CN111630177A - 使用脂质纳米粒子的体外mrna递送方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及用于将mRNA引入干细胞诸如HSPC以及用于将基因编辑组分体外递送至此类细胞的组合物和方法。举例而言，本公开涉及在HSPC中使用CRISPR‑Cas9复合物修饰基因序列，以及用于在HSPC中实现这种基因修饰的方法和递送系统。

Description

使用脂质纳米粒子的体外MRNA递送方法

本申请要求2017年9月29日提交的美国临时专利申请号62/566,232的优先权，所述申请的内容以引用方式整体并入本文。

将遗传变化引入干细胞(包括造血干细胞(HSC))及其后代中，对于基因编辑和基因治疗方法具有重要意义。干细胞(诸如HSC)在成熟细胞和定向祖细胞中失去增殖能力，使得它们对于基因编辑技术特别有用。举例而言，体外修饰HSC和干细胞的能力很重要，并且需要将生物剂递送至培养物中的HSC和其他干细胞的方法。特别需要用于递送培养物中的人类HSC的技术。

HSC对于终身造血是必不可少的。HSC由于能够分化而产生所有髓系和淋巴系血液谱系的成熟后代或者能够自我更新而替代逐渐定向于分化的细胞，因此能够维持长期的功能性造血作用。HSC可用于恢复移植受者、免疫受损患者或其他患者体内的血液和免疫细胞。具体地，HSC的自体或同种异体移植可用于治疗患有遗传性免疫缺陷和自身免疫疾病以及多种造血病症的患者，以重建造血细胞谱系和免疫系统防御。

将CRISPR/Cas基因编辑系统的组分递送至培养物中的HSC的方法是特别受关注的。本文提供将RNA(包括CRISPR/Cas系统组分)递送至包括HSC的造血细胞培养物的方法。所述方法将活性蛋白递送至体外培养的干细胞(包括HSC)，并且包括使所述细胞与提供编码所述蛋白质的mRNA的脂质纳米粒子(LNP)组合物接触。另外，提供在干细胞诸如HSC中进行体外基因编辑的方法，以及产生工程化细胞的方法。

在一些实施方案中，提供在HSC中进行体外基因编辑的方法，以及产生工程化HSC细胞的方法。在另外的实施方案中，本文提供一种将mRNA递送至造血干细胞和/或祖细胞(HSPC)或HSPC群体的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将血清因子与包含mRNA、胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质的LNP组合物一起预孵育。在一些实施方案中，所述方法还包括在体外使HSPC或HSPC群体与预孵育的LNP组合物接触。在一些实施方案中，所述方法还包括在体外培养HSPC或HSPC群体。在一些实施方案中，所述方法导致将mRNA递送至HSPC或HSPC群体。

在一些实施方案中，本文提供一种将Cas核酸酶mRNA和gRNA引入干细胞例如HSPC的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将血清因子与包含Cas核酸酶mRNA、gRNA、胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质的LNP组合物一起预孵育。在一些实施方案中，所述方法还包括在体外使HSPC与预孵育的LNP组合物接触。在一些实施方案中，所述方法还包括培养HSPC。在一些实施方案中，所述方法导致将Cas核酸酶mRNA和gRNA引入HSPC。

在一些实施方案中，本文提供一种在体外产生基因工程化干细胞例如HSPC的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将血清因子与包含Cas核酸酶mRNA、gRNA、胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质的LNP组合物一起预孵育。在一些实施方案中，所述方法还包括在体外使HSPC与预孵育的LNP组合物接触。在一些实施方案中，所述方法还包括在体外培养HSPC。在一些实施方案中，所述方法导致产生基因工程化的HSPC。

在一些实施方案中，提供一种将mRNA递送至HSPC或HSPC群体的方法，所述方法包括将LNP组合物与血清因子一起预孵育，在体外使细胞或群体与预孵育的LNP组合物接触；以及在体外培养细胞或群体；从而将mRNA递送至HSPC。在一些实施方案中，HSPC为HSC。在一些实施方案中，所述方法将mRNA诸如Cas核酸酶mRNA递送至HSPC群体(例如CD34+细胞群体)。在某些实施方案中，将指导RNA(gRNA)任选地与Cas核酸酶mRNA组合递送至细胞。

附图说明

图1显示使用LNP在CD34+骨髓细胞中进行的绿色荧光蛋白(GFP)mRNA递送。

图2显示CD34+骨髓细胞中的mRNA递送取决于与血清的预孵育。

图3A和图3B显示血清预孵育下的CD34+骨髓细胞中的B2M编辑，其中图3A描绘B2M-细胞的百分比(蛋白质表达敲落)，并且图3B描绘在实验中实现的编辑百分比。

图4A和图4B显示血清预孵育和ApoE3预孵育下的有效递送。图4A描绘B2M-细胞的百分比，并且图4B提供在实验中实现的编辑百分比。

图5显示LNP与各种血清因子制剂的预孵育对LNP递送至CD34+细胞的影响。

图6A和图6B显示以不同间隔暴露于LNP处理的CD34+细胞的存活率和编辑数据。图6A显示在暴露于LNP后2小时、6小时和24小时，CD34+细胞的存活率。图6B提供2小时、6小时和24小时处理组的编辑百分比数据。

具体实施方式

本公开提供使用LNP组合物将RNA，包括CRISPR/Cas组分RNA(“货物”)体外递送至CD34+细胞，例如含HSC的细胞群体的方法。所述方法可展现相比于先前递送技术改善的特性，举例来说，所述方法提供了有效的RNA递送，同时减少了由转染引起的细胞死亡。

在一些实施方案中，本文提供一种将mRNA递送至干细胞例如HSPC或HSPC群体的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将血清因子与包含mRNA、胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质的LNP组合物一起预孵育。在一些实施方案中，所述方法还包括在体外使HSPC或HSPC群体与预孵育的LNP组合物接触。在一些实施方案中，所述方法还包括在体外培养HSPC或HSPC群体。在一些实施方案中，所述方法导致将mRNA递送至HSPC或HSPC群体。在一些实施方案中，mRNA编码Cas核酸酶。

在一些实施方案中，本文提供一种将Cas核酸酶mRNA和gRNA引入干细胞例如HSPC或HSPC群体的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将血清因子与包含Cas核酸酶mRNA、gRNA、胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质的LNP组合物一起预孵育。在一些实施方案中，所述方法还包括在体外使HSPC与预孵育的LNP组合物接触。在一些实施方案中，所述方法还包括培养HSPC。在一些实施方案中，所述方法导致将Cas核酸酶mRNA和gRNA引入HSPC。

在一些实施方案中，本文提供一种在体外产生基因工程化干细胞例如HSPC的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将血清因子与包含Cas核酸酶mRNA、gRNA、胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质的LNP组合物一起预孵育。在一些实施方案中，所述方法还包括在体外使HSPC与预孵育的LNP组合物接触。在一些实施方案中，所述方法还包括在体外培养HSPC。在一些实施方案中，所述方法导致产生基因工程化的HSPC。

在一些实施方案中，LNP组合物还包含gRNA。在一些实施方案中，mRNA编码2类Cas核酸酶。在某些实施方案中，货物或RNA组分包括Cas核酸酶mRNA，诸如2类Cas核酸酶mRNA。在某些实施方案中，货物或RNA组分包括CRISPR/Cas系统gRNA或编码gRNA的核酸。还提供基因编辑方法和制备工程化细胞的方法。

体外方法

本方法在体外将RNA递送至CD34+细胞。“CD34+细胞”是指在其表面上表达CD34标记物的细胞。可使用例如流式细胞仪和荧光标记的抗人类CD34抗体检测和计数CD34+细胞。

在一些实施方案中，提供一种将mRNA递送至干细胞例如HSPC或HSPC群体的方法，所述方法包括(a)将血清因子与包含mRNA、胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质的LNP组合物一起预孵育；(b)在体外使HSPC或HSPC群体与预孵育的LNP组合物接触；以及(c)在体外培养HSPC或HSPC种群；从而将mRNA递送至HSPC。在一些实施方案中，mRNA编码Cas核酸酶，诸如2类Cas核酸酶。在一些方面，2类Cas核酸酶mRNA是Cas9 mRNA或Cpf1 mRNA。在某些实施方案中，2类Cas核酸酶是酿脓链球菌Cas9。在一些实施方案中，LNP组合物还包含gRNA。在另外的实施方案中，所述方法将Cas核酸酶mRNA和gRNA引入HSPC，所述方法包括(a)将血清因子与包含Cas核酸酶mRNA、gRNA、胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质的LNP组合物一起预孵育；(b)在体外使HSPC与预孵育的LNP组合物接触；以及(c)培养HSPC；从而将Cas核酸酶和gRNA引入HSPC。

在各种实施方案中，本文所述的方法的gRNA可为双指导RNA(dgRNA)或单指导RNA(sgRNA)。

在体外方法的一些实施方案中，与已知技术如电穿孔相比，LNP转染可减少HSPC或CD34+细胞死亡。在一些实施方案中，LNP转染可引起少于5％、少于10％、少于20％、少于30％或少于40％的细胞死亡。在某些实施方案中，转染后细胞存活率为至少60％、70％、80％、90％或95％。

干细胞的特征在于自我更新和分化成多种细胞类型的能力。哺乳动物干细胞的两种广泛类型是胚胎干(ES)细胞和成体干细胞。成体干细胞或祖细胞可补充特化的细胞。大多数成体干细胞受谱系限制，并可能以其组织起源来称呼。ES细胞系来源于胚泡或早期桑椹胚期胚胎的内细胞团的上胚层组织。ES细胞是多能的，产生三个生发层，即外胚层、内胚层和中胚层的衍生物。诱导性多能干细胞(iPSC)是已通过被迫表达对维持胚胎干细胞的确定特性至关重要的基因和因子，被基因重编程为胚胎干细胞样状态的成体细胞。举例而言，“干细胞”可为ESC、iPSC、祖细胞或HSPC。

术语“造血干细胞和/或祖细胞”和“HSPC”可互换使用，并且是指兼具HSC和造血祖细胞(“HPC”)的细胞群体。此类细胞可表征为例如CD34+。在示例性实施方案中，HSPC是从骨髓分离的。在其他示例性实施方案中，HSPC是从外周血分离的。在其他示例性实施方案中，HSPC是从脐带血分离的。

HSPC可来源于骨髓、外周血或脐带血，并且可能是自体的(患者自身的干细胞)或同种异体的(干细胞来自供体)。

如本文所用，术语“造血祖细胞”或“HPC”是指如下原始造血细胞：其具有有限的自我更新能力和多向分化(例如髓系、淋巴系)、单向分化(例如髓系或淋巴系)或细胞类型限制性分化(例如红系祖细胞)潜能，这取决于在造血层级结构中的位置(Doulatov等人，CellStem Cell 2012)。

如本文所用，术语“造血干细胞”或“HSC”还指代能自我更新并能分化成更成熟的血细胞的未成熟血细胞，所述更成熟的血细胞包括粒细胞(例如前髓细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、红细胞(例如网织红细胞、红细胞)、凝血细胞(例如原巨核细胞、血小板生成型巨核细胞、血小板)和单核细胞(例如单核细胞、巨噬细胞)。本领域已知此类细胞可包括或可不包括CD34+细胞。CD34+细胞是表达CD34细胞表面标记物的未成熟细胞。据信，CD34+细胞包括具有上述干细胞特性的细胞亚群。细胞群体(诸如包含多能HSC的HSPC)的移植可用于治疗白血病、淋巴瘤和其他病症。

HSC是可产生原始祖细胞(例如多能祖细胞)和/或定向于特定造血谱系的祖细胞(例如淋巴系祖细胞)的多能细胞。定向于特定造血谱系的干细胞可为T细胞谱系、B细胞谱系、树突状细胞谱系、朗格汉斯细胞谱系和/或淋巴组织特异性巨噬细胞谱系。另外，HSC还指代长期HSC(LT-HSC)和短期HSC(ST-HSC)。ST-HSC比LT-HSC更具活性和增殖性。但是，LT-HSC具有无限的自我更新能力(即，他们可在整个成体期存活)，而ST-HSC具有有限的自我更新能力(即，它们只能存活有限的时间段)。这些HSC中的任一种均可用于本文所述的任何方法中。任选地，ST-HSC是有用的，因为它们高度增殖，因此迅速增加了HSC及其后代的数目。

HSC、HPC和HSPC任选地从血液制品获得。血液制品包括从含有造血来源细胞的身体或身体器官获得的制品。这些来源包括骨髓、脐带、外周血(例如，动员的外周血，例如用动员剂诸如G-CSF或

(AMD3100)动员的外周血)、肝脏、胸腺、淋巴和脾脏。可按照本领域技术人员已知的方式富集前述所有血液制品(例如，呈粗制、未分级或分级形式)以获得具有HSC特征的细胞。同样，可针对HPC和/或HSPC群体特征富集这些血液制品。在一个实施方案中，HSC被表征为CD34+/CD38-/CD90+/CD45RA-。在多个实施方案中，HSC被表征为CD34+/CD90+/CD49f+细胞。在另外的实施方案中，HSC被表征为CD34+/CD38-/CD90+/CD45RA-。在多个实施方案中，HSC被表征为谱系-CD34+/CD90+/CD49f+细胞，其中“谱系”意指省略终末分化细胞例如T细胞、B细胞等的标记物。可通过用针对由已定向于造血谱系的细胞表达的表面标记物的抗体将细胞染色来除去这些标记物。这些标记物可包括但不限于：CD3(T细胞)、CD19(B细胞)、CD33(髓系细胞)、CD56(NK细胞)、CD235a(红系细胞)、CD71(红系细胞)。

当在细胞群体的情形中使用时，“富集”是指基于一种或多种标记物(例如CD34+)的存在而选择的细胞群体。细胞群体，诸如干细胞群体或HSPC群体，是指从生物来源(例如血液制品或组织)分离的且来源于超过一个细胞的真核哺乳动物(优选地是人类)细胞。

在预孵育过程中，血清因子可与LNP组合物接触，然后在体外递送至HSPC细胞。

体外方法的一些实施方案包括将血清因子和LNP组合物一起预孵育约30秒至过夜。在一些实施方案中，预孵育步骤包括将血清因子和LNP组合物一起预孵育约1分钟至1小时。在一些实施方案中，预孵育步骤包括预孵育约1-30分钟。在其他实施方案中，预孵育步骤包括预孵育约1-10分钟。另外的实施方案包括预孵育约5分钟。在某些实施方案中，以上提供的范围的端点和值可±0.5、1、2、3或4分钟。

在某些实施方案中，预孵育步骤在约4℃下发生。在某些实施方案中，预孵育步骤在约25℃下发生。在某些实施方案中，预孵育步骤在约37℃下发生。预孵育步骤可包括缓冲剂，诸如碳酸氢钠或HEPES。在某些实施方案中，缓冲液可包含HSPC培养基。在另外的实施方案中，缓冲液可由HSPC培养基组成。

将LNP组合物与血清因子预孵育可包括与血清、血清级分或分离的血清因子预孵育。在一些实施方案中，将LNP组合物与血清预孵育。血清可为哺乳动物、小鼠、灵长类动物或人类血清。在一些实施方案中，将LNP组合物与分离的血清因子预孵育。在某些实施方案中，血清因子为ApoE。在某些实施方案中，血清因子选自ApoE2、ApoE3和ApoE4。在另外的实施方案中，ApoE为重组蛋白，诸如重组人类蛋白。ApoE可为重组人类ApoE3。它可为重组人类ApoE4。

在一些实施方案中，所述方法包括在预孵育步骤之后，使干细胞(例如HSPC)或干细胞群体(例如HSPC群体)接触，例如使这些细胞与预孵育的LNP组合物接触。在一些实施方案中，所述方法包括在预孵育步骤之后，使干细胞群体诸如ES或iPSC群体接触，例如使这些细胞与预孵育的LNP组合物接触。在一些实施方案中，所述方法包括使细胞与预孵育的LNP组合物接触约1分钟至约72小时。在一些实施方案中，所述方法包括使细胞与预孵育的LNP组合物接触约1小时至约24小时。在一些实施方案中，所述方法包括使细胞与预孵育的LNP组合物接触约4小时至约24小时。在一些实施方案中，所述方法包括使细胞与预孵育的LNP组合物接触约4小时至约12小时。在一些实施方案中，所述方法包括使细胞与预孵育的LNP组合物接触约2小时至约12小时。在一些实施方案中，所述方法包括使细胞与预孵育的LNP组合物接触约6小时至约8小时。在一些实施方案中，所述方法包括使细胞与预孵育的LNP组合物接触约6小时至约24小时。在一些实施方案中，所述方法包括使细胞与预孵育的LNP组合物接触约6小时至约24小时。在一些实施方案中，所述方法包括使细胞与预孵育的LNP组合物接触约4小时至约12小时。在一些实施方案中，所述方法包括使细胞与预孵育的LNP组合物接触至少约0.5、1、2、4、6、8、10或12小时。在一些实施方案中，所述方法包括在接触步骤之后的洗涤步骤。洗涤步骤可包括介质。

在一些实施方案中，所述方法包括Cas核酸酶mRNA。在一些实施方案中，所述方法包括2类Cas核酸酶mRNA。在一些实施方案中，所述方法包括gRNA核酸，诸如gRNA。在某些实施方案中，所述方法包括至少两个gRNA核酸。在另外的实施方案中，所述方法包括3个或更多个gRNA核酸。在一些实施方案中，将mRNA(诸如Cas核酸酶mRNA)和gRNA配制在单一LNP组合物中。在一些实施方案中，所述方法包括共包封在LNP组合物中的mRNA(诸如Cas核酸酶mRNA)和gRNA核酸。在另外的实施方案中，所述方法包括单独封装在LNP中的mRNA和gRNA核酸。在某些实施方案中，将mRNA配制在第一LNP组合物中，并且将gRNA核酸配制在第二LNP组合物中。在一些实施方案中，同时施用第一LNP组合物和第二LNP组合物。在其他实施方案中，依序施用第一LNP组合物和第二LNP组合物。在体外方法的一些实施方案中，在预孵育步骤之前将第一LNP组合物和第二LNP组合物合并。在一些实施方案中，将第一LNP组合物和第二LNP组合物单独预孵育。

在一个实施方案中，可与包含gRNA的组合物的施用分开，将包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA的LNP组合物施用至细胞或细胞群体，诸如像HSPC或HSPC群体。在一个实施方案中，可与将模板核酸施用至细胞分开，将包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA和gRNA的LNP组合物施用至诸如HSPC或HSPC群体。在一个实施方案中，可将包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA的LNP组合物施用至诸如HSPC或HSPC群体，接着将包含gRNA的LNP组合物和模板依序施用至细胞或群体。在包含编码Cas核酸酶的mRNA的LNP组合物在包含gRNA的LNP组合物之前施用的实施方案中，施用可相隔约4、6、8、12、24、36、48或72小时；或约1、2或3天。

在本文所述体外方法的一些实施方案中，可在经由LNP转染后将干细胞、HSPC或HSPC群体在体外培养。

在一些实施方案中，将转染的干细胞、HSPC或HSPC群体在干细胞培养基，诸如HSPC培养基中扩增。在细胞的上下文中，“扩增”是指来自细胞(其可以相同或不同)的初始细胞群体的特有的一种或多种细胞类型的数量增加。用于扩增的初始细胞可能与产自扩增的细胞不同。体外方法的一些实施方案包括将HSPC或HSPC群体在HSPC培养基中培养。一些实施方案还包括将HSPC在包含干细胞扩增剂的HSPC培养基中扩增。参见例如WO2010/059401(例如，实施例1的化合物)、WO2013/110198和WO2017115268，所述文献关于用于干细胞扩增的合适化合物的内容以引用方式并入本文。“干细胞扩增剂”是指这样一种化合物：它使例如HSPC、HSC和/或HPC的细胞，相对于没有所述剂的相同细胞类型，以更快的速度增殖(例如，数目增加)。在一个示例性方面，干细胞扩增剂是芳烃受体途径的抑制剂。

在另外的实施方案中，体外方法还包括在接触步骤与培养步骤之间更换培养基。在另外的实施方案中，培养步骤包括细胞培养基，所述细胞培养基包含促血小板生成素(Tpo)、Flt3配体(Flt-3L)和人类干细胞因子(SCF)。在多个实施方案中，细胞培养基还包含人类白介素-6(IL-6)。在多个实施方案中，细胞培养基包含促血小板生成素(Tpo)、Flt3配体(Flt-3L)和人类干细胞因子(SCF)。

CRISPR/Cas货物

经由LNP制剂递送的CRISPR/Cas货物包括编码目标蛋白质的mRNA分子。举例而言，包括用于表达诸如绿色荧光蛋白(GFP)的蛋白质的mRNA，和RNA指导的DNA结合剂，或Cas核酸酶。提供LNP组合物，所述LNP组合物包括Cas核酸酶mRNA，例如允许在细胞中表达Cas9蛋白质的2类Cas核酸酶mRNA。另外，货物可含有一种或多种指导RNA或编码指导RNA的核酸。例如用于修复或重组的模板核酸也可包括在所述组合物中或模板核酸可用于本文所描述的方法中。

“mRNA”是指非DNA且包含可翻译成多肽(即，可充当通过核糖体和氨基酰化tRNA进行翻译的基质)的开放阅读框的多核苷酸。mRNA可包含包括核糖残基或其类似物，例如2’-甲氧基核糖残基的磷酸酯-糖主链。在一些实施方案中，mRNA磷酸酯-糖主链的糖基本上由核糖残基、2’-甲氧基核糖残基或它们的组合组成。一般来讲，mRNA不含大量胸苷残基(例如0个残基或少于30、20、10、5、4、3或2个胸苷残基；或小于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的胸苷含量)。mRNA可在其一些或全部尿苷位置处含有修饰的尿苷。

CRISPR/Cas核酸酶系统

所公开的制剂的一种组分为编码RNA指导的DNA结合剂(诸如Cas核酸酶)的mRNA。

如本文所用，“RNA指导的DNA结合剂”意指具有RNA和DNA结合活性的多肽或多肽复合物，或这种复合物的DNA结合亚单位，其中DNA结合活性具有序列特异性并且取决于RNA的序列。示例性RNA指导的DNA结合剂包括Cas裂解酶/切口酶以及它们的未活化形式(“dCasDNA结合剂”)。如本文所用，“Cas核酸酶”涵盖Cas裂解酶、Cas切口酶和dCas DNA结合剂。Cas裂解酶/切口酶和dCas DNA结合剂包括III型CRISPR系统的Csm或Cmr复合物、其Cas10、Csm1或Cmr2亚单位；I型CRISPR系统的级联复合物，其Cas3亚单位；以及2类Cas核酸酶。如本文所用，“2类Cas核酸酶”为具有RNA指导的DNA结合活性的单链多肽。2类Cas核酸酶包括2类Cas裂解酶/切口酶(例如H840A、D10A或N863A变体)，所述2类Cas裂解酶/切口酶还具有RNA指导的DNA裂解酶或切口酶活性；和2类dCas DNA结合剂，其中裂解酶/切口酶活性未活化。2类Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9(例如N497A、R661A、Q695A、Q926A变体)、HypaCas9(例如N692A、M694A、Q695A、H698A变体)、eSPCas9(1.0)(例如K810A、K1003A、R1060A变体)和eSPCas9(1.1)(例如K848A、K1003A、R1060A变体)蛋白质以及它们的修饰形式。Cpf1蛋白质(Zetsche等人，Cell，163:1-13(2015))与Cas9同源并且含有RuvC样核酸酶结构域。Zetsche的Cpf1序列以引用方式整体并入。参见例如Zetsche，表S1和表S3。参见例如Makarova等人，Nat Rev Microbiol，13(11):722-36(2015)；Shmakov等人，Molecular Cell，60:385-397(2015)。

在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂为2类Cas核酸酶。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂具有裂解酶活性，所述裂解酶活性也可称作双链核酸内切酶活性。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂包含Cas核酸酶，诸如2类Cas核酸酶(其可为例如II型、V型或VI型Cas核酸酶)。2类Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2和C2c3蛋白以及它们的修饰形式。Cas9核酸酶的实例包括酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌和其他原核生物(参见例如下一段落中的清单)的II型CRISPR系统的那些，以及它们的修饰(例如工程化或突变)型式。参见例如US2016/0312198A1；US 2016/0312199 A1。Cas切口酶的其他实例包括III型CRISPR系统的Csm或Cmr复合物，或其Cas10、Csm1或Cmr2亚单位；和I型CRISPR系统的级联复合物，或其Cas3亚单位。在一些实施方案中，Cas核酸酶可来自IIA型、IIB型或IIC型系统。关于各种CRISPR系统和Cas核酸酶的论述，参见例如Makarova等人，Nat.Rev.Microbiol.9:467-477(2011)；Makarova等人，Nat.Rev.Microbiol，13:722-36(2015)；Shmakov等人，Molecular Cell，60:385-397(2015)。

可衍生Cas核酸酶的非限制性示例性物种包括酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、链球菌属种(Streptococcussp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、无害李斯特菌(Listeria innocua)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、新凶手弗朗西斯菌(Francisellanovicida)、产琥珀酸沃廉菌(Wolinella succinogenes)、华德萨特菌(Sutterellawadsworthensis)、伽马变形菌(Gammaproteobacterium)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、产琥珀酸纤维杆菌(Fibrobactersuccinogene)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsisdassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、产绿色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、产绿色链霉菌、粉红链孢囊菌(Streptosporangiumroseum)、粉红链孢囊菌、嗜酸热脂环酸杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)、假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)、砷还原芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亚微小杆菌(Exiguobacteriumsibiricum)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、海洋微颤菌(Microscilla marina)、伯克霍尔德氏细菌(Burkholderiales bacterium)、萘降解极单胞菌(Polaromonasnaphthalenivorans)、单胞菌属种(Polaromonas sp.)、瓦氏鳄球藻(Crocosphaerawatsonii)、蓝丝菌属种(Cyanothece sp.)、铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)、聚球藻属(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋杆菌(Acetohalobiumarabaticum)、根制氨菌(Ammonifexdegensii)、热解纤维素菌(Caldicelulosiruptorbecscii)、脱硫菌候选种(CandidatusDesulforudis)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、Pelotomaculumthermopropionicum、嗜酸性喜温硫杆菌(Acidithiobacilluscaldus)、嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillusferrooxidans)、酒色异着色菌(Allochromatiumvinosum)、海杆菌属种(Marinobacter sp.)、嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcushalophilus)、瓦氏亚硝化球菌(Nitrosococcuswatsoni)、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonashaloplanktis)、消旋纤线杆菌(Ktedonobacterracemifer)、调查甲烷盐菌(Methanohalobiumevestigatum)、多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)、泡沫节球藻(Nodulariaspumigena)、念珠藻属种(Nostoc sp.)、极大节旋藻(Arthrospira maxima)、钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)、节旋藻属种(Arthrospira sp.)、林氏藻属种(Lyngbya sp.)、原型微鞘藻(Microcoleuschthonoplastes)、颤藻属种(Oscillatoriasp.)、运动石袍菌(Petrotogamobilis)、非洲栖热腔菌(Thermosiphoafricanus)、巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus)、灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)、红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculumlavamentivorans)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、氨基酸球菌属种(Acidaminococcus sp.)、毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)ND2006和海洋无核氯菌(Acaryochloris marina)。

在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自酿脓链球菌的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自嗜热链球菌的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自脑膜炎奈瑟氏菌的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自金黄色葡萄球菌的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自新凶手弗朗西斯菌的Cpf1核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自氨基酸球菌属种的Cpf1核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自毛螺科菌ND2006的Cpf1核酸酶。在其他实施方案中，Cas核酸酶为来自以下的Cpf1核酸酶：土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)、毛螺科菌、解蛋白丁酸弧菌(Butyrivibrioproteoclasticus)、异域菌门菌(Peregrinibacteria bacterium)、帕库氏菌(Parcubacteria bacterium)、史密斯氏菌(Smithella)、氨基酸球菌属、白蚁甲烷支原体菌候选种(CandidatusMethanoplasmatermitum)、挑剔真杆菌(Eubacteriumeligens)、牛眼莫拉氏菌(Moraxella bovoculi)、稻田钩端螺旋体(Leptospira inadai)、狗口腔卟啉单胞菌(Porphyromonascrevioricanis)、解糖胨普雷沃菌(Prevotelladisiens)或猕猴卟啉单胞菌(Porphyromonasmacacae)。在某些实施方案中，Cas核酸酶为来自氨基酸球菌属或毛螺菌科的Cpf1核酸酶。

野生型Cas9具有两个核酸酶结构域：RuvC和HNH。RuvC结构域裂解非靶DNA链，并且HNH结构域裂解靶DNA链。在一些实施方案中，Cas9核酸酶包含超过一个RuvC结构域和/或超过一个HNH结构域。在一些实施方案中，Cas9核酸酶为野生型Cas9。在一些实施方案中，Cas9能够诱导靶DNA中的双链断裂。在某些实施方案中，Cas核酸酶可裂解dsDNA，它可裂解dsDNA的一个链，或者它可不具有DNA裂解酶或切口酶活性。示例性Cas9氨基酸序列以SEQ ID NO:3形式提供。包括起始密码子和终止密码子的示例性Cas9 mRNA ORF序列以SEQ ID NO:4形式提供。适于包括在融合蛋白中的示例性Cas9 mRNA编码序列以SEQ ID NO:10形式提供。

在一些实施方案中，使用嵌合Cas核酸酶，其中蛋白质的一个结构域或区被不同蛋白质的一部分置换。在一些实施方案中，Cas核酸酶结构域可被来自诸如Fok1的不同核酸酶的结构域置换。在一些实施方案中，Cas核酸酶可为修饰的核酸酶。

在其他实施方案中，Cas核酸酶可来自I型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas核酸酶可为第I型CRISPR/Cas系统的级联复合物的组分。在一些实施方案中，Cas核酸酶可为Cas3蛋白质。在一些实施方案中，Cas核酸酶可来自III型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas核酸酶可具有RNA裂解活性。

在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂具有单链切口酶活性，即，可切割一个DNA链以产生单链断裂，也称为“切口”。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂包含Cas切口酶。切口酶为在dsDNA中产生切口，即，切割一个链但不切割DNA双螺旋的另一链的酶。在一些实施方案中，Cas切口酶为其中例如通过催化结构域的一种或多种改变(例如点突变)，使核酸内切酶活性位点未活化的Cas核酸酶的型式(例如上文所论述的Cas核酸酶)。关于Cas切口酶和示例性催化结构域改变的论述，参见例如美国专利号8,889,356。在一些实施方案中，Cas切口酶，诸如Cas9切口酶具有未活化的RuvC或HNH结构域。

在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂经修饰而仅含有一个功能核酸酶结构域。举例而言，剂蛋白质可经修饰以使得核酸酶结构域中的一者经突变或完全或部分缺失以降低其核酸裂解活性。在一些实施方案中，使用具有活性降低的RuvC结构域的切口酶。在一些实施方案中，使用具有非活性RuvC结构域的切口酶。在一些实施方案中，使用具有活性降低的HNH结构域的切口酶。在一些实施方案中，使用具有非活性HNH结构域的切口酶。

在一些实施方案中，Cas蛋白质核酸酶结构域中的保守氨基酸被取代以降低或改变核酸酶活性。在一些实施方案中，Cas核酸酶可包含RuvC或RuvC样核酸酶结构域中的氨基酸取代。RuvC或RuvC样核酸酶结构域中的示例性氨基酸取代包括D10A(基于酿脓链球菌Cas9蛋白质)。参见例如Zetsche等人(2015)Cell Oct 22:163(3):759-771。在一些实施方案中，Cas核酸酶可包含HNH或HNH样核酸酶结构域中的氨基酸取代。HNH或HNH样核酸酶结构域中的示例性氨基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A和D986A(基于酿脓链球菌Cas9蛋白质)。参见例如Zetsche等人(2015)。其他示例性氨基酸取代包括D917A、E1006A和D1255A(基于新凶手弗朗西斯菌U112Cpf1(FnCpf1)序列(UniProtKB-A0Q7Q2(CPF1_FRATN))。

在一些实施方案中，将与分别与靶序列的有义链和反义链互补的一对指导RNA组合提供编码切口酶的mRNA。在此实施方案中，指导RNA将切口酶引导至靶序列并且通过在靶序列的相对链上产生切口而引入DSB(即，双重切口)。在一些实施方案中，使用双重切口可提高特异性并减少脱靶效应。在一些实施方案中，连同靶向DNA的相对链的两个独立指导RNA使用切口酶以在靶DNA中产生双重切口。在一些实施方案中，连同被选择以紧密靠近的两个独立指导RNA使用切口酶以在靶DNA中产生双重切口。

在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂缺乏裂解酶和切口酶活性。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂包含dCas DNA结合多肽。dCas多肽具有DNA结合活性，而基本上缺乏催化(裂解酶/切口酶)活性。在一些实施方案中，dCas多肽为dCas9多肽。在一些实施方案中，缺乏裂解酶和切口酶活性的RNA指导的DNA结合剂或dCas DNA结合多肽为其中例如通过催化结构域的一种或多种改变(例如点突变)，使核酸内切酶活性位点未活化的Cas核酸酶的型式(例如上文所论述的Cas核酸酶)。参见例如US 2014/0186958 A1；US 2015/0166980 A1。

在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂包含一个或多个异源功能结构域(例如为或包含融合多肽)。

在一些实施方案中，异源功能结构域可促进将RNA指导的DNA结合剂输送至细胞核中。举例而言，异源功能结构域可为核定位信号(NLS)。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与1-10个NLS融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与1-5个NLS融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与一个NLS融合。在使用一个NLS的情况下，NLS可连接在RNA指导的DNA结合剂序列的N端或C端处。NLS也可插入RNA指导的DNA结合剂序列内。在其他实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与超过一个NLS融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与2、3、4或5个NLS融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与两个NLS融合。在某些情况下，两个NLS可相同(例如两个SV40 NLS)或不同。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂与连接在羧基末端处的两个SV40 NLS序列融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与两个NLS融合，一个NLS连接在N端处并且一个连接在C端处。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与3个NLS融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可不与NLS融合。在一些实施方案中，NLS可为单份序列，诸如像SV40 NLS、PKKKRKV或PKKKRRV。在一些实施方案中，NLS可为二分序列，诸如核质蛋白的NLS，KRPAATKKAGQAKKKK。在具体实施方案中，单一PKKKRKV NLS可连接在RNA指导的DNA结合剂的C端处。一个或多个接头任选地包括在融合位点处。

在一些实施方案中，异源功能结构域可能够修改RNA指导的DNA结合剂的细胞内半衰期。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂的半衰期可提高。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂的半衰期可降低。在一些实施方案中，异源功能结构域可能够提高RNA指导的DNA结合剂的稳定性。在一些实施方案中，异源功能结构域可能够降低RNA指导的DNA结合剂的稳定性。在一些实施方案中，异源功能结构域可充当蛋白质降解的信号肽。在一些实施方案中，蛋白质降解可由蛋白水解酶，诸如像蛋白酶体、溶酶体蛋白酶或钙蛋白酶蛋白酶介导。在一些实施方案中，异源功能结构域可包含PEST序列。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可通过添加泛素或多泛素链来修饰。在一些实施方案中，泛素可为类泛素蛋白(UBL)。类泛素蛋白的非限制性实例包括小类泛素修饰因子(SUMO)、泛素交叉反应蛋白(UCRP，也称为干扰素刺激基因-15(ISG15))、泛素相关修饰因子-1(URM1)、神经元-前驱体-细胞表达的发育下调蛋白-8(NEDD8，在酿酒酵母(S.cerevisiae)中也称作Rub1)、人类白细胞抗原F相关(FAT10)、自噬-8(ATG8)和自噬-12(ATG12)、Fau类泛素蛋白(FUB1)、膜锚定UBL(MUB)、泛素折叠修饰因子-1(UFM1)和类泛素蛋白-5(UBL5)。

在一些实施方案中，异源功能结构域可为标记结构域。标记结构域的非限制性实例包括荧光蛋白、纯化标签、表位标签和报告基因序列。在一些实施方案中，标记结构域可为荧光蛋白。合适荧光蛋白的非限制实例包括绿色荧光蛋白(例如，GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、sfGFP、EGFP、翡翠色(Emerald)、Azami绿(Azami Green)、单Azami绿(MonomericAzami Green)、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黄色荧光蛋白(例如，YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、蓝色荧光蛋白(例如，EBFP、EBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv、蓝宝石色(Sapphire)、T-蓝宝石色(T-sapphire))、青色荧光蛋白(例如，ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi青色(Midoriishi-Cyan))、红色荧光蛋白(例如，mKate、mKate2、mPlum、DsRed单色、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed单色(DsRed-Monomer)、HcRed串色(HcRed-Tandem)、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)和橙色荧光蛋白(mOrange、mKO、Kusabira橙色(Kusabira-Orange)、单Kusabira橙色(Monomeric Kusabira-Orange)、mTangerine、tdTomato)或任何其他合适的荧光蛋白。在其他实施方案中，标记结构域可为纯化标签和/或表位标签。非限制性的示例性标签包括谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase，GST)、壳质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白(thioredoxin，TRX)、聚(NANP)、串联亲和纯化(tandemaffinity purification，TAP)标签、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag1、Softag 3、链霉素、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis、8xHis、生物素羧基载体蛋白(BCCP)、聚His和钙调蛋白。非限制性的示例性报告基因包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、荧光素酶或荧光蛋白。

在其他实施方案中，异源功能结构域可将RNA指导的DNA结合剂靶向至特定细胞器、细胞型、组织或器官。在一些实施方案中，异源功能结构域可将RNA指导的DNA结合剂靶向至粒线体。

在其他实施方案中，异源功能结构域可为效应结构域。当RNA指导的DNA结合剂被引导至其靶序列时，例如当Cas核酸酶通过gRNA被引导至靶序列时，效应结构域可修饰或影响靶序列。在一些实施方案中，效应结构域可选自核酸结合结构域、核酸酶结构域(例如非Cas核酸酶结构域)、表观遗传修饰结构域、转录活化结构域或转录阻抑结构域。在一些实施方案中，异源功能结构域为核酸酶，诸如FokI核酸酶。参见例如美国专利号9,023,649。在一些实施方案中，异源功能结构域为转录活化因子或阻抑因子。参见例如Qi等人，“Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific controlof gene expression,”Cell 152:1173-83(2013)；Perez-Pinera等人，“RNA-guided geneactivation by CRISPR-Cas9-based transcription factors,”Nat.Methods 10:973-6(2013)；Mali等人，“CAS9 transcriptional activators for target specificityscreening and paired nickases for cooperative genome engineering,”Nat.Biotechnol.31:833-8(2013)；Gilbert等人，“CRISPR-mediated modular RNA-guidedregulation of transcription in eukaryotes,”Cell 154:442-51(2013)。因此，RNA指导的DNA结合剂基本上变成可使用指导RNA引导以结合所需靶序列的转录因子。在某些实施方案中，DNA修饰结构域为甲基化结构域，诸如脱甲基化或甲基转移酶结构域。在某些实施方案中，效应结构域为DNA修饰结构域，诸如碱基编辑结构域。在特定实施方案中，DNA修饰结构域为将特异性修饰引入DNA中的核酸编辑结构域，诸如脱氨酶结构域。参见例如WO 2015/089406；US 2016/0304846。WO 2015/089406和U.S.2016/0304846中所述的核酸编辑结构域、脱氨酶结构域和Cas9变体以引用方式并入本文。

核酸酶可包含至少一个与指导RNA(“gRNA”)相互作用的结构域。另外，核酸酶可通过gRNA被引导至靶序列。在2类Cas核酸酶系统中，gRNA与核酸酶以及靶序列相互作用，使其引导与靶序列的结合。在一些实施方案中，gRNA为靶向裂解提供特异性，并且核酸酶可以是通用的并且与不同gRNA配对以裂解不同靶序列。2类Cas核酸酶可与以上列出的类型、直系同源物和示例性物种的gRNA支架结构配对。

指导RNA(gRNA)

在本公开的一些实施方案中，LNP制剂的货物包括至少一个gRNA。gRNA可将Cas核酸酶或2类Cas核酸酶导引至靶核酸分子上的靶序列。在一些实施方案中，gRNA与2类Cas核酸酶结合并且通过2类Cas核酸酶提供裂解特异性。在一些实施方案中，gRNA和Cas核酸酶可形成核糖核蛋白(RNP)，例如CRISPR/Cas复合物，诸如CRISPR/Cas9复合物。在一些实施方案中，CRISPR/Cas复合物可为II型CRISPR/Cas9复合物。在一些实施方案中，CRISPR/Cas复合物可为V型CRISPR/Cas复合物，诸如Cpf1/指导RNA复合物。Cas核酸酶和同源gRNA可配对。与各2类Cas核酸酶配对的gRNA支架结构随特定CRISPR/Cas系统变化。

“指导RNA”、“gRNA”和简称“指导物”在本文中互换使用来指代crRNA(也称为CRISPR RNA)，或crRNA与trRNA(也称为tracrRNA)的组合。crRNA和trRNA可以单一RNA分子(单指导RNA，sgRNA)或以两个独立RNA分子(双指导RNA，dgRNA)形式缔合。“指导RNA”或“gRNA”是指各类型。trRNA可为天然存在的序列或与天然存在的序列相比具有修饰或改变的trRNA序列。

如本文所用，“指导序列”是指指导RNA中与靶序列互补并且用以通过RNA指导的DNA结合剂将指导RNA引导至靶序列以供结合或修饰(例如裂解)的序列。“指导序列”也可称作“靶序列”或“间隔序列”。指导序列的长度可为20个碱基对，例如在酿脓链球菌(即，SpyCas9)和相关Cas9同源物/直系同源物的情况下。较短或较长序列也可用作指导物，例如长度为15、16、17、18、19、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施方案中，靶序列处于例如基因中或染色体上，并且与指导序列互补。在一些实施方案中，指导序列与其相应靶序列之间的互补性或同一性的程度可为约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，指导序列与标靶区可为100％互补或相同的。在其他实施方案中，指导序列和标靶区可含有至少一个错配。举例而言，指导序列和靶序列可含有1、2、3或4个错配，其中靶序列的总长度为至少17、18、19、20或更多个碱基对。在一些实施方案中，指导序列和标靶区可含有1-4个错配，其中指导序列包含至少17、18、19、20或更多个核苷酸。在一些实施方案中，指导序列和靶区可含有1、2、3或4个错配，其中指导序列包含20个核苷酸。

针对Cas蛋白质的靶序列包括基因组DNA的正链和负链两者(即，给定序列和所述序列的反向互补序列)，因为Cas蛋白质的核酸底物为双链核酸。因此，在讲述指导序列“与靶序列互补”的情况下，应理解，指导序列可引导指导RNA结合至靶序列的反向互补序列。因此，在一些实施方案中，在指导序列结合靶序列的反向互补序列的情况下，指导序列与靶序列(例如不包括PAM的靶序列)的某些核苷酸相同，不同之处在于指导序列中U取代T。

靶向序列的长度可取决于所使用的CRISPR/Cas系统和组分。举例而言，来自不同细菌物种的不同2类Cas核酸酶具有改变的最佳靶向序列长度。因此，靶向序列的长度可包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或大于50个核苷酸。在一些实施方案中，靶向序列长度比天然存在的CRISPR/Cas系统的指导序列长或短0、1、2、3、4或5个核苷酸。在某些实施方案中，Cas核酸酶和gRNA支架将衍生自相同CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，靶向序列可包含或由18-24个核苷酸组成。在一些实施方案中，靶向序列可包含或由19-21个核苷酸组成。在一些实施方案中，靶向序列可包含或由20个核苷酸组成。

在一些实施方案中，sgRNA为能够通过Cas9蛋白质介导RNA指导的DNA裂解的“Cas9sgRNA”。在一些实施方案中，sgRNA为能够通过Cpf1蛋白质介导RNA指导的DNA裂解的“Cpf1sgRNA”。在某些实施方案中，gRNA包含足以与Cas9蛋白质形成活性复合物并且介导RNA指导的DNA裂解的crRNA和tracr RNA。在某些实施方案中，gRNA包含足以与Cpf1蛋白质形成活性复合物并且介导RNA指导的DNA裂解的crRNA。参见Zetsche 2015。

本发明的某些实施方案还提供编码本文所述的gRNA的核酸，例如表达盒。“指导RNA核酸”在本文中用于指代指导RNA(例如sgRNA或dgRNA)和指导RNA表达盒，所述指导RNA表达盒为编码一个或多个指导RNA的核酸。

在一些实施方案中，核酸可为DNA分子。在一些实施方案中，核酸可包含编码crRNA的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码crRNA的核苷酸序列包含由来自天然存在的CRISPR/Cas系统的重复序列的全部或一部分侧接的靶向序列。在一些实施方案中，核酸可包含编码tracr RNA的核苷酸序列。在一些实施方案中，crRNA和tracr RNA可由两个独立核酸编码。在其他实施方案中，crRNA和tracr RNA可由单一核酸编码。在一些实施方案中，crRNA和tracr RNA可由单一核酸的相对链编码。在其他实施方案中，crRNA和tracr RNA可由单一核酸的相同链编码。在一些实施方案中，gRNA核酸编码sgRNA。在一些实施方案中，gRNA核酸编码Cas9核酸酶sgRNA。在一些实施方案中，gRNA核酸编码Cpf1核酸酶sgRNA。

编码指导RNA的核苷酸序列能够可操作地连接于至少一个转录或调控控制序列，诸如启动子、3'UTR或5'UTR。在一个实例中，启动子可为tRNA启动子，例如tRNA^Lys3，或tRNA嵌合体。参见Mefferd等人，RNA.2015 21:1683-9；Scherer等人,Nucleic Acids Res.200735:2620–2628。在某些实施方案中，启动子可通过RNA聚合酶III(Pol III)识别。Pol III启动子的非限制性实例还包括U6和H1启动子。在一些实施方案中，编码指导RNA的核苷酸序列可与小鼠或人类U6启动子可操作地连接。在一些实施方案中，gRNA核酸为修饰的核酸。在某些实施方案中，gRNA核酸包括修饰的核苷或核苷酸。在一些实施方案中，gRNA核酸包括5'端修饰，例如修饰的核苷或核苷酸以稳定和阻止核酸整合。在一些实施方案中，gRNA核酸包含双链DNA，所述双链DNA在各链上具有5'端修饰。在某些实施方案中，gRNA核酸包括反向双脱氧-T或反向无碱基核苷或核苷酸作为5'端修饰。在一些实施方案中，gRNA核酸包括标记，诸如生物素、脱硫生物素-TEG(desthiobioten-TEG)、地高辛和荧光标记物，包括例如FAM、ROX、TAMRA和AlexaFluor。

在某些实施方案中，超过一个gRNA核酸，诸如gRNA可用于CRISPR/Cas核酸酶系统。各gRNA核酸可含有不同靶向序列，使得CRISPR/Cas系统裂解超过一个靶序列。在一些实施方案中，一个或多个gRNA可在CRISPR/Cas复合物内具有相同或不同特性，诸如活性或稳定性。在使用超过一个gRNA的情况下，各gRNA可编码于相同或不同gRNA核酸上。用于驱动超过一个gRNA的表达的启动子可相同或不同。

修饰的RNA

在某些实施方案中，LNP组合物包含修饰的RNA。

修饰的核苷或核苷酸可存在于RNA，例如gRNA或mRNA中。包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸的gRNA或mRNA例如称作“修饰的”RNA，用于描述替代或外加典型A、G、C和U残基使用的一种或多种非天然和/或天然存在的组分或配置的存在。在一些实施方案中，修饰的RNA由非典型核苷或核苷酸合成，此处称作“修饰的”。

修饰的核苷和核苷酸可包括以下中的一者或多者：(i)磷酸二酯主链键联中的非键联磷酸氧中的一者或两者和/或键联磷酸氧中的一者或多者的改变，例如置换(示例性主链修饰)；(ii)核糖成分，例如核糖上的2'羟基的改变，例如置换(示例性糖修饰)；(iii)用“脱磷酸”接头批量置换磷酸酯部分(示例性主链修饰)；(iv)天然存在的核碱基的修饰或置换，包括用非典型核碱基(示例性碱基修饰)；(v)核糖-磷酸酯主链的置换或修饰(示例性主链修饰)；(vi)寡核苷酸的3'端或5’端的修饰，例如末端磷酸酯基团的去除、修饰或者置换或部分、帽或接头的缀合(此类3'或5’帽修饰可包括糖和/或主链修饰)；和(vii)糖的修饰或置换(示例性糖修饰)。某些实施方案包含mRNA、gRNA或核酸的5'端修饰。某些实施方案包含mRNA、gRNA或核酸的3'端修饰。修饰的RNA可含有5'端和3'端修饰。修饰的RNA可在非末端位置含有一个或多个修饰的残基。在某些实施方案中，gRNA包括至少一个修饰的残基。在某些实施方案中，mRNA包括至少一个修饰的残基。

如本文所用，如果第一序列与第二序列的比对显示全部第二序列的X％或更多的位置与第一序列相匹配，则第一序列视为“包含与第二序列具有至少X％同一性的序列”。举例而言，序列AAGA包含与序列AAG具有100％同一性的序列，因为由于对第二序列的全部三个位置均存在匹配，所以比对将产生100％同一性。RNA与DNA之间的差异(一般来讲，尿苷更换为胸苷或反之亦然)和核苷类似物，诸如修饰的尿苷的存在不会造成多核苷酸之间同一性或互补性的差异，只要相关核苷酸(诸如胸苷、尿苷或修饰的尿苷)具有相同互补序列(例如针对全部胸苷、尿苷或修饰的尿苷的腺苷；另一实例为胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶，两者具有鸟苷或修饰的鸟苷作为互补序列)即可。因此，举例而言，序列5'-AXG(其中X为任何修饰的尿苷，诸如假尿苷、N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷)视为与AUG具有100％同一性，因为两者与同一序列(5'-CAU)完全互补。示例性比对算法为史密斯-沃特曼算法(Smith-Watermanalgorithm)和尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)，这些技术在本领域中是众所周知的。本领域的技术人员应理解何种算法选择和参数设置适合于待比对的给定序列对；对于具有一般类似长度和针对氨基酸的＞50％预期同一性或针对核苷酸的＞75％预期同一性的序列而言，由EBI于www.ebi.ac.uk网站服务器提供的尼德曼-翁施算法接口的具有默认设置的尼德曼-翁施算法通常为合适的。

mRNA

在一些实施方案中，本文所公开的组合物或制剂包含mRNA，所述mRNA包含开放阅读框(ORF)，诸如像编码RNA指导的DNA结合剂，诸如Cas核酸酶，或如本文所述的2类Cas核酸酶的ORF。在一些实施方案中，提供、使用或施用mRNA，所述mRNA包含编码RNA指导的DNA结合剂，诸如Cas核酸酶或2类Cas核酸酶的ORF。在一些实施方案中，编码RNA指导的DNA结合剂的ORF为“修饰的RNA指导的DNA结合剂ORF”或简称为“修饰的ORF”，其作为简写使用以指示ORF以如下方式中的一者或多者来修饰：(1)修饰的ORF的尿苷含量在其最小尿苷含量至最小尿苷含量的150％范围内；(2)修饰的ORF的尿苷二核苷酸含量在其最小尿苷二核苷酸含量至最小尿苷二核苷酸含量的150％范围内；(3)修饰的ORF与SEQ ID NO:1、4、10、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65或66中的任一者至少90％同一性；(4)修饰的ORF由一组密码子组成，其中至少75％的密码子为给定氨基酸的最小尿苷密码子，例如具有最少尿苷(除了苯丙氨酸的密码子(其中最小尿苷密码子具有2个尿苷)之外通常为0或1)的密码子；或(5)修饰的ORF包含至少一个修饰的尿苷。在一些实施方案中，修饰的ORF以前述方式中的至少两者、三者或四者进行修饰。在一些实施方案中，修饰的ORF包含至少一个修饰的尿苷并且以上述(1)-(4)中的至少一者、两者、三者或全部进行修饰。

“修饰的尿苷”在本文中用于指代除胸苷外的与尿苷具有相同氢键受体并且与尿苷存在一种或多种结构差异的核苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为取代的尿苷，即，其中一个或多个非质子取代基(例如烷氧基，诸如甲氧基)替代质子的尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为假尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为取代的假尿苷，即，其中一个或多个非质子取代基(例如烷基，诸如甲基)替代质子的假尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为取代的尿苷、假尿苷或取代的假尿苷中的任一者。

如本文所用，“尿苷位置”是指多核苷酸中由尿苷或修饰的尿苷占据的位置。因此，举例而言，其中“100％的尿苷位置为修饰的尿苷”的多核苷酸在将为相同序列的常规RNA(其中所有碱基均为标准A、U、C或G碱基)中的尿苷的每个位置处均含有修饰的尿苷。除非另外指明，否则本公开中或附随本公开的序列表(sequence table/sequence listing)的多核苷酸序列中的U可为尿苷或修饰的尿苷。

表1.最小尿苷密码子

在前述实施方案中的任一者中，修饰的ORF可由一组密码子组成，其中至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的密码子为最小尿苷密码子的表中所列的密码子。在前述实施方案中的任一者中，修饰的ORF可包含与SEQ ID NO:1、4、10、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65或66中的任一者具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性的序列。

在前述实施方案中的任一者中，修饰的ORF的尿苷含量可在其最小尿苷含量至最小尿苷含量的150％、145％、140％、135％、130％、125％、120％、115％、110％、105％、104％、103％、102％或101％范围内。

在前述实施方案中的任一者中，修饰的ORF的尿苷二核苷酸含量可在其最小尿苷二核苷酸含量至最小尿苷二核苷酸含量的150％、145％、140％、135％、130％、125％、120％、115％、110％、105％、104％、103％、102％或101％范围内。

在前述实施方案中的任一者中，修饰的ORF可至少在一个、多个或所有尿苷位置包含修饰的尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为在5位处，例如用卤素、甲基或乙基修饰的尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为在1位处，例如用卤素、甲基或乙基修饰的假尿苷。修饰的尿苷可为例如假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲氧基尿苷、5-碘尿苷或它们的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为5-甲氧基尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为5-碘尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为假尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为N1-甲基假尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为假尿苷和N1-甲基假尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为假尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为N1-甲基假尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为5-碘尿苷和N1-甲基假尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为假尿苷和5-碘尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为5-碘尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。

在一些实施方案中，根据本公开的mRNA中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的尿苷位置为修饰的尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的mRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为修饰的尿苷，例如5-甲氧基尿苷、5-碘尿苷、N1-甲基假尿苷、假尿苷或它们的组合。在一些实施方案中，根据本公开的mRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为5-甲氧基尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的mRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为假尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的mRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为N1-甲基假尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的mRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为5-碘尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的mRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为5-甲氧基尿苷，并且其余部分为N1-甲基假尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的mRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为5-碘尿苷，并且其余部分为N1-甲基假尿苷。

在前述实施方案中的任一者中，修饰的ORF可包含降低的尿苷二核苷酸含量，诸如最低可能的尿苷二核苷酸(UU)含量，例如(a)在每个位置处使用最小尿苷密码子(如上文所论述)和(b)编码与给定ORF相同的氨基酸序列的ORF。尿苷二核苷酸(UU)含量可以绝对术语表示为ORF中的UU二核苷酸的计数或基于比率，表示为尿苷二核苷酸的尿苷所占据的位置的百分比(例如，AUUAU的尿苷二核苷酸含量将为40％，因为尿苷二核苷酸的尿苷占据了5个位置中的2个)。出于评估最小尿苷二核苷酸含量的目的，修饰的尿苷残基视为等效于尿苷。

在一些实施方案中，mRNA包含至少一个来自表达的哺乳动物mRNA，诸如组成性表达的mRNA的UTR。如果mRNA在健康成年哺乳动物的至少一个组织中连续转录，则将其视为在哺乳动物中组成性表达。在一些实施方案中，mRNA包含来自表达的哺乳动物RNA，诸如组成性表达的哺乳动物mRNA的5'UTR、3'UTR或5'和3’UTR。肌动蛋白mRNA为组成性表达的mRNA的实例。

在一些实施方案中，mRNA包含至少一个来自羟基类固醇17-β脱氢酶4(HSD17B4或HSD)的UTR，例如来自HSD的5'UTR。在一些实施方案中，mRNA包含至少一个来自球蛋白mRNA，例如人类α球蛋白(HBA)mRNA、人类β球蛋白(HBB)mRNA或非洲爪蟾(Xenopus laevis)β球蛋白(XBG)mRNA的UTR。在一些实施方案中，mRNA包含来自球蛋白mRNA，诸如HBA、HBB或XBG的5'UTR、3'UTR或5'和3'UTR。在一些实施方案中，mRNA包含来自牛生长激素、巨细胞病毒(CMV)、小鼠Hba-a1、HSD、白蛋白基因、HBA、HBB或XBG的5'UTR。在一些实施方案中，mRNA包含来自牛生长激素、巨细胞病毒、小鼠Hba-a1、HSD、白蛋白基因、HBA、HBB或XBG的3'UTR。在一些实施方案中，mRNA包含来自牛生长激素、巨细胞病毒、小鼠Hba-a1、HSD、白蛋白基因、HBA、HBB、XBG、热休克蛋白90(Hsp90)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、β-肌动蛋白、α-微管蛋白、肿瘤蛋白(p53)或表皮生长因子受体(EGFR)的5'和3’UTR。

在一些实施方案中，mRNA包含来自同一来源，例如组成性表达的mRNA，诸如肌动蛋白、白蛋白或球蛋白(诸如HBA、HBB或XBG)的5'和3'UTR。

在一些实施方案中，mRNA不包含5'UTR，例如在5'帽与起始密码子之间不存在额外核苷酸。在一些实施方案中，mRNA在5'帽与起始密码子之间包含Kozak序列(下文所述)，但不具有任何额外5'UTR。在一些实施方案中，mRNA不包含3'UTR，例如在终止密码子与聚腺苷酸(poly-A)尾之间不存在额外核苷酸。

在一些实施方案中，mRNA包含Kozak序列。Kozak序列可影响翻译起始和由mRNA翻译的多肽的总产量。Kozak序列包括可充当起始密码子的甲硫氨酸密码子。最小Kozak序列为NNNRUGN，其中以下中的至少一者为成立的：第一个N为A或G并且第二个N为G。在核苷酸序列的情形下，R意指嘌呤(A或G)。在一些实施方案中，Kozak序列为RNNRUGN、NNNRUGG、RNNRUGG、RNNAUGN、NNNAUGG或RNNAUGG。在一些实施方案中，Kozak序列为具有零错配或在呈小写字母形式的位置具有至多一个或两个错配的rccRUGg。在一些实施方案中，Kozak序列为具有零错配或在呈小写字母形式的位置具有至多一个或两个错配的rccAUGg。在一些实施方案中，Kozak序列为具有零错配或在呈小写字母形式的位置具有至多一个、两个或三个错配的gccRccAUGG。在一些实施方案中，Kozak序列为具有零错配或在呈小写字母形式的位置具有至多一个、两个、三个或四个错配的gccAccAUG。在一些实施方案中，Kozak序列为GCCACCAUG。在一些实施方案中，Kozak序列为具有零错配或在呈小写字母形式的位置具有至多一个、两个、三个或四个错配的gccgccRccAUGG。

在一些实施方案中，包含编码RNA指导的DNA结合剂的ORF的mRNA包含与SEQ IDNO:43具有至少90％同一性的序列，任选地其中SEQ ID NO:43的ORF(即，SEQ ID NO:4)被替代ORF取代。在一些实施方案中，mRNA包含SEQ ID NO:10、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65或66中的任一者。

在一些实施方案中，与SEQ ID NO 43的任选地被取代的序列的同一性程度为95％。在一些实施方案中，与SEQ ID NO 4的任选地被取代的序列的同一性程度为98％。在一些实施方案中，与SEQ ID NO 43的任选地被取代的序列的同一性程度为99％。在一些实施方案中，与SEQ ID NO 43的任选地被取代的序列的同一性程度为100％。

在一些实施方案中，本文所公开的mRNA包含5'帽，诸如Cap0、Cap1或Cap2。5'帽通常为通过5'-三磷酸连接至mRNA的5'至3'链的第一核苷酸，即，第一帽近端核苷酸的5’位的7-甲基鸟嘌呤核糖核苷酸(其可被进一步修饰，如下文例如关于ARCA所论述)。在Cap0中，mRNA的第一和第二帽近端核苷酸的核糖均包含2'-羟基。在Cap1中，mRNA的第一和第二转录核苷酸的核糖分别包含2'-甲氧基和2'-羟基。在Cap2中，mRNA的第一和第二帽近端核苷酸的核糖均包含2'-甲氧基。参见例如Katibah等人(2014)Proc Natl Acad Sci USA111(33):12025-30；Abbas等人(2017)Proc Natl Acad Sci USA114(11):E2106-E2115。大多数内源性高等真核生物mRNA，包括哺乳动物mRNA(诸如人类mRNA)包含Cap1或Cap2。归因于通过先天免疫系统的组分，诸如IFIT-1和IFIT-5识别为“非自体(non-self)”，Cap0以及与Cap1和Cap2不同的其他帽结构在哺乳动物，诸如人类中可呈免疫原性，其可导致细胞因子，包括I型干扰素水平升高。先天免疫系统的组分，诸如IFIT-1和IFIT-5还可与eIF4E竞争结合具有除Cap1或Cap2外的帽的mRNA，从而潜在地抑制mRNA翻译。

帽可以共转录方式包括在内。举例而言，ARCA(抗反向帽类似物；Thermo FisherScientific目录号AM8045)为包含连接至鸟嘌呤核糖核苷酸的5'位的7-甲基鸟嘌呤3'-甲氧基-5'-三磷酸的帽类似物，其可在起始时体外并入转录物中。ARCA产生Cap0帽，其中第一帽近端核苷酸的2'位为羟基。参见例如Stepinski等人，(2001)“Synthesis andproperties of mRNAs containing the novel‘anti-reverse’cap analogs 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'deoxy)GpppG,”RNA 7:1486-1495。ARCA结构显示如下。

CleanCap^TM AG(m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG；TriLink Biotech nologies目录号N-7113)或CleanCap^TM GG(m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG；TriLink Biotechnologies目录号N-7133)可用于以共转录方式提供Cap1结构。CleanCap^TM AG和CleanCap^TM GG的3'-O-甲基化型式也可分别以目录号N-7413和N-7433购自TriLink Biotechnologies。CleanCap^TM AG结构显示如下。

或者，可以转录后方式将帽添加至RNA。举例而言，牛痘加帽酶可商购获得(NewEngland Biolabs目录号M2080S)，并且具有由其D1亚单位提供的RNA三磷酸酶和鸟苷酰基转移酶活性，和由其D12亚单位提供的鸟嘌呤甲基转移酶。因此，在S-腺苷甲硫氨酸和GTP存在下，可将7-甲基鸟嘌呤添加至RNA，以产生Cap0。参见例如Guo，P.和Moss，B.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，4023-4027；Mao，X.和Shuman，S.(1994)J.Biol.Chem.269，24472-24479。

在一些实施方案中，mRNA还包含聚腺苷酸化(poly-A)尾。在一些实施方案中，poly-A尾包含至少20、30、40、50、60、70、80、90或100个腺嘌呤，任选地至多300个腺嘌呤。在一些实施方案中，poly-A尾包含95、96、97、98、99或100个腺嘌呤核苷酸。在一些情况下，poly-A尾在poly-A尾中的一个或多个位置处被一个或多个非腺嘌呤核苷酸“锚”“中断”。poly-A尾可包含至少8个连续腺嘌呤核苷酸，但也包含一个或多个非腺嘌呤核苷酸。如本文所用，“非腺嘌呤核苷酸”是指不包含腺嘌呤的任何天然或非天然核苷酸。鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸为示例性非腺嘌呤核苷酸。因此，本文所述的mRNA上的poly-A尾可包含位于编码RNA指导的DNA结合剂或目标序列的核苷酸的3'的连续腺嘌呤核苷酸。在一些情况下，mRNA上的poly-A尾包含位于编码RNA指导的DNA结合剂或目标序列的核苷酸的3'的非连续腺嘌呤核苷酸，其中非腺嘌呤核苷酸以规则或不规则间隔中断腺嘌呤核苷酸。

如本文所用，“非腺嘌呤核苷酸”是指不包含腺嘌呤的任何天然或非天然核苷酸。鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸为示例性非腺嘌呤核苷酸。因此，本文所述的mRNA上的poly-A尾可包含位于编码RNA指导的DNA结合剂或目标序列的核苷酸的3'的连续腺嘌呤核苷酸。在一些情况下，mRNA上的poly-A尾包含位于编码RNA指导的DNA结合剂或目标序列的核苷酸的3'的非连续腺嘌呤核苷酸，其中非腺嘌呤核苷酸以规则或不规则间隔中断腺嘌呤核苷酸。

在一些实施方案中，对mRNA进行纯化。在一些实施方案中，使用沉淀法(例如LiCl沉淀、酒精沉淀或等效方法，例如如本文所述)对mRNA进行纯化。在一些实施方案中，使用基于色谱的方法，诸如基于HPLC的方法或等效方法(例如如本文所述)对mRNA进行纯化。在一些实施方案中，使用沉淀法(例如LiCl沉淀)和基于HPLC的方法两者对mRNA进行纯化。

在一些实施方案中，与本文所公开的mRNA组合提供至少一种gRNA。在一些实施方案中，以与mRNA分离的分子的形式提供gRNA。在一些实施方案中，以本文所公开的mRNA的一部分，诸如UTR的一部分的形式提供gRNA。

gRNA

在一方面，本公开提供将基因组编辑系统(例如锌指核酸酶系统、TALEN系统、大范围核酸酶系统或CRISPR/Cas系统)递送至细胞(或细胞群体)，例如HSPC(或HSPC群体)，例如CD34+细胞(或CD34+细胞群体)的方法，其中产生具有增加的胎儿血红蛋白表达的细胞(或其后代)(例如，当所述细胞分化成红细胞时)。本文公开可用于实现该效果的指导序列。在实施方案中，基因组编辑系统包含一种或多种编码基因组编辑系统的组分的载体，例如mRNA。在其他实施方案中，基因组编辑系统包含一种或多种多肽。在一个优选方面，所述方法包括递送CRISPR/Cas系统。在多个实施方案中，CRISPR/Cas系统包含例如以核糖核蛋白复合物(RNP)的形式复合的gRNA和Cas核酸酶。在其他实施方案中，CRISPR/Cas系统包含一种或多种编码gRNA和/或Cas核酸酶的载体。在其他实施方案中，CRISPR/Cas系统包含一种或多种编码Cas核酸酶(例如2类Cas核酸酶)的载体(例如mRNA)和一种或多种gRNA。在多个方面，CRISPR/Cas系统包含描述于WO2017/115268中的gRNA，所述文献的内容以引用方式整体并入本文。在多个方面，CRISPR/Cas系统包含gRNA，所述gRNA包含与BCL11a基因或其调控元件内的靶序列互补的指导序列。在其他方面，CRISPR/Cas系统包含gRNA，所述gRNA包含与BCL11a基因的内含子2内(例如，BCL11a基因的内含子2中位于或邻近GATA1结合位点的区域内)的靶序列互补的指导序列。在多个方面，CRISPR/Cas系统包含gRNA，所述gRNA包含与BCL11a基因的内含子2中从ch2:60494000到ch2:60498000(根据hg38)的区域内，例如BCL11a基因的内含子2中从ch2:60494250到ch2:60496300(根据hg38)的区域内的靶序列互补的指导序列。在多个实施方案中，CRISPR/Cas系统包含gRNA，所述gRNA包含在2017年9月29日提交的美国临时申请号62/566,232的表2中列出的指导序列，所述申请以引用方式并入本文。

与BCL11a基因的内含子2内的靶序列互补的gRNA的示例性指导序列。+58、+62和+55是指红系特异性增强子区的DNA酶超敏位点，如Bauer等人，Science 2013；342(6155):253-257中所述。

在其他方面，CRISPR/Cas系统包含gRNA，所述gRNA包含与11号染色体上的球蛋白基因座内的靶序列互补的指导序列。在一方面，CRISPR/Cas系统包含gRNA，所述gRNA包含与HPFH区域内的序列互补的指导序列。如本文所用，术语“HPFH区”是指如下基因组位点：其在被修饰(例如，突变或缺失)时引起成体红细胞中HbF产生增加，并且包括文献中鉴别的HPFH区(参见例如Online Mendelian Inheritance in Man：http://www.omim.org/entry/141749，以引用方式并入本文)。在一个示例性实施方案中，HPFH区是位于染色体11p15上的β球蛋白基因簇内的区域或涵盖染色体11p15上的β球蛋白基因簇的区域。在一个示例性实施方案中，HPFH区位于至少部分δ球蛋白基因及其调控元件内或涵盖至少部分δ球蛋白基因及其调控元件。在一个示例性实施方案中，HPFH区是HBG1的启动子的区域。在一个示例性实施方案中，HPFH区是HBG2的启动子的区域。在一个示例性实施方案中，HPFH区是SankaranVG等人NEJM(2011)365:807-814中描述的区域，所述文献以引用方式整体并入本文。在一个示例性实施方案中，HPFH区是如Sankaran VG等人NEJM(2011)365:807-814中所述的法国断点缺失性HPFH。在一个示例性实施方案中，HPFH区是如Sankaran VG等人NEJM(2011)365:807-814中所述的阿尔及利亚HPFH。在一个示例性实施方案中，HPFH区是如Sankaran VG等人NEJM(2011)365:807-814中所述的斯里兰卡HPFH。在一个示例性实施方案中，HPFH区是如Sankaran VG等人NEJM(2011)365:807-814中所述的HPFH-3。在一个示例性实施方案中，HPFH区是如Sankaran VG等人NEJM(2011)365:807-814中所述的HPFH-2。在一个实施方案中，HPFH-1区是如Sankaran VG等人NEJM(2011)365:807-814中所述的HPFH-3。在一个示例性实施方案中，HPFH区是如Sankaran VG等人NEJM(2011)365:807-814中所述的斯里兰卡(δβ)0地中海贫血HPFH。在一个示例性实施方案中，HPFH区是如Sankaran VG等人NEJM(2011)365:807-814中所述的西西里(δβ)0地中海贫血HPFH。在一个示例性实施方案中，HPFH区是如Sankaran VG等人NEJM(2011)365:807-814中所述的马其顿(δβ)0地中海贫血HPFH。在一个示例性实施方案中，HPFH区是如Sankaran VG等人NEJM(2011)365:807-814中所述的库尔德β0地中海贫血HPFH。在一个示例性实施方案中，HPFH区是位于Chr11:5213874-5214400(hg18)处的区域。在一个示例性实施方案中，HPFH区是位于Chr11:5215943-5215046(hg18)处的区域。在一个示例性实施方案中，HPFH区是位于Chr11:5234390-5238486(hg38)处的区域。在多个实施方案中，CRISPR/Cas系统包含gRNA，所述gRNA包含含有如WO2017/077394中所述的序列的指导序列，所述文献的内容以引用方式整体并入本文。在多个实施方案中，CRISPR/Cas系统包含gRNA，所述gRNA包含选自WO2017/077394的指导序列的序列的指导序列。在多个实施方案中，CRISPR/Cas系统包含gRNA，所述gRNA包含在2017年9月29日提交的美国临时申请号62/566,232的表3中列出的指导序列，所述申请以引用方式并入本文。

示例性指导序列被引导至法国HPFH(法国HPFH；Sankaran VG等人A functionalelement necessary for fetal hemoglobin silencing.NEJM(2011)365:807-814.)

在多个实施方案中，CRISPR/Cas系统包含gRNA，所述gRNA包含在2017年9月29日提交的美国临时申请号62/566,232的表4中列出的指导序列，所述申请以引用方式并入本文。

示例性指导序列可被引导至HBG1和/或HBG2启动子区域。

化学修饰的gRNA

在一些实施方案中，gRNA是经化学修饰的。包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸的gRNA称作“修饰的”gRNA或“化学修饰的”gRNA，用于描述替代或外加典型A、G、C和U残基使用的一种或多种非天然和/或天然存在的组分或配置的存在。在一些实施方案中，修饰的gRNA由非典型核苷或核苷酸合成，此处称作“修饰的”。修饰的核苷和核苷酸可包括以下中的一者或多者：(i)磷酸二酯主链键联中的非键联磷酸氧中的一者或两者和/或键联磷酸氧中的一者或多者的改变，例如置换(示例性主链修饰)；(ii)核糖成分，例如核糖上的2’羟基的改变，例如置换(示例性糖修饰)；(iii)用“脱磷酸”接头批量置换磷酸酯部分(示例性主链修饰)；(iv)天然存在的核碱基的修饰或置换，包括用非典型核碱基(示例性碱基修饰)；(v)核糖-磷酸酯主链的置换或修饰(示例性主链修饰)；(vi)寡核苷酸的3’端或5’端的修饰，例如末端磷酸酯基团的去除、修饰或者置换或部分、帽或接头的缀合(此类3’或5’帽修饰可包括糖和/或主链修饰)；和(vii)糖的修饰或置换(示例性糖修饰)。

在一些实施方案中，gRNA在一些或全部尿苷位置处包含修饰的尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为在5位处，例如用卤素或C1-C6烷氧基修饰的尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为在1位处，例如用C1-C6烷基修饰的假尿苷。修饰的尿苷可为例如假尿苷、N1-甲基假尿苷、5-甲氧基尿苷、5-碘尿苷或它们的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为5-甲氧基尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为5-碘尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为假尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为N1-甲基假尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为假尿苷和N1-甲基假尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为假尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为N1-甲基假尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为5-碘尿苷和N1-甲基假尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为假尿苷和5-碘尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为5-碘尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。

在一些实施方案中，根据本公开的gRNA中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的尿苷位置为修饰的尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的gRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为修饰的尿苷，例如5-甲氧基尿苷、5-碘尿苷、N1-甲基假尿苷、假尿苷或它们的组合。在一些实施方案中，根据本公开的gRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为5-甲氧基尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的gRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为假尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的gRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为N1-甲基假尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的gRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为5-碘尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的gRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为5-甲氧基尿苷，并且其余部分为N1-甲基假尿苷。在一些实施方案中，根据本公开的gRNA中10％-25％、15％-25％、25％-35％、35％-45％、45％-55％、55％-65％、65％-75％、75％-85％、85％-95％或90％-100％的尿苷位置为5-碘尿苷，并且其余部分为N1-甲基假尿苷。

化学修饰(诸如以上列出的那些)可组合以得到修饰的gRNA，所述修饰的gRNA包含可具有两个、三个、四个或更多个修饰的核苷和核苷酸(统称为“残基”)。举例而言，修饰的残基可具有修饰的糖和修饰的核碱基。在一些实施方案中，gRNA的各碱基是修饰的，例如所有碱基具有修饰的磷酸酯基团，诸如硫代磷酸酯基团。在某些实施方案中，gRNA分子的所有或基本上所有磷酸酯基团被硫代磷酸酯基团置换。在一些实施方案中，修饰的gRNA在RNA的5'端处或附近包含至少一个修饰的残基。在一些实施方案中，修饰的gRNA在RNA的3'端处或附近包含至少一个修饰的残基。

在一些实施方案中，gRNA包含一个、两个、三个或更多个修饰的残基。在一些实施方案中，修饰的gRNA中至少5％(例如至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％)的位置为修饰的核苷或核苷酸。

未修饰的核酸可易于通过例如细胞内核酸酶或血清中发现的那些核酸酶降解。举例而言，核酸酶可水解核酸磷酸二酯键。因此，在一方面，本文所述的gRNA可含有一个或多个修饰的核苷或核苷酸，例如以引入朝向细胞内核酸酶或基于血清的核酸酶的稳定性。在一些实施方案中，本文所述的修饰的gRNA分子可在体内和离体引入至细胞群体中时展现减少的先天性免疫反应。术语“先天性免疫反应”包括对外源性核酸(包括单链核酸)的细胞反应，涉及诱导细胞因子(特别是干扰素)表达和释放，和细胞死亡。

在主链修饰的一些实施方案中，修饰的残基的磷酸酯基团可通过用不同取代基置换一个或多个氧来加以修饰。另外，修饰的残基，例如存在于修饰的核酸中的修饰的残基可包括用如本文所述的修饰的磷酸酯基团批量置换未修饰的磷酸酯部分。在一些实施方案中，磷酸酯主链的主链修饰可包括产生不带电接头或具有不对称电荷分布的带电接头的改变。

修饰的磷酸酯基团的实例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸酯、硼烷磷酸酯、氢膦酸酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。未修饰的磷酸酯基团中的磷原子为非手性的。然而，用以上原子或原子组中的一者置换非桥联氧中的一者可使得磷原子为手性的。立体对称磷原子可具有“R”构型(本文中为Rp)或“S”构型(本文中为Sp)。主链也可通过用氮(桥联氨基磷酸酯)、硫(桥联硫代磷酸酯)和碳(桥联亚甲基膦酸酯)置换桥联氧(即，连接磷酸酯与核苷的氧)来加以修饰。置换可发生在任一连接氧或两个连接氧处。

磷酸酯基团可在某些主链修饰中被不含磷的连接基团置换。在一些实施方案中，带电磷酸酯基团可被中性部分置换。可置换磷酸酯基团的部分的实例可包括但不限于例如膦酸甲酯、羟氨基、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷接头、磺酸酯、磺酰胺、硫代甲缩醛、甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基肼、亚甲基二甲基肼和亚甲氧基甲基亚氨基。

在一些实施方案中，本发明包括在以下一个或多个区域中包含一个或多个修饰的sgRNA：5'端处的核苷酸；下茎区；凸起区；上茎区；连结区；发夹1区；发夹2区；以及3'端处的核苷酸。在一些实施方案中，修饰包括2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰的核苷酸。在一些实施方案中，修饰包括2'-氟(2'-F)修饰的核苷酸。在一些实施方案中，修饰包括核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键。

在一些实施方案中，5'端处的前三个或四个核苷酸和3'端处的最后三个或四个核苷酸被修饰。在一些实施方案中，5'端处的前四个核苷酸和3'端处的最后四个核苷酸经硫代磷酸酯(PS)键连接。在一些实施方案中，修饰包括2'-O-Me。在一些实施方案中，修饰包括2'-F。

在一些实施方案中，5'端处的前四个核苷酸和3'端处的最后四个核苷酸经PS键连接，并且5'端处的前三个核苷酸和3'端处的最后三个核苷酸包含2'-O-Me修饰。

在一些实施方案中，5'端处的前四个核苷酸和3'端处的最后四个核苷酸经PS键连接，并且5'端处的前三个核苷酸和3'端处的最后三个核苷酸包含2'-F修饰。

在一些实施方案中，sgRNA包含修饰型式的SEQ ID NO:74：(mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU)，其中N为任何天然或非天然核苷酸。在一些实施方案中，sgRNA包含SEQ ID NO:74。在某些实施方案中，sgRNA在其5’端的前三个残基处包含2'O-甲基修饰，在RNA的残基1-2、2-3和3-4之间具有硫代磷酸酯键联。

模板核酸

本文所公开的组合物和方法可包括模板核酸。模板可用于在Cas核酸酶的靶位点处或附近改变或插入核酸序列。在一些实施方案中，所述方法包括将模板引入至细胞。在一些实施方案中，可提供单一模板。在其他实施方案中，可提供两种或更多种模板以使得编辑可发生在两个或更多个靶位点处。举例而言，可提供不同模板以编辑细胞中的单一基因，或细胞中的两种不同基因。

在一些实施方案中，模板可用于同源重组中。在一些实施方案中，同源重组可导致模板序列或模板序列的一部分整合至靶核酸分子中。在其他实施方案中，模板可用于同源定向修复，同源定向修复涉及核酸中裂解位点处的DNA链侵袭。在一些实施方案中，同源定向修复可导致编辑的靶核酸分子中包括模板序列。在其他实施方案中，模板可用于由非同源末端连接介导的基因编辑。在一些实施方案中，模板序列与裂解位点附近的核酸序列不具有类似性。在一些实施方案中，并入模板或模板序列的一部分。在一些实施方案中，模板包括侧接反向末端重复(ITR)序列。

在一些实施方案中，模板可包含第一同源臂和第二同源臂(也称作第一核苷酸序列和第二核苷酸序列)，它们分别与位于裂解位点上游和下游的序列互补。当模板含有两个同源臂时，各臂可为相同长度或不同长度，并且同源臂之间的序列可基本上类似于或等同于同源臂之间的靶序列，或者所述序列可完全无关。在一些实施方案中，模板上的第一核苷酸序列与裂解位点上游的序列之间，和模板上的第二核苷酸序列与裂解位点下游的序列之间的互补性程度或同一性百分比可准许模板与靶核酸分子之间的同源重组，诸如高保真同源重组。在一些实施方案中，互补性程度可为约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，互补性程度可为约95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，互补性程度可为至少98％、99％或100％。在一些实施方案中，互补性程度可为100％。在一些实施方案中，同一性百分比可为约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，同一性百分比可为约95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，同一性百分比可为至少98％、99％或100％。在一些实施方案中，同一性百分比可为100％。

在一些实施方案中，模板序列可对应于、包含或由靶细胞的内源序列组成。模板序列可另外或替代地对应于、包含或由靶细胞的外源序列组成。如本文所用，术语“内源序列”是指原生于细胞的序列。术语“外源序列”是指非原生于细胞的序列，或在细胞的基因组中的原生位置处于不同位置的序列。在一些实施方案中，内源序列可为细胞的基因组序列。在一些实施方案中，内源序列可为染色体或染色体外序列。在一些实施方案中，内源序列可为细胞的质粒序列。在一些实施方案中，模板序列可与细胞中裂解位点处或附近的内源序列的一部分基本上相同，但包含至少一个核苷酸变化。在一些实施方案中，用模板编辑裂解靶核酸分子可导致包含靶核酸分子的一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代的突变。在一些实施方案中，突变可导致由包含靶序列的基因表达的蛋白质中的一个或多个氨基酸变化。在一些实施方案中，突变可导致由靶基因表达的RNA中的一个或多个核苷酸变化。在一些实施方案中，突变可改变靶基因的表达水平。在一些实施方案中，突变可导致靶基因的表达增加或减少。在一些实施方案中，突变可导致基因敲落。在一些实施方案中，突变可导致基因敲除。在一些实施方案中，突变可导致恢复基因功能。在一些实施方案中，用模板编辑裂解靶核酸分子可导致靶核酸分子(诸如DNA)的外显子序列、内含子序列、调控序列、转录控制序列、翻译控制序列、剪接位点或非编码序列的变化。

在其他实施方案中，模板序列可包含外源序列。在一些实施方案中，外源序列可包含可操作地连接至外源启动子序列的蛋白质或RNA编码序列，使得当外源序列整合至靶核酸分子中时，细胞能够表达由所述整合序列编码的蛋白质或RNA。在其他实施方案中，当将外源序列整合至靶核酸分子中时，可通过内源性启动子序列调控整合序列的表达。在一些实施方案中，外源序列可提供编码蛋白质或蛋白质的一部分的cDNA序列。在其他实施方案中，外源序列可包含或由外显子序列、内含子序列、调控序列、转录控制序列、翻译控制序列、剪接位点或非编码序列组成。在一些实施方案中，外源序列的整合可导致恢复基因功能。在一些实施方案中，外源序列的整合可导致基因敲入。在一些实施方案中，外源序列的整合可导致基因敲除。

模板可具有任何合适的长度。在一些实施方案中，模板的长度可包含10、15、20、25、50、75、100、150、200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000或更多个核苷酸。模板可为单链核酸。模板可为双链或部分双链核酸。在某些实施方案中，单链模板的长度为20、30、40、50、75、100、125、150、175或200个核苷酸。在一些实施方案中，模板可包含与包含靶序列的靶核酸分子的一部分互补的核苷酸序列(即，“同源臂”)。在一些实施方案中，模板可包含与位于靶核酸分子上的裂解位点上游或下游的序列互补的同源臂。

在一些实施方案中，模板含有具有侧接反向末端重复(ITR)序列的ssDNA或dsDNA。在一些实施方案中，模板以载体、质粒、微环、纳米环或PCR产物的形式提供。

核酸的纯化

在一些实施方案中，对核酸进行纯化。在一些实施方案中，使用沉淀法(例如LiCl沉淀、酒精沉淀或等效方法，例如如本文所述)对核酸进行纯化。在一些实施方案中，使用基于色谱的方法，诸如基于HPLC的方法或等效方法(例如如本文所述)对核酸进行纯化。在一些实施方案中，使用沉淀法(例如LiCl沉淀)和基于HPLC的方法两者对核酸进行纯化。

靶序列

在一些实施方案中，本公开的CRISPR/Cas系统可定向并裂解靶核酸分子上的靶序列。举例而言，靶序列可由Cas核酸酶识别和裂解。在某些实施方案中，Cas核酸酶的靶序列位于核酸酶的同源PAM序列附近。在一些实施方案中，2类Cas核酸酶可通过gRNA引导至靶核酸分子的靶序列，其中gRNA与靶序列杂交并且2类Cas蛋白质裂解靶序列。在一些实施方案中，指导RNA与靶序列杂交并且2类Cas核酸酶裂解靶序列，所述靶序列邻近于或包含其同源PAM。在一些实施方案中，靶序列可与指导RNA的靶向序列互补。在一些实施方案中，指导RNA的靶向序列与杂交至指导RNA的对应靶序列部分之间的互补性程度可为约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，指导RNA的靶向序列与杂交至指导RNA的对应靶序列部分之间的同一性百分比可为约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，标靶的同源区邻近于同源PAM序列。在一些实施方案中，靶序列可包含与指导RNA的靶向序列100％互补的序列。在其他实施方案中，相比于指导RNA的靶向序列，靶序列可包含至少一个错配、缺失或插入。

靶序列长度可取决于所使用的核酸酶系统。举例而言，CRISPR/Cas系统的指导RNA的靶向序列的长度可包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或超过50个核苷酸并且靶序列为对应长度，任选地邻近于PAM序列。在一些实施方案中，靶序列的长度可包含15-24个核苷酸。在一些实施方案中，靶序列的长度可包含17-21个核苷酸。在一些实施方案中，靶序列的长度可包含20个核苷酸。当使用切口酶时，靶序列可包含由裂解DNA分子的相对链的一对切口酶识别的一对靶序列。在一些实施方案中，靶序列可包含由裂解DNA分子的相同链的一对切口酶识别的一对靶序列。在一些实施方案中，靶序列可包含由一种或多种Cas核酸酶识别的靶序列的一部分。

靶核酸分子可为任何相对于细胞为内源或外源的DNA或RNA分子。在一些实施方案中，靶核酸分子可为来自细胞或在细胞中的游离型DNA、质粒、基因组DNA、病毒基因组、线粒体DNA或染色体DNA。在一些实施方案中，靶核酸分子的靶序列可为来自细胞(包括人类细胞)或在细胞中的基因组序列。

在其他实施方案中，靶序列可为病毒序列。在其他实施方案中，靶序列可为病原体序列。在其他实施方案中，靶序列可为合成序列。在其他实施方案中，靶序列可为染色体序列。在某些实施方案中，靶序列可包含易位接合点，例如与癌症相关联的易位。在一些实施方案中，靶序列可在真核染色体，诸如人类染色体上。在某些实施方案中，靶序列为肝特异性序列，因为其在肝脏细胞中表达。

在一些实施方案中，靶序列可位于基因的编码序列、基因的内含子序列、调控序列、基因的转录控制序列、基因的翻译控制序列、剪接位点或基因之间的非编码序列中。在一些实施方案中，基因可为蛋白质编码基因。在其他实施方案中，基因可为非编码RNA基因。在一些实施方案中，靶序列可包含疾病相关基因的全部或一部分。在一些实施方案中，靶序列可位于基因组中的非基因功能位点，例如控制染色质组织方面的位点，诸如支架位点或基因座控制区中。

在涉及Cas核酸酶，诸如2类Cas核酸酶的实施方案中，靶序列可邻近于原间隔区邻近基序(“PAM”)。在一些实施方案中，PAM可邻近于或在靶序列的3'端的1、2、3或4个核苷酸内。PAM的长度和序列可取决于所使用的Cas蛋白质。举例而言，PAM可选自特定Cas9蛋白质或Cas9直系同源物的共同序列或特定PAM序列，包括Ran等人，Nature，520:186-191(2015)的图1，和Zetsche 2015的图S5中公开的那些，所述文献的相关公开内容各自以引用方式并入本文。在一些实施方案中，PAM的长度可为2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。非限制性的示例性PAM序列包括NGG、NGGNG、NG、NAAAAN、NNAAAAW、NNNNACA、GNNNCNNA、TTN和NNNNGATT(其中N定义为任何核苷酸，并且W定义为A或T)。在一些实施方案中，PAM序列可为NGG。在一些实施方案中，PAM序列可为NGGNG。在一些实施方案中，PAM序列可为TTN。在一些实施方案中，PAM序列可为NNAAAAW。

脂质制剂

本文公开生物活性剂诸如RNA(包括CRISPR/Cas货物)的LNP制剂的各种实施方案。此类LNP制剂包含“胺脂质”或“可生物降解的脂质”，任选地连同辅助脂质、中性脂质和隐形脂质(诸如PEG脂质)中的一者或多者。“脂质纳米粒子”意指包含通过分子间力彼此物理缔合的多个(即，超过一个)脂质分子的粒子。

胺脂质

在某些实施方案中，用于递送生物活性剂的LNP组合物包含“胺脂质”，所述胺脂质定义为脂质A或其等效物，包括脂质A的缩醛类似物。

在一些实施方案中，胺脂质为脂质A，所述脂质A为十八-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，也称作(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯。脂质A可描绘为：

可根据WO2015/095340(例如第84-86页)合成脂质A。在某些实施方案中，胺脂质为脂质A的等效物。

在某些实施方案中，胺脂质为脂质A的类似物。在某些实施方案中，脂质A类似物为脂质A的缩醛类似物。在特定LNP组合物中，缩醛类似物为C4-C12缩醛类似物。在一些实施方案中，缩醛类似物为C5-C12缩醛类似物。在另外的实施方案中，缩醛类似物为C5-C10缩醛类似物。在另外的实施方案中，缩醛类似物选自C4、C5、C6、C7、C9、C10、C11和C12缩醛类似物。

适用于本文所述的LNP中的胺脂质和其他“可生物降解的脂质”在体内是可生物降解的。胺脂质具有低毒性(例如在动物模型中容许而无大于或等于10mg/kg的量的不良影响)。在某些实施方案中，包含胺脂质的LNP包括这样的LNP：其中在8、10、12、24或48小时或3、4、5、6、7或10天内从血浆清除至少75％的胺脂质。在某些实施方案中，包含胺脂质的LNP包括这样的LNP：其中在8、10、12、24或48小时或3、4、5、6、7或10天内从血浆清除至少50％的mRNA或gRNA。在某些实施方案中，包含胺脂质的LNP包括这样的LNP：其中例如通过测量脂质(例如胺脂质)、RNA(例如mRNA)或其他组分，在8、10、12、24或48小时或3、4、5、6、7或10天内从血浆清除至少50％的LNP。在某些实施方案中，测量LNP的脂质囊封的相对于游离的脂质、RNA或核酸组分。

可生物降解的脂质包括例如WO/2017/173054、WO2015/095340和WO2014/136086的可生物降解的脂质。

脂质清除率可如文献中所述来测量。参见Maier，M.A.等人Biodegradable LipidsEnabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles for Systemic Delivery of RNAiTherapeutics.Mol.Ther.2013，21(8)，1570-78(“Maier”)。举例而言，在Maier中，以0.3mg/kg通过静脉内快速注射经由侧尾静脉向六至八周龄雄性C57Bl/6小鼠施用含有靶向荧光素酶的siRNA的LNP-siRNA系统。在给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、24、48、96和168小时收集血液、肝脏和脾脏样品。在收集组织之前向小鼠灌注生理盐水并且处理血液样品以获得血浆。处理并且通过LC-MS分析所有样品。此外，Maier描述了一种用于评定施用LNP-siRNA制剂之后的毒性的程序。举例而言，以0、1、3、5和10mg/kg(5只动物/组)经由单一静脉内快速注射以5mL/kg的剂量体积向雄性斯普拉格-杜勒大鼠(Sprague-Dawley rat)施用靶向荧光素酶的siRNA。24小时之后，自清醒的动物的颈静脉获得约1mL血液并且分离血清。在给药后72小时，将所有动物安乐死以用于尸体剖检。进行临床征象、体重、血清化学、器官重量和组织病理学的评定。尽管Maier描述了用于评定siRNA-LNP制剂的方法，但这些方法也可适用于评定本公开的LNP组合物的施用的清除率、药代动力学和毒性。

脂质可导致增加的清除率。在一些实施方案中，清除率为脂质清除率，例如从血液、血清或血浆清除脂质的速率。在一些实施方案中，清除率为RNA清除率，例如从血液、血清或血浆清除mRNA或gRNA的速率。在一些实施方案中，清除率为从血液、血清或血浆清除LNP的速率。在一些实施方案中，清除率为从组织，诸如肝脏组织或脾脏组织清除LNP的速率。在某些实施方案中，高清除率产生不具有显著不良影响的安全概况。胺脂质和可生物降解的脂质可减少循环中和组织中的LNP积聚。在一些实施方案中，循环中和组织中的LNP积聚减少产生不具有显著不良影响的安全概况。

取决于脂质所处的介质的pH，脂质可为可电离的。举例而言，在弱酸性介质中，脂质诸如胺脂质可经质子化并且因此带有正电荷。相反地，在弱碱性介质，诸如pH为大约7.35的血液中，脂质诸如胺脂质可不经质子化并且因此不带电荷。

脂质带电荷的能力与其固有的pKa有关。在一些实施方案中，本公开的胺脂质可各自独立地具有在约5.1至约7.4范围内的pKa。在一些实施方案中，本公开的可生物降解的脂质可各自独立地具有在约5.1至约7.4范围内的pKa。举例而言，本公开的胺脂质可各自独立地具有在约5.8至约6.5范围内的pKa。具有在约5.1至约7.4范围内的pKa的脂质对体内递送货物(例如递送至肿瘤)有效。此外，已发现，具有在约5.3至约6.4范围内的pKa的脂质对体内递送(例如递送至肿瘤)有效。参见例如WO2014/136086。

另外的脂质

适用于本公开的脂质组合物中的“中性脂质”包括例如多种中性脂质、不带电脂质或两性离子型脂质。适用于本公开的中性磷脂的实例包括但不限于5-十七基苯-1,3-二醇(间苯二酚)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、磷酸胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、磷脂酰胆碱(PLPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DAPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二月桂酰基磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(MPPC)、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(PMPC)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰基磷脂酰胆碱(PSPC)、1,2-二花生酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DBPC)、1-硬脂酰基-2-棕榈酰基磷脂酰胆碱(SPPC)、1,2-二十碳烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DEPC)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、溶血磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二亚油酰基磷脂酰胆碱二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、棕榈酰油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、溶血磷脂酰乙醇胺以及它们的组合。在一个实施方案中，中性磷脂可选自由以下组成的组：二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)和二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)。在另一个实施方案中，中性磷脂可为二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)。

“辅助脂质”包括类固醇、固醇和烷基间苯二酚。适用于本公开的辅助脂质包括但不限于胆固醇、5-十七基间苯二酚和胆固醇半琥珀酸酯。在一个实施方案中，辅助脂质可为胆固醇。在一个实施方案中，辅助脂质可为胆固醇半琥珀酸酯。

“隐形脂质”为改变纳米粒子可在体内(例如血液中)存在的时长的脂质。隐形脂质可通过例如减少粒子聚集并且控制粒度来辅助配制过程。本文所用的隐形脂质可调节LNP的药代动力学特性。适用于本公开的脂质组合物的隐形脂质包括但不限于具有连接至脂质部分的亲水性头基的隐形脂质。适用于本公开的脂质组合物的隐形脂质以及有关此类脂质的生物化学的信息可在Romberg等人，Pharmaceutical Research，第25卷，第1期，2008，第55-71页和Hoekstra等人，Biochimica et Biophysica Acta 1660(2004)41-52中找到。另外的合适PEG脂质公开于例如WO 2006/007712中。

在一个实施方案中，隐形脂质的亲水性头基包含选自基于PEG的聚合物的聚合物部分。隐形脂质可包含脂质部分。在一些实施方案中，隐形脂质是PEG脂质。

在一个实施方案中，隐形脂质包含选自基于以下的聚合物部分：PEG(有时称为聚(环氧乙烷))、聚(噁唑啉)、聚(乙烯醇)、聚(甘油)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚氨基酸和聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]。

在一个实施方案中，PEG脂质包含基于PEG(有时称为聚(环氧乙烷))的聚合物部分。

PEG脂质还包含脂质部分。在一些实施方案中，脂质部分可衍生自二酰基甘油或二酰基甘油酰胺(diacylglycamide)、包括包含具有独立地包含约C4至约C40饱和或不饱和碳原子的烷基链长度的二烷基甘油或二烷基甘油酰胺基团的那些，其中该链可包含一个或多个官能团，诸如酰胺或酯。在一些实施方案中，烷基链长度包含约C10至C20。二烷基甘油或二烷基甘油酰胺基团可还包含一个或多个取代的烷基。链长可为对称或不对称的。

除非另外指明，否则如本文所用，术语“PEG”意指任何聚乙二醇或其他聚亚烷醚聚合物。在一个实施方案中，PEG为乙二醇或环氧乙烷的任选地取代的直链或支链聚合物。在一个实施方案中，PEG为未取代的。在一个实施方案中，PEG被例如一个或多个烷基、烷氧基、酰基、羟基或芳基取代。在一个实施方案中，所述术语包括PEG共聚物，诸如PEG-聚氨酯或PEG-聚丙烯(参见例如J.Milton Harris，Poly(ethylene glycol)chemistry:biotechnical and biomedical applications(1992))；在另一个实施方案中，所述术语不包括PEG共聚物。在一个实施方案中，PEG的分子量为约130至约50,000，在子实施方案中，为约150至约30,000，在子实施方案中，为约150至约20,000，在子实施方案中，为约150至约15,000，在子实施方案中，为约150至约10,000，在子实施方案中，为约150至约6,000，在子实施方案中，为约150至约5,000，在子实施方案中，为约150至约4,000，在子实施方案中，为约150至约3,000，在子实施方案中，为约300至约3,000，在子实施方案中，为约1,000至约3,000，并且在子实施方案中，为约1,500至约2,500。

在某些实施方案中，PEG(例如与脂质部分或脂质，诸如隐形脂质缀合)为“PEG-2K”，也称为“PEG 2000”，其平均分子量为约2,000道尔顿。PEG-2K在本文中由下式(I)表示，其中n为45，意指数均聚合度包含约45个亚单位

然而，可使用本领域中已知的其他PEG实施方案，包括例如其中数均聚合度包含约23个亚单位(n＝23)和/或68个亚单位(n＝68)的那些。在一些实施方案中，n可在约30至约60的范围内。在一些实施方案中，n可在约35至约55的范围内。在一些实施方案中，n可在约40至约50的范围内。在一些实施方案中，n可在约42至约48的范围内。在一些实施方案中，n可为45。在一些实施方案中，R可选自H、取代的烷基和未取代的烷基。在一些实施方案中，R可为未取代的烷基。在一些实施方案中，R可为甲基。

在本文所述的任一实施方案中，PEG脂质可选自PEG-二月桂酰甘油、PEG-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)(目录号GM-020，获自NOF，Tokyo，Japan)、PEG-二棕榈酰甘油、PEG-二硬脂酰甘油(PEG-DSPE)(目录号DSPE-020CN，NOF，Tokyo，Japan)、PEG-二月桂基甘油酰胺、PEG-二肉豆蔻基甘油酰胺、PEG-二棕榈酰甘油酰胺和PEG-二硬脂酰甘油酰胺、PEG-胆固醇(1-[8'-(胆甾-5-烯-3[β]-氧基)甲酰胺基-3',6'-二氧杂辛基]氨基甲酰基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB(3,4-二-十四氧基苯甲基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DMG)(目录号880150P，获自Avanti Polar Lipids，Alabaster，Alabama，USA)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DSPE)(目录号880120C，获自Avanti PolarLipids，Alabaster，Alabama，USA)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油，甲氧基聚乙二醇(PEG2k-DSG；GS-020，NOF Tokyo，Japan)、聚(乙二醇)-2000-二甲基丙烯酸酯(PEG2k-DMA)和1,2-二硬脂酰氧基丙基-3-胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](PEG2k-DSA)。在一个实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-DMG。在一些实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-DSG。在一个实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-DSPE。在一个实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-DMA。在一个实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-C-DMA。在一个实施方案中，PEG脂质可为化合物S027，其公开于WO2016/010840(第[00240]段至第[00244]段)中。在一个实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-DSA。在一个实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-C11。在一些实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-C14。在一些实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-C16。在一些实施方案中，PEG脂质可为PEG2k-C18。

LNP制剂

LNP可含有(i)可生物降解的脂质；(ii)任选的中性脂质；(iii)辅助脂质；和(iv)隐形脂质，诸如PEG脂质。LNP可含有可生物降解的脂质以及中性脂质、辅助脂质和隐形脂质(诸如PEG脂质)中的一者或多者。

LNP可含有(i)用于封装和用于内体逃逸的胺脂质；(ii)用于稳定化的中性脂质；(iii)同样用于稳定化的辅助脂质；和(iv)隐形脂质，诸如PEG脂质。LNP可含有可生物降解的脂质以及中性脂质、同样用于稳定化的辅助脂质和隐形脂质(诸如PEG脂质)中的一者或多者。

在一些实施方案中，LNP组合物可包含RNA组分，所述RNA组分包含RNA指导的DNA结合剂、Cas核酸酶mRNA、2类Cas核酸酶mRNA、Cas9 mRNA和gRNA中的一者或多者。在一些实施方案中，LNP组合物可包含2类Cas核酸酶和gRNA作为RNA组分。在某些实施方案中，LNP组合物可包含RNA组分、胺脂质、辅助脂质、中性脂质和隐形脂质。在某些LNP组合物中，辅助脂质为胆固醇。在其他组合物中，中性脂质为DSPC。在另外的实施方案中，隐形脂质为PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在某些实施方案中，所述LNP组合物包含脂质A或脂质A的等效物；辅助脂质；中性脂质；隐形脂质；和指导RNA。在某些组合物中，胺脂质为脂质A。在某些组合物中，胺脂质为脂质A或其缩醛类似物；辅助脂质为胆固醇；中性脂质为DSPC；并且隐形脂质为PEG2k-DMG。

在某些实施方案中，根据制剂中脂质组分的各自摩尔比描述脂质组合物。本公开的实施方案提供根据制剂中脂质组分的各自摩尔比描述的脂质组合物。在一个实施方案中，胺脂质的mol％可为约30mol％至约60mol％。在一个实施方案中，胺脂质的mol％可为约40mol％至约60mol％。在一个实施方案中，胺脂质的mol％可为约45mol％至约60mol％。在一个实施方案中，胺脂质的mol％可为约50mol％至约60mol％。在一个实施方案中，胺脂质的mol％可为约55mol％至约60mol％。在一个实施方案中，胺脂质的mol％可为约50mol％至约55mol％。在一个实施方案中，胺脂质的mol％可为约50mol％。在一个实施方案中，胺脂质的mol％可为约55mol％。在一些实施方案中，LNP批料的胺脂质mol％将为目标mol％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在一些实施方案中，LNP批料的胺脂质mol％将为目标mol％的±4mol％、±3mol％、±2mol％、±1.5mol％、±1mol％、±0.5mol％或±0.25mol％。所有mol％数均以LNP组合物的脂质组分的分率给定。在某些实施方案中，胺脂质mol％的LNP批次间变化率将小于15％、小于10％或小于5％。

在一个实施方案中，中性脂质的mol％可为约5mol％至约15mol％。在一个实施方案中，中性脂质的mol％可为约7mol％至约12mol％。在一个实施方案中，中性脂质的mol％可为约9mol％。在一些实施方案中，LNP批料的中性脂质mol％将为目标中性脂质mol％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在某些实施方案中，LNP批次间变化率将小于15％、小于10％或小于5％。

在一个实施方案中，辅助脂质的mol％可为约20mol％至约60mol％。在一个实施方案中，辅助脂质的mol％可为约25mol％至约55mol％。在一个实施方案中，辅助脂质的mol％可为约25mol％至约50mol％。在一个实施方案中，辅助脂质的mol％可为约25mol％至约40mol％。在一个实施方案中，辅助脂质的mol％可为约30mol％至约50mol％。在一个实施方案中，辅助脂质的mol％可为约30mol％至约40mol％。在一个实施方案中，基于胺脂质、中性脂质和PEG脂质浓度而调整辅助脂质的mol％以使脂质组分达到100mol％。在一些实施方案中，LNP批料的辅助脂质mol％将为目标mol％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在某些实施方案中，LNP批次间变化率将小于15％、小于10％或小于5％。

在一个实施方案中，PEG脂质的mol％可为约1mol％至约10mol％。在一个实施方案中，PEG脂质的mol％可为约2mol％至约10mol％。在一个实施方案中，PEG脂质的mol％可为约2mol％至约8mol％。在一个实施方案中，PEG脂质的mol％可为约2mol％至约4mol％。在一个实施方案中，PEG脂质的mol％可为约2.5mol％至约4mol％。在一个实施方案中，PEG脂质的mol％可为约3mol％。在一个实施方案中，PEG脂质的mol％可为约2.5mol％。在一些实施方案中，LNP批料的PEG脂质mol％将为目标PEG脂质mol％的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在某些实施方案中，LNP批次间变化率将小于15％、小于10％或小于5％。

在某些实施方案中，货物包括编码RNA指导的DNA结合剂(例如Cas核酸酶、2类Cas核酸酶或Cas9)的mRNA，和gRNA或编码gRNA的核酸，或mRNA和gRNA的组合。在一个实施方案中，LNP组合物可包含脂质A或其等效物。在一些方面，胺脂质为脂质A。在一些方面，胺脂质为脂质A等效物，例如脂质A的类似物。在某些方面，胺脂质为脂质A的缩醛类似物。在各种实施方案中，LNP组合物包含胺脂质、中性脂质、辅助脂质和PEG脂质。在某些实施方案中，辅助脂质为胆固醇。在某些实施方案中，中性脂质为DSPC。在特定实施方案中，PEG脂质为PEG2k-DMG。在一些实施方案中，LNP组合物可包含脂质A、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质。在一些实施方案中，LNP组合物包含胺脂质、DSPC、胆固醇和PEG脂质。在一些实施方案中，LNP组合物包含PEG脂质，所述脂质包含DMG。在某些实施方案中，胺脂质选自脂质A，和脂质A的等效物，包括脂质A的缩醛类似物。在另外的实施方案中，LNP组合物包含脂质A、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG。

本发明的实施方案还提供根据胺脂质的带正电胺基团(N)与待囊封的核酸的带负电磷酸酯基团(P)之间的摩尔比描述的脂质组合物。此可由方程式N/P数学表示。在一些实施方案中，LNP组合物可包含脂质组分，所述脂质组分包含胺脂质、辅助脂质、中性脂质和辅助脂质；和核酸组分，其中N/P比为约3至10。在一些实施方案中，LNP组合物可包含脂质组分，所述脂质组分包含胺脂质、辅助脂质、中性脂质和辅助脂质；和RNA组分，其中N/P比为约3至10。在一个实施方案中，N/P比可为约5-7。在一个实施方案中，N/P比可为约4.5-8。在一个实施方案中，N/P比可为约6。在一个实施方案中，N/P比可为6±1。在一个实施方案中，N/P比可为约6±0.5。在一些实施方案中，N/P比将为目标N/P比的±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±2.5％。在某些实施方案中，LNP批次间变化率将小于15％、小于10％或小于5％。

在一些实施方案中，RNA组分可包含mRNA，诸如编码Cas核酸酶的mRNA。在一个实施方案中，RNA组分可包含Cas9 mRNA。在一些包含编码Cas核酸酶的mRNA的组合物中，LNP还包含gRNA核酸，诸如gRNA。在一些实施方案中，RNA组分包含Cas核酸酶mRNA和gRNA。在一些实施方案中，RNA组分包含2类Cas核酸酶mRNA和gRNA。

在某些实施方案中，LNP组合物可包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA、胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质。在某些包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA的LNP组合物中，辅助脂质为胆固醇。在其他包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA的组合物中，中性脂质为DSPC。在其他包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA的实施方案中，PEG脂质为PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在包含编码Cas核酸酶(诸如2类Cas核酸酶)的mRNA的特定组合物中，胺脂质选自脂质A及其等效物，诸如脂质A的缩醛类似物。

在一些实施方案中，LNP组合物可包含gRNA。在某些实施方案中，LNP组合物可包含胺脂质、gRNA、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质。在某些包含gRNA的LNP组合物中，辅助脂质为胆固醇。在一些包含gRNA的组合物中，中性脂质为DSPC。在其他包含gRNA的实施方案中，PEG脂质为PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在某些实施方案中，胺脂质选自脂质A及其等效物，诸如脂质A的缩醛类似物。

在一个实施方案中，LNP组合物可包含sgRNA。在一个实施方案中，LNP组合物可包含Cas9 sgRNA。在一个实施方案中，LNP组合物可包含Cpf1 sgRNA。在一些包含sgRNA的组合物中，LNP包括胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质。在某些包含sgRNA的组合物中，辅助脂质为胆固醇。在其他包含sgRNA的组合物中，中性脂质为DSPC。在其他包含sgRNA的实施方案中，PEG脂质为PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在某些实施方案中，胺脂质选自脂质A及其等效物，诸如脂质A的缩醛类似物。

在某些实施方案中，LNP组合物包含编码Cas核酸酶的mRNA和gRNA，所述gRNA可为sgRNA。在一个实施方案中，LNP组合物可包含胺脂质、编码Cas核酸酶的mRNA、gRNA、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质。在某些包含编码Cas核酸酶的mRNA和gRNA的组合物中，辅助脂质为胆固醇。在一些包含编码Cas核酸酶的mRNA和gRNA的组合物中，中性脂质为DSPC。在其他包含编码Cas核酸酶的mRNA和gRNA的实施方案中，PEG脂质为PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在某些实施方案中，胺脂质选自脂质A及其等效物，诸如脂质A的缩醛类似物。

在某些实施方案中，LNP组合物包含Cas核酸酶mRNA，诸如2类Cas mRNA和至少一种gRNA。在某些实施方案中，LNP组合物包含比率为约25:1至约1:25的gRNA与Cas核酸酶mRNA，诸如2类Cas核酸酶mRNA。在某些实施方案中，LNP制剂包含比率为约10:1至约1:10的gRNA与Cas核酸酶mRNA，诸如2类Cas核酸酶mRNA。在某些实施方案中，LNP制剂包含比率为约8:1至约1:8的gRNA与Cas核酸酶mRNA，诸如2类Cas核酸酶mRNA。如本文中所测量，比率是按重量计的。在一些实施方案中，LNP制剂包含比率为约5:1至约1:5的gRNA与Cas核酸酶mRNA，诸如2类Cas mRNA。在一些实施方案中，比率范围为约3:1至1:3、约2:1至1:2、约5:1至1:2、约5:1至1:1、约3:1至1:2、约3:1至1:1、约3:1、约2:1至1:1。在一些实施方案中，gRNA与mRNA的比率为约3:1或约2:1在一些实施方案中，gRNA与Cas核酸酶mRNA(诸如2类Cas核酸酶)的比率为约1:1。比率可为约25:1、10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5、1:10或1:25。

本文所公开的LNP组合物可包括模板核酸。模板核酸可与编码Cas核酸酶的mRNA，诸如2类Cas核酸酶mRNA共配制。在一些实施方案中，模板核酸可与指导RNA共配制。在一些实施方案中，模板核酸可与编码Cas核酸酶的mRNA和指导RNA两者共配制。在一些实施方案中，模板核酸可与编码Cas核酸酶的mRNA或指导RNA分开配制。模板核酸可与LNP组合物一起或与其分开递送。在一些实施方案中，模板核酸可为单链或双链的，这取决于所需的修复机制。模板可具有与靶DNA或与邻近于靶DNA的序列同源的区域。

在一些实施方案中，LNP是通过混合RNA水溶液与基于有机溶剂的脂质溶液，例如100％乙醇而形成。合适的溶液或溶剂包括或可含有：水、PBS、Tris缓冲液、NaCl、柠檬酸盐缓冲液、乙醇、氯仿、二乙醚、环己烷、四氢呋喃、甲醇、异丙醇。可将药学上可接受的缓冲剂用于例如LNP的体内施用。在某些实施方案中，缓冲液用于将包含LNP的组合物的pH维持处于或高于pH 6.5。在某些实施方案中，缓冲液用于将包含LNP的组合物的pH维持处于或高于pH 7.0。在某些实施方案中，组合物的pH在约7.2至约7.7的范围内。在另外的实施方案中，组合物的pH在约7.3至约7.7的范围内或约7.4至约7.6的范围内。在其他实施方案中，组合物的pH为约7.2、7.3、7.4、7.5、7.6或7.7。组合物的pH可用微型pH探针测量。在某些实施方案中，组合物中包括低温保护剂。低温保护剂的非限制性实例包括蔗糖、海藻糖、甘油、DMSO和乙二醇。示例性组合物可包括至多10％低温保护剂，诸如蔗糖。在某些实施方案中，LNP组合物可包括约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％低温保护剂。在某些实施方案中，LNP组合物可包括约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％蔗糖。在一些实施方案中，LNP组合物可包含缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液可包含磷酸盐缓冲液(PBS)、Tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液以及它们的混合物。在某些示例性实施方案中，缓冲液包含NaCl。在某些实施方案中，省去NaCl。NaCl的示例性量可在约20mM至约45mM的范围内。NaCl的示例性量可在约40mM至约50mM的范围内。在一些实施方案中，NaCl的量为约45mM。在一些实施方案中，缓冲液为Tris缓冲液。Tris的示例性量可在约20mM至约60mM的范围内。Tris的示例性量可在约40mM至约60mM的范围内。在一些实施方案中，Tris的量为约50mM。在一些实施方案中，缓冲液包含NaCl和Tris。LNP组合物的某些示例性实施方案含有5％蔗糖和含45mM NaCl的Tris缓冲液。在其他示例性实施方案中，组合物含有呈约5％w/v的量的蔗糖、约45mM NaCl和约50mM Tris(pH 7.5)。盐、缓冲液和低温保护剂量可有所变化以使总制剂的重量克分子渗透浓度得以维持。举例而言，最终重量克分子渗透浓度可维持在小于450mOsm/L。在其他实施方案中，重量克分子渗透浓度在350与250mOsm/L之间。某些实施方案的最终重量克分子渗透浓度为300+/-20mOsm/L。

在一些实施方案中，使用微流体混合、T型混合或交叉混合。在某些方面，流动速率、接头大小、接头几何结构、接头形状、管径、溶液和/或RNA和脂质浓度可有所变化。LNP或LNP组合物可例如经由渗析、切向流过滤或色谱法加以浓缩或纯化。LNP可以例如悬浮液、乳液或冻干粉末形式储存。在一些实施方案中，LNP组合物储存在2℃-8℃下，在某些方面，LNP组合物储存在室温下。在另外的实施方案中，冷冻储存，例如在-20℃或-80℃下储存LNP组合物。在其他实施方案中，将LNP组合物储存在约0℃至约-80℃范围内的温度下。冷冻LNP组合物可在使用之前，例如在冰上、在4℃下、在室温下或在25℃下解冻。可将冷冻LNP组合物保持在各种温度下，例如在冰上、在4℃下、在室温下、在25℃下或在37℃下。

对干细胞(例如HSPC)进行工程化的方法；工程化的干细胞(例如HSPC)

本文所公开的LNP组合物可用于在体外例如通过CRISPR/Cas系统基因编辑对干细胞(例如HSPC)进行工程化的方法中。在一些实施方案中，基因工程化的细胞群体为CD34+细胞群体。在一些实施方案中，提供一种在体外产生基因工程化的HSPC或CD34+细胞群体的方法，所述方法包括(a)将血清因子与用于递送Cas核酸酶mRNA和gRNA的LNP组合物一起预孵育；(b)在体外使HSPC或CD34+细胞群体与预孵育的LNP组合物接触；以及(c)在体外培养HSPC或CD34+细胞群体，从而产生基因工程化的HSPC。在一些实施方案中，所述方法包括根据本文所述的递送方法使HSPC或CD34+细胞与本文所述的LNP组合物接触。

在一些实施方案中，提供工程化的干细胞(例如HSPC)，例如工程化的HSPC或HSPC群体。此类工程化细胞根据本文所述的方法来制备。在一些实施方案中，例如在移植工程化的HSPC之后，工程化的HSPC驻存于组织或器官，例如受试者体内的骨髓、血液或其他组织内。

在本文所述的一些方法和细胞中，细胞包含修饰，例如靶序列中的核苷酸的插入或缺失(“insertion or deletion(indel)”)或取代。在一些实施方案中，修饰包含靶序列中1、2、3、4或5个或更多个核苷酸的插入。在一些实施方案中，修饰包含靶序列中1或2个核苷酸的插入。在其他实施方案中，修饰包含靶序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25个或更多个核苷酸的缺失。在一些实施方案中，修饰包含靶序列中1或2个核苷酸的缺失。在一些实施方案中，修饰包含导致靶序列中的移码突变的插入或缺失。在一些实施方案中，修饰包含靶序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25个或更多个核苷酸的取代。在一些实施方案中，修饰包含靶序列中1或2个核苷酸的取代。在一些实施方案中，修饰包含由并入模板核酸，例如本文所述的任一模板核酸产生的一个或多个核苷酸插入、缺失或取代。

在一些实施方案中，提供包含工程化细胞的细胞群体，例如包含根据本文所述的方法进行工程化的细胞的细胞群体。在一些实施方案中，群体包含体外培养的工程化细胞。在一些实施方案中，群体驻存于组织或器官，例如受试者的肝脏内。在一些实施方案中，群体内的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％或更多的细胞经工程化。在某些实施方案中，本文所公开的方法导致至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％编辑效率(或“编辑百分比”)，其由检测插入或缺失定义。在其他实施方案中，本文所公开的方法导致至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％DNA修饰效率，其由检测序列变化(通过插入、缺失、取代或以其他方式)定义。在某些实施方案中，本文所公开的方法导致细胞群体中约5％至约100％、约10％至约50％、约20％至约100％、约20％至约80％、约40％至约100％或约40％至约80％之间的编辑效率水平或DNA修饰效率水平。

在本文所述的一些方法和细胞中，群体内的细胞包含靶序列处的修饰，例如插入或缺失或取代。在一些实施方案中，修饰包含靶序列中1、2、3、4或5个或更多个核苷酸的插入。在一些实施方案中，修饰包含靶序列中1或2个核苷酸的插入。在其他实施方案中，修饰包含靶序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25个或更多个核苷酸的缺失。在一些实施方案中，修饰包含靶序列中1或2个核苷酸的缺失。在一些实施方案中，修饰导致靶序列中的移码突变。在一些实施方案中，修饰包含导致靶序列中的移码突变的插入或缺失。在一些实施方案中，群体中至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％或更多的工程化细胞包含移码突变。在一些实施方案中，修饰包含靶序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25个或更多个核苷酸的取代。在一些实施方案中，修饰包含靶序列中1或2个核苷酸的取代。在一些实施方案中，修饰包含由并入模板核酸，例如本文所述的任一模板核酸产生的一个或多个核苷酸插入、缺失或取代。

基因编辑方法

本文所公开的方法可用于在体外在干细胞、HSPC或HSPC群体中进行基因编辑。在一个实施方案中，可将本文所述的一种或多种LNP组合物施用至干细胞、HSPC或HSPC群体。在一个实施方案中，本文所述的一种或多种LNP组合物可接触干细胞、HSPC和HSC或HPC。在一个实施方案中，可根据本文所述的方法通过使细胞与LNP组合物接触来产生基因工程化的细胞。在一些基因编辑方法中，将HSPC或HSPC群体保持在培养物中。在一些基因编辑方法中，将HSPC或HSPC群体移植到患者体内。在一些实施方案中，例如在移植工程化的HSPC之后，基因工程化的HSPC驻存于组织或器官，例如患者体内的骨髓、血液或其他组织内。

在一些实施方案中，所述方法包括相对于要施用所述细胞的患者而言是自体的干细胞、HSPC或HSPC群体。在一些实施方案中，所述方法包括相对于要施用所述细胞的患者而言是同种异体的HSPC或HSPC群体。

在各种实施方案中，本文所述的方法在干细胞、HSPC或HSPC群体中实现CRISPR-Cas基因编辑。在一些实施方案中，所述方法还包括检测HSPC或HSPC群体中的基因编辑。在一些实施方案中，以编辑百分比度量基因编辑。在一些实施方案中，以DNA修饰百分比度量基因编辑。所述方法可实现至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的编辑。所述方法可实现至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的DNA修饰。

在一个实施方案中，可将包含编码2类Cas核酸酶的mRNA和gRNA的LNP组合物施用至干细胞、HSPC或HSPC群体。在另外的实施方案中，将模板核酸也引入至细胞。在某些情况下，可将包含2类Cas核酸酶和sgRNA的LNP组合物施用至细胞。

在一个实施方案中，LNP组合物可用于编辑干细胞、HSPC或HSPC群体中的基因，导致基因敲除。在一个实施方案中，LNP组合物可用于编辑HSPC或HSPC群体中的基因，导致例如细胞群体中的基因敲落。敲落或敲除可通过测量靶蛋白水平来检测。敲落或敲除可通过检测靶DNA来检测。在另一个实施方案中，LNP组合物可用于编辑HSPC或HSPC群体中的基因，导致基因校正。在另一个实施方案中，LNP组合物可用于编辑细胞，导致基因插入。

LNP组合物可以与一种或多种药学上可接受的赋形剂结合的制剂形式施用。术语“赋形剂”包括除本公开的化合物、其他脂质组分和生物活性剂以外的任何成分。赋形剂可赋予制剂功能(例如药物释放速率控制)和/或非功能(例如加工助剂或稀释剂)特征。赋形剂的选择在很大程度上将取决于诸如特定施用模式、赋形剂对干细胞或HSPC培养物以及对溶解性和稳定性的影响，以及剂型性质的因素。

当制剂为水性时，可使用诸如糖(包括但不限于葡萄糖、甘露醇、山梨醇等)、盐、碳水化合物和缓冲剂(优选为3至9的pH)的赋形剂，但对于一些应用，制剂可更适当地配制为无菌非水性溶液或配置为待与合适的媒介物诸如无菌无热原质的水(WFI)结合使用的干燥形式。

虽然结合所说明的实施方案来描述本发明，但应理解不意欲将本发明限于那些实施方案。相反，本发明意欲涵盖所有替代方案、修改和等效物，包括特定特征的等效物，它们可包括在如由所附权利要求所定义的本发明内。

前述一般描述和详细描述，以及下述实施例均仅为示例性和解释性的并且不限制教导内容。本文所用的章节标题仅出于组织目的，而不应理解为以任何方式限制所需主题。在以引用方式并入的任何文献与本说明书中定义的任何术语相矛盾的情况下，以本说明书为准。除非另外陈述，否则本申请中给出的所有范围均涵盖端点。

应注意，除非上下文另外明确指示，否则如本申请中所使用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述/该”包括复数指示物。因此，举例而言，提及的“组合物(a composition)”包括多个组合物并且提及的“细胞(a cell)”包括多个细胞等等。除非另外陈述，否则使用的“或”为包括性的并且意指“和/或”。

数值范围包括限定所述范围的数字。考虑到有效数字和与测量相关的误差，所测量和可测量值应理解为大致的。术语“约”或“大致”意指如由本领域普通技术人员所测定的特定值的可接受误差，其部分取决于如何测量或测定该值。在范围之前或在值的清单之前使用诸如“约”的修饰语修饰范围的各端点或清单中的各值。举例而言，“约50-55”涵盖“约50至约55”。另外，使用“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有(contain)”、“含有(contains)”、“含有(containing)”、“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(including)”不具限制性。

除非在上述说明书中明确指出，否则本说明书中陈述“包含”各种组分的实施方案还考虑为“由”所述组分“组成”或“基本上由”所述组分“组成”；本说明书中陈述“由”各种组分“组成”还考虑为“包含”所述组分或“基本上由”所述组分“组成”；本说明书中陈述“约”各种组分的实施方案还考虑为“处于”所述组分；并且本说明书中陈述“基本上由”各种组分“组成”还考虑为“由”所述组分“组成”或“包含”所述组分(此互换性不适用于在权利要求中使用这些术语)。

实施例

实施例1-方法

细胞培养

低温保存的人类CD34+骨髓细胞获自AllCells(目录号ABM017F)或StemCellTechnologies(目录号70008)。解冻并在20ml StemSpan SFEM(Stem Cell technologies，目录号09650)中洗涤两次之后，将细胞在含有以下各项的StemSpan SFEM(StemCellTechnologies，目录号09650)中培养48小时：促血小板生成素(TPO，50ng/ml，StemCellTechnologies，目录号02922)、人类Flt3配体(Flt3l，50ng/ml，StemCellTechnologies，目录号78137.2)、人类白介素-6(Il-6，50ng/ml，StemCell Technologies，目录号78148.2)、人类干细胞因子(SCF，50ng/ml，StemCelltechnologies，目录号78155.2)和StemRegenin-1(SR1，0.75uM)以及青霉素/链霉素(P/S，100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素，Life Technologies，目录号15140122)。

脂质纳米粒子(“LNP”)制剂

通过将脂质纳米粒子成分以下述摩尔比溶解于100％乙醇中来配制LNP：45mol％(12.7mM)脂质胺(例如脂质A)；44mol％(12.4mM)辅助脂质(例如胆固醇)；9mol％(2.53mM)中性脂质(例如DSPC)；2mol％(.563mM)PEG脂质(例如PEG2k-DMG或PEG2k-C11)，除非另有说明。N/P比(脂质胺的摩尔对RNA的摩尔)为4.5。LNP制剂的ID号如下：LNP522、LNP525(GFPmRNA)和LNP670、LNP926(B2M单指导物，Cas9 mRNA)和LNP899(AAVS1单指导物，Cas9 mRNA)。将RNA货物溶解于50mM乙酸盐缓冲液(pH 4.5)或25mM柠檬酸钠、100mM NaCl，pH 5.0中，产生大约0.45mg/mL的RNA货物浓度。

根据根据制造商的方案，使用Precision Nanosystems NanoAssemblrTM台式仪器将脂质和RNA溶液微流体混合来形成LNP。使用差分流动速率在混合期间维持水相与有机溶剂的2:1比率。混合之后，收集LNP，并在磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4(PBS)或50mM tris，pH 7.5(Tris)(大约1:1)中稀释以减少乙醇含量，之后再进行进一步处理。通过在4℃下在轻轻搅拌下使用10kDa Slide-a-Lyzer^TM G2渗析盒(ThermoFisher Scientific)用PBS或Tris(样品体积的100倍过量)渗析过夜来完成最终的缓冲液更换。将Tris处理的制剂以1:1的比例稀释到100mM tris、90mM盐水、5％(w/v)蔗糖，pH 7.5(2x TSS)中。或者，在混合后收集LNP，在水中稀释，在室温下放置1小时，然后第二次用水1:1稀释。用PD-10脱盐柱(GE)来完成将最终缓冲液更换为TSS。如果需要，用Amicon 100kDa离心过滤器(Millipore)通过离心浓缩经任一处理方法得到的制剂。所得混合物接着使用0.2μm无菌过滤器过滤。如果最终缓冲液为PBS，则将所得滤液储存在2℃-8℃下；如果最终缓冲液为TSS，则将所得滤液储存在-80℃下。

核酸酶mRNA和单指导RNA(sgRNA)的体外转录(“IVT”)

通过使用线性化质粒DNA模板和T7 RNA聚合酶进行体外转录产生封端且聚腺苷酸化的Cas9 mRNA。通过在以下条件下与XbaI一起在37℃下孵育2小时来线性化含有T7启动子和100个残基的poly(A/T)区的质粒DNA：200ng/μL质粒、2U/μL XbaI(NEB)和1x反应缓冲液。通过在65℃下加热反应物20分钟来使XbaI失活。使用二氧化硅最大旋柱(Epoch LifeSciences)自酶和缓冲盐纯化线性化质粒并且通过琼脂糖凝胶加以分析以证实线性化。将用于产生Cas9修饰的mRNA的IVT反应物在37℃下在以下条件下孵育4小时：50ng/μL线性化质粒；2mM的GTP、ATP、CTP和N1-甲基假UTP(Trilink)中的每一者；10mM ARCA(Trilink)；5U/μL T7 RNA聚合酶(NEB)；1U/μL鼠类RNA酶抑制剂(NEB)；0.004U/μL无机大肠杆菌焦磷酸酶(NEB)；和1x反应缓冲液。在4小时孵育之后，添加TURBO DNA酶(ThermoFisher)至0.01U/μL的最终浓度，并且再孵育反应物30分钟以去除DNA模板。使用LiCl沉淀法纯化Cas9 mRNA。

对于所有方法，通过测量在260nm(Nanodrop)处的吸光度来测定转录物浓度，并通过使用Bioanlayzer(Agilent)进行毛细管电泳对转录物加以分析。SgRNA是化学合成的。

人类CD34+骨髓细胞的LNP转染

将含有GFP mRNA或Cas9 mRNA和靶向β2-微球蛋白(B2M)的单指导物的LNP以50.0Ng至800.0Ng范围内的各种浓度添加至30,000个人类CD34+骨髓细胞，总体积为100.0ul。靶向GGCCACGGAGCGAGACATCT B2M靶序列(SEQ ID NO:75)的sgRNA的序列为：mG*mG*mC*CACGGAGCGAGACAUCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:76)。在该核酸序列中，A、U、G和C分别指示腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤；m表示2’-O-甲基核苷酸；并且*指示硫代磷酸酯键。

对于种特异性血清研究(Triple S研究)，在细胞转染之前，在37℃下将LNP在来自以下的6.0％血清中孵育5分钟：小家鼠(BioreclamationIVT，目录号MSESRM，批号MSE245821)、食蟹猕猴(M.fascicularis)(BioreclamationIVT，目录号CYNSRM，批号CYN197451)和智人(Sigma，合并的，H4522-20ml，批号SLBR7629V；BioreclamationIVT，目录号HMSRM，批号BRH1278638；BioreclamationIVT，目录号HMSRM，批号BRH1227947)。在如上所述相同的孵育条件下，在推荐的缓冲液中使用一定浓度范围内(01.ug/ml、1.0ug/ml、10.0ug/ml和50.0ug/ml)的人类重组载脂蛋白E3(ApoE3，R&D Systems，目录号4144-AE)。

LNP转染的人类CD34+骨髓细胞的流式细胞术读出

在LNP-GFP转染后24小时或LNP-B2M转染后5天收集细胞用于抗体染色。在样品培养基(PBS+2％FBS+2mM EDTA)中洗涤细胞之后，在室温(RT)下用Human TruStain FcX(Biolegend，目录号422302)封闭细胞5分钟。

我们用如表2所示的以下抗体和标记对细胞进行了染色。

表2.抗体和标记.

将细胞在Beckman Coulter CytoflexS上运行，并使用FlowJo软件包加以分析。

用7-AAD染色评定细胞存活。基于富含GC的DNA区中的7-AAD插入对活细胞进行归一化，随后在流式细胞术测定中进行检测。使用以下公式计算细胞存活率：

[(样品1_{细胞事件数量}/样品1_{珠粒事件数量})*样品1_{添加的珠粒总数}]/平均值{[(对照1_{细胞事件数量}/对照1_{珠粒事件数量})*对照1_{添加的珠粒总数}]，[(对照2_{细胞事件数量}/对照1_{珠粒事件数量})*对照2_{添加的珠粒总数}]，…，对照N}

在该公式中，“样品”定义为在实验过程中接受LNP、mRNA、gRNA或前者的任意组合的治疗的任何人类CD34+HSPC群体，“对照”定义为在实验过程中未接受LNP、mRNA、gRNA或前者的任意组合的任何治疗的任何人类CD34+HSPC群体。

下一代测序(“NGS”)和裂解效率分析

为了定量地测定基因组中靶位置处的编辑效率，利用深度测序鉴别由基因编辑引入的插入和缺失的存在。

转染后第5天收集细胞，并使用PureLink Genomic DNA微型试剂盒(ThermoFisherScientific，目录号K182002)提取DNA。使用含有Illumina P5和P7衔接子序列的针对B2M靶基因座的引物在标准PCR反应中扩增目标基因组位点。

在B2M靶位点周围设计PCR引物，并且扩增目标基因组区域。提交样品进行样品制备(Illumina MiSeq v2试剂盒，300个循环，目录号15033624)，并在Illumina MiSeq仪器上运行测序。使用定制管道(bespoke pipeline)分析目标靶位点处的编辑频率。简而言之，根据制造商的方案(Illumina)进行额外PCR以添加测序所必需的化学性质。在IlluminaMiSeq仪器上对扩增子进行测序。在消除具有低质量评分的读段之后，将读段与人类参考基因组(例如hg38)比对。将含有读段的所得文件映射至参考基因组(BAM文件)，其中选择与目标靶区重叠的读段并且计算野生型读段的数目相对于含有插入、取代或缺失的读段的数目。

编辑百分比(例如“编辑效率”或“编辑％”)以具有插入或缺失的序列读段的总数相比于包括野生型的序列读段的总数形式提供。

制剂分析

分析LNP制剂的平均粒度、多分散性(pdi)、总RNA含量和RNA包封效率。通过动态光散射(DLS)使用Malvern Zetasizer仪器测量平均粒度和多分散性。在通过DLS进行测量之前，将LNP样品在PBS中稀释30X。连同数均直径和pdi一起报告Z-平均直径，所述Z-平均直径为平均粒度的基于强度的量度。

使用基于荧光的测定(

ThermoFisher Scientific)来测定总RNA浓度和游离RNA。包封效率计算为(总RNA-游离RNA)/总RNA。用含有0.2％Triton-X 100的1xTE缓冲液以适当方式稀释LNP样品以测定总RNA或用1x TE缓冲液稀释以测定游离RNA。通过利用用于制造制剂并且在1x TE缓冲液+/-0.2％Triton-X 100中稀释的起始RNA溶液制备标准曲线。接着将稀释的

染料(100X于1xTE缓冲液中，根据制造商的说明书)添加至标准品和样品中的每一者中，并且使它们在不存在光的情况下在室温下孵育大约10分钟。使用SpectraMax M5微板读数器(Molecular Devices)，以分别设定成488nm、515nm和525nm的激发波长、自动截止波长和发射波长来读取样品。根据适当标准曲线测定总RNA和游离RNA。包封效率计算为(总RNA-游离RNA)/总RNA。可使用相同程序来测定基于DNA的货物组分的包封效率。对于单链DNA，可使用Oligreen染料，并且对于双链DNA，可使用Picogreen染料。

实施例2-GFP至CD34+骨髓细胞的递送

如实施例1中所述地将LNP与GFP mRNA配制在最终PBS缓冲液中并将其添加至30,000个人类CD34+骨髓细胞，总体积为100.0ul，从而在各种反应中提供0、50.0ng、100.0ng和200.0ng的GFP mRNA。在施用至细胞之前，在37℃下将LNP与来自小家鼠(BioreclamationIVT，目录号MSESRM，批号MSE245821)的6％(v/v)血清一起预孵育5分钟。如实施例1中所述地培养细胞。

将LNP添加至人类CD34+细胞后24小时，通过流式细胞术定量GFP+细胞。相对于GFP-对照(在图1中标记为“对照”)，在FITC通道(最大激发490，最大发射525，激光线488)中确定GFP+细胞群体。LNP介导的GFP mRNA递送后24小时，所有人类CD34+活骨髓细胞中GFP+细胞的百分比示于图1中。LNP组成如下，图1(A)：45％脂质A，44％胆固醇，9％DSPC，2％PEG；图1(B)：45％脂质A，45％胆固醇，9％DSPC，1％PEG。生物样品大小n＝3。

LNP组合物证实了mRNA至CD34+骨髓细胞的剂量依赖性体外递送。

实施例3-LNP预孵育有利于递送

测试证实，LNP需要在转染之前与6％小鼠血清(v/v)一起孵育，才能有效地将GFPmRNA递送至人类CD34⁺骨髓细胞。如实施例2中所述地培养细胞并用LNP组合物转染细胞，且进行以下改动：

图2A显示在低温保存的细胞小瓶解冻后第0天立即应用LNP下的人类CD34⁺骨髓样品的所有活细胞中GFP⁺细胞的百分比。在转染之前进行或不进行血清孵育的情况下，将具有50.0ng、100.0ng或200.0ng GFP mRNA的LNP添加至细胞。

图2B显示在低温保存的细胞小瓶解冻后第2天应用LNP下的人类CD34⁺骨髓样品的所有活细胞中GFP⁺细胞的百分比。在转染之前进行或不进行血清孵育的情况下，将具有50.0ng、100.0ng或200.0ng GFP mRNA的LNP添加至细胞。生物样品大小n＝3。

实施例4-经由LNP递送Cas9和指导RNA；CD34+骨髓细胞中的基因编辑

如实施例1中所述地将LNP与如实施例1中所述的sgRNA(G529)和Cas9 mRNA且以1:1的重量比一起配制在最终TSS缓冲液中。LNP组成为45％脂质A，44％胆固醇，9％DSPC，2％PEG；N/P比为4.5。

使用LNP递送方法转染人类CD34⁺骨髓细胞，通过与增加百分比(v/v)的小家鼠或食蟹猕猴血清一起预孵育可将Cas9 mRNA和B2M sgRNA有效地递送至细胞。经由与各种血清一起预孵育的LNP递送活性Cas9-sgRNA复合物。

图3A描绘转染细胞的FACS分析结果，显示应用与6％、30％和60％(v/v)的小鼠血清(“小鼠-S”)或6％、30％和60％(v/v)的非人类灵长类动物血清(“食蟹猴-S”)一起孵育的LNP(400.0ng Cas9 mRNA和sgRNA(按重量计1:1))之后，B2M阴性细胞的百分比。未经血清预孵育的LNP(“仅LNP”)和未经处理的细胞(“对照(Ctrl)”)未显示有效递送(测量B2M表达敲落)。与小鼠或灵长类动物血清一起预孵育有利于有效敲落CD34⁺骨髓细胞中的B2M表达。

图3B描绘了如通过NGS测定的，用与6％、30％和60％(v/v)的小鼠血清或6％、30％和60％(v/v)的非人类灵长类动物血清一起孵育的LNP(400.0ng Cas9 mRNA和sgRNA(按重量计1:1))转染的人类CD34⁺骨髓细胞的基因组水平上的编辑效率。如图3(A)所示，未经血清预孵育的LNP施用和未经处理的细胞未显示有效的递送(测量编辑％)。插入(“In”，浅灰色)和缺失(“Del”，黑色)绘制在Y轴上，显示CD34⁺细胞中大于约60％、大于约70％、大于约80％和大于约90％的编辑效率。“仅LNP”和“对照”样本在B2M基因座处未展示可检测水平的插入或缺失。生物样品大小n＝3。

实施例5-与分离的血清因子ApoE3一起预孵育

为了调查血清预孵育步骤是否可被重组蛋白取代，在细胞转染之前如实施例4中所述地在LNP孵育步骤期间将递送Cas9和B2M sgRNA的LNP与人类重组载脂蛋白E3(ApoE3)、小鼠血清或非人类灵长类动物血清一起预孵育。

图4A中显示应用与6％(v/v)的小鼠血清(“小鼠-S”)或6％(v/v)的非人类灵长类动物血清(“食蟹猴-S”)或0.1μg/ml、1.0μg/ml、10.0μg/ml和50.0μg/ml的ApoE3一起预孵育的LNP(400ng Cas9 mRNA和sgRNA(1:1))之后，B2M阴性细胞的百分比。未经处理的人类CD34⁺骨髓细胞用作阴性对照(“对照”)。ApoE3显示出对递送至CD34+细胞的剂量依赖性增加，并且其可用于预孵育步骤。

同样，基因编辑显示出对ApoE3的剂量依赖性反应。图4B描绘如通过NGS测定的，用与6％(v/v)的小鼠血清或6％(v/v)的非人类灵长类动物血清或0.1μg/ml、1.0μg/ml、10.0μg/ml和50.0μg/ml的ApoE3一起孵育的400.0ng LNP转染的人类CD34⁺骨髓细胞的B2M靶标的编辑百分比。未经处理的人类CD34⁺骨髓细胞用作阴性对照，所述阴性对照在B2M基因座处未展示可检测水平的插入或缺失。生物样品大小n＝3。

实施例6-与血清因子一起预孵育

该实验测试LNP与多种不同载脂蛋白的预孵育，显示如以HSPC群体中B2M敲落水平和编辑频率测量的ApoE同种型的体外LNP摄取。在转染之前，将LNP(ID LNP926)与6％的小家鼠血清(v/v)或以下各种浓度的载脂蛋白在37℃下一起孵育5分钟：重组人类ApoA-I(Millipore Sigma，目录号SRP4693)、来自人类血浆的ApoB(Millipore Sigma，目录号A5353)、来自人类血浆的ApoC-I(Millipore Sigma，目录号A7785)、人类重组ApoE2(Millipore Sigma，目录号SRP4760)、人类重组ApoE3(Millipore Sigma，目录号SRP4696)、人类重组ApoE4(Millipore Sigma，目录号A3234)。将LNP以200ng总RNA货物(1:1w/w比率的Cas9 mRNA和单指导物)的浓度添加至人类CD34+骨髓细胞。在转染后第5天，使用与如上所述相同的抗体通过流式细胞术测定蛋白质水平上的B2M表达。使用FlowJo软件包进行数据分析。数据代表一个生物样品(N＝1)，技术重复品的平均值+/-SD。

图5显示食蟹猴血清、ApoE2、ApoE3和ApoE4预孵育的LNP转染后，CD34+HSPC群体中的B2M敲落。未经处理，未经预孵育以及与ApoA-I、ApoB和ApoC-I的预孵育不导致B2M敲落。在该实验中，与其他两个ApoE同种型相比，LNP与ApoE2的预孵育显示出较少的B2M敲落。

示例7-LNP暴露的时间过程

该实验测试LNP暴露持续时间对存活率和编辑率的影响。将递送Cas9 mRNA和靶向G562的AAVS1的LNP899与6％(v/v)的非人类灵长类动物血清在37℃下一起预孵育约5分钟。将LNP以300ng总RNA货物(1:1w/w比率的Cas9 mRNA和单指导物)的浓度添加至人类CD34+骨髓细胞。转染后2小时、6小时或24小时，将细胞离心并重悬于无LNP的新鲜培养基中。使用在CytoFLEXS流式细胞仪(Beckman Coulter)上测得的CountBright^TM绝对计数珠粒(Invitrogen，目录号C36950)评定3天和8天的细胞存活率。如实施例1中所述地通过NGS测量编辑。表3和图6B显示转导后8天的编辑频率。表3和图6A显示转导后3天和8天的细胞存活率。

表3-不同LNP暴露下的存活率和编辑

公开序列表简述

关于序列本身，参见下文序列表。转录物序列通常包括呈与ARCA一起使用的前三个核苷酸形式的GGG或呈与CleanCap^TM一起使用的前三个核苷酸形式的AGG。因此，前三个核苷酸可经过修饰以与其他加帽方法，诸如牛痘加帽酶一起使用。启动子和poly-A序列不包括在转录物序列中。启动子，诸如T7启动子(SEQ ID NO:31)和poly-A序列，诸如SEQ ID NO:63可在5’端和3’端处分别附接于所公开的转录物序列。大多数核苷酸序列以DNA形式提供，但可通过将T变成U而容易地转化成RNA。

序列表

以下序列表提供本文所公开的序列的清单。应理解，如果相对于RNA提及DNA序列(包含T)，则T应被U(取决于上下文，其可为修饰的或未修饰的)置换，反之亦然。

*＝PS键联；m＝2'-O-Me核苷酸；N＝任何天然或非天然核苷酸

GFP序列：

Claims (99)

1.一种将mRNA递送至造血干细胞和/或祖细胞(HSPC)或HSPC群体的方法，所述方法包括：

a.将血清因子与包含所述mRNA、胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质的LNP组合物一起预孵育；

b.在体外使所述HSPC或所述HSPC群体与所述预孵育的LNP组合物接触；以及

c.在体外培养所述HSPC或所述HSPC群体；

从而将所述mRNA递送至所述HSPC或所述HSPC群体。

2.一种将mRNA递送至HSPC的方法，所述方法包括：

a.将血清因子与包含所述mRNA和胺脂质的LNP组合物一起预孵育；

b.在体外使所述细胞与所述预孵育的LNP组合物接触；以及

c.在体外培养所述HSPC；

从而将所述mRNA递送至所述HSPC。

3.一种将mRNA递送至干细胞或干细胞群体的方法，所述方法包括：

a.将血清因子与包含所述mRNA的LNP组合物一起预孵育；

b.在体外使所述干细胞群体与所述预孵育的LNP组合物接触；以及

c.在体外培养所述干细胞群体；

从而将所述mRNA递送至所述干细胞群体。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述mRNA编码Cas核酸酶。

5.一种将Cas核酸酶mRNA和gRNA引入HSPC的方法，所述方法包括：

a.将血清因子与包含所述Cas核酸酶mRNA、gRNA、胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质的LNP组合物一起预孵育；

b.在体外使所述HSPC与所述预孵育的LNP组合物接触；以及

c.培养所述HSPC；

从而将所述Cas核酸酶mRNA和所述gRNA引入所述HSPC。

6.一种在体外产生基因工程化的HSPC的方法，所述方法包括：

a.将血清因子与包含Cas核酸酶mRNA、gRNA、胺脂质、辅助脂质、中性脂质和PEG脂质的LNP组合物一起预孵育；

b.在体外使所述HSPC与所述预孵育的LNP组合物接触；以及

c.在体外培养所述HSPC；

从而产生基因工程化的HSPC。

7.一种将Cas核酸酶mRNA和gRNA引入干细胞的方法，所述方法包括：

a.将血清因子与包含所述Cas核酸酶mRNA、gRNA和胺脂质的LNP组合物一起预孵育；

b.在体外使所述干细胞与所述预孵育的LNP组合物接触；以及

c.培养所述干细胞；

从而将所述Cas核酸酶mRNA和所述gRNA引入所述干细胞。

8.一种在体外产生基因工程化的干细胞诸如HSPC的方法，所述方法包括：

a.将血清因子与包含Cas核酸酶mRNA、gRNA和可生物降解脂质的LNP组合物一起预孵育；

b.在体外使所述细胞与所述预孵育的LNP组合物接触；以及

c.在体外培养所述细胞；

从而产生基因工程化的干细胞，诸如HSPC。

9.如权利要求4所述的方法，其中所述LNP组合物还包含gRNA。

10.如权利要求4-9中任一项所述的方法，其中所述Cas核酸酶为2类Cas核酸酶。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述2类Cas核酸酶为Cas9核酸酶。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述Cas9核酸酶为酿脓链球菌Cas9。

13.如权利要求10所述的方法，其中所述2类Cas核酸酶为Cpf1核酸酶。

14.如权利要求5-13中任一项所述的方法，其中所述gRNA为双指导RNA(dgRNA)。

15.如权利要求5-13中任一项所述的方法，其中所述gRNA为单指导RNA(sgRNA)。

16.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述接触步骤之后的洗涤步骤。

17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述接触步骤时长在约1分钟与约72小时之间。

18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述接触步骤时长在约1分钟与约24小时之间。

19.如权利要求17或18所述的方法，其中所述接触步骤在约2小时与约24小时之间。

20.如权利要求17-19中任一项所述的方法，其中所述接触步骤在约4小时与约12小时之间。

21.如权利要求17-20中任一项所述的方法，其中所述接触步骤在约6小时与约12小时之间。

22.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中转染后细胞存活率为至少60％。

23.如权利要求22所述的方法，其中其中转染后细胞存活率为至少70％。

24.如权利要求22所述的方法，其中其中转染后细胞存活率为至少80％。

25.如权利要求22所述的方法，其中转染后细胞存活率为至少90％。

26.如权利要求22所述的方法，其中转染后细胞存活率为至少95％。

27.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述血清因子与所述LNP组合物一起预孵育约30秒至过夜。

28.如权利要求27所述的方法，所述方法包括预孵育约1分钟至1小时。

29.如权利要求27所述的方法，所述方法包括预孵育约1-30分钟。

30.如权利要求27所述的方法，所述方法包括预孵育约1-10分钟。

31.如权利要求27所述的方法，所述方法包括预孵育约5分钟。

32.如权利要求27或权利要求31所述的方法，所述方法包括预孵育5分钟±2分钟。

33.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述预孵育在约4℃下发生。

34.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述预孵育在约25℃下发生。

35.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述预孵育在约37℃下发生。

36.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述预孵育步骤包括缓冲液。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述缓冲液包含HSPC培养基或由所述HSPC培养基组成。

38.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述LNP组合物与血清一起预孵育。

39.如权利要求38所述的方法，其中所述血清为哺乳动物、小鼠、灵长类动物或人类血清。

40.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中将所述LNP组合物与分离的血清因子一起预孵育。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述血清因子为ApoE。

42.如权利要求40所述的方法，其中所述血清因子选自ApoE2、ApoE3和ApoE4。

43.如权利要求40-42中任一项所述的方法，其中所述ApoE为重组人类蛋白。

44.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中培养步骤包括在HSPC培养缓冲液中扩增所述干细胞、所述HSPC或所述HSPC群体。

45.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述接触步骤与所述培养步骤之间更换所述培养基。

46.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养步骤包括干细胞扩增剂。

47.如权利要求1-2、4-6或8-46中任一项所述的方法，其中所述HSPC为造血干细胞(HSC)。

48.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述干细胞、所述HSPC或所述HSPC群体为人类细胞或样品。

49.如权利要求5-48中任一项所述的方法，其中将所述mRNA和所述指导RNA核酸配制在单一LNP组合物中。

50.如权利要求5-48中任一项所述的方法，其中将所述mRNA和所述gRNA共包封在所述LNP组合物中。

51.如权利要求5-48中任一项所述的方法，其中将所述mRNA和所述gRNA单独包封在LNP中。

52.如权利要求5-48中任一项所述的方法，其中将所述mRNA配制在第一LNP组合物中，并且将所述指导RNA核酸配制在第二LNP组合物中。

53.如权利要求52所述的方法，其中同时施用所述第一LNP组合物和所述第二LNP组合物。

54.如权利要求52所述的方法，其中依序施用所述第一LNP组合物和所述第二LNP组合物。

55.如权利要求52-54中任一项所述的方法，其中在所述预孵育步骤之前将所述第一LNP组合物和所述第二LNP组合物合并。

56.如权利要求52-54中任一项所述的方法，其中将所述第一LNP组合物和所述第二LNP组合物单独预孵育。

57.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括将模板核酸引入所述细胞。

58.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述LNP组合物包含：RNA组分和脂质组分，其中所述脂质组分包含胺脂质、中性脂质、辅助脂质和隐形脂质；并且其中N/P比约为1-10。

59.如权利要求58所述的方法，其中所述脂质组分包含脂质A或其缩醛类似物。

60.如权利要求58所述的方法，其中所述脂质组分包含：

约40-60mol％胺脂质；

约5-15mol％中性脂质；和

约1.5-10mol％PEG脂质，

其中所述脂质组分的其余部分为辅助脂质，并且

其中所述LNP组合物的所述N/P比为约3-10。

61.如权利要求58所述的方法，其中所述脂质组分包含：

约50-60mol％胺脂质；

约8-10mol％中性脂质；和

约2.5-4mol％PEG脂质，

其中所述脂质组分的其余部分为辅助脂质，并且

其中所述LNP组合物的所述N/P比为约3-8。

62.如权利要求56所述的方法，其中所述脂质组分包含：

约50-60mol％胺脂质；

约5-15mol％DSPC；和

约2.5-4mol％PEG脂质，

其中所述脂质组分的其余部分为胆固醇，并且

其中所述LNP组合物的所述N/P比为约3-8。

63.如权利要求58所述的方法，其中所述脂质组分包含：

48-53mol％脂质A；

约8-10mol％DSPC；和

1.5-10mol％PEG脂质，

其中所述脂质组分的其余部分为胆固醇，并且

其中所述LNP组合物的所述N/P比为3-8±0.2。

64.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RNA为修饰的RNA。

65.如权利要求64所述的方法，其中所述修饰的RNA为修饰的mRNA。

66.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述RNA包含编码RNA指导的DNA结合剂的开放阅读框，其中所述开放阅读框的尿苷含量在其最小尿苷含量至所述最小尿苷含量的150％范围内。

67.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述RNA包含包含编码RNA指导的DNA结合剂的开放阅读框，其中所述开放阅读框的尿苷二核苷酸含量在其最小尿苷二核苷酸含量至所述最小尿苷二核苷酸含量的150％范围内。

68.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述RNA包含与SEQ ID NO:1、4、10、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27、29、30、50、52、54、65或66中的任一者具有至少90％同一性的序列，其中所述mRNA包含编码RNA指导的DNA结合剂的开放阅读框。

69.如权利要求5-68中任一项所述的方法，其中所述gRNA为修饰的gRNA。

70.如权利要求69所述的方法，其中所述gRNA包含选自以下的修饰：2’-O-甲基(2’-O-Me)修饰的核苷酸、核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键；以及2’-氟基(2’-F)修饰的核苷酸。

71.如权利要求69或70所述的方法，其中所述gRNA在5’端的前五个核苷酸中的一者或多者处包含修饰。

72.如权利要求69-71中任一项所述的方法，其中所述gRNA在3’端的最后五个核苷酸中的一者或多者处包含修饰。

73.如权利要求69-72中任一项所述的方法，其中所述gRNA在前四个核苷酸之间包含PS键。

74.如权利要求69-73中任一项所述的方法，其中所述gRNA在最后四个核苷酸之间包含PS键。

75.如权利要求69-74中任一项所述的方法，所述方法在5’端的前三个核苷酸处还包含2’-O-Me修饰的核苷酸。

76.如权利要求69-75中任一项所述的方法，所述方法在3’端的最后三个核苷酸处还包含2’-O-Me修饰的核苷酸。

77.如权利要求1-2、4-6或8-76所述的方法，其中所述HSPC或所述HSPC群体为CD34+。

78.如权利要求1-2、4-6或8-77所述的方法，其中所述HSPC或所述HSPC群体为CD34+CD90+。

79.一种工程化的干细胞或干细胞群体，所述工程化的干细胞或干细胞群体通过如前述权利要求中任一项所述的方法产生。

80.一种工程化的HSPC或HSPC群体，所述工程化的HSPC或HSPC群体通过如前述权利要求中任一项所述的方法产生。

81.如权利要求78所述的HSPC或HSPC群体，其中例如在移植工程化的HSPC之后，所述工程化的HSPC驻存于患者体内的组织或器官，例如骨髓、血液或其他组织内。

82.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述干细胞、所述HSPC或所述HSPC群体相对于要施用所述细胞的患者而言是自体的。

83.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述干细胞、所述HSPC或所述HSPC群体相对于要施用所述细胞的患者而言是同种异体的。

84.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述干细胞、所述HSPC或所述HSPC群体中实现CRISPR-Cas基因编辑。

85.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括在所述干细胞、所述HSPC或所述HSPC群体中检测基因编辑。

86.如权利要求84或85所述的方法，其中以编辑百分比或DNA修饰百分比度量所述基因编辑。

87.如权利要求86所述的方法，其中所述编辑百分比为至少40％。

88.如权利要求86所述的方法，其中所述编辑百分比为至少60％。

89.如权利要求86所述的方法，其中所述编辑百分比为至少70％。

90.如权利要求86所述的方法，其中所述编辑百分比为至少80％。

91.如权利要求86所述的方法，其中所述编辑百分比为至少90％。

92.如权利要求86所述的方法，其中所述编辑百分比为至少95％。

93.如权利要求86所述的方法，其中所述DNA修饰百分比为至少40％。

94.如权利要求86所述的方法，其中所述DNA修饰百分比为至少60％。

95.如权利要求86所述的方法，其中所述DNA修饰百分比为至少70％。

96.如权利要求86所述的方法，其中所述DNA修饰百分比为至少80％。

97.如权利要求86所述的方法，其中所述DNA修饰百分比为至少90％。

98.如权利要求86所述的方法，其中所述DNA修饰百分比为至少95％。

99.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述干细胞、所述HSPC或所述HSPC群体来自骨髓样品。

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