ある特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物等の脂質組成物は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質をコードするｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡであり得るｇＲＮＡを水性成分中に、イオン化可能脂質を脂質成分中に含む。例えば、ＬＮＰ組成物は、イオン化可能脂質またはその薬学的に許容される塩、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質を含み得る。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む、ある特定の組成物では、ヘルパー脂質はコレステロールである。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含むいくつかの組成物では、中性脂質はＤＳＰＣである。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む追加の実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ-ＤＭＧである。
ある特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物等の脂質組成物には、クラス２Ｃａｓ ｍＲＮＡ及び少なくとも１つのｇＲＮＡ等の、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質が含まれる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡはｓｇＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質はＣａｓ９ ｍＲＮＡである。ある特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物には、ｇＲＮＡと、クラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ等のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質ｍＲＮＡとが約１：１または約１：２の比で含まれる。いくつかの実施形態では、重量比は、重量基準で約２５：１～約１：２５、約１０：１～約１：１０、約８：１～約１：８、約４：１～約１：４、約２：１～約１：２、約２：１～１：４であるか、または約１：１～約１：２である。
本明細書に開示される組成物及び方法には、鋳型核酸、例えば、ＤＮＡ鋳型が含まれ得る。鋳型核酸は、イオン化可能脂質またはその薬学的に許容される塩を含む脂質組成物（ＬＮＰ組成物としての場合も含む）と同時に、またはそれらとは別に送達され得る。いくつかの実施形態では、鋳型核酸は、所望の修復機構に応じて一本鎖でも二本鎖でもよい。鋳型は、例えば標的ＤＮＡ配列内の、標的ＤＮＡ、及び／または標的ＤＮＡに隣接する配列との相同領域を有し得る。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ＲＮＡ水溶液を有機溶媒系の脂質溶液と混合することによって形成される。好適な溶液または溶媒には、水、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＮａＣｌ、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、エタノール、クロロホルム、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、テトラヒドロフラン、メタノール、イソプロパノールが含まれ、またはそれらを含有し得る。例えば、有機溶媒は、１００％エタノールであり得る。例えばＬＮＰ組成物のインビボ投与用の、薬学的に許容される緩衝液が使用され得る。ある特定の実施形態では、緩衝液は、ＬＮＰを含む組成物のｐＨをｐＨ６．５以上に維持するために使用される。ある特定の実施形態では、緩衝液は、ＬＮＰを含む組成物のｐＨをｐＨ７．０以上に維持するために使用される。ある特定の実施形態では、組成物は、ｐＨが約７．２～約７．７の範囲である。追加の実施形態では、組成物は、ｐＨが約７．３～約７．７の範囲または約７．４～約７．６の範囲である。組成物のｐＨは、マイクロｐＨプローブで測定され得る。ある特定の実施形態では、組成物中に凍結保護剤が含まれる。凍結保護剤の非限定的な例としては、スクロース、トレハロース、グリセロール、ＤＭＳＯ、及びエチレングリコールが挙げられる。例示的組成物には、最大１０％の凍結保護剤、例えば、スクロース等が含まれ得る。ある特定の実施形態では、組成物は、ｔｒｉｓ生理食塩水スクロース（ＴＳＳ）を含み得る。ある特定の実施形態では、組成物はＬＮＰ組成物であり、それには、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％の凍結保護剤が含まれ得る。ある特定の実施形態では、組成物はＬＮＰ組成物であり、それには、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％のスクロース、が含まれ得る。いくつかの実施形態では、組成物には緩衝液が含まれる。いくつかの実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ緩衝液、クエン酸緩衝液、及びそれらの混合物を含み得る。特定の例示的な実施形態では、緩衝液はＮａＣｌを含む。ある特定の実施形態では、緩衝液はＮａＣｌを欠く。ＮａＣｌの例示的量は、約２０ｍＭ～約４５ｍＭの範囲であり得る。ＮａＣｌの例示的量は、約４０ｍＭ～約５０ｍＭの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌの量は約４５ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝液はＴｒｉｓ緩衝液である。Ｔｒｉｓの例示的量は、約２０ｍＭ～約６０ｍＭの範囲であり得る。Ｔｒｉｓの例示的量は、約４０ｍＭ～約６０ｍＭの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、Ｔｒｉｓの量は約５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＮａＣｌ及びＴｒｉｓを含む。組成物の特定の例示的な実施形態では、５％のスクロース及び４５ｍＭ ＮａＣｌ含有Ｔｒｉｓ緩衝液を含有する。他の例示的実施形態では、組成物は、約５ｗ／ｖ％の量のスクロース、約４５ｍＭ ＮａＣｌ、及びｐＨ７．５の約５０ｍＭ Ｔｒｉｓを含有する。塩、緩衝液、及び凍結保護剤量は、組成物全体の浸透圧が維持されるよう変更され得る。例えば、最終浸透圧は、４５０ｍＯｓｍ／Ｌ未満に維持され得る。さらなる実施形態では、浸透圧は、３５０～２５０ｍＯｓｍ／Ｌである。ある特定の実施形態では、最終浸透圧が３００＋／-２０ｍＯｓｍ／Ｌまたは３１０＋／-４０ｍＯｓｍ／Ｌである。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ水溶液と脂質溶液含有有機溶媒とのマイクロ流体混合、Ｔ字型混合、または交差混合を使用してＬＮＰ組成物を作製する。ある特定の態様では、流量、合流部サイズ、合流部の幾何形状、合流部形状、管径、溶液、及び／またはＲＮＡ及び脂質濃度は変動し得る。ＬＮＰまたはＬＮＰ組成物は、例えば、透析、遠心式フィルター、接線流濾過、またはクロマトグラフィーにより濃縮または精製され得る。ＬＮＰ組成物は、例えば、懸濁液、エマルジョン、または凍結乾燥粉末として保存され得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は２～８℃で保存され、ある特定の態様では、ＬＮＰ組成物は室温で保存される。追加の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、例えば、-２０℃または-８０℃で凍結保存される。他の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、約０℃～約-８０℃の範囲の温度で保存される。凍結ＬＮＰ組成物は、使用前に、例えば、氷上、室温、または２５℃にて解凍され得る。
好ましい脂質組成物、例えば、ＬＮＰ組成物は、治療的有効用量においてインビボで細胞毒性レベルまで蓄積することがないという点で、生分解性である。いくつかの実施形態では、組成物は、治療用量において、実質的な有害作用をもたらす自然免疫応答を引き起こすことがない。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される組成物は、治療用量において毒性を引き起こすことがない。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物中のＬＮＰの濃度は、約１～１０μｇ／ｍＬ、約２～１０μｇ／ｍＬ、約２．５～１０μｇ／ｍＬ、約１～５μｇ／ｍＬ、約２～５μｇ／ｍＬ、約２．５～５μｇ／ｍＬ、約０．０４μｇ／ｍＬ、約０．０８μｇ／ｍＬ、約０．１６μｇ／ｍＬ、約０．２５μｇ／ｍＬ、約０．６３μｇ／ｍＬ、約１．２５μｇ／ｍＬ、約２．５μｇ／ｍＬ、または約５μｇ／ｍＬである。
いくつかの実施形態では、本開示のＬＮＰの多分散指数（ＰＤＩ）及びサイズの特徴付けをするために動的光散乱法（「ＤＬＳ」）が使用され得る。ＤＬＳでは、試料を光源に晒すことから得られる光の散乱を測定する。ＤＬＳ測定から決定されるＰＤＩは、ある集団における粒径（およその平均粒径）分布を表し、完全に均一な集団では、ＰＤＩはゼロである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＬＮＰは、ＰＤＩが約０．００５～約０．７５である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＬＮＰは、ＰＤＩが約０．００５～約０．１である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＬＮＰは、ＰＤＩが約０．００５～約０．０９、約０．００５～約０．０８、約０．００５～約０．０７、または約０．００６～約０．０５である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＰＤＩが約０．０１～約０．５である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＰＤＩが約ゼロ～約０．４である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＰＤＩが約ゼロ～約０．３５である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰのＰＤＩは、約ゼロ～約０．３の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＰＤＩが、約ゼロ～約０．２５の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰのＰＤＩは、約ゼロ～約０．２の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＰＤＩが約ゼロ～約０．０５である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＰＤＩが約ゼロ～約０．０１である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ＰＤＩが約０．０１未満、約０．０２、約０．０５、約０．０８、約０．１、約０．１５、約０．２、または約０．４である。
ＬＮＰのサイズは、当該技術分野で知られている様々な分析方法により測定され得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰのサイズは、非対称流れ流動場分離法-多角度光散乱法（ＡＦ４-ＭＡＬＳ）を使用して測定され得る。ある特定の実施形態では、ＬＮＰのサイズは、組成物中の粒子を流体力学的半径により分離し、その後、分画された粒子の分子量、流体力学的半径及び根平均二乗半径を測定することにより測定され得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰのサイズ及び粒子濃度は、ナノ粒子トラッキング解析法（ＮＴＡ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ）により測定され得る。ある特定の実施形態では、ＬＮＰ試料を適切に希釈し、顕微鏡スライド上に注入する。粒子が視野を通ってゆっくりと注入されるのに伴い、カメラが散乱光を記録する。動画が撮影された後、ナノ粒子トラッキング解析（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ）は、ピクセルを追跡することによって動画を処理し、拡散係数を計算する。この拡散係数が、粒子の流体力学的半径に変換され得る。かかる方法ではまた、粒子個数を計数して粒子濃度が得られ得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰのサイズ、形態、及び構造特性は低温電子顕微鏡法（「低温ＥＭ」）によって決定され得る。
本明細書に開示されるＬＮＰ組成物のＬＮＰは、例えば、サイズ（例えば、Ｚ平均直径）が約１～約２５０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、サイズが約１０～約２００ｎｍである。さらなる実施形態では、ＬＮＰは、サイズが約２０～約１５０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、サイズが約５０～約１５０ｎｍまたは約７０～１３０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、サイズが約５０～約１００ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、サイズが約５０～約１２０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、サイズが約６０～約１００ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、サイズが約７５～約１５０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、サイズが約７５～約１２０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、サイズが約７５～約１００ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、サイズが約５０～約１４５ｎｍ、約５０～約１２０ｎｍ、約５０～約１２０ｎｍ、約５０～約１１５ｎｍ、約５０～約１００ｎｍ、約６０～約１４５ｎｍ、約６０～約１２０ｎｍ、約６０～約１１５ｎｍ、または約６０～約１００ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、サイズが約１４５ｎｍ未満、約１２０ｎｍ未満、約１１５ｎｍ未満、または約１００ｎｍ未満である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、サイズが約５０ｎｍ超または約６０ｎｍ超である。いくつかの実施形態では、粒径は、Ｚ平均粒径である。いくつかの実施形態では、粒径は、個数平均粒径である。いくつかの実施形態では、粒径は、個々のＬＮＰのサイズである。別段に示されていない限り、本明細書で言及されるサイズはいずれも、Ｍａｌｖｅｒｎ ＺｅｔａｓｉｚｅｒまたはＷｙａｔｔ ＮａｎｏＳｔａｒで動的光散乱法により測定される、完全に形成されたナノ粒子の平均サイズ（直径）である。ナノ粒子試料は、計数率がおおよそ２００～４００ｋｃｐｓとなるようリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に希釈される。
ＬＮＰは、サイズ（例えば、Ｚ平均直径）が約１～約２５０ｎｍであり得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、サイズが約１０～約２００ｎｍである。さらなる実施形態では、ＬＮＰは、サイズが約２０～約１５０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、サイズが約５０～約１５０ｎｍまたは約７０～１３０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、サイズが約５０～約１００ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、サイズが約５０～約１２０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、サイズが約６０～約１００ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、サイズが約７５～約１５０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、サイズが約７５～約１２０ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、サイズが約７５～約１００ｎｍである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、サイズが約４０～約１２５ｎｍ、約４０～約１１０ｎｍ、約４０～約１００ｎｍ、約４０～約９０ｎｍである。いくつかの実施形態では、粒径は、Ｚ平均粒径である。いくつかの実施形態では、粒径は、個数平均粒径である。いくつかの実施形態では、粒径は、個々のＬＮＰのサイズである。別段に示されていない限り、本明細書で言及されるサイズはいずれも、Ｍａｌｖｅｒｎ ＺｅｔａｓｉｚｅｒまたはＷｙａｔｔ ＮａｎｏＳｔａｒで動的光散乱法により測定される、完全に形成されたナノ粒子の平均サイズ（直径）である。ナノ粒子試料は、計数率がおおよそ２００～４００ｋｃｐｓとなるようリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に希釈される。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、約５０％～約１００％の範囲の平均封入率で形成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、約５０％～約９５％の範囲の平均封入率で形成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、約７０％～約９０％の範囲の平均封入率で形成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、約９０％～約１００％の範囲の平均封入率で形成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、約７５％～約９５％の範囲の平均封入率で形成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、約９０％～約１００％の範囲の平均封入率で形成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、約９５％～約１００％の範囲の平均封入率で形成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、約９８％～約１００％の範囲の平均封入率で形成される。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、約９９％～約１００％の範囲の平均封入率で形成される。
カーゴ
ＬＮＰ組成物を介して送達されるカーゴは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質等のＤＮＡ切断物質であり得る。ある特定の実施形態では、カーゴは、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、発現ベクター、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質、例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＣａｓヌクレアーゼまたはヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ等の、１つ以上のＤＮＡ切断物質であるか、またはそれらを含み、任意にガイドＲＮＡと組み合わせられる。上記に挙げたＤＮＡ切断物質は例示的なものにすぎず、限定することを意図していない。そのような化合物は、精製されている場合もあれば部分的に精製されている場合もあり、天然に存在するものであっても合成のものであってもよく、化学的に修飾されている場合がある。
ＬＮＰ組成物を介して送達されるカーゴは、ＤＮＡ切断物質をコードするｍＲＮＡ分子のようなＲＮＡであり得る。例えば、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質、またはＣａｓヌクレアーゼ等のタンパク質を発現させるためのｍＲＮＡが含まれる。ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ、例えば、細胞内でＣａｓ９またはＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａとも呼ばれる）タンパク質等のクラス２Ｃａｓヌクレアーゼの発現を可能にするクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含むＬＮＰ組成物が提供される。さらに、カーゴは、１つ以上のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸を含有し得る。例えば修復または組換えのための、鋳型核酸も本明細書に記載の方法で使用され得る。下位実施形態では、カーゴは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ、及び任意に、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡを含む。下位実施形態では、カーゴは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ、及び任意に、Ｎｍｅ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｇＲＮＡを含む。
「ｍＲＮＡ」とは、ポリヌクレオチドを指し、ポリペプチドに翻訳されることが可能な（すなわち、リボソーム及びアミノアシル化ｔＲＮＡによる翻訳のための基質として働くことができる）オープンリーディングフレームを含む。ｍＲＮＡは、リボース残基またはその類似体、例えば、２’-メトキシリボース残基等のリン酸-糖骨格を含むことができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡリン酸-糖骨格の糖は、本質的に、リボース残基、２’-メトキシリボース残基、またはそれらの組み合わせからなる。一般に、ｍＲＮＡは、実質的量のチミジン残基を含有しない（例えば、０残基または３０、２０、１０、５、４、３、もしくは２より少ないチミジン残基、あるいは１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、または０．１％未満のチミジン含量）。ｍＲＮＡは、そのウリジン位置の一部または全部において修飾ウリジンを含有し得る。
ＤＮＡ切断物質
いくつかの実施形態では、組成物または方法は、タンパク質もしくはＲＮＡ成分またはそれらをコードする核酸等のＤＮＡ切断物質を含む。本明細書で使用される場合、ＤＮＡ切断物質という用語は、細胞のゲノム内に編集を生成するのに必要または有用なゲノム編集システム（または遺伝子編集システム）の任意の成分である。いくつかの実施形態では、本開示は、ゲノム編集システム（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼシステム、ＴＡＬＥＮシステム、メガヌクレアーゼシステムまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）のＤＮＡ切断物質を細胞（または細胞の集団）に送達する方法を提供する。ＤＮＡ切断物質としては、例えば、細胞のＤＮＡまたはＲＮＡにおいて、例えば細胞のゲノムにおいて、単鎖または二本鎖切断を作成することができるヌクレアーゼ、及びそれらをコードするＲＮＡ等の核酸が挙げられる。ＤＮＡ切断物質、例えば、ヌクレアーゼは、任意に、核酸の切断またはニッカーゼを伴わずに細胞のゲノムを改変し得る。ＤＮＡ切断ヌクレアーゼまたはニッカーゼ物質は、ｍＲＮＡによってコードされ得る。そのようなヌクレアーゼ及びニッカーゼとしては、例えば、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ成分が挙げられる。ＤＮＡ切断物質には、例えば、エディタードメイン等のエフェクタードメインに融合したニッカーゼ等の、融合タンパク質が含まれる。ＤＮＡ切断物質には、例えば、ガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ等のような、ＤＮＡ切断を導入するゲノム編集を達成するのに必要または有用な任意の成分が含まれる。
本明細書に記載のＤＮＡ-ＰＫＩ化合物と共に使用するためのＤＮＡ切断物質を含む様々な好適な遺伝子編集システムには、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム、及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システムが含まれるが、これらに限定されない。一般に、ＤＮＡ切断物質には、標的ＤＮＡ配列内に二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニック（例えば、単鎖切断、またはＳＳＢ）を誘導するための操作された切断システムの使用を伴う。切断またはニッキングは、操作されたＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ等の特定のヌクレアーゼの使用を介して、または標的ＤＮＡ配列の特異的切断もしくはニッキングを誘導するよう操作されたガイドＲＮＡと共にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用することを介して生じさせることができる。さらに、アルゴノートシステム（例えば、「ＴｔＡｇｏ」として知られる、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するものであり、Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ ５０７（７４９１）：２５８～２６１を参照のこと）に基づく標的化ヌクレアーゼが開発されつつあり、これもまた、ゲノム編集及び遺伝子治療において使用される可能性を有し得る。
ある特定の実施形態では、開示される組成物は、ＤＮＡ切断物質等の１つ以上のＤＮＡ修飾物質を含む。様々なＤＮＡ修飾物質が本明細書に記載のＬＮＰ組成物中に含まれ得る。例えば、ＤＮＡ修飾物質としては、ヌクレアーゼ（配列に特異的なものと非特異的なものの両方）、トポイソメラーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、化学物質、医薬品、及び他の物質が挙げられる。いくつかの実施形態では、鎖切断等のＤＮＡ修飾を誘導するために、所与のＤＮＡ配列または配列セットに結合するタンパク質が用いられ得る。タンパク質は、例えば、放射性崩壊が鎖切断を引き起こす１２５Ｉの組み込み等の多くの手段、またはＵＶ光への曝露時にＤＮＡとの架橋を形成する４-アジドフェナシルブロミド等の架橋試薬を修飾すること、のいずれによっても修飾され得る。そのようなタンパク質-ＤＮＡ架橋は、その後、ピペリジンでの処理によって二本鎖ＤＮＡ切断に変換され得る。ＤＮＡ修飾のためのさらに別の手法では、転写因子またはクロマチン構造タンパク質等の、１つ以上のＤＮＡ部位において結合している特定タンパク質に対して産生され、核タンパク質複合体からＤＮＡを単離するために使用される抗体を伴う。
ある特定の実施形態では、開示される組成物は、１つ以上のＤＮＡ切断物質を含む。ＤＮＡ切断物質には、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ｍｉｔｏ-ＴＡＬＥＮ、及びメガヌクレアーゼシステム等の技術が含まれる。ＴＡＬＥＮ及びＺＦＮ技術では、特定のゲノム遺伝子座における標的とするＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導するために、エンドヌクレアーゼ触媒ドメインをモジュラーＤＮＡ結合タンパク質に係留させる戦略を使用する。追加のＤＮＡ切断物質には、低分子干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、抗マイクロＲＮＡ、アンタゴニスト、短ヘアピンＲＮＡ、及びアプタマー（ＲＮＡ、ＤＮＡまたはペプチドに基づく（アフィマーを含む））が含まれる。
いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムはＴＡＬＥＮシステムである。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＤＮＡの特定の配列を切断するよう操作が可能な制限酵素である。それらは、ＴＡＬエフェクターのＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメイン（ＤＮＡ鎖を切断するヌクレアーゼ）に融合させることによって作製される。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、特定の位置におけるＤＮＡ切断を促進するために、所望のＤＮＡ配列に結合するよう操作が可能である（例えば、Ｂｏｃｈ，２０１１，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈを参照のこと）。制限酵素は、操作ヌクレアーゼを用いたゲノム編集として知られる技術である、インサイチュでの遺伝子編集またはゲノム編集に使用するために、細胞内に導入され得る。そのような方法及びそこでの使用のための組成物は、当該技術分野で知られている。例えば、その内容が本明細書によりその全体が組み込まれるＷＯ２０１９１４７８０５、ＷＯ２０１４０４０３７０、ＷＯ２０１８０７３３９３を参照のこと。
いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムは、ジンクフィンガーシステムである。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーのＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることによって生成される人工制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、特定の所望のＤＮＡ配列を標的とし、ジンクフィンガーヌクレアーゼが複雑なゲノム内部の固有配列を標的とすることができるよう操作が可能である。ＺＦＮでは切断ドメインとしてＩＩ型制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩからの非特異的切断ドメインが典型的に使用される。切断は、内在性ＤＮＡ修復機構によって修復され、ことによりＺＦＮは高等生物のゲノムを正確に変化させることが可能になる。そのような方法及びそこでの使用のための組成物は、当該技術分野で知られている。例えば、その内容が本明細書によりその全体が組み込まれるＷＯ２０１１０９１３２４を参照のこと。
好ましい実施形態では、開示される組成物は、Ｃａｓヌクレアーゼ等のＤＮＡ切断物質をコードするｍＲＮＡを含む。特定の実施形態では、開示される組成物は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９等のクラス２ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質」は、ＤＮＡを結合及び切断する活性を有するポリペプチドもしくはポリペプチド複合体、またはそのような複合体のＤＮＡ結合サブユニットを意味し、ここで、ＤＮＡ結合活性は配列特異的であり、ｓｓＤＮＡ切断もしくはｄｓＤＮＡ切断を導入することができるＲＮＡ配列に依存する。例示的ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質としては、Ｃａｓクリベース／ニッカーゼ及びそれらの不活性化形態（「ｄＣａｓ ＤＮＡ切断物質」）が挙げられる。本明細書で使用される場合、「Ｃａｓヌクレアーゼ」は、Ｃａｓクリベース、Ｃａｓニッカーゼ、及びｄＣａｓ ＤＮＡ切断物質を包含する。Ｃａｓクリベース／ニッカーゼ及びｄＣａｓ ＤＮＡ切断物質には、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＣｓｍ複合体もしくはＣｍｒ複合体、それらのサブユニットであるＣａｓ１０、Ｃｓｍ１、もしくはＣｍｒ２、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＣａｓｃａｄｅ複合体、そのＣａｓ３サブユニット、及びクラス２Ｃａｓヌクレアーゼが含まれる。本明細書で使用される場合、「クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ」は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断活性のある一本鎖ポリペプチドである。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼには、ＲＮＡ誘導型のＤＮＡクリベースまたはニッカーゼ活性をさらに有するクラス２Ｃａｓクリベース／ニッカーゼ（例えば、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８６３Ａバリアント）、及びクリベース／ニッカーゼ活性が不活性化されているクラス２ｄＣａｓ ＤＮＡ切断物質が含まれる。本明細書に記載のＬＮＰ組成物と共に使用され得るクラス２Ｃａｓヌクレアーゼとしては、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＨＦ Ｃａｓ９（例えば、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａバリアント）、ＨｙｐａＣａｓ９（例えば、Ｎ６９２Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｈ６９８Ａバリアント）、ｅＳＰＣａｓ９（１．０）（例えば、Ｋ８１０Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａバリアント）、及びｅＳＰＣａｓ９（１．１）（例えば、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａバリアント）といったタンパク質及びそれらの修飾型が挙げられる。Ｃｐｆ１タンパク質（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３：１-１３（２０１５））はＣａｓ９と相同であり、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含有する。ＺｅｔｓｃｈｅのＣｐｆ１配列は、参照によりその全体が組み込まれる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅの表２及び４を参照のこと。例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３（１１）：７２２-３６（２０１５）；Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６０：３８５-３９７（２０１５）を参照のこと。
Ｃａｓヌクレアーゼが由来し得る非限定的な例示的種としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、及びＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａが挙げられる。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓからのＣａｓ９ヌクレアーゼである。他の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからのＣａｓ９ヌクレアーゼである。さらに他の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓからのＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓからのＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａからのＣｐｆ１ヌクレアーゼである。他の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．からのＣｐｆ１ヌクレアーゼである。さらに他の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６からのＣｐｆ１ヌクレアーゼである。さらなる実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ 、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、またはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅからのＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅからのＣｐｆ１ヌクレアーゼである。
野生型Ｃａｓ９は、２つのヌクレアーゼドメイン、すなわち、ＲｕｖＣ及びＨＮＨを有する。ＲｕｖＣドメインは非標的ＤＮＡ鎖を切断し、ＨＮＨドメインはＤＮＡの標的鎖を切断する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、複数のＲｕｖＣドメイン及び／または複数のＨＮＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは野生型Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡ内に二本鎖切断を誘導することができる。他の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ｄｓＤＮＡを切断する場合もあれば、ｄｓＤＮＡのうち一本鎖を切断する場合もあり、また、ＤＮＡクリベース活性またはニッカーゼ活性を有していない場合もある。いくつかの実施形態では、ｄｓＤＮＡ切断を生じさせるために２つのニッカーゼが組み合わせられる。
いくつかの実施形態では、キメラＣａｓヌクレアーゼ等のＣａｓヌクレアーゼが使用され、その場合、タンパク質の１つのドメインまたは領域が、異なるタンパク質の部分、例えば、異種ポリペプチドに融合しており、任意に、キメラＣａｓ９のＣａｓヌクレアーゼ部分と異種機能ドメイン部分の間にリンカーポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１等の異なるヌクレアーゼからのドメインに、例えばリンカーを介して、融合され得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ニッカーゼまたはｄＣａｓ９等の修飾ヌクレアーゼであり得る。
他の実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓニッカーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムからのものであり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＣａｓｃａｄｅ複合体の成分であり得る。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＣａｓ３タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムからのものであり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲＮＡ切断活性を有し得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質は一本鎖ニッカーゼ活性を有する、すなわち、１本のＤＮＡ鎖を切断して「ニック」としても知られる単鎖切断を生じさせることができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質は、Ｃａｓニッカーゼを含む。ニッカーゼは、ｄｓＤＮＡにニックを作成する、すなわち、ＤＮＡ二重らせんのうち１本の鎖を切断するが、もう１本の鎖は切断しない酵素である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、前述のＣａｓヌクレアーゼ）の変形であり、エンドヌクレアーゼによる分解活性部位が、例えば、触媒ドメイン内の１つ以上の変化（例えば、点変異）によって不活性化されている。Ｃａｓニッカーゼ及び例示的触媒ドメインの改変に関する考察については、例えば、米国特許第８，８８９，３５６号を参照のこと。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼ等のＣａｓニッカーゼは、不活性化されたＲｕｖＣドメインまたはＨＮＨドメインを有する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質は、機能的ヌクレアーゼドメインを１つのみ含有するよう修飾される。例えば、切断物質のタンパク質は、ヌクレアーゼドメインのうちの１つを変異させるかまたは完全もしくは部分的に欠失させてその核酸切断活性を低下させるよう修飾され得る。いくつかの実施形態では、活性が低下したＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態では、不活性ＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態では、活性が低下したＨＮＨドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態では、不活性ＨＮＨドメインを有するニッカーゼが使用される。
いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ活性を低下または変化させるために、Ｃａｓタンパク質ヌクレアーゼドメイン内の保存されたアミノ酸が置換される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインにアミノ酸置換を含み得る。ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的アミノ酸置換としては、Ｄ１０Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ Ｏｃｔ ２２：１６３（３）：７５９-７７１を参照のこと。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインにアミノ酸置換を含み得る。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的アミノ酸置換としては、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８３Ａ、及びＤ９８６Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）を参照のこと。さらなる例示的アミノ酸置換としては、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、及びＤ１２５５Ａ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２ Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ-Ａ０Ｑ７Ｑ２（ＣＰＦ１＿ＦＲＡＴＮ）に基づく）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ニッカーゼをコードするｍＲＮＡは、標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖にそれぞれ相補的な１対のガイドＲＮＡと組み合わせて提供される。この実施形態では、ガイドＲＮＡは、ニッカーゼを標的配列へと導き、標的配列の反対鎖にニックを生じさせることによりＤＳＢを導入する（すなわち、ダブルニッキング）。いくつかの実施形態では、ダブルニッキングの使用により、特異性が改善され、オフターゲット作用が低減され得る。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡにダブルニックを生成するために、ＤＮＡの反対鎖を標的にする２つの別々のガイドＲＮＡと共にニッカーゼを使用する。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡにダブルニックを生成するために、近接するよう選択された２つの別々のガイドＲＮＡと共にニッカーゼを使用する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼ等のニッカーゼを、デアミナーゼポリペプチド等の異種機能ドメインに融合させる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質は、クリベース活性及びニッカーゼ活性を欠く。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質は、ｄＣａｓ ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む。ｄＣａｓポリペプチドは、ＤＮＡ結合活性は有するが、触媒（クリベース／ニッカーゼ）活性を本質的に欠いている。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓポリペプチドは、ｄＣａｓ９ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、クリベース活性及びニッカーゼ活性を欠くＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質またはｄＣａｓ ＤＮＡ結合ポリペプチドは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、前述のＣａｓヌクレアーゼ）の変形であり、そのエンドヌクレアーゼによる分解活性部位が、例えば、その触媒ドメイン内の１つ以上の変化（例えば、点変異）によって不活性化されている。例えば、ＵＳ２０１４／０１８６９５８Ａ１、ＵＳ２０１５／０１６６９８０Ａ１を参照のこと。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質は、１つ以上の異種機能ドメイン（例えば、融合ポリペプチドであるかまたはそれを含む）を含む。
いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、細胞の核内へのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質の輸送を促進し得る。例えば、異種機能ドメインは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）であり得る。
いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質の細胞内半減期を改変する能力があり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質の半減期が延長され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質の半減期が短縮され得る。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質の安定性を高める能力があり得る。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質の安定性を低下させる能力があり得る。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、タンパク質分解のためのシグナルペプチドとして作用し得る。いくつかの実施形態では、タンパク質分解は、例えば、プロテアソーム、リソソームプロテアーゼ、またはカルパインプロテアーゼ等の、タンパク質分解酵素によって媒介され得る。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＰＥＳＴ配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質は、ユビキチン鎖またはポリユビキチン鎖の付加により修飾され得る。いくつかの実施形態では、ユビキチンは、ユビキチン様タンパク質（ＵＢＬ）であり得る。ユビキチン様タンパク質の非限定的な例としては、低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、ユビキチン交差反応性タンパク質（ＵＣＲＰ、インターフェロン刺激依存性（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ）遺伝子-１５（ＩＳＧ１５）としても知られる）、ユビキチン関連修飾因子１（ＵＲＭ１）、神経前駆細胞で発現される発達過程で下方制御されるタンパク質-８（ｎｅｕｒｏｎａｌ-ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ-ｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ-８；ＮＥＤＤ８、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅではＲｕｂ１とも呼ばれる）、ヒト白血球抗原Ｆ関連（ＦＡＴ１０）、オートファジー-８（ＡＴＧ８）及びオートファジー-１２（ＡＴＧ１２）、Ｆａｕユビキチン様タンパク質（ＦＵＢ１）、膜アンカー型ＵＢＬ（ＭＵＢ）、ユビキチンフォールド修飾因子-１（ＵＦＭ１）、及びユビキチン様タンパク質-５（ＵＢＬ５）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、マーカードメインであり得る。マーカードメインの非限定的な例としては、蛍光タンパク質、精製タグ、エピトープタグ、及びレポーター遺伝子配列が挙げられる。いくつかの実施形態では、マーカードメインは、蛍光タンパク質であり得る。好適な蛍光タンパク質の非限定的な例としては、ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ-２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｓｆＧＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、単量体Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ-ｓａｐｐｈｉｒｅ、）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ-Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ-Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ-Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ-Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、及びオレンジ色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ-Ｏｒａｎｇｅ、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ-Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）または他の任意の好適な蛍光タンパク質が挙げられる。他の実施形態では、マーカードメインは、精製タグ及び／またはエピトープタグであり得る。非限定的な例示的タグとしては、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ-Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ-Ｇ、６×Ｈｉｓ、８×Ｈｉｓ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、ポリ-Ｈｉｓ、及びカルモジュリンが挙げられる。非限定的な例示的レポーター遺伝子としては、グルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ-ガラクトシダーゼ、ベータ-グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、または蛍光タンパク質が挙げられる。
追加の実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質を特定の細胞小器官、細胞種、組織、または器官に指向させ得る。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質をミトコンドリアに指向させ得る。
さらなる実施形態では、異種機能ドメインは、エディタードメイン等のエフェクタードメインであり得る。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質がその標的配列に配向される場合、例えば、ＣａｓヌクレアーゼがｇＲＮＡによって標的配列に配向される場合、エディタードメイン等のエフェクタードメインは、標的配列を修飾するかまたはそれに影響を与え得る。いくつかの実施形態では、エディタードメイン等のエフェクタードメインは、核酸結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン（例えば、非Ｃａｓヌクレアーゼドメイン）、エピジェネティック修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写抑制因子ドメインから選択され得る。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＦｏｋＩヌクレアーゼ等のヌクレアーゼである。例えば、米国特許第９，０２３，６４９号を参照のこと。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、転写活性化因子または転写抑制因子である。例えば、Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ａｓ ａｎ ＲＮＡ-ｇｕｉｄｅｄ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ-ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，”Ｃｅｌｌ １５２：１１７３-８３（２０１３）、Ｐｅｒｅｚ-Ｐｉｎｅｒａ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮＡ-ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ-Ｃａｓ９-ｂａｓｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ，”Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １０：９７３-６（２０１３）、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，“ＣＡＳ９ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｐａｉｒｅｄ ｎｉｃｋａｓｅｓ ｆｏｒ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，”Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：８３３-８（２０１３）、Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，“ＣＲＩＳＰＲ-ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｏｄｕｌａｒ ＲＮＡ-ｇｕｉｄｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ，”Ｃｅｌｌ １５４：４４２-５１（２０１３）を参照のこと。したがって、本質的に、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質が、ガイドＲＮＡを使用して所望の標的配列と結合するよう配向され得る転写因子になる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、脱メチル化ドメインまたはメチルトランスフェラーゼドメイン等のメチル化ドメインである。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、塩基編集ドメイン等のＤＮＡ修飾ドメインである。特定の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、デアミナーゼドメイン等の、特定の修飾を導入する核酸編集ドメインである。例えば、ＷＯ２０１５／０８９４０６、ＵＳ２０１６／０３０４８４６を参照のこと。ＷＯ２０１５／０８９４０６及びＵ．Ｓ．２０１６／０３０４８４６に記載の核酸編集ドメイン、デアミナーゼドメイン、及びＣａｓ９バリアントは、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質またはＣａｓ９ニッカーゼ等のＣａｓニッカーゼは、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ（Ａ３Ａ）等のＡＰＯＢＥＣ３デアミナーゼである。いくつかの実施形態では、Ａ３Ａは、ヒトＡ３Ａである。いくつかの実施形態では、Ａ３Ａは、野生型Ａ３Ａである。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質はエディターを含む。例示的なエディターはＢＣ２２ｎであり、これは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ-Ｄ１０Ａ Ｃａｓ９ニッカーゼにＸＴＥＮリンカーによって融合されたＨ．ｓａｐｉｅｎｓ ＡＰＯＢＥＣ３Ａを含む。いくつかの実施形態では、エディターは、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（「ＵＧＩ」）と共に提供される。いくつかの実施形態では、エディターはＵＧＩに融合している。いくつかの実施形態では、エディターをコードするｍＲＮＡとＵＧＩをコードするｍＲＮＡは一緒にＬＮＰ組成物に製剤化される。他の実施形態では、エディターとＵＧＩは、別々のＬＮＰ組成物で提供される。
ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質は、ガイドＲＮＡ（「ｇＲＮＡ」）と相互作用する少なくとも１つのドメインを含み得る。さらに、それは、ｇＲＮＡによって標的配列に配向され得る。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼシステムでは、ｇＲＮＡは、ヌクレアーゼ及び標的配列と相互作用して、標的配列への結合を導く。いくつかの実施形態では、標的切断に対する特異性をｇＲＮＡが提供し、ヌクレアーゼは汎用性であってよく、様々な標的配列を切断するために様々なｇＲＮＡと対形成され得る。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼは、上掲の、型、オルソログ、及び例示的種のｇＲＮＡ足場構造と対形成し得る。
本明細書で使用される場合、「リボ核タンパク質」（ＲＮＰ）または「ＲＮＰ複合体」とは、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓクリベース、Ｃａｓニッカーゼ、またはｄＣａｓ９融合タンパク質等のｄＣａｓ ＤＮＡ切断物質のようなＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質（例えば、Ｃａｓ９）と一緒になったｇＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９等のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質を標的配列に誘導し、標的配列に対してｇＲＮＡがハイブリダイズし、当該切断物質が結合するが、当該切断物質がクリベースまたはニッカーゼである場合は、結合の後に切断またはニッキングが生じ得る。
本開示のいくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物用のカーゴには、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９等のＣａｓヌクレアーゼ）であり得るＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質を標的ＤＮＡへと導くガイド配列を含む少なくとも１つのｇＲＮＡが含まれる。ｇＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼまたはクラス２Ｃａｓヌクレアーゼを標的核酸分子上の標的配列へと誘導し得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、クラス２Ｃａｓヌクレアーゼと結合して、かかるヌクレアーゼによる切断の特異性を提供する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡとＣａｓヌクレアーゼは、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体等のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体を形成し得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体であり得る。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体は、Ｃｐｆ１／ｇＲＮＡ複合体等のＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体であり得る。Ｃａｓヌクレアーゼ及び対応するｇＲＮＡが対にされ得る。各クラス２Ｃａｓヌクレアーゼと対形成するｇＲＮＡ足場構造は、個々のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって異なる。
「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、及び単に「ガイド」は、本明細書では同じ意味で使用され、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質のための対応するガイド核酸を指す。ガイドＲＮＡには、本明細書に記載のような修飾ＲＮＡが含まれ得る。ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡとしても知られる）、またはｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡとしても知られる）の組み合わせのいずれでもあり得る。ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、単一ＲＮＡ分子として会合している（単一ガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）場合もあれば、任意に共有結合で連結された、２つ以上の別々のＲＮＡ分子（二重ガイドＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ）の場合もある。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」はそれぞれの型を指す。ｔｒＲＮＡは、天然に存在する配列であっても、または天然に存在する配列と比較して修飾または変形を有するｔｒＲＮＡ配列であってもよい。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質をコードするｍＲＮＡは第１のＬＮＰ組成物に製剤化され、ｇＲＮＡ核酸が第２のＬＮＰ組成物に製剤化される。いくつかの実施形態では、第１及び第２の脂質核酸集合体組成物は、同時に投与される。他の実施形態では、第１及び第２の脂質核酸集合体組成物は、逐次投与される。いくつかの実施形態では、第１及び第２の脂質核酸集合体組成物は、プレインキュベーションステップの前に組み合わせられる。他の実施形態では、第１及び第２の脂質核酸集合体組成物は、別々にプレインキュベートされる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物及び方法には、修飾ＲＮＡを伴う。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物及び方法には、ガイドＲＮＡ核酸を伴う。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物及び方法には、ｄｇＲＮＡまたは修飾ｇＲＮＡ等のｇＲＮＡを伴う。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質をコードするｍＲＮＡを含むいくつかの組成物では、組成物はさらに、ｇＲＮＡ等のｇＲＮＡ核酸を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物及び方法には、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質及びｇＲＮＡを伴う。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物及び方法には、ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びｇＲＮＡ、例えば、クラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを伴う。
いくつかの実施形態では、カーゴは、ＤＮＡ分子を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸は、ｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムからの反復配列の全部または一部が隣接する標的指向性配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含み得る。ある特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、２つの別々の核酸によってコードされ得る。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、単一核酸によってコードされ得る。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、単一核酸の反対鎖によってコードされ得る。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、単一核酸の同一鎖によってコードされ得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ核酸はｓｇＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ核酸はＣａｓ９ヌクレアーゼｓｇＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ核酸はＣｐｆ１ヌクレアーゼｓｇＲＮＡをコードする。
ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、プロモーター、３’ＵＴＲ、または５’ＵＴＲ等の少なくとも１つの転写性もしくは調節性の制御配列に機能的に連結され得る。一例では、プロモーターは、ｔＲＮＡプロモーター、例えば、ｔＲＮＡＬｙｓ３、またはｔＲＮＡキメラであり得る。Ｍｅｆｆｅｒｄ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ．２０１５ ２１：１６８３-９、Ｓｃｈｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００７ ３５：２６２０-２６２８を参照のこと。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）によって認識され得る。Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの非限定的な例として、Ｕ６プロモーター及びＨ１プロモーターも挙げられる。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトのＵ６プロモーターに機能的に連結され得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ核酸は修飾核酸である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ核酸としては、修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチドが挙げられる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ核酸には５’末端修飾が含まれ、例えば、核酸を安定化させ、かつ、核酸の組み込みを妨げるよう修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチドが含まれる。他の実施形態では、ｇＲＮＡ核酸は、各鎖に５’末端修飾を有する二本鎖ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ核酸には、５’末端修飾として逆位ジデオキシ-Ｔまたは逆位脱塩基ヌクレオシドもしくはヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ核酸には、ビオチン、デスチオビオチン-ＴＥＧ、ジゴキシゲニン、ならびに蛍光マーカー、例えば、ＦＡＭ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ等のような標識が含まれる。
本明細書で使用される場合、「ガイド配列」とは、標的配列に相補的であり、かつＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質が結合または修飾（例えば、切断）するためにｇＲＮＡを標的配列へと導くよう機能する、ｇＲＮＡ内の配列を指す。「ガイド配列」は、「標的指向配列」、または「スペーサー配列」とも呼ばれ得る。ガイド配列は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（すなわち、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）及び関連Ｃａｓ９相同体／オルソログの場合、長さが２０塩基対であり得る。それより短いかまたは長い配列、例えば、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、または２５ヌクレオチド長の配列もガイドとして使用され得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、例えば遺伝子内または染色体上にあり、ガイド配列に相補的である。いくつかの実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列の間の相補性または同一性の程度は、約または少なくとも、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％であり得る。いくつかの実施形態では、ガイド配列及び標的領域は、ヌクレオチドが少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０連続する領域にわたり、１００％相補的または同一であり得る。他の実施形態では、ガイド配列及び標的領域は、少なくとも１つのミスマッチを含有し得る。例えば、ガイド配列及び標的配列は、１つ、２つ、３つ、または４つのミスマッチを含有し得、その場合、標的配列の全長は、少なくとも１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の塩基対である。いくつかの実施形態では、ガイド配列及び標的領域は、１～４のミスマッチを含有し得、その場合、ガイド配列は、少なくとも１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイド配列及び標的領域は、１つ、２つ、３つ、または４つのミスマッチを含有し得、その場合、ガイド配列は２０のヌクレオチドを含む。
ある特定の実施形態では、複数のＬＮＰ組成物が、協働的に、及び／または別々の目的のために使用され得る。いくつかの実施形態では、細胞を、本明細書に記載の第１及び第２のＬＮＰ組成物と接触させてよい。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＬＮＰ組成物は、それぞれ独立して、例えば、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、及びｇＲＮＡ核酸のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＬＮＰ組成物は、同時に投与される。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＬＮＰ組成物は、逐次投与される。
いくつかの実施形態では、細胞内で複数のゲノム編集を生成する方法が提供される、（本明細書及び他の箇所で「マルチプレックスを行う」または「マルチプレックス遺伝子編集」または「マルチプレックスゲノム編集」と称されることもある）。単一細胞内に複数の属性を操作する性能は、生存能及び所望の細胞表現型を保持しつつ、ノックアウト及び遺伝子座内（ｉｎ ｌｏｃｕｓ）挿入等の、複数の標的遺伝子における編集を効率的に行う能力に依存する。いくつかの実施形態では、方法は、細胞をインビトロで培養すること、細胞を２つ以上の脂質核酸集合体組成物と接触させることであって、各脂質核酸集合体組成物が、標的部位を編集することができる核酸ゲノム編集ツールを含む、接触させること、及び細胞をインビトロで増殖させること、を含む。方法により、複数のゲノム編集を有する細胞が生じ、ここで、ゲノム編集は異なっている。ある特定の実施形態では、第１のＬＮＰ組成物は第１のｇＲＮＡを含み、第２のＬＮＰ組成物は第２のｇＲＮＡを含み、第１のｇＲＮＡ及び第２のｇＲＮＡは、異なる標的に相補的な異なるガイド配列を含む。そのような実施形態では、ＬＮＰ組成物により、マルチプレックス遺伝子編集が可能になり得る。
Ｃａｓタンパク質等のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断タンパク質の標的配列には、Ｃａｓタンパク質の核酸基質が二本鎖核酸であることから、ゲノムＤＮＡのプラス鎖とマイナス鎖（すなわち、所与の配列とその配列の逆相補鎖）の両方が含まれる。したがって、ガイド配列が「標的配列に相補的である」という場合には、ガイド配列は、ｇＲＮＡが標的配列の逆相補鎖に結合するよう導き得ることを理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態では、ガイド配列が標的配列の逆相補鎖と結合する場合、そのガイド配列は、ガイド配列中のＴのＵへの置換を除き、標的配列（例えば、ＰＡＭを含まない標的配列）の特定のヌクレオチドと同一である。
標的指向配列の長さは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム及び使用される成分に応じて異なり得る。例えば、異なる細菌種からの異なるクラス２Ｃａｓヌクレアーゼは、最適な標的指向配列長が異なる。したがって、標的指向配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または５０超のヌクレオチド長を構成し得る。いくつかの実施形態では、標的指向配列長は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのガイド配列よりも、０、１、２、３、４、または５ヌクレオチド長いかまたは短い。ある特定の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ足場は、同じＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来する。いくつかの実施形態では、標的指向配列は、１８～２４ヌクレオチドを含むかまたはそれからなり得る。いくつかの実施形態では、標的指向配列は、１９～２１ヌクレオチドを含むかまたはそれからなり得る。いくつかの実施形態では、標的指向配列は、２０ヌクレオチドを含むかまたはそれからなり得る。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質によるＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断を媒介することができる「Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡ」である。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｃｐｆ１タンパク質によるＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断を媒介することができる「Ｃｐｆ１ ｓｇＲＮＡ」である。ある特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質との活性複合体を形成してＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断を媒介するのに十分な、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。ある特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃｐｆ１タンパク質との活性複合体を形成し、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断を媒介するのに十分なｃｒＲＮＡを含む。Ｚｅｔｓｃｈｅ ２０１５を参照のこと。
ある特定の実施形態ではまた、本明細書に記載のｇＲＮＡをコードする核酸、例えば、発現カセットが提供される。「ガイドＲＮＡ核酸」は、本明細書では、ｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡ）、及び１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸であるｇＲＮＡ発現カセットを指すために使用される。
修飾ＲＮＡ
ある特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物等の脂質組成物は、修飾ＲＮＡ等の修飾核酸を含む。
修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、ｇＲＮＡまたはｍＲＮＡ中に存在し得る。１つ以上の修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチドを含むｇＲＮＡまたはｍＲＮＡは、例えば、「修飾」ＲＮＡと呼ばれ、標準残基のＡ、Ｇ、Ｃ、及びＵの代わりかもしくは追加で使用される、天然に存在しない成分もしくは構成及び／または天然に存在する成分もしくは構成が１つ以上存在することを表す。いくつかの実施形態では、修飾ＲＮＡは、非標準のヌクレオシドまたはヌクレオチドを用いて合成され、これを本明細書では「修飾される」と言う。
修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドには、以下のうちの１つ以上が含まれ得る：（ｉ）ホスホジエステル骨格の結合におけるリン酸の非結合酸素の一方もしく両方及び／またはリン酸の結合酸素のうちの１つ以上、の変化、例えば、置き換え（例示的な骨格修飾）、（ｉｉ）リボース糖の成分、例えば、リボース糖の２’位のヒドロキシル、の変化、例えば、置き換え（例示的な糖修飾）、（ｉｉｉ）「デホスホ」リンカーでのリン酸部分の大幅な置き換え（例示的な骨格修飾）、（ｉｖ）非標準核酸塩基を用いる等の、天然に存在する核酸塩基の修飾または置き換え（例示的な塩基修飾）、（ｖ）リボース-リン酸骨格の置き換えまたは修飾（例示的な骨格修飾）、（ｖｉ）ポリヌクレオチドの３’末端もしくは５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾もしくは置き換えまたは部分、キャップもしくはリンカーのコンジュゲーション（そのような３’もしくは５’のキャップ修飾は、糖及び／または骨格の修飾を含み得る）、ならびに（ｖｉｉ）糖の修飾または置き換え（例示的な糖修飾）。ある特定の実施形態は、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、または核酸に対する５’末端修飾を含む。ある特定の実施形態は、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、または核酸に対する修飾を含む。ある特定の実施形態は、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、または核酸に対する３’末端修飾を含む。修飾ＲＮＡは、５’末端及び３’末端の修飾を含有することができる。修飾ＲＮＡは、末端以外の位置にて１つ以上の修飾残基を含有することができる。ある特定の実施形態では、ｇＲＮＡには、少なくとも１つの修飾残基が含まれる。ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡには、少なくとも１つの修飾残基が含まれる。ある特定の実施形態では、修飾ｇＲＮＡは、５’末端の最初の５ヌクレオチドのうちの１つ以上にて修飾を含む。ある特定の実施形態では、修飾ｇＲＮＡは、５’末端の最初の５ヌクレオチドのうちの１つ以上にて修飾を含む。修飾ｇＲＮＡが、３’末端の最後の５ヌクレオチドのうちの１つ以上にて修飾を含む、請求項５２または５３に記載のＬＮＰ組成物。
未修飾核酸は、例えば、細胞内ヌクレアーゼまたは血清中に見られるヌクレアーゼによって分解されやすい可能性がある。例えば、ヌクレアーゼは、核酸のホスホジエステル結合を加水分解することができる。したがって、一態様では、本明細書に記載のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ）は、例えば、細胞内または血清にあるヌクレアーゼに対する安定性を導入するために、１つ以上の修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチドを含有することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＲＮＡ分子は、インビボ及びエクスビボのいずれにおいても、細胞の集団に導入された場合に自然免疫応答の低下を示すことができる。「自然免疫応答」という用語には、サイトカイン、特にインターフェロンの発現及び放出、ならびに細胞死の誘導を伴う、一本鎖核酸等の外来性核酸に対する細胞応答が含まれる。
したがって、いくつかの実施形態では、ＲＮＡまたは核酸は、安定性の向上または増強、例えば、インビボでのヌクレアーゼによる消化に対する耐性改善等、を核酸に付与する少なくとも１つの修飾を含む。本明細書で使用される場合、「修飾」及び「修飾された」という用語は、本明細書で提供される核酸に関連することから、かかる用語には好ましくは、安定性を増強させ、ＲＮＡまたは核酸を、そのＲＮＡまたは核酸の野生型または天然に存在する型よりも安定にする（例えば、ヌクレアーゼによる消化に対して耐性にする）少なくとも１つの変化が含まれる。本明細書で使用される場合、「安定な」及び「安定性」という用語、及びかかる用語が本明細書に記載の核酸に関する、特にＲＮＡに関する場合は、例えば、通常そのようなＲＮＡの分解能があるヌクレアーゼ（すなわち、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ）等による、分解に対する耐性の増加または増強を指す。安定性の向上には、例えば、加水分解あるいは内在性酵素（例えば、エンドヌクレアーゼもしくはエキソヌクレアーゼ）または標的細胞もしくは標的組織の内部の条件による他の破壊に対して感受性がより低いこと、それにより、標的である細胞、組織、対象及び／または細胞質におけるそのようなＲＮＡもしくは核酸の滞留が延長もしくは増強されることが含まれ得る。本明細書で提供される安定化されたＲＮＡまたは核酸分子は、天然に存在する未修飾のＲＮＡまたは核酸分子（例えば、分子の野生型バージョン）と比べて、より長い半減期を示す。「修飾」及び「修飾」という用語は、本明細書に開示されるＬＮＰ組成物のｍＲＮＡに関連していることから、かかる用語により、例えば、タンパク質翻訳の開始において機能する配列（例えば、コザックコンセンサス配列）を含めること等の、ｍＲＮＡ核酸の翻訳を改善または増強させる変化も企図される。（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５（２０）：８１２５-４８（１９８７））。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡまたは核酸には、より安定になるよう化学的または生物学的な修飾が行われている。ＲＮＡまたは核酸に対する例示的修飾としては、塩基の除去（例えば、あるヌクレオチドの欠失によるかまたは別のヌクレオチドへの置換によるもの）または塩基の修飾、例えば、塩基の化学修飾が挙げられる。本明細書で使用される「化学修飾」という表現には、天然に存在するＲＮＡまたは核酸において見られる化学とは異なる化学を導入する修飾、例えば、修飾ヌクレオチドの導入等の共有結合による修飾（例えば、ヌクレオチド類似体、またはそのようなＲＮＡ（デオキシヌクレオシド等）もしくは核酸分子には天然では見出されないペンダント基を含めること）が含まれる。
骨格修飾のいくつかの実施形態では、修飾残基のリン酸基は、酸素のうちの１つ以上を異なる置換基で置き換えることによって修飾され得る。さらに、修飾残基、例えば、修飾核酸中に存在する修飾残基には、未修飾リン酸部分を本明細書に記載のような修飾リン酸基で大幅に置き換えることが含まれ得る。いくつかの実施形態では、リン酸骨格の骨格修飾には、非荷電リンカーまたは電荷分布が非対称的な荷電リンカーのいずれかをもたらす変化が含まれ得る。
修飾リン酸基の例には、ホスホロチオアート、ホスホロセレナート、ボラノリン酸、ボラノホスファート、水素ホスホナート、ホスホロアミダート、アルキルホスホナートまたはアリールホスホナート及びホスホトリエステルが含まれる。未修飾リン酸基のリン原子はアキラルである。しかしながら、非架橋酸素のうちの１つを上記の原子または原子団で置き換えることにより、リン原子をキラルにすることができる。不斉リン原子は、「Ｒ」立体配置（本明細書ではＲｐ）または「Ｓ」立体配置（本明細書ではＳｐ）のいずれも有することができる。骨格はまた、架橋酸素（すなわち、ヌクレオシドにリン酸基を連結する酸素）を、窒素（架橋ホスホロアミダート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）及び炭素（架橋メチレンホスホナート）で置き換えることによっても修飾され得る。置き換えは、連結酸素のいずれか、または連結酸素の両方において起こり得る。特定の骨格修飾では、リン酸基をリン不含コネクターに置き換えることができる。いくつかの実施形態では、荷電リン酸基を中性部分に置き換えることができる。リン酸基に取って代わることができる部分の例としては、限定することなく、例えば、メチルホスホナート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カルボナート、カルボキシメチル、カルバマート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホナート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ及びメチレンオキシメチルイミノを挙げることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物または製剤は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼまたは本明細書に記載のようなクラス２Ｃａｓヌクレアーゼ等のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合物質をコードするＯＲＦ等を含むｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼまたはクラス２Ｃａｓヌクレアーゼ等のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合物質をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡが、提供、使用、または投与される。いくつかの実施形態では、ＯＲＦはコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合物質をコードするＯＲＦは、「修飾ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合物質ＯＲＦ」または単に「修飾ＯＲＦ」であり、ＯＲＦが、以下の方法のうち１つ以上の方法で修飾されていることを示す簡略表現として使用される：（１）修飾ＯＲＦが、その最小ウリジン含量から最小ウリジン含量の１５０％までの範囲のウリジン含量を有する、（２）修飾ＯＲＦが、その最小ウリジンジヌクレオチド含量から最小ウリジンジヌクレオチド含量の１５０％までの範囲のウリジンジヌクレオチド含量を有する、（３）修飾ＯＲＦがコドンのセットからなっており、そのコドンのうち少なくとも７５％が所与のアミノ酸について最小ウリジンコドン（複数可）、例えば、ウリジンが最も少ないコドン（複数可）（通常は０または１つであるが、例外として、フェニルアラニンのコドンは最小ウリジンコドンにウリジンを２つ有する）である、または（４）修飾ＯＲＦが少なくとも１つの修飾ウリジンを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＯＲＦは、上述の方法のうち少なくとも２つ、３つ、または４つの方法で修飾される。いくつかの実施形態では、修飾ＯＲＦは、少なくとも１つの修飾ウリジンを含み、上記（１）～（３）のうち、少なくとも１つ、２つ、３つ、または全部で修飾されている。
「修飾ウリジン」は、本明細書では、水素結合受容体がウリジンの場合と同じであり、かつ、ウリジンとの構造上の違いが１つ以上ある、チミジン以外のヌクレオシドを指すために使用される。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、置換ウリジン、すなわち、１つ以上の非プロトン置換基（例えば、メトキシ等のアルコキシ）がプロトンに取って代わるウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンはプソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、置換プソイドウリジン、すなわち、１つ以上の非プロトン置換基（例えば、メチル等のアルキル）がプロトンに取って代わるプソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、置換ウリジン、プソイドウリジン、または置換プソイドウリジンのうちのいずれかである。
本明細書で使用される「ウリジン位置」とは、ウリジンまたは修飾ウリジンに占有されているポリヌクレオチド内の位置を指す。したがって、例えば、「ウリジン位置の１００％が修飾ウリジンである」ポリヌクレオチドは、それと同じ配列の従来のＲＮＡ（全塩基が標準塩基のＡ、Ｕ、Ｃ、またはＧである）ではウリジンであるはずのどの位置においても修飾ウリジンを含有する。別段に示されていない限り、本開示内または本開示に添付の配列表（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｂｌｅ）もしくは配列表（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ）に記載のポリヌクレオチド配列におけるＵは、ウリジンまたは修飾ウリジンであり得る。

Figure 2024516376000059
前述の実施形態のうちのいずれかでは、修飾ＯＲＦは、コドンのうち少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％が上記の最小ウリジンコドン表に記載のコドンであるコドンセットからなり得る。
前述の実施形態のうちのいずれかでは、修飾ＯＲＦは、その最小ウリジン含量から最小ウリジン含量の１５０％、１４５％、１４０％、１３５％、１３０％、１２５％、１２０％、１１５％、１１０％、１０５％、１０４％、１０３％、１０２％、または１０１％までの範囲のウリジン含量を有し得る。
前述の実施形態のうちのいずれかでは、修飾ＯＲＦは、その最小ウリジンジヌクレオチド含量から最小ウリジンジヌクレオチド含量の１５０％、１４５％、１４０％、１３５％、１３０％、１２５％、１２０％、１１５％、１１０％、１０５％、１０４％、１０３％、１０２％、または１０１％までの範囲のウリジンジヌクレオチド含量を有し得る。
前述の実施形態のうちのいずれかでは、修飾ＯＲＦは、ウリジン位置の少なくとも１つ、複数、または全部において修飾ウリジンを含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５位において、例えば、ハロゲン、メチル、またはエチルで修飾されているウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、１位において、例えば、ハロゲン、メチル、またはエチルで修飾されているプソイドウリジンである。修飾ウリジンは、例えば、プソイドウリジン、Ｎ１-メチル-プソイドウリジン、５-メトキシウリジン、５-ヨードウリジン、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは５-メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは５-ヨードウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンはプソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンはＮ１-メチル-プソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、プソイドウリジンとＮ１-メチル-プソイドウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、プソイドウリジンと５-メトキシウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、Ｎ１-メチルプソイドウリジンと５-メトキシウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５-ヨードウリジンとＮ１-メチル-プソイドウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、プソイドウリジンと５-ヨードウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５-ヨードウリジンと５-メトキシウリジンの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、本開示によるｍＲＮＡのウリジン位置のうちの少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％が修飾ウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｍＲＮＡのウリジン位置のうちの１０％～２５％、１５～２５％、２５～３５％、３５～４５％、４５～５５％、５５～６５％、６５～７５％、７５～８５％、８５～９５％、または９０～１００％が修飾ウリジン、例えば、５-メトキシウリジン、５-ヨードウリジン、Ｎ１-メチルプソイドウリジン、プソイドウリジン、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、本開示によるｍＲＮＡのウリジン位置のうちの１０％～２５％、１５～２５％、２５～３５％、３５～４５％、４５～５５％、５５～６５％、６５～７５％、７５～８５％、８５～９５％、または９０～１００％が５-メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｍＲＮＡのウリジン位置のうちの１０％～２５％、１５～２５％、２５～３５％、３５～４５％、４５～５５％、５５～６５％、６５～７５％、７５～８５％、８５～９５％、または９０～１００％がプソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｍＲＮＡのウリジン位置のうちの１０％～２５％、１５～２５％、２５～３５％、３５～４５％、４５～５５％、５５～６５％、６５～７５％、７５～８５％、８５～９５％、または９０～１００％がＮ１-メチルプソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｍＲＮＡのウリジン位置のうちの１０％～２５％、１５～２５％、２５～３５％、３５～４５％、４５～５５％、５５～６５％、６５～７５％、７５～８５％、８５～９５％、または９０～１００％が５-ヨードウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｍＲＮＡのウリジン位置のうちの１０％～２５％、１５～２５％、２５～３５％、３５～４５％、４５～５５％、５５～６５％、６５～７５％、７５～８５％、８５～９５％、または９０～１００％が５-メトキシウリジンであり、残りはＮ１-メチルプソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｍＲＮＡのウリジン位置のうちの１０％～２５％、１５～２５％、２５～３５％、３５～４５％、４５～５５％、５５～６５％、６５～７５％、７５～８５％、８５～９５％、または９０～１００％が５-ヨードウリジンであり、残りはＮ１-メチルプソイドウリジンである。
前述の実施形態のうちのいずれかでは、修飾ＯＲＦは、可能な限り低いウリジンジヌクレオチド（ＵＵ）含量等の低ウリジンジヌクレオチド含量を含み得、例えば、ＯＲＦは、（ａ）あらゆる位置で最小ウリジンコドン（上述）を使用し、（ｂ）所与のＯＲＦと同じアミノ酸配列をコードする。ウリジンジヌクレオチド（ＵＵ）含量は、ＯＲＦ内のＵＵジヌクレオチドの計数として絶対的に表されるか、またはウリジンジヌクレオチドのウリジンにより占有されている位置のパーセンテージとして比率で表され得る（例えば、ＡＵＵＡＵの場合であれば、５つの位置のうち２つがウリジンジヌクレオチドのウリジンで占められているのでウリジンジヌクレオチド含量は４０％となる）。最小ウリジンジヌクレオチド含量を評価するために、修飾ウリジン残基はウリジンと同等であるとみなされる。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、構成的に発現されたｍＲＮＡ等の発現された哺乳類ｍＲＮＡからの少なくとも１つのＵＴＲを含む。ｍＲＮＡは、健康な成体哺乳類の少なくとも１つの組織で継続的に転写されている場合、哺乳類で構成的に発現されているとみなされる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、構成的に発現された哺乳類ｍＲＮＡ等の発現された哺乳類ＲＮＡからの５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または５’と３’のＵＴＲを含む。アクチンｍＲＮＡは、構成的に発現されるｍＲＮＡの一例である。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、１７-ベータヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ４（ＨＳＤ１７Ｂ４またはＨＳＤ）からの少なくとも１つのＵＴＲ、例えば、ＨＳＤからの５’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、グロビンｍＲＮＡ、例えば、ヒトアルファグロビン（ＨＢＡ）ｍＲＮＡ、ヒトベータグロビン（ＨＢＢ）ｍＲＮＡ、またはアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）ベータグロビン（ＸＢＧ）ｍＲＮＡからの少なくとも１つのＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ＨＢＡ、ＨＢＢ、またはＸＢＧ等のグロビンｍＲＮＡからの５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または５’と３’のＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ウシ成長ホルモン、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウスＨｂａ-ａ１、ＨＳＤ、アルブミン遺伝子、ＨＢＡ、ＨＢＢ、またはＸＢＧからの５’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ウシ成長ホルモン、サイトメガロウイルス、マウスＨｂａ-ａ１、ＨＳＤ、アルブミン遺伝子、ＨＢＡ、ＨＢＢ、またはＸＢＧからの３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ウシ成長ホルモン、サイトメガロウイルス、マウスＨｂａ-ａ１、ＨＳＤ、アルブミン遺伝子、ＨＢＡ、ＨＢＢ、ＸＢＧ、熱ショックタンパク質９０（Ｈｓｐ９０）、グリセルアルデヒド３-リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ベータ-アクチン、アルファ-チューブリン、腫瘍タンパク質（ｐ５３）、または上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）からの５’と３’のＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、同じ供給源、例えば、アクチン、アルブミン、またはＨＢＡ、ＨＢＢ、もしくはＸＢＧ等のグロビン等の構成的に発現されたｍＲＮＡからの５’と３’のＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは５’ＵＴＲを含まず、例えば、５’キャップと開始コドンの間に追加のヌクレオチドはない。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５’キャップと開始コドンの間にコザック配列（以下に記載）を含むが、いかなる追加の５’ＵＴＲも有していない。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは３’ＵＴＲを含まず、例えば、終止コドンとポリＡ尾部の間に追加のヌクレオチドはない。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはコザック配列を含む。コザック配列は、翻訳開始及びｍＲＮＡから翻訳されるポリペプチドの全体としての収率に影響を与え得る。コザック配列には、開始コドンとして機能することができるメチオニンコドンが含まれる。最小コザック配列はＮＮＮＲＵＧＮであり、ここで、以下のうちの少なくとも１つが真である：第１のＮはＡまたはＧである、及び第２のＮはＧである。ヌクレオチド配列との関連において、Ｒはプリン（ＡまたはＧ）を意味する。いくつかの実施形態では、コザック配列は、ＲＮＮＲＵＧＮ、ＮＮＮＲＵＧＧ、ＲＮＮＲＵＧＧ、ＲＮＮＡＵＧＮ、ＮＮＮＡＵＧＧ、またはＲＮＮＡＵＧＧである。いくつかの実施形態では、コザック配列はｒｃｃＲＵＧｇであり、ミスマッチがゼロであるか、または小文字の位置に対するミスマッチが最大１つもしくは２つである。いくつかの実施形態では、コザック配列はｒｃｃＡＵＧｇであり、ミスマッチがゼロであるか、または小文字の位置に対するミスマッチが最大１つもしくは２つである。いくつかの実施形態では、コザック配列はｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧであり、ミスマッチがゼロであるか、または小文字の位置に対するミスマッチが最大１つ、２つ、もしくは３つである。いくつかの実施形態では、コザック配列はｇｃｃＡｃｃＡＵＧであり、ミスマッチがゼロであるか、または小文字の位置に対するミスマッチが最大１つ、２つ、３つ、もしくは４つである。いくつかの実施形態では、コザック配列はＧＣＣＡＣＣＡＵＧである。いくつかの実施形態では、コザック配列はｇｃｃｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧであり、ミスマッチがゼロであるか、または小文字の位置に対するミスマッチが最大１つ、２つ、３つ、もしくは４つである。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｍＲＮＡは、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、またはＣａｐ２等の５’キャップを含む。５’キャップは一般に、ｍＲＮＡの５’から３’方向の鎖の１番目のヌクレオチド、すなわち、第１のキャップ近位ヌクレオチドの５’位に５’-三リン酸を介して連結されている７-メチルグアニンリボヌクレオチド（これは、以下に考察するように、例えばＡＲＣＡに関して、さらに修飾され得る）である。Ｃａｐ０では、ｍＲＮＡの第１と第２のキャップ近位ヌクレオチドのリボースがいずれも２’-ヒドロキシルを含む。Ｃａｐ１では、ｍＲＮＡの第１及び第２の転写されたヌクレオチドのリボースはそれぞれ、２’-メトキシ及び２’-ヒドロキシルを含む。Ｃａｐ２では、ｍＲＮＡの第１と第２のキャップ近位ヌクレオチドのリボースがいずれも２’-メトキシを含む。例えば、Ｋａｔｉｂａｈ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１１（３３）：１２０２５-３０、Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１４（１１）：Ｅ２１０６-Ｅ２１１５を参照のこと。ヒトｍＲＮＡ等の哺乳類ｍＲＮＡを含め、高等真核生物のほとんどの内在性ｍＲＮＡはＣａｐ１またはＣａｐ２を含む。Ｃａｐ０、ならびにＣａｐ１及びＣａｐ２とは異なる他のキャップ構造は、ヒト等の哺乳類では、ＩＦＩＴ-１及びＩＦＩＴ-５等の自然免疫系の成分によって「非自己」として認識されるために免疫原性の可能性があり、これによりＩ型インターフェロン等のサイトカイン濃度の上昇が生じ得る。ＩＦＩＴ-１及びＩＦＩＴ-５等の自然免疫系の成分はまた、Ｃａｐ１またはＣａｐ２以外のキャップを有するｍＲＮＡの結合についてｅＩＦ４Ｅと競合する場合もあり、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する可能性がある。
キャップは、共転写により含めることができる。例えば、ＡＲＣＡ（アンチリバースキャップアナログ（ａｎｔｉ-ｒｅｖｅｒｓｅ ｃａｐ ａｎａｌｏｇ）；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ カタログ番号ＡＭ８０４５）は、インビトロで転写開始時に転写物に組み込み可能な、グアニンリボヌクレオチドの５’位に連結された７-メチルグアニン３’-メトキシ-５’-三リン酸を含むキャップアナログである。ＡＲＣＡは、第１のキャップ近位ヌクレオチドの２’位がヒドロキシルであるキャップのＣａｐ０をもたらす。例えば、Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２００１）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｍＲＮＡｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ‘ａｎｔｉ-ｒｅｖｅｒｓｅ’ｃａｐ ａｎａｌｏｇｓ ７-ｍｅｔｈｙｌ（３’-Ｏ-ｍｅｔｈｙｌ）ＧｐｐｐＧ ａｎｄ ７-ｍｅｔｈｙｌ（３’ｄｅｏｘｙ）ＧｐｐｐＧ，”ＲＮＡ ７：１４８６-１４９５を参照のこと。ＡＲＣＡ構造を以下に示す。
Figure 2024516376000060
Ｃａｐ１構造を共転写により得るには、ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ；ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ カタログ番号Ｎ-７１１３）またはＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＧＧ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧ；ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ カタログ番号Ｎ-７１３３）を使用することができる。ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧ及びＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＧＧの３’-Ｏ-メチル化型も、それぞれ、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓよりカタログ番号Ｎ-７４１３及びＮ-７４３３で入手可能である。ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧ構造を以下に示す。

Figure 2024516376000061
別法として、キャップを、転写後にＲＮＡに付加することができる。例えば、ワクシニアのキャッピング酵素が市販されており（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ カタログ番号Ｍ２０８０Ｓ）、これは、そのＤ１サブユニットによりもたらされるＲＮＡトリホスファターゼ活性及びグアニリルトランスフェラーゼ活性、ならびにそのＤ１２サブユニットによりもたらされるグアニンメチルトランスフェラーゼを有する。したがって、この酵素は、Ｓ-アデノシルメチオニン及びＧＴＰの存在下、Ｃａｐ０をもたらすようＲＮＡに７-メチルグアニンを付加することができる。例えば、Ｇｕｏ，Ｐ．ａｎｄ Ｍｏｓｓ，Ｂ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，４０２３-４０２７、Ｍａｏ，Ｘ．ａｎｄ Ｓｈｕｍａｎ，Ｓ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２４４７２-２４４７９を参照のこと。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはさらに、ポリアデニル化（ポリＡ）尾部を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、少なくとも２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、または１００個のアデニン、任意に最大３００個のアデニンを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、または１００個のアデニンヌクレオチドを含む。場合によっては、ポリＡ尾部は、ポリＡ尾部内の１つ以上の位置において１個以上の非アデニンヌクレオチド「アンカー」で「中断」される。ポリＡ尾部は、少なくとも８個の連続するアデニンヌクレオチドを含み得るが、１個以上の非アデニンヌクレオチドも含み得る。本明細書で使用される場合、「非アデニンヌクレオチド」とは、アデニンを含まない任意の天然または非天然のヌクレオチドを指す。グアニンヌクレオチド、チミンヌクレオチド、及びシトシンヌクレオチドは、例示的な非アデニンヌクレオチドである。したがって、本明細書に記載されるｍＲＮＡのポリＡ尾部は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合物質または目的配列をコードするヌクレオチドの３’に位置する連続アデニンヌクレオチドを含み得る。場合によっては、ｍＲＮＡのポリＡ尾部は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合物質または目的配列をコードするヌクレオチドの３’に位置する非連続アデニンヌクレオチドを含み、ここで、非アデニンヌクレオチドが、規則的または不規則な間隔でアデニンヌクレオチドを中断する。
本明細書で使用される場合、「非アデニンヌクレオチド」とは、アデニンを含まない任意の天然または非天然のヌクレオチドを指す。グアニンヌクレオチド、チミンヌクレオチド、及びシトシンヌクレオチドは、例示的な非アデニンヌクレオチドである。したがって、本明細書に記載されるｍＲＮＡのポリＡ尾部は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合物質または目的配列をコードするヌクレオチドの３’に位置する連続アデニンヌクレオチドを含み得る。場合によっては、ｍＲＮＡのポリＡ尾部は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合物質または目的配列をコードするヌクレオチドの３’に位置する非連続アデニンヌクレオチドを含み、ここで、非アデニンヌクレオチドが、規則的または不規則な間隔でアデニンヌクレオチドを中断する。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは精製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、沈殿方法（例えば、ＬｉＣｌ沈殿、アルコール沈殿、または同等の方法、例えば、本明細書に記載のような方法）を使用して精製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ＨＰＬＣを用いる方法等のクロマトグラフィーを用いる方法または同等の方法（例えば、本明細書に記載のような方法）を使用して精製される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、沈殿方法（例えば、ＬｉＣｌ沈殿）とＨＰＬＣを用いる方法の両方を使用して精製される。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｇＲＮＡは、本明細書に開示のｍＲＮＡと組み合わせて提供される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｍＲＮＡとは別々の分子として提供される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、本明細書に開示のｍＲＮＡの一部として、例えば、ＵＴＲの一部として提供される。
ｍＲＮＡ
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物または製剤は、Ｃａｓヌクレアーゼ等のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質、または本明細書に記載のようなクラス２ＣａｓヌクレアーゼのようなＤＮＡ切断物質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼまたはクラス２Ｃａｓヌクレアーゼ等のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断物質をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡが、提供、使用、または投与される。ｍＲＮＡは、５’キャップ、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、及びポリアデニン尾部のうちの１つ以上を含み得る。ｍＲＮＡは、例えば、核局在化配列をコードするため、またはタンパク質をコードするよう代替コドンを使用するための、修飾オープンリーディングフレームを含み得る。
本開示のＬＮＰ組成物のｍＲＮＡは、例えば、分泌ホルモン、酵素、受容体、ポリペプチド、ペプチドまたは通常は分泌される他の目的タンパク質をコードし得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、例えば、そのようなｍＲＮＡの安定性及び／または半減期を改善する、またはタンパク質産生を改善するか、そうでなければ促進する、化学的または生物学的修飾を任意に有する場合がある。
さらに、好適な修飾には、そのｍＲＮＡの野生型バージョンに見出されるコドンと同じアミノ酸をコードするが、そのコドンよりも安定であるよう、コドンの１つ以上のヌクレオチドの変化が含まれる。例えば、ＲＮＡの安定性と、シチジン（Ｃ）残基及び／またはウリジン（Ｕ）残基の数が多いことの間に逆相関の関係があることが示されており、Ｃ残基及びＵ残基を欠いているＲＮＡは、ほとんどのＲＮａｓｅに安定であることがわかっている（Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９，２１３１-８（１９９４））。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ配列中のＣ残基及び／またはＵ残基の数を減少させる。別の実施形態では、Ｃ残基及び／またはＵ残基の数を、特定のアミノ酸をコードするあるコドンに、同じアミノ酸かまたは関連アミノ酸をコードする別のコドンを置換することによって減少させる。ｍＲＮＡ核酸に対して企図される修飾には、プソイドウリジンの組み込みも含まれる。ｍＲＮＡ核酸へのプソイドウリジンの組み込みにより、安定性及び翻訳能力が高まり、インビボでの免疫原性を低下させ得る。例えば、Ｋａｒｉｋｏ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １６（１１）：１８３３-１８４０（２００８）を参照のこと。ｍＲＮＡに対する置換及び修飾は、当業者に容易に知られる方法によって実施され得る。
配列中のＣ残基及びＵ残基の数を減少させる上での制約は、非翻訳領域と比較してｍＲＮＡのコード領域内において大きくなる可能性がある（すなわち、所望のアミノ酸配列をコードするためのメッセージの能力を保持したまま、メッセージ中に存在するＣ残基及びＵ残基のすべてを除去することはできない可能性がある）。但し、遺伝暗号の縮重があるため、配列中に存在するＣ残基及び／またはＵ残基の数を、同じコード能力を維持したままで減少させる機会が得られる（すなわち、コドンによりコードされるアミノ酸がどれなのかによって、ＲＮＡ配列の修飾についていくつかの異なる可能性が可能となり得る）。
修飾という用語には、例えば、ｍＲＮＡ配列内へのヌクレオチド以外の結合または修飾ヌクレオチドの組み込み（例えば、機能的な分泌タンパク質または酵素をコードするｍＲＮＡ分子の３′末端及び５′末端のうちの一方または両方に対する修飾）も含まれる。そのような修飾としては、ｍＲＮＡ配列への塩基の付加（例えば、ポリＡ尾部または長いポリＡ尾部を含めること）、３′ＵＴＲまたは５′ＵＴＲの変化、ある物質（例えば、タンパク質または相補的核酸分子）とのｍＲＮＡの複合体化、及びｍＲＮＡ分子の構造を変化させる（例えば、二次構造を形成する）要素を含めることが挙げられる。
ポリＡ尾部は、天然メッセンジャーを安定化させると考えられている。したがって、長いポリＡ尾部をｍＲＮＡ分子に付加し、それによりｍＲＮＡをより安定にする場合がある。ポリＡ尾部は、様々な当該技術分野で認められている技術を使用して付加することができる。例えば、ポリＡポリメラーゼを使用して合成またはインビトロで転写されたｍＲＮＡに長いポリＡ尾部を付加することができる（Ｙｏｋｏｅ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９９６；１４：１２５２-１２５６）。転写ベクターもまた、長いポリＡ尾部をコードすることができる。さらに、ポリＡ尾部を、ＰＣＲ産物からの直接転写によって付加することができる。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部の長さは、少なくとも約９０個、２００個、３００個、４００個少なくとも５００個のヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、ポリＡ尾部の長さは、修飾ｍＲＮＡ分子の安定性、したがってタンパク質の転写を、制御するよう調整され得る。例えば、ポリＡ尾部の長さはｍＲＮＡ分子の半減期に影響を与え得るため、ポリＡ尾部の長さは、ヌクレアーゼに対するｍＲＮＡの耐性レベルを変更し、それにより、細胞におけるタンパク質発現の経時変化を制御するよう調整され得る。いくつかの実施形態では、安定化ｍＲＮＡ分子は、（例えば、ヌクレアーゼによる）インビボ分解に対して十分に耐性であり、そのため、導入ビヒクルを用いずに標的細胞に送達され得る。
ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡは、天然では野生型ｍＲＮＡに見られない３′及び／または５′の非翻訳（ＵＴＲ）配列の組み込みにより修飾され得る。いくつかの実施形態では、天然ではｍＲＮＡに隣接し、第２の無関係なタンパク質をコードする３′及び／または５′のフランキング配列が、治療用または機能性タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列に、それを修飾するために組み込まれ得る。例えば、安定であるｍＲＮＡ分子（例えば、グロビン、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン、またはクエン酸回路酵素）からの３′または５′の配列が、センスｍＲＮＡ分子の安定性を高めるためにセンスｍＲＮＡ核酸分子の３′領域及び／または５′領域に組み込まれ得る。例えば、ＵＳ２００３／００８３２７２を参照のこと。
ｍＲＮＡ修飾のさらに詳細な説明は、ＵＳ２０１７／０２１０６９８Ａ１、５７～６８頁に見出すことができ、その内容は本明細書に組み込まれる。
鋳型核酸
本明細書に開示される方法には、鋳型核酸を使用することが含まれ得る。鋳型は、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ等のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断タンパク質のための標的部位またはその近傍において核酸配列を変化させるかまたは挿入するために使用され得る。いくつかの実施形態では、方法は、細胞に鋳型を導入することを含む。いくつかの実施形態では、単一の鋳型が提供され得る。他の実施形態では、２つ以上の標的部位で編集が生じるよう２つ以上の鋳型が提供され得る。例えば、ある細胞の単一遺伝子、またはある細胞の２つの異なる遺伝子を編集するために、異なる鋳型が提供され得る。
いくつかの実施形態では、鋳型は、相同組換えで使用され得る。いくつかの実施形態では、相同組換えにより、標的核酸分子内への鋳型配列または鋳型配列の一部の組み込みがもたらされ得る。他の実施形態では、鋳型は相同組換え修復で使用され得、これには、核酸の切断の部位におけるＤＮＡ鎖の侵入を伴う。いくつかの実施形態では、相同組換え修復により、編集された標的核酸分子内に鋳型配列が含まれることが生じる。さらに別の実施形態では、鋳型は、非相同末端結合によって媒介される遺伝子編集で使用され得る。いくつかの実施形態では、鋳型配列には、切断部位近傍の核酸配列との類似性は全くない。いくつかの実施形態では、鋳型または鋳型配列の一部が組み込まれる。いくつかの実施形態では、鋳型には、隣接する末端逆方向反復（ＩＴＲ）配列が含まれる。
いくつかの実施形態では、鋳型は、切断部位の上流及び下流に位置する配列にそれぞれ相補的な、第１のホモロジーアーム及び第２のホモロジーアーム（第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列とも呼ばれる）を含み得る。鋳型が２つのホモロジーアームを含有する場合、各アームは同じ長さであっても異なる長さであってもよく、ホモロジーアームに挟まれた配列は、ホモロジーアームに挟まれた標的配列と実質的に類似しているかもしくは同一であり得る、または全く無関係の配列であり得る。いくつかの実施形態では、鋳型上の第１のヌクレオチド配列と切断部位上流の配列との相補性または同一性パーセントの程度、及び鋳型上の第２のヌクレオチド配列と切断部位下流の配列との相補性または同一性パーセントの程度により、鋳型と標的核酸分子の間の相同組換え、例えば、高忠実度相同組換え等が可能になり得る。いくつかの実施形態では、相補性の程度は、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、相補性の程度は、約９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、相補性の程度は、少なくとも９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、相補性の程度は１００％であり得る。いくつかの実施形態では、同一性パーセントは、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、同一性パーセントは、約９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、同一性パーセントは、少なくとも９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、同一性パーセントは１００％であり得る。
いくつかの実施形態では、鋳型配列は、標的細胞の内在性配列に対応するか、それを含むか、またはそれからなり得る。さらに、または別の方法として、鋳型配列は、標的細胞の外来配列に対応するか、それを含むか、またはそれからなり得る。本明細書で使用される場合、「内在性配列」という用語は、その細胞にとって天然である配列を指す。「外来配列」という用語は、その細胞にとって天然ではない配列、またはその細胞のゲノムにおける天然での位置が別の異なる位置にある配列を指す。いくつかの実施形態では、内在性配列は、細胞のゲノム配列であり得る。いくつかの実施形態では、内在性配列は、染色体の配列または染色体外の配列であり得る。いくつかの実施形態では、内在性配列は、細胞のプラスミド配列であり得る。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、切断部位またはその近傍において細胞の内在性配列の一部と実質的に同一であり得るが、少なくとも１つのヌクレオチドの変化を含み得る。いくつかの実施形態では、切断された標的核酸分子を鋳型で編集することにより、標的核酸分子の１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む変異がもたらされ得る。いくつかの実施形態では、変異は、標的配列を含む遺伝子から発現されるタンパク質に１つ以上のアミノ酸変化をもたらし得る。
いくつかの実施形態では、変異は、標的挿入部位から発現されるＲＮＡに１つ以上のヌクレオチド変化をもたらし得る。いくつかの実施形態では、変異は、標的遺伝子の発現レベルを変化させ得る。いくつかの実施形態では、変異は、標的遺伝子の発現の増加または減少をもたらし得る。いくつかの実施形態では、変異は、遺伝子ノックダウンをもたらし得る。いくつかの実施形態では、変異は、遺伝子ノックアウトをもたらし得る。いくつかの実施形態では、変異は、遺伝子機能の回復をもたらし得る。いくつかの実施形態では、切断された標的核酸分子を鋳型で編集することにより、ＤＮＡ等の標的核酸分子の、エクソン配列、イントロン配列、制御配列、転写調節配列、翻訳制御配列、スプライシング部位、または非コード配列の変化がもたらされ得る。
他の実施形態では、鋳型配列は、外来配列を含み得る。いくつかの実施形態では、外来配列は、コード配列を含み得る。いくつかの実施形態では、外来配列は、標的核酸分子への外来配列の組み込み時に、その組み込み配列によってコードされるタンパク質またはＲＮＡを細胞が発現することができるよう、外来プロモーター配列に機能的に連結された、タンパク質またはＲＮＡをコードする配列（例えば、ＯＲＦ）を含み得る。他の実施形態では、標的核酸分子への外来配列の組み込み時、組み込まれた配列の発現は、内在性プロモーター配列によって調節され得る。いくつかの実施形態では、外来配列は、タンパク質または該タンパク質の一部をコードするｃＤＮＡ配列を提供し得る。さらに別の実施形態では、外来配列は、エクソン配列、イントロン配列、制御配列、転写調節配列、翻訳制御配列、スプライシング部位、または非コード配列を含むかまたはそれらからなり得る。いくつかの実施形態では、外来配列の組み込みは、遺伝子機能の回復をもたらし得る。いくつかの実施形態では、外来配列の組み込みは、遺伝子ノックインをもたらし得る。いくつかの実施形態では、外来配列の組み込みは、遺伝子ノックアウトをもたらし得る。
鋳型は、任意の好適な長さであってよい。いくつかの実施形態では、鋳型は、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、またはそれ以上のヌクレオチド長で構成され得る。鋳型は、一本鎖核酸であってよい。鋳型は、二本鎖または部分的に二本鎖の核酸であり得る。いくつかの実施形態では、一本鎖鋳型は、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、鋳型は、標的配列（すなわち、「ホモロジーアーム」）を含む標的核酸分子の一部に相補的なヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、鋳型は、標的核酸分子上の切断部位の上流または下流に位置する配列に相補的なホモロジーアームを含み得る。
いくつかの実施形態では、鋳型は、末端逆方向反復（ＩＴＲ）配列が隣接して含有されるｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態では、鋳型は、ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノサークル、またはＰＣＲ産物として提供される。
いくつかの実施形態では、核酸は精製される。いくつかの実施形態では、核酸は、沈殿方法（例えば、ＬｉＣｌ沈殿、アルコール沈殿、または同等の方法、例えば、本明細書に記載のような方法）を使用して精製される。いくつかの実施形態では、核酸は、ＨＰＬＣを用いる方法等のクロマトグラフィーを用いる方法または同等の方法（例えば、本明細書に記載のような方法）を使用して精製される。いくつかの実施形態では、核酸は、沈殿方法（例えば、ＬｉＣｌ沈殿）とＨＰＬＣを用いる方法の両方を使用して精製される。いくつかの実施形態では、核酸は、接線流濾過（ＴＦＦ）によって精製される。
細胞種
いくつかの実施形態では、細胞は、対象におけるヒト細胞等の真核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、インビボでの、例えば、組織、器官、または生物の細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、インビトロでの細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、免疫細胞である。本明細書で使用される場合、「免疫細胞」とは、例えば、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（「ＮＫ細胞」、及びＮＫＴ細胞、もしくはｉＮＫＴ細胞））、単球、マクロファージ、マスト細胞、樹状細胞、または顆粒球（例えば、好中球、好酸球、及び好塩基球）が含まれる、免疫系の細胞を指す。いくつかの実施形態では、細胞は、初代免疫細胞である。いくつかの実施形態では、免疫系細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及び樹状細胞（ＤＣ）から選択され得る。いくつかの実施形態では、免疫細胞は同種である。いくつかの実施形態では、細胞は、リンパ球である。いくつかの実施形態では、細胞は、適応免疫細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はＢ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はＮＫ細胞である。
本明細書で使用される場合、Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」または「αβ ＴＣＲ」または「γδ ＴＣＲ」）を発現する細胞と定義することができるが、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞のＴＣＲは、その発現が減少するよう遺伝子改変が（例えば、ＴＲＡＣ遺伝子またはＴＲＢＣ遺伝子に対する遺伝子改変により）行われている場合があり、そのため、タンパク質ＣＤ３の発現が、標準的フローサイトメトリー法でＴ細胞を同定するためのマーカーとして使用され得る。ＣＤ３は、ＴＣＲと会合するマルチサブユニットのシグナル伝達複合体である。したがって、Ｔ細胞は、ＣＤ３＋と呼ばれ得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ３＋マーカー及びＣＤ４＋か、ＣＤ８＋のいずれかのマーカーを発現する細胞である。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、糖タンパク質ＣＤ８を発現するため、標準的フローサイトメトリー法によるＣＤ８＋であり、これは、「細胞傷害性」Ｔ細胞と呼ばれ得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、糖タンパク質ＣＤ４を発現するため、標準的フローサイトメトリー法によるＣＤ４＋であり、これは、「ヘルパー」Ｔ細胞と呼ばれ得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞はサブセットに分化することができ、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ９細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、制御性Ｔ（「Ｔｒｅｇ」）細胞、または濾胞性ヘルパーＴ細胞（「Ｔｆｈ」）と呼ばれ得る。各ＣＤ４＋サブセットは、炎症誘発性機能または抗炎症機能、生存機能または保護機能のいずれかを有することができる、特定のサイトカインを放出する。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋の選択法によって対象から分離され得る。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、メモリーＴ細胞である。体内では、メモリーＴ細胞は抗原に遭遇したことがある。メモリーＴ細胞は、二次リンパ器官内（セントラルメモリーＴ細胞）または最近感染した組織内（エフェクターメモリーＴ細胞）に位置し得る。メモリーＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。メモリーＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞であり得る。本明細書で使用される場合、「セントラルメモリーＴ細胞」は、抗原を経験したＴ細胞と定義することができ、例えば、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＯを発現し得る。セントラルメモリーＴ細胞は、ＣＣＲ７も発現するセントラルメモリーＴ細胞によってＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ４５ＲＯ＋として検出され得るため、標準的フローサイトメトリー法によるＣＣＲ７＋として検出され得る。
本明細書で使用される場合、「初期幹細胞メモリーＴ細胞」（または「Ｔｓｃｍ」）は、ＣＤ２７及びＣＤ４５ＲＡを発現するＴ細胞と定義することができ、したがって、標準的フローサイトメトリー法によるＣＤ２７＋及びＣＤ４５ＲＡ＋である。Ｔｓｃｍは、ＣＤ４５のアイソフォームであるＣＤ４５ＲＯを発現しないため、このアイソフォームについて染色した場合、Ｔｓｃｍはさらには、標準的フローサイトメトリー法によるＣＤ４５ＲＯ-となる。したがって、ＣＤ４５ＲＯ-ＣＤ２７＋細胞は、初期幹細胞メモリーＴ細胞でもある。Ｔｓｃｍ細胞はさらに、ＣＤ６２Ｌ及びＣＣＲ７を発現し、したがって、標準的フローサイトメトリー法によるＣＤ６２Ｌ＋及びＣＣＲ７＋として検出され得る。初期幹細胞メモリーＴ細胞は、細胞療法製品の持続性及び治療有効性の増加と相関することが示されている。
いくつかの実施形態では、細胞はＢ細胞である。本明細書で使用される場合、「Ｂ細胞」は、ＣＤ１９及び／またはＣＤ２０、及び／またはＢ細胞成熟抗原（「ＢＣＭＡ」）を発現する細胞と定義することができ、したがって、Ｂ細胞は、標準的フローサイトメトリー法によるＣＤ１９＋、及び／またはＣＤ２０＋、及び／またはＢＣＭＡ＋である。Ｂ細胞はさらに、標準的フローサイトメトリー法によるＣＤ３陰性及びＣＤ５６陰性である。Ｂ細胞は、形質細胞であり得る。Ｂ細胞は、メモリーＢ細胞であり得る。Ｂ細胞は、ナイーブＢ細胞であり得る。Ｂ細胞は、ＩｇＭ＋であり得るか、またはクラススイッチしたＢ細胞受容体（例えば、ＩｇＧ＋、またはＩｇＡ＋）を有する。
ＡＣＴ療法に使用される細胞には、間葉系幹細胞（例えば、骨髄（ＢＭ）、末梢血（ＰＢ）、胎盤、臍帯（ＵＣ）または脂肪から分離されたもの）、造血幹細胞（ＨＳＣ、例えば、ＢＭから分離されたもの）、単核球（例えば、ＢＭまたはＰＢから分離されたもの）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ；ＢＭ、ＰＢ、及びＵＣから分離されたもの）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、角膜輪部幹細胞（ＬＳＣ）、または組織特異的初代細胞またはそれに由来する細胞（ＴＳＣ）等が含まれる。ＡＣＴ療法に使用される細胞にはさらに、例えば、膵島細胞、ニューロン、及び血液細胞等の他の細胞種に分化するよう誘導され得る人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）；眼幹細胞；多能性幹細胞（ＰＳＣ）；胚性幹細胞（ＥＳＣ）；器官または組織の移植のための細胞、例えば、膵島細胞、心筋細胞、甲状腺細胞、胸腺細胞、神経細胞、皮膚細胞、網膜細胞、軟骨細胞、筋細胞、及び角化細胞が含まれる。
いくつかの実施形態では、細胞は、対象からの細胞等のヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒトドナー等のヒト対象から分離される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒトドナーのＰＢＭＣまたはｌｅｕｋｏｐａｋから分離される。いくつかの実施形態では、細胞は、病態、障害、または疾患のある対象からのものである。いくつかの実施形態では、細胞は、エプスタイン-バーウイルス（「ＥＢＶ」）を有するヒトドナーからのものである。
いくつかの実施形態では、細胞は、骨髄または末梢血等からの単核球である。いくつかの実施形態では、細胞は、末梢血単核球（「ＰＢＭＣ」）である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＰＢＭＣ、例えば、リンパ球または単球である。いくつかの実施形態では、細胞は、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）である。
いくつかの実施形態では、方法はエクスビボで行われる。本明細書で使用される場合、「エクスビボ」とは、インビトロでの方法であって、細胞が、例えばＡＣＴ療法として、対象に移入され得るものを指す。いくつかの実施形態では、エクスビボ法は、ＡＣＴ療法の細胞または細胞集団を伴うインビトロでの方法である。
いくつかの実施形態では、細胞は、培養で維持される。いくつかの実施形態では、細胞は、患者に移植される。いくつかの実施形態では、細胞は、対象から除去され、エクスビボで遺伝子が改変され、その後、同患者に再び投与される。いくつかの実施形態では、細胞は、対象から除去され、エクスビボで遺伝子が改変され、その後、細胞を除去した対象以外の対象に投与される。
いくつかの実施形態では、細胞は、細胞株からのものである。いくつかの実施形態では、細胞株は、ヒト対象に由来する。いくつかの実施形態では、細胞株は、リンパ芽球様細胞株（「ＬＣＬ」）である。細胞は、凍結保存され、解凍され得る。細胞は、それまで凍結保存されていない場合がある。
いくつかの実施形態では、細胞は、細胞バンクからのものである。いくつかの実施形態では、細胞は、遺伝子が改変され、その後、細胞バンクへ移される。いくつかの実施形態では、細胞は、対象から除去され、エクスビボで遺伝子が改変され、細胞バンクへ移される。いくつかの実施形態では、遺伝子が改変された細胞の集団は、細胞バンクへ移される。いくつかの実施形態では、遺伝子が改変された免疫細胞の集団は、細胞バンクへ移される。いくつかの実施形態では、第１及び第２の亜集団を含む、遺伝子が改変された免疫細胞の集団であって、第１及び第２の亜集団が、少なくとも１つの共通する遺伝子改変及び少なくとも１つの異なる遺伝子改変を有する免疫細胞の集団が、細胞バンクへ移される。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、多クローン性活性化（または「多クローン性刺激」）（抗原特異的刺激ではない）によって活性化される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ３刺激によって活性化される（例えば、抗ＣＤ３抗体を提供する）。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ３及びＣＤ２８刺激によって活性化される（例えば、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を提供する）。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔ細胞を（例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を介して）活性化するための即時使用試薬を使用して活性化される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ビーズによりもたらされるＣＤ３／ＣＤ２８刺激を介することによって活性化される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を介することによって活性化され、ここで、１つ以上の成分が可溶性であり、及び／または１つ以上の成分が固体表面（例えば、プレートまたはビーズ）に結合している。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、抗原非依存性マイトジェン（例えば、レクチン、例えば、コンカナバリンＡ（「ＣｏｎＡ」）、またはＰＨＡ）によって活性化される。
いくつかの実施形態では、１つ以上のサイトカインがＴ細胞の活性化のために使用される。Ｔ細胞活性化のため、及び／またはＴ細胞生存を促進するために、ＩＬ-２が提供される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の活性化のためのサイトカイン（複数可）は、共通のガンマ鎖（γｃ）受容体に結合するサイトカインである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化のためにＩＬ-２が提供される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化のためにＩＬ-７が提供される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化のためにＩＬ-１５が提供される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化のためにＩＬ-２１が提供される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化のために、例えば、ＩＬ-２、ＩＬ-７、ＩＬ-１５、及び／またはＩＬ-２１等の、サイトカインの組み合わせが提供される。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、細胞を抗原に曝露すること（抗原刺激）によって活性化される。Ｔ細胞は、抗原が主要組織適合遺伝子複合体（「ＭＨＣ」）分子（ペプチド-ＭＨＣ複合体）にペプチドとして提示された場合に、抗原によって活性化される。Ｔ細胞を抗原提示細胞（フィーダー細胞）及び抗原と共に共培養することによって、同種抗原がＴ細胞に提示され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、抗原をパルスされた抗原提示細胞との共培養によって活性化される。いくつかの実施形態では、抗原提示細胞は、抗原のペプチドをパルスされている。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、１２～７２時間活性化され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、１２～４８時間活性化され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、１２～２４時間活性化され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、２４～４８時間活性化され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、２４～７２時間活性化され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、１２時間活性化され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、４８時間活性化され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、７２時間活性化され得る。
定義
本出願で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈で特に明確に指示されない限り、複数の指示対象が含まれることに留意すべきである。したがって、例えば、「組成物（ａ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」への言及には複数の組成物が含まれ、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及には複数の細胞が含まれ、他も同様である。「または」の使用は包括的なものであり、特に断らない限り、「及び／または」を意味する。
上記明細書で具体的に言及しない限り、様々な構成要素を「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を記述する本明細書の実施形態は、記述されている構成要素「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」またはそれ「から本質的になること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」としても企図され、様々な構成要素「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」を記述する本明細書の実施形態は、記述されている構成要素を「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「から本質的になること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」としても企図され、様々な構成要素「について（ａｂｏｕｔ）」記述する本明細書の実施形態は、記述されている構成要素「において（ａｔ）」としても企図され、様々な構成要素「から本質的になること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」を記述する本明細書の実施形態は、記述されている構成要素「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」としても企図される（この互換性は、特許請求の範囲におけるこれらの用語の使用には適用されない）。
数範囲には、その範囲を定義している数が包含される。測定値及び測定可能な値は、有効桁数及び測定に関連する誤差を考慮して、概数であると理解される。本出願で使用される場合、「約」及び「おおよそ」という用語は、それらの技術分野で理解されている意味を有し、一方を使用する場合と他方を使用する場合とで、必ずしも異なる範囲を意味するわけではない。別段に示されていない限り、本出願で使用される数字は、「約」または「おおよそ」等の修飾用語の有無を問わず、関連技術分野の当業者により理解されるような通常の相違及び／または変動を包含することを理解されるべきである。ある特定の実施形態では、「おおよそ」または「約」という用語は、別途記載があるか、または文脈から他の意味が明らかでない限り、記述されている基準値からいずれの方向（上回るまたは下回る）においても２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％またはそれ未満に入る値の範囲を指し得る（但し、そのような数が可能値の１００％を超える場合を除く）。
本明細書で使用される場合、「接触させること」という用語は、２つ以上の実体の間に物理的接続を確率することを意味する。例えば、哺乳類細胞をナノ粒子組成物と接触させるとは、哺乳類細胞とナノ粒子とに物理的接続を共有させることを意味する。細胞を、インビボ及びエクスビボの両方で外部実体と接触させる方法は、生物学の分野で周知である。例えば、哺乳類内部に配されたナノ粒子組成物と哺乳類細胞の接触は、様々な投与経路（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、及び皮下）により実施され得、様々な量のナノ粒子組成物を伴い得る。さらに、複数の哺乳類細胞が、ナノ粒子組成物により接触され得る。
本明細書で使用される場合、「送達すること」という用語は、目的物へ実体を提供することを意味する。例えば、対象への治療薬及び／または予防薬の送達には、治療薬及び／または予防薬を含むナノ粒子組成物を対象に投与することを伴い得る（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、または皮下経路による）。哺乳類または哺乳類細胞へのナノ粒子組成物の投与には、１つ以上の細胞をナノ粒子組成物と接触させることを伴い得る。
本明細書で使用される場合、「封入率」とは、ナノ粒子組成物の調製において使用された治療薬及び／または予防薬の初期総量に対する、ナノ粒子組成物の一部となる治療薬及び／または予防薬の量を指す。例えば、組成物に最初に与えられた総量１００ｍｇの治療薬及び／または予防薬のうち、９７ｍｇの治療薬及び／または予防薬がナノ粒子組成物中に封入されている場合、封入率は９７％となり得る。本明細書で使用される場合、「封入」とは、完全、実質的、または部分的な、包囲、閉じ込め、取り囲み、または内包を指し得る。
本明細書で使用される場合、「編集効率」、「編集パーセンテージ」、「インデル効率」、及び「インデルパーセント」という用語は、配列リードの総数に対する、挿入または欠失のある配列リードの総数を指す。例えば、ゲノム内の標的位置における編集効率は、ゲノムＤＮＡを単離及びシークエンシングして、遺伝子編集により導入された挿入及び欠失の存在を同定することにより測定され得る。いくつかの実施形態では、編集効率は、ある遺伝子を最初に含有していた細胞数（例えば、ＣＤ３＋細胞）に対する、処理後にその遺伝子（例えば、ＣＤ３）をもはや含有していない細胞のパーセンテージとして測定される。
本明細書で使用される場合、「ノックダウン」とは、特定の遺伝子産物（例えば、タンパク質、ｍＲＮＡ、または両方）の発現の減少を指す。タンパク質のノックダウンは、目的の組織、液体、または細胞集団等の試料からの細胞内のタンパク質の総量を検出することにより測定することができる。また、そのタンパク質についての代替、マーカー、または活性を測定することによっても測定することができる。ｍＲＮＡのノックダウンを測定する方法は知られており、これには、目的試料から単離されたｍＲＮＡのシークエンシングが含まれる。いくつかの実施形態では、「ノックダウン」は、とは、特定の遺伝子産物の発現のいくらかの消失、例えば、転写されたｍＲＮＡ量の減少または細胞の集団（インビボでの集団、例えば、組織に見られるものを含む）により発現されたタンパク質量の減少を指し得る。
本明細書で使用される場合、「ノックアウト」とは、特定の遺伝子からの発現の消失または細胞の特定のタンパク質の消失を指す。ノックアウトは、例えば、細胞、組織または細胞の集団における細胞内のタンパク質の総量を検出することにより測定することができる。ノックアウトは、例えば、ゲノムまたはｍＲＮＡレベルでも検出することができる。
本明細書で使用される場合、「生分解性」という用語は、細胞内に導入された際に、細胞機構によって分解されるか（例えば、酵素分解）または加水分解によって分解されて、細胞に対する重大な毒性作用（複数可）を伴わずに細胞が再利用または廃棄することができる成分になる材料を指すために使用される。ある特定の実施形態では、生分解性材料の分解により生成された成分は、インビボで炎症及び／または他の有害作用を誘導することはない。いくつかの実施形態では、生分解性材料は、酵素により分解される。別法または追加方法として、いくつかの実施形態では、生分解性材料は加水分解により分解される。
本明細書で使用される場合、「Ｎ／Ｐ比」は、例えば、脂質成分及びＲＮＡが含まれるナノ粒子組成物中の、イオン化可能な窒素原子含有脂質（例えば、式Ｉの化合物）とＲＮＡ中リン酸基のモル比である。
組成物には、１つ以上の化合物の塩も含まれ得る。塩は、薬学的に許容される塩であり得る。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」とは、親化合物が、既存の酸部分または塩基部分をその塩形態に変換させることによって（例えば、遊離塩基基を好適な有機酸と反応させることによって）変化させられている、本開示の化合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例としては、アミン等の塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩、カルボン酸等の酸性残基のアルカリまたは有機塩等が挙げられるが、これらに限定されない。代表的酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、二グルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミスルファート、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２-ヒドロキシ-エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ塩酸、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸、２-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３-フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等が挙げられる。代表的アルカリ金属またはアルカリ土類金属の塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等、ならびに無毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、及びアミンの陽イオン、例えば、限定されることなく、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン等が挙げられる。本開示の薬学的に許容される塩としては、例えば無毒な無機酸または有機酸から形成される、親化合物の従来の無毒な塩が挙げられる。本開示の薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法により塩基性部分または酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、そのような塩は、これらの化合物の遊離の酸形態もしくは塩基形態を、化学量論的量の適切な塩基もしくは酸と、水もしくは有機溶媒中、または両者の混合液中で反応させることによって調製可能であり、一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。好適な塩の一覧は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ-ＶＣＨ，２００８，及びＢｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，１-１９（１９７７）に見出され、その各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「多分散指数」は、系の粒度分布の均一性を表す比である。小さい値、例えば０．３未満は、狭い粒度分布を示す。いくつかの実施形態では、多分散指数は０．１未満であり得る。
本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」とは、細胞への種（例えば、ＲＮＡ）の導入を指す。トランスフェクションは、例えば、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで行われ得る。
本明細書で使用される「アルキル」という用語は、１～２４個の炭素原子の分岐状または非分岐状の飽和炭化水素基、例えば、メチル、エチル、ｎ-プロピル、イソプロピル、ｎ-ブチル、イソブチル、ｓ-ブチル、ｔ-ブチル、ｎ-ペンチル、イソペンチル、ｓ-ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシル等である。アルキル基は、環状でも非環状でもあり得る。アルキル基は、分岐状でも非分岐状（すなわち、直鎖状）でもあり得る。アルキル基はまた、置換でも非置換でもあり得る。例えば、アルキル基は、本明細書に記載されるような、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ニトロ、シリル、スルホキソ、スルホン酸、カルボン酸、またはチオールが含まれるがこれらに限定されない、１つ以上の基で置換され得る。「低級アルキル」基は、１～６個（例えば、１～４個）の炭素原子を含有するアルキル基である。
「アルケニル」という用語は、本明細書で使用される場合、少なくとも１つの炭素間二重結合を含有する脂肪族基を指し、「非置換アルケニル」及び「置換アルケニル」の両方が含まれることが意図され、そのうち後者は、アルケニル基の１つ以上の炭素上の水素を置き換える置換基を有するアルケニル部分を指す。そのような置換基は、１つ以上の二重結合に含まれるか、または含まれない、１つ以上の炭素において出現し得る。さらに、そのような置換基には、安定性に極めて難がある場合を除いては、以下に考察するように、アルキル基について企図されるものすべてが含まれる。例えば、アルケニル基は、１つ以上のアルキル基により置換され得、カルボシクリル基、アリール基、ヘテロシクリル基、またはヘテロアリール基が企図される。例示的アルケニル基としては、ビニル（-ＣＨ＝ＣＨ２）、アリル（-ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、シクロペンテニル（-Ｃ５Ｈ７）、及び５-ヘキセニル（-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）が挙げられるが、これらに限定されない。
「アルキレン」基とは、分岐状でも非分岐状（すなわち、直鎖状）でもあり得る二価のアルキルラジカルを指す。上記の一価アルキル基のうちのいずれかは、アルキルから第２の水素原子を引き抜くことによってアルキレンに変換され得る。代表的アルキレンとしては、Ｃ２-４アルキレン及びＣ２-３アルキレンが挙げられる。典型的なアルキレン基としては、-ＣＨ（ＣＨ３）-、-Ｃ（ＣＨ３）２-、-ＣＨ２ＣＨ２-、-ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）-、-ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２-、-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２-、-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２-等が挙げられるが、これらに限定されない。アルキレン基は、置換でも非置換でもあり得る。例えば、アルキレン基は、本明細書に記載されるような、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ニトロ、シリル、スルホキソ、スルホン酸、カルボン酸、またはチオールが含まれるがこれらに限定されない、１つ以上の基で置換され得る。
「アルケニレン」という用語には、少なくとも１つの炭素間二重結合を有し、一実施形態では、炭素間三重結合がない、二価の直鎖または分岐状の不飽和非環式ヒドロカルビル基が含まれる。上述の一価アルケニル基のうちのいずれかは、アルケニルから第２の水素原子を引き抜くことによってアルケニレンに変換され得る。代表的アルケニレンとしては、Ｃ２-６アルケニレンが挙げられる。
「Ｃｘ-ｙ」という用語は、アルキルまたはアルキレンのような化学部分と併用される場合、鎖内にｘ個～ｙ個の炭素を含有する基が含まれることが意図される。例えば、「Ｃｘ-ｙアルキル」という用語は、鎖内にｘ個～ｙ個の炭素を含有する直鎖及び分岐鎖のアルキル基及びアルキレン基が含まれる、置換または非置換の飽和炭化水素基を指す。
「アルコキシ」という用語は、それに結合している酸素を有する、アルキル基、好ましくは低級アルキル基を指す。代表的アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｔｅｒｔ-ブトキシ等が挙げられる。
本発明は、例示の実施形態と併せて記載されているが、それらが、本発明をそれらの実施形態に限定することを意図するものではないことが理解される。むしろ、本開示は、代替案、変更、及び、特定の特徴の均等物等の均等物のすべてを包含することが意図され、それらは、添付の特許請求の範囲によって定義されるように本発明内に含まれ得る。
上述の一般的記載及び詳細な説明の両方、ならびに以下の実施例は、例示的及び説明的なものにずぎず、教示を限定するものではない。本明細書で使用される項目見出しは構成のみを目的としており、いかなる形であっても所望の主題を限定するものと解釈されるべきではない。参照により組み込まれる文献が本明細書で定義した用語と矛盾する場合、本明細書が優先する。本出願に記載されるすべての範囲には、特に断らない限り、端点が包含される。
参照による組み込み
本明細書で言及または引用されている、記事、特許、及び特許出願、ならびに他のすべての文書及び電子的に利用可能な情報の内容は、個々の刊行物が各々参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかの如く同程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。出願人は、そのようないかなる記事、特許、特許出願、または他の物理的及び電子的な文書からであっても、あらゆる材料及び情報を本出願に物理的に組み込む権利を留保する。
実施例１-材料及び方法
１．１．Ｔ細胞培養培地の調製。
以下で使用されるＴ細胞培養培地の組成をここに記載する。「Ｘ-ＶＩＶＯ塩基性培地」は、Ｘ-ＶＩＶＯ（商標）１５培地、１％Ｐｅｎｓｔｒｅｐ、５０μＭのベータ-メルカプトエタノール、１０ｍＭのＮＡＣからなる。上記成分に加え、使用した他の可変の培地成分は、１．血清（ウシ胎児血清（ＦＢＳ））、及び２．サイトカイン（ＩＬ-２、ＩＬ-７、ＩＬ-１５）であった。
１．２．Ｔ細胞の調製
健常ヒトドナーの白血球アフェレーシスは市販のもの（Ｈｅｍａｃａｒｅ）を入手した。Ｔ細胞は、ＭｕｌｔｉＭＡＣＳ（商標） Ｃｅｌｌ２４ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｐｌｕｓ装置で、ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号１７９５１）を使用した陰性選択により、またはＳｔｒａｉｇｈｔＦｒｏｍ（登録商標）Ｌｅｕｋｏｐａｋ（登録商標）ＣＤ４／ＣＤ８ ＭｉｃｒｏＢｅａｄ（Ｍｉｌｔｅｎｙ、カタログ番号１３０-１２２-３５２）を使用したＣＤ４／ＣＤ８陽性選択により、製造者の指示に従って分離された。Ｔ細胞を、今後の使用のためにＣｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０凍結保存培地（カタログ番号０７９３０）中で凍結保存した。
融解時、Ｔ細胞を、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ）、及び１％ｐｅｎ-ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ、１５１４０-１２２）を添加したＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ Ｂａｓｅ Ｍｅｄｉａ（ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ Ｍｅｄｉａ（Ｇｉｂｃｏ、Ａ３７０５００１）で構成されるＴ細胞完全増殖培地で、さらに２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ-２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００-０２）、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ-７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００-０７）、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ-１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００-１５）、及び２．５％ヒト血清（Ｇｅｍｉｎｉ、１００-５１２）を添加して培養した。一晩静置した後、１０６／ｍＬの密度のＴ細胞をＴ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ試薬（１：１００希釈、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で活性化させ、３７℃で２４時間または４８時間インキュベートした。インキュベーション後、０．５×１０６／ｍＬの密度の細胞を編集用途に使用した。
別段に示されていない限り、以下の例外を除き、同じ工程を非活性化Ｔ細胞に使用した。融解時、非活性化Ｔ細胞を、ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ Ｂａｓｅ Ｍｅｄｉａ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ａ１０４８５-０１）、１％ｐｅｎ-ｓｔｒｅｐ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３０-００２-ＣＩ）、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、３５０５００６１）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、１５６３００８０））で構成されるＣＴＳ完全増殖培地で、そこへさらに２００Ｕ／ｍＬのＩＬ-２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００-０２）、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ-７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００-０７）、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ-１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００-１５）を５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ、１００-５１２）と共に添加して培養し、活性化をせずに２４時間インキュベートした。Ｔ細胞を、２．５％ヒト血清及び編集用途のサイトカインを含有する、上記の１００ｕＬのＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ基礎培地に１０６／ｍＬの細胞密度で播種した。
１．３．脂質ナノ粒子の調製。
特に明記しない限り、脂質成分を、１００％エタノールに様々なモル比で溶解させた。ＲＮＡカーゴ（例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡ）を２５ｍＭのクエン酸塩、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ５．０に溶解させ、ＲＮＡカーゴの濃度をおおよそ０．４５ｍｇ／ｍＬにした。
特に明記しない限り、ＬＮＰは、３-（（４，４-ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）-２-（（（（３-（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）-オクタデカ-９，１２-ジエノアート）とも呼ばれるイオン化可能脂質Ａ（（９Ｚ，１２Ｚ）-３-（（４，４-ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）-２-（（（（３-（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ-９，１２-ジエノアート、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ-ＤＭＧをそれぞれ、５０：３８：９：３のモル比で含有した。脂質核酸集合体は、特に明記しない限り、脂質のアミンとＲＮＡのリン酸（Ｎ：Ｐ）のモル比を約６で、またｇＲＮＡとｍＲＮＡとの重量比を１：１にして製剤化された。実施例１３～１６では、特に明記しない限り、ｇＲＮＡとｍＲＮＡとの重量比に１：２を使用した。
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、脂質含有エタノールと、２体積のＲＮＡ溶液及び１体積の水との衝突噴流混合を利用するクロスフロー技術を使用して調製した。脂質含有エタノールを、２体積のＲＮＡ溶液との混合十字部を介して混合した。第４流の水を十字部からの出口流と、インラインＴ字部を介して混合した（ＷＯ２０１６０１０８４０の図２を参照のこと）。ＬＮＰを室温（ＲＴ）で１時間保持し、水でさらに希釈した（おおよそ１：１のｖ／ｖ）。ＬＮＰを、例えば、フラットシートカートリッジ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、１００ｋＤ ＭＷＣＯ）で、接線流濾過を使用して濃縮し、ＰＤ-１０脱塩カラム（ＧＥ）を使用して緩衝液を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、４５ｍＭ ＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）スクロース、ｐＨ７．５（ＴＳＳ）に交換した。別法として、ＬＮＰを、１００ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎスピンフィルターを使用して任意に濃縮し、ＰＤ-１０脱塩カラム（ＧＥ）を使用して緩衝液をＴＳＳに交換した。その後、得られた混合物を、０．２μｍ滅菌フィルターを使用して濾過した。最終ＬＮＰを、以後の使用まで４℃または-８０℃で保存した。
１．４．オンターゲット切断効率についての次世代シークエンシング（「ＮＧＳ」）及び分析
ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号ＱＥ０９０５０）を製造者の操作手順に従って使用し、ゲノムＤＮＡを抽出した。
ゲノムの標的位置での編集効率を定量的に決定するため、次世代シークエンシングを用いて、遺伝子編集により導入された挿入及び欠失の存在を同定した。ＰＣＲプライマーを目的遺伝子（例えば、ＴＲＡＣ）内の標的部位周辺に設計し、目的ゲノム領域を増幅させた。当該技術分野で標準となっているようにプライマー配列設計を行った。
追加のＰＣＲを製造者（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）の操作手順に従って実施し、シークエンシングのための化学を加えた。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ装置でアンプリコンに配列決定を行った。品質スコアが低いリードを除去した後、リードをヒトの（例えば、ｈｇ３８）参照ゲノムに対して整列させた。リードを含有する結果ファイルを参照ゲノムにマッピングし（ＢＡＭファイル）、目的の標的領域と重なるリードを選択し、野生型のリード数に対する挿入または欠失（「インデル」）を含有するリード数を計算した。
編集パーセンテージ（例えば、「編集効率」または「編集パーセント」）は、野生型を含め、配列リードの総数に対する、挿入または欠失（「インデル」）のある配列リードの総数と定義される。
１．５．ヌクレアーゼｍＲＮＡのインビトロ転写（「ＩＶＴ」）
Ｎ１-メチルプセウド-Ｕを含有するキャップ化及びポリアデニル化されたｍＲＮＡを、線状化プラスミドＤＮＡ鋳型及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写により生成した。Ｔ７プロモーター、転写用配列、及びポリアデニル化領域を含有するプラスミドＤＮＡをＸｂａＩと３７℃で２時間インキュベートすることにより直線化し、用いた条件は、２００ｎｇ／μＬのプラスミド、２Ｕ／μＬのＸｂａＩ（ＮＥＢ）、及び１×反応緩衝液であった。反応物を６５℃で２０分間加熱することによりＸｂａＩを不活性化した。線状化プラスミドを酵素及び緩衝塩から精製した。修飾ｍＲＮＡを生成するためのＩＶＴ反応は、以下の条件で３７℃にて１．５～４時間インキュベートすることにより実施された：５０ｎｇ／μＬの線状化プラスミド、２～５ｍＭずつのＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＮ１-メチルプセウド-ＵＴＰ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）、１０～２５ｍＭ ＡＲＣＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）、５Ｕ／μＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、１Ｕ／μＬのマウスＲＮａｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）、０．００４Ｕ／μＬの無機Ｅ．ｃｏｌｉピロホスファターゼ（ＮＥＢ）、ならびに１×反応緩衝液。ＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を加えて最終濃度を０．０１Ｕ／μＬとし、反応物をさらに３０分間インキュベートしてＤＮＡ鋳型を除去した。ｍＲＮＡを、ＭｅｇａＣｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎ-ｕｐキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）またはＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の操作手順に従って使用して精製した。
別法として、ｍＲＮＡを沈殿操作手順により精製し、その後、場合によってはＨＰＬＣを用いる精製を行った。簡単に言えば、ＤＮａｓｅ消化の後、ＬｉＣｌ沈殿、酢酸アンモニウム沈殿及び酢酸ナトリウム沈殿を使用してｍＲＮＡを精製する。ＨＰＬＣで精製したｍＲＮＡの場合、ｍＲＮＡを、ＬｉＣｌ沈殿及び再調製の後、ＲＰ-ＩＰ ＨＰＬＣによって精製した（例えば、Ｋａｒｉｋｏ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１，Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．２１ ｅ１４２を参照のこと）。プール用に選択された画分を合わせ、上記のように、酢酸ナトリウム／エタノール沈殿により脱塩した。さらなる代替方法では、ｍＲＮＡをＬｉＣｌ沈殿法で精製し、その後、接線流濾過によりさらなる精製を行った。２６０ｎｍでの吸光度を測定することによって（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）ＲＮＡ濃度を決定し、転写産物を、Ｂｉｏａｎｌａｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるキャピラリー電気泳動によって分析した。
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（「Ｓｐｙ」）Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを、配列番号９及び１０（追加の配列表の配列を参照のこと）に記載のオープンリーディングフレームをコードするプラスミドＤＮＡから生成した。本段落で引用されている配列が以下でＲＮＡに関して言及される場合、ＴをＵで置き換えるべきであることが理解される（これは、上記のような修飾ヌクレオシドであり得る）。実施例において使用されるメッセンジャーＲＮＡには、５’キャップ及び３’ポリアデニル化配列（例えば最大１００ｎｔ）が含まれ、それらは追加の配列表で確認される。
ガイドＲＮＡは、当該技術分野で知られている方法により化学合成される。
化合物合成
一般情報
すべての試薬及び溶媒を購入し、商業ベンダーから受け取った状態のまま使用するかまたは引用されている手順に従って合成した。すべての中間体及び最終化合物は、フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィーを使用して精製した。ＮＭＲスペクトルは、ＢｒｕｋｅｒまたはＶａｒｉａｎ ４００ ＭＨｚ分光計で記録され、ＮＭＲデータは、ＣＤＣｌ３中で雰囲気温度にて収集された。化学シフトは、ＣＤＣｌ３（７．２６）に対する百万分率（ｐｐｍ）で報告される。１Ｈ ＮＭＲのデータは以下として報告される：化学シフト、多重度（ｂｒ＝幅広線、ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｑ＝四重線、ｄｄ＝二重の二重線、ｄｔ＝二重の三重線、ｍ＝多重線）、結合定数、及び積分。ＭＳデータは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）イオン源を用いてＷａｔｅｒｓ ＳＱＤ２質量分析計で記録された。最終化合物の純度は、ＳＱＤ２質量分析計を備えたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｈ-Ｃｌａｓｓ液体クロマトグラフィー装置をフォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器及び蒸発光散乱（ＥＬＳ）検出器と共に使用して、ＵＰＬＣ-ＭＳ-ＥＬＳにより決定された。

Figure 2024516376000062
Figure 2024516376000063
実施例２-化合物１
中間体１ａ：（Ｅ）-Ｎ，Ｎ-ジメチル-Ｎ’-（４-メチル-５-ニトロピリジン-２-イル）ホルムイミドアミド

Figure 2024516376000064
 ４-メチル-５-ニトロ-ピリジン-２-アミン（５ｇ、１．０当量）のトルエン溶液（０．３Ｍ）に、ＤＭＦ-ＤＭＡ（３．０当量）を加えた。混合物を１１０℃で２時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して残渣を得、カラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物を黄色固体として得た（５９％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ８．８２ （ｓ， １Ｈ）， ８．６３ （ｓ， １Ｈ）， ６．７４ （ｓ， １Ｈ）， ３．２１ （ｍ， ６Ｈ）．
中間体１ｂ：（Ｅ）-Ｎ-ヒドロキシ-Ｎ’-（４-メチル-５-ニトロピリジン-２-イル）ホルムイミドアミド
Figure 2024516376000065
 中間体１ａ（４ｇ、１．０当量）のＭｅＯＨ溶液（０．２Ｍ）に、ＮＨ２ＯＨ・ＨＣｌ（２．０当量）を加えた。反応混合物を８０℃で１時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣を、Ｈ２ＯとＥｔＯＡｃに分配し、ＥｔＯＡｃで抽出を２回行った。有機相を減圧下で濃縮して残渣を得、カラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物を白色固体として得た（６６％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ １０．５２ （ｄ， Ｊ ＝ ３．８ Ｈｚ， １Ｈ）， １０．０８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ９．９， ３．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．８４ （ｄ， Ｊ ＝ ３．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．８５ （ｄｄ， Ｊ ＝ ９．７， ３．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．０１ （ｄ， Ｊ ＝ ３．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．３６ （ｓ， ３ Ｈ）．
中間体１ｃ：７-メチル-６-ニトロ-［１，２，４］トリアゾロ［１，５-ａ］ピリジン
Figure 2024516376000066
 中間体１ｂ（２．５ｇ、１．０当量）のＴＨＦ溶液（０．４Ｍ）に、トリフルオロ酢酸無水物（１．０当量）を０℃で加えた。混合物を２５℃で１８時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物を白色固体として得た（４４％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ９．５３ （ｓ， １Ｈ）， ８．４９ （ｓ， １Ｈ）， ７．６９ （ｓ， １Ｈ）， ２．７８ （ｄ， Ｊ ＝ １．０ Ｈｚ， ３Ｈ）．
中間体１ｄ：７-メチル-［１，２，４］トリアゾロ［１，５-ａ］ピリジン-６-アミン
Figure 2024516376000067
 Ｐｄ／Ｃ（１０ｗ／ｗ％、０．２当量）の混合物のＥｔＯＨ溶液（０．１Ｍ）に、中間体１ｃ（１．０当量）及びギ酸アンモニウム（５．０当量）を加えた。混合物を１０５℃で２時間加熱した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物を淡褐色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ８．４１ （ｓ， ２Ｈ）， ８．０７ （ｄ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．４３ （ｓ， １Ｈ）， ２．２２ （ｓ， ３Ｈ）．
中間体１ｅ：２-クロロ-４-（（テトラヒドロ-２Ｈ-ピラン-４-イル）アミノ）ピリミジン-５-カルボン酸エチル
Figure 2024516376000068
 テトラヒドロピラン-４-アミン（５ｇ、１．０当量）及び２，４-ジクロロピリミジン-５-カルボン酸エチル（１．０当量）のＭｅＣＮ溶液（０．２５～２．０Ｍ）に、Ｋ２ＣＯ３（１．０～-３．０当量）を加えた。混合物を２０～２５℃で少なくとも１２時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物を淡黄色固体として得た（２１％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ８．６０ （ｓ， １Ｈ）， ８．２９ （ｄ， Ｊ ＝ ７．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．２８ （ｑ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．１４ （ｄｔｔ， Ｊ ＝ １１．３， ８．３， ４．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．８２ （ｄｔ， Ｊ ＝ １２．１， ３．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５７ （ｓ， １Ｈ）， １．８７ － １．７８ （ｍ， ２Ｈ）， １．７６ － １．６７ （ｍ， １Ｈ）， １．５４ （ｑｄ， Ｊ ＝ １０．９， ４．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．２８ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ３Ｈ）．
中間体１ｆ：２-クロロ-４-（（テトラヒドロ-２Ｈ-ピラン-４-イル）アミノ）ピリミジン-５-カルボン酸
Figure 2024516376000069
 ＬｉＯＨ（２．５当量）のＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（１：１）溶液（０．２５～１．０Ｍ）に、中間体１ｅ（３．０ｇ、１．０当量）を加えた。混合物を２５℃で１２時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮してＴＨＦを除去した。残渣を２Ｍ ＨＣｌによりｐＨ２に調整し、得られた沈殿物を濾過により回収し、水で洗浄し、真空下で乾燥させて残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物を白色固体として得る（７４％）か、または粗生成物として直接使用した。
中間体１ｇ：２-クロロ-９-（テトラヒドロ-２Ｈ-ピラン-４-イル）-７，９-ジヒドロ-８Ｈ-プリン-８-オン
Figure 2024516376000070
 中間体１ｆ（２ｇ、１．０当量）のＭｅＣＮ溶液（０．２～０．５Ｍ）に、Ｅｔ３Ｎ（１．０当量）を加えた。混合物を２５℃で３０分間撹拌した。次いで、混合物にＤＰＰＡ（１．０当量）を加えた。混合物を１００℃で少なくとも７時間撹拌した。反応混合物を水に注ぎ、得られた沈殿物を濾過により回収し、水で洗浄し、真空下で乾燥させて残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物を白色固体として得た（５６％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ９．５０ （ｓ， １Ｈ）， ８．０９ （ｓ， １Ｈ）， ４．５３ （ｔｔ， Ｊ ＝ １２．４， ４．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０７ （ｄｔ， Ｊ ＝ ９．５， ４．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４８ （ｔｄ， Ｊ ＝ １２．１， １．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６９ （ｑｄ， Ｊ ＝ １２．５， ４．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６７ （ｄｄ， Ｊ ＝ １２．１， ３．９ Ｈｚ， ２Ｈ）．
中間体１ｈ：２-クロロ-７-メチル-９-（テトラヒドロ-２Ｈ-ピラン-４-イル）-７，９-ジヒドロ-８Ｈ-プリン-８-オン
Figure 2024516376000071
 中間体１ｇ（３００ｍｇ、１．０当量）及びＮａＯＨ（５．０当量）の混合物のＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（１：１）溶液（０．２５～１．０Ｍ）に、ヨードメタン（２．０当量）を加えた。反応混合物を２５℃で１２時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して残渣を得、カラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物を白色固体として得た（４７％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ８．３４ （ｓ， １Ｈ）， ４．４３ （ｄｄｔ， Ｊ ＝ １２．２， ８．５， ４．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９５ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．５， ４．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４３ （ｔｄ， Ｊ ＝ １２．１， １．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４５ （ｓ， ３Ｈ）， ２．４０ （ｔｄ， Ｊ ＝ １２．５， ４．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６６ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．２， ４．４， １．９ Ｈｚ， ２Ｈ）．
化合物１：７-メチル-２-（（７-メチル-［１，２，４］トリアゾロ［１，５-ａ］ピリジン-６-イル）アミノ）-９-（テトラヒドロ-２Ｈ-ピラン-４-イル）-７，９-ジヒドロ-８Ｈ-プリン-８-オン
Figure 2024516376000072
 中間体１ｈ（１．３ｇ、１．０当量）、中間体１ｄ（１．０当量）、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（０．１～０．２当量）、ＸａｎｔＰｈｏｓ（０．１～０．２当量）及びＣｓ２ＣＯ３（２．０当量）の混合物のＤＭＦ溶液（０．０５～０．３Ｍ）を脱気してＮ２で３回パージし、混合物をＮ２雰囲気下、１００～１３０℃で少なくとも１２時間撹拌した。その後、反応混合物を水に注ぎ、ＤＣＭで３回抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて濾過し、濾液を真空濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物を淡黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ９．１３ （ｓ， １Ｈ）， ８．６９ （ｓ， １Ｈ）， ８．３９ （ｓ， １Ｈ）， ８．１０ （ｓ， １Ｈ）， ７．７２ （ｓ， １Ｈ）， ４．５０ － ４．３６ （ｍ， １Ｈ）， ３．９８ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．６， ４．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４４ （ｄ， Ｊ ＝ １１．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３２ （ｓ， ３Ｈ）， ２．４４ － ２．３８ （ｍ， ３Ｈ）， １．６９ （ｄ， Ｊ ＝ １１．６ Ｈｚ， ２Ｈ）． ＭＳ： ３８１．３ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
実施例３-化合物２
中間体２ａ：２-クロロ-７-エチル-９-（テトラヒドロ-２Ｈ-ピラン-４-イル）-７，９-ジヒドロ-８Ｈ-プリン-８-オン
Figure 2024516376000073
 中間体１ｈ（８００ｍｇ、１．０当量）及びＮａＯＨ（５．０当量）の混合物を溶解させたＴＨＦ（０．４Ｍ）とＨ２Ｏとの混合液（０．８Ｍ）に、ＥｔＩ（３．０当量）を加えた。反応混合物を２０℃で１２時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して残渣を得、カラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物を白色固体として得た（４５％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ８．５０ （ｓ， １Ｈ）， ４．５２ （ｔｔ， Ｊ ＝ １２．２， ４．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０３ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．５， ４．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．９５ （ｑ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５１ （ｔｄ， Ｊ ＝ １２．１， １．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４８ （ｔｄ， Ｊ ＝ １２．５， ４．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７９ － １．７１ （ｍ， ２Ｈ）， １．３１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ３Ｈ）．
化合物２：７-エチル-２-（（７-メチル-［１，２，４］トリアゾロ［１，５-ａ］ピリジン-６-イル）アミノ）-９-（テトラヒドロ-２Ｈ-ピラン-４-イル）-７，９-ジヒドロ-８Ｈ-プリン-８-オン
Figure 2024516376000074
 化合物２を、化合物１の場合に用いた方法を使用して、中間体１ｄ及び中間体２ａからのＴＦＡ塩として合成し、その後、逆相ＨＰＬＣによる精製を行った。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ９．１１ （ｓ， １Ｈ）， ８．６９ （ｓ， １Ｈ）， ８．３８ （ｓ， １Ｈ）， ８．１５ （ｓ， １Ｈ）， ７．７１ （ｔ， Ｊ ＝ １．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．４２ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．１， ７．９， ４．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９６ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．７， ４．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．８３ （ｑ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４１ （ｔ， Ｊ ＝ １１．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４０ （ｄ， Ｊ ＝ １．０ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．６８ （ｄ， Ｊ ＝ １１．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．２３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， ３Ｈ）． ＭＳ： ３９５．３ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
実施例４-化合物３
中間体３ａ：２-クロロ-４-（（４，４-ジフルオロシクロヘキシル）アミノ）ピリミジン-５-カルボン酸エチル
Figure 2024516376000075
 中間体３ａを、中間体１ｅで用いた方法を使用して、２，４-ジクロロピリミジン-５-カルボン酸エチル及び４，４-ジフルオロシクロヘキサンアミン塩酸塩から合成した。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ８．６１ （ｓ， １Ｈ）， ８．３０ （ｄ， Ｊ ＝ ７．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．２９ （ｑ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．１９ － ４．０９ （ｍ， １Ｈ）， ２．０９ － １．９０ （ｍ， ６Ｈ）， １．６９ － １．５８ （ｍ， ２Ｈ）， １．２９ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ３Ｈ）．
中間体３ｂ：２-クロロ-４-（（４，４-ジフルオロシクロヘキシル）アミノ）ピリミジン-５-カルボン酸
Figure 2024516376000076
 中間体３ｂを、中間体１ｆで用いた方法を使用して、中間体３ａから合成した（７８％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ １３．７７ （ｓ， １Ｈ）， ８．５７ （ｓ， １Ｈ）， ８．５３ （ｄ， Ｊ ＝ ７．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１２ （ｄ， Ｊ ＝ １０．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．１４ － １．８９ （ｍ， ６Ｈ）， １．６２ （ｄｄｔ， Ｊ ＝ １７．０， １０．３， ６．０ Ｈｚ， ２Ｈ）．
中間体３ｃ：２-クロロ-９-（４，４-ジフルオロシクロヘキシル）-７，９-ジヒドロ-８Ｈ-プリン-８-オン
Figure 2024516376000077
 中間体３ｃを、中間体１ｇで用いた方法を使用して、中間体３ｂから合成した（５６％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ １１．７６ － １１．６５ （ｍ， １Ｈ）， ８．２０ （ｓ， １Ｈ）， ４．４７ （ｄｑ， Ｊ ＝ １２．６， ６．２， ４．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．３４ － １．９７ （ｍ， ６Ｈ）， １．９０ （ｄ， Ｊ ＝ １２．９ Ｈｚ， ２Ｈ）．
中間体３ｄ：２-クロロ-９-（４，４-ジフルオロシクロヘキシル）-７-メチル-７，９-ジヒドロ-８Ｈ-プリン-８-オン
Figure 2024516376000078
 中間体３ｃ（１．４ｇ、１．０当量）、ＮａＯＨ（５．０当量）の混合物のＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（５：１）溶液（０．３Ｍ）に、ＭｅＩ（２．０当量）を加えた。混合物をＮ２雰囲気下、２０℃で１２時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して残渣を得、カラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物を黄色固体として得た（４７％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ８．０１ （ｓ， １Ｈ）， ４．５３ － ４．３９ （ｍ， １Ｈ）， ３．４３ （ｓ， ３Ｈ）， ２．７３ （ｑｄ， Ｊ ＝ １２．７， １２．１， ３．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３２ － ２．２０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．０３ － １．８２ （ｍ， ４Ｈ）．
化合物３：９-（４，４-ジフルオロシクロヘキシル）-７-メチル-２-（（７-メチル-［１，２，４］トリアゾロ［１，５-ａ］ピリジン-６-イル）アミノ）-７，９-ジヒドロ-８Ｈ-プリン-８-オン
Figure 2024516376000079
 化合物３を、化合物１の場合に用いた方法を使用して、中間体１ｄ及び中間体３ｄから合成し、その後、逆相ＨＰＬＣによる精製を行った。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ９．０３ （ｓ， １Ｈ）， ８．６６ （ｓ， １Ｈ）， ８．３８ （ｓ， １Ｈ）， ８．１０ （ｓ， １Ｈ）， ７．７１ （ｄ， Ｊ ＝ １．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３６ （ｄ， Ｊ ＝ １２．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．３１ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３８ （ｄ， Ｊ ＝ １．０ Ｈｚ， ３Ｈ）， ２．１１ － １．９６ （ｍ， ４Ｈ）， １．８１ （ｄ， Ｊ ＝ １２．６ Ｈｚ， ２Ｈ）． ＭＳ： ４１５．５ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
実施例５-化合物４
中間体４ａ：８-メチレン-１，４-ジオキサスピロ［４．５］デカン
Figure 2024516376000080
 メチル（トリフェニル）ホスホニウムブロミド（１．１５当量）のＴＨＦ溶液（０．６Ｍ）に、ｎ-ＢｕＬｉ（１．１当量）を-７８℃で滴加し、混合物を０℃で１時間撹拌した。次いで、反応混合物に１，４-ジオキサスピロ［４．５］デカン-８-オン（５０ｇ、１．０当量）を加えた。混合物を２５℃で１２時間撹拌した。反応混合物をＮＨ４Ｃｌ水溶液に０℃で注ぎ、Ｈ２Ｏで希釈し、ＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層を減圧下で濃縮して残渣を得、カラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物を無色油状物として得た（５１％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．６７ （ｓ， １Ｈ）， ３．９６ （ｓ， ４ Ｈ）， ２．８２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ４ Ｈ）， １．７０ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ４ Ｈ）．
中間体４ｂ：７，１０-ジオキサジスピロ［２．２．４６．２３］ドデカン
Figure 2024516376000081
 中間体４ａ（５ｇ、１．０当量）のトルエン溶液（３Ｍ）に、ＺｎＥｔ２（２．５７当量）を-４０℃で滴加し、混合物を-４０℃で１時間撹拌した。次いで、混合物に、ジヨードメタン（６．０当量）をＮ２下、-４０℃で滴加した。次いで、混合物をＮ２雰囲気下、２０℃で１７時間撹拌した。反応混合物をＮＨ４Ｃｌ水溶液に０℃で注ぎ、ＥｔＯＡｃで２回抽出した。合わせた有機相をブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて濾過し、濾液を真空濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物を淡黄色油状物として得た（７３％）。
中間体４ｃ：スピロ［２．５］オクタン-６-オン
Figure 2024516376000082
 中間体４ｂ（４ｇ、１．０当量）のＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（１：１）溶液（１．０Ｍ）に、ＴＦＡ（３．０当量）を加えた。混合物をＮ２雰囲気下、２０℃で２時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮してＴＨＦを除去し、残渣を２Ｍ ＮａＯＨ（水溶液）でｐＨ７に調整した。混合物を水に注ぎ、ＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて濾過し、濾液を真空濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物を淡黄色油状物として得た（６８％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ２．３５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ４Ｈ）， １．６２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ４Ｈ）， ０．４２ （ｓ， ４Ｈ）．
中間体４ｄ：Ｎ-（４-メトキシベンジル）スピロ［２．５］オクタン-６-アミン
Figure 2024516376000083
 中間体４ｃ（２ｇ、１．０当量）及び（４-メトキシフェニル）メタンアミン（１．１当量）の混合物のＤＣＭ溶液（０．３Ｍ）に、ＡｃＯＨ（１．３当量）を加えた。混合物をＮ２雰囲気下、２０℃で１時間撹拌した。次いで、混合物に、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（３．３当量）を０℃で加え、混合物をＮ２雰囲気下、２０℃で１７時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮してＤＣＭを除去し、得られた残渣をＨ２Ｏで希釈し、ＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて濾過し、濾液を減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物を灰色固体として得た（５１％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ７．１５ － ７．０７ （ｍ， ２Ｈ）， ６．７７ － ６．６８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５８ （ｓ， ３Ｈ）， ３．５４ （ｓ， ２Ｈ）， ２．３０ （ｄｄｔ， Ｊ ＝ １０．１， ７．３， ３．７ Ｈｚ， １Ｈ）， １．６９ － １．６２ （ｍ， ２Ｈ）， １．３７ （ｔｄ， Ｊ ＝ １２．６， ３．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．１２ － １．０２ （ｍ， ２Ｈ）， ０．８７ － ０．７８ （ｍ， ２Ｈ）， ０．１３ － ０．０４ （ｍ， ２Ｈ）．
中間体４ｅ：スピロ［２．５］オクタン-６-アミン
Figure 2024516376000084
 Ｐｄ／Ｃ（１０ｗ／ｗ％、１．０当量）のＭｅＯＨ懸濁液（０．２５Ｍ）に中間体４ｄ（２ｇ、１．０当量）を加え、混合物をＨ２雰囲気下、８０℃、５０Ｐｓｉで２４時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して残渣を得、それをカラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ２．６１ （ｔｔ， Ｊ ＝ １０．８， ３．９ Ｈｚ， １Ｈ）， １．６３ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ ９．６， ５．１， ２．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．４７ （ｔｄ， Ｊ ＝ １２．８， ３．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．２１ － １．０６ （ｍ， ２Ｈ）， ０．８２ － ０．７２ （ｍ， ２Ｈ）， ０．１４ － ０．０５ （ｍ， ２Ｈ）．
中間体４ｆ：２-クロロ-４-（スピロ［２．５］オクタン-６-イルアミノ）ピリミジン-５-カルボン酸エチル
Figure 2024516376000085
 中間体４ｆを、中間体１ｅで用いた方法を使用して、中間体４ｅから合成した（５４％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ８．６４ （ｓ， １Ｈ）， ８．４１ （ｄ， Ｊ ＝ ７．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３３ （ｑ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．０８ （ｄ， Ｊ ＝ ９．８ Ｈｚ， １Ｈ）， １．９０ （ｄｄ， Ｊ ＝ １２．７， ４．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６４ （ｔ， Ｊ ＝ １２．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５２ （ｑ， Ｊ ＝ １０．７， ９．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．３３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．１２ （ｄ， Ｊ ＝ １３．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ０．４０ － ０．２１ （ｍ， ４Ｈ）．
中間体４ｇ：２-クロロ-４-（スピロ［２．５］オクタン-６-イルアミノ）ピリミジン-５-カルボン酸
Figure 2024516376000086
 中間体４ｇを、中間体１ｆで用いた方法を使用して、中間体４ｆから合成した（８２％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ １３．５４ （ｓ， １Ｈ）， ８．３８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．３５ （ｓ， １Ｈ）， ３．８２ （ｑｔ， Ｊ ＝ ８．２， ３．７ Ｈｚ， １Ｈ）， １．６６ （ｄｑ， Ｊ ＝ １２．８， ４．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．４７ － １．３４ （ｍ， ２Ｈ）， １．３３ － １．２０ （ｍ， ２Ｈ）， ０．８６ （ｄｔ， Ｊ ＝ １３．６， ４．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ０．０８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．３， ４．８ Ｈｚ， ４Ｈ）．
中間体４ｈ：２-クロロ-９-（スピロ［２．５］オクタン-６-イル）-７，９-ジヒドロ-８Ｈ-プリン-８-オン
Figure 2024516376000087
 中間体４ｈを、中間体１ｇで用いた方法を使用して、中間体４ｇから合成した（６７％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ １１．６８ （ｓ， １Ｈ）， ８．１８ （ｓ， １Ｈ）， ４．２６ （ｄｄｔ， Ｊ ＝ １２．３， ７．５， ３．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．４２ （ｑｄ， Ｊ ＝ １２．６， ３．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．９５ （ｔｄ， Ｊ ＝ １３．３， ３．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．８２ － １．６９ （ｍ， ２Ｈ）， １．０８ － ０．９５ （ｍ， ２Ｈ）， ０．３９ （ｔｄｑ， Ｊ ＝ １１．６， ８．７， ４．２， ３．５ Ｈｚ， ４Ｈ）．
中間体４ｉ：２-クロロ-７-メチル-９-（スピロ［２．５］オクタン-６-イル）-７，９-ジヒドロ-８Ｈ-プリン-８-オン
Figure 2024516376000088
 中間体４ｉを、中間体１ｈで用いた方法を使用して、中間体４ｈから合成した（６７％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ７．５７ （ｓ， １Ｈ）， ４．０３ （ｔｔ， Ｊ ＝ １２．５， ３．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．０３ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１７ （ｑｄ， Ｊ ＝ １２．６， ３．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６０ （ｔｄ， Ｊ ＝ １３．４， ３．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．４７ － １．３４ （ｍ， ２Ｈ）， １．０７ （ｓ， １Ｈ）， ０．６３ （ｄｐ， Ｊ ＝ １４．０， ２．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， -０．０５ （ｓ， ４Ｈ）．
化合物４：７-メチル-２-（（７-メチル-［１，２，４］トリアゾロ［１，５-ａ］ピリジン-６-イル）アミノ）-９-（スピロ［２．５］オクタン-６-イル）-７，９-ジヒドロ-８Ｈ-プリン-８-オン
Figure 2024516376000089
 化合物４を、化合物１で用いた方法を使用して、中間体４ｉ及び中間体１ｄから合成した。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ９．０９ （ｓ， １Ｈ）， ８．７３ （ｓ， １Ｈ）， ８．４４ （ｓ， １Ｈ）， ８．１６ （ｓ， １Ｈ）， ７．７８ （ｓ， １Ｈ）， ４．２１ （ｔ， Ｊ ＝ １２．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．３６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．４３ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３４ （ｄｔ， Ｊ ＝ １３．０， ６．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．９３ － １．７７ （ｍ， ２Ｈ）， １．７７ － １．６２ （ｍ， ２Ｈ）， ０．９１ （ｄ， Ｊ ＝ １３．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ０．３１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ２Ｈ）． ＭＳ： ４０５．５ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
実施例６-化合物５
中間体５ａ：２-クロロ-４-（（３-ヒドロキシシクロブチル）アミノ）ピリミジン-５-カルボン酸エチル
Figure 2024516376000090
 中間体５ａを、中間体１ｅで用いた方法を使用して、３-アミノシクロブタノールから合成した（４９％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ， 回転異性体の混合物） δ ８．６２ （ｓ， １Ｈ）， ８．４５ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２５．７， ７．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ５．１７ （ｄｄ， Ｊ ＝ ６．０， ２．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３２ （ｑ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．９６ （ｄｐ， Ｊ ＝ ５０．４， ７．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６７ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １１．６， ５．８， ２．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．２５ （ｔｄ， Ｊ ＝ ８．１， ７．０， ４．０ Ｈｚ， １Ｈ）， １．８５ （ｑｄ， Ｊ ＝ ８．７， ２．８ Ｈｚ， １Ｈ）， １．３２ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ３Ｈ）．
中間体５ｂ：２-クロロ-４-（（３-ヒドロキシシクロブチル）アミノ）ピリミジン-５-カルボン酸
Figure 2024516376000091
 中間体５ｂを、中間体１ｆで用いた方法を使用して、中間体５ａから合成した（６７％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ， 回転異性体の混合物） δ １３．８２ （ｓ， １Ｈ）， ８．７０ （ｄｄ， Ｊ ＝ ２５．０， ７．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．６３ （ｓ， １Ｈ）， ４．６５ － ４．２９ （ｍ， １Ｈ）， ４．１７ － ４．０２ （ｍ， １Ｈ）， ３．９５ （ｐ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．７４ （ｄｈ， Ｊ ＝ １１．８， ３．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３０ （ｔ， Ｊ ＝ ６．２ Ｈｚ， １Ｈ）， １．８８ （ｑｄ， Ｊ ＝ ８．５， ２．８ Ｈｚ， １Ｈ）．
中間体５ｃ：２-クロロ-９-（３-ヒドロキシシクロブチル）-７，９-ジヒドロ-８Ｈ-プリン-８-オン
Figure 2024516376000092
 中間体５ｃを、中間体１ｇで用いた方法を使用して、中間体５ｂから合成した。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ， 回転異性体の混合物） δ ８．１２ （ｄ， Ｊ ＝ １．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．２９ － ７．１３ （ｍ， １Ｈ）， ４．２６ （ｔｔ， Ｊ ＝ ９．８， ７．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．００ － ３．８７ （ｍ， １Ｈ）， ２．７８ （ｄｔｄ， Ｊ ＝ ９．９， ８．１， ２．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５９ － ２．５２ （ｍ， ２Ｈ）．
中間体５ｄ：２-クロロ-９-（３-ヒドロキシシクロブチル）-７-メチル-７，９-ジヒドロ-８Ｈ-プリン-８-オン
Figure 2024516376000093
 中間体５ｄを、中間体１ｈで用いた方法を使用して、中間体５ｃから合成した（６１％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ８．３２ （ｄ， Ｊ ＝ ２．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．２６ （ｔｔ， Ｊ ＝ ９．８， ７．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９８ － ３．８５ （ｍ， １Ｈ）， ３．３１ （ｄ， Ｊ ＝ ２．４ Ｈｚ， ３Ｈ）， ２．８１ － ２．６５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５３ （ｄｄｔ， Ｊ ＝ ７．５， ４．１， ２．０ Ｈｚ， ２Ｈ）．
化合物５：９-（３-ヒドロキシシクロブチル）-７-メチル-２-（（７-メチル-［１，２，４］トリアゾロ［１，５-ａ］ピリジン-６-イル）アミノ）-７，９-ジヒドロ-８Ｈ-プリン-８-オン
Figure 2024516376000094
 化合物５を、化合物１で用いた方法を使用して、中間体５ｄ及び中間体１ｄから合成した。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ９．１５ （ｓ， １Ｈ）， ８．６１ （ｓ， １Ｈ）， ８．３８ （ｓ， １Ｈ）， ８．１０ （ｓ， １Ｈ）， ７．７２ （ｓ， １Ｈ）， ５．１５ （ｄ， Ｊ ＝ ６．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．２６ － ４．１７ （ｍ， １Ｈ）， ３．９４ （六重線， Ｊ ＝ ６．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．３０ （ｓ， ３Ｈ）， ２．７８ （ｑｄ， Ｊ ＝ ８．３， ２．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．６１ － ２．５４ （ｍ， ２Ｈ）， ２．４１ － ２．３９ （ｍ， ３Ｈ）． ＭＳ： ３６７．４ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
実施例７-化合物６
中間体６ａ：６-クロロ-４-（（テトラヒドロ-２Ｈ-ピラン-４-イル）アミノ）ニコチン酸エチル
Figure 2024516376000095
 中間体６ａを、中間体１ｅで用いた方法を使用して、４，６-ジクロロピリジン-３-カルボキシラート及びテトラヒドロピラン-４-アミンから合成した（４６％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ８．６１ （ｓ， １Ｈ）， ８．１３ （ｄ， Ｊ ＝ ７．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．０５ （ｓ， １Ｈ）， ４．３６ （ｑ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．９０ （ｄｔ， Ｊ ＝ １１．７， ３．８ Ｈｚ， ３Ｈ）， ３．５４ （ｔｄ， Ｊ ＝ １１．４， ２．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．９６ （ｄｄ， Ｊ ＝ １２．６， ３．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５２ （ｄｔｄ， Ｊ ＝ １２．７， １０．６， ４．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．３８ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ３Ｈ）．
中間体６ｂ：６-クロロ-４-（（テトラヒドロ-２Ｈ-ピラン-４-イル）アミノ）ニコチン酸
Figure 2024516376000096
 中間体６ｂを、中間体１ｆで用いた方法を使用して、中間体６ａから合成した（７４％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ８．５７ （ｓ， １Ｈ）， ８．３６ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．００ （ｓ， １Ｈ）， ３．９２ － ３．８１ （ｍ， ３Ｈ）， ３．５４ （ｔｄ， Ｊ ＝ １１．４， ２．２ Ｈｚ， ３Ｈ）， ２．０４ － １．９０ （ｍ， ２Ｈ）， １．５６ － １．４２ （ｍ， ２Ｈ）．
中間体６ｃ：６-クロロ-１-（テトラヒドロ-２Ｈ-ピラン-４-イル）-１，３-ジヒドロ-２Ｈ-イミダゾ［４，５-ｃ］ピリジン-２-オン
Figure 2024516376000097
 中間体６ｃを、中間体１ｇで用いた方法を使用して、中間体６ｂから合成した（７６％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ １１．３２ （ｓ， １Ｈ）， ７．９４ （ｓ， １Ｈ）， ７．４４ （ｓ， １Ｈ）， ４．３８ （ｔｔ， Ｊ ＝ １２．２， ４．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９４ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．５， ４．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４２ （ｔｄ， Ｊ ＝ １１．９， １．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３１ （ｑｄ， Ｊ ＝ １２．４， ４．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６９ － １．５６ （ｍ， ２Ｈ）．
中間体６ｄ：６-クロロ-３-メチル-１-（テトラヒドロ-２Ｈ-ピラン-４-イル）-１，３-ジヒドロ-２Ｈ-イミダゾ［４，５-ｃ］ピリジン-２-オン
Figure 2024516376000098
 中間体６ｄを、中間体１ｈで用いた方法を使用して、中間体６ｃのＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（２：１）溶液から合成した（６３％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ８．１５ （ｓ， １Ｈ）， ７．５０ （ｓ， １Ｈ）， ４．４３ （ｔｔ， Ｊ ＝ １２．１， ４．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．９４ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．５， ４．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４３ （ｔｄ， Ｊ ＝ １１．９， １．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３２ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３２ （ｑｄ， Ｊ ＝ １２．４， ４．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６３ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．２， ４．３， １．９ Ｈｚ， ２Ｈ）．
化合物６：３-メチル-６-（（７-メチル-［１，２，４］トリアゾロ［１，５-ａ］ピリジン-６-イル）アミノ）-１-（テトラヒドロ-２Ｈ-ピラン-４-イル）-１，３-ジヒドロ-２Ｈ-イミダゾ［４，５-ｃ］ピリジン-２-オン
Figure 2024516376000099
 化合物６を、化合物１で用いた方法を使用して、中間体６ｄ及び中間体１ｆから合成した。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ９．７８ （ｓ， １Ｈ）， ８．３１ （ｓ， １Ｈ）， ８．０３ （ｓ， １Ｈ）， ８．００ （ｓ， １Ｈ）， ７．６９ （ｓ， １Ｈ）， ７．２４ （ｓ， １Ｈ）， ４．４４ （ｄ， Ｊ ＝ １２．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０４ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．６， ４．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．５２ （ｔ， Ｊ ＝ １１．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．５０ － ２．４６ （ｍ， ３Ｈ）， ２．３２ （ｔｔ， Ｊ ＝ １２．３， ７．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．７５ － １．６７ （ｍ， ２Ｈ）． ＭＳ： ３８０．４ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
実施例８-化合物７
中間体７ａ：４，６-ジメチル-５-ニトロピリジン-２-アミン
Figure 2024516376000100
 ４，６-ジメチルピリジン-２-アミン（５０ｇ、１．０当量）のＨ２ＳＯ４溶液に、ＨＮＯ３（３．２５当量）及びＨ２ＳＯ４（２．３当量）の混合物を-１０℃で滴加した。添加後、混合物をこの温度で１時間撹拌した。反応混合物を、ＮＨ３・Ｈ２Ｏの０℃での滴加によりクエンチし、Ｈ２Ｏで希釈し、ＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層を減圧下で濃縮して残渣を得、カラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物を黄色固体として得た（１９％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ７．７０ （ｓ， １Ｈ）， ２．５３ （ｓ， ３Ｈ）， ２．４５ （ｓ， ３Ｈ）．
中間体７ｂ：（Ｅ）-Ｎ’-（４，６-ジメチル-５-ニトロピリジン-２-イル）-Ｎ，Ｎ-ジメチルホルムイミドアミド
Figure 2024516376000101
 中間体７ａ（１１．８ｇ、１．０当量）及びＤＭＦ-ＤＭＡ（１．１当量）を溶解させたトルエン溶液（０．７Ｍ）を脱気してＮ２で３回パージし、混合物をＮ雰囲気下、１１０℃で２時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して残渣を得、追加の精製をせずに次の反応で直接使用した。
中間体７ｃ：（Ｅ）-Ｎ’-（４，６-ジメチル-５-ニトロピリジン-２-イル）-Ｎ-ヒドロキシホルムイミドアミド
Figure 2024516376000102
 中間体７ｂ（１０ｇ、１．０当量）、ヒドロキシルアミン塩酸塩（２．０当量）の混合物のＭｅＯＨ溶液（０．４～０．５Ｍ）を脱気してＮ２で３回パージし、混合物をＮ２雰囲気下、８０℃で１時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、得られた残渣をＮａＨＣＯ３水溶液で希釈し、ＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層を減圧下で濃縮し、カラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物（１９％）を黄色固体としてを得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ９．９７ （ｄ， Ｊ ＝ ９．６ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．２７ （ｄ， Ｊ ＝ ９．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．６８ （ｓ， １Ｈ）， ２．５４ （ｓ， ３Ｈ）， ２．４６ （ｓ， ３Ｈ）．
中間体７ｄ：５，７-ジメチル-６-ニトロ-［１，２，４］トリアゾロ［１，５-ａ］ピリジン
Figure 2024516376000103
 中間体７ｃ（２．２ｇ、１．０当量）の混合物のＴＨＦ溶液（０．５Ｍ）に、ＴＦＡＡ（１．５当量）を加えた。混合物をＮ２雰囲気下、２５℃で１８時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去した。残渣をＮａＨＣＯ３水溶液で希釈し、ＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層を減圧下で濃縮し、カラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物を淡黄色固体として得た（５５％）。
中間体７ｅ：５，７-ジメチル-［１，２，４］トリアゾロ［１，５-ａ］ピリジン-６-アミン
Figure 2024516376000104
 中間体７ｄ（１．１ｇ、１．０当量）のＥｔＯＨ溶液（０．５～０．６Ｍ）に、ＮＨ４ＣＯ２Ｈ（１．０当量）及びＰｄ／Ｃ（１０ｗ／ｗ％、１．０当量）を加えた。混合物を１０５℃で２時間撹拌した。反応混合物を濾過して減圧下で濃縮し、カラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物を白色固体として得た（６４％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ８．１５ （ｓ， １Ｈ）， ７．３８ （ｓ， １Ｈ）， ４．７７ （ｓ， ２Ｈ）， ２．５８ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２８ （ｓ， ３Ｈ）．
化合物７：６-（（５，７-ジメチル-［１，２，４］トリアゾロ［１，５-ａ］ピリジン-６-イル）アミノ）-３-メチル-１-（テトラヒドロ-２Ｈ-ピラン-４-イル）-１，３-ジヒドロ-２Ｈ-イミダゾ［４，５-ｃ］ピリジン-２-オン
Figure 2024516376000105
 中間体７ｅ（１．０当量）、中間体６ｄ（１．０当量）、ＢｒｅｔｔＰｈｏｓ Ｐｄ Ｇ３（０．１当量）、Ｃｓ２ＣＯ３（２．０当量）の混合物のＤＭＦ溶液（０．１５Ｍ）を脱気してＮ２で３回パージし、混合物をＮ２雰囲気下、１００℃で１８時間撹拌した。反応混合物を水に注ぎ、ＤＣＭで３回抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて濾過し、濾液を真空濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物を淡黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ８．４４ （ｓ， １Ｈ）， ８．０５ （ｓ， １Ｈ）， ７．７１ （ｓ， １Ｈ）， ７．６３ （ｓ， １Ｈ）， ６．６８ （ｓ， １Ｈ）， ４．０６ － ３．９６ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５０ （ｄ， Ｊ ＝ １１．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．２６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．６０ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２９ （ｓ， ５Ｈ）， １．７０ （ｄ， Ｊ ＝ １１．５ Ｈｚ， ２Ｈ）． ＭＳ： ３９４．４ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
実施例９-化合物８
化合物８：２-（（５，７-ジメチル-［１，２，４］トリアゾロ［１，５-ａ］ピリジン-６-イル）アミノ）-７-メチル-９-（テトラヒドロ-２Ｈ-ピラン-４-イル）-７，９-ジヒドロ-８Ｈ-プリン-８-オン
Figure 2024516376000106
 中間体７ｅ（１．０当量）、中間体１ｈ（１．０当量）、Ｃｓ２ＣＯ３（２．０当量）、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（０．２当量）、ＸａｎｔＰｈｏｓ（０．４当量）の混合物のＤＭＦ溶液（０．１～０．２Ｍ）を脱気してＮ２で３回パージし、次いで、混合物をＮ２雰囲気下、１３０℃で２４時間撹拌した。混合物を水に注ぎ、ＤＣＭで３回抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて濾過し、濾液を真空濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物を茶色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ８．７６ （ｓ， １Ｈ）， ８．４９ （ｓ， １Ｈ）， ７．９８ （ｓ， １Ｈ）， ７．６８ （ｓ， １Ｈ）， ４．４４ （ｓ， １Ｈ）， ４．０３ － ３．９３ （ｍ， ２Ｈ）， ３．４７ （ｄ， Ｊ ＝ １２．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．３２ （ｓ， ３Ｈ）， ２．６４ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３４ （ｓ， ３Ｈ）， １．７１ （ｄ， Ｊ ＝ １２．３ Ｈｚ， ２Ｈ）． ＭＳ： ３９５．４ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
実施例１０-化合物９
中間体９ａ：４，６-ジクロロ-５-メチルニコチン酸エチル
Figure 2024516376000107
 ４，６-ジクロロ-５-メチル-ピリジン-３-カルボン酸（１．８ｇ、１．０当量）の混合物のＥｔＯＨ溶液（０．４～０．５Ｍ）に、Ｈ２ＳＯ４（１．０当量）を滴加した。混合物を８０℃で撹拌し、１２時間撹拌した。反応混合物をＮａＨＣＯ３水溶液に注ぎ、ＥｔＯＡｃで２回抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて濾過し、濾液を真空濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物を無色油状物として得た（５９％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ８．５５ （ｄ， Ｊ ＝ ４．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３６ （ｐｄ， Ｊ ＝ ６．９， ３．９ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．４９ （ｄ， Ｊ ＝ ４．３ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．３６ （ｔｄ， Ｊ ＝ ７．３， ４．０ Ｈｚ， ３Ｈ）．
中間体９ｂ：６-クロロ-５-メチル-４-（（テトラヒドロ-２Ｈ-ピラン-４-イル）アミノ）ニコチン酸エチル
Figure 2024516376000108
 中間体９ｂを、中間体１ｅで用いた方法を使用して、中間体９ａから合成した（５０％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ８．４４ （ｓ， １Ｈ）， ７．４３ （ｄ， Ｊ ＝ ９．３ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３１ （ｑ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．７９ （ｄｔ， Ｊ ＝ １１．７， ３．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．６７ （ｔｑ， Ｊ ＝ ９．７， ４．９， ４．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．３６ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．５， ２．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．３０ （ｓ， ３Ｈ）， １．８４ － １．７５ （ｍ， ２Ｈ）， １．４１ （ｄｔｄ， Ｊ ＝ １７．５， １０．６， ９．６， ４．４ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．３１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ３Ｈ）．
中間体９ｃ：６-クロロ-５-メチル-４-（（テトラヒドロ-２Ｈ-ピラン-４-イル）アミノ）ニコチン酸
Figure 2024516376000109
 中間体９ｃを、中間体１ｆで用いた方法を使用して、中間体９ｂから合成した（８３％）。
中間体９ｄ：６-クロロ-７-メチル-１-（テトラヒドロ-２Ｈ-ピラン-４-イル）-１，３-ジヒドロ-２Ｈ-イミダゾ［４，５-ｃ］ピリジン-２-オン
Figure 2024516376000110
 中間体９ｃ（０．４５ｇ、１．０当量）、Ｅｔ３Ｎ（１．０当量）の混合物のＤＭＡ溶液（０．１６Ｍ）に、ＤＰＰＡ（１．０当量）を加えた。混合物をＮ２雰囲気下、１２０℃で８時間撹拌した。反応混合物を水に注ぎ、沈殿物を濾過により回収し、水で洗浄し、真空下で乾燥させて残渣を得、それをさらなる精製をせずに次の反応で直接使用した（６７％）。
中間体９ｅ：６-クロロ-３，７-ジメチル-１-（テトラヒドロ-２Ｈ-ピラン-４-イル）-１，３-ジヒドロ-２Ｈ-イミダゾ［４，５-ｃ］ピリジン-２-オン
Figure 2024516376000111
 中間体９ｅを、中間体１ｈで用いた方法を使用して、中間体９ｄから合成した（７９％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ７．７９ （ｓ， １Ｈ）， ４．５５ （ｔｔ， Ｊ ＝ １２．０， ４．２ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．０８ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．８， ４．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４０ （ｔｄ， Ｊ ＝ １２．２， ２．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．８１ （ｑｄ， Ｊ ＝ １２．５， ４．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６６ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ １２．５， ４．２， １．９ Ｈｚ， ２Ｈ）．
化合物９：３，７-ジメチル-６-（（７-メチル-［１，２，４］トリアゾロ［１，５-ａ］ピリジン-６-イル）アミノ）-１-（テトラヒドロ-２Ｈ-ピラン-４-イル）-１，３-ジヒドロ-２Ｈ-イミダゾ［４，５-ｃ］ピリジン-２-オン
Figure 2024516376000112
 化合物９を、化合物で用いた方法を使用して、中間体１ｄ及び中間体９ｅから合成した。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ ８．６３ （ｓ， １Ｈ）， ８．３０ （ｓ， １Ｈ）， ７．７２ （ｓ， １Ｈ）， ７．６４ （ｓ， １Ｈ）， ７．５４ （ｓ， １Ｈ）， ４．６５ － ４．５６ （ｍ， １Ｈ）， ３．９５ （ｄｄ， Ｊ ＝ １１．４， ４．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４３ （ｔ， Ｊ ＝ １１．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．２２ （ｓ， ３Ｈ）， ２．６９ － ２．５２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．５０ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２１ （ｄ， Ｊ ＝ １．１ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．７１ （ｄ， Ｊ ＝ １１．４ Ｈｚ， ２Ｈ）． ＭＳ： ３９４．５ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
実施例１１-ＤＮＡ-ＰＫ阻害剤を用いる場合または用いない場合のＴ細胞のＴＲＡＣ ＬＮＰ処理
Ｔ細胞を液体Ｎ２保存から融解し、２．５％熱非働化ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ ＃１００-５１２）、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃３５０５００６１）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃１５１４０-１２２）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃１５６３００８０）、ＩＬ-２（２００Ｕ／ｍＬ、Ｐｅｐｔｒｏｔｅｃｈ ＃２００-０２）、ＩＬ-７（５ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｔｒｏｔｅｃｈ ＃２００-０７）、及びＩＬ-１５（５ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｔｒｏｔｅｃｈ ＃２００-１５）を含む、２．５％ヒト血清Ｔ増殖活性化培地（ＴＣＧＭ：ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃Ａ３７０５００１）中に一晩静置した。
一晩静置した後、挿入前にＴ細胞をＴｒａｎｓＡｃｔ（１：１００希釈、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で４８時間活性化させた。Ｔ細胞を回収して洗浄し、血清を用いずにＴＣＧＭに再懸濁させて１．２５×１０６細胞／ｍＬの濃度にした。ＬＮＰ-ＡｐｏＥ溶液を、１μｇ／ｍＬのＡｐｏＥ３を含む５％ヒト血清ＴＣＧＭ中５μｇ／ｍＬのＬＮＰ濃度にて調製し、３７度で１０分間インキュベートした。ＬＮＰ組成物を、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（配列番号８）及びヒトＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ（Ｇ０１３００６ 配列番号１）と共に、成分脂質である脂質Ａ、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ-ＤＭＧの脂質モル比をそれぞれ５０／３８．５／１０／１．５または３５／４７．５／１５／２．５にして、実施例１に記載のように製剤化した。ｓｇＲＮＡとＣａｓ９ ｍＲＮＡとのカーゴ重量比は１：２であった。ＬＮＰ-ＡｐｏＥミックスとＴ細胞（５０，０００細胞／ウェル）を１：１の体積で混合した。ＴＲＡＣ遺伝子座（配列番号１３）へのＧＦＰオープンリーディングフレーム（ＯＦＲ）挿入のための相同組換え修復鋳型をコードするＡＡＶを、３×１０５ウイルスゲノム／細胞のＭＯＩで加えた。ＤＮＡ-ＰＫ阻害剤（化合物１、化合物２、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物８、または化合物９）を２．５％血清ＴＣＧＭで希釈し、細胞に加えて最終濃度を１μＭ、０．２５μＭ、または０．０６２５μＭとした。翌日、Ｔ細胞を９６ウェルプレート中で５００ｇにて５分間の遠心沈殿にかけて培地を除去し、１回洗浄し、２．５％血清ＴＣＧＭに再懸濁させ、５日間増殖させた。５日間の増殖中、２日目に、細胞を一度新たな２．５％血清ＴＣＧＭに分割して異常増殖を防いだ。
１１．１．フローサイトメトリー
編集後５日目に、Ｔ細胞の表現型をフローサイトメトリーによって決定し、内因的ＴＣＲノックアウト及びＧＦＰ挿入を決定した。ＴＲＡＣによってコードされるＴ細胞受容体アルファ鎖は、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３複合体の集合及び細胞表面への移行に必要とされる。したがって、ゲノム編集によるＴＲＡＣ遺伝子の破壊は、Ｔ細胞の細胞表面でのＣＤ３タンパク質消失を引き起こす。簡単に言えば、編集されたＴ細胞を、ＣＤ３を標的とする抗体を含有するＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ７．４、２％ＦＢＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で染色し（１：２００）、氷上で遮光して３０分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、ＤＡＰＩを含有するＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ（１：５，０００）、氷上で遮光して１０分間インキュベートした。染色後、Ｔ細胞を洗浄してＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、ＣｙｔｏＦＬＥＸ ＬＸサイトメーターを使用して分析した。Ｔ細胞を、サイズ、ＤＡＰＩ染色、ならびにＧＦＰ及びＣＤ３発現でゲーティングした。結果を、表２及び図１Ａに示す。ＧＦＰ陽性細胞を、表３及び図１ＢにあるようにＣＤ３陰性集団内にゲーティングした。

Figure 2024516376000113
Figure 2024516376000114
Figure 2024516376000115
Figure 2024516376000116
実施例１２-ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びＤＮＡ-ＰＫ阻害剤を用いた機能的に活性なＴＣＲ Ｔ細胞の操作
Ｔ細胞の増殖、細胞傷害性またはサイトカイン放出を撹乱させずに、Ｔ細胞におけるトランスジェニックＴＣＲ（ｔｇＴＣＲ）の挿入を促進するためのＤＮＡ-ＰＫ阻害剤の使用について評価した。
１２．１．Ｔ細胞の分離
健常ヒトドナーのアフェレーシスは、３ドナー（００７ＨＤ、００８ＨＤ、及び００９ＨＤと呼ぶ）からの市販のもの（ＨｅｍａＣａｒｅ）を入手した。細胞を洗浄し、ＬＯＶＯデバイスでＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ カタログ番号１３０-０７０-５２５）に再懸濁させた。Ｔ細胞を、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ Ｐｌｕｓ及びＣｌｉｎｉＭＡＣＳ ＬＳ使い捨てキットを使用して、ＣＤ４及びＣＤ８磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏＴｅｃ カタログ番号１３０-０３０-４０１／１３０-０３０-８０１）を使用して陽性選択により分離した。Ｔ細胞をバイアルに分注し、今後の使用のために、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ カタログ番号０７９３０）とＰｌａｓｍａｌｙｔｅ Ａ（Ｂａｘｔｅｒ カタログ番号２Ｂ２５２２Ｘ）の１：１製剤中で凍結保存した。
１２．２．Ｔ細胞培地及び融解
Ｔ細胞を液体Ｎ２保存から融解し、２．５％熱非働化ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ ＃１００-５１２）、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃３５０５００６１）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃１５１４０-１２２）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃１５６３００８０）、ＩＬ-２（２００Ｕ／ｍＬ、Ｐｅｐｔｒｏｔｅｃｈ ＃２００-０２）、ＩＬ-７（５ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｔｒｏｔｅｃｈ ＃２００-０７）、及びＩＬ-１５（５ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｔｒｏｔｅｃｈ ＃２００-１５））を含む、２．５％ヒト血清Ｔ細胞活性化培地（ＴＣＡＭ：ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＃Ａ３７０５００１）中に一晩静置した。
１２．３．Ｔ細胞操作
静置されたＴ細胞を計数し、ＴｒａｎｓＡｃｔ試薬を１：５０の希釈度で加えたＴＣＧＭに２×１０６細胞／ｍＬの密度で再懸濁させた。一方で、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（配列番号８）及びＴＲＢＣを標的とするｓｇＲＮＡ（Ｇ０１６２３９）（配列番号２）を用いて製剤化された、５μｇ／ｍＬのＴＲＢＣ-ＬＮＰを、１μｇ／ｍＬの組換えヒトＡｐｏＥ３を含むＴＣＡＭ中でインキュベートしてからＴ細胞と１：１の体積で混合し、３７℃で４８時間インキュベートした。活性化の４８時間後、Ｔ細胞を回収して洗浄し、ＴＣＡＭに再懸濁させて濃度を１×１０６細胞／ｍＬにした。ＴＲＡＣ-ＬＮＰ-ＡｐｏＥ溶液を、５μｇ／ｍＬのＡｐｏＥ３を含むＴＣＡＭに５μｇ／ｍＬで調製した。ＴＲＡＣ-ＬＮＰを、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（配列番号８）及びＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ（Ｇ０１３００６）（配列番号１）と共に製剤化した。ＬＮＰ-ＡｐｏＥミックスとＴ細胞を１：１の体積で混合した。ＷＴ１特異的ＴＣＲであるＨＤ１のＴＲＡＣ遺伝子座（配列番号１３）への挿入のための相同組換え修復鋳型をコードするＡＡＶを、３×１０５ウイルスゲノム／細胞のＭＯＩで加えた。ＤＮＡ-ＰＫ阻害剤を０．２５ｕＭの濃度で、表４で示されているように加えた。翌日、Ｔ細胞を洗浄してＴ細胞増殖培地（ＴＣＥＭ：ヒトＡＢ血清が２．５％ではなく５％であること以外はＴＣＡＭに関する記載のとおり）に再懸濁させてからＧＲＥＸプレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ ＃８０２４０Ｍ）に移し、さらに６日間増殖させ、２～３日ごとにサイトカインの補充を行った。対照試料を、いずれのＤＮＡ-ＰＫ阻害剤処理も省略して上記のように処理した。増殖後細胞を回収してＶｉ-ＣＥＬＬ ＸＲ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒを使用して計数し、フローサイトメトリーによって特徴付けを行った。増殖倍率は、終点における総セルカウント収量を、０日目における各群の細胞数（すなわち、出発物質）で割ることによって決定した。化合物６、７、及び８を用いたＤＮＡ-ＰＫ処理によるＴ細胞増殖の影響は観察されなかった（表４）。Ｔ細胞を、今後の分析用に、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０凍結保存培地中で凍結保存した。
Figure 2024516376000117
１２．４．フローサイトメトリー
操作及び増殖の後、フローサイトメトリーを使用して編集効率及びメモリー表現型についてＴ細胞を特徴付けした。簡単に言えば、Ｔ細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ７．４、２％ＦＢＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で希釈した、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３ε、Ｖβ８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、及びＣＣＲ７を標的とする抗体カクテルで室温にて３０分間染色した。Ｖβ８抗体は、ＷＴ１-ＴＣＲにより使用される特定のＶβ鎖を認識する。染色後のＴ細胞を洗浄してＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、ＣｙｔｏＦＬＥＸ ＬＸサイトメーターを使用して分析した。各群内でＣＤ８＋Ｔ細胞の割合（％）に対する阻害剤の影響はなかった（図２Ａ）。ＤＮＡ-ＰＫ阻害剤処理した全群において、非処理群（表５、図２Ｃ）に対し、ＷＴ１-ＴＣＲ挿入のあるＣＤ８＋細胞（ＣＤ３ε＋、Ｖβ８＋）の割合（％）の統計学的に有意な増加（ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）が観察され、内因的ＴＣＲ ＫＯ増加に向かう傾向（図２Ｂ）も観察された。
Figure 2024516376000118
１２．５．ＷＴ１ ＴＣＲ Ｔ細胞は、６９７ ＡＬＬ細胞株及びＫ５６２-ＨＬＡ-Ａ＊０２：０１ ＣＭＬ細胞株に応答した細胞傷害性及びサイトカイン放出を媒介した。
ドナー００７ＨＤ及びドナー００８ＨＤから操作されたＷＴ１-ＴＣＲ Ｔ細胞が、天然レベルのＷＴ１を発現する血液がん細胞を殺傷する能力、及びサイトカインを放出する能力を評価した。ＴＲＡＣ／ＡＡＶの添加は行わずに、上記のように作製されたＴＣＲ ＫＯ細胞を、非殺傷性陰性対照として使用した。簡単に言えば、Ｔ細胞を、ＩＬ-２、ＩＬ-７、もしくはＩＬ-１５の添加をしないＴＣＥＭ中で、ルシフェラーゼを発現する、６９７ ＡＬＬ細胞（６９７-ｌｕｃ２）、またはＨＬＡ-Ａ＊０２：０１を発現するよう形質導入されたＫ５６２-ｌｕｃ２細胞（Ｋ５６９２-ＨＬＡ-Ａ＊０２：０１-ｌｕｃ２）と、様々なエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比（２：１、１：１、０．５：１）にて共培養した。注目すべきことに、エフェクター対標的比を各群の相対ＷＴ１ ＴＣＲ挿入に関して正規化したところ、阻害剤群及び未処理群を通じての絶対ＷＴ１ ＴＣＲ発現細胞と同量になった。共培養の２４時間後、Ｅ：Ｔ比が２：１の群からの上清を回収し、ＭＳＤ Ｕ／Ｒ-ＰＬＥＸアッセイで使用して、製造者（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）の操作手順に従ってＩＬ-２、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、及びグランザイムＢを定量化した。共培養の４８時間後にルシフェラーゼ活性をＢｒｉｇｈｔ-ＧＬＯ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して相対発光量（ＲＬＵ）で定量化した。特異的溶解パーセントを、式：
特異的溶解％＝１００-（（ＲＬＵ［実験ウェル］／ＲＬＵ［標的のみのウェル］）＊１００）
を使用して決定した。
細胞傷害性アッセイからの結果を図３Ａ～３Ｄ及び表６に示し、サイトカイン放出を表７及び図４Ａ～４Ｈに報告する。ＤＮＡ-ＰＫ阻害剤で処理された群のＴ細胞機能性に関して著明な相違は観察されなかった。

Figure 2024516376000119
Figure 2024516376000120
実施例１３-ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤を使用したＢ細胞における編集
Ｂ細胞における編集効率に対するＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤（ＤＮＡ-ＰＫＩ）の効果を評価した。
Ｂ細胞を、ＭｕｌｔｉＭＡＣＳ Ｃｅｌｌ２４ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｐｌｕｓ装置でＳｔｒａｉｇｈｔＦｒｏｍ Ｌｅｕｋｏｐａｋ ＣＤ１９ ＭｉｃｒｏＢｅａｄキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０-１１７-０２１）を使用してＣＤ１９陽性選択により健常ヒトドナーのｌｅｕｋｏｐａｋから分離した。ＭＡＣＳでの分離後、ＩＭＤＭ培地またはＳｔｅｍｓｐａｎ培地中でＣＤ１９＋Ｂ細胞を活性化させ、必要時まで凍結した。基礎培地は、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３０-００２-ＣＩ）、５０ｎｇ／ｍｌ ｈＩＬ-２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００-０２）、５０ｎｇ／ｍｌ ｈＩＬ-１０（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００-１０）、１０ｎｇ／ｍｌ ｈＩＬ-１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００-１５）、１００ｎｇ／ｍｌ ＭＥＧＡＣＤ４０Ｌ、１ｕｇ／ｍｌ ＣｐＧ ＯＤＮ ２００６（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ＴＬＲ-２００６）及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加した、ＩＭＤＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、１０-０１６-ＣＶ）またはＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、９６５０）である。Ｂ細胞を融解し、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３０-００２-ＣＩ）、５０ｎｇ／ｍｌ ｈＩＬ-２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００-０２）、５０ｎｇ／ｍｌ ｈＩＬ-１０（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００-１０）、１０ｎｇ／ｍｌ ｈＩＬ-１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００-１５）、１ｎｇ／ｍｌ ＭＥＧＡＣＤ４０Ｌ、１ｕｇ／ｍｌ ＣｐＧ ＯＤＮ ２００６（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ＴＬＲ-２００６）及び５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ-Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、１００-５１２）を添加した、Ｓｔｅｍｓｐａｎ培地中で培養した。２日間の培養後、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（配列番号８）及びＢ２Ｍを標的とするｇＲＮＡ Ｇ０００５２９を送達するＬＮＰ組成物を用いた処理の前に、細胞を回収して、最終濃度の２倍の濃度のサイトカイン、２ｕｇ／ｍｌ ＣｐＧ ＯＤＮ ２００６（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ＴＬＲ-２００６）及び２ｎｇ／ｍｌ ＭＥＧＡＣＤ４０Ｌを添加した、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＳｔｅｍＳｐａｎ培地中に１００，０００細胞／１００μｌで再懸濁させた。
ＬＮＰは一般に、イオン化可能脂質／コレステロール／ＤＳＰＣ／ＰＥＧのモル比としてそれぞれ表される５０／３８．５／１０／１．５の脂質組成で、実施例１に記載のように調製された。ＬＮＰを、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ-Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、１００-５１２）を添加したＳｔｅｍＳｐａｎ培地中で５μｇ／ｍｌの総ＲＮＡカーゴの濃度にて１．２５μｇ／ｍｌのＡｐｏＥ４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、３５０-０４）と３７℃で約１５分間プレインキュベートした。プレインキュベートしたＬＮＰを、２．５ｕｇ／ｍｌの総ＲＮＡカーゴの最終濃度でＢ細胞に加え、その後、ＤＮＡＰＫ阻害剤である化合物１、化合物３、または化合物４を０．２５ｕｇ／ｍｌにて添加した。
ＬＮＰ組成物処理後７日目に、Ｂ細胞の表現型をＢ２Ｍ表面タンパク質の存在について決定した。この場合、Ｂ細胞は、ＣＤ８６を標的とする抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３７４２１６）及びＢ２Ｍを標的とする抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３１６３１２）と共にインキュベートした。その後、細胞を生死判定用色素（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２２８０１）で染色し、洗浄して、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で処理し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを使用して分析した。Ｂ細胞をサイズ及び生存状態でゲーティングし、その後、全生存集団に対しＢ２Ｍ発現でゲーティングした。Ｂ２Ｍ陰性細胞パーセントを表８に示す。ＤＮＡ-ＰＫＩがない場合と比較して、ＤＮＡ-ＰＫＩの存在下ではＢ２Ｍ陰性Ｂ細胞のパーセンテージ増加が観察され、遺伝子編集の増加を示している。
Figure 2024516376000121
１３．２．ＤＮＡＰＫ阻害剤を使用した、複数ドナーからのＢ細胞における編集
Ｂ細胞を、３ドナーに由来するＰＢＭＣから実施例２３．１に記載のように分離した。ＭＡＣＳでの分離後、１ｕｇ／ｍｌ ＣｐＧ ＯＤＮ ２００６（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ＴＬＲ-２００６）、２．５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ-Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、１００-５１２）、１％ペニシリン-ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１５１４０１２２）、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ-２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００-０２）、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ-１０（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００-１０）、及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ-１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００-１５）ならびに１ｎｇ／ｍｌのＣＤ４０Ｌ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＡＬＸ-５２２-１１０-Ｃ０１０）を含むＳｔｅｍｓｐａｎ培地中でＣＤ１９＋Ｂ細胞を活性化させた。活性化の２日後、Ｂ細胞を、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（配列番号８）と、Ｂ２Ｍを標的とするｇＲＮＡ Ｇ０００５２９とを送達するＬＮＰ組成物で処理した。Ｂ細胞を、上記のＳｔｅｍｓｐａｎ完全培地に１ウェルあたり５０，０００細胞にて表９に示されるように三連で播種した。
ＬＮＰは一般に、イオン化可能脂質／コレステロール／ＤＳＰＣ／ＰＥＧのモル比としてそれぞれ表される５０／３８．５／１０／１．５の脂質組成で、実施例１の場合のように調製された。ＬＮＰを、１μｇ／ｍＬのＣｐＧ ＯＤＮ ２００６、２．５％ヒトＡＢ血清、１％ペニシリン-ストレプトマイシン、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ-２、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ-１０、及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ-１５、１ｎｇ／ｍｌのＣＤ４０Ｌ、及び１．２５μｇ／ｍＬのＡｐｏＥ４を含有するＳｔｅｍｓｐａｎ培地と３７℃で１５分間プレインキュベートした。プレインキュベートしたＬＮＰ組成物を、２．５μｇ／ｍＬの総ＲＮＡカーゴの最終濃度でＢ細胞に加え、その後、ＤＮＡＰＫ阻害剤である化合物１または化合物４を０．２５μｇ／ｍＬにて添加した。ＬＮＰ組成物添加の７２時間後、細胞を洗浄し、１μｇ／ｍＬのＣｐＧ ＯＤＮ ２００６、２．５％ヒトＡＢ血清、１％ペニシリン-ストレプトマイシン、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ-２、５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ-１０、及び１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ-１５、及び１００ｎｇ／ｍＬのＣＤ４０Ｌを含有するＳｔｅｍｓｐａｎ培地に再懸濁させ、４８ウェルプレートに移した。
ＬＮＰ組成物処理の７日後、細胞の表現型をフローサイトメトリーによって決定した。簡単に言えば、Ｂ細胞を、ＣＤ１９を標的とする抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３６３０１０Ａ）、ＣＤ２０を標的とする抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０２３２２）、ＣＤ８６を標的とする抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３７４２１６）及びＢ２Ｍを標的とする抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３９５８０６）と共にインキュベートし、その後、生死判定色素ＤＡＰＩ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２２８０１）とインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で処理し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを使用して分析した。Ｂ細胞をサイズ及び生存状態でゲーティングし、その後、全生存集団に対しＢ２Ｍ発現でゲーティングした。表９及び図５は、ＤＮＡＰＫ阻害剤を用いた編集後の平均Ｂ２Ｍ陰性細胞パーセントを示す。ＤＮＡＰＫ阻害剤の添加は、編集効率を中程度に改善した。
Figure 2024516376000122
実施例１４-ＤＮＡＰＫ阻害剤を使用したＮＫ細胞への挿入
ＮＫ細胞を、インデル及び挿入率に対するＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤（ＤＮＡ-ＰＫＩ）の影響について評価した。ＮＫ細胞を、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（配列番号８）と、ＡＡＶＳ１を標的とするｇＲＮＡ Ｇ０００５６２とを送達するＬＮＰ組成物を用いて、ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤の存在下で処理した。また、試料のサブセットを、ＡＡＶＳ１編集部位との相同領域に挟まれたＧＦＰコード配列をコードするＡＡＶ（配列番号１６）によっても処理した。
ＮＫ細胞は、ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、カタログ番号１７９５５）を製造者の操作手順に従って使用して、市販から入手したｌｅｕｋｏｐａｋから分離した。ヒト初代ＮＫ細胞を、５％ヒトＡＢ血清、５００Ｕ／ｍＬのＩＬ-２、及び５ｎｇ／ｍｌのＩＬ-１５を含むＯｐＴｍｉｚｅｒ培地中で活性化させ、フィーダー細胞としてＫ５６２-４１ＢＢＬ細胞を使用して３日間増殖させた。ＮＫ細胞を、表１０及び表１１に示されている濃度のＤＮＡ-ＰＫＩを上記のように添加したＯｐＴｍｉｚｅｒ中で１ウェルあたり５０，０００細胞にて三連で播種した。ＬＮＰを、２．５％ヒトＡＢ血清、５００Ｕ／ｍＬのＩＬ-２及び５ｎｇ／ｍｌのＩＬ-１５を含むＯｐＴｍｉｚｅｒ培地中で、１０ｕｇ／ｍｌのＡＰＯＥ３と３７℃で約１５分間プレインキュベートした。プレインキュベートしたＬＮＰ組成物を、１０ｕｇ／ｍｌの総ＲＮＡカーゴの最終濃度にて三連で、同じ培地に懸濁させたＮＫ細胞に加えた。試料のサブセットでは、ＡＡＶＳ１編集部位と相同な領域に挟まれたＧＦＰをコードするＡＡＶを、編集後、６００，０００ゲノムコピーの感染多重度（ＭＯＩ）で加えた。ＬＮＰ組成物処理後７日目に、ＧＦＰ挿入率を測定するため、細胞の表現型をフローサイトメトリーによって決定した。簡単に言えば、ＮＫ細胞を、ＣＤ３を標的とする抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７３３６）及びＣＤ５６を標的とする抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１８３１０）と共にインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で処理し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを使用して分析した。ＮＫ細胞を、サイズ、ＣＤ３／ＣＤ５６状態、及びＧＦＰ発現でゲーティングした。ＧＦＰ高発現細胞をＡＡＶＳ１遺伝子座内の標的ＧＦＰ挿入としてゲーティングし、ＧＦＰ低発現細胞をエピソーム内保持としてゲーティングした。その後、細胞をＮＧＳ分析用に実施例１．４に記載のように回収した。
表１０及び表１１ならびに図６Ａ及び図６Ｂは、ＬＮＰ組成物、ＡＡＶ、及び様々な濃度のＤＮＡＰＫ阻害剤である化合物１及び化合物４による処理後の編集パーセントを示す。インデル形成及び挿入の両方がＤＮＡＰＫ阻害剤の存在下で増加した。
Figure 2024516376000123
Figure 2024516376000124
実施例１５-Ｔ細胞における２つの挿入による多重編集
５つの別個のＣａｓ９編集を用いたＴ細胞の操作を示すため、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（配列番号８）と、ＴＲＡＣ（Ｇ０１３００６）、ＴＲＢＣ（Ｇ０１６２３９）、ＣＩＩＴＡ（Ｇ０１３６７６）、ＨＬＡ-Ａ（Ｇ０１８９９５）、またはＡＡＶＳ１（Ｇ０００５６２）を標的とする、いずれかのｓｇＲＮＡと、を用いて合剤化された５つのＬＮＰ組成物で健康なドナー細胞を順次処理した。ＴＣＲを標的とするトランスジェニックＷＴ１は、ＡＡＶを使用して相同組換え修復用鋳型（配列番号１４）を送達することによって、ＴＲＡＣ切断部位に部位特異的に組み込まれた。概念実証として、第２の相同修復用鋳型（配列番号１５）を使用してＡＡＶＳ１標的部位にＧＦＰも部位特異的に組み込んだ。
Ｔ細胞を、健常な２名のＨＬＡ-Ａ＊０２：０１＋ドナーの白血球アフェレーシス製品（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から分離した。ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１７９５１）を製造者の操作手順に従って使用してＴ細胞を分離し、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、０７９３０）を使用して凍結保存した。Ｔ細胞編集開始の前日、細胞を融解し、２．５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ、１００-５１２）、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、３５０５００６１）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、１５６３００８０）、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ-２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００-０２）、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ-７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００-０７）、及び５ｎｇ／ｍＬのＩＬ-１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００-１５）を添加したＴ細胞活性化培地（ＴＣＡＭ：ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ａ３７０５００１）に一晩静置した。
Ｔ細胞のＬＮＰ組成物処理及び増殖
ＬＮＰは一般に、イオン化可能脂質／コレステロール／ＤＳＰＣ／ＰＥＧのモル比としてそれぞれ表される５０／３８．５／１０／１．５の脂質組成で、実施例１に記載のように調製された。ＬＮＰ組成物を、Ｔ細胞への曝露直前にＡｐｏＥ含有培地中でプレインキュベートした。連続編集ステップ及び対照群の実験デザインを表１２に記載する。
Figure 2024516376000125
１日目：表１２で示されているＣＩＩＴＡを標的とするＬＮＰ組成物を、５ｕｇ／ｍＬのｒｈＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ３５０-０２）を含有するＴＣＡＭ中で５ｕｇ／ｍＬの濃度でインキュベートした。Ｔ細胞を回収して洗浄し、１：５０希釈のＴ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ、ヒト試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０-１１１-１６０）を含むＴＣＡＭ中に２×１０６細胞／ｍＬの密度で再懸濁させた。その後、Ｔ細胞及びＬＮＰ-ＡｐｏＥ溶液を１：１の体積比で混合し、Ｔ細胞を培養フラスコ内に一晩播種した。
２日目：表１２で示されているＨＬＡ-Ａを標的とするＬＮＰ組成物を、２０ｕｇ／ｍＬのｒｈＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ３５０-０２）を含有するＴＣＡＭ中で２５ｕｇ／ｍＬの濃度でインキュベートした。その後、ＬＮＰ-ＡｐｏＥ溶液を適切な培養物に１：１０の体積比で加えた。
３日目：ＴＲＡＣを標的とするＬＮＰ組成物を、５ｕｇ／ｍＬのｒｈＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ３５０-０２）を含有するＴＣＡＭ中で５ｕｇ／ｍＬの濃度でインキュベートした。Ｔ細胞を回収して洗浄し、ＴＣＡＭ中に１×１０６細胞／ｍＬの密度で再懸濁させた。Ｔ細胞及びＬＮＰ-ＡｐｏＥ培地を１：１の体積比で混合し、Ｔ細胞を培養フラスコ内に播種した。その後、ＷＴ１ ＡＡＶを、３×１０５ゲノムコピー／細胞のＭＯＩで各群に加えた。ＤＮＡ-ＰＫ阻害剤である化合物４を０．２５μＭの濃度で各群に加えた。
４日目：ＡＡＶＳ１を標的とするＬＮＰ組成物を、５ｕｇ／ｍＬのｒｈＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ３５０-０２）を含有するＴＣＡＭ中で５ｕｇ／ｍＬの濃度でインキュベートした。一方で、Ｔ細胞を回収して洗浄し、ＴＣＡＭ中に１×１０６細胞／ｍＬの密度で再懸濁させた。Ｔ細胞及びＬＮＰ-ＡｐｏＥ培地を１：１の体積比で混合し、Ｔ細胞を培養フラスコ内に播種した。その後、ＧＦＰ-ＡＡＶを、３×１０５ゲノムコピー／細胞のＭＯＩで各群に加えた。ＤＮＡ-ＰＫ阻害剤である化合物４を０．２５μＭの濃度で各群に加えた。
５日目：表１２で示されているＴＲＢＣを標的とするＬＮＰ組成物を、５ｕｇ／ｍＬのｒｈＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ３５０-０２）を含有するＴＣＡＭ中で５ｕｇ／ｍＬの濃度でインキュベートした。Ｔ細胞を回収して洗浄し、ＴＣＡＭ中に１×１０６細胞／ｍＬの密度で再懸濁させた。その後、ＬＮＰ-ＡｐｏＥ溶液を適切な培養物に１：１の体積比で加えた。
６～１１日目：Ｔ細胞を、Ｔ細胞増殖培地（ＴＣＥＭ：５％ＣＴＳ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ａ２５９６１０１）、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、３５０５００６１）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、１５６３００８０）、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ-２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００-０２）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ-７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００-０７）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ-１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００-１５）を添加したＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ａ３７０５００１））の２４ウェルＧＲＥＸプレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ、８０１９２）に移し、製造者の操作手順に従って増殖させた。簡単に言えば、Ｔ細胞を、１日おきに培地交換をして６日間増殖させた。
フローサイトメトリー及びＮＧＳによるＴ細胞編集の定量化
増殖後、編集されたＴ細胞を、ＨＬＡ-Ａ＊０２：０１を標的とする抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３４３３０７）、ＨＬＡ-ＤＲ-ＤＰ-ＤＱを標的とする抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３６１７１２）、ＷＴ１-ＴＣＲを標的とする抗体（Ｖｂ８＋、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３４８１０４）、ＣＤ３ｅを標的とする抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３００３２８）、ＣＤ４を標的とする抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３１７４３４）、ＣＤ８を標的とする抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３０１０４６）、及びＶｉａｋｒｏｍｅ ８０８ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（カタログ番号Ｃ３６６２８）で染色した。このカクテルを使用して、ＨＬＡ-Ａ＊０２：０１ノックアウト（ＨＬＡ-Ａ２-）、ＣＩＩＴＡノックアウトを介したＨＬＡ-ＤＲ-ＤＰ-ＤＱノックダウン（ＨＬＡ-ＤＲＤＰＤＱ-）、ＷＴ１-ＴＣＲ挿入（ＣＤ３＋Ｖｂ８＋）、及び残存する内因的ＴＣＲ（ＣＤ３＋Ｖｂ８-）を発現する細胞のパーセンテージを決定した。ＡＡＶＳ１部位への挿入をＧＦＰ発現のモニタリングにより追跡した。抗体インキュベーション後、細胞を洗浄してＣｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で処理し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを使用して分析した。Ｔ細胞を、編集マーカー及び挿入マーカーを調べる前に、サイズ及びＣＤ４／ＣＤ８の状態でゲーティングした。ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞の編集及び挿入率はそれぞれ、表１３及び表１４に見出すことができる。図７Ａ～図７Ｆは、ＣＤ８＋Ｔ細胞における全標的の編集率グラフを示す。意図された編集（すなわち、ＨＬＡ-Ａ及びＣＩＩＴＡのノックアウトと組み合わせた、ＷＴ１-ＴＣＲ及びＧＦＰの挿入）をすべて有するＴ細胞の割合（％）をＣＤ３＋ Ｖｂ８＋ ＧＦＰ＋ ＨＬＡ-Ａ- ＨＬＡ-ＤＲＤＰＤＱ-％としてゲーティングした。高レベルの、ＨＬＡ-Ａ及びＣＩＩＴＡのノックアウト、ならびにＧＦＰ及びＷＴ１-ＴＣＲの挿入が、両ドナーからの五重編集試料で観察され、７５％超の完全編集ＣＤ８＋Ｔ細胞及び８５％超の完全編集ＣＤ４＋Ｔ細胞が得られた。
Figure 2024516376000126
Figure 2024516376000127
実施例１６-血清培地条件において評価したＬＮＰ組成物活性
ＬＮＰ組成物の編集有効性を評価するため、ＬＮＰ組成物をインビトロで試験して、ＣＤ３陽性Ｔ細胞における挿入効率に対する代替的培地条件の効果を評価した。Ｔ細胞を、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡと、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡとを封入する脂質成分のモル比が様々なＬＮＰ組成物で処理した。ＡＡＶ６ウイルスコンストラクトは、ＴＲＡＣ遺伝子座への部位特異的な組み込みのためのホモロジーアームに挟まれたＧＦＰレポーターをコードする相同組換え修復鋳型（ＨＤＲＴ）を送達した（Ｖｉｇｅｎｅ；配列番号１７）。ＴＲＡＣ遺伝子破壊を、Ｔ細胞受容体表面タンパク質の消失についてフローサイトメトリーによって評価した。挿入を、ＧＦＰ発光についてフローサイトメトリーによって評価した。
ＬＮＰ組成物をＡｐｏＥ３と共にプレインキュベートした。等体積のＡｐｏＥ３培地を各ウェルに加えた。その後、１００μＬのＬＮＰ-ＡｐｏＥミックスを各Ｔ細胞プレートに加えた。最高用量におけるＬＮＰの最終濃度を５μｇ／ｍＬに設定した。５μｇ／ｍＬにおける最終濃度のＡｐｏＥ３及びＴ細胞は最終密度が０．５ｅ６細胞／ｍＬであった。プレートを５％ＣＯ２で３７℃にて７日間インキュベートし、次いで、フローサイトメトリー分析用に回収した。
ＬＮＰは一般に、イオン化可能脂質Ａ／コレステロール／ＤＳＰＣ／ＰＥＧのモル比としてそれぞれ表される、表１５で示されている脂質組成で、実施例１に記載のように調製された。ＬＮＰ組成物は、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ（配列番号８）及びｓｇＲＮＡ標的化及びヒトＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ（配列番号１）を送達した。ｓｇＲＮＡとＣａｓ９ ｍＲＮＡとのカーゴ重量比は１：２であった。
Figure 2024516376000128
単一ドナーからのＴ細胞（ロット番号Ｗ０１０６）を、以下の培地改変を用いて実施例１に記載のように調製した。Ｔ細胞を、２．５％ヒトＡＢ血清（ＨＡＢＳ）、２．５％ＣＴＳ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ ＳＲ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号Ａ２５９６１-０１）血清代替物（ＳＲ）、５％血清代替物（ＳＲ）、または２．５％ヒトＡＢ血清と２．５％血清代替物の組み合わせのいずれかを添加した培地を用いて播種した。Ｔ細胞を融解２４時間後に実施例１．２に記載のように活性化させた。活性化後２日目に、Ｔ細胞に、ＬＮＰ組成物を０．３１μｇ／ｍＬ、０．６３μｇ／ｍＬ、１．２５μｇ／ｍＬ、及び２．５μｇ／ｍＬのＬＮＰ濃度で実施例１６．１に記載のようにトランスフェクトした。ＴＲＡＣ遺伝子座への部位特異的な組み込みのためのホモロジーアームに挟まれたＧＦＰレポーターをコードする相同組換え修復鋳型（ＨＤＲＴ）をコードするＡＡＶ６（Ｖｉｇｅｎｅ；配列番号１３）を、３×１０５ウイルス粒子／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）で各ウェルに加えた。ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼの小分子阻害剤である化合物４を０．２５μＭで加えた。
トランスフェクション後５日目に、Ｔ細胞の表現型を実施例１４に記載のようにフローサイトメトリー分析によって決定し、ＬＮＰ組成物の挿入効率を評価した。表１６は、ＣＤ３陰性細胞の割合（％）を示す。ＴＲＡＣによってコードされるＴ細胞受容体アルファ鎖は、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３複合体の集合及び細胞表面への移行に必要とされる。したがって、ゲノム編集によるＴＲＡＣ遺伝子の破壊は、Ｔ細胞の細胞表面でのＣＤ３タンパク質消失を引き起こす。各培地条件の平均ＧＦＰ陽性Ｔ細胞パーセンテージを表１７ならびに図８Ａ及び８Ｂに示す。ＧＦＰタンパク質を発現する細胞は、ゲノムへの挿入成功を示す。
Figure 2024516376000129
Figure 2024516376000130
１６．１．Ｔ細胞のＬＮＰトランスフェクション
ＬＮＰ用量反応曲線（ＤＲＣ）トランスフェクションをＨａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏｌａｂ ＳＴＡＲリキッドハンドリングシステムで実施した。リキッドハンドラーには以下が準備された：（ａ）９６ディープウェルプレートの上段に所望最高用量の４倍のＬＮＰ用量、（ｂ）培地に２０μｇ／ｍＬに希釈したＡｐｏＥ３、（ｃ）実施例１で先述したＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ Ｂａｓｅ Ｍｅｄｉａで構成されるＴ細胞増殖用完全培地、及び（ｄ）９６ウェル平底組織培養プレート内１００ｕＬ中に１０６／ｍｌの密度で播種したＴ細胞。リキッドハンドラーで最初に、ディープウェルプレートの４倍用量のＬＮＰから開始してＬＮＰの８段階２倍系列希釈を行った。その後、等体積のＡｐｏＥ３培地を各ウェルに加えて、ＬＮＰとＡｐｏＥ３の両方の１：１希釈とした。その後、１００ｕＬのＬＮＰ-ＡｐｏＥミックスを各Ｔ細胞プレートに加えた。最高用量におけるＬＮＰの最終濃度を５μｇ／ｍＬに設定した。５μｇ／ｍＬにおける最終濃度のＡｐｏＥ３及びＴ細胞は最終密度が０．５×１０６細胞／ｍＬであった。プレートを５％ＣＯ２で３７℃にて、活性化Ｔ細胞または非活性化Ｔ細胞をそれぞれ、２４時間または４８時間インキュベートした。インキュベーション後、ＬＮＰで処理されたＴ細胞を採取し、オンターゲット編集またはＣａｓ９タンパク質発現検出について分析した。残りの細胞は、ＬＮＰ組成物処理後７～１０日間培養され、タンパク質表面発現をフローサイトメトリーにより評価した。
実施例１７-ＵｎＩＴによるＤＮＡ-ＰＫＩのオフターゲット構造変異比較
本実験では、化合物３または化合物４で処理したＴＲＡＣ標的ｓｇＲＮＡ（Ｇ０１３００６）を、未編集または未処理のＴＲＡＣ ｓｇＲＮＡと比較したオフターゲット構造変異（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）転座についてアッセイした。
編集後８日目に、未処理、未編集、化合物３ガイド及び化合物４ガイドの試料からの実施例１２からのＴ細胞を回収し、遠心沈殿にかけ、ペレットを、「Ｚｙｍｏ Ｑｕｉｃｋ ＤＮＡ／ＲＮＡ Ｍａｇ Ｂｅａｄｓ Ｋｉｔ」（Ｚｙｍｏ カタログ番号Ｒ２１３１）を使用したｇＤＮＡ単離のためのインプット材料として直接使用した。これらのｇＤＮＡ試料に対し、ＵｎＩＴ構造変異特徴付けアッセイを適用した。高分子量ゲノムＤＮＡが同時に断片化され、Ｔｎ５トランスポザーゼ及び部分的Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ５配列と１２ｂｐの固有分子識別子（ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ：ＵＭＩ）とを有するアダプターで配列タグが付けられる（「タグメントされる」）。試料あたり２つのＩｌｌｕｍｉｎａ互換性ＮＧＳライブラリーを作成するための（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、参照番号１５０３３６２４）、Ｐ５に対するプライマー及びＩｌｌｕｍｉｎａ Ｐ７配列を付与するヘミネステッド（ｈｅｍｉ-ｎｅｓｔｅｄ）遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）を使用した２連続ＰＣＲ。２つのライブラリーを用いてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が標的とする切断部位の両方向わたるシークエンシングにより、ゲノム編集後のＤＮＡ修復結果における構造変異の推測及び定量化が可能になる。２つの断片が異なる染色体に整列されている場合、その構造変異を「染色体間転座」に分類した。構造変異の程度を図９Ａ及び表１８に示した。挿入パーセントは図９Ｂ及び表１９に示した。

Figure 2024516376000131
Figure 2024516376000132
実施例１８-ＤＮＡ-ＰＫＩを用いたＴＲＡＣガイド及びＴＲＢＣガイドのオフターゲット分析
実施例１２からのＴ細胞に、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣを標的とするオフターゲットゲノム部位の検証のためのスクリーニングを行い、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＤＴ ｒｈＡｍｐＳｅｑ ｒｈＰＣＲプロトコルに従って実施した。本実験では、ＤＮＡ-ＰＫＩである化合物３及び化合物４と組み合わせた、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣを標的とする２つのｓｇＲＮＡに、オフターゲットプロファイル検証のためのスクリーニングを行った。ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ（Ｇ０１３００６）及びＴＲＢＣを標的とするｓｇＲＮＡ（Ｇ０１６２３９）の検証されたオフターゲット部位数を表２０に示した。オフターゲット部位は、ｐ値が０．０５インデルパーセント未満の場合に検証された。ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡについて同定された１７３のオフターゲット部位のうち、０部位が検証された。ＴＲＢＣを標的とするｓｇＲＮＡについて同定された９２のオフターゲット部位のうち、０部位が検証された。

Figure 2024516376000133
実施例１９-ＤＮＡ-ＰＫ阻害剤の有無によるＴＲＡＣ内への免疫受容体のＳｐｙＣａｓ９媒介性挿入
１９．１．Ｔ細胞の調製
健常ヒトドナーのアフェレーシスは市販のものを入手し（Ｈｅｍａｃａｒｅ、カタログ番号ＰＢ００１Ｆ-２）、細胞を洗浄してＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）ＰＢＳ／ＥＤＴＡ緩衝液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ カタログ番号１３０-０７０-５２５）に再懸濁させ、ＭｕｌｔｉＭＡＣＳ（商標）Ｃｅｌｌ ２４ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｐｌｕｓデバイス（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）で処理した。Ｔ細胞を、Ｓｔｒａｉｇｈｔ ｆｒｏｍ Ｌｅｕｋｏｐａｋ（登録商標）ＣＤ４／ＣＤ８ ＭｉｃｒｏＢｅａｄキット（ヒト）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ カタログ番号１３０-１２２-３５２）を使用して陽性選択により分離した。Ｔ細胞を分注し、今後の使用のためにＣｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ カタログ番号０７９３０）中で凍結保存した。
融解時、Ｔ細胞を、ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ＳＦＭ、及びＴ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ カタログ番号Ａ１０４８５０１）、５％ヒトＡＢ血清（ＧｅｍｉｎｉＢｉｏ、カタログ番号１００-５１２）、１×ペニシリン-ストレプトマイシン、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン-２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００-０２）、５ｎｇ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００-０７）、ならびに５ｎｇ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００-１５）で構成されるＴ細胞増殖培地（ＴＣＧＭ）中に、１．０×１０６細胞／ｍＬの密度で播種した。Ｔ細胞をこの培地に２４時間静置し、その時に、Ｔ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）、ヒト試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０-１１１-１６０）を体積比１：１００で加えて細胞を活性化させた。Ｔ細胞をＬＮＰ処理の前に４８時間活性化させた。
実施例１９．２．Ｔ細胞の処理及び増殖
活性化４８時間後、Ｔ細胞を回収して５００ｇで５分間遠心分離にかけ、Ｔ細胞播種培地（ＴＣＰＭ）（４００Ｕ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン-２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００-０２）、１０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００-０７）、及び１０ｎｇ／ｍＬの組換えヒトインターロイキン１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号２００-１５）を含有するＴＣＧＭの無血清バージョン）中に、６．４１×１０５Ｔ細胞／ｍＬの濃度で再懸濁させた。平底９６ウェルプレートの処理対象ウェルあたり５０μＬのＴ細胞含有ＴＣＰＭ（３．２×１０４Ｔ細胞）を加えた。
ＬＮＰを、５０／３８．５／１０／１．５（脂質Ａ／コレステロール／ＤＳＰＣ／ＰＥＧ２ｋ-ＤＭＧ）の比で実施例１に記載のように生成した。Ｔ細胞処理の前に、２つの別々のＬＮＰミックス（以下、ミックス「Ａ」及びミックス「Ｂ」と言う）を、インターロイキン２、１５、または７の非存在下で２０μｇ／ｍＬのｒｈＡｐｏＥ３を含有するバージョンのＴＣＧＭであるＴ細胞処理培地（ＴＣＴＭ）に調製した。
ミックス「Ａ」は、１３．３６μｇ／ｍＬに希釈したＧ０１３００６（配列番号１）を含むＬＮＰで構成され、ミックス「Ｂ」は、１３．３６μｇ／ｍＬに希釈したＣａｓ９ ｍＲＮＡ ６０（配列番号１１）を含むＬＮＰで構成された。ＬＮＰミックスの「Ａ」及び「Ｂ」を３７℃で１５分間インキュベートした。ミックス「Ａ」をＴＣＴＭで１：２に段階希釈し、ミックス「Ｂ」と１：１の体積で混合した。得られた溶液を２５μＬにて９６ウェルプレート内の３．２×１０＾４Ｔ細胞に加えた。
次に、ＨＤ３ ＴＣＲ（配列番号１８）をコードするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形態の修復鋳型を、２μＭに希釈した化合物４の存在下または非存在下、ＴＣＴＭで３．８４×１０１１ゲノムコピー／ｍＬに希釈した。得られた溶液を２５μＬにて、前のステップでＬＮＰにより処理されたＴ細胞に加えた。修復鋳型の干渉を伴わずにＮＧＳによる編集評価を可能にするため、本実験の一群には、ＡＡＶ非存在下、２μＭに希釈した化合物４を含むかまたは含まないＴＣＴＭを２５μＬにて与えた。
ＬＮＰ、修復鋳型及び化合物４の添加後、Ｔ細胞を３７℃で４８時間インキュベートし、その時に、Ｔ細胞を５００ｇで５分間遠心分離にかけ、２００μＬのＴＣＧＭに再懸濁させ、インキュベーターに戻した。
処理後４日目に、ＡＡＶ鋳型を与えなかった細胞を５００ｇで５分間遠心分離にかけ、実施例１に記載のように、溶解、各標的遺伝子座のＰＣＲ増幅及びその後のＮＧＳ分析に供した。インデルパーセントの結果を表２１及び図１０Ａに示す。
処理後４日目にはまた、ＡＡＶ鋳型を与えた細胞を混合し、ＴＣＧＭ中で１：４の比（ｖ／ｖ）で継代培養した。処理後７日目に、ＡＡＶ鋳型を与えた細胞をフローサイトメトリーによって評価した。
実施例１９．３．フローサイトメトリー
ＬＮＰ処理後７日目に、５０μＬの細胞を、Ｕ底９６ウェルプレートに移し、５分間５００ｇにて遠心沈殿にかけた。上清を廃棄し、細胞を、Ｖｉａｋｒｏｍｅ ８０８（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃ．、カタログ番号Ｃ３６６２８）（１：１００）、ＰＣ５．５抗ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７３３６）（１：２００）、ＢＶ４２１抗ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３１７４３４）（１：１００）、ＢＶ７８５抗ＣＤ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０１０４６）（１：１００）、及び抗Ｖβ７．２（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃ．、ＩＭ３６０４）（１：５０）を含有する１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、暗所で４℃にて３０分間染色した。細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ ＬＸフローサイトメーターで処理した。ＨＤ３ ＴＣＲ挿入パーセントの結果を表２２及び図１０Ｂに示す。
Figure 2024516376000134
Figure 2024516376000135
追加の配列表
以下の表中及び全体において、「ｍＡ」、「ｍＣ」、「ｍＵ」、または「ｍＧ」という用語は、２’-Ｏ-Ｍｅで修飾されているヌクレオチドを示すために使用されている。
以下の表中、「＊」は、ＰＳ修飾を示すために使用されている。本出願において、Ａ＊、Ｃ＊、Ｕ＊、またはＧ＊という用語は、次の（例えば、３’）ヌクレオチドにＰＳ結合で連結されているヌクレオチドを示すために使用され得る。
ＤＮＡ配列（Ｔを含む）がＲＮＡに関して参照されている場合は、ＴをＵで置き換えるべきであり（これは、文脈に応じて、修飾されている場合も未修飾の場合もある）、その逆も同様であることが理解される。
以下の表では、ペプチド配列を記載するためにアミノ酸の一文字表記が使用されている。

Figure 2024516376000136
Figure 2024516376000137
Figure 2024516376000138
Figure 2024516376000139
Figure 2024516376000140
Figure 2024516376000141
Figure 2024516376000142
Figure 2024516376000143
Figure 2024516376000144
Figure 2024516376000145
Figure 2024516376000146
Figure 2024516376000147
Figure 2024516376000148
Figure 2024516376000149
Figure 2024516376000150
Figure 2024516376000151
Figure 2024516376000152
Figure 2024516376000153
Figure 2024516376000154
Figure 2024516376000155
Figure 2024516376000156
Figure 2024516376000157

Claims (240)

  1. 式Ｉ：
    Figure 2024516376000158
     の構造を有する化合物またはその塩であって、
    式中、
    ｘ１は、Ｃ-Ｒ３またはＮであり、
    Ｒ１は、Ｃ１-Ｃ３アルキルであり、
    Ｒ２は、シクロアルキルまたはヘテロシクリルであり、シクロアルキル及びヘテロシクリルが１つ以上のＲ６で任意に置換されており、
    Ｒ３は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルであり、
    Ｒ４は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルであり、
    Ｒ５は、Ｃ１-Ｃ３アルキルであり、
    各Ｒ６は、独立して、ヒドロキシ、ハロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アミノ、及びシアノから選択されるか、または２つのＲ６が、それらが結合している原子（複数可）と一緒になって、スピロ環もしくは縮合環を形成し、かつ
    Ｒ７は、ＨまたはＣ１-Ｃ３アルキルであるが、
    但し、
    （ａ）ｘ１がＣ-Ｒ３である、
    （ｂ）Ｒ１がＣ２-Ｃ３アルキルである、
    （ｃ）Ｒ４がＣ１-Ｃ３アルキルである、
    （ｄ）Ｒ２が１つのＲ６で置換されており、Ｒ６がハロである、
    （ｅ）結合している原子（複数可）と一緒になってスピロ環式または縮合環を形成する２つのＲ６でＲ２が置換されている、及び
    （ｆ）Ｒ２が、１つ以上のＲ６で任意に置換されているＣ３-Ｃ５シクロアルキルである、
    のうちの少なくとも１つが当てはまることを条件とする、前記化合物またはその塩。
  2. ｘ１がＣ-Ｒ３である、請求項１に記載の化合物。
  3. Ｒ３が、Ｈまたはメチルである、請求項２に記載の化合物。
  4. ｘ１がＮである、請求項１に記載の化合物。
  5. Ｒ１がＣ２-Ｃ３アルキルである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
  6. Ｒ１が、メチル及びエチルから選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物。
  7. Ｒ１がメチルである、請求項６に記載の化合物。
  8. Ｒ４がＣ１-Ｃ３アルキルである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
  9. Ｒ４が、Ｈまたはメチルである、請求項１～７のいずれか１項に記載の化合物。
  10. Ｒ４がＨである、請求項９に記載の化合物。
  11. Ｒ２がシクロアルキルである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
  12. Ｒ２がＣ３-Ｃ７シクロアルキルである、請求項１１に記載の化合物。
  13. Ｒ２がシクロヘキシルである、請求項１２に記載の化合物。
  14. Ｒ２がＣ３-Ｃ５シクロアルキルである、請求項１～１２のいずれか１項に記載の化合物。
  15. Ｒ２がヘテロシクリルである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の化合物。
  16. Ｒ２が５～７員のヘテロシクリルである、請求項１５に記載の化合物。
  17. Ｒ２がテトラヒドロピラニルである、請求項１６に記載の化合物。
  18. Ｒ２がテトラヒドロフラニルである、請求項１６に記載の化合物。
  19. Ｒ２が、独立してヒドロキシ、ハロ、及びシクロアルキルから選択される、１つ以上のＲ６で任意に置換されているか、または結合している原子（複数可）と一緒になってスピロ環式もしくは縮合環を形成する２つのＲ６で任意に置換されている、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
  20. Ｒ２が１つ以上のＲ６で置換されており、各Ｒ６が、ハロまたはヒドロキシルである、請求項１９に記載の化合物。
  21. Ｒ２が１つのＲ６で置換されており、前記Ｒ６がハロである、請求項２０に記載の化合物。
  22. 各Ｒ６がフルオロである、請求項２０または２１に記載の化合物。
  23. 結合している原子（複数可）と一緒になってスピロ環式または縮合環を形成する２つのＲ６でＲ２が置換されている、請求項１９に記載の化合物。
  24. Ｒ２が、独立してヒドロキシ、メトキシ、及びメチルから選択される１つ以上のＲ６で任意に置換されている、請求項１～１８のいずれか１項に記載の化合物。
  25. Ｒ５がメチルである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。
  26. Ｒ７が、Ｈまたはメチルである、先行請求項のいずれか１項に記載の化合物。

  27. Figure 2024516376000159
    Figure 2024516376000160
     またはそれらの塩から選択される化合物。
  28. Figure 2024516376000161
     またはその塩である、請求項２７に記載の化合物。
  29. Figure 2024516376000162
     、
    またはその塩である、請求項２７に記載の化合物。
  30. Figure 2024516376000163
     またはその塩である、請求項２７に記載の化合物。
  31. Figure 2024516376000164
     またはその塩である、請求項２７に記載の化合物。
  32. Figure 2024516376000165
     またはその塩である、請求項２７に記載の化合物。

  33. Figure 2024516376000166
     またはその塩である、請求項２７に記載の化合物。
  34. Figure 2024516376000167
     またはその塩である、請求項２７に記載の化合物。
  35. 遊離塩基である、請求項１～３４のいずれか１項に記載の化合物。
  36. 塩である、請求項１～３４のいずれか１項に記載の化合物。
  37. 前記塩がトリフラートアニオンを含む、請求項３６に記載の化合物。
  38. ａ）ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤（ＤＮＡ－ＰＫＩ）、
    ｂ）ＤＮＡ切断物質、
    ｃ）任意に、細胞、及び
    ｄ）任意に、ドナーＤＮＡ、
    を含む組成物であって、前記ＤＮＡ－ＰＫＩが、式Ｉ

    Figure 2024516376000168
     の化合物またはその塩であり、
    式中、
    ｘ１は、Ｃ－Ｒ３またはＮであり、
    Ｒ１は、Ｃ１－Ｃ３アルキルであり、
    Ｒ２は、シクロアルキルまたはヘテロシクリルであり、シクロアルキル及びヘテロシクリルが１つ以上のＲ６で任意に置換されており、
    Ｒ３は、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであり、
    Ｒ４は、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであり、
    Ｒ５は、Ｃ１－Ｃ３アルキルであり、
    各Ｒ６は、独立して、ヒドロキシ、ハロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アミノ、及びシアノから選択されるか、または２つのＲ６が、それらが結合している原子（複数可）と一緒になって、スピロ環もしくは縮合環を形成し、かつ
    Ｒ７は、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルである、前記組成物。
  39. ｘ１がＮである、請求項３８に記載の組成物。
  40. Ｒ１がメチルである、請求項３８または３９に記載の組成物。
  41. Ｒ４がＨである、請求項３８～４０のいずれか１項に記載の組成物。
  42. Ｒ２がシクロヘキシルである、請求項３８～４１のいずれか１項に記載の組成物。
  43. Ｒ２がテトラヒドロピラニルである、請求項３８～４１のいずれか１項に記載の組成物。
  44. Ｒ２がテトラヒドロフラニルである、請求項３８～４１のいずれか１項に記載の組成物。
  45. Ｒ２が、独立してヒドロキシ、メトキシ、及びメチルから選択される、１つ以上のＲ６で任意に置換されている、請求項３８～４４のいずれか１項に記載の組成物。
  46. Ｒ５がメチルである、請求項３８～４５のいずれか１項に記載の組成物。
  47. Ｒ７が、Ｈまたはメチルである、請求項３８～４６のいずれか１項に記載の組成物。
  48. 前記ＤＮＡ－ＰＫＩが、請求項１～３７のいずれか１項に記載の化合物である、請求項３８に記載の組成物。
  49. ａ）ＤＮＡプロテインキナーゼ阻害剤（ＤＮＡ－ＰＫＩ）、
    ｂ）ＤＮＡ切断物質、
    ｃ）任意に、細胞、及び
    ｄ）任意に、ドナーＤＮＡ、
    を含む組成物であって、前記ＤＮＡ－ＰＫＩが、
    Figure 2024516376000169
    Figure 2024516376000170
     またはそれらの塩から選択される、前記組成物。
  50. 前記ＤＮＡ－ＰＫＩが、
    Figure 2024516376000171
     またはその塩である、請求項４９に記載の組成物。
  51. 前記ＤＮＡ－ＰＫＩが、

    Figure 2024516376000172
     またはその塩である、請求項４９に記載の組成物。
  52. 前記ＤＮＡ－ＰＫＩが、
    Figure 2024516376000173
     またはその塩である、請求項４９に記載の組成物。
  53. 前記ＤＮＡ－ＰＫＩが、
    Figure 2024516376000174
     またはその塩である、請求項４９に記載の組成物。
  54. 前記ＤＮＡ－ＰＫＩが、
    Figure 2024516376000175
     またはその塩である、請求項４９に記載の組成物。
  55. 前記ＤＮＡ－ＰＫＩが、
    Figure 2024516376000176
     またはその塩である、請求項４９に記載の組成物。
  56. 前記ＤＮＡ－ＰＫＩが、
    Figure 2024516376000177
     またはその塩である、請求項４９に記載の組成物。
  57. 前記ＤＮＡ－ＰＫＩが、
    Figure 2024516376000178
     またはその塩である、請求項４９に記載の組成物。
  58. 前記組成物中の前記ＤＮＡ－ＰＫＩの濃度が約１μＭ以下である、請求項３８～５７のいずれか１項に記載の組成物。
  59. 前記組成物中の前記ＤＮＡ－ＰＫＩの濃度が約０．２５μＭ以下である、請求項５８に記載の組成物。
  60. 前記組成物中の前記ＤＮＡ－ＰＫＩの濃度が約０．１～１μＭである、請求項３８～５７のいずれか１項に記載の組成物。
  61. 前記組成物中の前記ＤＮＡ－ＰＫＩの濃度が約０．１～０．５μＭである、請求項６０に記載の組成物。
  62. 細胞を含む、請求項３８～６１のいずれか１項に記載の組成物。
  63. 前記細胞が真核細胞である、請求項６２に記載の組成物。
  64. 前記細胞が肝細胞である、請求項６２に記載の組成物。
  65. 前記細胞が養子細胞療法（ＡＣＴ）において有用である、請求項６２に記載の組成物。
  66. 前記細胞が養子細胞療法において有用である、請求項６５に記載の組成物。
  67. 前記細胞が幹細胞である、請求項６５または６６に記載の組成物。
  68. 前記幹細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項６７に記載の組成物。
  69. 前記細胞が免疫細胞である、請求項６５～６８のいずれか１項に記載の組成物。
  70. 前記免疫細胞が、白血球またはリンパ球である、請求項６９に記載の組成物。
  71. 前記免疫細胞がリンパ球である、請求項７０に記載の組成物。
  72. 前記リンパ球が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞である、請求項７１に記載の組成物。
  73. 前記リンパ球がＴ細胞である、請求項７１に記載の組成物。
  74. Ｔ細胞が初代Ｔ細胞である、請求項７３に記載の組成物。
  75. Ｔ細胞が制御性Ｔ細胞である、請求項７３に記載の組成物。
  76. 前記リンパ球が活性化Ｔ細胞である、請求項７３～７５のいずれか１項に記載の組成物。
  77. 前記リンパ球が非活性化Ｔ細胞である、請求項７３～７５のいずれか１項に記載の組成物。
  78. 前記細胞がヒト細胞である、請求項６２～７７のいずれか１項に記載の組成物。
  79. 前記ＤＮＡ切断物質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ成分及び任意にガイドＲＮＡ成分を含む、請求項３８～７８のいずれか１項に記載の組成物。
  80. 前記ＤＮＡ切断物質が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥエフェクタードメインヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ成分、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項７９に記載の組成物。
  81. 前記ＤＮＡ切断物質が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ成分及びガイドＲＮＡ成分である、請求項７９に記載の組成物。
  82. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ成分が、Ｃａｓヌクレアーゼまたは前記ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、請求項８１に記載の組成物。
  83. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ成分が、前記ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、請求項８２に記載の組成物。
  84. 前記Ｃａｓヌクレアーゼがクラス２Ｃａｓヌクレアーゼである、請求項８２または８３に記載の組成物。
  85. 前記ＣａｓヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項８４に記載の組成物。
  86. 前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項８５に記載の組成物。
  87. 前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項８５に記載の組成物。
  88. 前記ＣａｓヌクレアーゼがＮｍｅ２Ｃａｓ９である、請求項８５に記載の組成物。
  89. 前記ＣａｓヌクレアーゼがＣａｓ１２ａヌクレアーゼである、請求項８１または８２に記載の組成物。
  90. 修飾ＲＮＡを含む、請求項３８～８９のいずれか１項に記載の組成物。
  91. 前記ガイドＲＮＡ成分が、ガイドＲＮＡ等のガイドＲＮＡ核酸である、請求項７９～９０のいずれか１項に記載の組成物。
  92. 前記ガイドＲＮＡ核酸がｇＲＮＡである、請求項９１に記載の組成物。
  93. 前記ガイドＲＮＡ核酸が、二重ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）であるかまたはそれをコードする、請求項９１または９２に記載の組成物。
  94. 前記ガイドＲＮＡ核酸が、単一ガイド（ｓｇＲＮＡ）であるかまたはそれをコードする、請求項９１または９２に記載の組成物。
  95. 前記ｇＲＮＡが修飾ｇＲＮＡである、請求項９２～９４のいずれか１項に記載の組成物。
  96. 前記修飾ｇＲＮＡが、５’末端の最初の５ヌクレオチドのうちの１つ以上において修飾を含む、請求項９５に記載の組成物。
  97. 前記修飾ｇＲＮＡが、３’末端の最後の５ヌクレオチドのうちの１つ以上において修飾を含む、請求項９５または９６に記載の組成物。
  98. 前記組成物が、ガイドＲＮＡ核酸及びクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含み、前記ｍＲＮＡと前記ガイドＲＮＡ核酸との重量比が約２：１～１：４である、請求項３８～９７のいずれか１項に記載の組成物。
  99. ドナーＤＮＡを含む、請求項３８～９８のいずれか１項に記載の組成物。
  100. 前記ドナーＤＮＡが、タンパク質をコードする配列、制御配列、または構造ＲＮＡをコードする配列、を含む鋳型を含む、請求項９９に記載の組成物。
  101. 前記ＤＮＡ切断物質が、脂質核酸集合体組成物中に存在する、請求項３８～１００のいずれか１項に記載の組成物。
  102. 前記脂質核酸集合体組成物が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物である、請求項１０１に記載の組成物。
  103. 前記ＬＮＰが、直径が約１０～２００ｎｍ、約２０～１５０ｎｍ、約５０～１５０ｎｍ、約５０～１００ｎｍ、約５０～１２０ｎｍ、約６０～１００ｎｍ、約７５～１５０ｎｍ、約７５～１２０ｎｍ、または約７５～１００ｎｍである、請求項１０２に記載の組成物。
  104. 前記組成物が、平均直径が約１０～２００ｎｍ、約２０～１５０ｎｍ、約５０～１５０ｎｍ、約５０～１００ｎｍ、約５０～１２０ｎｍ、約６０～１００ｎｍ、約７５～１５０ｎｍ、約７５～１２０ｎｍ、または約７５～１００ｎｍである前記ＬＮＰの集団を含む、請求項１０２または１０３に記載の組成物。
  105. 前記平均直径がＺ平均直径である、請求項１０４に記載の組成物。
  106. 前記脂質核酸集合体組成物がリポプレックスである、請求項１０１に記載の組成物。
  107. 前記脂質核酸集合体組成物がイオン化可能脂質を含む、請求項１０１～１０６のいずれか１項に記載の組成物。
  108. 前記イオン化可能脂質が、ｐＫａが約５．１～７．４、例えば、約５．５～６．６、約５．６～６．４、約５．８～６．２、または約５．８～６．５である、請求項１０７に記載の組成物。
  109. 前記脂質核酸集合体組成物がヘルパー脂質を含む、請求項１０１～１０８のいずれか１項に記載の組成物。
  110. 前記脂質核酸集合体組成物が中性脂質を含む、請求項１０１～１０９のいずれか１項に記載の組成物。
  111. 前記脂質核酸集合体組成物がＰＥＧ脂質を含む、請求項１０１～１１０のいずれか１項に記載の組成物。
  112. 前記脂質核酸集合体組成物のＮ／Ｐ比が約３～１０である、請求項１０１～１１１のいずれか１項に記載の組成物。
  113. 前記脂質核酸集合体組成物のＮ／Ｐ比が約５～７である、請求項１１２に記載の組成物。
  114. 前記脂質核酸集合体組成物のＮ／Ｐ比が約６である、請求項１１３に記載の組成物。
  115. ベクターをさらに含む、請求項３８～１１４のいずれか１項に記載の組成物。
  116. 前記ベクターが前記ＤＮＡ切断物質をコードする、請求項１１５に記載の組成物。
  117. 前記ベクターが前記ドナーＤＮＡをコードする、請求項１１５または１１６に記載の組成物。
  118. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１１５～１１７のいずれか１項に記載の組成物。
  119. 前記ベクターが非ウイルスベクターである、請求項１１５～１１７のいずれか１項に記載の組成物。
  120. 前記ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１１８に記載の組成物。
  121. 前記ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項１１８に記載の組成物。
  122. 前記ベクターがＡＡＶである、請求項１１８に記載の組成物。
  123. 前記細胞が、がん細胞ではない、請求項６２に記載の組成物。
  124. 細胞において標的ゲノム編集を行うための方法であって、前記細胞を、ＤＮＡ切断物質及びＤＮＡ－ＰＫＩと接触させることを含み、前記ＤＮＡ－ＰＫＩが、式Ｉ
    Figure 2024516376000179
     の化合物またはその塩であり、
    式中、
    ｘ１は、Ｃ－Ｒ３またはＮであり、
    Ｒ１は、Ｃ１－Ｃ３アルキルであり、
    Ｒ２は、シクロアルキルまたはヘテロシクリルであり、シクロアルキル及びヘテロシクリルが１つ以上のＲ６で任意に置換されており、
    Ｒ３は、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであり、
    Ｒ４は、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであり、
    Ｒ５は、Ｃ１－Ｃ３アルキルであり、
    各Ｒ６は、独立して、ヒドロキシ、ハロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アミノ、及びシアノから選択されるか、または２つのＲ６が、それらが結合している原子（複数可）と一緒になって、スピロ環もしくは縮合環を形成し、かつ
    Ｒ７は、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルである、前記方法。
  125. 細胞のゲノムにおける二本鎖ＤＮＡ切断を修復する方法であって、前記細胞を、ＤＮＡ切断物質及びＤＮＡ－ＰＫＩと接触させることを含み、前記ＤＮＡ－ＰＫＩが、式Ｉ
    Figure 2024516376000180
     の化合物またはその塩であり、
    式中、
    ｘ１は、Ｃ－Ｒ３またはＮであり、
    Ｒ１は、Ｃ１－Ｃ３アルキルであり、
    Ｒ２は、シクロアルキルまたはヘテロシクリルであり、シクロアルキル及びヘテロシクリルが１つ以上のＲ６で任意に置換されており、
    Ｒ３は、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであり、
    Ｒ４は、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであり、
    Ｒ５は、Ｃ１－Ｃ３アルキルであり、
    各Ｒ６は、独立して、ヒドロキシ、ハロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アミノ、及びシアノから選択されるか、または２つのＲ６が、それらが結合している原子（複数可）と一緒になって、スピロ環もしくは縮合環を形成し、かつ
    Ｒ７は、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルである、前記方法。
  126. 非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介した細胞のＤＮＡ切断の修復を阻害または抑制する方法であって、前記細胞を、ＤＮＡ切断物質及びＤＮＡ－ＰＫＩと接触させることを含み、前記ＤＮＡ－ＰＫＩが、式Ｉ
    Figure 2024516376000181
     の化合物またはその塩であり、
    式中、
    ｘ１は、Ｃ－Ｒ３またはＮであり、
    Ｒ１は、Ｃ１－Ｃ３アルキルであり、
    Ｒ２は、シクロアルキルまたはヘテロシクリルであり、シクロアルキル及びヘテロシクリルが１つ以上のＲ６で任意に置換されており、
    Ｒ３は、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであり、
    Ｒ４は、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであり、
    Ｒ５は、Ｃ１－Ｃ３アルキルであり、
    各Ｒ６は、独立して、ヒドロキシ、ハロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アミノ、及びシアノから選択されるか、または２つのＲ６が、それらが結合している原子（複数可）と一緒になって、スピロ環もしくは縮合環を形成し、かつ
    Ｒ７は、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルである、前記方法。
  127. 標的を定めた、細胞の前記ゲノムへのドナーＤＮＡの挿入方法であって、前記細胞を、ＤＮＡ切断物質、前記ドナーＤＮＡ、及びＤＮＡ－ＰＫＩと接触させることを含み、前記ＤＮＡ－ＰＫＩが、式Ｉ
    Figure 2024516376000182
     の化合物またはその塩であり、
    式中、
    ｘ１は、Ｃ－Ｒ３またはＮであり、
    Ｒ１は、Ｃ１－Ｃ３アルキルであり、
    Ｒ２は、シクロアルキルまたはヘテロシクリルであり、シクロアルキル及びヘテロシクリルが１つ以上のＲ６で任意に置換されており、
    Ｒ３は、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであり、
    Ｒ４は、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであり、
    Ｒ５は、Ｃ１－Ｃ３アルキルであり、
    各Ｒ６は、独立して、ヒドロキシ、ハロ、アルキル、アルコキシ、シクロアルキル、アミノ、及びシアノから選択されるか、または２つのＲ６が、それらが結合している原子（複数可）と一緒になって、スピロ環もしくは縮合環を形成し、かつ
    Ｒ７は、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルである、前記方法。
  128. 前記細胞を、前記ＤＮＡ－ＰＫＩを含まない細胞培地中で増殖させること、及び前記細胞培地に前記ＤＮＡ－ＰＫＩを加えることを含む、請求項１２４～１２７のいずれか１項に記載の方法。
  129. 前記細胞を前記ＤＮＡ切断物質と接触させてから、前記細胞を前記ＤＮＡ－ＰＫＩと接触させることを含む、請求項１２４～１２８のいずれか１項に記載の方法。
  130. 前記細胞を前記ＤＮＡ切断物質と接触させてから約６時間以内に、前記細胞を前記ＤＮＡ－ＰＫＩと接触させることを含む、請求項１２９に記載の方法。
  131. 前記細胞を前記ＤＮＡ切断物質と接触させてから約３時間以内に、前記細胞を前記ＤＮＡ－ＰＫＩと接触させることを含む、請求項１３０に記載の方法。
  132. 前記細胞を、前記ＤＮＡ－ＰＫＩと同時に前記ＤＮＡ切断物質と接触させることを含む、請求項１２４～１２８のいずれか１項に記載の方法。
  133. 前記細胞を前記ＤＮＡ－ＰＫＩと接触させた後に、前記細胞を前記ＤＮＡ切断物質と接触させることを含む、請求項１２４～１２８のいずれか１項に記載の方法。
  134. 前記細胞を前記ＤＮＡ－ＰＫＩと接触させてから約３時間以内に、前記細胞を前記ＤＮＡ切断物質と接触させることを含む、請求項１３３に記載の方法。
  135. 前記細胞を、前記ＤＮＡ－ＰＫＩを含む細胞培地中で増殖させることを含む、請求項１３３または１３４に記載の方法。
  136. 前記細胞を、前記ＤＮＡ切断物質及び前記ＤＮＡ－ＰＫＩと少なくとも約１日接触させる、請求項１２４～１３５のいずれか１項に記載の方法。
  137. 前記細胞を、前記ＤＮＡ切断物質及び前記ＤＮＡ－ＰＫＩと約１日～１週間接触させる、請求項１３６に記載の方法。
  138. 前記細胞を、前記ＤＮＡ切断物質及び前記ＤＮＡ－ＰＫＩと約５日間接触させる、請求項１３７に記載の方法。
  139. ｘ１がＮである、請求項１２４～１３８のいずれか１項に記載の方法。
  140. Ｒ１がメチルである、請求項１２４～１３９のいずれか１項に記載の方法。
  141. Ｒ４がＨである、請求項１２４～１４０のいずれか１項に記載の方法。
  142. Ｒ２がシクロヘキシルである、請求項１２４～１４１のいずれか１項に記載の方法。
  143. Ｒ２がテトラヒドロピラニルである、請求項１２４～１４１のいずれか１項に記載の方法。
  144. Ｒ２がテトラヒドロフラニルである、請求項１２４～１４１のいずれか１項に記載の方法。
  145. Ｒ２が、独立してヒドロキシ、メトキシ、及びメチルから選択される、１つ以上のＲ６で任意に置換されている、請求項１２４～１４４のいずれか１項に記載の方法。
  146. Ｒ５がメチルである、請求項１２４～１４５のいずれか１項に記載の方法。
  147. Ｒ７が、Ｈまたはメチルである、請求項１２４～１４６のいずれか１項に記載の方法。
  148. 前記ＤＮＡ－ＰＫＩが、請求項１～３７のいずれか１項に記載の化合物である、請求項１２４～１４７のいずれか１項に記載の方法。
  149. 細胞において標的ゲノム編集を行うための方法であって、前記細胞を、ＤＮＡ切断物質及びＤＮＡ－ＰＫＩと接触させることを含み、前記ＤＮＡ－ＰＫＩが、

    Figure 2024516376000183
    Figure 2024516376000184
     またはそれらの塩から選択される、前記方法。
  150. 細胞のゲノムにおける二本鎖ＤＮＡ切断を修復する方法であって、前記細胞を、ＤＮＡ切断物質及びＤＮＡ－ＰＫＩと接触させることを含み、前記ＤＮＡ－ＰＫＩが、

    Figure 2024516376000185
    Figure 2024516376000186
     またはそれらの塩から選択される、前記方法。
  151. 非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介した細胞のＤＮＡ切断の修復を阻害または抑制する方法であって、前記細胞を、ＤＮＡ切断物質及びＤＮＡ－ＰＫＩと接触させることを含み、前記ＤＮＡ－ＰＫＩが、

    Figure 2024516376000187
    Figure 2024516376000188
     またはその塩から選択される、前記方法。
  152. 標的を定めた、細胞の前記ゲノムへのドナーＤＮＡの挿入方法であって、前記細胞を、ＤＮＡ切断物質、前記ドナーＤＮＡ、及びＤＮＡ－ＰＫＩと接触させることを含み、前記ＤＮＡ－ＰＫＩが、

    Figure 2024516376000189
    Figure 2024516376000190
     またはそれらの塩から選択される、前記方法。
  153. 前記ＤＮＡ－ＰＫＩが、
    Figure 2024516376000191
     またはその塩である、請求項１４９～１５２のいずれか１項に記載の方法。
  154. 前記ＤＮＡ－ＰＫＩが、

    Figure 2024516376000192
     またはその塩である、請求項１４９～１５２のいずれか１項に記載の方法。
  155. 前記ＤＮＡ－ＰＫＩが、
    Figure 2024516376000193
     またはその塩である、請求項１４９～１５２のいずれか１項に記載の方法。
  156. 前記ＤＮＡ－ＰＫＩが、
    Figure 2024516376000194
     またはその塩である、請求項１４９～１５２のいずれか１項に記載の方法。
  157. 前記ＤＮＡ－ＰＫＩが、
    Figure 2024516376000195
     またはその塩である、請求項１４９～１５２のいずれか１項に記載の方法。
  158. 前記ＤＮＡ－ＰＫＩが、
    Figure 2024516376000196
     またはその塩である、請求項１４９～１５２のいずれか１項に記載の方法。
  159. 前記ＤＮＡ－ＰＫＩが、
    Figure 2024516376000197
     またはその塩である、請求項１４９～１５２のいずれか１項に記載の方法。
  160. 前記ＤＮＡ－ＰＫＩが、
    Figure 2024516376000198
     またはその塩である、請求項１４９～１５２のいずれか１項に記載の方法。
  161. 前記細胞を細胞培地中で前記ＤＮＡ-ＰＫＩと接触させ、前記細胞培地中の前記ＤＮＡ-ＰＫＩの濃度が約１μＭ以下である、請求項１２４～１６０のいずれか１項に記載の方法。
  162. 前記細胞培地中の前記ＤＮＡ-ＰＫＩの濃度が約０．２５μＭ以下である、請求項１６１に記載の方法。
  163. 前記細胞を細胞培地中で前記ＤＮＡ-ＰＫＩと接触させ、前記細胞培地中の前記ＤＮＡ-ＰＫＩの濃度が約０．１～１μＭである、請求項１２４～１６０のいずれか１項に記載の方法。
  164. 前記細胞培地中の前記ＤＮＡ-ＰＫＩの濃度が約０．１～０．５μＭである、請求項１６３に記載の方法。
  165. 前記細胞が真核細胞である、請求項１２４～１６４のいずれか１項に記載の方法。
  166. 前記細胞が肝細胞である、請求項１６５に記載の方法。
  167. 前記細胞が養子細胞療法（ＡＣＴ）において有用である、請求項１２４～１６５のいずれか１項に記載の方法。
  168. 前記細胞が自家細胞療法において有用である、請求項１６７に記載の方法。
  169. 前記細胞が幹細胞である、請求項１２４～１６５のいずれか１項に記載の方法。
  170. 前記幹細胞が造血幹細胞（ＨＳＣ）である、請求項１６９に記載の方法。
  171. 前記細胞が人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１６９に記載の方法。
  172. 前記細胞が免疫細胞である、請求項１６８に記載の方法。
  173. 前記免疫細胞が白血球またはリンパ球である、請求項１７２に記載の方法。
  174. 前記免疫細胞がリンパ球である、請求項１７３に記載の方法。
  175. 前記リンパ球が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞である、請求項１７４に記載の方法。
  176. 前記リンパ球がＴ細胞である、請求項１７５に記載の方法。
  177. Ｔ細胞が初代Ｔ細胞である、請求項１７６に記載の方法。
  178. Ｔ細胞が制御性Ｔ細胞である、請求項１７６に記載の方法。
  179. 前記リンパ球が活性化Ｔ細胞である、請求項１７４～１７８のいずれか１項に記載の方法。
  180. 前記リンパ球が非活性化Ｔ細胞である、請求項１７４～１７８のいずれか１項に記載の方法。
  181. 前記細胞がヒト細胞である、請求項１２４～１８０のいずれか１項に記載の方法。
  182. 前記ＤＮＡ切断物質が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥエフェクタードメインヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ成分、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項１２４～１８１のいずれか１項に記載の方法。
  183. 前記ＤＮＡ切断物質がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ成分である、請求項１８２に記載の方法。
  184. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ成分が、Ｃａｓヌクレアーゼまたは前記ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、請求項１８３に記載の方法。
  185. 前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ成分が、前記ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む、請求項１８４に記載の方法。
  186. 前記Ｃａｓヌクレアーゼがクラス２Ｃａｓヌクレアーゼである、請求項１８４または１８５に記載の方法。
  187. 前記ＣａｓヌクレアーゼがＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１８６に記載の方法。
  188. 前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１８７に記載の方法。
  189. 前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１８７に記載の方法。
  190. 前記ＣａｓヌクレアーゼがＮｍｅ２Ｃａｓ９である、請求項１８７に記載の方法。
  191. 前記ＣａｓヌクレアーゼがＣａｓ１２ａヌクレアーゼである、請求項１８６に記載の方法。
  192. 前記細胞を修飾ＲＮＡと接触させることをさらに含む、請求項１２４～１９１のいずれか１項に記載の方法。
  193. 前記細胞をガイドＲＮＡ核酸と接触させることをさらに含む、請求項１２４～１９２のいずれか１項に記載の方法。
  194. 前記ガイドＲＮＡ核酸がｇＲＮＡである、請求項１９３に記載の方法。
  195. 前記ガイドＲＮＡ核酸が、二重ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）であるかまたはそれをコードする、請求項１９３または１９４に記載の方法。
  196. 前記ガイドＲＮＡ核酸が、単一ガイド（ｓｇＲＮＡ）であるかまたはそれをコードする、請求項１９３または１９４に記載の方法。
  197. 前記ｇＲＮＡが修飾ｇＲＮＡである、請求項１９４～１９６のいずれか１項に記載の方法。
  198. 前記修飾ｇＲＮＡが、５’末端の最初の５ヌクレオチドのうちの１つ以上において修飾を含む、請求項１９７に記載の方法。
  199. 前記修飾ｇＲＮＡが、３’末端の最後の５ヌクレオチドのうちの１つ以上において修飾を含む、請求項１９７または１９８に記載の方法。
  200. 前記ＤＮＡ切断物質がクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡであり、前記ｍＲＮＡと前記ガイドＲＮＡ核酸との重量比が約２：１～１：４である、請求項１９３～１９９のいずれか１項に記載の方法。
  201. 前記細胞をドナーＤＮＡと接触させることをさらに含む、請求項１２４～２００のいずれか１項に記載の方法。
  202. 前記細胞を、前記ドナーＤＮＡを含むベクターと接触させることを含む、請求項２０１に記載の方法。
  203. 前記ドナーＤＮＡが、タンパク質をコードする配列、制御配列、構造ＲＮＡをコードする配列、を含む鋳型を含む、請求項２０１または２０２に記載の方法。
  204. 前記鋳型配列が、相同組換え修復（ＨＤＲ）を介して前記細胞の前記ゲノムに組み込まれる、請求項２０３に記載の方法。
  205. 前記細胞を、前記ＤＮＡ切断物質を含む脂質核酸集合体組成物と接触させることを含む、請求項１２４～２０５のいずれか１項に記載の方法。
  206. 前記脂質核酸集合体組成物が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物である、請求項２０５に記載の方法。
  207. 前記ＬＮＰが、直径が約１０～２００ｎｍ、約２０～１５０ｎｍ、約５０～１５０ｎｍ、約５０～１００ｎｍ、約５０～１２０ｎｍ、約６０～１００ｎｍ、約７５～１５０ｎｍ、約７５～１２０ｎｍ、または約７５～１００ｎｍである、請求項２０６に記載の方法。
  208. 前記細胞を、平均直径が約１０～２００ｎｍ、約２０～１５０ｎｍ、約５０～１５０ｎｍ、約５０～１００ｎｍ、約５０～１２０ｎｍ、約６０～１００ｎｍ、約７５～１５０ｎｍ、約７５～１２０ｎｍ、または約７５～１００ｎｍである前記ＬＮＰの集団と接触させることを含む、請求項２０６または２０７に記載の方法。
  209. 前記平均直径がＺ平均直径である、請求項２０７または２０８に記載の方法。
  210. 前記脂質核酸集合体組成物がイオン化可能脂質を含む、請求項２０５～２０９のいずれか１項に記載の方法。
  211. 前記イオン化可能脂質が、ｐＫａが約５．１～７．４、例えば、約５．５～６．６、約５．６～６．４、約５．８～６．２、または約５．８～６．５である、請求項２１０に記載の方法。
  212. 前記脂質核酸集合体組成物がヘルパー脂質を含む、請求項２０５～２１１のいずれか１項に記載の方法。
  213. 前記脂質核酸集合体組成物が中性脂質を含む、請求項２０５～２１２のいずれか１項に記載の方法。
  214. 前記脂質核酸集合体組成物がＰＥＧ脂質を含む、請求項２０５～２１３のいずれか１項に記載の方法。
  215. 前記脂質核酸集合体組成物のＮ／Ｐ比が約３～１０である、請求項２０５～２１４のいずれか１項に記載の方法。
  216. 前記脂質核酸集合体組成物のＮ／Ｐ比が約５～７である、請求項２１５に記載の方法。
  217. 前記脂質核酸集合体組成物のＮ／Ｐ比が約６である、請求項２１６に記載の方法。
  218. 前記細胞をベクターと接触させることをさらに含む、請求項１２４～２１７のいずれか１項に記載の方法。
  219. 前記ベクターが前記ＤＮＡ切断物質をコードする、請求項２１８に記載の方法。
  220. 前記ベクターがドナーＤＮＡをコードする、請求項２１８または２１９に記載の方法。
  221. 前記ベクターがウイルスベクターである、請求項２１８～２２０のいずれか１項に記載の方法。
  222. 前記ベクターが非ウイルスベクターである、請求項２１８～２２０のいずれか１項に記載の方法。
  223. 前記ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項２２１に記載の方法。
  224. 前記ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項２２１に記載の方法。
  225. 前記ベクターがＡＡＶである、請求項２２１に記載の方法。
  226. 前記ＤＮＡ切断物質が、前記細胞の前記ゲノム内の標的配列と相互作用して二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を生じさせる、請求項１２４～２２５のいずれか１項に記載の方法。
  227. 遺伝子ノックアウトをもたらす、請求項１２４～２２６のいずれか１項に記載の方法。
  228. 遺伝子修正をもたらす、請求項１２４～２２７のいずれか１項に記載の方法。
  229. 遺伝子挿入をもたらす、請求項１２４～２２７のいずれか１項に記載の方法。
  230. 前記ドナーＤＮＡが、タンパク質をコードする外因性核酸を含む鋳型を含む、請求項２０３～２２９のいずれか１項に記載の方法。
  231. 前記タンパク質が、サイトカイン、免疫抑制物質、抗体、受容体、及び酵素から選択される、請求項２３０に記載の方法。
  232. 前記タンパク質が受容体である、請求項２３１に記載の方法。
  233. 前記受容体が、免疫受容体、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、及びキメラ抗原受容体から選択される、請求項２３１または２３２に記載の方法。
  234. 前記受容体が免疫受容体である、請求項２３３に記載の方法。２３５。
    前記受容体がＴＣＲである、請求項２３３に記載の方法。
  235. 前記外因性核酸が、ＴＣＲのＴＣＲα鎖及び／またはＴＣＲβ鎖をコードする、請求項２３０に記載の方法。
  236. 前記受容体がキメラ抗原受容体である、請求項２３３に記載の方法。
  237. 前記ＤＮＡ切断物質が、前記細胞の前記ゲノム内の標的配列と相互作用して二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を生じさせる、請求項２３０～２３６のいずれか１項に記載の方法。
  238. 前記ＤＮＡ切断物質が、前記Ｔ細胞の前記ＴＲＡＣ遺伝子内の標的配列と相互作用する、請求項２３０～２３７のいずれか１項に記載の方法。
  239. 前記鋳型が、前記Ｔ細胞の前記ＴＲＡＣ遺伝子に組み込まれる、請求項２３０～２３８のいずれか１項に記載の方法。
  240. 前記鋳型が、切断部位の上流及び下流に位置する配列にそれぞれ相補的な第１のホモロジーアーム及び第２のホモロジーアームを含む、請求項２３０～２３９のいずれか１項に記載の方法。
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