ES2942309T3 - Materiales y métodos para el tratamiento de hemoglobinopatías - Google Patents

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Abstract

La presente solicitud proporciona materiales y métodos para el tratamiento de hemoglobinopatías. Más específicamente, la aplicación proporciona métodos para producir células progenitoras que se modifican genéticamente a través de la edición del genoma para aumentar la producción de hemoglobina fetal (HbF), así como células progenitoras modificadas (incluidas, por ejemplo, células madre hematopoyéticas humanas CD34+) que producen niveles aumentados de HbF, y métodos de uso de tales células para tratar hemoglobinopatías tales como anemia de células falciformes y β-talasemia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Materiales y métodos para el tratamiento de hemoglobi nopatías
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de EE. UU. N.° 62/250,823 presentada el 4 de noviembre de 2015 y solicitud de EE. UU. N.° 62/328,203 presentada el 27 de abril de 2016. En la medida en que existan discrepancias entre las descripciones de estas solicitudes relacionadas y la presente solicitud, debe prevalecer la descripción de la presente solicitud.
Referencia a la lista de secuencias
La presente solicitud contiene una lista de secuencias que se presentó de forma electrónica en formato ASCII y se incorpora a la presente en su totalidad por referencia. Dicha copia ASCII, creada el 4 de noviembre de 2016, se denomina 116339_8_Sequence_Listing.txt y tiene un tamaño de 31,0 MB.
Campo
La presente solicitud proporciona materiales y métodos para el tratamiento de hemoglobinopatías. Más específicamente, la solicitud proporciona métodos para producir células progenitoras que se modifican genéticamente mediante la edición del genoma para aumentar la producción de hemoglobina fetal (HbF), así como células progenitoras modificadas, incluyendo, por ejemplo, células madre hematopoyéticas humanas CD34+ (hHSC) que producen niveles mayores de HbF, y métodos de uso de tales células para tratar hemoglobinopatías tales como la anemia drepanocítica y la p-talasemia.
Antecedentes
Las hemoglobinopatías abarcan una serie de anemias que están asociadas con cambios en la estructura determinada genéticamente o en la expresión de la hemoglobina. Estos incluyen cambios en la estructura molecular de la cadena de hemoglobina, tal como ocurre con la anemia drepanocítica, así como cambios en los que se reduce o está ausente la síntesis de una o más cadenas, tal como ocurre en varias talasemias.
Los trastornos específicamente asociados con la proteína globina p se denominan generalmente phemoglobinopatías. Por ejemplo, las p-talasemias resultan de un defecto parcial o completo en la expresión del gen de la globina p, lo que conduce a la deficiencia o ausencia de hemoglobina A (HbA). La HbA es el tetrámero de hemoglobina humana más común y consiste en dos cadenas a y dos cadenas p (a2p2). Las ptalasemias se deben a mutaciones en el gen de la globina p del adulto (HBB) en el cromosoma 11 y se heredan de forma autosómica recesiva. La p-talasemia o p-tal se clasifica en dos tipos clínicamente significativos (que son un objetivo de la atención médica de los síntomas, los tratamientos médicos y la presente solicitud) que se distinguen por la gravedad de los síntomas: p-talasemia mayor (o p0, en la que las mutaciones bloquean la producción de cadenas de globina p, lo que da como resultado una afección grave que también se conoce como "anemia de Cooley") y p-talasemia intermedia (o p+, una afección intermedia en la que las mutaciones reducen pero no bloquean la producción de cadenas de globina p). Por el contrario, la p-talasemia menor o el rasgo de p-talasemia se refiere a la situación heterocigota en la que solo uno de los alelos de globina p contiene una mutación, de modo que las cadenas de globina p se pueden producir por la expresión del otro alelo del cromosoma 11 (es decir, no mutado). Si bien estos individuos son portadores de un alelo mutante de ptalasemia que pueden transmitir a sus hijos, los individuos con p-talasemia menor generalmente son ellos mismos asintomáticos o casi asintomáticos como resultado de la producción de p-globina del alelo no afectado.
Los signos y síntomas de la talasemia mayor generalmente aparecen dentro de los primeros 2 años de vida, cuando los niños con la enfermedad pueden desarrollar anemia potencialmente mortal. Los niños con talasemia mayor a menudo no logran ganar suficiente peso o crecer al ritmo esperado (déficit de crecimiento) y pueden desarrollar ictericia. Los individuos afectados también pueden tener el bazo, hígado y corazón agrandados, y sus huesos pueden estar deformados. Muchas personas con talasemia mayor tienen síntomas tan graves que necesitan transfusiones de sangre frecuentes para reponer el suministro de glóbulos rojos, lo que se conoce como talasemia dependiente de transfusiones. Si bien las transfusiones han sido un salvavidas crítico para muchos pacientes, son costosas y con frecuencia están asociadas a efectos secundarios significativos. Entre otros, con el tiempo, la administración de hemoglobina que contiene hierro de transfusiones de sangre crónicas tiende a conducir a una acumulación de hierro en el cuerpo, lo que puede producir problemas hepáticos, cardíacos y endocrinos.
La talasemia intermedia es más leve que la talasemia mayor. Los signos y síntomas de la talasemia intermedia aparecen en la primera infancia o más tarde en la vida. Aunque los síntomas son menos graves, las personas afectadas todavía tienen anemia de leve a moderada y también pueden sufrir de crecimiento lento y anomalías óseas.
La enfermedad drepanocítica (SCD) es un grupo de trastornos que afecta a millones de personas en todo el mundo. Es más común entre las personas que viven en África o cuyos antepasados provienen de África; países mediterráneos tales como Grecia, Turquía e Italia; la Península Arábiga; India; regiones de habla hispana en América Central y del Sur, y partes del Caribe. Sin embargo, la SCD también es el trastorno sanguíneo hereditario más común en los Estados Unidos. La SCD incluye la anemia drepanocítica, así como la enfermedad drepanocítica de la hemoglobina C (HbSC), beta-más-talasemia drepanocítica (HbS/p+) y betacero-talasemia drepanocítica (HbS/p0).
La anemia drepanocítica (SCA), que es la forma más frecuente de SCD, se encuentra entre los trastornos monogénicos graves más comunes en todo el mundo, con aproximadamente 250.000 niños que nacen con SCD cada año. La incidencia de la SCA es mayor en África occidental y central, donde el 1-2% de los bebés nacen con la enfermedad y hasta el 25% de las personas son portadores heterocigotos. Se cree que la mutación puntual de la s Ca se propagó a través de una ventaja selectiva porque la heterocigosidad proporciona una protección modesta contra la muerte por paludismo en la infancia. En la India, donde también prevalece la malaria, se estima que hay más de 2,5 millones de portadores heterocigotos de SCA y aproximadamente 150.000 homocigotos con la enfermedad.
A pesar de la relativa ausencia de malaria en América del Norte y Europa, el hecho de que cada uno tenga grandes poblaciones con orígenes genéticos en las áreas afectadas ha significado que ambas regiones tengan poblaciones sustanciales de portadores heterocigotos de SCA y, por lo tanto, individuos homocigotos afectados. Por ejemplo, los Centros para el Control de Enfermedades (CDC) de EE. UU. estiman que hay aproximadamente entre 90.000 y 100.000 estadounidenses con SCA; y la incidencia también es alta en los países de Europa Occidental, en particular aquellos con una gran población de inmigrantes, con una estimación de 10.000 en Francia y de 12.000 a 15.000 en el Reino Unido, por ejemplo. Los costes asociados a los sistemas de salud también son sustanciales. En un estudio en EE. UU. de cinco años realizado desde 1989 a 1993, el CDC estimó que la SCD produjo más de 75.000 hospitalizaciones al año y un coste de aproximadamente 500 millones de dólares. Se esperaría que los costes de todo el sistema fueran sustancialmente mayores ahora dado el aumento constante de los costes de atención médica durante las dos décadas intermedias.
Todas las formas de SCD están causadas por mutaciones en el gen estructural de la globina p (HBB). La anemia drepanocítica (SCA) es una enfermedad autosómica recesiva causada por una única mutación de sentido erróneo en el sexto codón del gen de la globina p (HBB; A ^ T) que da como resultado la sustitución del ácido glutámico por valina (Glu ^ Val). La proteína mutante, cuando se incorpora a la hemoglobina (Hb), da como resultado hemoglobina inestable HbS inestable (que es a2p2S) en contraste con la hemoglobina adulta normal o HbA (que es a2p2A). Tras la desoxigenación, la HbS polimeriza para formar HbSS por medio de interacciones hidrofóbicas entre la valina pS'6 de un tetrámero y la fenilalanina p-85 y la leucina p-88 de un tetrámero adyacente en el eritrón, lo que conduce a rigidez y vasooclusión [Atweh, Semin. Hematol. 38(4):367-73 (2001)].
Cuando la HbS es la forma predominante de hemoglobina, como en los individuos con SCA, sus glóbulos rojos (RBC) tienden a distorsionarse en forma de hoz o de media luna. Los glóbulos rojos en forma de hoz mueren prematuramente, lo que puede conducir a anemia. Además, las células falciformes son menos flexibles que los RBC normales y tienden a atascarse en los vasos sanguíneos pequeños, lo que produce sucesos vasooclusivos. Dichos sucesos vasooclusivos están asociados con la isquemia tisular que produce dolor agudo y crónico, así como daño orgánico que puede afectar a cualquier órgano del cuerpo, incluidos los huesos, pulmones, hígado, riñones, cerebro, ojos y articulaciones. El bazo está particularmente sujeto a infarto y la mayoría de las personas con SCD son funcionalmente asplénicas en la primera infancia, lo que aumenta el riesgo de ciertos tipos de infecciones bacterianas. Las oclusiones de vasos pequeños también pueden causar una enfermedad febril episódica aguda llamada "crisis", que se asocia con dolor intenso y disfunción multiorgánica. A lo largo de las décadas hay enfermedad orgánica progresiva y muerte prematura.
Los niños con SCD pueden ser diagnosticados mediante cribado de recién nacidos, pero por lo demás no se presenta hasta más tarde, cuando los niveles de hemoglobina fetal (HbF) disminuyen y los niveles de HbS aumentan como resultado del "cambio" alélico de la hemoglobina de hemoglobina fetal (codificada por HBG1 (A-gamma, también escrito ay) y HBG2 (G-gamma, también escrito gy)) a la forma p adulta codificada por HBB). El cambio de HbF a la forma adulta de globina p (es decir, HbA en niños no afectados o HbS en aquellos con SCA) generalmente comienza unos meses antes del nacimiento y se completa aproximadamente a los 6 meses de edad. Los efectos clínicos de la SCD no se manifiestan hasta que los niveles de HbF se vuelven significativamente bajos en relación con la HbS, lo que generalmente ocurre de dos a tres meses después del nacimiento. La SCD a menudo se presenta primero como dactilitis o "síndrome mano-pie", una afección asociada con dolor en las manos y/o los pies que puede ir acompañado de hinchazón. Además, el bazo puede llenarse de glóbulos rojos, lo que da como resultado una afección conocida como "secuestro esplénico". La hemólisis asociada con la SCD puede producir anemia, ictericia, colelitiasis, así como retraso en el crecimiento. Las personas con las tasas más altas de hemólisis por SCD también tienden a experimentar hipertensión arterial pulmonar, priapismo y úlceras en las piernas.
La anemia drepanocítica (HbSS homocigota) representa el 60%-70% de la enfermedad drepanocítica en los EE. UU. Las otras formas de enfermedad drepanocítica son el resultado de la herencia conjunta de HbS con otras variantes anormales de la cadena p de la globina, siendo las formas más comunes la enfermedad drepanocítica de hemoglobina C (HbSC) y dos tipos de p-talasemia drepanocítica (HbSp+-talasemia y HbSp°-talasemia). Las p-talasemias se dividen en p+-talasemia, en la que se producen niveles reducidos de cadenas de globina p normales, y p°-talasemia, en la que no hay síntesis de cadenas de globina p. Otras variantes de la cadena p de la globina, como D-Punjab, O-Arab y E, también dan lugar a la enfermedad drepanocítica cuando se heredan junto con la HbS.
Aunque las mejoras en la atención integral de la SCD han reducido la mortalidad en los niños afectados seguidos desde el cribado neonatal, el pilar del tratamiento para la mayoría de los individuos con SCD sigue siendo de apoyo. Los tratamientos actuales se dirigen a aliviar los síntomas y tratar complicaciones tales como: dolor por crisis vasooclusiva, infección, anemia, accidente cerebrovascular, priapismo, hipertensión pulmonar o daño orgánico crónico. Las terapias preventivas incluyen profilaxis de infecciones con penicilina regular, vacunación contra Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae, así como transfusiones periódicas en niños con ecografía Doppler transcraneal anormal para prevenir accidentes cerebrovasculares y quelación de hierro para la sobrecarga de hierro transfusional. El accidente cerebrovascular también se considera una indicación para el trasplante de médula ósea en niños y adolescentes que tienen hermanos con antígeno leucocitario humano (HLA) idéntico. El tratamiento eficaz del dolor agudo es uno de los problemas más comunes que plantea la atención integral de la SCA. Así, en la actualidad, los tratamientos definitivos que alteran sustancialmente la historia natural de la enfermedad (tales como la transfusión periódica o la exanguinotransfusión, la hidroxicarbamida a largo plazo y los trasplantes de HSC) son limitadas.
El documento WO2014/085593 se refiere a métodos y composiciones para tratar hemoglobinopatías dirigiéndose a elementos reguladores distales BCL11A que pretenden actuar como un regulador específico de etapa de la expresión de hemoglobina fetal reprimiendo la inducción de globina y. Por lo tanto, por ejemplo, la reivindicación 1 del documento WO2014/085593 se dirige a un método para producir una célula progenitora que tiene una expresión disminuida de ARNm o proteína BCL11A, comprendiendo el método poner en contacto una célula progenitora aislada con un agente que se une al ADN genómico de la célula en la ubicación del cromosoma 2 60,716,189-60,728,612 (según el ensamblado del genoma humano hg 19 del Navegador genómico UCSC), reduciendo así la expresión de ARNm o proteína de BCL11A.
Para estos y otros objetivos, la terapia génica se ha propuesto durante mucho tiempo como una opción potencialmente curativa para las hemoglobinopatías (véase, p. ej., de Montalembert, BMJ, 337: a1397 (2008); Sheth et al., British Journal of Haematology, 162: 455-464 (2013), documento WO2015148863 y referencias allí citadas).
Sin embargo, como resumieron recientemente Chandrakasan y Malik en una revisión titulada "Gene Therapy for Hemoglobinopathies: The State of the Field and the Future" [Hematol Oncol Clin North Am. 28(2): 199-216 (2014)] la terapia génica para las hemoglobinopatías se ha enfrentado a una serie de desafíos. Por ejemplo, los vectores retrovirales (RV) fueron los primeros vectores que se usaron en ensayos clínicos, y aunque los vectores con repeticiones terminales largas (LTR) intactas mediaban altos niveles de expresión transgénica que condujeron a una mejora clínica, el éxito en los ensayos pronto se vio empañado por problemas de seguridad de la oncogénesis insercional de la transactivación de oncogenes celulares por la LTR RV. La linfoproliferación y la leucemia en X-SCID se atribuyeron a la activación por inserción del oncogén LMO2. En el ensayo de terapia génica para la enfermedad granulomatosa crónica (CGD), después de cierto éxito inicial, hubo silenciamiento de la expresión transgénica causada por la metilación del promotor viral, y se desarrolló mielodisplasia con monosomía 7 como resultado de la activación por inserción del sitio de integración viral ecotrópico 1 Cf. Chandrakasan y Malik, véase antes, y referencias allí citadas.
La bioingeniería del VIH-1 desprovisto de cualquier elemento patógeno dio como resultado el desarrollo de vectores de lentivirus (LV). Los estudios iniciales habían establecido que los vectores LV eran vehículos fiables para la transferencia de genes de alta eficiencia. Bluebird Bio, Inc. está desarrollando LentiGlobin®BB305, como un tratamiento potencial en el que células madre hematopoyéticas (HSC) CD34+ autólogas se transducen ex vivo con un vector lentiviral de globina pA T87Q con el objetivo de insertar un gen de globina p humana completamente funcional en pacientes con p-talasemia mayor. El estudio Bluebird pretende basarse en los primeros datos clínicos del estudio LG001, en el que el producto farmacéutico se administró a un paciente con p-talasemia mayor [Cavazzana-Calvo et al., Nature, 467: 318-322 ( 2010)].
También se ha considerado la terapia génica usando globina y. Sin embargo, se sabe que los transcritos de globina y están muy silenciados en adultos y, por lo tanto, los enfoques para eludir esto incluyen impulsar la expresión de globina y con promotores y potenciadores de globina p, como describen Chandrakasan y Malik, véase antes.
Sin embargo, la introducción de potentes promotores y potenciadores en el contexto de la terapia génica, particularmente con vectores que se integran en ubicaciones impredecibles dentro del genoma (que incluyen vectores RV y LV), plantea problemas de seguridad ya que la activación de un protooncogén u otro evento dañino puede ser desencadenado por la introducción de tales elementos. En los ensayos de enfermedad de inmunodeficiencia combinada grave (SCID), por ejemplo, 5 de los 20 pacientes tratados desarrollaron leucemia en relación con su tratamiento [Wu et al. Front Med. 5(4): 356-371 (2011)].
En resumen, a pesar de décadas de esfuerzos de investigadores y profesionales médicos de todo el mundo que han estado tratando de abordar las hemoglobinopatías tales como la p-talasemia y la enfermedad drepanocítica, y a pesar de la promesa de los enfoques de terapia génica, aún existe una necesidad crítica de desarrollar tratamientos seguros y efectivos para estas y otras enfermedades relacionadas que se encuentran entre los trastornos genéticos más prevalentes y debilitantes.
Sumario
En el presente documento se proporcionan métodos para aumentar el nivel de hemoglobina fetal (HbF; dos cadenas polipeptídicas las cuales se expresan a partir de los genes de globina y como se describe a continuación) en células humanas mediante la edición del genoma, que pueden usarse para tratar hemoglobinopatías tales como la p-talasemia y enfermedad drepanocítica, así como componentes, kits y composiciones para llevar a cabo tales métodos, y células producidas por ellos, incluyendo, sin limitación, células madre hematopoyéticas humanas (hHSC) CD34+ autólogas que pueden administrarse a un paciente que padece una hemoglobinopatía.
En un aspecto, en el presente documento se proporcionan métodos para aumentar el nivel de HbF en una célula humana mediante la edición del genoma utilizando endonucleasa de ADN para realizar un par de roturas de doble cadena (DSB, por sus siglas en inglés double-strand breaks), la primera situada en un locus 5' DSB y la segunda situada en un locus 3' DSB dentro de la región de globina 86 del cromosoma 11 humano, produciendo una deleción del ADN de la región entre el locus 5' DSB y el locus 3' DSB que da como resultado una mayor expresión de uno o ambos genes de la globina y, produciendo así un aumento del nivel de HbF en la célula.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan métodos para aumentar el nivel de HbF en una célula humana mediante la edición del genoma utilizando endonucleasa de ADN para realizar un par de DSB, la primera situada en un locus 5' DSB y la segunda situada en un locus 3' DSB dentro de la región de globina 86 del cromosoma humano 11, produciendo una inversión de la región entre el locus 5' DSB y el locus 3' DSB que da como resultado una mayor expresión de la globina y, produciendo así un aumento del nivel de HbF en la célula.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan métodos para aumentar el nivel de HbF en una célula humana mediante la edición del genoma usando endonucleasa de ADN para efectuar una DSB situada en uno o más locus dentro de la región de globina 6 del cromosoma 11 humano, causando deleciones o inserciones de ADN cromosómico en uno o más locus que dan como resultado una mayor expresión de globina y, aumentando así el nivel de HbF en la célula. En un tipo de método que ilustra este aspecto, al menos una DSB se sitúa dentro de la región reguladora de la globina y del cromosoma 11 humano. En otro tipo de método que ilustra este aspecto, al menos una DSB se sitúa dentro de la región de la globina 86 del cromosoma 11 humano.
Las endonucleasas de ADN de ejemplo que pueden usarse incluyen, p. ej., una endonucleasa Cas9, una nucleasa de dedos de zinc, una nucleasa efectora similar a activador de transcripción (TALEN), una endonucleasa de asentamiento (homing), una nucleasa dCas9-Fokl o una nucleasa MegaTal. Las endonucleasas de ADN pueden introducirse en la célula por una variedad de medios, incluyendo por introducción y/o expresión de uno o más polinucleótidos que codifican la endonucleasa de ADN, como se conoce en la técnica y como se describe e ilustra más adelante en el presente documento. En determinadas realizaciones, las endonucleasas de ADN y/u otros componentes de los sistemas de edición del genoma, tal como los ARN guía en el caso de la edición del genoma con Cas9, están codificados por ARN introducidos en las células.
En algunas realizaciones, la endonucleasa de ADN es una endonucleasa Cas9 y el método comprende introducir en la célula uno o más polinucleótidos que codifican Cas9 y dos ARN guías, comprendiendo el primer ARN guía una secuencia espaciadora que es complementaria de un segmento del locus 5' DSB, y el segundo ARN guía que comprende una secuencia espaciadora que es complementaria de un segmento del locus 3' DSB. Ambos ARN guías pueden proporcionarse como a Rn guías de molécula única (que comprende ARNtacr y ARNcrispr), o uno o ambos pueden proporcionarse como ARN guías de doble molécula que comprenden un ARNcrispr y un ARNtracr que no están unidos entre sí, sino que son moléculas separadas.
En otras realizaciones, la endonucleasa de ADN es una nucleasa de dedos de zinc (ZFN) y el método comprende introducir en la célula uno o más polinucleótidos que codifican un primer par de ZFN que se dirigen a un segmento del locus 5' DSB , y un segundo par de ZFN que se dirigen a un segmento del locus 3' DSB. Alternativamente, se pueden usar TALEN u otras endonucleasas.
En algunas realizaciones, la célula humana que se va a modificar es una célula progenitora aislada, y en algunas realizaciones para el tratamiento de hemoglobinopatías es una célula progenitora hematopoyética capaz de dar lugar a células del linaje eritroide. La célula progenitora aislada también puede ser una célula madre pluripotente inducida.
En varias realizaciones, uno o ambos locus DSB están próximos a una deleción asociada con la persistencia hereditaria de hemoglobina fetal (HPFH) o 8p-talasemia de Corfú, como se describe e ilustra más adelante en el presente documento. (El término "próximo a" se refiere en el presente documento a una posición dentro o cerca de una región definida ya sea 5' o 3' de un punto de referencia particular, se usa en el presente documento con referencia específica a estas deleciones, y se describe con más detalle a continuación en la sección titulada "Selección de secuencia objetivo" e ilustrada adicionalmente por varias realizaciones de ejemplo proporcionadas en el presente documento).
Las deleciones asociadas con HPFH y 8p-talasemia de Corfú están ambas asociadas con aumentos de HbF y se denominan colectivamente en el presente documento como deleciones HPFH, una serie de las cuales se describen e ilustran en el presente documento, y otras son conocidas en la técnica. Por lo tanto, el locus 5' DSB puede estar próximo al límite 5' de una deleción HPFH, el locus 3' DSB puede estar próximo al límite 3' de una deleción HPFH, o ambos, lo que daría como resultado deleciones que imitan las deleciones HPFH que ocurren de forma natural. Ejemplos de deleciones como se ilustran en el presente documento incluyen, p. ej., la deleción HPFH-4, la deleción HPFH-5, la deleción HPFH-Kenia, la deleción HPFH-Black, la deleción de Corfú larga y la deleción de Corfú corta.
También se proporcionan realizaciones que tienen deleciones que comparten uno o más segmentos que se eliminan en HPFH, y que están asociadas con niveles aumentados de HbF, pero que no son co-terminales con deleciones que ocurren de forma natural.
En algunos aspectos, las deleciones eliminan toda o una parte de la región de la globina 86, como se describe más adelante en el presente documento.
En algunos aspectos, las deleciones eliminan toda o una parte del gen de la globina6 (HBB), como se describe más adelante en el presente documento. En el contexto de la enfermedad drepanocítica, la interrupción o eliminación del gen de la globina 6 puede reducir o eliminar de manera efectiva la expresión de hemoglobina drepanocítica (HbS), que además de aumentar los niveles de hemoglobina fetal (HbF) puede ser un beneficio adicional significativo para pacientes con SCD, tal como la anemia drepanocítica. En determinadas realizaciones, el método implica la edición del genoma de células de un paciente con SCD, en donde se aumenta la HbF y se disminuye la HbS.
En el contexto de las 6-talasemias, los problemas asociados con la falta de cadenas de globina 6 se ven exacerbados por el exceso de cadenas de globina a desapareadas, que interaccionan con la membrana de los glóbulos rojos (RBC), causando daño oxidativo a componentes de la membrana esquelética y potencialmente otros componentes que dan como resultado una menor supervivencia de los RBC, eritropoyesis ineficaz y anemia. En determinadas realizaciones, el método implica la edición del genoma de células de un paciente con p-talasemia, en donde se aumenta la HbF y se disminuye el nivel de cadenas de globina a desapareadas.
También se proporcionan células humanas que han sido modificadas por los métodos anteriores para aumentar sus niveles de HbF. En ciertas realizaciones, las células se derivan de un paciente con SCD y se reduce el nivel de HbS en tales células. En ciertas otras realizaciones, las células se derivan de un paciente con 6-talasemia y se reduce el nivel de cadenas de globina a desapareadas en tales células. Dichas células pueden ser células progenitoras aisladas, p. ej., células progenitoras hematopoyéticas capaces de dar lugar a células del linaje eritroide. Las células progenitoras aisladas pueden ser células madre pluripotentes inducidas.
Además, en el presente documento se proporcionan métodos para mejorar las hemoglobinopatías mediante la administración de células que han sido modificadas mediante los métodos anteriores para aumentar sus niveles de HbF. Los ejemplos de hemoglobinopatías incluyen, pero no se limitan a, enfermedad drepanocítica (incluyendo anemia drepanocítica), enfermedad de hemoglobina C, rasgo de hemoglobina C, enfermedad de hemoglobina S/C, enfermedad de hemoglobina D, enfermedad de hemoglobina E, una talasemia, una afección asociada con hemoglobina con afinidad por el oxígeno aumentada, una afección asociada con hemoglobina con afinidad por el oxígeno disminuida, enfermedad de la hemoglobina inestable y metahemoglobinemia.
En algunos aspectos de los métodos, el ARNg comprende una secuencia espaciadora seleccionada del grupo que consiste en las secuencias en la Lista de secuencias, la solicitud o las figuras.
En el presente documento se proporciona un ácido ribonucleico guía (ARNg) que comprende una secuencia espadadora seleccionada del grupo que consiste en secuencias en la Lista de secuencias, la solicitud o las figuras para editar el locus de la globina en una célula de un paciente con hemoglobinopatía. En algunos aspectos, el ARNg es un ARN guía de molécula única (ARNgu). En algunos aspectos, el ARNg o ARNgu es un ARNg o ARNgu modificado.
En el presente documento se describen y ejemplifican varios otros aspectos.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra la ubicación genómica de los sitios objetivo de CRISPR para la deleción de HPFH5. (A) Mapa de restricción de la variante de deleción HPFH5 (parte inferior) en comparación con el locus de la globina p de tipo natural (parte superior), según lo definido por Camaschella et al, Haematologica, 75 (Suppl 5): 26-30 (1990). (B) Esquema del locus de la globina p humana con cajas vacías que resaltan los sitios objetivo 5' y 3' similares a HPFH5 ilustrativos para CRISPR. La deleción de 12,9 kb empieza a 3 kb 5' del gen 8 y termina a 1,7 kb 3' del final del gen p (690 pb secuencia abajo de la señal p poliA), como describen Camaschella et al., véase antes.
La Figura 2 muestra un esquema de las ubicaciones de los cebadores de PCR para la detección de inversiones y deleciones del fragmento de 13 kb.
La figura 3 muestra un esquema de la ubicación genómica de las deleciones HPFH de Corfú de 3,5 kb y 7,2 kb.
La figura 4 muestra un esquema del locus de la globina p que muestra la ubicación de la deleción de Kenia, 5' (recuadro izquierdo) y 3' (recuadro derecho).
La figura 5 muestra la ubicación de la deleción HPFH-SD de 13 pb. (A) Alineación de secuencias de tipo natural y variante de deleción de 13 pb del locus de globina y humana. Los sitios potenciales de PAM para CRISPR están marcados con un círculo. (B) Alineación de secuencias de los genes HBG1 y HBG2 que muestra la región objetivo conservada (cuadro punteado), junto con la deleción potencial de ~5 kb que surge de la escisión en el sitio objetivo en ambos genes (panel inferior).
La Figura 6 muestra otras modificaciones de deleción y no deleción del locus de globina p asociadas con HPFH. (A) Esquema que muestra la ubicación de la deleción de HPFH-4. (B) Esquema que muestra la ubicación de la deleción de HPFH Black. (C) Secuencia genómica en la región de la mutación gy-175 (T a C). Los sitios potenciales de PAM para Cas9 de S. pyogenes están marcados con un círculo. El nucleótido T175 se muestra en negrita.
La Figura 7A es una ilustración de un plásmido (denominado en el presente documento "CTx-1") que comprende un gen de codones optimizados para la endonucleasa Cas9 de S. pyogenes. El plásmido CTx-1 también comprende una secuencia de armazón de ARNg, que incluye una secuencia espaciadora de la lista de secuencias.
La Figura 7B es una ilustración de un plásmido (denominado en el presente documento "CTx-2") que comprende un gen de codones optimizados diferente para la endonucleasa Cas9 de S. pyogenes. El plásmido CTx-21 también comprende una secuencia de armazón de ARNg, que incluye una secuencia espaciadora de la lista de secuencias.
La Figura 7C es una ilustración de un plásmido (denominado en el presente documento "CTx-3") que comprende todavía otro gen de codones optimizados diferente para la endonucleasa Cas9 de S. pyogenes. El plásmido CTx-3 también comprende una secuencia de armazón de ARNg, que incluye una secuencia espaciadora de 20 pb de la lista de secuencias.
La Figura 8A es una ilustración que representa el sistema CRISPR/Cas de tipo II.
La Figura 8B es otra ilustración que representa el sistema CRISPR/Cas de tipo II.
La figura 9 presenta un nuevo mapa de guías de Corfú grande, que muestra los extremos 5' y 3', así como los locus de ARNg.
La figura 10A presenta una vista ampliada del extremo 5' del nuevo mapa de guías de Corfú grande (que muestra 33 ARNg nuevos).
La figura 10B presenta una vista ampliada del extremo 3' del nuevo mapa de guías de Corfú grande (que muestra 30 ARNg nuevos).
La Figura 11 presenta los resultados del cribado de eficiencia de edición para el ARNg de Corfú grande. La figura 12 presenta un mapa de guías de Corfú pequeño, que muestra los extremos 5' y 3', así como los locus de ARNg.
La figura 13A presenta una vista 5' ampliada del extremo 5' del mapa de guías de Corfú pequeño (que muestra 30 ARNg).
La Figura 13B presenta una vista ampliada del extremo 3' del mapa de guías de Corfú pequeño (que muestra 16 ARNg).
La Figura 14 presenta los resultados del cribado de eficiencia de edición para el ARNg de Corfú pequeño. Breve descripción de la lista de secuencias
Las SEQ ID NOs: 1-56.961 es una lista de secuencias espaciadoras de 20 pb de ARNg, asociadas con PAM (NRG), para dirigirse al locus de la globina con una endonucleasa Cas9 de S. pyogenes.
Las SEQ ID NOs: 56.962-64.104 es una lista de secuencias espaciadoras de 20 pb de ARNg, asociadas con PAM (NNGRRT), para dirigirse al locus de la globina con una endonucleasa Cas9 de S. aureus.
Las SEQ ID NOs: 64.105-66.998 es una lista de secuencias espaciadoras de 20 pb de ARNg, asociadas con PAM (NNAGAAW), para dirigirse al locus de la globina con una endonucleasa Cas9 de S. thermophilus. Las SEQ ID NOs: 66.999-68.146 es una lista de secuencias espaciadoras de 20 pb de ARNg, asociadas con PAM (NAAAAC), para dirigirse al locus de la globina con una endonucleasa Cas9 de T. denticola.
Las SEQ ID NOs: 68.147-75.145 es una lista de secuencias espaciadoras de 20 pb de ARNg, asociadas con PAM (NNNNGHTT), para dirigirse al locus de la globina con una endonucleasa Cas9 de N. meningitides. Las SEQ ID NOs: 75.146-161.197 es una lista de secuencias espaciadoras de 22 pb de ARNg, asociadas con PAM (YTN), para dirigirse al locus de globina con una endonucleasa Cpf1 de Acidominococcus, Lachnospiracease y Franciscell Novicida.
La SEQ ID NO: 161.198 es un ejemplo de ácido nucleico objetivo.
Las SEQ ID NO: 161.199 es una secuencia de reconocimiento de endonucleasas de asentamiento (HE). Las SEQ ID NOs: 161.200-161.312 son secuencias de ARNg para dirigirse a la región de Corfú para la deleción con una endonucleasa Cas9.
Las SEQ ID NOs: 161.313-161.314 son secuencias para HPFH-SD de tipo natural y variantes de deleción de globina y humana. Véase la Figura 5A y la descripción correspondiente.
La SEQ ID NO: 161.315 es la secuencia genómica en la región de la mutación gy-175 (T a C). Véase la Figura 6C y la descripción correspondiente.
Obsérvese que cuando las guías están presentes como secuencias de ADN (complementarias a la cadena objetivo e idénticas a la cadena no objetivo), el ARNg es la secuencia de ARN correspondiente.
Descripción detallada
Hemoglobinopatías
La hemoglobina fetal (HbF) es un tetrámero de dos polipéptidos de globina a adulta y dos polipéptidos de globina y similar a p fetal. Los genes de la globina y (HBG1 y HBG2) normalmente se expresan en el hígado, bazo y médula ósea fetales. Un tetrámero de dos cadenas y junto con dos cadenas a constituyen la HbF. Durante la gestación, los genes de globina y duplicados constituyen los genes predominantes transcritos del locus de globina p. Después del nacimiento, la globina y es reemplazada progresivamente por la globina p del adulto, un proceso denominado "cambio fetal". Este cambio de desarrollo desde la producción predominantemente de HbF (a2Y2) a la producción de hemoglobina adulta o HbA (a2p2) comienza aproximadamente de las 28 a 34 semanas de gestación y continúa poco después del nacimiento, momento en el cual la HbA se vuelve predominante. El cambio se debe principalmente a la disminución de la transcripción de los genes de la globina y y al aumento de la transcripción de los genes de la globina p. En promedio, la sangre de un adulto normal contiene solo aproximadamente 2% de la hemoglobina total en forma de HbF, aunque los niveles residuales de HbF tienen una variación de más de 20 veces en adultos sanos (Atweh, Semin. Hematol. 38(4):367-73 (2001)). Los dos tipos de cadenas y difieren en el resto 136 donde se encuentra glicina en el producto G-y (HBG2) y se encuentra alanina en el producto A-y (HBG1). El gen de la hemoglobina HBG1 (ay o A-gamma [Homo sapiens (humano)] ID de gen: 3047), se actualizó el 16 de abril de 2014 (www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/3047).
Como se usa en el presente documento, el término "hemoglobinopatía" significa cualquier defecto en la estructura, función o expresión de cualquier hemoglobina de un individuo, e incluye defectos en la estructura primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria de la hemoglobina causados por cualquier mutación, tal como mutaciones de deleción o mutaciones de sustitución en las regiones codificantes del gen de la globina p, o mutaciones o deleciones de los promotores o potenciadores de dichos genes que causan una reducción en la cantidad de hemoglobina producida en comparación con un estado normal o estándar. El término incluye además cualquier disminución en la cantidad o eficacia de la hemoglobina, ya sea normal o anormal, causada por factores externos tales como enfermedad, quimioterapia, toxinas, venenos o similares. Las phemoglobinopatías contempladas en el presente documento incluyen, pero no se limitan a enfermedad drepanocítica (SCD, también denominada anemia drepanocítica o SCA), rasgo de células falciformes, enfermedad de hemoglobina C, rasgo de hemoglobina C, enfermedad de hemoglobina S/C, enfermedad de hemoglobina D, enfermedad de la hemoglobina E, talasemias, hemoglobinas con afinidad por el oxígeno aumentada, hemoglobinas con afinidad por el oxígeno disminuida, enfermedad de la hemoglobina inestable y metahemoglobinemia.
El potencial para abordar las p-hemoglobinopatías mediante el aumento de los niveles de hemoglobina fetal (a2Y2 ; HbF) está respaldado por las observaciones del fenotipo leve de los individuos que tienen p-talasemia homocigota co-hereditaria y persistencia hereditaria de hemoglobina fetal (HPFH), así como por aquellos pacientes con p-talasemia homocigota que no sintetizan hemoglobina adulta, pero en los que se observa un requisito reducido de transfusiones en presencia de concentraciones elevadas de HbF. El respaldo adicional proviene de la observación de que ciertas poblaciones de pacientes adultos con anomalías de la cadena p tienen niveles de HbF más altos de lo normal, y se ha observado que tienen un curso clínico más leve de la enfermedad que los pacientes con niveles normales de HbF en adultos. Por ejemplo, un grupo de pacientes con anemia drepanocítica de Arabia Saudita que expresan 20-30% de HbF (como porcentaje de la hemoglobina total) solo tienen manifestaciones clínicas leves de la enfermedad [Pembrey et al., Br. J. Haematol. 40: 415-429 (1978)]. Ahora se acepta que las hemoglobinopatías p, tales como la anemia drepanocítica y las p-talasemias, mejoran con el aumento de la producción de HbF. [Revisado en Jane y Cunningham, Br. J. Haematol. 102: 415-422 (1998) y Bunn, N. Engl. J. Med. 328: 129-131 (1993)].
El locus de la globina p humana está compuesto por cinco genes tipo p y un gen pseudo-p ubicado en una región corta del cromosoma 11 (aproximadamente 45 kb), responsable de la creación de las cadenas p de hemoglobina. La expresión de todos estos genes está controlada por una sola región de control de locus (LCR), y los genes se expresan de manera diferencial a lo largo del desarrollo. El orden de la LCR y los genes en la agrupación de la globina p, como se ilustra en la Figura 1B, es el siguiente:
5’ - [LCR] - £ (épsilon, HBE1) - Gy (G-gamma, HBG1) - Ay (A-gamma, HBG2) - [ipP
(psi-beta pseudogén)] - 5 (delta, HBD) - p (beta, HBB) - 3'.
La disposición de los cinco genes tipo p refleja la diferenciación temporal de su expresión durante el desarrollo, con la versión de la etapa embrionaria temprana HbE (codificada por el gen épsilon) que está situada más cerca de la LCR, seguida por la versión fetal HbF (codificada por los genes y), la versión delta, que comienza poco antes del nacimiento y se expresa en niveles bajos en adultos como HbA-2 (que constituye aproximadamente 3% de la hemoglobina adulta en adultos normales), y finalmente el gen beta, que codifica la versión adulta predominante HbA-1 (que constituye el 97% restante de la HbA en adultos normales).
La expresión de los genes tipo p está regulada en la eritropoyesis embrionaria por muchos factores de transcripción, incluido KLF1, que está asociado con la regulación por aumento de HbA en eritrocitos adultos definitivos, y KLF2, que está asociado con la expresión de hemoglobina embrionaria. BCL11A es activado por KLF1 y también se sabe que está implicado en el cambio de hemoglobina fetal a adulta. La regulación por disminución de la expresión de BCL11A o la alteración de su actividad o la unión a los sitios reguladores de la transcripción ha sido el foco de los esfuerzos a largo plazo de varios grupos para aumentar los niveles de HbF. Véase, p. ej., los documentos US 8383604, US2014085593, US20140093913, y las referencias citadas en los mismos.
Ciertas mutaciones genéticas que ocurren de forma natural dentro del locus de la globina p humana están asociadas con la desrepresión de la expresión del gen de la globina y y la manifestación clínica de HPFH. Dichas mutaciones van desde sustituciones de una sola base asociadas con varias formas de HFPF de no deleción, hasta deleciones que abarcan decenas de kb en el caso de algunas formas de HPFH de deleción. Se describió una variedad de HPFH de origen natural en A Syllabus of Thalassemia Mutations (1997) de Titus H.J. Huisman, Marianne F.H. Carver y Erol Baysal, publicado por The Sickle Cell Anemia Foundation en Augusta, GA, EE. UU., y las referencias citadas en el mismo, incluidos los tipos de deleción y no deleción.
Se ha descrito una serie de formas diferentes de HPFH de deleción basándose en estudios de individuos y familias que se encontró que tenían deleciones en una región denominada en el presente documento "región de globina Sp" que se extiende desde el pseudogén psi-beta hasta delta, beta y la región secuencia abajo de beta que se elimina en los alelos de HPFH más grandes, tales como HPFH-1, como se describe en la técnica.
En algunos casos de HPFH, casi toda la hemoglobina producida es HbF. Sin embargo, en la mayoría de los casos, la HbF varía aproximadamente en 15-30% de la hemoglobina total, dependiendo del tipo de HPFH así como de la variación entre los individuos.
Deleciones que alteran o eliminan el gen de la globina p y ventajas de tales deleciones en el tratamiento de la SCD
En ciertas realizaciones como se describe e ilustra en el presente documento, además de aumentar la expresión del producto del gen de la globina y HbF, la expresión del producto del gen de la globina p se reduce o elimina sustancialmente mediante la alteración o eliminación del gen de la globina p en conexión con el procedimiento de edición del genoma. Esto ocurre cuando la edición del genoma utiliza la endonucleasa de ADN para efectuar un par de DSB, la primera en un locus 5' DSB y la segunda en un locus 3' DSB dentro de la región de la globina del cromosoma 11 humano, produciendo una deleción del ADN cromosómico entre el locus 5' DSB y el locus 3' DSB que da como resultado una mayor expresión de globina y, la deleción también elimina todo o una parte del gen de la globina p (HBB) causando una disminución concomitante en la expresión o la eliminación del producto del gen de la globina p, dando así como resultado una combinación de (i) aumento del nivel de HbF en la célula y (ii) reducción o eliminación de la expresión del producto del gen de la globina p de al menos un alelo de HBB en el cromosoma 11.
Los efectos combinados del aumento de HbF y la reducción o eliminación de la expresión del gen de la globina p tienen ventajas adicionales particulares en el contexto de la mejora de las hemoglobinopatías tales como la SCD en la que el producto del alelo variante de la globina p (es decir, HbS) es dañino para las células que lo expresan, provocando la muerte celular prematura (así como otros efectos negativos asociados con la HbS). Por lo tanto, los RBC falciformes no sólo causan múltiples problemas a los pacientes, como se comentó anteriormente y en la técnica, sino que los RBC falciformes tienen una vida útil sustancialmente reducida en relación con los RBC normales. La presencia de HbS y de RBC falciformes también conduce a muchos otros efectos negativos, como se describe en el presente documento y en la técnica.
En el caso de realizaciones en las que el gen de la globina p se altera o elimina de manera efectiva como se describe en el presente documento, incluso "reducir la expresión" (knocking down) o "inactivar" (knocking out) solo uno de los alelos de la globina p que expresan HbS , p. ej., editando con éxito solo una de las dos copias del gen en pacientes con SCD homocigota (que tienen dos alelos de globina p defectuosos, uno en cada copia del cromosoma 11) puede tener un beneficio muy sustancial. En particular, se considera que aumentar los niveles de HbF hasta el intervalo de aproximadamente 20% elimina sustancialmente la formación de células falciformes. Sin embargo, como un factor relativamente continuo o creciente (a menudo denominado "rasgo cuantitativo") a lo largo de un intervalo significativo, niveles incluso más bajos de HbF pueden tener efectos beneficiosos significativos como se describe en el presente documento y en la técnica. En estas realizaciones, por lo tanto, incluso aunque el paciente con SCD tenga dos alelos de globina p defectuosos, la combinación de aumentar la HbF (que en sí misma es útil para reducir los efectos de la SCD) junto con la reducción de la HbS (que en sí misma es un promotor de muchos de los efectos dañinos de manera cuantitativa), mediante la edición del genoma utilizando el método descrito e ilustrado para estas realizaciones, puede dar lugar a una combinación de efectos que juntos mejoran uno o más síntomas de la enfermedad.
En algunos casos, el procedimiento de edición del genoma puede alterar eficazmente ambas copias de un alelo. En algunos casos, dicha edición bialélica se puede cribar o seleccionar, pero incluso si no se selecciona, puede ocurrir naturalmente, aunque con una frecuencia más baja en comparación con los aciertos monoalélicos o de un solo alelo, ya que generalmente existe el mismo sitio objetivo en cada miembro de los pares de cromosomas.
Sin embargo, por razones técnicas, como se indicó anteriormente, se esperaría que las realizaciones descritas e ilustradas en el presente documento en las que solo uno de los alelos de la globina p se altera o elimina, además de aumentar los niveles de HbF, tuvieran efectos positivos significativos en la mejora de uno o más síntomas o afecciones asociadas con la SCD.
La capacidad de generar estos efectos significativos de "tipo cis" (en el mismo alelo) usando los tipos de edición del genoma reflejados en tales realizaciones puede ser más ventajoso que los enfoques que dependen de los efectos de "tipo trans" tales como los que implican inactivación o reducción de la expresión o un factor de acción trans tal como un represor. En particular, como se indicó anteriormente, la edición del genoma en realizaciones en las que el gen de la globina p se altera o elimina de manera efectiva puede mejorar sustancialmente los efectos de la HbS al editar con éxito uno de los dos alelos. En el caso de los represores que actúan en trans, tal como un represor de la expresión del gen de la globina y, la reducción de la expresión o inactivación de una copia del gen represor puede no ser suficiente, ya que la expresión del represor de la otra copia del gen aún puede reducir la expresión del gen de la globina y limitando los niveles de HbF que se pueden alcanzar.
Efectos del aumento de HbF en el contexto de la p-talasemia
Como se ha indicado antes las p-talasemias resultan de un defecto parcial o completo en la expresión del gen de la globina p, lo que conduce a una hemoglobina A (HbA) deficiente o ausente. Dado que no hay producción de HbS, los RBC en pacientes con p-tal no presentan la formación de células falciformes y los problemas asociados con la SCD. Sin embargo, se produce un tipo diferente de "toxicidad" de los RBC y muerte celular prematura como resultado de la falta de HbA en el contexto de la p-tal. En particular, el exceso de las cadenas de globina alfa (a-globina) desapareadas en la p-talasemia interaccionan con la membrana de los glóbulos rojos (RBC), causando daño oxidativo a los componentes de la estructura de la membrana y potencialmente a otros componentes. Esta interacción da como resultado una membrana rígida, mecánicamente inestable que produce un aumento de la apoptosis (es decir, muerte celular programada) y una supervivencia reducida de los RBC, marcada por una eritropoyesis ineficaz y anemia.
El aumento de los niveles de HbF en los RBC de dichos pacientes puede mejorar significativamente uno o más síntomas de la p-talasemia porque las cadenas beta producidas al aumentar la expresión del gen de la globina Y pueden emparejarse con las cadenas alfa previamente desemparejadas para producir HbF, lo cual no solo da como resultado un tetrámero de hemoglobina que funciona, sino que al mismo tiempo reduce los niveles de cadenas de globina a desemparejadas que son una causa que contribuye a la afección de la p-talasemia debido a la muerte celular prematura de RBC.
Ventajas selectivas positivas de ciertas células editadas
En relación con las ventajas anteriores proporcionadas en ciertas realizaciones de la invención, en particular las ventajas en términos de supervivencia de los RBC para los RBC drepanocíticos que puede ser mediada por la edición del genoma que no solo aumenta los niveles de HbF sino que reduce los niveles de HbS, y las ventajas en términos de supervivencia de RBC para los RBC de la p-tal que no solo aumentan los niveles de HbF sino que reducen los niveles de cadenas alfa no emparejadas, las células que se modifican mediante técnicas de edición del genoma como se describe e ilustra en el presente documento tendrán ventajas selectivas en relación con las población de RBC enfermos en la que se pueden introducir, p. ej., mediante la edición de genes de las células progenitoras eritroides o h Sc del propio paciente ex vivo y luego reintroduciendo dichas células al paciente, donde las células reintroducidas generalmente deben persistir o "injertarse" con éxito con el fin de que los efectos beneficiosos sean suficientes y sostenidos.
Como resultado de las ventajas selectivas anteriores, se esperaría que la introducción de incluso un número modesto de células madre adecuadas editadas como se describe en el presente documento diera como resultado con el tiempo células mejoradas que representen una fracción significativamente mayor de la población total de RBC de la que era inicialmente después de la introducción en un paciente. A modo de ilustración, con células madre editadas genéticamente con éxito que representan inicialmente tan solo cierto porcentaje de las células correspondientes (es decir, en comparación con la población de células residentes que portan los alelos asociados a la hemoglobinopatía sin editar), las células de genes editados podrían llegar a representar un mayoría de las células como resultado de las ventajas de supervivencia selectiva que se les transmite mediante el uso de técnicas de edición de genes como se describe más adelante en el presente documento. Las cifras finales que reflejan dicho injerto seleccionado positivamente variarán dependiendo generalmente tanto del grado en el que las células enfermas residentes presentan una esperanza de vida reducida en un paciente dado, como de la ventaja de supervivencia relativa presentada por las células de genes editados. Sin embargo, como se señaló anteriormente, las células enfermas asociadas con la SCD y ptalasemia tienen una esperanza de vida significativamente reducida (debido a la presencia de HbS y cadenas alfa desemparejadas, respectivamente), y ciertas realizaciones no solo aumentan los niveles de HbF sino que reducen los niveles de HbS (asociado con SCD) o reducen los niveles de cadenas alfa desemparejadas (asociado con p-talasemia) y, por lo tanto, se espera que los beneficios relativos de supervivencia y con ellos el aumento del injerto sean significativos.
Deleciones de Corfú y similares a Corfú
Aunque el alelo cromosómico de Corfú descubierto por primera vez en un niño griego da como resultado una 5p-talasemia, comparte algunas características importantes con varias formas de deleción HPFH, en particular niveles elevados de HbF y, por lo tanto, la deleción asociada con Corfú está incluida con las formas de HPFH de deleción como se describe en el presente documento.
Sin embargo, Corfú es diferente de las formas de HPFH de deleción en términos de niveles de HbF y expresión de p-globina. Los niveles extremadamente altos de HbF están asociados con Corfú, acercándose al l0o% de la hemoglobina total en el caso del primer niño identificado, y esto fue particularmente sorprendente porque se encontró que los heterocigotos de Corfú (los padres del niño en el primer caso) tenían solo niveles normales muy bajos de HbF (1-2% de la hemoglobina total), una situación a la que los hematólogos se refieren como la "paradoja de Corfú".
Una supuesta explicación es que se encontró que el alelo cromosómico de Corfú contenía una mutación en el sitio de empalme en la posición 5 de IVS-I ("IVS-I-5") del gen de la globina p y niveles más bajos de transcrito del gen de la globina p. Se ha descrito que los altos niveles de HbF observados son aportados postranscripcionalmente por la maduración mejorada del ARNm y/o la estabilización del transcrito de globina Y, que aparentemente están asociados con los niveles reducidos de ARNm de globina p; véase, p. ej., Chakalova, L. et al., Blood 105:2154-2160 (2005).
Dado que el alelo cromosómico de Corfú contiene tanto la deleción grande como la mutación de IVS-I-5, y se cree que los niveles reducidos de ARNm de p-globina asociados con esta última contribuyen de forma independiente a los niveles inusualmente altos de HbF producidos, la "mutación de p-globina relacionada con Corfú" IVS-I-5 podría usarse sola o en combinación con otras alteraciones de genes editados como se describe en el presente documento con el fin de aumentar los niveles de HbF para usar en la mejora de las hemoglobinopatías.
Selección de secuencia objetivo
Para la mejora de las hemoglobinopatías a través de la edición de genes, como se describe en el presente documento, es deseable pero no necesario alcanzar niveles de HbF en el extremo superior de los observados en los casos que ocurren de forma natural con el fin de lograr mejoras relativas en la enfermedad. En particular, aunque originalmente se ha supuesto que los niveles relativamente altos de HbF eran esenciales para observar los efectos de mejora, especialmente con respecto a ciertas complicaciones, los estudios han demostrado que incluso pequeños aumentos incrementales de HbF pueden tener efectos beneficiosos sobre la mortalidad. Véase, p. ej., Powars et al., Blood 63(4):921-926 (1984); Platt et al., N Engl J Med 330(23):1639-1644 (1994); y Akinsheye et al., Blood 118: 19-27 (2011).
Una razón de los efectos beneficiosos de incluso niveles bajos de HbF en el contexto de la enfermedad drepanocítica, es que se ha mostrado que incluso pequeños aumentos incrementales en la HbF tienen algunos efectos beneficiosos, y niveles de HbF inferiores a 9% (con respecto a la hemoglobina total, Hb) parecen estar asociados con una mortalidad significativamente menor; véase, p. ej., Platt et al., véase antes.
Los niveles más altos de HbF están asociados con beneficios clínicos adicionales y disminuciones adicionales en la morbilidad y la mortalidad, como se observa en el caso de SCD coheredada con ciertos alelos de HPFH de origen natural y/o alelos de talasemia de Corfú, en los que niveles de HbF en el intervalo de 20-30% se han asociado con una normalización muy sustancial a casi completa del fenotipo de SCD.
Las modificaciones genéticas dentro de la región de la globina 5p que están contempladas para aumentar la expresión de HbF para mejorar una hemoglobinopatía como se describe en el presente documento, dan como resultado al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 9%, al menos aproximadamente 14%, al menos aproximadamente 20 al menos aproximadamente 25%, o por encima de 30% de HbF (con respecto a la Hb total en un sujeto).
Como se describe e ilustra adicionalmente en el presente documento, las modificaciones genéticas de ejemplo dentro de la región de la globina 5p que están contempladas para aumentar la expresión de HbF a tales niveles incluyen, pero no se limitan a las siguientes deleciones, así como variaciones de las mismas en las que el tamaño de la deleción se reduce (p. ej., desplazando el límite de 5' de la deleción especificada a continuación más hacia el límite de 3' de la deleción especificada a continuación o desplazando el límite de 3' de la deleción más hacia el límite de 5') o aumenta (desplazando cualquiera de los límites en la dirección opuesta). Las deleciones realizadas por otras combinaciones de dos de los siguientes límites de deleción que aumentan la expresión de HbF también están contemplados específicamente en la descripción.
A. Deleciones en el cromosoma 11 dentro de la región Chr11:5224779-5237723 basadas en la versión GRCh38/hg38 del ensamblaje del genoma humano, en donde el límite 3' de la deleción está próximo (como se define a continuación) a Chr11:5224779 y el límite 5' de la deleción está próximo a Chr11:5237723;
B. Deleciones en el cromosoma 11 dentro de la región Chr11:5234665-5238138 basadas en la versión GRCh38/hg38 del ensamblaje del genoma humano, en donde el límite 3' de la deleción está próximo a Chr11:5234665 y el límite 5' de la deleción está próximo a Chr11:5238138;
C. Deleciones en el cromosoma 11 dentro de la región Chr11:5233055-5240389 basadas en la versión GRCh38/hg38 del ensamblaje del genoma humano, en donde el límite 3' de la deleción está próximo a Chr11:5233055 y el límite 5' de la deleción está próximo a Chr11:5240389;
D. Deleciones en el cromosoma 11 dentro de la región Chr11:5226631-5249422 basadas en la versión GRCh38/hg38 del ensamblaje del genoma humano, en donde el límite 3' de la deleción está próximo a Chr11:5226631 y el límite 5' de la deleción está próximo a Chr11:5249422;
E. Deleciones en el cromosoma 11 dentro de la región Chr11:5249959-5249971 basadas en la versión GRCh38/hg38 del ensamblaje del genoma humano en donde el límite 3' de la deleción está en o es adyacente a Chr11:5249959 y el límite 5' de la deleción está en o es adyacente a Chr11:5249971;
F. Deleciones en el cromosoma 11 dentro de la región Chr11:5196709-5239223 basadas en la versión GRCh38/hg38 del ensamblaje del genoma humano, en donde el límite 3' de la deleción está próximo a Chr11:5196709 y el límite 5' de la deleción está próximo a Chr11:5239223;
G. Deleciones en el cromosoma 11 dentro de la región Chr11:5225700-5236750 basadas en la versión GRCh38/hg38 del ensamblaje del genoma humano, en donde el límite 3' de la deleción está próximo a Chr11:5225700 y el límite 5' de la deleción está próximo a Chr11:5236750.
En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan métodos para aumentar el nivel de hemoglobina fetal (HbF) en una célula humana mediante la edición del genoma usando endonucleasa de ADN para efectuar una rotura de doble cadena (DSB) situada en uno o más locus dentro de la región de la globina @ del cromosoma 11 humano, en donde al menos una DSB se sitúa dentro de la región reguladora de la globina y del cromosoma 11 humano, que se encuentra dentro de una región de menos de 2 kb, menos de 1 kb, menos de 0,5 kb o menos de 0,25 kb secuencia arriba del comienzo de uno de los genes de la globina y (HBG1 o HBG2), produciendo deleciones o inserciones de ADN cromosómico en uno o más locus que dan como resultado mayor expresión de la globina y, aumentando así el nivel de HbF en la célula. En otro tipo de método que ilustra este aspecto, al menos una DSB se sitúa dentro de la región de la globina 8^ 6 del cromosoma 11 humano.
Las modificaciones ilustrativas en el cromosoma 11 en la región reguladora de la globina y incluyen la creación de sustituciones de una sola base tales como -175 (T a C), -202 (C a G) y -114 (C a T) en el gen gy; y -196 (C a T), -175 (T a C), -117 (G a A) en el gen ay.
Las modificaciones ilustrativas dentro de la región de la globina 8^ 6 incluyen deleciones e inserciones dentro o próximas a los locus de deleciones HPFH mencionados anteriormente, y deleciones dentro de la región reguladora de la globina 8 del cromosoma 11 humano que se encuentra dentro de la región de menos de 3 kb, menos de 2 kb, menos de 1 kb, menos de 0,5 kb secuencia arriba del inicio del gen de la globina 8 (HBD), y deleciones dentro de la región reguladora de la globina @ del cromosoma 11 humano, que se encuentra dentro de la región de menos de 3 kb, menos de 2 kb y menos de 1 kb, o menos de 0,5 kb secuencia arriba del inicio del gen de la ^-globina (HBB).
Dadas las variaciones relativamente amplias en las deleciones que están asociadas con diversas formas de HPFH, junto con el hecho de que incluso niveles bajos de HbF pueden proporcionar niveles significativos de mejora de la hemoglobinopatía (como se indicó anteriormente), y la comprensión de un variedad de estudios de que parece haber múltiples locus y tipos de controles que pueden contribuir a la represión de HbF, se apreciará que se esperaría que numerosas variaciones de las deleciones mencionadas anteriormente (incluidas, sin limitación, deleciones más grandes así como más pequeñas), dieran como resultado niveles de HbF que estén dentro de los intervalos contemplados, como se indicó anteriormente.
Tales variantes incluyen deleciones que son más grandes en la dirección 5' y/o 3' que las deleciones HPFH que ocurren de forma natural, o más pequeñas en cualquier dirección. En consecuencia, por "próximo" con respecto a las deleciones tipo HPFH, se pretende que el locus de DSB asociado con un límite de deleción deseado (también denominado en el presente documento un punto final) puede estar dentro de una región que está a menos de aproximadamente 3 kb del locus de referencia indicado. En algunas realizaciones, el locus de DSB está más próximo y dentro de 2 kb, dentro de 1 kb, dentro de 0,5 kb o dentro de 0,1 kb. En el caso de deleciones pequeñas como las identificadas en el grupo E, el punto final deseado está en o es "adyacente a" el locus de referencia, por lo que se pretende que el punto final esté dentro de los 100 pb, dentro de los 50 pb, dentro de los 25 pb, o menos de aproximadamente 10 pb a 5 pb del locus de referencia.
Un grupo de realizaciones comprende deleciones dentro de la "región 8" (que incluye la mitad secuencia abajo de la secuencia intergénica entre el pseudogén ^P1 y el gen 8 HBD, y secuencias próximas secuencia abajo en 8). La región próxima a 8 parece incluir una serie de elementos asociados con la represión de la globina y. La deleción de la talasemia 8p "de Corfú grande" de 7,2 kb descrita e ilustrada adicionalmente en el presente documento cae dentro de la región 8, eliminando aproximadamente 1 kb del gen 8 y 6 kb secuencia arriba, y está asociada con un aumento significativo en los niveles de HbF. Una deleción "de Corfú pequeña" de 3,5, descrita más adelante e ilustrada en el presente documento, también tiene una deleción en la región 5, y también está asociada con niveles elevados de HbF. La región 5 también está eliminada en todas las formas principales de HPFH.
Con respecto a las regiones más secuencia abajo en la dirección 3', que estarían asociadas con deleciones más grandes como se describe en el presente documento, HPFH-1 a HPFH-5 tienen todas los genes 5 y p eliminados. Además de los elementos reguladores en la región 5 que pueden contribuir a la represión activa de la globina y, la actividad de los promotores 5 y p también puede contribuir indirectamente a la supresión a través de la competencia por los factores transcripcionales necesarios para la expresión de la globina y.
Muchos tipos de HPFH también tienen deleciones incluso más grandes que se extienden secuencia abajo, y estas regiones secuencia abajo adicionales también se pueden incorporar en las deleciones como se describe e ilustra en el presente documento, ya que se sabe que están asociadas con aumentos sustanciales de HbF, muy por encima de los intervalos de HbF conocidos por mejorar las hemoglobinopatías como se indicó anteriormente.
Una ventaja, para los pacientes con hemoglobinopatías, de reproducir o imitar aspectos de las deleciones que se encuentran de forma natural en individuos con HPFH es que ya se sabe que dichas deleciones son seguras y están asociadas con la mejora de la hemoglobinopatía. Sin embargo, entre las HPFH de deleción, también está claro que las deleciones más pequeñas, tales como HPFH-5, son efectivas para generar aumentos sustanciales en HbF. Se espera que otras realizaciones que comprenden deleciones más pequeñas proporcionen aumentos sustanciales y, como se indicó anteriormente, incluso niveles modestos de aumento de HbF tienen efectos beneficiosos. Por lo tanto, se espera que muchas variaciones de las deleciones descritas e ilustradas en el presente documento sean eficaces para mejorar las hemoglobinopatías.
Preferiblemente, los desplazamientos en la situación del límite 5' y/o el límite 3' en relación con locus de referencia particulares se usan para facilitar o mejorar aplicaciones particulares de edición de genes, que dependen en parte del sistema de endonucleasa seleccionado para la edición, como se describe e ilustra más adelante en el presente documento. En un primer aspecto de dicha selección de secuencias objetivo, muchos sistemas de endonucleasas tienen reglas o criterios que guían la selección inicial de potenciales sitios objetivo para la escisión, tal como el requisito de un motivo de secuencia PAM en una posición particular adyacente a los sitios de escisión del ADN en el caso de las endonucleasas Crispr Tipo II.
En otro aspecto de la selección u optimización de la secuencia objetivo, se evalúa la frecuencia de la actividad "fuera del objetivo" para una combinación particular de secuencia objetivo y endonucleasa de edición de genes (es decir, la frecuencia de DSB que ocurre en sitios distintos de la secuencia objetivo seleccionada) en relación con la frecuencia de la actividad en el objetivo. En algunos casos, las células que se han editado correctamente en el locus deseado pueden tener una ventaja selectiva en relación con otras células. Los ejemplos ilustrativos, pero no limitativos, de una ventaja selectiva incluyen la adquisición de atributos tales como tasas mejoradas de replicación, persistencia, resistencia a ciertas condiciones, tasas mejoradas de injerto con éxito o persistencia in vivo después de la introducción en un paciente y otros atributos asociados con el mantenimiento o aumento del número o viabilidad de tales células. En otros casos, las células que se han editado correctamente en el locus deseado pueden seleccionarse positivamente mediante uno o más métodos de cribado usados para identificar, separar o seleccionar de otro modo las células que se han editado correctamente. Tanto la ventaja selectiva como los métodos de selección dirigida pueden aprovechar el fenotipo asociado con la corrección.
Ya sea aplicable o no cualquier ventaja selectiva o que se aplique cualquier selección dirigida en un caso particular, la selección de la secuencia objetivo también puede estar guiada por la consideración de las frecuencias fuera del objetivo con el fin de mejorar la efectividad de la aplicación y/o reducir el potencial de alteraciones no deseadas en sitios distintos al objetivo deseado. Como se describe e ilustra más adelante en el presente documento y en la técnica, en la aparición de actividad fuera del objetivo influye una serie de factores que incluyen similitudes y diferencias entre el sitio objetivo y varios sitios fuera del objetivo, así como la endonucleasa particular utilizada. En muchos casos, están disponibles herramientas bioinformáticas para ayudar en la predicción de la actividad fuera del objetivo y, con frecuencia, dichas herramientas también se pueden usar para identificar los sitios más probables de actividad fuera del objetivo, que luego se pueden evaluar en entornos experimentales para evaluar las frecuencias relativas de actividad fuera del objetivo respecto a dentro del objetivo, lo que permite la selección de secuencias que tienen actividades relativas más altas en el objetivo. En el presente documento se proporcionan ejemplos ilustrativos de dichas técnicas y se conocen otros en la técnica.
Otro aspecto de la selección de la secuencia objetivo se refiere a los sucesos de recombinación homóloga. Es bien sabido que las secuencias que comparten regiones de homología pueden servir como puntos focales para sucesos de recombinación homóloga que dan como resultado la deleción de secuencias intermedias. Dichos sucesos de recombinación ocurren durante el transcurso normal de la replicación de cromosomas y otras secuencias de ADN, y también en otros momentos cuando se están sintetizando las secuencias de ADN, tal como en el caso de las reparaciones de roturas de doble cadena (DSB) que ocurren de forma regular durante el ciclo normal, pero también puede ser potenciados por la aparición de varios sucesos (tales como luz ultravioleta y otros inductores de la rotura del ADN) o la presencia de ciertos agentes (tales como varios inductores químicos). Muchos de estos inductores hacen que las DSB se produzcan indiscriminadamente en el genoma, y las DSB son inducidas y reparadas regularmente en células normales. Durante la reparación, la secuencia original puede reconstruirse con total fidelidad, sin embargo, en algunos casos, se introducen pequeñas inserciones o deleciones (denominadas "indels") en el sitio de DSB.
Las DSB también se pueden inducir específicamente en ubicaciones particulares, como en el caso de los sistemas de endonucleasas descritos en el presente documento, que se pueden usar para producir sucesos de modificación génica dirigida o preferencial en ubicaciones cromosómicas seleccionadas. La tendencia de las secuencias homólogas a ser sometidas a recombinación en el contexto de la reparación del ADN (así como de la replicación) puede aprovecharse en una serie de circunstancias y es la base para una aplicación de sistemas de edición de genes tal como Crispr en los que se usa la reparación dirigida por homología (HDR) para insertar una secuencia de interés, proporcionada mediante el uso de un polinucleótido "donador", en una ubicación cromosómica deseada.
Las regiones de homología entre secuencias particulares, que pueden ser regiones pequeñas de "microhomología" que pueden comprender tan solo diez pares de bases o menos, también pueden usarse para producir las deleciones deseadas. Por ejemplo, en el caso de la denominada "deleción pequeña" ilustrada en el presente documento, se introduce una sola DSB en un sitio que presenta microhomología con una secuencia cercana. Durante el transcurso normal de reparación de dicha DSB, un resultado que ocurre con frecuencia alta es la deleción de la secuencia intermedia como resultado de la recombinación que es facilitada por la DSB y el proceso de reparación celular concomitante. En el caso de esta deleción pequeña, que está en la región secuencia arriba del gen de la globina y como se ilustra en la Figura 14B, el resultado de la deleción es aumentar los niveles de HbF, aparentemente a través de la alteración de una secuencia de silenciamiento del gen.
En algunas circunstancias, sin embargo, la selección de secuencias objetivo dentro de regiones de homología también puede dar lugar a deleciones mucho más grandes, que incluyen fusiones de genes (cuando las deleciones están en regiones codificantes), que pueden o no ser deseables dadas las circunstancias particulares. Por ejemplo, como se ilustra en la Figura 14D, las homologías que existen entre los dos genes HBG1 y HBG2 de globina y estrechamente relacionados pueden dar lugar a grandes deleciones que surgen a través de la recombinación homóloga entre sitios de homología más alejados.
Los ejemplos proporcionados en el presente documento ilustran además la selección de varias regiones objetivo para la creación de DSB diseñadas para inducir deleciones que producen el aumento de los niveles de HbF en células humanas, así como la selección de secuencias objetivo específicas dentro de tales regiones que están diseñadas para minimizar los sucesos fuera del objetivo en relación con los sucesos dentro del objetivo.
Células humanas
Para mejorar las hemoglobinopatías, como se describe e ilustra en el presente documento, los objetivos principales para la edición de genes serán las células humanas que, después de ser modificadas utilizando las técnicas descritas, pueden dar lugar a glóbulos rojos (RBC) con niveles aumentados de HbF en un paciente que padece una hemoglobinopatía tal como p-talasemia o enfermedad drepanocítica.
Como se describe en el presente documento y en la técnica, incluso los aumentos incrementales y relativamente modestos en los niveles de HbF en un paciente que padece una hemoglobinopatía tal como la p-talasemia o enfermedad drepanocítica, pueden ser beneficiosos para mejorar los síntomas y/o la supervivencia. En algunas realizaciones, los niveles de HbF logrados tenderán hacia los observados en pacientes con HPFH, que varían entre los pacientes y el tipo de HPFH pero en un número sustancial de casos dan como resultado que la HbF esté comprendida en el intervalo de 10-30% de la hemoglobina total (frente a 1-2% en adultos típicos). Sin embargo, los estudios han mostrado que niveles más bajos de HbF pueden, no obstante, tener efectos que son lo suficientemente significativos como para ser considerados como una disminución de las expectativas de mortalidad general entre los grupos de pacientes con SCD; véase, p. ej., Platt et al., N Engl J Med. 330(23):1639-1644 (1994). E incluso las mejoras modestas de los síntomas pueden tener efectos beneficiosos para los pacientes. Por ejemplo, una reducción en la necesidad de transfusiones, una disminución de la incidencia o gravedad de uno o más síntomas de una hemoglobinopatía, o una reducción de los efectos secundarios como resultado de menores niveles o frecuencia de tratamientos o procedimientos también pueden ser significativos y beneficiosos para los pacientes. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el aumento de HbF puede estar en el intervalo de aproximadamente 80%, 60%, 40% o 20% de los niveles de HbF observados en pacientes con HPFH. En el presente documento se proporcionan consideraciones adicionales con respecto a los niveles de HbF que pueden lograrse, incluida la descripción detallada y los ejemplos, complementados con las referencias citadas en el presente documento y/o publicadas en la técnica.
Al realizar la edición de genes como se describe en el presente documento en células progenitoras tales como células progenitoras eritroides, tales como células progenitoras autólogas, que se obtienen de y, por lo tanto, ya coinciden completamente con el paciente que lo necesita, es posible generar células que se pueden reintroducir de forma segura en un paciente y dar lugar de manera efectiva a una población de RBC en circulación que serán efectivos para mejorar una o más afecciones clínicas asociadas con la enfermedad del paciente.
Si bien la presencia de un número significativo de RBC que tienen niveles elevados de HbF es beneficiosa, en algunas realizaciones, más de una cuarta parte de los glóbulos rojos (RBC) en circulación tendrán niveles significativamente elevados de HbF, en algunas realizaciones, al menos la mitad de los RBC en circulación tendrán niveles significativamente elevados de HbF y, en algunas realizaciones, al menos el 80% de los RBC en circulación tendrán niveles significativamente elevados de HbF con el fin de prevenir eficazmente la falciformación clínica de eritrocitos.
Las células progenitoras (también denominadas células madre en el presente documento), tal como las células progenitoras eritroides o hematopoyéticas, son capaces de proliferar y dar lugar a más células progenitoras, que a su vez tienen la capacidad de generar una gran cantidad de células madre que pueden, a su vez dar lugar a células hijas diferenciadas o diferenciables. Las propias células hijas pueden ser inducidas para que proliferen y produzcan progenie que posteriormente se diferencie en uno o más tipos de células maduras, al mismo tiempo que retienen una o más células con potencial de desarrollo parental. La expresión "célula madre" se refiere entonces a una célula con la capacidad o potencial, bajo circunstancias particulares, de diferenciarse a un fenotipo más especializado o diferenciado, y que retiene la capacidad, bajo ciertas circunstancias, de proliferar sin diferenciarse sustancialmente. En una realización, el término progenitor o célula madre se refiere a una célula madre generalizada cuyos descendientes (progenie) se especializan, a menudo en diferentes direcciones, por diferenciación, p. ej., mediante la adquisición de caracteres completamente individuales, tal como ocurre en la diversificación progresiva de tejidos y células embrionarias. La diferenciación celular es un proceso complejo que típicamente ocurre a través de varias divisiones celulares. Una célula diferenciada puede derivar de una célula multipotente la cual deriva ella misma de una célula multipotente y así sucesivamente. Aunque es posible considerar cada una de estas células multipotentes como células madre, la variedad de tipos de células que cada una puede generar puede variar en forma considerable. Algunas células diferenciadas también tienen la capacidad de dar lugar a células de mayor potencial de desarrollo. Tal capacidad puede ser natural o puede inducirse artificialmente tras el tratamiento con diversos factores. En muchos casos biológicos, las células madre también son "multipotentes" porque pueden producir progenie de más de un tipo de célula distinto, pero esto no es requerido para el "estado pluripotente".
La autorrenovación es otro aspecto importante de la célula madre, como se usa en este documento. En teoría, la autorrenovación puede producirse por cualquiera de dos mecanismos principales. Las células madre pueden dividirse en forma asimétrica, reteniendo una de las hijas el estado pluripotente y la otra hija expresa alguna otra función específica y fenotipo diferentes. De manera alternativa, algunas de las células madre en una población se pueden dividir en forma simétrica en dos células madre, manteniendo así algunas células madre en la población en conjunto, mientras que otras células en la población generan únicamente progenie diferenciada. Generalmente, las "células progenitoras" tienen un fenotipo celular que es más primitivo (es decir, está en una etapa anterior a lo largo de una ruta de desarrollo o progresión de lo que está una célula completamente diferenciada). A menudo las células progenitoras también tienen potencial proliferativo significativo o muy alto. Las células progenitoras pueden dar lugar a múltiples tipos de células diferenciadas diferentes o un único tipo de célula diferenciada, dependiendo de la ruta de desarrollo y del entorno en el que las células se desarrollan y se diferencian.
En el contexto de la ontogenia celular, el adjetivo "diferenciado" o "diferenciando" es un término relativo. Una "célula diferenciada" es una célula que ha progresado más en la ruta de desarrollo que la célula con la que se está comparando. Por lo tanto, las células madre pueden diferenciarse en células precursoras de linaje restringido (tales como una célula progenitora hematopoyética), que a su vez pueden diferenciarse en otros tipos de células precursoras más adelante en la ruta (tal como un precursor de eritrocito) y luego, a una célula diferenciada de etapa final, tal como un eritrocito, que desempeña una función característica en un determinado tipo de tejido y que puede o no retener la capacidad de proliferar adicionalmente.
"Célula progenitora hematopoyética", como se usa el término en el presente documento, se refiere a células de un linaje de células madre que dan lugar a todos los tipos de células sanguíneas, incluidas eritroides (eritrocitos o glóbulos rojos (RBC)), mieloides (monocitos y macrófagos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, megacariocitos/plaquetas y células dendríticas) y linfoides (células T, células B, células NK).
Una "célula del linaje eritroide" indica que la célula que se pone en contacto es una célula que experimenta eritropoyesis tal que tras la diferenciación final forma un eritrocito o glóbulo rojo. Tales células se originan a partir de células progenitoras hematopoyéticas de la médula ósea. Tras la exposición a factores de crecimiento específicos y otros componentes del microambiente hematopoyético, las células progenitoras hematopoyéticas pueden madurar a través de una serie de tipos celulares de diferenciación intermedia, todos los intermedios del linaje eritroide, en RBC. Por lo tanto, las células del "linaje eritroide", como se usa la expresión en el presente documento, comprenden células progenitoras hematopoyéticas, rubriblastos, prorrubrocitos, eritroblastos, metarrubrocitos, reticulocitos y eritrocitos.
En algunas realizaciones, la célula progenitora hematopoyética tiene al menos uno de los marcadores de superficie celular característicos de las células progenitoras hematopoyéticas: CD34+, CD59+, Thyl/CD90+, CD381o/- y C-kit/CDI 17+. En algunas realizaciones, los progenitores hematopoyéticos son CD34+.
En algunas realizaciones, la célula progenitora hematopoyética es una célula madre de sangre periférica obtenida del paciente después de que el paciente haya sido tratado con factor estimulador de colonias de granulocitos (opcionalmente en combinación con Plerixaflor). En realizaciones ilustrativas, las células CD34+ se enriquecen usando el Sistema de Selección de Células CliniMACS® (Miltenyi Biotec). En algunas realizaciones, las células CD34+ se estimulan débilmente en un medio sin suero (p. ej., medio CellGrow SCGM, CellGenix) con citocinas (p. ej., SCF, rhTPO, rhFLT3) antes de la edición del genoma. En algunas realizaciones, se contempla la adición de SR1 y dmPGE2 y/u otros factores para mejorar el injerto a largo plazo.
En algunas realizaciones, las células progenitoras hematopoyéticas del linaje eritroide tienen el marcador de superficie celular característico del linaje eritroide: tal como CD71 y Terl 19.
Células madre pluripotentes inducidas
En algunas realizaciones, las células humanas modificadas genéticamente descritas en el presente documento se derivan de células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Una ventaja de usar iPSC es que las células se pueden obtener del mismo sujeto al que se van a administrar las células progenitoras. Es decir, se puede obtener una célula somática de un sujeto, reprogramar a una célula madre pluripotente inducida y luego volver a diferenciar en una célula progenitora hematopoyética para administrarse al sujeto (p. ej., células autólogas). Dado que los progenitores derivan esencialmente de una fuente autóloga, el riesgo de rechazo del injerto o respuestas alérgicas se reduce en comparación con el uso de células de otro sujeto o grupo de sujetos. En algunas realizaciones, los progenitores hematopoyéticos se derivan de fuentes no autólogas. Además, el uso de iPSC niega la necesidad de células obtenidas de una fuente embrionaria. Por lo tanto, en una realización, las células madre utilizadas en los métodos descritos no son células madre embrionarias.
Aunque la diferenciación es generalmente irreversible en contextos fisiológicos, recientemente se han desarrollado varios métodos para reprogramar células somáticas a iPSC. Los métodos de ejemplo son conocidos por los expertos en la técnica y se describen brevemente a continuación.
Como se usa en el presente documento, el término "reprogramación" se refiere a un proceso que altera o invierte el estado de diferenciación de una célula diferenciada (p. ej., una célula somática). Dicho de otra manera, la reprogramación se refiere a un proceso de conducir la diferenciación de una célula hacia atrás a un tipo de célula más indiferenciada o más primitiva. Cabe señalar que poner muchas células primarias en cultivo puede llevar a cierta pérdida de características completamente diferenciadas. Por lo tanto, simplemente cultivar dichas células incluidas en el término células diferenciadas no convierte a estas células en células no diferenciadas (p. ej., células indiferenciadas) o células pluripotentes. La transición de una célula diferenciada a la pluripotencia requiere un estímulo de reprogramación más allá de los estímulos que conducen a la pérdida parcial del carácter diferenciado en cultivo. Las células reprogramadas también tienen la característica de la capacidad de pases extendidos sin pérdida de potencial de crecimiento respecto a los progenitores de células primarias, que generalmente tienen capacidad únicamente para una cantidad limitada de divisiones en cultivo.
La célula que se va a reprogramar puede estar parcial o totalmente diferenciada antes de la reprogramación. En algunas realizaciones, la reprogramación abarca la reversión completa del estado de diferenciación de una célula diferenciad (p. ej., una célula somática) a un estado pluripotente o un estado multipotente. En algunas realizaciones, la reprogramación abarca la reversión completa o parcial del estado de diferenciación de una célula diferenciada (p. ej., una célula somática) a una célula no diferenciada (p. ej., una célula de tipo embrionario). La reprogramación puede dar como resultado la expresión de genes particulares por las células, cuya expresión contribuye aún más a la reprogramación. En ciertas realizaciones descritas en el presente documento, la reprogramación de una célula diferenciada (p. ej., una célula somática) hace que la célula diferenciada asuma un estado indiferenciado (p. ej., es una célula indiferenciada). Las células resultantes se denominan "células reprogramadas" o "células madre pluripotentes inducidas (iPSC o células iPS)".
La reprogramación puede implicar la alteración, p. ej., reversión, de al menos algunos de los patrones heredables de modificación de ácido nucleico (p. ej., metilación), condensación de cromatina, cambios epigenéticos, impronta genómica, etc., que ocurren durante la diferenciación celular. La reprogramación es distinta de simplemente mantener el estado indiferenciado existente de una célula que ya es pluripotente o mantener el estado existente menos que completamente diferenciado de una célula que ya es una célula multipotente (p. ej., una célula madre hematopoyética). La reprogramación también es distinta de promover la autorrenovación o proliferación de células que ya son pluripotentes o multipotentes, aunque las composiciones y los métodos descritos en el presente documento también pueden ser útiles para tales fines, en algunas realizaciones.
El enfoque o método específico utilizado para generar células madre pluripotentes a partir de células somáticas no es crítico para la invención reivindicada. Por lo tanto, cualquier método que reprograme una célula somática al fenotipo pluripotente sería apropiado para usar en los métodos descritos en el presente documento.
Se han descrito metodologías de reprogramación para generar células pluripotentes usando combinaciones definidas de factores de transcripción. Las células somáticas de ratón se pueden convertir en células similares a células ES con potencial de desarrollo ampliado mediante la transducción directa de Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc; véase, p. ej., Takahashi y Yamanaka, Cell 126(4):663-76 (2006). Las iPSC se parecen a las células ES ya que restablecen el circuito transcripcional asociado a la pluripotencia y gran parte del paisaje epigenético. Además, las iPSC de ratón satisfacen todos los ensayos estándar de pluripotencia: específicamente, diferenciación in vitro en tipos de células de las tres capas germinales, formación de teratoma, contribución a quimeras, transmisión de línea germinal [véase, p. ej., Maherali y Hochedlinger, Cell Stem Cell. 3(6):595-605 (2008)], y complementación tetraploide.
Las iPSC humanas se pueden obtener utilizando métodos de transducción similares, y el trío de factores de transcripción, OCT4, SOX2 y NANOG, se ha establecido como el conjunto central de factores de transcripción que gobiernan la pluripotencia; véase, p. ej., Budniatzky y Gepstein, Stem Cells Transl Med. 3(4):448-57 (2014); Barrett et al., Stem Cells Trans Med 3:1-6 sctm.2014-0121 (2014); Focosi et al., Blood Cáncer Journal 4: e211 (2014); y las referencias citadas en los mismos. La producción de las iPSC se puede lograr mediante la introducción de secuencias de ácido nucleico que codifican genes asociados con células madre en una célula somática adulta, históricamente usando vectores virales.
Las iPSC pueden generarse o derivarse de células somáticas diferenciadas terminalmente, así como de células madre adultas o células madre somáticas. Es decir, una célula progenitora no pluripotente puede volverse pluripotente o multipotente mediante reprogramación. En tales casos, puede que no sea necesario incluir tantos factores de reprogramación como se requiere para reprogramar una célula diferenciada terminalmente. Además, la reprogramación puede inducirse mediante la introducción no viral de factores de reprogramación, p. ej., mediante la introducción de las propias proteínas, o mediante la introducción de ácidos nucleicos que codifican los factores de reprogramación, o mediante la introducción de ARN mensajeros que tras la traducción producen los factores de reprogramación (véase, p. ej., Warren et al., Cell Stem Cell, 7(5):618-30 (2010). La reprogramación se puede lograr mediante la introducción de una combinación de ácidos nucleicos que codifican genes asociados con células madre, incluidos, por ejemplo, Oct-4 (también conocido como Oct-3/4 o Pouf51), Soxl, Sox2, Sox3, Sox 15, Sox 18, NANOG, Klfl, Klf2, Klf4, Klf5, NR5A2, c-Myc, 1-Myc, n-Myc, Rem2, Tert y LIN28. En una realización, la reprogramación usando los métodos y composiciones descritos en el presente documento puede comprender además introducir uno o más de Oct-3/4, un miembro de la familia Sox, un miembro de la familia Klf y un miembro de la familia Myc en una célula somática. En una realización, los métodos y composiciones descritos en el presente documento comprenden además la introducción de uno o más de cada uno de Oct 4, Sox2, Nanog, c-MYC y Klf4 para la reprogramación. Como se indicó anteriormente, el método exacto utilizado para la reprogramación no es necesariamente crítico para los métodos y composiciones descritos en el presente documento. Sin embargo, cuando se van a usar células diferenciadas a partir de las células reprogramadas, p. ej., en terapia humana, en una realización la reprogramación no se efectúa mediante un método que altere el genoma. Por lo tanto, en tales realizaciones, la reprogramación se logra, p. ej., sin el uso de vectores virales o plasmídicos.
La eficacia de la reprogramación (es decir, el número de células reprogramadas) obtenida a partir de una población de células de partida puede mejorarse mediante la adición de varias moléculas pequeñas como se muestra en Shi et al., Cell-Stem Cell 2:525-528 (2008); Huangfu et al., Nature Biotechnology 26(7):795-797 (2008) y Marson et al., Cell-Stem Cell 3: 132-135 (2008). Por lo tanto, un agente o una combinación de agentes que mejoran la eficacia o la tasa de producción de células madre pluripotentes inducidas se puede usar en la producción de iPSC específicas del paciente o de la enfermedad. Algunos ejemplos no limitantes de agentes que mejoran la eficiencia de la reprogramación incluyen Wnt soluble, medios acondicionados con Wnt, BIX-01294 (una histona metiltransferasa G9a), PD0325901 (un inhibidor de MEK), inhibidores de ADN metiltransferasa, inhibidores de histona desacetilasa (HDAC), ácido valproico, 5'-azacitidina, dexametasona, suberoilanilida, ácido hidroxámico (SAHA), vitamina C y tricostatina (TSA), entre otros.
Otros ejemplos no limitativos de agentes que mejoran la reprogramación incluyen: ácido suberoilanilida hidroxámico (SAHA (p. ej., MK0683, vorinostat) y otros ácidos hidroxámicos), BML-210, Depudecina (p. ej., (-)-Depudecina), toxina HC, Nullscript (4-(I,3-Dioxo-IH,3H-benzo[de]isoquinolin-2-il)-N-hidroxibutanamida), fenilbutirato (p. ej., fenilbutirato de sodio) y ácido valproico ((VP A) y otros ácidos grasos de cadena corta), Scriptaid, suramina sódica, tricostatina A (TSA), compuesto APHA 8, apicidina, butirato de sodio, butirato de pivaloiloximetilo (Pivanex, AN-9), trapoxina B, clamidocina, depsipéptido (también conocido como FR901228 o FK228), benzamidas (p. ej., CI-994 (p. ej., N-acetildinalina) y MS-27-275), MGCD0103, NVP-LAQ-824, CBHA (ácido bishidroxámico del ácido m-carboxicinámico), JNJ16241199, tubacina, A-161906, proxamida, oxamflatina, 3-Cl-UCHA (p. ej., ácido 6-(3-clorofenilureido)caproico hidroxámico), AOE (ácido 2-amino-8-oxo-9,10-epoxidecanoico), CHAP31 y CHAP 50. Otros agentes potenciadores de la reprogramación incluyen, por ejemplo, formas negativas dominantes de las HDAC (p. ej., formas catalíticamente inactivas), inhibidores de ARNip de las HDAC y anticuerpos que se unen específicamente a las HDAC. Dichos inhibidores están disponibles, p. ej., de BIOMOL International, Fukasawa, Merck Biosciences, Novartis, Gloucester Pharmaceuticals, Titan Pharmaceuticals, MethylGene y Sigma Aldrich.
Para confirmar la inducción de células madre pluripotentes para usar con los métodos descritos en el presente documento, se pueden ensayar clones aislados para determinar la expresión de un marcador de células madre. Dicha expresión en una célula derivada de una célula somática identifica las células como células madre pluripotentes inducidas. Los marcadores de células madre se seleccionan del grupo no limitante que incluye SSEA3, SSEA4, CD9, Nanog, Fbxl5, Ecatl, Esgl, Eras, Gdf3, Fgf4, Cripto, Daxl, Zpf296, Slc2a3, Rexl, Utfl y Natl. En una realización, una célula que expresa Oct4 o Nanog se identifica como pluripotente. Los métodos para detectar la expresión de tales marcadores pueden incluir, por ejemplo, RT-PCR y métodos inmunológicos que detectan la presencia de los polipéptidos codificados, tales como transferencias Western o análisis de citometría de flujo. En algunas realizaciones, la detección no implica solo RT-PCR, sino que también incluye la detección de marcadores de proteínas. Los marcadores intracelulares pueden identificarse mejor mediante RT-PCR o métodos de detección de proteínas como la inmunocitoquímica, mientras que los marcadores de la superficie celular se identifican fácilmente, p. ej., mediante inmunocitoquímica.
El carácter de célula madre pluripotente de las células aisladas puede confirmarse mediante ensayos que evalúan la capacidad de las iPSC para diferenciarse en células de cada una de las tres capas germinales. Como un ejemplo, se puede utilizar la formación de teratomas en ratones atímicos para evaluar el carácter pluripotente de los clones aislados. Las células se introducen en ratones atímicos y se realiza la histología y/o inmunohistoquímica en un tumor que surge de las células. El crecimiento de un tumor que comprende células de las tres capas germinales, por ejemplo, indica además que las células son células madre pluripotentes.
Edición del genoma
La edición del genoma generalmente se refiere al procedimiento de modificar la secuencia de nucleótidos de un genoma, preferiblemente de una manera precisa o predeterminada. Los ejemplos de métodos de edición del genoma descritos en el presente documento incluyen métodos que usan nucleasas dirigidas al sitio para cortar el ADN en ubicaciones objetivo precisas en el genoma, creando así roturas de ADN de cadena doble o cadena sencilla en ubicaciones particulares dentro del genoma. Tales roturas pueden ser y son reparadas con regularidad mediante procesos celulares endógenos naturales, tales como la reparación dirigida por homología (HDR) y la unión de extremos no homólogos (NHEJ), como se revisó recientemente en Cox et al., Nature Medicine 21(2), 121-31 (2015). La NHEJ une directamente los extremos del ADN resultantes de una rotura de doble cadena, a veces con la pérdida o la adición de una secuencia de nucleótidos que puede alterar o mejorar la expresión génica. La HDR utiliza una secuencia homóloga, o secuencia donadora, como una plantilla para insertar una secuencia de ADN definida en el punto de rotura. La secuencia homóloga puede estar en el genoma endógeno, tal como una cromátida hermana. Alternativamente, el donador puede ser un ácido nucleico exógeno tal como un plásmido, un oligonucleótido monocatenario, un oligonucleótido dúplex o un virus, que tiene regiones de alta homología con el locus escindido por nucleasa, pero que también puede contener una secuencia adicional o cambios de secuencia que incluyen deleciones que se pueden incorporar en el locus objetivo escindido. Un tercer mecanismo de reparación es la unión de extremos mediada por microhomología (MMEJ), también conocida como "NHEJ alternativa", en la que el resultado genético es similar a la NHEJ en el sentido de que pueden ocurrir pequeñas deleciones e inserciones en el sitio de escisión. La MMEJ hace uso de secuencias homólogas de unos pocos pares de bases que flanquean el sitio de rotura del ADN para promover un resultado de reparación por unión de extremos de ADN más favorable, e informes recientes han elucidado más el mecanismo molecular de este proceso; véase, p. ej., Cho y Greenberg, Nature 518, 174-76 (2015); Kent et al., Nature Structural and Molecular Biology, Adv. doi en línea:10.1038/nsmb.2981 (2015); Mateos-Gomez et al., Nature 518, 254-57 (2015); Ceccaldi et al., Nature 528, 258-62 (2015). En algunos casos, puede ser posible predecir los posibles resultados de la reparación en función del análisis de potenciales microhomologías en el sitio de la rotura del ADN.
Cada uno de estos mecanismos de edición del genoma puede usarse para crear alteraciones genómicas deseadas. La primera etapa en el procedimiento de edición del genoma es crear normalmente una o dos roturas de ADN en el locus objetivo lo más cerca posible del sitio de la mutación prevista. Esto se puede lograr mediante el uso de endonucleasas dirigidas, como se describe e ilustra en el presente documento.
Se han modificado varias clases distintas de nucleasas para usar en la edición del genoma. Estas incluyen las nucleasas de dedos de zinc, nucleasas efectoras similares al activador de transcripción (TALE), nucleasas CRISPR/Cas, endonucleasas de asentamiento (también denominadas meganucleasas) y otras nucleasas; véase, p. ej., Hafez y Hausner, Genome 55, 553-69 (2012); Carroll, Ann. Rev. Biochem. 83, 409-39 (2014); Gupta y Musunuru, J. Clin. Invest. 124, 4154-61 (2014); y Cox et al., véase antes. Estos difieren principalmente en la forma en que se unen al ADN y crean la rotura de doble cadena (o cadena única) de ADN dirigida (DSB). Después de crear la DSB, se eligen esencialmente los mismos mecanismos naturales de reparación del ADN celular de NHEJ o HDR para lograr la modificación genética deseada. Por lo tanto, está contemplado que las tecnologías de edición del genoma que usan cualquiera de estas nucleasas se pueden usar para lograr los resultados genéticos y terapéuticos descritos en el presente documento.
Nucleasas de dedos de zinc
Las nucleasas de dedos de zinc (ZFN) son proteínas modulares compuestas por un dominio de unión al ADN de dedos de zinc modificado unido al dominio catalítico de la endonucleasa tipo II Fokl. Dado que Fokl funciona solo como un dímero, se debe modificar un par de ZFN para que se unan a secuencias de "medio sitio" objetivo afines en cadenas de ADN opuestas y con un espacio preciso entre ellas para permitir que se forme el dímero de Fokl catalíticamente activo. Tras la dimerización del dominio Fokl, que en sí mismo no tiene especificidad de secuencia per se, se genera una rotura de doble cadena de ADN entre los medios sitios de ZFN como etapa inicial en la edición del genoma.
El dominio de unión al ADN de cada ZFN se compone típicamente de 3-6 dedos de zinc de la abundante arquitectura Cys2-His2, reconociendo cada dedo principalmente un triplete de nucleótidos en una cadena de la secuencia de ADN objetivo, aunque la interacción entre cadenas con un cuarto nucleótido también puede ser importante. La alteración de los aminoácidos de un dedo en posiciones que hacen contactos clave con el ADN altera la especificidad de secuencia de un dedo dado. Por lo tanto, una proteína con dedos de zinc de cuatro dedos reconocerá selectivamente una secuencia objetivo de 12 pb, donde la secuencia objetivo es un compuesto de las preferencias de triplete aportadas por cada dedo, aunque la preferencia de triplete puede estar influida en diversos grados por los dedos vecinos. Entonces, un aspecto importante de los ZFN es que se pueden redirigir fácilmente a casi cualquier dirección genómica simplemente modificando los dedos individuales, aunque se requiere una experiencia considerable para hacerlo bien. En la mayoría de las aplicaciones de los ZFN se utilizan proteínas de 4-6 dedos, que reconocen 12-18 pb respectivamente. Por lo tanto, un par de ZFN normalmente reconocerá una secuencia objetivo combinada de 24-36 pb, sin incluir el espaciador de 5-7 pb entre los medios sitios. Es probable que una secuencia objetivo de esta longitud sea única en el genoma humano, suponiendo que las secuencias repetitivas o los homólogos de genes son excluidos durante el procedimiento de diseño. Sin embargo, las interacciones proteína ZFN-ADN no son absolutas en su especificidad y, por lo tanto, ocurren sucesos de unión y escisión fuera del objetivo, ya sea como un heterodímero entre los dos ZFN, o como un homodímero de uno u otro de los ZFN. La última posibilidad se eliminó efectivamente modificando la interfase de dimerización del dominio Fokl para crear variantes "más" y "menos", también conocidas como variantes de heterodímero obligado, que solo pueden dimerizar entre sí y no consigo mismas. Forzar el heterodímero obligado evita la formación del homodímero. Esto ha mejorado mucho la especificidad de los ZFN, así como de cualquier otra nucleasa que adopte estas variantes de Fokl.
Se ha descrito en la técnica una variedad de sistemas basados en ZFN, se comunican con regularidad modificaciones de los mismos, y numerosas referencias describen reglas y parámetros que se usan para guiar el diseño de ZFN; véase, p. ej., Segal et al., Proc Natl Acad Sci USA 96(6):2758-63 (1999); Dreier B et al., J Mol Biol. 303(4):489-502 (2000); Liu Q et al., J Biol Chem. 277(6):3850-6 (2002); Dreier et al., J Biol Chem 280(42):35588-97 (2005); y Dreier et al., J Biol Chem. 276(31):29466-78 (2001).
Nucleasas efectoras similares a activador de transcripción (TALEN)
Las TALEN representan otro formato de nucleasas modulares en las que, al igual que con los ZFN, un dominio de unión al ADN modificado se une al dominio de la nucleasa Fokl, y un par de TALEN operan en tándem para lograr la escisión del ADN objetivo. La principal diferencia con los ZFN es la naturaleza del dominio de unión al ADN y las propiedades de reconocimiento de secuencia de ADN objetivo asociadas. El dominio de unión al ADN de TALEN deriva de las proteínas TALE descritas originalmente en el patógeno bacteriano vegetal Xanthomonas sp. Las TALE están compuestas de matrices en tándem de repeticiones de 33-35 aminoácidos, reconociendo cada repetición un solo par de bases en la secuencia de ADN objetivo que típicamente tiene una longitud de hasta 20 pb, lo que da una longitud total de secuencia objetivo de hasta 40 pb. La especificidad de nucleótidos de cada repetición está determinada por el di-resto variable de repetición (RVD) que incluye solo dos aminoácidos en las posiciones 12 y 13. Las bases guanina, adenina, citosina y timina son predominantemente reconocidas por los cuatro RVD Asn-Asn, Asn-Ile, His-Asp y Asn-Gly, respectivamente. Esto constituye un código de reconocimiento mucho más simple que para los dedos de zinc y, por lo tanto, representa una ventaja frente a estos últimos para el diseño de nucleasas. No obstante, al igual que con los ZFN, las interacciones proteína-ADN de las TALEN no son absolutas en su especificidad y las TALEN también se han beneficiado del uso de las variantes de heterodímeros obligados del dominio Fokl para reducir la actividad fuera del objetivo.
Se han creado variantes adicionales del dominio Fokl que están desactivadas en su función catalítica. Si la mitad de un par TALEN o ZFN contiene un dominio Fokl inactivo, entonces solo se producirá una escisión (mella) de a Dn monocatenario en el sitio objetivo en lugar de una DSB. El resultado es comparable al uso de mutantes de "nickasa" de CRISPR/Cas9 en los que se ha desactivado uno de los dominios de escisión de Cas9. Las mellas del ADN se pueden usar para promover la edición del genoma mediante HDR, pero con menor eficiencia que con una DSB. El principal beneficio es que las mellas fuera del objetivo son reparadas de manera rápida y precisa, a diferencia de la DSB, que es propensa a la reparación incorrecta mediada por NHEJ.
Se han descrito en la técnica una variedad de sistemas basados en TALEN, y se comunican con regularidad modificaciones de los mismos; véase, p. ej., Boch, Science 326(5959):1509-12 (2009); Mak et al., Science 335(6069):716-9 (2012); y Moscou et al., Science 326(5959):1501 (2009). Múltiples grupos han descrito el uso de TALEN basados en la plataforma "Golden Gate"; véase, p. ej., Cermak et al., Nucleic Acids Res. 39(12):e82 (2011); Li et al., Nucleic Acids Res. 39(14):6315-25(2011); Weber et al., PLoS One. 6(2):e16765 (2011); Wang et al., J Genet Genomics 41(6):339-47, Epub 17 de mayo de 2014(2014); y Cermak T et al., Methods Mol Biol.
1239:133-59 (2015).
Endonucleasas de asentamiento
Las endonucleasas de asentamiento (HE, por sus siglas en inglés homing endonucleases) son endonucleasas específicas de secuencia que tienen secuencias de reconocimiento largas (14-44 pares de bases) y escinden el ADN con alta especificidad, a menudo en sitios únicos en el genoma. Hay al menos seis familias conocidas de HE clasificadas por su estructura, que incluyen LAGLIDADG (SEQ ID No s : 161-199), GIY-YIG, caja His-Cis, H-N-H, PD-(D/E)xK y tipo Vsr que se derivan de una amplia variedad de hospedantes, incluidos eucariotas, protistas, bacterias, arqueas, cianobacterias y fagos. Al igual que con ZFN y TALEN, las HE se pueden usar para crear una DSB en un locus objetivo como etapa inicial en la edición del genoma. Además, algunas HE naturales y modificadas cortan solo una única cadena del ADN, por lo que funcionan como nickasas específicas del sitio. La secuencia objetivo grande de las HE y la especificidad que ofrecen las ha convertido en candidatos atractivos para crear DSB específicas del sitio.
Se ha descrito en la técnica una variedad de sistemas basados en HE y se comunican con regularidad sus modificaciones; véase, p. ej., las revisiones de Steentoft et al., Glycobiology 24(8):663-80 (2014); Belfort y Bonocora, Methods Mol Biol. 1123:1-26 (2014); Hafez y Hausner, Genome 55(8):553-69 (2012); y referencias citadas en los mismos.
MegaTAL/Tev-mTALEN /MegaTev
Como ejemplos adicionales de nucleasas híbridas, la plataforma MegaTAL y la plataforma Tev-mTALEN utilizan una fusión de los dominios de unión al ADN TALE con HE catalíticamente activas, aprovechando tanto la unión al ADN ajustable como la especificidad de TALE, así como la especificidad de la secuencia de escisión de la HE; véase, p. ej., Boissel et al., NAR 42: 2591-2601 (2014); Kleinstiver et al., G34:1155-65 (2014); y Boissel y Scharenberg, Methods Mol. Biol. 1239: 171-96 (2015).
En una variación adicional, la arquitectura de MegaTev es la fusión de una meganucleasa (Mega) con el dominio de nucleasa derivado de la endonucleasa de asentamiento GIY-YIG I-Tevl (Tev). Los dos sitios activos están separados por -30 pb en el sustrato de ADN y generan dos DSB con extremos cohesivos no compatibles; véase, p. ej., Wolfs et al., NAR 42, 8816-29 (2014). Está previsto que otras combinaciones de enfoques basados en nucleasas existentes evolucionarán y serán útiles para lograr las modificaciones genómicas específicas descritas en el presente documento.
dCas9-Fokl y otras nucleasas
La combinación de las propiedades estructurales y funcionales de las plataformas de nucleasas descritas anteriormente ofrece un enfoque adicional para la edición del genoma que puede superar potencialmente algunas de las deficiencias inherentes. Como ejemplo, el sistema de edición del genoma CRISPR generalmente usa una sola endonucleasa Cas9 para crear la DSB. La especificidad del direccionamiento es promovida por una secuencia de 20 nucleótidos en el ARN guía que se somete al emparejamiento de bases de Watson-Crick con el ADN objetivo (más 2 bases adicionales en la secuencia de PAM NAG o NGG adyacente en el caso de Cas9 de S. pyogenes). Dicha secuencia es lo suficientemente larga para ser única en el genoma humano, sin embargo, la especificidad de la interacción ARN/ADN no es absoluta, con promiscuidad significativa a veces tolerada, particularmente en la mitad 5' de la secuencia objetivo, lo que reduce efectivamente el número de bases que promueven la especificidad. Una solución a esto ha sido desactivar por completo la función catalítica de Cas9, conservando solo la función de unión al ADN guiada por ARN, y en su lugar fusionar un dominio Fokl con la Cas9 desactivada; véase, p. ej., Tsai et al., Nature Biotech 32: 569-76 (2014); y Guilinger et al., Nature Biotech. 32: 577-82 (2014). Dado que Fokl debe dimerizar para volverse catalíticamente activo, se requieren dos ARN guía para unir dos fusiones Cas9-Fokl en estrecha proximidad para formar el dímero y escindir el ADN. Básicamente, esto duplica el número de bases en los sitios objetivo combinados, aumentando así la rigurosidad del direccionamiento por los sistemas basados en CRISPR.
Como ejemplo adicional, la fusión del dominio de unión al ADN de TALE con una HE catalíticamente activa tal como I-Tevl aprovecha tanto la unión al ADN ajustable como la especificidad de TALE así como la especificidad de la secuencia de escisión de I-Tevl, con la expectativa de que la escisión fuera del objetivo pueda reducirse aún más.
Sistema de endonucleasas CRISPR/Cas
Se puede encontrar un locus genómico de CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas) en los genomas de muchos procariotas (p. ej., bacterias y arqueas). En los procariotas, el locus de CRISPR codifica productos que funcionan como un tipo de sistema inmunitario para ayudar a defender a los procariotas contra invasores extraños tales como virus y fagos. Hay tres etapas de la función del locus de CRISPR: integración de nuevas secuencias en el locus, biogénesis del ARN de CRISPR (ARNcr) y silenciamiento del ácido nucleico invasor extraño. Se han identificado cuatro tipos de sistemas CRISPR (p. ej., Tipo I, Tipo II, Tipo III, Tipo U).
Un locus de CRISPR incluye una serie de secuencias repetitivas cortas denominadas "repeticiones". Las repeticiones pueden formar estructuras de horquilla y/o comprenden secuencias monocatenarias no estructuradas. Las repeticiones generalmente ocurren en agrupaciones y con frecuencia divergen entre especies. Las repeticiones están interespaciadas regularmente con secuencias intermedias únicas denominadas "espaciadores", lo que da como resultado una arquitectura de locus de repetición-espaciadorrepetición. Los espaciadores son idénticos o tienen una alta homología con secuencias invasoras extrañas conocidas. Una unidad espaciador-repetición codifica un ARNcrispr (ARNcr), que es procesada a una forma madura de la unidad espaciador-repetición. Un ARNcr comprende una "semilla" o secuencia espaciadora que está implicada en el direccionamiento a un ácido nucleico objetivo (en la forma natural en procariotas, la secuencia espaciadora se dirige al ácido nucleico invasor extraño). Una secuencia espaciadora se encuentra en el extremo 5' o 3' del ARNcr.
Un locus de CRISPR también comprende secuencias de polinucleótidos que codifican genes asociados a Crispr (Cas). Los genes Cas codifican endonucleasas implicadas en la biogénesis y las etapas de interferencia de la función del ARNcr en procariotas. Algunos genes Cas comprenden estructuras secundarias y/o terciarias homólogas.
Sistemas CRISPR Tipo II
La biogénesis del ARNcr en un sistema CRISPR de Tipo II en la naturaleza requiere un ARN CRISPR transactivador (ARNtracr). El ARNtracr es modificado por RNasaIII endógena y luego hibrida con una repetición de ARNcr en la matriz de pre-ARNcr. La RNasaIII endógena es reclutada para escindir el pre-ARNcr. Los ARNcr escindidos se someten a recorte por exorribonucleasa para producir la forma de ARNcr maduro (p. ej., recorte en 5'). El ARNtracr permanece hibridado con el ARNcr, y el ARNtracr y el ARNcr se asocian con un polipéptido dirigido al sitio (p. ej., Cas9). El ARNcr del complejo ARNcr-ARNtacr-Cas9 guía al complejo a un ácido nucleico objetivo con el que el ARNcr puede hibridar. La hibridación del ARNcr con el ácido nucleico objetivo activa Cas9 para la escisión del ácido nucleico objetivo. El ácido nucleico objetivo en un sistema CRISPR Tipo II se denomina motivo adyacente protoespaciador (PAM). En la naturaleza, el PAM es esencial para facilitar la unión de un polipéptido dirigido al sitio (p. ej., Cas9) al ácido nucleico objetivo. Los sistemas Tipo II (también denominados Nmeni o CASS4) se subdividen además en Tipo II-A (CASS4) y II-B (CASS4a). Jinek et al., Science, 337(6096):816-821 (2012) mostraron que el sistema CRISPR/Cas9 es útil para la edición del genoma programable por ARN, y el documento WO2013/176772 proporciona numerosos ejemplos y aplicaciones del sistema de endonucleasa CRISPR/Cas para la edición de genes específicos del sitio.
Genes/polipéptidos Cas y motivos adyacentes de protoespaciadores
Los polipéptidos Cas CRISPR de ejemplo incluyen polipéptidos Cas9 en la Fig. 1 de Fonfara et al., Nucleic Acids Research, 42: 2577-2590 (2014). El sistema de denominación de genes Cas-CRISPR se ha reescrito extensamente desde que se descubrieron los genes Cas. La Fig. 5 de Fonfara, véase antes, proporciona secuencias PAM para polipéptidos Cas9 de diversas especies.
Polipéptidos dirigidos al sitio
Un polipéptido dirigido al sitio en la presente descripción es una nucleasa utilizada en la edición del genoma para escindir el ADN.
En el contexto de un sistema CRISPR/Cas del presente documento, el polipéptido dirigido al sitio puede unirse a un ARN guía que, a su vez, especifica el sitio en el ADN objetivo al que se dirige el polipéptido. En las realizaciones de los sistemas CRISPR/Cas del presente documento, el polipéptido dirigido al sitio es una endonucleasa.
En algunas realizaciones, un polipéptido dirigido al sitio comprende una pluralidad de dominios de escisión de ácido nucleico (es decir, nucleasa). Se pueden unir dos o más dominios de escisión de ácido nucleico mediante un enlazador. En algunas realizaciones, el enlazador comprende un enlazador flexible. Los enlazadores comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40 o más aminoácidos de longitud.
Las enzimas Cas9 de tipo natural que se producen de forma natural comprenden dos dominios de nucleasa, un dominio de nucleasa HNH y un dominio RuvC. En el presente documento, "Cas9" se refiere tanto a Cas9 naturales como recombinantes. Las enzimas Cas9 contempladas en el presente documento comprenden un dominio de nucleasa HNH o similar a HNH y/o un dominio de nucleasa RuvC o similar a RuvC.
Los dominios HNH o similares a HNH comprenden un plegado similar a McrA. Los dominios HNH o similares a HNH comprenden dos cadenas p antiparalelas y una hélice a. Los dominios HNH o similares a HNH comprenden un sitio de unión a un metal (p. ej., sitio de unión a catión divalente). Los dominios HNH o similares a HNH pueden escindir una cadena de un ácido nucleico objetivo (p. ej., la cadena complementaria de la cadena objetivo de ARNcr).
Los dominios RuvC o similares a RuvC comprenden un plegado de RNasaH o similar aRNasaH. Los dominios RuvC/RNasaH están implicados en un conjunto diverso de funciones basadas en ácidos nucleicos, incluida la acción tanto sobre el a Rn como el ADN. El dominio de RNasaH comprende 5 cadenas p rodeadas por una pluralidad de hélices a. Los dominios RuvC/RNasaH o de tipo RuvC/RNasaH comprenden un sitio de unión a metal (p. ej., sitio de unión a catión divalente). Los dominios RuvC/RNasaH o de tipo RuvC/RNasaH pueden escindir una cadena de un ácido nucleico objetivo (p. ej., cadena no complementaria de ADN objetivo bicatenario).
Los polipéptidos dirigidos al sitio pueden introducir roturas de doble cadena o roturas de una cadena en el ácido nucleico (p. ej., ADN genómico). La rotura de doble cadena puede estimular una ruta de reparación del ADN endógeno de una célula (p. ej., reparación dependiente de homología (HDR) y unión de extremos no homólogos (NHEJ) o unión de extremos no homólogos alternativos (A-NHEJ) o unión de extremos mediada por microhomología (MMEJ)). La NHEJ puede reparar el ácido nucleico objetivo escindido sin necesidad de una plantilla homóloga. Esto a veces puede dar como resultado pequeñas deleciones o inserciones (indels) en el ácido nucleico objetivo en el sitio de escisión y puede conducir a la interrupción o alteración de la expresión génica. La HDR puede ocurrir cuando una plantilla de reparación homóloga, o de donador, está disponible. La plantilla del donador homólogo comprende secuencias que son homólogas a las secuencias que flanquean el sitio de escisión del ácido nucleico objetivo. La cromátida hermana generalmente es utilizada por la célula como plantilla de reparación. Sin embargo, para los fines de edición del genoma, la plantilla de reparación a menudo se suministra como un ácido nucleico exógeno, tal como un plásmido, oligonucleótido dúplex, oligonucleótido monocatenario o ácido nucleico viral. Con las plantillas de donadores exógenos, es común introducir una secuencia de ácido nucleico adicional (tal como un transgén) o una modificación (tal como un cambio o deleción de una sola base) entre las regiones flanqueantes de homología, de modo que la secuencia de ácido nucleico adicional o alterada también queda incorporada en el locus objetivo. La MMEJ produce un resultado genético similar a la NHEJ en el sentido de que pueden ocurrir pequeñas deleciones e inserciones en el sitio de escisión. La MMEJ hace uso de secuencias homólogas de unos pocos pares de bases que flanquean el sitio de escisión para promover un resultado de reparación de ADN de unión de extremos favorecido. En algunos casos, puede ser posible predecir los posibles resultados de la reparación basándose en el análisis de microhomologías potenciales en las regiones objetivo de la nucleasa.
Por lo tanto, en algunos casos, se usa la recombinación homóloga para insertar una secuencia de polinucleótido exógena en el sitio de escisión del ácido nucleico objetivo. Una secuencia de polinucleótido exógena se denomina en el presente documento polinucleótido donador. En algunas realizaciones, el polinucleótido donador, una parte del polinucleótido donador, una copia del polinucleótido donador o una parte de una copia del polinucleótido donador se inserta en el sitio de escisión del ácido nucleico objetivo. En algunas realizaciones, el polinucleótido donador es una secuencia de polinucleótido exógena, es decir, una secuencia que no se produce de forma natural en el sitio de escisión del ácido nucleico objetivo.
Las modificaciones del ADN objetivo debido a NHEJ y/o HDR pueden dar lugar, por ejemplo, a mutaciones, deleciones, alteraciones, integraciones, corrección de genes, reemplazo de genes, marcado de genes, inserción de transgenes, deleción de nucleótidos, alteración de genes, translocaciones y/o mutación de genes. Los procesos de deleción de ADN genómico e integración de ácidos nucleicos no nativos en el ADN genómico son ejemplos de edición del genoma.
En algunas realizaciones, el polipéptido dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o 100% de identidad de secuencia de aminoácidos con un polipéptido dirigido al sitio de tipo natural de ejemplo [p. ej., Cas9 de S. pyogenes, US2014/0068797 ID de secuencia N.° 8 o Sapranauskas et al., Nucleic Acids Res, 39(21): 9275-9282 (2011)], y varios otros polipéptidos dirigidos al sitio).
En algunas realizaciones, el polipéptido dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o 100% de identidad de secuencia de aminoácidos con el dominio de nucleasa de un polipéptido dirigido al sitio de ejemplo de tipo natural (p. ej., Cas9 de S. pyogenes, véase antes).
En algunas realizaciones, un polipéptido dirigido al sitio comprende al menos 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 o 100% de identidad con el polipéptido dirigido al sitio de tipo natural (p. ej., Cas9 de S. pyogenes, véase antes) a lo largo de 10 aminoácidos contiguos. En algunas realizaciones, un polipéptido dirigido al sitio comprende como máximo: 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 o 100% de identidad con el polipéptido dirigido al sitio de tipo natural (p. ej., Cas9 de S. pyogenes, véase antes) a lo largo de 10 aminoácidos contiguos. En algunas realizaciones, un polipéptido dirigido al sitio comprende al menos: 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 o 100% de identidad con el polipéptido dirigido al sitio de tipo natural (p. ej., Cas9 de S. pyogenes, véase antes) a lo largo de 10 aminoácidos contiguos en un dominio de nucleasa HNH del polipéptido dirigido al sitio. En algunas realizaciones, un polipéptido dirigido al sitio comprende como máximo: 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 o 100% de identidad con el polipéptido dirigido al sitio de tipo natural (p. ej., Cas9 de S. pyogenes, véase antes) a lo largo de 10 aminoácidos contiguos en un dominio de nucleasa HNH del polipéptido dirigido al sitio. En algunas realizaciones, un polipéptido dirigido al sitio comprende al menos: 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 o 100% de identidad con el polipéptido dirigido al sitio de tipo natural (p. ej., Cas9 de S. pyogenes, véase antes) a lo largo de 10 aminoácidos contiguos en un dominio de nucleasa RuvC del polipéptido dirigido al sitio. En algunas realizaciones, un polipéptido dirigido al sitio comprende como máximo: 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 99 o 100% de identidad con el polipéptido dirigido al sitio de tipo natural (p. ej., Cas9 de S. pyogenes, véase antes) a lo largo de 10 aminoácidos contiguos en un dominio de nucleasa RuvC del polipéptido dirigido al sitio.
En algunas realizaciones, el polipéptido dirigido al sitio comprende una forma modificada de un polipéptido dirigido al sitio de ejemplo de tipo natural. La forma modificada del polipéptido dirigido al sitio de ejemplo de tipo natural comprende una mutación que reduce la actividad de escisión del ácido nucleico del polipéptido dirigido al sitio. En algunas realizaciones, la forma modificada del polipéptido dirigido al sitio de ejemplo de tipo natural tiene menos del 90%, menos del 80%, menos del 70%, menos del 60%, menos del 50%, menos del 40%, menos del 30%, menos del 20%, menos del 10%, menos del 5% o menos del 1% de la actividad de escisión de ácido nucleico del polipéptido dirigido al sitio de ejemplo de tipo natural (p. ej., Cas9 de S. pyogenes, véase antes). La forma modificada del polipéptido dirigido al sitio puede no tener una actividad sustancial de escisión de ácido nucleico. Cuando un polipéptido dirigido al sitio es una forma modificada que no tiene actividad sustancial de escisión de ácido nucleico, se denomina en el presente documento "enzimáticamente inactivo".
En algunas realizaciones, la forma modificada del polipéptido dirigido al sitio comprende una mutación tal que puede inducir una rotura de una sola cadena (SSB) en un ácido nucleico objetivo (p. ej., cortando solo una de las cadenas principales de azúcar-fosfato de un ácido nucleico objetivo bicatenario). En algunas realizaciones, la mutación da como resultado menos del 90%, menos del 80%, menos del 70%, menos del 60%, menos del 50%, menos del 40%, menos del 30%, menos del 20%, menos del 10%, menos del 5% o menos del 1% de la actividad de escisión de ácido nucleico en uno o más de la pluralidad de dominios de escisión de ácido nucleico del polipéptido dirigido al sitio de tipo natural (p. ej., Cas9 de S. pyogenes, véase antes). En algunas realizaciones, la mutación da como resultado que uno o más de la pluralidad de dominios de escisión de ácido nucleico retengan la capacidad de escindir la cadena complementaria del ácido nucleico objetivo pero reduciendo su capacidad de escindir la cadena no complementaria del ácido nucleico objetivo. En algunas realizaciones, la mutación da como resultado que uno o más de la pluralidad de dominios de escisión de ácido nucleico retengan la capacidad de escindir la cadena no complementaria del ácido nucleico objetivo pero reduciendo su capacidad de escindir la cadena complementaria del ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, los restos en el polipéptido Cas9 de S. pyogenes de ejemplo de tipo natural tales como Asp10, His840, Asn854 y Asn856 se mutan para inactivar uno o más de la pluralidad de dominios de escisión de ácido nucleico (p. ej., dominios de nucleasa). En algunas realizaciones, los restos que se van a mutar corresponden a los restos Asp10, His840, Asn854 y Asn856 en el polipéptido Cas9 de S. pyogenes de ejemplo de tipo natural (p. ej., según lo determinado por alineamiento de secuencias y/o estructural). Los ejemplos no limitativos de mutaciones pueden incluir D10A, H840A, N854A o N856A. Un experto en la técnica reconocerá que son adecuadas mutaciones distintas de las sustituciones de alanina.
En algunas realizaciones, una mutación D10A se combina con una o más de las mutaciones H840A, N854A o N856A para producir un polipéptido dirigido al sitio que carece sustancialmente de actividad de escisión de ADN. En algunas realizaciones, una mutación H840A se combina con una o más de las mutaciones D10A, N854A o N856A para producir un polipéptido dirigido al sitio que carece sustancialmente de actividad de escisión de ADN. En algunas realizaciones, una mutación N854A se combina con una o más de las mutaciones H840A, D10A o N856A para producir un polipéptido dirigido al sitio que carece sustancialmente de actividad de escisión de ADN. En algunas realizaciones, una mutación N856A se combina con una o más de las mutaciones H840A, N854A o D10A para producir un polipéptido dirigido al sitio que carece sustancialmente de actividad de escisión de ADN. Los polipéptidos dirigidos al sitio que comprenden un dominio de nucleasa sustancialmente inactivo se denominan en el presente documento nickasas.
Se pueden usar variantes de nickasa de Cas9 para aumentar la especificidad de la edición del genoma mediada por CRISPR. La Cas9 de tipo natural suele estar guiada por un a Rn guía única diseñado para hibridar con una secuencia específica de ~20 nt en la secuencia objetivo (tal como un locus genómico endógeno). Sin embargo, se pueden tolerar varios apareamientos erróneos entre el ARN guía y el locus objetivo, lo que reduce efectivamente la longitud de la homología requerida en el sitio objetivo a, por ejemplo, tan poco como 13 nt de homología y, por lo tanto, da como resultado un potencial elevado para la unión y la escisión del ácido nucleico de doble cadena por el complejo CRISPR/Cas9 en otra parte del genoma objetivo, también conocida como escisión fuera del objetivo. Dado que las variantes de nickasa de Cas9 solo cortan una cadena, con el fin de crear una rotura de doble cadena es necesario que un par de nickasas se unan muy cerca y en cadenas opuestas del ácido nucleico objetivo, creando así un par de mellas, que es el equivalente a una rotura de doble cadena. Esto requiere que dos ARN guías separados, uno para cada nickasa, deban unirse muy cerca y en cadenas opuestas del ácido nucleico objetivo. Este requisito esencialmente duplica la longitud mínima de homología necesaria para que se produzca la rotura de la doble cadena, lo que reduce la probabilidad de que ocurra un suceso de escisión de doble cadena en otra parte del genoma donde los dos sitios de ARN guía, si existen, es poco probable que estén lo suficientemente cerca uno del otro para permitir que se forme la rotura de la doble cadena. Como se describe en la técnica, las nickasas también se pueden usar para promover la HDR frente a la NHEJ. La HDR se puede utilizar para introducir cambios seleccionados en sitios objetivo en el genoma mediante el uso de secuencias donadoras específicas que median de manera efectiva los cambios deseados. Se pueden encontrar descripciones de varios sistemas Crispr-Cas para su uso en la edición de genes, p. ej., en el documento WO2013/176772, y en Nature Biotechnology 32, 347-355 (2014), y las referencias citadas en los mismos.
Las mutaciones contempladas incluyen sustituciones, adiciones y deleciones, o cualquier combinación de las mismas. En algunas realizaciones, la mutación convierte el aminoácido mutado en alanina. En algunas realizaciones, la mutación convierte el aminoácido mutado en otro aminoácido (p. ej., glicina, serina, treonina, cisteína, valina, leucina, isoleucina, metionina, prolina, fenilalanina, tirosina, triptófano, ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina, histidina, lisina o arginina). En algunas realizaciones, la mutación convierte el aminoácido mutado en un aminoácido no natural (p. ej., seleniometionina). En algunas realizaciones, la mutación convierte el aminoácido mutado en miméticos de aminoácidos (p. ej., fosfomiméticos). En algunas realizaciones, la mutación es una mutación conservadora. Por ejemplo, la mutación puede convertir el aminoácido mutado en aminoácidos que se parecen en tamaño, forma, carga, polaridad, conformación y/o rotámeros a los aminoácidos mutados (p. ej., mutación de cisteína/serina, mutación de lisina/asparagina, mutación de histidina/fenilalanina). En algunas realizaciones, la mutación produce un desplazamiento en el marco de lectura y/o la creación de un codón de terminación prematuro. En algunas realizaciones, las mutaciones producen cambios en las regiones reguladoras de genes o locus que afectan a la expresión de uno o más genes.
En algunas realizaciones, el polipéptido dirigido al sitio (p. ej., polipéptido dirigido al sitio variante, mutado, enzimáticamente inactivo y/o condicionalmente inactivo enzimáticamente) se dirige al ácido nucleico. En algunas realizaciones, el polipéptido dirigido al sitio (p. ej., endorribonucleasa variante, mutada, enzimáticamente inactiva y/o condicionalmente inactiva enzimáticamente) puede dirigirse al ARN.
En algunas realizaciones, el polipéptido dirigido al sitio comprende una o más secuencias no nativas (p. ej., el polipéptido dirigido al sitio es una proteína de fusión).
En algunas realizaciones, el polipéptido dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 15% de identidad de aminoácidos con una Cas9 de una bacteria (p. ej., S. pyogenes), un dominio de unión de ácido nucleico y dos dominios de escisión de ácido nucleico (es decir, un dominio HNH y un dominio RuvC).
En algunas realizaciones, el polipéptido dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 15% de identidad de aminoácidos con una Cas9 de una bacteria (p. ej., S. pyogenes), y dos dominios de escisión de ácido nucleico (es decir, un dominio HNH y un dominio RuvC).
En algunas realizaciones, el polipéptido dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 15% de identidad de aminoácidos con una Cas9 de una bacteria (p. ej., S. pyogenes) y dos dominios de escisión de ácido nucleico, en donde uno o ambos de los dominios de escisión de ácido nucleico comprenden al menos 50% de identidad de aminoácidos con un dominio de nucleasa de Cas9 de una bacteria (p. ej., S. pyogenes).
En algunas realizaciones, el polipéptido dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 15% de identidad de aminoácidos con una Cas9 de una bacteria (p. ej., S. pyogenes), dos dominios de escisión de ácido nucleico (es decir, un dominio HNH y un dominio RuvC) y una secuencia no nativa (por ejemplo, una señal de localización nuclear) o un enlazador que une el polipéptido dirigido al sitio con una secuencia no nativa.
En algunas realizaciones, el polipéptido dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 15% de identidad de aminoácidos con una Cas9 de una bacteria (p. ej., S. pyogenes), dos dominios de escisión de ácido nucleico (es decir, un dominio HNH y un dominio RuvC), en donde el polipéptido dirigido al sitio comprende una mutación en uno o ambos dominios de escisión de ácido nucleico que reduce la actividad de escisión de los dominios de nucleasa en al menos 50%.
En algunas realizaciones, el polipéptido dirigido al sitio comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 15% de identidad de aminoácidos con una Cas9 de una bacteria (p. ej., S. pyogenes) y dos dominios de escisión de ácido nucleico (es decir, un dominio HNH y un dominio RuvC), en donde uno de los dominios de nucleasa comprende la mutación del ácido aspártico 10, y/o en donde uno de los dominios de nucleasa comprende la mutación de la histidina 840, y en donde la mutación reduce la actividad de escisión del o de los dominios de nucleasa en al menos 50%.
Ácido nucleico dirigido a ácido nucleico
La presente descripción proporciona un ácido nucleico dirigido a ácido nucleico que puede dirigir las actividades de un polipéptido asociado (p. ej., un polipéptido dirigido al sitio) a una secuencia objetivo específica dentro de un ácido nucleico objetivo. En algunas realizaciones, el ácido nucleico dirigido a ácido nucleico es un ARN. Un ARN dirigido a ácido nucleico se denomina en el presente documento "ARN guía". Un ARN guía comprende al menos una secuencia espaciadora que hibrida con una secuencia de ácido nucleico objetivo de interés, una secuencia de repetición de CRISPR y una secuencia de ARNtacr. En el ARN guía, la secuencia de repetición de CRISPR y la secuencia de ARNtacr se hibridan entre sí para formar un dúplex. El dúplex se une a un polipéptido dirigido al sitio de manera que el ARN guía y el polipéptido dirigido al sitio forman un complejo. El ácido nucleico dirigido a ácido nucleico proporciona especificidad de objetivo al complejo en virtud de su asociación con el polipéptido dirigido al sitio. El ácido nucleico dirigido a ácido nucleico dirige así la actividad del polipéptido dirigido al sitio.
Se han identificado secuencias espaciadoras de ARNg para dirigirse al locus de la globina en las SEQ ID NOs: 1-161.197 y 161.200-161.312.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico dirigido a ácido nucleico es un ARN guía de doble molécula. En algunas realizaciones, el ácido nucleico dirigido a ácido nucleico es un ARN de una sola molécula.
Un ARN guía de doble molécula comprende dos cadenas de ARN. La primera cadena comprende en la dirección 5' a 3', una secuencia de extensión de espaciador opcional, una secuencia espaciadora y una secuencia de repetición de CRISPR mínima. La segunda cadena comprende una secuencia de ARNtacr mínima (complementaria a la secuencia de repetición de CRISPR mínima), una secuencia de ARNtacr 3' y una secuencia de extensión de ARNtacr opcional.
Un ARN guía de molécula única comprende en la dirección de 5' a 3', una secuencia de extensión de espaciador opcional, una secuencia espaciadora, una secuencia de repetición de CRISPR mínima, un enlazador guía de una sola molécula, una secuencia de ARNtacr mínima, una secuencia de ARNtacr 3' y una secuencia de extensión de ARNtacr opcional. La extensión del ARNtacr opcional puede comprender elementos que aportan funcionalidad adicional (p. ej., estabilidad) al ARN guía. El enlazador guía de molécula única une la repetición de CRISPR mínima y la secuencia de ARNtacr mínima para formar una estructura de horquilla. La extensión del ARNtacr opcional comprende una o más horquillas.
A modo de ilustración, los ARN guía utilizados en el sistema Crispr-Cas, u otros ARN más pequeños, se pueden sintetizar fácilmente por medios químicos como se ilustra a continuación y se describe en la técnica. Si bien los procedimientos de síntesis química se expanden continuamente, las purificaciones de dichos ARN mediante procedimientos tales como la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC, que evita el uso de geles tales como PAGE) tienden a ser más desafiantes a medida que las longitudes de los polinucleótidos aumentan significativamente más allá de los cien nucleótidos aproximadamente. Un enfoque utilizado para generar ARN de mayor longitud es producir dos o más moléculas que se ligan entre sí. Los ARN mucho más largos, tales como los que codifican una endonucleasa Cas9, se generan más fácilmente enzimáticamente. Se pueden introducir varios tipos de modificaciones de ARN durante o después de la síntesis química y/o la generación enzimática de ARN, p. ej., modificaciones que mejoran la estabilidad, reducen la probabilidad o el grado de respuesta inmunitaria innata y/o mejoran otros atributos, como se describe en la técnica.
Secuencia de extensión de espaciador
En algunas realizaciones de ácidos nucleicos dirigidos a ácidos nucleicos, una secuencia de extensión de espaciador puede proporcionar estabilidad y/o proporcionar una ubicación para modificaciones de un ácido nucleico dirigido a ácido nucleico. En algunas realizaciones, se proporciona una secuencia de extensión de espaciador. Una secuencia de extensión de espaciador puede tener una longitud de más de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000 o 7000 o más nucleótidos. Una secuencia de extensión de espaciador puede tener una longitud de menos de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000 o más nucleótidos. En algunas realizaciones, una secuencia de extensión de espaciador comprende menos de 10 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, una secuencia de extensión de espaciador comprende entre 10 y 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, una secuencia de extensión de espaciador comprende entre 30-70 nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, la secuencia de extensión de espaciador comprende otro motivo (p. ej., una secuencia de control de estabilidad, una secuencia de unión a endorribonucleasa, una ribozima). En algunas realizaciones, el motivo aumenta la estabilidad de un ácido nucleico dirigido a ácido nucleico. En algunas realizaciones, el motivo es un segmento de terminación de la transcripción (es decir, una secuencia de terminación de la transcripción). En algunas realizaciones, el motivo funciona en una célula eucariota. En algunas realizaciones, el motivo funciona en una célula procariota. En algunas realizaciones, el motivo funciona tanto en células eucariotas como procariotas.
Los ejemplos no limitantes de motivos adecuados incluyen: caperuza 5' (p. ej., una caperuza de 7-metilguanilato (m7 G)), una secuencia de riboconmutador (p. ej., para permitir la estabilidad regulada y/o la accesibilidad regulada por proteínas y complejos de proteínas), una secuencia que forma un dúplex de ARNbc (es decir, una horquilla), una secuencia que dirige el ARN a una ubicación subcelular (p. ej., núcleo, mitocondrias, cloroplastos y similares), una modificación o secuencia que proporciona el seguimiento (p. ej., conjugación directa con una molécula fluorescente, conjugación con un motivo que facilita la detección fluorescente, una secuencia que permite la detección fluorescente, etc.) y/o una modificación o secuencia que proporciona un sitio de unión para proteínas (p. ej., proteínas que actúan sobre el ADN, incluidos activadores transcripcionales, represores transcripcionales, ADN metiltransferasas, ADN desmetilasas, histona acetiltransferasas, histona desacetilasas y similares).
Secuencia espaciadora
La secuencia espaciadora se hibrida con una secuencia en un ácido nucleico objetivo de interés. El espaciador de un ácido nucleico dirigido a ácido nucleico interacciona con un ácido nucleico objetivo de una manera específica de secuencia mediante hibridación (es decir, apareamiento de bases). La secuencia de nucleótidos del espaciador varía, por lo tanto, dependiendo de la secuencia del ácido nucleico objetivo de interés.
En un sistema CRISPR/Cas del presente documento, la secuencia espaciadora está diseñada para hibridarse con un ácido nucleico objetivo que se encuentra en 5' de un PAM de la enzima Cas9 utilizada en el sistema. Cada enzima Cas9 tiene una secuencia PAM particular que reconoce en el ADN objetivo. Por ejemplo, S. pyogenes reconoce en un ácido nucleico objetivo un PAM que comprende la secuencia 5'-NRG-3', donde R comprende A o G, donde N es cualquier nucleótido y N está inmediatamente 3' de la secuencia de ácido nucleico objetivo a la que se dirige la secuencia espaciadora.
En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico objetivo comprende 20 nucleótidos. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo comprende menos de 20 nucleótidos. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo comprende al menos: 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30 o más nucleótidos. En algunas realizaciones, el ácido nucleico objetivo comprende como máximo: 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30 o más nucleótidos. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico objetivo comprende 20 bases inmediatamente 5' del primer nucleótido del PAM. Por ejemplo, en una secuencia que comprende 5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3' (SEQ ID NO: 161.198), el ácido nucleico objetivo comprende la secuencia que corresponde a los N, en donde N es cualquier nucleótido.
En algunas realizaciones, la secuencia espaciadora que hibrida con el ácido nucleico objetivo tiene una longitud de al menos aproximadamente 6 nt. La secuencia espaciadora puede ser de al menos 6 nt, al menos aproximadamente 10 nt, al menos aproximadamente 15 nt, al menos aproximadamente 18 nt, al menos aproximadamente 19 nt, al menos aproximadamente 20 nt, al menos aproximadamente 25 nt, al menos aproximadamente 30 nt, al menos aproximadamente 35 nt o al menos aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 45 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 35 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 19 nt, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 45 nt, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 35 nt, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 19 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 35 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 45 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 19 nt a aproximadamente 60 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 35 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 45 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 50 nt, o de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 60 nt. En algunas realizaciones, la secuencia espaciadora comprende 20 nucleótidos. En algunas realizaciones, el espaciador comprende 19 nucleótidos.
En algunas realizaciones, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia espaciadora y el ácido nucleico objetivo es al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o 100%. En algunas realizaciones, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia espaciadora y el ácido nucleico objetivo es como máximo aproximadamente 30%, como máximo aproximadamente 40%, como máximo aproximadamente 50%, como máximo aproximadamente 60%, como máximo aproximadamente 65%, como máximo aproximadamente 70%, como máximo aproximadamente 75%, como máximo aproximadamente 80%, como máximo aproximadamente 85%, como máximo aproximadamente 90%, como máximo aproximadamente 95%, como máximo aproximadamente 97%, como máximo aproximadamente 98%, como máximo aproximadamente 99% o 100%. En algunas realizaciones, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia espaciadora y el ácido nucleico objetivo es de 100% a lo largo de los seis nucleótidos 5' más contiguos de la secuencia objetivo de la cadena complementaria del ácido nucleico objetivo. En algunas realizaciones, el porcentaje de complementariedad entre la secuencia espaciadora y el ácido nucleico objetivo es de al menos 60% a lo largo de aproximadamente 20 nucleótidos contiguos.
En algunas realizaciones, una secuencia espaciadora se diseña o elige utilizando un programa informático. El programa informático puede utilizar variables tales como la temperatura de fusión prevista, formación de estructuras secundarias y temperatura de reasociación prevista, identidad de la secuencia, contexto genómico, accesibilidad a la cromatina,% de GC, frecuencia de aparición genómica (p. ej., de secuencias que son idénticas o similares pero varían en uno o más puntos como resultado de un apareamiento erróneo, inserción o deleción), estado de metilación, presencia de SNP y similares.
Secuencia de repetición de CRISPR mínima
En algunas realizaciones, una secuencia de repetición de CRISPR mínima es una secuencia con al menos: aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95% o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de repetición CRISPR de referencia (por ejemplo, ARNcr de S. pyogenes).
Una repetición de CRISPR mínima comprende nucleótidos que pueden hibridar con una secuencia de ARNtacr mínima en una célula. La repetición de CRISPR mínima y una secuencia de ARNtacr mínima forman un dúplex, es decir, una estructura de doble cadena de bases apareadas. Juntas, la repetición de CRISPR mínima y la secuencia de ARNtacr mínima se unen al polipéptido dirigido al sitio. Al menos una parte de la secuencia de repetición de CRISPR mínima se hibrida con la secuencia de ARNtacr mínima. En algunas realizaciones, al menos una parte de la secuencia de repetición de CRISPR mínima comprende al menos: aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95% o 100% de complementariedad con la secuencia de ARNtacr mínima. En algunas realizaciones, al menos una parte de la secuencia de repetición de CRISPR mínima comprende como máximo: aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95% o 100% de complementariedad con la secuencia de ARNtacr mínima.
La secuencia de repetición de CRISPR mínima puede tener una longitud de aproximadamente 7 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos. Por ejemplo, la longitud de la secuencia de repetición de CRISPR mínima es de aproximadamente 7 nucleótidos (nt) a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 15 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 20 nt o de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 15 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 100 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 30 nt o de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 25 nt. En algunas realizaciones, la secuencia de repetición de CRISPR mínima es de aproximadamente 9 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia de repetición de CRISPR mínima es de aproximadamente 12 nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, la secuencia de repetición de CRISPR mínima es al menos aproximadamente 60% idéntica a una secuencia de repetición de CRISPR mínima de referencia (p. ej., ARNcr de tipo natural de S. pyogenes) en un tramo de al menos 6, 7 u 8 nucleótidos contiguos. Por ejemplo, la secuencia de repetición de CRISPR mínima es al menos aproximadamente 65% idéntica, al menos aproximadamente 70% idéntica, al menos aproximadamente 75% idéntica, al menos aproximadamente 80% idéntica, al menos aproximadamente 85% idéntica, al menos aproximadamente 90% idéntica, al menos aproximadamente 95% idéntica, al menos aproximadamente 98% idéntica, al menos aproximadamente 99% idéntica o 100% idéntica a una secuencia de repetición de CRISPR mínima de referencia en un tramo de al menos 6, 7 u 8 nucleótidos contiguos.
Secuencia de ARNtacr mínima
En algunas realizaciones, una secuencia de ARNtacr mínima es una secuencia con al menos: aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95% o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de ARNtacr de referencia (p. ej., ARNtacr de tipo natural de S. pyogenes).
Una secuencia de ARNtracr mínima comprende nucleótidos que hibridan con una secuencia de repetición de CRISPR mínima en una célula. Una secuencia de ARNtracr mínima y una secuencia de repetición de CRISPR mínima forman un dúplex, es decir una estructura de doble cadena de bases apareadas. Juntas, la secuencia de ARNtacr mínima y la secuencia de repetición de CRISPR mínima se unen al polipéptido dirigido al sitio. Al menos una parte de la secuencia de ARNtacr mínima puede hibridar con la secuencia de repetición de CRISPR mínima. En algunas realizaciones, la secuencia de ARNtacr mínima es al menos: aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95% o 100% complementaria con la secuencia de repetición de CRISPR mínima.
La secuencia de ARNtacr mínima puede tener una longitud de aproximadamente 7 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos. Por ejemplo, la secuencia de ARNtacr mínima puede ser de aproximadamente 7 nucleótidos (nt) a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 7 nt a aproximadamente 15 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 20 nt o de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 15 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 100 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 30 nt o de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 25 nt de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia de ARNtacr mínima es de aproximadamente 9 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia de ARNtacr mínima es de aproximadamente 12 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el ARNtacr mínimo consiste en ARNtacr de 23-48 nt descrito en Jinek et al., véase antes.
En algunas realizaciones, la secuencia mínima de ARNtacr es al menos aproximadamente 60% idéntica a una secuencia de ARNtacr mínima de referencia (p. ej., ARNtacr de tipo natural de S. pyogenes) en un tramo de al menos: 6, 7 u 8 nucleótidos contiguos. Por ejemplo, la secuencia de ARNtracr mínima es al menos: aproximadamente 65% idéntica, aproximadamente 70% idéntica, aproximadamente 75% idéntica, aproximadamente 80% idéntica, aproximadamente 85% idéntica, aproximadamente 90% idéntica, aproximadamente 95% idéntica, aproximadamente 98% idéntica, aproximadamente 99% idéntica o 100% idéntica a una secuencia de ARNtracr mínima de referencia en un tramo de al menos: 6, 7 u 8 nucleótidos contiguos.
En algunas realizaciones, el dúplex entre el ARN de CRISPR mínimo y el ARNtracr mínimo comprende una doble hélice. En algunas realizaciones, el dúplex entre el ARN de CRISPR mínimo y el ARNtracr mínimo comprende al menos aproximadamente: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más nucleótidos. En algunas realizaciones, el dúplex entre el ARN de CRISPR mínimo y el ARNtracr mínimo comprende como máximo aproximadamente: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más nucleótidos.
En algunas realizaciones, el dúplex comprende un apareamiento erróneo (es decir, las dos cadenas del dúplex no son 100% complementarias). En algunas realizaciones, el dúplex comprende al menos aproximadamente: 1, 2, 3, 4 o 5 o apareamientos erróneos. En algunas realizaciones, el dúplex comprende como máximo aproximadamente: 1, 2, 3, 4 o 5 o apareamientos erróneos. En algunas realizaciones, el dúplex comprende no más de 2 apareamientos erróneos.
Protuberancias
En algunas realizaciones, hay una "protuberancia" en el dúplex entre el ARN de CRISPR mínimo y el ARNtracr mínimo. La protuberancia es una región desapareada de nucleótidos dentro del dúplex. En algunas realizaciones, la protuberancia contribuye a la unión del dúplex al polipéptido dirigido al sitio. Una protuberancia comprende, en un lado del dúplex, un 5'-XXXY-3' desapareado donde X es cualquier purina e Y comprende un nucleótido que puede formar un par de titubeo con un nucleótido en la cadena opuesta, y una región de nucleótidos desapareados en el otro lado del dúplex. El número de nucleótidos desapareados en los dos lados del dúplex puede ser diferente.
En un ejemplo, la protuberancia comprende una purina desapareada (p. ej., adenina) en la cadena de repetición de CRISPR mínima de la protuberancia. En algunas realizaciones, una protuberancia comprende un 5'-AAGY-3' desapareado de la cadena de la secuencia de ARNtacr mínima de la protuberancia, donde Y comprende un nucleótido que puede formar un emparejamiento de titubeo con un nucleótido en la cadena de repetición de CRISPR mínima.
En algunas realizaciones, una protuberancia en el lado de la repetición de CRISPR mínima del dúplex comprende al menos: 1, 2, 3, 4 o 5 o más nucleótidos desapareados. En algunas realizaciones, una protuberancia en el lado de la repetición de CRISPR mínima del dúplex comprende como máximo: 1,2, 3, 4 o 5 o más nucleótidos desapareados. En algunas realizaciones, una protuberancia en el lado de la repetición de CRISPR mínima del dúplex comprende 1 nucleótido desapareado.
En algunas realizaciones, una protuberancia en el lado de la secuencia de ARNtacr mínima del dúplex comprende al menos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más nucleótidos desapareados. En algunas realizaciones, una protuberancia en el lado de la secuencia de ARNtacr mínima del dúplex comprende como máximo: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más nucleótidos desapareados. En algunas realizaciones, una protuberancia en un segundo lado del dúplex (p. ej., el lado de la secuencia de ARNtacr mínima del dúplex) comprende 4 nucleótidos desapareados.
En algunas realizaciones, una protuberancia comprende al menos un apareamiento de titubeo. En algunas realizaciones, una protuberancia comprende como máximo un apareamiento de titubeo. En algunas realizaciones, una protuberancia comprende al menos un nucleótido de purina. En algunas realizaciones, una protuberancia comprende al menos 3 nucleótidos de purina. En algunas realizaciones, una secuencia de protuberancia comprende al menos 5 nucleótidos de purina. En algunas realizaciones, una secuencia de protuberancia comprende al menos un nucleótido de guanina. En algunas realizaciones, una secuencia de protuberancia comprende al menos un nucleótido de adenina.
Horquillas
En varias realizaciones, una o más horquillas se encuentran 3' respecto al ARNtracr mínimo en la secuencia de ARNtracr 3'.
En algunas realizaciones, la horquilla comienza al menos aproximadamente: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 o más nucleótidos 3' desde el último nucleótido apareado en el dúplex de repetición de CRISPR mínima y secuencia de ARNtacr mínima. En algunas realizaciones, la horquilla comienza como máximo aproximadamente: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más nucleótidos 3' del último nucleótido apareado en el dúplex de repetición de CRISPR mínima y secuencia de ARNtacr mínima.
En algunas realizaciones, una horquilla comprende al menos aproximadamente: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 o más nucleótidos consecutivos. En algunas realizaciones, una horquilla comprende como máximo aproximadamente: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o más nucleótidos consecutivos.
En algunas realizaciones, una horquilla comprende un dinucleótido CC (es decir, dos nucleótidos de citosina consecutivos).
En algunas realizaciones, una horquilla comprende nucleótidos en dúplex (p. ej., nucleótidos en una horquilla, hibridados entre sí). Por ejemplo, una horquilla comprende un dinucleótido CC que se hibrida con un dinucleótido GG en un dúplex de horquilla de la secuencia de ARNtacr 3'.
Una o más de las horquillas pueden interaccionar con las regiones de interacción del ARN guía de un polipéptido dirigido al sitio.
En algunas realizaciones, hay dos o más horquillas, y en algunas realizaciones hay tres o más horquillas.
Secuencia de ARNtacr 3'
En algunas realizaciones, una secuencia de ARNtacr 3' comprende una secuencia con al menos: aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95% o 100% de identidad de secuencia con una secuencia de ARNtacr de referencia (p. ej., un ARNtacr de S. pyogenes).
En algunas realizaciones, la secuencia de ARNtacr 3' tiene una longitud de aproximadamente 6 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos. Por ejemplo, la secuencia de ARNtacr 3' puede tener una longitud de aproximadamente 6 nucleótidos (nt) a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 6 nt a aproximadamente 15 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 20 nt o de aproximadamente 8 nt a aproximadamente 15 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 100 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 30 nt o de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 25 nt. En algunas realizaciones, la secuencia de ARNtacr 3' tiene una longitud de aproximadamente 14 nucleótidos.
En algunas realizaciones, la secuencia de ARNtacr 3' es al menos aproximadamente 60% idéntica a una secuencia de ARNtacr 3' de referencia (p. ej., secuencia de ARNtacr 3' de tipo natural de S. pyogenes) en un tramo de al menos: 6, 7 u 8 nucleótidos contiguos. Por ejemplo, la secuencia de ARNtacr 3' es al menos: aproximadamente 60% idéntica, aproximadamente 65% idéntica, aproximadamente 70% idéntica, aproximadamente 75% idéntica, aproximadamente 80% idéntica, aproximadamente 85% idéntica, aproximadamente 90% idéntica, aproximadamente 95% idéntica, aproximadamente 98% idéntica, aproximadamente 99% idéntica o 100% idéntica a una secuencia de ARNtacr 3' de referencia (p. ej., secuencia de ARNtacr 3' de tipo natural de S. pyogenes) en un tramo de al menos 6, 7 u 8 nucleótidos contiguos.
En algunas realizaciones, una secuencia de ARNtacr 3' comprende más de una región en dúplex (p. ej., horquilla, región hibridada). En algunas realizaciones, una secuencia de ARNtacr 3' comprende dos regiones en dúplex.
En algunas realizaciones, la secuencia de ARNtacr 3' comprende una estructura de tallo-bucle. En algunas realizaciones, una estructura de tallo-bucle en el ARNtacr 3') comprende al menos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o 20 o más nucleótidos. En algunas realizaciones, la estructura de tallo-bucle en el ARNtacr 3' comprende como máximo: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más nucleótidos. En algunas realizaciones, la estructura de tallobucle comprende un motivo funcional. Por ejemplo, la estructura de tallo-bucle puede comprender un aptámero, una ribozima, una horquilla que interacciona con proteínas, una matriz CRISPR, un intrón o un exón. En algunas realizaciones, la estructura de tallo-bucle comprende al menos aproximadamente: 1, 2, 3, 4 o 5 o más motivos funcionales. En algunas realizaciones, la estructura de tallo-bucle comprende como máximo aproximadamente: 1, 2, 3, 4 o 5 o más motivos funcionales.
En algunas realizaciones, la horquilla en la secuencia de ARNtacr 3' comprende un dominio P. En algunas realizaciones, el dominio P comprende una región de doble cadena en la horquilla.
Secuencia de extensión de ARNtacr
Se puede proporcionar una secuencia de extensión de ARNtacr ya sea que el ARNtacr esté o no en el contexto de guías de molécula única o guías de doble molécula. En algunas realizaciones, una secuencia de extensión de ARNtacr tiene una longitud de aproximadamente 1 nucleótido a aproximadamente 400 nucleótidos. En algunas realizaciones, una secuencia de extensión de ARNtacr tiene una longitud de más de: 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400 nucleótidos. En algunas realizaciones, una secuencia de extensión de ARNtacr tiene una longitud de aproximadamente 20 a aproximadamente 5000 o más nucleótidos. En algunas realizaciones, una secuencia de extensión de ARNtacr tiene una longitud de más de 1000 nucleótidos. En algunas realizaciones, una secuencia de extensión de ARNtacr tiene una longitud de menos de: 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400 o más nucleótidos. En algunas realizaciones, una secuencia de extensión de ARNtacr puede tener una longitud de menos de 1000 nucleótidos. En algunas realizaciones, una secuencia de extensión de ARNtacr comprende menos de 10 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, una secuencia de extensión de ARNtacr es de 10-30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, la secuencia de extensión de ARNtacr es de 30-70 nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, la secuencia de extensión de ARNtacr comprende un motivo funcional (p. ej., secuencia de control de estabilidad, ribozima, secuencia de unión a endorribonucleasa). En algunas realizaciones, un motivo funcional comprende un segmento de terminación de la transcripción (es decir, una secuencia de terminación de la transcripción). En algunas realizaciones, el motivo funcional tiene una longitud total de aproximadamente 10 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos, de aproximadamente 10 nucleótidos (nt) a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 30 nt a aproximadamente 40 nt , de aproximadamente 40 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 50 nt a aproximadamente 60 nt, de aproximadamente 60 nt a aproximadamente 70 nt, de aproximadamente 70 nt a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 80 nt a aproximadamente 90 nt, o de aproximadamente 90 nt a aproximadamente 100 nt, de aproximadamente 15 nucleótidos (nt) a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 30 nt o de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 25 nt. En algunas realizaciones, el motivo funcional funciona en una célula eucariota. En algunas realizaciones, el motivo funcional funciona en una célula procariota. En algunas realizaciones, el motivo funcional funciona tanto en células eucariotas como procariotas.
Los ejemplos no limitantes de motivos funcionales de extensión de ARNtacr adecuados incluyen: una cola poliadenilada en 3', una secuencia de riboconmutador (p. ej., para permitir la estabilidad regulada y/o la accesibilidad regulada por proteínas y complejos de proteínas), una secuencia que forma un dúplex de ARNbc (es decir, una horquilla), una secuencia que dirige el ARN a una ubicación subcelular (p. ej., núcleo, mitocondrias, cloroplastos y similares), una modificación o secuencia que proporciona el seguimiento (p. ej., conjugación directa a una molécula fluorescente, conjugación con un motivo que facilita la detección fluorescente, una secuencia que permite la detección fluorescente, etc.), y/o una modificación o secuencia que proporciona un sitio de unión para proteínas (p. ej., proteínas que actúan en el ADN, incluidos activadores transcripcionales, represores transcripcionales, ADN metiltransferasas, ADN desmetilasas, histona acetiltransferasas, histona desacetilasas y similares). En algunas realizaciones, una secuencia de extensión de ARNtacr comprende un sitio de unión a cebador, un índice molecular (p. ej., secuencia de código de barras). En algunas realizaciones, la secuencia de extensión de ARNtacr comprende uno o más marcadores de afinidad.
Secuencia enlazadora de guía de molécula única
En algunas realizaciones, la secuencia enlazadora de un ácido nucleico guía de molécula única tiene una longitud de aproximadamente 3 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos. En Jinek et al., véase antes, por ejemplo, se usó un "tetrabucle" simple de 4 nucleótidos (-GAAA-), Science, 337(6096):816-821 (2012). Un enlazador ilustrativo tiene una longitud de aproximadamente 3 nucleótidos (nt) a aproximadamente 90 nt, de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 70 nt, de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 60 nt, de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 20 nt o de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 10 nt. Por ejemplo, el enlazador puede tener una longitud de aproximadamente 3 nt a aproximadamente 5 nt, de aproximadamente 5 nt a aproximadamente 10 nt, de aproximadamente 10 nt a aproximadamente 15 nt, de aproximadamente 15 nt a aproximadamente 20 nt, de aproximadamente 20 nt a aproximadamente 25 nt, de aproximadamente 25 nt a aproximadamente 30 nt, de aproximadamente 30 nt a aproximadamente 35 nt, de aproximadamente 35 nt a aproximadamente 40 nt, de aproximadamente 40 nt a aproximadamente 50 nt, de aproximadamente 50 nt a aproximadamente 60 nt, de aproximadamente 60 nt a aproximadamente 70 nt, de aproximadamente 70 nt a aproximadamente 80 nt, de aproximadamente 80 nt a aproximadamente 90 nt, o de aproximadamente 90 nt a aproximadamente 100 nt. En algunas realizaciones, el enlazador de un ácido nucleico guía de molécula única tiene entre 4 y 40 nucleótidos. En algunas realizaciones, un enlazador tiene al menos aproximadamente: 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500 o 7000 o más nucleótidos. En algunas realizaciones, un enlazador tiene como máximo aproximadamente: 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500 o 7000 o más nucleótidos.
Los enlazadores pueden comprender cualquiera de una variedad de secuencias, aunque preferiblemente el enlazador no comprenderá secuencias que tengan regiones extensas de homología con otras porciones del ARN guía, lo que podría causar una unión intramolecular que podría interferir con otras regiones funcionales de la guía. En Jinek et al., véase antes, se usó una secuencia simple de 4 nucleótidos -GAAA-, Science, 337(6096):816-821 (2012), pero también se pueden usar muchas otras secuencias, incluidas secuencias más largas.
En algunas modalidades, la secuencia enlazadora comprende un motivo funcional. Por ejemplo, la secuencia enlazadora puede comprender un aptámero, una ribozima, una horquilla que interacciona con proteínas, una matriz CRISPR, un intrón y un exón. En algunas realizaciones, la secuencia enlazadora comprende al menos aproximadamente: 1,2, 3, 4 o 5 o más motivos funcionales. En algunas realizaciones, la secuencia enlazadora comprende como máximo aproximadamente: 1, 2, 3, 4 o 5 o más motivos funcionales.
Complejos de un ácido nucleico dirigido a ácido nucleico y un polipéptido dirigido al sitio
Un ácido nucleico dirigido a ácido nucleico interacciona con un polipéptido dirigido al sitio (p. ej., una nucleasa guiada por ácido nucleico tal como Cas9), formando así un complejo. El ácido nucleico dirigido a ácido nucleico guía al polipéptido dirigido al sitio a un ácido nucleico objetivo.
Optimización de codones
En algunas realizaciones, un polinucleótido que codifica un polipéptido dirigido al sitio se somete a optimización de codones de acuerdo con métodos convencionales en la técnica para la expresión en la célula que contiene el ADN objetivo de interés. Por ejemplo, si el ácido nucleico objetivo pretendido está en una célula humana, se contempla un polinucleótido de codones optimizados humano que codifica Cas9 para usar en la producción del polipéptido Cas9.
Componentes del sistema de codificación de ácidos nucleicos
En otro aspecto, la presente descripción proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ácido nucleico dirigido a ácido nucleico de la descripción, un polipéptido dirigido al sitio de la descripción y/o cualquier ácido nucleico o molécula proteica necesarios para llevar a cabo las realizaciones de los métodos de la descripción.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica un ácido nucleico dirigido a ácido nucleico de la descripción, un polipéptido dirigido al sitio de la descripción y/o cualquier ácido nucleico o molécula proteica necesaria para llevar a cabo las realizaciones de los métodos de la descripción comprende un vector (p. ej., un vector de expresión recombinante).
Como se usa en el presente documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN de doble cadena circular en el que se pueden ligar segmentos de ácido nucleico adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde se pueden ligar segmentos de ácido nucleico adicionales en el genoma viral. Determinados vectores pueden replicarse de forma autónoma en una célula hospedante en la que se introducen (p. ej., vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (p. ej., vectores de mamíferos no episomales) se integran en el genoma de una célula hospedante tras la introducción en la célula hospedante, y así se replican junto con el genoma del hospedante.
En algunas realizaciones, los vectores pueden dirigir la expresión de genes a los que están operativamente unidos. Se hace referencia a dichos vectores en el presente documento como "vectores de expresión recombinantes" o de forma más simple "vectores de expresión" que tienen funciones equivalentes.
La expresión "unido operativamente" pretende significar en el presente documento que la secuencia de nucleótidos de interés está unida a secuencia(s) reguladora(s) de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos. La expresión "secuencia reguladora" pretende incluir, por ejemplo, promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (p. ej., señales de poliadenilación). Tales secuencias reguladoras son bien conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospedantes y aquellas que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos sólo en ciertas células hospedantes (p. ej., secuencias reguladoras específicas de tejido). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula objetivo, el nivel de expresión deseado y similares.
Los vectores de expresión contemplados incluyen, pero no se limitan a, vectores virales basados en el virus vaccinia, poliovirus, adenovirus, virus adenoasociado, SV40, virus del herpes simple, virus de la inmunodeficiencia humana, un retrovirus (p. ej., virus de la leucemia murina, virus de la necrosis del bazo y vectores derivados de retrovirus tales como el virus del sarcoma de Rous, virus del sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviar, un lentivirus, el virus de la inmunodeficiencia humana, virus del sarcoma mieloproliferativo y virus de tumor mamario) y otros vectores recombinantes. Otros vectores contemplados para células objetivo eucariotas incluyen, pero no se limitan a, los vectores pXT1, pSG5, pSVK3, pBPV, pMSG y pSVLSV40 (Pharmacia). Pueden usarse otros vectores siempre que sean compatibles con la célula hospedante.
En algunas realizaciones, un vector comprende uno o más elementos de control de transcripción y/o traducción. Dependiendo del sistema de hospedante/vector utilizado, se puede usar en el vector de expresión cualquiera de una serie de elementos de control de la transcripción y traducción adecuados, incluidos promotores constitutivos e inducibles, elementos potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc.
Los ejemplos no limitativos de promotores eucariotas adecuados (es decir, promotores funcionales en una célula eucariota) incluyen los de citomegalovirus (CMV) inmediato temprano, timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV), SV40 temprano y tardío, repeticiones terminales largas (LTR) de retrovirus, promotor del factor 1 de elongación humano (EF1), una construcción híbrida que comprende el potenciador de citomegalovirus (CMV) fusionado con el promotor de beta-actina de pollo (CAG), promotor del virus de células madre murinas (MSCV), promotor del locus de fosfoglicerato quinasa-1 (PGK) y metalotioneína-I de ratón.
Para expresar ARN pequeños, incluidos los ARN guías utilizados en relación con la endonucleasa Cas, pueden ser ventajosos varios promotores, tales como los promotores de la ARN polimerasa III, incluidos, por ejemplo, U6 y H1. Se conocen en la técnica descripciones y parámetros para mejorar el uso de dichos promotores y se describen periódicamente información y enfoques adicionales; véase, p. ej., Ma, H. et al., Molecular Therapy -Nucleic Acids 3, e161 (2014) doi:10.1038/mtna.2014.12.
El vector de expresión también puede contener un sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción y un terminador de la transcripción. El vector de expresión también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión. El vector de expresión también puede incluir secuencias de nucleótidos que codifican marcadores no nativos (p. ej., marcador de histidina, marcador de hemaglutinina, proteína fluorescente verde, etc.) que se fusionan con el polipéptido dirigido al sitio, dando como resultado una proteína de fusión.
En algunas realizaciones, un promotor es un promotor inducible (p. ej., promotor de choque térmico, promotor regulado por tetraciclina, promotor regulado por esteroides, promotor regulado por metales, promotor regulado por receptor de estrógeno, etc.). En algunas realizaciones, un promotor es un promotor constitutivo (p. ej., promotor de CMV, promotor de UBC). En algunas realizaciones, el promotor es un promotor espacialmente restringido y/o temporalmente restringido (p. ej., un promotor específico de tejido, un promotor específico de tipo de célula, etc.).
En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica un ácido nucleico dirigido a ácido nucleico de la descripción y/o un polipéptido dirigido al sitio se empaquetan en o sobre la superficie de vehículos de administración para la administración a las células. Los vehículos de administración contemplados incluyen, pero no se limitan a, nanoesferas, liposomas, puntos cuánticos, nanopartículas, partículas de polietilenglicol, hidrogeles y micelas. Como se describe en la técnica, se puede usar una variedad de motivos de direccionamiento para mejorar la interacción preferencial de tales vehículos con los tipos o ubicaciones de células deseados.
La introducción de los complejos, polipéptidos y ácidos nucleicos de la descripción en las células puede ocurrir por infección viral o bacteriófaga, transfección, conjugación, fusión de protoplastos, lipofección, electroporación, nucleofección, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polietilenimina (PEI), transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por liposomas, tecnología de cañón de partículas, precipitación con fosfato de calcio, microinyección directa, administración de ácido nucleico mediada por nanopartículas y similares.
Kits
La presente descripción proporciona kits para llevar a cabo los métodos de la descripción. Un kit puede incluir uno o más de: un ácido nucleico dirigido a un ácido nucleico de la descripción, un polinucleótido que codifica un ácido nucleico dirigido a ácido nucleico, un polipéptido dirigido al sitio de la descripción, un polinucleótido que codifica un polipéptido dirigido al sitio y/o cualquier ácido nucleico o molécula proteica necesaria para llevar a cabo las realizaciones de los métodos de la descripción, o cualquier combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, un kit comprende: (1) un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un ácido nucleico dirigido a ácido nucleico, y (2 ) un vector que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido dirigido al sitio y (3) un reactivo para la reconstitución y/o dilución de los vectores.
En algunas realizaciones, un kit comprende: (1) un vector que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica un ácido nucleico dirigido a ácido nucleico, y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido dirigido al sitio y (2 ) un reactivo para la reconstitución y/o dilución del vector.
En algunas realizaciones de cualquiera de los kits anteriores, el kit comprende un ácido nucleico dirigido a ácido nucleico guía de molécula única. En algunas realizaciones de cualquiera de los kits anteriores, el kit comprende un ácido nucleico dirigido a ácido nucleico de doble molécula. En algunas realizaciones de cualquiera de los kits anteriores, el kit comprende dos o más guías de doble molécula o guías de molécula única. En algunas realizaciones, los kits comprenden un vector que puede codificar el ácido nucleico dirigido a ácido nucleico.
En algunas realizaciones de cualquiera de los kits anteriores, el kit puede comprender además un polinucleótido que se va a insertar para efectuar la modificación genética deseada.
Los componentes de un kit pueden estar en recipientes separados; o combinados en un solo recipiente.
En algunas realizaciones, un kit descrito anteriormente comprende además uno o más reactivos adicionales, donde dichos reactivos adicionales se seleccionan de: un tampón, un tampón para introducir el elemento de polipéptido o polinucleótido del kit en una célula, un tampón de lavado, un reactivo de control, un vector de control, un polinucleótido de ARN de control, un reactivo para la producción in vitro del polipéptido a partir de ADN, adaptadores para secuenciación y similares. Un tampón puede ser un tampón de estabilización, un tampón de reconstitución o un tampón de dilución o similar.
Además de los componentes mencionados anteriormente, un kit puede incluir además instrucciones para usar los componentes del kit para practicar los métodos. Las instrucciones para practicar los métodos generalmente se registran en un medio de registro adecuado. Por ejemplo, las instrucciones pueden estar impresas en un sustrato, tal como papel o plástico, etc. Las instrucciones pueden estar presentes en los kits como un prospecto, en el etiquetado del recipiente del kit o de los componentes del mismo (es decir, asociado con el embalaje o subembalaje), etc. Las instrucciones pueden estar presentes como un archivo de datos de almacenamiento electrónico presente en un medio de almacenamiento legible por ordenador adecuado, p. ej. CD-ROM, disquete, unidad flash, etc. En algunos casos, las instrucciones reales no están presentes en el kit, pero se pueden proporcionar medios para obtener las instrucciones de una fuente remota (p. ej., a través de Internet). Un ejemplo de esta realización es un kit que incluye una dirección web donde se pueden ver las instrucciones y/o desde donde se pueden descargar las instrucciones. Al igual que con las instrucciones, este medio para obtener las instrucciones se puede registrar en un sustrato adecuado.
Formulación del ARN guía
Los ARN guía de la invención se formulan con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como vehículos, disolventes, estabilizantes, adyuvantes, diluyentes, etc., dependiendo del modo particular de administración y forma farmacéutica. Las composiciones de ARN guía generalmente se formulan para lograr un pH fisiológicamente compatible, y varían de un pH de aproximadamente 3 a un pH de aproximadamente 11, de aproximadamente pH 3 a aproximadamente pH 7, dependiendo de la formulación y la vía de administración. En realizaciones alternativas, el pH se ajusta a un intervalo de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 8. En algunas realizaciones, las composiciones comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un compuesto como se describe en el presente documento, junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. Opcionalmente, las composiciones comprenden una combinación de los compuestos descritos en el presente documento, o pueden incluir un segundo ingrediente activo útil en el tratamiento o la prevención del crecimiento bacteriano (por ejemplo y sin limitación, agentes antibacterianos o antimicrobianos), o pueden incluir una combinación de reactivos.
Los excipientes adecuados incluyen, por ejemplo, moléculas vehículo que incluyen macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente, tales como proteínas, polisacáridos, poli(ácidos lácticos), poli(ácidos glicólicos), aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas virales inactivas. Otros excipientes de ejemplo incluyen antioxidantes (por ejemplo y sin limitación, ácido ascórbico), agentes quelantes (por ejemplo y sin limitación, EDTA), carbohidratos (por ejemplo y sin limitación, dextrina, hidroxialquilcelulosa e hidroxialquilmetilcelulosa), ácido esteárico, líquidos (por ejemplo y sin limitación, aceites, agua, solución salina, glicerol y etanol) agentes humectantes o emulsionantes, sustancias de tamponamiento del pH y similares.
Células modificadas genéticamente
Como se usa en el presente documento, la expresión "célula modificada genéticamente" se refiere a una célula que comprende al menos una modificación genética introducida mediante la edición del genoma (p. ej., usando el sistema CRISPR/Cas). En algunas realizaciones del presente documento, la célula modificada genéticamente es una célula progenitora modificada genéticamente. En el presente documento se contempla una célula modificada genéticamente que comprende un ácido nucleico exógeno que se dirige a ácido nucleico y/o un ácido nucleico exógeno que codifica un ácido nucleico dirigido a ácido nucleico.
En relación con la desrepresión de la expresión de globina y, la frase "aumento de los niveles de globina y en una célula" o "mayor expresión de globina y en una célula" indica que la globina y en una célula o la población de células es al menos 2 % mayor en la célula o población de células sometidas a la edición del genoma que en una población de control comparable, en la que no ha habido edición del genoma. En algunas realizaciones, el aumento en la expresión de la globina y es de al menos aproximadamente 2 %, al menos aproximadamente 3%, al menos aproximadamente 4%, al menos aproximadamente 5%, al menos aproximadamente 6 %, al menos aproximadamente 7%, al menos aproximadamente 8 %, al menos aproximadamente 9%, al menos aproximadamente 1 0 %, al menos aproximadamente 1 1 %, al menos aproximadamente 1 2 %, al menos aproximadamente 13%, al menos aproximadamente 14%, al menos aproximadamente 15%, al menos aproximadamente 16%, al menos aproximadamente 17%, al menos aproximadamente 18%, al menos aproximadamente 19%, al menos aproximadamente 2 0 %, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 35%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 45%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 55%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 99%, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 6 veces, al menos aproximadamente 7 veces, al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 9 veces, al menos aproximadamente 10 veces, al menos aproximadamente 15 veces, al menos aproximadamente 20 veces, al menos aproximadamente 25 veces, al menos aproximadamente 30 veces, al menos aproximadamente 35 veces, al menos aproximadamente 40 veces, al menos aproximadamente 45 veces, al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 100 veces o más que una población tratada de control comparable. La expresión "población tratada de control" se usa en el presente documento para describir una población de células que se ha tratado con idénticos medios, inducción viral, secuencias de ácido nucleico, temperatura, confluencia, tamaño de matraz, pH, etc., con la excepción de la adición de los componentes de edición del genoma. Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para medir un aumento en la expresión de globina y, por ejemplo, análisis de transferencia Western de globina y o cuantificación de ARNm de globina y.
La expresión "célula aislada" como se usa en el presente documento, se refiere a una célula que se ha extraído de un organismo en el que se encontraba originalmente o un descendiente de dicha célula. Opcionalmente, la célula se ha cultivado in vitro, p. ej., en condiciones definidas o en presencia de otras células. Opcionalmente, luego se introduce la célula en un segundo organismo o se reintroduce en el organismo del que se aisló (o la célula de la que desciende).
La expresión "población aislada" con respecto a una población aislada de células como se usa en el presente documento se refiere a una población de células que se ha extraído y separado de una población de células mezclada o heterogénea. En algunas modalidades, una población aislada es una población sustancialmente pura de células en comparación con la población heterogénea de la que se aislaron las células o se enriquecieron. En algunas realizaciones, la población aislada es una población aislada de células progenitoras hematopoyéticas humanas, p. ej., una población sustancialmente pura de células progenitoras hematopoyéticas humanas en comparación con una población heterogénea de células que comprende células progenitoras hematopoyéticas humanas y células a partir de las cuales se derivaron las células progenitoras hematopoyéticas humanas.
La expresión "sustancialmente mejorada", con respecto a una población de células particular, se refiere a una población de células en la que la aparición de un tipo particular de célula aumenta en relación con los niveles preexistentes o de referencia, en al menos 2 veces, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6 , al menos 7, al menos 8 , al menos 9, al menos 10, al menos 20, al menos 50, al menos al menos 100, al menos 400, al menos 1000, al menos 5000, al menos 20000, al menos 100000 o más veces dependiendo, p. ej., de los niveles deseados de tales células para mejorar una hemoglobinopatía.
La expresión "sustancialmente enriquecido" con respecto a una población de células particular, se refiere a una población de células que es al menos: aproximadamente 1 0 %, aproximadamente 2 0 %, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70% o más con respecto a las células que componen una población de células totales.
Las expresiones "sustancialmente enriquecida" o "sustancialmente pura" con respecto a una población de células particular, se refiere a una población de células que es al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95% pura, con respecto a las células que componen la población de células totales. Es decir, las expresiones "sustancialmente pura" o "esencialmente purificada", con respecto a una población de células progenitoras hematopoyéticas, se refiere a una población de células que contiene menos de: aproximadamente 20%, aproximadamente 15%, aproximadamente 10%, aproximadamente 9%, aproximadamente 8 %, aproximadamente 7%, aproximadamente 6 %, aproximadamente 5%, aproximadamente 4%, aproximadamente 3%, aproximadamente 2 %, aproximadamente 1 %, o menos de 1 %, de células que no son células progenitoras hematopoyéticas según se define por los términos del presente documento.
Vehículos farmacéuticamente aceptables
Los métodos de administración de células progenitoras a un sujeto contemplados en el presente documento implican el uso de composiciones terapéuticas que comprenden células progenitoras.
Las composiciones terapéuticas contienen un vehículo fisiológicamente tolerable junto con la composición celular y, opcionalmente, al menos un agente bioactivo adicional como se describe en el presente documento, disuelto o disperso en el mismo como ingrediente activo. En algunas realizaciones, la composición terapéutica no es sustancialmente inmunogénica cuando se administra a un paciente mamífero o humano con fines terapéuticos, a menos que así se desee.
En general, las células progenitoras descritas en el presente documento se administran como una suspensión con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un experto en la técnica reconocerá que un vehículo farmacéuticamente aceptable para usar en una composición de células no incluirá tampones, compuestos, agentes de crioconservación, conservantes u otros agentes en cantidades que interfieran sustancialmente con la viabilidad de las células que se van a administrar al sujeto. Una formulación que comprende células puede incluir, p. ej., tampones osmóticos que permiten mantener la integridad de la membrana celular y, opcionalmente, nutrientes para mantener la viabilidad celular o mejorar el injerto tras la administración. Dichas formulaciones y suspensiones son conocidas por los expertos en la técnica y/o pueden adaptarse para usar con las células progenitoras como se describe en el presente documento usando experimentación de rutina.
Una composición celular también se puede emulsionar o presentar como una composición de liposomas, con la condición de que el procedimiento de emulsificación no afecte negativamente a la viabilidad celular. Las células y cualquier otro ingrediente activo pueden mezclarse con excipientes que sean farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo y en cantidades adecuadas para usar en los métodos terapéuticos descritos en el presente documento.
Los agentes adicionales incluidos en una composición celular como se describe en el presente documento pueden incluir sales farmacéuticamente aceptables de los componentes de la misma. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del polipéptido) que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2 -etilaminoetanol, histidina, procaína y similares.
Los vehículos fisiológicamente tolerables son bien conocidos en la técnica. Ejemplos de vehículos líquidos son las soluciones acuosas estériles que no contienen materiales además de los ingredientes activos y agua, o contienen un tampón tal como fosfato de sodio a valor de pH fisiológico, solución salina fisiológica o ambos, tal como solución salina tamponada de fosfato. Además también, los vehículos acuosos pueden contener más de una sal de tampón, así como sales tales como cloruros de sodio y de potasio, dextrosa, polietilenglicol y otros solutos. Las composiciones líquidas también pueden contener fases líquidas además de agua y excluyendo agua. Ejemplos de dichas fases líquidas adicionales son glicerina, aceites vegetales tales como aceite de semilla de algodón y emulsiones de agua-aceite. La cantidad de un compuesto activo utilizado en las composiciones celulares como se describe en el presente documento que es eficaz en el tratamiento de un trastorno o afección particular dependerá de la naturaleza del trastorno o afección y se puede determinar mediante técnicas clínicas convencionales.
Administración y eficacia
Como se usa en el presente documento, los términos "administrar", "introducir" y "trasplantar" se usan indistintamente en el contexto de poner células, p. ej., células progenitoras, como se describe en el presente documento en un sujeto, por un método o vía que dé como resultado la localización al menos parcial de las células introducidas en un sitio deseado, tal como un sitio de lesión o reparación, de modo que se produzcan el o los efectos deseados. Las células p. ej., células progenitoras, o su progenie diferenciada, pueden administrarse por cualquier vía apropiada que dé como resultado el suministro a un lugar deseado en el sujeto donde al menos una parte de las células implantadas o componentes de las células permanezcan viables. El período de viabilidad de las células después de la administración a un sujeto puede ser tan corto como de unas pocas horas, p. ej., de veinticuatro horas a unos días, hasta tan largo como de varios años, es decir, injerto a largo plazo. Por ejemplo, en algunas realizaciones de los aspectos descritos en el presente documento, se administra una cantidad eficaz de células progenitoras hematopoyéticas por una vía de administración sistémica, tal como una vía intraperitoneal o intravenosa.
Los términos "individuo", "sujeto", "hospedante" y "paciente" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a cualquier sujeto para el que se desea diagnóstico, tratamiento o terapia. En algunas modalidades, el sujeto es un mamífero. En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano.
Cuando se proporcionan de forma profiláctica, las células progenitoras descritas en el presente documento se pueden administrar a un sujeto antes de cualquier síntoma de una hemoglobinopatía, p. ej., antes del inicio del cambio de globina y fetal a predominantemente globina p y/o antes del desarrollo de anemia significativa u otro síntoma asociado con la hemoglobinopatía. Por consiguiente, la administración profiláctica de una población de células progenitoras hematopoyéticas sirve para prevenir una hemoglobinopatía, como se describe en el presente documento.
Cuando se proporcionan de forma terapéutica, las células progenitoras hematopoyéticas se proporcionan al (o después del) inicio de un síntoma o indicación de una hemoglobinopatía, p. ej., tras el inicio de la anemia drepanocítica u otra SCD.
En algunas realizaciones de los aspectos descritos en el presente documento, la población de células progenitoras hematopoyéticas que se administra de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento comprende células progenitoras hematopoyéticas alogénicas obtenidas de uno o más donantes. Como se usa en el presente documento, "alogénico" se refiere a una célula progenitora hematopoyética o muestras biológicas que comprenden células progenitoras hematopoyéticas obtenidas de uno o más donantes diferentes de la misma especie, donde los genes en uno o más locus no son idénticos. Por ejemplo, una población de células progenitoras hematopoyéticas que se administra a un sujeto puede derivar de la sangre del cordón umbilical obtenida de uno o más sujetos donantes no emparentados, o de uno o más hermanos no idénticos. En algunas realizaciones, pueden usarse poblaciones de células progenitoras hematopoyéticas singénicas, tales como las obtenidas de animales genéticamente idénticos o de gemelos idénticos. En otras realizaciones de este aspecto, las células progenitoras hematopoyéticas son células autólogas; es decir, las células progenitoras hematopoyéticas se obtienen o aíslan de un sujeto y se administran al mismo sujeto, es decir, el donante y el receptor son los mismos.
En una realización, la expresión "cantidad eficaz", como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad de una población de células progenitoras o su progenie necesaria para prevenir o aliviar al menos uno o más signos o síntomas de una hemoglobinopatía, y se refiere a una cantidad suficiente de una composición para proporcionar el efecto deseado, p. ej., tratar a un sujeto que tiene una hemoglobinopatía. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" por lo tanto se refiere a una cantidad de células progenitoras o una composición que comprende células progenitoras que es suficiente para promover un efecto particular cuando se administra a un sujeto típico, tal como uno que tiene o está en riesgo de tener una hemoglobinopatía. Una cantidad eficaz tal como se usa en el presente documento también incluiría una cantidad suficiente para prevenir o retrasar el desarrollo de un síntoma de la enfermedad, alterar el curso de un síntoma de la enfermedad (por ejemplo, pero no limitado a, retardar la progresión de un síntoma de la enfermedad), o revertir un síntoma de la enfermedad. Se entiende que, para cualquier caso dado, un experto en la técnica puede determinar una "cantidad eficaz" adecuada usando experimentación de rutina.
Para usar en los diversos aspectos descritos en el presente documento, una cantidad eficaz de células progenitoras comprende 102 células progenitoras, al menos 5 X 102 células progenitoras, al menos 103 células progenitoras, al menos 5 X 103 células progenitoras, al menos 104 células progenitoras, al menos 5 X 104 células progenitoras, al menos 105 células progenitoras, al menos 2 X 105 células progenitoras, al menos 3 X 105 células progenitoras, al menos 4 X 105 células progenitoras, al menos 5 X 105 células progenitoras, al menos 6 X 105 células progenitoras, al menos 7 X 105 células progenitoras, al menos 8 X 105 células progenitoras, al menos 9 X 105 células progenitoras, al menos 1 X 106 células progenitoras, al menos 2 X 106 células progenitoras, al menos 3 X 106 células progenitoras, al menos 4 X 106 células progenitoras, al menos 5 X 106 células progenitoras, al menos 6 X 106 células progenitoras, al menos 7 X 106 células progenitoras, al menos 8 X 106 células progenitoras, al menos 9 X 106 células progenitoras, o múltiplos de las mismas. Las células progenitoras se derivan de uno o más donantes, o se obtienen de una fuente autóloga. En algunas realizaciones de los aspectos descritos en el presente documento, las células progenitoras se expanden en cultivo antes de la administración a un sujeto que lo necesite.
Como se comentó anteriormente, incluso los aumentos modestos e incrementales en los niveles de HbF expresados en células de pacientes que tienen una hemoglobinopatía pueden ser beneficiosos para mejorar uno o más síntomas de la enfermedad, para aumentar la supervivencia a largo plazo y/o para reducir los efectos secundarios asociados con otros tratamientos. Tras la administración de dichas células a pacientes humanos, la presencia de RBC que producen niveles mayores de HbF es beneficiosa. En algunas realizaciones, el tratamiento eficaz de un sujeto da lugar a al menos aproximadamente un 9% de HbF con respecto a la Hb total en el sujeto tratado. En algunas realizaciones, la HbF será al menos aproximadamente 14% de la Hb total. En algunas realizaciones, la HbF será al menos aproximadamente de 20% a 30% de la Hb total. De manera similar, la introducción de subpoblaciones de células incluso relativamente limitadas que tienen niveles significativamente elevados de HbF (denominadas "células F") puede ser beneficiosa en varios pacientes, ya que en algunas situaciones las células normalizadas tendrán una ventaja selectiva en relación con las células enfermas. Sin embargo, incluso los niveles modestos de RBC en la circulación con niveles elevados de HbF pueden ser beneficiosos para mejorar uno o más aspectos de la hemoglobinopatía en los pacientes. En algunas realizaciones, aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90% o más de los RBC en pacientes a los que se les administran dichas células producen niveles mayores de HbF como se describe en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, "administrado" se refiere a la administración de una composición de células progenitoras como se describe en el presente documento a un sujeto por un método o vía que da como resultado la localización al menos parcial de la composición celular en un sitio deseado. Una composición de células se puede administrar por cualquier vía apropiada que dé como resultado un tratamiento efectivo en el sujeto, es decir, que la administración de como resultado el suministro en un lugar deseado en el sujeto donde se administre al menos una porción de la composición, es decir, al menos 1 * 10 4 células en el sitio deseado durante un período de tiempo. Los modos de administración incluyen inyección, infusión, instilación o ingestión. “ Inyección” incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intraventricular, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, intracerebroespinal e intraesternal. En algunas realizaciones, la vía es intravenosa. Para el suministro de células, generalmente se prefiere la administración por inyección o infusión.
En una realización, las células como se describe en el presente documento se administran sistémicamente. Las frases “administración sistémica”, “administrado de manera sistémica”, “administración periférica” y “administrado de manera periférica”, como se usa en el presente documento, se refiere a la administración de una población de células progenitoras de forma que no sea directamente en un sitio, tejido u órgano objetivo, de modo que, en su lugar, entre al sistema circulatorio del sujeto y, por lo tanto, esté sujeto al metabolismo y otros procesos similares.
El médico experto puede determinar la eficacia de un tratamiento que comprende una composición como se describe en el presente documento para el tratamiento de una hemoglobinopatía. Sin embargo, un tratamiento se considera "tratamiento efectivo", como se usa la expresión en el presente documento, si alguno o todos los signos o síntomas de, solo como un ejemplo, los niveles de hemoglobina fetal se alteran de manera beneficiosa (p. ej., aumentan en al menos 1 0 %), progresan o mejoran otros síntomas o marcadores de enfermedad clínicamente aceptados. La eficacia también se puede medir por el hecho de que un individuo no empeore evaluado por la hospitalización o la necesidad de intervenciones médicas (p. ej., reducción de la dependencia de transfusiones, o la progresión de la enfermedad se detiene o al menos se ralentiza). Los métodos para medir estos indicadores son conocidos por los expertos en la técnica y/o se describen en el presente documento. El tratamiento incluye cualquier tratamiento de una enfermedad en un individuo o un animal (algunos ejemplos no limitantes incluyen un ser humano o un mamífero) e incluye: (1 ) inhibir la enfermedad, p. ej., detener o retardar la progresión de los síntomas; o (2 ) aliviar la enfermedad, p. ej., provocando la regresión de los síntomas; y (3) prevenir o reducir la probabilidad del desarrollo de síntomas.
El tratamiento mejora uno o más síntomas asociados con una p-hemoglobinopatía aumentando la cantidad de hemoglobina fetal en el individuo. Los síntomas y signos típicamente asociados con una hemoglobinopatía incluyen, por ejemplo, anemia, hipoxia tisular, disfunción orgánica, valores anormales de hematocrito, eritropoyesis ineficaz, recuento anormal de reticulocitos (eritrocitos), carga anormal de hierro, presencia de sideroblastos anulares, esplenomegalia, hepatomegalia, flujo sanguíneo periférico deteriorado, disnea, aumento de la hemólisis, ictericia, crisis de dolor anémico, síndrome torácico agudo, secuestro esplénico, priapismo, accidente cerebrovascular, síndrome mano-pie y dolor tal como angina de pecho.
Tal como se utilizan en el presente documento el término "comprende" o "comprender" se usan en referencia a composiciones, métodos y componente(s) respectivos de los mismos, que son esenciales para la invención, aunque están abiertos a la inclusión de elementos no especificados, ya sean esenciales o no.
Tal como se utiliza en el presente documento la expresión "consiste esencialmente en" se refiere a los elementos requeridos para una realización dada. El término permite la presencia de elementos adicionales que no afectan en forma material la o las características básicas y novedosas o funcionales de dicha modalidad de la invención.
La expresión "que consiste en" se refiere a composiciones, métodos y componentes respectivos de los mismos como se describen en el presente documento, que son exclusivos de cualquier elemento no indicado en la descripción de la realización.
Tal como se usan en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “ la” incluyen referencias plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Ciertos valores numéricos presentados en el presente documento están precedidos por el término "aproximadamente". El término "aproximadamente" se utiliza en el presente documento para dar apoyo literal al valor numérico que va precedido del término "aproximadamente", así como un valor numérico que es aproximadamente el valor numérico, es decir, el valor numérico no mencionado que se aproxima puede ser un número que, en el contexto en que se presenta, es el equivalente sustancial del valor numérico específicamente mencionado.
Cuando se presenta un intervalo de valores numéricos en el presente documento, está contemplado que cada valor intermedio entre el límite inferior y superior del intervalo, los valores que son los límites superior e inferior del intervalo, y todo los valores expuestos con el intervalo están abarcados dentro de la descripción. Todos los posibles subintervalos dentro de los límites inferior y superior del intervalo también están contemplados en la descripción.
Ejemplos
La invención se entenderá de forma más completa por referencia a los siguientes ejemplos, que proporcionan realizaciones de la invención ilustrativas no limitantes.
Los ejemplos describen el uso del sistema CRISPR/Cas como una técnica ilustrativa de edición del genoma para crear deleciones genómicas terapéuticas definidas o sustituciones de una sola base, denominadas colectivamente "modificaciones genómicas" en el presente documento, en el grupo de genes de la globina p que conducen a la regulación por aumento de la expresión de HbF. Las modificaciones terapéuticas de ejemplo son genética y/o funcionalmente similares o idénticas a las observadas en células hematopoyéticas de individuos con hemoglobinopatía tal como de células falciformes o p-talasemia en las que las modificaciones desreprimen o conducen a la reexpresión de globina y y por lo tanto la hemoglobina fetal. La introducción de las modificaciones terapéuticas definidas representa una nueva estrategia terapéutica para la mejora potencial de las hemoglobinopatías como se describe e ilustra en el presente documento.
Ejemplo 1
Creación de deleciones próximas a Chr11:5224779-5237723
En este ejemplo, se ilustra el uso de los métodos descritos en el presente documento para generar ciertas deleciones que son próximas a la región de Chr11: 5224779-5237723. Se han observado deleciones en esta región en pacientes humanos designados como HPFH-5 (o "HPFH siciliano") descritos en Camaschella et al., Haematologica, 75 (Suppl 5): 26-30 (1990). La variante de deleción de 13 kb en el locus de la globina p humana observada en los pacientes humanos se asoció con el fenotipo clínico de persistencia hereditaria de la hemoglobina fetal (HPFH), en la que la presencia de hemoglobina fetal puede complementar el defecto en la síntesis o función de la hemoglobina adulta y mejorar la enfermedad, en la anemia drepanocítica o p-talasemia.
En este ejemplo, se ilustra que el sistema CRISPR/Cas puede usarse para crear deleciones que se asemejan funcionalmente a las asociadas con los alelos de HPFH naturales tales como HPFH-5. Los ARN guías se diseñaron para eliminar el alelo patógeno de drepanocitos eliminando los genes de globina 8 y p, así como una parte sustancial de la región 3' del gen de globina y. La figura 1A muestra el locus de la globina humana con recuadros vacíos que resaltan los sitios objetivo 5' y 3' de HPFH-5. La deleción de 13 kb comienza a 3 kb 5' del gen ^p1 y termina a 1,7 kb 3' del final del gen p (690 pb secuencia abajo de la señal poliA del gen p). Véase la Figura 1B. Además, se diseñaron ARN guías para sitios objetivo a lo largo de la región de 13 kb con el fin de determinar el potencial terapéutico de deleciones más pequeñas dentro de este locus.
Métodos experimentales
Selección de sitios objetivo
Se exploró en las regiones del grupo de genes de la globina p los sitios objetivo, incluidas las regiones 5' y 3' asociadas con la persistencia hereditaria de hemoglobina fetal-5 (HPFH-5). Se exploraron en cada área los motivos adyacentes de protoespaciador (PAM) que tuvieran la secuencia NGG y/o NRG. Se identificaron las cadenas guías correspondientes a los PAM.
Para este ejemplo ilustrativo, las guías candidatas se cribaron y seleccionaron en un procedimiento de múltiples etapas que implicaba tanto la unión teórica como la actividad evaluada experimentalmente. A modo de ilustración, las guías candidatas que tienen secuencias que coinciden con un sitio particular en el objetivo con el PAM adyacente pueden evaluarse para analizar su potencial para escindir en sitios fuera del objetivo que tienen secuencias similares, utilizando una o más de una variedad de herramientas bioinformáticas disponibles para evaluar la unión fuera del objetivo, como se describe e ilustra con más detalle a continuación, con el fin de evaluar la probabilidad de efectos en posiciones cromosómicas distintas de las previstas. Los candidatos que se predice que tienen un potencial relativamente menor para la actividad fuera del objetivo pueden evaluarse entonces experimentalmente para medir su actividad en el objetivo y luego las actividades fuera del objetivo en varios sitios. Las guías preferidas tienen actividad en el objetivo suficientemente alta para lograr los niveles deseados de edición de genes en el locus seleccionado y actividad fuera del objetivo relativamente más baja para reducir la probabilidad de alteraciones en otros locus cromosómicos. La proporción de actividad en el objetivo y fuera del objetivo a menudo se denomina "especificidad" de una guía.
Para el cribado inicial de actividades fuera del objetivo previstas, hay una serie de herramientas bioinformáticas conocidas y disponibles públicamente que se pueden usar para predecir los sitios fuera del objetivo más probables; y dado que la unión a los sitios objetivo en el sistema de nucleasa Crispr Cas9 está promovida por el apareamiento de bases de Watson-Crick entre secuencias complementarias, el grado de disimilitud (y, por lo tanto, el menor potencial para la unión fuera del objetivo) está esencialmente relacionado con las diferencias de secuencia primaria: apareamientos erróneos y protuberancias, es decir, bases que se cambian a una base no complementaria, e inserciones o deleciones de bases en el sitio potencial fuera del objetivo en relación con el sitio objetivo. Una herramienta bioinformática de ejemplo llamada COSMID (CRISPR Off-target Sites with Mismatches, Insertions and Deletions) (disponible en la web en crispr.bme.gatech.edu) compila dichas similitudes.
Clonación de CRISPR
Los plásmidos que expresan la proteína Cas9 y el ARN de cadena guía se ensamblaron usando un vector que expresaba Cas9 humanizada de S. pyogenes y el ARN guía de molécula única. Se obtuvieron oligonucleótidos complementarios correspondientes a la cadena guía (Operon o IDT), quinasa, se reasociaron y se clonaron en el vector. Los ARN guía se ensayaron en células
Las tres primeras secuencias espaciadoras se dirigen al límite 5' de la región que se va a eliminar, y las tres últimas se dirigen al límite 3' de la región que se va a eliminar.
Transfección de células
Se cultivaron células K-562 en medio RPMI suplementado con FBS al 10% y L-glutamina 2 mM nueva y se sometieron a pases a medida que se acercaban a una confluencia de 1 x 105/ml. Se usó un Amaxa Nucleofector 4D para transfectar 200.000 células K-562 con 1 |jg de vector que expresaba HPFH5 dirigido a los ARNgu y 1000 ng de plásmido que expresaba Cas9 siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genómico se recolectó después de 3 días usando la solución de extracción de ADN QuickExtract (Epicentre, Madison, WI), como se describe.
Se sembraron células Hek293T 24 horas antes de la transfección en placas de 24 pocillos a una densidad de 80.000 células por pocillo y se cultivaron en medio DMEM suplementado con FBS al 10% y L-glutamina 2 mM nueva. Las células se transfectaron con 1000 ng de plásmido que expresa Cas9 y ARNg usando 2 j l de Lipofectamine 2000 (Life technologies), según las instrucciones del fabricante. El ADN genómico se recogió 72 horas después de la transfección utilizando la solución de extracción de ADN QuickExtract (Epicenter).
Detección de mutaciones dentro y fuera del objetivo por secuenciación
Para secuenciar los sitios en el objetivo y los sitios fuera del objetivo putativos, se identificaron los cebadores de amplificación apropiados y las reacciones se prepararon con estos cebadores usando el ADN genómico recogido usando la solución de extracción de ADN QuickExtract (Epicentre) de las células tres días después de la transfección. Los cebadores de amplificación contienen la parte específica del gen flanqueada por adaptadores. El extremo 5' del cebador directo incluye un sitio de unión al cebador directo modificado (lectura1). El extremo 5' del cebador inverso contiene un sitio combinado de unión al cebador de código de barras e inverso modificado (lectura2), en orientación opuesta. Las reacciones de PCR individuales se validaron por separación en geles de agarosa, luego se purificaron y se volvieron a amplificar. Los cebadores directos de la segunda ronda contienen la secuencia P5 de IIIumina, seguida de una proporción del sitio de unión del cebador directo modificado (lectura1). Los cebadores inversos de la segunda ronda contienen la secuencia P7 de Illumina (en el extremo 5'), seguida del código de barras de 6 bases y el sitio combinado de unión del cebador inverso modificado (lectura2) y de código de barras. Las amplificaciones de la segunda ronda también se verificaron en geles de agarosa, luego se purificaron y cuantificaron usando un espectrofotómetro NanoDrop. Los productos de amplificación se agruparon para igualar la concentración y luego se enviaron al Emory Integrated Genomic Core para la preparación y secuenciación de bibliotecas en una máquina de IIIumina Miseq.
Las lecturas de secuenciación se ordenaron por código de barras y luego se alinearon con las secuencias de referencia suministradas por la bioinformática para cada producto. Se detectaron las tasas de inserción y deleción en las lecturas de secuenciación alineadas en la región de los sitios de cortes putativos utilizando el software descrito anteriormente; véase, p. ej., Lin et al., Nucleic Acids Res., 42: 7473-7485 (2014). Los niveles de inserciones y deleciones detectados en esta ventana se compararon luego con el nivel visto en el mismo lugar en el ADN genómico aislado de células transfectadas de forma simulada para minimizar los efectos de los artefactos de secuenciación.
Ensayos de detección de mutaciones
Las actividades de escisión dentro y fuera del objetivo de combinaciones de Cas9 y ARN guía se midieron usando las tasas de mutación resultantes de la reparación imperfecta de roturas de doble cadena por NHEJ.
Los locus en el objetivo se amplificaron utilizando ADN polimerasa Taq de alta fidelidad AccuPrime (Life Technologies, Carlsbad, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante durante 40 ciclos (94°C, 30 s; 52-60°C, 30 s; 6 8 °C , 60 s) en reacciones de 50 j l que contienen 1 j l del lisado celular y 1 j l de cada cebador de amplificación 10 jiM. Se realizaron ensayos de detección de mutaciones T7EI, según el protocolo del fabricante [Reyon et al., Nat. Biotechnol., 30: 460-465 (2012)], con las digestiones separadas en geles de agarosa al 2% y cuantificadas utilizando ImageJ [Guschin et al., Methods Mol. Biol., 649: 247-256 (2010)]. Los ensayos determinan el porcentaje de inserciones/deleciones ("indels") en la población total de células.
Detección de inversiones y deleciones por PCR de punto final
Todas las reacciones de PCR de punto final se realizaron usando la ADN polimerasa Taq de alta fidelidad AccuPrime (Life Technologies) siguiendo las instrucciones del fabricante durante 40 ciclos (94°C, 30 s; 60°C, 30 s; 6 8 °C, 45 s) en una reacción de 50 jil que contiene 1 jil del lisado celular y 1 jil de cada cebador de amplificación de la región objetivo 10 jiM.
Cuantificación de deleciones usando PCR digital en gotas (ddPCR)
El nivel de extremos cromosómicos unidos, que indica las deleciones cromosómicas previstas, se cuantificó usando la máquina de PCR digital en gotas (ddPCR) QX200 BioRad (Hercules, CA). Las máquinas permiten la cuantificación absoluta al romper las reacciones de PCR individuales en ~20.000 gotitas que se analizan individualmente por PCR de punto final utilizando un reactivo similar al verde Cyber y un lector que puede diferenciar de manera efectiva entre gotitas PCR positivas y PCR negativas. El ADN genómico para ddPCR se extrajo de células K-562 utilizando el mini kit de ADN QiaAMP (Qiagen, Valencia, CA). Las reacciones de PCR contenían 2x supermezcla ddPCR EvaGreen, 200 ng de ADN genómico, cebadores y HindlII (1 U/reacción). Las reacciones se realizaron durante 40 ciclos (94°C, 30 s; 55-65°C, 30 s; 72°C, 90 s).
La Figura 2 muestra un esquema de las ubicaciones de los cebadores de PCR para la detección de inversiones y deleciones del fragmento de 13 kb.
Ejemplo 2
Creación de deleciones próximas a Chr11:5233055-5240389
En este ejemplo, se ilustra el uso de los métodos descritos en el presente documento para generar ciertas deleciones que son próximas a la región de Chr11:5233055-5240389. Se han observado deleciones en esta región en pacientes humanos con una deleción de 7,2 kb en el locus de la globina p humana en el cromosoma 11 que se denomina en el presente documento deleción de “Corfú larga”. En el estado homocigoto, tal deleción está asociada con una ausencia completa de hemoglobina A y A2 y un alto nivel de hemoglobina fetal y HPFH [Wainscoat et al, Ann. NY Acad Sci 445:20 (1985) y Kulozik et al, Blood 71:457 (1988)]. Esta deleción se representa en la Figura 3. Se determinó además que los sitios de unión conocidos para los reguladores clave de globina y BCL11a y Gata1 se encuentran dentro de una subregión de 3,5 kb dentro de la región de 7,2 kb (Figura 3). Está contemplado que la deleción de esta región más pequeña sola (deleción en el cromosoma 11 dentro de la región Chr11:5233055-5240389) podría ser suficiente para conferir un fenotipo de HPFH comparable al observado con la deleción más grande y, además, puede lograrse con una mayor eficiencia de la edición del genoma que para la deleción más grande. Los ARN guías de CRISPR se diseñaron para efectuar la escisión en cada extremo de las regiones de 7,2 kb y 3,5 kb y se validó su capacidad para efectuar la eliminación del fragmento intermedio.
Los ARN guía individuales dirigidos hacia los límites de cada una de las deleciones de Corfú se ensayaron para determinar su eficacia en la edición de genes.
Ejemplo 3
Creación de deleciones próximas a Chr11:5226631-5249422
En este ejemplo, se ilustra el uso de los métodos descritos en el presente documento para generar ciertas deleciones que son próximas a la región de Chr11:5226631-5249422. Se han observado deleciones en esta región en pacientes humanos con una deleción grande en el locus de la globina p humana en el cromosoma 11 que se denomina en el presente documento variante de HPFH similar a Kenia [Huisman et al, Arch. Biochem. Biophys. 152:850 (1972) y Ojwang et al, Hemoglobin 7:115 (1983)]. La variante de origen natural parece ser el resultado de un entrecruzamiento no homólogo entre los aminoácidos 80-87 de los genes de globina ay y p y la deleción de ~23 kb de secuencia intermedia en el cromosoma 11 dentro de la región Chr11:5226631-5249422. La proteína de fusión de Kenia contiene los restos de aminoácidos 1-80 de la cadena aY y 87-146 de la cadena p. Se diseñaron y validaron los ARN guía de CRISPR utilizados para realizar la escisión en cada límite de la región de ~23 kb (Figuras 4 y 1B). Los vectores que codifican los ARN guías se generaron y se introdujeron en las células como se describe.
Se espera que las combinaciones de estas guías logren la deleción deseada.
Ejemplo 4
Creación de deleciones próximas a Chr11:5249959-5249971
En este ejemplo, se ilustra el uso de los métodos descritos en el presente documento para generar ciertas deleciones que son próximas a la región de Chr11:5249959-5249971. Se han observado deleciones en esta región en pacientes humanos con una variante de deleción pequeña del locus de la globina p en el cromosoma 11 dentro de la región Chr11:5249959-5249971 que se identificó y se mostró que estaba asociada con HPFH [Gilman et al, Nucleic acids Research 16(22):10635 (1988)]. Esta deleción abarca de -102 a -114 del gen de la globina y y abarca la caja CCAAT distal que se cree que es importante para la regulación del promotor del gen Y (Figura 5A).
Un enfoque es escindir este locus dentro de la región de 13 pb y permitir que NHEJ repare incorrectamente la lesión con la expectativa de que, en algunos casos, la eliminación exacta de 13 pb pueda recapitularse. Sin embargo, el resultado de la reparación por NHEJ solo no puede garantizarse y es poco probable que ocurra la deleción precisa de 13 pb con una frecuencia clínicamente significativa, en lugar de deleciones o inserciones adicionales, que pueda tener la consecuencia terapéutica deseada. Alternativamente, la DSB podría ser reparada por la HDR en presencia de un donador de plantilla de reparación suministrado conjuntamente que especifica la eliminación precisa de 13 pb.
Podría tomarse un tercer enfoque para crear la deleción de 13 pb que hace uso de la microhomología en el sitio de mutación pretendido y la ruta de reparación de MMEJ. En el presente ejemplo, el análisis de la secuencia que abarca y es adyacente al sitio de deleción de 13 pb puso de manifiesto la presencia de dos secuencias de repetición de 8 pb que los autores de la invención predijeron que probablemente se recombinarían durante la reparación mediada por MMEJ para producir la deleción de 13 pb en presencia de una única rotura de doble cadena.
Ejemplo 5
Creación de deleciones próximas a Chr11:5196709-5239223
En este ejemplo, se ilustra el uso de los métodos descritos en el presente documento para generar ciertas deleciones que son próximas a la región de Chr11:5196709-5239223. Se han observado deleciones en esta región en pacientes humanos con una deleción grande en el locus de la globina p humana en el cromosoma 11 que se conoce como el alelo HPFH-4 (o "HPFH italiana") [Camaschella et al, Haematologia 75 (5):26 (1990)] y se caracteriza por una deleción de 40 kb (Figura 6 A) en el cromosoma 11 dentro de la región Chr11:5196709-5239223 que abarca completamente el alelo HPFH-5 más corto (13 kb). Está contemplado que se pueden usar las tecnologías de edición del genoma tales como CRISPR para crear una deleción dirigida de la región genómica correspondiente o similar, o un subconjunto de la misma, en células hematopoyéticas de individuos con hemoglobinopatía tal como drepanocitemia o p-talasemia para desreprimir, o conducir a la reexpresión de la globina Y y, por lo tanto, de hemoglobina fetal.
Ejemplo 6
Creación de deleciones próximas a Chr11:5225700-5236750
En este ejemplo, se ilustra el uso de los métodos descritos en el presente documento para generar ciertas deleciones que son próximas a la región de Chr11:5225700-5236750. Se han observado deleciones en esta región en pacientes humanos con el alelo HPFH Black [Anagnou et al., Blood 65:1245 (1985)], que se caracteriza por una deleción grande (Figura 16B) en el cromosoma 11 dentro de la región Chr11:5225700-5236750 que solapa completamente con las deleciones HPFH-4 y HPFH-5. Está contemplado que se pueden usar las tecnologías de edición del genoma tales como CRISPR para crear una deleción dirigida de la región genómica correspondiente o similar, o un subconjunto de la misma, en células hematopoyéticas de individuos con hemoglobinopatía tal como drepanocitemia o p-talasemia para desreprimir, o conducir a la reexpresión de la globina Y y, por lo tanto, de hemoglobina fetal.
Ejemplo 7
Creación de mutaciones de no deleción asociadas a HPFH
La mutación puntual -175 (T a C) en el gen gy o ay del locus de la globina p está asociada con un fenotipo de HPFH pancelular, es decir, en muchas células con una distribución bastante uniforme; véase, p. ej., Ottolenghi et al., Blood 71:815 (1988) y Surrey et al., Blood 71:807 (1988). Se cree que el fenotipo de HPFH se debe a la alteración de uno o más elementos cis a los que normalmente se unen los factores reguladores y reprimen la expresión de la globina y, o al aumento de la unión de factores reguladores que regulan por aumento la expresión de la globina y. Está contemplado que se pueden usar las tecnologías de edición del genoma tales como CRISPR para crear una mutación puntual, u otra modificación que produzca cambios en la unión de los factores reguladores, en células hematopoyéticas de individuos con hemoglobinopatía tal como drepanocitemia o p-talasemia para desreprimir, o conducir a la reexpresión de la globina y y, por lo tanto, de hemoglobina fetal.
Se encuentran múltiples secuencias de PAM putativas para S. pyogenes Cas9 adyacentes a este sitio objetivo (Figura 6 C).
Ejemplo 8
Estudios Clínicos y Farmacología
Está bien establecido que un aumento en los niveles de HbF reduce la polimerización de HbS y, por lo tanto, mejora el fenotipo de SCA, reduciendo las complicaciones clínicas.
En el contexto de la tecnología CRISPR/Cas9, o usando otras endonucleasas para la edición de genes como se describe en el presente documento, los principales objetivos de los estudios farmacodinámicos primarios en sujetos/pacientes humanos serán demostrar la desrepresión exitosa de la globina y y aumentos concomitantes y efectos beneficiosos de HbF, y determinar la seguridad y eficacia de tales modificaciones genéticas para el tratamiento de hemoglobinopatías.
Los estudios basados en células pueden incluir tanto células de tipo natural, tales como hHSC CD34+ normales, que normalmente no expresan niveles altos de HbF, pero se editan como se describe en el presente documento para aumentar sus niveles de HbF; así como células tales como células CD34+ que se derivan de pacientes que tienen una hemoglobinopatía tal como p-talasemia o SCD.
La HbF total de glóbulos rojos se medirá mediante HPLC catiónica y la distribución de HbF en los glóbulos rojos se cuantificará en células F (células con niveles detectables de HbF) usando FACS. Aunque se ha demostrado que incluso pequeños aumentos incrementales en la HbF tienen efectos beneficiosos en el contexto de SCD, como se comentó anteriormente, en algunas realizaciones al menos aproximadamente 9% de la Hb total en un sujeto será HbF, que se asocia con una menor mortalidad en la SCD; véase, por ejemplo, Platt et al., N Engl J Med. 330(23): 1639-1644 (1994). En algunas realizaciones, la HbF será de al menos aproximadamente 14%, lo que se asocia con beneficios clínicos adicionales, y en algunas realizaciones, la HbF será de al menos aproximadamente 20% a 30%, lo que se asocia con una normalización sustancial del fenotipo en el contexto de la SCD. De manera similar, la introducción de subpoblaciones de células incluso relativamente limitadas que tienen niveles significativamente elevados de HbF (denominadas "células F") puede ser beneficiosa en varios pacientes, ya que en algunas situaciones las células normalizadas tendrán una ventaja selectiva en relación con las células enfermas. Incluso niveles modestos de RBC en la circulación con niveles elevados de HbF pueden ser beneficiosos para mejorar uno o más aspectos de la hemoglobinopatía en los pacientes. Sin embargo, generalmente está contemplado que al menos una décima parte de los glóbulos rojos (RBC) en la circulación tendrán niveles elevados de HbF, más de una cuarta parte de los RBC en la circulación tendrán niveles elevados de HbF, o al menos un tercio de los RBC en la circulación tendrán niveles elevados de HbF. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente la mitad y en algunas realizaciones al menos aproximadamente tres cuartas partes o más de los RBC en la circulación tendrán niveles elevados de HbF.
Ejemplo 9
Biodistribución
Se realizará un estudio de viabilidad preliminar (no GLP) para demostrar el injerto de hHSC CD34+ en ratones NOD/SCID IL2Ry. Se realizará un estudio de biodistribución y persistencia de GLP en ratones inmunocomprometidos NOD/SCID IL2Ry. Las HSC CD34+ humanas modificadas con CRISPR/Cas9 se administrarán por inyección i.v. (u otras vías, p. ej., intraósea) a ratones NOD/SCID IL2Ry. Las hHSC CD34+ no modificadas se utilizarán como control.
Ejemplo 10
Estudio de farmacología in vivo
En un ejemplo ilustrativo de farmacología in vivo, se introducen HSC editadas genéticamente en ratones inmunodeficientes y se evalúan resultados tales como el injerto de HSC. Por ejemplo, "NSG" o NOD scid gamma (NOD.Cg-Prkdcscid II2rgtm1Wjl/SzJ), es una cepa de ratones de laboratorio endogámicos, entre los más inmunodeficientes descritos hasta la fecha; véase, p. ej., Shultz et al., Nat. Rev. Inmunol. 7(2): 118-130 (2007). Otro modelo de ratón inmunocomprometido aplicable para investigar el trasplante de células madre hematopoyéticas es el ratón NOD/MrkBomTac-Prkdcscid (www.taconic.com/NODSC).
Un enfoque ilustrativo que emplea un modelo de ratón inmunocomprometido es inyectar HSC humanas CD34+ modificadas con CRlSPR/Cas9 en ratones inmunocomprometidos NOD/SClD/IL2rY para demostrar las capacidades de alojamiento e injerto.
También es posible considerar estudios en animales modelo, con la condición de que dichos modelos sean razonablemente predictivos de uno o más aspectos de las afecciones en pacientes humanos. El desarrollo de modelos animales que proporcionan información relevante para ciertos aspectos de varias enfermedades continúa siendo objeto de mejoras periódicas en la técnica, y el uso de la edición de genes CRISPR/Cas-9 está facilitando en gran medida la creación más rápida de dichos modelos animales relevantes para enfermedades.
Ejemplo 11
Uso de células editadas para la mejora de la p-talasemia
Utilizando los métodos descritos e ilustrados en el presente documento, se pueden producir células humanas que expresan niveles aumentados de HbF. Dichas células pueden incluir, por ejemplo, células madre hematopoyéticas humanas (HSC humanas) que son capaces de dar lugar a células del linaje eritroide tales como glóbulos rojos (RBC). Por lo tanto, dichas HSC pueden usarse para mejorar uno o más síntomas asociados con la p-talasemia.
Por ejemplo, cuando el procedimiento de edición del genoma se aplica para aumentar los niveles de HbF en las células de un paciente que sufre una p-talasemia, se pueden mejorar uno o más síntomas o complicaciones de la p-talasemia, como resultado de la combinación de dos efectos beneficiosos. En primer lugar, la HbF proporciona una forma funcional de hemoglobina que puede desempeñar un papel importante en la mejora de la anemia y afecciones clínicas asociadas de la p-talasemia (es decir, en la p-talasemia mayor y la p-talasemia intermedia), en las que las cadenas de globina p adultas que normalmente se expresaría a partir del gen HBB están ausentes o reducidas. En segundo lugar, el nivel de cadenas de globina a desapareadas, que es la causa de una serie de otros problemas asociados clínicamente a la p-talasemia, se reduce porque las cadenas de globina a pueden emparejarse con cadenas de globina p codificadas por los genes de globina y, cuya expresión se incrementa como se describe en el presente documento.
Como también se indica en el presente documento, los RBC en la p-talasemia tienen desventajas selectivas en comparación con los RBC normales en términos de supervivencia y otros factores; y el tratamiento de las células como se describe en el presente documento supera ciertas desventajas, p. ej., aumentando los niveles de HbF y disminuyendo concomitantemente los niveles de cadenas de globina a desemparejadas.
Además, se pueden aplicar otras técnicas para mejorar el suministro, expansión y/o persistencia de células modificadas mediante la edición del genoma como se describe en el presente documento. Estas incluyen técnicas de ablación en las que se eliminan algunas células residentes antes de la introducción de células. Dichas técnicas se utilizan habitualmente, por ejemplo, en el contexto del trasplante de médula ósea y otros procedimientos en los que se introducen células normales o corregidas en los pacientes. Se conocen en la técnica numerosos procedimientos de este tipo y se practican rutinariamente en relación con el tratamiento de pacientes humanos.
Un ejemplo ilustrativo y no limitativo del uso de dichas técnicas para la mejora de la p-talasemia es el siguiente.
En un procedimiento autólogo, la edición del genoma se realiza en células derivadas de un paciente con ptalasemia. Dado que las propias células del paciente ya son coincidentes, no plantean los problemas potenciales asociados con el uso de células alogénicas. La corrección de dichas células ex vivo seguida de su reintroducción en el paciente presenta un medio para mejorar la enfermedad.
Como un ejemplo ilustrativo de células que se pueden usar, las células madre de sangre periférica (PBSC) de un paciente con p-talasemia se pueden obtener del torrente sanguíneo. Se puede usar un procedimiento llamado aféresis o leucaféresis para obtener las PBSC. Durante 4 o 5 días antes de la aféresis, el paciente puede recibir un medicamento para aumentar el número de células madre liberadas en el torrente sanguíneo. En la aféresis, la sangre se extrae a través de una vena grande del brazo o un catéter venoso central (un tubo flexible que se coloca en una vena grande del cuello, el pecho o la zona de la ingle). La sangre pasa por una máquina que extrae las células madre.
Como otro ejemplo ilustrativo de células que pueden usarse, las células madre hematopoyéticas (HSC) pueden recolectarse de la médula ósea del paciente usando técnicas bien conocidas.
CD34 es un antígeno asociado con células madre hematopoyéticas, y el aislamiento de HSC CD34+ también puede llevarse a cabo mediante métodos bien conocidos y validados clínicamente. Por ejemplo, se puede utilizar un procedimiento de separación con perlas magnéticas que ha sido aprobado por la FDA para usar en varios contextos de trasplante y que está disponible comercialmente en Miltenyi Biotec, junto con preparaciones para el manejo y mantenimiento de dichas células.
Para tratar a un paciente humano con p-talasemia como se describe en el presente documento, se puede usar una población de HSC CD34+ ajustada para reflejar el peso del paciente, p. ej., una población que comprende aproximadamente diez millones de HSC CD34+ por kilogramo de peso. Esta población de células luego se modifica usando los métodos de edición del genoma descritos en el presente documento. A modo de ilustración, si Cas9 es la endonucleasa de edición del genoma, la proteína se puede introducir en las HSC CD34+ mediante la transfección de ARNm utilizando diversas técnicas conocidas; junto con la introducción, potencialmente de forma simultánea en la transfección, de ARN guías (que pueden ser guías de molécula única o guías de doble molécula) que se dirigen a los locus como se describe en el presente documento. Dependiendo del procedimiento utilizado, una parte de las células (p. ej., la mitad de las células originales) puede entonces utilizarse para reintroducirlas en el paciente. Si se va a utilizar la ablación para mejorar el injerto de las células recién introducidas, el paciente se puede someter, p. ej., a un acondicionamiento leve de la médula ósea antes de la introducción de las HSC de genoma editado. Después de cualquier acondicionamiento, la población de HSC de genoma editado se puede reintroducir en el paciente, p. ej., por transfusión. Con el tiempo, las HSC dan lugar a células del linaje eritroide, incluidos glóbulos rojos (RBC).
En los RBC resultantes, la edición del genoma en el caso de la p-talasemia da como resultado un aumento en el nivel de HbF y una disminución concomitante en las cadenas de globina a desapareadas; como resultado de lo cual se mejoran uno o más síntomas o complicaciones asociadas con la p-talasemia.
Ejemplo 12
Uso de células editadas para la mejora de la anemia drepanocítica
Utilizando los métodos descritos e ilustrados en el presente documento, se pueden producir células humanas que expresan niveles aumentados de HbF. Dichas células pueden incluir, por ejemplo, células madre hematopoyéticas humanas (HSC humanas) que son capaces de dar lugar a células del linaje eritroide tales como glóbulos rojos (RBC). Por lo tanto, dichas HSC se pueden usar para mejorar uno o más síntomas asociados con la enfermedad drepanocítica, tal como la anemia drepanocítica.
Por ejemplo, cuando el procedimiento de edición del genoma se aplica para aumentar los niveles de HbF en las células de un paciente que padece anemia drepanocítica (SCA), se pueden mejorar uno o más síntomas o complicaciones de la SCA. En ciertas realizaciones, al menos una copia del gen de la globina p mutante se reduce o elimina, lo que produce una combinación de dos efectos beneficiosos. En primer lugar, la HbF proporciona una forma funcional de hemoglobina que puede desempeñar un papel significativo en la mejora de la anemia y las afecciones clínicas asociadas a la SCA. En segundo lugar, se reduce o elimina el nivel de hemoglobina de drepanocitos (HbS) expresada a partir de la globina p mutante. La presencia de HbS produce una serie de problemas asociados clínicamente con la SCA, e incluso se pueden usar reducciones modestas en la presencia de HbS para reducir o prevenir esencialmente la falciformación, como se describe en el presente documento y en la técnica.
Como también se indica en el presente documento, los RBC drepanocíticos tienen desventajas selectivas en comparación con los RBC normales en términos de supervivencia y otros factores; y el tratamiento de células como se describe en el presente documento supera ciertas desventajas, p. ej., aumentando los niveles de HbF y, en realizaciones en las que el gen mutante de la globina p se reduce o elimina, disminuyendo concomitantemente los niveles de HbS.
Además, se pueden aplicar otras técnicas para mejorar la administración, expansión y/o persistencia de células modificadas por edición del genoma como se describe en el presente documento. Estas incluyen técnicas de ablación en las que se eliminan algunas células residentes antes de la introducción de células. Dichas técnicas se utilizan habitualmente, por ejemplo, en el contexto del trasplante de médula ósea y otros procedimientos en los que se introducen células normales o corregidas en los pacientes. Se conocen en la técnica numerosos procedimientos de este tipo y se practican rutinariamente en relación con el tratamiento de pacientes humanos.
Un ejemplo ilustrativo y no limitativo del uso de dichas técnicas para la mejora de la SCA es el siguiente.
En un procedimiento autólogo, la edición del genoma se realiza en células derivadas de un paciente con SCA. Dado que las propias células del paciente ya son coincidentes, no plantean los problemas potenciales asociados con el uso de células alogénicas. La corrección de dichas células ex vivo seguida de su reintroducción en el paciente presenta un medio para mejorar la enfermedad.
Como un ejemplo ilustrativo de células que pueden usarse, las PBSC de un paciente con SCA pueden obtenerse del torrente sanguíneo, o las h Sc pueden recolectarse de la médula ósea del paciente, cada una como se describe antes en el ejemplo anterior utilizando técnicas bien conocidas. Entonces se pueden derivar células CD34+, usando procedimientos como se describe en el ejemplo anterior y técnicas bien conocidas.
Para tratar a un paciente humano con SCA como se describe en el presente documento, se puede usar una población de HSC CD34+ ajustada para reflejar el peso del paciente, p. ej., una población que comprende aproximadamente diez millones de HSC CD34+ por kilogramo de peso. Esta población de células luego se modifica usando los métodos de edición del genoma descritos en el presente documento. A modo de ilustración, si Cas9 es la endonucleasa de edición del genoma, la proteína se puede introducir en las HSC CD34+ mediante la transfección de ARNm utilizando diversas técnicas conocidas; junto con la introducción, potencialmente de forma simultánea en la transfección, de ARN guías (que pueden ser guías de molécula única o guías de doble molécula) que se dirigen a los locus como se describe en el presente documento. Dependiendo del procedimiento utilizado, una parte de las células (p. ej., la mitad de las células originales) puede entonces utilizarse para reintroducirlas en el paciente. Si se va a utilizar la ablación para mejorar el injerto de las células recién introducidas, el paciente se puede someter, p. ej., a un acondicionamiento leve de la médula ósea antes de la introducción de las HSC de genoma editado. Después de cualquier acondicionamiento, la población de HSC de genoma editado se puede reintroducir en el paciente, p. ej., por transfusión. Con el tiempo, las HSC dan lugar a células del linaje eritroide, incluidos glóbulos rojos (RBC).
En los RBC resultantes, la edición del genoma en el caso de SCA da como resultado un aumento en el nivel de HbF, y en realizaciones en las que el gen de la globina p mutante se reduce o elimina, disminuyendo concomitantemente los niveles de HbS; como resultado de lo cual se mejoran uno o más síntomas o complicaciones asociadas con la p-talasemia.
Ejemplo 13 - Sitios objetivo de CRISPR/SpCas9 para el locus de la globina
Se buscaron en las regiones del locus de la globina los sitios objetivo. Se buscó en cada área un motivo adyacente de protoespaciador (PAM) que tuviera la secuencia NRG. Se identificaron secuencias espaciadoras de 20 pb de ARNg correspondientes al PAM, como se muestra en SEQ ID NOs: 1 - 56.961 de la Lista de secuencias.
Ejemplo 14 - Sitios objetivo de CRISPR/SaCas9 para el locus de la globina
Se buscaron en las regiones del locus de la globina los sitios objetivo. Se buscó en cada área un motivo adyacente de protoespaciador (PAM) que tuviera la secuencia NNGRRT. Se identificaron secuencias espaciadoras de 20 pb de ARNg correspondientes al PAM, como se muestra en las SEQ ID NOs: 56.962 -64.104 de la Lista de secuencias.
Ejemplo 15 - Sitios objetivo de CRISPR/StCas9 para el locus de la globina
Se buscaron en las regiones del locus de la globina los sitios objetivo. Se buscó en cada área un motivo adyacente de protoespaciador (PAM) que tuviera la secuencia NNAGAAW. Se identificaron secuencias espaciadoras de 20 pb de ARNg correspondientes al PAM, como se muestra en las SEQ ID NOs: 64.105 -66.998 de la Lista de secuencias.
Ejemplo 16 : Sitios objetivo de CRISPR/TdCas9 para el locus de la globina
Se buscaron en las regiones del locus de la globina los sitios objetivo. Se buscó en cada área un motivo adyacente de protoespaciador (PAM) que tuviera la secuencia NAAAAC. Se identificaron secuencias espaciadoras de 20 pb de ARNg correspondientes al PAM, como se muestra en las SEQ ID NOs: 66.999­ 68.146 de la Lista de secuencias.
Ejemplo 17 - Sitios objetivo de CRISPR/NmCas9 para el locus de la globina
Se buscaron en las regiones del locus de la globina los sitios objetivo. Se buscó en cada área un motivo adyacente de protoespaciador (PAM) que tuviera la secuencia (NNNNGHTT). Se identificaron secuencias espaciadoras de 20 pb de ARNg correspondientes al PAM, como se muestra en las SEQ ID NOs: 68.147­ 75.145 de la Lista de secuencias.
Ejemplo 18 - CRISPR/Acidominococcus y Lachnospiracease
Sitios objetivo de cpf1 para el locus de la globina
Se buscaron en las regiones del locus de la globina los sitios objetivo. Se buscó en cada área un motivo adyacente de protoespaciador (PAM) que tuviera la secuencia YTN. Se identificaron secuencias espaciadoras de 22 pb de ARNg correspondientes al PAM, como se muestra en las SEQ ID NOs: 75.146 - 161.297 de la Lista de secuencias.
Ejemplo 19 - Desarrollo de ARN guía de Corfú (transcripción in vitro, IVT)
Ejemplo 19A - Desarrollo de ARNg para la Región de Corfú grande
En este ejemplo, se ilustra el uso de los métodos descritos en el presente documento para generar ARNg para la deleción en el paciente de Corfú (situada aproximadamente en ch11:5233163-5240389). La deleción de esta "región de Corfú grande" ("CL"), por ejemplo usando el ARNg de la invención, puede conferir un fenotipo HPFH. Los ARNg de CRISPR se diseñaron para efectuar la escisión en cada extremo de la región de Corfú grande y se ensayó su respectiva eficiencia de edición. Se pueden seleccionar y usar pares de ARNg eficientes para la deleción de la región de Corfú grande. También se proporcionan métodos para un mayor refinamiento y selección de los pares de ARNg.
Diseño del ARN guía
Los ARN guía se diseñaron utilizando los métodos descritos en el presente documento. Brevemente, se usó COSMID (CRISPR Off-target Sites with Mismatches, Insertions and Deletions) (disponible en la web en crispr.bme.gatech.edu) con puntos de corte >0,42, <13,0 para generar 33 ARNg (14 AS, 19 S) para la deleción de 5' a CL. Se utilizó COs M iD con puntos de corte >0,48, <13,0 para generar 30 ARNg (20 AS, 10 S). Las posiciones de ARNg se muestran gráficamente en las FIGS. 9-10 y las secuencias de ARNg se dan en las Tablas 1-2.
La figura 9 presenta un mapa de guías de Corfú grande, que muestra los extremos 5' y 3', así como los locus de ARNg.
La figura 10A presenta una vista ampliada del extremo 5' del mapa de guías de Corfú grandes (que muestra 33 ARNg).
La figura 10B presenta una vista ampliada del extremo 3' del mapa de guías de Corfú grandes (que muestra 30 ARNg).
Tabla 1. ARNg 5'. Tenga en cuenta que cuando las guías se presentan como secuencias de ADN (p. ej., tablas 1-4), el ARNg es la secuencia de ARN correspondiente.
Figure imgf000049_0001
Tabla 2. ARNg 3'
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Figure imgf000050_0001
Parte experimental
Los ARNg descritos anteriormente se pidieron a Thermo Fisher (en una concentración media de 158,2 ng/pl). Los experimentos se llevaron a cabo en células CD34+ de sangre periférica movilizadas 2 días después de la descongelación (CD34 de AllCells, donante A5036). Se complejaron 5 pl de cada guía con 1,9 pg de Cas9 (Feldan) durante 10 min a temperatura ambiente. La mezcla de RNP resultante se electroporó en 50 K de CD34 por guía con el programa Lonza Amaxa 4D CA-137 y se cultivó a 37°C durante 48 horas antes de la extracción del ADN genómico para el análisis TIDE para mejorar la eficiencia de la edición. Los valores de eficiencia de edición resultantes se presentan en la Figura 11.
La Figura 11 presenta los resultados del cribado de eficiencia de edición para el ARNg de Corfú grande. Estos datos muestran que una serie de secuencias seleccionadas actuaron como ARN guías eficiente en un donante de CD34. En particular, estos ARN guías se usaron todos en una concentración más baja (0,5-1 pg) que las guías sintéticas típicas, pero todavía dieron como resultado eficiencias de edición altas. Por lo tanto, estos datos identifican una serie de pares de ARN guías que podrían usarse para dirigirse a la región de Corfú grande.
Estos datos también identifican una serie de pares de ARN guías que podrían usarse para un mayor desarrollo. Las cadenas de guías mejoradas podrían identificarse utilizando los métodos descritos en el presente documento. Un ejemplo sería (1) repetir la detección en un donador de CD34 separado, (2) preseleccionar los ARNg de alta eficiencia como ARNg modificados químicamente y matriz para la estrategia de deleción para detectar el aumento de HbF tras la diferenciación de eritroides, y (3) examinar y seleccionar pares basados en su eficacia así como en su actividad fuera del objetivo en las células CD34+.
Ejemplo 19B - Desarrollo de ARNg para la región de Corfú pequeña
En este ejemplo, se ilustra el uso de los métodos descritos en el presente documento para generar ARNg para la "región de Corfú pequeña" ("CS"), que no es una deleción conocida de origen natural. La deleción de CS, por ejemplo usando los ARNg de la invención, puede conferir un fenotipo HPFH. Los ARNg de CRISPR se diseñaron para efectuar la escisión en cada extremo de la región de Corfú pequeña y se ensayó su respectiva eficiencia de edición. Se pueden seleccionar y usar pares de ARNg eficientes para la deleción de la región de Corfú pequeña. También se proporcionan métodos para un mayor refinamiento y selección de los pares de ARNg.
Diseño del ARN guía
Los ARN guías se diseñaron utilizando los métodos descritos en el presente documento. Brevemente, se usó COSMID (CRISPR Off-target Sites with Mismatches, Insertions and Deletions) (disponible en la web en crispr.bme.gatech.edu) con puntos de corte >0,40, <15,0 para generar 46 ARNg (20 AS; 26 S). Las posiciones de los ARNg se muestran gráficamente en las FIGS. 12-13 y las secuencias de ARNg se dan en las Tablas 3­ 4.
La figura 12 presenta un mapa de guías de Corfú pequeño, que muestra los extremos 5' y 3', así como los locus de ARNg.
La figura 13A presenta una vista 5' ampliada del extremo 5' del mapa de guías de Corfú pequeñas (que muestra 30 ARNg).
La Figura 13B presenta una vista ampliada del extremo 3' del mapa de guías de Corfú pequeñas (que muestra 16 ARNg).
Tabla 3. ARNg 5'
Nombre del ARNg Secuencia de ARNg SEQ ID NO:
CS06 F17 GAAAACCTCTTCCGCCATT 161.263
Figure imgf000051_0002
Tabla 4. ARNg 3'
Figure imgf000051_0001
Parte experimental
Los ARNg descritos anteriormente se pidieron a Thermo Fisher (en una concentración media de 160,6 ng/pl). Los experimentos se llevaron a cabo en células CD34+ de sangre periférica movilizadas 2 días después de la descongelación (CD34 de AllCells, donante A5036). Se complejaron 5 pl de cada guía con 1,9 pg de Cas9 (Feldan) durante 10 min a temperatura ambiente. La mezcla de RNP resultante se electroporó en 50 K de CD34 por guía con el programa Lonza Amaxa 4D CA-137 y se cultivó a 37°C durante 48 horas antes de la extracción del ADN genómico para el análisis TIDE para mejorar la eficiencia de la edición. Los valores de eficiencia de edición resultantes se presentan en la Figura 14.
La Figura 14 presenta los resultados del cribado de eficiencia de edición para el ARNg de Corfú pequeño.
Estos datos muestran que la mayoría de las secuencias cribadas actuaron como ARN guía eficiente en un donante de CD34. En particular, estos ARN guías se usaron todos en una concentración más baja (0,5-1 |jg) que las guías sintéticas típicas, pero todavía dieron como resultado eficiencias de edición muy altas. Por lo tanto, estos datos identifican una serie de pares de ARN guías que podrían usarse para dirigirse a la región de Corfú pequeña.
Estos datos también identifican una serie de pares de ARN guías que podrían usarse para un mayor desarrollo. Las cadenas de guías mejoradas podrían identificarse utilizando los métodos descritos en el presente documento. Un ejemplo sería (1) repetir la detección en un donador de CD34 separado, (2) preseleccionar los ARNg de alta eficiencia como ARNg modificados químicamente y matriz para la estrategia de deleción para detectar el aumento de HbF tras la diferenciación de eritroides, y (3) examinar y seleccionar pares basados en su eficacia así como en su actividad fuera del objetivo en las células CD34+.
Nota sobre realizaciones ilustrativas
Si bien la presente descripción proporciona descripciones de varias realizaciones específicas con el propósito de ilustrar varios aspectos de la presente invención y/o sus aplicaciones potenciales, se entiende que a los expertos en la técnica se les ocurrirán variaciones y modificaciones. En consecuencia, la invención descrita en el presente documento debe entenderse como que es al menos tan amplia como se reivindica, y no como más estrechamente definida por las realizaciones ilustrativas particulares proporcionadas en el presente documento.

Claims (22)

REIVINDICACIONES
1. Un método in vitro o ex vivo de edición del genoma en una célula humana que utiliza una endonucleasa de ADN Cas9 para efectuar una rotura de doble cadena (DSB) en uno o más locus dentro de la región de globina @ del cromosoma 11 humano, causando deleciones o inserciones de ADN cromosómico en el uno o más locus, en donde el método comprende introducir en la célula la endonucleasa de ADN Cas9 y uno o más ARN guías, en donde cada ARN guía comprende una secuencia espaciadora que es complementaria de uno o más locus dentro de la región de globina @ del cromosoma 11 humano, y en donde uno o más ARN guías comprenden una secuencia espaciadora seleccionada de una secuencia de ARN correspondiente de las SEQ ID NOs: 161.203 161.204; 161.205 161.206; 161.207; 161.213; 161.215 161.216 161.217 161.218; 161.220; 161.221 161.222; 161.224 161.230; 161.231; 161.309 161.233 161.235 161.236 161.237; 161.240; 161.241 161.243; 161.245 161.250; 161.252; 161.254; 161.255 161.256 161.257 161.258; 161.259; 161.262 161.265; 161.267 161.269; 161.271; 161.272; 161.273 161.274 161.275 161.278; 161.279; 161.280 161.281; 161.283; 161.287; 161.297; 161.298; 161.299; 161.300; 161.303; 161,310; 161,311; y 161.312,
en donde el método no implica modificar la identidad genética de la línea germinal de los seres humanos.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el uno o más ARN guías comprenden una secuencia espaciadora seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de ARN correspondiente de las SEQ ID NOs: 161.205; 161.206; 161.207; 161.217; 161.220; 161.230; 161.231; 161.236; 161.237; 161.241; 161.245; 161.250; 161.254; 161.255; 161.257; 161.258; 161.259; 161.262; 161.269; 161.271; 161.273; 161.275; 161.279; 161.298; 161.299; 161.300; 161.310; 161.311; y 161.312.
3. El método de la reivindicación 1, en donde el uno o más ARN guías comprenden una secuencia espaciadora seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de ARN correspondiente de las SEQ ID NOs: 161.205; 161.206; 161.207; 161.217; 161.230; 161.231; 161.241; 161.254; 161.255; 161.259; 161.269; 161.275; 161.310; y 161.311.
4. El método de la reivindicación 1, en donde el uno o más ARN guías comprenden una secuencia espaciadora seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de ARN correspondiente de las SEQ ID NOs: 161.269; 161.271; 161.273; 161.275; 161.279; y 161.311.
5. El método de la reivindicación 1, en donde el uno o más ARN guías comprenden una secuencia espaciadora seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de ARN correspondiente de las SEQ ID NOs: 161.298; 161.299; 161.300; y 161.312.
6. El método de la reivindicación 1, en donde el uno o más ARN guías comprenden una secuencia espaciadora seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de ARN correspondiente de las SEQ ID NOs: 161.205; 161.206; 161.207; 161.217; 161.220; 161.230; 161.231.
7. El método de la reivindicación 1, en donde el uno o más ARN guías comprenden una secuencia espaciadora seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de ARN correspondiente de las SEQ ID NOs: 161.236; 161.237; 161.245; 161.250; 161.257; 161.258; y 161.262.
8. El método de la reivindicación 1, en donde el uno o más ARN guías comprenden una secuencia espaciadora seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de ARN correspondiente de las SEQ ID NOs: 161.241; 161.254; 161.255; 161.259; y 161.310.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 , en donde el uno o más ARN guías son ARN guías de molécula única.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el método comprende introducir en la célula (i) un polinucleótido que codifica la endonucleasa de ADN Cas9, o (ii) una RNP que comprende la endonucleasa de a Dn Cas9
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la célula humana es una célula progenitora aislada, opcionalmente en donde la célula progenitora aislada es
(i) una célula progenitora hematopoyética, además opcionalmente en donde la célula progenitora hematopoyética es capaz de dar lugar a células del linaje eritroide, o
(ii) una célula madre pluripotente inducida.
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método comprende introducir en la célula un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica uno o más ARN guías.
13. Un ácido ribonucleico guía (ARNg) que comprende una secuencia espadadora seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de A r N correspondiente de las SEQ ID NOs: 161.203; 161.204; 161.205; 1 6 1.2 0 6 ; 161.207 161.213 161.215; 161.216; 161.217; 161.218; 161.220; 161.221; 161.222; 161.224; 161.230; 161.231 161.309 161.233; 161.235; 161.236; 161.237; 161.240; 161.241; 161.243; 161.245; 161.250; 161.252 161.254 161.255; 161.256; 161.257; 161.258; 161.259; 161.262; 161.265; 161.267; 161.269; 161.271 161.272 161.273; 161.274; 161.275; 161.278; 161.279; 161.280; 161.281; 161.283; 161.287; 161.311 161.297; 161.298; 161.299; 161.300; 161.303; 161 .312 para usar en un método de edición in vitro o ex vivo del locus de la globina p en una célula de un paciente con hemoglobinopatía,
en donde dicha edición in vitro o ex vivo no implica la modificación de la identidad genética de la línea germinal de seres humanos.
14. El ARNg de la reivindicación 13, en donde el ARNg comprende una secuencia espaciadora seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de ARN correspondiente de las SEQ ID NOs: 161.205; 161.206; 161.207; 161.217; 161.220; 161.230; 161.231; 161.236; 161.237; 161.241; 161.245; 161.250; 161.254; 161.255; 161.257; 161.258; 161.259; 161.262; 161.269; 161.271; 161.273; 161.275; 161.279; 161.298; 161.299; 161.300; 161.310; 161.311; y 161.312.
15. El ARNg de la reivindicación 13, en donde el ARNg comprende una secuencia espaciadora seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de ARN correspondiente de las SEQ ID NOs: 161.205; 161.206; 161.207; 161.217; 161.230; 161.231; 161.241; 161.254; 161.255; 161.259; 161.269; 161.275; 161.310; y 161.311.
16. El ARNg de la reivindicación 13, en donde el uno o más ARN guías comprenden una secuencia espaciadora seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de ARN correspondiente de las SEQ ID NOs: 161.269; 161.271; 161.273; 161.275; 161.279; y 161.311.
17. El ARNg de la reivindicación 13, en donde el uno o más ARN guías comprenden una secuencia espaciadora seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de ARN correspondiente de las SEQ ID NOs: 161.298; 161.299; 161.300; y 161.312.
18. El ARNg de la reivindicación 13, en donde el uno o más ARN guías comprenden una secuencia espaciadora seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de ARN correspondiente de las SEQ ID NOs: 161.205; 161.206; 161.207; 161.217; 161.220; 161.230; 161.231.
19. El ARNg de la reivindicación 13, en donde el uno o más ARN guías comprenden una secuencia espaciadora seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de ARN correspondiente de las SEQ ID NOs: 161.236; 161.237; 161.245; 161.250; 161.257; 161.258; y 161.262.
20. El ARNg de la reivindicación 13, en donde el uno o más ARN guías comprenden una secuencia espaciadora seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de ARN correspondiente de las SEQ ID NOs: 161.241; 161.254; 161.255; 161.259; y 161.310.
21. El ARNg de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, en donde el ARNg es un ARN guía de molécula única (ARNgu).
22. El ARNg o ARNgu de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 21, en donde el ARNg o ARNgu es un ARNg o ARNgu modificado.
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