CN117940426A - Dna依赖性蛋白质激酶抑制剂以及其组合物和用途 - Google Patents

Dna依赖性蛋白质激酶抑制剂以及其组合物和用途 Download PDF

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Abstract

本公开涉及DNA蛋白质激酶抑制剂以及其组合物和使用方法。在一些实施方案中，所述抑制剂具有式I结构：或其盐，其中：x1为C‑R3或N；R1为C1‑C3烷基；R2为环烷基或杂环基，并且环烷基和杂环基任选地被一个或多个R6取代；R3为H或C1‑C3烷基；R4为H或C1‑C3烷基；R5为C1‑C3烷基；每个R6独立地选自羟基、卤基、烷基、烷氧基、环烷基、氨基和氰基，或两个R6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环；并且R7为H或C1‑C3烷基。

Description

DNA依赖性蛋白质激酶抑制剂以及其组合物和用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年4月17日提交的美国临时专利申请第63/176225号的优先权益，所述专利申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
随着最近发现和实施CRISPR/Cas9编辑技术，在精确位置处修饰任何细胞的基因组的能力已得到提高。然而，在给定基因座处引入特异性定向变化的能力受到以下事实的阻碍：在Cas9介导的DNA裂解后发生的主要细胞修复途径为错误的非同源末端连接(NHEJ)途径。同源定向重组(HDR)相较于NHEJ效率较低，从而降低真核细胞中的编辑效率。
DNA依赖性蛋白质激酶(DNA-PK)是一种核丝氨酸/苏氨酸激酶，已显示其在DNA双链断裂修复机制中是必需的。在哺乳动物中，双链DNA断裂的主要修复途径是非同源末端连接(NHEJ)途径，其无关于细胞周期的阶段起作用并且通过去除双链断裂的不可接合末端并且接合末端来运作。DNA-PK抑制剂(DNA-PKI)是一类结构多样的DNA-PK和NHEJ途径的抑制剂。
对用于修饰基因组的高效系统和技术存在相当大的需求。还需要用模板核酸编辑核酸分子的高效方法。
发明内容
本公开涉及DNA-PKI以及其组合物和使用方法。
在某些实施方案中，所述DNA-PKI是具有式I结构的化合物：
或其盐，
其中：
x1为C-R3或N；
R1为C1-C3烷基；
R2为环烷基或杂环基，并且环烷基和杂环基任选地被一个或多个R6取代；
R3为H或C1-C3烷基；
R4为H或C1-C3烷基；
R5为C1-C3烷基；
每个R6独立地选自羟基、卤基、烷基、烷氧基、环烷基、氨基和氰基，或两个R6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环；并且
R7为H或C1-C3烷基，
条件是以下中的至少一者适用：
(a)x1为C-R3；
(b)R1为C2-C3烷基；
(c)R4为C1-C3烷基；
(d)R2被一个R6取代，并且R6为卤基；
(e)R2被两个R6取代，所述两个R6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环；并且
(f)R2为任选地被一个或多个R6取代的C3-C5环烷基。
在优选实施方案中，本公开涉及选自以下的化合物：
或其盐。
在某些实施方案中，本公开涉及包含以下的DNA-PKI组合物：
a)DNA蛋白质激酶抑制剂(DNA-PKI)；
b)DNA切割剂；
c)任选地，细胞；和
d)任选地，供体DNA；
其中所述DNA-PKI是式I化合物
或其盐，
其中：
x1为C-R3或N；
R1为C1-C3烷基；
R2为环烷基或杂环基，并且环烷基和杂环基任选地被一个或多个R6取代；
R3为H或C1-C3烷基；
R4为H或C1-C3烷基；
R5为C1-C3烷基；
每个R6独立地选自羟基、卤基、烷基、烷氧基、环烷基、氨基和氰基，或两个R6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环；并且
R7为H或C1-C3烷基。
在某些实施方案中，本公开涉及一种用于在细胞中进行靶向基因组编辑的方法或一种在细胞基因组中修复双链DNA断裂的方法或一种抑制或遏制经由非同源末端连接(NHEJ)途径修复细胞中的DNA断裂的方法，所述方法包括使所述细胞与DNA切割剂和DNA-PKI接触，其中所述DNA-PKI是式I化合物
或其盐，
其中：
x1为C-R3或N；
R1为C1-C3烷基；
R2为环烷基或杂环基，并且环烷基和杂环基任选地被一个或多个R6取代；
R3为H或C1-C3烷基；
R4为H或C1-C3烷基；
R5为C1-C3烷基；
每个R6独立地选自羟基、卤基、烷基、烷氧基、环烷基、氨基和氰基，或两个R6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环；并且
R7为H或C1-C3烷基。
附图说明
图1A-1B显示DNA-PKI化合物对GFP插入至TRAC基因座中的影响。图1A显示在化合物(化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8和化合物9)情况下GFP插入至TRAC基因座中之后的CD3-细胞百分比，并且图1B显示如GFP+的CD3-细胞百分比的插入效率。
图2A-2C显示在TRAC基因座处用化合物(化合物1、化合物3和化合物4)进行编辑。图2A显示CD8+细胞百分比。图2B显示编辑之后的残余TCR+细胞，并且图2C显示编辑之后的WT1-TCR+细胞％。
图3A-3D显示用化合物(化合物1或化合物3)工程化的WT1-T细胞的细胞毒性。图3A和图3B分别显示从供体007HD和008HD工程化的WT1-T细胞所温育的表达荧光素酶的697ALL细胞的特异性裂解。图3C和图3D分别显示经转导以表达HLA-A*02:01的K562-luc2细胞在与从供体007HD和008HD工程化的WT1-T细胞一起温育之后的特异性裂解。
图4A-4H显示在与目标细胞一起温育之后通过用化合物1或化合物3工程化的T细胞的细胞因子释放。图4A和图4B分别显示在与697ALL细胞和经转导以表达HLA-A*02:01的K562-luc2细胞一起温育之后颗粒酶B的释放。图4C和图4D分别显示在与697ALL细胞和经转导以表达HLA-A*02:01的K562-luc2细胞一起温育之后干扰素-γ(IFNg)的释放。图4E和图4F分别显示在与697ALL细胞和经转导以表达HLA-A*02:01的K562-luc2细胞一起温育之后白细胞介素-2(IL-2)的释放。图4G和图4H分别显示在与697ALL细胞和经转导以表达HLA-A*02:01的K562-luc2细胞一起温育之后TNF-α的释放。
图5显示B2M阴性细胞的百分比，表示在用化合物1或化合物4编辑之后，具有有效基因破坏的B细胞群体。
图6A显示在用LNP组合物和不同剂量的化合物1或化合物4处理之后，通过NGS评估的AAVS1处的平均编辑百分比。
图6B显示在用化合物1或化合物4编辑以在AAVS1基因座处插入GFP之后，具有高GFP表达(GFP++)的NK细胞百分比。
图7A显示CD3eta+,Vb8-细胞的百分比，表示在TRAC或TRBC1/2基因座处无基因破坏的T细胞群体。
图7B显示CD3eta+,Vb8+细胞的百分比，表示在TRAC处具有WT1 TCR插入的T细胞群体。
图7C显示HLA-A2-细胞的百分比，表示在HLA基因座处具有有效基因破坏的T细胞群体。
图7D显示HLA-DRDPDQ-细胞的百分比，表示在CIITA基因座处具有有效基因破坏的T细胞群体。
图7E显示GFP+细胞的百分比，表示在AAVS1基因座处具有GFP插入的T细胞群体。
图7F显示Vb8+GFP+HLA-A-HLA-DRDPDQ-细胞的百分比，表示具有5个基因组编辑的T细胞群体。
图8A-8B显示GFP+细胞的百分比，表示针对两种LNP组合物在替代培养基条件下编辑之后的T细胞群体。图8A显示用脂质摩尔比为50％可离子化脂质/38.5％胆固醇/10％DSPC/1.5％ PEG脂质的LNP组合物处理的细胞。图8B显示用脂质摩尔比为35％可离子化脂质/47.5％胆固醇/15％ DSPC/2.5％ PEG脂质的LNP组合物处理的细胞。
图9A显示在用化合物3和化合物4编辑之后的非预期结构变异百分比。
图9B显示在用化合物3和化合物4编辑之后的GFP阳性细胞百分比。
图10A-B显示在不同剂量的sgRNA下，在DNApki化合物4存在和不存在下，插入/缺失(indels)百分比和HD3 TCR插入百分比。图10A显示TRAC编辑百分比。图10B显示CD3+Vβ7.2+ T细胞百分比。
具体实施方式
本文描述了DNA依赖性蛋白质激酶的小分子抑制剂(DNA-PKI)，其适用于在产生由Cas9裂解引起的双链断裂(DSB)后减少NHEJ介导的突变诱发事件或增加HDR的速率或机率。示例性DNA-PKI提供于例如WO 2018/114999；WO 2014/183850；WO 03/024949；Fok,J.H.L.等人,Nat,Commun,10,5065(2019)；Griffin,R.J.等人,J.Med.Chem.2005,48,569-585；Goldberg,F.W.等人,J.Med.Chem.2020,63,3461-3471；和美国专利第10,786,512号。
在一些实施方案中，DNAPK抑制剂(DNA-PKI)用于将包括核酸(例如CRISPR/Cas组分RNA和/或gRNA(“货物(cargo)”))的生物活性剂递送至细胞的组合物和方法中。
还提供了基因编辑方法和使用本文所描述的DNA-PKI和包含其的组合物制造工程化细胞的方法。
在一些实施方案中，本文提供的组合物和方法使得编辑效率大于约80％、大于约90％或大于约95％。在一些实施方案中，所述组合物和方法使得编辑效率为约80％-95％、约90％-95％、约80％-99％、约90％-99％或约95％-99％。
DNA PK抑制剂
本公开涉及DNA-PKI以及其组合物和使用方法。
在某些实施方案中，本公开涉及一种具有式I结构的化合物：
或其盐，
其中：
x1为C-R3或N；
R1为C1-C3烷基；
R2为环烷基或杂环基，并且环烷基和杂环基任选地被一个或多个R6取代；
R3为H或C1-C3烷基；
R4为H或C1-C3烷基；
R5为C1-C3烷基；
每个R6独立地选自羟基、卤基、烷基、烷氧基、环烷基、氨基和氰基，或两个R6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环；并且
R7为H或C1-C3烷基，
条件是以下中的至少一者适用：
(a)x1为C-R3；
(b)R1为C2-C3烷基；
(c)R4为C1-C3烷基；
(d)R2被一个R6取代，并且R6为卤基；
(e)R2被两个R6取代，所述两个R6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环；并且
(f)R2为任选地被一个或多个R6取代的C3-C5环烷基。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的化合物中的任一者，其中x1为C-R3。例如，R3可为H或甲基。在其他实施方案中，所述化合物涉及本文所描述的化合物中的任一者，其中x1为N。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的化合物中的任一者，其中R1为C2-C3烷基，例如，R1选自甲基和乙基，优选地，R1为甲基。
在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的化合物中的任一者，其中R4为C1-C3烷基，例如，R4为H或甲基，优选地，R4为H。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的化合物中的任一者，其中R2为环烷基，例如，R2为C3-C7环烷基，优选地，R2为环己基或C3-C5环烷基。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的化合物中的任一者，其中R2为杂环基，例如，R2为5元至7元杂环基，优选地R2为四氢吡喃基或四氢呋喃基。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的化合物中的任一者，其中R2任选地被一个或多个独立地选自羟基、卤基和环烷基的R6取代，或两个R6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环，例如，其中R2被一个或多个R6取代；并且每个R6为卤基或羟基，例如R2被一个R6取代，并且R6为卤基。在一些实施方案中，每个R6为氟。在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的化合物中的任一者，其中R2被两个R6取代，所述两个R6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环。在特定实施方案中，R2任选地被一个或多个独立地选自羟基、甲氧基和甲基的R6取代。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的化合物中的任一者，其中R5为甲基。
在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的化合物中的任一者，其中R7为H或甲基。
在优选实施方案中，本公开涉及选自以下的化合物：
或其盐。在特定实施方案中，所述化合物为或其盐。在特定实施方案中，所述化合物为或其盐。在特定实施方案中，所述化合物为或其盐。在特定实施方案中，所述化合物为或其盐。在特定实施方案中，所述化合物为或其盐。在特定实施方案中，所述化合物为
或其盐。
在特定实施方案中，所述化合物为
或其盐。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的化合物中的任一者，其中所述化合物为游离碱。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的化合物中的任一者，其中所述化合物为盐，例如三氟甲磺酸盐。
DNA-PKI组合物
本文描述了包含以下的DNA-PKI组合物：
a)DNA蛋白质激酶抑制剂(DNA-PKI)；
b)DNA切割剂；
c)任选地，细胞；和
d)任选地，供体DNA；
其中所述DNA-PKI是式I化合物
或其盐，
其中：
x1为C-R3或N；
R1为C1-C3烷基；
R2为环烷基或杂环基，并且环烷基和杂环基任选地被一个或多个R6取代；
R3为H或C1-C3烷基；
R4为H或C1-C3烷基；
R5为C1-C3烷基；
每个R6独立地选自羟基、卤基、烷基、烷氧基、环烷基、氨基和氰基，或两个R6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环；并且
R7为H或C1-C3烷基。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中x1为N。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中R1为甲基。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中R4为H。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中R2为环己基。在其他实施方案中，R2为四氢吡喃基。在另其他实施方案中，R2为四氢呋喃基。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中R2任选地被一个或多个独立地选自羟基、甲氧基和甲基的R6取代。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中R5为甲基。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中R7为H或甲基。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中DNA-PKI为本文所描述的化合物中的任一者。
在某些实施方案中，本公开涉及一种组合物，所述组合物包含
a)DNA蛋白质激酶抑制剂(DNA-PKI)；
b)DNA切割剂；
c)任选地，细胞；和
d)任选地，供体DNA；
其中所述DNA-PKI选自：
/>
/>
或其盐。
在特定实施方案中，所述组合物中的DNA-PKI为或其盐。
在特定实施方案中，所述组合物中的DNA-PKI为或其盐。
在特定实施方案中，所述组合物中的DNA-PKI为
或其盐。
在特定实施方案中，所述组合物中的DNA-PKI为
或其盐。
在特定实施方案中，所述组合物中的DNA-PKI为
或其盐。
在特定实施方案中，所述组合物中的DNA-PKI为
或其盐。
在特定实施方案中，所述组合物中的DNA-PKI为
或其盐。
在特定实施方案中，所述组合物中的DNA-PKI为
或其盐。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中所述组合物中的DNA-PKI的浓度为约1μM或更小，例如约0.25μM或更小，例如约0.1-1μM，优选地约0.1-0.5μM。
在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中所述组合物包含细胞，例如真核细胞，例如肝细胞或免疫细胞。在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中所述细胞适用于过继性细胞疗法(ACT)。ACT的实例包括自体和同种异体细胞疗法。在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中所述细胞为干细胞。在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中所述细胞为干细胞。在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中所述细胞为造血干细胞(HSC)或诱导多能干细胞(iPSC)。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中免疫细胞为白细胞或淋巴细胞，例如，免疫细胞为淋巴细胞，例如T细胞、B细胞或NK细胞，优选地淋巴细胞为T细胞。在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中T细胞为原代T细胞。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中T细胞为调控T细胞。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中淋巴细胞为活化T细胞或非活化T细胞。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中所述细胞为人类细胞。
在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中DNA切割剂包含CRISPR/Cas核酸酶组分和任选地引导RNA组分。在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其包含DNA切割剂或编码所述DNA切割剂的核酸，例如编码DNA切割剂的mRNA，其中所述DNA切割剂选自锌指核酸酶、TALE效应子域核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas核酸酶组分和其组合，优选地其中所述DNA切割剂为CRISPR/Cas核酸酶组分。在一些实施方案中，所述DNA切割剂为CRISPR/Cas核酸酶组分和引导RNA组分。在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中CRISPR/Cas核酸酶组分包含Cas核酸酶或编码所述Cas核酸酶的mRNA，例如，所述CRISPR/Cas核酸酶组分包含编码Cas核酸酶(例如第2类Cas核酸酶)的mRNA。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中所述Cas核酸酶为Cas9核酸酶，例如化脓性链球菌(S.pyogenes)Cas9核酸酶或脑膜炎双球菌(N.meningitidis)Cas9核酸酶。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中所述Cas核酸酶为Nme2Cas9。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中所述Cas核酸酶为Cas12a核酸酶。
在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其包含经修饰的RNA。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其包含引导RNA核酸，例如gRNA。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中所述引导RNA核酸为双引导RNA(dgRNA)或编码双引导RNA(dgRNA)。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中所述引导RNA核酸为单引导(sgRNA)或编码单引导(sgRNA)。在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中所述gRNA为经修饰的gRNA，例如其中所述经修饰的gRNA在5'端处包含前五个核苷酸中的一者或多者处的修饰或所述经修饰的gRNA在3'端处包含最后五个核苷酸中的一者或多者处的修饰。在一些实施方案中，所述gRNA与Cas核酸酶如Cas9核酸酶复合。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中所述组合物包含引导RNA核酸和第2类Cas核酸酶mRNA；并且所述mRNA与所述引导RNA核酸的比率按重量计为约2:1至1:4。
在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其包含DNA切割剂，其中所述DNA切割剂存在于脂质核酸组装组合物中。
在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其包含供体DNA。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中所述供体DNA(在本文中也称为“模板核酸”或“外源核酸”)包含编码蛋白质的序列、调控序列或编码结构RNA的序列。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中脂质核酸组装组合物为脂质纳米颗粒(LNP)组合物。在一些实施方案中，所述LNP组合物为本文所描述的LNP组合物中的任一者。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中LNP的直径为约10-200nm、约20-150nm、约50-150nm、约50-100nm、约50-120nm、约60-100nm、约75-150nm、约75-120nm或约75-100nm。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中所述组合物包含平均直径为约10-200nm、约20-150nm、约50-150nm、约50-100nm、约50-120nm、约60-100nm、约75-150nm、约75-120nm或约75-100nm的LNP群体。例如，平均直径可为Z平均直径。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中脂质核酸组装组合物为脂质复合物。
在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中脂质核酸组装组合物包含可离子化脂质，例如，本文所描述的可离子化脂质中的任一者。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中所述可离子化脂质的pKa为约5.1至约8.0，例如约5.5至约7.6或约5.1至7.4，例如约5.5至6.6、约5.6至6.4、约5.8至6.2、或约5.8至6.5。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，所述脂质核酸组装组合物包含辅助脂质。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中所述脂质核酸组装组合物包含中性脂质。
在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中所述脂质核酸组装组合物包含PEG脂质。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中所述脂质核酸组装组合物的N/P比为约3-10，例如约5-7，优选地约6。
在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其还包含载体，例如，其中所述载体编码DNA切割剂或供体DNA。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中所述载体为病毒载体。在其他实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中所述载体为非病毒载体。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中所述载体为慢病毒载体。在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中所述载体为逆转录病毒载体。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其中所述载体为AAV。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物中的任一者，其包含细胞，例如，其中所述细胞不为癌细胞。
DNA-PKI方法
在某些实施方案中，本公开涉及一种用于在细胞中进行靶向基因组编辑的方法，所述方法包括使所述细胞与DNA切割剂和DNA-PKI接触，其中所述DNA-PKI是式I化合物
或其盐，
其中：
x1为C-R3或N；
R1为C1-C3烷基；
R2为环烷基或杂环基，并且环烷基和杂环基任选地被一个或多个R6取代；
R3为H或C1-C3烷基；
R4为H或C1-C3烷基；
R5为C1-C3烷基；
每个R6独立地选自羟基、卤基、烷基、烷氧基、环烷基、氨基和氰基，或两个R6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环；并且
R7为H或C1-C3烷基。
在一些实施方案中，本公开涉及一种在细胞基因组中修复双链DNA断裂的方法，所述方法包括使所述细胞与DNA切割剂和DNA-PKI接触，其中所述DNA-PKI是式I化合物
或其盐，
其中：
x1为C-R3或N；
R1为C1-C3烷基；
R2为环烷基或杂环基，并且环烷基和杂环基任选地被一个或多个R6取代；
R3为H或C1-C3烷基；
R4为H或C1-C3烷基；
R5为C1-C3烷基；
每个R6独立地选自羟基、卤基、烷基、烷氧基、环烷基、氨基和氰基，或两个R6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环；并且
R7为H或C1-C3烷基。
在一些实施方案中，本公开涉及一种抑制或遏制经由非同源末端连接(NHEJ)途径修复细胞中的DNA断裂的方法，所述方法包括使所述细胞与DNA切割剂和DNA-PKI接触，其中所述DNA-PKI是式I化合物
或其盐，
其中：
x1为C-R3或N；
R1为C1-C3烷基；
R2为环烷基或杂环基，并且环烷基和杂环基任选地被一个或多个R6取代；
R3为H或C1-C3烷基；
R4为H或C1-C3烷基；
R5为C1-C3烷基；
每个R6独立地选自羟基、卤基、烷基、烷氧基、环烷基、氨基和氰基，或两个R6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环；并且
R7为H或C1-C3烷基。
在一些实施方案中，本公开涉及一种将供体DNA靶向插入至细胞基因组中的方法，所述方法包括使细胞与DNA切割剂、所述供体DNA和DNA-PKI接触，其中所述DNA-PKI是式I化合物
或其盐，
其中：
x1为C-R3或N；
R1为C1-C3烷基；
R2为环烷基或杂环基，并且环烷基和杂环基任选地被一个或多个R6取代；
R3为H或C1-C3烷基；
R4为H或C1-C3烷基；
R5为C1-C3烷基；
每个R6独立地选自羟基、卤基、烷基、烷氧基、环烷基、氨基和氰基，或两个R6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环；并且
R7为H或C1-C3烷基。
在一些实施方案中，本说明书涉及用于过继性细胞转移(ACT)疗法，例如用于免疫肿瘤学的方法。例如，在某些实施方案中，本文所描述的方法使得细胞在其基因组中的一个或多个特异性目标序列处经修饰，包括如通过引入靶向所述目标序列的包括gRNA分子的CRISPR系统所修饰。某些实施方案提供适用于以下的gRNA分子、CRISPR系统、细胞和方法：适用于免疫细胞(例如经工程化以缺乏内源性TCR表达的T细胞，例如适用于进一步工程化以插入所关注核酸的T细胞，例如经进一步工程化以表达TCR(例如转基因TCR(tgTCR))的T细胞)的基因组编辑并且适用于ACT疗法；和用于B细胞(例如经工程化以缺乏内源性B细胞受体(BCR)表达的B细胞，例如适用于进一步工程化以插入所关注核酸的B细胞，例如经进一步工程化以表达BCR(例如转基因BCR(tgBCR))的B细胞)的基因组编辑或用于抗体表达并且适用于ACT疗法。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的基因编辑的任何方法，所述方法包括向动物，例如人类施用LNP组合物。在某些实施方案中，所述方法包括向细胞，例如真核细胞，并且特别是人类细胞施用LNP组合物。在一些实施方案中，所述细胞为适用于疗法(例如过继性细胞疗法(ACT))的细胞类型。ACT的实例包括自体和同种异体细胞疗法。在一些实施方案中，所述细胞为干细胞，例如造血干细胞、诱导多能干细胞、或另一种多能(multipotent/pluripotent)细胞。在一些实施方案中，所述细胞为干细胞，例如可发育成骨骼、软骨、肌肉或脂肪细胞的间充质干细胞。在一些实施方案中，干细胞包含眼部干细胞。在某些实施方案中，所述细胞选自间充质干细胞、造血干细胞(HSC)、单核细胞、内皮祖细胞(EPC)、神经干细胞(NSC)、角膜缘干细胞(LSC)、组织特异性原代细胞或由其衍生的细胞(TSC)、诱导多能干细胞(iPSC)、眼部干细胞、多能干细胞(PSC)、胚胎干细胞(ESC)和用于器官或组织移植的细胞。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其包括在不含DNA-PKI的细胞培养基中生长细胞以及添加DNA-PKI至细胞培养基。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其包括在使细胞与DNA-PKI接触之前使细胞与DNA切割剂接触，例如，在使细胞与DNA切割剂接触的约六小时内，优选地，在使细胞与DNA切割剂接触的约三小时内。
在其他实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其包括使细胞与DNA切割剂同时与DNA-PKI接触。
在另其他实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其包括在使细胞与DNA-PKI接触之后(例如在使细胞与DNA-PKI接触的约三小时内)使细胞与DNA切割剂接触。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其包括使细胞在包含DNA-PKI的细胞培养基中生长。
在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中使细胞与DNA切割剂和DNA-PKI接触至少约一天，例如持续约一天至一周，优选地持续约五天。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中x1为N。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中R1为甲基。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中R4为H。
在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中R2为环己基、四氢吡喃基或四氢呋喃基。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中R2任选地被一个或多个独立地选自羟基、甲氧基和甲基的R6取代。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中R5为甲基。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中R7为H或甲基。
在优选实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中DNA-PKI为本文所描述的化合物中的任一者。
在某些实施方案中，本公开涉及一种用于在细胞中进行靶向基因组编辑的方法，所述方法包括使所述细胞与DNA切割剂和DNA-PKI接触，其中所述DNA-PKI选自：
/>
/>
或其盐。
在某些实施方案中，本公开涉及一种在细胞基因组中修复双链DNA断裂的方法，所述方法包括使所述细胞与DNA切割剂和DNA-PKI接触，其中所述DNA-PKI选自：
/>
或其盐。
在某些实施方案中，本公开涉及一种抑制或遏制经由非同源末端连接(NHEJ)途径修复细胞中的DNA断裂的方法，所述方法包括使所述细胞与DNA切割剂和DNA-PKI接触，其中所述DNA-PKI选自：
/>
或其盐。
在某些实施方案中，本公开涉及一种将供体DNA靶向插入至细胞基因组中的方法，所述方法包括使所述细胞与DNA切割剂、供体DNA和DNA-PKI接触，其中所述DNA-PKI选自：
/>
/>
或其盐。
在特定实施方案中，用于所述方法中的DNA-PKI为
或其盐。
在特定实施方案中，用于所述方法中的DNA-PKI为
或其盐。
在特定实施方案中，用于所述方法中的DNA-PKI为
或其盐。
在特定实施方案中，用于所述方法中的DNA-PKI为或其盐。/>
在特定实施方案中，用于所述方法中的DNA-PKI为或其盐。
在特定实施方案中，用于所述方法中的DNA-PKI为或其盐。
在特定实施方案中，用于所述方法中的DNA-PKI为或其盐。
在特定实施方案中，用于所述方法中的DNA-PKI为或其盐。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中使所述细胞与细胞培养基中的DNA-PKI接触，其中所述细胞培养基中的DNA-PKI的浓度为约1μM或更小，例如约0.25μM或更小，例如约0.1-1μM，优选地约0.1-0.5μM。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中所述细胞为真核细胞。
在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中所述组合物包含细胞，例如真核细胞，例如肝细胞或免疫细胞。在某些实施方案中，所述细胞适用于过继性细胞疗法(ACT)。ACT的实例包括自体和同种异体细胞疗法。在某些实施方案中，所述细胞为干细胞。在某些实施方案中，干细胞为造血干细胞(HSC)。在某些实施方案中，所述细胞为诱导多能干细胞(iPSC)。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中免疫细胞为白细胞或淋巴细胞，例如，免疫细胞为淋巴细胞，例如T细胞、B细胞或NK细胞，优选地淋巴细胞为T细胞。在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中T细胞为原代T细胞。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中T细胞为调控T细胞。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中淋巴细胞为活化T细胞或非活化T细胞。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中所述细胞为人类细胞。
在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其包括DNA切割剂，例如，其中所述DNA切割剂选自锌指核酸酶、TALE效应子域核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas核酸酶组分和其组合，优选地其中所述DNA切割剂为CRISPR/Cas核酸酶组分。
在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中所述CRISPR/Cas核酸酶组分包含Cas核酸酶或编码Cas核酸酶的mRNA，例如，所述CRISPR/Cas核酸酶组分包含编码Cas核酸酶(例如第2类Cas核酸酶)的mRNA。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中所述Cas核酸酶为Cas9核酸酶，例如化脓性链球菌Cas9核酸酶或脑膜炎双球菌Cas9核酸酶。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中所述Cas核酸酶为Nme2Cas9。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中所述Cas核酸酶为Cas12a核酸酶。
在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其包括经修饰的RNA。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其包含引导RNA核酸，例如gRNA。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中所述引导RNA核酸为双引导RNA(dgRNA)或编码双引导RNA(dgRNA)。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中所述引导RNA核酸为单引导(sgRNA)或编码单引导(sgRNA)。在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中所述gRNA为经修饰的gRNA，例如其中所述经修饰的gRNA在5'端处包含前五个核苷酸中的一者或多者处的修饰或所述经修饰的gRNA在3'端处包含最后五个核苷酸中的一者或多者处的修饰。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中所述组合物包含引导RNA核酸和第2类Cas核酸酶mRNA；并且所述mRNA与所述引导RNA核酸的比率按重量计为约2:1至1:4。在一些实施方案中，所述组合物包含第2类Cas核酸酶和引导RNA复合物。
在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其包含DNA切割剂，其中所述DNA切割剂存在于脂质核酸组装组合物中。
在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其包含供体DNA。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中所述供体DNA包含编码蛋白质的序列、调控序列或编码结构RNA的序列。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中模板序列经由同源定向修复(HDR)整合至细胞基因组中。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其包括使所述细胞与包含DNA切割剂的脂质核酸组装组合物接触。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中脂质核酸组装组合物为脂质纳米颗粒(LNP)组合物。在一些实施方案中，所述LNP组合物为本文所描述的LNP组合物中的任一者。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的组合物和方法中的任一者，其中LNP的直径为约10-200nm、约20-150nm、约50-150nm、约50-100nm、约50-120nm、约60-100nm、约75-150nm、约75-120nm或约75-100nm。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中所述组合物包含平均直径为约10-200nm、约20-150nm、约50-150nm、约50-100nm、约50-120nm、约60-100nm、约75-150nm、约75-120nm或约75-100nm的LNP群体。例如，平均直径可为Z平均直径。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中脂质核酸组装组合物为脂质复合物。
在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中脂质核酸组装组合物包含可离子化脂质，例如本文所描述的可离子化脂质中的任一者。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中可离子化脂质的pKa为约5.1至7.4，例如约5.5至6.6、约5.6至6.4、约5.8至6.2或约5.8至6.5。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，脂质核酸组装组合物包含辅助脂质。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中脂质核酸组装组合物包含中性脂质。
在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中脂质核酸组装组合物包含PEG脂质。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中脂质核酸组装组合物的N/P比为约3-10，例如约5-7，优选地约6。
在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其还包含载体，例如其中所述载体编码DNA切割剂或供体DNA。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中所述载体为病毒载体。在其他实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中所述载体为非病毒载体。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中所述载体为慢病毒载体。在一些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中所述载体为逆转录病毒载体。在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中所述载体为AAV。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中所述细胞不为癌细胞。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中DNA切割剂与细胞基因组内的目标序列相互作用，从而引起双链DNA断裂(DSB)。
在一些优选实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中所述方法引起基因敲除。
在一些优选实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中所述方法引起基因校正。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的基因编辑的任何方法，其中所述基因编辑引起插入。在一些实施方案中，所述插入为基因插入。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的方法中的任一者，其中供体DNA包含模板，所述模板包含编码蛋白质的外源核酸。在某些实施方案中，所述蛋白质选自细胞因子、免疫抑制剂、抗体、受体和酶。在某些实施方案中，所述蛋白质为受体。在某些实施方案中，所述受体选自免疫受体、T细胞受体(TCR)和嵌合抗原受体。在某些实施方案中，所述受体为免疫受体。在某些实施方案中，所述受体为TCR。在某些实施方案中，所述外源核酸编码TCR的TCRα链和/或TCRβ链。在某些实施方案中，所述受体为嵌合抗原受体。
在某些实施方案中，本公开涉及本文所描述的基因编辑的任何方法，其中所述DNA切割剂与细胞基因组内的目标序列相互作用，从而引起双链DNA断裂(DSB)。在某些实施方案中，所述DNA切割剂与T细胞的TRAC基因内的目标序列相互作用。在某些实施方案中，所述模板被整合至T细胞的TRAC基因中。在某些实施方案中，所述模板包含分别与位于裂解位点上游和下游的序列互补的第一同源臂和第二同源臂。
所述DNA切割剂，例如蛋白质、RNA或编码其的核酸，可通过电穿孔、基于脂质的递送，例如经由脂质核酸组装体(例如脂质纳米颗粒)或本领域中已知的其他递送技术递送至细胞。
可离子化脂质
在一些实施方案中，提供了方法和组合物，其中核酸组装体包含DNA切割剂并且用于将DNA切割剂递送至细胞。适用于本文所述的脂质核酸组装体的可离子化脂质和其他“可生物降解脂质”为可体内或离体生物降解的。所述可离子化脂质具有低毒性(例如，以大于或等于10mg/kg的量在动物模型中耐受而不具有不良作用)。适用于本文所述的脂质核酸组装体的可生物降解脂质包括例如WO/2020/219876、WO/2020/118041、WO/2020/072605、WO/2019/067992、WO/2017/173054、WO2015/095340和WO2014/136086的可生物降解脂质，所述文献各自通过引用整体并入本文，并且特定而言所述可离子化脂质和各自的组合物通过引用并入本文。
在一些实施方案中，脂质核酸组装组合物包含可离子化脂质，例如脂质A或其等效物，包括脂质A的缩醛类似物。
在一些实施方案中，所述可离子化脂质为脂质A，其为十八-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，也称为(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯。脂质A可描绘为：
可根据WO2015/095340(例如第84页-第86页)合成脂质A。
在一些实施方案中，所述可离子化脂质为脂质D，其为8-((7,7-双(辛氧基)庚基)(2-羟乙基)氨基)辛酸壬酯。脂质D可描绘为：
脂质D可根据WO2020/072605合成。
本公开的可离子化脂质可根据其所处的介质的pH来形成盐。例如，在弱酸性介质中，可离子化脂质可经质子化并且因此带有正电荷。相反地，在弱碱性介质中，例如，其中pH为大约7.35的血液中，所述可离子化脂质可不经质子化并且因此不带电荷。在一些实施方案中，本公开的可离子化脂质可在至少约9的pH下被主要质子化。在一些实施方案中，本公开的可离子化脂质可在至少约10的pH下被主要质子化。
可离子化脂质被主要质子化的pH与其内在pKa相关。在一些实施方案中，本公开的可离子化脂质的盐的pKa在约5.1至约8.0、甚至更优选在约5.5至约7.6的范围内。在一些实施方案中，本公开的可离子化脂质的盐的pKa在约5.7至约8、约5.7至约7.6、约6至约8、约6至约7.5、约6至约7或约6至约6.5的范围内。在一些实施方案中，本公开的可离子化脂质的盐的pKa为约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4或约6.6。或者，本公开的可离子化脂质的盐的pKa在约6至约8的范围内。pKa可为配制LNP的重要考虑因素，因为已发现pKa在约5.5至约7.0范围内的某些脂质所配制的LNP对体内递送货物至例如肝脏为有效的。此外，已发现，pKa在约5.3至约6.4范围内的某些脂质所配制的LNP对体内递送至例如肿瘤为有效的。参见例如WO 2014/136086。在一些实施方案中，可离子化脂质在酸性pH下带正电但在血液中为中性的。
额外脂质
适用于本公开的脂质组合物中的“中性脂质”包括例如多种中性、不带电荷或两性离子型脂质。适用于本公开中的中性磷脂的实例包括(但不限于)二软脂酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、磷酸胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、磷脂酰胆碱(PLPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DAPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、1-肉豆蔻酰基-2-软脂酰基磷脂酰胆碱(MPPC)、1-软脂酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(PMPC)、1-软脂酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱(PSPC)、1,2-二花生酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DBPC)、1-硬脂酰基-2-软脂酰基磷脂酰胆碱(SPPC)、1,2-二十碳烯酰基(dieicosenoyl)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DEPC)、软脂酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、溶血磷脂酰基胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二亚油酰基磷脂酰胆碱二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二软脂酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、软脂酰油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、溶血磷脂酰乙醇胺和其组合。在某些实施方案中，中性磷脂可选自二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)和二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)，优选二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)。
“辅助脂质”包括类固醇、固醇和烷基间苯二酚。适用于本公开中的辅助脂质包括但不限于胆固醇、5-十七基间苯二酚和胆固醇半丁二酸酯。在某些实施方案中，辅助脂质可为胆固醇或其衍生物，例如胆固醇半丁二酸酯。
在一些实施方案中，LNP组合物包括聚合物脂质，例如PEG脂质，其可影响纳米颗粒可体内或离体(例如在血液或培养基中)存在的时长。PEG脂质可通过例如减少颗粒聚集并且控制粒度来辅助配制方法。本文中所用的PEG脂质可调节LNP组合物的药物动力学特性。通常，PEG脂质包含脂质部分和基于PEG(有时称为聚(环氧乙烷))的聚合物部分(PEG部分)。适用于本公开脂质组合物的PEG脂质和关于此类脂质的生物化学的信息可见于Romberg等人,Pharmaceutical Research 25(1),2008,第55页-第71页和Hoekstra等人,Biochimicaet Biophysica Acta 1660(2004)41-52。额外适合的PEG脂质公开于例如WO 2015/095340(第31页第14行至第37页第6行)、WO 2006/007712和WO 2011/076807(“隐形脂质”)中，所述文献通过引用并入。
在一些实施方案中，脂质部分可源自二酰基甘油或二酰基甘油酰胺、包括包含具有独立地包含约C4至约C40饱和或不饱和碳原子的烷基链长度的二烷基甘油或二烷基甘油酰胺基团的那些，其中所述链可包含一个或多个官能团，例如酰胺或酯。在一些实施方案中，烷基链长度包含约C10至C20。二烷基甘油或二烷基甘油酰胺基团还可包含一个或多个被取代的烷基。链长可为对称或不对称的。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“PEG”意指任何聚乙二醇或其他聚亚烷基醚聚合物，例如乙二醇或环氧乙烷的任选地被取代的直链或支链聚合物。在某些实施方案中，PEG部分未被取代。或者，PEG部分可被例如一个或多个烷基、烷氧基、酰基、羟基或芳基取代。例如，PEG部分可包含PEG共聚物，例如PEG-聚氨基甲酸酯或PEG-聚丙烯(参见例如J.Milton Harris,Poly(ethylene glycol)chemistry:biotechnical and biomedicalapplications(1992))；或者，PEG部分可为PEG均聚物。在某些实施方案中，PEG部分的分子量为约130至约50,000，例如约150至约30,000，或甚至约150至约20,000。类似地，PEG部分的分子量可为约150至约15,000、约150至约10,000、约150至约6,000，或甚至约150至约5,000。在某些优选实施方案中，PEG部分的分子量为约150至约4,000、约150至约3,000、约300至约3,000、约1,000至约3,000、或约1,500至约2,500。
在某些优选实施方案中，PEG部分为“PEG-2K”，也称为“PEG 2000”，其平均分子量为约2,000道尔顿。PEG-2K在本文中由以下式(III)表示：其中n为约45，意指所述数目平均化聚合度包含约45个亚基。然而，还可使用本领域中已知的其他PEG实施方案，包括例如其中数目平均化聚合度包含约23个亚基(n＝23)和/或68个亚基(n＝68)的那些。在一些实施方案中，n可在约30至约60范围内。在一些实施方案中，n可在约35至约55范围内。在一些实施方案中，n可在约40至约50范围内。在一些实施方案中，n可在约42至约48范围内。在一些实施方案中，n可为45。在一些实施方案中，R可选自H、被取代的烷基和未被取代的烷基。在一些实施方案中，R可为未被取代的烷基，例如甲基。
在本文所描述的任何实施方案中，PEG脂质可选自PEG-二月桂酰基甘油、PEG-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG)(目录号GM-020，来自日本东京(Tokyo,Japan)的NOF)、PEG-二棕榈酰基甘油、PEG-二硬脂酰基甘油(PEG-DSPE)(目录号DSPE-020CN，来自日本东京的NOF)、PEG-二月桂基甘油酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘油酰胺、PEG-二棕榈酰基甘油酰胺和PEG-二硬脂酰基甘油酰胺、PEG-胆固醇(1-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3',6'-二氧杂辛基]氨甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-二-十四氧基苯甲基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DMPE)、或1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(PEG2k-DMG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DSPE)(目录号880120C，来自美国亚拉巴马州阿拉巴斯特(Alabaster,Alabama,USA)的Avanti PolarLipids)、1,2-二硬脂酰基-sn-丙三醇、甲氧基聚乙二醇(PEG2k-DSG；GS-020，日本东京的NOF)、聚(乙二醇)-2000-二甲基丙烯酸酯(PEG2k-DMA)和1,2-二硬脂酰氧基丙基-3-胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DSA)。在某些此类实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-DMG。在一些实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-DSG。在其他实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-DSPE。在一些实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-DMA。在另外其他实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-C-DMA。在某些实施方案中，PEG脂质可为化合物S027，其公开于WO2016/010840(第[00240]段至第[00244]段)中。在一些实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-DSA。在其他实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-C11。在一些实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-C14。在一些实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-C16。在一些实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-C18。
在优选实施方案中，PEG脂质包括甘油基团。在优选实施方案中，PEG脂质包括二肉豆蔻酰基甘油(DMG)基团。在优选实施方案中，PEG脂质包含PEG-2k。在优选实施方案中，PEG脂质为PEG-DMG。在优选实施方案中，PEG脂质为PEG-2k-DMG。在优选实施方案中，PEG脂质为1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000。在优选实施方案中，PEG-2k-DMG为1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000。
在一些实施方案中，提供了方法和组合物，其中核酸组装体包含阳离子脂质组合物和DNA切割剂并且用于将DNA切割剂递送至细胞。适用于本文所描述的脂质组合物的阳离子脂质包括但不限于N,N-二油烯基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTAP)、1,2-二油酰基-3-二甲铵-丙烷(DODAP)、N-(1-(2,3-二油烯基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、1,2-二油酰基氨甲酰基-3-二甲铵-丙烷(DOCDAP)、1,2-二亚油酰基-3-二甲铵-丙烷(DLINDAP)、二月桂基(C12:0)三甲铵丙烷(DLTAP)、二(十八烷基)酰氨基甘氨酰基精胺(DOGS)、DC-Choi、二油酰氧基-N-[2-(精胺甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸盐(DOSPA)、1,2-二肉豆蔻氧基丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DMRIE)、3-二甲氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁-4-氧基)-1-(顺式,顺式-9,12-十八碳二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、N,N-二甲基-2,3-二油烯基氧基)丙胺(DODMA)、2-[5'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)-3'-氧杂戊烯氧基)-3-二甲基-1-(顺式,顺式-9',1-2'-十八碳二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油烯基氧基苯甲胺(DMOBA)和1,2-N,N'-二油烯基氨甲酰基-3-二甲基氨基丙烷(DOcarbDAP)。在一些实施方案中，阳离子脂质为DOTAP或DLTAP。
在其他实施方案中，提供了方法和组合物，其中核酸组装体包含阴离子脂质组合物和DNA切割剂并且用于将DNA切割剂递送至细胞。适用于本文所描述的组合物中的阴离子脂质包括(但不限于)磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二酰基磷脂酰乙醇胺、N-丁二酰基磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰基磷脂酰乙醇胺胆固醇半丁二酸酯(CHEMS)和赖氨酰基磷脂酰甘油。
脂质组合物
本文描述了包含至少一种可离子化、阳离子或阴离子脂质(例如可离子化脂质)或其盐(例如其药学上可接受的盐)、任选地至少一种辅助脂质、至少一种中性脂质和至少一种聚合物脂质的脂质组合物。在一些实施方案中，脂质组合物包含可离子化脂质或其盐、中性脂质、辅助脂质和PEG脂质。在一些实施方案中，中性脂质为DSPC或DPME。在一些实施方案中，辅助脂质为胆固醇、5-十七基间苯二酚或胆固醇半丁二酸酯。
在优选实施方案中，可离子化脂质为
在优选实施方案中，中性脂质为DSPC。在优选实施方案中，辅助脂质为胆固醇。在优选实施方案中，PEG脂质为1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000。在特别优选的实施方案中，可离子化脂质为
中性脂质为DSPC，辅助脂质为胆固醇，并且PEG脂质为1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000。
在优选实施方案中，可离子化脂质为在优选实施方案中，中性脂质为DSPC。在优选实施方案中，辅助脂质为胆固醇。在优选实施方案中，PEG脂质为1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000。
在特别优选的实施方案中，可离子化脂质为中性脂质为DSPC，辅助脂质为胆固醇，并且PEG脂质为1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000。
在一些实施方案中，脂质组合物还包含一种或多种额外脂质组分。在一些实施方案中，脂质组合物还包含至少一种阳离子脂质和/或至少一种阴离子脂质。在其他实施方案中，脂质组合物还包含阳离子脂质，任选地具有一种或多种其他脂质组分。在其他实施方案中，脂质组合物还包含阴离子脂质，任选地具有一种或多种其他脂质组分。
在一些实施方案中，脂质组合物呈脂质体形式。在优选实施方案中，脂质组合物呈脂质纳米颗粒(LNP)组合物形式。“脂质纳米颗粒”或“LNP”是指(不限于以下含义)包含多种(即超过一种)通过分子间力彼此以物理方式缔合的LNP组分的颗粒。在某些实施方案中，脂质组合物适用于体内递送。在某些实施方案中，脂质组合物适用于递送至器官，例如肝脏。在某些实施方案中，脂质组合物适用于离体递送至组织。在某些实施方案中，脂质组合物适用于体外递送至细胞。
脂质组合物可呈各种形式，包括(但不限于)颗粒形成递送剂，包括微粒、纳米颗粒，和适用于递送各种分子至细胞的转染剂。特定组合物在转染或递送生物活性剂方面有效。优选的生物活性剂为RNA和DNA。在其他实施方案中，生物活性剂选自mRNA、gRNA和DNA。gRNA可为dgRNA或sgRNA。在某些实施方案中，货物包括编码经RNA引导的DNA切割剂(例如Cas核酸酶、第2类Cas核酸酶或Cas9)的mRNA、gRNA或编码gRNA的核酸、或mRNA和gRNA的组合。
所述化合物或组合物将通常(但未必)包括一种或多种药学上可接受的赋形剂。术语“赋形剂”包括除本公开的化合物、其他脂质组分和生物活性剂以外的任何成分。赋形剂可赋予组合物功能(例如药物释放速率控制)和/或非功能(例如加工助剂或稀释剂)特征。赋形剂的选择在很大程度上将取决于例如特定施用模式、赋形剂对溶解性和稳定性的影响以及剂型性质的因素。
非经肠制剂通常为水性或油性溶液或悬浮液。当制剂为水性时，赋形剂如糖(包括但不限于葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇等)、盐、碳水化合物和缓冲剂(优选为3至9的pH)，但对于一些应用，其可更适当地配制为无菌非水性溶液或干燥形式以与适合的媒介物如无菌、无热原质水(WFI)结合使用。
LNP组合物
脂质组合物可以LNP组合物的形式提供，并且本文所述的LNP组合物可以脂质组合物的形式提供。脂质纳米颗粒可例如为微球体(包括单层和多层囊泡，例如“脂质体”，在一些实施方案中为基本上球形的层状相脂质双层，并且在更特定实施方案中可包含水性核心，例如包含大部分RNA分子)、乳液中的分散相、胶束或悬浮液中的内相。
本文描述了包含至少一种可离子化脂质或其盐(例如其药学上可接受的盐)、至少一种辅助脂质、至少一种中性脂质和至少一种聚合物脂质的LNP组合物。在一些实施方案中，LNP组合物包含至少一种可离子化脂质或其药学上可接受的盐、至少一种中性脂质、至少一种辅助脂质和至少一种PEG脂质。在一些实施方案中，中性脂质为DSPC或DPME。在一些实施方案中，辅助脂质为胆固醇、5-十七基间苯二酚或胆固醇半丁二酸酯。
在优选实施方案中，可离子化脂质为
在优选实施方案中，中性脂质为DSPC。在优选实施方案中，辅助脂质为胆固醇。在优选实施方案中，PEG脂质为1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000。在特别优选的实施方案中，可离子化脂质为
中性脂质为DSPC，辅助脂质为胆固醇，并且PEG脂质为1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000。
在优选实施方案中，可离子化脂质为
在优选实施方案中，中性脂质为DSPC。在优选实施方案中，辅助脂质为胆固醇。在优选实施方案中，PEG脂质为1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000。
在特别优选的实施方案中，可离子化脂质为中性脂质为DSPC，辅助脂质为胆固醇，并且PEG脂质为1,2-二肉豆蔻酰基-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000。
本公开的实施方案提供根据组合物中脂质组分的相应摩尔比描述的脂质组合物。在某些实施方案中，可离子化脂质的量为约25mol％至约60mol％；中性脂质的量为约5mol％至约30mol％；辅助脂质的量为约20mol％至约65mol％；并且PEG脂质的量为约0.5mol％至约10mol％。所有mol％数目均以脂质组合物或更特定而言LNP组合物的脂质组分的分数形式给出。在一些实施方案中，脂质相对于脂质组分的脂质mol％将为指定、标称或实际mol％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在一些实施方案中，脂质相对于脂质组分的脂质mol％将为脂质组分的指定、标称或实际mol％的±4mol％、±3mol％、±2mol％、±1.5mol％、±1mol％、±0.5mol％、±0.25mol％或±0.05mol％。在某些实施方案中，脂质mol％将相对于脂质的指定、标称或实际mol％变化小于15％、小于10％、小于5％、小于1％或小于0.5％。在一些实施方案中，mol％数字是以标称浓度计。如本文所用，“标称浓度”是指按经组合以形成所得组合物的物质的输入量计的浓度。例如，如果添加100mg溶质至1L水中，则标称浓度为100mg/L。在一些实施方案中，mol％数字是基于实际浓度，例如通过分析方法测定的浓度。在一些实施方案中，脂质组分中的脂质的实际浓度可例如从色谱法(例如液相色谱法)，接着是检测方法(例如带电气溶胶检测)测定。在一些实施方案中，脂质组分中的脂质的实际浓度可通过脂质分析、AF4-MALS、NTA和/或冷冻电镜技术(cryo-EM)表征。所有mol％数字都以LNP组合物的脂质组分中的脂质的百分比形式给出。
在一些实施方案中，水性组分包含DNA切割剂。在一些实施方案中，水性组分包含任选地与核酸组合的多肽DNA切割剂。在一些实施方案中，水性组分包含核酸DNA切割剂，例如编码核酸酶或切口酶的RNA。在一些实施方案中，水性组分为核酸组分。在一些实施方案中，核酸组分包含DNA并且其可称为DNA组分。在一些实施方案中，核酸组分包含RNA。在一些实施方案中，例如RNA组分的水性组分可包含mRNA，例如编码经RNA引导的DNA切割剂的mRNA。在一些实施方案中，经RNA引导的DNA切割剂为Cas核酸酶。在某些实施方案中，水性组分可包含编码Cas核酸酶，例如Cas9的mRNA。在某些实施方案中，DNA切割剂为Cas核酸酶mRNA。在某些实施方案中，DNA切割剂为第2类Cas核酸酶mRNA。在某些实施方案中，DNA切割剂为Cas9核酸酶mRNA。在某些实施方案中，水性组分可包含经修饰的RNA。在一些实施方案中，水性组分可包含引导RNA核酸。在某些实施方案中，水性组分可包含gRNA。在某些实施方案中，水性组分可包含dgRNA。在某些实施方案中，水性组分可包含经修饰的gRNA。在包含编码经RNA引导的DNA切割剂的mRNA的一些组合物中，所述组合物还包含gRNA核酸，例如gRNA。在一些实施方案中，水性组分包含经RNA引导的DNA切割剂和gRNA。在一些实施方案中，水性组分包含Cas核酸酶mRNA和gRNA。在一些实施方案中，水性组分包含第2类Cas核酸酶mRNA和gRNA。
在某些实施方案中，脂质组合物，例如LNP组合物，可包含编码Cas核酸酶(例如第2类Cas核酸酶)的mRNA、可离子化脂质或其药学上可接受的盐、辅助脂质、任选地中性脂质和PEG脂质。在某些包含编码Cas核酸酶(例如第2类Cas核酸酶)的mRNA的组合物中，辅助脂质为胆固醇。在其他包含编码Cas核酸酶(例如第2类Cas核酸酶)的mRNA的组合物中，中性脂质为DSPC。在包含编码Cas核酸酶(例如第2类Cas核酸酶，例如Cas9)的mRNA的额外实施方案中，PEG脂质为PEG2k-DMG。在特定组合物中，包含编码Cas核酸酶(例如第2类Cas核酸酶)的mRNA，和可离子化脂质或其药学上可接受的盐。在某些组合物中，组合物还包含gRNA，例如dgRNA或sgRNA。
在一些实施方案中，脂质组合物，例如LNP组合物，可包含gRNA。在某些实施方案中，组合物可包含可离子化脂质或其药学上可接受的盐、gRNA、辅助脂质、任选地中性脂质和PEG脂质。在某些包含gRNA的LNP组合物中，辅助脂质为胆固醇。在一些包含gRNA的组合物中，中性脂质为DSPC。在包含gRNA的额外实施方案中，PEG脂质为PEG2k-DMG。在某些组合物中，gRNA选自dgRNA和sgRNA。
在某些实施方案中，脂质组合物，例如LNP组合物，包含编码经RNA引导的DNA切割剂的mRNA和可为sgRNA的gRNA，其呈水性组分形式；和可离子化脂质，其呈脂质组分形式。例如，LNP组合物可包含可离子化脂质或其药学上可接受的盐、编码Cas核酸酶的mRNA、gRNA、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质。在某些包含编码Cas核酸酶的mRNA和gRNA的组合物中，辅助脂质为胆固醇。在一些包含编码Cas核酸酶的mRNA和gRNA的组合物中，中性脂质为DSPC。在包含编码Cas核酸酶的mRNA和gRNA的额外实施方案中，PEG脂质为PEG2k-DMG。
在某些实施方案中，脂质组合物，例如LNP组合物包括经RNA引导的DNA切割剂，例如第2类Cas mRNA和至少一个gRNA。在一些实施方案中，gRNA为sgRNA。在一些实施方案中，经RNA引导的DNA切割剂为Cas9 mRNA。在某些实施方案中，LNP组合物包括约1:1或约1:2的gRNA与经RNA引导的DNA切割剂mRNA(例如第2类Cas核酸酶mRNA)的比率。在一些实施方案中，重量比为约25:1至约1:25、约10:1至约1:10、约8:1至约1:8、约4:1至约1:4、约2:1至约1:2、约2:1至1:4(按重量计)、或约1:1至约1:2。
本文公开的组合物和方法可包括模板核酸，例如DNA模板。模板核酸可与包含可离子化脂质或其药学上可接受的盐的脂质组合物(包括作为LNP组合物)同时或分开递送。在一些实施方案中，模板核酸可为单链或双链的，其取决于所需修复机制。模板可具有与目标DNA(例如在目标DNA序列内)和/或与目标DNA相邻的序列同源的区域。
在一些实施方案中，LNP组合物是通过混合RNA水溶液与有机溶剂基脂质溶液而形成。适合的溶液或溶剂包括或可含有：水、PBS、Tris缓冲液、NaCl、柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、乙醇、氯仿、二乙醚、环己烷、四氢呋喃、甲醇、异丙醇。例如，有机溶剂可为100％乙醇。可将药学上可接受的缓冲液用于例如LNP组合物的体内施用。在某些实施方案中，缓冲液用于将包含LNP的组合物的pH维持处于或高于pH 6.5。在某些实施方案中，缓冲液用于将包含LNP的组合物的pH维持处于或高于pH 7.0。在某些实施方案中，组合物的pH在约7.2至约7.7范围内。在额外实施方案中，组合物的pH在约7.3至约7.7范围内或约7.4至约7.6范围内。组合物的pH可用微型pH探针进行测量。在某些实施方案中，组合物中包括低温保护剂。低温保护剂的非限制性实例包括蔗糖、海藻糖、甘油、DMSO和乙二醇。示例性组合物可包括至多10％低温保护剂，例如蔗糖。在某些实施方案中，组合物可包含tris盐水蔗糖(TSS)。在某些实施方案中，组合物为LNP组合物，其可包括约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％低温保护剂。在某些实施方案中，组合物为LNP组合物，其可包括约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％蔗糖。在一些实施方案中，组合物包括缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液可包含磷酸盐缓冲液(PBS)、Tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和其混合物。在某些示例性实施方案中，缓冲液包含NaCl。在某些实施方案中，缓冲液缺乏NaCl。NaCl的示例性量可在约20mM至约45mM范围内。NaCl的示例性量可在约40mM至约50mM范围内。在一些实施方案中，NaCl的量为约45mM。在一些实施方案中，缓冲液为Tris缓冲液。Tris的示例性量可在约20mM至约60mM范围内。Tris的示例性量可在约40mM至约60mM范围内。在一些实施方案中，Tris的量为约50mM。在一些实施方案中，缓冲液包含NaCl和Tris。组合物的某些示例性实施方案含有5％蔗糖和含45mM NaCl的Tris缓冲液。在其他示例性实施方案中，组合物含有呈约5％w/v的量的蔗糖、约45mM NaCl和pH 7.5下的约50mM Tris。盐、缓冲液和低温保护剂量可有所变化以使总组合物的渗透重量摩尔浓度得以维持。例如，最终渗透重量摩尔浓度可维持低于450mOsm/L。在其他实施方案中，渗透重量摩尔浓度在350与250mOsm/L之间。某些实施方案具有300+/-20mOsm/L或310+/-40mOsm/L的最终渗透重量摩尔浓度。
在一些实施方案中，使用微流体混合、T混合或交叉混合RNA水溶液和脂质溶液于有机溶剂中以制备LNP组合物。在某些方面，流动速率、接头大小、接头几何结构、接头形状、管径、溶液和/或RNA和脂质浓度可有所变化。LNP或LNP组合物可例如经由渗析、离心过滤器、切向流过滤或色谱法得到浓缩或纯化。LNP组合物可以例如悬浮液、乳液或冻干粉形式储存。在一些实施方案中，LNP组合物储存于2-8℃下，在某些方面，LNP组合物储存于室温下。在其他实施方案中，将LNP组合物冷冻储存，例如在-20℃或-80℃下储存。在其他实施方案中，将LNP组合物储存在约0℃至约-80℃范围内的温度下。冷冻LNP组合物可在使用之前，例如在冰上、在室温下或在25℃下解冻。
优选的脂质组合物，例如LNP组合物可生物降解，因为其不在治疗有效剂量下体内积聚至细胞毒性水平。在一些实施方案中，组合物不在治疗剂量水平下引起导致重大副作用的先天性免疫反应。在一些实施方案中，本文提供的组合物不在治疗剂量水平下引起毒性。
在一些实施方案中，LNP组合物中LNP的浓度为约1-10μg/mL、约2-10μg/mL、约2.5-10μg/mL、约1-5μg/mL、约2-5μg/mL、约2.5-5μg/mL、约0.04μg/mL、约0.08μg/mL、约0.16μg/mL、约0.25μg/mL、约0.63μg/mL、约1.25μg/mL、约2.5μg/mL或约5μg/mL。
在一些实施方案中，可使用动态光散射(“DLS”)来表征本公开的LNP的多分散性指数(PDI)和大小。DLS测量由将样品置于光源下而产生的光的散射。如根据DLS测量所测定，PDI表示群体中粒度(大约平均粒度)的分布，其中完全均一群体的PDI为零。
在一些实施方案中，本文公开的LNP的PDI为约0.005至约0.75。在一些实施方案中，本文公开的LNP的PDI为约0.005至约0.1。在一些实施方案中，本文公开的LNP的PDI为约0.005至约0.09、约0.005至约0.08、约0.005至约0.07、或约0.006至约0.05。在一些实施方案中，LNP的PDI为约0.01至约0.5。在一些实施方案中，LNP的PDI为约零至约0.4。在一些实施方案中，LNP的PDI为约零至约0.35。在一些实施方案中，LNP PDI可在约零至约0.3范围内。在一些实施方案中，LNP的PDI可在约零至约0.25范围内。在一些实施方案中，LNP PDI可在约零至约0.2范围内。在一些实施方案中，LNP的PDI为约零至约0.05。在一些实施方案中，LNP的PDI为约零至约0.01。在一些实施方案中，LNP的PDI小于约0.01、约0.02、约0.05、约0.08、约0.1、约0.15、约0.2或约0.4。
LNP大小可通过本领域中已知的各种分析方法测量。在一些实施方案中，LNP大小可使用不对称流场流动分级分离-多角度光散射(AF4-MALS)测量。在某些实施方案中，LNP大小可通过以下方式测量：通过流体动力学半径分离组合物中的颗粒，接着测量经分级分离的颗粒的分子量、流体动力学半径和均方根半径。在一些实施方案中，LNP大小和颗粒浓度可通过纳米颗粒追踪分析(NTA，Malvern Nanosight)测量。在某些实施方案中，LNP样品经适当稀释并且注射至显微镜载片上。相机在颗粒缓慢输注通过视场时记录散射光。在捕获影片之后，纳米颗粒追踪分析通过追踪像素和计算扩散系数来处理影片。此扩散系数可转化成颗粒的流体动力学半径。此类方法还可对个别颗粒的数目进行计数以得到颗粒浓度。在一些实施方案中，LNP大小、形态和结构特征可通过低温-电子显微术(“冷冻电镜技术”)测定。
本文所公开的LNP组合物的LNP的例如大小(例如Z平均直径)为约1至约250nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约10至约200nm。在其他实施方案中，LNP的大小为约20至约150nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约50至约150nm或约70至130nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约50至约100nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约50至约120nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约60至约100nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约75至约150nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约75至约120nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约75至约100nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约50至约145nm、约50至约120nm、约50至约120nm、约50至约115nm、约50至约100nm、约60至约145nm、约60至约120nm、约60至约115nm、或约60至约100nm。在一些实施方案中，LNP的大小小于约145nm、小于约120nm、小于约115nm或小于约100nm。在一些实施方案中，LNP的大小大于约50nm或大于约60nm。在一些实施方案中，粒度为Z平均粒度。在一些实施方案中，粒度为数目平均粒度。在一些实施方案中，粒度为个别LNP的大小。除非另外指明，否则本文所提及的所有大小为完全成形纳米颗粒的平均大小(直径)，如通过Malvern Zetasizer或Wyatt NanoStar上的动态光散射所测量。将纳米颗粒样品稀释于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，以使得计数率为大约200-400kcps。
LNP的大小(例如Z平均直径)可为约1至约250nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约10至约200nm。在其他实施方案中，LNP的大小为约20至约150nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约50至约150nm或约70至130nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约50至约100nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约50至约120nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约60至约100nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约75至约150nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约75至约120nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约75至约100nm。在一些实施方案中，LNP的大小为约40至约125nm、约40至约110nm、约40至约100nm、约40至约90nm。在一些实施方案中，粒度为Z平均粒度。在一些实施方案中，粒度为数目平均粒度。在一些实施方案中，粒度为个别LNP的大小。除非另外指明，否则本文所提及的所有大小为完全成形纳米颗粒的平均大小(直径)，如通过Malvern Zetasizer或Wyatt NanoStar上的动态光散射所测量。纳米颗粒样品稀释于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，以使得计数率为大约200-400kcps。
在一些实施方案中，LNP组合物经形成而具有介于约50％至约100％范围内的平均囊封效率。在一些实施方案中，LNP组合物经形成而具有介于约50％至约95％范围内的平均囊封效率。在一些实施方案中，LNP组合物经形成而具有介于约70％至约90％范围内的平均囊封效率。在一些实施方案中，LNP组合物经形成而具有介于约90％至约100％范围内的平均囊封效率。在一些实施方案中，LNP组合物经形成而具有介于约75％至约95％范围内的平均囊封效率。在一些实施方案中，LNP组合物经形成而具有介于约90％至约100％范围内的平均囊封效率。在一些实施方案中，LNP组合物经形成而具有介于约95％至约100％范围内的平均囊封效率。在一些实施方案中，LNP组合物经形成而具有介于约98％至约100％范围内的平均囊封效率。在一些实施方案中，LNP组合物经形成而具有介于约99％至约100％范围内的平均囊封效率。
货物
经由LNP组合物递送的货物可为DNA切割剂，例如经RNA引导的DNA切割剂。在某些实施方案中，货物为或包含一种或多种DNA切割剂，例如mRNA、gRNA、表达载体、经RNA引导的DNA切割剂，例如CRISPR Cas核酸酶或编码所述核酸酶的mRNA，任选地与引导RNA组合。以上DNA切割剂列表仅为示例性的，并且并不旨在为限制性的。此类化合物可经纯化或部分纯化，并且可为天然存在或合成的，并且可经化学修饰。
经由LNP组合物递送的货物可为RNA，例如编码DNA切割剂的mRNA分子。例如，包括用于表达例如RNA引导的DNA切割剂或Cas核酸酶的蛋白质的mRNA。提供LNP组合物，其包括Cas核酸酶mRNA，例如允许在第2类Cas核酸酶(例如Cas9或Cpf1(也称为Cas12a)蛋白质)的细胞中表达的第2类Cas核酸酶mRNA。另外，货物可含有一种或多种gRNA或编码gRNA的核酸。例如用于修复或重组的模板核酸也可用于本文所描述的方法中。在子实施方案中，货物包含编码任选地化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9的mRNA和化脓性链球菌gRNA。在另一子实施方案中，货物包含编码任选地脑膜炎双球菌Cas9的mRNA和Nme(脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis))gRNA。
“mRNA”是指多核苷酸并且包含可翻译成多肽(即可充当通过核糖体和氨基酰化tRNA进行翻译的底物)的开放阅读框。mRNA可包含磷酸酯-糖主链，其包括核糖残基或其类似物，例如2'-甲氧基核糖残基。在一些实施方案中，mRNA磷酸酯-糖主链的糖基本上由核糖残基、2'-甲氧基核糖残基或其组合组成。一般而言，mRNA不含大量胸苷残基(例如0个残基或少于30、20、10、5、4、3或2个胸苷残基；或小于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的胸苷含量)。mRNA可在其一些或全部尿苷位置处含有经修饰的尿苷。
DNA切割剂
在一些实施方案中，组合物或方法包含DNA切割剂，例如蛋白质或RNA组分或编码其的核酸。如本文所用，术语DNA切割剂为细胞基因组中产生编辑所必需或有帮助的基因组编辑系统(或基因编辑系统)的任何组分。在一些实施方案中，本公开提供将基因组编辑系统(例如锌指核酸酶系统、TALEN系统、大范围核酸酶系统或CRISPR/Cas系统)的DNA切割剂递送至细胞(或细胞群体)的方法。DNA切割剂包括例如能够在细胞的DNA或RNA中(例如在细胞的基因组中)产生单链或双链断裂的核酸酶和编码其的核酸(例如RNA)。DNA切割剂(例如核酸酶)可任选地在不裂解核酸或切口酶的情况下修饰细胞的基因组。DNA切割核酸酶或切口酶剂可由mRNA编码。此类核酸酶和切口酶包括例如经RNA引导的DNA切割剂和CRISPR/Cas组分。DNA切割剂包括融合蛋白，包括例如融合至效应子域，例如编辑域的切口酶。DNA切割剂包括实现引入DNA断裂的基因组编辑所必需或有帮助的任何组分，例如引导RNA、sgRNA、dgRNA等。
本文描述的包含与DNA-PKI化合物一起使用的DNA切割剂的各种适合的基因编辑系统，包括但不限于CRISPR/Cas系统；锌指核酸酶(ZFN)系统；和转录活化子样效应物核酸酶(TALEN)系统。一般而言，DNA切割剂涉及使用工程化裂解系统以诱导目标DNA序列中的双链断裂(DSB)或切口(例如单链断裂或SSB)。裂解或切口可经由使用例如经工程化ZFN、TALEN的特异性核酸酶，或使用具有工程化引导RNA的CRISPR/Cas系统以引导目标DNA序列的特异性裂解或切口而发生。此外，基于阿尔古系统(Argonaute system)(例如来自嗜热栖热菌(T.thermophilus)，称为‘TtAgo’，参见Swarts等人(2014)Nature 507(7491):258-261)开发靶向核酸酶，所述阿尔古系统还可具有用于基因组编辑和基因疗法的潜力。
在某些实施方案中，所公开的组合物包含一种或多种DNA修饰剂，例如DNA切割剂。多种DNA修饰剂可包括于本文所述的LNP组合物中。例如，DNA修饰剂包括核酸酶(序列特异性和非特异性两者)、拓扑异构酶、甲基化酶、乙酰基酶、化学物质、药物和其他药剂。在一些实施方案中，与给定DNA序列或序列组结合的蛋白质可用于诱导DNA修饰，例如链断裂。蛋白质可通过许多方式修饰，例如并入125I，其放射性衰变将引起链断裂；或修饰交联试剂，例如4-叠氮苯甲酰甲基溴，其在暴露于UV光时与DNA形成交联。此类蛋白质DNA交联可随后通过用哌啶处理转化为双链DNA断裂。DNA修饰的又另一方法涉及针对在一个或多个DNA位点处结合的特异性蛋白(例如转录因子或建筑染色质蛋白)产生的抗体，并且用于分离DNA与核蛋白复合物。
在某些实施方案中，所公开的组合物包含一种或多种DNA切割剂。DNA切割剂包括以下技术，例如锌指核酸酶(ZFN)、转录活化子样效应物核酸酶(TALEN)、线粒体(mito)-TALEN和大范围核酸酶系统。TALEN和ZFN技术使用将核酸内切酶催化域栓系至模块化DNA结合蛋白以在特异性基因组基因座处诱导靶向DNA双链断裂(DSB)的策略。额外DNA切割剂包括小干扰RNA、微RNA、抗微RNA、拮抗剂、小发夹RNA和适体(RNA、DNA或肽类(包括亲和体))。
在一些实施方案中，基因编辑系统为TALEN系统。转录活化子样效应物核酸酶(TALEN)为可经工程化以切割DNA的特定序列的限制酶。其通过使TAL效应子DNA结合域与DNA裂解域(切割DNA链的核酸酶)融合而制得。转录活化子样效应子(TALE)可经工程化以结合至所需DNA序列，以促进特定位置处的DNA裂解(参见例如Boch,2011,Nature Biotech)。限制酶可引入至细胞中，用于基因编辑或用于原位基因组编辑，一种称为经工程化的核酸酶进行基因组编辑的技术。其中使用的此类方法和组合物是本领域中已知的。参见例如WO2019147805、WO2014040370、WO2018073393，其内容特此整体并入。
在一些实施方案中，基因编辑系统为锌指系统。锌指核酸酶(ZFN)为通过将锌指DNA结合域融合至DNA裂解域产生的人工限制酶。锌指域可经工程化以靶向特定的所需DNA序列，从而使得锌指核酸酶能够靶向复杂基因组内的独特序列。来自II型限制性核酸内切酶FokI的非特异性裂解域通常用作ZFN中的裂解域。裂解通过内源DNA修复机制修复，允许ZFN精确改变高等生物的基因组。其中使用的此类方法和组合物是本领域中已知的。参见例如WO2011091324，其内容特此整体并入。
在优选实施方案中，所公开的组合物包含编码DNA切割剂，例如Cas核酸酶的mRNA。在特定实施方案中，所公开的组合物包含编码第2类Cas核酸酶，例如化脓性链球菌Cas9的mRNA。
如本文所用，“RNA引导的DNA切割剂”意指具有DNA结合和切割活性的多肽或多肽复合物，或此类复合物的DNA结合亚基，其中DNA结合活性为序列特异性的并且取决于能够引入ssDNA或dsDNA断裂的RNA序列而定。示例性经RNA引导的DNA切割剂包括Cas裂解酶/切口酶和其不活化形式(“dCas DNA切割剂”)。如本文所用，“Cas核酸酶”涵盖Cas裂解酶、Cas切口酶和dCas DNA切割剂。Cas裂解酶/切口酶和dCas DNA切割剂包括III型CRISPR系统的Csm或Cmr复合物、其Cas10、Csm1或Cmr2亚基、I型CRISPR系统的级联复合物、其Cas3亚基、和第2类Cas核酸酶。如本文所用，“第2类Cas核酸酶”为具有经RNA引导的DNA切割活性的单链多肽。第2类Cas核酸酶包括第2类Cas裂解酶/切口酶(例如H840A、D10A或N863A变体)，其进一步具有经RNA引导的DNA裂解酶或切口酶活性，和第2类dCas DNA切割剂，其中裂解酶/切口酶活性已失活。可用于本文所描述的LNP组合物的第2类Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9(例如N497A、R661A、Q695A、Q926A变体)、HypaCas9(例如N692A、M694A、Q695A、H698A变体)、eSPCas9(1.0)(例如K810A、K1003A、R1060A变体)和eSPCas9(1.1)(例如K848A、K1003A、R1060A变体)蛋白和其修饰。Cpf1蛋白(Zetsche等人,Cell,163:1-13(2015))与Cas9同源，并且含有RuvC样核酸酶域。Zetsche的Cpf1序列通过引用整体并入。参见例如Zetsche,表2和表4。参见例如Makarova等人,Nat Rev Microbiol,13(11):722-36(2015)；Shmakov等人,Molecular Cell,60:385-397(2015)。
Cas核酸酶可来源的非限制性示例性物种包括化脓性链球菌、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、链球菌属、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、无害李氏菌(Listeria innocua)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、新凶手弗朗西斯氏菌(Francisella novicida)、产琥珀酸沃廉菌(Wolinella succinogenes)、华德萨特菌(Sutterella wadsworthensis)、伽马变形菌(Gammaproteobacterium)、奈瑟氏脑膜炎菌(Neisseria meningitidis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、产琥珀酸纤维杆菌(Fibrobacter succinogene)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、产绿色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)、粉红链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、嗜酸热脂环杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)、砷还原芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亚微小杆菌(Exiguobacteriumsibiricum)、戴白氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、齿垢密螺旋体(Treponemadenticola)、海洋微颤菌(Microscilla marina)、伯克霍尔德氏细菌(Burkholderialesbacterium)、食萘单胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)、单胞菌属(Polaromonassp.)、瓦氏鳄球藻(Crocosphaera watsonii)、蓝杆藻属(Cyanothece sp.)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、聚球藻属(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋杆菌(Acetohalobium arabaticum)、根制氨菌(Ammonifex degensii)、热解纤维素菌(Caldicelulosiruptor becscii)、金矿菌(Candidatus Desulforudis)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、热丙酸消化肠状菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacilluscaldus)、嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、酒色异着色菌(Allochromatium vinosum)、海杆菌属、嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、瓦氏亚硝化球菌(Nitrosococcus watsoni)、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonashaloplanktis)、消旋纤线杆菌(Ktedonobacter racemifer)、甲烷盐菌(Methanohalobiumevestigatum)、变异念珠藻(Anabaena variabilis)、泡沫节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻属(Nostoc sp.)、极大节旋藻(Arthrospira maxima)、钝顶节旋藻(Arthrospiraplatensis)、节旋藻属、螺旋藻属(Lyngbya sp.)、原型微鞘藻(Microcoleuschthonoplastes)、颤藻属(Oscillatoria sp.)、运动石袍菌(Petrotoga mobilis)、非洲高热杆菌(Thermosipho africanus)、巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus)、灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)、红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp.)、毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)ND2006和海洋无核氯菌(Acaryochloris marina)。
在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自化脓性链球菌的Cas9核酸酶。在其他实施方案中，Cas核酸酶为来自嗜热链球菌的Cas9核酸酶。在再其他实施方案中，Cas核酸酶为来自奈瑟氏脑膜炎菌的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自金黄色葡萄球菌的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自新凶手弗朗西斯氏菌的Cpf1核酸酶。在其他实施方案中，Cas核酸酶为来自氨基酸球菌属的Cpf1核酸酶。在再其他实施方案中，Cas核酸酶为来自毛螺科菌ND2006的Cpf1核酸酶。在其他实施方案中，Cas核酸酶为来自以下的Cpf1核酸酶：土拉热弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)、毛螺科菌、瘤胃溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio proteoclasticus)、佩氏细菌(Peregrinibacteria bacterium)、帕库氏菌(Parcubacteria bacterium)、史密斯氏菌(Smithella)、氨基酸球菌属、白蚁甲烷支原体菌候选种(Candidatus Methanoplasma termitum)、挑剔真杆菌(Eubacteriumeligens)、牛眼莫拉菌(Moraxella bovoculi)、稻田钩端螺旋体(Leptospira inadai)、狗口腔卟啉单胞菌(Porphyromonas crevioricanis)、解糖胨普雷沃菌(Prevotelladisiens)或猕猴卟啉单胞菌(Porphyromonas macacae)。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自氨基酸球菌属或毛螺菌科的Cpf1核酸酶。
野生型Cas9具有两个核酸酶域：RuvC和HNH。RuvC域裂解非目标DNA链，并且HNH域裂解目标DNA链。在一些实施方案中，Cas9核酸酶包含多于一个RuvC域和/或多于一个HNH域。在一些实施方案中，Cas9核酸酶为野生型Cas9。在一些实施方案中，Cas9能够诱导目标DNA中的双链断裂。在其他实施方案中，Cas核酸酶可裂解dsDNA，其可裂解dsDNA的一个链，或者其可不具有DNA裂解酶或切口酶活性。在一些实施方案中，组合两种切口酶以产生dsDNA断裂。
在一些实施方案中，使用Cas核酸酶，例如嵌合Cas核酸酶，其中蛋白质的一个域或区融合至不同蛋白质的一部分，例如异源多肽，并且任选地在嵌合Cas9的Cas核酸酶部分与异源功能域部分之间包含接头多肽。在一些实施方案中，Cas核酸酶域可例如经由接头融合至来自不同核酸酶(例如Fok1)的域。在一些实施方案中，Cas核酸酶可为经修饰核酸酶，例如切口酶或dCas9。
在其他实施方案中，Cas核酸酶或Cas切口酶可来自第I型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas核酸酶可为第I型CRISPR/Cas系统的级联复合物的组分。在一些实施方案中，Cas核酸酶可为Cas3蛋白。在一些实施方案中，Cas核酸酶来自第III型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas核酸酶可具有RNA裂解活性。
在一些实施方案中，经RNA引导的DNA切割剂具有单链切口酶活性，即，可切割一个DNA链以产生单链断裂，也称为“切口(nick)”。在一些实施方案中，经RNA引导的DNA切割剂包含Cas切口酶。切口酶为在dsDNA中产生切口，即切割DNA双螺旋体的一个链但不切割另一链的酶。在一些实施方案中，Cas切口酶为其中例如通过催化域中的一种或多种变化(例如点突变)使核酸内切酶活性位点不活化的Cas核酸酶(例如上文所论述的Cas核酸酶)的型式。关于Cas切口酶和示例性催化域改变的论述，参见例如美国专利第8,889,356号。在一些实施方案中，Cas切口酶，例如Cas9切口酶具有不活化的RuvC或HNH域。
在一些实施方案中，经RNA引导的DNA切割剂经修饰而仅含有一个功能核酸酶域。例如，药剂蛋白质可经修饰以使得核酸酶域中的一者经突变或完全或部分缺失以降低其核酸裂解活性。在一些实施方案中，使用具有活性降低的RuvC域的切口酶。在一些实施方案中，使用具有非活性RuvC域的切口酶。在一些实施方案中，使用具有活性降低的HNH域的切口酶。在一些实施方案中，使用具有非活性HNH域的切口酶。
在一些实施方案中，Cas蛋白质核酸酶域内的保守氨基酸被取代以降低或改变核酸酶活性。在一些实施方案中，Cas核酸酶可包含RuvC或RuvC样核酸酶域中的氨基酸取代。RuvC或RuvC样核酸酶域中的示例性氨基酸取代包括D10A(基于化脓性链球菌Cas9蛋白质)。参见例如Zetsche等人,(2015)Cell 10月22日:163(3):759-771。在一些实施方案中，Cas核酸酶可包含HNH或HNH样核酸酶域中的氨基酸取代。HNH或HNH样核酸酶域中的示例性氨基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A和D986A(基于化脓性链球菌Cas9蛋白质)。参见例如Zetsche等人,(2015)。其他示例性氨基酸取代包括D917A、E1006A和D1255A(基于新凶手弗朗西斯氏菌U112 Cpf1(FnCpf1)序列(UniProtKB-A0Q7Q2(CPF1_FRATN))。
在一些实施方案中，编码切口酶的mRNA以与一对分别与目标序列的有义链和反义链互补的引导RNA组合形式提供。在此实施方案中，引导RNA将切口酶引导至目标序列并且通过在目标序列的相对链上产生切口而引入DSB(即双重切口)。在一些实施方案中，使用双重切口可改进特异性并且减少脱靶效应。在一些实施方案中，连同靶向DNA的相对链的两个个别引导RNA使用切口酶以在目标DNA中产生双切口。在一些实施方案中，连同经选择以非常接近的两个个别引导RNA使用切口酶以在目标DNA中产生双切口。在一些实施方案中，例如Cas9切口酶的切口酶融合至异源功能域，例如脱氨酶多肽。
在一些实施方案中，经RNA引导的DNA切割剂缺乏裂解酶和切口酶活性。在一些实施方案中，经RNA引导的DNA切割剂包含dCas DNA结合多肽。dCas多肽具有DNA结合活性，而基本上缺乏催化(裂解酶/切口酶)活性。在一些实施方案中，dCas多肽为dCas9多肽。在一些实施方案中，缺乏裂解酶和切口酶活性的经RNA引导的DNA切割剂或dCas DNA结合多肽为其中例如通过催化域的一种或多种变化(例如点突变)，使核酸内切酶活性位点不活化的Cas核酸酶的形式(例如上文所论述的Cas核酸酶)。参见例如US2014/0186958A1；US2015/0166980 A1。
在一些实施方案中，经RNA引导的DNA切割剂包含一个或多个异源功能域(例如为或包含融合多肽)。
在一些实施方案中，异源功能域可促进将经RNA引导的DNA切割剂输送至细胞核中。例如，异源功能域可为核定位信号(NLS)。
在一些实施方案中，异源功能域可能能够修改经RNA引导的DNA切割剂的胞内半衰期。在一些实施方案中，经RNA引导的DNA切割剂的半衰期可增加。在一些实施方案中，经RNA引导的DNA切割剂的半衰期可缩短。在一些实施方案中，异源功能域可能能够增加经RNA引导的DNA切割剂的稳定性。在一些实施方案中，异源功能域可能能够降低经RNA引导的DNA切割剂的稳定性。在一些实施方案中，异源功能域可充当蛋白质降解的信号肽。在一些实施方案中，蛋白质降解可由蛋白水解酶介导，例如蛋白酶体、溶酶体蛋白酶或钙蛋白酶。在一些实施方案中，异源功能域可包含PEST序列。在一些实施方案中，经RNA引导的DNA切割剂可通过添加泛素或多泛素链来修饰。在一些实施方案中，泛素可为泛素样蛋白(UBL)。泛素样蛋白质的非限制性实例包括小泛素样修饰因子(SUMO)、泛素交叉反应蛋白(UCRP，也被称为干扰素刺激基因-15(ISG15))、泛素相关修饰因子-1(URM1)、神经元-前体-细胞表达的发育下调蛋白-8(NEDD8，在酿酒酵母(S.cerevisiae)中也称为Rub1)、人类白细胞抗原F相关(FAT10)、自噬-8(ATG8)和自噬-12(ATG12)、Fau泛素样蛋白(FUB1)、膜锚定UBL(MUB)、泛素折叠修饰因子-1(UFM1)和泛素样蛋白-5(UBL5)。
在一些实施方案中，异源功能域可为标记域。标记域的非限制性实例包括荧光蛋白、纯化标签、表位标签和报告基因序列。在一些实施方案中，标记域可为荧光蛋白。适合的荧光蛋白的非限制实例包括绿色荧光蛋白(例如GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、sfGFP、EGFP、Emerald、Azami绿、单体Azami绿、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黄色荧光蛋白(例如YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、蓝色荧光蛋白(例如EBFP、EBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv、Sapphire、T-sapphire)、青色荧光蛋白(例如ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi-Cyan)、红色荧光蛋白(例如mKate、mKate2、mPlum、DsRed单体、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed单体、HcRed-Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)，和橙色荧光蛋白(mOrange、mKO、Kusabira橙、单体Kusabira橙、mTangerine、tdTomato)或任何其他适合荧光蛋白。在其他实施方案中，标记域可为纯化标签和/或表位标签。非限制性示例性标签包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、壳质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白(TRX)、聚(NANP)、串联亲和纯化(TAP)标签、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis、8xHis、生物素羧基载体蛋白质(BCCP)、聚His和调钙蛋白。非限制性示例性报告基因包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化酶(HRP)、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、荧光素酶或荧光蛋白。
在其他实施方案中，异源功能域可将经RNA引导的DNA切割剂靶向至特定细胞器、细胞类型、组织或器官。在一些实施方案中，异源功能域可将经RNA引导的DNA切割剂靶向至线粒体。
在其他实施方案中，异源功能域可为效应子域，例如编辑域。当经RNA引导的DNA切割剂引导至其目标序列时，例如当Cas核酸酶通过gRNA引导至目标序列时，效应子域(例如编辑域)可修饰或影响目标序列。在一些实施方案中，效应子域(例如编辑域)可选自核酸结合域、核酸酶域(例如非Cas核酸酶域)、表观遗传修饰域、转录活化域或转录抑制子域。在一些实施方案中，异源功能域为核酸酶，例如FokI核酸酶。参见例如美国专利第9,023,649号。在一些实施方案中，异源功能域为转录活化子或抑制子。参见例如Qi等人,“RepurposingCRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of geneexpression”,Cell 152:1173-83(2013)；Perez-Pinera等人,“RNA-guided geneactivation by CRISPR-Cas9-based transcription factors”,Nat.Methods 10:973-6(2013)；Mali等人,“CAS9transcriptional activators for target specificityscreening and paired nickases for cooperative genome engineering”,Nat.Biotechnol.31:833-8(2013)；Gilbert等人,“CRISPR-mediated modular RNA-guidedregulation of transcription in eukaryotes”,Cell 154:442-51(2013)。因此，经RNA引导的DNA切割剂基本上变成可使用引导RNA引导以结合所需目标序列的转录因子。在一些实施方案中，DNA修饰域为甲基化域，例如去甲基化或甲基转移酶域。在一些实施方案中，效应子域为DNA修饰域，例如碱基编辑域。在特定实施方案中，DNA修饰域为将特异性修饰引入DNA中的核酸编辑域，例如脱氨酶域。参见例如WO 2015/089406；US2016/0304846。WO 2015/089406和U.S.2016/0304846中所述的核酸编辑域、脱氨酶域和Cas9变体是特此通过引用并入。
在一些实施方案中，经RNA引导的DNA切割剂或Cas切口酶，例如Cas9切口酶包含APOBEC脱氨酶。在一些实施方案中，APOBEC脱氨酶为APOBEC3脱氨酶，例如APOBEC3A(A3A)。在一些实施方案中，A3A为人类A3A。在一些实施方案中，A3A为野生型A3A。
在一些实施方案中，经RNA引导的DNA切割剂包含编辑器。示例性编辑器为BC22n，其包含通过XTEN接头与化脓性链球菌-D10A Cas9切口酶融合的智人APOBEC3A。在一些实施方案中，编辑器与尿嘧啶糖苷酶抑制剂(“UGI”)一起提供。在一些实施方案中，编辑器融合至UGI。在一些实施方案中，编码编辑器的mRNA和编码UGI的mRNA一起配制于LNP组合物中。在其他实施方案中，编辑器和UGI提供于单独LNP组合物中。
经RNA引导的DNA切割剂可包含至少一个与引导RNA(“gRNA”)相互作用的域。另外，其可通过gRNA引导至目标序列。在第2类Cas核酸酶系统中，gRNA与核酸酶以及目标序列相互作用，使其导引与目标序列的结合。在一些实施方案中，gRNA为靶向裂解提供特异性，并且核酸酶可通用并且与不同gRNA配对以裂解不同目标序列。第2类Cas核酸酶可与以上列出的类型、直系同源物和示例性物种的gRNA骨架结构配对。
如本文所用，“核糖核蛋白”(RNP)或“RNP复合物”是指gRNA连同经RNA引导的DNA切割剂，例如Cas核酸酶，例如Cas裂解酶、Cas切口酶或dCas DNA切割剂，例如dCas9融合蛋白(例如Cas9)。在一些实施方案中，gRNA将经RNA引导的DNA切割剂，例如Cas9引导至目标序列，并且gRNA与目标序列杂合并且所述切割剂结合于目标序列；在切割剂为裂解酶或切口酶的情况下，结合之后可进行裂解或切口。
在本公开的一些实施方案中，LNP组合物的货物包括至少一个gRNA，其包含引导序列，所述引导序列将可为核酸酶(例如Cas核酸酶，如Cas9)的经RNA引导的DNA切割剂导引至目标DNA。gRNA可将Cas核酸酶或第2类Cas核酸酶引导至目标核酸分子上的目标序列。在一些实施方案中，gRNA与第2类Cas核酸酶结合并且通过其提供裂解特异性。在一些实施方案中，gRNA和Cas核酸酶可形成核糖核蛋白(RNP)，例如CRISPR/Cas复合物，例如CRISPR/Cas9复合物。在一些实施方案中，CRISPR/Cas复合物可为第II型CRISPR/Cas9复合物。在一些实施方案中，CRISPR/Cas复合物可为第V型CRISPR/Cas复合物，例如Cpf1/gRNA复合物。Cas核酸酶和同源gRNA可配对。与每个第2类Cas核酸酶配对的gRNA骨架结构随特定CRISPR/Cas系统变化。
“引导RNA”、“gRNA”和仅“引导物”在本文中可互换使用，是指用于经RNA引导的DNA切割剂的同源引导核酸。引导RNA可包括如本文所述的经修饰RNA。gRNA可为crRNA(也称为CRISPR RNA)或crRNA与trRNA的组合(也称为tracrRNA)。crRNA和trRNA可呈单一RNA分子(单引导RNA，sgRNA)或呈两个或更多个单独RNA分子(双引导RNA，dgRNA)形式缔合，任选地共价连接。“引导RNA”或“gRNA”是指每个类型。trRNA可为天然存在的序列或与天然存在的序列相比具有修饰或变异的trRNA序列。
在一些实施方案中，编码经RNA引导的DNA切割剂的mRNA被配制于第一LNP组合物中并且gRNA核酸被配制于第二LNP组合物中。在一些实施方案中，第一和第二脂质核酸组装组合物是同时施用的。在其他实施方案中，第一和第二脂质核酸组装组合物是依序施用的。在一些实施方案中，第一和第二脂质核酸组装组合物在预温育步骤之前合并。在其他实施方案中，第一和第二脂质核酸组装组合物分开预温育。
在某些实施方案中，本文所述的组合物和方法涉及经修饰的RNA。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法涉及引导RNA核酸。在某些实施方案中，本文所述的组合物和方法涉及gRNA，例如dgRNA或经修饰gRNA。在包含编码经RNA引导的DNA切割剂的mRNA的一些组合物中，所述组合物还包含gRNA核酸，例如gRNA。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法涉及经RNA引导的DNA切割剂和gRNA。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法涉及Cas核酸酶mRNA和gRNA，例如第2类Cas核酸酶mRNA和gRNA。
在一些实施方案中，货物可包含DNA分子。在一些实施方案中，核酸可包含编码crRNA的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码crRNA的核苷酸序列包含由来自天然存在的CRISPR/Cas系统的重复序列的全部或一部分侧接的靶向序列。在一些实施方案中，核酸可包含编码tracr RNA的核苷酸序列。在某些实施方案中，crRNA和tracr RNA可由两个分离核酸编码。在其他实施方案中，crRNA和tracr RNA可由单一核酸编码。在一些实施方案中，crRNA和tracr RNA可由单一核酸的相对链编码。在其他实施方案中，crRNA和tracr RNA可由单一核酸的相同链编码。在一些实施方案中，gRNA核酸编码sgRNA。在一些实施方案中，gRNA核酸编码Cas9核酸酶sgRNA。在一些实施方案中，gRNA核酸编码Cpf1核酸酶sgRNA。
编码引导RNA的核苷酸序列能够可操作地连接于至少一个转录或调控控制序列，例如启动子、3'UTR或5'UTR。在一个实例中，启动子可为tRNA启动子，例如tRNALys3，或tRNA嵌合体。参见Mefferd等人,RNA.2015 21:1683-9；Scherer等人,Nucleic Acids Res.200735:2620-2628。在一些实施方案中，启动子可通过RNA聚合酶III(Pol III)识别。Pol III启动子的非限制性实例还包括U6和H1启动子。在一些实施方案中，编码引导RNA的核苷酸序列可与小鼠或人类U6启动子可操作地连接。在一些实施方案中，gRNA核酸为经修饰核酸。在一些实施方案中，gRNA核酸包括经修饰核苷或核苷酸。在一些实施方案中，gRNA核酸包括5'端修饰，例如经修饰核苷或核苷酸以稳定和阻止核酸整合。在其他实施方案中，gRNA核酸包含双链DNA，其在每个链上具有5'端修饰。在一些实施方案中，gRNA核酸包括反向双脱氧-T或反向无碱基核苷或核苷酸作为5'端修饰。在一些实施方案中，gRNA核酸包括标签，例如生物素、去硫生物素-TEG、地高辛和荧光标志物，包括例如FAM、ROX、TAMRA和AlexaFluor。
如本文所用，“引导序列”是指与目标序列互补并且用以通过经RNA引导的DNA切割剂将gRNA导引至目标序列以用于结合或修饰(例如裂解)的gRNA内的序列。“引导序列”也可称为“靶向序列”或“间隔序列”。引导序列的长度例如在化脓性链球菌(即Spy Cas9)和相关Cas9同源物/直系同源物的情况下可为20个碱基对。较短或较长序列还可用作例如长度为15、16、17、18、19、21、22、23、24或25个核苷酸的引导序列。在一些实施方案中，目标序列处于例如基因中或染色体上，并且与引导序列互补。在一些实施方案中，引导序列与其对应目标序列之间的互补性或同一性的程度可为约或至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，引导序列和目标区域可相对于至少15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的区域100％互补或同一。在其他实施方案中，引导序列和目标区域可含有至少一个错配。例如，引导序列和目标序列可含有1、2、3或4个错配，其中目标序列的总长度为至少17、18、19、20个或更多个碱基对。在一些实施方案中，引导序列和目标区域可含有1至4个错配，其中引导序列包含至少17、18、19、20个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，引导序列和目标区域可含有1、2、3或4个错配，其中引导序列包含20个核苷酸。
在某些实施方案中，可协同地和/或出于个别目的使用多种LNP组合物。在一些实施方案中，细胞可与本文所述的第一和第二LNP组合物接触。在一些实施方案中，第一和第二LNP组合物各自独立地包含例如mRNA、gRNA和gRNA核酸中的一者或多者。在一些实施方案中，第一和第二LNP组合物是同时施用的。在一些实施方案中，第一和第二LNP组合物是依序施用的。
在一些实施方案中，提供一种在细胞中产生多个基因组编辑的方法(有时在本文中和他处称为“多重”或“多重基因编辑”或“多重基因组编辑”)。将多个属性工程化至单个细胞中的能力取决于在多个靶向基因中有效进行编辑，包括基因敲除和基因座插入，同时保持活力和所需细胞表型。在一些实施方案中，所述方法包括体外培养细胞，使细胞与两种或更多种脂质核酸组装组合物接触，其中每个脂质核酸组装组合物包含能够编辑目标位点的核酸基因组编辑工具，以及体外扩增细胞。所述方法产生具有超过一个基因组编辑的细胞，其中基因组编辑不同。在某些实施方案中，第一LNP组合物包含第一gRNA并且第二LNP组合物包含第二gRNA，其中第一和第二gRNA包含与不同目标互补的不同引导序列。在此类实施方案中，LNP组合物可允许多重基因编辑。
针对经RNA引导的DNA切割蛋白质(例如Cas蛋白质)的目标序列包括基因组DNA的正链和负链两者(即给定序列和所述序列的反向互补序列)，因为Cas蛋白质的核酸底物为双链核酸。因此，在称引导序列“与目标序列互补”的情况下，应了解，引导序列可引导gRNA结合至目标序列的反向互补序列。因此，在一些实施方案中，在引导序列结合目标序列的反向互补序列的情况下，引导序列与目标序列(例如不包括PAM的目标序列)的某些核苷酸具有同一性，不同之处在于在引导序列中U取代T。
靶向序列的长度可取决于使用的CRISPR/Cas系统和组分。例如，来自不同细菌物种的不同第2类Cas核酸酶具有改变的最佳靶向序列长度。因此，靶向序列的长度可包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或大于50个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列长度比天然存在的CRISPR/Cas系统的引导序列长或短0、1、2、3、4或5个核苷酸。在某些实施方案中，Cas核酸酶和gRNA骨架将来源于相同CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，靶向序列可包含18-24个核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，靶向序列可包含19-21个核苷酸或由其组成。在一些实施方案中，靶向序列可包含20个核苷酸或由其组成。
在一些实施方案中，sgRNA是能够通过Cas9蛋白介导经RNA引导的DNA裂解的“Cas9sgRNA”。在一些实施方案中，sgRNA是能够通过Cpf1蛋白质介导经RNA引导的DNA裂解的“Cpf1 sgRNA”。在某些实施方案中，gRNA包含足以与Cas9蛋白形成活性复合物并且介导经RNA引导的DNA裂解的crRNA和tracr RNA。在某些实施方案中，gRNA包含足以与Cpf1蛋白质形成活性复合物并且介导经RNA引导的DNA裂解的crRNA。参见Zetsche 2015。
某些实施方案还提供编码本文所述的gRNA的核酸，例如表达盒。“引导RNA核酸”在本文中用于指gRNA(例如sgRNA或dgRNA)和gRNA表达盒，其为编码一个或多个gRNA的核酸。
经修饰的RNA
在某些实施方案中，脂质组合物，例如LNP组合物包含经修饰的核酸，包括经修饰的RNA。
经修饰的核苷或核苷酸可存在于RNA，例如gRNA或mRNA中。包含一个或多个经修饰核苷或核苷酸的gRNA或mRNA例如称为“经修饰”的RNA，用于描述替代或外加典型A、G、C和U残基使用的一种或多种非天然和/或天然存在的组分或构型的存在。在一些实施方案中，经修饰的RNA是通过非典型核苷或核苷酸合成，此处称为“经修饰”。
经修饰的核苷和核苷酸可包括以下中的一者或多者：(i)磷酸二酯主链键联中的一个或两个非键联磷酸酯氧和/或一个或多个键联磷酸酯氧的变化，例如置换(示例性主链修饰)；(ii)核糖成分(例如核糖上的2'羟基)的变化，例如置换(示例性糖修饰)；(iii)用“去磷酸化”接头成批置换磷酸酯部分(示例性主链修饰)；(iv)天然存在的核碱基的修饰或置换，包括用非典型核碱基修饰或置换(示例性碱基修饰)；(v)核糖-磷酸酯主链的置换或修饰(示例性主链修饰)；(vi)多核苷酸的3'端或5'端的修饰，例如末端磷酸酯基团的去除、修饰或置换，或部分、帽或接头的缀合(此类3'或5'帽修饰可包含糖和/或主链修饰)；和(vii)糖的修饰或置换(示例性糖修饰)。某些实施方案包含对mRNA、gRNA或核酸的5'端修饰。某些实施方案包含对mRNA、gRNA或核酸的修饰。某些实施方案包含对mRNA、gRNA或核酸的3'端修饰。经修饰的RNA可含有5'端和3'端修饰。经修饰的RNA可在非末端位置含有一个或多个经修饰的残基。在某些实施方案中，gRNA包括至少一个经修饰的残基。在某些实施方案中，mRNA包括至少一个经修饰的残基。在某些实施方案中，经修饰的gRNA在5'端处包含前五个核苷酸中的一者或多者处的修饰。在某些实施方案中，经修饰的gRNA在5'端处包含前五个核苷酸中的一者或多者处的修饰。如权利要求52或53所述的LNP组合物，其中经修饰的gRNA在3'端处包含最后五个核苷酸中的一者或多者处的修饰。
未经修饰的核酸可容易通过例如细胞内核酸酶或血清中所发现的那些核酸酶降解。例如，核酸酶可使核酸磷酸二酯键水解。因此，在一个方面，本文所述的RNA(例如mRNA、gRNA)可含有一个或多个经修饰的核苷或核苷酸，例如以引入针对细胞内核酸酶或基于血清的核酸酶的稳定性。在一些实施方案中，本文所述的经修饰的RNA分子当引入细胞群体中时，在体内与离体均可表现出降低的先天免疫反应。术语“先天性免疫反应”包括针对外源核酸(包括单链核酸)的细胞反应，其涉及诱导细胞因子(特别是干扰素)表达和释放，和细胞死亡。
因此，在一些实施方案中，RNA或核酸包含至少一种赋予核酸增加或增强的稳定性的修饰，包括例如改进的对体内核酸酶消化的抗性。如本文所用，如术语“修饰”和“经修饰”的此类术语涉及本文所提供的核酸，包括至少一种改变，其优选增强稳定性并且使RNA或核酸比野生型或天然存在的RNA或核酸形式更稳定(例如对核酸酶消化具有抗性)。如本文所用，术语“稳定”和“稳定性”和此类术语涉及本文所述的核酸，并且特别是关于RNA，是指对通过例如通常能够降解此类RNA的核酸酶(即核酸内切酶或核酸外切酶)的降解具有增加或增强的抗性。增加的稳定性可包括例如对通过内源酶(例如核酸内切酶或核酸外切酶)的水解或其他破坏或目标细胞或组织内的状况的敏感性降低，由此增加或增强此类RNA或核酸在目标细胞、组织、受试者和/或细胞质中的停留。本文提供的经稳定RNA或核酸分子展现相对于其天然存在的未经修饰的对应物(例如分子的野生型形式)的较长半衰期。如与本文所公开的LNP组合物的mRNA相关的术语，术语“修饰”和“经修饰”还涵盖改进或增强mRNA核酸翻译的改变，包括例如包括在蛋白质翻译起始中起作用的序列(例如Kozak共有序列)。(Kozak,M.,Nucleic Acids Res 15(20):8125-48(1987))。
在一些实施方案中，RNA或核酸已经受化学或生物修饰以使其更稳定。RNA或核酸的示例性修饰包括碱基耗尽(例如通过一个核苷酸缺失或通过另一个核苷酸取代一个核苷酸)或碱基修饰，例如碱基的化学修饰。如本文所用的短语“化学修饰”包括引入不同于天然存在的RNA或核酸中所发现的化学物质的修饰，例如共价修饰，例如引入经修饰的核苷酸(例如核苷酸类似物，或包括在此类RNA中未天然发现的侧基，例如脱氧核苷或核酸分子)。
在主链修饰的一些实施方案中，经修饰的残基的磷酸酯基可通过用不同取代基置换一个或多个氧而经修饰。此外，经修饰的残基，例如存在于经修饰的核酸中的经修饰的残基可包括用如本文所描述的经修饰的磷酸酯基批量置换未经修饰的磷酸酯部分。在一些实施方案中，磷酸酯主链的主链修饰可包括产生不带电接头或具有不对称电荷分布的带电接头的变化。
经修饰的磷酸酯基团的实例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、硼烷磷酸酯(borano phosphate ester)、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、膦酸烷酯和烷基磷酸三酯或膦酸芳酯和芳基磷酸三酯。未经修饰的磷酸酯基团中的磷原子是非手性的。然而，用上述原子或原子团之一置换非桥连氧之一可使得磷原子呈手性。立体对称磷原子可具有“R”构型(本文中为Rp)或“S”构型(本文中为Sp)。主链还可通过用氮(桥联氨基磷酸酯)、硫(桥联硫代磷酸酯)和碳(桥联亚甲基膦酸酯)置换桥联氧(即连接磷酸酯与核苷的氧)而加以修饰。置换可发生在任一连接氧或两个连接氧处。磷酸酯基可在某些主链修饰中被不含磷的连接基团置换。在一些实施方案中，带电磷酸酯基可被中性部分置换。可置换磷酸酯基的部分的实例可包括(但不限于)例如膦酸甲酯、羟氨基、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷接头、磺酸酯、磺酰胺、硫代甲缩醛、甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基肼、亚甲基二甲基肼和亚甲氧基甲基亚氨基。
在一些实施方案中，本文公开的组合物或制剂包含mRNA，其包含开放阅读框(ORF)，例如编码经RNA引导的DNA结合剂，例如Cas核酸酶，或如本文所述的第2类Cas核酸酶的ORF。在一些实施方案中，提供、使用或施用mRNA，其包含编码经RNA引导的DNA结合剂，例如Cas核酸酶或第2类Cas核酸酶的ORF。在一些实施方案中，ORF经密码子优化。在一些实施方案中，编码经RNA引导的DNA结合剂的ORF为“经修饰的RNA引导的DNA结合剂ORF”或仅“经修饰的ORF”，其以简写形式用于指示ORF以下列方式中的一者或多者修饰：(1)经修饰的ORF的尿苷含量在其最小尿苷含量至所述最小尿苷含量的150％范围内；(2)经修饰的ORF的尿苷二核苷酸含量在其最小尿苷二核苷酸含量至所述最小尿苷二核苷酸含量的150％范围内；(3)经修饰的ORF由一组密码子组成，其中对于既定氨基酸，至少75％的密码子为最小尿苷密码子，例如具有最少尿苷的密码子(通常0或1个，除苯丙氨酸的密码子以外，其中最小尿苷密码子具有2个尿苷)；或(4)经修饰的ORF包含至少一个经修饰的尿苷。在一些实施方案中，经修饰的ORF以至少两种、三种或四种前述方式经修饰。在一些实施方案中，经修饰的ORF包含至少一个经修饰的尿苷并且以上述(1)-(3)中的至少一者、两者、三者或全部进行修饰。
“经修饰的尿苷”在本文中用于指代除胸苷外的与尿苷具有相同氢键受体并且与尿苷存在一种或多种结构差异的核苷。在一些实施方案中，经修饰的尿苷为被取代的尿苷，即其中一个或多个非质子取代基(例如烷氧基，例如甲氧基)代替质子的尿苷。在一些实施方案中，经修饰的尿苷为假尿苷。在一些实施方案中，经修饰的尿苷为被取代的假尿苷，即其中一个或多个非质子取代基(例如烷基，例如甲基)代替质子的假尿苷。在一些实施方案中，经修饰的尿苷为被取代的尿苷、假尿苷或被取代的假尿苷中的任一者。
如本文所用的“尿苷位置”是指多核苷酸中由尿苷或经修饰的尿苷占据的位置。因此，例如，其中“100％的尿苷位置为经修饰的尿苷”的多核苷酸在相同序列的常规RNA(其中所有碱基都是标准A、U、C或G碱基)中应为尿苷的每个位置处均含有经修饰的尿苷。除非另外指明，否则本公开中或附随本公开的序列表(sequence table/sequence listing)的多核苷酸序列中的U可为尿苷或经修饰的尿苷。
最小尿苷密码子：
在以上实施方案中的任一者中，经修饰的ORF可由一组密码子组成，其中至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的密码子为以上最小尿苷密码子表中所列的密码子。
在以上实施方案中的任一者中，经修饰的ORF的尿苷含量可介于其最小尿苷含量至最小尿苷含量的150％、145％、140％、135％、130％、125％、120％、115％、110％、105％、104％、103％、102％或101％范围内。
在以上实施方案中的任一者中，经修饰的ORF的尿苷二核苷酸含量可介于其最小尿苷二核苷酸含量至最小尿苷二核苷酸含量的150％、145％、140％、135％、130％、125％、120％、115％、110％、105％、104％、103％、102％或101％范围内。
在以上实施方案中的任一者中，经修饰的ORF可至少在一个、多个或所有尿苷位置包含经修饰的尿苷。在一些实施方案中，经修饰的尿苷为在5位处，例如用卤素、甲基或乙基修饰的尿苷。在一些实施方案中，经修饰的尿苷为在1位处例如经卤素、甲基或乙基修饰的假尿苷。经修饰的尿苷可为例如假尿苷、N1-甲基-假尿苷、5-甲氧基尿苷、5-碘尿苷或其组合。在一些实施方案中，经修饰的尿苷为5-甲氧基尿苷。在一些实施方案中，经修饰的尿苷为5-碘尿苷。在一些实施方案中，经修饰的尿苷为假尿苷。在一些实施方案中，经修饰的尿苷为N1-甲基-假尿苷。在一些实施方案中，经修饰的尿苷为假尿苷和N1-甲基-假尿苷的组合。在一些实施方案中，经修饰的尿苷为假尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。在一些实施方案中，经修饰的尿苷为N1-甲基假尿苷与5-甲氧基尿苷的组合。在一些实施方案中，经修饰的尿苷为5-碘尿苷和N1-甲基-假尿苷的组合。在一些实施方案中，经修饰的尿苷为假尿苷与5-碘尿苷的组合。在一些实施方案中，经修饰的尿苷为5-碘尿苷与5-甲氧基尿苷的组合。
在一些实施方案中，根据本公开的mRNA中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的尿苷位置为经修饰的尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的mRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为经修饰的尿苷，例如5-甲氧基尿苷、5-碘尿苷、N1-甲基假尿苷、假尿苷或其组合。在一些实施方案中，根据本公开的mRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为5-甲氧基尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的mRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为假尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的mRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为N1-甲基假尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的mRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为5-碘尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的mRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为5-甲氧基尿苷，并且其余部分为N1-甲基假尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的mRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为5-碘尿苷，并且其余部分为N1-甲基假尿苷。
在以上实施方案中的任一者中，经修饰的ORF可包含降低的尿苷二核苷酸含量，例如最低可能的尿苷二核苷酸(UU)含量，例如(a)在每个位置处使用最小尿苷密码子(如上文所论述)和(b)编码与给定ORF相同的氨基酸序列的ORF。尿苷二核苷酸(UU)含量可以绝对术语表示为ORF中的UU二核苷酸的计数或基于比率，表示为尿苷二核苷酸的尿苷所占据的位置的百分比(例如，AUUAU的尿苷二核苷酸含量将为40％，因为尿苷二核苷酸的尿苷占据了5个位置中的2个)。出于评价最小尿苷二核苷酸含量的目的，经修饰的尿苷残基视为等效于尿苷。
在一些实施方案中，mRNA包含至少一个来自表达的哺乳动物mRNA，例如组成性表达的mRNA的UTR。如果mRNA在健康成年哺乳动物的至少一个组织中连续转录，则将其视为在哺乳动物中组成性表达。在一些实施方案中，mRNA包含来自表达的哺乳动物RNA，例如组成性表达的哺乳动物mRNA的5'UTR、3'UTR或5'和3'UTR。肌动蛋白mRNA为组成性表达的mRNA的实例。
在一些实施方案中，mRNA包含至少一个来自羟基类固醇17-β脱氢酶4(HSD17B4或HSD)的UTR，例如来自HSD的5'UTR。在一些实施方案中，mRNA包含至少一个来自珠蛋白mRNA，例如人类α珠蛋白(HBA)mRNA、人类β珠蛋白(HBB)mRNA或有爪蟾蜍(Xenopus laevis)β珠蛋白(XBG)mRNA的UTR。在一些实施方案中，mRNA包含来自珠蛋白mRNA，例如HBA、HBB或XBG的5'UTR、3'UTR或5'和3'UTR。在一些实施方案中，mRNA包含来自牛生长激素、巨细胞病毒(CMV)、小鼠Hba-a1、HSD、白蛋白基因、HBA、HBB或XBG的5'UTR。在一些实施方案中，mRNA包含来自牛生长激素、巨细胞病毒(CMV)、小鼠Hba-a1、HSD、白蛋白基因、HBA、HBB或XBG的3'UTR。在一些实施方案中，mRNA包含来自牛生长激素、巨细胞病毒、小鼠Hba-a1、HSD、白蛋白基因、HBA、HBB、XBG、热休克蛋白90(Hsp90)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白、α-微管蛋白、肿瘤蛋白质(p53)或表皮生长因子受体(EGFR)的5'和3'UTR。
在一些实施方案中，mRNA包含来自同一来源，例如组成性表达的mRNA，例如肌动蛋白、白蛋白或珠蛋白如HBA、HBB或XBG的5'和3'UTR。
在一些实施方案中，mRNA不包含5'UTR，例如在5'帽与起始密码子之间不存在额外核苷酸。在一些实施方案中，mRNA在5'帽与起始密码子之间包含Kozak序列(下文所描述)，但不具有任何额外5'UTR。在一些实施方案中，mRNA不包含3'UTR，例如在终止密码子与poly-A尾之间不存在额外核苷酸。
在一些实施方案中，mRNA包含Kozak序列。Kozak序列可影响翻译起始和由mRNA翻译的多肽的总产率。Kozak序列包括可充当起始密码子的甲硫氨酸密码子。最小Kozak序列为NNNRUGN，其中以下中的至少一者成立：第一个N为A或G并且第二个N为G。在核苷酸序列的情形下，R意指嘌呤(A或G)。在一些实施方案中，Kozak序列为RNNRUGN、NNNRUGG、RNNRUGG、RNNAUGN、NNNAUGG或RNNAUGG。在一些实施方案中，Kozak序列为具有零错配或在呈小写字母形式的位置具有至多一个或两个错配的rccRUGg。在一些实施方案中，Kozak序列为具有零错配或在呈小写字母形式的位置具有至多一个或两个错配的rccAUGg。在一些实施方案中，Kozak序列为具有零错配或在呈小写字母形式的位置具有至多一个、两个或三个错配的gccRccAUGG。在一些实施方案中，Kozak序列为具有零错配或在呈小写字母形式的位置具有至多一个、二个、三个或四个错配的gccAccAUG。在一些实施方案中，Kozak序列为GCCACCAUG。在一些实施方案中，Kozak序列为具有零错配或在呈小写字母形式的位置具有至多一个、两个、三个或四个错配的gccgccRccAUGG。
在一些实施方案中，本文所公开的mRNA包含5'帽，例如Cap0、Cap1或Cap2。5'帽通常为经由5'-三磷酸连接至mRNA的5'至3'链的第一个核苷酸，即第一个帽近端核苷酸的5'位的7-甲基鸟嘌呤核糖核苷酸(其可经进一步修饰，如下文例如关于ARCA所论述)。在Cap0中，mRNA的第一与第二帽近端核苷酸的核糖均包含2'-羟基。在Cap1中，mRNA的第一和第二转录核苷酸的核糖分别包含2'-甲氧基和2'-羟基。在Cap2中，mRNA的第一与第二帽近端核苷酸的核糖包含2'-甲氧基。参见例如Katibah等人,(2014)Proc Natl Acad Sci USA 111(33):12025-30；Abbas等人,(2017)Proc Natl Acad Sci USA 114(11):E2106-E2115。大多数内源性高等真核生物mRNA，包括哺乳动物mRNA(例如人类mRNA)包含Cap1或Cap2。由于根据例如IFIT-1和IFIT-5的先天免疫系统组分辨识为“非自体”，因此Cap0和与Cap1和Cap2不同的其他帽结构在例如人类的哺乳动物中可具免疫原性，这可致使包括第I型干扰素的细胞因子水平升高。先天免疫系统的组分，例如IFIT-1和IFIT-5也可与eIF4E竞争以结合具有除Cap1或Cap2外的帽的mRNA，这可能会抑制mRNA的翻译。
帽可以共转录方式包括在内。例如，ARCA(抗反向帽类似物；Thermo FisherScientific目录号AM8045)是包含连接至鸟嘌呤核糖核苷酸的5'位的7-甲基鸟嘌呤3'-甲氧基-5'-三磷酸的帽类似物，其可在开始时体外并入转录物中。ARCA产生Cap0帽，其中第一个帽近端核苷酸的2'位为羟基。参见例如Stepinski等人,(2001)“Synthesis andproperties of mRNAs containing the novel‘anti-reverse’cap analogs7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'deoxy)GpppG”,RNA 7:1486-1495。ARCA结构显示如下。
CleanCapTM AG(m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG；TriLink Biotechnologies目录号N-7113)或CleanCapTM GG(m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG；TriLink Biotechnologies目录号N-7133)可用于以共转录方式提供Cap1结构。CleanCapTM AG和CleanCapTM GG的3'-O-甲基化形式也可分别以目录号N-7413和N-7433购自TriLink Biotechnologies。CleanCapTM AG结构显示如下。
或者，可以转录后方式将帽添加至RNA。例如，牛痘加帽酶为可市售的(NewEngland Biolabs目录号M2080S)，并且具有由其D1亚基提供的RNA三磷酸酶和鸟苷酰基转移酶活性和由其D12亚基提供的鸟嘌呤甲基转移酶。因此，在S-腺苷甲硫氨酸和GTP存在下，可将7-甲基鸟嘌呤添加至RNA，以产生Cap0。参见例如Guo,P.和Moss,B.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,4023-4027；Mao,X.和Shuman,S.(1994)J.Biol.Chem.269,24472-24479。
在一些实施方案中，mRNA还包含聚腺苷酸化(poly-A)尾。在一些实施方案中，poly-A尾包含至少20、30、40、50、60、70、80、90或100个腺嘌呤，任选地至多300个腺嘌呤。在一些实施方案中，poly-A尾包含95、96、97、98、99或100个腺嘌呤核苷酸。在一些情况下，poly-A尾在poly-A尾中的一个或多个位置处被一个或多个非腺嘌呤核苷酸“锚”“中断”。poly-A尾可包含至少8个连续腺嘌呤核苷酸，但还包含一个或多个非腺嘌呤核苷酸。如本文所用，“非腺嘌呤核苷酸”是指不包含腺嘌呤的任何天然或非天然核苷酸。鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸为示例性非腺嘌呤核苷酸。因此，本文所述的mRNA上的poly-A尾可包含位于编码经RNA引导的DNA结合剂或所关注序列的核苷酸的3'的连续腺嘌呤核苷酸。在一些情况下，mRNA上的poly-A尾包含位于编码经RNA引导的DNA结合剂或所关注序列的核苷酸的3'的非连续腺嘌呤核苷酸，其中非腺嘌呤核苷酸以规则或不规则间隔中断腺嘌呤核苷酸。
如本文所用，“非腺嘌呤核苷酸”是指不包含腺嘌呤的任何天然或非天然核苷酸。鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸为示例性非腺嘌呤核苷酸。因此，本文所述的mRNA上的poly-A尾可包含位于编码经RNA引导的DNA结合剂或所关注序列的核苷酸的3'的连续腺嘌呤核苷酸。在一些情况下，mRNA上的poly-A尾包含位于编码经RNA引导的DNA结合剂或所关注序列的核苷酸的3'的非连续腺嘌呤核苷酸，其中非腺嘌呤核苷酸以规则或不规则间隔中断腺嘌呤核苷酸。
在一些实施方案中，mRNA经纯化。在一些实施方案中，mRNA是使用沉淀法(例如LiCl沉淀、酒精沉淀或等效方法，例如如本文所述)进行纯化。在一些实施方案中，mRNA是使用基于色谱法的方法，例如基于HPLC的方法或等效方法(例如如本文所述)进行纯化。在一些实施方案中，mRNA是使用沉淀法(例如LiCl沉淀)和基于HPLC的方法两者进行纯化。
在一些实施方案中，与本文公开的mRNA组合提供至少一种gRNA。在一些实施方案中，gRNA提供为与mRNA分离的分子。在一些实施方案中，gRNA提供为本文公开的mRNA的一部分，例如UTR的一部分。
mRNA
在一些实施方案中，本文公开的组合物或制剂包含mRNA，其包含编码DNA切割剂，例如经RNA引导的DNA切割剂，例如Cas核酸酶，或如本文所述的第2类Cas核酸酶的开放阅读框(ORF)。在一些实施方案中，提供、使用或施用mRNA，其包含编码经RNA引导的DNA切割剂，例如Cas核酸酶或第2类Cas核酸酶的ORF。mRNA可包含5'帽、5'未翻译区(UTR)、3'UTR和聚腺嘌呤尾中的一者或多者。mRNA可包含经修饰的开放阅读框，例如以编码核定位序列或使用替代密码子来编码蛋白质。
所公开LNP组合物中的mRNA可编码例如分泌性激素、酶、受体、多肽、肽或通常分泌的其他所关注蛋白质。在一些实施方案中，mRNA可任选地具有化学或生物修饰，其例如改进此类mRNA的稳定性和/或半衰期或改进或以其他方式促进蛋白质生产。
另外，适合修饰包括改变密码子的一个或多个核苷酸以使得密码子编码相同氨基酸，但比在野生型形式的mRNA中发现的密码子更稳定。例如，已证明RNA的稳定性与较高数目的胞苷(C)和/或尿苷(U)残基之间呈反向关系，并且已发现不含C和U残基的RNA对于大部分RNA酶而言是稳定的(Heidenreich等人,J Biol Chem 269,2131-8(1994))。在一些实施方案中，mRNA序列中C和/或U残基的数目减少。在另一实施方案中，C和/或U残基的数目通过将编码特定氨基酸的一种密码子取代为编码相同或相关氨基酸的另一密码子来减少。预期的对mRNA核酸的修饰还包括并入假尿苷。将假尿苷并入至mRNA核酸中可增强稳定性和翻译能力，以及降低体内免疫原性。参见例如Karikó,K.等人,Molecular Therapy 16(11):1833-1840(2008)。对mRNA的取代和修饰可通过本领域普通技术人员容易已知的方法进行。
与未翻译区相比，减少序列中的C和U残基的数目的约束条件将可能在mRNA的编码区内更大(即，消除信息中存在的全部C和U残基同时仍保留信息编码所需氨基酸序列的能力可能将为不可能的)。然而，遗传密码的简并提供允许存在于序列中的C和/或U残基的数目得以减少，同时维持相同编码能力(即，取决于由密码子编码何种氨基酸，数种不同RNA序列修饰可能性可为可能的)的机会。
术语修饰还包括例如将非核苷酸键联或经修饰的核苷酸并入至mRNA序列中(例如对编码功能性分泌蛋白或酶的mRNA分子的3'和5'端中的一者或两者的修饰)。此类修饰包括将碱基添加至mRNA序列(例如，包括poly A尾或较长poly A尾)、改变3'UTR或5'UTR、使mRNA与剂(例如，蛋白质或互补核酸分子)复合和包括改变mRNA分子的结构的元件(例如，其形成二级结构)。
poly A尾被认为使天然信使稳定。因此，长poly A尾可添加至mRNA分子中，因此使得mRNA更稳定。可使用多种本领域中公认的技术添加Poly A尾。例如，长poly A尾可使用poly A聚合酶添加至合成或体外转录mRNA(Yokoe等人,Nature Biotechnology.1996；14:1252-1256)。转录载体还可编码长poly A尾。另外，poly A尾可通过从PCR产物直接转录添加。在一些实施方案中，poly A尾的长度为至少约90、200、300、400个、至少500个核苷酸。在某些实施方案中，调节poly A尾的长度以控制经修饰的mRNA分子的稳定性，并且因此控制蛋白质的转录。例如，由于poly A尾的长度可影响mRNA分子的半衰期，因此poly A尾的长度可经调节以改变mRNA对核酸酶的抗性水平并且由此控制细胞中蛋白质表达的时程。在一些实施方案中，稳定的mRNA分子对体内降解(例如，通过核酸酶)具有足够抵抗性，使得其可在无转移媒介物的情况下递送至目标细胞。
在某些实施方案中，mRNA可通过并入未在野生型mRNA中天然发现的3'和/或5'未翻译(UTR)序列而经修饰。在一些实施方案中，自然侧接mRNA并且编码第二不相关蛋白质的3'和/或5'侧接序列，可并入至编码治疗或功能蛋白的mRNA分子的核苷酸序列中，以便将其修饰。例如，来自稳定的mRNA分子(例如珠蛋白、肌动蛋白、GAPDH、微管蛋白、组蛋白或柠檬酸循环酶)的3'或5'序列可并入至有义mRNA核酸分子的3'和/或5'区中以增加有义mRNA分子的稳定性。参见例如US2003/0083272。
mRNA修饰的更详细描述可见于US2017/0210698A1的第57页至第68页，其内容并入本文。
模板核酸
本文公开的方法可包括使用模板核酸。模板可用于在经RNA引导的DNA切割蛋白，例如Cas核酸酶，例如第2类Cas核酸酶的目标位点处或其附近改变或插入核酸序列。在一些实施方案中，方法包括将模板引入至细胞。在一些实施方案中，可提供单一模板。在其他实施方案中，可提供两种或更多种模板以使得编辑可发生在两个或更多个目标位点处。例如，可提供不同模板以编辑细胞中的单一基因，或细胞中的两种不同基因。
在一些实施方案中，模板可用于同源重组。在一些实施方案中，同源重组可导致模板序列或模板序列的一部分整合至目标核酸分子中。在其他实施方案中，模板可用于同源定向修复，其涉及核酸中裂解位点处的DNA链入侵。在一些实施方案中，同源定向修复可导致经编辑的目标核酸分子中包括模板序列。在其他实施方案中，模板可用于由非同源末端连接介导的基因编辑。在一些实施方案中，模板序列与裂解位点附近的核酸序列不具有类似性。在一些实施方案中，并入模板或模板序列的一部分。在一些实施方案中，模板包括侧接反向末端重复(ITR)序列。
在一些实施方案中，模板可包含第一同源臂和第二同源臂(也称为第一和第二核苷酸序列)，其分别与位于裂解位点上游和下游的序列互补。当模板含有两个同源臂时，每个臂可为相同长度或不同长度，并且同源臂之间的序列可基本上类似于或等同于同源臂之间的目标序列，或者其可完全无关。在一些实施方案中，模板上的第一核苷酸序列与裂解位点上游的序列之间，和模板上的第二核苷酸序列与裂解位点下游的序列之间的互补性程度或同一性百分比可准许模板与目标核酸分子之间的同源重组，例如高保真同源重组。在一些实施方案中，互补性程度可为约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，互补性程度可为约95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，互补性程度可为至少98％、99％或100％。在一些实施方案中，互补性程度可为100％。在一些实施方案中，同一性百分比可为约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，同一性百分比可为约95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，同一性百分比可为至少98％、99％或100％。在一些实施方案中，同一性百分比可为100％。
在一些实施方案中，模板序列可对应于、包含或由目标细胞的内源序列组成。其还可或替代地对应于、包含或由目标细胞的外源序列组成。如本文所用，术语“内源序列”是指原生于细胞的序列。术语“外源序列”是指非原生于细胞的序列，或在细胞的基因组中的原生位置处于不同位置的序列。在一些实施方案中，内源序列可为细胞的基因组序列。在一些实施方案中，内源序列可为染色体或染色体外序列。在一些实施方案中，内源序列可为细胞的质粒序列。在一些实施方案中，模板序列可与裂解位点处或附近的细胞中的内源序列的一部分基本上相同，但包含至少一个核苷酸变化。在一些实施方案中，用模板编辑裂解目标核酸分子可导致包含目标核酸分子的一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代的突变。在一些实施方案中，突变可导致由包含目标序列的基因表达的蛋白质中的一个或多个氨基酸变化。
在一些实施方案中，突变可导致由目标插入位点表达的RNA中的一个或多个核苷酸变化。在一些实施方案中，突变可改变目标基因的表达水平。在一些实施方案中，突变可导致目标基因的表达增加或减少。在一些实施方案中，突变可导致基因敲低。在一些实施方案中，突变可导致基因敲除。在一些实施方案中，突变可导致恢复基因功能。在一些实施方案中，用模板编辑裂解目标核酸分子可导致目标核酸分子(例如DNA)的外显子序列、内含子序列、调控序列、转录控制序列、翻译控制序列、剪接位点或非编码序列的变化。
在其他实施方案中，模板序列可包含外源序列。在一些实施方案中，外源序列可包含编码序列。在一些实施方案中，外源序列可包含蛋白质或RNA编码序列(例如ORF)，其可操作地连接至外源启动子序列，使得当外源序列整合至目标核酸分子中时，细胞能够表达由整合序列编码的蛋白质或RNA。在其他实施方案中，当将外源序列整合至目标核酸分子中时，可通过内源启动子序列调节整合序列的表达。在一些实施方案中，外源序列可提供编码蛋白质或蛋白质的一部分的cDNA序列。在其他实施方案中，外源序列可包含或由外显子序列、内含子序列、调控序列、转录控制序列、翻译控制序列、剪接位点或非编码序列组成。在一些实施方案中，外源序列的整合可导致恢复基因功能。在一些实施方案中，外源序列的整合可导致基因敲入。在一些实施方案中，外源序列的整合可导致基因敲除。
模板可具有任何适合的长度。在一些实施方案中，模板的长度可包含10、15、20、25、50、75、100、150、200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000或更多个核苷酸。模板可为单链核酸。模板可为双链或部分双链核酸。在一些实施方案中，单链模板的长度为20、30、40、50、75、100、125、150、175或200个核苷酸。在一些实施方案中，模板可包含与包含目标序列的目标核酸分子的一部分互补的核苷酸序列(即“同源臂”)。在一些实施方案中，模板可包含与位于目标核酸分子上的裂解位点上游或下游的序列互补的同源臂。
在一些实施方案中，模板含有ssDNA或dsDNA，其含有侧接反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，模板提供为载体、质粒、微环、纳米环或PCR产物。
在一些实施方案中，核酸经纯化。在一些实施方案中，核酸是使用沉淀法(例如LiCl沉淀、酒精沉淀或等效方法，例如如本文所述)进行纯化。在一些实施方案中，核酸是使用基于色谱法的方法，例如基于HPLC的方法或等效方法(例如如本文所述)进行纯化。在一些实施方案中，核酸是使用沉淀法(例如LiCl沉淀)和基于HPLC的方法两者进行纯化。在一些实施方案中，核酸是通过切向流过滤(TFF)进行纯化。
细胞类型
在一些实施方案中，细胞为真核细胞，例如受试者的人类细胞。在一些实施方案中，细胞为例如组织、器官或生物体中的体内细胞。在一些实施方案中，细胞为体外细胞。在一些实施方案中，细胞为免疫细胞。如本文所用，“免疫细胞”是指免疫系统的细胞，包括例如淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞、自然杀手细胞(“NK细胞”和NKT细胞或iNKT细胞))、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、树突状细胞或颗粒细胞(例如，嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)。在一些实施方案中，细胞为原代免疫细胞。在一些实施方案中，免疫系统细胞可选自CD3+、CD4+和CD8+ T细胞、调控T细胞(Treg)、B细胞、NK细胞和树突状细胞(DC)。在一些实施方案中，免疫细胞为同种异体的。在一些实施方案中，所述细胞为淋巴细胞。在一些实施方案中，所述细胞为适应性免疫细胞。在一些实施方案中，所述细胞为T细胞。在一些实施方案中，所述细胞为B细胞。在一些实施方案中，所述细胞为NK细胞。
如本文所用，T细胞可定义为表达T细胞受体(“TCR”或“αβTCR”或“γδTCR”)的细胞，然而，在一些实施方案中，T细胞的TCR可经基因修饰以降低其表达(例如通过对TRAC或TRBC基因的基因修饰)，因此蛋白质CD3的表达可用作通过标准流式细胞术方法鉴定T细胞的标志物。CD3为与TCR相关的多亚基信号传导复合物。因此，T细胞可称为CD3+。在一些实施方案中，T细胞为表达CD3+标志物和CD4+或CD8+标志物的细胞。
在一些实施方案中，T细胞表达糖蛋白CD8并且因此根据标准流式细胞术方法为CD8+，并且可称为“细胞毒性”T细胞。在一些实施方案中，T细胞表达糖蛋白CD4并且因此根据标准流式细胞术方法为CD4+，并且可称为“辅助”T细胞。CD4+ T细胞可分化成亚群并且可称为Th1细胞、Th2细胞、Th9细胞、Th17细胞、Th22细胞、T调控(“Treg”)细胞或T滤泡性辅助细胞(“Tfh”)。每个CD4+亚群释放可具有促炎或消炎功能、存活或保护功能的特定细胞因子。T细胞可通过CD4+或CD8+选择方法从受试者分离。
在一些实施方案中，T细胞为记忆T细胞。在体内，记忆T细胞遇到抗原。记忆T细胞可位于次级淋巴器官(中枢记忆T细胞)或最近感染的组织(效应记忆T细胞)中。记忆T细胞可为CD8+ T细胞。记忆T细胞可为CD4+ T细胞。如本文所用，“中枢记忆T细胞”可定义为经历抗原的T细胞，并且例如可表达CD62L和CD45RO。中枢记忆T细胞可通过也表达CCR7的中枢记忆T细胞检测为CD62L+和CD45RO+，因此可通过标准流式细胞术方法检测为CCR7+。
如本文所用，“早期干细胞记忆T细胞”(或“Tscm”)可定义为表达CD27和CD45RA的T细胞，并且因此根据标准流式细胞术方法为CD27+和CD45RA+。Tscm不表达CD45同功型CD45RO，因此如果这种同功型通过标准流式细胞术方法进行染色，则Tscm将进一步为CD45RO-。因此，CD45RO-CD27+细胞也是早期干细胞记忆T细胞。Tscm细胞进一步表达CD62L和CCR7，因此可通过标准流式细胞术方法检测为CD62L+和CCR7+。已显示早期干细胞记忆T细胞与细胞疗法产品的持久性和治疗功效增加相关。
在一些实施方案中，所述细胞为B细胞。如本文所用，“B细胞”可定义为表达CD19和/或CD20，和/或B细胞成熟抗原(“BCMA”)的细胞，并且因此B细胞根据标准流式细胞术方法为CD19+，和/或CD20+，和/或BCMA+。根据标准流式细胞术方法，B细胞对于CD3和CD56进一步为阴性的。B细胞可为浆细胞。B细胞可为记忆B细胞。B细胞可为原生B细胞。B细胞可为IgM+或具有类别转换的B细胞受体(例如IgG+或IgA+)。
包括用于ACT疗法的细胞，例如间充质干细胞(例如，从骨髓(BM)、外周血(PB)、胎盘、脐带(UC)或脂肪分离)；造血干细胞(HSC；例如，从BM分离)；单核细胞(例如，从BM或PB分离)；内皮祖细胞(EPC；从BM、PB和UC分离)；神经干细胞(NSC)；角膜缘干细胞(LSC)；或组织特异性原代细胞或由其衍生的细胞(TSC)。ACT疗法中所用的细胞还包括经诱导以分化成其他细胞类型的诱导多能干细胞(iPSC)，包括例如胰岛细胞、神经元和血细胞；眼部干细胞；多能干细胞(PSC)；胚胎干细胞(ESC)；器官或组织移植细胞，例如胰岛细胞、心肌细胞、甲状腺细胞、胸腺细胞、神经元细胞、皮肤细胞、视网膜细胞、软骨细胞、肌细胞和角质细胞。
在一些实施方案中，细胞为人类细胞，例如来自受试者的细胞。在一些实施方案中，细胞从人类受试者，例如人类供体分离。在一些实施方案中，细胞从人类供体PBMC或白细胞采集物分离。在一些实施方案中，细胞来自患有疾患、病症或疾病的受试者。在一些实施方案中，细胞来自具有爱泼斯坦-巴尔病毒(“EBV”)的人类供体。
在一些实施方案中，细胞为单核细胞，例如来自骨髓或外周血。在一些实施方案中，细胞为外周血单核细胞(“PBMC”)。在一些实施方案中，细胞为PBMC，例如淋巴细胞或单核细胞。在一些实施方案中，细胞为外周血淋巴细胞(“PBL”)。
在一些实施方案中，离体进行所述方法。如本文所用，“离体”是指其中细胞能够转移至受试者中的体外方法，例如作为ACT疗法。在一些实施方案中，离体方法为涉及ACT疗法细胞或细胞群体的体外方法。
在一些实施方案中，细胞维持培养。在一些实施方案中，细胞移植至患者体内。在一些实施方案中，细胞从受试者移出，离体进行基因修饰，并且然后重新向同一患者施用。在一些实施方案中，细胞从受试者移出，离体进行基因修饰，并且然后向移出其的受试者以外的受试者施用。
在一些实施方案中，细胞来自细胞系。在一些实施方案中，细胞系来源于人类受试者。在一些实施方案中，细胞系为类淋巴母细胞细胞系(“LCL”)。细胞可经冷冻保存和解冻。细胞可先前尚未经冷冻保存。
在一些实施方案中，细胞来自细胞库。在一些实施方案中，细胞经基因修饰并且随后转移至细胞库中。在一些实施方案中，细胞从受试者移出，离体进行基因修饰，并且转移至细胞库中。在一些实施方案中，将经基因修饰的细胞群体转移至细胞库中。在一些实施方案中，将经基因修饰的免疫细胞群体转移至细胞库中。在一些实施方案中，包含第一和第二亚群的经基因修饰的免疫细胞群体转移至细胞库中，其中第一和第二亚群具有至少一个共同基因修饰和至少一个不同基因修饰。
在一些实施方案中，T细胞通过多克隆活化(或“多克隆刺激”)(非抗原特异性刺激)来活化。在一些实施方案中，T细胞通过CD3刺激(例如提供抗CD3抗体)激活。在一些实施方案中，T细胞通过CD3和CD28刺激(例如提供抗CD3抗体和抗CD28抗体)激活。在一些实施方案中，T细胞使用即用型试剂活化以激活T细胞(例如经由CD3/CD28刺激)。在一些实施方案中，T细胞经由珠粒所提供的CD3/CD28刺激激活。在一些实施方案中，T细胞通过CD3/CD28刺激激活，其中一种或多种组分可溶和/或一种或多种组分结合至固体表面(例如板或珠粒)。在一些实施方案中，T细胞通过抗原非依赖性有丝分裂原(例如凝集素，包括例如刀豆球蛋白A(“ConA”)或PHA)激活。
在一些实施方案中，一种或多种细胞因子用于活化T细胞。提供IL-2用于T细胞活化和/或促进T细胞存活。在一些实施方案中，用于活化T细胞的细胞因子是结合至共同γ链(γc)受体的细胞因子。在一些实施方案中，提供IL-2用于T细胞活化。在一些实施方案中，提供IL-7用于T细胞活化。在一些实施方案中，提供IL-15用于T细胞活化。在一些实施方案中，提供IL-21用于T细胞活化。在一些实施方案中，提供细胞因子的组合用于T细胞活化，包括例如IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21。
在一些实施方案中，T细胞通过使细胞暴露于抗原(抗原刺激)而激活。当抗原呈递为主要组织相容性复合物(“MHC”)分子中的肽(肽-MHC复合物)时，T细胞通过抗原激活。同源抗原可通过将T细胞与抗原呈递细胞(饲养细胞)和抗原共培养而呈递给T细胞。在一些实施方案中，T细胞通过与已经抗原脉冲的抗原呈递细胞共培养而激活。在一些实施方案中，抗原呈递细胞已经抗原的肽脉冲。
在一些实施方案中，T细胞可活化12至72小时。在一些实施方案中，T细胞可活化12至48小时。在一些实施方案中，T细胞可活化12至24小时。在一些实施方案中，T细胞可活化24至48小时。在一些实施方案中，T细胞可活化24至72小时。在一些实施方案中，T细胞可活化12小时。在一些实施方案中，T细胞可活化48小时。在一些实施方案中，T细胞可活化72小时。
定义
应注意，除非上下文另外明确指示，否则如本申请中所使用，单数形式“一(a/an)”和“所述”包括多个提及物。因此，例如，提及的“组合物”包括多个组合物并且提及的“细胞”包括多个细胞等等。除非另外说明，否则使用的“或”为包括性的并且意指“和/或”。
除非在上述说明书中明确指出，否则本说明书中陈述“包含”各种组分的实施方案也考虑为“由”所述组分“组成”或“基本上由”所述组分“组成”；本说明书中陈述“由”各种组分“组成”的实施方案也考虑为“包含”所述组分或“基本上由”所述组分“组成”；本说明书中陈述“约”各种组分的实施方案也考虑为“处于”所述组分；并且本说明书中陈述“基本上由”各种组分“组成”的实施方案也考虑为“由”所述组分“组成”或“包含”所述组分(这种互换性不适用于在权利要求书中使用这些术语)。
数值范围包括限定所述范围的数字。考虑到有效数字和与测量相关的误差，实测值和可测量值应理解为近似值。如本申请中所使用，术语“约”和“大约”具有本领域中所理解的含义；使用一个相较于使用另一个未必暗示不同范围。除非另外指示，否则本申请中所使用的具有或不具有修饰术语(例如“约”或“大约”)的数字应理解为涵盖如相关技术中的本领域普通技术人员将了解的正常偏差和/或波动。在某些实施方案中，除非另有说明或以其他方式从上下文显而易见，否则术语“大约”或“约”可指在所陈述参考值的任一方向上(大于或小于)处于25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或更小的值范围内(除数字将超出可能值的100％的情况外)。
如本文所用，术语“接触(contacting)”意指在两个或更多个实体之间建立物理连接。例如，使哺乳动物细胞与纳米颗粒组合物接触意指使哺乳动物细胞和纳米颗粒共享物理连接。使细胞与外部实体体内和离体接触的方法是生物学技术领域中众所周知的。例如，纳米颗粒组合物与置于哺乳动物内的哺乳动物细胞的接触可通过不同施用途径(例如静脉内、肌肉内、皮内和皮下)进行并且可涉及不同量的纳米颗粒组合物。此外，纳米颗粒组合物可接触多于一个哺乳动物细胞。
如本文所用，术语“递送”意指将实体提供至目的地。例如，将治疗药物和/或预防药物递送至受试者可涉及向受试者施用包括治疗药物和/或预防药物的纳米颗粒组合物(例如通过静脉内、肌肉内、皮内或皮下途径)。向哺乳动物或哺乳动物细胞施用纳米颗粒组合物可涉及使一个或多个细胞与纳米颗粒组合物接触。
如本文所用，“囊封效率(encapsulation efficiency)”是指相对于用于制备纳米颗粒组合物的治疗药物和/或预防药物的初始总量，成为纳米颗粒组合物的一部分的治疗药物和/或预防药物的量。例如，如果最初提供给组合物的总共100mg治疗药物和/或预防药物中，97mg治疗药物和/或预防药物囊封于纳米颗粒组合物中，则囊封效率可给定为97％。如本文所用，“囊封(encapsulation)”可指完全、实质或部分封闭、限制、围绕或包覆。
如本文所用，术语“编辑效率”、“编辑百分比”、“插入/缺失效率”和“插入/缺失百分比”是指相对于序列读段总数，具有插入或缺失的序列读段的总数。例如，基因组中的目标位置处的编辑效率可通过分离和测序基因组DNA以鉴定通过基因编辑引入的插入和缺失的存在来测量。在一些实施方案中，编辑效率是以相对于最初含有基因(例如CD3)的细胞(例如CD3+细胞)的数目而言，在治疗后不再含有所述基因的细胞的百分比形式测量。
如本文所用，“基因敲低(knockdown)”是指特定基因产物(例如蛋白质、mRNA或两者)的表达降低。蛋白质的基因敲低可通过检测来自样品，例如所关注的组织、体液或细胞群体的蛋白质的总细胞量来测量。其还可通过测量蛋白质的替代物、标志物或活性来测量。用于测量mRNA的基因敲低的方法为已知的，并且包括对从所关注的样品分离的mRNA进行测序。在一些实施方案中，“基因敲低”可指一些特定基因产物的表达缺失，例如经转录的mRNA的量下降或由细胞群体(包括体内群体，例如组织中所发现的那些)表达的蛋白质的量下降。
如本文所用，“基因敲除(knockout)”是指细胞中的特定基因或特定蛋白质的表达缺失。基因敲除可通过检测例如细胞、组织或细胞群体中蛋白质的总细胞量来测量。例如，还可以基因组或mRNA水平检测基因敲除。
如本文所用，术语“可生物降解”用于指在引入细胞中时通过细胞机制(例如酶促降解)或通过水解而分解为使细胞可再次使用或处置而对细胞无显著毒性作用的组分的材料。在某些实施方案中，由可生物降解材料分解产生的组分在体内不诱导炎症和/或其他不良作用。在一些实施方案中，可生物降解材料以酶促方式分解。或者或另外，在一些实施方案中，可生物降解材料通过水解分解。
如本文所用，“N/P比率”是例如包括脂质组分和RNA的纳米颗粒组合物中的含可离子化氮原子的脂质(例如式I化合物)与RNA中磷酸酯基的摩尔比。
组合物还可包括一种或多种化合物的盐。盐可为药学上可接受的盐。如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开的化合物的衍生物，其中通过将现有酸或碱部分转化为其盐形式(例如通过使游离碱基与适合有机酸反应)来改变母体化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基(例如胺)的无机酸盐或有机酸盐；酸性残基(例如羧酸)的碱金属盐或有机盐；等等。代表性酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、反丁烯二酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙烷磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、顺丁烯二酸盐、丙二酸盐、甲烷磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟碱酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、丁二酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。代表性碱金属盐或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等，以及无毒性铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。本公开的药学上可接受的盐包括例如由无毒无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐。本公开的药学上可接受的盐可通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，此类盐可通过使游离酸或碱形式的这些化合物与化学计算量的适当碱或酸于水中或于有机溶剂中或于两者的混合物中反应来制备；通常，非水性介质如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是优选的。适合的盐的列表见于Remington'sPharmaceutical Sciences,第17版,Mack PublishingCompany,Easton,Pa.,1985,第1418页；Pharmaceutical Salts:Properties,Selection,and Use,P.H.Stahl和C.G.Wermuth(编),Wiley-VCH,2008；和Berge等人,Journal ofPharmaceutical Science,66,1-19(1977)，所述文献中的每一者均通过引用整体并入本文。
如本文所用，“多分散性指数”是描述系统的粒度分布的均匀性的比率。例如小于0.3的较小值指示窄粒度分布。在一些实施方案中，多分散性指数可小于0.1。
如本文所用，“转染”是指将物种(例如RNA)引入细胞中。转染可例如在体外、离体或体内发生。
如本文所用的术语“烷基”是具有1至24个碳原子的支链或无支链饱和烃基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、仲戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、二十烷基、二十四烷基等。烷基可为环状或非环状的。烷基可为支链或无支链(即直链)。烷基还可被取代或未被取代。例如，烷基可被一个或多个包括(但不限于)以下的基团取代：烷基、芳基、杂芳基、环烷基、烷氧基、氨基、醚、卤基、羟基、硝基、甲硅烷基、硫氧代基(sulfoxo)、磺酸酯、羧酸酯或硫醇，如本文所描述。“低级烷基”基团是含有一至六个(例如一至四个)碳原子的烷基。
如本文所用，术语“烯基”是指含有至少一个碳碳双键的脂族基并且旨在包括“未被取代的烯基”与“被取代的烯基”两者，后者是指烯基的一个或多个碳上的氢被取代基置换的烯基部分。此类取代基可存在于一个或多个包括或不包括于一个或多个双键中的碳上。此外，此类取代基包括如下文所论述的所有对于烷基所涵盖的取代基，除非稳定性不允许。例如，涵盖烯基可被一个或多个烷基、碳环基、芳基、杂环基或杂芳基取代。示例性烯基包括(但不限于)乙烯基(-CH＝CH2)、烯丙基(-CH2CH＝CH2)、环戊烯基(-C5H7)和5-己烯基(-CH2CH2CH2CH2CH＝CH2)。
“亚烷基”基团是指二价烷基，其可为支链或无支链(即直链)。以上提及的单价烷基中的任一者可通过从烷基提取第二氢原子而转化为亚烷基。代表性亚烷基包括C2-4亚烷基和C2-3亚烷基。典型的亚烷基包括(但不限于)-CH(CH3)-、-C(CH3)2-、-CH2CH2-、-CH2CH(CH3)-、-CH2C(CH3)2-、-CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-等。亚烷基还可被取代或未被取代。例如，亚烷基可被一个或多个包括(但不限于)以下的基团取代：烷基、芳基、杂芳基、环烷基、烷氧基、氨基、醚、卤基、羟基、硝基、甲硅烷基、硫氧代基、磺酸酯、羧酸酯或硫醇，如本文所描述。
术语“亚烯基”包括具有至少一个碳碳双键的二价、直链或支链、不饱和、非环状烃基，并且在一个实施方案中，无碳碳三键。以上提及的单价烯基中的任一者可通过从烯基提取第二氢原子而转化为亚烯基。代表性亚烯基包括C2-6亚烯基。
术语“Cx-y”当与例如烷基或亚烷基的化学部分结合使用时意在包括链中含有x至y个碳的基团。例如，术语“Cx-y烷基”是指被取代或未被取代的饱和烃基，包括在链中含有x至y个碳的直链和支链烷基和亚烷基。
术语“烷氧基”是指与氧连接的烷基、优选低级烷基。代表性烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。
虽然本发明结合所说明的实施方案描述，但应理解其不旨在将本发明限于那些实施方案。相反，本公开旨在涵盖所有替代方案、修改和等同物，包括特定特征的等同物，其可包括在如通过所附权利要求所限定的本发明内。
前述一般描述和详细描述，以及下述实施例均仅为示例性和解释性的并且不限制教导内容。本文所用的章节标题仅出于组织目的而不应解释为以任何方式限制所需主题。在通过引用并入的任何文献与本说明书中定义的任何术语矛盾的情况下，以本说明书为准。除非另外陈述，否则本申请中给出的所有范围涵盖端点。
通过引用并入
文章、专利和专利申请的内容和本文中提及或引用的所有其他文件和电子可用信息特此通过引用整体并入，其引用的程度如同每个个别公开具体且个别地指示为通过引用并入一般。申请人保留将来自任何此类文章、专利、专利申请或其他实体和电子文献的任何和所有材料和信息实际上并入本申请中的权利。
实施例
实施例1-材料和方法
1.1.T细胞培养基制备。
此处描述下文使用的T细胞培养基组合物。“X-VIVO基础培养基”由X-VIVOTM 15培养基、1％ Penstrep、50μMβ-巯基乙醇、10mM NAC组成。除上文所提及的组分以外，使用的其他可变培养基组分为：1.血清(胎牛血清(FBS))；和2.细胞因子(IL-2、IL-7、IL-15)。
1.2.T细胞制备
健康人类供体白细胞分离术是商业获得的(Hemacare)。通过负向选择使用EasySep人类T细胞分离试剂盒(Stem Cell Technology，目录号17951)或通过CD4/CD8正向选择使用CD4/CD8微珠(Miltenyi，目录号130-122-352)在MultiMACSTM Cell24Separator Plus仪器上遵循制造商的说明分离T细胞。将T细胞冷冻保存于Cryostor CS10冷冻培养基(目录号07930)中供将来使用。
解冻后，将T细胞培养在由以下构成的完全T细胞生长培养基中：CTS OpTmizer基础培养基(补充有1X GlutaMAX、10mM HEPES缓冲液(10mM)和1％青霉素-链霉素(Gibco，15140-122)，进一步补充有200IU/mL IL-2(Peprotech，200-02)、5ng/ml IL-7(Peprotech，200-07)、5ng/mL IL-15(Peprotech，200-15)和2.5％人类血清(Gemini，100-512)的CTSOpTmizer培养基(Gibco，A3705001))。在过夜静置后，将密度为106/mL的T细胞用T细胞TransAct试剂(1:100稀释，Miltenyi)活化并且在37℃下温育24或48小时。温育后，将密度为0.5x106/mL的细胞用于编辑应用。
除非另有指示，否则相同过程用于非活化T细胞，但有以下例外。解冻后，将非活化T细胞培养在由以下构成的CTS完全生长培养基中：CTS OpTmizer基础培养基(Thermofisher，A10485-01)、1％青霉素-链霉素(Corning，30-002-CI)、1X GlutaMAX(Thermofisher，35050061)、10mM HEPES(Thermofisher，15630080))，其进一步补充有200IU/mL IL-2(Peprotech，200-02)、5ng/ml IL-7(Peprotech，200-07)、5ng/mL IL-15(Peprotech，200-15)与5％人类AB血清(Gemini，100-512)，在无活化情况下温育24小时。将T细胞以106/mL的细胞密度接种于100uL的上文所述的含有2.5％人类血清和细胞因子的CTS OpTmizer基础培养基中以用于编辑应用。
1.3.制备脂质纳米颗粒。
除非另外规定，否则以各种摩尔比将脂质组分溶解于100％乙醇中。将RNA货物(例如Cas9 mRNA和sgRNA)溶解于25mM柠檬酸盐、100mM NaCl(pH 5.0)中，产生大约0.45mg/mL的RNA货物浓度。
除非另外规定，否则LNP含有分别为50:38:9:3摩尔比的可离子化脂质A(十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，也称为(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯)、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG。除非另外规定，否则脂质核酸组装体用约6的脂质胺与RNA磷酸酯(N:P)摩尔比和按重量计1:1的gRNA与mRNA的比配制。除非另外规定，否则在实施例13-16中，使用按重量计1:2的gRNA与mRNA的比。
使用交叉流技术，利用含脂质的乙醇与两个体积的RNA溶液和一个体积的水的冲击射流混合来制备脂质纳米颗粒(LNP)。经由混合交叉使含脂质的乙醇与两个体积的RNA溶液混合。经由线内T形件将第四水流与十字管的输出流混合(参见WO2016010840，图2)。将LNP在室温(RT)下保持1小时，并且进一步用水稀释(大约1:1v/v)。使用切向流过滤在例如平板滤筒(Sartorius，100kD MWCO)上浓缩LNP，并且使用PD-10脱盐柱(GE)将其缓冲液交换至50mM Tris、45mM NaCl、5％(w/v)蔗糖，pH 7.5(TSS)中。或者，任选地使用100kDa Amicon旋转过滤器浓缩LNP，并且使用PD-10脱盐柱(GE)将其缓冲液交换至TSS中。然后使用0.2μm无菌过滤器过滤所得混合物。将最终LNP储存在4℃或-80℃下直至进一步使用。
1.4.下一代测序(“NGS”)和中靶裂解效率分析
使用QuickExtractTM DNA提取溶液(Lucigen，目录号QE09050)根据制造商的方案提取基因组DNA。
为了定量地测定基因组中的目标位置处的编辑效率，下一代测序用于鉴定通过基因编辑引入的插入和缺失的存在。PCR引物设计于所关注基因(例如TRAC)内的目标位点周围，并且将所关注基因组区扩增。按本领域中的标准进行引物序列设计。
根据制造商的方案(Illumina)执行额外PCR以添加化学物质以进行测序。扩增子在Illumina MiSeq仪器上测序。在消除具有低质量评分的读段之后，将读段与人类(例如，hg38)参考基因组比对。将含有所述读段的所得文件映射至参考基因组(BAM文件)，其中选择重叠所关注的目标区域的读段，并且计算野生型读段的数目相对于含有插入或缺失(“插入/缺失”)的读段的数目。
编辑百分比(例如“编辑效率”或“编辑％”)定义为具有插入或缺失(“插入/缺失”)的序列读段的总数目除以包括野生型的序列读段的总数目。
1.5.核酸酶mRNA的体外转录(“IVT”)
含有N1-甲基假-U的经封端和聚腺苷酸化mRNA是通过使用线性化质粒DNA模板和T7 RNA聚合酶的体外转录产生。通过在以下条件下与XbaI一起在37℃下温育2小时来线性化含有T7启动子、转录序列和聚腺苷酸化区域的质粒DNA：200ng/μL质粒、2U/μLXbaI(NEB)和1x反应缓冲液。通过在65℃下加热反应物20分钟来使XbaI不活化。由酶和缓冲液盐纯化线性化质粒。用于产生经修饰mRNA的IVT反应是通过在37℃下在以下条件下温育1.5-4小时来进行：50ng/μL线性化质粒；各2-5mM的GTP、ATP、CTP和N1-甲基假-UTP(Trilink)；10-25mMARCA(Trilink)；5U/μL T7 RNA聚合酶(NEB)；1U/μL鼠类核糖核酸酶抑制剂(NEB)；0.004U/μL无机大肠杆菌焦磷酸酶(NEB)；和1x反应缓冲液。添加TURBO脱氧核糖核酸酶(ThermoFisher)，至0.01U/μL的最终浓度，并且将反应物再温育30分钟以去除DNA模板。根据制造商的方案使用MegaClear Transcription Clean-up试剂盒(ThermoFisher)或RNeasy Maxi试剂盒(Qiagen)纯化mRNA。
或者，经由沉淀方案(在一些情况下，其后接着基于HPLC的纯化)来纯化mRNA。简而言之，在脱氧核糖核酸酶消化后，使用LiCl沉淀、乙酸铵沉淀和乙酸钠沉淀来纯化mRNA。对于经HPLC纯化的mRNA而言，在LiCl沉淀和重构之后，通过RP-IP HPLC纯化mRNA(参见例如Kariko等人,Nucleic Acids Research,2011,第39卷,第21期e142)。合并选择用于汇集的洗脱份并且通过如上文所描述的乙酸钠/乙醇沉淀来脱盐。在另一替代方法中，mRNA用LiCl沉淀法纯化，接着通过切向流过滤进一步纯化。通过测量260nm处的吸光度(Nanodrop)测定RNA浓度，并且通过毛细电泳法用Bioanlayzer(Agilent)来分析转录物。
从编码根据SEQ ID NO:9-10的开放阅读框(参见额外序列表中的序列)的质粒DNA生成化脓性链球菌(“Spy”)Cas9 mRNA。当本段中引用的序列在下文中针对RNA提及时，应理解，T应替换为U(其可为如上文所述的经修饰的核苷)。实施例中所用的信使RNA包括5'帽和3'聚腺苷酸化序列，例如至多100nt，并且在额外序列表中鉴定。
引导RNA通过本领域中已知的方法以化学方式合成。
化合物合成
一般信息
所有试剂和溶剂是从商业供应商购买并且按原样使用或根据所引用的程序合成。所有中间体和最终化合物都使用硅胶快速柱色谱法来纯化。在Bruker或Varian 400MHz光谱仪上记录NMR光谱，并且在环境温度下在CDCl3中收集NMR数据。化学位移是相对于CDCl3(7.26)以百万分率(ppm)报告。1H NMR的数据报告如下：化学位移、多重性(br＝宽峰，s＝单峰，d＝二重峰，t＝三重峰，q＝四重峰，dd＝双重二重峰，dt＝双重三重峰，m＝多重峰)、偶合常数和积分。MS数据记录在具有电喷雾电离(ESI)源的Waters SQD2质谱仪上。最终化合物的纯度是由UPLC-MS-ELS，使用配备有SQD2质谱仪的Waters Acquity H-Class液相色谱法仪器测定，所述SQD2质谱仪具有光电二极管阵列(PDA)和蒸发光散射(ELS)检测器。
表1.DNA PK抑制剂化合物
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实施例2-化合物1
中间体1a：(E)-N,N-二甲基-N'-(4-甲基-5-硝基吡啶-2-基)甲脒
向4-甲基-5-硝基-吡啶-2-胺(5g，1.0当量)于甲苯(0.3M)中的溶液中添加DMF-DMA(3.0当量)。在110℃下搅拌混合物2h。在减压下浓缩反应混合物，得到残余物，并且通过柱色谱法纯化，得到呈黄色固体状的产物(59％)。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ8.82(s,1H),8.63(s,1H),6.74(s,1H),3.21(m,6H)。
中间体1b：(E)-N-羟基-N'-(4-甲基-5-硝基吡啶-2-基)甲脒
向中间体1a(4g，1.0当量)于MeOH(0.2M)中的溶液中添加NH2OH HCl(2.0当量)。在80℃下搅拌反应混合物1h。过滤反应混合物，并且在减压下浓缩滤液，得到残余物。将残余物分配于H2O与EtOAc之间，然后用EtOAc萃取2次。在减压下浓缩有机相，得到残余物，并且通过柱色谱法纯化，得到呈白色固体状的产物(66％)。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ10.52(d,J＝3.8Hz,1H),10.08(dd,J＝9.9,3.7Hz,1H),8.84(d,J＝3.8Hz,1H),7.85(dd,J＝9.7,3.8Hz,1H),7.01(d,J＝3.9Hz,1H),3.36(s,3H)。
中间体1c：7-甲基-6-硝基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶
在0℃下向中间体1b(2.5g，1.0当量)于THF(0.4M)中的溶液中添加三氟乙酸酐(1.0当量)。在25℃下搅拌混合物18h。过滤反应混合物，并且在减压下浓缩滤液，得到残余物。通过柱色谱法纯化残余物，得到呈白色固体状的产物(44％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.53(s,1H),8.49(s,1H),7.69(s,1H),2.78(d,J＝1.0Hz,3H)。
中间体1d：7-甲基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-胺
向Pd/C(10％w/w，0.2当量)于EtOH(0.1M)中的混合物中添加中间体1c(1.0当量)和甲酸铵(5.0当量)。在105℃下加热混合物2h。过滤反应混合物，并且在减压下浓缩滤液，得到残余物。通过柱色谱法纯化残余物，得到呈淡棕色固体状的产物。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ8.41(s,2H),8.07(d,J＝9.0Hz,2H),7.43(s,1H),2.22(s,3H)。
中间体1e：2-氯-4-((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)嘧啶-5-甲酸乙酯
向四氢吡喃-4-胺(5g，1.0当量)和2,4-二氯嘧啶-5-甲酸乙酯(1.0当量)于MeCN(0.25-2.0M)中的溶液中添加K2CO3(1.0-3.0当量)。在20-25℃下搅拌混合物至少12h。过滤反应混合物，并且在减压下浓缩滤液，得到残余物。通过柱色谱法纯化残余物，得到呈淡黄色固体状的产物(21％)。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ8.60(s,1H),8.29(d,J＝7.7Hz,1H),4.28(q,J＝7.1Hz,2H),4.14(dtt,J＝11.3,8.3,4.0Hz,1H),3.82(dt,J＝12.1,3.6Hz,2H),3.57(s,1H),1.87-1.78(m,2H),1.76-1.67(m,1H),1.54(qd,J＝10.9,4.3Hz,2H),1.28(t,J＝7.1Hz,3H)。
中间体1f：2-氯-4-((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)嘧啶-5-甲酸
向LiOH(2.5当量)于1:1THF/H2O(0.25-1.0M)中的溶液中添加中间体1e(3.0g，1.0当量)。在25℃下搅拌混合物12h。在减压下浓缩混合物以去除THF。通过2M HCl将残余物调节至pH 2，并且通过过滤收集所得沉淀物，用水洗涤，并且在真空下干燥，得到残余物。通过柱色谱法纯化残余物，得到呈白色固体状的产物(74％)或直接用作粗产物。
中间体1g：2-氯-9-(四氢-2H-吡喃-4-基)-7,9-二氢-8H-嘌呤-8-酮
向中间体1f(2g，1.0当量)于MeCN(0.2-0.5M)中的溶液中添加Et3N(1.0当量)。在25℃下搅拌混合物30min。然后向混合物中添加DPPA(1.0当量)。在100℃下搅拌混合物至少7h。将反应混合物倒入水中，并且通过过滤收集所得沉淀物，用水洗涤，并且在真空下干燥，得到残余物。通过柱色谱法纯化残余物，得到呈白色固体状的产物(56％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.50(s,1H),8.09(s,1H),4.53(tt,J＝12.4,4.2Hz,1H),4.07(dt,J＝9.5,4.8Hz,2H),3.48(td,J＝12.1,1.9Hz,2H),2.69(qd,J＝12.5,4.7Hz,2H),1.67(dd,J＝12.1,3.9Hz,2H)。
中间体1h：2-氯-7-甲基-9-(四氢-2H-吡喃-4-基)-7,9-二氢-8H-嘌呤-8-酮
向中间体1g(300mg，1.0当量)和NaOH(5.0当量)于1:1THF/H2O(0.25-1.0M)中的混合物中添加碘甲烷(2.0当量)。在25℃下搅拌反应混合物12h。在减压下浓缩反应混合物，得到残余物，并且通过柱色谱法纯化，得到呈白色固体状的产物(47％)。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ8.34(s,1H),4.43(ddt,J＝12.2,8.5,4.2Hz,1H),3.95(dd,J＝11.5,4.6Hz,2H),3.43(td,J＝12.1,1.9Hz,2H),2.45(s,3H),2.40(td,J＝12.5,4.7Hz,2H),1.66(ddd,J＝12.2,4.4,1.9Hz,2H)。
化合物1：7-甲基-2-((7-甲基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)氨基)-9-(四氢-2H-吡喃-4-基)-7,9-二氢-8H-嘌呤-8-酮
将中间体1h(1.3g，1.0当量)、中间体1d(1.0当量)、Pd(dppf)Cl2(0.1-0.2当量)、XantPhos(0.1-0.2当量)和Cs2CO3(2.0当量)于DMF(0.05-0.3M)中的混合物脱气并且用N2吹扫3次并且在100-130℃下在N2气氛下搅拌混合物至少12h。然后将反应混合物倒入水中并用DCM萃取3次。将合并的有机相用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中浓缩滤液。通过柱色谱法纯化残余物，得到呈淡黄色固体状的产物。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ9.13(s,1H),8.69(s,1H),8.39(s,1H),8.10(s,1H),7.72(s,1H),4.50-4.36(m,1H),3.98(dd,J＝11.6,4.4Hz,2H),3.44(d,J＝11.9Hz,2H),3.32(s,3H),2.44-2.38(m,3H),1.69(d,J＝11.6Hz,2H)。MS:381.3m/z[M+H]。
实施例3-化合物2
中间体2a：2-氯-7-乙基-9-(四氢-2H-吡喃-4-基)-7,9-二氢-8H-嘌呤-8-酮
向中间体1h(800mg，1.0当量)和NaOH(5.0当量)于THF(0.4M)和H2O(0.8M)中的混合物中添加EtI(3.0当量)。在20℃下搅拌反应混合物12h。在减压下浓缩反应混合物，得到残余物，并且通过柱色谱法纯化，得到呈白色固体状的产物(45％)。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ8.50(s,1H),4.52(tt,J＝12.2,4.2Hz,1H),4.03(dd,J＝11.5,4.6Hz,2H),3.95(q,J＝7.2Hz,2H),3.51(td,J＝12.1,1.9Hz,2H),2.48(td,J＝12.5,4.7Hz,2H),1.79-1.71(m,2H),1.31(t,J＝7.2Hz,3H)。
化合物2：7-乙基-2-((7-甲基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)氨基)-9-(四氢-2H-吡喃-4-基)-7,9-二氢-8H-嘌呤-8-酮
使用化合物1所用的方法由中间体1d和中间体2a合成呈TFA盐形式的化合物2，接着通过反相HPLC纯化。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ9.11(s,1H),8.69(s,1H),8.38(s,1H),8.15(s,1H),7.71(t,J＝1.0Hz,1H),4.42(ddd,J＝12.1,7.9,4.1Hz,1H),3.96(dd,J＝11.7,4.4Hz,2H),3.83(q,J＝7.2Hz,2H),3.41(t,J＝11.9Hz,2H),2.40(d,J＝1.0Hz,3H),1.68(d,J＝11.0Hz,2H),1.23(t,J＝7.2Hz,3H)。MS:395.3m/z[M+H]。
实施例4-化合物3
中间体3a：2-氯-4-((4,4-二氟环己基)氨基)嘧啶-5-甲酸乙酯
中间体3a是使用中间体1e中所用的方法由2,4-二氯嘧啶-5-甲酸乙酯和4,4-二氟环己胺盐酸盐合成。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ8.61(s,1H),8.30(d,J＝7.7Hz,1H),4.29(q,J＝7.1Hz,2H),4.19-4.09(m,1H),2.09-1.90(m,6H),1.69-1.58(m,2H),1.29(t,J＝7.1Hz,3H)。
中间体3b：2-氯-4-((4,4-二氟环己基)氨基)嘧啶-5-甲酸
中间体3b是使用中间体1f中所用的方法由中间体3a合成(78％)。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ13.77(s,1H),8.57(s,1H),8.53(d,J＝7.8Hz,1H),4.12(d,J＝10.2Hz,1H),2.14-1.89(m,6H),1.62(ddt,J＝17.0,10.3,6.0Hz,2H)。
中间体3c：2-氯-9-(4,4-二氟环己基)-7,9-二氢-8H-嘌呤-8-酮
中间体3c是使用中间体1g中所用的方法由中间体3b合成(56％)。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ11.76-11.65(m,1H),8.20(s,1H),4.47(dq,J＝12.6,6.2,4.3Hz,1H),2.34-1.97(m,6H),1.90(d,J＝12.9Hz,2H)。
中间体3d：2-氯-9-(4,4-二氟环己基)-7-甲基-7,9-二氢-8H-嘌呤-8-酮
向中间体3c(1.4g，1.0当量)、NaOH(5.0当量)于5:1THF/H2O(0.3M)中的混合物中添加MeI(2.0当量)。在N2气氛下在20℃下搅拌混合物12h。在减压下浓缩反应混合物，得到残余物，并且通过柱色谱法纯化，得到呈黄色固体状的产物(47％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.01(s,1H),4.53-4.39(m,1H),3.43(s,3H),2.73(qd,J＝12.7,12.1,3.8Hz,2H),2.32-2.20(m,2H),2.03-1.82(m,4H)。
化合物3：9-(4,4-二氟环己基)-7-甲基-2-((7-甲基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)氨基)-7,9-二氢-8H-嘌呤-8-酮
使用化合物1所用的方法由中间体1d和中间体3d合成化合物3，接着通过反相HPLC纯化。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ9.03(s,1H),8.66(s,1H),8.38(s,1H),8.10(s,1H),7.71(d,J＝1.4Hz,1H),4.36(d,J＝12.3Hz,1H),3.31(s,3H),2.38(d,J＝1.0Hz,3H),2.11-1.96(m,4H),1.81(d,J＝12.6Hz,2H)。MS:415.5m/z[M+H]。
实施例5-化合物4
中间体4a：8-亚甲基-1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷
在-78℃下向溴化甲基(三苯基)鏻(1.15当量)于THF(0.6M)中的溶液中滴加n-BuLi(1.1当量)，并且在0℃下搅拌混合物1h。然后，将1,4-二氧杂螺[4.5]癸-8-酮(50g，1.0当量)添加至反应混合物。在25℃下搅拌混合物12h。在0℃下将反应混合物倒入NH4Cl水溶液中，用H2O稀释并用EtOAc萃取3次。在减压下浓缩合并的有机层，得到残余物，并且通过柱色谱法纯化，得到呈无色油状物的产物(51％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.67(s,1H),3.96(s,4H),2.82(t,J＝6.4Hz,4H),1.70(t,J＝6.4Hz,4H)。
中间体4b：7,10-二氧杂二螺[2.2.46.23]十二烷
在-40℃下向中间体4a(5g，1.0当量)于甲苯(3M)中的溶液中滴加ZnEt2(2.57当量)并且在-40℃下搅拌混合物1h。然后在-40℃下在N2下将二碘甲烷(6.0当量)滴加至混合物中。然后在N2气氛下在20℃下搅拌混合物17h。在0℃下将反应混合物倒入NH4Cl水溶液中并用EtOAc萃取2次。将合并的有机相用盐水(20mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中浓缩滤液。通过柱色谱法纯化残余物，得到呈淡黄色油状物的产物(73％)。
中间体4c：螺[2.5]辛-6-酮
向中间体4b(4g，1.0当量)于1:1THF/H2O(1.0M)中的溶液中添加TFA(3.0当量)。将混合物在20℃下在N2气氛下搅拌2h。在减压下浓缩反应混合物以去除THF，并且用2M NaOH(水溶液)将残余物调节至pH 7。将混合物倒入水中并用EtOAc萃取3次。将合并的有机相用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中浓缩滤液。通过柱色谱法纯化残余物，得到呈淡黄色油状物的产物(68％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ2.35(t,J＝6.6Hz,4H),1.62(t,J＝6.6Hz,4H),0.42(s,4H)。
中间体4d：N-(4-甲氧基苯甲基)螺[2.5]辛-6-胺
向中间体4c(2g，1.0当量)和(4-甲氧基苯基)甲胺(1.1当量)于DCM(0.3M)中的混合物中添加AcOH(1.3当量)。将混合物在20℃下在N2气氛下搅拌1h。然后，在0℃下向混合物中添加NaBH(OAc)3(3.3当量)，并且在20℃下在N2气氛下搅拌混合物17h。在减压下浓缩反应混合物以去除DCM，并且将所得残余物用H2O稀释并用EtOAc萃取3次。将经合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并且在减压下浓缩滤液，得到残余物。通过柱色谱法纯化残余物，得到呈灰色固体状的产物(51％)。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ7.15-7.07(m,2H),6.77-6.68(m,2H),3.58(s,3H),3.54(s,2H),2.30(ddt,J＝10.1,7.3,3.7Hz,1H),1.69-1.62(m,2H),1.37(td,J＝12.6,3.5Hz,2H),1.12-1.02(m,2H),0.87-0.78(m,2H),0.13-0.04(m,2H)。
中间体4e：螺[2.5]辛-6-胺
向Pd/C(10％w/w，1.0当量)于MeOH(0.25M)中的悬浮液中添加中间体4d(2g，1.0当量)并且在80℃下在50Psi下在H2气氛下搅拌混合物24h。过滤反应混合物，并且在减压下浓缩滤液，得到残余物，其通过柱色谱法进行纯化，得到呈白色固体状的产物。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ2.61(tt,J＝10.8,3.9Hz,1H),1.63(ddd,J＝9.6,5.1,2.2Hz,2H),1.47(td,J＝12.8,3.5Hz,2H),1.21-1.06(m,2H),0.82-0.72(m,2H),0.14-0.05(m,2H)。
中间体4f：2-氯-4-(螺[2.5]辛-6-基氨基)嘧啶-5-甲酸乙酯
中间体4f是使用中间体1e中所用的方法由中间体4e合成(54％)。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ8.64(s,1H),8.41(d,J＝7.9Hz,1H),4.33(q,J＝7.1Hz,2H),4.08(d,J＝9.8Hz,1H),1.90(dd,J＝12.7,4.8Hz,2H),1.64(t,J＝12.3Hz,2H),1.52(q,J＝10.7,9.1Hz,2H),1.33(t,J＝7.1Hz,3H),1.12(d,J＝13.0Hz,2H),0.40-0.21(m,4H)。
中间体4g：2-氯-4-(螺[2.5]辛-6-基氨基)嘧啶-5-甲酸
中间体4g是使用中间体1f中所用的方法由中间体4f合成(82％)。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ13.54(s,1H),8.38(d,J＝8.0Hz,1H),8.35(s,1H),3.82(qt,J＝8.2,3.7Hz,1H),1.66(dq,J＝12.8,4.1Hz,2H),1.47-1.34(m,2H),1.33-1.20(m,2H),0.86(dt,J＝13.6,4.2Hz,2H),0.08(dd,J＝8.3,4.8Hz,4H)。
中间体4h：2-氯-9-(螺[2.5]辛-6-基)-7,9-二氢-8H-嘌呤-8-酮
中间体4h是使用中间体1g中所用的方法由中间体4g合成(67％)。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ11.68(s,1H),8.18(s,1H),4.26(ddt,J＝12.3,7.5,3.7Hz,1H),2.42(qd,J＝12.6,3.7Hz,2H),1.95(td,J＝13.3,3.5Hz,2H),1.82-1.69(m,2H),1.08-0.95(m,2H),0.39(tdq,J＝11.6,8.7,4.2,3.5Hz,4H)。
中间体4i：2-氯-7-甲基-9-(螺[2.5]辛-6-基)-7,9-二氢-8H-嘌呤-8-酮
中间体4i是使用中间体1h中所用的方法由中间体4h合成(67％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.57(s,1H),4.03(tt,J＝12.5,3.9Hz,1H),3.03(s,3H),2.17(qd,J＝12.6,3.8Hz,2H),1.60(td,J＝13.4,3.6Hz,2H),1.47-1.34(m,2H),1.07(s,1H),0.63(dp,J＝14.0,2.5Hz,2H),-0.05(s,4H)。
化合物4：7-甲基-2-((7-甲基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)氨基)-9-(螺[2.5]辛-6-基)-7,9-二氢-8H-嘌呤-8-酮
化合物4是使用化合物1中所用的方法由中间体4i和中间体1d合成。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ9.09(s,1H),8.73(s,1H),8.44(s,1H),8.16(s,1H),7.78(s,1H),4.21(t,J＝12.5Hz,1H),3.36(s,3H),2.43(s,3H),2.34(dt,J＝13.0,6.5Hz,2H),1.93-1.77(m,2H),1.77-1.62(m,2H),0.91(d,J＝13.2Hz,2H),0.31(t,J＝7.1Hz,2H)。MS:405.5m/z[M+H]。
实施例6-化合物5
中间体5a：2-氯-4-((3-羟基环丁基)氨基)嘧啶-5-甲酸乙酯
中间体5a是使用中间体1e中所用的方法由3-氨基环丁醇合成(49％)。1H NMR(400MHz，(CD3)2SO，旋转异构体的混合物)δ8.62(s,1H),8.45(dd,J＝25.7,7.1Hz,1H),5.17(dd,J＝6.0,2.7Hz,1H),4.32(q,J＝7.1Hz,2H),3.96(dp,J＝50.4,7.2Hz,2H),2.67(ddd,J＝11.6,5.8,2.8Hz,1H),2.25(td,J＝8.1,7.0,4.0Hz,1H),1.85(qd,J＝8.7,2.8Hz,1H),1.32(t,J＝7.1Hz,3H)。
中间体5b：2-氯-4-((3-羟基环丁基)氨基)嘧啶-5-甲酸
中间体5b是使用中间体1f中所用的方法由中间体5a合成(67％)。1H NMR(400MHz，(CD3)2SO，旋转异构体的混合物)δ13.82(s,1H),8.70(dd,J＝25.0,7.1Hz,1H),8.63(s,1H),4.65-4.29(m,1H),4.17-4.02(m,1H),3.95(p,J＝7.2Hz,1H),2.74(dh,J＝11.8,3.1Hz,2H),2.30(t,J＝6.2Hz,1H),1.88(qd,J＝8.5,2.8Hz,1H)。
中间体5c：2-氯-9-(3-羟基环丁基)-7,9-二氢-8H-嘌呤-8-酮
中间体5c是使用中间体1g中所用的方法由中间体5b合成。1HNMR(400MHz，(CD3)2SO，旋转异构体的混合物)δ8.12(d,J＝1.7Hz,1H),7.29-7.13(m,1H),4.26(tt,J＝9.8,7.5Hz,1H),4.00-3.87(m,1H),2.78(dtd,J＝9.9,8.1,2.8Hz,2H),2.59-2.52(m,2H)。
中间体5d：2-氯-9-(3-羟基环丁基)-7-甲基-7,9-二氢-8H-嘌呤-8-酮
中间体5d是使用中间体1h中所用的方法由中间体5c合成(61％)。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ8.32(d,J＝2.4Hz,1H),4.26(tt,J＝9.8,7.5Hz,1H),3.98-3.85(m,1H),3.31(d,J＝2.4Hz,3H),2.81-2.65(m,2H),2.53(ddt,J＝7.5,4.1,2.0Hz,2H)。
化合物5：9-(3-羟基环丁基)-7-甲基-2-((7-甲基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)氨基)-7,9-二氢-8H-嘌呤-8-酮
化合物5是使用化合物1中所用的方法由中间体5d和中间体1d合成。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ9.15(s,1H),8.61(s,1H),8.38(s,1H),8.10(s,1H),7.72(s,1H),5.15(d,J＝6.1Hz,1H),4.26-4.17(m,1H),3.94(hept,J＝6.8Hz,1H),3.30(s,3H),2.78(qd,J＝8.3,2.6Hz,2H),2.61-2.54(m,2H),2.41-2.39(m,3H)。MS:367.4m/z[M+H]。
实施例7-化合物6
中间体6a：6-氯-4-((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)烟碱酸乙酯
中间体6a是使用中间体1e中所用的方法由4,6-二氯吡啶-3-甲酸酯和四氢吡喃-4-胺合成(46％)。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ8.61(s,1H),8.13(d,J＝7.9Hz,1H),7.05(s,1H),4.36(q,J＝7.1Hz,2H),3.90(dt,J＝11.7,3.8Hz,3H),3.54(td,J＝11.4,2.2Hz,2H),1.96(dd,J＝12.6,3.6Hz,2H),1.52(dtd,J＝12.7,10.6,4.3Hz,2H),1.38(t,J＝7.1Hz,3H)。
中间体6b：6-氯-4-((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)烟碱酸
中间体6b是使用中间体1f中所用的方法由中间体6a合成(74％)。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ8.57(s,1H),8.36(d,J＝8.0Hz,1H),7.00(s,1H),3.92-3.81(m,3H),3.54(td,J＝11.4,2.2Hz,3H),2.04-1.90(m,2H),1.56-1.42(m,2H)。
中间体6c：6-氯-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1,3-二氢-2H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-酮
中间体6c是使用中间体1g中所用的方法由中间体6b合成(76％)。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ11.32(s,1H),7.94(s,1H),7.44(s,1H),4.38(tt,J＝12.2,4.2Hz,1H),3.94(dd,J＝11.5,4.5Hz,2H),3.42(td,J＝11.9,1.9Hz,2H),2.31(qd,J＝12.4,4.6Hz,2H),1.69-1.56(m,2H)。
中间体6d：6-氯-3-甲基-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1,3-二氢-2H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-酮
中间体6d是使用中间体1h中所用的方法由在2:1THF/H2O中的中间体6c合成(63％)。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ8.15(s,1H),7.50(s,1H),4.43(tt,J＝12.1,4.2Hz,1H),3.94(dd,J＝11.5,4.5Hz,2H),3.43(td,J＝11.9,1.9Hz,2H),3.32(s,3H),2.32(qd,J＝12.4,4.6Hz,2H),1.63(ddd,J＝12.2,4.3,1.9Hz,2H)。
化合物6：3-甲基-6-((7-甲基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)氨基)-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1,3-二氢-2H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-酮
化合物6是使用化合物1中所用的方法由中间体6d和中间体1f合成。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ9.78(s,1H),8.31(s,1H),8.03(s,1H),8.00(s,1H),7.69(s,1H),7.24(s,1H),4.44(d,J＝12.5Hz,1H),4.04(dd,J＝11.6,4.4Hz,2H),3.52(t,J＝11.7Hz,2H),2.50-2.46(m,3H),2.32(tt,J＝12.3,7.0Hz,2H),1.75-1.67(m,2H)。MS:380.4m/z[M+H]。
实施例8-化合物7
中间体7a：4,6-二甲基-5-硝基吡啶-2-胺
在-10℃下向4,6-二甲基吡啶-2-胺(50g，1.0当量)于H2SO4中的溶液中滴加HNO3(3.25当量)和H2SO4(2.3当量)的混合物。在添加后，在此温度下搅拌混合物1h。通过在0℃下滴加NH3 H2O来淬灭反应混合物，用H2O稀释并用EtOAc萃取3次。在减压下浓缩合并的有机层，得到残余物，并通过柱色谱法纯化，得到呈黄色固体状的产物(19％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.70(s,1H),2.53(s,3H),2.45(s,3H)。
中间体7b：(E)-N'-(4,6-二甲基-5-硝基吡啶-2-基)-N,N-二甲基甲脒
将中间体7a(11.8g，1.0当量)和DMF-DMA(1.1当量)于甲苯(0.7M)中的溶液脱气并用N2吹扫3次，并且在110℃下在氮气气氛下搅拌混合物2h。在减压下浓缩反应混合物，得到残余物，并且不经另外纯化即直接用于下一反应中。
中间体7c：(E)-N'-(4,6-二甲基-5-硝基吡啶-2-基)-N-羟基甲脒
将中间体7b(10g，1.0当量)、羟胺盐酸盐(2.0当量)于MeOH(0.4-0.5M)中的混合物脱气并用N2吹扫3次，并且在80℃下在N2气氛下搅拌混合物1h。在减压下浓缩反应混合物，并且将所得残余物用NaHCO3水溶液稀释并用EtOAc萃取3次。在减压下浓缩经合并的有机层并通过柱色谱法纯化，得到呈黄色固体状的产物(19％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ9.97(d,J＝9.6Hz,1H),8.27(d,J＝9.5Hz,1H),6.68(s,1H),2.54(s,3H),2.46(s,3H)。
中间体7d：5,7-二甲基-6-硝基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶
向中间体7c(2.2g，1.0当量)于THF(0.5M)中的混合物中添加TFAA(1.5当量)。在N2气氛下在25℃下搅拌混合物18h。在减压下浓缩反应混合物以去除溶剂。将残余物用NaHCO3水溶液稀释并用EtOAc萃取3次。在减压下浓缩合并的有机层并通过柱色谱法纯化，得到呈淡黄色固体状的产物(55％)。
中间体7e：5,7-二甲基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-胺
向中间体7d(1.1g，1.0当量)于EtOH(0.5-0.6M)中的溶液中添加NH4CO2H(1.0当量)和Pd/C(10％w/w，1.0当量)。在105℃下搅拌混合物2h。过滤反应混合物，在减压下浓缩并通过柱色谱法纯化，得到呈白色固体状的产物(64％)。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ8.15(s,1H),7.38(s,1H),4.77(s,2H),2.58(s,3H),2.28(s,3H)。
化合物7：6-((5,7-二甲基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)氨基)-3-甲基-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1,3-二氢-2H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-酮
将中间体7e(1.0当量)、中间体6d(1.0当量)、BrettPhos Pd G3(0.1当量)、Cs2CO3(2.0当量)于DMF(0.15M)中的混合物脱气并用N2吹扫3次，并且在100℃下在N2气氛下搅拌混合物18h。将反应混合物倒入水中并用DCM萃取3次。将合并的有机相用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中浓缩滤液。通过柱色谱法纯化残余物，得到呈淡黄色固体状的产物。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ8.44(s,1H),8.05(s,1H),7.71(s,1H),7.63(s,1H),6.68(s,1H),4.06-3.96(m,2H),3.50(d,J＝11.9Hz,2H),3.26(s,3H),2.60(s,3H),2.29(s,5H),1.70(d,J＝11.5Hz,2H)。MS:394.4m/z[M+H]。
实施例9-化合物8
化合物8：2-((5,7-二甲基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)氨基)-7-甲基-9-(四氢-2H-吡喃-4-基)-7,9-二氢-8H-嘌呤-8-酮
将中间体7e(1.0当量)、中间体1h(1.0当量)、Cs2CO3(2.0当量)、Pd(dppf)Cl2(0.2当量)、XantPhos(0.4当量)于DMF(0.1-0.2M)中的混合物脱气并用N2吹扫3次，并且然后在130℃下在N2气氛下搅拌混合物24h。将混合物倒入水中并用DCM萃取3次。将合并的有机相用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中浓缩滤液。通过柱色谱法纯化残余物，得到呈棕色固体状的产物。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ8.76(s,1H),8.49(s,1H),7.98(s,1H),7.68(s,1H),4.44(s,1H),4.03-3.93(m,2H),3.47(d,J＝12.5Hz,2H),3.32(s,3H),2.64(s,3H),2.34(s,3H),1.71(d,J＝12.3Hz,2H)。MS:395.4m/z[M+H]。
实施例10-化合物9
中间体9a：4,6-二氯-5-甲基烟碱酸乙酯
向4,6-二氯-5-甲基-吡啶-3-甲酸(1.8g，1.0当量)于EtOH(0.4-0.5M)中的混合物中滴加H2SO4(1.0当量)。在80℃下搅拌混合物并搅拌12h。将反应混合物倒入NaHCO3水溶液中并用EtOAc萃取2次。将合并的有机相用盐水洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并且在真空中浓缩滤液。通过柱色谱法纯化残余物，得到呈无色油状物的产物(59％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.55(d,J＝4.2Hz,1H),4.36(pd,J＝6.9,3.9Hz,2H),2.49(d,J＝4.3Hz,3H),1.36(td,J＝7.3,4.0Hz,3H)。
中间体9b：6-氯-5-甲基-4-((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)烟碱酸乙酯
中间体9b是使用中间体1e中所用的方法由中间体9a合成(50％)。1H NMR(400MHz,(CD3)2SO)δ8.44(s,1H),7.43(d,J＝9.3Hz,1H),4.31(q,J＝7.1Hz,2H),3.79(dt,J＝11.7,3.8Hz,2H),3.67(tq,J＝9.7,4.9,4.1Hz,1H),3.36(dd,J＝11.5,2.2Hz,2H),2.30(s,3H),1.84-1.75(m,2H),1.41(dtd,J＝17.5,10.6,9.6,4.4Hz,2H),1.31(t,J＝7.1Hz,3H)。
中间体9c：6-氯-5-甲基-4-((四氢-2H-吡喃-4-基)氨基)烟碱酸
中间体9c是使用中间体1f中所用的方法由中间体9b合成(83％)。
中间体9d：6-氯-7-甲基-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1,3-二氢-2H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-酮
向中间体9c(0.45g，1.0当量)、Et3N(1.0当量)于DMA(0.16M)中的混合物中添加DPPA(1.0当量)。将混合物在120℃下在N2气氛下搅拌8h。将反应混合物倒入水中，并且通过过滤收集沉淀物，用水洗涤并在真空下干燥，得到残余物，其未经进一步纯化即直接用于下一反应中(67％)。
中间体9e：6-氯-3,7-二甲基-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1,3-二氢-2H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-酮
中间体9e是使用中间体1h中所用的方法由中间体9d合成(79％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.79(s,1H),4.55(tt,J＝12.0,4.2Hz,1H),4.08(dd,J＝11.8,4.7Hz,2H),3.40(td,J＝12.2,2.0Hz,2H),2.81(qd,J＝12.5,4.6Hz,2H),1.66(ddd,J＝12.5,4.2,1.9Hz,2H)。
化合物9：3,7-二甲基-6-((7-甲基-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶-6-基)氨基)-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1,3-二氢-2H-咪唑并[4,5-c]吡啶-2-酮
化合物9是使用化合物中所用的方法由中间体1d和中间体9e合成。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.63(s,1H),8.30(s,1H),7.72(s,1H),7.64(s,1H),7.54(s,1H),4.65-4.56(m,1H),3.95(dd,J＝11.4,4.5Hz,2H),3.43(t,J＝11.8Hz,2H),3.22(s,3H),2.69-2.52(m,2H),2.50(s,3H),2.21(d,J＝1.1Hz,3H),1.71(d,J＝11.4Hz,2H)。MS:394.5m/z[M+H]。
实施例11-在具有或不具有DNA-PK抑制剂情况下对T细胞的TRAC LNP处理
将T细胞从液体N2储存解冻并在2.5％人类血清T生长活化培养基(TCGM：CTSOpTmizer(Thermofisher编号A3705001)，具有2.5％热灭活人类AB血清(Gemini编号100-512)、1X GlutaMAX(Thermofisher编号35050061)、1％青霉素/链霉素(Thermofisher编号15140-122)、10mM HEPES pH 7.4(Thermofisher编号15630080)、IL-2(200U/mL，Peptrotech编号200-02)、IL-7(5ng/mL，Peptrotech编号200-07)和IL-15(5ng/mL，Peptrotech编号200-15))中静置过夜。
在过夜静置后，T细胞在插入之前用TransAct(1:100稀释，Miltenyi)活化48小时。收集T细胞，洗涤，并且重悬于无血清的TCGM中达到1.25x106个细胞/毫升的浓度。LNP-ApoE溶液以5μg/mL的LNP浓度制备于具有1μg/mL ApoE3的5％人类血清TCGM中并在37度下温育10min。如实施例1中所描述，分别以组分脂质即脂质A、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG的50/38.5/10/1.5或35/47.5/15/2.5的脂质摩尔比，用编码Cas9的mRNA(SEQ ID:NO 8)和靶向人类TRAC的sgRNA(G013006SEQ ID:1)配制LNP组合物。sgRNA与Cas9mRNA的货物比按重量计为1:2。将LNP-ApoE混合物和T细胞(50,000个细胞/孔)按体积计1:1混合。以3x105个病毒基因组/细胞的MOI添加编码同源定向修复模板的AAV，用于将GFP开放阅读框(OFR)插入TRAC基因座(SEQ ID NO:13)中。将DNA-PK抑制剂(化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8或化合物9)稀释于2.5％血清TCGM中，并且添加至细胞中以实现1、0.25或0.0625μM的最终浓度。次日，将T细胞以500g在96孔板中短暂离心5分钟以去除培养基，洗涤一次，并重悬于2.5％血清TCGM中，并且扩增5天。在5天扩增期间，细胞在第2天一次分裂成新的2.5％血清TCGM以防止过度生长。
11.1.流式细胞术
在编辑后第5天，通过流式细胞术表对T细胞进行表型分析以测定内源TCR基因敲除和GFP插入。由TRAC编码的T细胞受体α链为T细胞受体/CD3复合物组装和易位至细胞表面所需。因此，通过基因组编辑破坏TRAC基因导致T细胞的细胞表面上的CD3蛋白质损失。简而言之，用含有靶向CD3的抗体(1:200)的FACS缓冲液(PBS pH 7.4，2％ FBS，1mM EDTA)染色经编辑T细胞并在冰上温育，避光保存30分钟。随后洗涤细胞并重悬于含有DAPI(1:5,000)的FACS缓冲液中并在冰上温育，避光保存10分钟。染色后，将T细胞洗涤，重悬于FACS缓冲液中，并使用CytoFLEX LX细胞计数器来分析。T细胞根据尺寸、DAPI染色以及GFP和CD3表达进行闸控。结果显示于表2和图1A中。如表3和图1B中，GFP阳性细胞在CD3阴性群体内进行闸控。
表2.在指定DNAPK抑制剂存在下编辑后的CD3阴性T细胞百分比
表3.在指定DNAPK抑制剂存在下编辑后CD3阴性T细胞的GFP阳性百分比
实施例12-用CRISPR/Cas9和DNA-PK抑制剂工程化功能活性TCR T细胞
评价在不扰动T细胞扩增、细胞毒性或细胞因子释放的情况下使用DNA-PK抑制剂增强T细胞中的转基因TCR(tgTCR)插入。
12.1.T细胞分离
可在商业上(HemaCare)从三个供体(称为007HD、008HD和009HD)获得健康人类供体血球分离术。洗涤细胞并且在LOVO装置上重悬于CliniMACS PBS/EDTA缓冲液(Miltenyi目录号130-070-525)中。使用CD4和CD8磁珠(Miltenyi BioTec目录号130-030-401/130-030-801)，使用CliniMACS Plus和CliniMACS LS一次性试剂盒，经由正向选择分离T细胞。将T细胞等分至小瓶中并冷冻保存于Cryostor CS10(StemCell Technologies目录号07930)和Plasmalyte A(Baxter目录号2B2522X)的1:1制剂中以供将来使用。
12.2.T细胞培养基和解冻
将T细胞从液体N2储存解冻并在2.5％人类血清T细胞活化培养基(TCAM：CTSOpTmizer(Thermofisher编号A3705001)，具有2.5％热灭活人类AB血清(Gemini编号100-512)、1X GlutaMAX(Thermofisher编号35050061)、1％青霉素/链霉素(Thermofisher编号15140-122)、10mM HEPES pH 7.4(Thermofisher编号15630080)、IL-2(200U/mL，Peptrotech编号200-02)、IL-7(5ng/mL，Peptrotech编号200-07)和IL-15(5ng/mL，Peptrotech编号200-15))中静置过夜。
12.3.T细胞工程化
对所静置的T细胞计数并且以2x106个细胞/毫升的密度重悬于TCGM中，其中以1:50稀释度添加TransAct试剂。同时，将用编码Cas9的mRNA(SEQ ID NO:8)和靶向TRBC(G016239)的sgRNA(SEQ ID NO:2)配制的5μg/mL TRBC-LNP与1μg/mL重组人类ApoE3一起在TCAM中温育，然后与T细胞以按体积计1:1混合并在37℃下温育48小时。在活化48h后，收集T细胞，洗涤并重悬于TCAM中达到1x106个细胞/毫升的浓度。TRAC-LNP-ApoE溶液以5μg/mL在具有5μg/mL ApoE3的TCAM中制备。TRAC-LNP用编码Cas9的mRNA(SEQ ID NO:8)和靶向TRAC(G013006)的sgRNA(SEQ ID NO:1)配制。将LNP-ApoE混合物与T细胞以按体积计1:1混合。以3x105个病毒基因组/细胞的MOI添加AAV编码同源定向修复模板，用于插入HD1(WT1特异性TCR)的TRAC基因座(SEQ ID NO:13)中。如表4中所指示以0.25uM的浓度添加DNA-PK抑制剂。次日，洗涤T细胞，重悬于T细胞扩增培养基(TCEM：如对于TCAM所述，除5％人类AB血清代替2.5％)中，然后转移至GREX板(Wilson Wolf编号80240M)，并且在每隔2-3天补充细胞因子情况下再扩增6天。在省略任何DNA-PK抑制剂处理的情况下如上文所描述来处理对照样品。收集扩增后细胞，使用Vi-CELL XR细胞计数器计数，并且通过流式细胞术表征。通过将事件终点处的总细胞计数产量除以第0天每个组中的细胞数目(即起始物质)来确定扩增倍数。通过使用化合物6、7和8进行DNA-PK处理后，未观测到T细胞扩增的影响(表4)。将T细胞冷冻保存于Cryostor CS10冷冻培养基中供将来分析。
表4.在指定DNAPK抑制剂存在下编辑后的T细胞扩增倍数
供体 无抑制剂 化合物1 化合物3 化合物4
007HD 130.64 110.18 110.47 118.46
008HD 104.43 114.56 111.44 108.81
009HD 142.91 159.08 143.01 140.77
平均值 125.99 127.94 121.64 122.68
SD 19.66 27.06 18.51 16.39
相对于无抑制剂的P值 0.88 0.65 0.56
12.4.流式细胞术
在工程化和扩增后，使用流式细胞术表征T细胞的编辑效率和记忆表型。简而言之，在室温下用靶向CD4、CD8、CD3ε、Vβ8、CD45RA、CD45RO、CD62L和CCR7的稀释于FACS缓冲液(PBS pH 7.4、2％FBS、1mM EDTA)中的抗体混合液染色T细胞30分钟。Vβ8抗体识别WT1-TCR所使用的特异性Vβ链。洗涤染色后T细胞，重悬于FACS缓冲液中，并使用CytoFLEX LX细胞计数器分析。每个组内抑制剂对CD8+ T细胞百分比无影响(图2A)。我们观测到相对于未经处理的组，所有DNA-PK抑制剂处理组中具有WT1-TCR插入的CD8+细胞百分比(CD3ε+，Vβ8+)在统计学上显著增加(p<0.05，学生T检验)(表5，图2C)，以及内源TCR KO具有增加的趋势(图2B)。
表5.在指定DNAPK抑制剂存在下编辑后的CD8+细胞中的CD3ε+、Vβ8+细胞百分比。
12.5.WT1 TCR T细胞介导的响应于697ALL和K562-HLA-A*02:01CML细胞系的细胞毒性和细胞因子释放。
评价从供体007HD和008HD工程化的WT1-TCR T细胞杀伤表达天然水平的WT1的血液癌细胞和释放细胞因子的能力。使用如上所述产生但无TRAC/AAV添加的TCR KO细胞作为阴性非杀伤对照。简而言之，将T细胞与表达荧光素酶的697ALL细胞(697-luc2)或经转导以表达HLA-A*02:01的K562-luc2细胞(K5692-HLA-A*02:01-luc2)以各种效应物:靶标(E:T)比率(2:1、1:1、0.5:1)在不添加IL-2、IL-7或IL-15的TCEM中共培养。值得注意的是，针对每个组中的相对WT1 TCR插入对效应物与靶标的比率进行归一化，从而在抑制剂和无处理组产生相同量的绝对WT1 TCR表达细胞。共培养24h后，收集来自2:1E:T比率组的上清液并用于MSD U/R-PLEX测定以根据制造商方案(Mesoscale Discovery)定量IL-2、TNFα、IFNγ和颗粒酶B。共培养48h后，使用Bright-GLO荧光素酶测定系统(Promega)以相对发光单位(RLU)定量荧光素酶活性。使用下式确定特异性裂解百分比：
特异性裂解％＝100-((RLU[实验孔]/RLU[仅目标孔])*100)
细胞毒性测定结果显示于图3A-3D和表6中，而细胞因子释放报告于表7和图4A-4H中。观测到用DNA-PK抑制剂处理的组中T细胞功能性无显著差异。
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实施例13-使用DNA蛋白质激酶抑制剂在B细胞中的编辑
评估DNA蛋白质激酶抑制剂(DNA-PKI)对B细胞中的编辑效率的影响。
通过CD19正向选择使用StraightFrom Leukopak CD19MicroBead试剂盒(Miltenyi，130-117-021)在MultiMACS Cell24Separator Plus仪器上从健康人类供体白细胞采集物分离B细胞。MACS分离之后，在IMDM培养基或Stemspan培养基中活化CD19+B细胞并且冷冻直至需要为止。基础培养基为补充有1％青霉素/链霉素(Corning，30-002-CI)、50ng/ml hIL-2(Peprotech，200-02)、50ng/ml hIL-10(Peprotech，200-10)、10ng/ml hIL-15(Peprotech，200-15)、100ng/ml MEGACD40L、1ug/ml CpG ODN 2006(Invivogen，TLR-2006)和10％胎牛血清(FBS)的IMDM(Corning，10-016-CV)或StemSpan SFEM(StemCellTechnologies，9650)。将B细胞解冻并在补充有1％青霉素/链霉素(Corning，30-002-CI)、50ng/ml hIL-2(Peprotech，200-02)、50ng/ml hIL-10(Peprotech，200-10)、10ng/ml hIL-15(Peprotech，200-15)、1ng/ml MEGACD40L、1ug/ml CpG ODN 2006(Invivogen，TLR-2006)和5％人类AB血清(Gemini Bio-Products，100-512)的Stemspan培养基中培养。在两天培养之后，收获细胞并以100,000个细胞/100μl重悬于具有1％青霉素/链霉素、补充有2倍最终浓度的细胞因子、2μg/ml CpG ODN 2006(Invivogen，TLR-2006)和2ng/ml MEGACD40L的StemSpan培养基中，然后用递送编码Cas9的mRNA(SEQ ID NO:8)和靶向B2M的gRNA G000529的LNP组合物处理。
LNP一般如实施例1中所述来制备，脂质组成为50/38.5/10/1.5，分别表示为可离子化脂质/胆固醇/DSPC/PEG的摩尔比。将LNP在37℃下在补充有1％青霉素/链霉素和5％人类AB血清(Gemini Bio-Products，100-512)的StemSpan培养基中以5μg/ml总RNA货物的浓度与1.25μg/ml ApoE4(Peprotech，350-04)一起预温育约15分钟。将预温育的LNP以2.5μg/ml总RNA货物的最终浓度添加至B细胞中，接着添加0.25μg/ml DNAPK抑制剂化合物1、化合物3或化合物4。
在LNP组合物处理后第7天，针对B2M表面蛋白质的存在对B细胞进行表型分析。为此，将B细胞与靶向CD86(Biolegend，374216)和B2M(Biolegend，316312)的抗体一起温育。随后将细胞用活力染料(Biolegend，422801)染色，洗涤，在Cytoflex仪器(BeckmanCoulter)上处理并使用FlowJo软件包进行分析。B细胞根据大小和活力状态，接着根据总的活群体上的B2M表达进行闸控。B2M阴性细胞百分比显示于表8中。相比于无DNA-PKI，在DNA-PKI存在下观测到B2M阴性B细胞的百分比增加，指示基因编辑增加。
表8.在用DNA-PKI和靶向B2M的LNP组合物编辑之后的B2M阴性细胞百分比。
13.2.使用DNAPK抑制剂在来自多个供体的B细胞中的编辑
如实施例23.1中所述，从源自3个供体的PBMC中分离B细胞。在MACS分离之后，CD19+B细胞在Stemspan培养基中活化，所述培养基具有1ug/ml CpG ODN 2006(Invivogen，TLR-2006)、2.5％人类AB血清(Gemini Bio-Products，100-512)、1％青霉素-链霉素(ThermoFisher，15140122)、50ng/ml IL-2(Peprotech，200-02)、50ng/ml IL-10(Peprotech，200-10)和10ng/ml IL-15(Peprotech，200-15)和1ng/ml CD40L(Enzo LifeSciences，ALX-522-110-C010)。活化后两天，B细胞用递送编码Cas9的mRNA(SEQ ID NO:8)和靶向B2M的gRNA G000529的LNP组合物处理。如表9中所指示，将B细胞以50,000个细胞/孔一式三份地接种于如上文所述的完全Stemspan培养基中。
LNP一般如实施例1来制备，脂质组成为50/38.5/10/1.5，分别表示为可离子化脂质/胆固醇/DSPC/PEG的摩尔比。LNP在37℃下用含有以下的Stemspan培养基预温育15分钟：1μg/mL CpG ODN 2006、2.5％人类AB血清、1％青霉素-链霉素、50ng/mL IL-2、50ng/mL IL-10和10ng/ml IL-15、1ng/ml CD40L和1.25μg/mL ApoE4。将预温育的LNP组合物以2.5μg/mL总RNA货物的最终浓度添加至B细胞中，接着添加0.25μg/mL DNAPK抑制剂化合物1或化合物4。LNP组合物添加后七十二小时，将细胞洗涤，重悬于含有1μg/mL CpG ODN 2006、2.5％人类AB血清、1％青霉素-链霉素、50ng/mL IL-2、50ng/mL IL-10和10ng/mL IL-15和100ng/mLCD40L的Stemspan培养基中，并转移至48孔板。
LNP组合物处理后七天，细胞通过流式细胞术进行表型分析。简而言之，将B细胞与靶向CD19(Biolegend，363010A)、CD20(Biolegend，302322)、CD86(Biolegend，374216)和B2M(Biolegend，395806)的抗体，接着与活力染料DAPI(Biolegend，422801)一起温育。随后洗涤细胞并在Cytoflex仪器(Beckman Coulter)上处理并使用FlowJo软件包进行分析。B细胞根据大小和活力状态，接着根据总的活群体上的B2M表达进行闸控。表9和图5显示用DNAPK抑制剂编辑之后的B2M阴性细胞的平均百分比。添加DNAPK抑制剂适度地提高编辑效率。
表9.用DNAPK抑制剂编辑之后的B2M阴性细胞的平均百分比
实施例14-使用DNAPK抑制剂插入至NK细胞中
对于DNA蛋白质激酶抑制剂(DNA-PKI)对插入/缺失和插入率的影响评估NK细胞。在DNA蛋白质激酶抑制剂存在下，用递送编码Cas9的mRNA(SEQ ID NO:8)和靶向AAVS1的gRNA G000562的LNP组合物处理NK细胞。还用AAV处理样品子集，所述AAV编码由与AAVS1编辑位点同源的区域侧接的GFP编码序列(SEQ ID NO:16)。
使用EasySep人类NK细胞分离试剂盒(STEMCELL，目录号17955)根据制造商方案从商业获得的白细胞采集物中分离NK细胞。在具有5％人类AB血清、500U/mL IL-2和5ng/mlIL-15的OpTmizer培养基中使用K562-41BBL细胞作为饲养细胞使人类原代NK细胞活化和扩增3天。NK细胞以50,000个细胞/孔一式三份地接种于OpTmizer中，所述OpTmizer如上文所述地补充有表10和表11中指示的浓度的DNA-PKI。LNP在37℃下在具有2.5％人类AB血清、500U/mL IL-2和5ng/ml IL-15的OpTmizer培养基中与10ug/ml APOE3一起预温育约15分钟。将预温育的LNP组合物以10ug/ml总RNA货物的最终浓度一式三份地添加至悬浮于相同培养基中的NK细胞。对于样品子集，在编辑之后以600,000个基因组拷贝的感染倍率(MOI)添加编码GFP的AAV，GFP由与AAVS1编辑位点同源的区域侧接。在LNP组合物处理后七天，通过流式细胞术表型分析细胞以测量GFP插入率。简而言之，将NK细胞与靶向CD3(Biolegend，目录号317336)和CD56(Biolegend，目录号318310)的抗体一起温育。随后洗涤细胞，在Cytoflex仪器(Beckman Coulter)上处理并使用FlowJo软件包进行分析。NK细胞根据大小、CD3/CD56状态和GFP表达进行闸控。将高GFP表达细胞闸控为AAVS1基因座中的靶向GFP插入，并且将低GFP表达细胞闸控为游离型保留。然后如实施例1.4中所述收集细胞用于NGS分析。
表10和表11以及图6A和图6B显示用LNP组合物、AAV和不同浓度的DNAPK抑制剂化合物1和化合物4处理之后的编辑百分比。在DNAPK抑制剂存在下，插入/缺失形成和插入均增加。
表10.在不同剂量的DNA-PKI下在AAVS1处的平均编辑百分比
表11.在用LNP组合物、AAV和DNA-PKI编辑之后七天具有高GFP表达的NK细胞的百分比。
实施例15-T细胞中具有两个插入的多编辑
为证实具有五个不同Cas9编辑的T细胞的工程化，健康供体细胞依序用五种与编码Cas9的mRNA(SEQ ID NO:8)和靶向TRAC(G013006)、TRBC(G016239)、CIITA(G013676)、HLA-A(G018995)或AAVS1(G000562)的sgRNA共配制的LNP组合物处理。通过使用AAV递送同源定向修复模板(SEQ ID NO:14)将靶向TCR的转基因WT1以位点特异性方式整合至TRAC切割位点中。作为概念验证，我们还使用第二同源修复模板(SEQ ID NO:15)将GFP以位点特异性方式整合至AAVS1目标位点中。
T细胞从两个健康HLA-A*02:01+供体的白细胞去除术产物(STEMCELLTechnologies)分离。T细胞使用EasySep人类T细胞分离试剂盒(STEMCELL Technologies，17951)遵循制造商的方案分离并使用Cryostor CS10(STEMCELL Technologies，07930)冷冻保存。在开始T细胞编辑之前一天，将细胞解冻并在T细胞活化培养基(TCAM：CTSOpTmizer(Thermofisher，A3705001)中静置过夜，所述培养基补充有2.5％人类AB血清(Gemini，100-512)、1X GlutaMAX(Thermofisher，35050061)、10mM HEPES(Thermofisher，15630080)、200U/mL IL-2(Peprotech，200-02)、5ng/mL IL-7(Peprotech，200-07)和5ng/mL IL-15(Peprotech，200-15)。
T细胞的LNP组合物处理和扩增
LNP一般如实施例1中所述来制备，脂质组成为50/38.5/10/1.5，分别表示为可离子化脂质/胆固醇/DSPC/PEG的摩尔比。在即将暴露于T细胞之前，将LNP组合物在含ApoE的培养基中预温育。依序编辑步骤和对照组的实验设计见于表12中。
表12.实验设计
第1天：如表12中所指示靶向CIITA的LNP组合物在含有5ug/mL rhApoE3(Peprotech 350-02)的TCAM中以5ug/mL的浓度温育。收集T细胞，洗涤，并以2x106个细胞/毫升的密度重悬于具有1:50稀释度的T细胞TransAct人类试剂(Miltenyi，130-111-160)的TCAM中。T细胞和LNP-ApoE溶液然后按体积计以1:1比率混合并在培养烧瓶中接种T细胞过夜。
第2天：如表12中所指示靶向HLA-A的LNP组合物在含有20ug/mL rhApoE3(Peprotech 350-02)的TCAM中以25ug/mL的浓度温育。然后将LNP-ApoE溶液按体积计以1:10比添加至适当培养物中。
第3天：靶向TRAC的LNP组合物在含有5ug/mL rhApoE3(Peprotech 350-02)的TCAM中以5ug/mL的浓度温育。收集T细胞，洗涤，并以1x106个细胞/毫升的密度重悬于TCAM中。T细胞和LNP-ApoE培养基按体积计以1:1比率混合并且在培养烧瓶中接种T细胞。然后将WT1AAV以3x105个基因组拷贝/细胞的MOI添加至每个组。DNA-PK抑制剂化合物4以0.25μM的浓度添加至每个组。
第4天：靶向AAVS1的LNP组合物在含有5ug/mL rhApoE3(Peprotech 350-02)的TCAM中以5ug/mL的浓度温育。同时，收集T细胞，洗涤，并以1x106个细胞/毫升的密度重悬于TCAM中。T细胞和LNP-ApoE培养基按体积计以1:1比率混合并且在培养烧瓶中接种T细胞。然后将GFP-AAV以3x105个基因组拷贝/细胞的MOI添加至每个组。DNA-PK抑制剂化合物4以0.25μM的浓度添加至每个组。
第5天：如表12中所指示靶向TRBC的LNP组合物在含有5ug/mL rhApoE3(Peprotech350-02)的TCAM中以5ug/mL的浓度温育。收集T细胞，洗涤，并且以1x106个细胞/毫升的密度重悬于TCAM中。然后将LNP-ApoE溶液按体积计以1:1比率添加至适当培养物中。
第6-11天：将T细胞转移至24孔GREX板(Wilson Wolf，80192)的T细胞扩增培养基中(TCEM：CTS OpTmizer(Thermofisher，A3705001)，补充有5％ CTS免疫细胞血清替代物(Thermofisher，A2596101)、1X GlutaMAX(Thermofisher，35050061)、10mM HEPES(Thermofisher，15630080)、200U/mL IL-2(Peprotech，200-02)、5ng/ml IL-7(Peprotech，200-07)、5ng/ml IL-15(Peprotech,200-15))并且根据制造商的方案扩增。简而言之，将T细胞扩增6天，每隔一天更换培养基。
通过流式细胞术和NGS定量T细胞编辑
扩增后，经编辑T细胞用靶向以下的抗体染色：HLA-A*02:01(Biolegend 343307)、HLA-DR-DP-DQ(Biolegend 361712)、WT1-TCR(Vb8+、Biolegend 348104)、CD3e(Biolegend300328)、CD4(Biolegend 317434)、CD8(Biolegend 301046)和Viakrome 808 Live/Dead(目录号C36628)。此混合液用于测定HLA-A*02:01基因敲除(HLA-A2-)、经由CIITA基因敲除的HLA-DR-DP-DQ基因敲低(HLA-DRDPDQ-)、WT1-TCR插入(CD3+Vb8+)和表达残余内源性TCR(CD3+Vb8-)的细胞百分比。通过监测GFP表达追踪插入至AAVS1位点中。抗体温育后，洗涤细胞，在Cytoflex LX仪器(Beckman Coulter)上处理并使用FlowJo软件包进行分析。T细胞根据大小和CD4/CD8状态闸控，随后检查编辑和插入标志物。对于CD8+和CD4+ T细胞，编辑和插入率分别可见于表13和表14中。图7A-7F显示CD8+ T细胞中所有靶标的编辑率的图。具有所有预期编辑(即，WT1-TCR和GFP的插入，以及HLA-A和CIITA的基因敲除)的T细胞的百分比闸控为CD3+Vb8+GFP+HLA-A-HLA-DRDPDQ-％。在来自两个供体的五重编辑样品中观测到高水平的HLA-A和CIITA基因敲除，以及GFP和WT1-TCR插入，产生>75％经完全编辑的CD8+ T细胞和>85％经完全编辑的CD4+ T细胞。
表13.供体A和B中的CD8+ T细胞的编辑率
表14.供体A和B中的CD4+ T细胞的编辑率
实施例16-在血清培养基条件中评价的LNP组合物活性
为了评价LNP组合物编辑功效，体外测试LNP组合物以评价替代培养基条件对CD3阳性T细胞中的插入效率的影响。用LNP组合物处理T细胞，所述组合物具有不同摩尔比的囊封Cas9 mRNA和靶向TRAC基因的sgRNA的脂质组分。AAV6病毒构建体递送同源定向修复模板(HDRT)，其编码由同源臂侧接的GFP报告基因，以便位点特异性整合至TRAC基因座(Vigene；SEQ ID NO:17)中。通过流式细胞术评估TRAC基因破坏的T细胞受体表面蛋白质损失。通过流式细胞术评估插入的GFP发光。
LNP组合物与ApoE3一起预温育。将相等体积的ApoE3培养基添加至每个孔。随后将100μL LNP-ApoE混合物添加至每个T细胞板。将最高剂量下的LNP的最终浓度设定为5μg/mL。ApoE3的最终浓度为5μg/mL，并且T细胞的最终密度为0.5e6个细胞/毫升。将板在37℃下以5％ CO2温育7天并且然后收集用于流式细胞术分析。
LNP一般如实施例1中所述来制备，脂质组成如表15中所指示，分别表示为可离子化脂质A/胆固醇/DSPC/PEG的摩尔比。LNP组合物递送编码Cas9的mRNA(SEQ ID NO:8)和靶向人类TRAC的sgRNA(SEQ ID NO.1)。sgRNA与Cas9 mRNA的货物比按重量计为1:2。
表15.LNP制剂分析结果
来自单个供体(批号W0106)的T细胞的制备如实施例1中所述，其中修改以下培养基。使用培养基涂布T细胞，所述培养基补充有2.5％人类AB血清(HABS)、2.5％ CTS免疫细胞SR(Gibco，目录号A25961-01)血清替代物(SR)、5％血清替代物(SR)或2.5％人类AB血清和2.5％血清替代物的组合。如实施例1.2中所述，T细胞在解冻后24小时活化。活化后两天，将T细胞如实施例16.1中所述以0.31μg/mL、0.63μg/mL、1.25μg/mL和2.5μg/mL的LNP浓度用LNP组合物转染。AAV6编码同源定向修复模板(HDRT)，所述模板编码由同源臂侧接的GFP报告基因(Vigene；SEQ ID NO:13)，以用于位点特异性整合至TRAC基因座中，并且以3x105个病毒颗粒/细胞的感染倍率(MOI)添加至每个孔中。以0.25μM添加DNA依赖性蛋白质激酶的小分子抑制剂即化合物4。
转染后五天，如实施例14中所述通过流式细胞术分析对T细胞进行表型分析，以评价LNP组合物的插入效率。表16显示CD3阴性细胞的百分比。由TRAC编码的T细胞受体α链为T细胞受体/CD3复合物组装和易位至细胞表面所需。因此，通过基因组编辑破坏TRAC基因导致T细胞的细胞表面上的CD3蛋白质损失。每个培养基条件下GFP阳性T细胞的平均百分比显示于表17和图8A-8B中。表达GFP蛋白质的细胞指示成功插入至基因组中。
表16-用AAV和指定LNP制剂处理活化T细胞之后的CD3阴性T细胞百分比。
表17.用AAV和指定LNP制剂处理活化T细胞之后的GFP+细胞百分比。
16.1.T细胞的LNP转染
在Hamilton Microlab STAR液体处置系统上进行LNP剂量反应曲线(DRC)转染。液体处置器配备有以下：(a)在深孔96深孔板的顶列中的4倍所需最高LNP剂量，(b)以20μg/mL稀释于培养基中的ApoE3，(c)由如先前实施例1中所述的CTS OpTmizer基础培养基构成的完全T细胞生长培养基和(d)在96孔平底组织培养板中以106/ml密度以100uL接种的T细胞。液体处置器首先在深孔板中从4X LNP剂量开始进行LNP的8点两倍连续稀释。然后将等体积的ApoE3培养基添加至每个孔中，引起LNP和ApoE3两者的1:1稀释。随后，将100uL LNP-ApoE混合物添加至每个T细胞板中。将最高剂量下的LNP的最终浓度设定为5μg/mL。ApoE3的最终浓度为5μg/mL，并且T细胞的最终密度为0.5x106个细胞/毫升。将板在37℃下以5％CO2温育24或48小时，分别用于活化或非活化的T细胞。温育后，收集经LNP处理的T细胞并且加以分析用于中靶编辑或Cas9蛋白质表达检测。在LNP组合物处理之后培养剩余细胞7-10天并且通过流式细胞术评估蛋白质表面表达。
实施例17-通过UnIT进行的DNA-PKI的脱靶结构变异比较
在此实验中，相较于未经编辑或未经处理的TRAC sgRNA，分析用化合物3或化合物4处理的靶向TRAC(G013006)的sgRNA的脱靶结构变异易位。
在编辑后第8天，收集实施例12的来自未经处理、未经编辑、化合物3和化合物4引导物样品的T细胞，短暂离心，并且将团粒直接用作用于使用“Zymo Quick DNA/RNA磁珠试剂盒”(Zymo目录号R2131)进行gDNA分离的输入材料。将UnIT结构变异表征测定应用于这些gDNA样品。高分子量基因组DNA用Tn5转座酶和具有部分Illumina P5序列和12bp独特分子标识符(UMI)的衔接子同时进行片段化和序列标记(‘片段化标记(tagmented)’)。使用P5引物和半嵌套基因特异性引物(GSP)的两个连续PCR将P7序列赋予Illumina，以产生每个样品两个Illumina相容性NGS文库(Illumina，参考号15033624)。用两个文库对CRISPR/Cas9靶向切割位点的两个方向进行测序允许推断和定量基因组编辑之后DNA修复结果中的结构变体。如果两个片段与不同染色体对齐，则将SV归类为“染色体间易位”。结构变异的量值示于图9A和表18中。插入百分比示于图9B和表19中。
表18.非预期结构变异
样品 平均值 SD
未经编辑 0.28 0.08
未经Pki处理 1.89 0.09
经化合物3处理 1.30 0.24
经化合物4处理 1.46 0.28
表19.插入百分比
样品 平均值 SD
未经编辑 0.11 0.19
未经Pki处理 32.02 4.41
经化合物3处理 68.35 3.99
经化合物4处理 67.82 2.98
实施例18-使用DNA-PKI的TRAC和TRBC引导物的脱靶分析
筛选来自实施例12的T细胞以验证靶向TRAC和TRBC的脱靶基因组位点并且是根据Integrated DNA Technologies，IDT rhAmpSeq rhPCR方案进行。在此实验中，筛选2种靶向TRAC和TRBC的sgRNA以及DNA-PKI化合物3和化合物4以验证脱靶概况。靶向TRAC(G013006)和TRBC(G016239)的sgRNA的经验证脱靶位点的数目示于表20中。如果p值小于0.05％插入/缺失，则验证脱靶位点。在针对靶向TRAC的sgRNA所鉴定的173个脱靶位点中，验证0个位点。在针对靶向TRBC的sgRNA所鉴定的92个脱靶位点中，验证0个位点。
表20.使用DNA-PKI的TRAC和TRBC引导序列的脱靶位点验证
实施例19-在具有或不具有DNA-PK抑制剂情况下的SpyCas9介导的TRAC内免疫受体插入
19.1.T细胞制备
健康人类供体血球分离术是商业获得的(Hemacare，目录号PB001F-2)，并且将细胞洗涤、重悬于PBS/EDTA缓冲液(Miltenyi Biotec目录号130-070-525)中并在MultiMACSTM Cell 24 Separator Plus装置(Miltenyi Biotec)中进行处理。使用Straight from />CD4/CD8MicroBead试剂盒(人类)(Miltenyi Biotec目录号130-122-352)经由正向选择分离T细胞。将T细胞等分并在/>CS10(StemCellTechnologies目录号07930)中冷冻保存以供将来使用。
在解冻之后，将T细胞以1.0x106个细胞/毫升的密度接种于由以下各者构成的T细胞生长培养基(TCGM)中：CTS OpTmizer T细胞扩增SFM和T细胞扩增补充物(ThermoFisher目录号A1048501)、5％人类AB血清(GeminiBio，目录号100-512)、1X青霉素-链霉素、1XGlutamax、10mM HEPES、200U/mL重组人类白细胞介素-2(Peprotech，目录号200-02)、5ng/ml重组人类白细胞介素7(Peprotech，目录号200-07)和5ng/mL重组人类白细胞介素15(Peprotech，目录号200-15)。将T细胞在此培养基中静置24小时，此时其经以按体积计1:100比率添加的T Cell TransActTM人类试剂(Miltenyi，目录号130-111-160)活化。T细胞在LNP处理之前活化48小时。
实施例19.2.T细胞处理和扩增
在活化后48小时，收集T细胞，以500g离心5分钟，并且以6.41x105个T细胞/毫升的浓度重悬于T细胞接种培养基(TCPM)中，所述培养基是一种无血清型式的TCGM，含有400U/mL重组人类白细胞介素-2(Peprotech，目录号200-02)、10ng/mL重组人类白细胞介素7(Peprotech，目录号200-07)和10ng/mL重组人类白细胞介素15(Peprotech，目录号200-15)。每孔添加50μL的于TCPM中的T细胞(3.2x104个T细胞)，在平底96孔板中进行处理。
如实施例1中所描述以50/38.5/10/1.5(脂质A/胆固醇/DSPC/PEG2k-DMG)的比率产生LNP。在T细胞处理之前，在T细胞处理培养基(TCTM)中制备两种单独的LNP混合物(下文称为混合物“A”和“B”)，所述T细胞处理培养基为含有20μg/mL rhApoE3，不存在白细胞介素2、15或7的TCGM型式。
混合物“A”由稀释至13.36μg/mL的具有G013006(SEQ ID NO:1)的LNP组成，而混合物“B”由稀释至13.36μg/mL的具有Cas9 mRNA 60(SEQ ID NO:11)的LNP组成。在37℃下温育LNP混合物“A”和“B”15分钟。混合物“A”在TCTM中以1:2连续稀释，并且按体积计与混合物“B”1:1混合。将25μL的所得溶液添加至96孔板中的3.2x104个T细胞中。
接下来，在存在或不存在经稀释至2μM的化合物4的情况下，呈编码HD3 TCR(SEQID NO:18)的腺相关病毒(AAV)形式的修复模板在TCTM中稀释至3.84x1011个基因组拷贝/毫升。将25μL的所得溶液添加至在先前步骤中已用LNP处理的T细胞中。为了在无修复模板干扰的情况下能够通过NGS实现编辑评估，此实验的组在无AAV存在下接受25μL的具有或不具有经稀释至2μM的化合物4的TCTM。
在添加LNP、修复模板和化合物4之后，将T细胞在37℃下温育48小时，此时T细胞以500g离心5分钟，重悬于200μL的TCGM中并且放回至温育箱。
在处理后第4天，将未接受AAV模板的细胞以500g离心5分钟，进行裂解、每个靶向基因座的PCR扩增和后续NGS分析，如实施例1中所描述。插入/缺失百分比的结果示于表21和图10A中。
也在处理后第4天，将接受AAV模板的细胞在TCGM中以1:4比率(v/v)混合并继代培养。在处理后第7天，通过流式细胞术评价接受AAV模板的细胞。
实施例19.3.流式细胞术
在LNP处理后第7天，将50μL的细胞转移至U底96孔板中并以500g短暂离心5分钟。丢弃上清液，将细胞重悬于100μL的含有以下的FACS缓冲液中：Viakrome 808(Beckman C.，目录号C36628)(1:100)、PC5.5抗CD3(Biolegend，目录号317336)(1:200)、BV421抗CD4(Biolegend，目录号317434)(1:100)、BV785抗CD8(Biolegend，目录号301046)(1:100)和抗Vβ7.2(Beckman C.，IM3604)(1:50)，并且在4℃下在暗处染色30分钟。将细胞用200μL FACS缓冲液洗涤一次，重悬于100μL的FACS缓冲液中并且在Cytoflex LX流式细胞仪上处理。HD3TCR插入百分比的结果示于表22和图10B中。
表21.在存在和不存在化合物4的情况下的插入/缺失百分比。
表22.在存在和不存在化合物4的情况下的HD3 TCR插入百分比。
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额外序列表
在下表和通篇中，术语“mA”、“mC”、“mU”或“mG”用于指示已经2'-O-Me修饰的核苷酸。
在下表中，“*”用于描绘PS修饰。在本申请中，术语A*、C*、U*或G*可用于指示用PS键连接至下一个(例如3')核苷酸的核苷酸。
应理解，如果相对于RNA提及DNA序列(包含Ts)，则Ts应经Us(取决于上下文，其可经修饰或未经修饰)置换，并且反之亦然。
在下表中，使用单氨基酸字母编码来提供肽序列。
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Claims (241)

1.一种化合物，所述化合物具有式I结构：
或其盐，
其中：
x1为C-R3或N；
R1为C1-C3烷基；
R2为环烷基或杂环基，并且环烷基和杂环基任选地被一个或多个R6取代；
R3为H或C1-C3烷基；
R4为H或C1-C3烷基；
R5为C1-C3烷基；
每个R6独立地选自羟基、卤基、烷基、烷氧基、环烷基、氨基和氰基，或两个R6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环；并且
R7为H或C1-C3烷基，
条件是以下中的至少一者适用：
(a)x1为C-R3；
(b)R1为C2-C3烷基；
(c)R4为C1-C3烷基；
(d)R2被一个R6取代，并且R6为卤基；
(e)R2被两个R6取代，所述两个R6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环；并且
(f)R2为任选地被一个或多个R6取代的C3-C5环烷基。
2.如权利要求1所述的化合物，其中x1为C-R3。
3.如权利要求2所述的化合物，其中R3为H或甲基。
4.如权利要求1所述的化合物，其中x1为N。
5.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R1为C2-C3烷基。
6.如权利要求1-4中任一项所述的化合物，其中R1选自甲基和乙基。
7.如权利要求6所述的化合物，其中R1为甲基。
8.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R4为C1-C3烷基。
9.如权利要求1-7中任一项所述的化合物，其中R4为H或甲基。
10.如权利要求9所述的化合物，其中R4为H。
11.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R2为环烷基。
12.如权利要求11所述的化合物，其中R2为C3-C7环烷基。
13.如权利要求12所述的化合物，其中R2为环己基。
14.如权利要求1-12中任一项所述的化合物，其中R2为C3-C5环烷基。
15.如权利要求1-10中任一项所述的化合物，其中R2为杂环基。
16.如权利要求15所述的化合物，其中R2为5元至7元杂环基。
17.如权利要求16所述的化合物，其中R2为四氢吡喃基。
18.如权利要求16所述的化合物，其中R2为四氢呋喃基。
19.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R2任选地被一个或多个独立地选自羟基、卤基和环烷基的R6取代，或两个R6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环。
20.如权利要求19所述的化合物，其中R2被一个或多个R6取代；并且每个R6为卤基或羟基。
21.如权利要求20所述的化合物，其中R2被一个R6取代，并且R6为卤基。
22.如权利要求20或21所述的化合物，其中每个R6为氟。
23.如权利要求19所述的化合物，其中R2被两个R6取代，所述两个R6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环。
24.如权利要求1-18中任一项所述的化合物，其中R2任选地被一个或多个独立地选自羟基、甲氧基和甲基的R6取代。
25.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R5为甲基。
26.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中R7为H或甲基。
27.一种化合物，所述化合物选自：
或其盐。
28.如权利要求27所述的化合物，其中所述化合物为或其盐。
29.如权利要求27所述的化合物，其中所述化合物为或其盐。
30.如权利要求27所述的化合物，其中所述化合物为或其盐。
31.如权利要求27所述的化合物，其中所述化合物为或其盐。
32.如权利要求27所述的化合物，其中所述化合物为或其盐。
33.如权利要求27所述的化合物，其中所述化合物为或其盐。
34.如权利要求27所述的化合物，其中所述化合物为
或其盐。
35.如权利要求1-34中任一项所述的化合物，其中所述化合物为游离碱。
36.如权利要求1-34中任一项所述的化合物，其中所述化合物为盐。
37.如权利要求36所述的化合物，其中所述盐包含三氟甲磺酸根阴离子。
38.一种组合物，所述组合物包含：
a)DNA蛋白质激酶抑制剂(DNA-PKI)；
b)DNA切割剂；
c)任选地，细胞；和
d)任选地，供体DNA；
其中所述DNA-PKI是式I化合物
或其盐，
其中：
x1为C-R3或N；
R1为C1-C3烷基；
R2为环烷基或杂环基，并且环烷基和杂环基任选地被一个或多个R6取代；
R3为H或C1-C3烷基；
R4为H或C1-C3烷基；
R5为C1-C3烷基；
每个R6独立地选自羟基、卤基、烷基、烷氧基、环烷基、氨基和氰基，或两个R6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环；并且
R7为H或C1-C3烷基。
39.如权利要求38所述的组合物，其中x1为N。
40.如权利要求38或39所述的组合物，其中R1为甲基。
41.如权利要求38-40中任一项所述的组合物，其中R4为H。
42.如权利要求38-41中任一项所述的组合物，其中R2为环己基。
43.如权利要求38-41中任一项所述的组合物，其中R2为四氢吡喃基。
44.如权利要求38-41中任一项所述的组合物，其中R2为四氢呋喃基。
45.如权利要求38-44中任一项所述的组合物，其中R2任选地被一个或多个独立地选自羟基、甲氧基和甲基的R6取代。
46.如权利要求38-45中任一项所述的组合物，其中R5为甲基。
47.如权利要求38-46中任一项所述的组合物，其中R7为H或甲基。
48.如权利要求38所述的组合物，其中所述DNA-PKI为如权利要求1-37中任一项所述的化合物。
49.一种组合物，所述组合物包含：
a)DNA蛋白质激酶抑制剂(DNA-PKI)；
b)DNA切割剂；
c)任选地，细胞；和
d)任选地，供体DNA；
其中所述DNA-PKI选自：
或其盐。
50.如权利要求49所述的组合物，其中所述DNA-PKI为或其盐。
51.如权利要求49所述的组合物，其中所述DNA-PKI为或其盐。
52.如权利要求49所述的组合物，其中所述DNA-PKI为或其盐。
53.如权利要求49所述的组合物，其中所述DNA-PKI为或其盐。
54.如权利要求49所述的组合物，其中所述DNA-PKI为或其盐。
55.如权利要求49所述的组合物，其中所述DNA-PKI为或其盐。
56.如权利要求49所述的组合物，其中所述DNA-PKI为或其盐。
57.如权利要求49所述的组合物，其中所述DNA-PKI为或其盐。
58.如权利要求38-57中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的所述DNA-PKI的浓度为约1μM或更低。
59.如权利要求58所述的组合物，其中所述组合物中的所述DNA-PKI的浓度为约0.25μM或更低。
60.如权利要求38-57中任一项所述的组合物，其中所述组合物中的所述DNA-PKI的浓度为约0.1-1μM。
61.如权利要求60所述的组合物，其中所述组合物中的所述DNA-PKI的浓度为约0.1-0.5μM。
62.如权利要求38-61中任一项所述的组合物，所述组合物包含细胞。
63.如权利要求62所述的组合物，其中所述细胞为真核细胞。
64.如权利要求62所述的组合物，其中所述细胞为肝细胞。
65.如权利要求62所述的组合物，其中所述细胞可用于过继性细胞疗法(ACT)。
66.如权利要求65所述的组合物，其中所述细胞可用于过继性细胞疗法。
67.如权利要求65或66所述的组合物，其中所述细胞为干细胞。
68.如权利要求67所述的组合物，其中所述干细胞为造血干细胞(HSC)或诱导多能干细胞(iPSC)。
69.如权利要求65-68中任一项所述的组合物，其中所述细胞为免疫细胞。
70.如权利要求69所述的组合物，其中所述免疫细胞为白细胞或淋巴细胞。
71.如权利要求70所述的组合物，其中所述免疫细胞为淋巴细胞。
72.如权利要求71所述的组合物，其中所述淋巴细胞为T细胞、B细胞或NK细胞。
73.如权利要求71所述的组合物，其中所述淋巴细胞为T细胞。
74.如权利要求73所述的组合物，其中T细胞为原代T细胞。
75.如权利要求73所述的组合物，其中T细胞为调控T细胞。
76.如权利要求73-75中任一项所述的组合物，其中所述淋巴细胞为活化T细胞。
77.如权利要求73-75中任一项所述的组合物，其中所述淋巴细胞为非活化T细胞。
78.如权利要求62-77中任一项所述的组合物，其中所述细胞为人类细胞。
79.如权利要求38-78中任一项所述的组合物，其中所述DNA切割剂包含CRISPR/Cas核酸酶组分和任选地引导RNA组分。
80.如权利要求79所述的组合物，其中所述DNA切割剂选自锌指核酸酶、TALE效应子域核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas核酸酶组分和其组合。
81.如权利要求79所述的组合物，其中所述DNA切割剂为CRISPR/Cas核酸酶组分和引导RNA组分。
82.如权利要求81所述的组合物，其中所述CRISPR/Cas核酸酶组分包含Cas核酸酶或编码所述Cas核酸酶的mRNA。
83.如权利要求82所述的组合物，其中所述CRISPR/Cas核酸酶组分包含编码所述Cas核酸酶的mRNA。
84.如权利要求82或83所述的组合物，其中所述Cas核酸酶为第2类Cas核酸酶。
85.如权利要求84所述的组合物，其中所述Cas核酸酶为Cas9核酸酶。
86.如权利要求85所述的组合物，其中所述Cas核酸酶为化脓性链球菌Cas9核酸酶。
87.如权利要求85所述的组合物，其中所述Cas核酸酶为脑膜炎双球菌Cas9核酸酶。
88.如权利要求85所述的组合物，其中所述Cas核酸酶为Nme2Cas9。
89.如权利要求81或82所述的组合物，其中所述Cas核酸酶为Cas12a核酸酶。
90.如权利要求38-89中任一项所述的组合物，所述组合物包含经修饰的RNA。
91.如权利要求79-90中任一项所述的组合物，其中所述引导RNA组分为引导RNA核酸，例如引导RNA。
92.如权利要求91所述的组合物，其中所述引导RNA核酸为gRNA。
93.如权利要求91或92所述的组合物，其中所述引导RNA核酸为双引导RNA(dgRNA)或编码双引导RNA(dgRNA)。
94.如权利要求91或92所述的组合物，其中所述引导RNA核酸为单引导(sgRNA)或编码单引导(sgRNA)。
95.如权利要求92-94中任一项所述的组合物，其中所述gRNA为经修饰的gRNA。
96.如权利要求95所述的组合物，其中所述经修饰的gRNA在5'端处包含在前五个核苷酸中的一者或多者处的修饰。
97.如权利要求95或96所述的组合物，其中所述经修饰的gRNA在3'端处包含在最后五个核苷酸中的一者或多者处的修饰。
98.如权利要求38-97中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含引导RNA核酸和第2类Cas核酸酶mRNA；并且所述mRNA与所述引导RNA核酸的比率按重量计为约2:1至1:4。
99.如权利要求38-98中任一项所述的组合物，所述组合物包含所述供体DNA。
100.如权利要求99所述的组合物，其中所述供体DNA包含模板，所述模板包含编码蛋白质的序列、调控序列或编码结构RNA的序列。
101.如权利要求38-100中任一项所述的组合物，其中所述DNA切割剂存在于脂质核酸组装组合物中。
102.如权利要求101所述的组合物，其中所述脂质核酸组装组合物为脂质纳米颗粒(LNP)组合物。
103.如权利要求102所述的组合物，其中所述LNP的直径为约10-200nm、约20-150nm、约50-150nm、约50-100nm、约50-120nm、约60-100nm、约75-150nm、约75-120nm或约75-100nm。
104.如权利要求102或103所述的组合物，其中所述组合物包含平均直径为约10-200nm、约20-150nm、约50-150nm、约50-100nm、约50-120nm、约60-100nm、约75-150nm、约75-120nm或约75-100nm的所述LNP的群体。
105.如权利要求104所述的组合物，其中所述平均直径为Z平均直径。
106.如权利要求101所述的组合物，其中所述脂质核酸组装组合物为脂质复合物。
107.如权利要求101-106中任一项所述的组合物，其中所述脂质核酸组装组合物包含可离子化脂质。
108.如权利要求107所述的组合物，其中所述可离子化脂质的pKa为约5.1至7.4，例如约5.5至6.6、约5.6至6.4、约5.8至6.2或约5.8至6.5。
109.如权利要求101-108中任一项所述的组合物，其中所述脂质核酸组装组合物包含辅助脂质。
110.如权利要求101-109中任一项所述的组合物，其中所述脂质核酸组装组合物包含中性脂质。
111.如权利要求101-110中任一项所述的组合物，其中所述脂质核酸组装组合物包含PEG脂质。
112.如权利要求101-111中任一项所述的组合物，其中所述脂质核酸组装组合物的N/P比为约3-10。
113.如权利要求112所述的组合物，其中所述脂质核酸组装组合物的所述N/P比为约5-7。
114.如权利要求113所述的组合物，其中所述脂质核酸组装组合物的所述N/P比为约6。
115.如权利要求38-114中任一项所述的组合物，所述组合物还包含载体。
116.如权利要求115所述的组合物，其中所述载体编码所述DNA切割剂。
117.如权利要求115或116所述的组合物，其中所述载体编码所述供体DNA。
118.如权利要求115-117中任一项所述的组合物，其中所述载体为病毒载体。
119.如权利要求115-117中任一项所述的组合物，其中所述载体为非病毒载体。
120.如权利要求118所述的组合物，其中所述载体为慢病毒载体。
121.如权利要求118所述的组合物，其中所述载体为逆转录病毒载体。
122.如权利要求118所述的组合物，其中所述载体为AAV。
123.如权利要求62所述的组合物，其中所述细胞不为癌细胞。
124.一种在细胞中进行靶向基因组编辑的方法，所述方法包括使所述细胞与DNA切割剂和DNA-PKI接触，其中所述DNA-PKI是式I化合物
或其盐，
其中：
x1为C-R3或N；
R1为C1-C3烷基；
R2为环烷基或杂环基，并且环烷基和杂环基任选地被一个或多个R6取代；
R3为H或C1-C3烷基；
R4为H或C1-C3烷基；
R5为C1-C3烷基；
每个R6独立地选自羟基、卤基、烷基、烷氧基、环烷基、氨基和氰基，或两个R6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环；并且
R7为H或C1-C3烷基。
125.一种在细胞基因组中修复双链DNA断裂的方法，所述方法包括使所述细胞与DNA切割剂和DNA-PKI接触，其中所述DNA-PKI是式I化合物
或其盐，
其中：
x1为C-R3或N；
R1为C1-C3烷基；
R2为环烷基或杂环基，并且环烷基和杂环基任选地被一个或多个R6取代；
R3为H或C1-C3烷基；
R4为H或C1-C3烷基；
R5为C1-C3烷基；
每个R6独立地选自羟基、卤基、烷基、烷氧基、环烷基、氨基和氰基，或两个R6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环；并且
R7为H或C1-C3烷基。
126.一种抑制或遏制经由非同源末端连接(NHEJ)途径修复细胞中的DNA断裂的方法，所述方法包括使所述细胞与DNA切割剂和DNA-PKI接触，其中所述DNA-PKI是式I化合物
或其盐，
其中：
x1为C-R3或N；
R1为C1-C3烷基；
R2为环烷基或杂环基，并且环烷基和杂环基任选地被一个或多个R6取代；
R3为H或C1-C3烷基；
R4为H或C1-C3烷基；
R5为C1-C3烷基；
每个R6独立地选自羟基、卤基、烷基、烷氧基、环烷基、氨基和氰基，或两个R6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环；并且
R7为H或C1-C3烷基。
127.一种将供体DNA靶向插入至细胞基因组中的方法，所述方法包括使所述细胞与DNA切割剂、所述供体DNA和DNA-PKI接触，其中所述DNA-PKI是式I化合物
或其盐，
其中：
x1为C-R3或N；
R1为C1-C3烷基；
R2为环烷基或杂环基，并且环烷基和杂环基任选地被一个或多个R6取代；
R3为H或C1-C3烷基；
R4为H或C1-C3烷基；
R5为C1-C3烷基；
每个R6独立地选自羟基、卤基、烷基、烷氧基、环烷基、氨基和氰基，或两个R6与其所键合的一个或多个原子共同形成螺环或稠环；并且
R7为H或C1-C3烷基。
128.如权利要求124-127中任一项所述的方法，所述方法包括使所述细胞在不含所述DNA-PKI的细胞培养基中生长，以及添加所述DNA-PKI至所述细胞培养基。
129.如权利要求124-128中任一项所述的方法，所述方法包括在使所述细胞与所述DNA-PKI接触之前，使所述细胞与所述DNA切割剂接触。
130.如权利要求129所述的方法，所述方法包括在使所述细胞与所述DNA切割剂接触约六小时内，使所述细胞与所述DNA-PKI接触。
131.如权利要求130所述的方法，所述方法包括在使所述细胞与所述DNA切割剂接触约三小时内，使所述细胞与所述DNA-PKI接触。
132.如权利要求124-128中任一项所述的方法，所述方法包括使所述细胞和所述DNA切割剂同时与所述DNA-PKI接触。
133.如权利要求124-128中任一项所述的方法，所述方法包括在使所述细胞与所述DNA-PKI接触之后，使所述细胞与所述DNA切割剂接触。
134.如权利要求133所述的方法，所述方法包括在使所述细胞与所述DNA-PKI接触约三小时内，使所述细胞与所述DNA切割剂接触。
135.如权利要求133或134所述的方法，所述方法包括使所述细胞在包含所述DNA-PKI的细胞培养基中生长。
136.如权利要求124-135中任一项所述的方法，其中使所述细胞与所述DNA切割剂和所述DNA-PKI接触至少约一天。
137.如权利要求136所述的方法，其中使所述细胞与所述DNA切割剂和所述DNA-PKI接触约一天至一周。
138.如权利要求137所述的方法，其中使所述细胞与所述DNA切割剂和所述DNA-PKI接触约五天。
139.如权利要求124-138中任一项所述的方法，其中x1为N。
140.如权利要求124-139中任一项所述的方法，其中R1为甲基。
141.如权利要求124-140中任一项所述的方法，其中R4为H。
142.如权利要求124-141中任一项所述的方法，其中R2为环己基。
143.如权利要求124-141中任一项所述的方法，其中R2为四氢吡喃基。
144.如权利要求124-141中任一项所述的方法，其中R2为四氢呋喃基。
145.如权利要求124-144中任一项所述的方法，其中R2任选地被一个或多个独立地选自羟基、甲氧基和甲基的R6取代。
146.如权利要求124-145中任一项所述的方法，其中R5为甲基。
147.如权利要求124-146中任一项所述的方法，其中R7为H或甲基。
148.如权利要求124-147中任一项所述的方法，其中所述DNA-PKI为如权利要求1-37中任一项所述的化合物。
149.一种在细胞中进行靶向基因组编辑的方法，所述方法包括使所述细胞与DNA切割剂和DNA-PKI接触，其中所述DNA-PKI选自：
/>
/>
或其盐。
150.一种在细胞基因组中修复双链DNA断裂的方法，所述方法包括使所述细胞与DNA切割剂和DNA-PKI接触，其中所述DNA-PKI选自：
/>
或其盐。
151.一种抑制或遏制经由非同源末端连接(NHEJ)途径修复细胞中的DNA断裂的方法，所述方法包括使所述细胞与DNA切割剂和DNA-PKI接触，其中所述DNA-PKI选自：
/>
或其盐。
152.一种将供体DNA靶向插入至细胞基因组中的方法，所述方法包括使所述细胞与DNA切割剂、所述供体DNA和DNA-PKI接触，其中所述DNA-PKI选自：
/>
/>
或其盐。
153.如权利要求149-152中任一项所述的方法，其中所述DNA-PKI为
或其盐。
154.如权利要求149-152中任一项所述的方法，其中所述DNA-PKI为
或其盐。
155.如权利要求149-152中任一项所述的方法，其中所述DNA-PKI为
或其盐。
156.如权利要求149-152中任一项所述的方法，其中所述DNA-PKI为
或其盐。
157.如权利要求149-152中任一项所述的方法，其中所述DNA-PKI为
或其盐。
158.如权利要求149-152中任一项所述的方法，其中所述DNA-PKI为
或其盐。
159.如权利要求149-152中任一项所述的方法，其中所述DNA-PKI为
或其盐。
160.如权利要求149-152中任一项所述的方法，其中所述DNA-PKI为
或其盐。
161.如权利要求124-160中任一项所述的方法，其中使所述细胞与细胞培养基中的所述DNA-PKI接触，其中所述细胞培养基中的所述DNA-PKI的浓度为约1μM或更低。
162.如权利要求161所述的方法，其中所述细胞培养基中的所述DNA-PKI的浓度为约0.25μM或更低。
163.如权利要求124-160中任一项所述的方法，其中使所述细胞与细胞培养基中的所述DNA-PKI接触，其中所述细胞培养基中的所述DNA-PKI的浓度为约0.1-1μM。
164.如权利要求163所述的方法，其中所述细胞培养基中的所述DNA-PKI的浓度为约0.1-0.5μM。
165.如权利要求124-164中任一项所述的方法，其中所述细胞为真核细胞。
166.如权利要求165所述的方法，其中所述细胞为肝细胞。
167.如权利要求124-165中任一项所述的方法，其中所述细胞可用于过继性细胞疗法(ACT)。
168.如权利要求167所述的方法，其中所述细胞可用于自体细胞疗法。
169.如权利要求124-165中任一项所述的方法，其中所述细胞为干细胞。
170.如权利要求169所述的方法，其中所述干细胞为造血干细胞(HSC)。
171.如权利要求169所述的方法，其中所述细胞为诱导多能干细胞(iPSC)。
172.如权利要求168所述的方法，其中所述细胞为免疫细胞。
173.如权利要求172所述的方法，其中所述免疫细胞为白细胞或淋巴细胞。
174.如权利要求173所述的方法，其中所述免疫细胞为淋巴细胞。
175.如权利要求174所述的方法，其中所述淋巴细胞为T细胞、B细胞或NK细胞。
176.如权利要求175所述的方法，其中所述淋巴细胞为T细胞。
177.如权利要求176所述的方法，其中T细胞为原代T细胞。
178.如权利要求176所述的方法，其中T细胞为调控T细胞。
179.如权利要求174-178中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞为活化T细胞。
180.如权利要求174-178中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞为非活化T细胞。
181.如权利要求124-180中任一项所述的方法，其中所述细胞为人类细胞。
182.如权利要求124-181中任一项所述的方法，其中所述DNA切割剂选自锌指核酸酶、TALE效应子域核酸酶(TALEN)、CRISPR/Cas核酸酶组分和其组合。
183.如权利要求182所述的方法，其中所述DNA切割剂为CRISPR/Cas核酸酶组分。
184.如权利要求183所述的方法，其中所述CRISPR/Cas核酸酶组分包含Cas核酸酶或编码所述Cas核酸酶的mRNA。
185.如权利要求184所述的方法，其中所述CRISPR/Cas核酸酶组分包含编码所述Cas核酸酶的mRNA。
186.如权利要求184或185所述的方法，其中所述Cas核酸酶为第2类Cas核酸酶。
187.如权利要求186所述的方法，其中所述Cas核酸酶为Cas9核酸酶。
188.如权利要求187所述的方法，其中所述Cas核酸酶为化脓性链球菌Cas9核酸酶。
189.如权利要求187所述的方法，其中所述Cas核酸酶为脑膜炎双球菌Cas9核酸酶。
190.如权利要求187所述的方法，其中所述Cas核酸酶为Nme2Cas9。
191.如权利要求186所述的方法，其中所述Cas核酸酶为Cas12a核酸酶。
192.如权利要求124-191中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述细胞与经修饰的RNA接触。
193.如权利要求124-192中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述细胞与引导RNA核酸接触。
194.如权利要求193所述的方法，其中所述引导RNA核酸为gRNA。
195.如权利要求193或194所述的方法，其中所述引导RNA核酸为双引导RNA(dgRNA)或编码双引导RNA(dgRNA)。
196.如权利要求193或194所述的方法，其中所述引导RNA核酸为单引导(sgRNA)或编码单引导(sgRNA)。
197.如权利要求194-196中任一项所述的方法，其中所述gRNA为经修饰的gRNA。
198.如权利要求197所述的方法，其中所述经修饰的gRNA在5'端处包含在前五个核苷酸中的一者或多者处的修饰。
199.如权利要求197或198所述的方法，其中所述经修饰的gRNA在3'端处包含在最后五个核苷酸中的一者或多者处的修饰。
200.如权利要求193-199中任一项所述的方法，其中所述DNA切割剂为第2类Cas核酸酶mRNA；并且所述mRNA与所述引导RNA核酸的比率按重量计为约2:1至1:4。
201.如权利要求124-200中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述细胞与供体DNA接触。
202.如权利要求201所述的方法，所述方法包括使所述细胞与包含所述供体DNA的载体接触。
203.如权利要求201或202所述的方法，其中所述供体DNA包含模板，所述模板包含编码蛋白质的序列、调控序列、编码结构RNA的序列。
204.如权利要求203所述的方法，其中模板序列经由同源定向修复(HDR)整合至所述细胞的所述基因组中。
205.如权利要求124-205中任一项所述的方法，所述方法包括使所述细胞与包含所述DNA切割剂的脂质核酸组装组合物接触。
206.如权利要求205所述的方法，其中所述脂质核酸组装组合物为脂质纳米颗粒(LNP)组合物。
207.如权利要求206所述的方法，其中所述LNP的直径为约10-200nm、约20-150nm、约50-150nm、约50-100nm、约50-120nm、约60-100nm、约75-150nm、约75-120nm或约75-100nm。
208.如权利要求206或207所述的方法，所述方法包括使所述细胞与所述LNP的群体接触，所述LNP的群体的平均直径为约10-200nm、约20-150nm、约50-150nm、约50-100nm、约50-120nm、约60-100nm、约75-150nm、约75-120nm或约75-100nm。
209.如权利要求207或208所述的方法，其中所述平均直径为Z平均直径。
210.如权利要求205-209中任一项所述的方法，其中所述脂质核酸组装组合物包含可离子化脂质。
211.如权利要求210所述的方法，其中所述可离子化脂质的pKa为约5.1至7.4，例如约5.5至6.6、约5.6至6.4、约5.8至6.2或约5.8至6.5。
212.如权利要求205-211中任一项所述的方法，其中所述脂质核酸组装组合物包含辅助脂质。
213.如权利要求205-212中任一项所述的方法，其中所述脂质核酸组装组合物包含中性脂质。
214.如权利要求205-213中任一项所述的方法，其中所述脂质核酸组装组合物包含PEG脂质。
215.如权利要求205-214中任一项所述的方法，其中所述脂质核酸组装组合物的N/P比为约3-10。
216.如权利要求215所述的方法，其中所述脂质核酸组装组合物的所述N/P比为约5-7。
217.如权利要求216所述的方法，其中所述脂质核酸组装组合物的所述N/P比为约6。
218.如权利要求124-217中任一项所述的方法，所述方法还包括使所述细胞与载体接触。
219.如权利要求218所述的方法，其中所述载体编码所述DNA切割剂。
220.如权利要求218或219所述的方法，其中所述载体编码供体DNA。
221.如权利要求218-220中任一项所述的方法，其中所述载体为病毒载体。
222.如权利要求218-220中任一项所述的方法，其中所述载体为非病毒载体。
223.如权利要求221所述的方法，其中所述载体为慢病毒载体。
224.如权利要求221所述的方法，其中所述载体为逆转录病毒载体。
225.如权利要求221所述的方法，其中所述载体为AAV。
226.如权利要求124-225中任一项所述的方法，其中所述DNA切割剂与所述细胞的所述基因组内的目标序列相互作用，从而引起双链DNA断裂(DSB)。
227.如权利要求124-226中任一项所述的方法，其中所述方法引起基因敲除。
228.如权利要求124-227中任一项所述的方法，其中所述方法引起基因校正。
229.如权利要求124-227中任一项所述的方法，其中所述方法引起基因插入。
230.如权利要求203-229中任一项所述的方法，其中所述供体DNA包含模板，所述模板包含编码蛋白质的外源核酸。
231.如权利要求230所述的方法，其中所述蛋白质选自细胞因子、免疫抑制剂、抗体、受体和酶。
232.如权利要求231所述的方法，其中所述蛋白质为受体。
233.如权利要求231或232所述的方法，其中所述受体选自免疫受体、T细胞受体(TCR)和嵌合抗原受体。
234.如权利要求233所述的方法，其中所述受体为免疫受体。
235.如权利要求233所述的方法，其中所述受体为TCR。
236.如权利要求230所述的方法，其中所述外源核酸编码TCR的TCRα链和/或TCRβ链。
237.如权利要求233所述的方法，其中所述受体为嵌合抗原受体。
238.如权利要求230-236中任一项所述的方法，其中所述DNA切割剂与所述细胞的所述基因组内的目标序列相互作用，从而引起双链DNA断裂(DSB)。
239.如权利要求230-237中任一项所述的方法，其中所述DNA切割剂与T细胞的TRAC基因内的目标序列相互作用。
240.如权利要求230-238中任一项所述的方法，其中所述模板整合至所述T细胞的所述TRAC基因中。
241.如权利要求230-239中任一项所述的方法，其中所述模板包含第一同源臂和第二同源臂，其分别与位于裂解位点上游和下游的序列互补。
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