CN113082001B - 一种核酸递送系统及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种核酸递送系统及其制备方法和应用，所述核酸递送系统是以聚羟基脂肪酸酯和胺类材料为载体包载核酸形成的纳米粒子。本发明创造性地以聚羟基脂肪酸酯复配胺类材料作为包载核酸的载体，其中胺类材料与核酸分子结合，其所提供的正电性可提高核酸的装载效率，并提高核酸的细胞摄取效率；其中聚羟基脂肪酸酯具有良好的生物可降解性和生物相容性，且可保护核酸在递送过程中的分子稳定性，使核酸免受核酸酶和溶酶体的降解，增加核酸的细胞摄取效率，并延长其释放时间。最终制得的核酸递送系统具有良好的核酸包载能力，可有效地将核酸药物递送至细胞内，具有转染率高、细胞毒性低的优点。

Description

一种核酸递送系统及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种核酸递送系统及其制备方法和应用，尤其涉及一种包载能力强、稳定性好、细胞摄取效率高的核酸递送系统及其制备方法和应用。
背景技术
siRNA药物必须进入到细胞质与信使RNA(messenger RNA,mRNA)结合才能够发挥药效。但由于siRNA较大的分子量及携带的大量负电荷以及易被核酸酶降解的特性，使其体内递送具有较大的难度。一般需要将siRNA分子进行一定的化学修饰或包载到具有细胞转染能力的纳米载体中，使其被靶细胞摄取，从而进入细胞质内启动RNAi机制。由于siRNA药物分子量大、本身携带负电，并易受体内核酸酶降解，因此siRNA药物的体内递送一般需要借助一定的载体，以提高其在递送过程中的稳定性和细胞转染效率。
CN111714468A公开了一种siNRA递送系统复合物的制备方法，先由Boc保护的组氨酸与胆固醇反应生成Boc保护的组氨酸胆固醇基酯，后在三氟乙酸中脱BOC释放保护的氨基生成组氨酸胆固醇基酯，后由氨基与羧甲基壳聚糖的羧基反应修饰到长链羧甲基壳聚糖生成组氨酸胆固醇基酯修饰的羧甲基壳聚糖，对组氨酸胆固醇基酯修饰的羧甲基壳聚糖进行靶向标记生成组氨酸胆固醇基酯与靶向标记物共同修饰的羧甲基壳聚糖高分子化合物，然后在临界胶束浓度以上通过自组装形成稳定的球状递送载体，与siRNA混合，制得siNRA递送系统复合物，其具有较好的靶向性，环境响应性，siRNA稳定性。
CN105078889A公开了一种软骨siRNA脂质体递送系统及其制备方法，包括脂质体、脂质体修饰物和小核酸药物，脂质体为磷脂酰胆碱、胆固醇、Dlin-KC2-DMA；脂质体修饰物为聚乙二醇脂质共轭物，小核酸药物为Ihh-siRNA。形成的复合物带有正电荷，安全、体积小，能分布到全层软骨组织中。载体实验证实，能将siRNA递送入软骨细胞，成功敲除软骨细胞内的相应基因，突破了软骨组织中基因敲除的瓶颈；可作为一个靶向基因来治疗PTOA。
目前如何提高核酸类药物在递送过程中的稳定性和细胞转染效率的策略还十分有限，聚酯类高分子作为siRNA药物的递送材料也具有一定的潜能，但尚需更多的相关研究，探索这类材料用于siRNA药物递送的可行性是非常有必要的。
PHA是由细菌生物合成的聚酯，具有良好的生物相容性和生物可降解性，已成功应用于组织工程支架等相关研究。与PLGA等生物材料相比，PHA结构多元化，通过改变给料、发酵过程可以很方便地改变PHA的组成，而组成结构多样性带来的性能多样化使其在应用中具有明显的优势。且PHA的生产是一种低能耗和低二氧化碳排放的生产，因此从生产过程到产品对于环境保护都是很有利的，更加符合绿色化学的要求。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种核酸递送系统及其制备方法和应用，尤其提供一种包载能力强、稳定性好、细胞摄取效率高的核酸递送系统及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种核酸递送系统，所述核酸递送系统是以聚羟基脂肪酸酯和胺类材料为载体包载核酸形成的纳米粒子。
本发明创造性地以聚羟基脂肪酸酯复配胺类材料作为包载核酸的载体，其中胺类材料与核酸分子结合，其所提供的正电性可提高核酸的装载效率，并提高核酸的细胞摄取效率；其中聚羟基脂肪酸酯具有良好的生物可降解性和生物相容性，且可保护核酸在递送过程中的分子稳定性，使核酸免受核酸酶和溶酶体的降解，增加核酸的细胞摄取效率，并延长其释放时间。最终制得的核酸递送系统具有良好的核酸包载能力，可有效地将核酸药物递送至细胞内，具有转染率高、细胞毒性低的优点。
优选地，所述聚羟基脂肪酸酯与胺类材料的质量比为(1-10):(1-5)。
本发明所涉及的核酸递送系统中聚羟基脂肪酸酯与胺类材料的质量比特定选择上述范围内，使得聚羟基脂肪酸酯与胺类材料的配合效果更佳，具有更显著的核酸包载能力，细胞转染率更高，稳定性更强。
所述(1-10)是指具体值可以选择1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
所述(1-5)是指具体值可以选择1、2、3、4、5等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述聚羟基脂肪酸酯包括聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸-co-3-羟基己酸)(P3HB3HV3HHx)、聚(3-羟基丁酸-3-羟基己酸)(PHBHHx)、聚(3-羟基丁酸-4-羟基丁酸)(P3HB4HB)或聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸)(PHBV)中的任意一种或至少两种的组合。
所述至少两种的组合例如聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸-co-3-羟基己酸)和聚(3-羟基丁酸-3-羟基己酸)的组合、聚(3-羟基丁酸-3-羟基己酸)和聚(3-羟基丁酸-4-羟基丁酸)的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述胺类材料包括二油酰基卵磷脂(DOPC)和/或聚酰胺胺树枝状大分子(PAMAM)。
相对于其他类型的胺类材料，本发明优选二油酰基卵磷脂和/或聚酰胺胺树枝状大分子是因为其能使得核酸递送系统的核酸包载能力更强，细胞转染率更高，稳定性更强。
优选地，所述核酸包括单链DNA、双链DNA、环状DNA、siRNA、miRNA或mRNA。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的核酸递送系统的制备方法，所述核酸递送系统采用复乳化溶剂挥发法制备得到。
本发明所涉及的核酸递送系统的制备方法条件稳定，操作简便，采用的聚羟基脂肪酸酯(PHA)来源于细菌发酵，具有低毒和生物可降解的优良特性，且生产过程更符合绿色化学的要求，对环境无污染。具有实用性，非常适合于大规模的工业化生产。
优选地，所述制备方法包括：
(1)将聚羟基脂肪酸酯、胺类材料和核酸混合后形成W/O初乳；
(2)初乳与表面分散剂溶液混合形成复乳；
(3)将复乳再次加至表面分散剂溶液中，待有机溶剂挥发后，复乳滴固化形成所述核酸递送系统。
步骤(1)实际为由水相和油相溶液混合形成的W/O初乳，然后步骤(2)再与水相溶液混合形成W/O/W复乳，最后步骤(3)向复乳中加入更多的外水相溶液，并使有机溶剂挥发，收集固化后的纳米粒子。
优选地，步骤(1)所述聚羟基脂肪酸酯、胺类材料和核酸可选地在混合前配制成溶液，所述溶液的溶剂各自独立地选自：水、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、甲苯或环己烷中的至少一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(1)所述混合在超声下进行。
优选地，所述超声的功率为50-80W，例如50W、55W、60W、65W、70W、75W、80W等，时间为3-8min，例如3min、4min、5min、6min、7min、8min等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(2)所述表面分散剂包括聚乙烯醇、吐温80、聚乙烯吡咯烷酮或烷基糖苷；优选聚乙烯醇。
此处优选聚乙烯醇作为表面分散剂是因为相对于其他类型的表面分散剂，聚乙烯醇具有最优的亲水亲油平衡值。
优选地，步骤(2)所述表面分散剂溶液的溶剂为水。
优选地，步骤(2)所述混合在超声下进行。
优选地，所述超声的功率为50-80W，例如50W、55W、60W、65W、70W、75W、80W等，时间为3-8min，例如3min、4min、5min、6min、7min、8min等，上述数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
上述制备方法中形成初乳和复乳的工艺参数对于初乳和复乳的稳定性也非常重要，进一步影响最终产品的稳定性和细胞摄取效率。
优选地，步骤(3)所述表面分散剂溶液的溶剂为水。
优选地，步骤(3)所述有机溶剂挥发的方法包括在400-800rpm(例如400rpm、500rpm、600rpm、700rpm或800rpm等)的速度下磁力搅拌4-8h(例如4h、5h、6h、7h、8h等)。
第三方面，本发明提供一种核酸类药物，所述核酸类药物包括如第一方面所述的核酸递送系统。
优选地，所述核酸类药物还包括药学上可接受的药用辅料。
优选地，所述药用辅料包括增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、芳香剂、缓冲剂、增塑剂、增稠剂或保湿剂中的至少一种或至少两种的组合。
第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的核酸递送系统在制备基因治疗类药物中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明创造性地以聚羟基脂肪酸酯复配胺类材料作为包载核酸的载体，其中胺类材料与核酸分子结合，其所提供的正电性可提高核酸的装载效率，并提高核酸的细胞摄取效率；其中聚羟基脂肪酸酯具有良好的生物可降解性和生物相容性，且可保护核酸在递送过程中的分子稳定性，使核酸免受核酸酶和溶酶体的降解，增加核酸的细胞摄取效率，并延长其释放时间。最终制得的核酸递送系统具有良好的核酸包载能力，可有效地将核酸药物递送至细胞内，具有转染率高、细胞毒性低的优点。
附图说明
图1是实施例1、实施例8制得的两种纳米粒在siRNA浓度为100nM时，对细胞荧光蛋白表达强度图；
图2是实施例8制得的纳米粒在siRNA浓度为100、200、300nM时对细胞中EGFP表达水平的影响结果图；
图3是实施例1制得的纳米粒在siRNA浓度为100、200、300nM时对细胞中EGFP表达水平的影响结果图；
图4是利用CCK8试剂盒进行细胞毒性检测的结果图(其中a、b、c、d分别表示MDA-MB-231-EGFP,24h、MDA-MB-231-EGFP,72h、BEAS-2B,24h、BEAS-2B,72h)；
图5是利用LDH试剂盒进行细胞毒性检测的结果图(其中a、b、c、d分别表示MDA-MB-231-EGFP,24h、MDA-MB-231-EGFP,72h、BEAS-2B,24h、BEAS-2B,72h)；
图6是纳米粒在pH值为5的条件下3h的溶血率统计图；
图7是纳米粒在pH值为7.4的条件下3h的溶血率统计图；
图8是纳米粒在pH值为7.4的条件下12h的溶血率统计图；
图9是利用荧光显微镜分析纳米粒以50nM，100nM，150nM，200nM，250nM及300nM的siRNA终浓度转染24h后，细胞内cy5-siRNA的荧光强度统计图；
图10是利用流式细胞仪分析纳米粒以50nM，100nM，150nM，200nM，250nM及300nM的siRNA终浓度转染24h后，细胞内cy5-siRNA的荧光强度统计图；
图11是利用荧光显微镜分析纳米粒以siRNA终浓度为200nM，转染BEAS-2B细胞4h，6h，8h，12h及24h后的细胞内cy5荧光强度统计图；
图12是利用流式细胞仪分析纳米粒以siRNA终浓度为200nM，转染BEAS-2B细胞4h，6h，8h，12h及24h后的细胞内cy5荧光强度统计图；
图13是纳米粒在BEAS-2B细胞中转染12h及24h后，纳米粒与早期内体及溶酶体的共定位情况镜下观察图；
图14是纳米粒在BEAS-2B细胞中转染12h及24h后，纳米粒与早期内体及溶酶体的共定位系数统计图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例所涉及的siRNA分子为anti-EGFP siRNA和cy5-siRNA(购自广州市锐博生物科技有限公司)。
所涉及的P3HB3HV3HHx购自于北京蓝晶微生物科技有限公司；P3HB4HB购自于北京蓝晶微生物科技有限公司；DOPC购自于Avanti Polar Lipids Inc；第四代氨基表面聚酰胺胺树枝状大分子(G4)购自于NanoSynthons。
实施例1
本发明提供一种核酸递送系统，命名为P3HB3HV3HHx/DOPC/siRNA-1纳米粒，其制备方法如下：
(1)量取26.5μL 50mg/mL的DOPC氯仿溶液，加入到玻璃管中，置于通风橱中，待溶剂完全挥干后，加入662.5μL 1％的P3HB3HV3HHx二氯甲烷溶液。取20μL浓度为50nmol/mL的siRNA溶液(溶剂为DEPC水)，补加DEPC水至331.3μL，加入上述玻璃瓶中。在超声细胞破碎仪65W(超声细胞破碎仪最大功率的10％)功率下，超声5min(每超声3s暂停2s)，形成W/O初乳。
(2)在初乳中加入1987.5μL 2％(w/w)的PVA水溶液，涡旋30s，65W的功率下超声5min(每超声3s暂停2s)，形成复乳。
(3)将复乳加入至5.96mL 2％(w/w)的PVA水溶液中，磁力搅拌6h(600rpm)使二氯甲烷充分挥发。随着二氯甲烷的挥发，复乳滴固化形成纳米粒。
(4)在4℃条件下，18000rpm离心15min，弃去上清液，收集固化的纳米粒。将所得纳米粒用DEPC水重复洗涤3次，分散在1mL DEPC水中，得到P3HB3HV3HHx/DOPC/siRNA纳米粒。
实施例2
本发明提供一种核酸递送系统，命名为P3HB3HV3HHx/DOTAP/siRNA纳米粒，其制备方法与实施例1的区别仅在于：将DOPC替换成等量的DOTAP，其他条件均保持不变。
实施例3
本发明提供一种核酸递送系统，命名为P3HB3HV3HHx/bPEI/siRNA纳米粒，其制备方法与实施例1的区别仅在于：将DOPC替换成等量的bPEI，其他条件均保持不变。
实施例4
本发明提供一种核酸递送系统，命名为P3HB3HV3HHx/DOPC/siRNA-2纳米粒，其制备方法与实施例1的区别仅在于：将PVA替换成等量的PVP，其他条件均保持不变。
实施例5
本发明提供一种核酸递送系统，命名为P3HB3HV3HHx/DOPC/siRNA-3纳米粒，其制备方法与实施例1的区别仅在于：步骤(1)和步骤(2)中超声功率为100W，时间3min。其他条件均保持不变。
实施例6
本发明提供一种核酸递送系统，命名为P3HB3HV3HHx/DOPC/siRNA-4纳米粒，其制备方法与实施例1的区别仅在于：步骤(1)和步骤(2)中超声功率为30W，时间8min。其他条件均保持不变。
实施例7
本发明提供一种核酸递送系统，命名为P3HB4HB/G4/siRNA纳米粒，其制备方法如下：
(1)量取20μL浓度为50nmol/mL的siRNA溶液(溶剂为DEPC水)及12.5μL 30mg/mL的G4(N/P＝40)水溶液加入EP管中，补加DEPC水至93.5μL，反复吹打10次混匀，25℃下静置30min以形成静电复合物。在玻璃管中加入187μL 1％的P3HB4HB二氯甲烷溶液，加入上述静电复合物溶液，65W的功率下超声5min(每超声3s暂停2s)，形成W/O初乳；
(2)初乳中加入561μL 2％(w/w)的PVA水溶液，涡旋30s，65W的功率下超声5min(每超声3s暂停2s)形成复乳；
(3)将复乳加入至1.68mL 2％(w/w)PVA水溶液中，磁力搅拌6h(600rpm)使二氯甲烷充分挥发。随着二氯甲烷的挥发，复乳乳滴固化形成纳米粒。
(4)在4℃条件下，18000rpm离心15min，弃去上清液，收集固化的纳米粒。将所得纳米粒用DEPC水重复洗涤3次，分散在1mL DEPC水中，得到P3HB4HB/G4/siRNA纳米粒。
实施例8
本发明提供一种核酸递送系统，命名为P3HB3HV3HHx/G4/siRNA纳米粒，其制备方法如下：
(1)量取20μL浓度为50nmol/mL的siRNA溶液(溶剂为DEPC水)及12.5μL 30mg/mL的G4(N/P＝40)水溶液加入EP管中，补加DEPC水至93.5μL，反复吹打10次混匀，25℃下静置30min以形成静电复合物。在玻璃管中加入187μL 1％的P3HB3HV3HHx二氯甲烷溶液，加入上述静电复合物溶液，65W的功率下超声5min(每超声3s暂停2s)，形成W/O初乳；
(2)初乳中加入561μL 2％(w/w)的PVA水溶液，涡旋30s，65W的功率下超声5min(每超声3s暂停2s)形成复乳；
(3)将复乳加入至1.68mL 2％(w/w)PVA水溶液中，磁力搅拌6h(600rpm)使二氯甲烷充分挥发。随着二氯甲烷的挥发，复乳乳滴固化形成纳米粒。
(4)在4℃条件下，18000rpm离心15min，弃去上清液，收集固化的纳米粒。将所得纳米粒用DEPC水重复洗涤3次，分散在1mL DEPC水中，得到P3HB3HV3HHx/G4/siRNA纳米粒。
测试例1
纳米粒包封率的测定：
对于实施例1-8中制备好并重悬于水中的样品，取适量样品(0.05nmol siRNA)，离心弃去上清，加入200μL氯仿溶解PHA；加入500μL HD solution(含1mg/mL肝素，100nM n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷)，涡旋混合5min；在脱色摇床上混合90min；12000rpm 4℃离心20min使水层和有机层分离；取出300μL上清液，37℃水浴5min，去除剩余有机溶剂；稀释样品至标准曲线线性浓度范围内，每孔加入100μL Ribogreen稀释液，避光(锡箔纸包裹)25℃孵育3min；利用酶标仪(激发波长485nm，发射波长530nm)测定荧光强度。结果如表1所示：
表1
Figure BDA0003083187950000111
Figure BDA0003083187950000121
由表1数据可知：本发明所涉及的核酸递送系统中胺类材料的类型、制备过程中所使用的表面分散剂类型、超声参数等均会影响核酸的包封率，其中胺类材料类型的影响最为显著。
测试例2
粒径及Zeta电位的测定和储存稳定性的考察：
将实施例1-8制得的纳米粒用超纯水稀释100倍后使用Malvern Zetasizer分析仪测定其粒径，PDI及Zeta电位。结果如表2所示。
表2
组别 粒径(nm)(n＝3) PDI(n＝3) Zeta电位(n＝3)
实施例1 181.5±6.6 0.055±0.025 -11.20±1.71
实施例2 160.6±1.3 0.150±0.049 +11.90±5.92
实施例3 224.4±2.9 0.262±0.039 -9.54±9.79
实施例4 181.5±5.5 0.162±0.053 +9.88±4.62
实施例5 178.6±2.5 0.175±0.123 +5.80±1.25
实施例6 164.3±2.5 0.190±0.102 +7.52±2.52
实施例7 261.3±2.6 0.106±0.010 +19.80±1.05
实施例8 248.3±7.3 0.099±0.031 +0.99±4.46
将纳米粒重悬于DEPC水中，储存于4℃条件下，于第1天，第7天，第10天及第14天分别取样，用超纯水稀释后使用Malvern Zetasizer分析仪测定其粒径，PDI及Zeta电位，以检测其储存稳定性。每个制剂组合重复三个样品，每个样品测定3次。结果分别如表3-5所示。
表3
粒径(nm) 第1天 第7天 第10天 第14天
实施例1 181.5±6.6 184.1±4.0 186.3±5.8 349.0±64.6
实施例2 160.6±1.3 168.5±2.3 159.5±5.2 190.3±5.6
实施例3 224.4±2.9 225.6±6.2 231.2±4.1 253.1±2.5
实施例4 181.5±5.5 185.2±3.2 187.5±3.2 195.3±4.1
实施例5 178.6±2.5 182.3±3.4 183.4±2.3 190.5±22.8
实施例6 164.3±2.5 168.3±2.3 169.2±1.4 173.2±13.9
实施例7 261.3±2.6 265.3±2.8 167.2±1.9 180.2±3.9
实施例8 248.3±7.3 258.6±33.3 236.4±5.7 262.1±14.6
表4
Figure BDA0003083187950000131
Figure BDA0003083187950000141
表5
Zeta电位 第1天 第7天 第10天 第14天
实施例1 -11.20±1.71 -10.99±5.05 -8.04±4.15 -11.67±2.57
实施例2 +11.90±5.92 +10.85±3.26 +12.03±2.36 +15.20±5.43
实施例3 -9.54±9.79 -5.68±10.23 -12.65±8.15 -15.15±5.26
实施例4 +9.88±4.62 +12.02±5.23 +15.02±2.78 +10.89±5.93
实施例5 +5.80±1.25 +6.23±2.51 +6.15±5.23 +11.56±1.98
实施例6 +7.52±2.52 +10.25±3.25 +11.23±3.89 +15.26±3.95
实施例7 +19.80±1.05 +20.36±5.17 +26.2±6.19 +21.83±4.15
实施例8 +0.99±4.46 +3.65±2.22 +14.93±1.72 +13.91±7.45
由表3-表5数据可知：本发明所涉及的核酸递送系统在7天内的稳定性均很好，其中实施例8在14天内的稳定性最好。
测试例3
纳米粒基因抑制效果的检测：
将对数期MDA-MB-231-EGFP细胞按5×104cells/孔的密度种植于24孔板中，于空气环境培养箱37℃培养18h，待细胞融合度达50％时，弃去细胞培养液，每孔加入500μL含1％双抗的完全培养基，加入实施例1和实施例8的纳米粒使培养基中的siRNA终浓度为100nM，同时设置加入lipofectamine3000与siRNA形成的lipoplex的阳性对照孔及只加入等量PBS的阴性对照孔。置于培养箱中空气条件下培养48h后，弃去培养液，用1mL PBS溶液清洗后加入500μL PBS溶液。利用德国莱卡公司倒置荧光显微镜或BD C6Plus流式细胞仪进行检测。
图1展示了实施例1和实施例8制得的两种纳米粒在siRNA浓度为100nM时，对细胞荧光蛋白表达强度的抑制效果(标尺为250μm)。图2-3展示了实施例1和实施例8制得的两种纳米粒在siRNA浓度为100、200、300nM时，均可使细胞中EGFP的表达水平显著降低。
测试例4
纳米粒毒性检测：
将对数期BEAS-2B、MDA-MB-231-EGFP细胞按3×103cells/孔的密度种植于96孔板中，于空气坏境培养箱37℃培养18h，待细胞融合度达50％时，弃去细胞培养液，每孔加入100μL含1％双抗的完全培养基，加入实施例1和实施例8制得的纳米粒使培养基中siRNA终浓度为100nM，同时设置只加培养液的空白孔，未经制剂处理的空白细胞孔和lipofectamine3000作为转染试剂的对照孔。于培养箱中继续孵育24h或72h后，利用CCK8或LDH试剂盒进行细胞毒性检测。
图4为利用CCK8试剂盒进行细胞毒性检测的结果(其中a、b、c、d分别表示MDA-MB-231-EGFP,24h、MDA-MB-231-EGFP,72h、BEAS-2B,24h、BEAS-2B,72h)，图5为利用LDH试剂盒进行细胞毒性检测的结果(其中a、b、c、d分别表示MDA-MB-231-EGFP 24h、MDA-MB-231-EGFP72h、BEAS-2B 24h、BEAS-2B 72h.)。综合两种细胞毒性检测方法所得的实验结果，两种处方的纳米粒以100nM的siRNA终浓度作用于BEAS-2B及MDA-MB-231-EGFP细胞时，细胞毒性均较小。
测试例5
纳米粒溶血性检测：
取无菌新西兰兔血收集到涂有肝素的试管中，5000rpm离心5min，弃去上清后用生理盐水洗涤沉淀的红细胞3次，至上清不显红色为止。将所得红细胞用生理盐水稀释成2％(v/v)的混悬液备用。将实施例8制得的纳米粒重悬于pH 5.0和pH 7.4的PBS溶液中，每个EP管中加入400μL纳米制剂，与400μL红细胞悬液混匀，另取400μL TritonX-100(0.2％，v/v)和生理盐水分别做阳性对照和阴性对照。静置3h或12h后5000rpm离心10min，吸取上清用多功能酶标仪在540nm处测定其吸收值，计算溶血率。
图6展示了纳米粒在pH值为5的条件下3h的溶血率，根据实验结果可知，纳米粒在100nM，200nM及300nM浓度的下溶血率均低于5％。
图7展示了纳米粒在pH值为7.4的条件下3h的溶血率，根据实验结果可知，纳米粒在100nM，200nM及300nM浓度下的溶血率均低于5％。
图8展示了纳米粒在pH值为7.4的条件下12h的溶血率，根据实验结果可知，纳米粒在100nM，200nM及300nM浓度下的溶血率均低于5％。
测试例6
纳米粒的浓度梯度细胞摄取试验：
将对数期BEAS-2B细胞按5×104cells/孔的密度种植于24孔板中，5％CO2培养箱37℃培养18h，待细胞融合度达50％时，弃去细胞培养液，每孔加入500μL含1％双抗的完全培养基，加入实施例8制得的纳米粒使培养基中的siRNA终浓度为50nM，100nM，150nM，200nM，250nM，300nM。于培养箱培养24h后，利用荧光显微镜及流式细胞仪进行分析。
图9-10展示了该纳米粒以50nM，100nM，150nM，200nM，250nM及300nM的siRNA终浓度转染24h后，细胞内cy5-siRNA的荧光强度。结果显示：纳米粒的细胞摄取存在浓度依赖性，siRNA终浓度为150nM时，达到细胞摄取效率的平台期。
测试例7
纳米粒的时间梯度细胞摄取试验：
将对数期BEAS-2B细胞按5×104cells/孔的密度种植于24孔板中，5％CO2培养箱37℃培养18h，待细胞融合度达50％时，弃去细胞培养液，每孔加入500μL含1％双抗的完全培养基，加入实施例8制得的纳米粒使培养基中的siRNA终浓度为200nM。于培养箱中培养4h，6h，8h，12h，24h后，弃去培养液，利用荧光显微镜及流式细胞仪进行分析。
图11-12展示了该纳米粒以siRNA终浓度为200nM，转染BEAS-2B细胞4h，6h，8h，12h及24h后的细胞内cy5荧光强度。由结果可知：纳米粒在转染24h内细胞内cy5荧光强度一直增高。
测试例8
纳米粒溶酶体逃逸考察：
取对数生长期的BEAS-2B细胞，以3×104cells/孔的密度接种于共聚焦专用8孔板中，于5％CO2培养箱37℃培养过夜使细胞贴壁，弃掉培养液，分别加入早期内体(EE)及溶酶体(Lyso)的红色荧光蛋白(RFP)染料孵育24h，弃掉培养液，加入实施例8制得的纳米粒使培养基中的siRNA终浓度为200nM的培养基(培养基中加入1％青霉素/链霉素双抗)培养12h或24h后，加入Hoechst对细胞核进行染色，用PBS清洗后加入500μL PBS，于结构光学显微镜下观察，63倍油镜下拍照并利用ZEISS(black version)软件计算出SIM超分辨图片。利用image j软件对siRNA药物与细胞器(早期内体及溶酶体)的Manders’共定位系数进行计算比较。
本试验用cy5标记siRNA(图13中红色)，用RFP染料标记早期内体及溶酶体(图13中绿色)，用Hoechst标记细胞核(图13中蓝色)，通过计算的Manders’共定位系数来表征siRNA与早期内体及溶酶体的共定位情况。
图13-14展示了该纳米粒在BEAS-2B细胞中转染12h及24h后，纳米粒与早期内体及溶酶体的共定位情况。由图可知：由12h至24h的过程中，siRNA在早期内体中的共定位系数增大，而与溶酶体的共定位系数下降。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种核酸递送系统及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (9)

1.一种核酸递送系统，其特征在于，所述核酸递送系统是以聚羟基脂肪酸酯和胺类材料为载体包载核酸形成的纳米粒子；所述聚羟基脂肪酸酯与胺类材料的质量比为(1-10):(1-5)；所述胺类材料为二油酰基卵磷脂或第四代氨基表面聚酰胺胺树枝状大分子G4；
所述聚羟基脂肪酸酯选自聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸-co-3-羟基己酸)、聚(3-羟基丁酸-3-羟基己酸)、聚(3-羟基丁酸-4-羟基丁酸)或聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基戊酸)中的任意一种或至少两种的组合；
所述核酸选自siRNA、miRNA或mRNA；
所述核酸递送系统采用复乳化溶剂挥发法制备得到，具体包括：
(1)将聚羟基脂肪酸酯、胺类材料和核酸混合后形成W/O初乳；所述混合在超声下进行，功率为50-80W，时间为3-8min；
(2)初乳与聚乙烯醇溶液混合形成复乳；所述混合在超声下进行，功率为50-80W，时间为3-8min；
(3)将复乳再次加至聚乙烯醇溶液中，待有机溶剂挥发后，复乳滴固化形成所述核酸递送系统。
2.如权利要求1所述的核酸递送系统的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
(1)将聚羟基脂肪酸酯、胺类材料和核酸混合后形成W/O初乳；所述混合在超声下进行，功率为50-80W，时间为3-8min；
(2)初乳与聚乙烯醇溶液混合形成复乳；所述混合在超声下进行，功率为50-80W，时间为3-8min；
(3)将复乳再次加至聚乙烯醇溶液中，待有机溶剂挥发后，复乳滴固化形成所述核酸递送系统。
3.如权利要求2所述的核酸递送系统的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述聚羟基脂肪酸酯、胺类材料和核酸可选地在混合前配制成溶液，所述溶液的溶剂各自独立地选自：水、二氯甲烷、三氯甲烷、四氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、甲苯或环己烷中的至少一种或至少两种的组合。
4.如权利要求2所述的核酸递送系统的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述聚乙烯醇溶液的溶剂为水。
5.如权利要求2所述的核酸递送系统的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述聚乙烯醇溶液的溶剂为水。
6.如权利要求2所述的核酸递送系统的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述有机溶剂挥发的方法包括在400-800rpm的速度下磁力搅拌4-8h。
7.一种核酸类药物，其特征在于，所述核酸类药物由如权利要求1所述的核酸递送系统和药学上可接受的药用辅料制得。
8.如权利要求7所述的核酸类药物，其特征在于，所述药用辅料包括增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、芳香剂、缓冲剂、增塑剂、增稠剂或保湿剂中的至少一种或至少两种的组合。
9.如权利要求1所述的核酸递送系统在制备基因治疗类药物中的应用。
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