KR20240017792A - 지질 나노입자 조성물 - Google Patents

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KR20240017792A
KR20240017792A KR1020237039429A KR20237039429A KR20240017792A KR 20240017792 A KR20240017792 A KR 20240017792A KR 1020237039429 A KR1020237039429 A KR 1020237039429A KR 20237039429 A KR20237039429 A KR 20237039429A KR 20240017792 A KR20240017792 A KR 20240017792A
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mole
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아르카나 스와미
비샬 락쉐
아론 프로디우스
미카 마에타니
루비나 자레 파마르
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인텔리아 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

본 개시내용은 생물학적 활성제의 전달, 예를 들어, 조작된 세포를 제조하기 위해 생물학적 활성제를 세포에 전달하는 데 유용한 이온화 가능한 지질, 헬퍼 지질, 중성 지질 및 PEG 지질의 지질 나노입자(LNP) 조성물을 제공한다. 본 명세서에 개시된 LNP 조성물은 유전자 편집 방법 및 생물학적 활성제를 전달하는 방법 및 DNA를 변형 또는 절단하는 방법에 유용하다.

Description

지질 나노입자 조성물
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 2021년 4월 17일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/176227호; 2021년 10월 12일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/254948호; 2021년 11월 1일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/274153호; 및 2022년 3월 4일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/316568호에 대한 우선권을 주장하며, 각각의 전체 내용은 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
이온화 가능한 지질로 제형화된 지질 나노입자는 생물학적 활성제(biologically active agent), 특히 mRNA 및 가이드 RNA를 포함하여 RNA와 같은 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 전달하기 위한 카고 비히클의 역할을 할 수 있다. 이온화 가능한 지질을 포함하는 LNP 조성물은 세포막을 통해 올리고뉴클레오타이드 작용제의 전달을 촉진할 수 있고, 유전자 편집을 위한 성분 및 조성물을 살아있는 세포에 도입하는 데 사용될 수 있다. 특히 세포에 전달하기 어려운 생물학적 활성제는 단백질, 핵산-기반 약물 및 이의 유도체, 특히 mRNA와 같은 상대적으로 큰 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 약물을 포함한다. CRISPR/Cas9 시스템 구성요소의 전달과 같이 유망한 유전자 편집 기술을 세포에 전달하기 위한 조성물이 특히 관심 대상이다(예를 들어, 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA 및 관련 가이드 RNA(gRNA)).
생체내 및 시험관내에서 RNA와 같은 핵산의 개선된 전달을 위한 조성물이 필요하다. 예로서, CRISPR/Cas의 성분을 인간 세포와 같은 진핵생물 세포에 전달하기 위한 조성물이 필요하다. 특히, CRISPR 단백질 성분을 암호화하는 mRNA를 전달하고 CRISPR gRNA를 전달하기 위한 조성물이 특히 관심 대상이다. RNA 성분을 안정화하고 전달할 수 있는 시험관내 및 생체내 전달을 위한 유용한 특성을 갖는 조성물도 특히 관심 대상이다.
본 개시내용은 지질 조성물(예를 들어, 지질 나노입자(lipid nanoparticle: LNP) 조성물)을 제공한다. 이러한 지질 조성물은, 예를 들어, CRISPR/Cas 유전자 편집 구성요소와 같은 핵산 카고를 포함하는 생물학적 작용제를 세포에 전달하는 데 유리한 특성을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, LNP 조성물은
핵산 성분; 및
지질 성분을 포함하되, 지질 성분은
a) 지질 성분의 약 25몰% 내지 45몰% 양의 이온화 가능한 지질;
b) 지질 성분의 약 10몰% 내지 30몰% 양의 중성 지질;
c) 지질 성분의 약 25몰% 내지 65몰% 양의 헬퍼 지질; 및
d) 지질 성분의 약 1.5몰% 내지 3.5몰% 양의 PEG 지질
을 포함하고; 이온화 가능한 지질은 하기 화학식 (I)의 화합물:
또는 이의 염이고, 식 중,
X1은 O, NH 또는 직접 결합이고;
X2는 C2-3 알킬렌이고;
R3은 C1-3 알킬이고;
R2는 C1-3 알킬이거나, 또는
R2는 이것이 부착된 질소 원자 및 X2의 2개 내지 3개의 탄소 원자와 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하거나, 또는
R2는 R3 및 이들이 부착된 질소 원자와 함께 5-원 고리를 형성하고;
Y1은 C6-10 알킬렌이고;
Y2는 , 및 로부터 선택되고;
R4는 C4-11 알킬이고;
Z1은 C2-5 알킬렌이고;
Z2는 이거나 또는 존재하지 않고;
R5는 C6-8 알킬, C5-10 알콕시(예를 들어, -OC5-10 할로알킬), -O(C2-3 알킬)OC6-10알킬, -OC6-10 알켄일(예를 들어, -OC6-10 분지형 알켄일) 또는 -OC6-10 알킨일이고, 그리고
R6은 C6-8 알킬, C5-10 알콕시(예를 들어, -OC5-10 할로알킬), -O(C2-3 알킬)OC6-10알킬, -OC6-10 알켄일(예를 들어, -OC6-10 분지형 알켄일) 또는 -OC6-10 알킨일이거나, 또는
R5는 R6과 함께 제미날(geminal) C6-8 알킬로 치환된 6-원 환식 아세탈을 형성한다.
일부 실시형태에서, LNP 조성물은,
생물학적 활성제; 및
지질 성분을 포함하되, 지질 성분은
a) 지질 성분의 약 25몰% 내지 45몰% 양의 이온화 가능한 지질;
b) 지질 성분의 약 10몰% 내지 30몰% 양의 중성 지질;
c) 지질 성분의 약 25몰% 내지 65몰% 양의 헬퍼 지질; 및
d) 지질 성분의 약 1.5몰% 내지 3.5몰% 양의 PEG 지질
을 포함하고; 이온화 가능한 지질은 하기 화학식 (I)의 화합물:
또는 이의 염이되, 식 중,
X1은 O, NH 또는 직접 결합이고;
X2는 C2-3 알킬렌이고;
R3은 C1-3 알킬이고;
R2는 C1-3 알킬이거나, 또는
R2는 이것이 부착된 질소 원자 및 X2의 2개 내지 3개의 탄소 원자와 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하거나, 또는
R2는 R3 및 이들이 부착된 질소 원자와 함께 5-원 고리를 형성하고;
Y1은 C6-10 알킬렌이고;
Y2는 , 및 로부터 선택되고;
R4는 C4-11 알킬이고;
Z1은 C2-5 알킬렌이고;
Z2는 이거나 또는 존재하지 않고;
R5는 C6-8 알킬 또는 C6-8 알콕시이고; 그리고
R6은 C6-8 알킬 또는 C6-8 알콕시이다.
소정의 실시형태에서, 이온화 가능한 지질의 양은 지질 성분의 약 29몰% 내지 44몰%이고, 중성 지질의 양은 지질 성분의 약 11몰% 내지 28몰%이고, 헬퍼 지질의 양은 지질 성분의 약 28몰% 내지 55몰%이고, PEG 지질의 양은 지질 성분의 약 2.3몰% 내지 3.5몰%이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질의 양은 지질 성분의 약 33몰%이고, 중성 지질의 양은 지질 성분의 약 15몰%이고, 헬퍼 지질의 양은 지질 성분의 약 49몰%이고, PEG 지질의 양은 지질 성분의 약 3몰%이다.
소정의 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은
또는 이의 염이고, 중성 지질은 DSPC이고; 헬퍼 지질은 콜레스테롤이고; PEG 지질은 1,2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000이다.
소정의 실시형태에서, LNP는 약 145㎚ 미만, 예를 들어, 약 120㎚ 미만, 약 115㎚ 미만 또는 약 100㎚ 미만의 Z-평균 직경을 갖는다. 소정의 실시형태에서, LNP는 약 50㎚ 초과, 예를 들어, 약 60㎚ 초과의 수-평균 직경을 갖는다.
소정의 실시형태에서, LNP는 약 0.005 내지 약 0.75, 예를 들어, 약 0.005 내지 약 0.1의 다분산 지수를 갖는다.
일부 실시형태에서, LNP 조성물의 N/P 비는 약 5 내지 약 7, 바람직하게는, 약 6이다.
소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이되, 핵산 성분은 RNA 성분이다. 일부 실시형태에서, RNA 성분은 mRNA를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이되, RNA 성분은 RNA-가이드된 DNA-결합제, 예를 들어, Cas 뉴클레이스 mRNA, 예컨대, 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA 또는 Cas9 뉴클레이스 mRNA를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이되, mRNA는 변형된 mRNA이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이되, RNA 성분은 gRNA 핵산을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이되, gRNA 핵산은 gRNA이다.
소정의 바람직한 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 LNP 조성물에 관한 것이되, RNA 성분은 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA 및 gRNA를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이되, gRNA 핵산은 이중-가이드 RNA(dgRNA)이거나 또는 이를 암호화한다. 소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이되, gRNA 핵산은 단일-가이드 RNA(sgRNA)이거나 또는 이를 암호화한다.
소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 가이드 RNA 핵산 및 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA를 포함하는 본 명세서에 기재된 LNP 조성물에 관한 것이되, mRNA 대 가이드 RNA 핵산의 비는 중량 기준으로 약 2:1 내지 1:4, 바람직하게는 중량 기준으로 약 1:1이다.
소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 임의의 LNP 조성물에 관한 것이되, gRNA는 변형된 gRNA이고, 예를 들어, 변형된 gRNA는 5' 말단의 처음 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에 변형을 포함하거나 또는 변형된 gRNA는 3' 말단의 마지막 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에 변형을 포함하거나 또는 둘 다에 변형을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 세포를 본 명세서에 기재된 LNP 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 생물학적 활성제를 세포에 전달하는 방법에 관한 것이다.
소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 세포를 본 명세서에 기재된 LNP 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, DNA를 절단하는 방법에 관한 것이다. 소정의 실시형태에서, 절단 단계는 단일 가닥 DNA 닉(nick)을 도입하는 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 절단 단계는 이중-가닥 DNA 절단(double-stranded DNA break)을 도입하는 단계를 포함한다. 소정의 실시형태에서, LNP 조성물은 클래스 2 Cas mRNA 및 gRNA 핵산을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 방법은 적어도 하나의 주형 핵산을 세포에 도입하는 단계를 더 포함한다.
소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 LNP 조성물을 동물, 예를 들어, 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 본 명세서에 기재된 유전자 편집의 임의의 방법에 관한 것이다. 소정의 실시형태에서, 방법은 LNP 조성물을 진핵생물 세포 및 특히 인간 세포와 같은 세포에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 요법, 예를 들어, 입양 세포 요법(adoptive cell therapy: ACT)에 유용한 세포의 유형이다. ACT의 예는 자가 및 동종 세포 요법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 조혈 줄기 세포, 유도 만능성 줄기 세포 또는 또 다른 다능성(multipotent) 또는 만능성(pluripotent) 세포와 같은 줄기 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 줄기 세포, 예를 들어, 뼈, 연골, 근육 또는 지방 세포로 발달할 수 있는 중간엽 줄기 세포이다. 일부 실시형태에서, 줄기 세포는 안구 줄기 세포를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 세포는 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell: HSC), 단핵 세포, 내피 전구 세포(endothelial progenitor cell: EPC), 신경 줄기 세포(neural stem cell: NSC), 윤부 줄기 세포(limbal stem cell: LSC), 조직-특이적 일차 세포 또는 이로부터 유래된 세포(tissue-specific primary cell: TSC), 유도 만능성 줄기 세포(iPSC), 안구 줄기 세포, 만능성 줄기 세포(pluripotent stem cell: PSC), 배아 줄기 세포(embryonic stem cell: ESC) 및 장기 또는 조직 이식용 세포로부터 선택된다.
소정의 실시형태에서, 세포는 간 세포이다. 다른 실시형태에서, 세포는 면역 세포, 예를 들어, 백혈구 또는 림프구, 바람직하게는 림프구, 보다 더 바람직하게는, T 세포, B 세포 또는 NK 세포, 가장 바람직하게는 활성화된 T 세포 또는 비활성화된 T 세포이다.
소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 제1 LNP 조성물로 제형화된 mRNA 및 mRNA, gRNA 및 gRNA 핵산 중 하나 이상을 포함하는 제2 LNP 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 본 명세서에 기재된 유전자 편집의 임의의 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 LNP 조성물은 동시에 투여된다. 다른 실시형태에서, 제1 및 제2 LNP 조성물은 순차적으로 투여된다. 소정의 실시형태에서, mRNA 및 gRNA 핵산은 단일 LNP 조성물로 제형화된다. 일부 실시형태에서, 제1 LNP 조성물은 제1 gRNA를 포함하고 제2 LNP 조성물은 제2 gRNA를 포함하되, 제1 및 제2 gRNA는 서로 다른 표적과 상보적인 상이한 가이드 서열을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 유전자 편집의 임의의 방법에 관한 것이되, 세포는 시험관내에서 LNP 조성물과 접촉된다. 소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 유전자 편집의 임의의 방법에 관한 것이되, 세포는 생체외에서 LNP 조성물과 접촉된다. 소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 동물의 조직을 LNP와 접촉시키는 단계를 포함하는, 본 명세서에 기재된 유전자 편집의 임의의 방법에 관한 것이다.
소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 유전자 편집의 임의의 방법에 관한 것이되, 유전자 편집은 유전자 넉아웃을 초래한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 유전자 편집의 임의의 방법에 관한 것이되, 유전자 편집 유전자 교정을 초래한다.
소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 유전자 편집의 임의의 방법에 관한 것이되, 유전자 편집은 삽입을 초래한다. 일부 실시형태에서, 삽입은 유전자 삽입이다.
이전 방법의 장애를 극복하는 시험관내에서 T 세포를 유전적으로 조작하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 미경험 T 세포는 시험관내에서 적어도 하나의 지질 조성물과 접촉되고 유전적으로 변형된다. 일부 실시형태에서, 비활성화된 T 세포는 시험관내에서 2개 이상의 지질 조성물과 접촉되고 유전적으로 변형된다. 일부 실시형태에서, 활성화된 T 세포는 시험관내에서 2개 이상의 지질 조성물과 접촉되고 유전적으로 변형된다. 일부 실시형태에서, T 세포는 (비활성화된) T 세포를 하나 이상의 지질 조성물과 접촉시킨 후 T 세포를 활성화하는 활성화 전 단계에서 변형되고, 이어서 활성화된 T 세포를 하나 이상의 지질 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 활성화 후 단계에서 T 세포에 대한 추가 변형이 이어진다. 일부 실시형태에서, 비활성화된 T 세포는 1개, 2개 또는 3개의 지질 조성물과 접촉된다. 일부 실시형태에서, 활성화된 T 세포는 1개 내지 12개의 지질 조성물과 접촉된다. 일부 실시형태에서, 활성화된 T 세포는 1개 내지 8개의 지질 조성물, 선택적으로 1개 내지 4개의 지질 조성물과 접촉된다. 일부 실시형태에서, 활성화된 T 세포는 1개 내지 6개의 지질 조성물과 접촉된다. 일부 실시형태에서, T 세포는 2개의 지질 조성물과 접촉된다. 일부 실시형태에서, T 세포는 3개의 지질 조성물과 접촉된다. 일부 실시형태에서, T 세포는 4개의 지질 조성물과 접촉된다. 일부 실시형태에서, T 세포는 5개의 지질 조성물과 접촉된다. 일부 실시형태에서, T 세포는 6개의 지질 조성물과 접촉된다. 일부 실시형태에서, T 세포는 7개의 지질 조성물과 접촉된다. 일부 실시형태에서, T 세포는 8개의 지질 조성물과 접촉된다. 일부 실시형태에서, T 세포는 9개의 지질 조성물과 접촉된다. 일부 실시형태에서, T 세포는 10개의 지질 조성물과 접촉된다. 일부 실시형태에서, T 세포는 11개의 지질 조성물과 접촉된다. 일부 실시형태에서, T 세포는 12개의 지질 조성물과 접촉된다. 지질 조성물의 이러한 예시적인 순차적 투여(선택적으로 활성화 전 단계 및 활성화 후 단계에서 추가의 순차적 또는 동시 투여와 함께)는 T 세포의 활성화 상태를 이용하며, 편집 후 고유한 이점 및 더 건강한 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, 유전적으로 조작된 T 세포는 각 표적 부위에서 높은 편집 효율, 증가된 편집 후 생존율, 다중 형질감염에도 불구하고 낮은 독성, 낮은 전좌(예를 들어, 측정 가능한 표적-표적 전좌 없음), 증가된 사이토카인(예를 들어, IL-2, IFNγ, TNFα)의 생산, 반복 자극(예를 들어, 반복 항원 자극)으로 인한 지속적인 증식, 증가된 확장 및/또는, 예를 들어, 초기 줄기 세포를 포함한 기억 세포 표현형 마커의 발현의 유리한 특성을 갖는다.
도 1a는 다양한 비의 지질 성분을 갖는 화합물 6을 포함한 LNP 조성물을 사용하여 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 활성화된 CD3+ T 세포에 전달한 후 CD3- 세포의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 1b는 다양한 비의 지질 성분을 갖는 화합물 6을 포함한 LNP 조성물을 사용하여 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 비활성화된 CD3+ T 세포에 전달한 후 CD3- 세포의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 2a는 다양한 비의 지질 성분을 갖는 화합물 6을 포함한 LNP 조성물을 사용하여 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 활성화된 CD3+ T 세포에 전달한 후 CD3- 세포의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 2b는 다양한 비의 지질 성분을 갖는 화합물 6을 포함한 LNP 조성물을 사용하여 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 비활성화된 CD3+ T 세포에 전달한 후 CD3- 세포의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 3a는 35%의 이온화 가능한 지질, 15%의 DSPC, 47.5%의 콜레스테롤 및 2.5% PEG-2k-DMG의 공칭(nominal) 몰% 비의 지질 성분을 갖는 화합물 6, 화합물 8 및 화합물 11을 포함한 LNP 조성물 및 50%의 이온화 가능한 지질, 10%의 DSPC, 38.5%의 콜레스테롤 및 1.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는 화합물 6, 화합물 8 및 화합물 11을 포함한 비교 LNP 조성물을 사용하여 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 활성화된 CD3+ T 세포에 전달한 후 CD3- 세포의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 3b는 35%의 이온화 가능한 지질, 15%의 DSPC, 47.5%의 콜레스테롤 및 2.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는 화합물 6, 화합물 8 및 화합물 11을 포함한 LNP 조성물 및 50%의 이온화 가능한 지질, 10%의 DSPC, 38.5%의 콜레스테롤 및 1.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는 화합물 6, 화합물 8 및 화합물 11을 포함한 비교 LNP 조성물을 사용하여 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 비활성화된 CD3+ T 세포에 전달한 후 CD3- 세포의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 4a는 35%의 이온화 가능한 지질, 15%의 DSPC, 47.5%의 콜레스테롤 및 2.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는 화합물 6을 포함한 LNP 조성물 및 50%의 이온화 가능한 지질, 10%의 DSPC, 38.5%의 콜레스테롤 및 1.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는 비교 LNP 조성물을 사용하여 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 활성화된 CD3+ T 세포에 전달한 후 CD3- 세포의 백분율에 대한 sgRNA 대 Cas9 mRNA의 다양한 비의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 4b는 지질 성분: 35%의 이온화 가능한 지질, 15%의 DSPC, 47.5%의 콜레스테롤 및 2.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는 화합물 6을 포함한 LNP 조성물 및 50%의 이온화 가능한 지질, 10%의 DSPC, 38.5%의 콜레스테롤 및 1.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는 비교 LNP 조성물을 사용하여 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 2명의 상이한 공여자로부터의 비활성화된 CD3+ T 세포에 전달한 후 CD3- 세포의 백분율에 대한 sgRNA 대 Cas9 mRNA의 다양한 비의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 35%의 이온화 가능한 지질, 15%의 DSPC, 47.5%의 콜레스테롤 및 2.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는 화합물 6을 포함한 LNP 조성물 및 50%의 이온화 가능한 지질, 10%의 DSPC, 38.5%의 콜레스테롤 및 1.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는 비교 LNP 조성물을 사용하여 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 전달한 후 활성화된 CD3+ T 세포의 GFP 삽입 효율에 대한 다양한 혈청 배지 조건의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 6a는 35%의 이온화 가능한 지질, 15%의 DSPC, 47.5%의 콜레스테롤 및 2.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는 LNP 조성물 및 50%의 이온화 가능한 지질, 10%의 DSPC, 38.5%의 콜레스테롤 및 1.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는 비교 LNP 조성물을 사용하여 Cas9 mRNA 및 TRAC-표적화 sgRNA를 활성화된 T 세포에 전달한 후 CD3- 세포의 백분율에 대한 다양한 LNP 조성물 농도의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 6b는 35%의 이온화 가능한 지질, 15%의 DSPC, 47.5%의 콜레스테롤 및 2.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는 LNP 조성물 및 50%의 이온화 가능한 지질, 10%의 DSPC, 38.5%의 콜레스테롤 및 1.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는 비교 LNP 조성물을 사용하여 Cas9 mRNA 및 CIITA-표적화 sgRNA를 활성화된 T 세포에 전달한 후 HLA-DR-, HLA-DP-, HLA-DQ- 세포의 백분율에 대한 다양한 LNP 조성물 농도의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 6c는 35%의 이온화 가능한 지질, 15%의 DSPC, 47.5%의 콜레스테롤 및 2.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는 LNP 조성물 및 50%의 이온화 가능한 지질, 10%의 DSPC, 38.5%의 콜레스테롤 및 1.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는 비교 LNP 조성물을 사용하여 Cas9 mRNA 및 TRBC-표적화 sgRNA를 활성화된 T 세포에 전달한 후 CD3- 세포의 백분율에 대한 다양한 LNP 조성물 농도의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 6d는 35%의 이온화 가능한 지질, 15%의 DSPC, 47.5%의 콜레스테롤 및 2.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는 LNP 조성물 및 50%의 이온화 가능한 지질, 10%의 DSPC, 38.5%의 콜레스테롤 및 1.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는 비교 LNP 조성물을 사용하여 Cas9 mRNA 및 HLA-A-표적화 sgRNA를 활성화된 T 세포에 전달한 후 HLA-A- 세포의 백분율에 대한 다양한 LNP 조성물 농도의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 7a는 음성 대조군과 함께 0.65 ㎍/㎖ 또는 2.5 ㎍/㎖ 농도의 LNP 조성물을 사용하여 CIITA, HLA-A, TRAC 및 TRBC 유전자좌를 표적으로 하는 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 전달한 후 CD8+ T 세포에서 HLA-A, CIITA, TCR 및 WT1 각각의 편집률을 보여주는 그래프이며, 여기서 LNP 조성물은 35%의 이온화 가능한 지질, 15%의 DSPC, 47.5%의 콜레스테롤 및 2.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖고, 비교 LNP 조성물은 50%의 이온화 가능한 지질, 10%의 DSPC, 38.5%의 콜레스테롤 및 1.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는다.
도 7b는 음성 대조군과 함께 0.65 ㎍/㎖ 또는 2.5 ㎍/㎖ 농도의 LNP 조성물을 사용하여 CIITA, HLA-A, TRAC 및 TRBC 유전자좌를 표적으로 하는 Cas9 mRNA 및 sgRNA를 전달한 후 CD8+ T 세포에서 HLA-A, CIITA, TCR 및 WT1의 합한 편집률을 보여주는 그래프이며, 여기서 LNP 조성물은 35%의 이온화 가능한 지질, 15%의 DSPC, 47.5%의 콜레스테롤 및 2.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖고, 비교 LNP 조성물은 50%의 이온화 가능한 지질, 10%의 DSPC, 38.5%의 콜레스테롤 및 1.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는다.
도 8은 35%의 이온화 가능한 지질, 15%의 DSPC, 47.5%의 콜레스테롤 및 2.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는 LNP 조성물 및 50%의 이온화 가능한 지질, 10%의 DSPC, 38.5%의 콜레스테롤 및 1.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는 비교 LNP 조성물을 사용하여 Cas9 mRNA 및 AAVS1-표적화 sgRNA를 NK 세포에 전달한 후 편집 퍼센트에 대한 다양한 LNP 조성물 농도의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 9a는 35%의 이온화 가능한 지질, 15%의 DSPC, 47.5%의 콜레스테롤 및 2.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는 LNP 조성물 및 50%의 이온화 가능한 지질, 10%의 DSPC, 38.5%의 콜레스테롤 및 1.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는 비교 LNP 조성물을 사용하여 Cas9 mRNA 및 AAVS1-표적화 sgRNA를 단핵구에 전달한 후 편집 퍼센트에 대한 다양한 LNP 조성물 농도의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 9b는 35%의 이온화 가능한 지질, 15%의 DSPC, 47.5%의 콜레스테롤 및 2.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는 LNP 조성물 및 50%의 이온화 가능한 지질, 10%의 DSPC, 38.5%의 콜레스테롤 및 1.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는 비교 LNP 조성물을 사용하여 Cas9 mRNA 및 AAVS1-표적화 sgRNA를 대식세포에 전달한 후 편집 퍼센트에 대한 다양한 LNP 조성물 농도의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 10은 35%의 이온화 가능한 지질, 15%의 DSPC, 47.5%의 콜레스테롤 및 2.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는 LNP 조성물 및 50%의 이온화 가능한 지질, 10%의 DSPC, 38.5%의 콜레스테롤 및 1.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는 비교 LNP 조성물을 사용하여 Cas9 mRNA 및 AAVS1-표적화 sgRNA를 B 세포에 전달한 후 편집 퍼센트에 대한 다양한 LNP 조성물 농도의 효과를 보여주는 그래프이다.
본 개시내용은 CRISPR/Cas 성분 RNA(mRNA 및/또는 gRNA)("카고")와 같은 핵산을 포함하는 생물학적 활성제를 세포에 전달하는 데 유용한 지질 조성물 및 이러한 조성물을 제조하고 사용하는 방법을 제공한다. 이러한 지질 조성물은 이온화 가능한 지질, 중성 지질, PEG 지질 및 헬퍼 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 본 명세서에 정의된 바와 같은 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물이다. 소정의 실시형태에서, 지질 조성물은 생물학적 활성제, 예를 들어, RNA 성분을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, RNA 성분은 mRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, mRNA는 클래스 2 Cas 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA이다. 소정의 실시형태에서, RNA 성분은 gRNA 및 선택적으로 클래스 2 Cas 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질 조성물은 지질 나노입자(LNP) 조성물이다. "지질 나노입자" 또는 "LNP"는 의미에 제한되지 않고 분자간 힘에 의해 서로 물리적으로 회합된 복수(즉, 하나 초과)의 지질 성분을 포함하는 입자를 지칭한다.
유전자 편집 방법 및 이러한 지질 조성물을 사용하여 조작된 세포를 만드는 방법도 제공된다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 생물학적 활성제를 세포, 조직 또는 동물에 전달하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 진핵생물 세포 및 특히 인간 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 간 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 요법, 예를 들어, 자가 및 동종 세포 요법과 같은 입양 세포 요법(ACT)에 유용한 세포 유형이다. 일부 실시형태에서, 세포는 조혈 줄기 세포, 유도 만능성 줄기 세포, 또는 또 다른 다능성 또는 만능성 세포와 같은 줄기 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 줄기 세포, 예를 들어, 뼈, 연골, 근육 또는 지방 세포로 발달할 수 있는 중간엽 줄기 세포이다. 일부 실시형태에서, 줄기 세포는 안구 줄기 세포를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 세포는 중간엽 줄기 세포, 조혈 줄기 세포(HSC), 단핵 세포, 내피 전구 세포(EPC), 신경 줄기 세포(NSC), 윤부 줄기 세포(LSC), 조직-특이적 일차 세포 또는 이로부터 유래된 세포(TSC), 유도 만능성 줄기 세포(iPSC), 안구 줄기 세포, 만능성 줄기 세포(PSC), 배아 줄기 세포(ESC) 및 장기 또는 조직 이식용 세포로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 세포는 백혈구 또는 림프구와 같은 면역 세포이다. 바람직한 실시형태에서, 면역 세포는 림프구이다. 소정의 실시형태에서, 림프구는 T 세포, B 세포 또는 NK 세포이다. 바람직한 실시형태에서, 림프구는 T 세포이다. 소정의 실시형태에서, 림프구는 활성화된 T 세포이다. 소정의 실시형태에서, 림프구는 비활성화된 T 세포이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 LNP 조성물 및 방법은 약 80% 초과, 약 90% 초과 또는 약 95% 초과의 편집 효율을 초래한다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물 및 방법은 약 80% 내지 95%, 약 90% 내지 95%, 약 80% 내지 99%, 약 90% 내지 99% 또는 약 95% 내지 99%의 편집 효율을 초래한다.
이온화 가능한 지질
본 개시내용은 LNP 조성물에 사용될 수 있는 이온화 가능한 지질을 제공한다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 하기 화학식 (I)의 화합물:
또는 이의 염이되, 식 중,
X1은 O, NH 또는 직접 결합이고;
X2는 C2-3 알킬렌이고;
R3은 C1-3 알킬이고;
R2는 C1-3 알킬이거나, 또는
R2는 이것이 부착된 질소 원자 및 X2의 2개 내지 3개의 탄소 원자와 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하거나, 또는
R2는 R3 및 이들이 부착된 질소 원자와 함께 5-원 고리를 형성하고;
Y1은 C6-10 알킬렌이고;
Y2는 , 및 로부터 선택되고;
R4는 C4-11 알킬이고;
Z1은 C2-5 알킬렌이고;
Z2는 이거나 또는 존재하지 않고;
R5는 C6-8 알킬, C5-10 알콕시(예를 들어, -OC5-10 할로알킬), -O(C2-3 알킬)OC6-10알킬, -OC6-10 알켄일(예를 들어, -OC6-10 분지형 알켄일) 또는 -OC6-10 알킨일이고, 그리고
R6은 C6-8 알킬, C5-10 알콕시(예를 들어, -OC5-10 할로알킬), -O(C2-3 알킬)OC6-10알킬, -OC6-10 알켄일(예를 들어, -OC6-10 분지형 알켄일) 또는 -OC6-10 알킨일이거나, 또는
R5는 R6과 함께 제미날 C6-8 알킬로 치환된 6-원 환식 아세탈을 형성한다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 하기 화학식 I의 구조를 갖는 화합물:
또는 이의 염이되, 식 중,
X1은 O, NH 또는 직접 결합이고;
X2는 C2-3 알킬렌이고;
R3은 C1-3 알킬이고;
R2는 C1-3 알킬이거나, 또는
R2는 이것이 부착된 질소 원자 및 X2의 2개 내지 3개의 탄소 원자와 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하거나, 또는
R2는 R3 및 이들이 부착된 질소 원자와 함께 5-원 고리를 형성하고;
Y1은 C6-10 알킬렌이고;
Y2는 , 및 로부터 선택되고;
R4는 C4-11 알킬이고;
Z1은 C2-5 알킬렌이고;
Z2는 이거나 또는 존재하지 않고;
R5는 C6-8 알킬 또는 C6-8 알콕시이고; 그리고
R6은 C6-8 알킬 또는 C6-8 알콕시이다.
일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 하기 화학식 (II)의 화합물:
또는 이의 염이되, 식 중,
X1은 O, NH 또는 직접 결합이고;
X2는 C2-3 알킬렌이고;
Z1은 C3 알킬렌이고, R5 및 R6은 각각 C6 알킬이거나, 또는 Z1은 직접 결합이고, R5 및 R6은 각각 C8 알콕시이고; 그리고
R8은 또는 이다.
소정의 실시형태에서, X1은 O이다. 다른 실시형태에서, X1은 NH이다. 또 다른 실시형태에서, X1은 직접 결합이다.
소정의 실시형태에서, X2는 C3 알킬렌이다. 특정 실시형태에서, X2는 C2 알킬렌이다.
소정의 실시형태에서, Z1은 직접 결합이고, R5 및 R6은 각각 C8 알콕시이다. 다른 실시형태에서, Z1은 C3 알킬렌이고, R5 및 R6은 각각 C6 알킬이다.
소정의 실시형태에서, R8은 이다. 다른 실시형태에서, R8은 이다.
소정의 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 염이다.
대표적인 화학식 (I)의 화합물은 다음:
또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과 같은 이의 염을 포함한다. 화합물은 각각 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 WO2015/095340(예를 들어, 84 내지 86 페이지) 및 WO2020/219876(예를 들어, 87 내지 186 페이지)에 제시된 방법에 따라 합성될 수 있다.
본 개시내용의 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물은 이들이 존재하는 매질의 pH에 따라 염을 형성할 수 있다. 예를 들어, 약산성 매질에서, 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물은 양성자화될 수 있으므로 양전하를 가질 수 있다. 반대로, 예를 들어, pH가 대략 7.35인 혈액과 같은 약염기성 매질에서, 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물은 양성자화되지 않으므로 전하를 갖지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물은 적어도 약 9의 pH에서 주로 양성자화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물은 적어도 약 10의 pH에서 주로 양성자화될 수 있다.
화학식 (I) 또는 (II)의 화합물이 주로 양성자화되는 pH는 고유 pKa와 관련이 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 염은 약 5.1 내지 약 8.0, 보다 더 바람직하게는 약 5.5 내지 약 7.6의 범위의 pKa를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 염은 약 5.7 내지 약 8, 약 5.7 내지 약 7.6, 약 6 내지 약 8, 약 6 내지 약 7.5, 약 6 내지 약 7, 약 6 내지 약 6.9, 약 6 내지 약 6.5, 약 6.1 내지 약 6.9 또는 약 6 내지 약 6.85의 범위의 pKa를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 염은 약 6.0, 약 6.1, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8 또는 약 6.9의 pKa를 갖는다. 대안적으로, 본 개시내용의 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 염은 약 6 내지 약 8의 범위의 pKa를 갖는다. 약 5.5 내지 약 7.0의 범위의 pKa를 갖는 소정의 지질로 제형화된 LNP가 생체내, 예를 들어, 간으로의 카고의 전달에 효과적인 것으로 밝혀졌기 때문에, 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 염의 pKa는 LNP의 제형화에 있어서 중요한 고려사항이 될 수 있다. 또한, 약 5.3 내지 약 6.4의 범위의 pKa를 갖는 소정의 지질로 제형화된 LNP가 생체내, 예를 들어, 종양으로의 전달에 효과적인 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, WO 2014/136086을 참조한다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 산성 pH에서는 양전하를 띠지만 혈액에서는 중성이다.
추가적인 지질
본 개시내용의 지질 조성물에 사용하기에 적합한 "중성 지질"은, 예를 들어, 다양한 중성, 하전되지 않은 또는 양성이온성 지질을 포함한다. 본 개시내용에 사용하기에 적합한 중성 인지질의 예는 다이팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 포스포콜린(DOPC), 다이미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 포스파티딜콜린(PLPC), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DAPC), 포스파티딜에탄올아민(PE), 달걀 포스파티딜콜린(EPC), 다이라우릴로일포스파티딜콜린(DLPC), 다이미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 1-미리스토일-2-팔미토일 포스파티딜콜린(MPPC), 1-팔미토일-2-미리스토일 포스파티딜콜린(PMPC), 1-팔미토일-2-스테아로일 포스파티딜콜린(PSPC), 1,2-다이아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DBPC), 1-스테아로일-2-팔미토일 포스파티딜콜린(SPPC), 1,2-다이에이코세노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DEPC), 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린(POPC), 라이소포스파티딜 콜린, 다이올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE), 다이리놀레오일포스파티딜콜린 다이스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE), 다이미리스토일 포스파티딜에탄올아민(DMPE), 다이팔미토일 포스파티딜에탄올아민(DPPE), 팔미토일올레오일 포스파티딜에탄올아민(POPE), 라이소포스파티딜에탄올아민 및 이들의 조합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 소정의 실시형태에서, 중성 인지질은 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 및 다이미리스토일 포스파티딜 에탄올아민(DMPE)로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 다이스테아로일포스파티딜콜린(DSPC)이다.
"헬퍼 지질"은 스테로이드, 스테롤 및 알킬 레조르시놀을 포함한다. 본 개시내용에 사용하기에 적합한 헬퍼 지질은 콜레스테롤, 5-헵타데실레조르시놀 및 콜레스테롤 헤미석시네이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 소정의 실시형태에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤 또는 이의 유도체, 예컨대, 콜레스테롤 헤미석시네이트일 수 있다.
일부 실시형태에서, LNP 조성물은 나노입자가 생체내 또는 생체외(예를 들어, 혈액 또는 배지 내)에서 존재할 수 있는 시간의 길이에 영향을 미칠 수 있는 PEG 지질과 같은 중합체성 지질을 포함한다. PEG 지질은, 예를 들어, 입자 응집을 감소시키고 입자 크기를 조절함으로써 제형화 과정을 도울 수 있다. 본 명세서에 사용된 PEG 지질은 LNP의 약동학적 특성을 조절할 수 있다. 전형적으로, PEG 지질은 지질 모이어티 및 PEG(때때로 폴리(에틸렌 옥사이드)로도 지칭됨) 기반 중합체 모이어티(PEG 모이어티)를 포함한다. 본 개시내용의 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물과 함께 지질 조성물에 사용하기에 적합한 PEG 지질 및 이러한 지질의 생화학에 관한 정보는 문헌[Romberg et al., Pharmaceutical Research 25(1), 2008, pp. 55-71 and Hoekstra et al., Biochimica et Biophysica Acta 1660 (2004) 41-52]에서 찾을 수 있다. 추가적인 적합한 PEG 지질은, 예를 들어, 각각 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 WO 2015/095340(31 페이지 14줄 내지 37 페이지 6 줄), WO 2006/007712 및 WO 2011/076807("스텔스 지질")에 개시되어 있다.
일부 실시형태에서, 지질 모이어티는 독립적으로 약 C4 내지 약 C40 포화 또는 불포화된 탄소 원자를 포함하는 알킬 사슬 길이를 갖는 다이알킬글리세롤 또는 다이알킬글리카마이드기를 포함하는 것을 포함하는 다이아실글리세롤 또는 다이아실글리카마이드로부터 유래될 수 있되, 사슬은, 예를 들어, 아마이드 또는 에스터와 같은 하나 이상의 작용기를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 알킬 사슬 길이는 약 C10 내지 C20을 포함한다. 다이알킬글리세롤 또는 다이알킬글리카마이드기는 하나 이상의 치환된 알킬기를 추가로 포함할 수 있다. 사슬 길이는 대칭 또는 비대칭일 수 있다.
달리 명시하지 않는 한, 본 명세서에 사용되는 용어 "PEG"는 임의의 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 폴리알킬렌 에터 중합체, 예컨대, 에틸렌 글리콜 또는 에틸렌 옥사이드의 선택적으로 치환된 선형 또는 분지형 중합체를 의미한다. 소정의 실시형태에서, PEG 모이어티는 비치환된다. 대안적으로, PEG 모이어티는, 예를 들어, 하나 이상의 알킬, 알콕시, 아실, 하이드록시 또는 아릴기로 치환될 수 있다. 예를 들어, PEG 모이어티는 PEG-폴리우레탄 또는 PEG-폴리프로필렌(예를 들어, 문헌[J. Milton Harris, Poly(ethylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications (1992)] 참조)과 같은 PEG 공중합체를 포함할 수 있고; 대안적으로, PEG 모이어티는 PEG 단독중합체일 수 있다. 소정의 실시형태에서, PEG 모이어티는 약 130 내지 약 50,000, 예컨대, 약 150 내지 약 30,000 또는 심지어 약 150 내지 약 20,000의 분자량을 갖는다. 유사하게는, PEG 모이어티는 약 150 내지 약 15,000, 약 150 내지 약 10,000, 약 150 내지 약 6,000 또는 심지어 약 150 내지 약 5,000의 분자량을 가질 수 있다. 소정의 바람직한 실시형태에서, PEG 모이어티는 약 150 내지 약 4,000, 약 150 내지 약 3,000, 약 300 내지 약 3,000, 약 1,000 내지 약 3,000 또는 약 1,500 내지 약 2,500의 분자량을 갖는다.
소정의 바람직한 실시형태에서, PEG 모이어티는 평균 분자량이 약 2,000달톤인 "PEG 2000"이라고도 불리는 "PEG-2K"이다. PEG-2K는 본 명세서에서 하기 화학식 (III): (III)으로 표시되되, n은 약 45이며, 이는 수평균 중합도가 약 45개의 서브유닛을 포함함을 의미한다. 그러나, 예를 들어, 수평균 중합도가 약 23개의 서브유닛(n=23) 및/또는 68개의 서브유닛(n=68)을 포함하는 것을 포함하여 당업계에 공지된 다른 PEG 실시형태가 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, n은 약 30 내지 약 60의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, n은 약 35 내지 약 55의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, n은 약 40 내지 약 50의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, n은 약 42 내지 약 48의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, n은 45일 수 있다. 일부 실시형태에서, R은 H, 치환된 알킬 및 비치환된 알킬로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, R은 메틸과 같은 비치환된 알킬일 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 실시형태에 있어서, PEG 지질은 PEG-다이라우로일글리세롤, PEG-다이미리스토일글리세롤(PEG-DMG)(NOF(일본 도쿄 소재)의 카탈로그 번호 GM-020), PEG-다이팔미토일글리세롤, PEG-다이스테아로일글리세롤(PEG-DSPE)(카탈로그 번호 DSPE-020CN, NOF, 일본 도쿄 소재), PEG-다이라우릴글리카마이드, PEG-다이미리스틸글리카마이드, PEG-다이팔미토일글리카마이드 및 PEG-다이스테아로일글리카마이드, PEG-콜레스테롤(1-[8'-(콜레스트-5-엔-3[베타]-옥시)카복사미도-3',6'-다이옥사옥탄일]카바모일-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜), PEG-DMB(3,4-다이테트라데콕실벤질-[오메가]-메틸-폴리(에틸렌 글리콜)에터), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG2k-DMPE), 1,2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000(PEG2k-DMG), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG2k-DSPE)(Avanti Polar Lipids(미국, 앨라배마주 엘라베스터 소재)의 카탈로그 번호 880120C), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜(PEG2k-DSG; GS-020, NOF, 일본 도쿄 소재), 폴리(에틸렌 글리콜)-2000-다이메타크릴레이트(PEG2k-DMA) 및 1,2-다이스테아릴옥시프로필-3-아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG2k-DSA)로부터 선택될 수 있다. 소정의 이러한 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-DMG일 수 있다. 일부 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-DSG일 수 있다. 다른 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-DSPE일 수 있다. 일부 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-DMA일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-C-DMA일 수 있다. 소정의 실시형태에서, PEG 지질은 WO2016/010840(단락 [00240] 내지 [00244])에 기재되어 있는 화합물 S027일 수 있다. 일부 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-DSA일 수 있다. 다른 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-C11일 수 있다. 일부 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-C14일 수 있다. 일부 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-C16일 수 있다. 일부 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-C18일 수 있다.
바람직한 실시형태에서, PEG 지질은 글리세롤기를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, PEG 지질은 다이미리스토일글리세롤(DMG)기를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, PEG 지질은 PEG-2k를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, PEG 지질은 PEG-DMG이다. 바람직한 실시형태에서, PEG 지질은 PEG-2k-DMG이다. 바람직한 실시형태에서, PEG 지질은 1,2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000이다. 바람직한 실시형태에서, PEG-2k-DMG는 1,2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000이다.
지질 조성물
적어도 하나의 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물 또는 이의 염(예를 들어, 이의 약제학적으로 허용 가능한 염), 적어도 하나의 헬퍼 지질, 적어도 하나의 중성 지질 및 적어도 하나의 중합체성 지질을 포함하는 지질 조성물이 본 명세서에 기재된다. 일부 실시형태에서, 지질 조성물은 적어도 하나의 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물 또는 이의 염, 적어도 하나의 중성 지질, 적어도 하나의 헬퍼 지질 및 적어도 하나의 PEG 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 중성 지질은 DSPC 또는 DPME이다. 일부 실시형태에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤, 5-헵타데실레조르시놀 또는 콜레스테롤 헤미석시네이트이다.
바람직한 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 이다. 바람직한 실시형태에서, 중성 지질은 DSPC이다. 바람직한 실시형태에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. 바람직한 실시형태에서, PEG 지질은 1,2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000이다. 특히 바람직한 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 이고, 중성 지질은 DSPC이고, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이고, PEG 지질은 1,2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000이다.
일부 실시형태에서, 지질 조성물은 하나 이상의 추가적인 지질 성분을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 지질 조성물은 리포솜의 형태이다. 바람직한 실시형태에서, 지질 조성물은 지질 나노입자(LNP)의 형태이다. 소정의 실시형태에서, 지질 조성물은 생체내 전달에 적합하다. 소정의 실시형태에서, 지질 조성물은 간과 같은 기관으로의 전달에 적합하다. 소정의 실시형태에서, 지질 조성물은 생체외 조직으로의 전달에 적합하다. 소정의 실시형태에서, 지질 조성물은 시험관내에서 세포로의 전달에 적합하다.
화학식 (I) 또는 (II)의 지질 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 지질 조성물은 다양한 분자를 세포에 전달하는 데 유용한 미세입자, 나노입자 및 형질감염제를 포함하는 입자 형성 전달제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 형태일 수 있다. 특정 조성물은 생물학적 활성제를 형질감염시키거나 또는 전달하는 데 효과적이다. 바람직한 생물학적 활성제는 RNA와 같은 핵산이다. 추가 실시형태에서, 생물학적 활성제는 mRNA 및 gRNA로부터 선택된다. gRNA는 dgRNA 또는 sgRNA일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 카고는 RNA-가이드된 DNA-결합제(예를 들어, Cas 뉴클레이스, 클래스 2 Cas 뉴클레이스 또는 Cas9)를 암호화하는 mRNA, gRNA 또는 gRNA를 암호화하는 핵산 또는 mRNA와 gRNA의 조합을 포함한다.
위의 지질 조성물에 사용하기 위한 예시적인 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물은 전체가 참조에 의해 원용되어 있는 WO2020/219876에 제시되어 있다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 1이다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 2이다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 3이다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 4이다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 5이다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 6이다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 7이다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 8이다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 9이다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 10이다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 11이다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 12이다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 13이다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 14이다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 15이다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 16이다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 17이다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 18이다. 소정의 실시형태에서, 화학식 (I)의 화합물은 화합물 19이다.
조성물은 반드시 그런 것은 아니지만 일반적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함할 것이다. 용어 "부형제"는 본 개시내용의 화합물(들), 다른 지질 성분(들) 및 생물학적 활성제 이외의 임의의 성분을 포함한다. 부형제는 기능성(예를 들어, 약물 방출 속도 조절) 및/또는 비기능성(예를 들어, 가공 보조제 또는 희석제) 특성을 조성물에 부여할 수 있다. 부형제의 선택은 특정 투여 방식, 용해도 및 안정성에 대한 부형제의 효과 및 투여 형태의 특성과 같은 요인에 크게 의존할 것이다.
비경구 제형 전형적으로 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액이다. 제형이 수성인 경우, 당(글루코스, 만니톨, 소르비톨 등을 포함하지만 이에 제한되지 않음) 염, 탄수화물 및 완충제(바람직하게는 3 내지 9의 pH)와 같은 부형제이지만, 일부 적용의 경우 멸균 비수성 용액으로 또는 멸균 무발열원수(WFI)와 같은 적합한 비히클과 함께 사용되는 건조된 형태로 더 적합하게 제형화될 수 있다.
LNP 조성물
지질 조성물은 LNP 조성물로서 제공될 수 있고, 본 명세서에 기재된 LNP 조성물은 지질 조성물로서 제공될 수 있다. 지질 나노입자는, 예를 들어, 마이크로스피어(단층 및 다층 소포, 예를 들어, "리포솜" - 일부 실시형태에서 실질적으로 구형이고, 보다 특정한 실시형태에서는, 예를 들어, RNA 분자의 상당 부분을 포함하는 수성 코어를 포함할 수 있는 층상 지질 이중층 포함), 에멀션의 분산된 상, 현탁액의 마이셀 또는 내부상일 수 있다.
적어도 하나의 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물 또는 이의 염(예를 들어, 이의 약제학적으로 허용 가능한 염), 적어도 하나의 헬퍼 지질, 적어도 하나의 중성 지질 및 적어도 하나의 중합체성 지질을 포함하는 LNP 조성물이 본 명세서에 기재된다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 적어도 하나의 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 적어도 하나의 중성 지질, 적어도 하나의 헬퍼 지질 및 적어도 하나의 PEG 지질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 중성 지질은 DSPC 또는 DPME이다. 일부 실시형태에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤, 5-헵타데실레조르시놀 또는 콜레스테롤 헤미석시네이트이다.
바람직한 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 이다. 바람직한 실시형태에서, 중성 지질은 DSPC이다. 바람직한 실시형태에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. 바람직한 실시형태에서, PEG 지질은 1,2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000이다. 특히 바람직한 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 이고, 중성 지질은 DSPC이고, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이고, PEG 지질은 1,2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000이다.
본 개시내용의 실시형태는 조성물 내 성분 지질의 각각의 몰비에 따라 기재된 지질 조성물을 제공한다. 모든 몰% 수치는 지질 조성물 또는, 보다 구체적으로, LNP 조성물의 지질 성분의 분율로서 제공된다. 일부 실시형태에서, 지질 성분에 대한 지질의 지질 몰%는 지질의 명시된 공칭 또는 실제 몰%의 ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5% 또는 ±2.5%일 수 있다. 일부 실시형태에서, 지질 성분에 대한 지질의 지질 몰%는 지질 성분의 명시된 공칭 또는 실제 몰%의 ±4몰%, ±3몰%, ±2몰%, ±1.5몰%, ±1몰%, ±0.5몰%, ±0.25몰% 또는 ±0.05몰%일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 지질 몰%는 지질의 명시된 공칭 또는 실제 몰%의 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만 또는 0.5% 미만으로 다양할 수 있다. 일부 실시형태에서, 몰% 수치는 공칭 농도를 기준으로 한다. 본 명세서에서 사용되는 "공칭 농도"는 생성된 조성물을 형성하기 위해 조합된 물질의 투입량을 기준으로 한 농도를 지칭한다. 예를 들어, 1ℓ의 물에 100㎎의 용질을 첨가하면, 공칭 농도는 100 ㎎/ℓ이다. 일부 실시형태에서, 몰% 수치는 실제 농도, 예를 들어, 분석적 방법에 의해 결정된 농도를 기준으로 한다. 일부 실시형태에서, 지질 성분 중 지질의 실제 농도는, 예를 들어, 액체 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피에 이어 하전된 에어로졸 검출과 같은 검출 방법에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 지질 성분 중 지질의 실제 농도는 지질 분석, AF4-MALS, NTA 및/또는 cryo-EM에 의해 특성화될 수 있다. 모든 몰% 수치는 지질 성분 중 지질의 백분율로 주어진다.
본 개시내용의 실시형태는 지질 성분 중 지질의 각각의 몰비에 따라 기재된 LNP 조성물을 제공한다. 소정의 실시형태에서, 이온화 가능한 지질의 양은 약 25몰% 내지 약 45몰%이고; 중성 지질의 양은 약 10몰% 내지 약 30몰%이고; 헬퍼 지질의 양은 약 25몰% 내지 약 65몰%이고; PEG 지질의 양은 약 1.5몰% 내지 약 3.5몰%이다. 소정의 실시형태에서, 이온화 가능한 지질의 양은 지질 성분의 약 29몰% 내지 44몰%이고; 중성 지질의 양은 지질 성분의 약 11몰% 내지 28몰%이고; 헬퍼 지질의 양은 지질 성분의 약 28몰% 내지 55몰%이고; PEG 지질의 양은 지질 성분의 약 2.3몰% 내지 3.5몰%이다. 소정의 실시형태에서, 이온화 가능한 지질의 양은 지질 성분의 약 29몰% 내지 38몰%이고; 중성 지질의 양은 지질 성분의 약 11몰% 내지 20몰%이고; 헬퍼 지질의 양은 지질 성분의 약 43몰% 내지 55몰%이고; PEG 지질의 양은 지질 성분의 약 2.3몰% 내지 2.7몰%이다. 소정의 실시형태에서, 이온화 가능한 지질의 양은 지질 성분의 약 25몰% 내지 34몰%이고; 중성 지질의 양은 지질 성분의 약 10몰% 내지 20몰%이고; 헬퍼 지질의 양은 지질 성분의 약 45몰% 내지 65몰%이고; PEG 지질의 양은 지질 성분의 약 2.5몰% 내지 3.5몰%이다. 소정의 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 지질 성분의 약 30몰% 내지 43몰%이고; 중성 지질의 양은 지질 성분의 약 10몰% 내지 17몰%이고; 헬퍼 지질의 양은 지질 성분의 약 43.5몰% 내지 56몰%이고; PEG 지질의 양은 지질 성분의 약 1.5몰% 내지 3몰%이다. 소정의 실시형태에서, 이온화 가능한 지질은 지질 성분의 약 33몰%이고; 중성 지질의 양은 지질 성분의 약 15몰%이고; 헬퍼 지질의 양은 지질 성분의 약 49몰%이고; PEG 지질의 양은 지질 성분의 약 3몰%이다. 소정의 실시형태에서, 이온화 가능한 지질의 양은 지질 성분의 약 32.9몰%이고; 중성 지질의 양은 지질 성분의 약 15.2몰%이고; 헬퍼 지질의 양은 지질 성분의 약 49.2몰%이고; PEG 지질의 양은 지질 성분의 약 2.7몰%이다. 소정의 실시형태에서, 이온화 가능한 지질의 양은 지질 성분의 약 35몰%이고; 중성 지질의 양은 지질 성분의 약 15몰%이고; 헬퍼 지질의 양은 지질 성분의 약 47.5몰%이고; PEG 지질의 양은 지질 성분의 약 2.5몰%이다.
소정의 실시형태에서, 이온화 가능한 지질의 양은 약 20몰% 내지 50몰%, 약 25몰% 내지 34몰%, 약 25몰% 내지 38몰%, 약 25몰% 내지 45몰%, 약 29몰% 내지 38몰%, 약 29몰% 내지 43몰%, 약 29몰% 내지 34몰%, 약 30몰% 내지 34몰%, 약 30몰% 내지 38몰%, 약 30몰% 내지 43몰%, 약 30몰% 내지 43몰% 또는 약 33몰%이다. 추가적인 실시형태에서, 이온화 가능한 지질의 양은 약 25몰% 내지 45몰%, 약 25몰% 내지 43몰%, 약 25몰% 내지 40몰%, 약 25몰% 내지 38몰%, 약 25몰% 내지 35몰%, 약 25몰% 내지 33몰%, 약 25몰% 내지 30몰%, 약 25몰% 내지 28몰%, 약 28몰% 내지 45몰%, 약 28몰% 내지 43몰%, 약 28몰% 내지 40몰%, 약 28몰% 내지 38몰%, 약 28몰% 내지 35몰%, 약 28몰% 내지 33몰%, 약 28몰% 내지 30몰%, 약 30몰% 내지 45몰%, 약 30몰% 내지 43몰%, 약 30몰% 내지 40몰%, 약 30몰% 내지 38몰%, 약 30몰% 내지 35몰%, 약 30몰% 내지 33몰%, 약 32몰% 내지 45몰%, 약 32몰% 내지 43몰%, 약 32몰% 내지 40몰%, 약 32몰% 내지 38몰%, 약 32몰% 내지 35몰%, 약 35몰% 내지 45몰%, 약 35몰% 내지 43몰%, 약 35몰% 내지 40몰%, 약 35몰% 내지 38몰%, 약 37몰% 내지 45몰%, 약 37몰% 내지 43몰%, 약 37몰% 내지 40몰%, 약 40몰% 내지 45몰%, 약 40몰% 내지 43몰% 또는 약 42몰% 내지 45몰%이다. 일부 실시형태에서, 이온화 가능한 지질의 몰%는 약 30몰%, 약 31몰%, 약 32몰%, 약 33몰%, 약 34몰%, 약 35몰%, 약 36몰%, 약 37몰%, 약 38몰%, 약 39몰%, 약 40몰%, 약 41몰%, 약 42몰%, 약 43몰%, 약 44몰% 또는 약 45몰%일 수 있다. 일부 실시형태에서, 지질 성분에 대한 이온화 가능한 지질 몰%는 명시된 공칭 또는 실제 몰%의 ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5% 또는 ±2.5%일 수 있다. 일부 실시형태에서, 지질 성분에 대한 이온화 가능한 지질 몰%는 명시된 공칭 또는 실제 몰%의 ±4몰%, ±3몰%, ±2몰%, ±1.5몰%, ±1몰%, ±0.5몰% 또는 ±0.25몰%일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 이온화 가능한 지질 몰%의 LNP 로트간(inter-lot) 변동성은 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만일 것이다. 일부 실시형태에서, 몰% 수치는 공칭 농도를 기준으로 한다. 일부 실시형태에서, 몰% 수치는 실제 농도를 기준으로 한다.
소정의 실시형태에서, 중성 지질의 양은 약 10몰% 내지 30몰%, 약 11몰% 내지 30몰%, 약 11몰% 내지 20몰%, 약 13몰% 내지 17몰% 또는 약 15몰%이다. 추가적인 실시형태에서, 중성 지질의 양은 약 5몰% 내지 30몰%, 약 5몰% 내지 28몰%, 약 5몰% 내지 25몰%, 약 5몰% 내지 23몰%, 약 5몰% 내지 20몰%, 약 5몰% 내지 18몰%, 약 5몰% 내지 23몰%, 약 5몰% 내지 20몰%, 약 5몰% 내지 18몰%, 약 5몰% 내지 15몰%, 약 5몰% 내지 13몰%, 약 5몰% 내지 10몰%, 약 10몰% 내지 30몰%, 약 10몰% 내지 28몰%, 약 10몰% 내지 25몰%, 약 10몰% 내지 23몰%, 약 10몰% 내지 20몰%, 약 10몰% 내지 18몰%, 약 10몰% 내지 23몰%, 약 10몰% 내지 20몰%, 약 10몰% 내지 18몰%, 약 10몰% 내지 15몰%, 약 10몰% 내지 13몰%, 약 12몰% 내지 30몰%, 약 12몰% 내지 28몰%, 약 12몰% 내지 25몰%, 약 12몰% 내지 23몰%, 약 12몰% 내지 20몰%, 약 12몰% 내지 18몰%, 약 12몰% 내지 23몰%, 약 12몰% 내지 20몰%, 약 12몰% 내지 18몰%, 약 12몰% 내지 15몰%, 약 15몰% 내지 30몰%, 약 15몰% 내지 28몰%, 약 15몰% 내지 25몰%, 약 15몰% 내지 23몰%, 약 15몰% 내지 20몰%, 약 15몰% 내지 18몰%, 약 15몰% 내지 23몰%, 약 15몰% 내지 20몰%, 약 15몰% 내지 18몰%, 약 17몰% 내지 30몰%, 약 17몰% 내지 28몰%, 약 17몰% 내지 25몰%, 약 17몰% 내지 23몰%, 약 17몰% 내지 20몰%, 약 17몰% 내지 18몰%, 약 17몰% 내지 23몰%, 약 17몰% 내지 20몰%, 약 20몰% 내지 30몰%, 약 20몰% 내지 28몰%, 약 20몰% 내지 25몰%, 약 20몰% 내지 23몰%, 약 22몰% 내지 30몰%, 약 22몰% 내지 28몰%, 약 22몰% 내지 25몰%, 약 22몰% 내지 23몰%, 약 22몰% 내지 20몰% 또는 약 22몰% 내지 18몰%일 수 있다. 일부 실시형태에서, 중성 지질의 몰%는 약 10몰%, 약 11몰%, 약 12몰%, 약 13몰%, 약 14몰%, 약 15몰%, 약 16몰%, 약 17몰%, 약 18몰%, 약 19몰%, 약 20몰%, 약 21몰%, 약 22몰%, 약 23몰%, 약 24몰% 또는 약 25몰%일 수 있다. 일부 실시형태에서, 지질 성분에 대한 중성 지질 몰%는 명시된 공칭 또는 실제 중성 지질 몰%의 ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5% 또는 ±2.5%일 것이다. 일부 실시형태에서, 지질 성분에 대한 중성 지질 몰%는 명시된 공칭 또는 실제 몰%의 ±4몰%, ±3몰%, ±2몰%, ±1.5몰%, ±1몰%, ±0.5몰% 또는 ±0.25몰%일 것이다. 소정의 실시형태에서, LNP 로트간 변동성은 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만일 것이다. 일부 실시형태에서, 몰% 수치는 공칭 농도를 기준으로 한다. 일부 실시형태에서, 몰% 수치는 실제 농도를 기준으로 한다.
소정의 실시형태에서, 헬퍼 지질의 양은 약 35몰% 내지 50몰%, 약 35몰% 내지 65몰%, 약 35몰% 내지 55몰%, 약 38몰% 내지 50몰%, 약 38몰% 내지 55몰%, 약 38몰% 내지 65몰%, 약 40몰% 내지 50몰%, 약 40몰% 내지 65몰%, 약 43몰% 내지 65몰%, 약 43몰% 내지 55몰% 또는 약 49몰%이다. 추가적인 실시형태에서, 헬퍼 지질의 양은 약 25몰% 내지 65몰%, 약 28몰% 내지 65몰%, 약 30몰% 내지 65몰%, 약 32몰% 내지 65몰%, 약 35몰% 내지 65몰%, 약 38몰% 내지 65몰%, 약 40몰% 내지 65몰%, 약 42몰% 내지 65몰%, 약 45몰% 내지 65몰%, 약 48몰% 내지 65몰%, 약 50몰% 내지 65몰%, 약 52몰% 내지 65몰%, 약 55몰% 내지 65몰%, 약 58몰% 내지 65몰%, 약 60몰% 내지 65몰%, 약 25몰% 내지 62몰%, 약 28몰% 내지 62몰%, 약 30몰% 내지 62몰%, 약 32몰% 내지 62몰%, 약 35몰% 내지 62몰%, 약 38몰% 내지 62몰%, 약 40몰% 내지 62몰%, 약 42몰% 내지 62몰%, 약 45몰% 내지 62몰%, 약 48몰% 내지 62몰%, 약 50몰% 내지 62몰%, 약 52몰% 내지 62몰%, 약 55몰% 내지 62몰%, 약 58몰% 내지 62몰%, 약 60몰% 내지 62몰%, 약 25몰% 내지 60몰%, 약 28몰% 내지 60몰%, 약 30몰% 내지 60몰%, 약 32몰% 내지 60몰%, 약 35몰% 내지 60몰%, 약 38몰% 내지 60몰%, 약 40몰% 내지 60몰%, 약 42몰% 내지 60몰%, 약 45몰% 내지 60몰%, 약 48몰% 내지 60몰%, 약 50몰% 내지 60몰%, 약 52몰% 내지 60몰%, 약 55몰% 내지 60몰%, 약 58몰% 내지 60몰%, 약 25몰% 내지 58몰%, 약 28몰% 내지 58몰%, 약 30몰% 내지 58몰%, 약 32몰% 내지 58몰%, 약 35몰% 내지 58몰%, 약 38몰% 내지 58몰%, 약 40몰% 내지 58몰%, 약 42몰% 내지 58몰%, 약 45몰% 내지 58몰%, 약 48몰% 내지 58몰%, 약 50몰% 내지 58몰%, 약 52몰% 내지 58몰%, 약 55몰% 내지 58몰%, 약 25몰% 내지 55몰%, 약 28몰% 내지 55몰%, 약 30몰% 내지 55몰%, 약 32몰% 내지 55몰%, 약 35몰% 내지 55몰%, 약 38몰% 내지 55몰%, 약 40몰% 내지 55몰%, 약 42몰% 내지 55몰%, 약 45몰% 내지 55몰%, 약 48몰% 내지 55몰%, 약 50몰% 내지 55몰%, 약 52몰% 내지 55몰%, 약 25몰% 내지 53몰%, 약 28몰% 내지 53몰%, 약 30몰% 내지 53몰%, 약 32몰% 내지 53몰%, 약 35몰% 내지 53몰%, 약 38몰% 내지 53몰%, 약 40몰% 내지 53몰%, 약 42몰% 내지 53몰%, 약 45몰% 내지 53몰%, 약 48몰% 내지 53몰%, 약 50몰% 내지 53몰%, 약 25몰% 내지 50몰%, 약 28몰% 내지 50몰%, 약 30몰% 내지 50몰%, 약 32몰% 내지 50몰%, 약 35몰% 내지 50몰%, 약 38몰% 내지 50몰%, 약 40몰% 내지 50몰%, 약 42몰% 내지 50몰%, 약 45몰% 내지 50몰%, 약 48몰% 내지 50몰%, 약 25몰% 내지 48몰%, 약 28몰% 내지 48몰%, 약 30몰% 내지 48몰%, 약 32몰% 내지 48몰%, 약 35몰% 내지 48몰%, 약 38몰% 내지 48몰%, 약 40몰% 내지 48몰%, 약 42몰% 내지 48몰%, 약 45몰% 내지 48몰%, 약 25몰% 내지 45몰%, 약 28몰% 내지 45몰%, 약 30몰% 내지 45몰%, 약 32몰% 내지 45몰%, 약 35몰% 내지 45몰%, 약 38몰% 내지 45몰%, 약 40몰% 내지 45몰%, 약 42몰% 내지 45몰%, 약 25몰% 내지 43몰%, 약 28몰% 내지 43몰%, 약 30몰% 내지 43몰%, 약 32몰% 내지 43몰%, 약 35몰% 내지 43몰%, 약 38몰% 내지 43몰%, 약 40몰% 내지 43몰%, 약 25몰% 내지 40몰%, 약 28몰% 내지 40몰%, 약 30몰% 내지 40몰%, 약 32몰% 내지 40몰%, 약 35몰% 내지 40몰%, 약 38몰% 내지 40몰%, 약 25몰% 내지 38몰%, 약 28몰% 내지 38몰%, 약 30몰% 내지 38몰%, 약 32몰% 내지 38몰%, 약 35몰% 내지 38몰%, 약 25몰% 내지 35몰%, 약 28몰% 내지 35몰%, 약 30몰% 내지 35몰%, 약 32몰% 내지 35몰%, 약 25몰% 내지 33몰%, 약 28몰% 내지 33몰%, 약 30몰% 내지 33몰%, 약 25몰% 내지 30몰%, 약 28몰% 내지 30몰% 또는 약 25몰% 내지 28몰%일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 헬퍼 지질의 양은 지질 성분이 약 100몰%가 되도록 이온화 가능한 지질, 중성 지질 및/또는 PEG 지질의 양을 기준으로 조정된다. 일부 실시형태에서, 지질 성분에 대한 헬퍼 지질 몰%는 명시된 공칭 또는 실제 헬퍼 지질 몰%의 ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5% 또는 ±2.5%일 것이다. 일부 실시형태에서, 지질 성분에 대한 헬퍼 지질 몰%는 명시된 공칭 또는 실제 몰%의 ±4몰%, ±3몰%, ±2몰%, ±1.5몰%, ±1몰%, ±0.5몰% 또는 ±0.25몰%일 것이다. 소정의 실시형태에서, LNP 로트간 변동성은 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만일 것이다. 일부 실시형태에서, 몰% 수치는 공칭 농도를 기준으로 한다. 일부 실시형태에서, 몰% 수치는 실제 농도를 기준으로 한다.
소정의 실시형태에서, PEG 지질의 양은 약 1.5몰% 내지 3.5몰%, 약 2.0몰% 내지 2.7몰%, 약 2.0몰% 내지 3.5몰%, 약 2.3몰% 내지 3.5몰%, 약 2.3몰% 내지 2.7몰%, 약 2.5몰% 내지 3.5몰%, 약 2.5몰% 내지 2.7몰%, 약 2.9몰% 내지 3.5몰% 또는 약 2.7몰%이다. 추가적인 실시형태에서, PEG 지질의 양은 약 1.0몰% 내지 4.0몰%, 약 1.2몰% 내지 4.0몰%, 약 1.4몰% 내지 4.0몰%, 약 1.5몰% 내지 4.0몰%, 약 1.6몰% 내지 4.0몰%, 약 1.7몰% 내지 4.0몰%, 약 1.8몰% 내지 4.0몰%, 약 1.9몰% 내지 4.0몰%, 약 2.0몰% 내지 4.0몰%, 약 2.1몰% 내지 4.0몰%, 약 2.2몰% 내지 4.0몰%, 약 2.3몰% 내지 4.0몰%, 약 2.4몰% 내지 4.0몰%, 약 2.5몰% 내지 4.0몰%, 약 2.6몰% 내지 4.0몰%, 약 2.7몰% 내지 4.0몰%, 약 2.8몰% 내지 4.0몰%, 약 2.9몰% 내지 4.0몰%, 약 3.0몰% 내지 4.0몰%, 약 3.1몰% 내지 4.0몰%, 약 3.2몰% 내지 4.0몰%, 약 3.3몰% 내지 4.0몰%, 약 3.4몰% 내지 4.0몰%, 약 3.5몰% 내지 4.0몰%, 약 3.7몰% 내지 4.0몰%, 1.0몰% 내지 3.7몰%, 약 1.2몰% 내지 3.7몰%, 약 1.4몰% 내지 3.7몰%, 약 1.5몰% 내지 3.7몰%, 약 1.6몰% 내지 3.7몰%, 약 1.7몰% 내지 3.7몰%, 약 1.8몰% 내지 3.7몰%, 약 1.9몰% 내지 3.7몰%, 약 2.0몰% 내지 3.7몰%, 약 2.1몰% 내지 3.7몰%, 약 2.2몰% 내지 3.7몰%, 약 2.3몰% 내지 3.7몰%, 약 2.4몰% 내지 3.7몰%, 약 2.5몰% 내지 3.7몰%, 약 2.6몰% 내지 3.7몰%, 약 2.7몰% 내지 3.7몰%, 약 2.8몰% 내지 3.7몰%, 약 2.9몰% 내지 3.7몰%, 약 3.0몰% 내지 3.7몰%, 약 3.1몰% 내지 3.7몰%, 약 3.2몰% 내지 3.7몰%, 약 3.3몰% 내지 3.7몰%, 약 3.4몰% 내지 3.7몰%, 약 3.5몰% 내지 3.7몰%, 1.0몰% 내지 3.5몰%, 약 1.2몰% 내지 3.5몰%, 약 1.4몰% 내지 3.5몰%, 약 1.5몰% 내지 3.5몰%, 약 1.6몰% 내지 3.5몰%, 약 1.7몰% 내지 3.5몰%, 약 1.8몰% 내지 3.5몰%, 약 1.9몰% 내지 3.5몰%, 약 2.0몰% 내지 3.5몰%, 약 2.1몰% 내지 3.5몰%, 약 2.2몰% 내지 3.5몰%, 약 2.3몰% 내지 3.5몰%, 약 2.4몰% 내지 3.5몰%, 약 2.5몰% 내지 3.5몰%, 약 2.6몰% 내지 3.5몰%, 약 2.7몰% 내지 3.5몰%, 약 2.8몰% 내지 3.5몰%, 약 2.9몰% 내지 3.5몰%, 약 3.0몰% 내지 3.5몰%, 약 3.1몰% 내지 3.5몰%, 약 3.2몰% 내지 3.5몰%, 약 3.3몰% 내지 3.5몰%, 약 3.4몰% 내지 3.5몰%, 1.0몰% 내지 3.4몰%, 약 1.2몰% 내지 3.4몰%, 약 1.4몰% 내지 3.4몰%, 약 1.5몰% 내지 3.4몰%, 약 1.6몰% 내지 3.4몰%, 약 1.7몰% 내지 3.4몰%, 약 1.8몰% 내지 3.4몰%, 약 1.9몰% 내지 3.4몰%, 약 2.0몰% 내지 3.4몰%, 약 2.1몰% 내지 3.4몰%, 약 2.2몰% 내지 3.4몰%, 약 2.3몰% 내지 3.4몰%, 약 2.4몰% 내지 3.4몰%, 약 2.5몰% 내지 3.4몰%, 약 2.6몰% 내지 3.4몰%, 약 2.7몰% 내지 3.4몰%, 약 2.8몰% 내지 3.4몰%, 약 2.9몰% 내지 3.4몰%, 약 3.0몰% 내지 3.4몰%, 약 3.1몰% 내지 3.4몰%, 약 3.2몰% 내지 3.4몰%, 약 3.3몰% 내지 3.4몰%, 1.0몰% 내지 3.3몰%, 약 1.2몰% 내지 3.3몰%, 약 1.4몰% 내지 3.3몰%, 약 1.5몰% 내지 3.3몰%, 약 1.6몰% 내지 3.3몰%, 약 1.7몰% 내지 3.3몰%, 약 1.8몰% 내지 3.3몰%, 약 1.9몰% 내지 3.3몰%, 약 2.0몰% 내지 3.3몰%, 약 2.1몰% 내지 3.3몰%, 약 2.2몰% 내지 3.3몰%, 약 2.3몰% 내지 3.3몰%, 약 2.4몰% 내지 3.3몰%, 약 2.5몰% 내지 3.3몰%, 약 2.6몰% 내지 3.3몰%, 약 2.7몰% 내지 3.3몰%, 약 2.8몰% 내지 3.3몰%, 약 2.9몰% 내지 3.3몰%, 약 3.0몰% 내지 3.3몰%, 약 3.1몰% 내지 3.3몰%, 약 3.2몰% 내지 3.3몰%, 1.0몰% 내지 3.2몰%, 약 1.2몰% 내지 3.2몰%, 약 1.4몰% 내지 3.2몰%, 약 1.5몰% 내지 3.2몰%, 약 1.6몰% 내지 3.2몰%, 약 1.7몰% 내지 3.2몰%, 약 1.8몰% 내지 3.2몰%, 약 1.9몰% 내지 3.2몰%, 약 2.0몰% 내지 3.2몰%, 약 2.1몰% 내지 3.2몰%, 약 2.2몰% 내지 3.2몰%, 약 2.3몰% 내지 3.2몰%, 약 2.4몰% 내지 3.2몰%, 약 2.5몰% 내지 3.2몰%, 약 2.6몰% 내지 3.2몰%, 약 2.7몰% 내지 3.2몰%, 약 2.8몰% 내지 3.2몰%, 약 2.9몰% 내지 3.2몰%, 약 3.0몰% 내지 3.2몰%, 약 3.1몰% 내지 3.2몰%, 1.0몰% 내지 3.1몰%, 약 1.2몰% 내지 3.1몰%, 약 1.4몰% 내지 3.1몰%, 약 1.5몰% 내지 3.1몰%, 약 1.6몰% 내지 3.1몰%, 약 1.7몰% 내지 3.1몰%, 약 1.8몰% 내지 3.1몰%, 약 1.9몰% 내지 3.1몰%, 약 2.0몰% 내지 3.1몰%, 약 2.1몰% 내지 3.1몰%, 약 2.2몰% 내지 3.1몰%, 약 2.3몰% 내지 3.1몰%, 약 2.4몰% 내지 3.1몰%, 약 2.5몰% 내지 3.1몰%, 약 2.6몰% 내지 3.1몰%, 약 2.7몰% 내지 3.1몰%, 약 2.8몰% 내지 3.1몰%, 약 2.9몰% 내지 3.1몰%, 약 3.0몰% 내지 3.1몰%, 1.0몰% 내지 3.0몰%, 약 1.2몰% 내지 3.0몰%, 약 1.4몰% 내지 3.0몰%, 약 1.5몰% 내지 3.0몰%, 약 1.6몰% 내지 3.0몰%, 약 1.7몰% 내지 3.0몰%, 약 1.8몰% 내지 3.0몰%, 약 1.9몰% 내지 3.0몰%, 약 2.0몰% 내지 3.0몰%, 약 2.1몰% 내지 3.0몰%, 약 2.2몰% 내지 3.0몰%, 약 2.3몰% 내지 3.0몰%, 약 2.4몰% 내지 3.0몰%, 약 2.5몰% 내지 3.0몰%, 약 2.6몰% 내지 3.0몰%, 약 2.7몰% 내지 3.0몰%, 약 2.8몰% 내지 3.0몰%, 약 2.9몰% 내지 3.0몰%, 1.0몰% 내지 2.9몰%, 약 1.2몰% 내지 2.9몰%, 약 1.4몰% 내지 2.9몰%, 약 1.5몰% 내지 2.9몰%, 약 1.6몰% 내지 2.9몰%, 약 1.7몰% 내지 2.9몰%, 약 1.8몰% 내지 2.9몰%, 약 1.9몰% 내지 2.9몰%, 약 2.0몰% 내지 2.9몰%, 약 2.1몰% 내지 2.9몰%, 약 2.2몰% 내지 2.9몰%, 약 2.3몰% 내지 2.9몰%, 약 2.4몰% 내지 2.9몰%, 약 2.5몰% 내지 2.9몰%, 약 2.6몰% 내지 2.9몰%, 약 2.7몰% 내지 2.9몰%, 약 2.8몰% 내지 2.9몰%, 1.0몰% 내지 2.8몰%, 약 1.2몰% 내지 2.8몰%, 약 1.4몰% 내지 2.8몰%, 약 1.5몰% 내지 2.8몰%, 약 1.6몰% 내지 2.8몰%, 약 1.7몰% 내지 2.8몰%, 약 1.8몰% 내지 2.8몰%, 약 1.9몰% 내지 2.8몰%, 약 2.0몰% 내지 2.8몰%, 약 2.1몰% 내지 2.8몰%, 약 2.2몰% 내지 2.8몰%, 약 2.3몰% 내지 2.8몰%, 약 2.4몰% 내지 2.8몰%, 약 2.5몰% 내지 2.8몰%, 약 2.6몰% 내지 2.8몰%, 약 2.7몰% 내지 2.8몰%, 1.0몰% 내지 2.7몰%, 약 1.2몰% 내지 2.7몰%, 약 1.4몰% 내지 2.7몰%, 약 1.5몰% 내지 2.7몰%, 약 1.6몰% 내지 2.7몰%, 약 1.7몰% 내지 2.7몰%, 약 1.8몰% 내지 2.7몰%, 약 1.9몰% 내지 2.7몰%, 약 2.0몰% 내지 2.7몰%, 약 2.1몰% 내지 2.7몰%, 약 2.2몰% 내지 2.7몰%, 약 2.3몰% 내지 2.7몰%, 약 2.4몰% 내지 2.7몰%, 약 2.5몰% 내지 2.7몰%, 약 2.6몰% 내지 2.7몰%, 1.0몰% 내지 2.6몰%, 약 1.2몰% 내지 2.6몰%, 약 1.4몰% 내지 2.6몰%, 약 1.5몰% 내지 2.6몰%, 약 1.6몰% 내지 2.6몰%, 약 1.7몰% 내지 2.6몰%, 약 1.8몰% 내지 2.6몰%, 약 1.9몰% 내지 2.6몰%, 약 2.0몰% 내지 2.6몰%, 약 2.1몰% 내지 2.6몰%, 약 2.2몰% 내지 2.6몰%, 약 2.3몰% 내지 2.6몰%, 약 2.4몰% 내지 2.6몰%, 약 2.5몰% 내지 2.6몰%, 1.0몰% 내지 2.5몰%, 약 1.2몰% 내지 2.5몰%, 약 1.4몰% 내지 2.5몰%, 약 1.5몰% 내지 2.5몰%, 약 1.6몰% 내지 2.5몰%, 약 1.7몰% 내지 2.5몰%, 약 1.8몰% 내지 2.5몰%, 약 1.9몰% 내지 2.5몰%, 약 2.0몰% 내지 2.5몰%, 약 2.1몰% 내지 2.5몰%, 약 2.2몰% 내지 2.5몰%, 약 2.3몰% 내지 2.5몰%, 약 2.4몰% 내지 2.5몰%, 1.0몰% 내지 2.4몰%, 약 1.2몰% 내지 2.4몰%, 약 1.4몰% 내지 2.4몰%, 약 1.5몰% 내지 2.4몰%, 약 1.6몰% 내지 2.4몰%, 약 1.7몰% 내지 2.4몰%, 약 1.8몰% 내지 2.4몰%, 약 1.9몰% 내지 2.4몰%, 약 2.0몰% 내지 2.4몰%, 약 2.1몰% 내지 2.4몰%, 약 2.2몰% 내지 2.4몰%, 약 2.3몰% 내지 2.4몰%, 1.0몰% 내지 2.3몰%, 약 1.2몰% 내지 2.3몰%, 약 1.4몰% 내지 2.3몰%, 약 1.5몰% 내지 2.3몰%, 약 1.6몰% 내지 2.3몰%, 약 1.7몰% 내지 2.3몰%, 약 1.8몰% 내지 2.3몰%, 약 1.9몰% 내지 2.3몰%, 약 2.0몰% 내지 2.3몰%, 약 2.1몰% 내지 2.3몰%, 약 2.2몰% 내지 2.3몰%, 1.0몰% 내지 2.2몰%, 약 1.2몰% 내지 2.2몰%, 약 1.4몰% 내지 2.2몰%, 약 1.5몰% 내지 2.2몰%, 약 1.6몰% 내지 2.2몰%, 약 1.7몰% 내지 2.2몰%, 약 1.8몰% 내지 2.2몰%, 약 1.9몰% 내지 2.2몰%, 약 2.0몰% 내지 2.2몰%, 약 2.1몰% 내지 2.2몰%, 약 2.2몰% 내지 2.2몰%, 약 2.3몰% 내지 2.2몰%, 약 2.4몰% 내지 2.2몰%, 1.0몰% 내지 2.1몰%, 약 1.2몰% 내지 2.1몰%, 약 1.4몰% 내지 2.1몰%, 약 1.5몰% 내지 2.1몰%, 약 1.6몰% 내지 2.1몰%, 약 1.7몰% 내지 2.1몰%, 약 1.8몰% 내지 2.1몰%, 약 1.9몰% 내지 2.1몰%, 약 2.0몰% 내지 2.1몰%, 1.0몰% 내지 2.0몰%, 약 1.2몰% 내지 2.0몰%, 약 1.4몰% 내지 2.0몰%, 약 1.5몰% 내지 2.0몰%, 약 1.6몰% 내지 2.0몰%, 약 1.7몰% 내지 2.0몰%, 약 1.8몰% 내지 2.0몰%, 약 1.9몰% 내지 2.0몰%, 1.0몰% 내지 1.9몰%, 약 1.2몰% 내지 1.9몰%, 약 1.4몰% 내지 1.9몰%, 약 1.5몰% 내지 1.9몰%, 약 1.6몰% 내지 1.9몰%, 약 1.7몰% 내지 1.9몰%, 약 1.8몰% 내지 1.9몰%, 1.0몰% 내지 1.8몰%, 약 1.2몰% 내지 1.8몰%, 약 1.4몰% 내지 1.8몰%, 약 1.5몰% 내지 1.8몰%, 약 1.6몰% 내지 1.8몰%, 약 1.7몰% 내지 1.8몰%, 1.0몰% 내지 1.7몰%, 약 1.2몰% 내지 1.7몰%, 약 1.4몰% 내지 1.7몰%, 약 1.5몰% 내지 1.7몰%, 약 1.6몰% 내지 1.7몰%, 1.0몰% 내지 1.6몰%, 약 1.2몰% 내지 1.6몰%, 약 1.4몰% 내지 1.6몰%, 약 1.5몰% 내지 1.6몰%, 1.0몰% 내지 1.5몰%, 약 1.2몰% 내지 1.5몰%, 약 1.4몰% 내지 1.5몰%, 약 1.5몰% 내지 1.5몰%, 약 1.6몰% 내지 1.5몰%, 약 1.7몰% 내지 1.5몰%, 약 1.8몰% 내지 1.5몰%, 약 1.9몰% 내지 1.5몰%, 1.0몰% 내지 1.4몰%, 약 1.2몰% 내지 1.4몰% 또는 1.0몰% 내지 1.2몰%일 수 있다. 일부 실시형태에서, PEG 지질의 몰%는 약 1.5몰%, 약 1.6몰%, 약 1.7몰%, 약 1.8몰%, 약 1.9몰%, 약 2.0몰%, 약 2.1몰%, 약 2.2몰%, 약 2.3몰%, 약 2.4몰%, 약 2.5몰%, 약 2.6몰%, 약 2.7몰%, 약 2.8몰%, 약 2.9몰%, 약 3.0몰%, 약 3.1몰%, 약 3.2몰%, 약 3.3몰%, 약 3.4몰% 또는 약 3.5몰%일 수 있다. 일부 실시형태에서, 지질 성분에 대한 PEG 지질 몰%는 명시된 공칭 또는 실제 PEG 지질 몰%의 ±30%, ±25%, ±20%, ±15%, ±10%, ±5% 또는 ±2.5%일 것이다. 일부 실시형태에서, 지질 성분에 대한 PEG 지질 몰%는 명시된 공칭 또는 실제 몰%의 ±4몰%, ±3몰%, ±2몰%, ±1.5몰%, ±1몰%, ±0.5몰% 또는 ±0.25몰%일 것이다. 소정의 실시형태에서, LNP 로트간 변동성은 15% 미만, 10% 미만 또는 5% 미만일 것이다. 일부 실시형태에서, 몰% 수치는 공칭 농도를 기준으로 한다. 일부 실시형태에서, 몰% 수치는 실제 농도를 기준으로 한다.
소정의 실시형태에서, 헬퍼 지질의 양은 약 30몰% 내지 40몰%이고, PEG 지질의 양은 약 2.5몰% 내지 3.5몰%이고; 헬퍼 지질의 양은 약 33몰% 내지 37몰%이고, PEG 지질의 양은 약 2.9몰% 내지 3.3몰%이거나; 또는 헬퍼 지질의 양은 약 35몰%이고, PEG 지질의 양은 약 3몰%이다. 소정의 실시형태에서, 헬퍼 지질의 양은 약 37몰% 내지 47몰%이고, PEG 지질의 양은 약 2.0몰% 내지 3.0몰%이고; 헬퍼 지질의 양은 약 40몰% 내지 45몰%이고, PEG 지질의 양은 약 2.2몰% 내지 2.8몰%이거나; 또는 헬퍼 지질의 양은 약 42몰%이고, PEG 지질의 양은 약 2.2몰% 내지 2.8몰%이다. 소정의 실시형태에서, 헬퍼 지질의 양은 약 47몰% 내지 57몰%이고, PEG 지질의 양은 약 2.0몰% 내지 3.0몰%이고; 헬퍼 지질의 양은 약 50몰% 내지 55몰%이고, PEG 지질의 양은 약 2.3몰% 내지 2.7몰%이거나; 또는 헬퍼 지질의 양은 약 52몰%이고, PEG 지질의 양은 약 2.3몰% 내지 2.7몰%이다.
소정의 실시형태에서, LNP 조성물과 같은 지질 조성물은 지질 성분 및 핵산 성분(수성 성분으로도 지칭됨), 예를 들어, RNA 성분을 포함하며, 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물 대 핵산의 몰비가 측정될 수 있다. 본 개시내용의 실시형태는 또한 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염의 양으로 하전된 아민기(N)와 캡슐화될 핵산의 음으로 하전된 포스페이트기(P) 사이에 정의된 몰비를 갖는 지질 조성물을 제공한다. 이는 방정식 N/P로 수학적으로 나타낼 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물과 같은 지질 조성물은 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염; 및 핵산 성분을 포함하는 지질 성분을 포함할 수 있되, N/P 비는 약 3 내지 10이다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염; 및 RNA 성분을 포함하는 지질 성분을 포함할 수 있되, N/P 비는 약 3 내지 10이다. 예를 들어, N/P 비는 약 4 내지 7, 약 5 내지 7 또는 약 6 내지 7일 수 있다. 일부 실시형태에서, N/P 비는 약 6, 예를 들어, 6±1 또는 6±0.5일 수 있다. 일부 실시형태에서, N/P 비는 약 7, 예를 들어, 7±1 또는 7±0.5일 수 있다.
일부 실시형태에서, 수성 성분은 생물학적 활성제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수성 성분은 선택적으로 핵산과 조합된 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수성 성분은 RNA와 같은 핵산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수성 성분은 핵산 성분이다. 일부 실시형태에서, 핵산 성분은 DNA를 포함하며, 이는 DNA 성분으로 불릴 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산 성분은 RNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA 성분과 같은 수성 성분은 RNA-가이드된 DNA-결합제를 암호화하는 mRNA와 같은 mRNA를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 Cas 뉴클레이스이다. 소정의 실시형태에서, 수성 성분은 Cas9와 같은 Cas 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA를 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 생물학적 활성제는 Cas 뉴클레이스 mRNA이다. 소정의 실시형태에서, 생물학적 활성제는 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA이다. 소정의 실시형태에서, 생물학적 활성제는 Cas9 뉴클레이스 mRNA이다. 소정의 실시형태에서, 수성 성분은 변형된 RNA를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 수성 성분은 가이드 RNA 핵산을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 수성 성분은 gRNA를 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 수성 성분은 dgRNA를 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 수성 성분은 변형된 gRNA를 포함할 수 있다. RNA-가이드된 DNA-결합제를 암호화하는 mRNA를 포함하는 일부 조성물에서, 조성물은 gRNA와 같은 gRNA 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 수성 성분은 RNA-가이드된 DNA-결합제 및 gRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수성 성분은 Cas 뉴클레이스 mRNA 및 gRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 수성 성분은 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA 및 gRNA를 포함한다.
소정의 실시형태에서, LNP 조성물과 같은 지질 조성물은 클래스 2 Cas 뉴클레이스와 같은 Cas 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA, 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 헬퍼 지질, 선택적으로 중성 지질 및 PEG 지질을 포함할 수 있다. 클래스 2 Cas 뉴클레이스와 같은 Cas 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA를 포함하는 소정의 조성물에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. 클래스 2 Cas 뉴클레이스와 같은 Cas 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA를 포함하는 다른 조성물에서, 중성 지질은 DSPC이다. 클래스 2 Cas 뉴클레이스와 같은 Cas 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA를 포함하는 추가적인 실시형태에서, 예를 들어, Cas9, PEG 지질은 PEG2k-DMG이다. 클래스 2 Cas 뉴클레이스와 같은 Cas 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA 및 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 특정 조성물에서. 소정의 조성물에서, 조성물은 dgRNA 또는 sgRNA와 같은 gRNA를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, LNP 조성물과 같은 지질 조성물은 gRNA를 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 조성물은 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, gRNA, 헬퍼 지질, 선택적으로 중성 지질 및 PEG 지질을 포함할 수 있다. gRNA를 포함하는 소정의 LNP 조성물에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. gRNA를 포함하는 일부 조성물에서, 중성 지질은 DSPC이다. gRNA를 포함하는 추가적인 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-DMG이다. 소정의 조성물에서, gRNA는 dgRNA 및 sgRNA로부터 선택된다.
소정의 실시형태에서, LNP 조성물과 같은 지질 조성물은 수성 성분 중 RNA-가이드된 DNA-결합제를 암호화하는 mRNA와 sgRNA일 수 있는 gRNA 및 지질 성분 중 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물을 포함한다. 예를 들어, LNP 조성물은 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, Cas 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA, gRNA, 헬퍼 지질, 중성 지질 및 PEG 지질을 포함할 수 있다. Cas 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA 및 gRNA를 포함하는 소정의 조성물에서, 헬퍼 지질은 콜레스테롤이다. Cas 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA 및 gRNA를 포함하는 일부 조성물에서, 중성 지질은 DSPC이다. Cas 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA 및 gRNA를 포함하는 추가적인 실시형태에서, PEG 지질은 PEG2k-DMG이다.
소정의 실시형태에서, LNP 조성물과 같은 지질 조성물은 클래스 2 Cas mRNA와 같은 RNA-가이드된 DNA-결합제 및 적어도 하나의 gRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 sgRNA이다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 Cas9 mRNA이다. 소정의 실시형태에서, LNP 조성물은 약 1:1 또는 약 1:2의 gRNA 대 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA와 같은 RNA-가이드된 DNA-결합제 mRNA의 비를 포함한다. 일부 실시형태에서, 중량 기준으로 비는 중량 기준으로 약 25:1 내지 약 1:25, 약 10:1 내지 약 1:10, 약 8:1 내지 약 1:8, 약 4:1 내지 약 1:4, 약 2:1 내지 약 1:2, 약 2:1 내지 1:4 또는 약 1:1 내지 약 1:2이다.
LNP 조성물과 같은 본 명세서에 개시된 지질 조성물은 CRISPR/Cas9 성분을 전달하여 주형 핵산, 예를 들어, DNA 주형을 삽입하기 위해 본 명세서에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 주형 핵산은 화학식 (I) 또는 (II)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 지질 조성물과 별도로 전달될 수 있다. 일부 실시형태에서, 주형 핵산은 목적하는 복구 메커니즘에 따라 단일- 또는 이중-가닥일 수 있다. 주형은, 예를 들어, 표적 DNA 서열 내 및/또는 표적 DNA에 인접한 서열에 표적 DNA와 상동인 영역을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, LNP 조성물은 수성 RNA 용액과 유기 용매-기반 지질 용액을 혼합함으로써 형성된다. 적합한 용액 또는 용매는 물, PBS, Tris 완충액, NaCl, 시트레이트 완충액, 아세테이트 완충액, 에탄올, 클로로폼, 다이에틸에터, 사이클로헥세인, 테트라하이드로퓨란, 메탄올, 아이소프로판올을 포함하거나 또는 함유할 수 있다. 예를 들어, 유기 용매는 100% 에탄올일 수 있다. 예를 들어, LNP 조성물의 생체내 투여를 위한 약제학적으로 허용 가능한 완충액이 사용될 수 있다. 소정의 실시형태에서, LNP를 포함하는 조성물의 pH를 pH 6.5 이상으로 유지하기 위해 완충액이 사용된다. 소정의 실시형태에서, LNP를 포함하는 조성물의 pH를 pH 7.0 이상으로 유지하기 위해 완충액이 사용된다. 소정의 실시형태에서, 조성물은 약 7.2 내지 약 7.7 범위의 pH를 갖는다. 추가적인 실시형태에서, 조성물은 약 7.3 내지 약 7.7 범위 또는 약 7.4 내지 약 7.6 범위의 pH를 갖는다. 추가 실시형태에서, 조성물은 약 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6 또는 7.7의 pH를 갖는다. 조성물의 pH는 마이크로 pH 프로브로 측정될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 동결 방지제가 조성물에 포함된다. 동결 방지제의 비제한적인 예는 수크로스, 트레할로스, 글리세롤, DMSO 및 에틸렌 글리콜을 포함한다. 예시적인 조성물은, 예를 들어, 수크로스와 같은 최대 10%의 동결 방지제를 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 조성물은 트리스 식염수 수크로스(tris saline sucrose: TSS)를 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, LNP 조성물은 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%의 동결 방지제를 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, LNP 조성물은 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%의 수크로스를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 완충액을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 완충액은 포스페이트 완충액(PBS), Tris 완충액, 시트레이트 완충액 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 소정의 예시적인 실시형태에서, 완충액은 NaCl을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 완충액은 NaCl이 없다. NaCl의 예시적인 양은 약 20mM 내지 약 45mM의 범위일 수 있다. NaCl의 예시적인 양은 약 40mM 내지 약 50mM의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, NaCl의 양은 약 45mM이다. 일부 실시형태에서, 완충액은 Tris 완충액이다. Tris의 예시적인 양은 약 20mM 내지 약 60mM의 범위일 수 있다. Tris의 예시적인 양은 약 40mM 내지 약 60mM의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, Tris의 양은 약 50mM이다. 일부 실시형태에서, 완충액은 NaCl 및 Tris를 포함한다. LNP 조성물의 소정의 예시적인 실시형태는 Tris 완충액 중 5% 수크로스 및 45mM NaCl을 포함한다. 다른 예시적인 실시형태에서, 조성물은 pH 7.5에서 약 5% w/v 양의 수크로스, 약 45mM NaCl 및 약 50mM Tris를 포함한다. 염, 완충액 및 동결 방지제의 양은 전체 조성물의 삼투질 농도가 유지되도록 다양할 수 있다. 예를 들어, 최종 삼투질 농도는 450 mOsm/ℓ 미만으로 유지될 수 있다. 추가 실시형태에서, 삼투질 농도는 350 mOsm/ℓ 내지 250 mOsm/ℓ이다. 소정의 실시형태는 300±20 mOsm/ℓ 또는 310±40 mOsm/ℓ의 최종 삼투질 농도를 갖는다.
일부 실시형태에서, 유기 용매 내에서 수성 RNA 용액 및 지질 용액의 미세유체 혼합, T-혼합 또는 교차-혼합이 사용된다. 소정의 양태에서, 유속, 접합 크기, 접합 기하학, 접합 모양, 튜브 직경, 용액 및/또는 RNA 및 지질 농도는 다양할 수 있다. LNP 또는 LNP 조성물은, 예를 들어, 투석, 원심분리 필터, 접선 유동 여과 또는 크로마토그래피를 통해 농축되거나 또는 정제될 수 있다. LNP 조성물은, 예를 들어, 현탁액, 에멀션 또는 동결건조된 분말로 보관될 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 2℃ 내지 8℃에서 보관되며, 소정의 양태에서, LNP 조성물은 실온에서 보관된다. 추가적인 실시형태에서, LNP 조성물은, 예를 들어, -20℃ 또는 -80℃에서 동결 보존된다. 다른 실시형태에서, LNP 조성물은 약 0℃ 내지 약 -80℃ 범위의 온도에서 보관된다. 동결된 LNP 조성물은 사용 전, 예를 들어, 얼음 위에서, 실온에서 또는 25℃에서 해동될 수 있다.
LNP 조성물과 같은 바람직한 지질 조성물은, 예를 들어, 치료학적 유효 용량에서 생체내에서 세포독성 수준으로 축적되지 않는다는 점에서 생분해성이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 치료적 용량 수준에서 실질적인 부작용을 초래하는 선천적 면역 반응을 일으키지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물은 치료적 용량 수준에서 독성을 일으키지 않는다.
일부 실시형태에서, LNP 조성물 중 LNP의 농도는 약 1 ㎍/㎖ 내지 10 ㎍/㎖, 약 2 ㎍/㎖ 내지 10 ㎍/㎖, 약 2.5 ㎍/㎖ 내지 10 ㎍/㎖, 약 1 ㎍/㎖ 내지 5 ㎍/㎖, 약 2 ㎍/㎖ 내지 5 ㎍/㎖, 약 2.5 ㎍/㎖ 내지 5 ㎍/㎖, 약 0.04 ㎍/㎖, 약 0.08 ㎍/㎖, 약 0.16 ㎍/㎖, 약 0.25 ㎍/㎖, 약 0.63 ㎍/㎖, 약 1.25 ㎍/㎖, 약 2.5 ㎍/㎖ 또는 약 5 ㎍/㎖이다.
일부 실시형태에서, 동적 광산란(Dynamic Light Scattering: "DLS")은 본 개시내용의 LNP의 다분산 지수(PDI) 및 크기를 특성화하는 데 사용될 수 있다. DLS는 샘플을 광원에 적용함으로써 발생하는 빛의 산란을 측정한다. DLS 측정으로부터 결정된 PDI는 PDI가 0인 완벽하게 균일한 집단을 갖는 집단의 입자 크기 분포(약 평균 입자 크기)를 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 LNP는 약 0.005 내지 약 0.75의 PDI를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 LNP는 약 0.005 내지 약 0.1의 PDI를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 LNP는 약 0.005 내지 약 0.09, 약 0.005 내지 약 0.08, 약 0.005 내지 약 0.07 또는 약 0.006 내지 약 0.05의 PDI를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 0.01 내지 약 0.5의 PDI를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 0 내지 약 0.4의 PDI를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 0 내지 약 0.35의 PDI를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP PDI는 약 0 내지 약 0.3의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 0 내지 약 0.25 범위의 PDI를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP PDI는 약 0 내지 약 0.2의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 0 내지 약 0.05의 PDI를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 0 내지 약 0.01의 PDI를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 0.01, 약 0.02, 약 0.05, 약 0.08, 약 0.1, 약 0.15, 약 0.2 또는 약 0.4 미만의 PDI를 갖는다.
LNP 크기는 당업계에 공지된 다양한 분석적 방법에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP 크기는 비대칭-흐름장 흐름 분획법 - 다중 각도 광산란법(Asymetric-Flow Field Flow Fractionation - Multi-Angle Light Scattering: AF4-MALS)을 사용하여 측정될 수 있다. 소정의 실시형태에서, LNP 크기는 조성물 내 입자를 유체역학적 반경으로 분리한 후, 분별된 입자의 분자량, 유체역학적 반경 및 제곱 평균 제곱근 반경을 측정함으로써 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP 크기 및 입자 농도는 나노입자 추적 분석(nanoparticle tracking analysis: NTA, Malvern Nanosight)에 의해 측정될 수 있다. 소정의 실시형태에서, LNP 샘플은 적절하게 희석되어 현미경 슬라이드에 주입된다. 카메라는 입자가 시야를 통해 천천히 주입될 때 산란된 빛을 기록한다. 동영상이 캡처된 후, 나노입자 추적 분석은 픽셀을 추적하고 확산 계수를 계산함으로써 동영상을 처리한다. 이 확산 계수는 입자의 유체역학적 반경으로 변환될 수 있다. 이러한 방법은 또한 입자 농도를 제공하기 위해 개별 입자의 수를 계산할 수 있다. 일부 실시형태에서, LNP 크기, 형태 및 구조적 특징은 저온 전자현미경(cryo-electron microscopy: "cryo-EM")에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에 개시된 LNP 조성물의 LNP는 약 1㎚ 내지 약 250㎚의 크기(예를 들어, Z-평균 직경 또는 수-평균 직경)를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 10㎚ 내지 약 200㎚의 크기를 갖는다. 추가 실시형태에서, LNP는 약 20㎚ 내지 약 150㎚의 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 50㎚ 내지 약 150㎚ 또는 약 70㎚ 내지 130㎚의 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 50㎚ 내지 약 100㎚의 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 50㎚ 내지 약 120㎚의 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 60㎚ 내지 약 100㎚의 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 75㎚ 내지 약 150㎚의 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 75㎚ 내지 약 120㎚의 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 75㎚ 내지 약 100㎚의 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 50㎚ 내지 약 145㎚, 약 50㎚ 내지 약 120㎚, 약 50㎚ 내지 약 120㎚, 약 50㎚ 내지 약 115㎚, 약 50㎚ 내지 약 100㎚, 약 60㎚ 내지 약 145㎚, 약 60㎚ 내지 약 120㎚, 약 60㎚ 내지 약 115㎚ 또는 약 60㎚ 내지 약 100㎚의 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 145㎚ 미만, 약 120㎚ 미만, 약 115㎚ 미만, 약 100㎚ 미만 또는 약 80㎚ 미만의 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, LNP는 약 50㎚ 초과 또는 약 60㎚ 초과의 크기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 입자 크기는 Z-평균 입자 크기이다. 일부 실시형태에서, 입자 크기는 수-평균 입자 크기이다. 일부 실시형태에서, 입자 크기는 개별 LNP의 크기이다. 달리 명시하지 않는 한, 본 명세서에 언급된 모든 크기는 Malvern Zetasizer 또는 Wyatt NanoStar에서 동적 광산란에 의해 측정된 완전히 형성된 나노입자의 평균 크기(직경)이다. 나노입자 샘플은 인산 완충 식염수(PBS)에 희석되어 계수율이 대략 200kcp 내지 400kcp가 된다.
일부 실시형태에서, LNP 조성물은 약 50% 내지 약 100% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 약 50% 내지 약 95% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 약 70% 내지 약 90% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 약 90% 내지 약 100% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 약 75% 내지 약 95% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 약 90% 내지 약 100% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 약 95% 내지 약 100% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 약 98% 내지 약 100% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다. 일부 실시형태에서, LNP 조성물은 약 99% 내지 약 100% 범위의 평균 캡슐화 효율로 형성된다.
카고
본 명세서에 기재된 LNP 조성물을 통해 전달된 카고는 생물학적 활성제를 포함한다. 생물학적 활성제는 mRNA 또는 gRNA와 같은 핵산일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 카고는 하나 이상의 생물학적 활성제, 예컨대, mRNA, gRNA, 발현 벡터, RNA-가이드된 DNA-결합제, 항체(예를 들어,, 단일클론, 키메라, 인간화된, 나노바디 및 이의 단편 등), 콜레스테롤, 호르몬, 펩타이드, 단백질, 화학치료제 및 다른 유형의 항신생물제, 저분자량 약물, 바이타민, 보조인자, 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 효소 핵산, 안티센스 핵산, 삼중체 형성 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 DNA 또는 RNA 조성물, 키메라 DNA:RNA 조성물, 알로자임, 압타머, 리보자임, 데코이 및 이의 유사체, 플라스미드 및 다른 유형의 벡터 및 소형 핵산 분자, RNAi 작용제, 짧은 간섭 핵산(siNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 이중-가닥 RNA(dsRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 및 "자가-복제 RNA"(복제 효소 활성을 암호화하고 생체내에서 자체 복제 또는 증폭을 지시할 수 있음) 분자, 펩타이드 핵산(PNA), 잠금 핵산 리보뉴클레오타이드(LNA), 모폴리노 뉴클레오타이드, 트레오스 핵산(TNA), 글리콜 핵산(GNA), sisiRNA(내부적으로 분할된 소형 간섭 RNA) 및 iRNA(비대칭 간섭 RNA)이거나 또는 이들을 포함한다. 생물학적 활성제의 상기 목록은 예시일 뿐이며 제한하려는 의도는 아니다. 이러한 화합물은 정제되거나 또는 부분적으로 정제될 수 있고, 자연 발생적이거나 또는 합성일 수 있으며, 화학적으로 변형될 수 있다.
LNP 조성물을 통해 전달된 카고는 관심 단백질을 암호화하는 mRNA 분자와 같은 RNA일 수 있다. 예를 들어, 녹색 형광 단백질(GFP), RNA-가이드된 DNA-결합제 또는 Cas 뉴클레이스와 같은 단백질을 발현하기 위한 mRNA가 포함된다. Cas9 또는 Cpf1(Cas12a로도 지칭됨) 단백질과 같은 클래스 2 Cas 뉴클레이스의 세포에서 발현을 가능하게 하는 Cas 뉴클레이스 mRNA, 예를 들어, 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA를 포함하는 LNP 조성물이 제공된다. 또한, 카고는 하나 이상의 gRNA 또는 gRNA를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 복구 또는 재조합을 위한 주형 핵산이 또한 조성물에 포함될 수 있거나, 또는 주형 핵산은 본 명세서에 기재된 방법에 사용될 수 있다. 하위 실시형태에서, 카고는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9를 암호화하는 mRNA, 선택적으로 S. 피오게네스 gRNA를 포함한다. 추가 하위 실시형태에서, 카고는 네이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis) Cas9를 암호화하는 mRNA, 선택적으로 Nme(네이세리아 메닌지티디스) gRNA를 포함한다.
"mRNA"는 폴리뉴클레오타이드를 지칭하며, 폴리펩타이드로 번역될 수 있는(즉, 리보솜 및 아미노-아실화된 tRNA에 의한 번역을 위한 기질의 역할을 할 수 있음) 오픈 리딩 프레임을 포함한다. mRNA는 리보스 잔기 또는 이의 유사체, 예를 들어, 2'-메톡시 리보스 잔기를 포함하는 포스페이트-당 백본을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, mRNA 포스페이트-당 백본의 당은 리보스 잔기, 2'-메톡시 리보스 잔기 또는 이들의 조합으로 본질적으로 이루어진다. 일반적으로, mRNA는 상당량의 티미딘 잔기를 포함하지 않는다(예를 들어, 0개의 잔기 또는 30개, 20개, 10개, 5개, 4개, 3개 또는 2개 미만의 티미딘 잔기; 또는 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2% 또는 0.1% 미만의 티미딘 함량). mRNA는 우리딘 위치의 일부 또는 전부에 변형된 우리딘을 포함할 수 있다.
게놈 편집 도구
일부 실시형태에서, LNP 조성물은 지질 핵산 조성물로도 지칭되는 지질 핵산 어셈블리이다. 일부 실시형태에서, 지질 핵산 조성물 또는 LNP 조성물은 게놈 편집 도구 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "게놈 편집 도구"(또는 "유전자 편집 도구")는 세포 게놈의 편집을 생성하는 데 필요하거나 또는 도움이 되는 "게놈 편집 시스템"(또는 "유전자 편집 시스템")의 임의의 구성요소이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 게놈 편집 시스템(예를 들어, 아연 핑거 뉴클레이스 시스템, TALEN 시스템, 메가뉴클레이스 시스템 또는 CRISPR/Cas 시스템)의 게놈 편집 도구를 세포(또는 세포 집단)에 전달하는 방법을 제공한다. 게놈 편집 도구는, 예를 들어, 세포의 DNA 또는 RNA, 예를 들어, 세포의 게놈에서 단일 또는 이중 가닥 절단을 만들 수 있는 뉴클레이스를 포함한다. 게놈 편집 도구, 예를 들어, 뉴클레이스는 선택적으로 핵산 또는 닉케이스를 절단하지 않고 세포의 게놈을 변형시킬 수 있다. 게놈 편집 뉴클레이스 또는 닉케이스는 mRNA에 의해 암호화될 수 있다. 이러한 뉴클레이스는, 예를 들어, RNA-가이드된 DNA 결합제 및 CRISPR/Cas 성분을 포함한다. 게놈 편집 도구는, 예를 들어, 편집기 도메인과 같은 효과기 도메인에 융합된 닉케이스를 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 게놈 편집 도구는, 예를 들어, 가이드 RNA, sgRNA, dgRNA, 공여자 핵산 등과 같은 게놈 편집의 목표를 달성하는 데 필요하거나 또는 도움이 되는 임의의 항목을 포함한다.
CRISPR/Cas 시스템; 아연 핑거 뉴클레이스(ZFN) 시스템; 및 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레이스(TALEN) 시스템을 포함하지만 이에 제한되지 않는 지질 핵산 어셈블리 조성물과 함께 전달하기 위한 게놈 편집 도구를 포함하는 다양한 적합한 유전자 편집 시스템이 본 명세서에 기재된다. 일반적으로, 유전자 편집 시스템은 표적 DNA 서열에서 이중 가닥 절단(DSB) 또는 닉(예를 들어, 단일 가닥 절단 또는 SSB)을 유도하기 위해 조작된 절단 시스템의 사용을 포함한다. 절단 또는 닉킹(nicking)은 조작된 ZFN, TALEN과 같은 특정 뉴클레이스의 사용을 통해 또는 조작된 가이드 RNA와 함께 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 표적 DNA 서열의 특정 절단 또는 닉킹을 가이드함으로써 발생할 수 있다. 또한, 표적화된 뉴클레이스는 아르고노트 시스템에 기초하여 개발되고 있으며(예를 들어, T. 써모필루스로부터 유래되고 'TtAgo'로 알려짐, 문헌[Swarts et al (2014) Nature 507(7491): 258-261] 참조), 이는 또한 게놈 편집 및 유전자 요법에도 사용될 가능성이 있다.
소정의 실시형태에서, 개시된 조성물은 DNA 절단제와 같은 하나 이상의 DNA 변형제를 포함한다. 다양한 DNA 변형제가 본 명세서에 기재된 LNP 조성물에 포함될 수 있다. 예를 들어, DNA 변형제는 뉴클레이스(서열-특이적 및 비특이적 모두), 토포아이소머레이스, 메틸레이스, 아세틸레이스, 화학물질, 약 및 다른 작용제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 주어진 DNA 서열 또는 서열 세트에 결합하는 단백질은 가닥 절단과 같은 DNA 변형을 유도하는 데 사용될 수 있다. 단백질은 방사성 붕괴로 인해 가닥 절단이 일어날 수 있는 125I의 혼입 또는 자외선에 노출되어 DNA와 가교를 형성하는 4-아지도페나실브로마이드와 같은 가교 시약을 변형시키는 것과 같은 다양한 수단에 의해 변형될 수 있다. 이러한 단백질-DNA 가교는 이후 피페리딘 처리에 의해 이중-가닥 DNA 절단으로 전환될 수 있다. DNA 변형에 대한 또 다른 접근법은 전사 인자 또는 구조적 염색질 단백질과 같은 하나 이상의 DNA 부위에 결합된 특정 단백질에 대해 생성된 항체를 포함하며, 핵단백질 복합체로부터 DNA를 단리하는 데 사용된다.
소정의 실시형태에서, 개시된 조성물은 하나 이상의 DNA 절단제를 포함한다. DNA 절단제는 아연-핑거 뉴클레이스(ZFN), 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레이스(TALEN), mito-TALEN 및 메가뉴클레이스 시스템과 같은 기술을 포함한다. TALEN 및 ZFN 기술은 특정 게놈 유전자좌에서 표적화된 DNA 이중-가닥 절단(DSB)을 유도하기 위해 엔도뉴클레이스 촉매 도메인을 모듈형 DNA 결합 단백질에 연결하는 전략을 사용한다. 추가적인 DNA 절단제는 소형 간섭 RNA, 마이크로 RNA, 항-마이크로RNA, 길항제, 소형 헤어핀 RNA 및 압타머(RNA, DNA 또는 펩타이드 기반(아피머 포함))를 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전자 편집 시스템은 TALEN 시스템이다. 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레이스(TALEN)는 DNA의 특정 서열을 절단하도록 조작될 수 있는 제한 효소이다. 이들은 TAL 효과기 DNA-결합 도메인을 DNA 절단 도메인(DNA 가닥을 절단하는 뉴클레이스)에 융합함으로써 만들어진다. 전사 활성화제-유사 효과기(TALE)는 목적하는 DNA 서열에 결합하고 특정 위치에서 DNA 절단을 촉진하도록 조작될 수 있다(예를 들어, 문헌[Boch, 2011, Nature Biotech] 참조). 제한 효소는 유전자 편집 또는 조작된 뉴클레이스를 사용한 게놈 편집으로 알려진 기법인 현장 게놈 편집에 사용하기 위해 세포에 도입될 수 있다. 이에 사용하기 위한 이러한 방법 및 조성물은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 전체 내용이 본 명세서에 원용되어 있는 WO2019147805, WO2014040370, WO2018073393을 참조한다.
일부 실시형태에서, 유전자 편집 시스템은 아연-핑거 시스템이다. 아연-핑거 뉴클레이스(ZFN)는 아연 핑거 DNA-결합 도메인을 DNA-절단 도메인에 융합시킴으로써 생성된 인공 제한 효소이다. 아연 핑거 도메인은 아연-핑거 뉴클레이스가 복잡한 게놈 내의 고유한 서열을 표적으로 할 수 있도록 특정 목적하는 DNA 서열을 표적화하도록 조작될 수 있다. 유형 II 제한 엔도뉴클레이스 FokI로부터의 비특이적 절단 도메인은 전형적으로 ZFN에서 절단 도메인으로 사용된다. 절단은 내인성 DNA 복구 기구에 의해 복구되어, ZFN이 고등 유기체의 게놈을 정확하게 변경할 수 있게 한다. 이에 사용하기 위한 이러한 방법 및 조성물은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 전체 내용이 본 명세서에 원용되어 있는 WO2011091324를 참조한다.
바람직한 실시형태에서, 개시된 조성물은 Cas 뉴클레이스와 같은 RNA-가이드된 DNA-결합제를 암호화하는 mRNA를 포함한다. 특정 실시형태에서, 개시된 조성물은 S. 피오게네스 Cas9와 같은 클래스 2 Cas 뉴클레이스를 암호화하는 mRNA를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "RNA-가이드된 DNA-결합제"는 RNA 및 DNA-결합 활성을 갖는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체 또는 이러한 복합체의 DNA-결합 서브유닛을 의미하되, DNA-결합 활성은 서열-특이적이며, RNA의 서열에 따라 달라진다. 예시적인 RNA-가이드된 DNA-결합제는 Cas 절단효소/닉케이스 및 이의 불활성화된 형태("dCas DNA-결합제")를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 "Cas 뉴클레이스"는 Cas 절단효소, Cas 닉케이스 및 dCas DNA-결합제를 포함한다. Cas 절단효소/닉케이스 및 dCas DNA-결합제는 유형 III CRISPR 시스템의 Csm 또는 Cmr 복합체, 이의 Cas10, Csm1 또는 Cmr2 서브유닛, 유형 I CRISPR 시스템의 캐스케이드 복합체, 이의 Cas3 서브유닛 및 클래스 2 Cas 뉴클레이스를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "클래스 2 Cas 뉴클레이스"는 RNA-가이드된 DNA-결합 활성을 갖는 단일-사슬 폴리펩타이드이다. 클래스 2 Cas 뉴클레이스는 RNA-가이드된 DNA 절단효소 또는 닉케이스 활성을 추가로 갖는 클래스 2 Cas 절단효소/닉케이스(예를 들어, H840A, D10A 또는 N863A 변이체) 및 절단효소/닉케이스 활성이 불활성화된 클래스 2 dCas DNA-결합제를 포함한다. 본 명세서에 기재된 LNP 조성물과 함께 사용될 수 있는 클래스 2 Cas 뉴클레이스는, 예를 들어, Cas9, Cpf1, C2c1, C2c2, C2c3, HF Cas9(예를 들어, N497A, R661A, Q695A, Q926A 변이체), HypaCas9(예를 들어, N692A, M694A, Q695A, H698A 변이체), eSPCas9(1.0)(예를 들어, K810A, K1003A, R1060A 변이체) 및 eSPCas9(1.1)(예를 들어, K848A, K1003A, R1060A 변이체) 단백질 및 이들의 변형을 포함한다. Cpf1 단백질(Zetsche et al., Cell, 163: 1-13 (2015))은 Cas9와 상동성이고 RuvC-유사 뉴클레이스 도메인을 포함한다. Zetsche의 Cpf1 서열은 전체가 참조에 의해 원용된다. 예를 들어, Zetsche, 표 2 및 표 4를 참조한다. 예를 들어, 문헌[Zetsche]의 표 2 및 표 4를 참조한다. 예를 들어, 문헌[Makarova et al., Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015); Shmakov et al., Molecular Cell, 60:385-397 (2015)]을 참조한다.
Cas 뉴클레이스가 유래될 수 있는 비제한적인 예시적인 종은 스트렙토코커스 피오게네스, 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 종, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 인노쿠아(Listeria innocua), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida), 올리넬라 석시노게네스(Wolinella succinogenes), 수테렐라 와즈워텐시스(Sutterella wadsworthensis), 감마프로테오박테리움(Gammaproteobacterium), 네이세리아 메닌지티디스, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 파스퇴렐라 멀토시다(Pasteurella multocida), 피브로박터 석시노겐(Fibrobacter succinogene), 로도스피릴룸 루브룸(Rhodospirillum rubrum), 노카르디옵시스 다손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티나에스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스, 스트렙토스포란지움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포란지움 로세움, 알리시클로바실러스 아시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius), 바실러스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실러스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실러스 델브루키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 부크네리(Lactobacillus buchneri), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 마이크로실라 마리나(Microscilla marina), 부크홀데리알레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 종, 크로코스파에라 와트소니이(Crocosphaera watsonii), 사이아노테세 종(Cyanothece sp.), 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 시네코코커스 종(Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시이(Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시럽토 벡시이(Caldicelulosiruptor becscii), 칸디다투스 데설포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 써모필루스(Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨룸 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 아시디티오바실러스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 아시디티오바실러스 페록시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 종(Marinobacter sp.), 니트로소코커스 할로필루스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코커스 와트소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로모나스 할로플랑크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박터 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나바에나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스톡 종(Nostoc sp.), 아트로스피라 막시마(Arthrospira maxima), 아트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아트로스피라 종(Arthrospira sp.), 링비아 종(Lyngbya sp.), 마이크로콜레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 종(Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus), 스트렙토코커스 파스퇴리아누스(Streptococcus pasteurianus), 네이세리아 시네레아(Neisseria cinerea), 캄필로박터 라리(Campylobacter lari), 파르비바쿨룸 라바멘티보란스(Parvibaculum lavamentivorans), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 아시다미노코커스 종(Acidaminococcus sp.), 라크노스피라세아에 박테리움(Lachnospiraceae bacterium) ND2006 및 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina)를 포함한다.
일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 Cas9 뉴클레이스이다. 다른 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 스트렙토코커스 써모필루스로부터의 Cas9 뉴클레이스이다. 또 다른 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 네이세리아 메닌지티디스로부터의 Cas9 뉴클레이스이다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 스타필로코커스 아우레우스로부터의 Cas9 뉴클레이스이다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 프란시셀라 노비시다로부터의 Cpf1 뉴클레이스이다. 다른 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 아시다미노코커스 종으로부터의 Cpf1 뉴클레이스이다. 또 다른 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 라크노스피라세아에 박테리움 ND2006으로부터의 Cpf1 뉴클레이스이다. 추가 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis), 라크노스피라세아에 박테리움, 부티리비브리오 프로테오칼라스티쿠스(Butyrivibrio proteoclasticus), 페레그리니박테리아 박테리움(Peregrinibacteria bacterium), 파르쿠박테리아 박테리움(Parcubacteria bacterium), 스미텔라(Smithella), 아시다미노코커스, 칸디다투스 메타노플라스마 테르미툼(Candidatus Methanoplasma termitum), 에우박테리움 엘리겐스(Eubacterium eligens), 모락셀라 보보쿨리(Moraxella bovoculi), 렙토스피라 이나다이(Leptospira inadai), 포르피로모나스 크레비오리카니스(Porphyromonas crevioricanis), 프레보텔라 디시엔스(Prevotella disiens) 또는 포르피로모나스 마카카에(Porphyromonas macacae)로부터의 Cpf1 뉴클레이스이다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 아시다미노코커스 또는 라크노스피라세아에로부터의 Cpf1 뉴클레이스이다.
야생형 Cas9는 2개의 뉴클레이스 도메인: RuvC 및 HNH를 갖는다. RuvC 도메인은 비표적 DNA 가닥을 절단하고, HNH 도메인은 DNA의 표적 가닥을 절단한다. 일부 실시형태에서, Cas9 뉴클레이스는 하나 초과의 RuvC 도메인 및/또는 하나 초과의 HNH 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, Cas9 뉴클레이스는 야생형 Cas9이다. 일부 실시형태에서, Cas9는 표적 DNA에서 이중 가닥 절단을 유도할 수 있다. 다른 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 dsDNA를 절단할 수 있으며, 이는 dsDNA의 한 가닥을 절단할 수 있거나 또는 DNA 절단효소 또는 닉케이스 활성을 갖지 않을 수 있다.
일부 실시형태에서, 키메라 Cas 뉴클레이스는 단백질의 하나의 도메인 또는 영역이 상이한 단백질의 일부로 대체되는 경우에 사용된다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스 도메인은 Fok1과 같은 상이한 뉴클레이스로부터의 도메인으로 대체될 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 변형된 뉴클레이스일 수 있다.
다른 실시형태에서, Cas 뉴클레이스 또는 Cas 닉케이스는 유형-I CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래할 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 유형-I CRISPR/Cas 시스템의 캐스케이드 복합체의 구성요소일 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 Cas3 단백질일 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 유형-III CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래할 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 RNA 절단 활성을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 단일-가닥 닉케이스 활성을 가지며, 즉, 하나의 DNA 가닥을 절단하여 "닉"으로도 알려져 있는 단일-가닥 절단을 생성할 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 Cas 닉케이스를 포함한다. 닉케이스는 dsDNA에서 닉을 생성하는 효소이며, 즉, DNA 이중 나선의 한 가닥은 절단하지만 다른 가닥은 절단하지 않는다. 일부 실시형태에서, Cas 닉케이스는, 예를 들어, 촉매 도메인에서 하나 이상의 변경(예를 들어, 점 돌연변이)에 의해 내핵분해성 활성 부위가 불활성화된 Cas 뉴클레이스(예를 들어, 위에 논의된 Cas 뉴클레이스)의 버전이다. 예를 들어, Cas 닉케이스 및 예시적인 촉매 도메인 변경에 대한 논의는 미국 특허 제8,889,356호를 참조한다. 일부 실시형태에서, Cas9 닉케이스와 같은 Cas 닉케이스는 불활성화된 RuvC 또는 HNH 도메인을 갖는다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 단 하나의 기능성 뉴클레이스 도메인을 포함하도록 변형된다. 예를 들어, 작용제 단백질은 뉴클레이스 도메인 중 하나가 돌연변이되거나 또는 완전히 또는 부분적으로 결실되어 핵산 절단 활성이 감소되도록 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 감소된 활성을 갖는 RuvC 도메인을 갖는 닉케이스가 사용된다. 일부 실시형태에서, 불활성 RuvC 도메인을 갖는 닉케이스가 사용된다. 일부 실시형태에서, 감소된 활성을 갖는 HNH 도메인을 갖는 닉케이스가 사용된다. 일부 실시형태에서, 불활성 HNH 도메인을 갖는 닉케이스가 사용된다.
일부 실시형태에서, Cas 단백질 뉴클레이스 도메인 내의 보존된 아미노산은 뉴클레이스 활성을 감소시키거나 또는 변경하기 위해 치환된다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 RuvC 또는 RuvC-유사 뉴클레이스 도메인에 아미노산 치환을 포함할 수 있다. RuvC 또는 RuvC-유사 뉴클레이스 도메인의 예시적인 아미노산 치환은 D10A(S. 피오게네스 Cas9 단백질 기반)를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Zetsche et al. (2015) Cell Oct 22:163(3): 759-771]을 참조한다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스는 HNH 또는 HNH-유사 뉴클레이스 도메인에 아미노산 치환을 포함할 수 있다. HNH 또는 HNH-유사 뉴클레이스 도메인의 예시적인 아미노산 치환은 E762A, H840A, N863A, H983A 및 D986A(S. 피오게네스 Cas9 단백질 기반)를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Zetsche et al. (2015)]을 참조한다. 추가의 예시적인 아미노산 치환은 D917A, E1006A 및 D1255A(프란시셀라 노비시다 U112 Cpf1(FnCpf1) 서열(UniProtKB - A0Q7Q2(CPF1_FRATN) 기반)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 닉케이스를 암호화하는 mRNA는 표적 서열의 센스 및 안티센스 가닥과 각각 상보적인 가이드 RNA의 쌍과 조합하여 제공된다. 이 실시형태에서, 가이드 RNA는 닉케이스를 표적 서열로 지시하고 표적 서열의 반대 가닥에 닉을 생성함으로써(즉, 이중 닉킹) DSB를 도입한다. 일부 실시형태에서, 이중 닉킹의 사용은 특이성을 개선하고 표적외 효과를 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 닉케이스는 표적 DNA에 이중 닉을 생성하기 위해 DNA의 반대 가닥을 표적으로 하는 2개의 별도의 가이드 RNA와 함께 사용된다. 일부 실시형태에서, 닉케이스는 표적 DNA에 이중 닉을 생성하기 위해 근접하게 선택되는 2개의 별도의 가이드 RNA와 함께 사용된다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 절단효소 및 닉케이스 활성이 결여되어 있다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 dCas DNA-결합 폴리펩타이드를 포함한다. dCas 폴리펩타이드는 DNA-결합 활성을 갖지만 본질적으로 촉매(절단효소/닉케이스) 활성이 결여되어 있다. 일부 실시형태에서, dCas 폴리펩타이드는 dCas9 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 절단효소 및 닉케이스 활성이 결여된 RNA-가이드된 DNA-결합제 또는 dCas DNA-결합 폴리펩타이드는 내핵분해성 활성 부위가, 예를 들어, 촉매 도메인에서 하나 이상의 변경(예를 들어, 점 돌연변이)에 의해 불활성화된 Cas 뉴클레이스(예를 들어, 위에 논의된 Cas 뉴클레이스)의 버전이다. 예를 들어, US 2014/0186958 A1; US 2015/0166980 A1을 참조한다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제는 APOBEC3 데아미네이스를 포함한다. 일부 실시형태에서, APOBEC3 데아미네이스는 APOBEC3A(A3A)이다. 일부 실시형태에서, A3A는 인간 A3A이다. 일부 실시형태에서, A3A는 야생형 A3A이다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제는 편집기를 포함한다. 예시적인 편집기는 XTEN 링커에 의해 S. 피오게네스-D10A Cas9 닉케이스에 융합된 H. 사피엔스 APOBEC3A를 포함하는 BC22n이다. 일부 실시형태에서, 편집기는 우라실 글리코실레이스 저해제(uracil glycosylase inhibitor: "UGI")와 함께 제공된다. 일부 실시형태에서, 편집기는 UGI에 융합된다. 일부 실시형태에서, 편집기를 암호화하는 mRNA 및 UGI를 암호화하는 mRNA는 LNP로 함께 제형화된다. 다른 실시형태에서, 편집기 및 UGI는 별도의 LNP로 제공된다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 하나 이상의 이종 기능성 도메인을 포함한다(예를 들어, 융합 폴리펩타이드이거나 또는 이를 포함한다).
일부 실시형태에서, 이종 기능성 도메인은 RNA-가이드된 DNA-결합제의 세포 핵으로의 수송을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 이종 기능성 도메인은 핵 국재화 신호(nuclear localization signal: NLS)일 수 있다.
일부 실시형태에서, 이종 기능성 도메인은 RNA-가이드된 DNA 결합제의 세포내 반감기를 변형시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제의 반감기는 증가될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제의 반감기는 감소될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종 기능성 도메인은 RNA-가이드된 DNA-결합제의 안정성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종 기능성 도메인은 RNA-가이드된 DNA-결합제의 안정성을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종 기능성 도메인은 단백질 분해를 위한 신호 펩타이드로 작용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단백질 분해는, 예를 들어, 프로테아솜, 라이소솜 프로테이스 또는 칼파인 프로테이스와 같은 단백질분해 효소에 의해 매개될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종 기능성 도메인은 PEST 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 유비퀴틴 또는 폴리유비퀴틴 사슬의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유비퀴틴은 유비퀴틴 유사 단백질(ubiquitinlike protein: UBL)일 수 있다. 유비퀴틴-유사 단백질의 비제한적인 예는 소형 유비퀴틴 유사 변형자(small ubiquitinlike modifier: SUMO), 유비퀴틴 교차-반응성 단백질(ubiquitin cross-reactive protein: UCRP, 인터페론 자극된 유전자-15(interferonstimulated gene-15: ISG15)로도 알려져 있음), 유비퀴틴-관련 변형자-1(ubiquitin-related modifier-1: URM1), 신경-전구체-세포 발현된 발달상으로 하향조절된 단백질-8(neuronal-precursor-cellexpressed developmentally downregulated protein-8: NEDD8, S. 세레비시아에에서 Rub1이라고도 함), 인간 백혈구 항원 F-회합된(human leukocyte antigen F-associated: FAT10), 자가포식-8(autophagy-8: ATG8) 및 -12(ATG12), Fau 유비퀴틴-유사 단백질(FUB1), 막-고정된 UBL(membrane-anchored UBL: MUB), 유비퀴틴 접힘-변형자-1(ubiquitin fold-modifier-1: UFM1) 및 유비퀴틴-유사 단백질-5(ubiquitin-like protein-5: UBL5)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 이종 기능성 도메인은 마커 도메인일 수 있다. 마커 도메인의 비제한적인 예는 형광 단백질, 정제 태그, 에피토프 태그 및 리포터 유전자 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 마커 도메인은 형광 단백질일 수 있다. 적합한 형광 단백질의 비제한적인 예는 녹색 형광 단백질(예를 들어, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, sfGFP, EGFP, Emerald, Azami Green, Monomeric Azami Green, CopGFP, AceGFP, ZsGreen1), 황색 형광 단백질(예를 들어, YFP, EYFP, Citrine, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellow1), 청색 형광 단백질(예를 들어, EBFP, EBFP2, Azurite, mKalamal, GFPuv, Sapphire, T-sapphire), 시안 형광 단백질(예를 들어, ECFP, Cerulean, CyPet, AmCyan1, Midoriishi-Cyan), 적색 형광 단백질(예를 들어, mKate, mKate2, mPlum, DsRed monomer, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-Monomer, HcRed-탠덤, HcRed1, AsRed2, eqFP611, mRasberry, mStrawberry, Jred) 및 오렌지색 형광 단백질(mOrange, mKO, Kusabira-Orange, Monomeric Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato) 또는 임의의 다른 적합한 형광 단백질을 포함한다. 다른 실시형태에서, 마커 도메인은 정제 태그 및/또는 에피토프 태그일 수 있다. 비제한적인 예시적인 태그는 글루타티온-S-트랜스퍼레이스(glutathione-S-transferase: GST), 키틴 결합 단백질(chitin binding protein: CBP), 말토스 결합 단백질(maltose binding protein: MBP), 티오레독신(thioredoxin: TRX), 폴리(NANP), 탠덤 친화성 정제(tandem affinity purification: TAP) 태그, myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, HA, nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 6xHis, 8xHis, 바이오틴 카복실 운반체 단백질(biotin carboxyl carrier protein: BCCP), 폴리-His 및 칼모듈린을 포함한다. 비제한적인 예시적인 리포터 유전자는 글루타티온-S-트랜스퍼레이스(GST), 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase: HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼레이스(chloramphenicol acetyltransferase: CAT), 베타-갈락토시데이스, 베타-글루쿠로니데이스, 루시퍼레이스 또는 형광 단백질을 포함한다.
추가적인 실시형태에서, 이종 기능성 도메인은 RNA-가이드된 DNA-결합제를 특정 소기관, 세포 유형, 조직 또는 기관으로 표적화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종 기능성 도메인은 RNA-가이드된 DNA-결합제를 미토콘드리아에 표적화할 수 있다.
추가 실시형태에서, 이종 기능성 도메인은 편집기 도메인과 같은 효과기 도메인일 수 있다. RNA-가이드된 DNA-결합제가 표적 서열에 대해 지시되는 경우, 예를 들어, Cas 뉴클레이스가 gRNA에 의해 표적 서열에 지시될 때, 편집기 도메인과 같은 효과기 도메인은 표적 서열을 변형시키거나 또는 이에 영향을 미칠 수 있다. 일부 실시형태에서, 편집기 도메인과 같은 효과기 도메인은 핵산 결합 도메인, 뉴클레이스 도메인(예를 들어, 비-Cas 뉴클레이스 도메인), 후성적 변형 도메인, 전사 활성화 도메인 또는 전사 억제 도메인으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종 기능성 도메인은 FokI 뉴클레이스와 같은 뉴클레이스이다. 예를 들어, 미국 특허 제9,023,649호를 참조한다. 일부 실시형태에서, 이종 기능성 도메인은 전사 활성화제 또는 억제제이다. 예를 들어, 문헌[Qi et al., "Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression," Cell 152:1173-83 (2013); Perez-Pinera et al., "RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9- based transcription factors," Nat. Methods 10:973-6 (2013); Mali et al., "CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering," Nat. Biotechnol. 31:833-8 (2013); Gilbert et al., "CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes," Cell 154:442-51 (2013)]을 참조한다. 이와 같이, RNA-가이드된 DNA-결합제는 본질적으로 가이드 RNA를 사용하여 목적하는 표적 서열에 결합하도록 지시될 수 있는 전사 인자가 된다. 일부 실시형태에서, DNA 변형 도메인은 메틸화 도메인, 예컨대, 탈메틸화 또는 메틸트랜스퍼레이스 도메인이다. 일부 실시형태에서, 효과기 도메인은 염기-편집 도메인과 같은 DNA 변형 도메인이다. 특정 실시형태에서, DNA 변형 도메인은 데아미네이스 도메인과 같이 특정 변형을 DNA에 도입하는 핵산 편집 도메인이다. 예를 들어, WO 2015/089406; US 2016/0304846을 참조한다. 핵산 편집 도메인, 데아미네이스 도메인 및 Cas9 변이체는 각각 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 WO 2015/089406 및 U.S. 2016/0304846에 기술되어 있다.
뉴클레이스는 가이드 RNA("gRNA")와 상호작용하는 적어도 하나의 도메인을 포함할 수 있다. 추가적으로, 뉴클레이스는 gRNA에 의해 표적 서열에 대해 지시될 수 있다. 클래스 2 Cas 뉴클레이스 시스템에서, gRNA 뉴클레이스 뿐만 아니라 표적 서열과 상호작용하여 표적 서열에 대한 결합을 지시한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 표적화된 절단에 대한 특이성을 제공하고, 뉴클레이스는 보편적일 수 있으며 다양한 gRNA와 쌍을 이루어 다양한 표적 서열을 절단할 수 있다. 클래스 2 Cas 뉴클레이스는 위에 나열된 유형, 오쏘로그 및 예시적인 종의 gRNA 스캐폴드 구조와 쌍을 이룰 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "리보핵단백질"(ribonucleoprotein: RNP) 또는 "RNP 복합체"는 Cas 뉴클레이스, 예를 들어, Cas 절단효소, Cas 닉케이스 또는 dCas DNA-결합제(예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA-결합제와 함께 gRNA를 지칭한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 Cas9와 같은 RNA-가이드된 DNA-결합제를 표적 서열로 가이드하고, gRNA는 표적 서열과 혼성화하고 작용제는 표적 서열에 결합하고; 작용제가 절단효소 또는 닉케이스인 경우, 결합 후에 절단 또는 닉킹이 발생할 수 있다.
본 개시내용 일부 실시형태에서, LNP 조성물에 대한 카고는 뉴클레이스(예를 들어, Cas9와 같은 Cas 뉴클레이스)일 수 있는 RNA-가이드된 DNA-결합제를 표적 DNA로 지시하는 가이드 서열을 포함하는 적어도 하나의 gRNA를 포함한다. gRNA는 Cas 뉴클레이스 또는 클래스 2 Cas 뉴클레이스를 표적 핵산 분자의 표적 서열로 가이드 할 수 있다. 일부 실시형태에서, gRNA는 클래스 2 Cas 뉴클레이스와 결합하여 이에 의한 절단 특이성을 제공한다. 일부 실시형태에서, gRNA 및 Cas 뉴클레이스는 리보핵단백질(RNP), 예를 들어, CRISPR/Cas9 복합체와 같은 CRISPR/Cas 복합체를 형성할 수 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas 복합체는 유형-II CRISPR/Cas9 복합체일 수 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas 복합체는 Cpf1/gRNA 복합체와 같은 유형-V CRISPR/Cas 복합체일 수 있다. Cas 뉴클레이스 및 동족 gRNA는 쌍을 이룰 수 있다. 각각의 클래스 2 Cas 뉴클레이스와 쌍을 이루는 gRNA 스캐폴드 구조는 특정 CRISPR/Cas 시스템에 따라 다르다.
"가이드 RNA", "gRNA" 및 간단히 "가이드"는 RNA-가이드된 DNA-결합제에 대한 동족 가이드 핵산을 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 가이드 RNA는 본 명세서에 기재된 바와 같은 변형된 RNA를 포함할 수 있다. gRNA는, 예를 들어, 단일 가이드 RNA이거나 또는 crRNA와 trRNA의 조합(tracrRNA로도 알려져 있음)일 수 있다. crRNA 및 trRNA는 단일 RNA 분자(단일 가이드 RNA인 sgRNA로) 회합되거나 또는, 예를 들어, 2개의 별도의 RNA 가닥(이중 가이드 RNA, dgRNA)으로 회합될 수 있다. 일부 시스템에서, gRNA는 crRNA(CRISPR RNA로도 알려져 있음)일 수 있다. "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 각각의 유형을 지칭한다. trRNA는 자연 발생적 서열일 수 있거나 또는 자연 발생적 서열과 비교하여 변형 또는 변이가 있는 trRNA 서열일 수 있다.
일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 mRNA는 제1 LNP 조성물로 제형화되고, gRNA 핵산은 제2 LNP 조성물로 제형화된다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 LNP 조성물은 동시에 투여된다. 다른 실시형태에서, 제1 및 제2 LNP 조성물은 순차적으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 LNP 조성물은 사전 인큐베이션 단계 전에 배합된다. 다른 실시형태에서, 제1 및 제2 LNP 조성물은 별도로 사전 인큐베이션된다.
일부 실시형태에서, 카고는 DNA 분자를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산은 crRNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, crRNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 자연 발생적 CRISPR/Cas 시스템으로부터의 반복 서열의 전부 또는 일부가 측면에 있는 표적화 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산은 tracr RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, crRNA 및 tracr RNA는 2개의 별도의 핵산에 의해 암호화될 수 있다. 다른 실시형태에서, crRNA 및 tracr RNA는 단일 핵산에 의해 암호화될 수 있다. 일부 실시형태에서, crRNA 및 tracr RNA는 단일 핵산의 반대 가닥에 의해 암호화될 수 있다. 다른 실시형태에서, crRNA 및 tracr RNA는 단일 핵산의 동일한 가닥에 의해 암호화될 수 있다. 일부 실시형태에서, gRNA 핵산은 sgRNA를 암호화한다. 일부 실시형태에서, gRNA 핵산은 Cas9 뉴클레이스 sgRNA를 암호화한다. 일부 실시형태에서, gRNA 핵산은 Cpf1 뉴클레이스 sgRNA를 암호화한다.
가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 프로모터, 3' UTR 또는 5' UTR과 같은 적어도 하나의 전사 또는 조절 제어 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일례에서, 프로모터는 tRNA 프로모터, 예를 들어, tRNALys3 또는 tRNA 키메라일 수 있다. 문헌[Mefferd et al., RNA. 2015 21:1683-9; Scherer et al., Nucleic Acids Res. 2007 35: 2620-2628]을 참조한다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 RNA 폴리머레이스 III(Pol III)에 의해 인식될 수 있다. Pol III 프로모터의 비제한적인 예는 또한 U6 및 H1 프로모터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 마우스 또는 인간 U6 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시형태에서, gRNA 핵산은 변형된 핵산이다. 일부 실시형태에서, gRNA 핵산은 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 핵산은 5' 말단 변형, 예를 들어, 핵산의 통합을 안정화하고 방지하기 위한 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, gRNA 핵산은 각 가닥에 5' 말단 변형을 갖는 이중-가닥 DNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 핵산은 5' 말단 변형으로서 역전된 다이데옥시-T 또는 역전된 무염기 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함한다. gRNA 핵산은 바이오틴, 데스티오바이오틴- TEG, 다이곡시게닌 및, 예를 들어, FAM, ROX, TAMRA 및 AlexaFluor를 비롯한 형광 마커와 같은 표지를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "가이드 서열"은 표적 서열과 상보적이며 RNA-가이드된 DNA-결합제에 의한 결합 및/또는 변형(예를 들어, 절단)을 위해 gRNA를 표적 서열로 지시하는 기능을 하는 gRNA 내의 서열을 지칭한다. "가이드 서열"은 또한 "표적화 서열", 또는 "스페이서 서열"로도 지칭될 수 있다. 가이드 서열은, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(즉, Spy Cas9) 및 관련 Cas9 상동체/오쏘로그의 경우 20개의 염기쌍 길이일 수 있다. 더 짧거나 또는 더 긴 서열, 예를 들어, 15-, 16-, 17-, 18-, 19-, 21-, 22-, 23-, 24- 또는 25-뉴클레오타이드 길이가 가이드로 사용될 수도 있다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 유전자 내에 있거나 또는 염색체 상에 있으며, 예를 들어, 가이드 서열과 상보적이다. 일부 실시형태에서, 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 또는 동일성의 정도는 약 또는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%일 수 있다. 일부 실시형태에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 100% 상보적이거나 또는 적어도 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개의 연속 뉴클레오타이드 영역에 걸쳐 동일할 수 있다. 다른 실시형태에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 적어도 하나의 미스매치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 가이드 서열 및 표적 서열은 1개, 2개, 3개 또는 4개의 미스매치를 포함할 수 있되, 표적 서열의 전체 길이는 적어도 17개, 18개, 19개, 20개 이상의 염기쌍이다. 일부 실시형태에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 1개 내지 4개의 미스매치를 포함할 수 있되, 가이드 서열은 적어도 17개, 18개, 19개, 20개 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 1개, 2개, 3개 또는 4개의 미스매치를 포함할 수 있되, 가이드 서열은 20개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 다수의 LNP 조성물은 공동으로 및/또는 별도의 목적으로 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 본 명세서에 기재된 제1 및 제2 LNP 조성물과 접촉될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 LNP 조성물은 각각 독립적으로 mRNA, gRNA 및 가이드 RNA 핵산 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 LNP 조성물은 동시에 투여된다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 LNP 조성물은 순차적으로 투여된다.
일부 실시형태에서, 세포에서 다중 게놈 편집을 생성하는 방법이 제공된다(때때로 본 명세서 및 다른 곳에서 "멀티플렉싱(multiplexing)" 또는 "멀티플렉스 유전자 편집(multiplex gene editing)" 또는 "멀티플렉스 게놈 편집(multiplex genome editing)"으로 지칭됨). 단일 세포에 여러 속성을 조작하는 능력은 생존력 및 목적하는 세포 표현형을 유지하면서 넉아웃 및 유전자좌 삽입을 포함하여 여러 표적화된 유전자에서 효율적으로 편집을 수행하는 능력에 달려 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 시험관내에서 세포를 배양하는 단계, 세포를 2개 이상의 지질 핵산 어셈블리 조성물과 접촉시키는 단계(여기서, 각 지질 핵산 어셈블리 조성물은 편집 표적 부위를 편집할 수 있는 핵산 게놈 편집 도구를 포함함) 및 시험관내에서 세포를 확장시키는 단계를 포함한다. 해당 방법은 하나 초과의 게놈 편집을 갖는 세포를 생성하되, 게놈 편집은 다르다. 소정의 실시형태에서, 제1 LNP 조성물은 제1 gRNA를 포함하고, 제2 LNP 조성물은 제2 gRNA를 포함하되, 제1 및 제2 gRNA는 상이한 표적에 상보적인 상이한 가이드 서열을 포함한다. 이러한 실시형태에서, LNP 조성물은 멀티플렉스 유전자 편집을 가능하게 할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 11개의 지질 핵산 어셈블리 조성물과 접촉된다. 일부 실시형태에서, 세포는 적어도 6개의 지질 핵산 어셈블리 조성물과 접촉된다.
Cas 단백질과 같은 RNA-가이드된 DNA-결합 단백질에 대한 표적 서열은 Cas 단백질에 대한 핵산 기질이 이중 가닥 핵산이기 때문에 게놈 DNA의 양성 및 음성 가닥(즉, 주어진 서열과 서열의 역 보체)을 모두 포함한다. 따라서, 가이드 서열이 "표적 서열과 상보적"이라고 하는 경우, 가이드 서열은 gRNA가 표적 서열의 역 보체에 결합하도록 지시할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 가이드 서열이 표적 서열의 역 보체에 결합하는 경우, 가이드 서열은 가이드 서열에서 T를 U로 치환한 것을 제외하고는 표적 서열(예를 들어, PAM을 포함하지 않는 표적 서열)의 소정의 뉴클레오타이드와 동일하다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 gRNA는 T 세포 수용체, MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II의 표면 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 유전자를 표적으로 한다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 gRNA는 TRAC를 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 gRNA는 TRBC를 표적으로 한다. 추가 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 gRNA는 CIITA를 표적으로 한다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 gRNA는 HLA-A를 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 gRNA는 HLA-B를 표적으로 한다. 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 gRNA는 HLA-C를 표적으로 한다. 추가 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 gRNA는 B2M을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 시험관 배양된 세포에서 다중 게놈 편집을 생성하기 위한 방법이 제공된다: a) 시험관내에서 세포를 적어도 제1 핵산을 포함하는 제1 지질 조성물과 접촉시켜 접촉된 세포를 생산하는 단계; b) 시험관내에서 세포를 적어도 제2 핵산을 포함하는 제2 지질 조성물과 접촉시키는 단계(여기서, 제2 핵산은 제1 핵산과 상이함); 및 c) 시험관내에서 세포를 확장시키는 단계. 소정의 실시형태에서, 다음 단계를 포함하는 시험관 배양된 세포에서 다중 게놈 편집을 생성하기 위한 방법이 제공된다: a) 시험관내에서 세포를 적어도 제1 핵산을 포함하는 제1 지질 조성물과 접촉시켜 접촉된 세포를 생산하는 단계; b) 시험관내에서 접촉된 세포를 배양하여 배양된 접촉된 세포를 생산하는 단계; c) 시험관내에서 배양된 접촉된 세포를 적어도 제2 핵산을 포함하는 제2 지질 조성물과 접촉시키는 단계(여기서, 제2 핵산은 제1 핵산과 상이함); 및 d) 시험관내에서 세포를 확장시키는 단계. 추가 실시형태에서, 방법은 시험관내에서 세포를 적어도 제3 핵산을 포함하는 제3 지질 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 제3 핵산은 제1 및 제2 핵산과 상이하다. 다른 추가 실시형태에서, 방법은 시험관내에서 세포를 적어도 제4 핵산을 포함하는 제4 지질 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 제4 핵산은 제1, 제2 및 제3 핵산과 상이하다. 또 다른 추가 실시형태에서, 방법은 시험관내에서 세포를 적어도 제5 핵산을 포함하는 제5 지질 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 제5 핵산은 제1, 제2, 제3 및 제4 핵산과 상이하다. 추가적인 실시형태에서, 방법은 시험관내에서 세포를 적어도 제6 핵산을 포함하는 제6 지질 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 제6 핵산은 제1, 제2, 제3, 제4 및 제5 핵산과 상이하다. 소정의 실시형태에서, 적어도 2개의 지질 조성물은 순차적으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 적어도 2개의 지질 조성물은 동시에 투여된다. 일부 실시형태에서, 확장된 세포는 증가된 생존을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 시험관내 배양된 세포에서 다중 게놈 편집을 생성하기 위한 임의의 전술한 방법의 핵산은 gRNA와 같은 RNA이다. 소정의 실시형태에서, 지질 조성물 중 적어도 하나는 TRAC를 표적으로 하는 gRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질 조성물 중 적어도 하나는 TRBC를 표적으로 하는 gRNA를 포함한다. 추가 실시형태에서, 지질 조성물 중 적어도 하나는 MHC 클래스 I의 표면 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 유전자를 표적으로 하는 gRNA를 포함한다. 다른 추가 실시형태에서, 지질 조성물 중 적어도 하나는 MHC 클래스 II의 표면 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 유전자를 표적으로 하는 gRNA를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 지질 조성물 중 적어도 하나는 TRAC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 지질 조성물 중 적어도 하나는 TRBC를 표적으로 하는 gRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 지질 조성물 중 적어도 하나는 HLA-A를 표적으로 하는 gRNA를 포함하되, 선택적으로 세포는 HLA-B에 대해 동형접합성이고 HLA-C에 대해 동형접합성이다. 일부 실시형태에서, 지질 조성물 중 적어도 하나는 CIITA를 표적으로 하는 gRNA를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 지질 조성물 중 적어도 하나는 TRAC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 지질 조성물 중 적어도 하나는 TRBC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 지질 조성물 중 적어도 하나는 HLA-A를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 지질 조성물 중 적어도 하나는 CIITA를 표적으로 하는 gRNA를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 지질 조성물 중 적어도 하나는 TRAC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 지질 조성물 중 적어도 하나는 TRBC를 표적으로 하는 gRNA, HLA-A를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 지질 조성물 중 적어도 하나는 MHC 클래스 II의 표면 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 gRNA를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 지질 조성물 중 적어도 하나는 TRAC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 지질 조성물 중 적어도 하나는 TRBC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 지질 조성물 중 적어도 하나는 MHC 클래스 I의 표면 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 유전자를 표적으로 하는 gRN를 포함하고, 지질 조성물 중 적어도 하나는 CIITA를 표적으로 하는 gRNA를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 지질 조성물 중 적어도 하나는 T 세포 수용체의 표면 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 유전자를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 지질 조성물 중 적어도 하나는 HLA-A를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 지질 조성물 중 적어도 하나는 CIITA를 표적으로 하는 gRNA를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 지질 조성물 중 적어도 하나는 TRAC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 지질 조성물 중 적어도 하나는 HLA-A를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 지질 조성물 중 적어도 하나는 CIITA를 표적으로 하는 gRNA를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 지질 조성물 중 적어도 하나는 MHC 클래스 I의 표면 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 유전자를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 지질 조성물 중 적어도 하나는 CIITA를 표적으로 하는 gRNA를 포함한다.
소정의 실시형태에서, 전술한 지질 조성물 중 적어도 하나는 본 명세서에 기재된 바와 같은 핵산 게놈 편집 도구를 포함한다. 일부 실시형태에서, 추가의 지질 조성물은 RNA-가이드된 DNA 결합제를 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA-가이드된 DNA 결합제는 Cas9이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 방법은 세포를 공여자 핵산과 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 추가의 지질 조성물은 공여자 핵산을 포함한다. 공여자 핵산은 표적 서열에 삽입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 공여자 핵산 서열은 벡터로서 제공된다. 일부 실시형태에서, 공여자 핵산은 표적화 수용체를 암호화한다. 소정의 실시형태에서, 공여자 핵산은 T 세포 수용체 서열의 상응하는 영역과 상동성을 갖는 영역을 포함한다. "표적화 수용체"는 세포가 표적 부위, 예를 들어, 유기체의 특정 세포 또는 조직에 결합하도록 하기 위해 세포, 예를 들어, T 세포의 표면에 존재하는 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 표적화 수용체는 CAR이다. 일부 실시형태에서, 표적화 수용체는 범용 CAR(UniCAR)이다. 일부 실시형태에서, 표적화 수용체는 TCR이다. 일부 실시형태에서, 표적화 수용체는 T 세포 수용체 융합 작제물(TRuC)이다. 일부 실시형태에서, 표적화 수용체는 B 세포 수용체(BCR)(예를 들어, B 세포에서 발현됨)이다. 일부 실시형태에서, 표적화 수용체는 케모카인 수용체이다. 일부 실시형태에서, 표적화 수용체는 사이토카인 수용체이다.
일부 실시형태에서, 시험관내 게놈 편집 방법은 T 세포의 여러 표적 부위에서 높은 편집 효율을 가져왔다. 일부 실시형태에서, 내인성 TCR이 넉아웃된 조작된 T 세포가 생산된다. 일부 실시형태에서, 내인성 TCR의 발현이 넉아웃된 조작된 T 세포가 생산된다. 일부 실시형태에서, 2개의 유전자가 발현이 감소되고/되거나 넉아웃된 조작된 T 세포가 생산된다. 일부 실시형태에서, 3개의 유전자가 넉다운되고/되거나 넉아웃된 조작된 T 세포가 생산된다. 일부 실시형태에서, 4개의 유전자가 넉다운되고/되거나 넉아웃된 조작된 T 세포가 생산된다. 일부 실시형태에서, 5개의 유전자가 넉다운되고/되거나 넉아웃된 조작된 T 세포가 생산된다. 일부 실시형태에서, 6개의 유전자가 넉다운되고/되거나 넉아웃된 조작된 T 세포가 생산된다. 일부 실시형태에서, 7개의 유전자가 넉다운되고/되거나 넉아웃된 조작된 T 세포가 생산된다. 일부 실시형태에서, 8개의 유전자가 넉다운되고/되거나 넉아웃된 조작된 T 세포가 생산된다. 일부 실시형태에서, 9개의 유전자가 넉다운되고/되거나 넉아웃된 조작된 T 세포가 생산된다. 일부 실시형태에서, 10개의 유전자가 넉다운되고/되거나 넉아웃된 조작된 T 세포가 생산된다. 일부 실시형태에서, 11개의 유전자가 넉다운되고/되거나 넉아웃된 조작된 T 세포가 생산된다.
일부 실시형태에서, 내인성 TCR이 넉아웃되고 트랜스제닉 TCR이 삽입되고 발현된 조작된 T 세포가 생산된다. 일부 실시형태에서, 조작된 T 세포는 일차 인간 T 세포이다. 일부 실시형태에서, tgTCR은 윌름스 종양 1(WT1)을 표적으로 한다. 일부 실시형태에서, WT1 tgTCR은 개시된 지질 조성물을 사용하여 높은 비율의 T 세포(예를 들어, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 초과)에 삽입된다.
β2M 또는 B2M은 본 명세서에서 β-2 마이크로글로불린의 핵산 서열 또는 단백질 서열과 관련하여 상호교환적으로 사용되며; 인간 유전자는 등록 번호 NC_000015(범위 44711492..44718877)를 가지며, GRCh38.p13을 참조한다. B2M 단백질은 유핵 세포 표면의 이종이량체로서 MHC 클래스 I 분자와 연관되어 있으며 MHC 클래스 I 단백질 발현에 필요하다.
CIITA 또는 CIITA 또는 C2TA는 본 명세서에서 클래스 II 주요 조직적합성 복합체 전사활성화 인자의 핵산 서열 또는 단백질 서열과 관련하여 상호교환적으로 사용되며; 인간 유전자는 등록 번호 NC_000016.10(범위 10866208..10941562)을 가지며, 참조 GRCh38.p13은 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있다. 핵에 있는 CIITA 단백질은 MHC 클래스 II 유전자 전사의 양성 조절자 역할을 하며 MHC 클래스 II 단백질 발현에 필요하다.
MHC 또는 MHC 분자(들) 또는 MHC 단백질 또는 MHC 복합체(들)은 주요 조직적합성 복합체 분자(또는 복수형)를 지칭하며, 예를 들어, MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 분자를 포함한다. 인간에서, MHC 분자는 인간 백혈구 항원 복합체 또는 HLA 분자 또는 HLA 단백질로 지칭된다. 용어 MHC 및 HLA의 사용은 제한을 의미하지 않으며; 본 명세서에 사용되는 용어 MHC는 인간 MHC 분자, 즉, HLA 분자를 지칭하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 용어 MHC 및 HLA는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
HLA-A 단백질의 맥락에서 본 명세서에 사용되는 HLA-A는 중쇄(HLA-A 유전자에 의해 암호화됨) 및 경쇄(즉, 베타-2 마이크로글로불린)로 이루어진 이종이량체인 MHC 클래스 I 단백질 분자를 지칭한다. 핵산의 맥락에서 본 명세서에 사용되는 용어 HLA-A 또는 HLA-A 유전자는 HLA-A 단백질 분자의 중쇄를 암호화하는 유전자를 지칭한다. HLA-A 유전자는 HLA 클래스 I 조직적합성, A 알파 사슬로도 지칭되고; 인간 유전자는 등록 번호 NC_000006.12(29942532.29945870)를 가지며, 이는 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있다. HLA-A 유전자는 전체 인구에 걸쳐 수백 가지의 상이한 버전(대립유전자로도 지칭됨)을 갖는 것으로 알려져 있다(그리고 개체는 HLA-A 유전자의 2개의 상이한 대립유전자를 받을 수 있다). HLA-A의 모든 대립유전자는 HLA-A 및 HLA-A 유전자라는 용어에 포함된다.
핵산의 맥락에서 본 명세서에서 사용되는 HLA-B는 HLA-B 단백질 분자의 중쇄를 암호화하는 유전자를 지칭한다. HLA-B는 HLA 클래스 I 조직적합성, B 알파 사슬로도 지칭되고; 인간 유전자는 등록 번호 NC_000006.12(31353875.31357179)를 가지며, 이는 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있다.
핵산의 맥락에서 본 명세서에서 사용되는 HLA-C는 HLA-C 단백질 분자의 중쇄를 암호화하는 유전자를 지칭한다. HLA-C는 HLA 클래스 I 조직적합성, C 알파 사슬로도 지칭되고; 인간 유전자는 등록 번호 NC_000006.12(31268749.31272092)를 가지며, 이는 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있다.
표적화 서열의 길이는 사용되는 CRISPR/Cas 시스템 및 구성요소에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 상이한 세균 종으로부터의 상이한 클래스 2 Cas 뉴클레이스는 최적의 표적화 서열 길이가 다양하다. 따라서, 표적화 서열은 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개 또는 50개 이상의 뉴클레오타이드 길이를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적화 서열 길이는 자연 발생적 CRISPR/Cas 시스템의 가이드 서열보다 길거나 또는 짧은 0개, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 뉴클레오타이드이다. 소정의 실시형태에서, Cas 뉴클레이스 및 gRNA 스캐폴드는 동일한 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래할 것이다. 일부 실시형태에서, 표적화 서열은 18개 내지 24개의 뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적화 서열은 19개 내지 21개의 뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적화 서열은 20개의 뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
일부 실시형태에서, sgRNA는 Cas9 단백질에 의한 RNA-가이드된 DNA 절단을 매개할 수 있는 "Cas9 sgRNA"이다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 Cpf1 단백질에 의한 RNA-가이드된 DNA 절단을 매개할 수 있는 "Cpf1 sgRNA"이다. 소정의 실시형태에서, gRNA는 Cas9 단백질과 활성 복합체를 형성하고 RNA-가이드된 DNA 절단을 매개하기에 충분한 crRNA 및 tracr RNA를 포함한다. 소정의 실시형태에서, gRNA는 Cpf1 단백질과 활성 복합체를 형성하고 RNA-가이드된 DNA 절단을 매개하기에 충분한 crRNA를 포함한다. 문헌[Zetsche 2015]을 참조한다.
소정의 실시형태는 또한 본 명세서에 기재된 gRNA를 암호화하는 핵산, 예를 들어, 발현 카세트를 제공한다. "가이드 RNA 핵산"은 gRNA(예를 들어, sgRNA 또는 dgRNA) 및 하나 이상의 gRNA를 암호화하는 핵산인 gRNA 발현 카세트를 지칭하기 위해 본 명세서에 사용된다.
변형된 RNA
소정의 실시형태에서, LNP 조성물과 같은 지질 조성물은 변형된 RNA를 포함하여 변형된 핵산을 포함한다.
변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드는 RNA, 예를 들어, gRNA 또는 mRNA에 존재할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함하는 gRNA 또는 mRNA는 정규 A, G, C 및 U 잔기 대신에 또는 이에 추가하여 사용되는 하나 이상의 비자연 및/또는 자연 발생적 성분 또는 배열의 존재를 설명하기 위해 "변형된" RNA로 불린다. 일부 실시형태에서, 변형된 RNA는 본 명세서에서 "변형된" 것으로 불리는 비정규 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드로 합성된다.
변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (i) 포스포다이에스터 백본 연결에서 비연결 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 다 및/또는 연결 포스페이트 산소 중 하나 이상의 변경, 예를 들어, 대체(예시적인 백본 변형); (ii) 리보스 당의 구성성분, 예를 들어, 리보스 당 상의 2' 하이드록실의 변경, 예를 들어, 대체(예시적인 당 변형); (iii) 포스페이트 모이어티의 "탈포스포" 링커로의 전면(wholesale) 대체(예시적인 백본 변형); (iv) 비정규 핵염기를 포함하는 자연 발생적 핵염기의 변형 또는 대체(예시적인 염기 변형); (v) 리보스-포스페이트 백본의 대체 또는 변형(예시적인 백본 변형); (vi) 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단 또는 5' 말단의 변형, 예를 들어, 말단 포스페이트기의 제거, 변형 또는 대체 또는 모이어티, 캡 또는 링커의 접합(이러한 3' 또는 5' 캡 변형은 당 및/또는 백본 변형을 포함할 수 있음); 및 (vii) 당의 변형 또는 대체(예시적인 당 변형). 소정의 실시형태는 mRNA, gRNA 또는 핵산에 대한 5' 말단 변형을 포함한다. 소정의 실시형태는 mRNA, gRNA 또는 핵산에 대한 변형을 포함한다. 소정의 실시형태는 mRNA, gRNA 또는 핵산에 대한 3' 말단 변형을 포함한다. 변형된 RNA는 5' 말단 및 3' 말단 변형을 포함할 수 있다. 변형된 RNA는 비말단 위치에 하나 이상의 변형된 잔기를 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, gRNA는 적어도 하나의 변형된 잔기를 포함한다. 소정의 실시형태에서, mRNA는 적어도 하나의 변형된 잔기를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 변형된 gRNA는 5' 말단의 처음 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에 변형을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 변형된 gRNA는 5' 말단의 처음 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에 변형을 포함한다. 제52항 또는 제53항의 LNP 조성물에서, 변형된 gRNA는 3' 말단의 마지막 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에 변형을 포함한다.
비변형된 핵산은, 예를 들어, 세포내 뉴클레이스 또는 혈청에서 발견되는 것에 의해 분해되기 쉽다. 예를 들어, 뉴클레이스는 핵산 포스포다이에스터 결합을 가수분해할 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 본 명세서에 기재된 RNA(예를 들어, mRNA, gRNA)는, 예를 들어, 세포내 또는 혈청-기반 뉴클레이스에 대한 안정성을 도입하기 위해 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 RNA 분자는 생체내 및 생체외 모두에서 세포 집단에 도입될 때 감소된 선천적 면역 반응을 나타낼 수 있다. 용어 "선천적 면역 반응"은 사이토카인 발현 및 방출, 특히 인터페론의 유도 및 세포 사멸을 포함하는 단일 가닥 핵산을 포함한 외인성 핵산에 대한 세포 반응을 포함한다.
따라서, 일부 실시형태에서, RNA 또는 핵산은, 예를 들어, 생체내 뉴클레이스 분해에 대한 개선된 저항성을 포함하여 핵산에 증가되거나 또는 향상된 안정성을 부여하는 적어도 하나의 변형을 포함한다. 본 명세서에 제공된 핵산과 관련된 본 명세서에 사용되는 용어 "변형" 및 "변형된"은 바람직하게는 안정성을 향상시키고 RNA 또는 핵산을 RNA 또는 핵산의 야생형 또는 자연 발생적 버전보다 더 안정적이게 만드는(예를 들어, 뉴클레이스 분해에 대한 저항성) 적어도 하나의 변경을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "안정적인" 및 "안정성" 및 본 명세서에 기재된 핵산에 관한 것이며, 특히 RNA와 관련한 이러한 용어는, 예를 들어, 일반적으로 이러한 RNA를 분해할 수 있는 뉴클레이스(즉, 엔도뉴클레이스 또는 엑소뉴클레이스)에 의한 분해에 대한 증가된 또는 향상된 저항성을 지칭한다. 증가된 안정성은, 예를 들어, 표적 세포 또는 조직 내의 내인성 효소(예를 들어, 엔도뉴클레이스 또는 엑소뉴클레이스) 또는 조건에 의한 가수분해 또는 기타 파괴에 대한 민감도가 낮아짐으로써 표적 세포, 조직, 대상 및/또는 세포질에서 이러한 RNA 또는 핵산의 체류가 증가하거나 또는 향상되는 것을 포함할 수 있다. 본 명세서에 제공된 안정화된 RNA 또는 핵산 분자는 자연 발생적인 비변형된 대응물(예를 들어, 분자의 야생형 버전)에 비해 더 긴 반감기를 보여준다. 또한, 본 명세서에 개시된 LNP 조성물의 mRNA와 관련된 용어 "변형" 및 "변형된"은, 예를 들어, 단백질 번역의 개시에서 기능하는 서열(예를 들어, 코작 컨센서스 서열)의 포함을 포함하여 mRNA 핵산의 번역을 개선하거나 또는 향상시키는 변경이 상정된다(Kozak, M., Nucleic Acids Res 15 (20): 8125-48 (1987)).
일부 실시형태에서, RNA 또는 핵산은 화학적 또는 생물학적 변형을 거쳐 더욱 안정적으로 만들어졌다. RNA 또는 핵산에 대한 예시적인 변형은 염기의 고갈(예를 들어, 결실 또는 하나의 뉴클레오타이드의 또 다른 것으로의 치환에 의해) 또는 염기의 변형, 예를 들어, 염기의 화학적 변형을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 어구 "화학적 변형"은 자연 발생적 RNA 또는 핵산에서 나타나는 것과 다른 화학물질을 도입하는 변형, 예를 들어, 변형된 뉴클레오타이드의 도입(예를 들어, 뉴클레오타이드 유사체, 또는 데옥시뉴클레오사이드 또는 핵산 분자와 같은 이러한 RNA에서 자연적으로 발견되지 않는 펜던트기의 포함)과 같은 공유 변형을 포함한다.
백본 변형의 일부 실시형태에서, 변형된 잔기의 포스페이트기는 하나 이상의 산소를 다른 치환기로 대체함으로써 변형될 수 있다. 또한, 변형된 잔기, 예를 들어, 변형된 핵산에 존재하는 변형된 잔기는 본 명세서에 기재된 바와 같이 비변형된 포스페이트 모이어티를 변형된 포스페이트기로 전면 대체하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 포스페이트 백본의 백본 변형은 하전되지 않은 링커 또는 비대칭 전하 분포를 갖는 하전된 링커를 초래하는 변경을 포함할 수 있다.
변형된 포스페이트기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스터, 하이드로겐 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트라이에스터를 포함한다. 비변형된 포스페이트기의 인 원자는 아카이랄이다. 그러나, 비-브리지 산소 중 하나를 위의 원자 또는 원자단 중 하나로 대체하면 인 원자를 카이랄로 만들 수 있다. 입체이성질체성인 원자는 "R" 배열(본 명세서에서 Rp) 또는 "S" 배열(본 명세서에서 Sp)을 가질 수 있다. 백본은 또한 브리징 산소(즉, 포스페이트를 뉴클레오사이드에 연결하는 산소)를 질소(브리지된 포스포로아미데이트), 황(브리지된 포스포로티오에이트) 및 탄소(브리지된 메틸렌포스포네이트)로 대체함으로써 변형될 수 있다. 대체는 연결 산소 또는 연결 산소 둘 다에서 발생할 수 있다. 포스페이트기는 소정의 백본 변형에서 비-인 함유 연결인자로 대체될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하전된 포스페이트기는 중성 모이어티로 대체될 수 있다. 포스페이트기를 대체할 수 있는 모이어티의 예는 제한 없이, 예를 들어, 메틸 포스포네이트, 하이드록실아미노, 실록세인, 카보네이트, 카복시메틸, 카바메이트, 아마이드, 티오에터, 에틸렌 옥사이드 링커, 설포네이트, 설폰아마이드, 티오폼아세탈, 폼아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌하이드라조, 메틸렌다이메틸하이드라조 및 메틸렌옥시메틸이미노를 포함할 수 있다.
mRNA
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물 또는 제형은 본 명세서에 기재된 바와 같은 Cas 뉴클레이스 또는 클래스 2 Cas 뉴클레이스와 같은 RNA-가이드된 DNA-결합제를 암호화하는 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 mRNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, Cas 뉴클레이스 또는 클래스 2 Cas 뉴클레이스와 같은 RNA-가이드된 DNA-결합제를 암호화하는 ORF를 포함하는 mRNA가 제공되거나, 사용되거나 또는 투여된다. mRNA는 5' 캡, 5' 비번역 영역(UTR), 3' UTR 및 폴리아데닌 꼬리 중 하나 이상을 포함할 수 있다. mRNA는, 예를 들어, 핵 국재화 서열을 암호화하거나 또는 대체 코돈을 사용하여 단백질을 암호화하기 위해 변형된 오픈 리딩 프레임을 포함할 수 있다.
개시된 LNP 조성물 내의 mRNA는 세포 표면 또는 세포내 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 개시된 LNP 조성물 내의 mRNA는, 예를 들어, 분비된 호르몬, 효소, 수용체, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 일반적으로 분비된 다른 관심 단백질을 암호화할 수 있다. 일부 실시형태에서, mRNA는 선택적으로, 예를 들어, 이러한 mRNA의 안정성 및/또는 반감기를 개선하거나 또는 단백질 생산을 개선하거나 또는 그렇지 않으면 촉진하는 화학적 또는 생물학적 변형을 가질 수 있다.
또한, 적합한 변형은 코돈이 동일한 아미노산을 암호화하지만 mRNA의 야생형 버전에서 발견되는 코돈보다 더 안정적이도록 코돈의 하나 이상의 뉴클레오타이드에 변경을 포함한다. 예를 들어, RNA의 안정성과 더 많은 수의 사이티딘(C) 및/또는 우리딘(U) 잔기 사이의 역관계가 입증되었으며, C 및 U 잔기가 없는 RNA는 대부분 RNase에 안정적인 것으로 밝혀졌다(Heidenreich, et al. J Biol Chem 269, 2131-8 (1994)). 일부 실시형태에서, mRNA 서열 내 C 및/또는 U 잔기의 수는 감소된다. 또 다른 실시형태에서, C 및/또는 U 잔기의 수는 특정 아미노산을 암호화하는 하나의 코돈을 동일하거나 또는 관련 아미노산을 암호화하는 또 다른 코돈으로 치환함으로써 감소된다. mRNA 핵산에 대해 상정되는 변형은 또한 슈도우리딘의 혼입을 포함한다. 슈도우리딘을 mRNA 핵산으로 혼입하면 안정성 및 번역 능력이 향상될 뿐만 아니라 생체내 면역원성이 감소할 수 있다. 예를 들어, 문헌[, K., et al., Molecular Therapy 16 (11): 1833-1840 (2008)]을 참조한다. mRNA에 대한 치환 및 변형은 당업자에게 쉽게 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
서열 내 C 및 U 잔기 수 감소에 대한 제약은 비번역 영역에 비해 mRNA의 코딩 영역 내에서 더 클 가능성이 높다(즉, 목적하는 아미노산 서열을 암호화하는 메시지의 능력을 계속 유지하면서 메시지에 존재하는 모든 C 및 U 잔기를 제거하는 것은 불가능할 것이다). 그러나, 유전자 코드의 축퇴성은 동일한 코딩 능력을 유지하면서 서열에 존재하는 C 및/또는 U 잔기의 수를 줄일 수 있는 기회를 제공한다(즉, 어떤 아미노산이 코돈에 의해 암호화되는지에 따라, RNA 서열의 변형에 대한 여러 가지 다른 가능성이 가능할 수 있다).
용어 변형은 또한, 예를 들어, 비뉴클레오타이드 연결 또는 변형된 뉴클레오타이드를 mRNA 서열에 혼입시키는 것(예를 들어, 기능성 분비 단백질 또는 효소를 암호화하는 mRNA 분자의 3' 및 5' 말단 중 하나 또는 둘 다에 대한 변형)을 포함한다. 이러한 변형은 mRNA 서열에 대한 염기의 추가(예를 들어, 폴리 A 꼬리 또는 더 긴 폴리 A 꼬리 포함), 3' UTR 또는 5' UTR의 변경, mRNA를 작용제와 복합체화하는 것(예를 들어, 단백질 또는 상보적 핵산 분자) 및 mRNA 분자의 구조를 변화시키는 요소(예를 들어, 2차 구조를 형성하는 요소)의 포함을 포함한다.
폴리 A 꼬리는 천연 메신저를 안정화시키는 것으로 생각된다. 따라서, 긴 폴리 A 꼬리가 mRNA 분자에 추가되어 mRNA를 더 안정적으로 만들 수 있다. 폴리 A 꼬리는 다양한 당업계에서 인정받는 기법을 사용하여 추가될 수 있다. 예를 들어, 긴 폴리 A 꼬리는 폴리 A 폴리머레이스를 사용하여 합성 또는 시험관내 전사된 mRNA에 추가될 수 있다(Yokoe, et al. Nature Biotechnology. 1996; 14: 1252-1256). 전사 벡터는 또한 긴 폴리 A 꼬리를 암호화할 수 있다. 또한, 폴리 A 꼬리는 PCR 산물로부터 직접 전사에 의해 추가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리 A 꼬리의 길이는 적어도 약 90개, 200개, 300개, 400개, 적어도 500개의 뉴클레오타이드이다. 소정의 실시형태에서, 폴리 A 꼬리의 길이는 변형된 mRNA 분자의 안정성 및 그에 따른 단백질의 전사를 제어하기 위해 조정된다. 예를 들어, 폴리 A 꼬리의 길이는 mRNA 분자의 반감기에 영향을 미칠 수 있으므로, 폴리 A 꼬리의 길이는 뉴클레이스에 대한 mRNA의 저항성의 수준을 수정하여 세포에서 단백질 발현의 시간 경과를 제어하도록 조정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 안정화된 mRNA 분자는 (예를 들어, 뉴클레이스에 의한) 생체내 분해에 대해 충분히 저항성이 있어 전달 비히클 없이 표적 세포에 전달될 수 있다.
소정의 실시형태에서, mRNA는 야생형 mRNA에서는 자연적으로 발견되지 않는 3' 및/또는 5' 비번역(UTR) 서열의 혼입에 의해 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 자연적으로 mRNA의 측면에 있으며 관련되지 않은 제2 단백질을 암호화하는 3' 및/또는 5' 플랭킹 서열은 이를 변형시키기 위해 치료적 또는 기능성 단백질을 암호화하는 mRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열에 혼입될 수 있다. 예를 들어, 안정적인 mRNA 분자(예를 들어, 글로빈, 액틴, GAPDH, 튜불린, 히스톤 또는 시트르산 회로 효소)의 3' 또는 5' 서열은 센스 mRNA 분자의 안정성을 증가시키기 위해 센스 mRNA 핵산 분자의 3' 및/또는 5' 영역에 혼입될 수 있다. 예를 들어, US2003/0083272를 참조한다.
mRNA 변형에 대한 더 상세한 설명은 내용이 본 명세서에 원용되어 있는 US2017/0210698A1의 57 내지 68 페이지에서 찾을 수 있다.
주형 핵산
본 명세서에 개시된 방법은 주형 핵산을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 주형은 Cas 뉴클레이스, 예를 들어, 클래스 2 Cas 뉴클레이스와 같은 RNA-가이드된 DNA-결합 단백질에 대한 표적 부위 또는 그 근처에서 핵산 서열을 변경하거나 또는 이를 삽입하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 주형을 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 주형이 제공될 수 있다. 다른 실시형태에서, 편집이 2개 이상의 표적 부위에서 발생할 수 있도록 2개 이상의 주형이 제공될 수 있다. 예를 들어, 세포 내 단일 유전자 또는 세포 내 2개의 상이한 유전자를 편집하기 위해 상이한 주형이 제공될 수 있다.
일부 실시형태에서, 주형은 상동 재조합에서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상동 재조합은 주형 서열 또는 주형 서열의 일부를 표적 핵산 분자에 통합시킬 수 있다. 다른 실시형태에서, 주형은 핵산의 절단 부위에 DNA 가닥 침입을 포함하는 상동성-지시 복구에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상동성-지시 복구는 편집된 표적 핵산 분자에 주형 서열을 포함시킬 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 주형은 비상동 말단 연결에 의해 매개되는 유전자 편집에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 주형 서열은 절단 부위 근처의 핵산 서열과 유사성이 없다. 일부 실시형태에서, 주형 또는 주형 서열의 일부가 혼입된다. 일부 실시형태에서, 주형은 플랭킹 역 말단 반복(inverted terminal repeat: ITR) 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 주형 서열은 표적 세포의 내인성 서열에 상응하거나, 이를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 이는 또한 또는 대안적으로 표적 세포의 외인성 서열에 상응하거나, 이를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "내인성 서열"은 세포에 고유한 서열을 지칭한다. 용어 "외인성 서열"은 세포에 고유하지 않은 서열 또는 세포의 게놈 내 고유 위치가 상이한 위치에 있는 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 내인성 서열은 세포의 게놈 서열일 수 있다. 일부 실시형태에서, 내인성 서열은 염색체 또는 염색체외 서열일 수 있다. 일부 실시형태에서, 내인성 서열은 세포의 플라스미드 서열일 수 있다.
일부 실시형태에서, 주형은 플랭킹 역-말단 반복(ITR) 서열을 포함하는 ssDNA 또는 dsDNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 주형은 벡터, 플라스미드, 미니서클, 나노서클 또는 PCR 산물로 제공된다.
일부 실시형태에서, 핵산은 정제된다. 일부 실시형태에서, 핵산은 침전 방법(예를 들어, LiCl 침전, 알코올 침전 또는 동등한 방법, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법)을 사용하여 정제된다. 일부 실시형태에서, 핵산은 HPLC-기반 방법 또는 동등한 방법(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법)과 같은 크로마토그래피-기반 방법을 사용하여 정제된다. 일부 실시형태에서, 핵산은 침전 방법(예를 들어, LiCl 침전) 및 HPLC-기반 방법 모두를 사용하여 정제된다. 일부 실시형태에서, 핵산은 접선 유동 여과(TFF)에 의해 정제된다.
세포 유형
일부 실시형태에서, 세포는 면역 세포이다. 본 명세서에서 사용되는 "면역 세포"는, 예를 들어, 림프구(예를 들어, T 세포, B 세포, 자연 살해 세포("NK 세포" 및 NKT 세포 또는 iNKT 세포)), 단핵구, 대식세포, 비만 세포, 수지상 세포 또는 과립구(예를 들어, 호중구, 호산구 및 호염기구)를 포함하는 면역계의 세포를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 세포는 일차 면역 세포이다. 일부 실시형태에서, 면역계 세포는 CD3+, CD4+ 및 CD8+ T 세포, 조절 T 세포(Treg), B 세포, NK 세포 및 수지상 세포(DC)로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 동종이다. 일부 실시형태에서, 세포는 림프구이다. 일부 실시형태에서, 세포는 적응 면역 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 B 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 NK 세포이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, T 세포는 T 세포 수용체("TCR" 또는 "αβ TCR" 또는 "γδ TCR")를 발현하는 세포로 정의될 수 있지만, 일부 실시형태에서 T 세포의 TCR은 유전적으로 변형되어 (예를 들어, TRAC 또는 TRBC 유전자에 대한 유전적 변형에 의해) 발현이 감소될 수 있으므로, 단백질 CD3의 발현은 표준 유세포 측정법 방법에 의해 T 세포를 식별하기 위한 마커로서 사용될 수 있다. CD3은 TCR과 관련된 다중-서브유닛 신호전달 복합체이다. 따라서, T 세포는 CD3+로 지칭될 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포는 CD3+ 마커 및 CD4+ 또는 CD8+ 마커를 발현하는 세포이다.
일부 실시형태에서, T 세포는 당단백질 CD8을 발현하므로 표준 유세포 측정법 방법에 의해 CD8+이며, "세포독성" T 세포로 지칭될 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포는 당단백질 CD4를 발현하므로 표준 유세포 측정법 방법에 의해 CD4+이며, "헬퍼" T 세포로 지칭되리 수 있다. CD4+ T 세포는 서브세트로 분화할 수 있으며, Th1 세포, Th2 세포, Th9 세포, Th17 세포, Th22 세포, T 조절("Treg") 세포 또는 T 여포성 헬퍼 세포("Tfh")로 지칭될 수 있다. 각 CD4+ 서브세트는 전염증성 또는 항-염증성 기능, 생존 또는 보호 기능을 가질 수 있는 특정 사이토카인을 방출한다. T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ 선택 방법에 의해 대상체로부터 단리될 수 있다.
일부 실시형태에서, T 세포는 기억 T 세포이다. 신체에서, 기억 T 세포는 항원과 조우한다. 기억 T 세포는 2차 림프 기관(중심 기억 T 세포) 또는 최근 감염된 조직(효과기 기억 T 세포)에 위치할 수 있다. 기억 T 세포는 CD8+ T 세포일 수 있다. 기억 T 세포는 CD4+ T 세포일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "중심 기억 T 세포"는 항원-경험 T 세포로 정의될 수 있으며, 예를 들어, CD62L 및 CD45RO를 발현할 수 있다. 중심 기억 T 세포는 중심 기억 T 세포에 의해 CD62L+ 및 CD45RO+로 검출될 수 있고 CCR7도 발현하므로, 표준 유세포 측정법 방법에 의해 CCR7+로 검출될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "초기 줄기-세포 기억 T 세포"(또는 "Tscm")는 CD27 및 CD45RA을 발현하는 T 세포로 정의될 수 있으므로 표준 유세포 측정법 방법에 의해 CD27+ 및 CD45RA+이다. Tscm은 CD45 아이소형 CD45RO를 발현하지 않으므로, 표준 유세포 측정법 방법에 의해 이 아이소형에 대해 염색된 경우 Tscm은 추가로 CD45RO-일 것이다. 따라서, CD45RO- CD27+ 세포는 또한 초기 줄기-세포 기억 T 세포이다. Tscm 세포는 CD62L 및 CCR7을 추가로 발현하므로, 표준 유세포 측정법 방법에 의해 CD62L+ 및 CCR7+로 검출될 수 있다. 초기 줄기-세포 기억 T 세포는 세포 요법제의 증가된 지속성 및 치료 효능과 상관관계가 있는 것으로 나타났다.
일부 실시형태에서, 세포는 B 세포이다. 본 명세서에서 사용되는 "B 세포"는 CD19 및/또는 CD20 및/또는 B 세포 성숙 항원("BCMA")을 발현하는 세포로 정의될 수 있으므로, B 세포는 표준 유세포 측정법 방법에 의해 CD19+ 및/또는 CD20+ 및/또는 BCMA+이다. B 세포는 표준 유세포 측정법 방법에 의해 CD3 및 CD56에 대해 추가로 음성이다. B 세포는 형질 세포일 수 있다. B 세포는 기억 B 세포일 수 있다. B 세포는 미경험 B 세포일 수 있다. B 세포는 IgM+일 수 있거나 또는 클래스-전환 B 세포 수용체(예를 들어, IgG+ 또는 IgA+)를 가질 수 있다.
ACT 요법에 사용되는 세포에는, 예컨대, 중간엽 줄기 세포(예를 들어, 골수(BM), 말초 혈액(PB), 태반, 탯줄(UC) 또는 지방으로부터 단리됨); 조혈 줄기 세포(HSC; 예를 들어, BM으로부터 단리됨); 단핵 세포(예를 들어, BM 또는 PB로부터 단리됨); 내피 전구 세포(EPC; BM, PB 및 UC로부터 단리됨); 신경 줄기 세포(NSC); 윤부 줄기 세포(LSC); 또는 조직-특이적 일차 세포 또는 이로부터 유래된 세포(TSC)가 포함된다. ACT 요법에 사용되는 세포는, 예를 들어, 섬 세포, 뉴런 및 혈액 세포; 안구 줄기 세포; 만능성 줄기 세포(PSC); 배아 줄기 세포(ESC); 장기 또는 조직 이식용 세포, 예컨대, 섬 세포, 심장근육세포, 갑상선 세포, 흉선세포, 신경 세포, 피부 세포, 망막 세포, 연골세포, 근세포 및 각질세포를 포함하는 다른 세포 유형으로 분화하도록 유도될 수 있는 유도 만능성 줄기 세포(iPSC)를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포는 대상체로부터의 세포와 같은 인간 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 인간 공여자와 같은 인간 대상체로부터 단리된다. 일부 실시형태에서, 세포는 인간 공여자 PBMC 또는 류코팩(leukopak)으로부터 단리된다. 일부 실시형태에서, 세포는 병태, 장애 또는 질환이 있는 대상체로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, 세포는 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr Virus: "EBV")를 가진 인간 공여자로부터 유래한다.
일부 실시형태에서, 세포는 골수 또는 말초 혈액과 같은 단핵 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 말초 혈액 단핵 세포("PBMC")이다. 일부 실시형태에서, 세포는 PBMC, 예를 들어, 림프구 또는 단핵구이다. 일부 실시형태에서, 세포는 말초 혈액 림프구("PBL")이다.
일부 실시형태에서, 방법은 생체외에서 수행된다. 본 명세서에서 사용되는 "생체외", 예를 들어, ACT 요법으로서 세포가 대상체 내로 전달될 수 있는 시험관내 방법을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 생체외 방법은 ACT 요법 세포 또는 세포 집단을 포함하는 시험관내 방법이다.
일부 실시형태에서, 세포는 배양에서 유지된다. 일부 실시형태에서, 세포는 환자에게 이식된다. 일부 실시형태에서, 세포는 대상체로부터 제거되고, 생체외에서 유전적으로 변형된 다음, 동일한 환자에게 다시 투여된다. 일부 실시형태에서, 세포는 대상체로부터 제거되고, 생체외에서 유전적으로 변형된 다음, 세포가 제거된 해당 대상체가 아닌 다른 대상체에게 투여된다.
일부 실시형태에서, 세포는 세포주로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, 세포주는 인간 대상체로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포주는 림프아구성 세포주(lymphoblastoid cell line: "LCL")이다. 세포는 동결보존되고 해동될 수 있다. 세포는 이전에 동결보존되지 않았을 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포는 세포 은행으로부터 유래한다. 일부 실시형태에서, 세포는 유전적으로 변형된 다음, 세포 은행으로 옮겨진다. 일부 실시형태에서, 세포는 대상체로부터 제거되고, 생체외에서 유전적으로 변형되고, 세포 은행으로 옮겨진다. 일부 실시형태에서, 유전적으로 변형된 세포 집단은 세포 은행으로 옮겨진다. 일부 실시형태에서, 유전적으로 변형된 면역 세포 집단은 세포 은행으로 옮겨진다. 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 하위집단은 유전적으로 변형된 면역 세포 집단을 포함하되, 제1 및 제2 하위집단은 적어도 하나의 공통 유전적 변형을 갖고, 적어도 하나의 상이한 유전적 변형은 세포 은행으로 옮겨진다.
일부 실시형태에서, T 세포는 다중클론 활성화(또는 "다중클론 자극")에 의해 활성화된다(항원-특이적 자극이 아님). 일부 실시형태에서, T 세포는 CD3 자극에 의해 활성화된다(예를 들어, 항-CD3 항체 제공). 일부 실시형태에서, T 세포는 CD3 및 CD28 자극에 의해 활성화된다(예를 들어, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체 제공). 일부 실시형태에서, T 세포는 T 세포를 활성화(예를 들어, CD3/CD28 자극을 통해)하기 위해 즉시 사용 가능한 시약을 사용하여 활성화된다. 일부 실시형태에서, T 세포는 비드에 의해 제공되는 CD3/CD28 자극을 통해 활성화된다. 일부 실시형태에서, T 세포는 하나 이상의 성분이 가용성이고/이거나 하나 이상의 성분이 고체 표면(예를 들어, 플레이트 또는 비드)에 결합되는 CD3/CD28 자극을 통해 활성화된다. 일부 실시형태에서, T 세포는 항원-독립적 미토겐(예를 들어, 콘카나발린 A(concanavalin A: "ConA") 또는 PHA를 포함한, 예를 들어, 렉틴)에 의해 활성화된다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 사이토카인이 T 세포의 활성화에 사용된다. IL-2가 T 세포 활성화 및/또는 T 세포 생존의 촉진을 위해 제공된다. 일부 실시형태에서, T 세포의 활성화를 위한 사이토카인(들)은 공통 감마 사슬(γc) 수용체에 결합하는 사이토카인이다. 일부 실시형태에서, IL-2가 T 세포 활성화를 위해 제공된다. 일부 실시형태에서, IL-7이 T 세포 활성화를 위해 제공된다. 일부 실시형태에서, IL-15가 T 세포 활성화를 위해 제공된다. 일부 실시형태에서, IL-21이 T 세포 활성화를 위해 제공된다. 일부 실시형태에서, 사이토카인의 조합이, 예를 들어, IL-2, IL-7, IL-15 및/또는 IL-21을 포함한 T 세포 활성화를 위해 제공된다.
일부 실시형태에서, T 세포는 세포를 항원에 노출시킴으로써(항원 자극) 활성화된다. T 세포는 항원이 주요 조직적합성 복합체("MHC") 분자(펩타이드-MHC 복합체)에서 펩타이드로 제시될 때 항원에 의해 활성화된다. 동족 항원은 T 세포를 항원-제시 세포(피더 세포) 및 항원과 공동 배양함으로써 T 세포에 제시될 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포는 항원으로 펄스된 항원-제시 세포와의 공동 배양에 의해 활성화된다. 일부 실시형태에서, 항원-제시 세포는 항원의 펩타이드로 펄스되었다.
일부 실시형태에서, T 세포는 12시간 내지 72시간 동안 활성화될 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포는 12시간 내지 48시간 동안 활성화될 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포는 12시간 내지 24시간 동안 활성화될 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포는 24시간 내지 48시간 동안 활성화될 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포는 24시간 내지 72시간 동안 활성화될 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포는 12시간 동안 활성화될 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포는 48시간 동안 활성화될 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포는 72시간 동안 활성화될 수 있다.
본 발명은 예시된 실시형태와 관련하여 기술되지만, 본 발명이 그러한 실시형태로 제한되도록 의도되지는 않는다는 것이 이해된다. 반대로, 본 개시내용은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같이 본 발명 내에 포함될 수 있는 특정 특징의 등가물을 포함하여 모든 대안, 수정 및 등가물을 포괄하도록 의도된다.
전술한 일반적인 설명과 상세한 설명뿐만 아니라 다음 실시예는 모두 예시적이고 설명을 위한 것이며 교시를 제한하지 않는다. 본 명세서에 사용된 부문 제목은 구성 목적으로만 사용되며, 어떤 방식으로든 목적하는 특허 대상을 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 참조에 의해 원용된 임의의 문헌이 본 명세서에 정의된 용어와 모순되는 경우, 본 명세서가 제어한다. 달리 명시하지 않는 한, 본 출원에 제공된 모든 범위는 종점을 포함한다.
정의
본 출원에서 사용된 "단수형"은 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수형을 포함한다는 점에 유의하여야 한다. 따라서, 예를 들어, "조성물"에 대한 언급은 복수의 조성물을 포함하고, "세포"에 대한 언급은 복수의 세포 등을 포함한다. "또는"의 사용은 포괄적이며 달리 명시하지 않는 한 "및/또는"을 의미한다.
위의 명세서에서 구체적으로 언급되지 않는 한, 다양한 구성요소를 "포함하는"이라고 기술한 명세서의 실시형태는 또한 언급된 구성요소로 "이루어지는" 또는 "본질적으로 이루어지는" 것으로 상정되고; 다양한 구성요소로 "이루어지는"이라고 기술한 명세서의 실시형태는 또한 언급된 구성요소를 "포함하는" 또는 "본질적으로 이루어지는" 것으로 상정되고; 다양한 구성요소에 "대해(about)" 기술한 명세서의 실시형태는 언급된 구성요소 "에서(at)"로 상정되고; 다양한 구성요소로 "본질적으로 이루어지는"이라고 기술한 명세서의 실시형태는 또한 언급된 구성요소로 "이루어지는" 또는 "포함하는" 것으로 상정된다(이러한 상호교환성은 청구범위에서 이들 용어의 사용에 적용되지 않는다).
숫자 범위에는 범위를 정의하는 숫자가 포함된다. 측정된 값과 측정 가능한 값은 유효 자릿수와 측정과 관련된 오류를 고려한 대략적인 것으로 이해된다. 본 출원에서 사용되는 용어 "약" 및 "대략"은 해당 분야에서 이해되는 의미를 갖고; 하나와 다른 것을 사용한다고 해서 반드시 다른 범위를 의미하는 것은 아니다. 달리 명시하지 않는 한, 본 출원에 사용된 숫자는 "약" 또는 "대략"과 같은 변형어의 유무에 관계없이 관련 기술 분야의 당업자가 인식할 수 있는 정상적인 차이 및/또는 변동을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 소정의 실시형태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 명시되지 않거나 문맥상 달리 명백하지 않는 한 명시된 참조 값의 어느 방향(크거나 또는 작음)으로든 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1% 또는 그 이하에 속하는 값의 범위를 지칭할 수 있다(이러한 숫자가 가능한 값의 100%를 초과하는 경우는 제외).
본 명세서에서 사용되는 용어 "접촉하는"은 2개 이상의 실체 사이에 물리적 연결을 확립하는 것을 의미한다. 예를 들어, 포유동물 세포를 나노입자 조성물과 접촉시키는 것은 포유동물 세포와 나노입자가 물리적 연결을 공유하게 된다는 것을 의미한다. 생체내 및 생체외 모두에서 세포를 외부 실체와 접촉시키는 방법은 생물학 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 나노입자 조성물과 포유동물 내에 있는 포유동물 세포의 접촉은 다양한 투여 경로(예를 들어, 정맥내, 근육내, 피내 및 피하)에 의해 수행될 수 있고, 다양한 양이 나노입자 조성물을 포함할 수 있다. 더욱이, 하나 초과의 포유동물 세포는 나노입자 조성물에 의해 접촉될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "전달하는"은 실체를 목적지에 제공하는 것을 의미한다. 예를 들어, 치료제 및/또는 예방제를 대상체에게 전달하는 것은 치료제 및/또는 예방제를 포함하는 나노입자 조성물을 대상체에게 투여하는 것(예를 들어, 정맥내, 근육내, 피내 또는 피하 경로에 의해)을 포함할 수 있다. 나노입자 조성물의 포유동물 또는 포유동물 세포로의 투여는 하나 이상의 세포를 나노입자 조성물과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "캡슐화 효율"은 나노입자 조성물의 제조에 사용된 치료제 및/또는 예방제의 초기 총량에 대한 나노입자 조성물의 일부가 되는 치료제 및/또는 예방제의 양을 지칭한다. 예를 들어, 처음에 조성물에 제공된 총 100㎎의 치료제 및/또는 예방제 중 97㎎의 치료제 및/또는 예방제가 나노입자 조성물에 캡슐화되는 경우, 캡슐화 효율은 97%로 주어질 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "캡슐화"는 완전한, 실질적인 또는 부분적인 동봉(enclosure), 감금(confinement), 감싸기(surrounding) 또는 상자화(encasement)를 지칭할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "편집 효율", "편집 백분율", "indel 효율" 및 "indel 퍼센트"는 서열 리드의 총 수에 대한 삽입 또는 결실을 포함한 서열 리드의 총 수를 지칭한다. 예를 들어, 게놈 내 표적 위치에서의 편집 효율은 유전자 편집에 의해 도입된 삽입 및 결실의 존재를 확인하기 위해 게놈 DNA를 단리하고 시퀀싱함으로써 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 편집 효율은 처음에 유전자를 포함하였던 세포(예를 들어, CD3+ 세포)의 수에 비해 처리 후 더 이상 해당 유전자(예를 들어, CD3)를 포함하지 않는 세포의 백분율로 측정된다.
본 명세서에서 사용되는 "넉다운"은 특정 유전자 산물(예를 들어, 단백질, mRNA 또는 둘 다)의 발현의 감소를 지칭한다. 단백질의 넉다운은 관심 조직, 체액 또는 세포 집단과 같은 샘플로부터의 단백질의 총 세포 양을 검출함으로써 측정될 수 있다. 이는 또한 단백질의 대용물, 마커 또는 활성을 측정함으로써 측정될 수 있다. mRNA의 넉다운을 측정하는 방법은 공지되어 있으며, 관심 샘플로부터 단리된 mRNA의 시퀀싱을 포함한다. 일부 실시형태에서, "넉다운"은 특정 유전자 산물의 발현의 일부 손실, 예를 들어, 전사된 mRNA 양의 감소 또는 세포 집단(조직에서 발견되는 것과 같은 생체내 집단을 포함)에 의해 발현된 단백질의 양의 감소를 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "넉아웃"은 세포 내 특정 유전자 또는 특정 단백질로부터의 발현의 손실을 지칭한다. 넉아웃은, 예를 들어, 세포, 조직 또는 세포 집단에서 단백질의 총 세포 양을 검출함으로써 측정될 수 있다. 넉아웃은 또한, 예를 들어, 게놈 또는 mRNA 수준에서도 검출될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "생분해성"은 세포에 도입될 때 세포 기구(예를 들어, 효소적 분해)에 의해 분해되거나 또는 가수분해에 의해 세포가 세포에 심각한 독성 효과(들) 없이 재사용하거나 또는 폐기할 수 있는 성분으로 분해되는 물질을 지칭하는 데 사용된다. 소정의 실시형태에서, 생분해성 물질의 분해에 의해 생성된 성분은 생체내에서 염증 및/또는 기타 부작용을 유발하지 않는다. 일부 실시형태에서, 생분해성 물질은 효소적으로 분해된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 실시형태에서, 생분해성 물질은 가수분해에 의해 분해된다.
본 명세서에서 사용되는 "N/P 비"는, 예를 들어, 지질 성분 및 RNA를 포함하는 나노입자 조성물에서 RNA 내 이온화 가능한 질소 원자-함유 지질(예를 들어, 화학식 I의 화합물) 대 포스페이트기의 몰비이다.
조성물은 또한 하나 이상의 화합물의 염을 포함할 수 있다. 염은 약제학적으로 허용 가능한 염일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "약제학적으로 허용 가능한 염"은 기존의 산 또는 염기 모이어티를 이의 염 형태로 전환시킴으로써(예를 들어, 유리 염기기를 적합한 유기산과 반응시킴으로써) 모 화합물이 변경되는 개시된 화합물의 유도체를 지칭한다. 약제학적으로 허용 가능한 염의 예는 아민과 같은 염기성 잔기의 무기산염 또는 유기산염; 카복실산과 같은 산성 잔기의 알칼리 또는 유기염; 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 대표적인 산 부가염은 아세테이트, 아디페이트, 알지네이트, 아스코르베이트, 아스파테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이설페이트, 보레이트, 뷰티레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜테인프로피오네이트, 다이글루코네이트, 도데실설페이트, 에테인설포네이트, 퓨마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵토네이트, 헥사노에이트, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 하이드로아이오다이드, 2-하이드록시-에테인설포네이트, 락토바이오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 메테인설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 나이코티네이트, 나이트레이트, 올리에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 석시네이트, 설페이트, 타트레이트, 티오사이아네이트, 톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발러레이트 염 등을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 소듐, 리튬, 포타슘, 칼슘, 마그네슘 등뿐만 아니라 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 다이메틸아민, 트라이메틸아민, 트라이에틸아민, 에틸아민 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 무독성 암모늄, 4차 암모늄 및 아민 양이온을 포함한다. 본 개시내용 약제학적으로 허용 가능한 염은, 예를 들어, 무독성 무기 또는 유기산으로부터 형성된 모 화합물의 통상적인 무독성 염을 포함한다. 본 개시내용의 약제학적으로 허용 가능한 염은 통상적인 화학적 방법에 의해 염기성 또는 산성 모이어티를 포함하는 모 화합물로부터 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 염은 이들 화합물의 유리 산 또는 염기 형태를 물 또는 유기 용매 중 또는 이 둘의 혼합물 중 화학량론적 양의 적절한 염기 또는 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있고; 일반적으로, 에터, 에틸 아세테이트, 에탄올, 아이소프로판올 또는 아세토나이트릴과 같은 비수성 매질이 바람직하다. 적합한 염의 목록은 각각 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P. H. Stahl and C. G. Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008, 및 Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1-19 (1977)]에서 찾을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "다분산 지수"는 시스템의 입자 크기 분포의 균질성을 설명하는 비이다. 예를 들어, 0.3 미만의 작은 값은 좁은 입자 크기 분포를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 다분산 지수는 0.1 미만일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "형질감염"은 종(예를 들어, RNA)을 세포에 도입하는 것을 지칭한다. 형질감염은, 예를 들어, 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 발생할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "알킬"은 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-뷰틸, 아이소뷰틸, s-뷰틸, t-뷰틸, n-펜틸, 아이소펜틸, s-펜틸, 네오펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 논일, 데실, 도데실, 테트라데실, 헥사데실, 에이코실, 테트라코실 등과 같은 1개 내지 24개의 탄소 원자의 분지형 또는 비분지형 포화 탄화수소기이다. 알킬기는 환식 또는 비환식일 수 있다. 알킬기는 분지형 또는 비분지형(즉, 선형)일 수 있다. 알킬기는 또한 치환 또는 비치환될 수 있다. 예를 들어, 알킬기는 본 명세서에 기재된 바와 같이 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 알콕시, 아미노, 에터, 할라이드, 하이드록시, 나이트로, 실릴, 설폭소, 설포네이트, 카복실레이트 또는 티올을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 기로 치환될 수 있다. "저급 알킬"기는 1개 내지 6개(예를 들어, 1개 내지 4개)의 탄소 원자를 포함하는 알킬기이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "알켄일"은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 지방족기를 지칭하며, "비치환된 알켄일" 및 "치환된 알켄일"을 모두 포함하도록 의도되고, 후자는 알켄일기의 하나 이상의 탄소에서 수소를 대체하는 치환기를 갖는 알켄일 모이어티를 지칭한다. 이러한 치환기는 하나 이상의 이중 결합에 포함되거나 또는 포함되지 않는 하나 이상의 탄소에서 발생할 수 있다. 더욱이, 이러한 치환기는 안정성이 금지되는 경우를 제외하고 아래에 논의되는 바와 같이 알킬기에 대해 상정되는 모든 치환기를 포함한다. 예를 들어, 알켄일기는 하나 이상의 알킬로 치환될 수 있으며, 카보사이클릴, 아릴, 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴기가 상정된다. 예시적인 알켄일기는 바이닐(-CH=CH2), 알릴(-CH2CH=CH2), 사이클로펜텐일(-C5H7) 및 5-헥센일(-CH2CH2CH2CH2CH=CH2)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"알킬렌"기는 분지형 또는 비분지형(즉, 선형)일 수 있는 2가 알킬 라디칼을 지칭한다. 임의의 위에 언급된 1가 알킬기는 알킬로부터 두 번째 수소 원자의 추출(abstraction)에 의해 알킬렌으로 전환될 수 있다. 대표적인 알킬렌은 C2-4 알킬렌 및 C2-3 알킬렌을 포함한다. 전형적인 알킬렌기는 -CH(CH3)-, -C(CH3)2-, -CH2CH2-, -CH2CH(CH3)-, -CH2C(CH3)2-, -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2- 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 알킬렌기는 또한 치환 또는 비치환될 수 있다. 예를 들어, 알킬렌기는 본 명세서에 기재된 바와 같이 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 사이클로알킬, 알콕시, 아미노, 에터, 할라이드, 하이드록시, 나이트로, 실릴, 설폭소, 설포네이트, 카복실레이트 또는 티올을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 기로 치환될 수 있다.
용어 "알케닐렌"은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 갖고, 일 실시형태에서는 탄소-탄소 삼중 결합을 갖지 않는 2가의 직쇄형 또는 분지형, 불포화, 비환식 하이드로카빌기를 포함한다. 임의의 위에 언급된 1가 알켄일기는 알켄일로부터 두 번째 수소 원자의 추출에 의해 알케닐렌으로 전환될 수 있다. 대표적인 알케닐렌은 C2-6알케닐렌을 포함한다.
알킬 또는 알킬렌과 같은 화학적 모이어티와 함께 사용될 때 용어 "Cx-y"는 사슬에 x 내지 y개의 탄소를 포함하는 기를 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 용어 "Cx-y 알킬"은 사슬에 x 내지 y개의 탄소를 포함하는 직쇄형-사슬 및 분지형-사슬 알킬 및 알킬렌기를 포함하는 치환 또는 비치환된 포화 탄화수소기를 지칭한다.
용어 "알콕시"는 산소가 부착된 알킬기, 바람직하게는 저급 알킬기를 지칭한다. 대표적인 알콕시기는 메톡시, 에톡시, 프로폭시, tert-뷰톡시 등을 포함한다.
참조에 의한 원용
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실시예
실시예 1 - 물질 및 방법
실시예 1.1 지질 나노입자("LNP") 제형
LNP 성분을 다양한 몰비로 100% 에탄올에 용해시켰다. RNA 카고(예를 들어, 조합된 Cas9 mRNA 및 sgRNA)를 25mM 시트레이트, 100mM NaCl, pH 5.0에 용해시켜 대략 0.45 ㎎/㎖의 RNA 카고 농도를 얻었다. LNP는 달리 명시하지 않는 한 약 6의 지질 아민 대 RNA 포스페이트(N:P) 몰비 및 중량 기준으로 1:2 비의 sgRNA 대 Cas9 mRNA 비로 제형화하였다.
4-성분 지질 시스템에서 다양한 아민 지질을 사용하여 LNP를 제조하였다. 달리 명시하지 않는 한, LNP는 이온화 가능한 지질인 화합물 6, 3-((4,4-비스(옥틸옥시)뷰타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-다이에노에이트)라고도 하는 ((9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)뷰타노일)옥시)-2-((((3-(다이에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-다이에노에이트, DSPC, 콜레스테롤 및 PEG2k-DMG를 포함하였다.
2부피의 RNA 용액과 1부피의 물과 에탄올 중의 지질의 충돌 제트 혼합을 이용하는 교차-유동 기법을 사용하여 LNP를 제조하였다. 에탄올 중 지질을 2부피의 RNA 용액과의 혼합 교차를 통해 혼합하였다. 물의 제4 스트림을 인라인 티(inline tee)를 통해 교차로의 출구 스트림과 혼합하였다(WO2016010840 도 2 참조). LNP를 실온에서 1시간 동안 유지하고, 물(대략 1:1 v/v)로 추가로 희석하였다. 예를 들어, 플랫 시트 카트리지(Sartorius, 100kD MWCO)에서 접선 유동 여과를 사용하여 LNP를 농축시키고, 선택적으로 완충액을 PD-10 탈염 칼럼(GE)을 사용하여 50mM Tris, 45mM NaCl, 5%(w/v) 수크로스, pH 7.5(TSS)로 교환하였다. 대안적으로, LNP는 선택적으로 100kDa Amicon 스핀 필터를 사용하여 농축시키고, 완충액은 PD-10 탈염 칼럼(GE)을 사용하여 TSS로 교환하였다. 그런 다음, 생성된 혼합물을 0.2㎛ 멸균 필터를 사용하여 여과하였다. 최종 LNP를 추가로 사용할 때까지 4℃ 또는 -80℃에서 보관하였다.
실시예 1.2 뉴클레이스 mRNA의 시험관내 전사("IVT")
선형화된 플라스미드 DNA 주형 및 T7 RNA 폴리머레이스를 사용하여 시험관내 전사에 의해 N1-메틸 슈도-U를 포함하는 캐핑되고 폴리아데닐화된 mRNA를 생성하였다. T7 프로모터, 전사용 서열 및 폴리아데닐화 영역을 포함하는 플라스미드 DNA를 다음 조건: 200 ng/㎕ 플라스미드, 2 U/㎕ XbaI(NEB) 및 1x 반응 완충액을 사용하여 XbaI와 함께 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하여 선형화하였다. XbaI는 65℃에서 20분 동안 가열 반응에 의해 불활성화시켰다. 선형화된 플라스미드를 효소 및 완충액 염으로부터 정제하였다. 다음 조건: 50 ng/㎕의 선형화된 플라스미드; 각각 2mM 내지 5mM의 GTP, ATP, CTP 및 N1-메틸 슈도-UTP(Trilink); 10mM 내지 25mM의 ARCA(Trilink); 5 U/㎕의 T7 RNA 폴리머레이스(NEB); 1 U/㎕의 뮤린 RNase 저해제(NEB); 0.004 U/㎕의 무기 대장균 피로포스파테이스(NEB); 및 1x 반응 완충액에서 37℃에서 1.5시간 내지 4시간 동안 인큐베이션함으로써 변형된 mRNA를 생성하기 위한 IVT 반응을 수행하였다. TURBO DNase(ThermoFisher)를 0.01 U/㎕의 최종 농도로 첨가하고, 반응물을 추가로 30분 동안 인큐베이션하여 DNA 주형을 제거하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 MegaClear 전사 클린-업 키트(ThermoFisher) 또는 RNeasy Maxi 키트(Qiagen)를 사용하여 mRNA를 정제하였다.
대안적으로, mRNA는 침전 프로토콜을 통해 정제하였으며, 일부 경우에는 HPLC-기반 정제가 뒤따랐다. 간략하게는, DNase 분해 후, LiCl 침전, 암모늄 아세테이트 침전 및 소듐 아세테이트 침전을 사용하여 mRNA를 정제하였다. HPLC 정제된 mRNA의 경우, LiCl 침전 및 재구성 후, RP-IP HPLC에 의해 mRNA를 정제하였다(예를 들어, 문헌[Kariko, et al. Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 21 e142] 참조). 풀링을 위해 선택된 분획을 합하고, 위에 기술된 바와 같이 소듐 아세테이트/에탄올 침전에 의해 탈염시켰다. 추가의 대안적인 방법에서, mRNA는 LiCl 침전 방법으로 정제한 후 접선 유동 여과에 의해 추가 정제하였다. RNA 농도는 260㎚(Nanodrop)에서 흡광도를 측정함으로써 결정하였으며, 전사체는 Bioanlayzer(Agilent)로 모세관 전기영동에 의해 분석하였다.
스트렙토코커스 피오게네스("Spy") Cas9 mRNA를 서열번호 1 내지 3에 따른 오픈 리딩 프레임을 암호화하는 플라스미드 DNA로부터 생성하였다(표 35의 서열 참조). 이 단락에 인용된 서열이 RNA와 관련하여 아래에 언급될 때, T는 U로 대체되어야 함을 이해하여야 한다(위에 기재된 바와 같이 변형된 뉴클레오사이드일 수 있음). 실시예에서 사용된 메신저 RNA는 5' 캡 및 3' 폴리아데닐화 서열(예를 들어, 최대 100nt)을 포함하며 표 35에서 확인된다.
가이드 RNA는 당업계에 공지된 방법에 의해 화학적으로 합성된다.
실시예 1.4 제형 분석
동적 광산란("DLS")을 사용하여 본 개시내용의 LNP의 다분산 지수("pdi") 및 크기를 특성화하였다. DLS는 샘플을 광원에 적용함으로써 발생하는 빛의 산란을 측정한다. DLS 측정으로부터 결정된 PDI는 PDI가 0인 완벽하게 균일한 집단을 갖는 집단의 입자 크기(대략 평균 입자 크기) 분포를 나타낸다.
비대칭-흐름장 흐름 분획법 - 다중 각도 광산란법(AF4-MALS)을 사용하여 조성물 내 입자를 유체역학적 반경으로 분리한 다음, 분별된 입자의 분자량, 유체역학적 반경 및 제곱 평균 제곱근 반경을 측정하였다. 이는 분자량 및 크기 분포뿐만 아니라 버처드-스톡마이어 플롯(Burchard-Stockmeyer Plot)(입자의 내부 코어 밀도를 시사하는 시간 경과에 따른 유체역학적 반경에 대한 제곱 평균 제곱근("rms") 반경의 비) 및 rms 형태 플롯(rms 반경의 로그 대 분자량의 로그, 여기서 생성된 선형 맞춤의 기울기는 어느 정도의 압축성 대 신장성을 제공함)과 같은 2차 특성을 평가할 수 있다.
저온 전자현미경("cryo-EM")은 LNP의 입자 크기, 형태 및 구조적 특징을 결정하는 데 사용될 수 있다.
LNP의 지질 조성 분석은 액체 크로마토그래피에 이어 하전된 에어로졸 검출(LC-CAD)로부터 결정하였다. 이 분석은 실제 지질 함량 대 공칭 지질 함량의 비교를 제공한다.
LNP 조성물을 평균 입자 크기, 다분산 지수(pdi), 총 RNA 함량, RNA의 캡슐화 효율 및 제타 전위에 대해 분석하였다. LNP 조성물은 지질 분석, AF4-MALS, NTA 및/또는 cryo-EM에 의해 추가로 특성화될 수 있다. 평균 입자 크기 및 다분산도를 Malvern Zetasizer DLS 기기를 사용하여 동적 광산란(DLS)에 의해 측정하였다. LNP 샘플을 DLS에 의해 측정하기 전에 PBS 완충액으로 희석하였다. Z-평균 직경은 수 평균 직경 및 pdi와 함께 보고하였다. Z 평균은 입자의 앙상블 수집물의 강도 가중 평균 유체역학적 크기이며, 동적 광산란에 의해 측정하였다. 수 평균은 동적 광산란에 의해 측정된 입자의 앙상블 수집물의 입자 수 가중 평균 유체역학적 크기이다. Malvern Zetasizer 기기도 또한 LNP의 제타 전위를 측정하는 데 사용하였다. 측정 전 샘플을 0.1X PBS(pH 7.4)에 1:17(50 ㎕에서 800 ㎕로)로 희석하였다.
캡슐화 효율은 (총 RNA - 유리 RNA)/총 RNA로 계산하였다. 형광-기반 검정(Ribogreen®, ThermoFisher Scientific)을 사용하여 총 RNA 농도 및 유리 RNA를 결정하였다. LNP 샘플을 0.2% Triton-X 100을 포함하는 1x TE 완충액으로 적절하게 희석하여 총 RNA를 결정하거나 또는 1x TE 완충액으로 유리 RNA를 결정하였다. 표준 곡선은 조성물을 만드는 데 사용되며 1x TE 완충액 +/- 0.2% Triton-X 100으로 희석된 출발 RNA 용액을 이용하여 제조하였다. 그런 다음, 희석된 Ribogreen® 염료(제조업체의 지시에 따라)를 각 표준 및 샘플에 첨가하고, 빛이 없는 실온에서 대략 10분 동안 인큐베이션하였다. SpectraMax M5 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 여기, 자동 차단 및 방출 파장을 각각 488㎚, 515㎚ 및 525㎚로 설정하여 샘플을 판독하였다. 적절한 표준 곡선으로부터 총 RNA 및 유리 RNA를 결정하였다.
AF4-MALS를 사용하여 분자량 및 크기 분포뿐만 아니라 해당 계산의 2차 통계를 확인하였다. LNP를 적절하게 희석하고, HPLC 오토샘플러를 사용하여 AF4 분리 채널에 주입하였으며, 여기서 이들을 초점을 맞춘 다음 채널을 가로지르는 교차 흐름의 지수적 구배로 용리하였다. 모든 유체는 HPLC 펌프 및 Wyatt Eclipse 기기에 의해 구동하였다. AF4 채널로부터 용리되는 입자는 UV 검출기, 다중 각도 광산란 검출기, 준-탄성 광산란 검출기 및 시차 굴절률 검출기를 통과한다. 원시 데이터를 Debeye 모델을 사용하여 처리하여 검출기 신호로부터 분자량 및 rms 반경을 결정하였다.
CAD는 모든 비휘발성 화합물을 검출하는 파괴적인 질량-기반 검출기이며, 분석물 구조에 관계없이 신호는 일관된다.
LNP의 지질 성분을 하전된 에어로졸 검출기(CAD)에 결합된 HPLC에 의해 정량적으로 분석하였다. 4가지 지질 성분의 크로마토그래피 분리는 상 HPLC에 의해 달성하였다. HPLC 지질 분석은 표 1에 나타낸 바와 같이 다음 실시예에 기재된 LNP 조성물의 각 성분에 대한 실제 몰 퍼센트(몰-%) 지질 수준을 제공하였다.
실시예 1.5 T 세포 제조
건강한 인간 공여자 백혈구 성분채집술을 상업적으로(Hemacare) 얻었다. 제조업체의 지시에 따라 EasySep 인간 T 세포 단리 키트(Stem Cell Technology, 카탈로그 번호 17951)를 사용한 음성 선택에 의해 또는 MultiMACSTM Cell24 Separator Plus 기기에서 StraightFrom® Leukopak® CD4/CD8 마이크로비드(Milteny, 카탈로그 번호 130-122-352)를 사용한 CD4/CD8 양성 선택에 의해 T 세포를 단리하였다. 추후 사용을 위해 Cryostor CS10 냉동 배지(카탈로그 번호 07930)에 T 세포를 동결보존하였다.
해동 시, 1X GlutaMAX, 10mM HEPES 완충액(10mM) 및 1% pen-strep(Gibco, 15140-122)이 보충되고 200 IU/㎖ IL2(Peprotech, 200-02), 5 ng/㎖ IL7(Peprotech, 200-07), 5 ng/㎖ IL15(Peprotech, 200-15) 및 2.5% 인간 혈청(Gemini, 100-512)이 추가로 보충된 CTS OpTmizer 기초 배지(CTS OpTmizer 배지(Gibco, A3705001)로 구성된 완전 T 세포 성장 배지에서 T 세포를 배양하였다. 밤새 방치한 후, 10^6개 세포/㎖ 밀도의 T 세포를 T 세포 TransAct 시약(1:100 희석, Miltenyi)으로 활성화하고, 37℃에서 24시간 또는 48시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 0.5×10^6/㎖ 밀도의 세포를 편집 적용을 위해 사용하였다.
달리 명시하지 않는 한, 다음을 제외하고는 비활성화된 T 세포에 대해 동일한 절차를 사용하였다. 해동 시, 200 U/㎖ IL2(Peprotech, 200-02), 5 ng/㎖ IL7(Peprotech, 200-07), 5 ng/㎖ IL15(Peprotech, 200-15)와 5% 인간 AB 혈청(Gemini, 100-512)이 추가로 보충된 CTS OpTmizer 기초 배지(Thermofisher, A10485-01), 1% pen-strep(Corning, 30-002-CI) 1X GlutaMAX(Thermofisher, 35050061), 10mM HEPES(Thermofisher, 15630080)로 구성된 CTS 완전 성장 배지에서 비활성화된 T 세포를 배양하고, 활성화 없이 24시간 동안 인큐베이션하였다. T 세포는 편집 적용을 위해 2.5% 인간 혈청 및 사이토카인을 포함하는 위에서 설명한 100㎕의 CTS OpTmizer 기초 배지에 10^6/㎖의 세포 밀도로 플레이팅하였다.
실시예 1.6 T 세포의 LNP 형질감염
T 세포를 실시예 1에서 이전에 기재된 바와 같이 제형화된 LNP로 형질감염시켰다. LNP 형질감염에 사용된 물질은 실시예 1에 기재되어 있다. LNP 용량 반응 곡선(DRC) 형질감염을 Hamilton Microlab STAR 액체 취급 시스템에서 수행하였다. 액체 처리기에 다음과 같이 제공하였다: (a) 딥 웰 96-딥 웰 플레이트의 맨 윗줄에 4X 목적하는 최고 LNP 용량, (b) 20 ㎍/㎖로 배지에 희석된 ApoE3, (c) 실시예 1에서 이전에 기재된 바와 같은 CTS OpTmizer 기초 배지로 구성된 완전 T 세포 성장 배지 및 (d) 96-웰 플랫 버텀 조직 배양 플레이트에서 100㎕에 10^6/㎖ 밀도로 플레이팅된 T 세포. 액체 처리기는 먼저 딥 웰 플레이트에서 4X LNP 용량으로부터 시작하여 LNP의 8-포인트 2-배 연속 희석을 수행하였다. 그런 다음, 동일한 부피의 ApoE3 배지를 각 웰에 첨가하였다. 후속적으로, 100㎕의 LNP-ApoE 혼합물을 각 T 세포 플레이트에 첨가하였다. 최고 용량에서 LNP의 최종 농도를 5 ㎍/㎖로 설정하였다. 5 ㎍/㎖의 ApoE3 및 T 세포의 최종 농도는 0.5×10^6개 세포/㎖의 최종 밀도였다. 플레이트를 활성화된 또는 활성화 중인(on-activated) T 세포에 대해 각각 5% CO2와 함께 37℃에서 24시간 또는 48시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, LNP로 처리한 T 세포를 수거하고, 표적 편집 또는 Cas9 단백질 발현 검출에 대해 분석하였다. 남은 세포를 LNP 처리 후 7일 내지 10일 동안 배양하고, 단백질 표면 발현을 유세포 측정법에 의해 평가하였다.
실시예 1.8 유세포 측정법 분석
TRAC에 의해 암호화된 T 세포 수용체 알파 사슬은 T 세포 수용체/CD3 복합체 조립 및 세포 표면으로의 전위에 필요하다. 편집 후 CD3 음성 세포의 백분율을 증가시켜 편집을 검정하였다. 유세포 측정법에 의해 세포 표면 단백질을 검정하기 위해, T 세포를 100㎕의 항체 칵테일(1:100 PE-항-인간 CD3[Biolegend, 카탈로그 번호 300441], 1:200 FITC 항-인간 CD4[Biolegend, 카탈로그 번호 300538], 1:200 APC 항-인간 CD8a[Biolegend, 카탈로그 번호 301049], FACS 완충액[PBS + 2% FBS + 2mM EDTA])에 현탁시키고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. T 세포를 세척한 다음, FACS 완충액(PBS + 2% FBS + 2mM EDTA)에 현탁시켰다. 후속적으로 T 세포를 Cytoflex 기기(Beckman Coulter)에서 처리하였다. FlowJo 소프트웨어 패키지(v.10.6.1 또는 v.10.7.1)를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다. 간략하게는, T 세포를 림프구에 이어 단일 세포에 대해 게이팅하였다. 이들 단일 세포를 CD8+/CD3- 세포가 선택된 CD4+/CD8+ 상태에 대해 게이팅하였다. 편집된 표적 유전자좌가 TCR 넉아웃을 초래한 세포 집단의 백분율을 결정하기 위해 CD8+/CD3- 세포의 퍼센트를 정량화하였다. Prism GraphPad(v.9.0)를 사용하여 TCR KO에 대한 용량 반응 곡선을 생성하기 위해 선형 회귀 모델을 사용하였다. 곡선의 최대 유효 농도의 절반(EC50) 및 최대 퍼센트 CD3-값을 각 LNP에 대해 계산하였다.
실시예 1.9. 차세대 시퀀싱("NGS") 및 편집 효율의 분석
게놈의 표적 위치에서의 편집 효율을 정량적으로 결정하기 위해, 시퀀싱을 이용하여 유전자 편집에 의해 도입된 삽입 및 결실의 존재를 확인하였다. PCR 프라이머를 관심 유전자 (예를 들어, TRAC) 내의 표적 부위 주위에 설계하고, 관심 게놈 영역을 증폭하였다. 프라이머 서열 설계는 현장 표준에 따라 수행하였다.
시퀀싱을 위한 화학물질을 추가하기 위해 제조업체의 프로토콜(Illumina)에 따라 추가적인 PCR을 수행하였다. 앰플리콘을 Illumina MiSeq 기기에서 시퀀싱하였다. 품질 점수가 낮은 것들을 제거한 후, 리드를 참조 게놈(예를 들어, hg38)에 정렬하였다. 리드를 포함하는 결과 파일을 참조 게놈(BAM 파일)에 매핑하였으며, 여기서 관심 표적 영역과 중첩되는 리드를 선택하고, 야생형 리드의 수 대 삽입 또는 결실("indel")을 포함하는 리드의 수를 계산하였다.
실시예 2 - T 세포에서의 화합물 6 조성물 스크리닝
2.1 CD3 양성 T 세포에서 LNP 이온화 가능한 지질의 특성화
편집 효능을 평가하기 위해, T 세포를 Cas9 mRNA 및 TRAC 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 캡슐화하는 다양한 몰 퍼센트의 지질 성분을 갖는 LNP 조성물로 처리하고, T 세포 수용체 표면 단백질의 손실에 대해 유세포 측정법으로 평가하였다.
LNP를 일반적으로 표 1에 표시된 지질 조성물을 사용하여 실시예 1과 같이 제조하였으며, 이는 각각 이온화 가능한 화합물 6/DSPC/콜레스테롤/PEG의 몰비로 표시된다. LNP는 Cas9(서열번호 4) 및 인간 TRAC를 표적으로 하는 sgRNA(서열번호 10)를 암호화하는 mRNA를 전달하였다. sgRNA 대 Cas9 mRNA의 카고 비는 중량 기준으로 1:2였다.
LNP 조성물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 Z-평균 및 수 평균 입자 크기, 다분산도(pdi), 총 RNA 함량 및 RNA의 캡슐화 효율에 대해 분석하였으며, 결과는 표 2에 나타나 있다. 지질 분석은 표 1에 나타난 바와 같이 각 성분의 실제 지질 수준을 몰-%로 보여주었다.
표 2의 LNP를 평가하여 CD3 양성(CD3+) T 세포에서의 편집 효율에 대한 LNP 조성 비의 효과를 결정하였다. 2명의 공여자(로트 번호 W0106 및 W0186)로부터 T 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하고, 활성화된 T 세포 및 비활성화된 T 세포 각각에 대해 형질감염시켰다. 형질감염 7일 후, 편집된 T 세포를 수거하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 유세포 측정법으로 표현형을 결정하였다.
CD3 음성(CD3-) T 세포의 백분율을 0.04 ㎍/㎖, 0.08 ㎍/㎖, 0.16 ㎍/㎖, 0.25 ㎍/㎖, 0.63 ㎍/㎖, 1.25 ㎍/㎖, 2.5 ㎍/㎖ 및 5 ㎍/㎖의 LNP 농도로 처리한 후 측정하였다. 각 LNP 용량에서의 CD3 음성 T 세포 평균 퍼센트, CD3 음성 최대 퍼센트 값 및 EC50은 활성화된 T 세포의 경우 표 3 및 도 1a에, 비활성화된 T 세포의 경우 표 4 및 도 1b에 나타나 있다. 대략적인 값은 물결표로 표시하고, 분석 소프트웨어에 의해 결정할 수 없는 값은 "ND"로 표시하였다.
실시예 3 - T 세포에서의 선택된 화합물 6 LNP 조성물 스크리닝
3.1 편집된 CD3+ T 세포에서의 선택된 LNP 조성물의 평가
LNP 편집 효능을 평가하기 위해, T 세포를 Cas9 mRNA 및 TRAC 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 캡슐화하는 다양한 몰비의 지질 성분과 함께 화합물 6을 포함하는 LNP 조성물로 처리하고, T 세포 수용체 표면 단백질의 손실에 대해 유세포 측정법으로 평가하였다.
LNP를 일반적으로 표 5에 나타낸 바와 같은 지질 조성물을 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였으며, 이는 각각 이온화 가능한 화합물 6/DSPC/콜레스테롤/PEG의 몰비로 표시된다. LNP는 Cas9 mRNA(서열번호 4) 및 인간 TRAC를 표적으로 하는 sgRNA(서열번호 10)를 암호화하는 mRNA를 전달하였다. sgRNA 대 Cas9 mRNA의 카고 비는 중량 기준으로 1:2였다.
LNP 조성물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 평균 입자 크기, 다분산도(pdi), 총 RNA 함량 및 RNA의 캡슐화 효율에 대해 분석하고, 결과를 표 5에 나타내었다. 지질 분석은 표 1에 나타낸 바와 같이 실제 지질 수준을 몰-%로 보여주었다.
2명의 공여자(로트 번호 W0106 및 W790)로부터 T 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하고, 형질감염시켰다. 형질감염 6일 후, 편집된 활성화된 및 비활성화된 T 세포를 수거하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 유세포 측정법으로 표현형을 결정하였다. CD3 음성 T 세포의 백분율을 0.04㎍, 0.08㎍, 0.16㎍, 0.31㎍, 0.63㎍, 1.25㎍, 2.5㎍ 및 5㎍의 LNP 농도로 처리한 T 세포에 대해 측정하였다. 각 LNP 용량에서의 CD3 음성 T 세포 평균 퍼센트, 계산된 CD3 최대 퍼센트 값 및 EC50은 활성화된 T 세포의 경우 표 6 및 도 2a에, 비활성화된 T 세포의 경우 표 7 및 도 2b에 나타나 있다.
실시예 4. T 세포에서의 화합물 6 조성물 스크리닝
4.1 CD3 양성 T 세포에서 LNP 이온화 가능한 지질의 특성화
LNP 편집 효능을 평가하기 위해, T 세포를 Cas9 mRNA 및 TRAC 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 캡슐화하는 대안적인 몰비의 지질 성분을 갖는 LNP 조성물로 처리하고, T 세포 수용체 표면 단백질의 손실에 대해 유세포 측정법으로 평가하였다.
LNP를 일반적으로 표 8에 나타낸 바와 같은 지질 조성물을 사용하여 실시예 1과 같이 제조하였으며, 이는 각각 이온화 가능한 화합물 6/DSPC/콜레스테롤/PEG의 몰비로 표시된다. LNP Cas9(서열번호 4) 및 인간 TRAC를 표적으로 하는 sgRNA(서열번호 10)를 암호화하는 mRNA를 전달하였다. sgRNA 대 Cas9 mRNA의 카고 비는 중량 기준으로 1:2 또는 1:1이었다. 비교 조성물 21은 1:2의 카고 비를 갖고, 나머지 LNP 카고 비는 1:1이었다.
LNP 조성물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 평균 입자 크기, 다분산도(pdi), 총 RNA 함량 및 RNA의 캡슐화 효율에 대해 분석하고, 결과를 표 8에 나타내었다. 지질 분석은 표 1에 나타낸 바와 같이 실제 지질 수준을 몰-%로 보여주었다.
단일 공여자(W0106)로부터 T 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하고, 활성화하고, 형질감염시켰다. 형질감염 7일 후, 편집된 활성화된 및 비활성화된 T 세포를 수거하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 유세포 측정법으로 표현형을 결정하였다.
CD3 음성 T 세포의 백분율을 0.04㎍, 0.08㎍, 0.16㎍, 0.25㎍, 0.63㎍, 1.25㎍, 2.5㎍ 및 5㎍의 LNP 농도로 처리한 후 측정하였다. 각 LNP 용량에서의 CD3 음성 T 세포 평균 퍼센트, CD3 최대 퍼센트 값 및 EC50은 표 9 및 표 10에 나타나 있다.
표 9 및 표 10에서 볼 수 있는 바와 같이, 이온화 가능한 지질의 양이 낮고, DSPC, 콜레스테롤 및 PEG 지질이 높은 LNP는 비교 조성물에 비해 놀라울 정도로 유리한 EC50 값을 나타내었다.
실시예 5 - T 세포에서의 이온화 가능한 지질 스크리닝
5.1 다양한 이온화 가능한 지질을 갖는 LNP 조성물의 특성화
편집에 대한 LNP의 다른 이온화 가능한 지질의 효과를 평가하기 위해, T 세포를 2개의 상이한 성분 비의 3가지 이온화 가능한 지질 화합물 중 하나로 제형화된 LNP 조성물로 처리하였다. LNP를 일반적으로 표 11에 나타낸 지질 조성물을 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였으며, 이는 각각 이온화 가능한 지질 화합물/DSPC/콜레스테롤/PEG의 몰비로 표시된다. 화합물 6, 화합물 8 및 화합물 11 각각을 35%의 이온화 가능한 지질, 15%의 DSPC, 47.5%의 콜레스테롤 및 2.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는 LNP 및 50%의 이온화 가능한 지질, 10%의 DSPC, 38.5%의 콜레스테롤 및 1.5% PEG-2k-DMG의 공칭 몰% 비의 지질 성분을 갖는 비교 LNP로 제형화하였다. LNP를 Cas9 mRNA 및 TRAC 유전자를 표적으로 하는 sgRNA로 캡슐화하고, 편집을 T 세포 수용체 표면 단백질의 손실에 대해 유세포 측정법으로 평가하였다.
LNP는 Cas9(서열번호 5) 및 sgRNA 표적화 및 인간 TRAC를 표적으로 하는 sgRNA(서열번호 10)를 암호화하는 mRNA를 전달하였다. 테스트된 LNP에 대한 sgRNA 대 Cas9 mRNA의 카고 비는 중량 기준으로 1:1이었다.
LNP 조성물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 평균 입자 크기, 다분산도(pdi), 총 RNA 함량 및 RNA의 캡슐화 효율에 대해 분석하고, 결과를 표 11에 나타내었다. 지질 분석은 표 1에 나타낸 바와 같이 실제 지질 수준을 몰-%로 보여주었다.
단일 공여자(W0106)로부터 T 세포를 일반적으로 비활성화된 T 세포를 형질감염 전 48시간 동안 휴지시킨 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하고, 활성화하고, 형질감염시켰다. 형질감염 7일 후, 편집된 활성화된 T 세포를 수거하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 유세포 측정법으로 표현형을 결정하였다.
CD3 음성 T 세포의 백분율을 0.04㎍, 0.08㎍, 0.16㎍, 0.25㎍, 0.63㎍, 1.25㎍, 2.5㎍ 및 5㎍의 LNP 농도로 처리한 후 측정하였다. 각 LNP 용량에서의 CD3 음성 T 세포 평균 퍼센트, CD3 최대 퍼센트 값 및 EC50은 활성화된 T 세포의 경우 표 12 및 도 3a에, 비활성화된 T 세포의 경우 표 13 및 도 3b에 나타나 있다.
실시예 6 - 선택된 LNP 조성물의 카고 비 평가
LNP 편집 효능에 대한 카고 비의 효과를 평가하기 위해, CD3 양성 T 세포를 다양한 비의 Cas9 mRNA 및 TRAC 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 갖는 LNP 조성물로 처리하였다. 편집을 T 세포 수용체 표면 단백질의 손실에 대해 유세포 측정법으로 평가하였다.
6.1 활성화된 T 세포에서의 카고 비 평가
표 14에 기재된 선택된 LNP의 편집 효율에 대한 다양한 카고 비의 효과를 활성화된 CD3 양성 T 세포에서 테스트하였다. LNP를 일반적으로 표 14에 나타낸 지질 조성물을 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였으며, 이는 각각 이온화 가능한 화합물 6/DSPC/콜레스테롤/PEG의 몰비로 표시된다. LNP는 Cas9 mRNA(서열번호 5) 및 TRAC 유전자를 표적으로 하는 sgRNA(서열번호 10)를 암호화하는 mRNA를 전달하였다. 편집을 T 세포 수용체 표면 단백질의 손실에 대해 유세포 측정법으로 평가하였다. sgRNA 대 Cas9 mRNA의 카고 비는 중량 기준으로 1:1, 1:2, 2:1 또는 4:1이었다.
LNP 조성물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 평균 입자 크기, 다분산도(pdi), 총 RNA 함량 및 RNA의 캡슐화 효율에 대해 분석하고, 결과를 표 14에 나타내었다. 지질 분석은 표 1에 나타낸 바와 같이 실제 지질 수준을 몰-%로 보여주었다.
T 세포를 단일 공여자(로트 번호 W0106)로부터 수집하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하고, 형질감염시켰다. 형질감염 7일 후, T 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 유세포 측정법 분석으로 표현형을 결정하였다. CD3 음성 T 세포의 백분율을 0.04㎍, 0.08㎍, 0.16㎍, 0.25㎍, 0.63㎍, 1.25㎍, 2.5㎍ 및 5㎍의 LNP 농도로 처리한 후 측정하였다. 각 LNP 용량에서의 CD3 음성 T 세포 평균 퍼센트, CD3 최대 퍼센트 값 및 EC50은 표 15 및 도 4a에 나타나 있다.
6.2 비활성화된 T 세포에서의 카고 비 평가
실시예 6.1에 기재된 선택된 LNP의 LNP 편집 효율에 대한 다양한 카고 비의 효과를 비활성화된 CD3 양성 T 세포에서 테스트하였다. 실시예 6.1에 기재된 선택된 LNP 조성물을 이 연구에 사용하였다.
T 세포를 2명의 공여자(로트 번호 W106, W790)로부터 수집하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하고, 형질감염시켰다. 형질감염 7일 후, 편집된 비활성화된 T 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 유세포 측정법 분석으로 표현형을 결정하였다.
CD3 음성 T 세포의 백분율을 0.04㎍, 0.08㎍, 0.16㎍, 0.25㎍, 0.63㎍, 1.25㎍, 2.5㎍ 및 5㎍의 LNP 농도에서 측정하였다. 각 LNP 용량에서의 CD3 음성 T 세포 평균 퍼센트, CD3 최대 퍼센트 값 및 EC50은 표 16과 표 17 및 도 4b에 나타나 있다.
실시예 7 - 혈청 배지 조건에서 평가된 LNP 조성물 활성
LNP 편집 효능을 평가하기 위해, CD3 양성 T 세포에서의 삽입 효율에 대한 대안적인 배지 조건의 효과를 평가하기 위해 LNP 조성물을 시험관내에서 테스트하였다. T 세포를 Cas9 mRNA 및 TRAC 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 캡슐화하는 다양한 몰비의 지질 성분을 갖는 LNP 조성물로 처리하였다. AAV6 바이러스 작제물은 TRAC 유전자좌로의 부위-특이적 통합을 위해 상동성 군(arm)의 측면에 있는 GFP 리포터를 암호화하는 상동성 지정 복구 주형(homology directed repair template: HDRT)을 전달하였다. TRAC 유전자 파괴를 T 세포 수용체 표면 단백질의 손실에 대해 유세포 측정법으로 평가하였다. 삽입은 GFP 발광에 대한 유세포 측정법으로 평가하였다.
LNP를 일반적으로 표 18에 나타낸 바와 같은 지질 조성물을 사용하여 실시예 1과 같이 제조하였으며, 이는 각각 이온화 가능한 화합물 6/DSPC/콜레스테롤/PEG의 몰비로 표시된다. LNP는 Cas9(서열번호 4) 및 인간 TRAC를 표적으로 하는 sgRNA(서열번호 10)를 암호화하는 mRNA를 전달하였다. sgRNA 대 Cas9 mRNA의 카고 비는 중량 기준으로 1:2였다.
LNP 조성물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 평균 입자 크기, 다분산도(pdi), 총 RNA 함량 및 RNA의 캡슐화 효율에 대해 분석하고, 결과를 표 18에 나타내었다. 지질 분석은 표 1에 나타낸 바와 같이 실제 지질 수준을 몰-%로 보여주었다.
단일 공여자(로트 번호 W0106)로부터 T 세포를 다음과 같이 배지를 변형하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. T 세포를 2.5% 인간 AB 혈청(HABS), 2.5% CTS 면역 세포 SR(Gibco, 카탈로그 번호 A25961-01) 혈청 대체물(SR), 5% 혈청 대체물(SR) 또는 2.5% 인간 AB 혈청과 2.5% 혈청 대체물의 조합물이 보충된 배지에 플레이팅하였다. T 세포를 실시예 1.5에 기재된 바와 같이 해동 후 24시간 동안 활성화하였다. 활성화 2일 후, T 세포를 실시예 1.6에 기재된 바와 같이 0.31 ㎍/㎖, 0.63 ㎍/㎖, 1.25 ㎍/㎖ 및 2.5 ㎍/㎖의 LNP 농도의 LNP로 형질감염시켰다. TRAC 유전자좌로의 부위-특이적 통합을 위해 상동성 군의 측면에 있는 GFP 리포터(Vigene; 서열번호 7)를 암호화하는 상동성 지정 복구 주형(HDRT)을 암호화하는 AAV6을 3×10e5개 바이러스 입자/세포의 감염 다중도(multiplicity of infection: MOI)로 각 웰에 첨가하였다. DNA-의존적 단백질 카이네이스의 소분자 저해제를 0.25μM로 첨가하였다. 이하 "DNAPKI 화합물 4"로 지칭되는 저해제는 9-(4,4-다이플루오로사이클로헥실)-7-메틸-2-((7-메틸-[1,2,4]트라이아졸로[1,5-a]피리딘-6-일)아미노)-7,9-다이하이드로-8H-퓨린-8-온이며, 또한 다음과 같이 표시된다:
.
DNAPKI 화합물 4는 다음과 같이 제조하였다:
일반적인 정보
모든 시약 및 용매는 상업적 공급업체로부터 구입하여 받은 그대로 사용하거나 또는 인용된 절차에 따라 합성하였다. 모든 중간체 및 최종 화합물은 실리카 겔 상에서 플래시 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. NMR 스펙트럼은 Bruker 또는 Varian 400MHz 분광계에서 기록하였으며, NMR 데이터는 주위 온도의 CDCl3에서 수집하였다. 화학적 이동은 CDCl3(7.26)에 대해 백만분의 일(parts per million: ppm)로 보고하였다. 1H NMR에 대한 데이터는 다음과 같이 보고하였다: 화학적 이동, 다중도(br = 넓음, s = 단일선, d = 이중선, t = 삼중선, q = 사중선, dd = 이중선의 이중선, dt = 삼중선의 이중선, m = 다중선), 결합 상수 및 적분. MS 데이터는 전기분무 이온화(electrospray ionization: ESI) 공급원이 있는 Waters SQD2 질량 분광계에서 기록하였다. 최종 화합물의 순도는 포토다이오드 어레이(PDA) 및 증발 광산란(ELS) 검출기가 있는 SQD2 질량 분광계가 장착된 Waters Acquity H-클래스 액체 크로마토그래피 기기를 사용하여 UPLC-MS-ELS로 결정하였다.
중간체 1a: (E)-N,N-다이메틸-N'-(4-메틸-5-나이트로피리딘-2-일)폼이미드아마이드
톨루엔(0.3M) 중 4-메틸-5-나이트로-피리딘-2-아민(5g, 1.0당량)의 용액에 DMF-DMA(3.0당량)를 첨가하였다. 혼합물을 110℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축시켜 잔사를 수득하고, 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 황색 고체(59%)로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, (CD3)2SO) δ 8.82 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 6.74 (s, 1H), 3.21 (m, 6H).
중간체 1b: (E)-N-하이드록시-N'-(4-메틸-5-나이트로피리딘-2-일)폼이미드아마이드
MeOH(0.2M) 중 중간체 1a(4g, 1.0당량)의 용액에 NH2OH·HCl(2.0당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여과액을 감압하에 농축시켜 잔사를 수득하였다. 잔사를 H2O와 EtOAc 사이에 분배시킨 후, EtOAc로 2회 추출하였다. 유기상을 감압하에 농축시켜 잔사를 수득하고, 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 백색 고체(66%)로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, (CD3)2SO) δ 10.52 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 10.08 (dd, J = 9.9, 3.7 Hz, 1H), 8.84 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 7.85 (dd, J = 9.7, 3.8 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 3.36 (s, 3 H).
중간체 1c: 7-메틸-6-나이트로-[1,2,4]트라이아졸로[1,5-a]피리딘
THF(0.4M) 중 중간체 1b(2.5g, 1.0당량)의 용액에 트라이플루오로아세트산 무수물(1.0당량)을 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 18시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여과액을 감압하에 농축시켜 잔사를 수득하였다. 잔사를 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 백색 고체(44%)로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.53 (s, 1H), 8.49 (s, 1H), 7.69 (s, 1H), 2.78 (d, J = 1.0 Hz, 3H).
중간체 1d: 7-메틸-[1,2,4]트라이아졸로[1,5-a]피리딘-6-아민
EtOH(0.1M) 중 Pd/C(10% w/w, 0.2당량)의 혼합물에 중간체 1c(1.0당량) 및 암모늄 폼에이트(5.0당량)를 첨가하였다. 혼합물을 105℃에서 2시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여과액을 감압하에 농축시켜 잔사를 수득하였다. 잔사를 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 담갈색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, (CD3)2SO) δ 8.41 (s, 2H), 8.07 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.43 (s, 1H), 2.22 (s, 3H).
중간체 1e: 8-메틸렌-1,4-다이옥사스피로[4.5]데케인
THF(0.6M) 중 메틸(트라이페닐)포스포늄 브로마이드(1.15당량)의 용액에 n-BuLi(1.1당량)를 -78℃에서 적가하고, 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 1,4-다이옥사스피로[4.5]데칸-8-온(50g, 1.0당량)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 수성 NH4Cl에 붓고, H2O로 희석하고, EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 감압하에 농축시켜 잔사를 수득하고, 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 무색 오일(51%)로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.67 (s, 1H), 3.96 (s, 4 H), 2.82 (t, J = 6.4 Hz, 4 H), 1.70 (t, J = 6.4 Hz, 4 H).
중간체 1f: 7,10-다이옥사다이스피로[2.2.46.23]도데케인
톨루엔(3M) 중 중간체 4a(5g, 1.0당량)의 용액에 ZnEt2(2.57당량)를 -40℃에서 적가하고, 혼합물을 -40℃에서 1시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 다이아이오도메테인(6.0당량)을 N2하에 -40℃에서 혼합물에 적가하였다. 그런 다음, 혼합물을 N2 분위기하에 20℃에서 17시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 수성 NH4Cl에 붓고, EtOAc로 2회 추출하였다. 합한 유기상을 염수(20㎖)로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 여과액을 진공에서 농축시켰다. 잔사를 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 담황색 오일(73%)로서 수득하였다.
중간체 1g: 스피로[2.5]옥탄-6-온
1:1 THF/H2O(1.0M) 중 중간체 4b(4g, 1.0당량)의 용액에 TFA(3.0당량)를 첨가하였다. 혼합물을 N2 분위기하에 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축시켜 THF를 제거하고, 2M NaOH(수성)로 잔사의 pH를 7로 조정하였다. 혼합물을 물에 붓고, EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기상을 염수로 세척하고, 무수 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 여과액을 진공에서 농축시켰다. 잔사를 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 담황색 오일(68%)로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 2.35 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 1.62 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 0.42 (s, 4H).
중간체 1h: N-(4-메톡시벤질)스피로[2.5]옥탄-6-아민
DCM(0.3M) 중 중간체 4c(2g, 1.0당량) 및 (4-메톡시페닐)메탄아민(1.1당량)의 혼합물에 AcOH(1.3당량)를 첨가하였다. 혼합물을 N2 분위기하에 20℃에서 1시간 동안 교반하였다. 그런 다음, NaBH(OAc)3(3.3당량)을 0℃에서 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 N2 분위기하에 20℃에서 17시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축시켜 DCM을 제거하고, 생성된 잔사를 H2O로 희석하고, EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기층을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 여과액을 감압하에 농축시켜 잔사를 수득하였다. 잔사를 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 회색 고체(51%)로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, (CD3)2SO) δ 7.15 - 7.07 (m, 2H), 6.77 - 6.68 (m, 2H), 3.58 (s, 3H), 3.54 (s, 2H), 2.30 (ddt, J = 10.1, 7.3, 3.7 Hz, 1H), 1.69 - 1.62 (m, 2H), 1.37 (td, J = 12.6, 3.5 Hz, 2H), 1.12 - 1.02 (m, 2H), 0.87 - 0.78 (m, 2H), 0.13 - 0.04 (m, 2H).
중간체 1i: 스피로[2.5]옥탄-6-아민
MeOH(0.25M) 중 Pd/C(10% w/w, 1.0당량)의 현탁액에 중간체 4d(2g, 1.0당량)를 첨가하고, 혼합물을 H2 분위기하에 80℃, 50Psi에서 24시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여과액을 감압하에 농축시켜 잔기를 수득하고, 이를 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, (CD3)2SO) δ 2.61 (tt, J = 10.8, 3.9 Hz, 1H), 1.63 (ddd, J = 9.6, 5.1, 2.2 Hz, 2H), 1.47 (td, J = 12.8, 3.5 Hz, 2H), 1.21 - 1.06 (m, 2H), 0.82 - 0.72 (m, 2H), 0.14 - 0.05 (m, 2H).
중간체 1j: 에틸 2-클로로-4-(스피로[2.5]옥탄-6-일아미노)피리미딘-5-카복실레이트
ACN(0.5M 내지 0.6M) 중 에틸 2,4-다이클로로피리미딘-5-카복실레이트(2.7g, 1.0당량) 및 중간체 1i(1.0당량)의 혼합물에 K2CO3(2.5당량)를 N2하에 한 번에 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여과액을 감압하에 농축시켜 잔사를 수득하였다. 잔사를 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 백색 고체(54%)로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, (CD3)2SO) δ 8.64 (s, 1H), 8.41 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.33 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 4.08 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 1.90 (dd, J = 12.7, 4.8 Hz, 2H), 1.64 (t, J = 12.3 Hz, 2H), 1.52 (q, J = 10.7, 9.1 Hz, 2H), 1.33 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.12 (d, J = 13.0 Hz, 2H), 0.40 - 0.21 (m, 4H).
중간체 1k: 2-클로로-4-(스피로[2.5]옥탄-6-일아미노)피리미딘-5-카복실산
1:1 THF/H2O(0.3M) 중 중간체 1j(2g, 1.0당량)의 용액에 LiOH(2.0당량)를 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 여과액을 감압하에 농축시켜 잔사를 수득하였다. 2M HCl로 잔사를 pH 2로 조정하고, 침전물을 여과에 의해 수집하고, 물로 세척하고, 진공하에 건조시켰다. 생성물을 추가적인 정제 없이 다음 단계에 직접 사용하였다(82%). 1H NMR (400 MHz, (CD3)2SO) δ 13.54 (s, 1H), 8.38 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.35 (s, 1H), 3.82 (qt, J = 8.2, 3.7 Hz, 1H), 1.66 (dq, J = 12.8, 4.1 Hz, 2H), 1.47 - 1.34 (m, 2H), 1.33 - 1.20 (m, 2H), 0.86 (dt, J = 13.6, 4.2 Hz, 2H), 0.08 (dd, J = 8.3, 4.8 Hz, 4H).
중간체 1l: 2-클로로-9-(스피로[2.5]옥탄-6-일)-7,9-다이하이드로-8H-퓨린-8-온
DMF(0.3M) 중 중간체 1k(1.5g, 1.0당량) 및 Et3N(1.0당량)의 혼합물에 DPPA(1.0당량)를 첨가하였다. 혼합물을 N2 분위기하에 120℃에서 8시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물에 부었다. 침전물을 여과에 의해 수집하고, 물로 세척하고, 진공하에 건조시켜 잔기를 수득하고, 이를 추가적인 정제 없이 다음 단계에 직접 사용하였다(67%). 1H NMR (400 MHz, (CD3)2SO) δ 11.68 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 4.26 (ddt, J = 12.3, 7.5, 3.7 Hz, 1H), 2.42 (qd, J = 12.6, 3.7 Hz, 2H), 1.95 (td, J = 13.3, 3.5 Hz, 2H), 1.82 - 1.69 (m, 2H), 1.08 - 0.95 (m, 2H), 0.39 (tdq, J = 11.6, 8.7, 4.2, 3.5 Hz, 4H).
중간체 1m: 2-클로로-7-메틸-9-(스피로[2.5]옥탄-6-일)-7,9-다이하이드로-8H-퓨린-8-온
1:1 THF/H2O(0.3M 내지 0.5M) 중 중간체 1l(1.0g, 1.0당량) 및 NaOH(5.0당량)이 혼합물에 MeI(2.0당량)를 첨가하였다. 혼합물을 N2 분위기하에 20℃에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축시켜 잔기를 수득하고, 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 담황색 고체(67%)로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.57 (s, 1H), 4.03 (tt, J = 12.5, 3.9 Hz, 1H), 3.03 (s, 3H), 2.17 (qd, J = 12.6, 3.8 Hz, 2H), 1.60 (td, J = 13.4, 3.6 Hz, 2H), 1.47 - 1.34 (m, 2H), 1.07 (s, 1H), 0.63 (dp, J = 14.0, 2.5 Hz, 2H), -0.05 (s, 4H).47 - 1.34(m, 2H), 1.07(s, 1H), 0.63(dp, J = 14.0, 2.5 Hz, 2H), -0.05(s, 4H).
DNAPKI 화합물 4: 7-메틸-2-((7-메틸-[1,2,4]트라이아졸로[1,5-a]피리딘-6-일)아미노)-9-(스피로[2.5]옥탄-6-일)-7,9-다이하이드로-8H-퓨린-8-온
DMF(0.2M 내지 0.3M) 중 중간체 1m(1.0당량) 및 중간체 1d(1.0당량), Pd(dppf)Cl2(0.2당량), XantPhos(0.4당량) 및 Cs2CO3(2.0당량)의 혼합물을 탈기시키고, N2로 3회 퍼징하고, 혼합물을 N2 분위기하에 130℃에서 12시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 혼합물을 물에 붓고, DCM으로 3회 추출하였다. 합한 유기상을 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 여과액을 진공에서 농축시켰다. 잔사를 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 생성물을 회백색 고체로서 수득하였다. 1H NMR (400 MHz, (CD3)2SO) δ 9.09 (s, 1H), 8.73 (s, 1H), 8.44 (s, 1H), 8.16 (s, 1H), 7.78 (s, 1H), 4.21 (t, J = 12.5 Hz, 1H), 3.36 (s, 3H), 2.43 (s, 3H), 2.34 (dt, J = 13.0, 6.5 Hz, 2H), 1.93 - 1.77 (m, 2H), 1.77 - 1.62 (m, 2H), 0.91 (d, J = 13.2 Hz, 2H), 0.31 (t, J = 7.1 Hz, 2H). MS: 405.5 m/z [M+H].
형질감염 5일 후, T 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 유세포 측정법 분석으로 표현형을 결정하여 LNP 조성물의 삽입 효율을 평가하였다. 표 19는 CD3 음성 세포의 퍼센트를 보여준다. TRAC에 의해 암호화된 T 세포 수용체 알파 사슬은 T 세포 수용체/CD3 복합체 조립 및 세포 표면으로의 전위에 필요하다. 따라서, 게놈 편집에 의한 TRAC 유전자의 파괴는 T 세포의 세포 표면에서 CD3 단백질의 손실을 초래한다. 각 배지 조건에 대한 GFP 양성 T 세포의 평균 백분율은 표 20 및 도 5에 나타나 있다. GFP 단백질을 발현하는 세포는 게놈으로의 성공적인 삽입을 나타낸다.
실시예 8 - 다양한 sgRNA를 사용한 LNP 조성물의 평가
여러 표적에 걸친 편집 효능을 평가하기 위해, T 세포를 Cas9 mRNA 및 TRAC(서열번호 10), TRBC(서열번호 11), HLA-A(서열번호 13) 또는 CIITA(서열번호 12) 유전자를 표적으로 하는 sgRNA를 캡슐화하는 다양한 몰비의 지질 성분을 갖는 LNP 조성물로 처리하였다. TRAC 또는 TRBC 편집은 편집 후 CD3 음성 세포의 백분율의 증가로 검정하였다. TRAC 또는 TRBC에 의해 각각 암호화된 T 세포 수용체 알파 사슬 및 T 세포 수용체 베타 사슬은 모두 T 세포 수용체/CD3 복합체 조립 및 세포 표면으로의 전위에 필요하다. 따라서, 게놈 편집에 의한 TRAC 또는 TRBC 유전자의 파괴는 T 세포의 세포 표면에서 CD3 단백질의 손실을 초래한다. CIITA는 HLA-클래스 II 유전자의 발현에 직접적으로 관여하는 전사 인자이므로, CIITA의 파괴는 세포 표면 HLA-DR DP DQ 대립유전자의 손실을 초래한다.
3명의 공여자(W0662, 110046967, 110044591)로부터의 건강한 인간 공여자 백혈구 성분채집술 상업적으로 얻었다(STEMCELL Technologies). T 세포를 제조업체의 지시에 따라 EasySep 인간 T-세포 단리 키트(Stem Cell Technology, 카탈로그 번호 17951)를 사용한 음성 선택 또는 MultiMACSTM Cell24 Separator Plus 기기에서 StraightFrom® Leukopak® CD4/CD8 마이크로비드(Milteny, 카탈로그 번호 130-122-352)를 사용한 CD4/CD8 양성 선택에 의해 단리하였다. T 세포를 향후 사용을 위해 Cryostor CS10 냉동 배지(카탈로그 번호 07930)에 동결보존하였다.
해동 시, T 세포를 1X GlutaMAX, 10mM HEPES 완충액(10mM) 및 1% pen-strep(Gibco, 15140-122)가 보충되고 200 IU/㎖ IL2(Peprotech, 200-02), 5 ng/㎖ IL7(Peprotech, 200-07), 5 ng/㎖ IL15(Peprotech, 200-15) 및 2.5% 인간 혈청(Gemini, 100-512)이 추가로 보충된 CTS OpTmizer 기초 배지(CTS OpTmizer 배지(Gibco, A3705001)로 구성된 완전 T 세포 성장 배지에서 배양하였다. 밤새 방치한 후, 10^6/㎖ 밀도의 T 세포를 T 세포 TransAct 시약(1:100 희석, Miltenyi)으로 활성화하고, 다음 방법을 사용하여 LNP로 처리하였다:
T 세포를 이온화 가능한 화합물 6/DSPC/콜레스테롤/PEG의 몰비로 표시되는 표 21에 나타낸 바와 같은 지질 조성물을 갖는 실시예 1에 기재된 바와 같이 제형화된 LNP로 형질감염시켰다. LNP는 나타낸 바와 같이 Cas9(서열번호 4) 및 sgRNA를 암호화하는 mRNA를 전달하였다. sgRNA 대 Cas9 mRNA의 카고 비는 중량 기준으로 50/10/35.5/1.5(화합물 6/DSPC/콜레스테롤/PEG) LNP 조성물의 경우 1:2였고, 35/15/47.5/2.5(화합물 6/DSPC/콜레스테롤/PEG) 조성물의 경우 1:1이었다. N:P 비는 달리 명시하지 않는 한 약 6이었다.
활성화된 T 세포를 실시예 1에서 이전에 기재된 바와 같이 제형화된 LNP로 형질감염시켰다. LNP 형질감염은 표 26의 각 조성물에 대해 기재된 바와 같이 활성화 후 순서 및 타이밍에 따라 발생하였다. CIITA를 표적으로 하는 sgRNA(서열번호 12)를 포함하는 T 세포는 활성화 직후 LNP로 처리하였고, HLA-A를 표적으로 하는 sgRNA(서열번호 13)를 포함하는 T 세포는 활성화 24시간 후에 처리하였고, TRAC를 표적으로 하는 sgRNA(서열번호 10)를 포함하는 T 세포는 활성화 48시간 후에 처리하였고, TRBC를 표적으로 하는 sgRNA(서열번호 11)를 포함하는 T 세포는 활성화 72시간 후에 처리하였다. LNP 처리된 세포를 사용할 때까지 5% CO2와 함께 37℃에서 인큐베이션하였다.
각 LNP 처리에 대해, T 세포를 96 웰 플레이트에 100㎕ 부피로 플레이팅하였다. 표 21에 나타낸 LNP의 8-포인트 2-배 연속 희석은 최고 LNP 최종 용량인 5 ㎍/㎖에서 시작하여 실시예 1에서 이전에 기재된 바와 같은 CTS OpTmizer 기초 배지로 구성된 ApoE 완전 T 세포 성장 배지를 사용하여 수행하였다. 후속적으로, 100㎕의 LNP-ApoE 혼합물을 웰에 플레이팅된 세포에 첨가하여 200㎕의 최종 부피에서 0.5×10^6/㎖의 최종 밀도 및 5 ㎍/㎖의 최종 ApoE 농도를 얻었다. 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 다음, 새로운 배지에서 1:4로 분할하였다.
인큐베이션 후, LNP로 처리된 T 세포를 수거하고, 표적 편집에 대해 분석하였다. 플레이트를 11일까지 5% CO2와 함께 37℃에서 인큐베이션한 다음, 유세포 측정법 분석을 위해 수거하였다.
유세포 측정법 분석
유세포 측정법으로 세포 표면 단백질을 검정하기 위해, T 세포를 CD3(Biolegend, 카탈로그 번호 300441) 또는 HLA-DR,DP,DQ(Biolegend, 카탈로그 번호 361712) 또는 HLA-A*02(Biolegend 카탈로그 번호 343320)를 표적으로 하는 항체와 혼합된 CD4(Biolegend, 카탈로그 번호 300538) 및 CD8a(Biolegend, 카탈로그 번호 301049)를 표적으로 하는 항체와 함께 인큐베이션하였다. T 세포를 Cytoflex 기기(Beckman Coulter)에서 후속적으로 처리하였다. FlowJo 소프트웨어 패키지(v.10.6.1 또는 v.10.7.1)를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다. 간략하게는, T 세포를 림프구에 이어 단일 세포에 대해 게이팅하였다. 이들 단일 세포를 CD8+/CD3-, CD8+/HLA-DR,DP,DQ- 또는 CD8+/HLA-A*02- 세포가 정량화되는 CD4+/CD8+ 상태에 대해 게이팅하였다.
CD8+/CD3-, CD8+/HLA-DR,DP,DQ-, CD8+/HLA-A2- 세포의 퍼센트를 정량화하여 편집된 표적 유전자좌가 TCR 넉아웃을 초래한 세포 집단의 백분율을 결정하였다. Prism GraphPad(v.9.0)를 사용한 TCR KO에 대한 용량 반응 곡선을 생성하기 위해 선형 회귀 모델을 사용하였다. 곡선의 최대 유효 농도의 절반(EC50) 및 CD3- 값의 최대 퍼센트를 각 LNP에 대해 계산하였다.
LNP 조성물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 Z-평균 및 수 평균 입자 크기, 다분산도(pdi), 총 RNA 함량 및 RNA의 캡슐화 효율에 대해 분석하고, 결과를 표 21에 나타내었다.
CD3 음성 T 세포의 백분율을 0.04 ㎍/㎖, 0.08 ㎍/㎖, 0.16 ㎍/㎖, 0.31 ㎍/㎖, 0.63 ㎍/㎖, 1.25 ㎍/㎖, 2.5 ㎍/㎖ 및 5 ㎍/㎖의 LNP 농도로 처리한 후 측정하였다. 검정은 3회 반복 수행하였다. 각 LNP 용량에서의 CD3 음성 T 세포 평균 퍼센트, CD3 값의 표준 편차 및 EC50은 표 22 내지 표 25 및 도 6a 내지 도 6d에 나타나 있다.
실시예 9 - 다중 유전자 파괴 및 삽입을 위한 다중 LNP 조성물의 순차적 전달
T 세포를 일련의 유전자 파괴 및 삽입으로 조작하였다. 건강한 공여자 세포를 4개의 LNP 조성물로 순차적으로 처리하였으며, 각 LNP 조성물은 Cas9(서열번호 4)를 암호화하는 mRNA 및 TRAC(서열번호 10), TRBC(서열번호 11), CIITA(서열번호 12) 또는 HLA-A(서열번호 13)를 표적으로 하는 sgRNA를 함께 공동 제형화하였다. LNP를 표시된 용량으로 각각 35:15:47.5:2.5 몰 비의 화합물 6, DSPC, 콜레스테롤 및 PEG2k-DMG(그룹 1 및 그룹 2) 또는 50:10:38.5:1.5 몰 비의 화합물 6, DSPC, 콜레스테롤 및 PEG2k-DMG(그룹 3)를 사용하여 표 26에 나타낸 그룹에 따라 제형화하였다. 그룹 1과 그룹 2는 LNP 농도가 다르다. 지질 핵산 어셈블리는 약 6의 지질 아민 대 RNA 포스페이트(N:P) 몰비 및 중량 기준으로 1:2의 gRNA 대 mRNA 비로 제형화하였다. TCR(서열번호 14)을 표적으로 하는 트랜스제닉 WT1을 AAV를 사용하여 상동성 지정 복구 주형을 전달함으로써 TRAC 절단 부위에 부위-특이적으로 통합하였다. LNP의 그룹을 매일 제조하고, 표 26에 기재된 바와 같이 T 세포에 순차적으로 전달하였다.
9.1 T 세포 제조
3개의 HLA-A*02:01+ 혈청형으로부터 T 세포를 2명의 건강한 공여자(STEMCELL Technologies)의 백혈구 성분채집 산물로부터 단리하였다. T 세포를 제조업체의 프로토콜에 따라 EasySep 인간 T 세포는 단리 키트(STEMCELL Technologies, 카탈로그 번호 17951)를 사용하여 단리하고, Cryostor CS10(STEMCELL Technologies, 카탈로그 번호 07930)을 사용하여 동결보존하였다. T 세포 편집을 시작하기 전날, 세포를 해동시키고, T 세포 활성화 배지(TCAM: 2.5% 인간 AB 혈청[Gemini #100-512], 1X GlutaMAX[Thermofisher #35050061], 10mM HEPES[Thermofisher #15630080], 200 U/㎖ IL-2[Peprotech #200-02], 5 ng/㎖ IL-7[Peprotech #200-07] 및 5 ng/㎖ IL-15[Peprotech #200-15]가 보충된 CTS OpTmizer[Thermofisher #A3705001])에서 밤새 휴지시켰다.
9.2 T 세포의 LNP 처리 및 확장
LNP를 해동시키고, ApoE 함유 배지에 희석하고, 다음과 같이 T 세포에 전달하였다.
제1일에, 표 26에 나타낸 바와 같은 LNP를 5 ㎍/㎖ rhApoE3(Peprotech 350-02)을 포함하는 TCAM에서 인큐베이션하였다. 한편, T 세포를 수거하고, 세척하고, 인간 시약인 T 세포 TransAct(Miltenyi, 130-111-160)를 1:50으로 희석하여 TCAM에 2×10^6개 세포/㎖의 밀도로 재현탁시켰다. T 세포 및 LNP-ApoE 배지를 1:1 비로 혼합하고, T 세포를 배양 플라스크에 밤새 플레이팅하였다.
제2일에, 표 26에 나타낸 바와 같은 LNP를 20 ㎍/㎖ rhApoE3(Peprotech 350-02)을 포함하는 TCAM에서 25 ㎍/㎖의 농도로 인큐베이션하였다. 그런 다음, LNP-ApoE 용액을 적절한 배양물에 10:1 비로 첨가하였다.
제3일에, 표 26에 나타낸 바와 같은 TRAC-LNP를 5 ㎍/㎖ rhApoE3(Peprotech 350-02)을 포함하는 TCAM에서 인큐베이션하였다. 한편, T 세포를 수거하고, 세척하고, TCAM에 1×10^6개 세포/㎖의 밀도로 재현탁시켰다. T 세포 및 LNP-ApoE 배지를 1:1 비로 혼합하고, T 세포를 배양 플라스크에 플레이팅하였다. 그런 다음, WT1(서열번호 14) AAV를 각 그룹에 3×10^5 GC/세포의 MOI로 첨가하였다. DNAPKI 화합물 4를 각 그룹에 0.25μM의 농도로 첨가하였다.
제4일에, 표 26에 나타낸 바와 같은 LNP를 5 ㎍/㎖ rhApoE3(Peprotech 350-02)을 포함하는 TCAM에서 인큐베이션하였다. 한편, T 세포를 수거하고, 세척하고, TCAM에 1×10^6개 세포/㎖의 밀도로 재현탁시켰다. T 세포 및 LNP-ApoE 배지를 1:1 비로 혼합하고, T 세포를 배양 플라스크에 플레이팅하였다.
제5일 내지 제13일에, T 세포를 T 세포 확장 배지(TCEM: 5% 인간 AB 혈청[Gemini #100-512], 1X GlutaMAX[Thermofisher #35050061], 10mM HEPES[Thermofisher #15630080], 200 U/㎖ IL-2[Peprotech #200-02], 5 ng/㎖ IL-7[Peprotech #200-07], 5 ng/㎖ IL-15[Peprotech #200-15]가 보충된 CTS OpTmizer[Thermofisher #A3705001]) 내 24-웰 GREX 플레이트(Wilson Wolf, 80192)로 옮기고, 제조업체의 프로토콜에 따라 확장시켰다. 간략하게는, T-세포를 8일 동안 확장시키고, 2일 내지 3일마다 배지를 교환하였다.
9.3 유세포 측정법 및 NGS에 의한 T 세포 편집의 정량화
확장 후, 편집된 T 세포를 유세포 측정법으로 검정하여 CIITA 넉아웃을 통한 HLA-A*02:01 넉아웃, HLA-DR-DP-DQ 넉다운, WT1-TCR 삽입(CD3+Vb8+) 및 잔류 내인성을 발현하는 세포의 백분율(CD3+Vb8-)을 결정하였다. T 세포를 다음 분자를 표적으로 하는 항체 칵테일과 함께 인큐베이션하였다: Vb8(Biolegend, 카탈로그 번호 348104), HLA-A2(Biolegend, 카탈로그 번호 343320), HLA-DRDPDQ(Biolegend, 카탈로그 번호 361712), CD4(Biolegend, 카탈로그 번호 300538), CD8(Biolegend, 카탈로그 번호 301046), CD3(Biolegend, 카탈로그 번호 317336), CCR7(Biolegend, 카탈로그 번호 353214), CD62L(Biolegend, 카탈로그 번호 304820), CD45RA(Biolegend, 카탈로그 번호 304134), CD45RO(Biolegend, 카탈로그 번호 304230), CD56(Biolegend, 카탈로그 번호 318328) 및 Viakrome(Beckman Coulter, 카탈로그 번호 C36628). 이후, 세포를 세척하고, Cytoflex LX 기기(Beckman Coulter)에서 처리하고, FlowJo 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석하였다. T 세포를 편집 및 삽입률이 결정되기 전에 크기 및 CD4/CD8 상태에 대해 게이팅하였다.
Cas9 mRNA 및 CIITA, HLA-A, TRAC 및 TRBC 유전자좌를 표적으로 하는 sgRNA를 전달하는 데 사용된 LNP 조성물을 실시예 1 및 실시예 8에 기재된 바와 같이 분석하였다.
순차적 T 세포 조작 후 관련 세포 표면 단백질을 발현하는 세포의 백분율은 CD8+ T 세포에 대해 표 27 및 도 7a에 나타나 있다. 모든 의도된 편집(즉, HLA-A 및 CIITA의 넉아웃과 조합된 WT1-TCR의 삽입; 또는 CD3+Vb8+ HLA-A-HLA-DRDPDQ- %)을 갖는 T 세포의 퍼센트는 각 그룹에 대해 도 7b에 나타나 있다. 높은 수준의 HLA-A 및 CIITA 넉아웃뿐만 아니라 WT1-TCR 삽입이 모든 그룹으로부터의 편집된 샘플에서 관찰되었으며, 이는 완전히 편집된 CD8+ T 세포의 75%를 초과하였다. 그룹 1에 사용된 더 낮은 용량(0.65 ㎍/㎖)은 더 높은 LNP 용량(2.5 ㎍/㎖)의 그룹 2 제형 및 그룹 3 제형 모두에서와 같이 모든 표적에 걸쳐 T 세포를 편집하는 데 있어 유사한 효능을 나타내었다.
실시예 10. NK 세포에서의 편집
10.1. LNP 조성물
LNP를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제형화하였다. LNP를 약 6의 지질 아민 대 RNA 포스페이트(N:P) 몰비, 조성물 64의 경우 중량 기준으로 1:2의 sgRNA 대 Cas9 mRNA 비(카고 비) 또는 조성물 65 및 화합물 6의 경우 중량 기준으로 1:1 카고 비로 제형화하였다. LNP는 Cas9(서열번호 4)를 암호화하는 mRNA 및 인간 AAVS1 유전자를 표적으로 하는 sgRNA(서열번호 15)를 전달하였다.
LNP의 지질 성분을 하전된 에어로졸 검출기(CAD)가 결합된 HPLC로 정량적으로 분석하였다. 4가지 지질 성분의 크로마토그래피 분리는 역상 HPLC에 의해 달성하였다. HPLC 지질 분석은 표 28에 나타낸 바와 같이 다음 실시예에 기재된 LNP 조성물의 각 성분에 대한 실제 지질 수준의 몰 퍼센트(몰-%)를 제공하였다.
LNP 조성물을 실시예 1에 기재된 방법에 따라 Z-평균 및 수 평균 입자 크기, 다분산도(PDI), 총 RNA 함량 및 RNA의 캡슐화 효율에 대해 분석하였으며, 결과를 표 29에 나타내었다.
NK 세포를 제조업체의 프로토콜에 따라 EasySep 인간 NK 세포는 단리 키트(STEM세포, 카탈로그 번호 17955)를 사용하여 건강한 공여자로부터 상업적으로 얻은 류코팩으로부터 단리하였다. 단리 후, NK 세포를 필요할 때까지 냉동 보관하였다. 세포를 해동한 후, NK 세포를 5% 인간 AB 혈청(GemCell 카탈로그 번호 100-512), 500 U/㎖ IL-2(Peprotech, 카탈로그 번호 200-02), 5 ng/㎖ IL-15(Peprotech, 카탈로그 번호 200-15), 10㎖ Glutamax(Gibco 카탈로그 번호 35050-61), 10㎖ HEPES(Gibco, 카탈로그 번호 15630-080) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(ThermoFisher, 카탈로그 번호 15140-122)이 포함된 CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 배지(Gibco, 카탈로그 번호 A10221-01)에서 밤새 휴지시켰다. 그런 다음, 휴지시킨 NK 세포를 41BBL(서열번호 16) 및 막 결합된 IL21(서열번호 17)을 발현하는 방사선 조사된 K562 세포와 1:1 비로 배양하였으며, 이를 3일 동안 위의 CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 배지에서 NK 활성화를 위한 피더 세포로 사용하였다.
활성화 3일 후, NK 세포를 Cas9(서열번호 4)를 암호화하는 mRNA 및 AAVS1 유전자좌를 표적으로 하는 sgRNA(서열번호 15)를 전달하는 LNP로 처리하였다. 2.5% 인간 AB 혈청 및 0.25μM DNAPKI 화합물 4가 포함된 위의 CTS™ OpTmizer™ T 세포 확장 배지에서 2.5 ㎍/㎖의 ApoE3(Peprotech 350-02)과 혼합된 10 ㎍/㎖ LNP로 시작하는 2-배 연속 희석 시리즈를 수행하여 12-포인트 용량 반응 곡선을 생성하였다. LNP의 총 RNA 카고의 최종 농도는 표 30에 나타낸 바와 같이 10 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 2.5 ㎍/㎖, 1.25 ㎍/㎖, 0.63 ㎍/㎖, 0.31 ㎍/㎖, 0.16 ㎍/㎖, 0.08 ㎍/㎖, 0.04 ㎍/㎖, 0.02 ㎍/㎖, 0.01 ㎍/㎖, 0.005 ㎍/㎖ 및 0 ㎍/㎖(비처리된 대조군)이었다. 혼합된 LNP를 1×10^6개 세포/㎖의 NK 세포에 1:1 비로 3회 반복하여 첨가하였다.
LNP 처리 7일 후, 게놈 DNA를 세포로부터 단리하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 NGS 분석을 수행하였다.
표시된 농도에서 LNP 조성물의 평균 편집 퍼센트, 표준 편차 및 EC50은 표 30에, 용량 반응 곡선은 도 8에 나타나 있다.
실시예 11. 단핵구 및 대식세포 편집
MultiMACS™ Cell24 Separator Plus 기기(Miltenyi Biotec)에서 제조업체의 프로토콜에 따라 인간의 StraightFrom® Leukopak® CD14 마이크로비드 키트(Miltenyi Biotec, 카탈로그 번호 130-117-020)를 사용하여 상업적으로 얻은 류코팩(Hmemacare)으로부터 CD14+ 세포를 단리하였다. CD14+ 세포를 해동시키고, 96-웰 비조직 배양 플레이트(Falcon, 351172)에서 5×10^5/㎖의 세포 밀도로 10 ng/㎖ GM-CSF(Stemcell, 78140.1)가 포함된 실시예 1에 기재된 바와 같은 OpTmizer 기초 배지에서 50,000개 세포/웰로 3회 반복하여 배양하였다. 2일 내지 3일마다, 웰당 OpTmizer 배지의 50%를 20 ng/㎖의 새로운 사이토카인 배지(GM-CSF(Stemcell, 78140.1), 2.5% 인간 혈청(HS) OpTmizer(Gibco, A3705001)로 교체하였다.
세포를 실시예 10에 기재된 바와 같이 제조된 LNP로 처리하였다. LNP를 10 ㎍/㎖의 ApoE3(Peprotech 350-02)과 함께 37℃에서 15분 동안 사전인큐베이션하였다. 사전인큐베이션된 LNP를 세포에 1:1 v/v 비로 첨가하여, 0 ㎍/㎖ 내지 1.25 ㎍/㎖의 최종 총 RNA 카고 용량을 생성하였다.
인큐베이션 후, 50㎕의 LNP 농도를 CD14+ 세포를 비조직 배양 플레이트(Falcon, 351172)에 플레이팅한 당일 단핵구에 그리고 비조직 배양 플레이트(Falcon, 351172)에서 5일간 인큐베이션한 후 대식세포에 첨가하였다. 단핵구 및 대식세포 플레이트를 사용할 때까지 37℃에서 인큐베이션하였다.
LNP 처리 6일 후, 게놈 DNA를 실시예 1에 기재된 바와 같이 단핵구로부터 단리하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 NGS를 위해 대식세포-조작된 세포를 수집하였다.
표시된 농도에서 각 LNP 조성물의 평균 편집 퍼센트, 표준 편차 및 EC50은 단핵구의 경우 표 31, 대식세포의 경우 표 32에 나타나 있다. 단핵구 및 대식세포에 대한 용량 반응 곡선은 각각 도 9a 및 도 9b에 도시되어 있다.
실시예 12. B 세포 편집
12.1. B 세포 단리 및 배양 및 배지 제조
B 세포(Hemacare)를 1% 페니실린-스트렙토마이신(ThermoFisher, 카탈로그 번호 15140122), 1 ㎍/㎖ CpG ODN 2006(Invivogen, 카탈로그 번호 tlrl-2006-1), 50 ng/㎖ IL-2(Peprotech, 카탈로그 번호 200-02), 50 ng/㎖ IL-10(Peprotech, 카탈로그 번호 200-10) 및 10 ng/㎖ IL-15(Peprotech, 카탈로그 번호 200-15)가 보충된 Stemspan SFEM 배지(StemCell Technologies, 카탈로그 번호 09650)에서 배양하였다. 다양한 농도의 다음 두 가지 배지 성분도 배지를 보충하는 데 사용하였다: 1. 인간 혈청 AB(Gemini Bioproducts, 카탈로그 번호 100-512, 로트 번호 H94X00K, 2.5% 및 5%) 및 2. MEGACD40L(Enzo Life Sciences, 카탈로그 번호 ALX-522-110-0000, 1ng/㎖ 및 100ng/㎖). B 세포를 제조하는 데 사용된 B 세포 배양 배지 조성물은 표 33에 기재되어 있다.
제조업체의 지시에 따라 MultiMACS Cell24 Separator Plus 기기에서 StraightFrom 류코팩 CD19 마이크로비드 키트(Miltenyi, 130-117-021)를 사용하여 건강한 인간 공여자(Hemacare)로부터의 류코팩으로부터 CD19 양성 선택에 의해 B 세포를 단리하였다. 단리된 CD19+ B 세포를 필요할 때까지 액체 질소에 냉동 보관하였다.
사용할 준비가 되면, B 세포를 해동시키고, 같은 날 B 세포 배지 1에서 활성화하였다.
B 세포 해동 및 활성화 2일 후, B 세포를 배지 2에서 배양하고, Cas9 mRNA(서열번호 4) 및 AAVS1을 표적으로 하는 gRNA(서열번호 15)를 전달하는 LNP로 처리하였다. 20 ㎍/㎖의 총 RNA 카고(최종 용량의 4x)에서 시작하여 1:2 연속 희석을 설정함으로써 8-포인트 용량 반응 곡선을 생성하기 위해 각 LNP에 대해 여러 농도를 테스트하였다. 이후에, B 세포 배지 2 중 4 ㎍/㎖ ApoE3을 첨가(최종 용량의 4x)한 후 B 세포를 1:1 비 v/v로 LNP-APOE3 혼합물에 첨가하여, 표 34에 나타낸 바와 같이 5 ㎍/㎖, 2.5 ㎍/㎖, 1.25 ㎍/㎖, 0.625 ㎍/㎖, 0.313 ㎍/㎖, 0.156 ㎍/㎖, 0.078 ㎍/㎖의 총 RNA 카고의 최종 용량을 얻었다. 세포를 실시예 10에 기재된 바와 같이 제조되고 분석된 LNP로 처리하거나 또는 대조군의 역할을 하도록 LNP로 처리하지 않았다.
LNP 처리 3일 후, 세포를 세척하고, B 세포 배지 3에 재현탁시켰다. LNP 처리 7일 후, 게놈 DNA를 세포로부터 단리하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 NGS 분석을 수행하였다.
표시된 농도에서 LNP 조성물의 평균 편집 퍼센트 및 표준 편차는 표 34에, 및 용량 반응 곡선은 도 10에 나타나 있다. "비처리된 B 세포"는 LNP 조성물로 처리하지 않았다.
다음 표 및 전체에서, 용어 "mA", "mC", "mU" 또는 "mG"는 2'-O-Me로 변형된 뉴클레오타이드를 나타내는 데 사용된다.
다음 표에서, "*"는 PS 변형을 나타내는 데 사용된다. 본 출원에서, 용어 A*, C*, U* 또는 G*는 PS 결합으로 다음(예를 들어, 3') 뉴클레오타이드에 연결된 뉴클레오타이드를 나타내는 데 사용될 수 있다.
DNA 서열(T 포함)이 RNA와 관련하여 참조되면, T는 U로 대체되어야 하며(문맥에 따라 변형되거나 또는 변형되지 않을 수 있음), 그 반대의 경우도 마찬가지인 것으로 이해되어야 한다.
다음 표에서, 단일 아미노산 문자 코드는 펩타이드 서열을 제공하는 데 사용된다.
<110> INTELLIA THERAPEUTICS, INC. <120> LIPID NANOPARTICLE COMPOSITIONS <130> P239034IC <140> PCT/US2022/025076 <141> 2022-04-15 <150> 63/316,568 <151> 2022-03-04 <150> 63/274,153 <151> 2021-11-01 <150> 63/254,948 <151> 2021-10-12 <150> 63/176,227 <151> 2021-04-17 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 1 atggacaaga agtacagcat cggactggac atcggaacaa acagcgtcgg atgggcagtc 60 atcacagacg aatacaaggt cccgagcaag aagttcaagg tcctgggaaa cacagacaga 120 cacagcatca agaagaacct gatcggagca ctgctgttcg acagcggaga aacagcagaa 180 gcaacaagac tgaagagaac agcaagaaga agatacacaa gaagaaagaa cagaatctgc 240 tacctgcagg aaatcttcag caacgaaatg gcaaaggtcg acgacagctt cttccacaga 300 ctggaagaaa gcttcctggt cgaagaagac aagaagcacg aaagacaccc gatcttcgga 360 aacatcgtcg acgaagtcgc ataccacgaa aagtacccga caatctacca cctgagaaag 420 aagctggtcg acagcacaga caaggcagac ctgagactga tctacctggc actggcacac 480 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tcgcaaacct ggcaggaagc ccggcaatca agaagggaat cctgcagaca 2220 gtcaaggtcg tcgacgaact ggtcaaggtc atgggaagac acaagccgga aaacatcgtc 2280 atcgaaatgg caagagaaaa ccagacaaca cagaagggac agaagaacag cagagaaaga 2340 atgaagagaa tcgaagaagg aatcaaggaa ctgggaagcc agatcctgaa ggaacacccg 2400 gtcgaaaaca cacagctgca gaacgaaaag ctgtacctgt actacctgca gaacggaaga 2460 gacatgtacg tcgaccagga actggacatc aacagactga gcgactacga cgtcgaccac 2520 atcgtcccgc agagcttcct gaaggacgac agcatcgaca acaaggtcct gacaagaagc 2580 gacaagaaca gaggaaagag cgacaacgtc ccgagcgaag aagtcgtcaa gaagatgaag 2640 aactactgga gacagctgct gaacgcaaag ctgatcacac agagaaagtt cgacaacctg 2700 acaaaggcag agagaggagg actgagcgaa ctggacaagg caggattcat caagagacag 2760 ctggtcgaaa caagacagat cacaaagcac gtcgcacaga tcctggacag cagaatgaac 2820 acaaagtacg acgaaaacga caagctgatc agagaagtca aggtcatcac actgaagagc 2880 aagctggtca gcgacttcag aaaggacttc cagttctaca aggtcagaga aatcaacaac 2940 taccaccacg cacacgacgc atacctgaac gcagtcgtcg gaacagcact gatcaagaag 3000 tacccgaagc 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caaggccgac ctgcggctga tctacctggc cctggcccac 480 atgatcaagt tccggggcca cttcctgatc gagggcgacc tgaaccccga caactccgac 540 gtggacaagc tgttcatcca gctggtgcag acctacaacc agctgttcga ggagaacccc 600 atcaacgcct ccggcgtgga cgccaaggcc atcctgtccg cccggctgtc caagtcccgg 660 cggctggaga acctgatcgc ccagctgccc ggcgagaaga agaacggcct gttcggcaac 720 ctgatcgccc tgtccctggg cctgaccccc aacttcaagt ccaacttcga cctggccgag 780 gacgccaagc tgcagctgtc caaggacacc tacgacgacg acctggacaa cctgctggcc 840 cagatcggcg accagtacgc cgacctgttc ctggccgcca agaacctgtc cgacgccatc 900 ctgctgtccg acatcctgcg ggtgaacacc gagatcacca aggcccccct gtccgcctcc 960 atgatcaagc ggtacgacga gcaccaccag gacctgaccc tgctgaaggc cctggtgcgg 1020 cagcagctgc ccgagaagta caaggagatc ttcttcgacc agtccaagaa cggctacgcc 1080 ggctacatcg acggcggcgc ctcccaggag gagttctaca agttcatcaa gcccatcctg 1140 gagaagatgg acggcaccga ggagctgctg gtgaagctga accgggagga cctgctgcgg 1200 aagcagcgga ccttcgacaa cggctccatc ccccaccaga tccacctggg cgagctgcac 1260 gccatcctgc ggcggcagga ggacttctac 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gccgtggtgg gcaccgccct gatcaagaag 3000 taccccaagc tggagtccga gttcgtgtac ggcgactaca aggtgtacga cgtgcggaag 3060 atgatcgcca agtccgagca ggagatcggc aaggccaccg ccaagtactt cttctactcc 3120 aacatcatga acttcttcaa gaccgagatc accctggcca acggcgagat ccggaagcgg 3180 cccctgatcg agaccaacgg cgagaccggc gagatcgtgt gggacaaggg ccgggacttc 3240 gccaccgtgc ggaaggtgct gtccatgccc caggtgaaca tcgtgaagaa gaccgaggtg 3300 cagaccggcg gcttctccaa ggagtccatc ctgcccaagc ggaactccga caagctgatc 3360 gcccggaaga aggactggga ccccaagaag tacggcggct tcgactcccc caccgtggcc 3420 tactccgtgc tggtggtggc caaggtggag aagggcaagt ccaagaagct gaagtccgtg 3480 aaggagctgc tgggcatcac catcatggag cggtcctcct tcgagaagaa ccccatcgac 3540 ttcctggagg ccaagggcta caaggaggtg aagaaggacc tgatcatcaa gctgcccaag 3600 tactccctgt tcgagctgga gaacggccgg aagcggatgc tggcctccgc cggcgagctg 3660 cagaagggca acgagctggc cctgccctcc aagtacgtga acttcctgta cctggcctcc 3720 cactacgaga agctgaaggg ctcccccgag gacaacgagc agaagcagct gttcgtggag 3780 cagcacaagc actacctgga cgagatcatc 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ccaucuacca ccugcggaag 420 aagcuggugg acuccaccga caaggccgac cugcggcuga ucuaccuggc ccuggcccac 480 augaucaagu uccggggcca cuuccugauc gagggcgacc ugaaccccga caacuccgac 540 guggacaagc uguucaucca gcuggugcag accuacaacc agcuguucga ggagaacccc 600 aucaacgccu ccggcgugga cgccaaggcc auccuguccg cccggcuguc caagucccgg 660 cggcuggaga accugaucgc ccagcugccc ggcgagaaga agaacggccu guucggcaac 720 cugaucgccc ugucccuggg ccugaccccc aacuucaagu ccaacuucga ccuggccgag 780 gacgccaagc ugcagcuguc caaggacacc uacgacgacg accuggacaa ccugcuggcc 840 cagaucggcg accaguacgc cgaccuguuc cuggccgcca agaaccuguc cgacgccauc 900 cugcuguccg acauccugcg ggugaacacc gagaucacca aggccccccu guccgccucc 960 augaucaagc gguacgacga gcaccaccag gaccugaccc ugcugaaggc ccuggugcgg 1020 cagcagcugc ccgagaagua caaggagauc uucuucgacc aguccaagaa cggcuacgcc 1080 ggcuacaucg acggcggcgc cucccaggag gaguucuaca aguucaucaa gcccauccug 1140 gagaagaugg acggcaccga ggagcugcug gugaagcuga accgggagga ccugcugcgg 1200 aagcagcgga ccuucgacaa cggcuccauc ccccaccaga uccaccuggg cgagcugcac 1260 gccauccugc ggcggcagga ggacuucuac cccuuccuga aggacaaccg ggagaagauc 1320 gagaagaucc ugaccuuccg gauccccuac uacgugggcc cccuggcccg gggcaacucc 1380 cgguucgccu ggaugacccg gaaguccgag gagaccauca cccccuggaa cuucgaggag 1440 gugguggaca agggcgccuc cgcccagucc uucaucgagc ggaugaccaa cuucgacaag 1500 aaccugccca acgagaaggu gcugcccaag cacucccugc uguacgagua cuucaccgug 1560 uacaacgagc ugaccaaggu gaaguacgug accgagggca ugcggaagcc cgccuuccug 1620 uccggcgagc agaagaaggc caucguggac cugcuguuca agaccaaccg gaaggugacc 1680 gugaagcagc ugaaggagga cuacuucaag aagaucgagu gcuucgacuc cguggagauc 1740 uccggcgugg aggaccgguu caacgccucc cugggcaccu accacgaccu gcugaagauc 1800 aucaaggaca aggacuuccu ggacaacgag gagaacgagg acauccugga ggacaucgug 1860 cugacccuga cccuguucga ggaccgggag augaucgagg agcggcugaa gaccuacgcc 1920 caccuguucg acgacaaggu gaugaagcag cugaagcggc ggcgguacac cggcuggggc 1980 cggcuguccc ggaagcugau caacggcauc cgggacaagc aguccggcaa gaccauccug 2040 gacuuccuga aguccgacgg cuucgccaac cggaacuuca ugcagcugau 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agtctcctag acacgaagtg accgagatgg gccaagaagt gaccctgcgc tgcaagccta 1980 tcagcggcca cgattacctg ttctggtaca gacagaccat gatgagaggc ctggaactgc 2040 tgatctactt caacaacaac gtgcccatcg acgacagcgg catgcccgag gatagattca 2100 gcgccaagat gcccaacgcc agcttcagca ccctgaagat ccagcctagc gagcccagag 2160 atagcgccgt gtacttctgc gccagcagaa agacaggcgg ctacagcaat cagccccagc 2220 actttggaga tggcacccgg ctgagcatcc tggaagatct gaagaacgtg ttcccacctg 2280 aggtggccgt gttcgagcct tctgaggccg agatcagcca cacacagaaa gccacactcg 2340 tgtgtctggc caccggcttc tatcccgatc acgtggaact gtcttggtgg gtcaacggca 2400 aagaggtgca cagcggcgtc agcaccgatc ctcagcctct gaaagagcag cccgctctga 2460 acgacagcag atactgcctg agcagcagac tgagagtgtc cgccaccttc tggcagaacc 2520 ccagaaacca cttcagatgc caggtgcagt tctacggcct gagcgagaac gatgagtgga 2580 cccaggatag agccaagcct gtgacacaga tcgtgtctgc cgaagcctgg ggcagagccg 2640 attgtggctt taccagcgag agctaccagc agggcgtgct gtctgccaca atcctgtacg 2700 agatcctgct gggcaaagcc actctgtacg ccgtgctggt gtctgccctg gtgctgatgg 2760 ccatggtcaa gcggaaggat agcaggggcg gctccggtgc cacaaacttc tccctgctca 2820 agcaggccgg agatgtggaa gagaaccctg gccctatgga aaccctgctg aaggtgctga 2880 gcggcacact gctgtggcag ctgacatggg tccgatctca gcagcctgtg cagtctcctc 2940 aggccgtgat tctgagagaa ggcgaggacg ccgtgatcaa ctgcagcagc tctaaggccc 3000 tgtacagcgt gcactggtac agacagaagc acggcgaggc ccctgtgttc ctgatgatcc 3060 tgctgaaagg cggcgagcag aagggccacg agaagatcag cgccagcttc aacgagaaga 3120 agcagcagtc cagcctgtac ctgacagcca gccagctgag ctacagcggc acctactttt 3180 gtggcaccgc ctggatcaac gactacaagc tgtctttcgg agccggcacc acagtgacag 3240 tgcgggccaa tattcagaac cccgatcctg ccgtgtacca gctgagagac agcaagagca 3300 gcgacaagag cgtgtgcctg ttcaccgact tcgacagcca gaccaacgtg tcccagagca 3360 aggacagcga cgtgtacatc accgataaga ctgtgctgga catgcggagc atggacttca 3420 agagcaacag cgccgtggcc tggtccaaca agagcgattt cgcctgcgcc aacgccttca 3480 acaacagcat tatccccgag gacacattct tcccaagtcc tgagagcagc tgcgacgtga 3540 agctggtgga aaagagcttc gagacagaca ccaacctgaa cttccagaac ctgagcgtga 3600 tcggcttcag aatcctgctg ctcaaggtgg ccggcttcaa cctgctgatg accctgagac 3660 tgtggtccag ctaacctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc 3720 ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga 3780 ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca 3840 ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc 3900 tatggcttct gaggcggaaa gaaccagctg gggctctagg gggtatcccc actagtcgtg 3960 taccagctga gagactctaa atccagtgac aagtctgtct gcctattcac cgattttgat 4020 tctcaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat tctgatgtgt atatcacaga caaaactgtg 4080 ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc aacagtgctg tggcctggag caacaaatct 4140 gactttgcat gtgcaaacgc cttcaacaac agcattattc cagaagacac cttcttcccc 4200 agcccaggta agggcagctt tggtgccttc gcaggctgtt tccttgcttc aggaatggcc 4260 aggttctgcc cagagctctg gtcaatgatg tctaaaactc ctctgattgg tggtctcggc 4320 cttatccatt gccaccaaaa ccctcttttt actaagaaac agtgagcctt gttctggcag 4380 tccagagaat gacacgggaa aaaagcagat gaagagaagg tggcaggaga gggcacgtgg 4440 cccagcctca gtctctagat ctaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg 4500 cgcgctcgct cgctcactga ggccgcccgg gcaaagcccg ggcgtcgggc gacctttggt 4560 cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaa 4607 <210> 15 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 15 ccaauaucag gagacuagga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100 <210> 16 <211> 254 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro 1 5 10 15 Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val 20 25 30 Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe 35 40 45 Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser 50 55 60 Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp 65 70 75 80 Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val 85 90 95 Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp 100 105 110 Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu 115 120 125 Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe 130 135 140 Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser 145 150 155 160 Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala 165 170 175 Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala 180 185 190 Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala 195 200 205 Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His 210 215 220 Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val 225 230 235 240 Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 245 250 <210> 17 <211> 238 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Met Asp Trp Thr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val 1 5 10 15 His Ser His Lys Ser Ser Ser Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg 20 25 30 Met Arg Gln Leu Ile Asp Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn 35 40 45 Asp Leu Val Pro Glu Phe Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn 50 55 60 Cys Glu Trp Ser Ala Phe Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser 65 70 75 80 Ala Asn Thr Gly Asn Asn Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys 85 90 95 Leu Lys Arg Lys Pro Pro Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His 100 105 110 Arg Leu Thr Cys Pro Ser Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys 115 120 125 Glu Phe Leu Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln 130 135 140 His Leu Ser Ser Arg Thr His Gly Ser Glu Asp Ser Glu Gln Lys Leu 145 150 155 160 Ile Ser Glu Glu Asp Leu Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr 165 170 175 Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala 180 185 190 Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe 195 200 205 Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys 210 215 220 Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val 225 230 235 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 18 His His His His His His 1 5 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 8xHis tag <400> 19 His His His His His His His His 1 5

Claims (189)

  1. 지질 조성물 또는 이의 염으로서,
    생물학적 활성제(biologically active agent); 및
    지질 성분을 포함하되, 상기 지질 성분은
    a) 상기 지질 성분의 약 25몰% 내지 45몰% 양의 이온화 가능한 지질;
    b) 상기 지질 성분의 약 10몰% 내지 30몰% 양의 중성 지질;
    c) 상기 지질 성분의 약 25몰% 내지 65몰% 양의 헬퍼 지질; 및
    d) 상기 지질 성분의 약 1.5몰% 내지 3.5몰% 양의 PEG 지질
    을 포함하고; 상기 이온화 가능한 지질은 하기 화학식 (I)의 화합물

    이되, 식 중,
    X1은 O, NH 또는 직접 결합이고;
    X2는 C2-3 알킬렌이고;
    R3은 C1-3 알킬이고;
    R2는 C1-3 알킬이거나, 또는
    R2는 이것이 부착된 질소 원자 및 X2의 2개 내지 3개의 탄소 원자와 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하거나, 또는
    R2는 R3 및 이들이 부착된 질소 원자와 함께 5-원 고리를 형성하고;
    Y1은 C6-10 알킬렌이고;
    Y2는 , 및 로부터 선택되고;
    R4는 C4-11 알킬이고;
    Z1은 C2-5 알킬렌이고;
    Z2는 이거나 또는 존재하지 않고;
    R5는 C6-8 알킬, C5-10 알콕시(예를 들어, -OC5-10 할로알킬), -O(C2-3 알킬)OC6-10알킬, -OC6-10 알켄일(예를 들어, -OC6-10 분지형 알켄일) 또는 -OC6-10 알킨일이고, 그리고
    R6은 C6-8 알킬, C5-10 알콕시(예를 들어, -OC5-10 할로알킬), -O(C2-3 알킬)OC6-10알킬, -OC6-10 알켄일(예를 들어, -OC6-10 분지형 알켄일) 또는 -OC6-10 알킨일이거나, 또는
    R5는 R6과 함께 제미날(geminal) C6-8 알킬로 치환된 6-원 환식 아세탈을 형성하는, 지질 조성물.
  2. 지질 조성물 또는 이의 염으로서,
    생물학적 활성제; 및
    지질 성분을 포함하되, 상기 지질 성분은
    a) 상기 지질 성분의 약 25몰% 내지 45몰% 양의 이온화 가능한 지질;
    b) 상기 지질 성분의 약 10몰% 내지 30몰% 양의 중성 지질;
    c) 상기 지질 성분의 약 25몰% 내지 65몰% 양의 헬퍼 지질; 및
    d) 상기 지질 성분의 약 1.5몰% 내지 3.5몰% 양의 PEG 지질
    을 포함하고; 상기 이온화 가능한 지질은 하기 화학식 (I)의 화합물:

    이되, 식 중,
    X1은 O, NH 또는 직접 결합이고;
    X2는 C2-3 알킬렌이고;
    R3은 C1-3 알킬이고;
    R2는 C1-3 알킬이거나, 또는
    R2는 이것이 부착된 질소 원자 및 X2의 2개 내지 3개의 탄소 원자와 함께 5- 또는 6-원 고리를 형성하거나, 또는
    R2는 R3 및 이들이 부착된 질소 원자와 함께 5-원 고리를 형성하고;
    Y1은 C6-10 알킬렌이고;
    Y2는 , 및 로부터 선택되고;
    R4는 C4-11 알킬이고;
    Z1은 C2-5 알킬렌이고;
    Z2는 이거나 또는 존재하지 않고;
    R5는 C6-8 알킬 또는 C6-8 알콕시이고; 그리고
    R6은 C6-8 알킬 또는 C6-8 알콕시인, 지질 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질은 하기 화학식 (II)의 화합물:

    또는 이의 염이되, 식 중,
    X1은 O, NH 또는 직접 결합이고;
    X2는 C2-3 알킬렌이고;
    Z1은 C3 알킬렌이고, R5 및 R6은 각각 C6 알킬이거나 또는 Z1은 직접 결합이고, R5 및 R6은 각각 C8 알콕시이고; 그리고
    R8은 또는 인, 지질 조성물.
  4. 지질 조성물 또는 이의 염으로서,
    생물학적 활성제; 및
    지질 성분을 포함하되, 상기 지질 성분은
    a) 상기 지질 성분의 약 25몰% 내지 45몰% 양의 이온화 가능한 지질;
    b) 상기 지질 성분의 약 10몰% 내지 30몰% 양의 중성 지질;
    c) 상기 지질 성분의 약 25몰% 내지 65몰% 양의 헬퍼 지질; 및
    d) 상기 지질 성분의 약 1.5몰% 내지 3.5몰% 양의 PEG 지질
    을 포함하고; 상기 이온화 가능한 지질은
    ;
    ;
    ;
    ;
    ;
    ;
    ;
    ;
    ;
    ;
    ;
    ;
    ;
    ;
    ;
    ;
    ;
    ; 또는

    인, 지질 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질은
    ;
    ; 또는

    또는 이의 염인, 지질 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질은
    ;
    또는 이의 염인, 지질 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중성 지질은 하전되지 않은 지질 또는 양성이온성 지질인, 지질 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중성 지질은 DSPC 또는 DPME인, 지질 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중성 지질은 DSPC인, 지질 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헬퍼 지질은 콜레스테롤, 5-헵타데실레조르시놀 및 콜레스테롤 헤미석시네이트로부터 선택되는, 지질 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헬퍼 지질은 콜레스테롤인, 지질 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG 지질은 다이미리스토일글리세롤(DMG)을 포함하는, 지질 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG 지질은 PEG-2k를 포함하는, 지질 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG 지질은 PEG-DMG인, 지질 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG 지질은 PEG-2k DMG인, 지질 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG 지질은 1,2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000인, 지질 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질은
    이고; 중성 지질은 DSPC이고; 헬퍼 지질은 콜레스테롤이고; PEG 지질은 1,2-다이미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000인, 지질 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 29몰% 내지 38몰%인, 지질 조성물.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질의 양은 지질 성분의 약 30몰% 내지 43몰%인, 지질 조성물.
  20. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 25몰% 내지 34몰%인, 지질 조성물.
  21. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 33몰%인, 지질 조성물.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중성 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 11몰% 내지 20몰%인, 지질 조성물.
  23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중성 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 15몰%인, 지질 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헬퍼 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 43몰% 내지 65몰%인, 지질 조성물.
  25. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헬퍼 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 43몰% 내지 55몰%인, 지질 조성물.
  26. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헬퍼 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 49몰%인, 지질 조성물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 2.0몰% 내지 3.5몰%인, 지질 조성물.
  28. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 2.3몰% 내지 3.5몰%인, 지질 조성물.
  29. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 2.3몰% 내지 2.7몰%인, 지질 조성물.
  30. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 2.7몰%인, 지질 조성물.
  31. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 29몰% 내지 44몰%이고; 상기 중성 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 11몰% 내지 28몰%이고; 상기 헬퍼 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 28몰% 내지 55몰%이고; 상기 PEG 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 2.3몰% 내지 3.5몰%인, 지질 조성물.
  32. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 29몰% 내지 38몰%이고; 상기 중성 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 11몰% 내지 20몰%이고; 상기 헬퍼 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 43몰% 내지 55몰%이고; 상기 PEG 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 2.3몰% 내지 2.7몰%인, 지질 조성물.
  33. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 25몰% 내지 34몰%이고; 상기 중성 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 10몰% 내지 20몰%이고; 상기 헬퍼 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 45몰% 내지 65몰%이고; 상기 PEG 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 2.5몰% 내지 3.5몰%인, 지질 조성물.
  34. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 30몰% 내지 43몰%이고; 상기 중성 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 10몰% 내지 17몰%이고; 상기 헬퍼 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 43.5몰% 내지 56몰%이고; 상기 PEG 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 1.5몰% 내지 3몰%인, 지질 조성물.
  35. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질의 양은 상기 지질 성분의 지질 성분의 약 33몰%이고; 상기 중성 지질의 양은 상기 지질 성분의 지질 성분의 약 15몰%이고; 상기 헬퍼 지질의 양은 상기 지질 성분의 지질 성분의 약 49몰%이고; 상기 PEG 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 3몰%인, 지질 조성물.
  36. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 32.9몰%이고; 상기 중성 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 15.2몰%이고; 상기 헬퍼 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 49.2몰%이고; 상기 PEG 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 2.7몰%인, 지질 조성물.
  37. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이온화 가능한 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 35몰%이고; 상기 중성 지질의 양은 상기 지질 성분의 지질 성분의 약 15몰%이고; 상기 헬퍼 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 47.5몰%이고; 상기 PEG 지질의 양은 상기 지질 성분의 약 2.5몰%인, 지질 조성물.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각 몰%는 5% 미만만큼 가변적인(vary), 지질 조성물.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각 몰%는 1% 미만만큼 가변적인, 지질 조성물.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각 몰%는 0.5% 미만만큼 가변적인, 지질 조성물.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각 몰%는 상기 이온화 가능한 지질, 중성 지질, 헬퍼 지질 및 PEG 지질의 상대적 공칭 농도를 기준으로 하는, 지질 조성물.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각 몰%는 상기 이온화 가능한 지질, 중성 지질, 헬퍼 지질 및 PEG 지질의 상대적 실제 농도를 기준으로 하는, 지질 조성물.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물은 LNP의 형태이고; 상기 LNP는 약 145㎚ 미만의 Z-평균 직경을 갖는, 지질 조성물.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물은 LNP의 형태이고; 상기 LNP는 약 120㎚ 미만의 Z-평균 직경을 갖는, 지질 조성물.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP 조성물은 LNP의 형태이고; 상기 LNP는 약 115㎚ 미만의 Z-평균 직경을 갖는, 지질 조성물.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물은 LNP의 형태이고; 상기 LNP는 약 100㎚ 미만의 Z-평균 직경을 갖는, 지질 조성물.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물은 LNP의 형태이고; 상기 LNP는 약 50㎚ 초과의 수-평균 직경을 갖는, 지질 조성물.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물은 LNP의 형태이고; 상기 LNP는 약 60㎚ 초과의 수-평균 직경을 갖는, 지질 조성물.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물은 LNP의 형태이고; 상기 LNP는 약 0.005 내지 약 0.75의 다분산 지수를 갖는, 지질 조성물.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물은 LNP의 형태이고; 상기 LNP는 약 0.005 내지 약 0.1의 다분산 지수를 갖는, 지질 조성물.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물의 N/P 비는 약 5 내지 약 7인, 지질 조성물.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물의 N/P 비는 약 6인, 지질 조성물.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 활성제는 비핵산 성분을 포함하는, 지질 조성물.
  54. 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 활성제는 치료적으로 활성인 단백질을 포함하거나 또는 암호화하는, 지질 조성물.
  55. 제1항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 활성제는 게놈-편집 도구를 포함하거나 또는 암호화하는, 지질 조성물.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 활성제는 DNA 또는 RNA에서 단일 또는 이중 가닥 절단을 만들 수 있는 하나 이상의 뉴클레이스를 포함하거나 또는 암호화하는, 지질 조성물.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 활성제는 핵산 성분을 포함하는, 지질 조성물.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 활성제는 RNA를 포함하는, 지질 조성물.
  59. 제58항에 있어서, 상기 RNA는 mRNA인, 지질 조성물.
  60. 제59항에 있어서, 상기 핵산 성분은 RNA-가이드된 DNA-결합제를 암호화하는 mRNA를 포함하는, 지질 조성물.
  61. 제60항에 있어서, 상기 mRNA는 Cas 뉴클레이스 mRNA를 포함하는, 지질 조성물.
  62. 제60항에 있어서, 상기 mRNA는 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA를 포함하는, 지질 조성물.
  63. 제60항에 있어서, 상기 mRNA는 Cas9 뉴클레이스 mRNA를 포함하는, 지질 조성물.
  64. 제57항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 성분은 변형된 RNA를 포함하는, 지질 조성물.
  65. 제57항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 성분은 가이드 RNA 핵산을 포함하는, 지질 조성물.
  66. 제65항에 있어서, 상기 가이드 RNA 핵산은 gRNA인, 지질 조성물.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 상기 가이드 RNA 핵산은 이중-가이드 RNA(dgRNA)이거나 또는 이를 암호화하는, 지질 조성물.
  68. 제65항 또는 제66항에 있어서, 상기 가이드 RNA 핵산은 단일-가이드(sgRNA)이거나 또는 이를 암호화하는, 지질 조성물.
  69. 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 변형된 gRNA인, 지질 조성물.
  70. 제69항에 있어서, 상기 변형된 gRNA는 5' 말단에서 처음 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에 변형을 포함하는, 지질 조성물.
  71. 제69항 또는 제70항에 있어서, 상기 변형된 gRNA는 3' 말단에서 마지막 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에 변형을 포함하는, 지질 조성물.
  72. 제57항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 성분은 가이드 RNA 핵산을 포함하고; mRNA는 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA를 포함하고; mRNA 대 가이드 RNA 핵산의 비는 중량 기준으로 약 2:1 내지 1:4인, 지질 조성물.
  73. 제72항에 있어서, 상기 가이드 RNA 핵산 대 상기 클래스 2 Cas 뉴클레이스 mRNA의 비는 중량 기준으로 약 1:1인, 지질 조성물.
  74. 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물은 LNP 조성물인, 지질 조성물.
  75. 유전자 편집 방법으로서, 세포를 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 지질 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 유전자 편집은 유전자 넉아웃을 초래하는, 방법.
  77. 제75항에 있어서, 상기 유전자 편집은 유전자 교정을 초래하는, 방법.
  78. 제75항에 있어서, 상기 유전자 편집은 삽입을 초래하는, 방법.
  79. DNA를 절단하는 방법으로서, 세포를 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 지질 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  80. 생물학적 활성제를 세포에 전달하는 방법으로서, 상기 세포를 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 지질 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  81. 제75항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 단일 가닥 DNA 닉(nick)을 초래하는, 방법.
  82. 제75항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉시키는 단계는 이중-가닥 DNA 절단을 초래하는, 방법.
  83. 제75항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 주형 핵산을 상기 세포에 도입하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  84. 제75항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 지질 조성물을 상기 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  85. 제75항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물은 제1 지질 조성물이고, 상기 방법은 상기 세포를 mRNA, gRNA 및 gRNA 핵산 중 하나 이상을 포함하는 제2 지질 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 제2 지질 조성물은 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 제2 지질 조성물인, 방법.
  87. 제85항 또는 제86항에 있어서, 상기 제1 및 제2 지질 조성물은 동시에 투여되는, 방법.
  88. 제85항 또는 제86항에 있어서, 상기 제1 및 제2 지질 조성물은 순차적으로 투여되는, 방법.
  89. 제85항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 지질 조성물은 제1 gRNA를 포함하고, 상기 제2 지질 조성물은 제2 gRNA를 포함하되, 상기 제1 및 제2 gRNA는 상이한 표적 서열과 상보적인 상이한 가이드 서열을 포함하는, 방법.
  90. 제75항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 진핵생물 세포인, 방법.
  91. 제90항에 있어서, 상기 세포는 인간 세포인, 방법.
  92. 제75항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 입양 세포 요법(adoptive cell therapy: ACT)에 유용한, 방법.
  93. 제92항에 있어서, 상기 세포는 자가 세포 요법에 유용한, 방법.
  94. 제75항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 줄기 세포인, 방법.
  95. 제94항에 있어서, 상기 줄기 세포는 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell: HSC) 또는 유도 만능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cell: iPSC)인, 방법.
  96. 제75항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 면역 세포인, 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 면역 세포는 백혈구 또는 림프구인, 방법.
  98. 제96항에 있어서, 상기 면역 세포는 림프구인, 방법.
  99. 제98항에 있어서, 상기 림프구는 T 세포, B 세포 또는 NK 세포인, 방법.
  100. 제98항에 있어서, 상기 림프구는 T 세포인, 방법.
  101. 제98항에 있어서, 상기 림프구는 활성화된 T 세포인, 방법.
  102. 제98항에 있어서, 상기 림프구는 비활성화된 T 세포인, 방법.
  103. 제75항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 시험관내에서 상기 지질 조성물과 접촉되는, 방법.
  104. 제75항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 생체외에서 상기 지질 조성물과 접촉되는, 방법.
  105. 제75항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 동물의 조직을 상기 지질과 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
  106. 제75항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 지질 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  107. 제104항 또는 제106항에 있어서, 상기 동물은 인간인, 방법.
  108. 제75항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물은 T 세포 수용체, MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II의 표면 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 유전자를 표적으로 하는 gRNA를 포함하는, 방법.
  109. 제108항에 있어서, 상기 지질 조성물은 TRAC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하는, 방법.
  110. 제108항에 있어서, 상기 지질 조성물은 TRBC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하는, 방법.
  111. 제108항에 있어서, 상기 지질 조성물은 CIITA를 표적으로 하는 gRNA를 포함하는, 방법.
  112. 제108항에 있어서, 상기 지질 조성물은 HLA-A를 표적으로 하는 gRNA를 포함하는, 방법.
  113. 제108항에 있어서, 상기 지질 조성물은 HLA-B를 표적으로 하는 gRNA를 포함하는, 방법.
  114. 제108항에 있어서, 상기 지질 조성물은 HLA-C를 표적으로 하는 gRNA를 포함하는, 방법.
  115. 제108항에 있어서, 상기 지질 조성물은 B2M을 표적으로 하는 gRNA를 포함하는, 방법.
  116. 세포에서 다중 게놈 편집을 생성하는 방법으로서,
    시험관내에서 상기 세포를 적어도 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 제1 지질 조성물 및 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 제2 지질 조성물과 접촉시킴으로써 상기 세포에서 다중 게놈 편집을 생성하는 단계를 포함하되,
    상기 제1 지질 조성물의 생물학적 활성제는 제1 표적 서열에 대해 지시된 제1 가이드 RNA(gRNA) 및 선택적으로 핵산 게놈 편집 도구를 포함하고, 그리고
    상기 제2 지질 조성물의 생물학적 활성제는 제2 표적 서열에 대해 지시된 제2 gRNA 및 선택적으로 핵산 게놈 편집 도구를 포함하는, 방법.
  117. 제116항에 있어서, 상기 세포를 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 제3 지질 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 상기 제3 지질 조성물의 생물학적 활성제는 제3 표적 서열에 대해 지시된 제3 gRNA 및 선택적으로 핵산 게놈 편집 도구를 포함하는, 방법.
  118. 제117항에 있어서, 상기 세포를 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 제4 지질 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 상기 제4 지질 조성물의 생물학적 활성제는 제4 표적 서열에 대해 지시된 제4 gRNA 및 선택적으로 핵산 게놈 편집 도구를 포함하는, 방법.
  119. 제118항에 있어서, 상기 세포를 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 제5 지질 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 상기 제5 지질 조성물의 생물학적 활성제는 제5 표적 서열에 대해 지시된 제5 gRNA 및 선택적으로 핵산 게놈 편집 도구를 포함하는, 방법.
  120. 제119항에 있어서, 상기 세포를 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 제6 지질 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 상기 제6 지질 조성물의 생물학적 활성제는 제6 표적 서열에 대해 지시된 제6 gRNA 및 선택적으로 핵산 게놈 편집 도구를 포함하는, 방법.
  121. 제116항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 게놈 편집 도구를 포함하는 적어도 하나의 지질 조성물과 접촉되는, 방법.
  122. 제121항에 있어서, 상기 게놈 편집 도구는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산을 포함하는, 방법.
  123. 제116항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 표적 서열에 삽입하기 위해 공여자 핵산과 추가로 접촉되되, 선택적으로 상기 공여자 핵산은 벡터로서 제공되는, 방법.
  124. 제116항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물은 순차적으로 투여되는, 방법.
  125. 제116항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 2개의 지질 조성물은 동시에 투여되는, 방법.
  126. 제116항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 진핵생물 세포인, 방법.
  127. 제126항에 있어서, 상기 세포는 인간 세포인, 방법.
  128. 제116항 내지 제127항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 입양 세포 요법(ACT)에 유용한, 방법.
  129. 제128항에 있어서, 상기 세포는 입양 세포 요법에 유용한, 방법.
  130. 제116항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 줄기 세포인, 방법.
  131. 제130항에 있어서, 상기 줄기 세포는 조혈 줄기 세포(HSC) 또는 유도 만능성 줄기 세포(iPSC)인, 방법.
  132. 제116항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 면역 세포인, 방법.
  133. 제132항에 있어서, 상기 면역 세포는 백혈구 또는 림프구인, 방법.
  134. 제133항에 있어서, 상기 면역 세포는 림프구인, 방법.
  135. 제134항에 있어서, 상기 림프구는 T 세포, B 세포 또는 NK 세포인, 방법.
  136. 제132항에 있어서, 상기 면역 세포는 림프구, 단핵구, 대식세포, 비만 세포, 수지상 세포, 과립구, 일차 면역 세포, CD3+ 세포, CD4+ 세포, CD8+ T 세포, 조절 T 세포(Treg), B 세포, NK 세포 및 수지상 세포(DC)로부터 선택되는, 방법.
  137. 제132항에 있어서, 상기 세포는 T 세포인, 방법.
  138. 제137항에 있어서, 상기 세포는 활성화된 T 세포인, 방법.
  139. 제137항에 있어서, 상기 세포는 비활성화된 T 세포인, 방법.
  140. 제123항에 있어서, 상기 세포는 T 세포이고, 상기 공여자 핵산은 T 세포 수용체 서열의 상응하는 영역과 상동성을 갖는 영역을 포함하는, 방법.
  141. 제116항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물 중 하나는 TRAC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하는, 방법.
  142. 제116항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물 중 하나는 TRBC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하는, 방법.
  143. 제116항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물 중 하나는 MHC 클래스 I의 표면 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 유전자를 표적으로 하는 gRN를 포함하는, 방법.
  144. 제116항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물 중 하나는 MHC 클래스 II의 표면 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 유전자를 표적으로 하는 gRN를 포함하는, 방법.
  145. 제116항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물 중 하나는 TRAC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 TRBC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하는, 방법.
  146. 제116항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물 중 하나는 TRAC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 TRBC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 HLA-A를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 CIITA를 표적으로 하는 gRNA를 포함하는, 방법.
  147. 제116항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물 중 하나는 TRAC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 TRBC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 HLA-A를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 MHC 클래스 II의 표면 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 유전자를 표적으로 하는 gRNA를 포함하는, 방법.
  148. 제116항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물 중 하나는 TRAC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 TRBC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 MHC 클래스 I의 표면 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 유전자를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 CIITA를 표적으로 하는 gRNA를 포함하는, 방법.
  149. 제116항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물 중 하나는 T 세포 수용체의 표면 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 유전자를 표적으로 하는 gRN를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 HLA-A를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 CIITA를 표적으로 하는 gRNA를 포함하는, 방법.
  150. 제116항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물 중 하나는 TRAC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 HLA-A를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 CIITA를 표적으로 하는 gRNA를 포함하는, 방법.
  151. 제116항 내지 제145항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물 중 하나는 T 세포 수용체의 표면 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 유전자를 표적으로 하는 gRN를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 MHC 클래스 I의 표면 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 유전자를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 CIITA를 표적으로 하는 gRNA를 포함하는, 방법.
  152. 제116항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내에서 상기 세포를 확장시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
  153. 세포 집단에서 다중 게놈 편집을 생성하는 방법으로서,
    a) 시험관내에서 상기 세포 집단을 적어도 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 제1 지질 조성물 및 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 제2 지질 조성물과 접촉시킴으로써 상기 세포 집단에서 다중 게놈 편집을 생성하는 단계를 포함하되,
    상기 제1 지질 조성물의 생물학적 활성제는 제1 표적 서열에 대해 지시된 제1 가이드 RNA(gRNA) 및 선택적으로 핵산 게놈 편집 도구를 포함하고, 그리고
    상기 제2 지질 조성물의 생물학적 활성제는 제2 표적 서열에 대해 지시된 제2 gRNA 및 선택적으로 핵산 게놈 편집 도구를 포함하는, 방법.
  154. 제153항에 있어서, 상기 세포 집단을 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 제3 지질 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 상기 제3 지질 조성물의 생물학적 활성제는 제3 표적 서열에 대해 지시된 제3 gRNA 및 선택적으로 핵산 게놈 편집 도구를 포함하는, 방법.
  155. 제154항에 있어서, 상기 세포 집단을 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 제4 지질 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 상기 제4 지질 조성물의 생물학적 활성제는 제4 표적 서열에 대해 지시된 제4 gRNA 및 선택적으로 핵산 게놈 편집 도구를 포함하는, 방법.
  156. 제155항에 있어서, 상기 세포 집단을 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 제5 지질 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 상기 제5 지질 조성물의 생물학적 활성제는 제5 표적 서열에 대해 지시된 제5 gRNA 및 선택적으로 핵산 게놈 편집 도구를 포함하는, 방법.
  157. 제156항에 있어서, 상기 세포 집단을 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항의 제6 지질 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함하되, 상기 제6 지질 조성물의 생물학적 활성제는 제6 표적 서열에 대해 지시된 제6 gRNA 및 선택적으로 핵산 게놈 편집 도구를 포함하는, 방법.
  158. 제153항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단은 게놈 편집 도구를 포함하는 적어도 하나의 지질 조성물과 접촉되는, 방법.
  159. 제158항에 있어서, 상기 게놈 편집 도구는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산을 포함하는, 방법.
  160. 제153항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단은 표적 서열에 삽입하기 위해 공여자 핵산과 추가로 접촉되되, 선택적으로 상기 공여자 핵산은 벡터로서 제공되는, 방법.
  161. 제153항 내지 제160항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물은 순차적으로 투여되는, 방법.
  162. 제153항 내지 제160항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 2개의 지질 조성물은 동시에 투여되는, 방법.
  163. 제153항 내지 제162항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단은 진핵생물 세포의 집단인, 방법.
  164. 제163항에 있어서, 상기 세포 집단은 인간 세포의 집단인, 방법.
  165. 제153항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단은 입양 세포 요법(ACT)에 유용한, 방법.
  166. 제165항에 있어서, 상기 세포 집단은 자가 세포 요법에 유용한, 방법.
  167. 제153항 내지 제166항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단은 줄기 세포의 집단인, 방법.
  168. 제167항에 있어서, 상기 줄기 세포의 집단은 조혈 줄기 세포(HSC)의 집단 또는 유도 만능성 줄기 세포(iPSC)의 집단인, 방법.
  169. 제153항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단은 면역 세포의 집단인, 방법.
  170. 제169항에 있어서, 상기 면역 세포의 집단은 백혈구의 집단 또는 림프구의 집단인, 방법.
  171. 제170항에 있어서, 상기 면역 세포의 집단은 림프구의 집단인, 방법.
  172. 제171항에 있어서, 상기 림프구의 집단은 T 세포의 집단, B 세포의 집단 또는 NK 세포의 집단인, 방법.
  173. 제169항에 있어서, 상기 면역 세포는 림프구, 단핵구, 대식세포, 비만 세포, 수지상 세포, 과립구, 일차 면역 세포, CD3+ 세포, CD4+ 세포, CD8+ T 세포, 조절 T 세포(Treg), B 세포, NK 세포 및 수지상 세포(DC)로부터 선택되는, 방법.
  174. 제169항에 있어서, 상기 세포 집단은 T 세포의 집단인, 방법.
  175. 제174항에 있어서, 상기 세포는 활성화된 T 세포인, 방법.
  176. 제174항에 있어서, 상기 세포는 비활성화된 T 세포인, 방법.
  177. 제160항에 있어서, 상기 세포 집단은 T 세포의 집단이고, 상기 공여자 핵산은 T 세포 수용체 서열의 상응하는 영역과 상동성을 갖는 영역을 포함하는, 방법.
  178. 제153항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물 중 하나는 TRAC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하는, 방법.
  179. 제153항 내지 제178항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물 중 하나는 TRBC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하는, 방법.
  180. 제153항 내지 제179항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물 중 하나는 MHC 클래스 I의 표면 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 유전자를 표적으로 하는 gRN를 포함하는, 방법.
  181. 제153항 내지 제180항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물 중 하나는 MHC 클래스 II의 표면 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 유전자를 표적으로 하는 gRN를 포함하는, 방법.
  182. 제153항 내지 제181항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물 중 하나는 TRAC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 TRBC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하는, 방법.
  183. 제153항 내지 제182항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물 중 하나는 TRAC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 TRBC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 HLA-A를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 CIITA를 표적으로 하는 gRNA를 포함하는, 방법.
  184. 제153항 내지 제182항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물 중 하나는 TRAC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 TRBC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 HLA-A를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 MHC 클래스 II의 표면 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 유전자를 표적으로 하는 gRNA를 포함하는, 방법.
  185. 제153항 내지 제182항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물 중 하나는 TRAC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 TRBC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 MHC 클래스 I의 표면 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 유전자를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 CIITA를 표적으로 하는 gRNA를 포함하는, 방법.
  186. 제153항 내지 제182항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물 중 하나는 T 세포 수용체의 표면 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 유전자를 표적으로 하는 gRN를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 HLA-A를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 CIITA를 표적으로 하는 gRNA를 포함하는, 방법.
  187. 제153항 내지 제182항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물 중 하나는 TRAC를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 HLA-A를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 CIITA를 표적으로 하는 gRNA를 포함하는, 방법.
  188. 제153항 내지 제182항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 조성물 중 하나는 T 세포 수용체의 표면 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 유전자를 표적으로 하는 gRN를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 MHC 클래스 I의 표면 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 유전자를 표적으로 하는 gRNA를 포함하고, 상기 지질 조성물 중 하나는 CIITA를 표적으로 하는 gRNA를 포함하는, 방법.
  189. 제153항 내지 제188항 중 어느 한 항에 있어서, 시험관내에서 상기 세포 집단을 확장시키는 단계를 더 포함하는, 방법.
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