CN116650669A - 一种壳-核结构的CRISPR/Cas9递送系统及其制备方法和应用 - Google Patents
一种壳-核结构的CRISPR/Cas9递送系统及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种壳‑核结构的CRISPR/Cas9递送系统及其制备方法。该壳‑核结构由外壳生物相容性良好的两亲性树形分子G1和内核亲水性树形分子PAMAMGn组成。所述由树形分子构建的壳‑核结构递送系统能够通过其壳‑核结构压缩大尺寸的CRISPR/Cas9质粒，形成稳定均一的核‑壳结构的纳米组装体，凭借树形分子高效递送基因的安全高效地递送CRISPR/Cas9质粒至靶部位，在肿瘤细胞内可通过“质子海绵效应”和特定的病理因子的刺激下促进负载药物的释放，有效定点编辑靶基因，降低相关靶蛋白的表达，实现CRISPR/Cas9体系的细胞特异性递送，从而增强疗效。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及PAMAM树形分子与CRISPR/Cas9质粒形成的壳-核结构的递送系统及其制备方法和应用。
背景技术
CRISPR/Cas9基因编辑技术能够对细胞特定DNA片段进行精确定点破坏、插入或替换从而改变基因组信息，是一种颇具应用潜力的新型治疗手段，大大加速了基因治疗的快速发展，给难治性疾病的有效治疗带来新希望。CRISPR/Cas9基因编辑技术主要通过以下三种形式实现靶细胞编辑效果：Cas9蛋白和sgRNA的复合物、编码Cas9蛋白的mRNA和sgRNA的复合物、同时编码Cas9蛋白和sgRNA的质粒。质粒因其同时编码Cas9蛋白和sgRNA，具有操作简单,成本低以及更好的稳定性等优点使其受到广泛的关注。
CRISPR/Cas9质粒需要安全稳定到达靶部位才能对靶细胞发挥基因编辑作用，CRISPR/Cas9质粒与其他核酸(siRNA、mRNA等)相似，结构的强负电性以及面临的血液循环、细胞内外屏障使其需要高效的载体帮助其安全输送进入靶部位。除此之外，与其他核酸相比，CRISPR/Cas9质粒具有独特的大分子量的特点(～9×103bp)是影响其递送载体输送效率的关键之一(Nucleic Acids Res 1999；27:3792–3798.)。树形分子作为非病毒载体的一种，其具有多个末端基团、多价效应等优势使其siRNA和mRNA等核酸递送中有较好的应用前景。然而使用树形分子高效递送输送CRISPR/Cas9质粒具有比较大的挑战。目前，用于质粒递送树形分子的代数较高，高代树形分子可通过静电相互作用紧密压缩质粒，形成稳定的复合物，保护其免受核酸酶降解。然而，在用于CRISPR/Cas9质粒输送时,高代数树形分子与大尺寸且负电荷密度较高的CRISPR/Cas9质粒之间强的静电相互作用虽然能对负载的质粒起到有效的保护作用，但在一定程度上会阻碍负载CRISPR/Cas9质粒的快速释放，从而制约该体系的基因编辑效率。因此，根据CRISPR/Cas9质粒独特特点，合理化设计递送载体以提高输送的效率是亟待解决的关键问题。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种壳-核结构的CRISPR/Cas9递送系统，能够有效结合并压缩大尺寸的CRISPR/Cas9质粒，形成稳定的具有壳-核结构的纳米颗粒，保护其安全有效的递送，从而提高CRISPR/Cas9的递送效率。
本发明的另一目的是提供一种壳-核结构的CRISPR/Cas9递送系统的制备方法
本发明的又一目的是提供壳-核结构的CRISPR/Cas9递送系统在制备基因编辑治疗药物中的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种壳-核结构的CRISPR/Cas9递送系统，该壳-核递送系统由纳米外壳和包载CRISPR/Cas9质粒的纳米内核组成，所述纳米外壳材料选自两亲性树形分子或其类似物；纳米内核为包载CRISPR/Cas9质粒的亲水性树形分子。纳米外壳材料和纳米内核均具备良好的生物相容性。该壳-核体系保护其安全到达靶部位，凭借质子海绵效应或凭借肿瘤部位特点病理刺激因子逃逸并释放CRISPR/Cas9质粒，发挥其基因编辑作用。
作为本发明的一种优选，所述的纳米外壳材料为不同末端修饰的G1代两亲性树形分子，由亲水端和疏水端组成；两亲性树形分子G1的疏水端为疏水烷基链，亲水端为树枝状结构，包括但不限于聚酰胺、聚氨酯骨架，其末端修饰不同功能的功能基团，包括但不限于胍基、N,N-二甲基、N,N-二乙基、吡咯、哌啶、吗啉，哌嗪。
作为本发明的进一步优选，所述两亲性树形分子G1优选为式I所示结构的化合物，或其药学上可接受的盐：
其中，
R1为C6-22烷基、C6-22烯基、C21-103聚乙二醇单甲醚基、C6-22烷氧基、胆固醇或优选/>
R2为C6-22烷基、C6-22烯基、C21-103聚乙二醇单甲醚基或C6-22烷氧基，优选C6-18烷基，进一步优选C6-14烷基；
R3为C或S，优选S；
R4为C4-10的亚烷基、三聚乙二醇基团或C4-10亚烷基氧基，优选C4-10的亚烷基；
R5为C2-6亚烷基或三聚乙二醇基团，优选C2-4亚烷基；
R6为
R为氢、氨基、C1-5烷基或R7取代的C1-5烷基；
R7为氨基、C1-5烷基单取代的氨基、羧基、C2-5酯基；
R8为C1-10亚烷基，优选C1-6亚烷基；
R9或R10分别独立地为C1-5烷基，优选C1-3烷基。
作为本发明的一种优选实施方式，此类两亲性树形分子G1分子我们已经申请了化合物专利，公开号为CN 113214171 A。
作为本发明的一种优选，所述的纳米内核材料为包载CRISPR/Cas9质粒的亲水性树形分子为聚酰胺-胺(PAMAM)球形树形分子PAMAM Gn，Gn表示所有亲水性树形分子代数，n优选1～6的整数；亲水性树形分子PAMAM Gn的核心包括但不限于乙二胺、三乙醇胺、胱胺或其衍生物，用于压缩CRISPR/Cas9质粒。
作为本发明的一种优选实施方式，所优先的亲水性树形分子PAMAM Gn以三乙醇胺为核心的聚酰胺-胺球形树形分子，优选G1-G6代的TEA-PAMAM树形分子，以G1代为例结构如式II所示此类分子已发表学术论文https://doi.org/10.1021/bc200275g。
作为本发明的另一种优选实施方式，所优先的亲水性树形分子PAMAM Gn以胱胺为核心的聚酰胺-胺球形树形分子，优选G1-G6代的GSH-PAMAM树形分子，以G1代为例结构如式III所示此类分子已经商品化，可以购买得到https://www.sigmaaldrich.cn/CN/zh/search/pamam-％E8％83％B1％E8％83％BA？focus＝products&page＝1&perpage＝30&sort＝relevance&term＝pamam％20％E8％83％B1％E8％83％BA&type＝product，厂家:Sigma-Aldrich。
作为本发明的一种优选，所述的递送系统纳米内核粒径为5–100nm，壳-核递送系统粒径为50nm–200nm。
本发明所述的一种壳-核结构的CRISPR/Cas9递送系统的制备方法，包括如下步骤：
(1)壳-核结构的CRISPR/Cas9递送系统：采用以下几种方式得到复合物溶液①薄膜分散法：先将一定量亲水性树形分子PMAMA Gn溶于有机溶剂中，旋转蒸发形成薄膜，加入含CRISPR/Cas9质粒的水溶液形成一定的N/P纳米内核复合物水溶液，再将一定量的纳米外壳两亲性树形分子G1溶液以相同方法制备成薄膜，再加入已制备好的纳米内核溶液混匀，静置，最后用无菌水稀释至一定浓度，制备为所需浓度的复合物溶液(或者亲水性树形分子PMAMA Gn的水溶液与CRISPR/Cas9质粒的水溶液按一定的N/P迅速混匀，二者通过静电相互作用形成纳米内核溶液；再将一定量的两亲性树形分子G1水溶液加入至有机溶液中旋转蒸发形成薄膜，加入一定量的内核两亲性树形分子G1水溶液，进一步制备复合物溶液)②溶剂挥发法：将亲水性树形分子PMAMA Gn的水溶液与CRISPR/Cas9质粒的水溶液按一定的N/P迅速混匀，二者通过静电相互作用形成纳米内核水溶液，在无菌条件下操作，将两亲性树形分子G1溶于适量的乙醇或其它有机溶剂中，将其与一定量的纳米内核水溶液搅拌混匀，通过超声或者搅拌使有机溶剂挥发完全，即得复合物溶液；③直接水溶法：在无菌条件下操作，将两亲性树形分子G1溶于无菌水溶液中，经超声后静置得到所需溶液；其中使用的无菌水溶液包括但不限于纯净水、去离子水、RNA-free水溶液、磷酸盐缓冲液和0.9％的氯化钠溶液等。将一定量两亲性树形分子G1的溶液与由亲水性树形分子PMAMA Gn与CRISPR/Cas9质粒的形成的纳米内核水溶液迅速混匀，配置一定N/P比的溶液。混匀后，将复合物溶液用无菌水溶液稀释至一定浓度，即得复合物溶液；
(2)灌装：在无菌条件下操作，将单剂量的复合物溶液灌装密封或制成冻干粉剂。
所述的形成纳米内核的亲水性树形分子PMAMA Gn与CRISPR/Cas9质粒的N/P比为1:10～20:1，进一步优选N/P比为1:5～10:1；纳米外壳两亲性树形分子G1与CRISPR/Cas9质粒的N/P比为1:20～30:1，进一步优选N/P比为1:10～20:1。N/P为树形分子中氨基与核苷酸中磷酸基团的比例。
所述的CRISPR/Cas9质粒选自采用环形质粒pX330或pX485质粒构建的含有不同sgRNA序列的环状脱氧核糖核酸的一种。
所述的递送系统纳米内核复合物粒径为5–100nm，壳-核纳米复合物粒径为50–200nm。
所述的壳-核结构的CRISPR/Cas9递送系统在制备基因编辑治疗药物中的应用，优选在制备治疗癌症的基因编辑治疗药物中的应用。
有益效果：本发明根据CRISPR/Cas9质粒独特的特点，利用亲水性树形分子PMAMAGn其表面多伯胺基团能够结合并压缩较大尺寸的CRISPR/Cas9质粒形成纳米内核，形成均一稳定的纳米复合物，其次，外壳包裹具有疏水烷基链与不同末端修饰亲水树枝状头基的两亲性树形分子G1具有类脂质特性，能够促进细胞摄取及内涵体逃逸等，从而有效的提高CRISPR/Cas9质粒递送系统的效率；此外，不同末端修饰的亲水头基能够赋予其递送系统不同的性质，从而进一步提高递送系统的安全性、摄取能力等。该递送系统可安全高效地将CRISPR/Cas9质粒递送至靶部位，随后被细胞摄取并利用树形分子内部的叔胺基团通过质子海绵效应从内涵体中逃逸，或者同时利用肿瘤部位高GSH条件释放出CRISPR/Cas9质粒以发挥治疗作用。该递送体系能够有效的增强CRISPR/Cas9质粒在体内输送过程中效率，发挥CRISPR/Cas9是疾病治疗中的潜力。
附图说明
图1所述壳-核结构的CRISPR/Cas9递送系统的制备流程示意图
图2所述负载CRISPR/Cas9质粒的壳-核结构复合物的形貌
图3所述负载CRISPR/Cas9质粒的壳-核结构复合物的稳定性
图4所述负载CRISPR/Cas9质粒的壳-核结构纳米复合物的细胞摄取能力
图5所述负载CRISPR/Cas9质粒的壳-核结构复合物的内涵体逃逸能力
图6所述负载CRISPR/Cas9质粒的壳-核结构复合物的基因编辑能力
图7所述负载CRISPR/Cas9质粒的壳-核结构复合物的体内抗肿瘤活性研究中的肿瘤体积变化。
图8实施例8中荷瘤小鼠经过药物处理后各脏器组织切片的H&E染色。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明做进一步的说明。这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：壳-核结构的递送系统中纳米内核材料和纳米外壳材料制备
1.1树形分子与CRISPR/Cas9质粒壳-核复合物的制备
(1)负载CRISPR/Cas9质粒纳米内核复合物制备在无菌条件下操作，分别将亲水性树形分子GSH-PAMAM Gn和TEAPAMAM Gn的水溶液与CRISPR/Cas9质粒pX330-sgEGFP(所用CRISPR/Cas质粒由pX330质粒构建靶向EGFP)的溶液(如2μg)按照N/P比0.5(N/P为树形分子中氨基与核苷酸中磷酸基团的比例)条件的混合，室温孵育30min，分别得到纳米内核复合物pX330-sgEGFP/GSH-PAMAM G1和pX330-sgEGFP/TEA-PAMAM G1。
(2)负载CRISPR/Cas9质粒纳米外壳复合物制备在无菌条件下操作，分别将各纳米外壳材料的水溶液与CRISPR/Cas9质粒pX330-sgEGFP(所用CRISPR/Cas质粒由pX330质粒构建靶向EGFP)的溶液(如2μg)按照N/P比2.5条件的混合分别制备得到不同结构纳米外壳材料负载CRISPR/Cas9质粒的复合物。
(3)负载CRISPR/Cas9质粒壳-核结构纳米复合物制备在无菌条件下操作，将纳米外壳两亲性树形分子的一种ROS-AD C8-10 G1(G1-NH2；下文均以G1-NH2指代)的水溶液与上述纳米内核的水溶液按照N/P比＝2.5的条件混合，室温孵育30min，分别得到不同内核的壳-核结构纳米复合物pX330-sgEGFP/GSH-PAMAM G1/G1-NH2、pX330-sgEGFP/TEA-PAMAMG1/G1-NH2。
实施例2：负载CRISPR/Cas9质粒的壳-核结构的纳米复合物的表征
2.1所述负载CRISPR/Cas9质粒纳米内核复合物的递送效率
取对数生长期的HeLa-EGFP细胞，将其以每孔2×104个细胞的密度接种于24孔板中，待细胞贴壁生长。转染时，按照上述方法分别制备得到G1-G6代的pX330-sgEGFP/TAE-PAMAM Gn纳米内核壳复合物以及G1-G2代的pX330-sgEGFP/GSH-PAMAM Gn纳米内核复合物，并各孔加入250μL的纳米内核复合物使得CRISPR/Cas9质粒终浓度4ng/μL，置于37℃培养箱培养8h，而后更换新鲜培养基，与孵箱内培养至80％密度，使用荧光显微镜拍照记录EGFP荧光情，并通过流式细胞仪测定绿色荧光蛋白的荧光强度(激发波长为488nm，发射波长为507nm)。
表1负载CRISPR/Cas9质粒纳米内核复合物的递送效率
如表1结果所示，不同核心以及不同代数的PAMAM Gn均具有一定的递送活性，表明PAMAM Gn能够负载CRISPR/Cas9质粒将其运输至细胞内发挥疗效，后续我们选择G1-G2代的不同核心的PAMAM Gn作为纳米内核材料用于壳-核结构递送。
2.2所述负载CRISPR/Cas9质粒纳米外壳复合物的递送效率
取对数生长期的HeLa-EGFP细胞，将其以每孔2×104个细胞的密度接种于24孔板中，待细胞贴壁生长。转染时，加入250μL的实施例1中制备得到的不同末端修饰以及不同核心的两亲性树形分子的pX330-sgEGFP/G1纳米外壳复合物，使得CRISPR/Cas9质粒终浓度4ng/μL，置于37℃培养箱培养8h，而后更换新鲜培养基，与孵箱内培养至80％密度，使用荧光显微镜拍照记录EGFP荧光情，并通过流式细胞仪测定绿色荧光蛋白的荧光强度(激发波长为488nm，发射波长为507nm)。
表2负载CRISPR/Cas9质粒纳米外壳复合物的递送效率
如表2结果说明，不同末端以及不同核心的两亲性树形分子G1均具有一定的递送活性，后续我们选择G1-NH2作为纳米外壳材料用于壳-核结构递送。
2.3所述负载CRISPR/Cas9质粒壳-核结构纳米复合物的递送效率
取对数生长期的HeLa-EGFP细胞，将其以每孔2×104个细胞的密度接种于24孔板中，待细胞贴壁生长。转染时，各孔加入250μL实施例1中制备的不同核心和代数的亲水性PMAMAM制备壳-核结构纳米复合物pX330-sgEGFP/PAMAM Gn/G1-NH2，使得CRISPR/Cas9质粒终浓度4ng/μL，置于37℃培养箱培养8h，而后更换新鲜培养基，与孵箱内培养至80％密度，使用荧光显微镜拍照记录EGFP荧光情，并通过流式细胞仪测定绿色荧光蛋白的荧光强度(激发波长为488nm，发射波长为507nm)。本实验用商品化转染试剂Lipofectamine 2000作为阳性对照，评估壳-核结构纳米复合物的递送效率。
表3所述负载CRISPR/Cas9质粒壳-核结构纳米复合物的递送效率
如表3结果所示，pX330-sgEGFP/PAMAM Gn/G1-NH2壳-核结构复合物具有优异的递送效率，并且略优于阳性对照Lipofectamine 2000；除此之外，壳-核结构复合物提高了纳米外壳材料以及纳米内核材料的递送效率，说明壳-核结构递送体系的优越性。
2.4壳-核结构纳米复合物的粒径电位与形貌
按照上述条件制备壳-核结构纳米复合物pX330-sgEGFP/GSH-PAMAM G1/G1-NH2(内核和外壳均为N/P＝2.5)，采用多角度粒度及Zeta电位分析仪测定壳-核结构纳米复合物粒径分布及Zeta电位，并采用透射电子显微镜(TEM)观察负载CRISPR/Cas9质粒形成的壳-核结构的复合物的结构形貌。
表4壳-核结构纳米复合物的粒径电位
如上述表4结果表明，通过动态光散射测得壳-核结构纳米复合物粒径分布为133.8nm，Zeta电位为37.0mV，且从图2结果所示，透射电子显微镜结果中观察到粒径约为110nm左右，中间为圆形核心四周有明显的环状结构的球形颗粒，表明采用亲水性树形分子以及两亲性树形子能够可以将CRISPR/Cas9质粒压缩在核心形成壳-核结构的纳米复合物。
2.5负载CRISPR/Cas9质粒的壳-核结构纳米复合物的稳定性
按照上述实施例1的方法条件制备壳-核结构纳米复合物pX330-sgEGFP/GSH-PAMAM G1/G1-NH2(N/P＝2.5)，采用多角度粒度分析仪测定CRISPR/Cas9质粒形成的壳-核结构的复合物在一定时间内的粒径变化，评估其复合物的稳定性。
如图3所示，负载CRISPR/Cas9质粒的壳-核结构的复合物粒径在48h内均无明显变化，说明树形分子能够有效的负载CRISPR/Cas9质粒形成稳定的纳米颗粒，利于体内外应用。
实施例3：负载CRISPR/Cas9质粒的壳-核结构纳米复合物的细胞摄取能力
取对数生长期的HeLa细胞，以每孔5×104个细胞的密度接种于24孔板，待细胞贴壁后，进行转染，取CRISPR/Cas9质粒用YOYO-1(20μg DNA使用5μL 80μM的红色荧光染料YOYO-1标记)染料标记，将标记后的CRISPR/Cas9质粒与亲水性树形分子、两亲性树形分子按照上述实施例1的方法条件制备壳-核结构纳米复合物pX330-sgEGFP/GSH-PAMAM G1/G1-NH2(内核和外壳均为N/P＝2.5)，各孔加入250μL的壳-核结构纳米复合物使得CRISPR/Cas9质粒终浓度4ng/μL,并分别与细胞共孵育不同时间(0.25、0.5、1、2、4h)后，消化细胞并用PBS洗涤三次，通过流式细胞仪检测细胞内YOYO-1荧光信号，评估细胞对于壳-核结构纳米复合物的摄取。(激发波长为491nm，发射波长为509nm)
如图4所示，随着时间的延长，细胞内YOYO-1荧光信号增加。表明负载CRISPR/Cas9质粒形成的壳-核结构的纳米复合物随着时间的延长，壳-核结构的纳米复合物能被有效摄取，说明具有PAMAM树形分子构成的壳-核结构的纳米复合物具有实现CRISPR/Cas9质粒胞内递送的潜力。
实施例4：负载CRISPR/Cas9质粒的壳-核结构纳米复合物的内涵体逃逸能力
取对数生长期的细胞HeLa细胞，以每孔5×104个细胞的密度接种于24孔板，待细胞贴壁后，进行转染。采取实施例1方法制备的壳-核纳米结构复合物pX330-sgEGFP/GSH-PAMAM G1/G1-NH2(内核和外壳均为N/P＝2.5)分别与细胞置于培养箱培养中共孵育不同时间(1、4h)，转染结束后弃去复合物溶液，用冷PBS洗涤细胞三次，加入PBS稀释的染色液(包含标记细胞核，标记内涵体的颜料)，于培养箱孵育15min，弃去染色液，冷PBS洗涤细胞三次后通过激光共聚焦显微镜观察并拍照记录。
如图5所示，红色荧光代表被YOYO-1标记的壳-核结构纳米复合物，细胞核被标记呈现蓝色荧光，而绿色荧光定位内涵体，红色荧光与绿色荧光重叠是形成黄色荧光，表示壳-核结构纳米复合物与内涵体共定位。在1h时，可以观察到大量的黄色信号，表明壳-核结构纳米复合物摄取进入内涵体内，；孵育4h后，在HeLa细胞中可以观察大量的红色荧光信号，表明壳-核结构纳米复合物实现有效的内涵体逃逸。
实施例5：所述负载CRISPR/Cas9质粒的壳-核结构的递送系统的基因编辑能力
取对数生长期的细胞HeLa细胞，以每孔5×104个细胞的密度接种于24孔板，待细胞贴壁后，进行转染。采取实施例1方法制备的负载CRISPR/Cas9质粒复合物(其内核和外壳N/P＝2.5；CRISPR/Cas9质粒使用pX330质粒构建靶向EGFP以及由pX458质粒构建靶向Survivin)分别与细胞置于培养箱培养中共孵育8h，而后更换新鲜培养基后继续培养至细胞密度为80％。实验结束后收集细胞基因组DNA并将其进行PCR扩增、纯化、变性/退火反应，将所得产物与的T7 E1酶，涡旋混匀，孵育40min加入4μL 6×DNA上样缓冲液，涡旋混匀后利用琼脂糖凝胶电泳评估负载CRISPR/Cas9质粒的壳-核结构的递送系统的基因编辑能力。
如图6所示，图中星号标记的条带的出现说明负载CRISPR/Cas9质粒形成的壳-核结构的递送系统成功对靶标EGFP以及Survivin基因进行了编辑，使其降解为分子量较小的片段。结果表明，该负载CRISPR/Cas9质粒的壳-核结构递送系统能够有效的实现基因定点编辑，从而降低细胞中靶基因的表达，说明该系统具有优异的CRISPR/Cas9质粒递送应用前景。
实施例6：所述负载CRISPR/Cas9质粒形成的壳-核结构的纳米复合物的抗肿瘤增殖活力
构建HeLa荷癌小鼠模型以考察该负载CRISPR/Cas9质粒(CRISPR/Cas质粒使用pX458质粒构建靶向Survivin，同实施例5)的壳-核结构递送系统的抗肿瘤活性，将荷瘤小鼠随机分为3组用于体内抗癌分析。将它们随机分组，分别腹腔注射分别给予生理盐水、空白壳-核结构纳米复合物、包含靶向编辑Survivin的CRISPR/Cas9质粒的壳-核结构纳米复合物的生理盐水溶液，一周给药两次。给药结束后，处死小鼠，剥离肿瘤组织，进行石蜡包埋切片并进行H&E染色以考察载药制剂的体内毒性。
如图7所示，在给药周期结束后，经靶向编辑Survivin的CRISPR/Cas9质粒的壳-核结构纳米复合物给药的小鼠的肿瘤体积明显小于其它对照组别，表明靶向编辑Survivin的CRISPR/Cas9质粒的壳-核结构纳米复合物能够将Survivin的CRISPR/Cas9质粒递送至肿瘤部位，剪切肿瘤相关的Surivivn基因从而发挥优异的抗肿瘤增殖效果，表明该壳-核递送体系能够保护CRISPR Cas9质粒，并将其递送至靶部位，发挥疗效。除此之外，图8显示给药后，小鼠脏器未见明显损伤，表明负载CRISPR/Cas9质粒的壳-核结构的递送系统是一种安全有效的递送平台。这些结果表明，该负载CRISPR/Cas9质粒的壳-核结构递送系统能有效在体内输送CRISPR/Cas9质粒，实现体内定点基因编辑，明显抑制肿瘤生长。
上述实施例中涉及的树形分子结构如下：
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GSH-PAMAM Gn的通式为：[SCH2CH2N(R(Rn-1)2)2]2,其中n＝1、2、3、4、5、6；R＝CH2CH2CONHCH2CH2N；n＝1时，R0＝H；n>1时，Rn-1＝R(Rn-2)2；以下以GSH-PAMAM G1与GSH-PAMAMG2为例。
TEA-PAMAM Gn的通式为：N(CH2CH2OR(Rn-1)2)3,其中n＝1、2、3、4、5、6；n＝1时，R0＝H；n>1时，Rn-1＝R(Rn-2)2；以下以TEA-PAMAM G1与TEA-PAMAM G2为例。
按照上述方法制备pX330-sgEGFP/GSH-PAMAM G1/G1-Dea、pX330-sgEGFP/GSH-PAMAM G1/G1-Gua、pX330-sgEGFP/GSH-PAMAM G1/G1-Pyr、pX330-sgEGFP/GSH-PAMAM G1/G1-Ta、pX330-sgEGFP/GSH-PAMAM G1/G1-Pid、pX330-sgEGFP/TEA-PAMAM G1/G1-Dea、pX330-sgEGFP/TEA-PAMAM G1/G1-Gua、pX330-sgEGFP/TEA-PAMAM G1/G1-Pyr、pX330-sgEGFP/TEA-PAMAM G1/G1-Ta、pX330-sgEGFP/TEA-PAMAM G1/G1-Pid、pX330-sgEGFP/GSH-PAMAM G2/G1-Dea、pX330-sgEGFP/GSH-PAMAM G2/G1-Gua、pX330-sgEGFP/GSH-PAMAM G2/G1-Pyr、pX330-sgEGFP/GSH-PAMAM G2/G1-Ta、pX330-sgEGFP/GSH-PAMAM G2/G1-Pid、pX330-sgEGFP/TEA-PAMAM G2/G1-Dea、pX330-sgEGFP/TEA-PAMAM G2/G1-Gua、pX330-sgEGFP/TEA-PAMAM G2/G1-Pyr、pX330-sgEGFP/TEA-PAMAM G2/G1-Ta、pX330-sgEGFP/TEA-PAMAM G2/G1-Pid也具有与壳-核结构纳米复合物pX330-sgEGFP/PAMAM Gn/G1-NH2相似的递送效率和肿瘤抑制活性。
上述实施例为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种壳-核结构的CRISPR/Cas9递送系统，其特征在于该壳-核递送系统由纳米外壳和包载CRISPR/Cas9质粒的纳米内核组成，所述纳米外壳材料选自两亲性树形分子或其类似物；纳米内核为包载CRISPR/Cas9质粒的亲水性树形分子。
2.根据权利要求1所述的壳-核结构的CRISPR/Cas9递送系统，其特征在于所述的纳米外壳材料为不同末端修饰的G1代两亲性树形分子，由亲水端和疏水端组成；两亲性树形分子G1的疏水端为疏水烷基链，亲水端为树枝状结构，包括但不限于聚酰胺、聚氨酯骨架，其末端修饰不同功能的功能基团，包括但不限于胍基、N,N-二甲基、N,N-二乙基、吡咯、哌啶、吗啉，哌嗪。
3.根据权利要求2所述的壳-核结构的CRISPR/Cas9递送系统，其特征在于纳米外壳材料为式I所示的不同末端修饰的两亲性树形分子:
其中，
R1为C6-22烷基、C6-22烯基、C21-103聚乙二醇单甲醚基、C6-22烷氧基、胆固醇或优选
R2为C6-22烷基、C6-22烯基、C21-103聚乙二醇单甲醚基或C6-22烷氧基，优选C6-18烷基，进一步优选C6-14烷基；
R3为C或S，优选S；
R4为C4-10的亚烷基、三聚乙二醇基团或C4-10亚烷基氧基，优选C5-10的亚烷基；
R5为C2-6亚烷基或三聚乙二醇基团，优选C2-4亚烷基；
R6为
R为氢、氨基、C1-5烷基或R7取代的C1-5烷基；
R7为氨基、C1-5烷基单取代的氨基、羧基、C2-5酯基；
R8为C1-10亚烷基，优选C1-6亚烷基；
R9或R10分别独立地为C1-5烷基，优选C1-3烷基。
4.根据权利要求2所述的壳-核结构的CRISPR/Cas9递送系统，其特征在于包载CRISPR/Cas9质粒的亲水性树形分子为聚酰胺-胺球形树形分子PAMAM Gn，Gn表示所有亲水性树形分子代数，n优选1～6的整数；亲水性树形分子PAMAM Gn的核心包括但不限于乙二胺、三乙醇胺、胱胺或其衍生物，用于压缩CRISPR/Cas9质粒。
5.根据权利要求4所述的壳-核结构的CRISPR/Cas9递送系统，其特征在于包载CRISPR/Cas9质粒的亲水性树形分子PAMAM Gn为以三乙醇胺为核心的聚酰胺-胺球形树形分子；其G1代结构如式II：
6.根据权利要求4所述的壳-核结构的CRISPR/Cas9递送系统，其特征在于包载CRISPR/Cas9质粒的亲水性树形分子为以胱胺为核心的聚酰胺-胺球形树形分子，优选G1-G3代的GSH-PAMAM树形分子，其G1代结构如式III所示：
7.一种壳-核结构的CRISPR/Cas9递送系统的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)树形分子的制备：在无菌条件下操作，将亲水性树形分子PMAMAM Gn以及两亲性树形分子G1分别溶于无菌水中，超声，静置，制备成储备液；
(2)壳-核结构的CRISPR/Cas9递送系统的制备：将亲水性树形分子PAMAM Gn的储备液与CRISPR/Cas9质粒的水溶液迅速混匀，配置一定N/P的溶液，N/P为树形分子中氨基与核苷酸中磷酸基团的比例，静置后，加入不同末端修饰的两亲性树形分子G1水溶液混匀静置即得含壳-核结构的CRISPR/Cas9递送系统的溶液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述壳的两亲性树形分子和亲水性树形分子的溶解温度为20～30℃，静置时间为10～30min；步骤(2)中所述的CRISPR/Cas9质粒选自采用环形质粒pX330或pX485质粒构建的含有不同sgRNA序列的环状脱氧核糖核酸，所述的形成纳米内核的亲水性树形分子PAMAM Gn与CRISPR/Cas9质粒的N/P比为1:10～20:1，优选N/P比为1:5～10:1；两亲性树形分子G1与CRISPR/Cas9质粒的N/P比为1:20～30:1，优选N/P比为1:10～20:1，静置时间为10～40min。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括(3)灌装：在无菌条件下操作，将单剂量的含壳-核结构的CRISPR/Cas9递送系统溶液灌装到安瓿瓶中，密封。
10.权利要求1-6中任一项所述的壳-核结构的CRISPR/Cas9递送系统在制备基因编辑治疗药物中的应用，优选在制备治疗癌症的基因编辑治疗药物中的应用。
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