JP2024515650A - 脂質ナノ粒子組成物 - Google Patents

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ラクシェ，ヴィシャル
プロデウス，アーロン
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インテリア セラピューティクス，インコーポレーテッド
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Abstract

本開示は、イオン化可能な脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物であって、生物学的に活性な薬剤の送達、例えば、操作細胞の調製のために生物学的に活性な薬剤を細胞に送達するのに有用である、ＬＮＰ組成物を提供する。本明細書で開示するＬＮＰ組成物は、遺伝子編集の方法、生物学的に活性な薬剤を送達する方法、及びＤＮＡを修飾または切断する方法に有用である。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６３／１７６２２７号（２０２１年４月１７日出願）、米国仮特許出願第６３／２５４９４８号（２０２１年１０月１２日出願）、米国仮特許出願第６３／２７４１５３号（２０２１年１１月１日出願）、及び米国仮特許出願第６３／３１６５６８号（２０２２年３月４日出願）に対する優先権の利益を主張し、これらの各出願の全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
イオン化可能な脂質を用いて製剤化された脂質ナノ粒子は、生物学的に活性な薬剤、特にポリヌクレオチド、例えばＲＮＡ（ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを含む）を細胞内に送達するためのカーゴビヒクルとして機能することができる。イオン化可能な脂質を含むＬＮＰ組成物は、細胞膜を横断したオリゴヌクレオチド薬剤の送達を促進することができ、また、遺伝子編集用の構成要素及び組成物を生細胞に導入するために使用することができる。細胞への送達が特に困難な生物学的に活性な薬剤としては、タンパク質、核酸ベース薬剤、及びその誘導体、特にｍＲＮＡのような比較的大きなオリゴヌクレオチドを含む薬剤が挙げられる。細胞に有望な遺伝子編集技術を送達するための、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの構成要素（例えば、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及び関連するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ））を送達するための組成物が特に注目されている。
ｉｎ ｖｉｖｏ及び ｉｎ ｖｉｔｒｏで核酸（例えば、ＲＮＡ）の送達を改善するための組成物に対するニーズが存在する。一例として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの構成要素を真核細胞（例えば、ヒト細胞）に送達するための組成物が必要とされている。詳細には、ＣＲＩＳＰＲタンパク質構成要素をコードするｍＲＮＡを送達するための組成物、及びＣＲＩＳＰＲ ｇＲＮＡを送達するための組成物が特に関心対象となる。また、ＲＮＡ構成要素を安定化させ送達することができるｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの送達に有用な特性を有する組成物も特に関心対象となる。
本開示は、脂質組成物（例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物）を提供する。このような脂質組成物は、例えば、核酸カーゴ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集構成要素）を含む生物学的薬剤を細胞に送達するのに有利な特性を有し得る。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、
核酸構成要素、及び
脂質構成要素を含み、当該脂質構成要素は、
ａ）脂質構成要素の約２５～４５ｍｏｌ％の量のイオン化可能な脂質、
ｂ）脂質構成要素の約１０～３０ｍｏｌ％の量の中性脂質、
ｃ）脂質構成要素の約２５～６５ｍｏｌ％の量のヘルパー脂質、及び
ｄ）脂質構成要素の約１．５～３．５ｍｏｌ％の量のＰＥＧ脂質を含み、
イオン化可能な脂質は、式（Ｉ）の化合物
Figure 2024515650000001
 （式中、
Ｘ１はＯ、ＮＨ、または直接結合であり、
Ｘ２はＣ２～３アルキレンであり、
Ｒ３はＣ１～３アルキルであり、
Ｒ２はＣ１～３アルキルであり、または
Ｒ２は、それが結合する窒素原子及びＸ２の２～３個の炭素原子と一緒になって５員もしくは６員環を形成し、または
Ｒ２は、Ｒ３及びそれらが結合している窒素原子と一緒になって５員環を形成し、
Ｙ１はＣ６～１０アルキレンであり、
Ｙ２は
Figure 2024515650000002
 から選択され、
Ｒ４はＣ４～１１アルキルであり、
Ｚ１はＣ２～５アルキレンであり、
Ｚ２は
Figure 2024515650000003
 または不在であり、
Ｒ５は、Ｃ６～８アルキル、Ｃ５～１０アルコキシ（例えば、－ＯＣ５～１０ハロアルキル）、－Ｏ（Ｃ２～３アルキル）ＯＣ６～１０アルキル、－ＯＣ６～１０アルケニル（例えば、－ＯＣ６～１０分枝状アルケニル）、もしくは－ＯＣ６～１０アルキニルであり、
Ｒ６は、Ｃ６～８アルキル、Ｃ５～１０アルコキシ（例えば、－ＯＣ５～１０ハロアルキル）、－Ｏ（Ｃ２～３アルキル）ＯＣ６～１０アルキル、－ＯＣ６～１０アルケニル（例えば、－ＯＣ６～１０分枝アルケニル）、もしくは－ＯＣ６～１０アルキニルであり、または
Ｒ５はＲ６と一緒になって、ジェミナルなＣ６～８アルキルにより置換された６員環のアセタールを形成する）
またはその塩を含む。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、
生物学的に活性な薬剤、及び
脂質構成要素を含み、当該脂質構成要素は、
ａ）脂質構成要素の約２５～４５ｍｏｌ％の量のイオン化可能な脂質、
ｂ）脂質構成要素の約１０～３０ｍｏｌ％の量の中性脂質、
ｃ）脂質構成要素の約２５～６５ｍｏｌ％の量のヘルパー脂質、及び
ｄ）脂質構成要素の約１．５～３．５ｍｏｌ％の量のＰＥＧ脂質を含み、
イオン化可能な脂質は、式（Ｉ）の化合物
Figure 2024515650000004
 （式中、
Ｘ１はＯ、ＮＨ、または直接結合であり、
Ｘ２はＣ２～３アルキレンであり、
Ｒ３はＣ１～３アルキルであり、
Ｒ２はＣ１～３アルキルであり、または
Ｒ２は、それが結合する窒素原子及びＸ２の２～３個の炭素原子と一緒になって５員もしくは６員環を形成し、または
Ｒ２は、Ｒ３及びそれらが結合している窒素原子と一緒になって５員環を形成し、
Ｙ１はＣ６～１０アルキレンであり、
Ｙ２は
Figure 2024515650000005
 から選択され、
Ｒ４はＣ４～１１アルキルであり、
Ｚ１はＣ２～５アルキレンであり、
Ｚ２は
Figure 2024515650000006
 または不在であり、
Ｒ５はＣ６～８アルキルまたはＣ６～８アルコキシであり、
Ｒ６はＣ６～８アルキルまたはＣ６～８アルコキシである）
またはその塩を含む。
ある特定の実施形態において、イオン化可能な脂質の量は脂質構成要素の約２９～４４ｍｏｌ％であり、中性脂質の量は脂質構成要素の約１１～２８ｍｏｌ％であり、ヘルパー脂質の量は脂質構成要素の約２８～５５ｍｏｌ％であり、ＰＥＧ脂質の量は脂質構成要素の約２．３～３．５ｍｏｌ％である。
いくつかの実施形態において、イオン化可能な脂質の量は脂質構成要素の約３３ｍｏｌ％であり、中性脂質の量は脂質構成要素の約１５ｍｏｌ％であり、ヘルパー脂質の量は脂質構成要素の約４９ｍｏｌ％であり、ＰＥＧ脂質の量は脂質構成要素の約３ｍｏｌ％である。
ある特定の実施形態において、イオン化可能な脂質は
Figure 2024515650000007
 またはその塩であり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ヘルパー脂質はコレステロールであり、ＰＥＧ脂質は１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００である。
ある特定の実施形態において、ＬＮＰは約１４５ｎｍ未満、例えば約１２０ｎｍ未満、約１１５ｎｍ未満、または約１００ｎｍ未満のＺ平均直径を有する。ある特定の実施形態において、ＬＮＰは約５０ｎｍ超、例えば約６０ｎｍ超の数平均直径を有する。
ある特定の実施形態において、ＬＮＰは約０．００５～約０．７５、例えば約０．００５～約０．１の多分散指数を有する。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約５～約７、好ましくは約６である。
ある特定の実施形態において、本開示は、核酸構成要素がＲＮＡ構成要素である、本明細書に記載の任意のＬＮＰ組成物に関する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ構成要素はｍＲＮＡを含む。好ましい実施形態において、本開示は、ＲＮＡ構成要素が、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤、例えば、ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ、例えば、クラス２ ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ、またはＣａｓ９ヌクレアーゼｍＲＮＡを含む、本明細書に記載の任意のＬＮＰ組成物に関する。
ある特定の実施形態において、本開示は、ｍＲＮＡが修飾ｍＲＮＡである、本明細書に記載の任意のＬＮＰ組成物に関する。いくつかの実施形態において、本開示は、ＲＮＡ構成要素がｇＲＮＡ核酸を含む、本明細書に記載の任意のＬＮＰ組成物に関する。ある特定の実施形態において、本開示は、ｇＲＮＡ核酸がｇＲＮＡである、本明細書に記載の任意のＬＮＰ組成物に関する。
ある特定の好ましい実施形態において、本開示は、ＲＮＡ構成要素がクラス２ ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む、本明細書に記載のＬＮＰ組成物に関する。ある特定の実施形態において、本開示は、ｇＲＮＡ核酸がデュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）である、またはそれをコードする、本明細書に記載のＬＮＰ組成物に関する。ある特定の実施形態において、本開示は、ｇＲＮＡ核酸がシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、またはそれをコードする、本明細書に記載のＬＮＰ組成物に関する。
ある特定の実施形態において、本開示は、ガイドＲＮＡ核酸及びクラス２ ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含み、ｍＲＮＡ：ガイドＲＮＡ核酸の重量比が、約２：１～１：４、好ましくは約１：１である、本明細書に記載のＬＮＰ組成物に関する。
ある特定の実施形態において、本開示は、ｇＲＮＡが修飾ｇＲＮＡであり、例えば、修飾ｇＲＮＡが、５’末端の最初の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上に修飾を含む、または修飾ｇＲＮＡが、３’末端の最後の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上に修飾を含む、またはその両方である、本明細書に記載のＬＮＰ組成物に関する。
ある特定の実施形態において、本開示は、生物学的に活性な薬剤を細胞に送達する方法であって、細胞を、本明細書に記載のＬＮＰ組成物に接触させることを含む、方法に関する。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＤＮＡを切断する方法であって、細胞を、本明細書に記載のＬＮＰ組成物に接触させることを含む、方法に関する。ある特定の実施形態において、切断ステップは一本鎖ＤＮＡニックを導入することを含む。他の実施形態において、切断ステップは二本鎖ＤＮＡ切断を導入することを含む。ある特定の実施形態において、ＬＮＰ組成物はクラス２ Ｃａｓ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡ核酸を含む。ある特定の実施形態において、この方法は、少なくとも１つの鋳型核酸を細胞に導入することをさらに含む。
ある特定の実施形態において、本開示は、ＬＮＰ組成物を動物（例えば、ヒト）に投与することを含む、本明細書に記載の任意の遺伝子編集の方法に関する。ある特定の実施形態において、この方法は、ＬＮＰ組成物を、細胞（例えば、真核細胞、特にヒト細胞）に投与することを含む。いくつかの実施形態において、細胞は、療法（例えば、養子細胞療法（ＡＣＴ））に有用なタイプである。ＡＣＴの例としては、自己由来細胞療法及び同種異系細胞療法が挙げられる。いくつかの実施形態において、細胞は幹細胞であり、例えば、造血幹細胞、誘導多能性幹細胞、または別の多分化能もしくは多能性細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は幹細胞であり、例えば、骨、軟骨、筋肉、または脂肪細胞に発達し得る間葉系幹細胞である。いくつかの実施形態において、幹細胞は眼球幹細胞を含む。ある特定の実施形態において、細胞は、間葉系幹細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、単核細胞、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、辺縁幹細胞（ＬＳＣ）、組織特異的初代細胞またはそれに由来する細胞（ＴＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、眼球幹細胞、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、及び臓器または組織移植用の細胞から選択される。
ある特定の実施形態において、細胞は肝細胞である。他の実施形態において、細胞は免疫細胞であり、例えば、白血球またはリンパ球、好ましくはリンパ球、さらに好ましくはＴ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞、最も好ましくは活性化Ｔ細胞または非活性化Ｔ細胞である。
ある特定の実施形態において、本開示は、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、及びｇＲＮＡ核酸のうちの１つ以上を含む第１のＬＮＰ組成物及び第２のＬＮＰ組成物中で製剤化されたｍＲＮＡを投与することを含む、本明細書に記載の任意の遺伝子編集の方法に関する。いくつかの実施形態において、第１及び第２のＬＮＰ組成物が同時に投与される。他の実施形態において、第１及び第２のＬＮＰ組成物が順次投与される。ある特定の実施形態において、ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡ核酸は、単一のＬＮＰ組成物中で製剤化される。いくつかの実施形態において、第１のＬＮＰ組成物は第１のｇＲＮＡを含み、第２のＬＮＰ組成物は第２のｇＲＮＡを含み、第１及び第２のｇＲＮＡは、異なる標的に相補的である異なるガイド配列を含む。
ある特定の実施形態において、本開示は、細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏでＬＮＰ組成物と接触される、本明細書に記載の遺伝子編集の任意の方法に関する。ある特定の実施形態において、本開示は、細胞がｅｘ ｖｉｖｏでＬＮＰ組成物と接触される、本明細書に記載の遺伝子編集の任意の方法に関する。ある特定の実施形態において、本開示は、動物の組織をＬＮＰに接触させることを含む、本明細書に記載の遺伝子編集の任意の方法に関する。
ある特定の実施形態において、本開示は、遺伝子編集が遺伝子ノックアウトをもたらす、本明細書に記載の遺伝子編集の任意の方法に関する。
いくつかの実施形態において、本開示は、遺伝子編集が遺伝子修正をもたらす、本明細書に記載の遺伝子編集の任意の方法に関する。
ある特定の実施形態において、本開示は、遺伝子編集が挿入をもたらす、本明細書に記載の遺伝子編集の任意の方法に関する。いくつかの実施形態において、挿入は遺伝子挿入である。
本明細書では、先行プロセスのハードルを克服する、Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで遺伝子操作する方法が提供される。いくつかの実施形態において、ナイーブＴ細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで少なくとも１つの脂質組成物と接触され、遺伝子修飾される。いくつかの実施形態において、非活性化Ｔ細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで２つ以上の脂質組成物と接触され、遺伝子修飾される。いくつかの実施形態において、活性化Ｔ細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで２つ以上の脂質組成物と接触され、遺伝子修飾される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、（非活性化）Ｔ細胞を１つ以上の脂質組成物に接触させることを含む前活性化ステップで修飾され、次いでＴ細胞の活性化が行われ、次いで活性化されたＴ細胞を１つ以上の脂質組成物に接触させることを含む後活性化ステップでＴ細胞のさらなる修飾が行われる。いくつかの実施形態において、非活性化Ｔ細胞が１、２、または３つの脂質組成物と接触させられる。いくつかの実施形態において、活性化Ｔ細胞が１～１２の脂質組成物と接触される。いくつかの実施形態において、活性化Ｔ細胞が１～８つの脂質組成物、任意選択で１～４つの脂質組成物と接触される。いくつかの実施形態において、活性化Ｔ細胞が１～６つの脂質組成物と接触される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞が２つの脂質組成物と接触される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞が３つの脂質組成物と接触される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞が４つの脂質組成物と接触される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞が５つの脂質組成物と接触される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞が６つの脂質組成物と接触される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞が７つの脂質組成物と接触される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞が８つの脂質組成物と接触される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞が９つの脂質組成物と接触される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞が１０の脂質組成物と接触される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞が１１の脂質組成物と接触される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞が１２の脂質組成物と接触される。このような例示的な脂質組成物の順次投与（任意選択で、活性化前ステップ及び活性化後ステップでのさらなる順次投与または同時投与を伴うもの）は、Ｔ細胞の活性化状態を利用し、独自の利点及びより健康な細胞を編集後に提供する。いくつかの実施形態において、遺伝子操作Ｔ細胞は、各標的部位における高い編集効率、編集後の生存率の増加、形質移入の多重度に反して低い毒性、低い転座（例えば、測定可能な標的間転座がない、測定可能な標的－標的間転座がない）、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）の生成の増加、反復刺激による（例えば、反復抗原刺激による）増殖の継続、増殖の増加、及び／または記憶細胞（例えば、初期の幹細胞を含む）の表現型マーカーの発現を有する。
様々な比率の脂質構成要素を有する化合物６を含むＬＮＰ組成物を用いて、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡを活性化ＣＤ３＋Ｔ細胞に送達した後のＣＤ３－細胞のパーセンテージを示すグラフである。 様々な比率の脂質構成要素を有する化合物６を含むＬＮＰ組成物を用いて、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡを非活性化ＣＤ３＋Ｔ細胞に送達した後のＣＤ３－細胞のパーセンテージを示すグラフである。 様々な比率の脂質構成要素を有する化合物６を含むＬＮＰ組成物を用いて、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡを活性化ＣＤ３＋Ｔ細胞に送達した後のＣＤ３－細胞のパーセンテージを示すグラフである。 様々な比率の脂質構成要素を有する化合物６を含むＬＮＰ組成物を用いて、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡを非活性化ＣＤ３＋Ｔ細胞に送達した後のＣＤ３－細胞のパーセンテージを示すグラフである。 以下の名目ｍｏｌ％比：３５％のイオン化可能な脂質、１５％のＤＳＰＣ、４７．５％のコレステロール、及び２．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧの脂質構成要素を有する化合物６、化合物８、及び化合物１１を含むＬＮＰ組成物と、以下の名目ｍｏｌ％比：５０％のイオン化可能な脂質、１０％のＤＳＰＣ、３８．５％のコレステロール、及び１．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧの脂質構成要素を有する化合物６、化合物８、及び化合物１１を含む比較ＬＮＰ組成物を使用することにより、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡを活性化ＣＤ３＋Ｔ細胞に送達した後のＣＤ３－細胞のパーセンテージを示すグラフである。 以下の名目ｍｏｌ％比：３５％のイオン化可能な脂質、１５％のＤＳＰＣ、４７．５％のコレステロール、及び２．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧの脂質構成要素を有する化合物６、化合物８、及び化合物１１を含むＬＮＰ組成物と、以下の名目ｍｏｌ％比：５０％のイオン化可能な脂質、１０％のＤＳＰＣ、３８．５％のコレステロール、及び１．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧの脂質構成要素を有する化合物６、化合物８、及び化合物１１を含む比較ＬＮＰ組成物とを使用することにより、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡを非活性化ＣＤ３＋Ｔ細胞に送達した後のＣＤ３－細胞のパーセンテージを示すグラフである。 以下の名目ｍｏｌ％比：３５％のイオン化可能な脂質、１５％のＤＳＰＣ、４７．５％のコレステロール、及び２．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧの脂質構成要素を有する化合物６を含むＬＮＰ組成物と、以下の名目ｍｏｌ％比：５０％のイオン化可能な脂質、１０％のＤＳＰＣ、３８．５％のコレステロール、及び１．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧ脂質構成要素を有する比較ＬＮＰ組成物とを使用することにより、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡを活性化ＣＤ３＋Ｔ細胞に送達した後に、様々な比率のｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９ ｍＲＮＡがＣＤ３－細胞のパーセンテージに及ぼす効果を示すグラフである。 以下の名目ｍｏｌ％比：３５％のイオン化可能な脂質、１５％のＤＳＰＣ、４７．５％のコレステロール、及び２．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧの脂質構成要素を有する化合物６を含むＬＮＰ組成物と、以下の名目ｍｏｌ％比：５０％のイオン化可能な脂質、１０％のＤＳＰＣ、３８．５％のコレステロール、及び１．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧの脂質構成要素を有する比較ＬＮＰ組成物とを使用することにより、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡを２例の異なるドナーからの非活性化ＣＤ３＋Ｔ細胞に送達した後に、様々な比率のｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９ ｍＲＮＡがＣＤ３－細胞のパーセンテージに及ぼす効果を示すグラフである。 以下の名目ｍｏｌ％比：３５％のイオン化可能な脂質、１５％のＤＳＰＣ、４７．５％のコレステロール、及び２．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧの脂質構成要素を有する化合物６を含むＬＮＰ組成物と、以下の名目ｍｏｌ％比：５０％のイオン化可能な脂質、１０％のＤＳＰＣ、３８．５％のコレステロール、及び１．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧの脂質構成要素を有する比較ＬＮＰ組成物とを使用することにより、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡを送達した後に、様々な血清培地条件が活性化ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＧＦＰ挿入効率に及ぼす効果を示すグラフである。 以下の名目ｍｏｌ％比：３５％のイオン化可能な脂質、１５％のＤＳＰＣ、４７．５％のコレステロール、及び２．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧの脂質構成要素を有するＬＮＰ組成物と、以下の名目ｍｏｌ％比：５０％のイオン化可能な脂質、１０％のＤＳＰＣ、３８．５％のコレステロール、及び１．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧの脂質構成要素を有する比較ＬＮＰ組成物とを使用することにより、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びＴＲＡＣ標的化ｓｇＲＮＡを活性化Ｔ細胞に送達した後に、様々なＬＮＰ組成物濃度がＣＤ３－細胞のパーセンテージに及ぼす効果を示すグラフである。 以下の名目ｍｏｌ％比：３５％のイオン化可能な脂質、１５％のＤＳＰＣ、４７．５％のコレステロール、及び２．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧの脂質構成要素を有するＬＮＰ組成物と、以下の名目ｍｏｌ％比：５０％のイオン化可能な脂質、１０％のＤＳＰＣ、３８．５％のコレステロール、及び１．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧ脂質構成要素を有する比較ＬＮＰ組成物とを使用することにより、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びＣＩＩＴＡ標的化ｓｇＲＮＡを活性化Ｔ細胞に送達した後に、様々な比率のＬＮＰ組成濃度がＨＬＡ－ＤＲ－、ＨＬＡ－ＤＰ－、ＨＬＡ－ＤＱ－細胞のパーセンテージに及ぼす効果を示すグラフである。 以下の名目ｍｏｌ％比：３５％のイオン化可能な脂質、１５％のＤＳＰＣ、４７．５％のコレステロール、及び２．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧの脂質構成要素を有するＬＮＰ組成物と、以下の名目ｍｏｌ％比：５０％のイオン化可能な脂質、１０％のＤＳＰＣ、３８．５％のコレステロール、及び１．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧ脂質構成要素を有する比較ＬＮＰ組成物とを使用することにより、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びＴＲＢＣ標的化ｓｇＲＮＡを活性化Ｔ細胞に送達した後に、様々なＬＮＰ組成濃度がＣＤ３－細胞のパーセンテージに及ぼす効果を示すグラフである。 以下の名目ｍｏｌ％比：３５％のイオン化可能な脂質、１５％のＤＳＰＣ、４７．５％のコレステロール、及び２．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧの脂質構成要素を有するＬＮＰ組成物と、以下の名目ｍｏｌ％比：５０％のイオン化可能な脂質、１０％のＤＳＰＣ、３８．５％のコレステロール、及び１．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧの脂質構成要素を有する比較ＬＮＰ組成物とを使用することにより、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びＨＬＡ－Ａ－標的化ｓｇＲＮＡを活性化Ｔ細胞に送達した後に、様々なＬＮＰ組成物濃度がＨＬＡ－Ａ－細胞のパーセンテージに及ぼす効果を示すグラフである。 ０．６５ｕｇ／ｍＬまたは２．５ｕｇ／ｍＬの濃度のＬＮＰ組成物を使用することにより、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＴＲＡＣ、及びＴＲＢＣ座位を標的とするＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡを送達した後のＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＨＬＡ－Ａ、ＣＩＩＴＡ、ＴＣＲ及びＷＴ１の各々の編集率を示すグラフであり、ここで、ＬＮＰ組成物は、以下の名目ｍｏｌ％比：３５％のイオン化可能な脂質、１５％のＤＳＰＣ、４７．５％のコレステロール、及び２．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧの脂質構成要素を有し、以下の名目ｍｏｌ％比：５０％のイオン化可能な脂質、１０％のＤＳＰＣ、３８．５％のコレステロール、及び１．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧの脂質構成要素を有する比較ＬＮＰ組成物及び陰性対照とともに用いた。 ０．６５ｕｇ／ｍＬまたは２．５ｕｇ／ｍＬの濃度のＬＮＰ組成物を使用することにより、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＴＲＡＣ、及びＴＲＢＣ座位を標的とするＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡを送達した後のＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＨＬＡ－Ａ、ＣＩＩＴＡ、ＴＣＲ及びＷＴ１の各々の合わされた編集率を示すグラフであり、ここで、ＬＮＰ組成物は、以下の名目ｍｏｌ％比：３５％のイオン化可能な脂質、１５％のＤＳＰＣ、４７．５％のコレステロール、及び２．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧの脂質構成要素を有し、以下の名目ｍｏｌ％比：５０％のイオン化可能な脂質、１０％のＤＳＰＣ、３８．５％のコレステロール、及び１．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧの脂質構成要素を有する比較ＬＮＰ組成物及び陰性対照とともに用いた。 以下の名目ｍｏｌ％比：３５％のイオン化可能な脂質、１５％のＤＳＰＣ、４７．５％のコレステロール、及び２．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧの脂質構成要素を有するＬＮＰ組成物と、以下の名目ｍｏｌ％比：５０％のイオン化可能な脂質、１０％のＤＳＰＣ、３８．５％のコレステロール、及び１．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧ脂質構成要素を有する比較ＬＮＰ組成物とを使用することにより、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びＡＡＶＳ１標的化ｓｇＲＮＡをＮＫ細胞に送達した後に、様々なＬＮＰ組成濃度が編集パーセントに及ぼす効果を示すグラフである。 以下の名目ｍｏｌ％比：３５％のイオン化可能な脂質、１５％のＤＳＰＣ、４７．５％のコレステロール、及び２．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧの脂質構成要素を有するＬＮＰ組成物と、以下の名目ｍｏｌ％比：５０％のイオン化可能な脂質、１０％のＤＳＰＣ、３８．５％のコレステロール、及び１．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧ脂質構成要素を有する比較ＬＮＰ組成物とを使用することにより、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びＡＡＶＳ１標的化ｓｇＲＮＡを単球に送達した後に、様々なＬＮＰ組成濃度が編集パーセントに及ぼす効果を示すグラフである。 以下の名目ｍｏｌ％比：３５％のイオン化可能な脂質、１５％のＤＳＰＣ、４７．５％のコレステロール、及び２．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧの脂質構成要素を有するＬＮＰ組成物と、以下の名目ｍｏｌ％比：５０％のイオン化可能な脂質、１０％のＤＳＰＣ、３８．５％のコレステロール、及び１．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧ脂質構成要素を有する比較ＬＮＰ組成物とを使用することにより、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びＡＡＶＳ１標的化ｓｇＲＮＡをマクロファージに送達した後に、様々なＬＮＰ組成濃度が編集パーセントに及ぼす効果を示すグラフである。 以下の名目ｍｏｌ％比：３５％のイオン化可能な脂質、１５％のＤＳＰＣ、４７．５％のコレステロール、及び２．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧの脂質構成要素を有するＬＮＰ組成物と、以下の名目ｍｏｌ％比：５０％のイオン化可能な脂質、１０％のＤＳＰＣ、３８．５％のコレステロール、及び１．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧ脂質構成要素を有する比較ＬＮＰ組成物とを使用することにより、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びＡＡＶＳ１標的化ｓｇＲＮＡをＢ細胞に送達した後に、様々なＬＮＰ組成濃度が編集パーセントに及ぼす効果を示すグラフである。
本開示は、生物学的に活性な薬剤（核酸（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素ＲＮＡ（ｍＲＮＡ及び／またはｇＲＮＡ））（「カーゴ」）を含む）を細胞に送達するのに有用な脂質組成物、ならびにこのような組成物を調製及び使用する方法を提供する。このような脂質組成物は、イオン化可能な脂質、中性脂質、ＰＥＧ脂質、及びヘルパー脂質を含む。いくつかの実施形態において、イオン化可能な脂質は、本明細書で定義される式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物である。ある特定の実施形態において、脂質組成物は生物学的に活性な薬剤（例えば、ＲＮＡ構成要素）を含むことができる。ある特定の実施形態において、ＲＮＡ構成要素はｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、クラス２ ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである。ある特定の実施形態において、ＲＮＡ構成要素は、ｇＲＮＡと、任意選択でクラス２ ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡとを含む。いくつかの実施形態において、脂質組成物は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物である。「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」とは、意味を限定するものではないが、分子間力によって物理的に互いに結合した複数（すなわち、２つ以上）の脂質構成要素を含む粒子を指す。
これらの脂質組成物を用いた遺伝子編集の方法及び操作細胞の作製方法も提供される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、生物学的に活性な薬剤を細胞、組織、または動物に送達するために使用することができる。いくつかの実施形態において、細胞は真核細胞、特にヒト細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は肝細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、療法、例えば、養子細胞療法（ＡＣＴ）（例えば、自己由来及び同種異系細胞療法）に有用なタイプの細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は幹細胞であり、例えば、造血幹細胞、誘導多能性幹細胞、または別の多分化能もしくは多能性細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は幹細胞であり、例えば、骨、軟骨、筋肉、または脂肪細胞に発達し得る間葉系幹細胞である。いくつかの実施形態において、幹細胞は眼球幹細胞を含む。ある特定の実施形態において、細胞は、間葉系幹細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、単核細胞、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、辺縁幹細胞（ＬＳＣ）、組織特異的初代細胞またはそれに由来する細胞（ＴＳＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、眼球幹細胞、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、及び臓器または組織移植用の細胞から選択される。
いくつかの実施形態において、細胞は免疫細胞（例えば、白血球またはリンパ球）である。好ましい実施形態において、免疫細胞はリンパ球である。ある特定の実施形態において、リンパ球はＴ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞である。好ましい実施形態において、リンパ球はＴ細胞である。ある特定の実施形態において、リンパ球は活性化Ｔ細胞である。ある特定の実施形態において、リンパ球は非活性化Ｔ細胞である。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＬＮＰ組成物及び方法は、約８０％超、約９０％超、または約９５％超の編集効率をもたらす。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物及び方法は、約８０～９５％、約９０～９５％、約８０～９９％、約９０～９９％、または約９５～９９％の編集効率をもたらす。
イオン化可能な脂質
本開示は、ＬＮＰ組成物に使用できるイオン化可能な脂質を提供する。
いくつかの実施形態において、イオン化可能な脂質は、式（Ｉ）の化合物
Figure 2024515650000008
 （式中、
Ｘ１はＯ、ＮＨ、または直接結合であり、
Ｘ２はＣ２～３アルキレンであり、
Ｒ３はＣ１～３アルキルであり、
Ｒ２はＣ１～３アルキルであり、または
Ｒ２は、それが結合する窒素原子及びＸ２の２～３個の炭素原子と一緒になって５員もしくは６員環を形成し、または
Ｒ２は、Ｒ３及びそれらが結合している窒素原子と一緒になって５員環を形成し、
Ｙ１はＣ６～１０アルキレンであり、
Ｙ２は
Figure 2024515650000009
 から選択され、
Ｒ４はＣ４～１１アルキルであり、
Ｚ１はＣ２～５アルキレンであり、
Ｚ２は
Figure 2024515650000010
 または不在であり、
Ｒ５は、Ｃ６～８アルキル、Ｃ５～１０アルコキシ（例えば、－ＯＣ５～１０ハロアルキル）、－Ｏ（Ｃ２～３アルキル）ＯＣ６～１０アルキル、－ＯＣ６～１０アルケニル（例えば、－ＯＣ６～１０分枝状アルケニル）、もしくは－ＯＣ６～１０アルキニルであり、
Ｒ６は、Ｃ６～８アルキル、Ｃ５～１０アルコキシ（例えば、－ＯＣ５～１０ハロアルキル）、－Ｏ（Ｃ２～３アルキル）ＯＣ６～１０アルキル、－ＯＣ６～１０アルケニル（例えば、－ＯＣ６～１０分枝アルケニル）、もしくは－ＯＣ６～１０アルキニルであり、または
Ｒ５はＲ６と一緒になって、ジェミナルなＣ６～８アルキルにより置換された６員環のアセタールを形成する）
またはその塩である。
いくつかの実施形態において、イオン化可能な脂質は、式Ｉの構造を有する化合物
Figure 2024515650000011
 （式中、
Ｘ１はＯ、ＮＨ、または直接結合であり、
Ｘ２はＣ２～３アルキレンであり、
Ｒ３はＣ１～３アルキルであり、
Ｒ２はＣ１～３アルキルであり、または
Ｒ２は、それが結合する窒素原子及びＸ２の２～３個の炭素原子と一緒になって５員もしくは６員環を形成し、または
Ｒ２は、Ｒ３及びそれらが結合している窒素原子と一緒になって５員環を形成し、
Ｙ１はＣ６～１０アルキレンであり、
Ｙ２は
Figure 2024515650000012
 から選択され、
Ｒ４はＣ４～１１アルキルであり、
Ｚ１はＣ２～５アルキレンであり、
Ｚ２は
Figure 2024515650000013
 または不在であり、
Ｒ５はＣ６～８アルキルまたはＣ６～８アルコキシであり、
Ｒ６はＣ６～８アルキルまたはＣ６～８アルコキシである）
またはその塩である。
いくつかの実施形態において、イオン化可能な脂質は、式（ＩＩ）の化合物
Figure 2024515650000014
 （式中、
Ｘ１はＯ、ＮＨ、または直接結合であり、
Ｘ２はＣ２～３アルキレンであり、
Ｚ１はＣ３アルキレンであり、Ｒ５及びＲ６は各々Ｃ６アルキルであり、またはＺ１は直接結合であり、Ｒ５及びＲ６は各々Ｃ８アルコキシであり、
Ｒ８は
Figure 2024515650000015
 である）
またはその塩である。
ある特定の実施形態において、Ｘ１はＯであり、他の実施形態において、Ｘ１はＮＨである。さらに他の実施形態において、Ｘ１は直接結合である。
ある特定の実施形態において、Ｘ２はＣ３アルキレンである。特定の実施形態において、Ｘ２はＣ２アルキレンである。
ある特定の実施形態において、Ｚ１は直接結合であり、Ｒ５及びＲ６は各々Ｃ８アルコキシである。他の実施形態において、Ｚ１はＣ３アルキレンであり、Ｒ５及びＲ６は各々Ｃ６アルキルである。
ある特定の実施形態において、Ｒ８は
Figure 2024515650000016
 である。他の実施形態において、Ｒ８は
Figure 2024515650000017
 である。
ある特定の実施形態において、イオン化可能な脂質は塩である。
式（Ｉ）の代表的な化合物としては、以下：

Figure 2024515650000018
Figure 2024515650000019
Figure 2024515650000020
Figure 2024515650000021
 またはその塩、例えばその医薬的に許容される塩が挙げられる。化合物は、ＷＯ２０１５／０９５３４０（例えば、８４～８６ページ）及びＷＯ２０２０／２１９８７６（例えば、８７～１８６ページ）（これらの各々は、参照により全体として組み込まれる）に記載の方法に従って合成することができる。
本開示の式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物は、それらが存在する媒体のｐＨに応じて塩を形成することができる。例えば、わずかに酸性の媒体中では、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物はプロトン化されて正電荷を有することがある。逆に、わずかに塩基性の媒体（例えば、ｐＨがおよそ７．３５の血液）中では、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物はプロトン化されず、電荷を有しないことがある。いくつかの実施形態において、本開示の式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物は、主に少なくとも約９のｐＨでプロトン化され得る。いくつかの実施形態において、本開示の式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物は、主に少なくとも約１０のｐＨでプロトン化され得る。
式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物が主にプロトン化されるｐＨは、その固有のｐＫａに関連する。いくつかの実施形態において、本開示の式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物の塩は、約５．１～約８．０、さらに好ましくは約５．５～約７．６の範囲のｐＫａを有する。いくつかの実施形態において、本開示の式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物の塩は、約５．７～約８、約５．７～約７．６、約６～約８、約６～約７．５、約６～約７、約６～約６．９、約６～約６．５、約６．１～約６．９、または約６～約６．８５の範囲のｐＫａを有する。いくつかの実施形態において、本開示の式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物の塩は、約６．０、約６．１、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．６、約６．７、約６．８、または約６．９のｐＫａを有する。代替的に、本開示の式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物の塩は、約６～約８の範囲のｐＫａを有する。式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物の塩のｐＫａは、ＬＮＰを製剤化する際に重要な考慮事項となり得る。これは、約５．５～約７．０の範囲のｐＫａを有するある特定の脂質を用いて製剤化されたＬＮＰが、例えば肝臓への、カーゴのｉｎ ｖｉｖｏ送達に有効であることが分かっているためである。さらに、約５．３～約６．４の範囲のｐＫａを有するある特定の脂質で製剤化したＬＮＰは、例えば腫瘍へのｉｎ ｖｉｖｏ送達に有効であることが分かっている。例えば、ＷＯ２０１４／１３６０８６を参照。いくつかの実施形態において、イオン化可能な脂質は、酸性ｐＨでは正に帯電しているが、血液中では中性である。
追加の脂質
本開示の脂質組成物に使用するのに適した「中性脂質」としては、例えば、様々な中性、非荷電、または双性イオン性脂質が挙げられる。本開示での使用に適した中性リン脂質の例としては、限定されるものではないが、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１－ミリストイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１，２－ジアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２－ジエイコセノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リゾホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、リゾホスファチジルエタノールアミン、及びこれらの組合せが挙げられる。ある特定の実施形態において、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）及びジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）から選択することができ、好ましくはジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）であり得る。
「ヘルパー脂質」としては、ステロイド、ステロール、及びアルキルレゾルシノールが挙げられる。本開示での使用に適したヘルパー脂質としては、限定されるものではないが、コレステロール、５－ヘプタデシルレゾルシノール、及びコレステロールヘミスクシネートが挙げられる。ある特定の実施形態において、ヘルパー脂質はコレステロールまたはその誘導体、例えばコレステロールヘミスクシネートであり得る。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、ポリマー脂質、例えば、ナノ粒子がｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ（例えば、血液中または培地中）で存在できる時間の長さに影響を及ぼし得るＰＥＧ脂質を含む。ＰＥＧ脂質は、例えば、粒子の凝集を低減し、粒子サイズを制御することにより、製剤化プロセスを支援することができる。本明細書で使用するＰＥＧ脂質は、ＬＮＰの薬物動態特性を調節することができる。典型的には、ＰＥＧ脂質は、脂質部分と、ＰＥＧ（ポリ（エチレンオキシド）と称されることもある）に基づくポリマー部分（ＰＥＧ部分）とを含む。本開示の式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物を有する脂質組成物に使用するのに適したＰＥＧ脂質、及びこのような脂質の生化学に関する情報は、Ｒｏｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５（１），２００８，ｐｐ．５５－７１及びＨｏｅｋｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １６６０（２００４）４１－５２に見出すことができる。追加の好適なＰＥＧ脂質は、例えば、ＷＯ２０１５／０９５３４０（ｐ．３１の第１４行～ｐ．３７の第６行）、ＷＯ２００６／００７７１２、及びＷＯ２０１１／０７６８０７（「ステルス脂質」）に開示されており、これらの各々は参照により全体として組み込まれる。
いくつかの実施形態において、脂質部分はジアシルグリセロールまたはジアシルグリカミドに由来してもよく、これには、約Ｃ４～約Ｃ４０の飽和または不飽和炭素原子を独立して含むアルキル鎖長を有するジアルキルグリセロールまたはジアルキルグリカミド基を含むものが含まれ、ここで、鎖は１つ以上の官能基（例えば、アミドまたはエステル）を含むことができる。いくつかの実施形態において、アルキル鎖長は約Ｃ１０～Ｃ２０を含む。ジアルキルグリセロール基またはジアルキルグリカミド基は、１つ以上の置換アルキル基をさらに含むことができる。鎖長は対称であっても非対称であってもよい。
別段の指示がない限り、本明細書で使用する場合、「ＰＥＧ」という用語は、任意のポリエチレングリコールまたは他のポリアルキレンエーテルポリマー、例えば、エチレングリコールまたはエチレンオキシドの任意選択で置換された直鎖状または分枝状ポリマーを意味する。ある特定の実施形態において、ＰＥＧ部分は置換されていない。代替的に、ＰＥＧ部分は、例えば、１つ以上のアルキル基、アルコキシ基、アシル基、ヒドロキシ基、またはアリール基によって置換されてもよい。例えば、ＰＥＧ部分はＰＥＧ－ポリウレタンまたはＰＥＧ－ポリプロピレンなどのＰＥＧコポリマーを含んでもよく（例えば、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９２）を参照）、代替的に、ＰＥＧ部分はＰＥＧホモポリマーであってもよい。ある特定の実施形態において、ＰＥＧ部分は約１３０～約５０，０００、例えば、約１５０～約３０，０００、さらに約１５０～約２０，０００の分子量を有する。同様に、ＰＥＧ部分は約１５０～約１５，０００、約１５０～約１０，０００、約１５０～約６，０００、またはさらに約１５０～約５，０００の分子量を有することができる。ある特定の好ましい実施形態において、ＰＥＧ部分は約１５０～約４，０００、約１５０～約３，０００、約３００～約３，０００、約１，０００～約３，０００、または約１，５００～約２，５００の分子量を有する。
ある特定の好ましい実施形態において、ＰＥＧ部分は「ＰＥＧ－２Ｋ」（「ＰＥＧ－２０００」とも称される）であり、これは約２，０００ダルトンの平均分子量を有する。ＰＥＧ－２Ｋは、本明細書では以下の式（ＩＩＩ）、
Figure 2024515650000022
 によって表され、式中、ｎは約４５であり、これは数平均重合度が約４５のサブユニットを含むことを意味する。ただし、当技術分野で知られている他のＰＥＧ実施形態（例えば、数平均重合度が約２３サブユニット（ｎ＝２３）及び／または６８サブユニット（ｎ＝６８）を含む実施形態を含む）を使用することができる。いくつかの実施形態において、ｎは約３０～約６０の範囲とすることができる。いくつかの実施形態において、ｎは約３５～約５５の範囲とすることができる。いくつかの実施形態において、ｎは約４０～約５０の範囲とすることができる。いくつかの実施形態において、ｎは約４２～約４８の範囲とすることができる。いくつかの実施形態において、ｎは４５とすることができる。いくつかの実施形態において、Ｒは、Ｈ、置換アルキル、及び非置換アルキルから選択することができる。いくつかの実施形態において、Ｒは、メチルなどの非置換アルキルであり得る。
本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいて、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ジラウロイルグリセロール、ＰＥＧ－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）（カタログ番号ＧＭ－０２０（ＮＯＦ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ））、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）（カタログ番号ＤＳＰＥ－０２０ＣＮ（ＮＯＦ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ））、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、及びＰＥＧ－ジステアロイルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（１－［８’－（コレスト－５－エン－３［ベータ］－オキシ）カルボキサミド－３’－，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＰＥ）、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＰＥ）（カタログ番号８８０１２０Ｃ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａｂａｍａ，ＵＳＡ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＧ；ＧＳ－０２０（ＮＯＦ Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ））、ポリ（エチレングリコール）－２０００－ジメタクリレート（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＡ）、及び１，２－ジステアリルオキシプロピル－３－アミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＡ）から選択することができる。ある特定のこのような実施形態において、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧであってもよい。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＳＧであってもよい。他の実施形態において、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＳＰＥであってもよい。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＭＡであってもよい。また他の実施形態において、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－Ｃ－ＤＭＡであってもよい。ある特定の実施形態において、ＰＥＧ脂質はＷＯ２０１６／０１０８４０（段落［００２４０］～［００２４４］）に開示されている化合物Ｓ０２７であってもよい。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＳＡであってもよい。他の実施形態において、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－Ｃ１１であってもよい。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－Ｃ１４であってもよい。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－Ｃ１６であってもよい。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－Ｃ１８であってもよい。
好ましい実施形態において、ＰＥＧ脂質はグリセロール基を含む。好ましい実施形態において、ＰＥＧ脂質はジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ）基を含む。好ましい実施形態において、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ－２ｋを含む。好ましい実施形態において、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ－ＤＭＧである。好ましい実施形態において、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧである。好ましい実施形態において、ＰＥＧ脂質は１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００である。好ましい実施形態において、ＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧは１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００である。
脂質組成物
本明細書では、少なくとも１つの式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物、またはその塩（例えば、その医薬的に許容される塩）、少なくとも１つのヘルパー脂質、少なくとも１つの中性脂質、及び少なくとも１つのポリマー脂質を含む脂質組成物が記載されている。いくつかの実施形態において、脂質組成物は、少なくとも１つの式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物またはその塩、少なくとも１つの中性脂質、少なくとも１つのヘルパー脂質、及び少なくとも１つのＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態において、中性脂質はＤＳＰＣまたはＤＰＭＥである。いくつかの実施形態において、ヘルパー脂質はコレステロール、５－ヘプタデシルレゾルシノール、またはコレステロールヘミスクシネートである。
好ましい実施形態において、イオン化可能な脂質は
Figure 2024515650000023
 である。好ましい実施形態において、中性脂質はＤＳＰＣである。好ましい実施形態において、ヘルパー脂質はコレステロールである。好ましい実施形態において、ＰＥＧ脂質は１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００である。特に好ましい実施形態において、イオン化可能な脂質は
Figure 2024515650000024
 であり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ヘルパー脂質はコレステロールであり、ＰＥＧ脂質は１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００である。
いくつかの実施形態において、脂質組成物は、１つ以上の追加の脂質構成要素をさらに含む。
いくつかの実施形態において、脂質組成物はリポソームの形態をとる。好ましい実施形態において、脂質組成物は脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の形態をとる。ある特定の実施形態において、脂質組成物はｉｎ ｖｉｖｏ送達に適している。ある特定の実施形態において、脂質組成物は肝臓などの器官への送達に適している。ある特定の実施形態において、脂質組成物は組織へのｅｘ ｖｉｖｏ送達に適している。ある特定の実施形態において、脂質組成物は細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏ送達に適している。
式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の脂質、またはその医薬的に許容される塩を含む脂質組成物は様々な形態をとることができ、これには、限定されるものではないが、様々な分子を細胞に送達するのに有用であるマイクロ粒子、ナノ粒子、及び形質移入剤を含む粒子形成送達剤が含まれる。特定の組成物は、生物学的に活性な薬剤の形質移入または送達に有効である。好ましい生物学的に活性な薬剤はＲＮＡなどの核酸である。さらなる実施形態において、生物学的に活性な薬剤は、ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡから選択される。ｇＲＮＡは、ｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡであり得る。ある特定の実施形態において、カーゴは、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼ、もしくはＣａｓ９）をコードするｍＲＮＡ、ｇＲＮＡもしくはｇＲＮＡをコードする核酸、またはｍＲＮＡ及びｇＲＮＡの組合せを含む。
上記の脂質組成物に使用するための式（Ｉ）または（ＩＩ）の例示的な化合物は、ＷＯ２０２０／２１９８７６（参照により全体として組み込まれる）に示されている。ある特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は化合物１である。ある特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は化合物２である。ある特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は化合物３である。ある特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は化合物４である。ある特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は化合物５である。ある特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は化合物６である。ある特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は化合物７である。ある特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は化合物８である。ある特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は化合物９である。ある特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は化合物１０である。ある特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は化合物１１である。ある特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は化合物１２である。ある特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は化合物１３である。ある特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は化合物１４である。ある特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は化合物１５である。ある特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は化合物１６である。ある特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は化合物１７である。ある特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は化合物１８である。ある特定の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は化合物１９である。
概して組成物は、必ずしもそうではないが、１つ以上の医薬的に許容される賦形剤を含む。「賦形剤」という用語は、本開示の化合物（複数可）、他の脂質構成要素（複数可）、及び生物学的に活性な薬剤以外の任意の構成要素を含む。賦形剤は、組成物に機能的特性（例えば、薬物放出速度の制御）及び／または非機能的特性（例えば、処理補助もしくは希釈）のいずれかを付与することができる。賦形剤の選択は、特定の投与様式、賦形剤が溶解性及び安定性に及ぼす影響、及び投与形態の性質などの要因にかなりの程度まで依存する。
典型的には、非経口製剤は水性または油性の溶液または懸濁液である。製剤が水性である場合、糖（例えば、限定されるものではないが、グルコース、マンニトール、ソルビトールなどを含む）、塩、炭水化物、及びバッファー（好ましくは３から９までのｐＨにするもの）などの賦形剤となるが、いくつかの用途においては、無菌の非水溶液を用いて、または無菌のパイロジェンフリー水（ＷＦＩ）などの好適なビヒクルとともに使用するための乾燥形態として、より好適に製剤化することができる。
ＬＮＰ組成物
脂質組成物はＬＮＰ組成物として提供することができ、本明細書に記載のＬＮＰ組成物は脂質組成物として提供することができる。脂質ナノ粒子は、例えば、ミクロスフェア（単層及び多重層小胞、例えば、「リポソーム」：いくつかの実施形態において、実質的に球状であり、より特定の実施形態において、水性コアを含むことができる（例えば、ＲＮＡ分子の実質的な部分を含む）層状相脂質二重層を含む）、エマルション中の分散相、ミセル、または懸濁液中の内相であり得る。
本明細書では、少なくとも１つの式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物、またはその塩（例えば、その医薬的に許容される塩）、少なくとも１つのヘルパー脂質、少なくとも１つの中性脂質、及び少なくとも１つのポリマー脂質を含むＬＮＰ組成物が記載されている。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、少なくとも１つの式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物またはその医薬的に許容される塩、少なくとも１つの中性脂質、少なくとも１つのヘルパー脂質、及び少なくとも１つのＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態において、中性脂質はＤＳＰＣまたはＤＰＭＥである。いくつかの実施形態において、ヘルパー脂質はコレステロール、５－ヘプタデシルレゾルシノール、またはコレステロールヘミスクシネートである。
好ましい実施形態において、イオン化可能な脂質は
Figure 2024515650000025
 である。好ましい実施形態において、中性脂質はＤＳＰＣである。好ましい実施形態において、ヘルパー脂質はコレステロールである。好ましい実施形態において、ＰＥＧ脂質は１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００である。特に好ましい実施形態において、イオン化可能な脂質は
Figure 2024515650000026
 であり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ヘルパー脂質はコレステロールであり、ＰＥＧ脂質は１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００である。
本開示の実施形態は、組成物中の構成要素脂質のそれぞれのモル比に従って記載される脂質組成物を提供する。全てのｍｏｌ％の数字は、脂質組成物、より具体的にはＬＮＰ組成物の脂質構成要素の割合として示されている。いくつかの実施形態において、脂質構成要素に対する脂質のｍｏｌ％は、脂質の指定、名目、または実測ｍｏｌ％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％となる。いくつかの実施形態において、脂質構成要素に対する脂質のｍｏｌ％は、脂質構成要素の指定、名目、または実測ｍｏｌ％の±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１．５ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、±０．２５ｍｏｌ％、または±０．０５ｍｏｌ％となる。ある特定の実施形態において、脂質のｍｏｌ％は、脂質の指定、名目、または実測ｍｏｌ％から１５％未満、１０％未満、５％未満、１％未満、または０．５％未満変動する。いくつかの実施形態において、ｍｏｌ％の数字は名目濃度に基づく。本明細書で使用する場合、「名目濃度」とは、得られる組成物を形成するために組み合わされる物質の投入量に基づく濃度を指す。例えば、１００ｍｇの溶質を１Ｌの水に加える場合、名目濃度は１００ｍｇ／Ｌである。いくつかの実施形態において、ｍｏｌ％の数字は実測濃度、例えば、解析方法によって定量された濃度に基づく。いくつかの実施形態において、脂質構成要素の脂質の実測濃度は、例えば、クロマトグラフィー（例えば、液体クロマトグラフィー）を行い、次に検出方法（例えば、荷電エアロゾル検出）を行うことにより定量することができる。いくつかの実施形態において、脂質構成要素の脂質の実測濃度は、脂質解析、ＡＦ４－ＭＡＬＳ、ＮＴＡ、及び／またはクライオＥＭによって特性評価することができる。全てのｍｏｌ％の数字は、脂質構成要素の脂質のパーセンテージとして示されている。
本開示の実施形態は、脂質構成要素の脂質のそれぞれのモル比に従って記載されるＬＮＰ組成物を提供する。ある特定の実施形態において、イオン化可能な脂質の量は約２５ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％であり、中性脂質の量は約１０ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％であり、ヘルパー脂質の量は約２５ｍｏｌ％～約６５ｍｏｌ％であり、ＰＥＧ脂質の量は約１．５ｍｏｌ％～約３．５ｍｏｌ％である。ある特定の実施形態において、イオン化可能な脂質の量は脂質構成要素の約２９～４４ｍｏｌ％であり、中性脂質の量は脂質構成要素の約１１～２８ｍｏｌ％であり、ヘルパー脂質の量は脂質構成要素の約２８～５５ｍｏｌ％であり、ＰＥＧ脂質の量は脂質構成要素の約２．３～３．５ｍｏｌ％である。ある特定の実施形態において、イオン化可能な脂質の量は脂質構成要素の約２９～３８ｍｏｌ％であり、中性脂質の量は脂質構成要素の約１１～２０ｍｏｌ％であり、ヘルパー脂質の量は脂質構成要素の約４３～５５ｍｏｌ％であり、ＰＥＧ脂質の量は脂質構成要素の約２．３～２．７ｍｏｌ％である。ある特定の実施形態において、イオン化可能な脂質の量は脂質構成要素の約２５～３４ｍｏｌ％であり、中性脂質の量は脂質構成要素の約１０～２０ｍｏｌ％であり、ヘルパー脂質の量は脂質構成要素の約４５～６５ｍｏｌ％であり、ＰＥＧ脂質の量は脂質構成要素の約２．５～３．５ｍｏｌ％である。ある特定の実施形態において、イオン化可能な脂質は脂質構成要素の約３０～４３ｍｏｌ％であり、中性脂質の量は脂質構成要素の約１０～１７ｍｏｌ％であり、ヘルパー脂質の量は脂質構成要素の約４３．５～５６ｍｏｌ％であり、ＰＥＧ脂質の量は脂質構成要素の約１．５～３ｍｏｌ％である。ある特定の実施形態において、イオン化可能な脂質は脂質構成要素の約３３ｍｏｌ％であり、中性脂質の量は脂質構成要素の約１５ｍｏｌ％であり、ヘルパー脂質の量は脂質構成要素の約４９ｍｏｌ％であり、ＰＥＧ脂質の量は脂質構成要素の約３ｍｏｌ％である。ある特定の実施形態において、イオン化可能な脂質の量は脂質構成要素の約３２．９ｍｏｌ％であり、中性脂質の量は脂質構成要素の約１５．２ｍｏｌ％であり、ヘルパー脂質の量は脂質構成要素の約４９．２ｍｏｌ％であり、ＰＥＧ脂質の量は脂質構成要素の約２．７ｍｏｌ％である。ある特定の実施形態において、イオン化可能な脂質の量は脂質構成要素の約３５ｍｏｌ％であり、中性脂質の量は脂質構成要素の約１５ｍｏｌ％であり、ヘルパー脂質の量は脂質構成要素の約４７．５ｍｏｌ％であり、ＰＥＧ脂質の量は脂質構成要素の約２．５ｍｏｌ％である。
ある特定の実施形態において、イオン化可能な脂質の量は、約２０～５０ｍｏｌ％、約２５～３４ｍｏｌ％、約２５～３８ｍｏｌ％、約２５～４５ｍｏｌ％、約２９～３８ｍｏｌ％、約２９～４３ｍｏｌ％、約２９～３４ｍｏｌ％、約３０～３４ｍｏｌ％、約３０～３８ｍｏｌ％、約３０～４３ｍｏｌ％、約３０～４３ｍｏｌ％、または約３３ｍｏｌ％である。追加の実施形態において、イオン化可能な脂質の量は、２５～４５ｍｏｌ％、約２５～４３ｍｏｌ％、約２５～４０ｍｏｌ％、約２５～３８ｍｏｌ％、約２５～３５ｍｏｌ％、約２５～３３ｍｏｌ％、約２５～３０ｍｏｌ％、約２５～２８ｍｏｌ％、約２８～４５ｍｏｌ％、約２８～４３ｍｏｌ％、約２８～４０ｍｏｌ％、約２８～３８ｍｏｌ％、約２８～３５ｍｏｌ％、約２８～３３ｍｏｌ％、約２８～３０ｍｏｌ％、約３０～４５ｍｏｌ％、約３０～４３ｍｏｌ％、約３０～４０ｍｏｌ％、約３０～３８ｍｏｌ％、約３０～３５ｍｏｌ％、約３０～３３ｍｏｌ％、約３２～４５ｍｏｌ％、約３２～４３ｍｏｌ％、約３２～４０ｍｏｌ％、約３２～３８ｍｏｌ％、約３２～３５ｍｏｌ％、約３５～４５ｍｏｌ％、約３５～４３ｍｏｌ％、約３５～４０ｍｏｌ％、約３５～３８ｍｏｌ％、約３７～４５ｍｏｌ％、約３７～４３ｍｏｌ％、約３７～４０ｍｏｌ％、約４０～４５ｍｏｌ％、約４０～４３ｍｏｌ％、または約４２～４５ｍｏｌ％である。いくつかの実施形態において、イオン化可能な脂質のｍｏｌ％は、約３０ｍｏｌ％、約３１ｍｏｌ％、約３２ｍｏｌ％、約３３ｍｏｌ％、約３４ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％、約３６ｍｏｌ％、約３７ｍｏｌ％、約３８ｍｏｌ％、約３９ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％、約４１ｍｏｌ％、約４２ｍｏｌ％、約４３ｍｏｌ％、約４４ｍｏｌ％、または約４５ｍｏｌ％であり得る。いくつかの実施形態において、脂質構成要素に対するイオン化可能な脂質のｍｏｌ％は、指定、名目、または実測ｍｏｌ％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％となる。いくつかの実施形態において、脂質構成要素に対するイオン化可能な脂質のｍｏｌ％は、指定、名目、または実測ｍｏｌ％の±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１．５ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、または±０．２５ｍｏｌ％となる。ある特定の実施形態において、イオン化可能な脂質のｍｏｌ％のＬＮＰロット間変動は、１５％未満、１０％未満、または５％未満となる。いくつかの実施形態において、ｍｏｌ％の数字は名目濃度に基づく。いくつかの実施形態において、ｍｏｌ％の数字は実測濃度に基づく。
ある特定の実施形態において、中性脂質の量は、約１０～３０ｍｏｌ％、約１１～３０ｍｏｌ％、約１１～２０ｍｏｌ％、約１３～１７ｍｏｌ％、または約１５ｍｏｌ％である。追加の実施形態において、中性脂質の量は、約５～３０ｍｏｌ％、約５～２８ｍｏｌ％、約５～２５ｍｏｌ％、約５～２３ｍｏｌ％、約５～２０ｍｏｌ％、約５～１８ｍｏｌ％、約５～２３ｍｏｌ％、約５～２０ｍｏｌ％、約５～１８ｍｏｌ％、約５～１５ｍｏｌ％、約５～１３ｍｏｌ％、約５～１０ｍｏｌ％、約１０～３０ｍｏｌ％、約１０～２８ｍｏｌ％、約１０～２５ｍｏｌ％、約１０～２３ｍｏｌ％、約１０～２０ｍｏｌ％、約１０～１８ｍｏｌ％、約１０～２３ｍｏｌ％、約１０～２０ｍｏｌ％、約１０～１８ｍｏｌ％、約１０～１５ｍｏｌ％、約１０～１３ｍｏｌ％、約１２～３０ｍｏｌ％、約１２～２８ｍｏｌ％、約１２～２５ｍｏｌ％、約１２～２３ｍｏｌ％、約１２～２０ｍｏｌ％、約１２～１８ｍｏｌ％、約１２～２３ｍｏｌ％、約１２～２０ｍｏｌ％、約１２～１８ｍｏｌ％、約１２～１５ｍｏｌ％、約１５～３０ｍｏｌ％、約１５～２８ｍｏｌ％、約１５～２５ｍｏｌ％、約１５～２３ｍｏｌ％、約１５～２０ｍｏｌ％、約１５～１８ｍｏｌ％、約１５～２３ｍｏｌ％、約１５～２０ｍｏｌ％、約１５～１８ｍｏｌ％、約１７～３０ｍｏｌ％、約１７～２８ｍｏｌ％、約１７～２５ｍｏｌ％、約１７～２３ｍｏｌ％、約１７～２０ｍｏｌ％、約１７～１８ｍｏｌ％、約１７～２３ｍｏｌ％、約１７～２０ｍｏｌ％、約２０～３０ｍｏｌ％、約２０～２８ｍｏｌ％、約２０～２５ｍｏｌ％、約２０～２３ｍｏｌ％、約２２～３０ｍｏｌ％、約２２～２８ｍｏｌ％、約２２～２５ｍｏｌ％、約２２～２３ｍｏｌ％、約２２～２０ｍｏｌ％、または約２２～１８ｍｏｌ％であり得る。いくつかの実施形態において、中性脂質のｍｏｌ％は、約１０ｍｏｌ％、約１１ｍｏｌ％、約１２ｍｏｌ％、約１３ｍｏｌ％、約１４ｍｏｌ％、約１５ｍｏｌ％、約１６ｍｏｌ％、約１７ｍｏｌ％、約１８ｍｏｌ％、約１９ｍｏｌ％、約２０ｍｏｌ％、約２１ｍｏｌ％、約２２ｍｏｌ％、約２３ｍｏｌ％、約２４ｍｏｌ％、または約２５ｍｏｌ％であり得る。いくつかの実施形態において、脂質構成要素に対する中性脂質のｍｏｌ％は、指定、名目、または実測中性脂質ｍｏｌ％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％となる。いくつかの実施形態において、脂質構成要素に対する中性脂質のｍｏｌ％は、指定、名目、または実測ｍｏｌ％の±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１．５ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、または±０．２５ｍｏｌ％となる。ある特定の実施形態において、ＬＮＰのロット間変動は１５％未満、１０％未満、または５％未満となる。いくつかの実施形態において、ｍｏｌ％の数字は名目濃度に基づく。いくつかの実施形態において、ｍｏｌ％の数字は実測濃度に基づく。
ある特定の実施形態において、ヘルパー脂質の量は、約３５～５０ｍｏｌ％、約３５～６５ｍｏｌ％、約３５～５５ｍｏｌ％、約３８～５０ｍｏｌ％、約３８～５５ｍｏｌ％、約３８～６５ｍｏｌ％、約４０～５０ｍｏｌ％、約４０～６５ｍｏｌ％、約４３～６５ｍｏｌ％、約４３～５５ｍｏｌ％、または約４９ｍｏｌ％である。追加の実施形態において、ヘルパー脂質の量は、約２５～６５ｍｏｌ％、約２８～６５ｍｏｌ％、約３０～６５ｍｏｌ％、約３２～６５ｍｏｌ％、約３５～６５ｍｏｌ％、約３８～６５ｍｏｌ％、約４０～６５ｍｏｌ％、約４２～６５ｍｏｌ％、約４５～６５ｍｏｌ％、約４８～６５ｍｏｌ％、約５０～６５ｍｏｌ％、約５２～６５ｍｏｌ％、約５５～６５ｍｏｌ％、約５８～６５ｍｏｌ％、約６０～６５ｍｏｌ％、約２５～６２ｍｏｌ％、約２８～６２ｍｏｌ％、約３０～６２ｍｏｌ％、約３２～６２ｍｏｌ％、約３５～６２ｍｏｌ％、約３８～６２ｍｏｌ％、約４０～６２ｍｏｌ％、約４２～６２ｍｏｌ％、約４５～６２ｍｏｌ％、約４８～６２ｍｏｌ％、約５０～６２ｍｏｌ％、約５２～６２ｍｏｌ％、約５５～６２ｍｏｌ％、約５８～６２ｍｏｌ％、約６０～６２ｍｏｌ％、約２５～６０ｍｏｌ％、約２８～６０ｍｏｌ％、約３０～６０ｍｏｌ％、約３２～６０ｍｏｌ％、約３５～６０ｍｏｌ％、約３８～６０ｍｏｌ％、約４０～６０ｍｏｌ％、約４２～６０ｍｏｌ％、約４５～６０ｍｏｌ％、約４８～６０ｍｏｌ％、約５０～６０ｍｏｌ％、約５２～６０ｍｏｌ％、約５５～６０ｍｏｌ％、約５８～６０ｍｏｌ％、約２５～５８ｍｏｌ％、約２８～５８ｍｏｌ％、約３０～５８ｍｏｌ％、約３２～５８ｍｏｌ％、約３５～５８ｍｏｌ％、約３８～５８ｍｏｌ％、約４０～５８ｍｏｌ％、約４２～５８ｍｏｌ％、約４５～５８ｍｏｌ％、約４８～５８ｍｏｌ％、約５０～５８ｍｏｌ％、約５２～５８ｍｏｌ％、約５５～５８ｍｏｌ％、約２５～５５ｍｏｌ％、約２８～５５ｍｏｌ％、約３０～５５ｍｏｌ％、約３２～５５ｍｏｌ％、約３５～５５ｍｏｌ％、約３８～５５ｍｏｌ％、約４０～５５ｍｏｌ％、約４２～５５ｍｏｌ％、約４５～５５ｍｏｌ％、約４８～５５ｍｏｌ％、約５０～５５ｍｏｌ％、約５２～５５ｍｏｌ％、約２５～５３ｍｏｌ％、約２８～５３ｍｏｌ％、約３０～５３ｍｏｌ％、約３２～５３ｍｏｌ％、約３５～５３ｍｏｌ％、約３８～５３ｍｏｌ％、約４０～５３ｍｏｌ％、約４２～５３ｍｏｌ％、約４５～５３ｍｏｌ％、約４８～５３ｍｏｌ％、約５０～５３ｍｏｌ％、約２５～５０ｍｏｌ％、約２８～５０ｍｏｌ％、約３０～５０ｍｏｌ％、約３２～５０ｍｏｌ％、約３５～５０ｍｏｌ％、約３８～５０ｍｏｌ％、約４０～５０ｍｏｌ％、約４２～５０ｍｏｌ％、約４５～５０ｍｏｌ％、約４８～５０ｍｏｌ％、約２５～４８ｍｏｌ％、約２８～４８ｍｏｌ％、約３０～４８ｍｏｌ％、約３２～４８ｍｏｌ％、約３５～４８ｍｏｌ％、約３８～４８ｍｏｌ％、約４０～４８ｍｏｌ％、約４２～４８ｍｏｌ％、約４５～４８ｍｏｌ％、約２５～４５ｍｏｌ％、約２８～４５ｍｏｌ％、約３０～４５ｍｏｌ％、約３２～４５ｍｏｌ％、約３５～４５ｍｏｌ％、約３８～４５ｍｏｌ％、約４０～４５ｍｏｌ％、約４２～４５ｍｏｌ％、約２５～４３ｍｏｌ％、約２８～４３ｍｏｌ％、約３０～４３ｍｏｌ％、約３２～４３ｍｏｌ％、約３５～４３ｍｏｌ％、約３８～４３ｍｏｌ％、約４０～４３ｍｏｌ％、約２５～４０ｍｏｌ％、約２８～４０ｍｏｌ％、約３０～４０ｍｏｌ％、約３２～４０ｍｏｌ％、約３５～４０ｍｏｌ％、約３８～４０ｍｏｌ％、約２５～３８ｍｏｌ％、約２８～３８ｍｏｌ％、約３０～３８ｍｏｌ％、約３２～３８ｍｏｌ％、約３５～３８ｍｏｌ％、約２５～３５ｍｏｌ％、約２８～３５ｍｏｌ％、約３０～３５ｍｏｌ％、約３２～３５ｍｏｌ％、約２５～３３ｍｏｌ％、約２８～３３ｍｏｌ％、約３０～３３ｍｏｌ％、約２５～３０ｍｏｌ％、約２８～３０ ｍｏｌ％、または約２５～２８ｍｏｌ％であり得る。ある特定の実施形態において、ヘルパー脂質の量は、イオン化可能な脂質、中性脂質、及び／またはＰＥＧ脂質の量に基づき、脂質構成要素を約１００ｍｏｌ％にするように調整される。いくつかの実施形態において、脂質構成要素に対するヘルパー脂質のｍｏｌ％は、指定、名目、または実測ヘルパー脂質のｍｏｌ％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％となる。いくつかの実施形態において、脂質構成要素に対するヘルパー脂質のｍｏｌ％は、指定、名目、または実測ｍｏｌ％の±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１．５ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、または±０．２５ｍｏｌ％となる。ある特定の実施形態において、ＬＮＰのロット間変動は１５％未満、１０％未満、または５％未満となる。いくつかの実施形態において、ｍｏｌ％の数字は名目濃度に基づく。いくつかの実施形態において、ｍｏｌ％の数字は実測濃度に基づく。
ある特定の実施形態において、ＰＥＧ脂質の量は、約１．５～３．５ｍｏｌ％、約２．０～２．７ｍｏｌ％、約２．０～３．５ｍｏｌ％、約２．３～３．５ｍｏｌ％、約２．３～２．７ｍｏｌ％、約２．５～３．５ｍｏｌ％、約２．５～２．７ｍｏｌ％、約２．９～３．５ｍｏｌ％、または約２．７ｍｏｌ％である。追加の実施形態において、ＰＥＧ脂質の量は、約１．０～４．０ｍｏｌ％、約１．２～４．０ｍｏｌ％、約１．４～４．０ｍｏｌ％、約１．５～４．０ｍｏｌ％、約１．６～４．０ｍｏｌ％、約１．７～４．０ｍｏｌ％、約１．８～４．０ｍｏｌ％、約１．９～４．０ｍｏｌ％、約２．０～４．０ｍｏｌ％、約２．１～４．０ｍｏｌ％、約２．２～４．０ｍｏｌ％、約２．３～４．０ｍｏｌ％、約２．４～４．０ｍｏｌ％、約２．５～４．０ｍｏｌ％、約２．６～４．０ｍｏｌ％、約２．７～４．０ｍｏｌ％、約２．８～４．０ｍｏｌ％、約２．９～４．０ｍｏｌ％、約３．０～４．０ｍｏｌ％、約３．１～４．０ｍｏｌ％、約３．２～４．０ｍｏｌ％、約３．３～４．０ｍｏｌ％、約３．４～４．０ｍｏｌ％、約３．５～４．０ｍｏｌ％、約３．７～４．０ｍｏｌ％、１．０～３．７ｍｏｌ％、約１．２～３．７ｍｏｌ％、約１．４～３．７ｍｏｌ％、約１．５～３．７ｍｏｌ％、約１．６～３．７ｍｏｌ％、約１．７～３．７ｍｏｌ％、約１．８～３．７ｍｏｌ％、約１．９～３．７ｍｏｌ％、約２．０～３．７ｍｏｌ％、約２．１～３．７ｍｏｌ％、約２．２～３．７ｍｏｌ％、約２．３～３．７ｍｏｌ％、約２．４～３．７ｍｏｌ％、約２．５～３．７ｍｏｌ％、約２．６～３．７ｍｏｌ％、約２．７～３．７ｍｏｌ％、約２．８～３．７ｍｏｌ％、約２．９～３．７ｍｏｌ％、約３．０～３．７ｍｏｌ％、約３．１～３．７ｍｏｌ％、約３．２～３．７ｍｏｌ％、約３．３～３．７ｍｏｌ％、約３．４～３．７ｍｏｌ％、約３．５～３．７ｍｏｌ％、１．０～３．５ｍｏｌ％、約１．２～３．５ｍｏｌ％、約１．４～３．５ｍｏｌ％、約１．５～３．５ｍｏｌ％、約１．６～３．５ｍｏｌ％、約１．７～３．５ｍｏｌ％、約１．８～３．５ｍｏｌ％、約１．９～３．５ｍｏｌ％、約２．０～３．５ｍｏｌ％、約２．１～３．５ｍｏｌ％、約２．２～３．５ｍｏｌ％、約２．３～３．５ｍｏｌ％、約２．４～３．５ｍｏｌ％、約２．５～３．５ｍｏｌ％、約２．６～３．５ｍｏｌ％、約２．７～３．５ｍｏｌ％、約２．８～３．５ｍｏｌ％、約２．９～３．５ｍｏｌ％、約３．０～３．５ｍｏｌ％、約３．１～３．５ｍｏｌ％、約３．２～３．５ｍｏｌ％、約３．３～３．５ｍｏｌ％、約３．４～３．５ｍｏｌ％、１．０～３．４ｍｏｌ％、約１．２～３．４ｍｏｌ％、約１．４～３．４ｍｏｌ％、約１．５～３．４ｍｏｌ％、約１．６～３．４ｍｏｌ％、約１．７～３．４ｍｏｌ％、約１．８～３．４ｍｏｌ％、約１．９～３．４ｍｏｌ％、約２．０～３．４ｍｏｌ％、約２．１～３．４ｍｏｌ％、約２．２～３．４ｍｏｌ％、約２．３～３．４ｍｏｌ％、約２．４～３．４ｍｏｌ％、約２．５～３．４ｍｏｌ％、約２．６～３．４ｍｏｌ％、約２．７～３．４ｍｏｌ％、約２．８～３．４ｍｏｌ％、約２．９～３．４ｍｏｌ％、約３．０～３．４ｍｏｌ％、約３．１～３．４ｍｏｌ％、約３．２～３．４ｍｏｌ％、約３．３～３．４ｍｏｌ％、１．０～３．３ｍｏｌ％、約１．２～３．３ｍｏｌ％、約１．４～３．３ｍｏｌ％、約１．５～３．３ｍｏｌ％、約１．６～３．３ｍｏｌ％、約１．７～３．３ｍｏｌ％、約１．８～３．３ｍｏｌ％、約１．９～３．３ｍｏｌ％、約２．０～３．３ｍｏｌ％、約２．１～３．３ｍｏｌ％、約２．２～３．３ｍｏｌ％、約２．３～３．３ｍｏｌ％、約２．４～３．３ｍｏｌ％、約２．５～３．３ｍｏｌ％、約２．６～３．３ｍｏｌ％、約２．７～３．３ｍｏｌ％、約２．８～３．３ｍｏｌ％、約２．９～３．３ｍｏｌ％、約３．０～３．３ｍｏｌ％、約３．１～３．３ｍｏｌ％、約３．２～３．３ｍｏｌ％、１．０～３．２ｍｏｌ％、約１．２～３．２ｍｏｌ％、約１．４～３．２ｍｏｌ％、約１．５～３．２ｍｏｌ％、約１．６～３．２ｍｏｌ％、約１．７～３．２ｍｏｌ％、約１．８～３．２ｍｏｌ％、約１．９～３．２ｍｏｌ％、約２．０～３．２ｍｏｌ％、約２．１～３．２ｍｏｌ％、約２．２～３．２ｍｏｌ％、約２．３～３．２ｍｏｌ％、約２．４～３．２ｍｏｌ％、約２．５～３．２ｍｏｌ％、約２．６～３．２ｍｏｌ％、約２．７～３．２ｍｏｌ％、約２．８～３．２ｍｏｌ％、約２．９～３．２ｍｏｌ％、約３．０～３．２ｍｏｌ％、約３．１～３．２ｍｏｌ％、１．０～３．１ｍｏｌ％、約１．２～３．１ｍｏｌ％、約１．４～３．１ｍｏｌ％、約１．５～３．１ｍｏｌ％、約１．６～３．１ｍｏｌ％、約１．７～３．１ｍｏｌ％、約１．８～３．１ｍｏｌ％、約１．９～３．１ｍｏｌ％、約２．０～３．１ｍｏｌ％、約２．１～３．１ｍｏｌ％、約２．２～３．１ｍｏｌ％、約２．３～３．１ｍｏｌ％、約２．４～３．１ｍｏｌ％、約２．５～３．１ｍｏｌ％、約２．６～３．１ｍｏｌ％、約２．７～３．１ｍｏｌ％、約２．８～３．１ｍｏｌ％、約２．９～３．１ｍｏｌ％、約３．０～３．１ｍｏｌ％、１．０～３．０ｍｏｌ％、約１．２～３．０ｍｏｌ％、約１．４～３．０ｍｏｌ％、約１．５～３．０ｍｏｌ％、約１．６～３．０ｍｏｌ％、約１．７～３．０ｍｏｌ％、約１．８～３．０ｍｏｌ％、約１．９～３．０ｍｏｌ％、約２．０～３．０ｍｏｌ％、約２．１～３．０ｍｏｌ％、約２．２～３．０ｍｏｌ％、約２．３～３．０ｍｏｌ％、約２．４～３．０ｍｏｌ％、約２．５～３．０ｍｏｌ％、約２．６～３．０ｍｏｌ％、約２．７～３．０ｍｏｌ％、約２．８～３．０ｍｏｌ％、約２．９～３．０ｍｏｌ％、１．０～２．９ｍｏｌ％、約１．２～２．９ｍｏｌ％、約１．４～２．９ｍｏｌ％、約１．５～２．９ｍｏｌ％、約１．６～２．９ｍｏｌ％、約１．７～２．９ｍｏｌ％、約１．８～２．９ｍｏｌ％、約１．９～２．９ｍｏｌ％、約２．０～２．９ｍｏｌ％、約２．１～２．９ｍｏｌ％、約２．２～２．９ｍｏｌ％、約２．３～２．９ｍｏｌ％、約２．４～２．９ｍｏｌ％、約２．５～２．９ｍｏｌ％、約２．６～２．９ｍｏｌ％、約２．７～２．９ｍｏｌ％、約２．８～２．９ｍｏｌ％、１．０～２．８ｍｏｌ％、約１．２～２．８ｍｏｌ％、約１．４～２．８ｍｏｌ％、約１．５～２．８ｍｏｌ％、約１．６～２．８ｍｏｌ％、約１．７～２．８ｍｏｌ％、約１．８～２．８ｍｏｌ％、約１．９～２．８ｍｏｌ％、約２．０～２．８ｍｏｌ％、約２．１～２．８ｍｏｌ％、約２．２～２．８ｍｏｌ％、約２．３～２．８ｍｏｌ％、約２．４～２．８ｍｏｌ％、約２．５～２．８ｍｏｌ％、約２．６～２．８ｍｏｌ％、約２．７～２．８ｍｏｌ％、１．０～２．７ｍｏｌ％、約１．２～２．７ｍｏｌ％、約１．４～２．７ｍｏｌ％、約１．５～２．７ｍｏｌ％、約１．６～２．７ｍｏｌ％、約１．７～２．７ｍｏｌ％、約１．８～２．７ｍｏｌ％、約１．９～２．７ｍｏｌ％、約２．０～２．７ｍｏｌ％、約２．１～２．７ｍｏｌ％、約２．２～２．７ｍｏｌ％、約２．３～２．７ｍｏｌ％、約２．４～２．７ｍｏｌ％、約２．５～２．７ｍｏｌ％、約２．６～２．７ｍｏｌ％、１．０～２．６ｍｏｌ％、約１．２～２．６ｍｏｌ％、約１．４～２．６ｍｏｌ％、約１．５～２．６ｍｏｌ％、約１．６～２．６ｍｏｌ％、約１．７～２．６ｍｏｌ％、約１．８～２．６ｍｏｌ％、約１．９～２．６ｍｏｌ％、約２．０～２．６ｍｏｌ％、約２．１～２．６ｍｏｌ％、約２．２～２．６ｍｏｌ％、約２．３～２．６ｍｏｌ％、約２．４～２．６ｍｏｌ％、約２．５～２．６ｍｏｌ％、１．０～２．５ｍｏｌ％、約１．２～２．５ｍｏｌ％、約１．４～２．５ｍｏｌ％、約１．５～２．５ｍｏｌ％、約１．６～２．５ｍｏｌ％、約１．７～２．５ｍｏｌ％、約１．８～２．５ｍｏｌ％、約１．９～２．５ｍｏｌ％、約２．０～２．５ｍｏｌ％、約２．１～２．５ｍｏｌ％、約２．２～２．５ｍｏｌ％、約２．３～２．５ｍｏｌ％、約２．４～２．５ｍｏｌ％、１．０～２．４ｍｏｌ％、約１．２～２．４ｍｏｌ％、約１．４～２．４ｍｏｌ％、約１．５～２．４ｍｏｌ％、約１．６～２．４ｍｏｌ％、約１．７～２．４ｍｏｌ％、約１．８～２．４ｍｏｌ％、約１．９～２．４ｍｏｌ％、約２．０～２．４ｍｏｌ％、約２．１～２．４ｍｏｌ％、約２．２～２．４ｍｏｌ％、約２．３～２．４ｍｏｌ％、１．０～２．３ｍｏｌ％、約１．２～２．３ｍｏｌ％、約１．４～２．３ｍｏｌ％、約１．５～２．３ｍｏｌ％、約１．６～２．３ｍｏｌ％、約１．７～２．３ｍｏｌ％、約１．８～２．３ｍｏｌ％、約１．９～２．３ｍｏｌ％、約２．０～２．３ｍｏｌ％、約２．１～２．３ｍｏｌ％、約２．２～２．３ｍｏｌ％、１．０～２．２ｍｏｌ％、約１．２～２．２ｍｏｌ％、約１．４～２．２ｍｏｌ％、約１．５～２．２ｍｏｌ％、約１．６～２．２ｍｏｌ％、約１．７～２．２ｍｏｌ％、約１．８～２．２ｍｏｌ％、約１．９～２．２ｍｏｌ％、約２．０～２．２ｍｏｌ％、約２．１～２．２ｍｏｌ％、約２．２～２．２ｍｏｌ％、約２．３～２．２ｍｏｌ％、約２．４～２．２ｍｏｌ％、１．０～２．１ｍｏｌ％、約１．２～２．１ｍｏｌ％、約１．４～２．１ｍｏｌ％、約１．５～２．１ｍｏｌ％、約１．６～２．１ｍｏｌ％、約１．７～２．１ｍｏｌ％、約１．８～２．１ｍｏｌ％、約１．９～２．１ｍｏｌ％、約２．０～２．１ｍｏｌ％、１．０～２．０ｍｏｌ％、約１．２～２．０ｍｏｌ％、約１．４～２．０ｍｏｌ％、約１．５～２．０ｍｏｌ％、約１．６～２．０ｍｏｌ％、約１．７～２．０ｍｏｌ％、約１．８～２．０ｍｏｌ％、約１．９～２．０ｍｏｌ％、１．０～１．９ｍｏｌ％、約１．２～１．９ｍｏｌ％、約１．４～１．９ｍｏｌ％、約１．５～１．９ｍｏｌ％、約１．６～１．９ｍｏｌ％、約１．７～１．９ｍｏｌ％、約１．８～１．９ｍｏｌ％、１．０～１．８ｍｏｌ％、約１．２～１．８ｍｏｌ％、約１．４～１．８ｍｏｌ％、約１．５～１．８ｍｏｌ％、約１．６～１．８ｍｏｌ％、約１．７～１．８ｍｏｌ％、１．０～１．７ｍｏｌ％、約１．２～１．７ｍｏｌ％、約１．４～１．７ｍｏｌ％、約１．５～１．７ｍｏｌ％、約１．６～１．７ｍｏｌ％、１．０～１．６ｍｏｌ％、約１．２～１．６ｍｏｌ％、約１．４～１．６ｍｏｌ％、約１．５～１．６ｍｏｌ％、１．０～１．５ｍｏｌ％、約１．２～１．５ｍｏｌ％、約１．４～１．５ｍｏｌ％、約１．５～１．５ｍｏｌ％、約１．６～１．５ｍｏｌ％、約１．７～１．５ｍｏｌ％、約１．８～１．５ｍｏｌ％、約１．９～１．５ｍｏｌ％、１．０～１．４ｍｏｌ％、約１．２～１．４ｍｏｌ％、または１．０～１．２ｍｏｌ％であり得る。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ脂質のｍｏｌ％は、約１．５ｍｏｌ％、約１．６ｍｏｌ％、約１．７ｍｏｌ％、約１．８ｍｏｌ％、約１．９ｍｏｌ％、約２．０ｍｏｌ％、約２．１ｍｏｌ％、約２．２ｍｏｌ％、約２．３ｍｏｌ％、約２．４ｍｏｌ％、約２．５ｍｏｌ％、約２．６ｍｏｌ％、約２．７ｍｏｌ％、約２．８ｍｏｌ％、約２．９ｍｏｌ％、約３．０ｍｏｌ％、約３．１ｍｏｌ％、約３．２ｍｏｌ％、約３．３ｍｏｌ％、約３．４ｍｏｌ％、または約３．５ｍｏｌ％であり得る。いくつかの実施形態において、脂質構成要素に対するＰＥＧ脂質ｍｏｌ％は、指定、名目、または実測ＰＥＧ脂質ｍｏｌ％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％となる。いくつかの実施形態において、脂質構成要素に対するＰＥＧ脂質のｍｏｌ％は、指定、名目、または実測ｍｏｌ％の±４ｍｏｌ％、±３ｍｏｌ％、±２ｍｏｌ％、±１．５ｍｏｌ％、±１ｍｏｌ％、±０．５ｍｏｌ％、または±０．２５ｍｏｌ％となる。ある特定の実施形態において、ＬＮＰのロット間変動は１５％未満、１０％未満、または５％未満となる。いくつかの実施形態において、ｍｏｌ％の数字は名目濃度に基づく。いくつかの実施形態において、ｍｏｌ％の数字は実測濃度に基づく。
ある特定の実施形態において、ヘルパー脂質の量は約３０～４０ｍｏｌ％、ＰＥＧ脂質の量は約２．５～３．５ｍｏｌ％であるか、ヘルパー脂質の量は約３３～３７ｍｏｌ％、ＰＥＧ脂質の量は約２．９～３．３ｍｏｌ％であるか、またはヘルパー脂質の量は約３５ｍｏｌ％、ＰＥＧ脂質の量は約３ｍｏｌ％である。ある特定の実施形態において、ヘルパー脂質の量は約３７～４７ｍｏｌ％、ＰＥＧ脂質の量は約２．０～３．０ｍｏｌ％であるか、ヘルパー脂質の量は約４０～４５ｍｏｌ％、ＰＥＧ脂質の量は約２．２～２．８ｍｏｌ％であるか、またはヘルパー脂質の量は約４２ｍｏｌ％、ＰＥＧ脂質の量は約２．２～２．８ｍｏｌ％である。ある特定の実施形態において、ヘルパー脂質の量は約４７～５７ｍｏｌ％、ＰＥＧ脂質の量は約２．０～３．０ｍｏｌ％であるか、ヘルパー脂質の量は約５０～５５ｍｏｌ％、ＰＥＧ脂質の量は約２．３～２．７ｍｏｌ％であるか、またはヘルパー脂質の量は約５２ｍｏｌ％、ＰＥＧ脂質の量は約２．３～２．７ｍｏｌ％である。
ある特定の実施形態において、脂質組成物（例えば、ＬＮＰ組成物）は、脂質構成要素及び核酸構成要素（水性構成要素とも称される）（例えば、ＲＮＡ構成要素）を含み、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物：核酸のモル比を測定することができる。また、本開示の実施形態は、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物の医薬的に許容される塩の正に荷電したアミン基（Ｎ）と、カプセル化される核酸の負に荷電したリン酸基（Ｐ）との間で、規定されたモル比を有する脂質組成物も提供する。これは、式Ｎ／Ｐによって数学的に表すことができる。いくつかの実施形態において、脂質組成物（例えば、ＬＮＰ組成物）は、Ｎ／Ｐ比が約３～１０である、式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物またはその医薬的に許容される塩を含む脂質構成要素と、核酸構成要素とを含むことができる。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、Ｎ／Ｐ比が約３～１０である、式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物またはその医薬的に許容される塩を含む脂質構成要素と、ＲＮＡ構成要素とを含むことができる。例えば、Ｎ／Ｐ比は約４～７、約５～７、または約６～７であり得る。いくつかの実施形態において、Ｎ／Ｐ比は約６、例えば６±１、または６±０．５であり得る。いくつかの実施形態において、Ｎ／Ｐ比は約７、例えば７±１、または７±０．５であり得る。
いくつかの実施形態において、水性構成要素は生物学的に活性な薬剤を含む。いくつかの実施形態において、水性構成要素はポリペプチドを、任意選択で核酸と組み合わせて含む。いくつかの実施形態において、水性構成要素は核酸（例えば、ＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、水性構成要素は核酸構成要素である。いくつかの実施形態において、核酸構成要素はＤＮＡを含み、これはＤＮＡ構成要素と呼ぶことができる。いくつかの実施形態において、核酸構成要素はＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、水性構成要素（例えば、ＲＮＡ構成要素）は、ｍＲＮＡ（例えば、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡ）を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤はＣａｓヌクレアーゼである。ある特定の実施形態において、水性構成要素は、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）をコードするｍＲＮＡを含むことができる。ある特定の実施形態において、生物学的に活性な薬剤はＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡである。ある特定の実施形態において、生物学的に活性な薬剤はクラス２ ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡである。ある特定の実施形態において、生物学的に活性な薬剤はＣａｓ９ヌクレアーゼｍＲＮＡである。ある特定の実施形態において、水性構成要素は修飾ＲＮＡを含むことができる。いくつかの実施形態において、水性構成要素はガイドＲＮＡ核酸を含むことができる。ある特定の実施形態において、水性構成要素はｇＲＮＡを含むことができる。ある特定の実施形態において、水性構成要素はｄｇＲＮＡを含むことができる。ある特定の実施形態において、水性構成要素は修飾ｇＲＮＡを含むことができる。ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡを含むいくつかの組成物においては、組成物はｇＲＮＡ核酸（例えば、ｇＲＮＡ）をさらに含む。いくつかの実施形態において、水性構成要素はＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤及びｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、水性構成要素はＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、水性構成要素はクラス２ ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む。
ある特定の実施形態において、脂質組成物（例えば、ＬＮＰ組成物）は、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼ）をコードするｍＲＮＡと、式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物またはその医薬的に許容される塩と、ヘルパー脂質と、任意選択で中性脂質と、ＰＥＧ脂質とを含むことができる。Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼ）をコードするｍＲＮＡを含むある特定の組成物において、ヘルパー脂質はコレステロールである。Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼ）をコードするｍＲＮＡを含む他の組成物において、中性脂質はＤＳＰＣである。Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９）をコードするｍＲＮＡを含む追加の実施形態において、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼ）をコードするｍＲＮＡと、式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物またはその医薬的に許容される塩とを含む特定の組成物において。ある特定の組成物において、組成物はｇＲＮＡ（例えば、ｄｇＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）をさらに含む。
いくつかの実施形態において、脂質組成物（例えば、ＬＮＰ組成物）はｇＲＮＡを含むことができる。ある特定の実施形態において、組成物は、式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物またはその医薬的に許容される塩と、ｇＲＮＡと、ヘルパー脂質と、任意選択で中性脂質と、ＰＥＧ脂質とを含むことができる。ｇＲＮＡを含むある特定のＬＮＰ組成物において、ヘルパー脂質はコレステロールである。ｇＲＮＡを含むいくつかの組成物において、中性脂質はＤＳＰＣである。ｇＲＮＡを含む追加の実施形態において、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。ある特定の組成物において、ｇＲＮＡはｄｇＲＮＡ及びｓｇＲＮＡから選択される。
ある特定の実施形態において、脂質組成物（例えば、ＬＮＰ組成物）は、水性構成要素中にＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤とｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡであり得る）をコードするｍＲＮＡとを含み、脂質構成要素中に式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物を含む。例えば、ＬＮＰ組成物は、式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物またはその医薬的に許容される塩と、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、ｇＲＮＡと、ヘルパー脂質と、中性脂質と、ＰＥＧ脂質とを含むことができる。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含むある特定の組成物において、ヘルパー脂質はコレステロールである。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含むいくつかの組成物において、中性脂質はＤＳＰＣである。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む追加の実施形態において、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。
ある特定の実施形態において、脂質組成物（例えば、ＬＮＰ組成物）は、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、クラス２ Ｃａｓ ｍＲＮＡ及び少なくとも１つのｇＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡはｓｇＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤はＣａｓ９ ｍＲＮＡである。ある特定の実施形態において、ＬＮＰ組成物は、約１：１～約１：２のｇＲＮＡ：ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤ｍＲＮＡ（例えば、クラス２ ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ）の比を含む。いくつかの実施形態において、重量比は、約２５：１～約１：２５、約１０：１～約１：１０、約８：１～約１：８、約４：１～約１：４、約２：１～約１：２、約２：１～約１：４、または約１：１～約１：２である。
本明細書で開示する脂質組成物（例えば、ＬＮＰ組成物）を本明細書で開示する方法で使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成要素を送達し、鋳型核酸（例えば、ＤＮＡ鋳型）を挿入することができる。鋳型核酸は、式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）の化合物またはその医薬的に許容される塩を含む脂質組成物とは別に送達することができる。いくつかの実施形態において、鋳型核酸は、所望の修復機構に応じて、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。鋳型は、例えば標的ＤＮＡ配列内に、及び／または標的ＤＮＡに隣接する配列に、標的ＤＮＡと相同性のある領域を有することができる。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は、ＲＮＡ水溶液と有機溶媒ベースの脂質溶液とを混合することにより形成される。好適な溶液または溶媒は、水、ＰＢＳ、トリスバッファー、ＮａＣｌ、クエン酸バッファー、酢酸バッファー、エタノール、クロロホルム、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、テトラヒドロフラン、メタノール、イソプロパノールを含む、または含むことができる。例えば、有機溶媒は１００％エタノールであってもよい。医薬的に許容されるバッファー、例えば、ＬＮＰ組成物のｉｎ ｖｉｖｏ投与のためのバッファーを使用することができる。ある特定の実施形態において、ＬＮＰを含む組成物のｐＨをｐＨ６．５以上に維持するためにバッファーが使用される。ある特定の実施形態において、ＬＮＰを含む組成物のｐＨをｐＨ７．０以上に維持するためにバッファーが使用される。ある特定の実施形態において、組成物は約７．２～約７．７の範囲のｐＨを有する。追加の実施形態において、組成物は約７．３～約７．７の範囲または約７．４～約７．６の範囲のｐＨを有する。さらなる実施形態において、組成物は約７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、または７．７のｐＨを有する。組成物のｐＨは、マイクロｐＨプローブを用いて測定することができる。ある特定の実施形態において、凍結保護剤が組成物中に含まれる。凍結保護剤の非限定的な例としてはスクロース、トレハロース、グリセロール、ＤＭＳＯ、及びエチレングリコールが挙げられる。例示的な組成物は凍結保護剤（例えば、スクロース）を最大１０％含むことができる。ある特定の実施形態において、組成物はトリス食塩水スクロース（ＴＳＳ）を含むことができる。ある特定の実施形態において、ＬＮＰ組成物は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０％の凍結保護剤を含むことができる。ある特定の実施形態において、ＬＮＰ組成物は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０％のスクロースを含むことができる。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物はバッファーを含むことができる。いくつかの実施形態において、バッファーは、リン酸バッファー（ＰＢＳ）、トリスバッファー、クエン酸バッファー、及びこれらの混合物を含むことができる。ある特定の例示的な実施形態において、バッファーはＮａＣｌを含む。ある特定の実施形態において、バッファーはＮａＣｌが欠如している。ＮａＣｌの例示的な量は、約２０ｍＭ～約４５ｍＭの範囲であり得る。ＮａＣｌの例示的な量は、約４０ｍＭ～約５０ｍＭの範囲であり得る。いくつかの実施形態において、ＮａＣｌの量は約４５ｍＭである。いくつかの実施形態において、バッファーはトリスバッファーである。トリスの例示的な量は、約２０ｍＭ～約６０ｍＭの範囲であり得る。トリスの例示的な量は、約４０ｍＭ～約６０ｍＭの範囲であり得る。いくつかの実施形態において、トリスの量は約５０ｍＭである。いくつかの実施形態において、バッファーはＮａＣｌ及びトリスを含む。ＬＮＰ組成物のある特定の例示的な実施形態は、トリスバッファー中に５％のスクロース及び４５ｍＭのＮａＣｌを含む。他の例示的な実施形態において、組成物は約５％ｗ／ｖの量のスクロース、約４５ｍＭのＮａＣｌ、及びｐＨ７．５の約５０ｍＭのトリスを含む。塩、バッファー、及び凍結保護剤の量は、組成物全体のオスモル濃度が維持されるように変化させることができる。例えば、最終オスモル濃度は４５０ｍＯｓｍ／Ｌ未満に維持することができる。さらなる実施形態において、オスモル濃度は３５０～２５０ｍＯｓｍ／Ｌである。ある特定の実施形態は３００±２０ｍＯｓｍ／Ｌまたは３１０±４０ｍＯｓｍ／Ｌの最終オスモル濃度を有する。
いくつかの実施形態において、有機溶媒中の水性ＲＮＡ溶液及び脂質溶液のマイクロ流体混合、Ｔ混合、またはクロス混合が使用される。ある特定の態様において、流量、接合部サイズ、接合部幾何学的形態、接合部形状、チューブ直径、溶液、及び／またはＲＮＡ及び脂質の濃度を変化させることができる。ＬＮＰまたはＬＮＰ組成物は、例えば、透析、遠心フィルター、タンジェンシャルフロー濾過、またはクロマトグラフィーを介して、濃縮または精製することができる。ＬＮＰ組成物は、例えば、懸濁液、乳濁液、または凍結乾燥粉末として保存することができる。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は２～８℃で保存され、ある態様では、ＬＮＰ組成物は室温で保存される。追加の実施形態において、ＬＮＰ組成物は、例えば、－２０℃または－８０℃で凍結保存される。他の実施形態において、ＬＮＰ組成物は約０℃～約－８０℃の範囲の温度で保存される。凍結されたＬＮＰ組成物は使用前に、例えば、氷上で、室温で、または２５℃で解凍することができる。
好ましい脂質組成物（例えば、ＬＮＰ組成物）は、例えば、治療有効用量においてｉｎ ｖｉｖｏで細胞毒性レベルまで蓄積しないという点において、生分解性である。いくつかの実施形態において、組成物は、治療用量レベルにおいて、実質的な有害作用につながる自然免疫応答を引き起こさない。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される組成物は、治療用量レベルにおいて毒性を引き起こさない。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物中のＬＮＰの濃度は、約１～１０μｇ／ｍＬ、約２～１０μｇ／ｍＬ、約２．５～１０μｇ／ｍＬ、約１～５μｇ／ｍＬ、約２～５μｇ／ｍＬ、約２．５－５μｇ／ｍＬ、約０．０４μｇ／ｍＬ、約０．０８μｇ／ｍＬ、約０．１６μｇ／ｍＬ、約０．２５μｇ／ｍＬ、約０．６３μｇ／ｍＬ、約１．２５μｇ／ｍＬ、約２．５μｇ／ｍＬ、または約５μｇ／ｍＬである。
いくつかの実施形態において、動的光散乱法（「ＤＬＳ」）は、本開示のＬＮＰの多分散指数（ＰＤＩ）及びサイズを特性評価するために使用することができる。ＤＬＳは、試料を光源に供することから生じる光の散乱を測定する。ＤＬＳ測定から求められるＰＤＩは、集団における粒子サイズの分布（平均粒子サイズの周辺）に相当し、完全に均一な集団はゼロのＰＤＩを有する。
いくつかの実施形態において、本明細書で開示するＬＮＰは約０．００５～約０．７５のＰＤＩを有する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示するＬＮＰは約０．００５～約０．１のＰＤＩを有する。いくつかの実施形態において、本明細書で開示するＬＮＰは約０．００５～約０．０９、約０．００５～約０．０８、約０．００５～約０．０７、または約０．００６～約０．０５のＰＤＩを有する。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは約０．０１～約０．５のＰＤＩを有する。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは約ゼロ～約０．４のＰＤＩを有する。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは約ゼロ～約０．３５のＰＤＩを有する。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ ＰＤＩは約ゼロ～約０．３の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは、約ゼロ～約０．２５の範囲であり得るＰＤＩを有する。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ ＰＤＩは約ゼロ～約０．２の範囲であり得る。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは約ゼロ～約０．０５のＰＤＩを有する。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは約ゼロ～約０．０１のＰＤＩを有する。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは約０．０１、約０．０２、約０．０５、約０．０８、約０．１、約０．１５、約０．２、または約０．４未満のＰＤＩを有する。
ＬＮＰサイズは、当技術分野で知られている様々な解析方法によって測定することができる。いくつかの実施形態において、ＬＮＰサイズは、非対称流動場分画法－マルチアングル光散乱（ＡＦ４－ＭＡＬＳ）を使用して測定することができる。ある特定の実施形態において、ＬＮＰサイズは、流体力学的半径によって組成物中の粒子を分離し、次に分割された粒子の分子量、流体力学的半径、及び二乗平均平方根半径を測定することにより、測定することができる。いくつかの実施形態において、ＬＮＰサイズ及び粒子濃度は、ナノ粒子追跡解析（ＮＴＡ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ）によって測定することができる。ある特定の実施形態において、ＬＮＰ試料は適切に希釈され、顕微鏡スライド上に注入される。粒子が視野を通じてゆっくり注入されるに伴い、カメラが散乱光を記録する。動画が取り込まれた後、ナノ粒子追跡解析は、ピクセルを追跡し拡散係数を計算することにより動画を処理する。この拡散係数を粒子の流体力学的半径に変換することができる。このような方法は、個々の粒子の数を数えて粒子濃度を得ることもできる。いくつかの実施形態において、ＬＮＰのサイズ、形態、及び構造特性は、クライオ電子顕微鏡法（「クライオＥＭ」）によって定量することができる。
本明細書で開示するＬＮＰ組成物のＬＮＰは、約１～約２５０ｎｍのサイズ（例えば、Ｚ平均直径または数平均直径）を有する。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは約１０～約２００ｎｍのサイズを有する。さらなる実施形態において、ＬＮＰは約２０～約１５０ｎｍのサイズを有する。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは約５０～約１５０ｎｍまたは約７０～約１３０ｎｍのサイズを有する。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは約５０～約１００ｎｍのサイズを有する。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは約５０～約１２０ｎｍのサイズを有する。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは約６０～約１００ｎｍのサイズを有する。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは約７５～約１５０ｎｍのサイズを有する。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは約７５～約１２０ｎｍのサイズを有する。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは約７５～約１００ｎｍのサイズを有する。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは約５０～約１４５ｎｍ、約５０～約１２０ｎｍ、約５０～約１２０ｎｍ、約５０～約１１５ｎｍ、約５０～約１００ｎｍ、約６０～約１４５ｎｍ、約６０～約１２０ｎｍ、約６０～約１１５ｎｍ、または約６０～約１００ｎｍのサイズを有する。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは約１４５ｎｍ未満、約１２０ｎｍ未満、約１１５ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、または約８０ｎｍ未満のサイズを有する。いくつかの実施形態において、ＬＮＰは約５０ｎｍ超または約６０ｎｍ超のサイズを有する。いくつかの実施形態において、粒子サイズはＺ平均粒子サイズである。いくつかの実施形態において、粒子サイズは数平均粒子サイズである。いくつかの実施形態において、粒子サイズは個々のＬＮＰのサイズである。別段の指示がない限り、本明細書で言及する全てのサイズは、Ｍａｌｖｅｒｎ ＺｅｔａｓｉｚｅｒまたはＷｙａｔｔ ＮａｎｏＳｔａｒにおいて動的光散乱法により測定した、完全に形成されたナノ粒子の平均サイズ（直径）である。ナノ粒子試料をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈し、カウントレートがおよそ２００～４００ｋｃｐｓになるようにする。
いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は約５０％～約１００％の範囲の平均カプセル化効率で形成される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は約５０％～約９５％の範囲の平均カプセル化効率で形成される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は約７０％～約９０％の範囲の平均カプセル化効率で形成される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は約９０％～約１００％の範囲の平均カプセル化効率で形成される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は約７５％～約９５％の範囲の平均カプセル化効率で形成される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は約９０％～約１００％の範囲の平均カプセル化効率で形成される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は約９５％～約１００％の範囲の平均カプセル化効率で形成される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は約９８％～約１００％の範囲の平均カプセル化効率で形成される。いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は約９９％～約１００％の範囲の平均カプセル化効率で形成される。
カーゴ
本明細書に記載のＬＮＰ組成物を介して送達されるカーゴは、生物学的に活性な薬剤を含む。生物学的に活性な薬剤は核酸（例えば、ｍＲＮＡやｇＲＮＡ）であり得る。ある特定の実施形態において、カーゴは、１つ以上の生物学的に活性な薬剤、例えば、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、発現ベクター、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤、抗体（例えば、モノクローナル、キメラ、ヒト化、ナノボディ、及びこれらのフラグメントなど）、コレステロール、ホルモン、ペプチド、タンパク質、化学療法剤及び他のタイプの抗悪性腫瘍剤、低分子薬物、ビタミン、補因子、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素核酸、アンチセンス核酸、三重鎖形成オリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ組成物、キメラＤＮＡ：ＲＮＡ組成物、アロザイム、アプタマー、リボザイム、デコイ及びそのアナログ、プラスミド及び他のタイプのベクター、ならびに低分子核酸分子、ＲＮＡｉ剤、短鎖干渉核酸（ｓｉＮＡ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）及び「自己複製ＲＮＡ」（レプリカーゼ酵素活性をコードし、ｉｎ ｖｉｖｏで自身の複製または増幅を指示可能）分子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸リボヌクレオチド（ＬＮＡ）、モルホリノヌクレオチド、スレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ｓｉｓｉＲＮＡ（低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ）、及びｉＲＮＡ（非対称干渉ＲＮＡ）である、またはそれらを含む。上記の生物学的に活性な薬剤のリストは例示に過ぎず、限定であるようには意図されていない。このような化合物は精製しても部分的に精製してもよく、天然に存在しても合成であってもよく、化学的に修飾されてもよい。
ＬＮＰ組成物を介して送達されるカーゴはＲＮＡ（例えば、目的タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子）であり得る。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤、またはＣａｓヌクレアーゼなどのタンパク質を発現するためのｍＲＮＡが含まれる。ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ、例えば、クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１（Ｃａｓ１２ａとも呼ばれる）タンパク質）の細胞内での発現を可能にするクラス２ ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含むＬＮＰ組成物が提供される。さらに、カーゴは、１つ以上のｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸を含むことができる。鋳型核酸（例えば、修復または組換えのためのもの）が組成物に含まれてもよく、または鋳型核酸を本明細書に記載の方法で使用することができる。下位実施形態において、カーゴは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡと、任意選択でＳ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ ｇＲＮＡとを含む。さらなる下位実施形態において、カーゴは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡと、任意選択でＮｍｅ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ｇＲＮＡとを含む。
「ｍＲＮＡ」はポリヌクレオチドを指し、ポリペプチドに翻訳することができる（すなわち、リボソーム及びアミノアシル化ｔＲＮＡによる翻訳のための基質として機能することができる）オープンリーディングフレームを含む。ｍＲＮＡは、リボース残基またはそのアナログ（例えば、２′－メトキシリボース残基）を含むリン酸－糖骨格を含むことができる。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡリン酸－糖骨格の糖は、リボース残基、２’－メトキシリボース残基、またはこれらの組合せから本質的になる。概して、ｍＲＮＡは、実質的な量のチミジン残基を含まない（例えば、０個の残基、または３０、２０、１０、５、４、３、もしくは２個のチミジン残基、または１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．２％、または０．１％未満のチミジン含量）。ｍＲＮＡは、ウリジンの位置の一部または全てに修飾ウリジンを含むことができる。
ゲノム編集ツール
いくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物は脂質核酸集合体であり、脂質核酸組成物とも称される。いくつかの実施形態において、脂質核酸組成物またはＬＮＰ組成物は、ゲノム編集ツールまたはそれをコードする核酸を含む。本明細書で使用する場合、「ゲノム編集ツール」（または「遺伝子編集ツール」）という用語は、細胞のゲノムに編集を生成するために必要または有用な「ゲノム編集システム」（または「遺伝子編集システム」）の任意の構成要素である。いくつかの実施形態において、本開示は、ゲノム編集システム（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼシステム、ＴＡＬＥＮシステム、メガヌクレアーゼシステム、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）のゲノム編集ツールを細胞（または細胞の集団）に送達する方法を提供する。ゲノム編集ツールとしては、例えば、細胞のＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば細胞のゲノムに一本鎖または二本鎖の切断を起こすことが可能なヌクレアーゼが挙げられる。ゲノム編集ツール、例えば、ヌクレアーゼまたはニッカーゼは、任意選択で、核酸を切断することなく細胞のゲノムを修飾することができる。ゲノム編集ヌクレアーゼまたはニッカーゼはｍＲＮＡによってコードされ得る。このようなヌクレアーゼとしては、例えば、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ構成要素が挙げられる。ゲノム編集ツールには融合タンパク質（例えば、ニッカーゼをエフェクタードメイン（例えば、エディタードメイン）と融合させたものを含む）が含まれる。ゲノム編集ツールには、ゲノム編集の目標を達成するために必要または有用な任意のアイテム（例えば、ガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ、ドナー核酸など）が含まれる。
脂質核酸集合組成物とともに送達するためのゲノム編集ツールを含む様々な好適な遺伝子編集システムが本明細書に記載されており、これには、限定されるものではないが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システム、及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システムが含まれる。概して、遺伝子編集システムは、標的ＤＮＡ配列内で二重鎖切断（ＤＳＢ）またはニック（例えば、一本鎖切断、またはＳＳＢ）を誘導するために、操作された切断システムの使用を伴う。切断またはニッキングは、特異的ヌクレアーゼ（例えば、操作されたＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ）の使用により、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを操作されたガイドＲＮＡとともに使用して、標的ＤＮＡ配列の特異的切断もしくはニッキングを先導することにより、生じ得る。さらに、アルゴノートシステムに基づいた標的ヌクレアーゼが開発されており（例えば、「ＴｔＡｇｏ」として知られているＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のもの；Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ ５０７（７４９１）：２５８－２６１を参照）、これは、ゲノム編集及び遺伝子治療で使用される可能性も有し得る。
ある特定の実施形態において、本開示の組成物は、１つ以上のＤＮＡ修飾剤（例えば、ＤＮＡ切断剤）を含む。様々なＤＮＡ修飾剤が本明細書に記載のＬＮＰ組成物に含まれ得る。例えば、ＤＮＡ修飾剤としては、ヌクレアーゼ（配列特異的及び非特異的の両方）、トポイソメラーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、化学物質、医薬、及び他の薬剤が挙げられる。いくつかの実施形態において、所与のＤＮＡ配列または配列のセットに結合するタンパク質を用いて、鎖切断などのＤＮＡ修飾を誘導することができる。タンパク質は、例えば、放射性崩壊が鎖切断を引き起こす１２５Ｉの組込み、またはＵＶ光に曝露するとＤＮＡとの架橋を形成する４－アジドフェナシルブロミドなどの架橋試薬の修飾などの多くの手段によって修飾することができる。このようなタンパク質－ＤＮＡ架橋は、続いてピペリジンで処置することにより二本鎖ＤＮＡ切断に変換することができる。ＤＮＡ修飾のまた別のアプローチは、転写因子または構築クロマチンタンパク質などの、１つ以上のＤＮＡ部位に結合している特異的タンパク質に対する抗体の産生を伴い、これを核タンパク質複合体からＤＮＡを単離するために使用する。
ある特定の実施形態において、本開示の組成物は、１つ以上のＤＮＡ切断剤を含む。ＤＮＡ切断剤としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ｍｉｔｏ－ＴＡＬＥＮ、及びメガヌクレアーゼシステムなどの技術が挙げられる。ＴＡＬＥＮとＺＦＮの技術は、特定のゲノム座位で標的ＤＮＡの二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導するために、エンドヌクレアーゼの触媒ドメインをモジュラーＤＮＡ結合タンパク質に繋留するという戦略を使用する。さらなるＤＮＡ切断剤としては、低分子干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、抗マイクロＲＮＡ、アンタゴニスト、低分子ヘアピンＲＮＡ、及びアプタマー（ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはペプチドベース（アフィマーを含む））が挙げられる。
いくつかの実施形態において、遺伝子編集システムはＴＡＬＥＮシステムである。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ＤＮＡの特定の配列を切断するように操作することができる制限酵素である。これは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメイン（ＤＮＡ鎖を切断するヌクレアーゼ）に融合させることによって作製される。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、所望のＤＮＡ配列に結合し、特定の位置でＤＮＡ切断を促進するように操作することができる（例えば、Ｂｏｃｈ，２０１１，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈを参照）。制限酵素は、遺伝子編集に使用するために、あるいは操作されたヌクレアーゼによるゲノム編集として知られる技法であるｉｎ ｓｉｔｕでのゲノム編集のために、細胞に導入することができる。このような方法及びそこで使用するための組成物は、当技術分野で知られている。例えば、ＷＯ２０１９１４７８０５、ＷＯ２０１４０４０３７０、ＷＯ２０１８０７３３９３を参照（これらの内容は、全体として本明細書に組み込まれる）。
いくつかの実施形態において、遺伝子編集システムはジンクフィンガーシステムである。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインと融合させることによって生成される人工制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、特定の所望のＤＮＡ配列を標的化するように操作して、複雑なゲノム内のユニークな配列を標的化するジンクフィンガーヌクレアーゼを有効にすることができる。ＩＩｓ型制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの非特異的切断ドメインは、典型的にはＺＦＮ内の切断ドメインとして使用される。切断は、内在性ＤＮＡ修復装置によって修復され、これによりＺＦＮは高等生物のゲノムを正確に改変することが可能になる。このような方法及びそこで使用するための組成物は、当技術分野で知られている。例えば、ＷＯ２０１１０９１３２４を参照（これらの内容は、全体として本明細書に組み込まれる）。
好ましい実施形態において、本開示の組成物は、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）をコードするｍＲＮＡを含む。特定の実施形態において、本開示の組成物は、Ｓ． ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９などのクラス２ ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む。
本明細書で使用する場合、「ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤」とは、ＲＮＡ及びＤＮＡの結合活性を有するポリペプチドもしくはポリペプチドの複合体、またはこのような複合体のＤＮＡ結合サブユニットを意味し、このときＤＮＡ結合活性は配列特異的であり、ＲＮＡの配列に依存する。例示的なＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤としては、Ｃａｓクリーバーゼ／ニッカーゼ及びその不活性化形態（「ｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤」）が挙げられる。本明細書で使用する場合、「Ｃａｓヌクレアーゼ」はＣａｓクリーバーゼ、Ｃａｓニッカーゼ、及びｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤を包含する。Ｃａｓクリーバーゼ／ニッカーゼ及びｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤は、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＣｓｍまたはＣｍｒ複合体、Ｃａｓ１０、そのＣｓｍ１またはＣｍｒ２サブユニット、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＣａｓｃａｄｅ複合体、そのＣａｓ３サブユニット、及びクラス２ Ｃａｓヌクレアーゼを含む。本明細書で使用する場合、「クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼ」とは、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合活性を有する一本鎖ポリペプチドである。クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼとしては、ＲＮＡ先導ＤＮＡクリーバーゼまたはニッカーゼ活性をさらに有するクラス２ Ｃａｓクリーバーゼ／ニッカーゼ（例えば、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８６３Ａバリアント）、及びクリーバーゼ／ニッカーゼ活性が不活性化されているクラス２ ｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤が挙げられる。本明細書に記載のＬＮＰ組成物とともに使用することができるクラス２ Ｃａｓヌクレアーゼとしては、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＨＦ Ｃａｓ９（例えば、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａバリアント）、ＨｙｐａＣａｓ９（例えば、Ｎ６９２Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｈ６９８Ａバリアント）、ｅＳＰＣａｓ９（１．０）（例えば、Ｋ８１０Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａバリアント）、及びｅＳＰＣａｓ９（１．１）（例えば、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａバリアント）のタンパク質及びこれらの修飾物が挙げられる。Ｃｐｆ１タンパク質（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３：１－１３（２０１５））はＣａｓ９に相同的であり、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＺｅｔｓｃｈｅのＣｐｆ１配列は、参照により全体として組み込まれる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅの表２及び４を参照。例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３（１１）：７２２－３６（２０１５）；Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６０：３８５－３９７（２０１５）を参照。
Ｃａｓヌクレアーゼが由来し得る種の非限定的な例示としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、及びＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａが挙げられる。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。他の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。なお他の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。他の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。なお他の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。さらなる実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、またはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。
野生型Ｃａｓ９は、ＲｕｖＣ及びＨＮＨという２つのヌクレアーゼドメインを有する。ＲｕｖＣドメインは非標的ＤＮＡ鎖を切断し、ＨＮＨドメインはＤＮＡの標的鎖を切断する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、２つ以上のＲｕｖＣドメイン及び／または２つ以上のＨＮＨドメインを含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは野生型Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９は標的ＤＮＡの二本鎖切断を誘導可能である。他の実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼはｄｓＤＮＡを切断することもあれば、ｄｓＤＮＡの一本鎖を切断することもあれば、ＤＮＡクリーバーゼまたはニッカーゼ活性を有しないこともある。
いくつかの実施形態において、１つのドメインまたは領域が異なるタンパク質の一部で置き換えられているキメラＣａｓヌクレアーゼが使用される。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１のような異なるヌクレアーゼ由来のドメインで置き換えられてもよい。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは修飾ヌクレアーゼであり得る。
他の実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓニッカーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのカスケード複合体の構成要素であり得る。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼはＣａｓ３タンパク質であり得る。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム由来であってもよい。いくつかの実施形態において、ＣａｓヌクレアーゼはＲＮＡ切断活性を有し得る。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤は一本鎖ニッカーゼ活性を有し、すなわち、１本のＤＮＡ鎖を切断して、「ニック」としても知られる一本鎖切断をもたらすことができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤はＣａｓニッカーゼを含む。ニッカーゼとは、ｄｓＤＮＡ内でニックを作成する酵素であり、すなわち、ＤＮＡ二重らせんの一方の鎖を切断し、他方の鎖を切断しない。いくつかの実施形態において、Ｃａｓニッカーゼは、エンドヌクレアーゼ活性部位が、例えば、触媒ドメインにおける１つ以上の改変（例えば、点変異）によって不活性化されたＣａｓヌクレアーゼ（例えば、上述のＣａｓヌクレアーゼ）のバージョンである。例えば、Ｃａｓニッカーゼ及び例示的な触媒ドメインの改変の議論については、米国特許第８，８８９，３５６号を参照。いくつかの実施形態において、Ｃａｓニッカーゼ（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ）は、不活性化ＲｕｖＣまたはＨＮＨドメインを有する。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤は、１つの機能的ヌクレアーゼドメインのみを含むように修飾されている。例えば、薬剤タンパク質は、ヌクレアーゼドメインのうちの１つが変異し、または完全もしくは部分的に欠失して、その核酸切断活性を低減するように修飾することができる。いくつかの実施形態において、活性が低減したＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態において、不活性のＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態において、活性が低減したＨＮＨドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態において、不活性のＨＮＨドメインを有するニッカーゼが使用される。
いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質ヌクレアーゼドメイン内の保存アミノ酸が、ヌクレアーゼ活性を低減または改変するために置換される。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン内にアミノ酸置換を含むことができる。ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン内の例示的なアミノ酸置換としては、Ｄ１０Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５） Ｃｅｌｌ Ｏｃｔ ２２：１６３（３）：７５９－７７１を参照。いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン内にアミノ酸置換を含むことができる。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン内の例示的なアミノ酸置換としては、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８３Ａ、及びＤ９８６Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）を参照。さらなる例示的なアミノ酸置換としては、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、及びＤ１２５５Ａが挙げられる（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２ Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ａ０Ｑ７Ｑ２（ＣＰＦ１＿ＦＲＡＴＮ））に基づく）。
いくつかの実施形態において、ニッカーゼをコードするｍＲＮＡは、標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖にそれぞれ相補的な一対のガイドＲＮＡと組み合わせて提供される。この実施形態において、ガイドＲＮＡは、ニッカーゼを標的配列に誘導し、標的配列の対向鎖上にニックを生成すること（すなわち、二重ニッキング）によってＤＳＢを導入する。いくつかの実施形態において、ダブルニッキングの使用は、特異性を改善し、オフターゲット効果を低減し得る。いくつかの実施形態において、ニッカーゼは、標的ＤＮＡ内で二重ニックを生成するために、ＤＮＡの対向鎖を標的化する２つの別々のガイドＲＮＡと一緒に使用される。いくつかの実施形態において、ニッカーゼは、標的ＤＮＡ内でダブルニックを生成するために、極めて近接するように選択された２つの別々のガイドＲＮＡと一緒に使用される。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤はクリーバーゼ及びニッカーゼ活性が欠如している。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤はｄＣａｓ ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む。ｄＣａｓポリペプチドはＤＮＡ結合活性を有する一方で、触媒活性（クリーバーゼ／ニッカーゼ活性）が本質的に欠如している。いくつかの実施形態において、ｄＣａｓポリペプチドはｄＣａｓ９ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、クリーバーゼ及びニッカーゼ活性が欠如しているＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤、またはｄＣａｓ ＤＮＡ結合ポリペプチドは、そのエンドヌクレアーゼ活性部位が、例えば、その触媒ドメインにおける１つ以上の改変（例えば、点変異）によって不活性化されているＣａｓヌクレアーゼのバージョン（例えば、上記で論じたＣａｓヌクレアーゼ）である。例えば、ＵＳ２０１４／０１８６９５８Ａ１及びＵＳ２０１５／０１６６９８０Ａ１を参照。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤はＡＰＯＢＥＣ３デアミナーゼを含む。いくつかの実施形態において、ＡＰＯＢＥＣ３デアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ３Ａ（Ａ３Ａ）である。いくつかの実施形態において、Ａ３ＡはヒトＡ３Ａである。いくつかの実施形態において、Ａ３Ａは野生型Ａ３Ａである。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤はエディターを含む。例示的なエディターとしては、ＸＴＥＮリンカーによってＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ－Ｄ１０ＡＣａｓ９ニッカーゼと融合したＨ．ｓａｐｉｅｎｓ ＡＰＯＢＥＣ３Ａを含むＢＣ２２ｎがある。いくつかの実施形態において、エディターはウラシルグリコシラーゼ阻害剤（「ＵＧＩ」）とともに提供される。いくつかの実施形態において、エディターはＵＧＩと融合している。いくつかの実施形態において、エディターをコードするｍＲＮＡ及びＵＧＩをコードするｍＲＮＡは、ＬＮＰ中で一緒に製剤化される。他の実施形態において、エディター及びＵＧＩは別々のＬＮＰ中で提供される。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤は、１つ以上の異種の機能的ドメインを含む（例えば、融合ポリペプチドである、またはそれを含む）。
いくつかの実施形態において、異種の機能的ドメインは、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤の細胞核内への輸送を促進することができる。例えば、異種の機能的ドメインは核局在化シグナル（ＮＬＳ）であってもよい。
いくつかの実施形態において、異種の機能的ドメインはＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤の細胞内半減期を修飾可能であり得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤の半減期を増加させることができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤の半減期を低減することができる。いくつかの実施形態において、異種の機能的ドメインはＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤の安定性を増加可能であり得る。いくつかの実施形態において、異種の機能的ドメインはＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤の安定性を低減可能であり得る。いくつかの実施形態において、異種の機能的ドメインはタンパク質分解のためのシグナルペプチドとして作用することができる。いくつかの実施形態において、タンパク質分解はタンパク質分解酵素（例えば、プロテアソーム、リソソームプロテアーゼ、またはカルパインプロテアーゼ）によって媒介することができる。いくつかの実施形態において、異種の機能的ドメインはＰＥＳＴ配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤はユビキチンまたはポリユビキチン鎖の付加により修飾することができる。いくつかの実施形態において、ユビキチンはユビキチン様タンパク質（ＵＢＬ）であってもよい。ユビキチン様タンパク質の非限定的な例としては、小ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、ユビキチン交差反応性タンパク質（ＵＣＲＰ、別名インターフェロン刺激遺伝子－１５（ＩＳＧ１５））、ユビキチン関連修飾因子－１（ＵＲＭ１）、神経細胞前駆体細胞発現発達下方調節タンパク質－８（ＮＥＤＤ８：ｎｅｕｒｏｎａｌ－ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ－ｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ－８；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてはＲｕｂ１とも呼ばれる）、ヒト白血球抗原Ｆ関連（ＦＡＴ１０）、オートファジー－８（ＡＴＧ８）及び－１２（ＡＴＧ１２）、Ｆａｕユビキチン様タンパク質（ＦＵＢ１）、膜アンカーＵＢＬ（ＭＵＢ）、ユビキチンフォールド修飾因子－１（ＵＦＭ１）、及びユビキチン様タンパク質－５（ＵＢＬ５）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、異種の機能的ドメインはマーカードメインであってもよい。マーカードメインの非限定的な例としては、蛍光タンパク質、精製タグ、エピトープタグ、及びレポーター遺伝子配列が挙げられる。いくつかの実施形態において、マーカードメインは蛍光タンパク質であってもよい。好適な蛍光タンパク質の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｓｆＧＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、単量体Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ単量体、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、及び橙色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、または他の任意の好適な蛍光タンパク質が挙げられる。他の実施形態において、マーカードメインは精製タグ及び／またはエピトープタグであってもよい。非限定的な例示的なタグとしては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、６ｘＨｉｓ、８ｘＨｉｓ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、ポリ－Ｈｉｓ、及びカルモジュリンが挙げられる。非限定的な例示的なレポーター遺伝子としては、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ－ガラクトシダーゼ、ベータ－グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、または蛍光タンパク質が挙げられる。
追加の実施形態において、異種の機能的ドメインは、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤を特定のオルガネラ、細胞タイプ、組織、または器官に標的化させることができる。いくつかの実施形態において、異種の機能的ドメインは、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤をミトコンドリアに標的化することができる。
さらなる実施形態において、異種の機能的ドメインはエフェクタードメイン（例えば、エディタードメイン）であってもよい。ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤が標的配列に誘導される場合、例えばＣａｓヌクレアーゼがｇＲＮＡによって標的配列に誘導される場合、エフェクタードメイン（例えば、エディタードメイン）は標的配列を修飾したりそれに影響を及ぼしたりすることができる。いくつかの実施形態において、エフェクタードメイン（例えば、エディタードメイン）は核酸結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン（例えば、非Ｃａｓヌクレアーゼドメイン）、エピジェネティック修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写抑制ドメインから選択することができる。いくつかの実施形態において、異種の機能的ドメインはヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼ）である。例えば、米国特許第９，０２３，６４９号を参照。いくつかの実施形態において、異種の機能的ドメインは転写活性化因子または転写抑制因子である。例えば、Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ａｓ ａｎ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，”Ｃｅｌｌ １５２：１１７３－８３（２０１３）；Ｐｅｒｅｚ－Ｐｉｎｅｒａ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９－ ｂａｓｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ，”Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １０：９７３－６（２０１３）；Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，“ＣＡＳ９ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｐａｉｒｅｄ ｎｉｃｋａｓｅｓ ｆｏｒ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，”Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：８３３－８（２０１３）；Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，“ＣＲＩＳＰＲ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｏｄｕｌａｒ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ，”Ｃｅｌｌ １５４：４４２－５１（２０１３）を参照。そのため、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤は本質的に、ガイドＲＮＡを用いて所望の標的配列に結合するように誘導することができる転写因子となる。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ修飾ドメインはメチル化ドメイン（例えば、脱メチル化またはメチルトランスフェラーゼドメイン）である。いくつかの実施形態において、エフェクタードメインはＤＮＡ修飾ドメイン（例えば、塩基編集ドメイン）である。特定の実施形態において、ＤＮＡ修飾ドメインは、ＤＮＡに特定の修飾を導入する核酸編集ドメイン（例えば、デアミナーゼドメイン）である。例えば、ＷＯ２０１５／０８９４０６及びＵＳ２０１６／０３０４８４６を参照。ＷＯ２０１５／０８９４０６及びＵ．Ｓ．２０１６／０３０４８４６に記載されている核酸編集ドメイン、デアミナーゼドメイン、及びＣａｓ９バリアントは、各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる。
ヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡ（「ｇＲＮＡ」）と相互作用する少なくとも１つのドメインを含むことができる。さらに、ヌクレアーゼは、ｇＲＮＡによって標的配列に誘導されてもよい。クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼシステムにおいて、ｇＲＮＡはヌクレアーゼ及び標的配列と相互作用して、標的配列との結合を誘導する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは標的切断の特異性を提供し、ヌクレアーゼは汎用性であり、異なるｇＲＮＡと対合して異なる標的配列を切断することができる。クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼは、上記に挙げたタイプ、オルソログ、及び例示的な種のｇＲＮＡスキャフォールド構造と対合することができる。
本明細書で使用する場合、「リボ核タンパク質」（ＲＮＰ）または「ＲＮＰ複合体」とは、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓクリーバーゼ、Ｃａｓニッカーゼ、またはｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９））と一緒になったｇＲＮＡを指す。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９）を標的配列に先導し、ｇＲＮＡは標的配列とハイブリダイズし、結合剤は標的配列に結合する。結合剤がクリーバーゼまたはニッカーゼである場合、結合は切断またはニッキングの後に行われ得る。
本開示のいくつかの実施形態において、ＬＮＰ組成物におけるカーゴは、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼ）であり得るＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤を標的ＤＮＡに誘導するガイド配列を含む少なくとも１つのｇＲＮＡを含む。ｇＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼまたはクラス２ Ｃａｓヌクレアーゼを標的核酸分子上の標的配列に先導することができる。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡはクラス２ Ｃａｓヌクレアーゼと結合し、また当該ヌクレアーゼによる切断の特異性を提供する。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼは、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体）を形成することができる。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体であり得る。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体はＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体（例えば、Ｃｐｆ１／ｇＲＮＡ複合体）であり得る。Ｃａｓヌクレアーゼ及び同族ｇＲＮＡは対合することができる。各クラス２ Ｃａｓヌクレアーゼと対合するｇＲＮＡスキャフォールド構造は、特定のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって異なる。
「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、及び単に「ガイド」は、本明細書では互換的に使用され、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤の同族ガイド核酸を指す。ガイドＲＮＡは、本明細書に記載のような修飾ＲＮＡを含むことができる。ｇＲＮＡは、例えば、単一のガイドＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡ（別名ｔｒａｃｒＲＮＡ）との組合せのいずれかであり得る。ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子として（シングルガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡとして）会合することも、例えば、２つの別々のＲＮＡ鎖（デュアルガイドＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ）において会合することもできる。いくつかのシステムでは、ｇＲＮＡはｃｒＲＮＡ（別名ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）であり得る。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は各々のタイプを指す。ｔｒＲＮＡは、天然に存在する配列であっても、天然に存在する配列と比較して修飾またはバリエーションを有するｔｒＲＮＡ配列であってもよい。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡが第１のＬＮＰ組成物中で製剤化され、ｇＲＮＡ核酸が第２のＬＮＰ組成物中で製剤化される。いくつかの実施形態において、第１及び第２のＬＮＰ組成物が同時に投与される。他の実施形態において、第１及び第２のＬＮＰ組成物が順次投与される。いくつかの実施形態において、第１及び第２のＬＮＰ組成物はプレインキュベートステップの前に組み合わされる。他の実施形態において、第１及び第２のＬＮＰ組成物は別々にプレインキュベートされる。
いくつかの実施形態において、カーゴはＤＮＡ分子を含むことができる。いくつかの実施形態において、核酸は、ｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムからの反復配列の全部または一部に隣接する標的化配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、ｔｒａｃｒ ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。ある特定の実施形態において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒ ＲＮＡは２つの別々の核酸によってコードすることができる。他の実施形態において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒ ＲＮＡは単一の核酸によってコードすることができる。いくつかの実施形態において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒ ＲＮＡは単一の核酸の対向鎖によってコードすることができる。他の実施形態において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒ ＲＮＡは単一の核酸の同じ鎖によってコードすることができる。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ核酸はｓｇＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ核酸はＣａｓ９ヌクレアーゼｓｇＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ核酸はＣｐｆ１ヌクレアーゼｓｇＲＮＡをコードする。
ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つの転写制御配列または調節制御配列（例えば、プロモーター、３’ＵＴＲ、または５’ＵＴＲ）に作用可能に結合することができる。一例において、プロモーターはｔＲＮＡプロモーター（例えば、ｔＲＮＡＬｙｓ３またはｔＲＮＡキメラ）であり得る。Ｍｅｆｆｅｒｄ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ．２０１５ ２１：１６８３－９；Ｓｃｈｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００７ ３５：２６２０－２６２８を参照。いくつかの実施形態において、プロモーターはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）により認識することができる。Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの非限定的な例としては、Ｕ６プロモーター及びＨ１プロモーターも挙げられる。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトのＵ６プロモーターに対し作用可能に結合していてもよい。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ核酸は修飾核酸である。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ核酸は修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ核酸は、核酸の統合を安定化及び防止するために、５’末端修飾（例えば、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチド）を含む。他の実施形態において、ｇＲＮＡ核酸は、各鎖に５’末端修飾を有する二本鎖ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ核酸は、５’末端修飾として、逆ジデオキシ－Ｔまたは逆脱塩基ヌクレオシドもしくはヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡ核酸は、ビオチン、デスチオビオチン－ＴＥＧ、ジゴキシゲニン、及び蛍光マーカー（例えば、ＦＡＭ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒを含む）などの標識を含む。
本明細書で使用する場合、「ガイド配列」とは、標的配列に対し相補的であり、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤による結合及び／または修飾（例えば、切断）のためにｇＲＮＡを標的配列に誘導する、ｇＲＮＡ内の配列を指す。また「ガイド配列」は「標的化配列」または「スペーサー配列」と称されることもある。ガイド配列は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（すなわち、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）及び関連するＣａｓ９ホモログ／オーソログの場合、２０塩基対の長さであり得る。これより短い配列または長い配列（例えば、長さ１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド）も、ガイドとして使用することができる。いくつかの実施形態において、標的配列は、例えば、遺伝子内または染色体上にあり、ガイド配列に相補的である。いくつかの実施形態において、ガイド配列と対応する標的配列との間の相補性または同一性は、約または少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態において、ガイド配列及び標的領域は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドの領域にわたって１００％相補的または同一であり得る。他の実施形態において、ガイド配列及び標的領域は少なくとも１つのミスマッチを含むことができる。例えば、ガイド配列及び標的配列は１つ、２つ、３つ、または４つのミスマッチを含むことができ、ここで標的配列の全長は、少なくとも１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の塩基対である。いくつかの実施形態において、ガイド配列及び標的領域は１～４つのミスマッチを含むことができ、ここでガイド配列は、少なくとも１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ガイド配列及び標的領域は１つ、２つ、３つ、または４つのミスマッチを含むことができ、ここでガイド配列は２０ヌクレオチドを含む。
ある特定の実施形態において、複数のＬＮＰ組成物を協同的に、及び／または別々の目的で使用することができる。いくつかの実施形態において、細胞を本明細書に記載の第１及び第２のＬＮＰ組成物に接触させることができる。いくつかの実施形態において、第１及び第２のＬＮＰ組成物は、それぞれ独立して、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、及びガイドＲＮＡ核酸のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、第１及び第２のＬＮＰ組成物が同時に投与される。いくつかの実施形態において、第１及び第２のＬＮＰ組成物が順次投与される。
いくつかの実施形態において、細胞内で複数のゲノム編集を生成する方法（本明細書などで「多重化」または「多重遺伝子編集」または「多重ゲノム編集」と称されることもある）が提供される。単一の細胞に複数の属性を操作する能力は、生存能及び所望される細胞の表現型を保持しながら、複数の標的遺伝子の編集（ノックアウト及び座位挿入を含む）を効率的に実施する能力に依存する。いくつかの実施形態において、この方法は、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することと、細胞を２つ以上の脂質核酸集合組成物に接触させることであって、各脂質核酸集合組成物が、標的部位を編集可能な核酸ゲノム編集ツールを含む、接触させることと、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させることとを含む。この方法により、複数かつ異なるゲノム編集を有する細胞が得られる。ある特定の実施形態において、第１のＬＮＰ組成物は第１のｇＲＮＡを含み、第２のＬＮＰ組成物は第２のｇＲＮＡを含み、第１及び第２のｇＲＮＡは、異なる標的に相補的である異なるガイド配列を含む。このような実施形態において、ＬＮＰ組成物は多重遺伝子編集を可能にし得る。いくつかの実施形態において、細胞は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１の脂質核酸集合組成物と接触される。いくつかの実施形態において、細胞は、少なくとも６つの脂質核酸集合組成物と接触される。
Ｃａｓタンパク質の核酸基質は二本鎖核酸であるため、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、Ｃａｓタンパク質）の標的配列は、ゲノムＤＮＡのプラス鎖及びマイナス鎖の両方（すなわち、所与の配列及びその配列の逆相補配列）を含む。したがって、ガイド配列が「標的配列に相補的」であると述べられている場合、ガイド配列はｇＲＮＡに標的配列の逆相補配列に結合するように誘導することができることを理解されたい。したがって、いくつかの実施形態において、ガイド配列が標的配列の逆相補配列に結合する場合、ガイド配列は、ガイド配列中でＴがＵに置換されていることを除いて、標的配列（例えば、ＰＡＭを含まない標的配列）におけるある特定のヌクレオチドと同一である。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のｇＲＮＡは、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣクラスＩ、またはＭＨＣクラスＩＩの表面発現を低減または除去する遺伝子を標的とする。ある特定の実施形態において、本明細書に記載のｇＲＮＡは、ＴＲＡＣを標的とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のｇＲＮＡは、ＴＲＢＣを標的とする。さらなる実施形態において、本明細書に記載のｇＲＮＡは、ＣＩＩＴＡを標的とする。他の実施形態において、本明細書に記載のｇＲＮＡは、ＨＬＡ－Ａを標的とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のｇＲＮＡは、ＨＬＡ－Ｂを標的とする。他の実施形態において、本明細書に記載のｇＲＮＡは、ＨＬＡ－Ｃを標的とする。さらなる実施形態において、本明細書に記載のｇＲＮＡは、Ｂ２Ｍを標的とする。いくつかの実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養細胞における複数のゲノム編集を生成するための方法であって、ａ）細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで、第１の核酸を含む少なくとも第１の脂質組成物に接触させて、接触細胞を生成するステップと、ｂ）細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで、第２の核酸を含む少なくとも第２の脂質組成物に接触させるステップであって、第２の核酸が第１の核酸とは異なるステップと、ｃ）細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させるステップとを含む、方法が提供される。ある特定の実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養細胞における複数のゲノム編集を生成するための方法であって、ａ）細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで、第１の核酸を含む少なくとも第１の脂質組成物に接触させて、接触細胞を生成するステップと、ｂ）接触細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して、培養接触細胞を精製するステップと、ｃ）培養接触細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで、第２の核酸を含む少なくとも第２の脂質組成物に接触させるステップであって、第２の核酸が第１の核酸とは異なるステップと、ｄ）細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させるステップとを含む、方法が提供される。さらなる実施形態において、この方法は、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで、第３の核酸を含む少なくとも第３の脂質組成物に接触させることをさらに含み、ここで、第３の核酸は第１及び第２の核酸とは異なる。さらなる実施形態において、この方法は、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで、第４の核酸を含む少なくとも第４の脂質組成物に接触させることをさらに含み、ここで、第４の核酸は第１、第２、及び第３の核酸とは異なる。なおまたさらなる実施形態において、この方法は、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで、第５の核酸を含む少なくとも第５の脂質組成物に接触させることをさらに含み、ここで、第５の核酸は第１、第２、第３、及び第４の核酸とは異なる。追加の実施形態において、この方法は、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで、第６の核酸を含む少なくとも第６の脂質組成物に接触させることをさらに含み、ここで、第６の核酸は第１、第２、第３、第４、及び第５の核酸とは異なる。ある特定の実施形態において、少なくとも２つの脂質組成物が順次投与される。いくつかの実施形態において、少なくとも２つの脂質組成物が同時に投与される。いくつかの実施形態において、細胞の増殖は生存率の増加を示す。
いくつかの実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養細胞において複数のゲノム編集を生成するための前述のいずれかの方法の核酸はＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）である。ある特定の実施形態において、脂質組成物のうちの少なくとも１つは、ＴＲＡＣを標的とするｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、脂質組成物のうちの少なくとも１つは、ＴＲＢＣを標的とするｇＲＮＡを含む。さらなる実施形態において、脂質組成物のうちの少なくとも１つは、ＭＨＣクラスＩの表面発現を低減または除去する遺伝子を標的とするｇＲＮＡを含む。なおさらなる実施形態において、脂質組成物のうちの少なくとも１つは、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現を低減または除去する遺伝子を標的とするｇＲＮＡを含む。ある特定の実施形態において、脂質組成物のうちの少なくとも１つは、ＴＲＡＣを標的とするｇＲＮＡを含み、脂質組成物のうちの少なくとも１つは、ＴＲＢＣを標的とするｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、脂質組成物のうちの少なくとも１つは、ＨＬＡ－Ａを標的とするｇＲＮＡを含み、任意選択で、細胞はＨＬＡ－Ｂにホモ接合性であり、ＨＬＡ－Ｃにホモ接合性である。いくつかの実施形態において、脂質組成物のうちの少なくとも１つは、ＣＩＩＴＡを標的とするｇＲＮＡを含む。ある特定の実施形態において、脂質組成物のうちの少なくとも１つは、ＴＲＡＣを標的とするｇＲＮＡを含み、脂質組成物のうちの少なくとも１つは、ＴＲＢＣを標的とするｇＲＮＡを含み、脂質組成物のうちの少なくとも１つは、ＨＬＡ－Ａを標的とするｇＲＮＡを含み、脂質組成物のうちの少なくとも１つは、ＣＩＩＴＡを標的とするｇＲＮＡを含む。ある特定の実施形態において、脂質組成物のうちの少なくとも１つは、ＴＲＡＣを標的とするｇＲＮＡを含み、脂質組成物のうちの少なくとも１つは、ＴＲＢＣを標的とするｇＲＮＡ、ＨＬＡ－Ａを標的とするｇＲＮＡを含み、脂質組成物のうちの少なくとも１つは、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現を低減または除去するｇＲＮＡを含む。ある特定の実施形態において、脂質組成物のうちの少なくとも１つは、ＴＲＡＣを標的とするｇＲＮＡを含み、脂質組成物のうちの少なくとも１つは、ＴＲＢＣを標的とするｇＲＮＡを含み、脂質組成物のうちの少なくとも１つは、ＭＨＣクラスＩの表面発現を低減または除去する遺伝子を標的とするｇＲＮＡを含み、脂質組成物のうちの少なくとも１つは、ＣＩＩＴＡを標的とするｇＲＮＡを含む。ある特定の実施形態において、脂質組成物のうちの少なくとも１つは、Ｔ細胞受容体の表面発現を低減または除去する遺伝子を標的とするｇＲＮＡを含み、脂質組成物のうちの少なくとも１つは、ＨＬＡ－Ａを標的とするｇＲＮＡを含み、脂質組成物のうちの少なくとも１つは、ＣＩＩＴＡを標的とするｇＲＮＡを含む。ある特定の実施形態において、脂質組成物のうちの少なくとも１つは、ＴＲＡＣを標的とするｇＲＮＡを含み、脂質組成物のうちの少なくとも１つは、ＨＬＡ－Ａを標的とするｇＲＮＡを含み、脂質組成物のうちの少なくとも１つは、ＣＩＩＴＡを標的とするｇＲＮＡを含む。ある特定の実施形態において、脂質組成物のうちの少なくとも１つは、ＭＨＣクラスＩの表面発現を低減または除去する遺伝子を標的とするｇＲＮＡを含み、脂質組成物のうちの少なくとも１つは、ＣＩＩＴＡを標的とするｇＲＮＡを含む。
ある特定の実施形態において、前述の脂質組成物のうちの少なくとも１つは、本明細書に記載の核酸ゲノム編集ツールを含む。いくつかの実施形態において、さらなる脂質組成物はＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤を含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤はＣａｓ９である。
いくつかの実施形態において、本開示の方法は、細胞をドナー核酸に接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、さらなる脂質組成物はドナー核酸を含む。ドナー核酸は標的配列に挿入することができる。いくつかの実施形態において、ドナー核酸配列がベクターとして提供される。いくつかの実施形態において、ドナー核酸は標的化受容体をコードする。ある特定の実施形態において、ドナー核酸は、Ｔ細胞受容体配列の対応する領域と相同性を有する領域を含む。「標的化受容体」とは、細胞（例えば、Ｔ細胞）の表面に存在して、細胞が標的部位（例えば、生物内の特定の細胞または組織）に結合するのを可能にするポリペプチドのことである。いくつかの実施形態において、標的化受容体はＣＡＲである。いくつかの実施形態において、標的化受容体はユニバーサルＣＡＲ（ＵｎｉＣＡＲ）である。いくつかの実施形態において、標的化受容体はＴＣＲである。いくつかの実施形態において、標的化受容体はＴ細胞受容体融合コンストラクト（ＴＲｕＣ）である。いくつかの実施形態において、標的化受容体は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）（例えば、Ｂ細胞上に発現するもの）である。いくつかの実施形態において、標的化受容体はケモカイン受容体である。いくつかの実施形態において、標的化受容体はサイトカイン受容体である。
いくつかの実施形態において、ｉｎ ｖｉｔｒｏゲノム編集法は、Ｔ細胞の複数の標的部位で高い編集効率をもたらしている。いくつかの実施形態において、内在性ＴＣＲがノックアウトされている操作Ｔ細胞が生成される。いくつかの実施形態において、内在性ＴＣＲの発現がノックアウトされている操作Ｔ細胞が生成される。いくつかの実施形態において、２つの遺伝子の発現が減少し、及び／またはノックアウトされている操作Ｔ細胞が生成される。いくつかの実施形態において、３つの遺伝子がノックダウンされ、及び／またはノックアウトされている操作Ｔ細胞が生成される。いくつかの実施形態において、４つの遺伝子がノックダウンされ、及び／またはノックアウトされている操作Ｔ細胞が生成される。いくつかの実施形態において、５つの遺伝子がノックダウンされ、及び／またはノックアウトされている操作Ｔ細胞が生成される。いくつかの実施形態において、６つの遺伝子がノックダウンされ、及び／またはノックアウトされている操作Ｔ細胞が生成される。いくつかの実施形態において、７つの遺伝子がノックダウンされ、及び／またはノックアウトされている操作Ｔ細胞が生成される。いくつかの実施形態において、８つの遺伝子がノックダウンされ、及び／またはノックアウトされている操作Ｔ細胞が生成される。いくつかの実施形態において、９つの遺伝子がノックダウンされ、及び／またはノックアウトされている操作Ｔ細胞が生成される。いくつかの実施形態において、１０の遺伝子がノックダウンされ、及び／またはノックアウトされている操作Ｔ細胞が生成される。いくつかの実施形態において、１１の遺伝子がノックダウンされ、及び／またはノックアウトされている操作Ｔ細胞が生成される。
いくつかの実施形態において、内在性ＴＣＲがノックアウトされ、トランスジェニックＴＣＲが挿入及び発現される操作Ｔ細胞が生成される。いくつかの実施形態において、操作Ｔ細胞は初代ヒトＴ細胞である。いくつかの実施形態において、ｔｇＴＣＲはウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）を標的とする。いくつかの実施形態において、ＷＴ１ ｔｇＴＣＲが、本開示の脂質組成物を用いて高い割合（例えば、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％超）のＴ細胞に挿入される。
β２ＭまたはＢ２Ｍは、本明細書では互換的に、β－２ミクログロブリンの核酸配列またはタンパク質配列に関連して使用される。ヒト遺伝子はアクセッション番号ＮＣ＿００００１５（範囲４４７１１４９２．．４４７１８８７７）、参照ＧＲＣｈ３８．ｐ１３を有する。Ｂ２Ｍタンパク質は、有核細胞の表面でヘテロ二量体としてＭＨＣクラスＩ分子と会合しており、ＭＨＣクラスＩタンパク質の発現に必要である。
ＣＩＩＴＡまたはＣＩＩＴＡまたはＣ２ＴＡは、本明細書では互換的に使用され、クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランスアクチベーターの核酸配列またはタンパク質配列を指し、ヒト遺伝子のアクセッション番号はＮＣ＿００００１６．１０（範囲１０８６６２０８．．１０９４１５６２）、参照ＧＲＣｈ３８．ｐ１３であり、参照により本明細書に組み込まれる。核内のＣＩＩＴＡタンパク質は、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子転写の正の調節因子として機能し、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現に必要である。
ＭＨＣまたはＭＨＣ分子（複数可）またはＭＨＣタンパク質またはＭＨＣ複合体（複数可）とは、主要組織適合性複合体分子（複数可）を指し、例えばＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ分子を含む。ヒトの場合、ＭＨＣ分子はヒト白血球抗原複合体またはＨＬＡ分子またはＨＬＡタンパク質と称される。ＭＨＣ及びＨＬＡという用語の使用は限定的であるようには意図されておらず、本明細書で使用する場合、ＭＨＣという用語はヒトＭＨＣ分子、すなわちＨＬＡ分子を指すために使用することができる。そのため、ＭＨＣとＨＬＡという用語は本明細書では互換的に使用される。
ＨＬＡ－Ａタンパク質の文脈で本明細書で使用する場合、ＨＬＡ－Ａとは、重鎖（ＨＬＡ－Ａ遺伝子によってコードされる）及び軽鎖（すなわち、ベータ２ミクログロブリン）を含むヘテロ二量体であるＭＨＣクラスＩタンパク質分子を指す。核酸の文脈で本明細書で使用する場合、ＨＬＡ－ＡまたはＨＬＡ－Ａ遺伝子という用語は、ＨＬＡ－Ａタンパク質分子の重鎖をコードする遺伝子を指す。ＨＬＡ－Ａ遺伝子はＨＬＡクラスＩ組織適合性Ａアルファ鎖とも称され、ヒト遺伝子のアクセッション番号はＮＣ＿０００００６．１２（２９９４２５３２．．２９９４５８７０）であり、参照により本明細書に組み込まれる。ＨＬＡ－Ａ遺伝子は、集団において数百の異なるバージョン（アレルとも称される）を有することが知られている（そして、一個体がＨＬＡ－Ａ遺伝子の２つの異なるアレルを受けることがある）。ＨＬＡ－Ａの全てのアレルは、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ａ遺伝子という用語に包含される。
核酸の文脈で本明細書で使用する場合、ＨＬＡ－Ｂとは、ＨＬＡ－Ｂタンパク質分子の重鎖をコードする遺伝子を指す。ＨＬＡ－ＢはＨＬＡクラスＩ組織適合性Ｂアルファ鎖とも称され、ヒト遺伝子のアクセッション番号はＮＣ＿０００００６．１２（３１３５３８７５．．３１３５７１７９）であり、参照により本明細書に組み込まれる。
核酸の文脈で本明細書で使用する場合、ＨＬＡ－Ｃとは、ＨＬＡ－Ｃタンパク質分子の重鎖をコードする遺伝子を指す。ＨＬＡ－ＣはＨＬＡクラスＩ組織適合性Ｃアルファ鎖とも称され、ヒト遺伝子のアクセッション番号はＮＣ＿０００００６．１２（３１２６８７４９．．３１２７２０９２）であり、参照により本明細書に組み込まれる。
標的化配列の長さは、使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム及び構成要素に依存し得る。例えば、異なる細菌種由来の異なるクラス２ Ｃａｓヌクレアーゼは、最適な標的配列の長さが異なる。したがって、標的化配列は５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または５０超のヌクレオチド長を含むことができる。いくつかの実施形態において、標的化配列の長さは、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのガイド配列よりも０、１、２、３、４、または５ヌクレオチド長いまたは短い。ある特定の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼ及びｇＲＮＡスキャフォールドは、同じＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来する。いくつかの実施形態において、標的化配列は１８～２４ヌクレオチドを含む、またはそれからなることができる。いくつかの実施形態において、標的化配列は１９～２１ヌクレオチドを含む、またはそれからなることができる。いくつかの実施形態において、標的化配列は２０ヌクレオチドを含む、またはそれからなることができる。
いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質によるＲＮＡ先導ＤＮＡ切断を媒介可能な「Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡ」である。いくつかの実施形態において、ｓｇＲＮＡは、Ｃｐｆ１タンパク質によるＲＮＡ先導ＤＮＡ切断を媒介可能な「Ｃｐｆ１ ｓｇＲＮＡ」である。ある特定の実施形態において、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質と活性複合体を形成し、ＲＮＡ先導ＤＮＡ切断を媒介するのに十分なｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒ ＲＮＡを含む。ある特定の実施形態において、ｇＲＮＡは、Ｃｐｆ１タンパク質と活性複合体を形成し、ＲＮＡ先導ＤＮＡ切断を媒介するのに十分なｃｒＲＮＡを含む。Ｚｅｔｓｃｈｅ ２０１５を参照。
ある特定の実施形態は、本明細書に記載のｇＲＮＡをコードする核酸（例えば、発現カセット）も提供する。「ガイドＲＮＡ核酸」は、本明細書ではｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡ）及びｇＲＮＡ発現カセット（１つ以上のｇＲＮＡをコードする核酸）を指すために使用される。
修飾ＲＮＡ
ある特定の実施形態において、脂質組成物（例えば、ＬＮＰ組成物）は修飾核酸（修飾ＲＮＡを含む）を含む。
修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドはＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡまたはｍＲＮＡ）内に存在し得る。１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むｇＲＮＡまたはｍＲＮＡは、カノニカルなＡ、Ｇ、Ｃ、及びＵ残基の代わりに、またはそれに加えて使用される１つ以上の非天然及び／または天然に存在する構成要素または構成の存在を説明するために、例えば、「修飾」ＲＮＡと呼ばれる。いくつかの実施形態において、修飾ＲＮＡはノンカノニカルなヌクレオシドまたはヌクレオチドで合成され、ここでは「修飾」と呼ばれる。
修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、（ｉ）ホスホジエステル骨格結合における非結合リン酸酸素の一方もしくは両方、及び／または結合リン酸酸素の一方もしくは両方の改変（例えば、置換）（例示的な骨格修飾）、（ｉｉ）例えばリボース糖上の２’ヒドロキシルの、リボース糖の構成要素の改変（例えば、置換）（例示的な糖修飾）、（ｉｉｉ）「脱ホスホ」リンカーによるリン酸部分のホールセール置換（例示的な骨格修飾）、（ｉｖ）天然に存在する核酸塩基の修飾または置換（ノンカノニカルな核酸塩基を含む）（例示的な塩基修飾）、（ｖ）リボース－リン酸骨格の置換または修飾（例示的な骨格修飾）、（ｖｉ）ポリヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾、もしくは置換、または部分、キャップ、もしくはリンカーの結合体化（このような３’または５’キャップ修飾は、糖及び／または骨格修飾を含み得る）、ならびに（ｖｉｉ）糖の修飾または置換（例示的な糖修飾）、のうちの１つ以上を含むことができる。ある特定の実施形態はｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、または核酸に対する５’末端修飾を含む。ある特定の実施形態はｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、または核酸に対する修飾を含む。ある特定の実施形態はｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、または核酸に対する３’末端修飾を含む。修飾ＲＮＡは５’末端及び３’末端の修飾を含むことができる。修飾ＲＮＡは、非末端位置に１つ以上の修飾残基を含むことができる。ある特定の実施形態において、ｇＲＮＡは少なくとも１つの修飾残基を含む。ある特定の実施形態において、ｍＲＮＡは少なくとも１つの修飾残基を含む。ある特定の実施形態において、修飾ｇＲＮＡは、５’末端の最初の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上に修飾を含む。ある特定の実施形態において、修飾ｇＲＮＡは、５’末端の最初の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上に修飾を含む。修飾ｇＲＮＡが、３’末端の最後の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上に修飾を含む、請求項５２または５３に記載のＬＮＰ組成物。
非修飾核酸は、例えば、細胞内ヌクレアーゼまたは血清中に見出されるヌクレアーゼによって分解する傾向があり得る。例えば、ヌクレアーゼは核酸のホスホジエステル結合を加水分解し得る。したがって、１つの態様において、本明細書に記載のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ）は、例えば、細胞内ヌクレアーゼまたは血清ベースのヌクレアーゼに対する安定性を導入するために、１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の修飾ＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの両方において、細胞集団に導入されたときに自然免疫応答の低減を示すことができる。「自然免疫応答」という用語は、一本鎖核酸を含む外来性核酸に対する細胞応答を含み、これはサイトカイン、特にインターフェロンの発現及び放出、ならびに細胞死の誘導を伴う。
したがって、いくつかの実施形態において、ＲＮＡまたは核酸は、核酸に安定性の増加または増強を付与する少なくとも１つの修飾を含み、これには、例えばｉｎ ｖｉｖｏでのヌクレアーゼ消化に対する抵抗性の改善が含まれる。本明細書で使用する場合、「修飾」及び「修飾されている」という用語は、このような用語が本明細書で提供される核酸に関連する場合、好ましくは安定性を増強し、ＲＮＡまたは核酸をＲＮＡまたは核酸の野生型または天然バージョンよりも安定に（例えば、ヌクレアーゼ消化に対し抵抗性に）する少なくとも１つの修飾を含む。本明細書で使用する場合、「安定」及び「安定性」などの用語は、このような用語が本明細書に記載の核酸に関する場合、特にＲＮＡにおいて、通常このようなＲＮＡを分解可能な、例えばヌクレアーゼ（すなわち、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ）による分解に対する抵抗性の増加または増強を指す。安定性の増加には、例えば、内在性酵素（例えば、エンドヌクレアーゼもしくはエキソヌクレアーゼ）または標的細胞もしくは組織内の条件による加水分解または他の破壊に対する感受性が低くなることにより、標的細胞、組織、対象、及び／または細胞質においてこのようなＲＮＡまたは核酸の滞留が増加または増強することが含まれ得る。本明細書で提供される安定化されたＲＮＡまたは核酸分子は、天然に存在する非修飾対応物（例えば、野生型バージョンの分子）よりも長い半減期を示す。また、本明細書で開示するＬＮＰ組成物のｍＲＮＡに関連する用語としての「修飾」及び「修飾されている」という用語は、ｍＲＮＡ核酸の翻訳を改善または増強する改変を企図しており、例えば、タンパク質翻訳の開始の際に機能する配列（例えば、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）の包含が含まれる。（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １５（２０）：８１２５－４８（１９８７））。
いくつかの実施形態において、ＲＮＡまたは核酸は、より安定にするために化学的または生物学的修飾を経ている。ＲＮＡまたは核酸に対する例示的な修飾としては、塩基の枯渇（例えば、欠失によるもの、もしくはあるヌクレオチドの別のヌクレオチドに対する置換によるもの）または塩基の修飾（例えば、塩基の化学的修飾）が挙げられる。本明細書で使用する場合、「化学修飾」という表現は、天然に存在するＲＮＡまたは核酸に見られる化学的性質とは異なるものを導入する修飾、例えば、共有結合修飾（例えば、修飾ヌクレオチド（例えば、ヌクレオチドアナログ、またはこのようなＲＮＡに天然に見出されないペンダント基（例えば、デオキシヌクレオシド）の包含、または核酸分子）の導入）を含む。
骨格修飾のいくつかの実施形態において、修飾残基のリン酸基は、酸素のうちの１つ以上を異なる置換基で置き換えることにより、修飾することができる。さらに、修飾残基、例えば、修飾核酸中に存在する修飾残基は、本明細書に記載のような修飾リン酸基による非修飾リン酸部分のホールセール置換を含むことができる。いくつかの実施形態において、リン酸骨格の骨格修飾は、非荷電リンカーまたは非対称電荷分布を有する荷電リンカーのいずれかをもたらす改変を含むことができる。
修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、及びホスホトリエステルが挙げられる。非修飾リン酸基のリン原子はアキラルである。ただし、非架橋酸素のうちの１つを上記の原子または原子群の１つで置き換えると、リン原子をキラルにすることができる。立体化学的リン原子は「Ｒ」配置（本明細書ではＲｐ）または「Ｓ」配置（本明細書ではＳｐ）のいずれかを有し得る。また、骨格は、架橋酸素（すなわち、リン酸をヌクレオシドに結合する酸素）を窒素（架橋ホスホロアミデート）、及び硫黄（架橋ホスホロチオエート）、炭素（架橋メチレンホスホネート）で置き換えることによって修飾することもできる。この置換は、一方の結合酸素で生じることもあれば、両方の結合酸素で生じることもある。リン酸基は、ある特定の骨格修飾において非リン含有コネクターによって置き換えることができる。いくつかの実施形態において、荷電リン酸基は中性部分によって置き換えることができる。ホスフェート基を置き換えることができる部分の例としては、限定されるものではないが、例えば、メチルホスホネート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルマセタール、ホルマセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、及びメチレンオキシメチルイミノを挙げることができる。
ｍＲＮＡ
いくつかの実施形態において、本明細書で開示する組成物または製剤は、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、本明細書に記載のＣａｓヌクレアーゼまたはクラス２ Ｃａｓヌクレアーゼ）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼまたはクラス２ Ｃａｓヌクレアーゼ）をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡが提供、使用、または投与される。ｍＲＮＡは５’キャップ、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’ＵＴＲ、及びポリアデニンテールのうちの１つ以上を含むことができる。ｍＲＮＡは、例えば、核局在化配列をコードするために、または代替コドンを使用してタンパク質をコードするために、修飾オープンリーディングフレームを含むことができる。
本開示のＬＮＰ組成物中のｍＲＮＡは細胞表面または細胞内ポリペプチドをコードすることができる。本開示のＬＮＰ組成物中のｍＲＮＡは、例えば、分泌ホルモン、酵素、受容体、ポリペプチド、ペプチド、または通常分泌される他の目的タンパク質をコードすることができる。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは任意選択で、例えば、このようなｍＲＮＡの安定性及び／または半減期を改善する、あるいはタンパク質生成を改善または他の方法で促進する化学的または生物学的修飾を有することができる。
さらに、好適な修飾としては、コドンが同じアミノ酸をコードし、ただし野生型バージョンのｍＲＮＡに見出されるコドンよりも安定するような、コドンの１つ以上のヌクレオチドの改変が挙げられる。例えば、ＲＮＡの安定性とシチジン（Ｃ）残基及び／またはウリジン（Ｕ）残基の数がより多いこととの間の逆比例関係が実証されており、Ｃ残基及びＵ残基がないＲＮＡはほとんどのＲＮアーゼに対して安定していることが分かっている（Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９，２１３１－８（１９９４））。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ配列中のＣ及び／またはＵ残基の数が低減される。別の実施形態において、Ｃ及び／またはＵ残基の数は、特定のアミノ酸をコードする１つのコドンを、同じまたは関連するアミノ酸をコードする別のコドンで置換することにより、低減される。ｍＲＮＡ核酸に対し企図される修飾には、プソイドウリジンの組込みも含まれる。プソイドウリジンをｍＲＮＡ核酸に組み込むことにより、安定性及び翻訳能力を増強し、さらにｉｎ ｖｉｖｏの免疫原性を減弱することができる。例えば、Ｋａｒｉｋｏ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １６（１１）：１８３３－１８４０（２００８）を参照。ｍＲＮＡの置換及び修飾は、当業者に容易に知られている方法により実施することができる。
配列中のＣ残基及びＵ残基の数を低減することの制約は、ｍＲＮＡのコード領域内では、非翻訳領域と比較して大きくなる可能性がある（すなわち、メッセージが所望のアミノ酸配列をコードする能力を保持したまま、メッセージ中に存在するＣ残基及びＵ残基を全て除去することはおそらく不可能である）。ただし、遺伝暗号の縮退は、同じコード能力を維持しながら、配列中に存在するＣ残基及び／またはＵ残基の数の低減を可能にする機会をもたらす（すなわち、どのアミノ酸がコドンによってコードされるかに応じて、ＲＮＡ配列の修飾にはいくつかの異なる可能性が考えられ得る）。
修飾という用語は、例えば、ｍＲＮＡ配列への非ヌクレオチド結合または修飾ヌクレオチドの組み込み（例えば、機能的分泌タンパク質または酵素をコードするｍＲＮＡ分子の３’末端及び５’末端の一方または両方に対する修飾）も含む。このような修飾としては、ｍＲＮＡ配列への塩基の付加（例えば、ポリＡテールまたはより長いポリＡテールの包含）、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲの改変、ｍＲＮＡと薬剤（例えば、タンパク質または相補的核酸分子）との複合体化、及びｍＲＮＡ分子の構造を変化させる要素の包含（例えば、二次構造を形成するもの）が挙げられる。
ポリＡテールは天然のメッセンジャーを安定化させると考えられている。そのため、長いポリＡテールをｍＲＮＡ分子に付加してｍＲＮＡをより安定にすることができる。ポリＡテールは、当技術分野で認められている様々な技法を用いて付加することができる。例えば、ポリＡポリメラーゼを用いて、合成またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡに長いポリＡテールを付加することができる（Ｙｏｋｏｅ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９９６；１４：１２５２－１２５６）。転写ベクターは長いポリＡテールもコードすることができる。さらに、ＰＣＲ産物から直接転写することによりポリＡテールを付加することもできる。いくつかの実施形態において、ポリＡテールの長さは少なくとも約９０、２００、３００、４００、少なくとも５００ヌクレオチドである。ある特定の実施形態において、ポリＡテールの長さが、修飾ｍＲＮＡ分子の安定性、ひいてはタンパク質の転写を制御するために調整される。例えば、ポリＡテールの長さはｍＲＮＡ分子の半減期に影響を及ぼし得るため、ポリＡテールの長さを調節して、ヌクレアーゼに対するｍＲＮＡの抵抗性のレベルを修飾し、それにより細胞内でのタンパク質発現の時間経過を制御することができる。いくつかの実施形態において、安定化されたｍＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ分解（例えば、ヌクレアーゼによるもの）に対する抵抗性が十分であるため、移動ビヒクルなしで標的細胞に送達することができる。
ある特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、野生型ｍＲＮＡ中に天然には見出されない３’及び／または５’非翻訳（ＵＴＲ）配列を組み込むことにより、修飾することができる。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡに天然に隣接し、第２の無関係なタンパク質をコードする３’及び／または５’フランキング配列は、それを修飾するために治療的または機能的タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列に組み込むことができる。例えば、安定しているｍＲＮＡ分子（例えば、グロビン、アクチン、ＧＡＰＤＨ、チューブリン、ヒストン、またはクエン酸回路酵素）からの３’または５’配列を、センスｍＲＮＡ核酸分子の３’及び／または５’領域に組み込んでセンスｍＲＮＡ分子の安定性を高めることができる。例えば、ＵＳ２００３／００８３２７２を参照。
ｍＲＮＡ修飾のより詳細な説明は、ＵＳ２０１７／０２１０６９８Ａ１の５７～６８ページに見出すことができ、その内容は本明細書に組み込まれる。
鋳型核酸
本明細書で開示する方法は、鋳型核酸を使用することを含むことができる。鋳型は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合タンパク質（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えばクラス２ Ｃａｓヌクレアーゼ）の標的部位におけるまたはその付近の核酸配列を改変または挿入するために使用することができる。いくつかの実施形態において、この方法は細胞に鋳型を導入することを含む。いくつかの実施形態において、単一の鋳型が提供され得る。他の実施形態において、２つ以上の標的部位で編集が生じることができるように２つ以上の鋳型が提供され得る。例えば、細胞内の単一の遺伝子を編集するために、または細胞内の２つの異なる遺伝子を編集するために異なる鋳型が提供され得る。
いくつかの実施形態において、鋳型は相同組換えで使用することができる。いくつかの実施形態において、相同組換えの結果、鋳型配列または鋳型配列の一部を標的核酸分子に組み込むことができる。他の実施形態において、鋳型は、核酸内の切断部位におけるＤＮＡ鎖侵入を伴う相同組換え修復に使用することができる。いくつかの実施形態において、相同組換え修復の結果、編集した標的核酸分子内に鋳型配列を含めることができる。また他の実施形態において、鋳型は、非相同末端結合によって媒介される遺伝子編集に使用することができる。いくつかの実施形態において、鋳型配列は、切断部位付近の核酸配列と類似性を有しない。いくつかの実施形態において、鋳型または鋳型配列の一部が組み込まれる。いくつかの実施形態において、鋳型はフランキング逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。
いくつかの実施形態において、鋳型配列は標的細胞の内在性配列に対応する、それを含む、またはそれからなることができる。また、標的細胞の外来性配列に対応する、それを含む、またはそれからなることもできる。本明細書で使用する場合、「内在性配列」という用語は、細胞にネイティブな配列を指す。「外来性配列」という用語は、細胞にネイティブでない配列、または細胞のゲノム内のネイティブな位置が異なる位置にある配列を指す。いくつかの実施形態において、内在性配列は細胞のゲノム配列であり得る。いくつかの実施形態において、内在性配列は染色体配列または染色体外配列であり得る。いくつかの実施形態において、内在性配列は細胞のプラスミド配列であり得る。
いくつかの実施形態において、鋳型は、フランキング逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含むｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、鋳型はベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノサークル、またはＰＣＲ産物として提供される。
いくつかの実施形態において、核酸は精製される。いくつかの実施形態において、核酸は沈殿法（例えば、ＬｉＣｌ沈殿、アルコール沈殿、または同等の方法、例えば、本明細書に記載の方法）を用いて精製される。いくつかの実施形態において、核酸は、クロマトグラフィーベースの方法（例えば、ＨＰＬＣベースの方法または同等の方法（例えば、本明細書に記載の方法））を用いて精製される。いくつかの実施形態において、核酸は、沈殿法（例えば、ＬｉＣｌ沈殿法）及びＨＰＬＣベースの方法の両方を用いて精製される。いくつかの実施形態において、核酸はタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって精製される。
細胞タイプ
いくつかの実施形態において、細胞は免疫細胞である。本明細書で使用する場合、「免疫細胞」とは免疫システムの細胞を指し、これには例えば、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（「ＮＫ細胞」、及びＮＫＴ細胞、もしくはｉＮＫＴ細胞））、単球、マクロファージ、マスト細胞、樹状細胞、または顆粒球（例えば、好中球、好酸球、及び好塩基球）が含まれる。いくつかの実施形態において、細胞は初代免疫細胞である。いくつかの実施形態において、免疫システム細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、及びＣＤ８＋Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ならびに樹状細胞（ＤＣ）から選択することができる。いくつかの実施形態において、免疫細胞は同種異系である。いくつかの実施形態において、細胞はリンパ球である。いくつかの実施形態において、細胞は適応免疫細胞である。いくつかの実施形態において、細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、細胞はＢ細胞である。いくつかの実施形態において、細胞はＮＫ細胞である。
本明細書で使用する場合、Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（「ＴＣＲ」または「αβ ＴＣＲ」または「γδ ＴＣＲ」）を発現する細胞として定義することができるが、いくつかの実施形態において、Ｔ細胞のＴＣＲは、（例えば、ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣ遺伝子に対する遺伝子修飾により）その発現を低減するように遺伝子修飾することがあり、そのため、タンパク質ＣＤ３の発現は、標準的なフローサイトメトリー法によりＴ細胞を同定するためのマーカーとして使用することができる。ＣＤ３は、ＴＣＲと会合するマルチサブユニットシグナル伝達複合体である。したがって、Ｔ細胞はＣＤ３＋と称されることがある。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ３＋マーカー及びＣＤ４＋マーカーまたはＣＤ８＋マーカーのいずれかを発現する細胞である。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は糖タンパク質ＣＤ８を発現し、そのため標準的なフローサイトメトリー法によればＣＤ８＋であり、「細胞傷害性」Ｔ細胞と称されることがある。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は糖タンパク質ＣＤ４を発現し、そのため標準的なフローサイトメトリー法によればＣＤ４＋であり、「ヘルパー」Ｔ細胞と称されることがある。ＣＤ４＋Ｔ細胞はサブセットに分化することができ、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ９細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ２２細胞、Ｔ調節性（「Ｔｒｅｇ」）細胞、またはＴ濾胞ヘルパー細胞（「Ｔｆｈ」）と称され得る。各ＣＤ４＋サブセットは、炎症または抗炎症機能、生存または保護機能のいずれかを有し得る特定のサイトカインを放出する。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋選択法により、対象から単離することができる。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞はメモリーＴ細胞である。体内では、メモリーＴ細胞が抗原に遭遇している。メモリーＴ細胞は、二次リンパ器官に位置する（セントラルメモリーＴ細胞）こともあれば、最近感染した組織に位置する（エフェクターメモリーＴ細胞）こともある。メモリーＴ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。メモリーＴ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞であり得る。本明細書で使用する場合、「セントラルメモリーＴ細胞」は抗原経験Ｔ細胞として定義することができ、例えば、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４５ＲＯを発現することができる。セントラルメモリーＴ細胞はＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ４５ＲＯ＋として検出され得る。セントラルメモリーＴ細胞はＣＣＲ７も発現し、そのため標準的なフローサイトメトリー法によりＣＣＲ７＋として検出され得る。
本明細書で使用する場合、「初期幹細胞メモリーＴ細胞」（または「Ｔｓｃｍ」）は、ＣＤ２７及びＣＤ４５ＲＡを発現し、そのため標準的なフローサイトメトリー法によりＣＤ２７＋及びＣＤ４５ＲＡであるＴ細胞として定義することができる。ＴｓｃｍはＣＤ４５アイソフォームＣＤ４５ＲＯを発現せず、そのため、標準的なフローサイトメトリー法によりこのアイソフォームが染色されると、ＴｓｃｍはさらにＣＤ４５ＲＯ－となる。そのためＣＤ４５ＲＯ－ＣＤ２７＋細胞は、初期の幹細胞メモリーＴ細胞でもある。Ｔｓｃｍ細胞はＣＤ６２Ｌ及びＣＣＲ７をさらに発現し、そのため標準的なフローサイトメトリー法によりＣＤ６２Ｌ＋及びＣＣＲ７＋として検出され得る。初期の幹細胞メモリーＴ細胞は、細胞療法製品の持続性及び治療有効性の増加と相関することが示されている。
いくつかの実施形態において、細胞はＢ細胞である。本明細書で使用する場合、「Ｂ細胞」はＣＤ１９及び／またはＣＤ２０、及び／またはＢ細胞成熟抗原（「ＢＣＭＡ」）を発現する細胞として定義することができ、そのため、Ｂ細胞は標準的なフローサイトメトリー法によればＣＤ１９＋、及び／またはＣＤ２０＋、及び／またはＢＣＭＡ＋である。Ｂ細胞はさらに、標準的なフローサイトメトリー法によればＣＤ３及びＣＤ５６が陰性である。Ｂ細胞は形質細胞であり得る。Ｂ細胞はメモリーＢ細胞であり得る。Ｂ細胞はナイーブＢ細胞であり得る。Ｂ細胞はＩｇＭ＋であり得、またはクラススイッチＢ細胞受容体（例えば、ＩｇＧ＋、ＩｇＡ＋）を有する。
ＡＣＴ療法に使用される細胞が含まれ、例えば、間葉系幹細胞（例えば、骨髄（ＢＭ）、末梢血（ＰＢ）、胎盤、臍帯（ＵＣ）、もしくは脂肪から単離）、造血幹細胞（ＨＳＣ；例えば、ＢＭから単離）、単核細胞（例えば、ＢＭもしくはＰＢから単離）、内皮前駆細胞（ＥＰＣ；ＢＭ、ＰＢ、及びＵＣから単離）、神経幹細胞（ＮＳＣ）、角膜縁幹細胞（ＬＳＣ）、または組織特異的初代細胞もしくはそれに由来する細胞（ＴＳＣ）が含まれる。ＡＣＴ療法に使用される細胞としてはさらに、他の細胞タイプ（例えば、島細胞、神経細胞、及び血液細胞を含む）に分化するように誘導することができる誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、眼球幹細胞、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、臓器または組織移植用の細胞（例えば、島細胞、心筋細胞、甲状腺細胞、胸腺細胞、神経細胞、皮膚細胞、網膜細胞、軟骨細胞、筋細胞、及びケラチノサイト）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、細胞はヒト細胞（例えば、対象由来の細胞）である。いくつかの実施形態において、細胞はヒト対象（例えば、ヒトドナー）から単離される。いくつかの実施形態において、細胞はヒトドナーＰＢＭＣまたはロイコパックから単離される。いくつかの実施形態において、細胞は状態、障害、疾患を有する対象由来である。いくつかの実施形態において、細胞はエプスタインバーウイルス（「ＥＢＶ」）を有するヒトドナー由来である。
いくつかの実施形態において、細胞は単核細胞（例えば、骨髄または末梢血由来）である。いくつかの実施形態において、細胞は末梢血単核球（「ＰＢＭＣ」）である。いくつかの実施形態において、細胞はＰＢＭＣ（例えば、リンパ球または単球）である。いくつかの実施形態において、細胞は末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）である。
いくつかの実施形態において、この方法はｅｘ ｖｉｖｏで行われる。本明細書で使用する場合、「ｅｘ ｖｉｖｏ」とは、例えばＡＣＴ療法として、細胞を対象に移行可能なｉｎ ｖｉｔｒｏの方法を指す。いくつかの実施形態において、ｅｘ ｖｉｖｏの方法は、ＡＣＴ療法細胞または細胞集団を伴うｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である。
いくつかの実施形態において、細胞は培養下で維持される。いくつかの実施形態において、細胞は患者に移植される。いくつかの実施形態において、細胞が対象から取り出され、ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子修飾され、次いで同じ患者に再び投与される。いくつかの実施形態において、細胞が対象から取り出され、ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子修飾され、次いで取り出された対象以外の対象に投与される。
いくつかの実施形態において、細胞は細胞株由来である。いくつかの実施形態において、細胞株はヒト対象に由来する。いくつかの実施形態において、細胞株はリンパ芽球様細胞株（「ＬＣＬ」）である。細胞は凍結保存し解凍することができる。細胞は以前に凍結保存されていなくてもよい。
いくつかの実施形態において、細胞は細胞バンク由来である。いくつかの実施形態において、細胞は遺伝子修飾され、次いで細胞バンクに移される。いくつかの実施形態において、細胞は対象から取り出され、ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子修飾され、細胞バンクに移される。いくつかの実施形態において、遺伝子修飾された細胞集団が細胞バンクに移される。いくつかの実施形態において、遺伝子修飾された免疫細胞集団が細胞バンクに移される。いくつかの実施形態において、第１及び第２の亜集団を含む遺伝子修飾された免疫細胞集団であって、第１及び第２の亜集団が少なくとも１つの共通の遺伝子修飾及び少なくとも１つの異なる遺伝子修飾を有する、遺伝子修飾された免疫細胞集団が、細胞バンクに移される。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ポリクローナル活性化（または「ポリクローナル刺激」）（抗原特異的刺激ではない）によって活性化される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ３刺激（例えば、抗ＣＤ３抗体の提供）によって活性化される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ３及びＣＤ２８刺激（例えば、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体の提供）によって活性化される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、Ｔ細胞を活性化するためのすぐに使用可能な試薬を用いて（例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激を介して）活性化される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞はビーズにより提供されるＣＤ３／ＣＤ２８刺激によって活性化される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、１つ以上の構成要素が可溶性であり、及び／または１つ以上の構成要素が固体表面（例えば、プレートまたはビーズ）に結合しているＣＤ３／ＣＤ２８刺激を介して活性化される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、抗原非依存性マイトジェン（例えば、レクチン（例えば、コンカナバリンＡ（「ＣｏｎＡ」）またはＰＨＡを含む））によって活性化される。
いくつかの実施形態において、１つ以上のサイトカインがＴ細胞の活性化のために使用される。ＩＬ－２は、Ｔ細胞の活性化のため及び／またはＴ細胞の生存を促進するために提供される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞の活性化のためのサイトカイン（複数可）は、共通ガンマ鎖（γｃ）受容体に結合するサイトカインである。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２がＴ細胞活性化のために提供される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－７がＴ細胞活性化のために提供される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１５がＴ細胞活性化のために提供される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－２１がＴ細胞活性化のために提供される。いくつかの実施形態において、サイトカインの組合せ（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／またはＩＬ－２１を含む）がＴ細胞活性化のために提供される。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、細胞を抗原に曝露する（抗原刺激）ことにより活性化される。抗原が主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子（ペプチド－ＭＨＣ複合体）内でペプチドとして提示されると、Ｔ細胞は抗原により活性化される。Ｔ細胞を抗原提示細胞（フィーダー細胞）及び抗原と共培養することにより、同族抗原をＴ細胞に提示することができる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、抗原でパルスされた抗原提示細胞との共培養により活性化される。いくつかの実施形態において、抗原提示細胞は抗原のペプチドでパルスされている。
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は１２～７２時間活性化させることができる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は１２～４８時間活性化させることができる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は１２～２４時間活性化させることができる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は２４～４８時間活性化させることができる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は２４～７２時間活性化させることができる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は１２時間活性化させることができる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は４８時間活性化させることができる。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は７２時間活性化させることができる。
本発明を示された実施形態と併せて説明するが、これらの実施形態は、本発明をこれらの実施形態に限定するように意図されていないことを理解されたい。そうではなく、本開示は、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本発明内に含まれ得る全ての代替形態、変更形態、及び等価物（特定の特徴の等価物を含む）を網羅するように意図されている。
前述の一般的な説明及び詳細な説明、ならびに以下の実施例は、いずれも例示及び説明にとどまるものであり、教示内容を制限するものではない。本明細書で使用される節の見出しは、編成上の目的にとどまるものであり、いかなる形でも主題を限定するものと解釈すべきではない。参照により組み込まれた文献が本明細書で定義された用語と矛盾する場合は、本明細書が優先される。本出願で示される全ての範囲は、別段の記載がない限り、両端値を包含する。
定義
本出願で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈による明確な別段の定めがない限り、複数形への言及を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「（１つの）組成物」に言及された場合は複数の組成物を含み、「（１つの）細胞」に言及された場合は複数の細胞を含む、などとなる。「または」の使用は包括的であり、別段の記載がない限り「及び／または」を意味する。
本明細書の上記で特に注記しない限り、本明細書内で、様々な構成要素を「含む」と記載している実施形態は、記載された構成要素から「なる」または「本質的になる」ことも企図されており、本明細書内で様々な構成要素から「なる」と記載されている実施形態は、記載された構成要素を「含む」またはそれから「本質的になる」ことも企図されており、本明細書内で様々な構成要素について「約」と記載している実施形態は、記載された構成要素「における」ことも企図されており、本明細書内で、様々な構成要素から「本質的になる」と記載している実施形態は、記載された構成要素から「なる」またはそれを「含む」ことも企図されている（この互換性は、特許請求の範囲におけるこれらの用語の使用には適用されない）。
数値範囲は、その範囲を規定する数字を含む。測定値及び測定可能値は、有効数字及び測定に伴う誤差を考慮した概算値であると理解される。本出願で使用される「約」及び「およそ」という用語は、当技術分野で理解されている意味を有する。一方及び他方の使用は、必ずしも異なる範囲を意味するものではない。別段の指示がない限り、本出願で使用される数値は、「約」または「およそ」などの修飾語の有無にかかわらず、関連技術分野の当業者が理解すると考えられる通常の乖離及び／または変動を包含するものと理解されたい。ある特定の実施形態において、「およそ」または「約」という用語は、別段の明記がない限り、または文脈から別の内容が明らかでない限り（このような数字が可能な値の１００％を超える場合を除いて）、記載された基準値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、またはそれ以下のいずれかの方向（より大きい、またはより小さい）に収まる値の範囲を指すことができる。
本明細書で使用する場合、「接触」という用語は、２つ以上の実体間に物理的な接続を確立することを意味する。例えば、哺乳類細胞をナノ粒子組成物に接触させることは、哺乳類細胞及びナノ粒子に物理的な接続を共有させることを意味する。細胞を外部の実体に接触させる方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの両方において、生物学的技術分野で周知されている。例えば、哺乳類内で配置されたナノ粒子組成物と哺乳類細胞との接触は、様々な投与経路（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、及び皮下）により実施することができ、様々な量のナノ粒子組成物を伴うことができる。さらに、複数の哺乳類細胞をナノ粒子組成物に接触させることができる。
本明細書で使用する場合、「送達する」という用語は、実体を宛先に供給することを意味する。例えば、治療薬及び／または予防薬を対象に送達することは、治療薬及び／または予防薬を含むナノ粒子組成物を（例えば、静脈内、筋肉内、皮内、または皮下経路により）対象に投与することを伴い得る。哺乳類または哺乳類細胞へのナノ粒子組成物の投与は、１つ以上の細胞をナノ粒子組成物に接触させることを含み得る。
本明細書で使用する場合、「カプセル化効率」とは、ナノ粒子組成物の調製に使用される治療薬及び／または予防薬の最初の総量に対する、ナノ粒子組成物の一部となる治療薬及び／または予防薬の量を指す。例えば、最初に組成物に供給された合計１００ｍｇの治療薬及び／または予防薬のうち、９７ｍｇの治療薬及び／または予防薬がナノ粒子組成物内にカプセル化された場合、カプセル化効率は９７％として得ることができる。本明細書で使用する場合、「カプセル化」とは完全な、実質的な、または部分的な封入、拘束、取囲み、または内包を指すことができる。
本明細書で使用する場合、「編集効率」、「編集パーセンテージ」、「インデル効率」、及び「パーセントインデル」という用語は、配列リードの総数に対する挿入または欠失を伴った配列リードの総数を指す。例えば、ゲノム内の標的位置における編集効率は、ゲノムＤＮＡを単離及びシークエンシングして、遺伝子編集によって導入された挿入及び欠失の存在を特定することにより、測定することができる。いくつかの実施形態において、編集効率は、最初にその遺伝子を含んでいた細胞（例えば、ＣＤ３＋細胞）の数に対する、処置後に遺伝子をもはや含まない細胞（例えば、ＣＤ３）のパーセンテージとして測定される。
本明細書で使用する場合、「ノックダウン」とは、特定の遺伝子産物（例えば、タンパク質、ｍＲＮＡ、またはこの両方）の発現の減少を指す。タンパク質のノックダウンは、目的の組織、液体、細胞集団などの試料から、そのタンパク質の細胞内総量を検出することにより、測定することができる。また、タンパク質のサロゲート、マーカー、または活性を測定することによっても測定することができる。ｍＲＮＡのノックダウンを測定する方法は知られており、目的試料から単離したｍＲＮＡのシークエンシングを含む。いくつかの実施形態において、「ノックダウン」は、特定の遺伝子産物における発現の何らかの喪失、例えば、転写されるｍＲＮＡの量の減少、または細胞集団（組織中に見出されるようなｉｎ ｖｉｖｏ集団を含む）により発現するタンパク質の量の減少を指すことができる。
本明細書で使用する場合、「ノックアウト」とは、細胞内で特定の遺伝子からのまたは特定のタンパク質の発現が喪失することを指す。ノックアウトは、例えば、細胞、組織、または細胞集団におけるタンパク質の総細胞量を検出することにより測定することができる。また、ノックアウトは、例えばゲノムやｍＲＮＡレベルで検出することもできる。
本明細書で使用する場合、「生分解性」という用語は、細胞内に導入されたときに、細胞機構（例えば、酵素分解）または加水分解によって分解され、細胞に対する重大な毒性効果（複数可）なしで細胞が再利用または廃棄できる構成要素となる物質を指すために使用される。ある特定の実施形態において、生分解性材料の分解によって生成される構成要素は、ｉｎ ｖｉｖｏで炎症及び／または他の有害作用を誘導しない。いくつかの実施形態において、生分解性材料は酵素的に分解される。代替的または追加的に、いくつかの実施形態において、生分解性材料は加水分解によって分解される。
本明細書で使用する場合、「Ｎ／Ｐ比」とは、例えば、脂質構成要素及びＲＮＡを含むナノ粒子組成物中の、イオン化可能な窒素原子含有脂質（例えば式Ｉの化合物）：ＲＮＡ中のリン酸基のモル比のことである。
また、組成物は１つ以上の化合物の塩も含むことができる。塩は医薬的に許容される塩であり得る。本明細書で使用する場合、「医薬的に許容される塩」とは、既存の酸または塩基部分をその塩の形態に変換することにより（例えば、遊離塩基基を好適な有機酸と反応させることにより）親化合物が改変されている本開示の化合物の誘導体を指す。医薬的に許容される塩の例としては、限定されるものではないが、アミンなどの塩基性残基の鉱物または有機酸塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリまたは有機酸塩などが挙げられる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、カンファー酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどに加えて無毒性アンモニウム、四級アンモニウム、及びアミンカチオンが挙げられ、これには、限定されるものではないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどが含まれる。本開示の医薬的に許容される塩としては、例えば無毒性の無機酸または有機酸から形成される、親化合物の従来の無毒性塩が挙げられる。本開示の医薬的に許容される塩は、従来の化学的方法により、塩基性または酸性部分を含む親化合物から合成することができる。概して、このような塩は、これらの化合物の遊離酸または塩基形態を、化学量論量の適切な塩基または酸と、水または有機溶媒中で、またはこの２つの混合物中で反応させることによって調製することができ、概して、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。好適な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ，Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ． Ｇ． Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ， ２００８及びＢｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，１－１９（１９７７）に記載されており、これらの各々は参照により全体として本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用する場合、「多分散指数」とは、システムの粒度分布の均一性を表す比率のことである。小さい値、例えば０．３未満は粒度分布が狭いことを示す。いくつかの実施形態において、多分散指数は０．１未満であり得る。
本明細書で使用する場合、「形質移入」とは、ある種（例えば、ＲＮＡ）を細胞に導入することを指す。形質移入は、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで行うことができる。
本明細書で使用する場合、「アルキル」という用語は、１～２４個の炭素原子を有する分枝状または非分枝状の飽和炭化水素基のことであり、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓ－ブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ｓ－ペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルである。アルキル基は環状であっても非環状であってもよい。アルキル基は分枝状であっても非分枝状（すなわち、直鎖状）であってもよい。また、アルキル基は置換されていても置換されていなくてもよい。例えば、アルキル基は、本明細書に記載のように、１つ以上の基（限定されるものではないが、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ニトロ、シリル、スルホオキソ、スルホネート、カルボキシレート、またはチオールを含む）で置換されてもよい。「低級アルキル」基は、１～６個（例えば、１～４個）の炭素原子を含有するアルキル基である。
本明細書で使用する場合、「アルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素間二重結合を含む脂肪族基を指し、「非置換アルケニル」及び「置換アルケニル」の両方を含むことが意図され、後者は、当該アルケニル基の１個以上の炭素上の水素を置き換える置換基を有するアルケニル部分を指す。このような置換基は、１つ以上の二重結合に含まれるか、または含まれない１個以上の炭素上で存在し得る。さらに、このような置換基は、安定性が抑制される場合を除いて、以下のようにアルキル基に対して企図されるもの全てを含む。例えば、アルケニル基は、１つ以上のアルキル基、カルボシクリル基、アリール基、ヘテロシクリル基、またはヘテロアリール基で置換され得ることが企図される。例示的なアルケニル基としては、限定されるものではないが、ビニル（－ＣＨ＝ＣＨ２）、アリル（－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、シクロペンテニル（－Ｃ５Ｈ７）、及び５－ヘキセニル（－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）が挙げられる。
「アルキレン」基とは、分枝状であっても非分枝状（すなわち、直鎖状）であってもよい二価のアルキルラジカルを指す。上述した一価のアルキル基はいずれも、アルキルから第２の水素原子を除去することにより、アルキレンに変換することができる。代表的なアルキレンとしては、Ｃ２～４アルキレン及びＣ２～３アルキレンが挙げられる。代表的なアルキレン基としては、限定されるものではないが、－ＣＨ（ＣＨ３）－、－Ｃ（ＣＨ３）２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－、－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－などが挙げられる。また、アルキレン基は置換されていても置換されていなくてもよい。例えば、アルキレン基は、本明細書に記載のように、１つ以上の基（限定されるものではないが、アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ニトロ、シリル、スルホオキソ、スルホネート、カルボキシレート、またはチオールを含む）で置換されてもよい。
「アルケニレン」という用語は、少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を有し、１つの実施形態では炭素間三重結合を有しない、二価の直鎖状または分枝状不飽和非環式ヒドロカルビル基を含む。上述した一価のアルケニル基はいずれも、アルケニルから第２の水素原子を除去することにより、アルケニレンに変換することができる。代表的なアルケニレンとしてはＣ２～６アルケニレンが挙げられる。
「Ｃｘ～ｙ」という用語は、アルキルまたはアルキレンなどの化学部分とともに使用される場合、鎖内にｘ～ｙ個の炭素を含む基を含むことを意味する。例えば、「Ｃｘ～ｙアルキル」という用語は、鎖内にｘ～ｙ個の炭素を含む直鎖状及び分枝状のアルキル基及びアルキレン基を含む、置換または非置換の飽和炭化水素基を指す。
「アルコキシ」という用語は、酸素が結合しているアルキル基、好ましくは低級アルキル基を指す。代表的なアルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシなどが挙げられる。
参照による組込み
論文、特許、及び特許出願の内容、ならびに本明細書で言及または引用されている他の全ての文書及び電子的に入手可能な情報は、個々の刊行物が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されている場合と同じ程度に、参照により全体として本明細書に組み込まれる。出願人は、このような論文、特許、特許出願、または他の物理的及び電子的文書に含まれる全ての資料及び情報を本出願に物理的に組み込む権利を留保する。
実施例１：材料及び方法
実施例１．１ 脂質ナノ粒子（「ＬＮＰ」）製剤
ＬＮＰ構成要素を、様々なモル比で１００％エタノールに溶解した。ＲＮＡカーゴ（例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡの組合せ）を２５ｍＭのクエン酸、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０に溶解して、その結果ＲＮＡカーゴの濃度はおよそ０．４５ｍｇ／ｍＬとなった。ＬＮＰは、別段の指定がない限り、脂質アミン：ＲＮＡリン酸（Ｎ：Ｐ）のモル比を約６で、ｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの重量比を１：２で製剤化した。
４構成要素脂質システムにおいて様々なアミン脂質を用いてＬＮＰを調製した。別段の指定がない限り、ＬＮＰには、イオン化可能な脂質、化合物６（（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエート（別名３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノエート））、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧが含まれた。
ＬＮＰは、エタノール中の脂質と２体積のＲＮＡ溶液及び１体積の水との衝突ジェット混合を利用するクロスフロー技法を用いて調製した。エタノール中の脂質を、ミキシングクロスを通じて２体積のＲＮＡ溶液と混合した。第４の水流を、インラインティーを通じてクロスのアウトレット流と混合した（ＷＯ２０１６０１０８４０の図２を参照）。ＬＮＰを室温で１時間保持し、さらに水で希釈した（およそ１：１ ｖ／ｖ）。タンジェンシャルフロー濾過を、例えばフラットシートカートリッジ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、１００ｋＤ ＭＷＣＯ）上で用いてＬＮＰを濃縮し、任意選択で、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ）を用いて５０ｍＭのトリス、４５ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）のスクロース、ｐＨ７．５（ＴＳＳ）にバッファー交換した。代替的に、１００ｋＤａのＡｍｉｃｏｎスピンフィルターを用いてＬＮＰを任意選択で濃縮し、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ）を用いてＴＳＳにバッファー交換した。次に、０．２μＭの滅菌フィルターを用いて得られた混合物を濾過した。最終的なＬＮＰを、さらに使用するまで４℃または－８０℃で保存した。
実施例１．２ ヌクレアーゼｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（「ＩＶＴ」）
Ｎ１－メチルシュード－Ｕを含むキャッピング及びポリアデニル化されたｍＲＮＡを、線状化プラスミドＤＮＡ鋳型及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写により生成した。Ｔ７プロモーター、転写のための配列、及びポリアデニル化領域を含むプラスミドＤＮＡを、以下の条件：２００ｎｇ／μＬのプラスミド、２Ｕ／μＬのＸｂａＩ（ＮＥＢ）、及び１×反応バッファーを用いて、ＸｂａＩとともに３７℃にて２時間インキュベートすることにより線状化した。ＸｂａＩは、反応物を６５℃で２０分間加熱することにより不活性化した。線状化プラスミドを酵素及びバッファー塩から精製した。修飾ｍＲＮＡを生成するためのＩＶＴ反応を、以下の条件：５０ｎｇ／μＬの線状化プラスミド；各２～５ｍＭのＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＮ１－メチルシュード－ＵＴＰ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）；１０～２５ｍＭのＡＲＣＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）；５Ｕ／μＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）；１Ｕ／μＬのマウスＲＮアーゼ阻害剤（ＮＥＢ）；０．００４Ｕ／μＬの無機Ｅ．ｃｏｌｉピロホスファターゼ（ＮＥＢ）；ならびに１×反応バッファーにおいて、３７℃で１．５～４時間インキュベートすることにより実施した。ＴＵＲＢＯ ＤＮアーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を加えて最終濃度０．０１Ｕ／μＬとし、反応物をさらに３０分間インキュベートしてＤＮＡ鋳型を取り出した。ＭｅｇａＣｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）またはＲＮｅａｓｙ Ｍａｘｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者のプロトコルに従って用いて、ｍＲＮＡを精製した。
代替的に、ｍＲＮＡを沈殿プロトコルにより精製し、場合によってはその後にＨＰＬＣベースの精製を行った。簡潔に説明すると、ＤＮアーゼ消化後、ＬｉＣｌ沈殿、酢酸アンモニウム沈殿、及び酢酸ナトリウム沈殿を用いてｍＲＮＡを精製する。ＨＰＬＣ精製ｍＲＮＡについては、ＬｉＣｌ沈殿及び再構成の後、ｍＲＮＡをＲＰ－ＩＰ ＨＰＬＣによって精製した（例えば、Ｋａｒｉｋｏ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１，Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．２１ ｅ１４２を参照）。プール用に選択した画分を合わせ、上記のように酢酸ナトリウム／エタノール沈殿により脱塩した。さらに代替的な方法では、ｍＲＮＡをＬｉＣｌ沈殿方法で精製し、続いてタンジェンシャルフロー濾過によりさらに精製した。ＲＮＡ濃度を、２６０ｎｍにおける光吸収を測定することにより定量し（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）、転写物をＢｉｏａｎｌａｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるキャピラリー電気泳動により解析した。
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（「Ｓｐｙ」）Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを、配列番号１～３に従うオープンリーディングフレームをコードするプラスミドＤＮＡから生成した（表３５の配列参照）。この段落で引用する配列が以下でＲＮＡに関し言及される場合、ＴｓをＵｓ（上記のように修飾されたヌクレオシドであり得る）で置き換えるべきであることを理解されたい。実施例で使用したメッセンジャーＲＮＡは５’キャップ及び３’ポリアデニル化配列（例えば、最大１００ｎｔ）を含み、表３５で明らかにしている。
ガイドＲＮＡは、当技術分野で知られている方法により化学合成される。
実施例１．４ 製剤解析
動的光散乱法（「ＤＬＳ」）を使用して、本開示のＬＮＰの多分散指数（「ｐｄｉ」）及びサイズを特性評価した。ＤＬＳは、試料を光源に供することから生じる光の散乱を測定する。ＤＬＳ測定から求められるＰＤＩは、集団における粒子サイズの分布（平均粒子サイズの周辺）に相当し、完全に均一な集団はゼロのＰＤＩを有する。
非対称流動場分画－多角度光散乱（ＡＦ４－ＭＡＬＳ）は、流体力学的半径によって組成物中の粒子を分離し、次いで分割された粒子の分子量、流体力学的半径、及び二乗平均平方根半径を測定するために使用される。これにより、分子量分布及び粒度分布を評価する能力に加えて、二次特性、例えば、Ｂｕｒｃｈａｒｄ－Ｓｔｏｃｋｍｅｙｅｒプロット（粒子の内部コア密度を示唆する二乗平均平方根（「ｒｍｓ」）半径：流体力学的半径の経時的な比）及びｒｍｓ立体構造プロット（得られる線形フィットの傾きによって圧縮ｖｓ伸長の程度が得られるｒｍｓ半径の対数ｖｓ分子量の対数）を評価することができる。
クライオ電子顕微鏡（「クライオＥＭ」）は、ＬＮＰの粒子サイズ、形態、及び構造特性を定量するために使用することができる。
液体クロマトグラフィー及び荷電エアロゾル検出（ＬＣ－ＣＡＤ）を用いてＬＮＰの脂質組成物解析を決定した。この解析は、実測脂質含量及び名目脂質含量を比較するものである。
ＬＮＰ組成物の平均粒子サイズ、多分散指数（ｐｄｉ）、総ＲＮＡ含量、ＲＮＡのカプセル化効率、及びゼータ電位を解析した。ＬＮＰ組成物は脂質解析、ＡＦ４－ＭＡＬＳ、ＮＴＡ、及び／またはクライオＥＭによってさらに特性評価することができる。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＤＬＳ装置を用いた動的光散乱法（ＤＬＳ）により、平均粒子サイズ及び多分散性を測定した。ＬＮＰ試料をＰＢＳバッファーで希釈してからＤＬＳにより測定した。Ｚ平均直径を数平均直径及びｐｄｉとともに報告した。Ｚ平均とは、粒子の集合の強度加重平均流体力学的サイズのことであり、動的光散乱法によって測定した。数平均とは、動的光散乱法によって測定された粒子の集合の粒子数加重平均流体力学的サイズのことである。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ装置も使用してＬＮＰのゼータ電位を測定した。測定前に試料を０．１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４で１：１７（８００μＬ中５０μＬ）に希釈した。
カプセル化効率を（総ＲＮＡ－遊離ＲＮＡ）／総ＲＮＡとして計算した。蛍光ベースアッセイ（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標）；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して総ＲＮＡ濃度及び遊離ＲＮＡを定量した。ＬＮＰ試料を０．２％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を含む１×ＴＥバッファーで適切に希釈して、総ＲＮＡまたは１×ＴＥバッファーを定量して遊離ＲＮＡを定量した。標準曲線は、組成物の作製に使用し１×ＴＥバッファー＋／－０．２％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００で希釈した出発ＲＮＡ溶液を利用することによって用意した。次いで、希釈したＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）色素（製造業者の指示に従う）を標準物質及び試料の各々に加え、光の不在下で、室温でおよそ１０分間インキュベートした。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、励起、オートカットオフ、及び発光の波長をそれぞれ４８８ｎｍ、５１５ｎｍ、及び５２５ｎｍに設定して試料を読み取った。総ＲＮＡ及び遊離ＲＮＡを適切な標準曲線から定量した。
ＡＦ４－ＭＡＬＳは、分子量及び粒度分布、ならびにこれらの計算値からの二次統計量を調べるために使用される。ＬＮＰを適宜希釈し、ＨＰＬＣオートサンプラーを用いてＡＦ４分離チャネルに注入し、集中させ、次いでチャネルを横切るクロスフローの指数関数的勾配で溶出する。全ての流体はＨＰＬＣポンプ及びＷｙａｔｔ Ｅｃｌｉｐｓｅ装置によって駆動される。ＡＦ４チャネルから溶出した粒子は、ＵＶ検出器、多角度光散乱検出器、準弾性光散乱検出器、及び示差屈折率検出器を流れる。生データを、Ｄｅｂｅｙｅモデルを使用することによって処理して、検出器シグナルから分子量及びｒｍｓ半径を定量する。
ＣＡＤは、全ての不揮発性化合物を検出する破壊質量ベース検出器であり、シグナルはアナライト構造に関係なく一貫している。
ＬＮＰ中の脂質構成要素を、荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）と結合したＨＰＬＣにより定量的に解析した。４つの脂質構成要素のクロマトグラフィー分離は逆相ＨＰＬＣにより達成される。ＨＰＬＣ脂質解析により、表１に示されているように、以下の実施例に記載したＬＮＰ組成物の各構成要素の実際のモル％（ｍｏｌ－％）脂質レベルが得られた。

Figure 2024515650000027
Figure 2024515650000028
実施例１．５ Ｔ細胞の調製
健康なヒトドナーの白血球アフェレーシスを市販で入手した（Ｈｅｍａｃａｒｅ）。ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞単離キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；カタログ番号１７９５１）を用いたネガティブセレクション、またはＳｔｒａｉｇｈｔＦｒｏｍ（登録商標）Ｌｅｕｋｏｐａｋ（登録商標）ＣＤ４／ＣＤ８マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙ；カタログ番号１３０－１２２－３５２）を用いたＣＤ４／ＣＤ８ポジティブセレクションにより、Ｔ細胞を、製造業者の指示に従ってＭｕｌｔｉＭＡＣＳＴＭ Ｃｅｌｌ２４ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｐｌｕｓ装置上で単離した。Ｔ細胞は、将来の使用のためにＣｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０凍結培地（カタログ番号０７９３０）中で凍結保存した。
解凍したら、ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ基本培地（Ｇｉｂｃｏ；Ａ３７０５００１）に１×ＧｌｕｔａＭＡＸ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（１０ｍＭ）、及び１％ｐｅｎ－ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ；１５１４０－１２２）を補充し、さらに２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；２００－０２）、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；２００－０７）、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；２００－１５）、及び２．５％ヒト血清（Ｇｅｍｉｎｉ；１００－５１２）を補充したものから構成される完全Ｔ細胞増殖培地中でＴ細胞を培養した。一晩静置した後、１０＾６細胞／ｍＬの密度のＴ細胞をＴ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ試薬（１：１００希釈、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で活性化し、３７℃で２４または４８時間インキュベートした。インキュベート後、０．５×１０＾６／ｍＬの密度の細胞を編集用途に使用した。
別段の指示がない限り、以下の例外を除いて非活性化Ｔ細胞にも同じプロセスを使用した。解凍したら、ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ基本培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ；Ａ１０４８５－０１）、１％のｐｅｎ－ｓｔｒｅｐ（Ｃｏｒｎｉｎｇ；３０－００２－ＣＩ）、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ；３５０５００６１）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ；１５６３００８０）から構成され、さらに２００Ｕ／ｍＬのＩＬ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；２００－０２）、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；２００－０７）、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；２００－１５）及び５％ヒトＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ；１００－５１２）を補充したＣＴＳ完全増殖培地中で非活性化Ｔ細胞を培養し、活性化せずに２４時間インキュベートした。２．５％ヒト血清及び編集用途用サイトカインを含む１００ｕＬの上述したＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ基本培地に、Ｔ細胞を１０＾６／ｍＬの細胞密度でプレーティングした。
実施例１．６ Ｔ細胞のＬＮＰ形質移入
Ｔ細胞を、実施例１で先に記載のように調製したＬＮＰにより形質移入した。ＬＮＰ形質移入に用いた材料については実施例１に記載されている。ＬＮＰ用量応答曲線（ＤＲＣ）形質移入をＨａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏｌａｂ ＳＴＡＲリキッドハンドリングシステムで実施した。リキッドハンドラーに以下のものを供給した：（ａ）９６ディープウェルプレートの最上列のディープウェルに入った所望される最高用量の４倍のＬＮＰ、（ｂ）２０μｇ／ｍＬで培地に希釈したＡｐｏＥ３、（ｃ）先に実施例１に記載したＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ基本培地で構成された完全Ｔ細胞増殖培地、及び（ｄ）９６ウェル平底組織培養プレートに１００ｕＬ中１０＾６／ｍｌの密度でプレーティングしたＴ細胞。まずリキッドハンドラーは、ディープウェルプレートに入ったＬＮＰの４倍用量から、ＬＮＰの８ポイント２倍段階希釈を実施した。次いで、等体積のＡｐｏＥ３培地を各ウェルに加えた。続いて１００μＬのＬＮＰ－ＡｐｏＥ混合物を各Ｔ細胞プレートに加えた。最高用量におけるＬＮＰの最終濃度は５μｇ／ｍＬであった。ＡｐｏＥ３の最終濃度は５μｇ／ｍＬ、Ｔ細胞は０．５×１０＾６細胞／ｍＬの最終密度であった。プレートを３７℃、５％のＣＯ２で、活性化Ｔ細胞及びオン活性化Ｔ細胞についてそれぞれ２４時間または４８時間インキュベートした。インキュベート後、ＬＮＰで処置したＴ細胞を採取し、オンターゲット編集またはＣａｓ９タンパク質発現検出を解析した。残りの細胞をＬＮＰ処置後７～１０日間培養し、フローサイトメトリーによりタンパク質表面発現を評価した。
実施例１．８ フローサイトメトリー解析
ＴＲＡＣによってコードされるＴ細胞受容体アルファ鎖は、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３複合体のアセンブリー及び細胞表面への転座に必要である。編集は、編集後のＣＤ３陰性細胞のパーセンテージの増加によってアッセイした。フローサイトメトリーにより細胞表面タンパク質をアッセイするため、Ｔ細胞を１００μＬの抗体カクテル（１：１００ ＰＥ－抗ヒトＣＤ３［Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号３００４４１］、１：２００ ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ４［Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号３００５３８］、１：２００ ＡＰＣ抗ヒトＣＤ８ａ［Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号３０１０４９］、ＦＡＣＳバッファー［ＰＢＳ＋２％のＦＢＳ＋２ｍＭのＥＤＴＡ］）中に浮遊させ、４℃で３０分間インキュベートした。Ｔ細胞を洗浄し、次いでＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋２％のＦＢＳ＋２ｍＭのＥＤＴＡ）に再浮遊させた。続いてＴ細胞をＣｙｔｏｆｌｅｘ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で処理した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージ（ｖ．１０．６．１またはｖ．１０．７．１）を用いてデータ解析を実施した。簡潔に説明すると、Ｔ細胞をリンパ球でゲーティングし、続いて単一細胞でゲーティングした。これらの単一細胞をＣＤ４＋／ＣＤ８＋状態でゲーティングし、そこからＣＤ８＋／ＣＤ３－細胞を選択した。ＣＤ８＋／ＣＤ３－細胞のパーセントを定量化して、編集した標的座位がＴＣＲノックアウトをもたらした細胞集団のパーセンテージを求めた。線形回帰モデルを使用して、ＴＣＲ ＫＯの用量応答曲線をＰｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄ（ｖ．９．０）を用いて作成した。曲線の半数効果濃度（ＥＣ５０）及びＣＤ３－の最大パーセント値を各ＬＮＰごとに算出した。
実施例１．９．次世代シークエンシング（ＮＧＳ）及び編集効率の解析
ゲノム内の標的位置における編集効率を定量的に決定するため、シークエンシングを利用して、遺伝子編集により導入された挿入及び欠失の存在を特定した。目的の遺伝子（例えば、ＴＲＡＣ）内の標的部位に基づいてＰＣＲプライマーを設計し、目的のゲノム区域を増幅した。プライマー配列設計は、この分野で標準的であるように行った。
製造業者のプロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従って追加のＰＣＲを実施して、シークエンシングに化学作用を加えた。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ装置上でアンプリコンをシークエンシングした。品質スコアが低いリードを除去した後、リードを参照ゲノム（例えば、ｈｇ３８）に対しアラインメントした。リードを含む結果ファイルを参照ゲノムにマッピングし（ＢＡＭファイル）、目的の標的領域と重なるリードを選択し、野生型のリード数に対し挿入または欠失（「インデル」）を含むリード数を計算した。
実施例２：Ｔ細胞における化合物６組成物のスクリーニング
２．１ ＣＤ３陽性Ｔ細胞におけるＬＮＰのイオン化可能な脂質の特性評価
編集の有効性を評価するため、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをカプセル化する様々なモルパーセントの脂質構成要素を含むＬＮＰ組成物でＴ細胞を処置し、フローサイトメトリーにより、Ｔ細胞受容体表面タンパク質の喪失を評価した。
概してＬＮＰは、表１に示す脂質組成物（それぞれ、イオン化可能な化合物６／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧのモル比として表されている）を用いて、実施例１のように調製した。ＬＮＰは、Ｃａｓ９（配列番号４）をコードするｍＲＮＡ及びヒトＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ（配列番号１０）を送達した。ｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９ ｍＲＮＡのカーゴ重量比は１：２であった。
ＬＮＰ組成物のＺ平均粒子サイズ、数平均粒子サイズ、多分散性（ｐｄｉ）、総ＲＮＡ含量、及びＲＮＡのカプセル化効率を実施例１に記載のように解析した。結果を表２に示す。脂質解析は、表１に示されているように各構成要素の実測ｍｏｌ－％脂質レベルを示した。

Figure 2024515650000029
ＬＮＰ組成比がＣＤ３陽性（ＣＤ３＋）Ｔ細胞の編集効率に及ぼす効果を定量するために表２のＬＮＰを評価した。２例のドナーからのＴ細胞（ロット番号Ｗ０１０６及びＷ０１８６）を調製し、それぞれ活性化Ｔ細胞と非活性化Ｔ細胞について実施例１に記載のように形質移入した。形質移入から７日後、編集したＴ細胞を採取し、実施例１に記載のようにフローサイトメトリーによりフェノタイピングした。
０．０４μｇ／ｍＬ、０．０８μｇ／ｍＬ、０．１６μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬ、０．６３μｇ／ｍＬ、１．２５μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、及び５μｇ／ｍＬのＬＮＰ濃度で処置した後のＣＤ３陰性（ＣＤ３－）Ｔ細胞のパーセンテージを測定した。各ＬＮＰ用量におけるＣＤ３陰性Ｔ細胞の平均パーセント、ＣＤ３陰性最大パーセント、及びＥＣ５０を、活性化Ｔ細胞については表３及び図１Ａに、非活性化Ｔ細胞については表４及び図１Ｂに示す。近似値には「チルダ」を、解析ソフトにより定量できなかった値には「ＮＤ」を付している。

Figure 2024515650000030
Figure 2024515650000031
Figure 2024515650000032
Figure 2024515650000033
Figure 2024515650000034
Figure 2024515650000035
実施例３：Ｔ細胞における選択化合物６ ＬＮＰ組成物のスクリーニング
３．１ 編集したＣＤ３＋ Ｔ細胞における選択ＬＮＰ組成物の評価
ＬＮＰ編集の有効性を評価するため、化合物６を含み、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをカプセル化する様々なモルパーセントの脂質構成要素を含むＬＮＰ組成物でＴ細胞を処置し、フローサイトメトリーにより、Ｔ細胞受容体表面タンパク質の喪失を評価した。
概してＬＮＰは、表５に示す脂質組成物（それぞれ、イオン化可能な化合物６／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧのモル比として表されている）を用いて、実施例１に記載のように調製した。ＬＮＰは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（配列番号４）をコードするｍＲＮＡ及びヒトＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ（配列番号１０）を送達した。ｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９ ｍＲＮＡのカーゴ重量比は１：２であった。
ＬＮＰ組成物の平均粒子サイズ、多分散性（ｐｄｉ）、総ＲＮＡ含量、及びＲＮＡのカプセル化効率を実施例１に記載のように解析した。結果を表５に示す。脂質解析は、表１に示されているように実測ｍｏｌ－％脂質レベルを示した。
Figure 2024515650000036
２例のドナーのＴ細胞（ロット番号Ｗ０１０６及びＷ７９０）を調製し、実施例１に記載のように形質移入した。形質移入から６日後、編集した活性化Ｔ細胞及び非活性化Ｔ細胞を採取し、実施例１に記載のようにフローサイトメトリーによりフェノタイピングした。０．０４μｇ、０．０８μｇ、０．１６μｇ、０．３１μｇ、０．６３μｇ、１．２５μｇ、２．５μｇ、及び５μｇのＬＮＰ濃度で処置したＴ細胞について、ＣＤ３陰性Ｔ細胞のパーセンテージを測定した。各ＬＮＰ用量におけるＣＤ３陰性Ｔ細胞の平均パーセント、ＣＤ３最大パーセントの計算値、及びＥＣ５０を、活性化Ｔ細胞については表６及び図２Ａに、非活性化Ｔ細胞については表７及び図２Ｂに示す。

Figure 2024515650000037
Figure 2024515650000038
Figure 2024515650000039
Figure 2024515650000040
Figure 2024515650000041
Figure 2024515650000042
実施例４．Ｔ細胞における化合物６組成物のスクリーニング
４．１ ＣＤ３陽性Ｔ細胞におけるＬＮＰのイオン化可能な脂質の特性評価
ＬＮＰ編集の有効性を評価するため、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをカプセル化する代替的モル比の脂質構成要素を含むＬＮＰ組成物でＴ細胞を処置し、フローサイトメトリーにより、Ｔ細胞受容体表面タンパク質の喪失を評価した。
概してＬＮＰは、表８に示す脂質組成物（それぞれ、イオン化可能な化合物６／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧのモル比として表されている）を用いて、実施例１のように調製した。ＬＮＰは、Ｃａｓ９（配列番号４）をコードするｍＲＮＡ及びヒトＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ（配列番号１０）を送達した。ｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９ ｍＲＮＡのカーゴ重量比は１：２または１：１であった。比較組成物２１のカーゴ比は１：２、残りのＬＮＰのカーゴ比は１：１であった。
ＬＮＰ組成物の平均粒子サイズ、多分散性（ｐｄｉ）、総ＲＮＡ含量、及びＲＮＡのカプセル化効率を実施例１に記載のように解析した。結果を表８に示す。脂質解析は、表１に示されているように実測ｍｏｌ－％脂質レベルを示した。

Figure 2024515650000043
１例のドナー（Ｗ０１０６）からのＴ細胞を調製し、活性化し、実施例１に記載のように形質移入した。形質移入から７日後、編集した活性化Ｔ細胞及び非活性化Ｔ細胞を採取し、実施例１に記載のようにフローサイトメトリーによりフェノタイピングした。
０．０４μｇ、０．０８μｇ、０．１６μｇ、０．２５μｇ、０．６３μｇ、１．２５μｇ、２．５μｇ、及び５μｇのＬＮＰ濃度で処置した後のＣＤ３陰性Ｔ細胞のパーセンテージを測定した。各ＬＮＰ用量におけるＣＤ３陰性Ｔ細胞の平均パーセント、ＣＤ３の最大パーセント値、及びＥＣ５０を表９及び１０に示す。
Figure 2024515650000044
Figure 2024515650000045
Figure 2024515650000046
Figure 2024515650000047
Figure 2024515650000048
Figure 2024515650000049
Figure 2024515650000050
Figure 2024515650000051
Figure 2024515650000052
Figure 2024515650000053
Figure 2024515650000054
Figure 2024515650000055
Figure 2024515650000056
表９及び表１０に見られるように、イオン化可能な脂質の量が少なく、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ脂質の量が多いＬＮＰほど、比較組成物に比べて驚くほど好ましいＥＣ５０値を有した。
実施例５：Ｔ細胞におけるイオン化可能な脂質のスクリーニング
５．１ 様々なイオン化可能な脂質を含むＬＮＰ組成物の特性評価
ＬＮＰ中の他のイオン化可能な脂質が編集に及ぼす影響を評価するため、３つのイオン化可能な脂質のうちの１つを２つの異なる構成要素比で製剤化したＬＮＰ組成物でＴ細胞を処置した。概してＬＮＰは、表１１に示す脂質組成物（それぞれ、イオン化可能な脂質化合物／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧのモル比として表されている）を用いて、実施例１に記載のように調製した。化合物６、化合物８、及び化合物１１の各々を、以下の名目ｍｏｌ％比：３５％のイオン化可能な脂質、１５％のＤＳＰＣ、４７．５％のコレステロール、及び２．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧの脂質構成要素を有するＬＮＰ中で、及び以下の名目ｍｏｌ％比：５０％のイオン化可能な脂質、１０％のＤＳＰＣ、３８．５％のコレステロール、及び１．５％のＰＥＧ－２ｋ－ＤＭＧの脂質構成要素を有する比較ＬＮＰ中で製剤化した。ＬＮＰはＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをカプセル化した。フローサイトメトリーにより、Ｔ細胞受容体表面タンパク質の喪失について編集を評価した。
ＬＮＰは、Ｃａｓ９（配列番号５）をコードするｍＲＮＡ及びヒトＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ（配列番号１０）を送達した。試験したＬＮＰにおけるｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９ ｍＲＮＡのカーゴ重量比は１：１であった。
ＬＮＰ組成物の平均粒子サイズ、多分散性（ｐｄｉ）、総ＲＮＡ含量、及びＲＮＡのカプセル化効率を実施例１に記載のように解析した。結果を表１１に示す。脂質解析は、表１に示されているように実測ｍｏｌ－％脂質レベルを示した。

Figure 2024515650000057
単一ドナー（Ｗ０１０６）からのＴ細胞を、非活性化Ｔ細胞を形質移入の前に４８時間静置した以外は、実施例１に記載のように一般的に調製し、活性化し、形質移入した。形質移入から７日後、編集した活性化Ｔ細胞を採取し、実施例１に記載のようにフローサイトメトリーによりフェノタイピングした。
０．０４μｇ、０．０８μｇ、０．１６μｇ、０．２５μｇ、０．６３μｇ、１．２５μｇ、２．５μｇ、及び５μｇのＬＮＰ濃度で処置した後のＣＤ３陰性Ｔ細胞のパーセンテージを測定した。各ＬＮＰ用量におけるＣＤ３陰性Ｔ細胞の平均パーセント、ＣＤ３の最大パーセント値、及びＥＣ５０を、活性化Ｔ細胞については表１２及び図３Ａに、非活性化Ｔ細胞については表１３及び図３Ｂに示す。

Figure 2024515650000058
Figure 2024515650000059
Figure 2024515650000060
Figure 2024515650000061
実施例６：選択したＬＮＰ組成物のカーゴ比評価
カーゴ比がＬＮＰ編集効果に及ぼす効果を評価するため、ＣＤ３陽性Ｔ細胞を、様々な比率のＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを含むＬＮＰ組成物で処置した。フローサイトメトリーにより、編集をＴ細胞受容体表面タンパク質の喪失について評価した。
６．１ 活性化Ｔ細胞におけるカーゴ比評価
カーゴ比の変化が表１４に記載の選択ＬＮＰの編集効率に及ぼす効果を活性化ＣＤ３陽性Ｔ細胞において試験した。概してＬＮＰは、表１４に示す脂質組成物（それぞれ、イオン化可能な化合物６／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧのモル比として表されている）を用いて、実施例１に記載のように調製した。ＬＮＰは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（配列番号５）をコードするｍＲＮＡ及びＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ（配列番号１０）を送達した。フローサイトメトリーにより、編集をＴ細胞受容体表面タンパク質の喪失について評価した。ｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９ ｍＲＮＡのカーゴ重量比は、１：１、１：２、２：１、または４：１であった。
ＬＮＰ組成物の平均粒子サイズ、多分散性（ｐｄｉ）、総ＲＮＡ含量、及びＲＮＡのカプセル化効率を実施例１に記載のように解析した。結果を表１４に示す。脂質解析は、表１に示されているように実測ｍｏｌ－％脂質レベルを示した。
Figure 2024515650000062
Ｔ細胞を単一のドナー（ロット番号Ｗ０１０６）から収集し、調製し、実施例１に記載のように形質移入した。形質移入から７日後、実施例１に記載のように、フローサイトメトリー解析によりＴ細胞をフェノタイピングした。０．０４μｇ、０．０８μｇ、０．１６μｇ、０．２５μｇ、０．６３μｇ、１．２５μｇ、２．５μｇ、及び５μｇのＬＮＰ濃度で処置した後にＣＤ３陰性Ｔ細胞のパーセンテージを測定した。各ＬＮＰ用量におけるＣＤ３陰性Ｔ細胞の平均パーセント、ＣＤ３の最大パーセント値、及びＥＣ５０を表１５及び図４Ａに示す。

Figure 2024515650000063
Figure 2024515650000064
６．２ 非活性化Ｔ細胞における荷電比評価
カーゴ比の変化が実施例６．１に記載の選択ＬＮＰのＬＮＰ編集効率に及ぼす効果を非活性化ＣＤ３陽性Ｔ細胞において試験した。実施例６．１に記載の選択されたＬＮＰ組成物を本試験で使用した。
２例のドナーのＴ細胞（ロット番号Ｗ１０６、Ｗ７９０）を調製し、実施例１に記載のように形質移入した。形質移入から７日後、編集した非活性化Ｔ細胞を、実施例１に記載のように、フローサイトメトリー解析によりフェノタイピングした。
ＣＤ３陰性Ｔ細胞のパーセンテージを０．０４μｇ、０．０８μｇ、０．１６μｇ、０．２５μｇ、０．６３μｇ、１．２５μｇ、２．５μｇ、５μｇのＬＮＰ濃度で測定した。各ＬＮＰ用量におけるＣＤ３陰性Ｔ細胞の平均パーセント、ＣＤ３の最大パーセント値、及びＥＣ５０を表１６及び１７ならびに図４Ｂに示す。

Figure 2024515650000065
Figure 2024515650000066
Figure 2024515650000067
Figure 2024515650000068
実施例７：血清培地条件下で評価するＬＮＰ組成物活性
ＬＮＰの編集効果を評価するため、ＬＮＰ組成物をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験して、代替培地条件がＣＤ３陽性Ｔ細胞における挿入効率に及ぼす効果を評価した。Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びＴＲＡＣ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをカプセル化する様々なモル比の脂質構成要素を含むＬＮＰ組成物でＴ細胞を処置した。ＡＡＶ６ウイルスコンストラクトは、ＴＲＡＣ座位に部位特異的に組み込むための相同性アームに隣接するＧＦＰレポーターをコードする相同組換え修復鋳型（ＨＤＲＴ）を送達した。フローサイトメトリーにより、ＴＲＡＣ遺伝子破壊をＴ細胞受容体表面タンパク質の喪失について評価した。挿入をフローサイトメトリーによりＧＦＰ発光について評価した。
概してＬＮＰは、表１８に示す脂質組成物（それぞれ、イオン化可能な化合物６／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧのモル比として表されている）を用いて、実施例１のように調製した。ＬＮＰは、Ｃａｓ９（配列番号４）をコードするｍＲＮＡ及びヒトＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ（配列番号１０）を送達した。ｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９ ｍＲＮＡのカーゴ重量比は１：２であった。
ＬＮＰ組成物の平均粒子サイズ、多分散性（ｐｄｉ）、総ＲＮＡ含量、及びＲＮＡのカプセル化効率を実施例１に記載のように解析した。結果を表１８に示す。脂質解析は、表１に示されているように実測ｍｏｌ－％脂質レベルを示した。
Figure 2024515650000069
単一ドナー由来のＴ細胞（ロット番号Ｗ０１０６）を、以下の培地修飾を伴って実施例１に記載のように調製した。２．５％ヒトＡＢ血清（ＨＡＢＳ）、２．５％のＣＴＳ免疫細胞ＳＲ（Ｇｉｂｃｏ；カタログ番号Ａ２５９６１－０１）血清代替物（ＳＲ）、５％血清代替物（ＳＲ）、または２．５％ヒトＡＢ血清と２．５％血清代替物との組合せのいずれかを補充した培地でＴ細胞をプレーティングした。Ｔ細胞を、実施例１．５に記載のように解凍後２４時間活性化した。活性化から２日後、実施例１．６に記載のようにＴ細胞のＬＮＰによる形質移入を、０．３１μｇ／ｍｌ、０．６３μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ、及び２．５μｇ／ｍｌのＬＮＰ濃度で行った。ＴＲＡＣ座位への部位特異的組込みのための相同性アームに隣接するＧＦＰレポーター（Ｖｉｇｅｎｅ；配列番号７）をコードする相同組換え修復鋳型（ＨＤＲＴ）をコードするＡＡＶ６を、３×１０ｅ５ウイルス粒子／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）で各ウェルに加えた。ＤＮＡ依存性プロテインキナーゼの低分子阻害剤を０．２５ｕＭで加えた。以下で「ＤＮＡＰＫＩ化合物４」と称する阻害剤は、９－（４，４－ジフルオロシクロヘキシル）－７－メチル－２－（（７－メチル－［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）アミノ）－７，９－ジヒドロ－８Ｈ－プリン－８－オンであり、また下記のように示される。
Figure 2024515650000070
ＤＮＡＰＫＩ化合物４を以下のように調製した。
一般的情報
全ての試薬及び溶媒は、商用ベンダーから購入しそのまま使用するか、または引用の手順に従って合成した。全ての中間体及び最終化合物は、シリカゲルによるフラッシュカラムクロマトグラフィーを用いて精製した。ＮＭＲスペクトルはＢｒｕｋｅｒまたはＶａｒｉａｎ ４００ＭＨｚ分光計で記録し、ＮＭＲデータはＣＤＣｌ３中周囲温度で収集した。化学シフトはＣＤＣｌ３（７．２６）に対しｐｐｍ単位で報告する。１Ｈ ＮＭＲのデータは以下のように報告する：化学シフト、多重度（ｂｒ＝幅広、ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｑ＝四重線、ｄｄ＝二重線の二重線、ｄｔ＝三重線の二重線、ｍ＝多重線）、結合定数、及び積分。ＭＳデータは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源を備えたＷａｔｅｒｓ ＳＱＤ２質量分析計で記録した。最終化合物の純度は、ＵＰＬＣ－ＭＳ－ＥＬＳにより、フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器及び蒸発光散乱（ＥＬＳ）検出器を備えたＳＱＤ２質量分析計を装備したＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ Ｈ－Ｃｌａｓｓ液体クロマトグラフィー装置を用いて定量した。
中間体１ａ：（Ｅ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ’－（４－メチル－５－ニトロピリジン－２－イル）ホルムイミダミド
Figure 2024515650000071
 ４－メチル－５－ニトロ－ピリジン－２－アミン（５ｇ、１．０当量）のトルエン（０．３Ｍ）中溶液に、ＤＭＦ－ＤＭＡ（３．０当量）を加えた。混合物を１１０℃で２時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して残渣を得、カラムクロマトグラフィーにより精製して生成物を黄色の固体として得た（５９％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ８．８２ （ｓ， １Ｈ）， ８．６３ （ｓ， １Ｈ）， ６．７４ （ｓ， １Ｈ）， ３．２１ （ｍ， ６Ｈ）．
中間体１ｂ：（Ｅ）－Ｎ－ヒドロキシ－Ｎ’－（４－メチル－５－ニトロピリジン－２－イル）ホルムイミダミド
Figure 2024515650000072
 中間体１ａ（４ｇ、１．０当量）のＭｅＯＨ（０．２Ｍ）中溶液に、ＮＨ２ＯＨ－ＨＣｌ（２．０当量）を加えた。反応混合物を８０℃で１時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をＨ２Ｏ及びＥｔＯＡｃに分割し、続いてＥｔＯＡｃで２回抽出した。有機相を減圧下で濃縮して残渣を得、カラムクロマトグラフィーにより精製して生成物を白色の固体として得た（６６％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ １０．５２ （ｄ， Ｊ ＝ ３．８ Ｈｚ， １Ｈ）， １０．０８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ９．９， ３．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．８４ （ｄ， Ｊ ＝ ３．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．８５ （ｄｄ， Ｊ ＝ ９．７， ３．８ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．０１ （ｄ， Ｊ ＝ ３．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．３６ （ｓ， ３ Ｈ）．
中間体１ｃ：７－メチル－６－ニトロ－［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン
Figure 2024515650000073
 中間体１ｂ（２．５ｇ、１．０当量）のＴＨＦ（０．４Ｍ）中溶液に、トリフルオロ酢酸無水物（１．０当量）を０℃で加えた。混合物を２５℃で１８時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製して、生成物を白色の固体として得た（４４％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ９．５３ （ｓ， １Ｈ）， ８．４９ （ｓ， １Ｈ）， ７．６９ （ｓ， １Ｈ）， ２．７８ （ｄ， Ｊ ＝ １．０ Ｈｚ， ３Ｈ）．
中間体１ｄ：７－メチル－［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－アミン
Figure 2024515650000074
 Ｐｄ／Ｃ（１０％ｗ／ｗ、０．２当量）のＥｔＯＨ（０．１Ｍ）中混合物に、中間体１ｃ（１．０当量）及びギ酸アンモニウム（５．０当量）を加えた。混合物を１０５℃で２時間加熱した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製して、生成物を淡褐色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ８．４１ （ｓ， ２Ｈ）， ８．０７ （ｄ， Ｊ ＝ ９．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ７．４３ （ｓ， １Ｈ）， ２．２２ （ｓ， ３Ｈ）．
中間体１ｅ：８－メチレン－１，４－ジオキサスピロ［４．５］デカン
Figure 2024515650000075
 メチル（トリフェニル）ホスホニウムブロミド（１．１５当量）のＴＨＦ（０．６Ｍ）中溶液に、ｎ－ＢｕＬｉ（１．１当量）を－７８℃で滴加し、混合物を０℃で１時間撹拌した。次いで１，４－ジオキサスピロ［４．５］デカン－８－オン（５０ｇ、１．０当量）を反応混合物に加えた。混合物を２５℃で１２時間撹拌した。反応混合物を水性ＮＨ４Ｃｌに０℃で注ぎ、Ｈ２Ｏで希釈し、ＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層を減圧下で濃縮して残渣を得、カラムクロマトグラフィーにより精製して、生成物を無色の油として得た（５１％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ４．６７ （ｓ， １Ｈ）， ３．９６ （ｓ， ４ Ｈ）， ２．８２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ４ Ｈ）， １．７０ （ｔ， Ｊ ＝ ６．４ Ｈｚ， ４ Ｈ）．
中間体１ｆ：７，１０－ジオキサジスピロ［２．２．４６．２３］ドデカン
Figure 2024515650000076
 中間体４ａ（５ｇ、１．０当量）のトルエン（３Ｍ）中溶液にＺｎＥｔ２（２．５７当量）を－４０℃で滴加し、混合物を－４０℃で１時間撹拌した。次いでジヨードメタン（６．０当量）を混合物にＮ２下で、－４０℃で滴加した。次いで混合物をＮ２雰囲気下で、２０℃で１７時間撹拌した。反応混合物を水性ＮＨ４Ｃｌに０℃で注ぎ、ＥｔＯＡｃで２回抽出した。合わせた有機相をブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濾液を真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製して、生成物を淡黄色の油として得た（７３％）。
中間体１ｇ：スピロ［２．５］オクタン－６－オン

Figure 2024515650000077
 中間体４ｂ（４ｇ、１．０当量）の１：１ ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（１．０Ｍ）中溶液に、ＴＦＡ（３．０当量）を加えた。混合物をＮ２雰囲気下で、２０℃で２時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮してＴＨＦを除去し、２ＭのＮａＯＨ（水性）で残渣のｐＨを７に調整した。混合物を水に注ぎ、ＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濾液を真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製して、生成物を淡黄色の油として得た（６８％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ２．３５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ４Ｈ）， １．６２ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６ Ｈｚ， ４Ｈ）， ０．４２ （ｓ， ４Ｈ）．
中間体１ｈ：Ｎ－（４－メトキシベンジル）スピロ［２．５］オクタン－６－アミン
Figure 2024515650000078
 中間体４ｃ（２ｇ、１．０当量）及び（４－メトキシフェニル）メタンアミン（１．１当量）のＤＣＭ（０．３Ｍ）中混合物にＡｃＯＨ（１．３当量）を加えた。混合物をＮ２雰囲気下で、２０℃で１時間撹拌した。次いでＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（３．３当量）を混合物に０℃で加え、混合物をＮ２雰囲気下で、２０℃で１７時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮してＤＣＭを除去し、得られた残渣をＨ２Ｏで希釈し、ＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濾液を減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製して、生成物を灰色の固体として得た（５１％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ７．１５ － ７．０７ （ｍ， ２Ｈ）， ６．７７ － ６．６８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．５８ （ｓ， ３Ｈ）， ３．５４ （ｓ， ２Ｈ）， ２．３０ （ｄｄｔ， Ｊ ＝ １０．１， ７．３， ３．７ Ｈｚ， １Ｈ）， １．６９ － １．６２ （ｍ， ２Ｈ）， １．３７ （ｔｄ， Ｊ ＝ １２．６， ３．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．１２ － １．０２ （ｍ， ２Ｈ）， ０．８７ － ０．７８ （ｍ， ２Ｈ）， ０．１３ － ０．０４ （ｍ， ２Ｈ）．
中間体１ｉ：スピロ［２．５］オクタン－６－アミン
Figure 2024515650000079
 Ｐｄ／Ｃ（１０％ｗ／ｗ、１．０当量）のＭｅＯＨ（０．２５Ｍ）中懸濁液に中間体４ｄ（２ｇ、１．０当量）を加え、混合物をＨ２雰囲気下で、８０℃、５０Ｐｓｉで２４時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して残渣を得、これをカラムクロマトグラフィーにより精製して、生成物を白色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ２．６１ （ｔｔ， Ｊ ＝ １０．８， ３．９ Ｈｚ， １Ｈ）， １．６３ （ｄｄｄ， Ｊ ＝ ９．６， ５．１， ２．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．４７ （ｔｄ， Ｊ ＝ １２．８， ３．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．２１ － １．０６ （ｍ， ２Ｈ）， ０．８２ － ０．７２ （ｍ， ２Ｈ）， ０．１４ － ０．０５ （ｍ， ２Ｈ）．
中間体１ｊ：エチル２－クロロ－４－（スピロ［２．５］オクタン－６－イルアミノ）ピリミジン－５－カルボキシレート
Figure 2024515650000080
 エチル２，４－ジクロロピリミジン－５－カルボキシレート（２．７ｇ、１．０当量）及び中間体１ｉ（１．０当量）のＡＣＮ（０．５～０．６Ｍ）中混合物に、Ｋ２ＣＯ３（２．５当量）をＮ２下で一度に加えた。混合物を２０℃で１２時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製して、生成物を白色の固体として得た（５４％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ８．６４ （ｓ， １Ｈ）， ８．４１ （ｄ， Ｊ ＝ ７．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．３３ （ｑ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， ４．０８ （ｄ， Ｊ ＝ ９．８ Ｈｚ， １Ｈ）， １．９０ （ｄｄ， Ｊ ＝ １２．７， ４．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６４ （ｔ， Ｊ ＝ １２．３ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．５２ （ｑ， Ｊ ＝ １０．７， ９．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．３３ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ３Ｈ）， １．１２ （ｄ， Ｊ ＝ １３．０ Ｈｚ， ２Ｈ）， ０．４０ － ０．２１ （ｍ， ４Ｈ）．
中間体１ｋ：２－クロロ－４－（スピロ［２．５］オクタン－６－イルアミノ）ピリミジン－５－カルボン酸
Figure 2024515650000081
 中間体１ｊ（２ｇ、１．０当量）の１：１ ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（０．３Ｍ）中溶液にＬｉＯＨ（２．０当量）を加えた。混合物を２０℃で１２時間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して残渣を得た。残渣を２Ｍ塩酸でｐＨ２に調整し、沈殿物を濾過により収集し、水で洗浄し、真空下で試みた。生成物をさらに精製せずに次のステップに直接使用した（８２％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ １３．５４ （ｓ， １Ｈ）， ８．３８ （ｄ， Ｊ ＝ ８．０ Ｈｚ， １Ｈ）， ８．３５ （ｓ， １Ｈ）， ３．８２ （ｑｔ， Ｊ ＝ ８．２， ３．７ Ｈｚ， １Ｈ）， １．６６ （ｄｑ， Ｊ ＝ １２．８， ４．１ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．４７ － １．３４ （ｍ， ２Ｈ）， １．３３ － １．２０ （ｍ， ２Ｈ）， ０．８６ （ｄｔ， Ｊ ＝ １３．６， ４．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ０．０８ （ｄｄ， Ｊ ＝ ８．３， ４．８ Ｈｚ， ４Ｈ）．
中間体１ｌ：２－クロロ－９－（スピロ［２．５］オクタン－６－イル）－７，９－ジヒドロ－８Ｈ－プリン－８－オン
Figure 2024515650000082
 中間体１ｋ（１．５ｇ、１．０当量）及びＥｔ３Ｎ（１．０当量）のＤＭＦ（０．３Ｍ）中混合物にＤＰＰＡ（１．０当量）を加えた。混合物をＮ２雰囲気下で、１２０℃で８時間撹拌した。反応混合物を水に注いだ。沈殿物を濾過により収集し、水で洗浄し、真空下で乾燥させて残渣を得、これをさらに精製せずに次のステップに直接使用した（６７％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ １１．６８ （ｓ， １Ｈ）， ８．１８ （ｓ， １Ｈ）， ４．２６ （ｄｄｔ， Ｊ ＝ １２．３， ７．５， ３．７ Ｈｚ， １Ｈ）， ２．４２ （ｑｄ， Ｊ ＝ １２．６， ３．７ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．９５ （ｔｄ， Ｊ ＝ １３．３， ３．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．８２ － １．６９ （ｍ， ２Ｈ）， １．０８ － ０．９５ （ｍ， ２Ｈ）， ０．３９ （ｔｄｑ， Ｊ ＝ １１．６， ８．７， ４．２， ３．５ Ｈｚ， ４Ｈ）．
中間体１ｍ：２－クロロ－７－メチル－９－（スピロ［２．５］オクタン－６－イル）－７，９－ジヒドロ－８Ｈ－プリン－８－オン
Figure 2024515650000083
 中間体１ｌ（１．０ｇ、１．０当量）及びＮａＯＨ（５．０当量）の１：１ ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（０．３～０．５Ｍ）中混合物にＭｅＩ（２．０当量）を加えた。混合物をＮ２雰囲気下で、２０℃で１２時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮して残渣を得、これをカラムクロマトグラフィーにより精製して、生成物を淡黄色の固体として得た（６７％）。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ ７．５７ （ｓ， １Ｈ）， ４．０３ （ｔｔ， Ｊ ＝ １２．５， ３．９ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．０３ （ｓ， ３Ｈ）， ２．１７ （ｑｄ， Ｊ ＝ １２．６， ３．８ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．６０ （ｔｄ， Ｊ ＝ １３．４， ３．６ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．４７ － １．３４ （ｍ， ２Ｈ）， １．０７ （ｓ， １Ｈ）， ０．６３ （ｄｐ， Ｊ ＝ １４．０， ２．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， －０．０５ （ｓ， ４Ｈ）．
ＤＮＡＰＫＩ化合物４：７－メチル－２－（（７－メチル－［１，２，４］トリアゾロ［１，５－ａ］ピリジン－６－イル）アミノ）－９－（スピロ［２．５］オクタン－６－イル）－７，９－ジヒドロ－８Ｈ－プリン－８－オン
Figure 2024515650000084
 中間体１ｍ（１．０当量）及び中間体１ｄ（１．０当量）の混合物に、ＤＭＦ（０．２～０．３Ｍ）中のＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（０．２当量）、ＸａｎｔＰｈｏｓ（０．４当量）、及びＣｓ２ＣＯ３（２．０当量）を脱気し、Ｎ２で３回パージし、混合物をＮ２雰囲気下で、１３０℃で１２時間撹拌した。次いで混合物を水に注ぎ、ＤＣＭで３回抽出した。合わせた有機相をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、濾液を真空中で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーにより精製して、生成物をオフホワイト色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， （ＣＤ３）２ＳＯ） δ ９．０９ （ｓ， １Ｈ）， ８．７３ （ｓ， １Ｈ）， ８．４４ （ｓ， １Ｈ）， ８．１６ （ｓ， １Ｈ）， ７．７８ （ｓ， １Ｈ）， ４．２１ （ｔ， Ｊ ＝ １２．５ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．３６ （ｓ， ３Ｈ）， ２．４３ （ｓ， ３Ｈ）， ２．３４ （ｄｔ， Ｊ ＝ １３．０， ６．５ Ｈｚ， ２Ｈ）， １．９３ － １．７７ （ｍ， ２Ｈ）， １．７７ － １．６２ （ｍ， ２Ｈ）， ０．９１ （ｄ， Ｊ ＝ １３．２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ０．３１ （ｔ， Ｊ ＝ ７．１ Ｈｚ， ２Ｈ）． ＭＳ： ４０５．５ ｍ／ｚ ［Ｍ＋Ｈ］．
形質移入から５日後、ＬＮＰ組成物の挿入効率を評価するため、実施例１に記載のようにフローサイトメトリー解析によりＴ細胞をフェノタイピングした。表１９はＣＤ３陰性細胞のパーセントを示している。ＴＲＡＣによりコードされるＴ細胞受容体アルファ鎖は、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３複合体のアセンブリー及び細胞表面への転座に必要である。したがって、ゲノム編集によってＴＲＡＣ遺伝子を破壊すると、Ｔ細胞の細胞表面上のＣＤ３タンパク質の喪失につながる。各培地条件におけるＧＦＰ陽性Ｔ細胞の平均パーセンテージを表２０及び図５に示す。ＧＦＰタンパク質を発現する細胞は、ゲノムへの挿入の成功を示している。
Figure 2024515650000085
Figure 2024515650000086
実施例８：様々なｓｇＲＮＡを有するＬＮＰ組成物の評価
複数の標的における編集有効性を評価するため、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びＴＲＡＣ（配列番号１０）、ＴＲＢＣ（配列番号１１）、ＨＬＡ－Ａ（配列番号１３）、またはＣＩＩＴＡ（配列番号１２）遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをカプセル化する様々なモル比の脂質構成要素を含むＬＮＰ組成物でＴ細胞を処置した。ＴＲＡＣまたはＴＲＢＣの編集を、編集後のＣＤ３陰性細胞のパーセンテージの増加によってアッセイした。それぞれＴＲＡＣまたはＴＲＢＣによってコードされるＴ細胞受容体アルファ鎖及びＴ細胞受容体ベータ鎖は、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３複合体の集合及び細胞表面への転座に必要である。したがって、ゲノム編集によってＴＲＡＣまたはＴＲＢＣいずれかの遺伝子を破壊すると、Ｔ細胞の細胞表面上のＣＤ３タンパク質の喪失につながる。ＣＩＩＴＡはＨＬＡ－クラスＩＩ遺伝子の発現に直接関与する転写因子であるため、ＣＩＩＴＡを破壊すると細胞表面のＨＬＡ－ＤＲ ＤＰ ＤＱアレルの喪失につながる。
３例のドナー（Ｗ０６６２、１１００４６９６７、１１００４４５９１）からの健康ヒトドナーの白血球を市販品で入手した（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞単離キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；カタログ番号１７９５１）を用いたネガティブセレクション、またはＳｔｒａｉｇｈｔＦｒｏｍ（登録商標）Ｌｅｕｋｏｐａｋ（登録商標）ＣＤ４／ＣＤ８マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙ；カタログ番号１３０－１２２－３５２）を用いたＣＤ４／ＣＤ８ポジティブセレクションにより、Ｔ細胞を、製造業者の指示に従ってＭｕｌｔｉＭＡＣＳＴＭ Ｃｅｌｌ２４ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｐｌｕｓ装置上で単離した。Ｔ細胞は、将来の使用のためにＣｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０凍結培地（カタログ番号０７９３０）中で凍結保存した。
解凍したら、ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ基本培地（Ｇｉｂｃｏ；Ａ３７０５００１）に１×ＧｌｕｔａＭＡＸ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー（１０ｍＭ）、及び１％ｐｅｎ－ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ；１５１４０－１２２）を補充し、さらに２００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；２００－０２）、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；２００－０７）、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；２００－１５）、及び２．５％ヒト血清（Ｇｅｍｉｎｉ；１００－５１２）を補充したものから構成される完全Ｔ細胞増殖培地中でＴ細胞を培養した。一晩静置した後、１０＾６／ｍＬの密度のＴ細胞をＴ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔ試薬（１：１００希釈、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で活性化し、以下の方法を用いてＬＮＰで処置した。
Ｔ細胞は、表２１に示されている、イオン化可能な化合物６／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧのモル比として表される脂質組成物を用いて、実施例１に記載のように調製したＬＮＰで形質移入した。ＬＮＰは、示される通りにＣａｓ９（配列番号４）をコードするｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡを送達した。ｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９ ｍＲＮＡのカーゴ重量比は、５０／１０／３５．５／１．５（化合物６／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ）ＬＮＰ組成物においては１：２、３５／１５／４７．５／２．５（化合物６／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ）組成物においては１：１であった。Ｎ：Ｐ比は、別の指示がない限り約６であった。
活性化Ｔ細胞を、先に実施例１に記載のように製剤化したＬＮＰで形質移入した。ＬＮＰ形質移入は、表２６の各組成物について記載されているように、活性化後の順序及びタイミングで行った。ＣＩＩＴＡを標的とするｓｇＲＮＡ（配列番号１２）を含むＴ細胞を活性化直後にＬＮＰで処置し、ＨＬＡ－Ａを標的とするｓｇＲＮＡ（配列番号１３）を含むＴ細胞を活性化から２４時間後に処置し、ＴＲＡＣを標的とするｓｇＲＮＡ（配列番号１０）を含むＴ細胞を活性化から４８時間後に処置し、ＴＲＢＣを標的とするｓｇＲＮＡ（配列番号１１）を含むＴ細胞を活性化から７２時間後に処置した。ＬＮＰ処置した細胞を、使用するまで３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートした。
各ＬＮＰ処置について、Ｔ細胞を９６ウェルプレートで１００μＬの体積でプレーティングした。表２１に示されているＬＮＰの８ポイント２倍段階希釈を、最高ＬＮＰ最終用量としての５μｇ／ｍＬから開始し、先に実施例１に記載のように、ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ基本培地から構成されたＡｐｏＥ完全Ｔ細胞増殖培地を用いて実施した。続いて１００μＬのＬＮＰ－ＡｐｏＥ混合物を、ウェルにプレーティングした細胞に加え、その結果、２００μＬの最終体積において０．５×１０＾６／ｍＬの最終密度、及び５μｇ／ｍＬの最終ＡｐｏＥ濃度となった。細胞を３７℃、５％のＣＯ２で２４時間培養し、次いで新鮮培地上で１：４に分割した。
インキュベート後、ＬＮＰで処置したＴ細胞を採取し、オンターゲット編集を解析した。プレートを３７℃、５％のＣＯ２で１１日目までインキュベートし、次いでフローサイトメトリー解析のために採取した。
フローサイトメトリー解析
フローサイトメトリーにより細胞表面タンパク質をアッセイするため、ＣＤ４を標的とする抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号３００５３８）及びＣＤ８ａを標的とする抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号３０１０４９）を、ＣＤ３を標的とする抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号３００４４１）またはＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱを標的とする抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号３６１７１２）またはＨＬＡ－Ａ＊０２を標的とする抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号３４３３２０）と混合したものとともに、Ｔ細胞をインキュベートした。続いてＴ細胞をＣｙｔｏｆｌｅｘ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で処理した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージ（ｖ．１０．６．１またはｖ．１０．７．１）を用いてデータ解析を実施した。簡潔に説明すると、Ｔ細胞をリンパ球でゲーティングし、続いて単一細胞でゲーティングした。これらの単一細胞をＣＤ４＋／ＣＤ８＋状態でゲーティングし、そこからＣＤ８＋／ＣＤ３－、ＣＤ８＋／ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ－、またはＣＤ８＋／ＨＬＡ－Ａ＊０２－細胞を定量化した。
ＣＤ８＋／ＣＤ３－、ＣＤ８＋／ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＰ、ＤＱ－、ＣＤ８＋／ＨＬＡ－Ａ２－細胞のパーセントを定量化して、編集した標的座位がＴＣＲノックアウトをもたらした細胞集団のパーセンテージを求めた。線形回帰モデルを使用して、ＴＣＲ ＫＯの用量応答曲線をＰｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄ（ｖ．９．０）を用いて作成した。曲線の半数効果濃度（ＥＣ５０）及びＣＤ３－の最大パーセント値を各ＬＮＰごとに算出した。
ＬＮＰ組成物のＺ平均及び数平均粒子サイズ、多分散性（ｐｄｉ）、総ＲＮＡ含量、ならびにＲＮＡのカプセル化効率を実施例１に記載のように解析した。結果を表２１に示す。

Figure 2024515650000087
０．０４μｇ／ｍＬ、０．０８μｇ／ｍＬ、０．１６μｇ／ｍＬ、０．３１μｇ／ｍＬ、０．６３μｇ／ｍＬ、１．２５μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、及び５μｇ／ｍＬのＬＮＰ濃度で処置した後のＣＤ３陰性Ｔ細胞のパーセンテージを測定した。アッセイを三重反復で実施した。各ＬＮＰ用量におけるＣＤ３陰性Ｔ細胞の平均パーセント、ＣＤ３値の標準偏差、及びＥＣ５０を表２２～２５及び図６Ａ～６Ｄに示す。

Figure 2024515650000088
Figure 2024515650000089
Figure 2024515650000090
Figure 2024515650000091
実施例９：複数の遺伝子破壊及び挿入のための複数のＬＮＰ組成物の順次送達
Ｔ細胞を一連の遺伝子破壊及び挿入により操作した。健康ドナー細胞を４つのＬＮＰ組成物で順次処置し、各ＬＮＰ組成物を、Ｃａｓ９（配列番号４）をコードするｍＲＮＡ、及びＴＲＡＣ（配列番号１０）、ＴＲＢＣ（配列番号１１）、ＣＩＩＴＡ（配列番号１２）、またはＨＬＡ－Ａ（配列番号１３）のいずれかを標的とするｓｇＲＮＡとともに共製剤化した。ＬＮＰを、表２６に示されている群に従って、化合物６、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを３５：１５：４７．５：２．５のモル比で（第１群及び第２群）、または化合物６、ＤＳＰＣ、コレステロール 、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを５０：１０：３８．５：１．５のモル比で（第３群）、それぞれ指示用量で製剤化した。
第１群及び第２群はＬＮＰ濃度が異なる。脂質核酸集合体を、脂質アミン：ＲＮＡリン酸（Ｎ：Ｐ）のモル比を約６で、ｇＲＮＡ：ｍＲＮＡの重量比を１：２で製剤化した。ＡＡＶを用いて相同組換え修復鋳型を送達することにより、トランスジェニックＷＴ１標的化ＴＣＲ（配列番号１４）を部位特異的にＴＲＡＣ切断部位に組み込んだ。ＬＮＰの群を毎日調製し、表２６に記載のようにＴ細胞に順次送達した。
９．１ Ｔ細胞の調製
２例の健康ドナーの白血球アフェレーシス製品（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から、３つのＨＬＡ－Ａ＊０２：０１＋血清型からのＴ細胞を単離した。ＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞単離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号１７９５１）を製造業者のプロトコルに従って用いてＴ細胞を単離し、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号０７９３０）を用いて凍結保存した。Ｔ細胞編集を開始する前日に、細胞を解凍し、Ｔ細胞活性化培地（ＴＣＡＭ：ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ［Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ；カタログ番号Ａ３７０５００１］に２．５％ヒトＡＢ血清［Ｇｅｍｉｎｉ；カタログ番号１００－５１２］、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ［Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ；カタログ番号３５０５００６１］、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ［Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ；カタログ番号１５６３００８０］、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２［Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；カタログ番号２００－０２］、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７［Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；カタログ番号２００－０７］、及び５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５［Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；カタログ番号２００－１５］を補充）中で一晩静置した。
９．２ ＬＮＰ処置及びＴ細胞の増殖
以下のように、ＬＮＰを毎日解凍してＡｐｏＥ含有培地に希釈し、Ｔ細胞に送達した。

Figure 2024515650000092
１日目に、表２６に示されているＬＮＰを、５μｇ／ｍＬのｒｈＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；３５０－０２）を含むＴＣＡＭ中でインキュベートした。一方、Ｔ細胞を採取し、洗浄し、Ｔ細胞ＴｒａｎｓＡｃｔヒト試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ；１３０－１１１－１６０）を１：５０で希釈したＴＣＡＭに、２ｘ１０＾６細胞／ｍＬの密度で再浮遊させた。Ｔ細胞及びＬＮＰ－ＡｐｏＥ培地を１：１比で混合し、Ｔ細胞を培養フラスコ内で一晩プレーティングした。
２日目に、表２６に示すＬＮＰを、２０ｕｇ／ｍＬのｒｈＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；３５０－０２）を含むＴＣＡＭ中で２５ｕｇ／ｍＬの濃度でインキュベートした。次いでＬＮＰ－ＡｐｏＥ溶液を適切な培養液に１０：１比で加えた。
３日目に、表２６に示すＴＲＡＣ－ＬＮＰを、５μｇ／ｍＬのｒｈＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；３５０－０２）を含むＴＣＡＭ中でインキュベートした。一方、Ｔ細胞を採取し、洗浄し、ＴＣＡＭに１×１０＾６細胞／ｍＬの密度で再浮遊させた。Ｔ細胞及びＬＮＰ－ＡｐｏＥ培地を１：１比で混合し、Ｔ細胞を培養フラスコ内でプレーティングした。次いでＷＴ１（配列番号１４）ＡＡＶを３×１０＾５ＧＣ／細胞のＭＯＩで各群に加えた。ＤＮＡＰＫＩ化合物４を０．２５μＭの濃度で各群に加えた。
４日目に、表２６に示すＬＮＰを、５ｕｇ／ｍＬのｒｈＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；３５０－０２）を含むＴＣＡＭ中でインキュベートした。一方、Ｔ細胞を採取し、洗浄し、ＴＣＡＭに１×１０＾６細胞／ｍＬの密度で再浮遊させた。Ｔ細胞及びＬＮＰ－ＡｐｏＥ培地を１：１比で混合し、Ｔ細胞を培養フラスコ内でプレーティングした。
５～１３日目に、Ｔ細胞をＴ細胞拡大培地（ＴＣＥＭ：ＣＴＳ ＯｐＴｍｉｚｅｒ［Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ；カタログ番号Ａ３７０５００１］に５％ヒトＡＢ血清［Ｇｅｍｉｎｉ；カタログ番号１００－５１２］、１Ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ［Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ；カタログ番号３５０５００６１］、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ［Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ；カタログ番号１５６３００８０］、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２［Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；カタログ番号２００－０２］、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７［Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；カタログ番号２００－０７］、５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１５［Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；カタログ番号２００－１５］を補充）が入った２４ウェルＧＲＥＸプレート（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ；８０１９２）に移し、製造業者のプロトコルに従って増殖させた。簡潔に説明すると、Ｔ細胞を２～３日ごとに培地交換しながら８日間増殖させた。
９．３ フローサイトメトリー及びＮＧＳによるＴ細胞編集の定量化
増殖後、編集したＴ細胞をフローサイトメトリーによりアッセイして、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１ノックアウト、ＣＩＩＴＡノックアウトによるＨＬＡ－ＤＲ－ＤＰ－ＤＱノックダウン、ＷＴ１－ＴＣＲ挿入（ＣＤ３＋Ｖｂ８＋）、及び残存内在性（ＣＤ３＋Ｖｂ８－）を発現する細胞のパーセンテージを求めた。Ｔ細胞を、以下の分子を標的とする抗体カクテルとインキュベートした：Ｖｂ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号３４８１０４）、ＨＬＡ－Ａ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号３４３３２０）、ＨＬＡ－ＤＲＤＰＤＱ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号３６１７１２）、ＣＤ４（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号３００５３８）、ＣＤ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号３０１０４６）、ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号３１７３３６）、ＣＣＲ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号３５３２１４）、ＣＤ６２Ｌ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号３０４８２０）、ＣＤ４５ＲＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号３０４１３４）、ＣＤ４５ＲＯ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号３０４２３０）、ＣＤ５６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；カタログ番号３１８３２８）、及びＶｉａｋｒｏｍｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ；カタログ番号Ｃ３６６２８）。続いて細胞を洗浄し、ＣｙｔｏＦｌｅｘ ＬＸ装置（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で処理し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを用いて解析した。Ｔ細胞をサイズ及びＣＤ４／ＣＤ８の状態でゲーティングしてから編集率及び挿入率を求めた。
ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＴＲＡＣ、及びＴＲＢＣ座位を標的とするＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡの送達に使用するＬＮＰ組成物を、実施例１及び８に記載のように解析した。
順次Ｔ細胞操作の後に関連する細胞表面タンパク質を発現する細胞のパーセンテージを、ＣＤ８＋Ｔ細胞について表２７及び図７Ａに示す。全ての意図された編集を有するＴ細胞のパーセンテージ（すなわち、ＷＴ１－ＴＣＲの挿入とＨＬＡ－Ａ及びＣＩＩＴＡのノックアウトとの組合せ、またはＣＤ３＋Ｖｂ８＋ＨＬＡ－Ａ－ＨＬＡ－ＤＲＤＰＤＱ－％）を、各群について図７Ｂに示す。全ての群からの編集した試料で高レベルのＨＬＡ－Ａ及びＣＩＩＴＡのノックアウトならびにＷＴ１－ＴＣＲの挿入が観察され、７５％超の完全に編集したＣＤ８＋Ｔ細胞が得られた。第１群に使用した低投与量（０．６５μｇ／ｍＬ）は、より高いＬＮＰ用量（２．５μｇ／ｍＬ）の第２群製剤及び第３群製剤と同様に、全ての標的にわたりＴ細胞の編集に同様の効力を示した。
Figure 2024515650000093
実施例１０．ＮＫ細胞における編集
１０．１．ＬＮＰ組成物
ＬＮＰを実施例１に記載のように製剤化した。約６の脂質アミン：ＲＮＡリン酸（Ｎ：Ｐ）のモル比、組成物６４については１：２のｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ重量比（カーゴ比）、または組成物６５については１：１のカーゴ重量比、及び化合物６を用いてＬＮＰを製剤化した。ＬＮＰは、Ｃａｓ９（配列番号４）をコードするｍＲＮＡ及びヒトＡＡＶＳ１遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ（配列番号１５）を送達した。
ＬＮＰ中の脂質構成要素を、荷電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）と結合したＨＰＬＣにより定量的に解析した。逆相ＨＰＬＣにより、４つの脂質構成要素のクロマトグラフィー分離を達成した。ＨＰＬＣ脂質解析により、表２８に示されているように、以下の実施例に記載したＬＮＰ組成物の各構成要素の実際のモル％（ｍｏｌ－％）脂質レベルが得られた。

Figure 2024515650000094
ＬＮＰ組成物のＺ平均及び数平均粒子サイズ、多分散性（ＰＤＩ）、総ＲＮＡ含量、ならびにＲＮＡのカプセル化効率を実施例１に記載の方法に従って解析した。結果を表２９に示す。
Figure 2024515650000095
市販で入手した健康ドナー由来のロイコパックから、ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ；カタログ番号１７９５５）を製造業者のプロトコルに従って用いてＮＫ細胞を単離した。分離後、ＮＫ細胞を必要となるまで凍結保存した。細胞解凍後、ＮＫ細胞をＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ細胞増殖培地（Ｇｉｂｃｏ；カタログ番号Ａ１０２２１－０１）（５％ヒトＡＢ血清（ＧｅｍＣｅｌｌ；カタログ番号１００－５１２）、５００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；カタログ番号２００－０２）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；カタログ番号２００－１５）、１０ｍｌのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ；カタログ番号３５０５０－６１）、１０ｍｌのＨＥＰＥＳ（Ｇｉｂｃｏ；カタログ番号１５６３０－０８０）、及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；カタログ番号１５１４０－１２２）を含む）中で一晩静置した。次いで、静置したＮＫ細胞を、４１ＢＢＬ（配列番号１６）を発現する照射Ｋ５６２ 細胞と１：１の比で培養し、膜結合ＩＬ２１（配列番号１７）を、ＮＫ活性化のためのフィーダー細胞として上記のＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ細胞増殖培地中で３日間使用した。
活性化から３日後、ＮＫ細胞を、ＡＡＶＳ１座位を標的とするＣａｓ９（配列番号４）及びｓｇＲＮＡ（配列番号１５）をコードするｍＲＮＡを送達するＬＮＰで処置した。２．５％ヒトＡＢ血清及び０．２５μＭのＤＮＡＰＫＩ化合物４を含む上記のＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ細胞増殖培地において、２．５μｇ／ｍｌのＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；３５０－０２）と混合した１０μｇ／ｍＬのＬＮＰから開始して２倍段階希釈系列を実施することにより、１２ポイントの用量応答曲線を作成した。表３０に示すように、ＬＮＰ中の総ＲＮＡカーゴの最終濃度は１０、５、２．５、１．２５、０．６３、０．３１、０．１６、０．０８、０．０４、０．０２、０．０１、０．００５、及び０μｇ／ｍｌ（無処置対照）となった。混合ＬＮＰを１×１０＾６細胞／ｍｌのＮＫ細胞に１：１比で三重反復で加えた。
ＬＮＰ処置から７日後、ゲノムＤＮＡを細胞から単離し、実施例１に記載のようにＮＧＳ解析を実施した。
指示濃度におけるＬＮＰ組成物の平均編集パーセント、標準偏差、及びＥＣ５０を表３０に示し、用量応答曲線を図８に示す。
Figure 2024515650000096
実施例１１．単球及びマクロファージの編集
市販で入手したロイコパック（Ｈｅｍａｃａｒｅ）から、ＭｕｌｔｉＭＡＣＳ（商標）Ｃｅｌｌ２４ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｐｌｕｓ装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）上でＳｔｒａｉｇｈｔＦｒｏｍ（登録商標）Ｌｅｕｋｏｐａｋ（登録商標）ＣＤ１４ビーズキットヒト用（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；カタログ１３０－１１７－０２０）を製造業者のプロトコルに従って用いてＣＤ１４＋細胞を単離した。ＣＤ１４＋細胞を解凍し、９６ウェル非組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ；３５１１７２）上で１０ｎｇ／ｍＬのＧＭ－ＣＳＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ；７８１４０．１）を５×１０＾５／ｍＬの細胞密度で含む実施例１に記載のＯｐＴｍｉｚｅｒ基本培地中で、５０，０００細胞／ウェルで三重反復で培養した。２～３日ごとに、ウェル当たりＯｐＴｍｉｚｅｒ培地の５０％を２０ｎｇ／ｍＬの新鮮なサイトカイン培地（ＧＭ－ＣＳＦ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ；７８１４０．１）、２．５％ヒト血清（ＨＳ）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（Ｇｉｂｃｏ；Ａ３７０５００１））と交換した。
細胞を、実施例１０に記載のように調製したＬＮＰで処置した。ＬＮＰを１０μｇ／ｍｌのＡｐｏＥ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ３５０－０２）と３７℃で１５分間プレインキュベートした。プレインキュベートしたＬＮＰを１：１のｖ／ｖ比で細胞に加え、０～１．２５μｇ／ｍＬの最終総ＲＮＡカーゴ量を得た。
インキュベート後、５０μＬのＬＮＰ濃度を、単球にはＣＤ１４＋細胞を非組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ；３５１１７２）にプレーティングした同じ日に加え、マクロファージには非組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ；３５１１７２）で５日間インキュベートした後に加えた。単球及びマクロファージプレートを、使用するまで３７℃でインキュベートした。
ＬＮＰ処置から６日後、実施例１に記載のようにゲノムＤＮＡを単球から単離し、実施例１に記載のようにＮＧＳを行うためにマクロファージ操作細胞を収集した。
指示濃度における各ＬＮＰ組成物の平均編集パーセント、標準偏差、及びＥＣ５０を、単球については表３１に、マクロファージについては表３２に示す。単球及びマクロファージにおける用量応答曲線をそれぞれ図９Ａ及び９Ｂに示す。
Figure 2024515650000097
Figure 2024515650000098
実施例１２．Ｂ細胞の編集
１２．１．Ｂ細胞の分離及び培養ならびに培地調製
Ｂ細胞（Ｈｅｍａｃａｒｅ）を、Ｓｔｅｍｓｐａｎ ＳＦＥＭ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；カタログ番号０９６５０）に１％ペニシリン－ストレプトマイシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；カタログ番号１５１４０１２２）、１μｇ／ｍｌのＣｐＧ ＯＤＮ ２００６（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ；カタログ番号ｔｌｒｌ－２００６－１）、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；カタログ番号２００－０２）、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１０（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；カタログ番号２００－１０）、及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ；カタログ番号２００－１５）を補充したもので培養した。また、様々な濃度の２つの培地構成要素も培地の補充に使用した：１．ヒト血清ＡＢ（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ；カタログ番号１００－５１２、ロット番号Ｈ９４Ｘ００Ｋ、２．５％及び５％）、ならびに２．ＭＥＧＡＣＤ４０Ｌ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号ＡＬＸ－５２２－１１０－００００、１ｎｇ／ｍｌ及び１００ｎｇ／ｍｌ）。Ｂ細胞の調製に使用するＢ細胞培養基組成物を表３３に示す。

Figure 2024515650000099
健康ヒトドナー由来のロイコパック（Ｈｅｍａｃａｒｅ）から、ＭｕｌｔｉＭＡＣＳ Ｃｅｌｌ２４ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｐｌｕｓ装置上でＳｔｒａｉｇｈｔＦｒｏｍロイコパックＣＤ１９マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０－１１７－０２１）を製造者の指示に従って用いて、Ｂ細胞をＣＤ１９ポジティブセレクションにより単離した。単離したＣＤ１９＋Ｂ細胞は、必要になるまで液体窒素で凍結保存した。
使用の準備ができたら、Ｂ細胞を解凍し、同じ日にＢ細胞培地１で活性化した。
Ｂ細胞の解凍及び活性化から２日後、Ｂ細胞を培地２中で培養し、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ（配列番号４）及びＡＡＶＳ１を標的とするｇＲＮＡ（配列番号１５）を送達するＬＮＰで処置した。各ＬＮＰについていくつかの濃度を試験して、２０μｇ／ｍｌの総ＲＮＡカーゴ（最終用量の４倍）を開始点に１：２の段階希釈を設定することにより、８ポイントの用量応答曲線を作成した。続いてＢ細胞培地２中４μｇ／ｍｌのＡｐｏＥ３（最終用量の４倍）を加えてから、Ｂ細胞を１：１比ｖ／ｖでＬＮＰ－ＡＰＯＥ３混合物に加え、その結果、表３４に示すように、総ＲＮＡカーゴの最終用量は５、２．５、１．２５、０．６２５、０．３１３、０．１５６、０．０７８μｇ／ｍｌとなった。細胞を、実施例１０に記載のように調製及び解析したＬＮＰで処置するか、または対照としてＬＮＰで処置しなかった。
ＬＮＰ処置から３日後、細胞を洗浄し、Ｂ細胞培地３に再浮遊させた。ＬＮＰ処置から７日後、ゲノムＤＮＡを細胞から単離し、実施例１に記載のようにＮＧＳ解析を実施した。
指示濃度におけるＬＮＰ組成物の平均編集パーセント及び標準偏差を表３４に示し、用量応答曲線を図１０に示す。「無処置Ｂ細胞」はＬＮＰ組成物で処置しなかった。
Figure 2024515650000100
以下の表及び全体において、「ｍＡ」、「ｍＣ」、「ｍＵ」、または「ｍＧ」という用語は、２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されたヌクレオチドを示すために使用される。
以下の表において、「＊」はＰＳ修飾を示すために使用される。本出願において、Ａ＊、Ｃ＊、Ｕ＊、またはＧ＊という用語は、ＰＳ結合で次の（例えば、３’）ヌクレオチドに結合しているヌクレオチドを示すために使用され得る。
（Ｔを含む）ＤＮＡ配列がＲＮＡに関して言及される場合、ＴはＵ（文脈に応じて修飾されている場合も修飾されていない場合もある）に置き換えられるべきであり、逆もまた同様であることを理解されたい。
以下の表では、アミノ酸一文字コードを使用してペプチド配列を示す。

Figure 2024515650000101
Figure 2024515650000102
Figure 2024515650000103
Figure 2024515650000104
Figure 2024515650000105
Figure 2024515650000106
Figure 2024515650000107
Figure 2024515650000108
Figure 2024515650000109
Figure 2024515650000110
Figure 2024515650000111
Figure 2024515650000112
Figure 2024515650000113
Figure 2024515650000114
Figure 2024515650000115
Figure 2024515650000116
Figure 2024515650000117
Figure 2024515650000118
Figure 2024515650000119

Claims (189)

  1. 脂質組成物であって、
    生物学的に活性な薬剤、及び
    脂質構成要素を含み、前記脂質構成要素が、
    ａ）前記脂質構成要素の約２５～４５ｍｏｌ％の量のイオン化可能な脂質、
    ｂ）前記脂質構成要素の約１０～３０ｍｏｌ％の量の中性脂質、
    ｃ）前記脂質構成要素の約２５～６５ｍｏｌ％の量のヘルパー脂質、及び
    ｄ）前記脂質構成要素の約１．５～３．５ｍｏｌ％の量のＰＥＧ脂質を含み、
    前記イオン化可能な脂質が、式（Ｉ）の化合物
    Figure 2024515650000120
     （式中、
    Ｘ１はＯ、ＮＨ、または直接結合であり、
    Ｘ２はＣ２～３アルキレンであり、
    Ｒ３はＣ１～３アルキルであり、
    Ｒ２はＣ１～３アルキルであり、または
    Ｒ２は、それが結合する窒素原子及びＸ２の２～３個の炭素原子と一緒になって５員もしくは６員環を形成し、または
    Ｒ２は、Ｒ３及びそれらが結合している窒素原子と一緒になって５員環を形成し、
    Ｙ１はＣ６～１０アルキレンであり、
    Ｙ２は
    Figure 2024515650000121
     から選択され、
    Ｒ４はＣ４～１１アルキルであり、
    Ｚ１はＣ２～５アルキレンであり、
    Ｚ２は
    Figure 2024515650000122
     または不在であり、
    Ｒ５は、Ｃ６～８アルキル、Ｃ５～１０アルコキシ（例えば、－ＯＣ５～１０ハロアルキル）、－Ｏ（Ｃ２～３アルキル）ＯＣ６～１０アルキル、－ＯＣ６～１０アルケニル（例えば、－ＯＣ６～１０分枝状アルケニル）、もしくは－ＯＣ６～１０アルキニルであり、
    Ｒ６は、Ｃ６～８アルキル、Ｃ５～１０アルコキシ（例えば、－ＯＣ５～１０ハロアルキル）、－Ｏ（Ｃ２～３アルキル）ＯＣ６～１０アルキル、－ＯＣ６～１０アルケニル（例えば、－ＯＣ６～１０分枝状アルケニル）、もしくは－ＯＣ６～１０アルキニルであり、または
    Ｒ５はＲ６と一緒になって、ジェミナルなＣ６～８アルキルにより置換された６員環のアセタールを形成する）
    またはその塩である、前記脂質組成物。
  2. 脂質組成物であって、
    生物学的に活性な薬剤、及び
    脂質構成要素を含み、前記脂質構成要素が、
    ａ）前記脂質構成要素の約２５～４５ｍｏｌ％の量のイオン化可能な脂質、
    ｂ）前記脂質構成要素の約１０～３０ｍｏｌ％の量の中性脂質、
    ｃ）前記脂質構成要素の約２５～６５ｍｏｌ％の量のヘルパー脂質、及び
    ｄ）前記脂質構成要素の約１．５～３．５ｍｏｌ％の量のＰＥＧ脂質を含み、
    前記イオン化可能な脂質が、式（Ｉ）の化合物
    Figure 2024515650000123
     （式中、
    Ｘ１はＯ、ＮＨ、または直接結合であり、
    Ｘ２はＣ２～３アルキレンであり、
    Ｒ３はＣ１～３アルキルであり、
    Ｒ２はＣ１～３アルキルであり、または
    Ｒ２は、それが結合する窒素原子及びＸ２の２～３個の炭素原子と一緒になって５員もしくは６員環を形成し、または
    Ｒ２は、Ｒ３及びそれらが結合している窒素原子と一緒になって５員環を形成し、
    Ｙ１はＣ６～１０アルキレンであり、
    Ｙ２は
    Figure 2024515650000124
     から選択され、
    Ｒ４はＣ４～１１アルキルであり、
    Ｚ１はＣ２～５アルキレンであり、
    Ｚ２は
    Figure 2024515650000125
     または不在であり、
    Ｒ５はＣ６～８アルキルまたはＣ６～８アルコキシであり、
    Ｒ６はＣ６～８アルキルまたはＣ６～８アルコキシである）
    またはその塩である、前記脂質組成物。
  3. 前記イオン化可能な脂質が、式（ＩＩ）の化合物
    Figure 2024515650000126
     （式中、
    Ｘ１はＯ、ＮＨ、または直接結合であり、
    Ｘ２はＣ２～３アルキレンであり、
    Ｚ１はＣ３アルキレンであり、Ｒ５及びＲ６は各々Ｃ６アルキルであり、またはＺ１は直接結合であり、Ｒ５及びＲ６は各々Ｃ８アルコキシであり、
    Ｒ８は
    Figure 2024515650000127
     である）
    またはその塩である、請求項１または２に記載の脂質組成物。
  4. 脂質組成物であって、
    生物学的に活性な薬剤、及び
    脂質構成要素を含み、前記脂質構成要素が、
    ａ）前記脂質構成要素の約２５～４５ｍｏｌ％の量のイオン化可能な脂質、
    ｂ）前記脂質構成要素の約１０～３０ｍｏｌ％の量の中性脂質、
    ｃ）前記脂質構成要素の約２５～６５ｍｏｌ％の量のヘルパー脂質、及び
    ｄ）前記脂質構成要素の約１．５～３．５ｍｏｌ％の量のＰＥＧ脂質を含み、
    前記イオン化可能な脂質が、
    Figure 2024515650000128
    Figure 2024515650000129
    Figure 2024515650000130
    Figure 2024515650000131
     またはその塩である、前記脂質組成物。
  5. 前記イオン化可能な脂質が、
    Figure 2024515650000132
     またはその塩である、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  6. 前記イオン化可能な脂質が、
    Figure 2024515650000133
     またはその塩である、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  7. 前記中性脂質が非荷電性脂質または双性イオン性脂質である、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  8. 前記中性脂質がＤＳＰＣまたはＤＰＭＥである、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  9. 前記中性脂質がＤＳＰＣである、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  10. 前記ヘルパー脂質が、コレステロール、５－ヘプタデシルレゾルシノール、及びコレステロールヘミスクシネートから選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  11. 前記ヘルパー脂質がコレステロールである、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  12. 前記ＰＥＧ脂質がジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ）を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  13. 前記ＰＥＧ脂質がＰＥＧ－２ｋを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  14. 前記ＰＥＧ脂質がＰＥＧ－ＤＭＧである、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  15. 前記ＰＥＧ脂質がＰＥＧ－２ｋ ＤＭＧである、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  16. 前記ＰＥＧ脂質が１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００である、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  17. 前記イオン化可能な脂質が、
    Figure 2024515650000134
     であり、前記中性脂質がＤＳＰＣであり、前記ヘルパー脂質がコレステロールであり、前記ＰＥＧ脂質が１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００である、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  18. 前記イオン化可能な脂質の量が前記脂質構成要素の約２９～３８ｍｏｌ％である、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  19. 前記イオン化可能な脂質の量が前記脂質構成要素の約３０～４３ｍｏｌ％である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  20. 前記イオン化可能な脂質の量が前記脂質構成要素の約２５～３４ｍｏｌ％である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  21. 前記イオン化可能な脂質の量が前記脂質構成要素の約３３ｍｏｌ％である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  22. 前記中性脂質の量が前記脂質構成要素の約１１～２０ｍｏｌ％である、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  23. 前記中性脂質の量が前記脂質構成要素の約１５ｍｏｌ％である、請求項１～２１のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  24. 前記ヘルパー脂質の量が前記脂質構成要素の約４３～６５ｍｏｌ％である、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  25. 前記ヘルパー脂質の量が前記脂質構成要素の約４３～５５ｍｏｌ％である、請求項１～２３のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  26. 前記ヘルパー脂質の量が前記脂質構成要素の約４９ｍｏｌ％である、請求項１～２３のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  27. 前記ＰＥＧ脂質の量が前記脂質構成要素の約２．０～３．５ｍｏｌ％である、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  28. 前記ＰＥＧ脂質の量が前記脂質構成要素の約２．３～３．５ｍｏｌ％である、請求項１～２６のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  29. 前記ＰＥＧ脂質の量が前記脂質構成要素の約２．３～２．７ｍｏｌ％である、請求項１～２６のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  30. 前記ＰＥＧ脂質の量が前記脂質構成要素の約２．７ｍｏｌ％である、請求項１～２６のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  31. 前記イオン化可能な脂質の量が前記脂質構成要素の約２９～４４ｍｏｌ％であり、前記中性脂質の量が前記脂質構成要素の約１１～２８ｍｏｌ％であり、前記ヘルパー脂質の量が前記脂質構成要素の約２８～５５ｍｏｌ％であり、前記ＰＥＧ脂質の量が前記脂質構成要素の約２．３～３．５ｍｏｌ％である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  32. 前記イオン化可能な脂質の量が前記脂質構成要素の約２９～３８ｍｏｌ％であり、前記中性脂質の量が前記脂質構成要素の約１１～２０ｍｏｌ％であり、前記ヘルパー脂質の量が前記脂質構成要素の約４３～５５ｍｏｌ％であり、前記ＰＥＧ脂質の量が前記脂質構成要素の約２．３～２．７ｍｏｌ％である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  33. 前記イオン化可能な脂質の量が前記脂質構成要素の約２５～３４ｍｏｌ％であり、前記中性脂質の量が前記脂質構成要素の約１０～２０ｍｏｌ％であり、前記ヘルパー脂質の量が前記脂質構成要素の約４５～６５ｍｏｌ％であり、前記ＰＥＧ脂質の量が前記脂質構成要素の約２．５～３．５ｍｏｌ％である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  34. 前記イオン化可能な脂質の量が前記脂質構成要素の約３０～４３ｍｏｌ％であり、前記中性脂質の量が前記脂質構成要素の約１０～１７ｍｏｌ％であり、前記ヘルパー脂質の量が前記脂質構成要素の約４３．５～５６ｍｏｌ％であり、前記ＰＥＧ脂質の量が前記脂質構成要素の約１．５～３ｍｏｌ％である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  35. 前記イオン化可能な脂質の量が前記脂質構成要素の約３３ｍｏｌ％であり、前記中性脂質の量が前記脂質構成要素の約１５ｍｏｌ％であり、前記ヘルパー脂質の量が前記脂質構成要素の約４９ｍｏｌ％であり、前記ＰＥＧ脂質の量が前記脂質構成要素の約３ｍｏｌ％である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  36. 前記イオン化可能な脂質の量が前記脂質構成要素の約３２．９ｍｏｌ％であり、前記中性脂質の量が前記脂質構成要素の約１５．２ｍｏｌ％であり、前記ヘルパー脂質の量が前記脂質構成要素の約４９．２ｍｏｌ％であり、前記ＰＥＧ脂質の量が前記脂質構成要素の約２．７ｍｏｌ％である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  37. 前記イオン化可能な脂質の量が前記脂質構成要素の約３５ｍｏｌ％であり、前記中性脂質の量が前記脂質構成要素の約１５ｍｏｌ％であり、前記ヘルパー脂質の量が前記脂質構成要素の約４７．５ｍｏｌ％であり、前記ＰＥＧ脂質の量が前記脂質構成要素の約２．５ｍｏｌ％である、請求項１～１７のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  38. 各ｍｏｌ％の変動が５％未満である、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  39. 各ｍｏｌ％の変動が１％未満である、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  40. 各ｍｏｌ％の変動が０．５％未満である、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  41. 各ｍｏｌ％が、前記イオン化可能な脂質、前記中性脂質、前記ヘルパー脂質、及び前記ＰＥＧ脂質の相対的な名目濃度に基づく、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  42. 各ｍｏｌ％が、前記イオン化可能な脂質、前記中性脂質、前記ヘルパー脂質、前記、及び前記ＰＥＧ脂質の相対的な実測濃度に基づく、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  43. 前記脂質組成物がＬＮＰの形態をとり、前記ＬＮＰが約１４５ｎｍ未満のＺ平均直径を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  44. 前記脂質組成物がＬＮＰの形態をとり、前記ＬＮＰが約１２０ｎｍ未満のＺ平均直径を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  45. 前記ＬＮＰ組成物がＬＮＰの形態をとり、前記ＬＮＰが約１１５ｎｍ未満のＺ平均直径を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  46. 脂質組成物がＬＮＰの形態をとり、前記ＬＮＰが約１００ｎｍ未満のＺ平均直径を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  47. 前記脂質組成物がＬＮＰの形態をとり、前記ＬＮＰが約５０ｎｍ超の数平均直径を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  48. 前記脂質組成物がＬＮＰの形態をとり、前記ＬＮＰが約６０ｎｍ超の数平均直径を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  49. 前記脂質組成物がＬＮＰの形態をとり、前記ＬＮＰが約０．００５～約０．７５の多分散性指数を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  50. 前記脂質組成物がＬＮＰの形態をとり、前記ＬＮＰが約０．００５～約０．１の多分散指数を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  51. 前記脂質組成物のＮ／Ｐ比が約５～約７である、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  52. 前記脂質組成物のＮ／Ｐ比が約６である、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  53. 前記生物学的に活性な薬剤が非核酸構成要素を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  54. 前記生物学的に活性な薬剤が、治療的に活性なタンパク質を含むまたはコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  55. 前記生物学的に活性な薬剤がゲノム編集ツールを含むまたはコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  56. 前記生物学的に活性な薬剤が、ＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖または二本鎖切断を行うことが可能な１つ以上のヌクレアーゼを含むまたはコードする、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  57. 前記生物学的に活性な薬剤が核酸構成要素を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  58. 前記生物学的に活性な薬剤がＲＮＡを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  59. 前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項５８に記載の脂質組成物。
  60. 前記核酸構成要素が、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡを含む、請求項５９に記載の脂質組成物。
  61. 前記ｍＲＮＡがＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含む、請求項６０に記載の脂質組成物。
  62. 前記ｍＲＮＡがクラス２ ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含む、請求項６０に記載の脂質組成物。
  63. 前記ｍＲＮＡがＣａｓ９ヌクレアーゼｍＲＮＡを含む、請求項６０に記載の脂質組成物。
  64. 前記核酸構成要素が修飾ＲＮＡを含む、請求項５７～６３のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  65. 前記核酸構成要素がガイドＲＮＡ核酸を含む、請求項５７～６４のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  66. 前記ガイドＲＮＡ核酸がｇＲＮＡである、請求項６５に記載の脂質組成物。
  67. 前記ガイドＲＮＡ核酸がデュアルガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）である、またはそれをコードする、請求項６５または６６に記載の脂質組成物。
  68. 前記ガイドＲＮＡ核酸がシングルガイド（ｓｇＲＮＡ）である、またはそれをコードする、請求項６５または６６に記載の脂質組成物。
  69. 前記ｇＲＮＡが修飾ｇＲＮＡである、請求項６６～６８のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  70. 前記修飾ｇＲＮＡが、５’末端の最初の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上に修飾を含む、請求項６９に記載の脂質組成物。
  71. 前記修飾ｇＲＮＡが、３’末端の最後の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上に修飾を含む、請求項６９または７０に記載の脂質組成物。
  72. 前記核酸構成要素がガイドＲＮＡ核酸を含み、前記ｍＲＮＡがクラス２ ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含み、前記ｍＲＮＡ：前記ガイドＲＮＡ核酸の重量比が約２：１～１：４である、請求項５７～７１のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  73. 前記ガイドＲＮＡ核酸：前記クラス２ ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡの重量比が約１：１である、請求項７２に記載の脂質組成物。
  74. 前記脂質組成物がＬＮＰ組成物である、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物。
  75. 遺伝子編集の方法であって、細胞を、先行請求項のいずれか１項に記載の脂質組成物に接触させることを含む、前記方法。
  76. 前記遺伝子編集が遺伝子ノックアウトをもたらす、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記遺伝子編集が遺伝子修正をもたらす、請求項７５に記載の方法。
  78. 前記遺伝子編集が挿入をもたらす、請求項７５に記載の方法。
  79. ＤＮＡを切断する方法であって、細胞を、請求項１～７４のいずれか１項に記載の脂質組成物に接触させることを含む、前記方法。
  80. 生物学的に活性な薬剤を細胞に送達する方法であって、前記細胞を、請求項１～７４のいずれか１項に記載の脂質組成物に接触させることを含む、前記方法。
  81. 前記接触ステップが一本鎖ＤＮＡニックをもたらす、請求項７５～８０のいずれか１項に記載の方法。
  82. 前記接触ステップが二本鎖ＤＮＡ切断をもたらす、請求項７５～８０のいずれか１項に記載の方法。
  83. 少なくとも１つの鋳型核酸を前記細胞に導入することをさらに含む、請求項７５～８２のいずれか１項に記載の方法。
  84. 前記脂質組成物を前記細胞に投与することを含む、請求項７５～８３のいずれか１項に記載の方法。
  85. 前記脂質組成物が第１の脂質組成物であり、前記方法が、前記細胞を、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、及びｇＲＮＡ核酸のうちの１つ以上を含む第２の脂質組成物に接触させることをさらに含む、請求項７５～８４のいずれか１項に記載の方法。
  86. 前記第２の脂質組成物が、請求項１～７４のいずれか１項に記載の第２の脂質組成物である、請求項８５に記載の方法。
  87. 前記第１の脂質組成物及び前記第２の脂質組成物が同時に投与される、請求項８５または８６に記載の方法。
  88. 前記第１の脂質組成物及び前記第２の脂質組成物が順次投与される、請求項８５または８６に記載の方法。
  89. 前記第１の脂質組成物が第１のｇＲＮＡを含み、前記第２の脂質組成物が第２のｇＲＮＡを含み、前記第１のｇＲＮＡ及び前記第２のｇＲＮＡが、異なる標的配列に相補的である異なるガイド配列を含む、請求項８５～８８のいずれか１項に記載の方法。
  90. 前記細胞が真核細胞である、請求項７５～８９のいずれか１項に記載の方法。
  91. 前記細胞がヒト細胞である、請求項９０に記載の方法。
  92. 前記細胞が養子細胞療法（ＡＣＴ）に有用である、請求項 ７５～９１のいずれか１項に記載の方法。
  93. 前記細胞が自己由来細胞療法に有用である、請求項９２に記載の方法。
  94. 前記細胞が幹細胞である、請求項７５～９３のいずれか１項に記載の方法。
  95. 前記幹細胞が造血幹細胞（ＨＳＣ）または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項９４に記載の方法。
  96. 前記細胞が免疫細胞である、請求項７５～９５のいずれか１項に記載の方法。
  97. 前記免疫細胞が白血球またはリンパ球である、請求項９６に記載の方法。
  98. 前記免疫細胞がリンパ球である、請求項９６に記載の方法。
  99. 前記リンパ球がＴ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞である、請求項９８に記載の方法。
  100. 前記リンパ球がＴ細胞である、請求項９８に記載の方法。
  101. 前記リンパ球が活性化Ｔ細胞である、請求項９８に記載の方法。
  102. 前記リンパ球が非活性化Ｔ細胞である、請求項９８に記載の方法。
  103. 前記細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで前記脂質組成物と接触される、請求項７５～１０２のいずれか１項に記載の方法。
  104. 前記細胞がｅｘ ｖｉｖｏで前記脂質組成物と接触される、請求項７５～１０３のいずれか１項に記載の方法。
  105. 前記方法が、動物の組織を前記脂質に接触させることを含む、請求項７５～１０４のいずれか１項に記載の方法。
  106. 前記方法が、前記脂質組成物を動物に投与することを含む、請求項７５～１０５のいずれか１項に記載の方法。
  107. 前記動物がヒトである、請求項１０４または１０６に記載の方法。
  108. 前記脂質組成物が、Ｔ細胞受容体、ＭＨＣクラスＩ、またはＭＨＣクラスＩＩの表面発現を低減または除去する遺伝子を標的とするｇＲＮＡを含む、請求項７５～１０７のいずれか１項に記載の方法。
  109. 前記脂質組成物が、ＴＲＡＣを標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１０８に記載の方法。
  110. 前記脂質組成物が、ＴＲＢＣを標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１０８に記載の方法。
  111. 前記脂質組成物が、ＣＩＩＴＡを標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１０８に記載の方法。
  112. 前記脂質組成物が、ＨＬＡ－Ａを標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１０８に記載の方法。
  113. 前記脂質組成物が、ＨＬＡ－Ｂを標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１０８に記載の方法。
  114. 前記脂質組成物が、ＨＬＡ－Ｃを標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１０８に記載の方法。
  115. 前記脂質組成物が、Ｂ２Ｍを標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１０８に記載の方法。
  116. 細胞内で複数のゲノム編集を生成する方法であって、
    前記細胞を、少なくとも請求項１～７４のいずれか１項に記載の第１の脂質組成物及び請求項１～７４のいずれか１項に記載の第２の脂質組成物に接触させることを含み、
    前記第１の脂質組成物の前記生物学的に活性な薬剤が、第１の標的配列に向けられた第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、任意選択で核酸ゲノム編集ツールとを含み、
    前記第２の脂質組成物の前記生物学的に活性な薬剤が、第２の標的配列に向けられた第２のｇＲＮＡと、任意選択で核酸ゲノム編集ツールとを含み、
    それにより、前記細胞内で複数のゲノム編集を生成する、前記方法。
  117. 前記細胞を、請求項１～７４のいずれか１項に記載の第３の脂質組成物に接触させることをさらに含み、前記第３の脂質組成物の前記生物学的に活性な薬剤が、第３の標的配列に向けられた第３のｇＲＮＡと、任意選択で核酸ゲノム編集ツールとを含む、請求項１１６に記載の方法。
  118. 前記細胞を、請求項１～７４のいずれか１項に記載の第４の脂質組成物に接触させることをさらに含み、前記第４の脂質組成物の前記生物学的に活性な薬剤が、第４の標的配列に向けられた第４のｇＲＮＡと、任意選択で核酸ゲノム編集ツールとを含む、請求項１１７に記載の方法。
  119. 前記細胞を、請求項１～７４のいずれか１項に記載の第５の脂質組成物に接触させることをさらに含み、前記第５の脂質組成物の前記生物学的に活性な薬剤が、第５の標的配列に向けられた第５のｇＲＮＡと、任意選択で核酸ゲノム編集ツールとを含む、請求項１１８に記載の方法。
  120. 前記細胞を、請求項１～７４のいずれか１項に記載の第６の脂質組成物に接触させることをさらに含み、前記第６の脂質組成物の前記生物学的に活性な薬剤が、第６の標的配列に向けられた第６のｇＲＮＡと、任意選択で核酸ゲノム編集ツールとを含む、請求項１１９に記載の方法。
  121. 前記細胞が、ゲノム編集ツールを含む少なくとも１つの脂質組成物と接触される、請求項１１６～１２０のいずれか１項に記載の方法。
  122. 前記ゲノム編集ツールが、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤をコードする核酸を含む、請求項１２１に記載の方法。
  123. 前記細胞が、標的配列に挿入するためのドナー核酸にさらに接触され、任意選択で、前記ドナー核酸がベクターとして提供される、請求項１１６～１２２のいずれか１項に記載の方法。
  124. 前記脂質組成物が順次投与される、請求項１１６～１２３のいずれか１項に記載の方法。
  125. 少なくとも２つの脂質組成物が同時に投与される、請求項１１６～１２３のいずれか１項に記載の方法。
  126. 前記細胞が真核細胞である、請求項１１６～１２５のいずれか１項に記載の方法。
  127. 前記細胞がヒト細胞である、請求項１２６に記載の方法。
  128. 前記細胞が養子細胞療法（ＡＣＴ）に有用である、請求項１１６～１２７のいずれか１項に記載の方法。
  129. 前記細胞が養子細胞療法に有用である、請求項１２８に記載の組成物。
  130. 前記細胞が幹細胞である、請求項１１６～１２９のいずれか１項に記載の方法。
  131. 前記幹細胞が造血幹細胞（ＨＳＣ）または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１３０に記載の方法。
  132. 前記細胞が免疫細胞である、請求項１１６～１３１のいずれか１項に記載の方法。
  133. 前記免疫細胞が白血球またはリンパ球である、請求項１３２に記載の方法。
  134. 前記免疫細胞がリンパ球である、請求項１３３に記載の方法。
  135. 前記リンパ球がＴ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫ細胞である、請求項１３４に記載の方法。
  136. 前記免疫細胞が、リンパ球、単球、マクロファージ、マスト細胞、樹状細胞、顆粒球、一次免疫細胞、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及び樹状細胞（ＤＣ））から選択される、請求項１３２に記載の方法。
  137. 前記細胞がＴ細胞である、請求項１３２に記載の方法。
  138. 前記細胞が活性化Ｔ細胞である、請求項１３７に記載の方法。
  139. 前記細胞が非活性化Ｔ細胞である、請求項１３７に記載の方法。
  140. 前記細胞がＴ細胞であり、前記ドナー核酸が、Ｔ細胞受容体配列の対応する領域と相同性を有する領域を含む、請求項１２３に記載の方法。
  141. 前記脂質組成物のうちの１つが、ＴＲＡＣを標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１１６～１４０のいずれか１項に記載の方法。
  142. 前記脂質組成物のうちの１つが、ＴＲＢＣを標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１１６～１４１のいずれか１項に記載の方法。
  143. 前記脂質組成物のうちの１つが、ＭＨＣクラスＩの表面発現を低減または除去する遺伝子を標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１１６～１４２のいずれか１項に記載の方法。
  144. 前記脂質組成物のうちの１つが、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現を低減または除去する遺伝子を標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１１６～１４３のいずれか１項に記載の方法。
  145. 前記脂質組成物のうちの１つが、ＴＲＡＣを標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＴＲＢＣを標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１１６～１４４のいずれか１項に記載の方法。
  146. 前記脂質組成物のうちの１つが、ＴＲＡＣを標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＴＲＢＣを標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＨＬＡ－Ａを標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＣＩＩＴＡを標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１１６～１４５のいずれか１項に記載の方法。
  147. 前記脂質組成物のうちの１つが、ＴＲＡＣを標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＴＲＢＣを標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＨＬＡ－Ａを標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現を低減または除去する遺伝子を標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１１６～１４５のいずれか１項に記載の方法。
  148. 前記脂質組成物のうちの１つが、ＴＲＡＣを標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＴＲＢＣを標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＭＨＣクラスＩの表面発現を低減または除去する遺伝子を標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＣＩＩＴＡを標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１１６～１４５のいずれか１項に記載の方法。
  149. 前記脂質組成物のうちの１つが、Ｔ細胞受容体の表面発現を低減または除去する遺伝子を標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＨＬＡ－Ａを標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＣＩＩＴＡを標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１１６～１４５のいずれか１項に記載の方法。
  150. 前記脂質組成物のうちの１つが、ＴＲＡＣを標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＨＬＡ－Ａを標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＣＩＩＴＡを標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１１６～１４５のいずれか１項に記載の方法。
  151. 前記脂質組成物のうちの１つが、Ｔ細胞受容体の表面発現を低減または除去する遺伝子を標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＭＨＣクラスＩの表面発現を低減または除去する遺伝子を標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＣＩＩＴＡを標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１１６～１４５のいずれか１項に記載の方法。
  152. 前記細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させることをさらに含む、請求項１１６～１５１のいずれか１項に記載の方法。
  153. 細胞の集団内で複数のゲノム編集を生成する方法であって、
    ａ）前記細胞の集団を、少なくとも請求項１～７４のいずれか１項に記載の第１の脂質組成物及び請求項１～７４のいずれか１項に記載の第２の脂質組成物に接触させるステップを含み、
    前記第１の脂質組成物の前記生物学的に活性な薬剤が、第１の標的配列に向けられた第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と、任意選択で核酸ゲノム編集ツールとを含み、
    前記第２の脂質組成物の前記生物学的に活性な薬剤が、第２の標的配列に向けられた第２のｇＲＮＡと、任意選択で核酸ゲノム編集ツールとを含み、
    それにより、前記細胞の集団内で複数のゲノム編集を生成する、前記方法。
  154. 前記細胞の集団を、請求項１～７４のいずれか１項に記載の第３の脂質組成物に接触させることをさらに含み、前記第３の脂質組成物の前記生物学的に活性な薬剤が、第３の標的配列に向けられた第３のｇＲＮＡと、任意選択で核酸ゲノム編集ツールとを含む、請求項１５３に記載の方法。
  155. 前記細胞の集団を、請求項１～７４のいずれか１項に記載の第４の脂質組成物に接触させることをさらに含み、前記第４の脂質組成物の前記生物学的に活性な薬剤が、第４の標的配列に向けられた第４のｇＲＮＡと、任意選択で核酸ゲノム編集ツールとを含む、請求項１５４に記載の方法。
  156. 前記細胞の集団を、請求項１～７４のいずれか１項に記載の第５の脂質組成物に接触させることをさらに含み、第５の脂質組成物の生物学的に活性な薬剤が、第５の標的配列に向けられた第５のｇＲＮＡ、及び任意選択で核酸ゲノム編集ツールを含む、請求項１５５に記載の方法。
  157. 前記細胞の集団を、請求項１～７４のいずれか１項に記載の第６の脂質組成物に接触させることをさらに含み、前記第６の脂質組成物の前記生物学的に活性な薬剤が、第６の標的配列に向けられた第６のｇＲＮＡと、任意選択で核酸ゲノム編集ツールとを含む、請求項１５６に記載の方法。
  158. 前記細胞の集団が、ゲノム編集ツールを含む少なくとも１つの脂質組成物と接触される、請求項１５３～１５７のいずれか１項に記載の方法。
  159. 前記ゲノム編集ツールが、ＲＮＡ先導ＤＮＡ結合剤をコードする核酸を含む、請求項１５８に記載の方法。
  160. 前記細胞の集団が、標的配列に挿入するためのドナー核酸とさらに接触され、任意選択で、前記ドナー核酸がベクターとして提供する、請求項１５３～１５９のいずれか１項に記載の方法。
  161. 前記脂質組成物が順次投与される、請求項１５３～１６０のいずれか１項に記載の方法。
  162. 少なくとも２つの脂質組成物が同時に投与される、請求項１５３～１６０のいずれか１項に記載の方法。
  163. 前記細胞の集団が真核細胞の集団である、請求項１５３～１６２のいずれか１項に記載の方法。
  164. 前記細胞の集団がヒト細胞の集団である、請求項１６３に記載の方法。
  165. 前記細胞の集団が養子細胞療法（ＡＣＴ）に有用である、請求項１５３～１６４のいずれか１項に記載の方法。
  166. 前記細胞の集団が自己由来細胞療法に有用である、請求項１６５に記載の方法。
  167. 前記細胞の集団が幹細胞の集団である、請求項１５３～１６６のいずれか１項に記載の方法。
  168. 前記幹細胞の集団が造血幹細胞（ＨＳＣ）の集団または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の集団である、請求項１６７に記載の方法。
  169. 前記細胞の集団が免疫細胞の集団である、請求項１５３～１６８のいずれか１項に記載の方法。
  170. 前記免疫細胞の集団が白血球の集団またはリンパ球の集団である、請求項１６９に記載の方法。
  171. 前記免疫細胞の集団がリンパ球の集団である、請求項１７０に記載の方法。
  172. 前記リンパ球の集団が、Ｔ細胞の集団、Ｂ細胞の集団、またはＮＫ細胞の集団である、請求項１７１に記載の方法。
  173. 前記免疫細胞が、リンパ球、単球、マクロファージ、マスト細胞、樹状細胞、顆粒球、一次免疫細胞、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、及び樹状細胞（ＤＣ））から選択される、請求項１６９に記載の方法。
  174. 前記細胞の集団がＴ細胞の集団である、請求項１６９に記載の方法。
  175. 前記細胞が活性化Ｔ細胞である、請求項１７４に記載の方法。
  176. 前記細胞が非活性化Ｔ細胞である、請求項１７４に記載の方法。
  177. 前記細胞の集団がＴ細胞の集団であり、前記ドナー核酸が、Ｔ細胞受容体配列の対応する領域と相同性を有する領域を含む、請求項１６０に記載の方法。
  178. 前記脂質組成物のうちの１つが、ＴＲＡＣを標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１５３～１７７のいずれか１項に記載の方法。
  179. 前記脂質組成物のうちの１つが、ＴＲＢＣを標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１５３～１７８のいずれか１項に記載の方法。
  180. 前記脂質組成物のうちの１つが、ＭＨＣクラスＩの表面発現を低減または除去する遺伝子を標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１５３～１７９のいずれか１項に記載の方法。
  181. 前記脂質組成物のうちの１つが、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現を低減または除去する遺伝子を標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１５３～１８０のいずれか１項に記載の方法。
  182. 前記脂質組成物のうちの１つが、ＴＲＡＣを標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＴＲＢＣを標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１５３～１８１のいずれか１項に記載の方法。
  183. 前記脂質組成物のうちの１つが、ＴＲＡＣを標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＴＲＢＣを標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＨＬＡ－Ａを標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＣＩＩＴＡを標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１５３～１８２のいずれか１項に記載の方法。
  184. 前記脂質組成物のうちの１つが、ＴＲＡＣを標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＴＲＢＣを標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＨＬＡ－Ａを標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＭＨＣクラスＩＩの表面発現を低減または除去する遺伝子を標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１５３～１８２のいずれか１項に記載の方法。
  185. 前記脂質組成物のうちの１つが、ＴＲＡＣを標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＴＲＢＣを標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＭＨＣクラスＩの表面発現を低減または除去する遺伝子を標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＣＩＩＴＡを標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１５３～１８２のいずれか１項に記載の方法。
  186. 前記脂質組成物のうちの１つが、Ｔ細胞受容体の表面発現を低減または除去する遺伝子を標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＨＬＡ－Ａを標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＣＩＩＴＡを標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１５３～１８２のいずれか１項に記載の方法。
  187. 前記脂質組成物のうちの１つが、ＴＲＡＣを標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＨＬＡ－Ａを標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＣＩＩＴＡを標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１５３～１８２のいずれか１項に記載の方法。
  188. 前記脂質組成物のうちの１つが、Ｔ細胞受容体の表面発現を低減または除去する遺伝子を標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＭＨＣクラスＩの表面発現を低減または除去する遺伝子を標的とするｇＲＮＡを含み、前記脂質組成物のうちの１つが、ＣＩＩＴＡを標的とするｇＲＮＡを含む、請求項１５３～１８２のいずれか１項に記載の方法。
  189. 前記細胞の集団をｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させることをさらに含む、請求項１５３～１８８のいずれか１項に記載の方法。
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