CN117203244A - 功能性核酸以及蛋白质引入用载体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种氨基化聚轮烷(PRX)(Amino‑PRX)载体作为核酸/蛋白质载体。Amino‑PRX向Cas9的sgRNA以及酸性氨基酸自由地提供氨基，并且仅通过混合Amino‑PRX和Cas9RNP(自动分子印迹)使CD旋转以及移动，由此能够有效且简单地与Cas9RNP形成复合物，并实现将Cas9RNP有效地递送到细胞内。此外，通过优化轴/端帽连接物、以及氨基/CD连接物的结构，能够严格地控制Cas9RNP在细胞内的动力并提高基因组编辑效率。
Description
相关申请的交叉引用
本国际申请要求2021年1月26日在日本专利局提交的日本发明专利申请第2021-010606号的优先权，所述日本发明专利申请的全部内容通过引用而并入本文。
技术领域
本公开涉及一种载体，其协助将核酸以及蛋白质稳定地引入到细胞中。
背景技术
近年，迫切希望开发一种将例如用于诱导基因组编辑的蛋白质和核酸安全且高效地引入到细胞内的技术，其中，用于诱导基因组编辑的蛋白质和核酸包括Cas9 RNP等蛋白质/核酸复合体、siRNA等核酸分子等。
CRISPR-Cas9(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats-CRISPR associated proteins 9；成簇的规律性间隔的短回文重复序列-CRISPR关联蛋白质9)是一种全新的基因组编辑技术，其能够裂解DNA双链，并且能够对基因组序列的任意部位进行删除、取代、插入。为了通过CRISPR-Cas9诱导基因组编辑，需要将Cas9蛋白质和向导RNA(核酸)引入到细胞内。作为引入方法，主要使用引入对Cas9蛋白质以及向导RNA进行了编码的质粒DNA的方法、引入对Cas9进行了编码的信使RNA(mRNA)和向导RNA的方法、引入Cas9蛋白质与向导RNA的复合体(Cas9 RNP)的方法。其中，直接引入被预先装配的(preassembled)Cas9 RNP的方法不仅基因组编辑效率高，而且安全性和便捷性也高，因此最受关注(非专利文献1、2)。由于Cas9 RNP具有膜不渗透性，因此，需要载体将其递送至细胞内。作为该载体，可以使用阳离子性的材料(脂质/脂质粒)(非专利文献3～7)、纳米颗粒(非专利文献8～10)、异种相互作用阳离子性聚合物(非专利文献11以及12)等非病毒性载体。但是，Cas9 RNP具有源自Cas9(蛋白质)的两性离子和复杂的表面结构，因此，存在与阳离子性材料的相互作用较低的问题。多层纳米颗粒或异种相互作用阳离子性聚合物虽然能够与Cas9的碱性氨基酸相互作用，但是无法适合于Cas9 RNP的立体结构和电荷分布。另一方面，据报告，原位聚合纳米胶囊(NC)可根据Cas9 RNP(分子印迹)的表面结构提供适当的单体，从而能够更有效地进行Cas9 RNP的装载(非专利文献13)。NC单体间的交联具有生物降解性，因此，Cas9 RNP能够通过细胞内动力控制有效地进行基因组编辑。但是，NC的制备不仅需要添加可相互作用的单体，还需要许多步骤(氮取代/回流、透析、冷冻干燥)，因此，存在难以使用NC和实现基因的重新靶向的问题。
聚轮烷(PRX)是一种高分子化合物，其具有由PEG等轴向分子穿过(threaded)如环糊精(CD)等多个大环分子而形成的结构，并且在轴向分子的两端具有庞大的取代基(cap；端帽)，以防止该大环分子的解离(非专利文献14～19)。据报告，PRX的CD能够在轴向分子上移动(非专利文献20)。因此，PRX的CD上的被修饰的阳离子电荷能够灵活地移动，并且与基因(非专利文献21以及22)、核酸(非专利文献23)、酸性蛋白质(非专利文献24以及25)强烈相互作用。例如，据报告，向PRX中的CD引入阳离子性的N,N-二甲氨基乙基(DMAE)后形成的化合物(DMAE-PRX)与阴离子性质粒DNA形成聚离子复合物，该聚离子复合物具有稳定性，从而有助于基因引入。此外，还报告了一种向PRX的大环分子引入氨基的细胞剥离剂(专利文献1)。
此外，设计了如下分子：使DMAE-PRX的轴向分子的两端经由在还原环境下可裂解的结构与端帽键合，由此，在基因引入后端帽脱离并释释放CD，从而促进核酸在细胞内释放。据报告，通过使用该分子，与非释放型DMAE-PRX相比，可提升引入后的siRNA和蛋白质的功能性(非专利文献26以及27)。此外，据报告，通过使用多臂型PRX，可改善血液保留(非专利文献28)。此外，据报告，通过使用经由二硫连接物使DMAE与α-环糊精键合而成的多臂型PRX，可改善质粒DNA在细胞内的还原环境下的释放，并且还报告了一种使功能肽键合而形成的多臂型PRX(非专利文献29)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国際公开公报WO2015/025815
非专利文献
非专利文献1：S.Kim et al.,Genome Res.,24:112-1019(2014).
非专利文献2：M.wang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,113:2868-2873(2015).
非专利文献3：Gao,X.et al.,Nature 553,217-221(2018).
非专利文献4：Wei,T.et al.,Nat Commun 11,3232(2020).
非专利文献5：Lee,K.et al.,Elife,6(2017).
非专利文献6：Wang,Y.et al.,ACS Appl Mater Interfaces 10,31915-31927(2018).
非专利文献7：Taharabaru,T.et al.,ACS Appl Mater Interfaces；12,21386-21397(2020).
非专利文献8：Lee,K.et al.,Nat Biomed Eng 1,889-901(2017).
非专利文献9：Lee,B.et al.,Nat Biomed Eng 2,497-507(2018).
非专利文献10：Ch,E.Y.et al.,J Nanobiotechnology 17,19(2019).
非专利文献11：Liu,C.et al.,Sci Adv 5,eaaw8922(2019).
非专利文献12：Rui,Y.et al.,Sci Adv 5,eaay3255(2019).
非专利文献13：Chen,G.et al.,Nat Nanotechnol 14,974-980(2019).
非专利文献14：Akira Harada et al.,Nature,356:325-327(1992).
非专利文献15：Akira Harada et al.,Chem.Rev.,109:5974-6023(2009).
非专利文献16：Jun Araki et al.,Macromolecules,38:7524-7527(2005).
非专利文献17：Wenz,G.et al.,Chemical Reviews 106,782-817(2006).
非专利文献18：Tamura,A.et al.,Chem Commun(Camb)50,13433-13446(2014).
非专利文献19：Higashi,T.et al.,Chem Pharm Bull(Tokyo)67,289-298(2019).
非专利文献20：Yasuda,Y.et al.,J Am Chem Soc 141,9655-9663(2019).
非专利文献21：Ooya,T.et al.,Journal of the American Chemical Society128,3852-3853(2006).
非专利文献22：Emami,M.R.et al.,Advanced Therapeutics 2,1900061(2019).
非专利文献23：Tamura,A.et al.,Biomaterials 34,2480-2491(2013).
非专利文献24：Tamura,A.et al.,Sci Rep 3,2252(2013).
非专利文献25：Tamura,A.et al.,Macromol Biosci 15,1134-1145(2015).
非专利文献26：Atsushi Tamura.et al.,Biomaterials；34:2480-2491(2013).
非专利文献27：Atsushi Tamura.et al.,Sci Rep；3:2252(2013).
非专利文献28：Ying Ji.et al.,Biomaterials；192:416-428(2019).
非专利文献29：Michael R.Enami.et al.,Adv.Therap.；2:1900061(2019).
发明内容
发明要解决的技术问题
为了使用非病毒性载体将Cas9 RNP等核酸/蛋白质复合体或蛋白质、核酸等生物聚合物高效地引入到细胞内，则需要：将生物聚合物引入到细胞；使生物聚合物迅速地从胞内体逸出以免被降解；在细胞质释放生物聚合物；以及将生物聚合物转运到细胞核中等，从而存在多阶屏障。但是，例如Cas9 RNP这样的复合体是包括带正电荷的Cas9蛋白质和带负电荷的向导RNA的两性物质，而且其立体结构也比较复杂，因此存在如下问题：难以与阳离子脂质粒或阳离子性聚合物等非病毒载体形成复合物，并且引入到细胞内的效率较低(TaoWan.Et al.,Journal of Controlled Release；322:236-247.(2020))。
解决问题的技术方案
本申请的发明人对更加优异的载体进行了研究考察，结果发现：通过向聚轮烷(PRX)的大环分子上的修饰部分引入氨基而形成的载体仅进行混合便与蛋白质或核酸灵活地结合且具有稳定性，能够有效地被吸纳到细胞内。此外发现具有氨基修饰的大环分子的PRX载体能够在引入Cas9/sgRNA时实现优异的基因编辑效果。而且，还发现反复设计修饰基团，用在中性pH值下具有一价质子且在酸性pH值下具有二价质子的修饰部分(例如，既具有仲胺又具有氨基的二乙烯三胺(DET)基团)来修饰PRX的大环分子，复合体在被吸纳到细胞内之后会有效地从胞内体中释放出来。由此，DET基修饰的PRX实现了优异的基因编辑效果和siRNA所展现的静默效果。
此外，还发现通过向端帽与轴向分子之间、和/或大环分子上的修饰氨基与大环分子之间引入细胞内可降解键，会促进载体在细胞质内从核酸/蛋白质中解离。由此，成功地开发出一种载体，其不仅比以往的载体更高效地与蛋白质/核酸结合并被吸纳到细胞内，而且能够在被引入细胞内后有效地从胞内体释放，然后载体在细胞质内解离，这些均是以往的载体无法实现的。通过使用本公开的载体，能够非常高效且简单地将核酸/蛋白质引入到细胞内。
发明的效果
本公开的修饰PRX仅通过混合便与蛋白质/核酸结合，并且仅与细胞接触便被有效地吸纳到细胞内，并且在细胞内自动进行从胞内体逸出和载体的解离，由此，能够作为优异的核酸/蛋白质引入用载体而加以使用。
附图说明
图1A是示出Cas9 RNP的结构以及氨基酸和磷酸的电荷的图。图1B是示出BAEE-PRX(Amino-PRX(1G))的结构的示意图。图1C是示出BAEE-PRX/Cas9 RNP复合物的结构(自动分子印迹)的图。
图2是示出使用了BAEE-PRX以及BAEE-DEX的Cas9 RNP复合物的ζ电位的图。其中，纵轴表示ζ电位(mV)，横轴表示氨基的印迹率(％)。各值表示3～4次实验的平均值±S.E.。“＊”表示与BAEE-DEX复合物对比p<0.05。
图3是示出各种混合比例的BAEE-PRX与Cas9 RNP的复合体在HeLa GFP细胞中的细胞吸纳的图。各值表示5～6次实验的平均值±S.E.。
图4A是单独的Cas9 RNP的TEM图像。图4B是BAEE-PRX/Cas9 RNP复合物的TEM图像。图4C是BAEE-DEX/Cas9 RNP复合物的TEM图像。在图4A～图4C中，标尺＝50nm。
图5A是示出BAEE-PRX与Cas9 RNP的复合物以及BAEE-DEX与Cas9 RNP复合物在不存在肝素的状态下以及在存在肝素的状态下的稳定性的图，是在琼脂糖S凝胶上对与肝素一起培养的Cas9 RNP复合物进行电泳，用溴化乙锭进行染色后的照片。数值表肝素/sgRNA的比率(w/w)。图5B是示出BAEE-PRX与Cas9 RNP的复合物以及BAEE-DEX与Cas9 RNP复合物在不存在肝素的状态下以及在存在肝素的状态下的稳定性的图，是表示残留复合物的比率(％)的图。+BAEE-PRX表示BAEE-PRX复合物，+BAEE-DEX表示BAEE-DEX复合物。纵轴表示残留复合物的比率(％)，横轴表示肝素/sgRNA的比率(w/w)。根据复合物和释放的Cas9 RNP的条带强度比，并使用Image J软件对残留的复合物的百分比进行了定量化。各值表示3～4次实验的平均值±S.E.。“＊”表示与BAEE-DEX复合物对比p<0.05。
图6A是示出Cas9 RNP与各种阳离子性聚合物的复合物在HeLa细胞内的吸纳情况的图。横轴表示阳离子性聚合物的种类，从左至右依次示出：无阳离子性聚合物(Cas9 RNPalone)、BAEE-PRX(Amino-PRX(1G))、BAEE-DEX、线性聚乙烯亚胺Linear-polyethyleneimine(L-PEI)(2.5kDa)、L-PEI(25kDa)、支化聚乙烯亚胺branched-polyethyleneimine(B-PEI)(2kDa)、聚酰胺-胺树枝状聚合物polyamidoamine dendrimer(Dendrimer)(G2)、Dendrimer(G3)、Dendrimer(G4)、以及CRISPRMAX的结果。Cas9 RNP的浓度为14.6nM。各值表示4次实验的平均值±S.E.。图6B是示出对照阳离子性聚合物的化学结构的图。L-PEI表示线状聚乙烯亚胺，B-PEI表示支链PEI，PLL表示聚-L-赖氨酸氢溴酸盐，Dendrimer(G2-4)表示聚酰胺-胺树枝状聚合物(G2-4)(df)。此外，B-PEI的化学结构式中的虚线表示C9-10烷基(碳原子数为9-10的烷基)。图6C是示出对照阳离子性聚合物的氨基的数量和分子量的表。
图7是示出在pH值7.4以及pH值5.5的条件下，经复合物进行处理后的HeLa细胞的细胞生存率的图，其中，该复合物是经各种氨基修饰的PRX与Cas9 RNP的复合物。Cas9 RNP的浓度设为29.2nM。混合聚合物的量相对于Cas9 RNP设定为50％的氨基。各值表示3～4次实验的平均值±S.E.。“＊”表示与pH值7.4的复合物对比p<0.05。
图8是示出经各种氨基修饰的PRX与Cas9 RNP的复合物在HeLa细胞内的吸纳情况的图。Cas9 RNP的浓度设为14.6nM。混合聚合物的量相对于Cas9 RNP设定为50％的氨基。各值表示9次实验的平均值±S.E.。
图9A是示出经各种氨基修饰的PRX(BAEE-PRX、DET-PRX以及DMAE-PRX)与Cas9 RNP的复合物在HeLa/GFP细胞中的基因组编辑活性的图。纵轴表示被敲除的GFP的比率(％)。在各组中从左至右依次示出Cas9/sgGFP的浓度为29.2nM、58.4nM、116.8nM的结果以及sgCont的浓度为116.8nM的结果。各值表示3～4次实验的平均值±S.E.。图9B是示出经各种氨基修饰的PRX(BAEE-PRX、DET-PRX以及DMAE-PRX)与Cas9 RNP的复合物在HeLa/GFP细胞中的基因组编辑活性的图。纵轴表示被敲除的GFP的比率(％)。在各组中从左至右依次示出20％基因印迹、50％基因印迹、100％基因印迹、以及sgCont的100％基因印迹的结果。Cas9 RNP的浓度设为29.2nM。各值表示6次实验的平均值±S.E.。
图10是示出在pH值7.4以及pH值5.5的条件下，经复合物处理后的HeLa细胞的细胞生存率的图，其中，该复合物是DET-PRX与Cas9 RNP的复合物、以及DET-DEX与Cas9 RNP的复合物。Cas9 RNP的浓度设为29.2nM。混合聚合物的量相对于Cas9 RNP设定为50％的氨基。各值表示3～4次实验的平均值±S.E.。“＊”表示与pH值7.4的复合物对比p<0.05。
图11是通过DET修饰大环分子的旋转效果而产生的DET-PRX复合物的高效的胞内体破坏效果的概略图。
图12A是端帽降解性PRX释放Cas9 RNP的概略图。图12B是示出候补端帽连接物的化学式的图。R1表示端帽侧，R2表示轴向分子侧。
图13是示出使用了具有各种端帽降解性连接物(酰胺、氨基甲酸酯、二硫化物以及缩酮)的DET-PRX的Cas9 RNP复合物的基因组编辑活性的图。纵轴表示被敲除的GPF的比率(％)。Cas9 RNP的浓度设定为29.2nM。各值表示3次实验的平均值±S.E.。
图14A是刷状降解性PRX释放Cas9 RNP的概略图。图14B是示出具有被α-CD的羟基修饰的且具有胞内体破坏能力以及GSH裂解能力的氨基的结构的图。
图15A是示出使用了DET-PRX与Cys-PRX的混合物的Cas9 RNP复合物的基因组编辑活性的图。DET单元：Cys单元的摩尔比设为1：1。Cas9 RNP的浓度设为29.2nM。各值表示9次实验的平均值±S.E.。“＊”表示仅与Cas9 RNP对比p<0.05。图15B是示出使用了Cys-DET-PRX的Cas9 RNP复合物的基因组编辑活性的图。Cas9 RNP的浓度设为29.2nM。各值表示6次实验的平均值±S.E.。
图16A是示出测试GSH的浓度对Cys-DET-PRX的基因组编辑活性的影响的机理图。图16B是示出各GSH浓度的基因组编辑活性的图。纵轴表示将对0mM的GSH和预培养的Cys-DET-PRX/Cas9 RNP复合物实施处理时的基因组编辑效果设定为1时的相对值(相对于稳定表达GFP的细胞的GFP敲除效率)，横轴表示GSH的浓度(mM)。Cas9 RNP的浓度设为29.2nM。各值表示6次实验的平均值±S.E.。
图17是示出CRISPRMAX/Cas9 RNP和Cys-DET-PRX/Cas9 RNP的基因组编辑活性的对比图。各值表示6次实验的平均值±S.E.。
图18是直到由Cys-DET-PRX实现有效的基因组编辑的过程的示意图，该过程包括：通过自动分子印迹与Cas9 RNP形成复合体；通过在胞内体的质子化和α-CD旋转对膜的破坏；刷状连接物的降解和Cas9 RNP在胞质溶胶中的释放；以及Cas9 RNP的核移位。
图19A是示出Cys-DET-PRX/Cas9 RNP的粒径的图。各值表示3次实验的平均值±S.E.。图19B是示出Cys-DET-PRX/Cas9 RNP的ζ电位的图。各值表示3次实验的平均值±S.E.。图19C是示出处理羟基酯酶后降解的DET-PRX的比率的图。各值表示4次实验的平均值±S.E.。
图20是示出各种氨基修饰的PRX与siRNA复合体在HeLa/GFP细胞中的RNAi活性的图。LipofectamineTM2000与siRNA的体积比率设定为3.75。各值表示6次实验的平均±S.E.。
图21是对比CRISPRMAX/Cas9 RNP和Cys-DET-PRX/Cas9 RNP在活体(in vivo)中的基因组编辑活性的图。将对移植了HeLa GFP细胞的肿瘤小鼠的肿瘤内直接施用样品时肿瘤内的荧光强度的相对值设为纵轴。各值表示3～5只小鼠实验的平均值±S.E.。
图22是示出各种氨基修饰的PRX与siRNA的复合体在HeLa/GFP细胞中的RNAi活性的图。Amino-PRX与siRNA的电荷比设为10。各值表示6次实验的平均±S.E.。“＊”表示与单独的siRNA对比p<0.05，表示与+DMAE-PRX对比p<0.05，/>表示与+BAEE-PRX对比p<0.05。此外，+BAEE-PRX表示BAEE-PRX/siRNA，+DET-PRX表示DET-PRX/siRNA，+DMAE-PRX表示DMAE-PRX/siRNA。
图23是示出Amino-PRX(3G)与siRNA的复合体在HeLa/GFP细胞中的RNAi活性的图。Amino-PRX(3G)与siRNA的电荷比设为10。“＊”表示与单独的siRNA对比p<0.05，表示与+酰胺-DET-PRX对比p<0.05。此外，siGFP alone表示单独的siRNA，+Amide-DET-PRX表示酰胺-DET-PRX/siRNA，+Carbamate-DET-PRX表示氨基甲酸酯-DET-PRX/siRNA，+Disuphide-DET-PRX表示二硫化物-DET-PRX/siRNA，+Ketal-DET-PRX表示缩酮-DET-PRX/siRNA。
图24是示出经Amino-PRX(5G)与siRNA的复合体或LipofectamineTM2000与siRNA的复合体处理后的HeLa细胞的细胞生存率的图。LipofectamineTM2000与siRNA的体积的比率设为3.75。此外，Amino-PRX(5G)与siRNA的电荷比设定为10。各值表示7～8次实验的平均±S.E.。“＊”表示与LipofectamineTM2000/siRNA对比p<0.05。
图25是示出Amino-PRX(5G)与ASO的复合体在HeLa GFP细胞中的基因敲除活性的图。各值表示6次实验的平均±S.E.。“＊”表示与单独的ASO对比p<0.05，表示与+LipofectamineTM2000对比p<0.05。
图26是示出经Amino-PRX(5G)与ASO的复合体或LipofectamineTM2000与ASO的复合体处理后的HeLa细胞的细胞生存率的图。LipofectamineTM2000与ASO的体积的比率设定为3.75。此外，Amino-PRX(5G)与ASO的电荷比设定为10。各值表示7～8次实验的平均±S.E.。“＊”表示与LipofectamineTM2000/ASO对比p<0.05。
图27是示出Amino-PRX(5G)与gapmer型ASO的复合体在HeLa GFP细胞中的基因敲除活性的图。各值表示3次实验的平均±S.E.。此外，GFP gapmer表示单独的gapmer型ASO，+5G NP2表示Amino-PRX(5G)NP2/gapmer型ASO，+5G NP5表示Amino-PRX(5G)NP5/gapmer型ASO，+5G NP10表示Amino-PRX(5G)NP10/gapmer型ASO。
图28是示出由Amino-PRX(5G)/β-Gal复合体处理后的HeLa细胞中的细胞内β-gal酶活性的荧光图像。图中的SPiDER-β-Gal列表示源自SPiDER-β-Gal的荧光(绿色)，Hoechst33342列表示被染色的细胞核的荧光(蓝色)，Merge列表示合并两种荧光后的图像，FC列表示相位差图像。此外，+Amino-PRX(5G)NC2表示Amino-PRX(5G)NC2/β-gal，+Amino-PRX(5G)NC5表示Amino-PRX(5G)NC5/β-gal，+Amino-PRX(5G)NC10表示Amino-PRX(5G)NC10/β-gal。NC表示Amino-PRX(5G)的氨基/β-gal的酸性氨基酸残基(COOH)的比。
图29是示出经Amino-PRX(5G)与mCherry mRNA的复合体处理后的HeLa细胞中的mCherry的表达的图。各值表示3次实验的平均±S.E.。此外，图中的+Lipo2000表示LipofectamineTM2000/mCherry mRNA，+5G NP0.5表示Amino-PRX(5G)NP0.5/mCherry mRNA，+5G NP0.75表示Amino-PRX(5G)NP0.75/mCherry mRNA，+5G NP1表示Amino-PRX(5G)NP1/mCherry mRNA，+5G NP2表示Amino-PRX(5G)NP2/mCherry mRNA。
图30是表示各种Amino-PRX与Cas9 RNP的复合体在HeLa GFP细胞中的基因组编辑活性的图。各值表示3次实验的平均±S.E.。Cas9 RNP的浓度设为29.2nM。“＊”表示Control对比p<0.05，表示与Cas9 RNP对比p<0.05，/>表示与CRISPRMAX对比p<0.05。此外，图中的Cas9 RNP表示单独的Cas9/sgGFP RNP，CRISPRMAX(cont)表示CRISPRMAX/Cas9 RNP(sgCont)，CRISPRMAX表示CRISPRMAX/Cas9 RNP(sgGFP)，低取代度化Amino-PRX(5G)(cont)表示低取代度化Amino-PRX(5G)/Cas9 RNP(sgCont)，低取代度化Amino-PRX(5G)表示低取代度化Amino-PRX(5G)/Cas9 RNP(sgGFP)。
具体实施方式
(聚轮烷)
“聚轮烷”包括多个大环分子、以及贯穿该大环分子的环且两端具有端帽的轴向分子。聚轮烷的化学结构的示意图如下所示。聚类轮烷具有多个大环分子、以及贯穿该大环分子的环的轴向分子，但是不具有端帽结构。
“轴向分子”通常为聚合物，并且是单一单体的聚合体(均聚物)和由两种以上的单体组成的共聚物等。“聚合物”是指一个或多个单体重复结合而成的高分子。单体通常是具有一个碳碳双键的分子或每个分子至少具有两个官能基团的分子。共聚物可以是无规共聚物、交替共聚物和/或嵌段共聚物等。当轴向分子是均聚物时，作为聚合物可以列举例如聚环氧烷、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醚、聚甲基乙烯醚、聚乙烯亚胺、聚(环氧丙烷)、聚(ε-己内酯)、聚乳酸、聚氨基酸、聚(ε-赖氨酸)、聚酰胺、聚(亚氨基低聚亚甲基)、紫罗烯、聚(偏二氯乙烯；polyvinyldiene chloride)、聚丙烯、低聚丙烯、聚乙烯、低聚乙烯、聚(亚烷基苯并咪唑)、聚氨基甲酸酯、聚(紫罗碱)、聚(N-二甲基十甲烯基铵)、聚(二甲基硅氧烷)、聚苯胺、聚碳酸酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(N-酰基乙烯亚胺)、聚(4-乙烯吡啶)-十二基苯磺酸复合体、富勒烯聚乙二醇结合体、疎水化多糖。当轴向分子为共聚物时，可列举聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物、聚(ε-己内酯)与聚乳酸的共聚物、聚乳酸与聚乙二醇的共聚物、聚乙二醇多糖接枝共聚物、聚丙二醇多糖接枝共聚物。此外，轴向分子既可以是具有支链的多臂型聚合物，例如可以是星形聚乙二醇，超枝化聚醚，超枝化低聚乙二醇、或超枝化低聚丙二醇。这些聚合物可视需要而被修饰，或由取代基取代。关于轴向分子的聚合度和分子量，只要对应着要引入到细胞内的目标核酸/蛋白质而具有能贯穿所需数量的大环分子的长度即可，例如，可以使用数均分子量(Mn)约为200～1,000,000Da、约为400～50,000Da、约为500～40,000Da、或约为1000～30,000Da的聚合物。
在本说明书中，“大环分子”是环状分子，其具有供所述轴向分子穿过的充分大的内部开口部(空腔)，并且具有能够修饰的基团(例如羟基)。作为大环分子的示例，可列举环状聚醚、环状聚酯、环状聚醚胺、环状多胺、冠醚、葫芦[n]脲、杯芳烃、环状酰胺、过渡金属络合物、环糊精、环糊精衍生物以及上述这些的任意组合。“环糊精”是环状低聚糖化合物，包括例如α-环糊精(六糖)，β-环糊精(七糖)，或γ-环糊精(八糖)。大环分子可以由除后文所述的“修饰部分”以外的取代基取代，也可以被甲基、羟乙基、羟丙基、乙酰基、羧甲基、琥珀酰基、葡糖基、羧乙基、磺丁基、氨基、卤素原子以及上述这些的任意组合取代。
在聚轮烷以及聚类轮烷中，轴向分子穿过大环分子的开口部从而贯穿大环分子。聚轮烷以及聚类轮烷具有多个如上所述的被轴向分子贯穿的大环分子。可根据目的来设定1个聚轮烷分子中的大环分子的数量，例如平均值可以为约5个～约200个、约10个～约100个的程度。大环分子未与轴向分子共价键合，因此，可以相对于轴向分子在旋转方向以及轴向上移动。
在本公开的聚轮烷中，至少一部分大环分子与如下“修饰部分”(modifyingmoiety)键合，该“修饰部分”是在中性pH值下具有1价质子，并在酸性pH值(优选为弱酸性pH值(例如pH值5.5))下具有2价质子的“修饰部分”(下文有时仅称为“修饰部分”)。修饰部分优选为具有仲胺以及氨基的基团，较典型为由-L1-NH-L2-NH2(在此，-L1和L2相同或不同，代表直链或支链的C1～6烯烃基)表示的基团，例如为二乙烯三胺。修饰部分在中性pH值下具有1价质子，从而能够相对于生物体内成分具有安全性，另一方面，修饰部分在作为胞内体内环境的酸性pH值(优选为弱酸性pH值(例如pH值5.5))下具有2价质子，从而能够破坏胞内体膜。由此，能够促进被吸纳到细胞内的胞内体中的聚离子复合物破坏胞内体并在细胞质中释放。
在本说明书中，作为“直链或支链的C1～6烯烃基”，可以列举例如-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-、-(CH2)5-、-(CH2)6-、-CH(CH3)CH2-、-CH2CH(CH3)-、-CH(CH2CH3)CH2-、-CH2CH(CH2CH3)-、-CH(CH3)CH2CH2-、-CH2CH(CH3)CH2-、-CH2CH2CH(CH3)-等。
在另外的方案中，在本公开的聚轮烷中，至少一部分大环分子与通过在细胞内能够降解的键而具有氨基的基团(下文有时称为“细胞内降解性氨基”)键合。通过在细胞内能够降解的键而具有氨基的基团典型为由-L3-X-L4-NH2(在此，-L3和L4相同或不同，是直链或支链的C1～6烯烃基或者不存在直链或支链的C1～6烯烃基，X为在细胞内能够降解的键)表示的基团。作为具有氨基的基团(在所述式中，对应于-L4-NH2的基团)，可以列举-CH2-NH2、-(CH2)2-NH2、-(CH2)3-NH2、-(CH2)4-NH2、-(CH2)5-NH2、-(CH2)6-NH2、以及-CH(CH3)CH2-NH2等。
“在细胞内能够降解的键”是指，通过不同于细胞外的细胞内环境下的条件，例如通过pH值等物理化学的条件或细胞内酶等生物学条件易于被降解的键。在细胞内能够降解的键优选为在细胞外难以降解的键。在此，“能够降解”以及“难以降解”的术语并非是绝对的含义，且并不分别表示完全降解和完全不降解的意思。“能够降解”以及“难以降解”分别是指，将细胞外和细胞内进行对比时，相对易于降解以及相对难以降解。例如，在不同于细胞外的细胞内环境下的条件可以是GSH浓度，该情况下，在细胞内能够降解的键可以是在～0.2mM的GSH浓度(细胞外浓度)下难以降解且在2～10mM的GSH浓度(细胞内浓度)下能够降解的键。在细胞内能够降解的键可以是例如氨基甲酸酯(-NH(C＝O)O-)键、缩酮(-OC(CH3)2O-)键、酰胺(-NHCO-)键、二硫化物(-S-S-)键、缩醛(-C(OH)O-)键、原酸酯键、乙烯基醚(-CH2＝CH-O-)键、酰肼键、以及酯(-COO-)键。
作为“通过在细胞内能够降解的键而具有氨基的基团”，优选为-(CH2)2-S-S-(CH2)2-NH2(胱胺)。
在本公开的聚轮烷中，在除了修饰部分还键合有细胞内降解性氨基的情况下，修饰部分和细胞内降解性氨基通常为不同的基团。此外，该情况下，修饰部分优选通过在细胞内不降解或难以降解的键与大环分子键合。由此，到聚离子复合物在细胞内被释放之前，即使一部分细胞内降解性氨基的键被降解从而导致氨基从大环分子解离，也能够借助修饰部分的氨基酸保持聚轮烷与生物学材料的键合，并且被释放到细胞质内后，细胞内降解性氨基的键几乎全部裂解，由此会削弱生物学材料与聚轮烷的键合，从而能够促进生物学材料从聚轮烷的解离。
例如，在大环分子具有环糊精等的羟基的情况下，该羟基可以被所述修饰部分和/或具有经由在细胞内能够降解的键而键合的氨基的基团(以下在本段中统称为“大环分子的取代基”)所取代。环糊精的羟基可以是形成环糊精的葡萄糖中的羟基。该情况下，大环分子的取代基可以经由-O-CO-NH-、-O-COO-、-O-OC-、-O-、-O-C(OH)-、或-OC(＝S)NH-(最左侧的-O-均表示源自羟基的氧原子)与形成该羟基的氧原子键合。例如，大环分子为α-环糊精，形成该α-环糊精的羟基的氧原子经由-O-CO-NH与由-L1-NH-L2-NH2表示的取代基键合，该情况下下，可以用以下的结构式表示。
“端帽”(CAP)是键合在聚轮烷的末端的庞大的取代基，其防止大环分子从轴向分子脱离。作为端帽，可以列举例如二硝基苯基类、环糊精类、金刚烷基类、三苯甲基类、荧光素类、倍半硅氧烷类、芘类、取代苯类(可以被如一个以上的烷基、烷氧基、羟基、卤素、氰基、磺酰基、羧基、氨基、以及苯基的取代基取代)、类固醇类、氨基酸、低聚肽、低聚糖类、糖衍生物、具有一个以上的苯环的基团(苄氧羰(Z)基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)基、苄基酯(OBz)基)、或具有一个以上的叔丁基的基团(叔丁基羰(Boc)基、氨基酸叔丁基酯(OBu)基)等。优选为二硝基苯基类、环糊精类、金刚烷基类、三苯甲基类、荧光素类、倍半硅氧烷类、或芘类，更优选为金刚烷基类或环糊精类。端帽键合在聚类轮烷的末端，由此防止被轴向分子贯穿的大环分子脱离轴向分子。因此，端帽具有足够的大小以阻止大环分子从轴向分子脱出。
端帽优选经由在细胞内能够降解的键与轴向分子键合。在此所述的“在细胞内能够降解的键”遵从上文所述的定义。端帽优选经由氨基甲酸酯键与轴向分子键合。端帽经由在细胞内能够降解的键与轴向分子键合可参照例如Journal of Controlled Release 76(2001)11-25；Biomacromolecules 2003,4,1426-1432；Langmuir 2011,27(2),612-617；Angew.Chem.Int.Ed.2013,52,7300-7305；J.Mater.Chem.B,2013,1,3535-3544；Biomaterials，34，2480-2491(2013)；Scientific Reports,3,2252(2013)等记载的方法。
可以利用本领域技术人员周知的方法并按照后文所述的制造例1～10的方法制造本公开的聚轮烷。
在其他的方案中，本公开提供一种聚轮烷组合物，其含有：至少一部分大环分子与含有胺的修饰部分键合的聚轮烷、以及至少一部分大环分子与通过在细胞内能够降解的键而具有氨基的基团键合的聚轮烷。
此外，在其他的方案中，本公开提供一种聚轮烷，其具有多个大环分子、贯穿所述大环分子的环的轴向分子、以及键合在所述轴向分子的末端的端帽，其中，至少一部分所述大环分子与含有胺的修饰部分键合，且至少一部分所述大环分子与通过在细胞内能够降解的键而具有氨基的基团键合。
(聚离子复合物)
在其他的方案中，本公开涉及一种生物学材料和所述聚轮烷的聚离子复合物及其制造方法。“生物学材料”是指，欲向细胞内引入的、包括天然或人工的氨基酸或核酸的物质，例如包括：核酸分子、运载体、蛋白质或肽；或上述这些的融合物，或者可以是上述这些的复合体。核酸分子包括：向导RNA(single-guide RNAs(单链向导RNA；sgRNAs)以及prime-editing guide RNAs(引物编辑向导RNA；PEGRNAs)(包括Chow,R.DET al.Nat Biomed Eng(2020))等的衍生物)、CRISPR RNA(crRNA)，反式激活crRNA(tracrRNA)、siRNA(包括shRNA等的衍生物)、陷阱(decoy)，CpG寡聚体、miRNA、反义DNA、反义RNA、适体、mRNA、以及核酸疫苗(mRNA疫苗、DNA疫苗等)。运载体包括病毒运载体以及质粒运载体。蛋白质/肽包括核酸酶(例如Cas9核酸酶、Cas9切口酶、Cas12a、Cas13a等Cas蛋白质)、脱氨酶(胞苷脱氨酶、腺苷脱氨酶等)，逆转录酶等功能性蛋白质/肽、以及荧光素酶、荧光/放射性标记蛋白质等标记蛋白质/肽。蛋白质/肽可以是例如具有DNA结合结构域(锌指、螺旋-转角-螺旋，螺旋-环-螺旋、翼螺旋(wing helix)、或亮氨酸拉链等)、或RNA结合结构域(锌指、KH、S1、PAZ、PUF、PIWI以及RRM(RNA识别基序)结构域等)的核酸结合性蛋白质/肽。作为融合物，可列举锌指核酸酶或类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nuclease(TALEN))。复合体包括蛋白质-DNA复合体或蛋白质-RNA复合体等，可列举例如Cas蛋白质和向导RNA的复合体(作为代表，有Cas9与sgRNA的复合体(Cas9 RNP))。
聚离子复合物的印迹率例如可以设为20％以上，也可以为20～100％、20～90％、20～80％、以及20～50％。印迹率例如也可以为50％以上，还可以为50～100％、50～90％、以及50～80％。在本说明书中，“印迹率”是指，与聚轮烷的大环分子键合的基团(修饰部分和/或细胞内降解性氨基)的末端(包括末端附近)存在的胺(伯胺、仲胺、或叔胺)的总数相对于可与聚离子复合物所含有的生物学材料结合的阳离子性单体的最大数量的比率。例如，当与大环分子键合的基团为DET时，仅将DET的末端的氨基计为“与大环分子键合的基团的末端存在的胺”，而内部的仲胺不计算在内。换言之，一个DET基向聚轮烷上的大环分子提供一个胺。
可通过混合所述生物学材料和本公开的聚轮烷来制备本公开的聚离子复合物。可在室温下并在缓冲液或培养基中通过搅拌而进行混合。可根据使用的聚轮烷和生物学材料、以及它们的浓度等酌情设定混合时间，通常可以以5分钟～一夜、5分钟～6小时、5～180分钟、5～120分钟、5～60分钟、5～30分钟的程度进行混合。
(将生物学材料引入细胞的方法)
在其他的方案中，本公开涉及一种方法，是将生物学材料引入细胞的方法，其包括：使本公开的聚离子复合物和细胞相接触，从而使所述聚离子复合物被吸纳到细胞内。本方法可视需要而包括：通过混合生物学材料和本公开的聚轮烷来形成聚离子复合物；以及使所述聚离子复合物和细胞相接触，从而使所述聚离子复合物被吸纳到细胞内。
此外，通过使用Cas9蛋白质和向导RNA的复合体作为生物学材料，而能够作为用于基因组编辑的方法而使用本方法。因此，本公开的一个方案涉及一种方法，是用于基因组编辑的方法，其包括：使聚离子复合物与细胞接触，从而使所述聚离子复合物被吸纳到所述细胞内，其中，所述聚离子复合物是复合体和本公开的聚轮烷的聚离子复合物，所述复合体是Cas9蛋白质和向导RNA的复合体(Cas9 RNP)。本方法可视需要而包括：混合Cas9蛋白质和向导RNA的复合体(Cas9 RNP)以及本公开的聚轮烷，由此来制造聚离子复合物；以及使所述聚离子复合物和细胞相接触，从而使所述聚离子复合物被吸纳到所述细胞内。
可以向细胞培养液中添加聚离子复合物，并进行培养，由此来进行聚离子复合物和细胞的接触。所使用的培养基以及培养条件可以根据所使用的细胞酌情设定，通常为37℃和5％CO2的条件。培养时间可以设为1小时～一夜、1～12小时、2～6小时、或3～5小时。可以根据需要，对细胞进行洗涤以去除聚离子复合物，然后再培养1～4天以上，或再培养6～10日以内的时间。
(细胞引入剂)
本公开的聚轮烷被吸纳到胞内体，并在细胞内从胞内体释放，在释放后从细胞质内的生物学材料中有效地进行解离，由此，能够将生物学材料有效地引入到细胞质内或细胞核内。因此，本公开的聚轮烷能够作为生物学材料的细胞引入剂，尤其能够作为细胞质内引入剂或细胞核内引入剂而加以使用。细胞引入剂除聚轮烷之外可视需要含有缓冲液和/或稳定剂等。
(医药组合物)
在其他的方案中，本公开涉及一种医药组合物，其含有所述聚轮烷或所述聚离子复合物。本公开的医药组合物中，生物学材料是以下物质，即，如Cas蛋白质/sgRNA复合体、核酸药物或疫苗等被引入细胞内或细胞核内，并发挥治疗效果。
本公开的一个方案涉及一种对患者的疾病或状态进行治疗或改善的方法，该方法包括对有需要的患者施用有效量的所述聚离子复合物。“治疗”是用于获得有益或所预期的临床结果的方法。就本公开的发明目的而言，无论能够检测到还是不能检测到，有益或所预期的临床结果均包括：一种以上的症状的减轻；疾病范围的缩小；疾病的稳定化(即，没有恶化)的状态；延缓或减缓疾病发展；疾病状态的恢复或减轻以及缓解(局部或整体)，不过有益或所预期的临床结果不限于此。“治疗”也可以指相对于不接受治疗时的预期寿命而言，延长了预期寿命。“有效量”是足以实现包含临床结果在内的有益或所预期的临床结果的量。有效量可以分一次或多次而进行施用。治疗对象包括人类、牛、马、狗、猫、猪、羊等哺乳动物，优选为人类。
医药组合物可以含有药理学容许的担体(制剂用添加物)。本领域技术人员可根据组合物的形态，对制造医药组合物而使用的制剂用添加物的种类、制剂用添加物相对于有效成分的比率、或医药组合物的制造方法适当进行选择。制剂用添加物可使用无机或有机物质，或者可以使用固体或液体(生理盐水等)的物质，通常而言，可以相对于有效成分重量在1重量％～99重量％间掺配制剂用添加物。
本公开的医药组合物可以是口服施用或非口服施用的医药组合物，可以为注射剂，例如包括用于静脈注射的注射剂、用于皮下施用的注射剂、用于肌肉注射的注射剂、输液等。或者，本公开的医药组合物也可以是细胞疗法中的细胞处理剂。在对哺乳动物(包括小鼠等模式动物以及人类)等受试者施用时，可以口服施用上述制剂，或者也可以在血液中(静脈中或动脈中)施用注射剂或输液剂。施用量以及施用频率对应着作为对象的哺乳类、症状、疾病或残障、年龄、性别、体重、施用形态等而有所不同，例如在人类的血液中施用时，日剂量可以为0.001～100g，或者也可以为0.01～1000mg/kg。此外，也可以将日剂量分数次施用。施用频率可以以每天1次、每周1次、每两周1次、每月1次或每几个月1次进行施用。施用期间可以视症状的改善而酌情确定，可以为1个月、几个月、半年、1年、几年、5年、或10年。
以下参照实施例对本公开进行详细的说明，不过本公开的范围不限于此。此外，本申请整个说明书中引用的文献通过引用而将其全部内容并入本申请说明书中。
【实施例】
(材料)
α-CD由日本食品化工(日本东京)捐赠。N,N-羰基二咪唑(CDI)、乙二胺、BOP试剂、1-羟基苯并三唑(HOBt)、N-乙基二异丙胺(EDIPA)、三乙胺(TEA)、胱胺二盐酸盐，1-金刚烷甲醛购自富士胶卷和光纯药株式会社(日本大阪)。1-金刚烷乙酸、1-金刚烷胺、二乙烯三胺(DET)、DMAE、以及右旋糖酐70购自东京化成工业株式会社(日本东京)。PEG(20kDa)、BAEE、2,2-双(氨基乙氧基)丙烷、以及树枝状聚合物(G2-4)购自Sigma-Aldrich Japan(日本东京)。PEI和PLL购自Polysciences Asia Pacific,Inc(中国台湾台北)。重组化脓性链球菌Cas9蛋白质(用NLS修饰N末端)购自TaKaRa Bio(日本滋贺)。sgRNA、crRNA以及ATTO-tracrRNA购自Integrated DNA Technologies Japan(日本东京)。sgRNA靶标和PCT引物的序列如表1所示。CRISPRMAX和Opti-MEM购自ThermoFisherScientific K.K.(日本东京)。其他所有的化学物质和溶剂均使用分析试剂等级物以及去离子水。
【表1】
用于T7E1检测的sgRNA靶标和PCT引物的序列
sgRNAs序列仅示出DNA靶区
(细胞培养)
作为人类神经母细胞肿瘤细胞系且人类子宫颈部上皮癌的HeLa细胞来自日本理化研究所生物资源中心(日本茨城)，并在含有谷氨酰胺(2mM)、青霉素(100U/mL)以及链霉素(100mg/L)且添加了10％胎牛血清(FBS)的DMEM(高葡萄糖)中以37℃、置换为湿润的5％CO2的条件下保持该HeLa细胞。HeLa GFP细胞，即稳定表达GFP的HeLa细胞购自CellBiolabs，Inc.(美国圣地亚哥)，除了DMEM中含有10μg/mL的灭瘟素之外，以与上述HeLa细胞同样的方式进行保持。
(数据分析)
数据以平均±S.E.形式提供，通过Scheffe检验确定统计显著性。p值<0.05时设为具有统计显著性。
(制造例1)氨基甲酸酯-PRX的制备
按照荒木等人(Araki，J.et al.，Macromolecules 38，7524-7527(2005).)报告的方法稍加改变而制备了氨基甲酸酯-PRX。为了获得末端具有二氨基的PEG(20kDa)(PEG-DAT)，使PEG(20kDa)(56g，2.8mmol)以及CDI(20g，12.4mmol)溶解在四氢呋喃(THF)(200mL)中，在置换为氮气的条件下，在50℃下搅拌18小时。将反应物滴加到乙二胺(6.0mL，88.0mmol)中，在50℃下搅拌2小时。加入乙醇(200mL)，并在-20℃下静置2小时后，通过离心分离回收了沉淀物，用冷乙醇洗涤数次，并进行减压干燥。产量：52.7g，94％。
为了获得α-CD/PEG-DAT聚类轮烷，将PEG-DAT(3.0g)添加到12％(w/v)的α-CD水溶液(100mL)中。在4℃下搅拌一夜后，通过离心分离回收了沉淀物，并通过冷冻干燥使其干燥。
为了获得氨基甲酸酯-PRX，使1-金刚烷乙酸(2.45g，12.6mmol)、BOP试剂(5.25g，11.8mmol)、HOBt(1.75g，11.4mmol)、以及EDIPA(2.28mL，13.2mmol)溶解在二甲基甲酰胺(DMF)(100mL)中，并添加了α-CD/PEG-DAT聚类轮烷(14g)。在置换为氮气的条件下，在4℃下搅拌48小时后，通过离心分离回收了沉淀物，分别用甲醇/DMF(1：1v/v)以及甲醇洗涤两次。使所获得的产物溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，加入过量的水使其沉淀。相同的步骤重复3次，通过冷冻干燥使获得的沉淀物干燥。产量：10.23g，82％(基于PEG)。
(制造例2)酰胺-PRX的制备
按照荒木等人(Araki,J.et al.,Macromolecules 38,7524-7527(2005).)报告的方法稍加改变而制备了酰胺-PRX。为了获得HOOC-PEG-COOH(20kDa)(PEG-COOH)，将PEG(20kDa)(10g，0.5mmol)、2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧(100mg，0.64mmol)，NaBr(100mg，0.97mmol)，以及NaClO(有效氯浓度>5％，10mL)置于水中并在室温下搅拌15分钟。为了淬灭反应，向反应物中添加乙醇(10mL)，并向反应物中添加1-NHCl以调整到pH<2，由此进行了去离子化。Spectra/PorTM膜MWCO：使用10kDa相对于水透析后，用蒸发器浓缩样本，通过冷冻干燥使其干燥。产量：9.53g，95％。
使用PEG-COOH并按照上述方法制备了α-CD/PEG-COOH聚类轮烷。
为了获得酰胺-PRX，使1-金刚烷胺(72.5mg，0.48mmol)、BOP试剂(212.5g，0.48mmol)、以及EDIPA(90.25μL，0.52mmol)溶解在DMF(25mL)中，并加入α-CD/PEG-COOH聚类轮烷(3.5g)。在置换为氮气的条件下，在4℃下搅拌48小时后，通过离心分离回收了沉淀物，分别用甲醇/DMF(1：1v/v)以及甲醇洗涤两次。使获得的产物溶解在DMSO中，加入过量的水使其沉淀。相同的步骤重复3次，通过冷冻干燥使获得的沉淀物干燥。产量：3.12g，92.4％(基于PEG)。
(制造例3)酯-PRX的制备
使用PEG-双琥珀酸(20kDa)(PEG-bis SA)，并按照制造例2制备了酯-PRX。为了获得PEG-bis SA，使PEG(20kDa)(5.8g，0.29mmol)、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(85.5μL，0.57mmol)、以及琥珀酸酐(1.7g，17mmol)溶解在吡啶(26mL)中，在置换为氮气的条件下，在55℃下搅拌18小时。加入乙醇(25mL)，并在-20℃下静置2小时后，通过离心分离回收了沉淀物，用冷乙醇洗涤数次，在减压条件下使其干燥。产量：4.68g，81％。
使用PEG-bis SA并按照上述方法制备了α-CD/PEG-bis SA聚类轮烷。
为了获得酯-PRX，使1-金刚烷胺(72.5mg，0.48mmol)、BOP试剂(212.5mg，0.48mmol)、以及EDIPA(90.3μL，0.52mmol)溶解在DMF(25mL)中，并加入α-CD/PEG-bis SA聚类轮烷(3.5g)。在置换为氮气的条件下，在4℃下搅拌48小时后，通过离心分离回收了沉淀物，分别用甲醇/DMF(1：1v/v)和甲醇洗涤两次。使获得的产物溶解在DMSO中，加入过量的水使其沉淀。上述步骤重复3次，通过冷冻干燥使获得的沉淀物干燥。产量：2.71g，87％(基于PEG)。
(制造例4)二硫化物-PRX的制备
使用PEG-双胱胺(20kDa)(PEG-bis Cys)，并按照制造例1制备了二硫化物-PRX。为了获得PEG-bis Cys，使PEG(20kDa)(14.5g，0.73mmol)、CDI(3.3g，20.0mmol)、以及TEA(208μL，1.5mmol)溶解在DMSO(500mL)中，在置换为氮气的条件下，在室温下搅拌24小时。使胱胺二盐酸盐(3.5g，15.5mmol)溶解在DMSO(50mL)中，在TEA(2.3mL，31.0mMol)存在的条件下搅拌30分钟以进行脱盐。将反应物滴加到已脱盐的胱胺中，在室温下搅拌48小时。加入乙醇(550mL)，并在-20℃下静置2小时后，通过离心分离回收沉淀物，用冷乙醇洗涤数次，并进行减压干燥。产量：14.2g，98％。
使用PEG-bis Cys，并按照上述方法制备了α-CD/PEG-bis Cys聚类轮烷。
为了获得二硫化物-PRX，使1-金刚烷乙酸(0.61g，3.2mmol)、BOP试剂(1.31g，3.0mmol)、HOBt(0.44g，2.9mmol)、以及EDIPA(0.57mL，3.3mol)溶解在DMF(22mL)中，并添加α-CD/PEG-bis Cys聚类轮烷(3.5g)。在置换为氮气的条件下，在4℃下搅拌48小时后，通过离心分离收集沉淀物，分别用甲醇/DMF(1：1v/v)和甲醇洗涤两次。使获得的产物溶解在DMSO中，用过量的丙酮使其沉淀。用水洗涤沉淀物3次，通过冷冻干燥使获得的沉淀物干燥。产量：1.41g，51％(基于PEG)。
(制造例5)缩酮-PRX的制备(方法A)
使用PEG-双缩酮(20kDa)(PEG-bis ket)，并按照制造例1制备了缩酮-PRX。为了获得PEG-bis ket，使PEG(20kDa)(2g，0.1mmol)以及CDI(72mg，0.44mmol)溶解在THF(7.15mL)中，在置换为氮气的条件下，在50℃下搅拌18小时。将反应物滴加到乙二胺(0.5mL，3.14mmol)中，并在50℃下搅拌2小时。加入乙醇(14.3mL)，并在-20℃下静置2小时后，通过离心分离回收沉淀物，用冷乙醇洗涤数次，并在减压条件下使其干燥。产量：1.7g，83.6％。
使用PEG-bis ket并按照上述方法制备了α-CD/PEG-bis ket聚类轮烷。并且聚类轮烷的收率低。
(制造例6)缩酮-PRX的制备(方法B)
使用1-金刚烷缩酮(Ad-ket)，并按照制造例2制备了缩酮-PRX。为了获得Ad-ket，使1-金刚烷乙酸(194mg，1.0mmol)、N-羟基琥珀酰亚胺(230mg，2mmol)、以及1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(382mg，2mmol)溶解在二氯甲烷(DCM)(10mL)中，在室温下搅拌5小时。将反应物滴加到DCM(10mL)中的2,2-双(氨基乙氧基)丙烷溶液(796.8μL，5mmol)中，在室温下搅拌一夜。在添加了饱和NaCl水溶液后，回收了有机层。反复进行3次该萃取，并进行减压干燥。产量：308mg，91％。
为了获得缩酮-PRX，使Ad-ket(300mg，0.89mmol)、BOP试剂(393.1mg，0.89mmol)、以及EDIPA(167μL，0.96mmol)溶解在DMF(40.7mL)中，并加入α-CD/PEG-COOH聚类轮烷(6.475g)。在置换为氮气的条件下，在室温下搅拌48小时后，通过离心分离收集沉淀物，分别用甲醇/DMF(1：1v/v)和甲醇洗涤两次。使获得的产物溶解在DMSO中，并在过量的水中使其沉淀。上述步骤重复3次，通过冷冻干燥使获得的沉淀物干燥。产量：4.69g，89％(基于PEG)。
(制造例7)腙-PRX的制备
PEG-双酰肼(Creative PEGWorks，美国教堂山)，并按照上述方法制备了α-CD/PEG-双酰肼(20kDa)(PEG-双酰肼)聚类轮烷。为了获得腙-PRX，使1-金刚烷甲醛(59.1mg，0.36mmol)分散在DMF(2.86mL)中，并添加α-CD/PEG-双酰肼聚类轮烷(400mg)。在置换为氮气的条件下，在室温下搅拌48小时后，通过离心分离回收了沉淀物，分别用甲醇/DMF(1：1v/v)和甲醇洗涤两次。使获得的产物溶解在DMSO中，用过量的丙酮使其沉淀。用水洗涤沉淀物两次，通过冷冻干燥使获得的沉淀物干燥。产量：<5mg，<2％(基于PEG)。
(制造例8)PRX中的α-CD的羟基中的BAEE、DET以及DMAE的修饰
使用CDI活化按照上述方法制备的各种PRX中的α-CD的羟基，并将反应物添加到含有双胺或一端具有胺的溶液中，由此制备了BAEE-PRX(Amino-PRX(1G))，DET-PRX(Amino-PRX(2G))，以及DMAE-PRX。
作为典型方案，在氨基甲酸酯-DET-PRX的制备中，使氨基甲酸酯-PRX(100mg，1.25μmol，α-CD：76.8μmol)以及CDI(114mg，0.7mmol)溶解在DMSO(3mL)中，在置换为氮气的条件下，在室温下搅拌一夜。将反应物滴加到DET(758.6μL，7.0mmol)中，在置换为氮气的条件下，在室温下搅拌一夜。
为了纯化氨基甲酸酯-BAEE-PRX、氨基甲酸酯-DET-PRX、氨基甲酸酯-DMAE-PRX以及酰胺-DET-PRX，使样本相对于水透析(Spectra/PorTM膜MWCO：10kDa)，并通过冷冻干燥使其干燥。为了纯化二硫化物-DET-PRX，使样本相对于甲醇透析(Spectra/PorTM膜MWCO：10kDa)，使其蒸发并溶解在水中，通过冷冻干燥使其干燥。为了纯化缩酮-DET-PRX，用过量的冷乙醇使样本沉淀，并用乙醇洗涤5次，使其蒸发并溶解在水中，通过冷冻干燥使其干燥。氨基甲酸酯-BAEE-PRX、氨基甲酸酯-DET-PRX、氨基甲酸酯-DMAE-PRX、酰胺-DET-PRX、二硫化物-DET-PRX以及缩酮-DET-PRX的产量分别为133.0mg(80％)、116.2mg(84％)、92.5mg(69％)、574mg(85％)、110.6mg(73％)以及27.7mg(42％)。
(制造例9)Cys-PRX(Amino-PRX(4G))的制备
使氨基甲酸酯-PRX(100mg，1.25μmol，α-CD：76.8μmol)以及CDI(114mg，0.7mmol)溶解在DMSO(3mL)中，在置换为氮气的条件下，在室温下搅拌24小时。使胱胺二盐酸盐(3.16g，14.0mmol)溶解在DMSO(45mL)中，在TEA(3.9mL，28.1mol)存在的条件下搅拌30分钟，以进行脱盐。将反应物滴加到已脱盐的胱胺中，在氮气气氛下，在室温下搅拌一夜。为了进行纯化，用过量的冷乙醇使样本沉淀，并用乙醇洗涤5次，使其蒸发并溶解在水中，通过冷冻干燥使其干燥。产量：82.1mg，66％。
(制造例10)Cys-DET-PRX(Amino-PRX(5G))的制备
使氨基甲酸酯-PRX(100mg，1.25μmol，α-CD：76.8μmol)以及CDI(114mg，0.7mmol)溶解在DMSO(3mL)中，在氮气气氛下，在室温下搅拌24小时。使胱胺二盐酸盐(1.58g，7.0mmol)溶解在DMSO(22.5mL)中，在TEA(20mL，14.0mol)存在的条件下搅拌30分钟，以进行脱盐。然后向已脱盐的胱胺溶液中加入DET(758.0μL，7.0mol)。将反应物滴加到DET/脱盐胱胺混合物中，在氮气气氛下，在室温下搅拌一夜。与上述Cys-PRX相同的方案纯化样本。产量：98.2mg，76％。
(制造例11)BAEE-DEX的制备
使右旋糖酐70(7.56g，11mmol)以及CDI(10.07g，62mmol)溶解在DMSO(250mL)中，在氮气气氛下，在室温下搅拌一夜。将反应物滴加到1,2-双(2-氨基乙氧基)乙烷(92.1mL，630mmol)中，在氮气气氛下，在室温下搅拌一夜。相对于水透析(Spectra/PorTM膜MWCO：10kDa)后，通过冷冻干燥使样本干燥。
(制造例12)DET-DEX的制备
在DET-DEX的制备中，使右旋糖酐70(0.5g，7.14μmol)和CDI(1.33g，8.2mmol)溶解在DMSO(15mL)中，在氮气气氛下，在室温下搅拌一夜。将反应物滴加到DET(9.0mL，83.4mmol)中，在氮气气氛下，在室温下搅拌一夜。相对于水透析(Spectra/PorTM膜MWCO：10kDa)后，通过冷冻干燥使样本干燥。产量：433.6mg，65％。
(制造例13)使用各种阳离子性材料制备Cas9 RNP复合体
将重组Cas9蛋白质(N末端经NLS修饰)和sgRNA以1：1的摩尔比进行混合，并在无核酸酶水(用于评价物理性质)或Opti-MEM(用于细胞实验)(相对于0.24μg的sgRNA为25μL)中，在室温下培养10分钟。接下来，将Cas9RNP溶液添加到等量的hank’s平衡盐溶液(HBSS)或Opti-MEM(含有各种含量的Amino-PRX、阳离子性聚合物以及CRISPRMAX)中，稳定地搅拌，在室温下培养15分钟。根据印迹的百分率设定聚合物的含量(927氨基/Cas9 RNP＝100％)。基本上将伯氨基、仲氨基和叔氨基均算作1个胺，DET按单元算作1个胺，仅树枝状聚合物的表面胺用于计算。严格遵守制造方规定的有关混合比例、稀释时间、培养时间等的方案而制备了CRISPRMAX/Cas9 RNP复合体。严格按照相同的步骤，使用crRNA/ATTO-tracrRNA复合体代替sgRNA进行了细胞内吸纳以及细胞内分布的测试。
(试验例1)pH值对DET-PRX的质子化的影响
添加DCl将溶解于D2O的DET-PRX的pD调整到中性或酸性，用1NMR观察DET的亚甲基单元的质子的下移。根据以往的报告(Liu,F.et al.Nat Cell Biol.19,1358-1370(2017).)，在以下公式中使用pH值计显示的值来计算pD。
pD＝pH+0.41
(试验例2)Cas9 RNP复合物的尺寸和ζ电位的测量
用800μL的HBSS(pH值7.4)稀释Cas9 RNP复合物(sgRNA：0.96μg，总共200μL)。使用Zetasizer Nano ZS装置(Malvern Instruments，英国伍斯特郡)通过动态光散射法测定了复合物的尺寸和ζ电位。
(试验例3)低温电子显微镜(Cryo-TEM)观察
使用JEM-2100F场致发射TEM装置(日本电子株式会社)并以加速电压120kV进行了Cryo-TEM测量。在Cryo-TEM中，将含有高浓度的Cas9 RNP复合体(sgRNA：2.85μg，总共10μL)的2μL的制备悬浮液放置在由穿孔碳膜覆盖的200目的铜制栅格(Nisshin EM CO.,Ltd.,日本东京)上。吸取多余的液体而制备了悬浮液的薄水膜(厚度约100nm)。此外，使用徕卡CPSC低温制备腔室(徕卡显微系统，德国韦茨拉尔)使薄膜浸渍液体乙烷，从而使其快速玻璃化。将已玻璃化的薄膜的栅格设置在样本保持件上，然后移至显微镜室中。使用液氮，将样本温度保持为低于-170℃。
(试验例4)肝素竞争测定
将Cas9 RNP复合物(sgRNA：0.2μg，总共7μL)与1μL的各种浓度的肝素钠盐(Nacalai Tesque，日本京都)溶液(0mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、0.75mg/mL、1mg/mL)混合，并在室温下培养10分钟。向混合物中加入2μL的6×加载缓冲液(TaKaRa Bio，日本滋贺)后，在Tris-borate EDTA缓冲液(45mM Tris-borate，1mM EDTA，pH值8.0(0.5×TBE))中，在2％(w/v)琼脂糖S凝胶上以室温且100V的条件，进行40分钟的凝胶电泳。用溴化乙锭对凝胶进行染色。使用Amersham Typhoon扫描仪(FLA-9000，富士胶卷，日本东京)使sgRNA以及Cas9 RNP条带可视化。根据复合物和释放的Cas9 RNP的相对条带强度，使用Image J软件(国立卫生研究所，美国马里兰州贝赛斯达)将剩余的复合物的比率(％)定量化。
(试验例5)与各种阳离子性材料形成了复合体的Cas9 RNP的细胞内吸纳在转染前24小时将HeLa细胞(3.75×104细胞/孔)接种到24孔板上，用无血清培养基洗涤两次。将在DMEM中最终浓度被稀释至14.6nM的Cas9 RNP复合体500μL(crRNA/ATTO tracrRNA，非靶向性)添加到各孔中，在37℃下培养4小时。用HBSS洗涤细胞两次，用胰蛋白酶-EDTA法进行分离，并通过离心分离进行回收，然后分散在500μL的含有10％FBS的HBSS中，用尼龙网过滤。使用BD Accuri C6流式细胞仪(BD Bioscience Japan，日本东京)和BD Accuri C6软件(BDBioscience Japan，日本东京)对来自1×104个细胞的数据进行分析。
(试验例6)细胞生存率
在转染前24小时将HeLa细胞(1.5×104细胞/孔)接种到96孔板上，用无血清培养基洗涤两次。将在DMEM中最终浓度被稀释至14.6～58.4nM的200μL的Cas9 RNP复合体(sgCont)添加到各孔中，在37℃下培养4小时。用DMEM洗涤细胞两次，将200μL的DMEM(10％FBS)添加到各孔中，在37℃下培养20小时。用HBSS洗涤两次后，将100μL新鲜的HBSS和10μL的细胞计数试剂盒-8(Dojindo，日本熊本)加入到各孔中，在37℃下培养1小时。用Epoch微孔板阅读器(Bio Tek Instruments，美国佛蒙特州威努斯基)测量溶液的吸光度(450nm(样本)，655nm(参考))。
为了测量pH值5.5下的细胞生存率以研究胞内体膜破坏情况，使用经酸性DMEM(pH值5.5)稀释的Cas9 RNP复合物，并且以与上述方法相同的方式实施了其他步骤，其中该酸性DMEM(pH值5.5)是用通常的DMEM(pH值7.4)或用HCL调整的酸性DMEM。
(试验例7)各种Cas9 RNP复合体在HeLa GFP细胞中的基因组编辑活性
在转染前24小时将HeLa/GFP细胞(3.75×104细胞/孔)接种到24孔板上，用无血清培养基洗涤两次。将在DMEM中最终浓度被稀释至29.2～116.8nM的500μL的Cas9 RNP复合体(sgCont(未靶向GFP的sgRNA)或sgGFP)添加到各孔中，在37℃下培养4小时。用DMEM洗涤细胞两次，将500μL的DMEM(10％FBS)加入到各孔中，培养5天。用HBSS洗涤细胞两次，在HBSS中移液由此进行分离，并通过离心分离进行回收，使其分散在1mL的含有10％FBS的HBSS中，然后用尼龙网过滤。按照上述方法进行了流式细胞术分析。按照以下公式计算GFP敲除(％)。
GFP敲除(％)＝100-100×(样本的GFP阳性细胞/未处理对照组的GFP阳性细胞)
(试验例8)Amino-PRX(5G)/Cas9 RNP复合物在GSH存在下的基因组编辑活性
用含有各种浓度的GSH(0～10mM)的DMEM稀释Amino-PRX(5G)/Cas9 RNP复合物，并按照上述方法测量基因组编辑活性。
(试验例9)T7E1测定
使用DNA用MightyPrep试剂(Takera Bio，日本滋贺)提取了经Cas9 RNP复合体处理的细胞的基因组DNA。使用MightyAmp DNA聚合酶Ver.3(TaKaRa Bio，日本滋贺)扩增GFP的目标序列。使用NucleoSpin凝胶和PCR Clean-up(TaKaRa Bio，日本滋贺)纯化PCR扩增子。使被纯化的扩增子改性，再退火，使用T7核酸内切酶I检测试剂盒(GeneCopoeia,Inc.,美国马里兰州罗克维尔)并通过T7E1进行消化。在室温、0.5×TBE、4％(w/v)琼脂糖21凝胶、100V的条件下进行40分钟凝胶电泳。以与上文所述相同的方法进行了条带的染色可视化。
(试验例10)Amino-PRX/Cas9 RNP复合物的颗粒针对各种刺激的反应
用800μL的HBSS(pH值7.4：正常)、乙酸缓冲液(pH值5.5：胞内体环境)或HBSS(GSH：2mM：胞质溶胶中的还原环境)稀释Cas9 RNP复合物(sgRNA：0.96g，总共200μL)。并按照上述方法测定复合物的尺寸和ζ电位。
(试验例11)各种Amino-PRX/Cas9 RNP复合物的细胞内分布
将HeLa细胞(1.0×104细胞/皿)在转染前24小时接种到35mm的玻璃底皿中，并用无血清培养基洗涤两次。将在DMEM中最终浓度被稀释至14.6nm的200μL的Cas9 RNP复合体(crRNA/ATTO tracrRNA，非靶向性)添加到各皿中，并在37℃下培养4小时(4h样本)。然后对于一部分样本，用DMEM洗涤细胞两次，再将2mL的DMEM添加到各皿中，然后，再培养4小时(8h样本)或8小时(12h样本)。接下来，用HBSS洗涤细胞两次，用4％的多聚甲醛溶液在室温下固定10分钟，使用2μg/mL的Hoechst33342(Thermo Fisher Scientific K.K.,日本东京)在室温下染色10分钟。使用徕卡TCS-SP5(徕卡日本，日本东京)进行共焦激光扫描显微镜观察。用Image J软件将获得的图像的荧光强度/核面积定量。
(实施例1)使用Amino-PRX的Cas9 RNP的自动分子印迹(BAEE-PRX)
Cas9 RNP具有两性离子和三维电荷分布(图1A)，因此以往的阳离子性聚合物无法与Cas9 RNP形成复合物。考察了BAEE-PRX是否能够仅经混合便如分子印迹一样借助氨基修饰的α-CD的移动和旋转效果而与Cas9 RNP有效地形成复合物，即，考察了BAEE-PRX是否可以作为用于Cas9 RNP的自动分子印迹剂发挥作用。
合成了在α-CD贯穿(threaded)、并用金刚烷(Ad)封端的带有PEG(20kDa)主干的PRX。然后，用1,2-双(2-氨基乙氧基)乙烷(BAEE)修饰PRX的α-CD的羟基，获得了伯氨基修饰的PRX(Amino-PRX)(图1C)。作为对照聚合物，以几乎相同的BAEE修饰率和分子量制备了葡萄糖基的聚合物即BAEE-右旋糖酐(BAEE-DEX)。
对于BAEE-PRX和Cas9 RNP的复合体、以及BAEE-DEX和Cas9 RNP的复合体的形成效率，根据它们的ζ电位进行了评价(图2)。跟据以往所报告的NC，一个Cas9 RNP分子的分子印迹需要927个阳离子性单体(Chen,G.et al.Nat Nanotechnol 14,974-980(2019).)。因此，作为复合体形成的指标，将该氨基的混合比例设定为能够施加100％印迹的量。通过添加BAEE-PRX，Cas9 RNP的ζ电位立即发生逆转，并以对应于10％印迹的氨基达到平稳。另一方面，通过添加BAEE-DEX而发生的ζ电位的逆转比BAEE-PRX慢，仅在添加了具有与100％印迹的氨基相当的量的Amino-DEX的情况下获得了充分的络合。
接下来，检测了BAEE-PRX/Cas9 RNP复合物的细胞内吸纳达到最大的氨基的比率，发现在50％印迹达到最大细胞内吸纳(图3)。
此外，用Cryo-TEM观察了以达到最大细胞内吸纳(50％印迹)的混合比例制备的BAEE-PRX/Cas9 RNP复合物(图4A～图4C)。Cas9 RNP显示呈小晶体凝聚一样的晶体形态(图4A)，不过，BAEE-PRX/Cas9 RNP复合物也可以取代Cas9RNP晶体而显示为约100～200nm的低对比度的颗粒(图4B)。BAEE-PRX/Cas9 RNP颗粒的对比度低表示Cas9 RNP的晶体化程度下降，这表明Cas9 RNP与BAEE-PRX之间存在较强的分子水平的相互作用。BAEE-DEX/Cas9 RNP复合物的图像(图4C)与单独的Cas9 RNP的情况相比几乎没有变化，从而有可能原样剩余了未发生相互作用的Cas9 RNP。
这些结果强有力地证明了借助大环分子的移动性，使得BAEE-PRX与以往的低运动性聚合物相比以更高的效率为Cas9 RNP提供相互作用基团，从而以更高的效率形成复合物。
此外，此外，对在静电破坏复合物的肝素(具有负电荷的物质)存在下的BAEE-PRX/Cas9 RNP的稳定性和BAEE-DEX/Cas9 RNP的稳定性进行比较，由此通过肝素竞争测定检测了哪种载体能够与Cas9 RNP产生更强的相互作用并使复合物稳定化。进行肝素竞争测定的结果表明，就Cas9 RNP复合物的稳定性而言，Cas9 RNP与BAEE-PRX的复合物的稳定性高于Cas9 RNP与BAEE-DEX的复合物的稳定性(图5A以及图5B)。这表明与以往的聚合物相比，通过BAEE-PRX与Cas9 RNP形成复合物不仅效率更高，而且效力更强。
此外，与使用BAEE-DEX、使用显示各种结构/分子量/电荷分布的共8种阳离子性聚合物、以及在能够保证安全性的条件下使用作为用于引入Cas9 RNP的试剂而被广泛应用的LipofectamineTM和CRISPRMAXTM的情形相比，BAEE-PRX和Cas9 RNP的复合物的HeLa细胞内吸纳程度最高(图6A～图6C)。
这些结果表明，BAEE-PRX借助与Cas9 RNP的超分子转换，而仅通过混合便能够高效地形成强力的复合体，从而能够作为与以往的聚合物相比具有更加优异的细胞内引入效率的载体而加以使用。尤其还展现了作为PRX基相对于Cas9 RNP的自动分子印迹的实用性。
(实施例2)由二乙烯三胺(DET)和PRX的动态特性实现的Cas9 RNP复合物的协调性胞内体破坏效果
与基因/核酸的情况相同，在Cas9 RNP的情况下，将Cas9 RNP吸纳到细胞内后从胞内体释放Cas9 RNP，这对于避免被溶酶体消化从而实现有效的基因组编辑至关重要。因此，对提高Amino-PRX的胞内体逸出能力的PRX的修饰氨基进行了考察。迄今为止，不仅关于Cas9 RNP，在基因/核酸的引入方面也未进行PRX的氨基优化的相关研究。除了作为BAEE-PRX而被使用的具有伯氨基的BAEE-PRX，还分别制备了用DET和DMAE以相同的修饰比修饰的PRX来作为DET-PRX以及DMAE-PRX，其中，所述DET是作为胞内体破坏氨基单元而被报告的DET(Miyata,Ketal.,Journal of the American Chemical Society 130,16287-16294(2008).)；所述DMAE是作为PRX修饰胺被大量报告的叔胺即2-(二甲基氨基)乙基胺(DMAE)(Ooya,T.et al.(2006)同上；Emami,M.R.et al.(2019)同上；Tamura,A.et al.,Biomaterials 34,2480-2491(2013)；Tamura,A.et al.,Sci Rep 3,2252(2013)；Tamura,A.et al.(2015)同上)。在表2中，“Number(CyD)”表示，相对于1分子的PRX被修饰的氨基的个数。尤其是，DET单元的两个阳离子的电荷状态在中性pH值下以单质子化(安全形态)呈现，在酸性条件下以双质子化(膜破坏形态)呈现，因此，当DET单元存在于细胞外以及细胞质溶胶中时，虽然不会引起膜(细胞/细胞器)的损伤，但是据报告在酸性环境下(后期胞内体等)会引起膜的损伤，从而促进内含物从膜中释放(Miyata,Ketal.(2008)同上)。测量了酸性、中性以及碱性溶液中的NMR频谱，并确认到DET-PRX的两阶段质子化(非图示)。
【表2】
为了评价各种氨基修饰PRX的Cas9 RNP复合物的胞内体膜破坏能力，假设pH值5.5的细胞膜作为胞内体膜，并实施了细胞毒性检测(图7)。在中性pH值下，DET-PRX复合物以及DMAE-PRX复合物相较于BAEE-PRX复合物显示了较低的细胞毒性。在胞内体环境(pH值5.5)下，DET-PRX复合物通过ζ电位的增强，而比BAEE-PRX复合物以及DMAE-PRX复合物显示出更强的细胞膜破坏活性，表明DET-PRX在三种Amino-PRX中诱导Cas9 RNP的胞内体逸出效率最高。
关于复合物的细胞内吸纳的效率，DMAE-PRX/Cas9 RNP复合物最高，DET-PRX/Cas9RNP复合物最低(图8)。但是，DET-PRX/Cas9 RNP复合物的基因组编辑活性比BAEE-PRX/Cas9RNP复合物以及DMAE-PRX/Cas9 RNP复合物的基因组编辑活性高(图9A以及图9B)。这强力证明了DET-PRX的改善效果以及细胞内动力(尤其是胞内体逸出)的重要性。
此外，在胞内体条件下，使用以使得DET修饰率和分子量几乎相同的方式制备的DET-PRX以及DET-DEX，对Cas9 RNP的膜破坏活性进行了比较(图10)。DET-PRX复合物的胞内体破坏活性稍高于DET-DEX复合物，从而表明DET和PRX的动态特性相对于胞内体和Cas9RNP的逃逸具有协调效果、以及PRX主干的重要性。由此发现，DET-PRX在胞内体环境下使CD旋转，由此消除胞内体膜与DET单元之间的三维结构上的错配，从而通过有效地相互作用，可获得比用DET修饰的通常的聚合物更高的膜破坏效果，并成功开发了DET-PRX，除了自动分子印迹之外，通过第2阶段的分子结构转换而促进从胞内体逸出(图11)。
(实施例3)赋予Amino-PRX细胞内降解性以有效地释放Cas9 RNP
若从Amino-PRX释放出Cas9 RNP，则通过核定位信号促进Cas9 RNP的核移位，从而提高基因组编辑效率。迄今为止，报告了向端帽与轴向分子之间的键合引入了可在细胞内裂解的连接物(端帽连接物)的PRX因连接物在细胞内被破坏而向细胞内释放被加载的成分(Ooya,T.et al.(2006)同上；Tamura,A.et al.(2013)同上；Tamura,A.et al.(2013)同上；Tamura,A.et al.(2015)同上)。但是，迄今为止并未对优化适合于各分子的端帽连接物进行研究，亦不存在与Cas9RNP相关的报告。因此，尝试通过改变PEG末端的官能基团来制备含有酰胺、氨基甲酸酯(实施例2的DET-PRX)、二硫化物、缩酮、酯以及腙这6种端帽连接物的DET-PRX(图12A以及图12B)。PEG末端的2-甲基通过立体效应来阻碍对α-CD的贯穿，导致聚类轮烷的收率较低，例外的是，向金刚烷(端帽)侧引入缩酮连接物而生成了缩酮-PRX。由于金刚烷醛难以溶解于DMF，因此腙-PRX的收率较低，此外，与略带吸湿性且为碱性的DET的反应过程中不可避免地发生降解，因此用DET对酯-PRX的修饰是不可能的。
对最终获得的含有4种Amino-PRX(氨基甲酸酯-DET-PRX、缩酮-DET-PRX、酰胺-DET-PRX以及二硫化物-DET-PEX)的低浓度的Cas9 RNP复合物的基因组编辑效率进行了评价(图13)。所有的Amino-PRX展现了基因组编辑效果，特别是氨基甲酸酯-DET-PEX、缩酮-DET-PRX、酰胺-DET-PRX展现出等同的基因组编辑效率。考虑到生物体相容性，选择了可长期水解的氨基甲酸酯-连接物作为Amino-PRX的最佳端帽连接物。
作为使加载到PRX的分子释放的其他策略，向CD与氨基的键合引入了能够在细胞内裂解的连接物(刷状连接物)。由此，期待细胞内刺激使连接物裂解以减少与CD键合的氨基的数量，并减弱CD与Cas RNP的相互作用。可以认为生物降解性PRX的药物释放功能在端帽型中比刷状型中更加显著，因此，选择二硫化物键合作为刷状连接物。通过用胱胺(Cys)修饰α-CD的羟基，而新合成了经由二硫化物键而添加了伯胺的Cys-PRX(图14A以及图14B)。对于与实施例2相同的伯胺即Cys-PRX，Cas9 RNP从胞内体释放的能力较低，从而在低浓度下未展现出基因组编辑(非图示)。因此，尝试了混合Cys和DET的策略。
使用以1：1混合Cys-PRX和DET-PRX的混合物(DET-PRX/Cys-PRX)、以及在同一PRX上用Cys和DET修饰的Amino-PRX(Cys-DET-PRX)，来检测Cas9 RNP复合物的基因组编辑活性(图15A以及图15B)。均展现了基因组编辑效果，不过在Cys-DET-PRX中确认到大幅度的改善。该效果表明，既借助于DET实现了从胞内体的释放，又通过Cys在细胞内被降解以使相互作用的官能基团减半而实现了Cas9 RNP从载体的释放。
由以上实验结果表明，不仅细胞内吸纳，细胞内吸纳后的细胞内动力的控制也成为决定基因组编辑效率的因素。此外，和GSH预培养的Cys-DET-PRX的基因组编辑活性在细胞外浓度(～0.02mM)的GSH中不会减少，不过在细胞内浓度(2～10mM)的GSH中会有所减少(图16A以及图16B)，由此可知Cys-DET-PRX的稳定性和刺激反应性之间的平衡良好，仅在细胞内还原环境下才会引起复合物破坏。
此外，Cys-DET-PRX/Cas9 RNP复合物能够与CRISPRMAX/Cas9 RNP复合体等同有效地诱导基因组编辑(图17)。此外，Cys-DET-PRX比CRISPRMAX具有更高的安全性，由此能够以高浓度实施处理。因此可知，通过采用CRISPRMAX无法用于诱导的高浓度，而能够以更高的效率实现基因引入(图17)。
(实施例4)由Cys-DET-PRX的5种形态变化而实现的Cas9 RNP的有效核移位和基因组编辑
可以认为由Cys-DET-PRX实现的有效的基因组编辑是通过如下而实现的(图18)，即，通过自动印迹与Cas9 RNP形成复合体；在胞内体中通过质子化和α-CD旋转而破坏膜；刷状连接物的降解和Cas9 RNP在胞质溶胶中的释放；以及Cas9 RNP的核移位。为了对此进行证明，首先，对各种刺激环境下的Cys-DET-PRX/Cas9 RNP复合物的物理特性进行了评价(图19A～图19C)。Cys-DET-PRX复合物的ζ电位在胞内体环境下增加，并且颗粒在细胞内浓度的GSH处理下被破坏。而且，通过将氨基甲酸酯键作为端帽连接物而能够实现长期降解，可展现优异的生物体相容性。Cys-DET-PRX通过(1)复合体形成前、(2)复合物(细胞外/细胞质溶胶)、(3)高电荷复合物(胞内体)、(4)不稳定化复合物(GSH刺激)以及(5)Cys-DET-PRX的单体化PRX(长期降解)这5种形态变化，能够非常有效、简单且安全地递送Cas9 RNP。实际上，使用Cys-DET-PRX引入的Cas9 RNP复合物的核移位能力因胞内体逸出能力以及Cas9RNP在细胞质溶胶中的释放能力而非常高。这些结果表明Cys-DET-PRX通过5个阶段的变化而实现了高效率的Cas9 RNP递送。
(实施例5)Cys-DET-PRX/siRNA的RNAi效果
将HeLa GFP细胞接种到24孔板上，在37℃下培养24小时。向用无血清培养基洗涤两次后的细胞中添加了500μL的含有以下样本的无血清培养基。
(样本)
siRNA单独(25nM、50nM、100nM)
LipofectamineTM2000/siRNA(25nM、50nM、100nM)
Amino-PRX(2G)/siRNA(25nM、50nM、100nM)
Amino-PRX(5G)/siRNA(25nM、50nM、100nM)
在样本存在下，在37℃下培养4小时后，用无血清培养基洗涤两次，并添加了500μL的含有10％FBS的DMEM，然后，再培养68小时后评价了RNAi。
结果如图20所示。Amino-PRX(2G)/siRNA的复合物显示了与LipofectamineTM2000/siRNA等同程度的RNAi效果，而Amino-PRX(5G)/siRNA(25nM、50nM、100nM)复合物显示了比其他更高的RNAi效果。这表明，Amino-PRX(2G)以及Amino-PRX(5G)是优异的siRNA载体，尤其是Amino-PRX(5G)是全新的划时代的载体，其具有比作为市售的核酸引入用试剂的LipofectamineTM2000更高的siRNA引入效果。
(实施例6)Cys-DET-PRX/Cas9 RNP在in vivo中进行的基因组编辑
将HeLa/GFP细胞(1×106细胞，100mL)移植到Balb/c nu/nu(♂，4-w old)小鼠的左后肢。对肿瘤长径达到5mm的小鼠(移植约5天后)的肿瘤直接施用(250pmol，200mL)以下样本。
(样本)
HBSS(Control)
Cas9/sgGFP
Amino-PRX(5G)/Cas9 RNP(sgCont)
Amino-PRX(5G)/Cas9 RNP(sgGFP)
CRISPRMAX/Cas9 RNP(sgCont)
CRISPRMAX/Cas9 RNP(sgGFP)
饲养5天后，用PBS回流并回收了肿瘤。对100mg的肿瘤添加1mL的RIPA缓冲液，并搅拌均匀。实施离心(转速5000rpm，5min)后，回收了上清液。该操作(离心和回收)重复执行两次，用荧光平板阅读器测量了获得的上清液的荧光强度。
结果如图21所示。CRISPRMAX/Cas9 RNP在in vivoz中无法诱导基因组编辑效应，而Amino-PRX(5G)/Cas9 RNP能够诱导基因组编辑。这表明，Amino-PRX(5G)是一种优异的Cas9 RNP，其能够诱导市售的引入试剂无法诱导的in vivo基因组编辑。
(实施例7)核酸递送中的修饰氨基的优化
为了在核酸递送中优化PRX的修饰氨基，使用siRNA作为模型核酸，并考察了将3种氨基化PRX与siRNA的复合体引入细胞时的RNAi效果。作为3种氨基化PRX，使用了以与实施例2同样的方法制备的BAEE-PRX、DET-PRX以及DMAE-PRX。此外，使用下述siGFP作为siRNA。
(siGFP)
Sence：5’-GCAAGCUGACCCUGAAGUUCAU dTdT-3’(序列号6)
antiSence：5’-AUGAACUUCAGGGUCAGCUUGCCG-3’(序列号7)
将HeLa/GFP细胞接种(3.75×104细胞/孔)到24孔板，在37℃下培养24小时。向用无血清培养基洗涤两次后的细胞中添加了300μL的含有以下各种样本的无血清培养基。
(样本)
siRNA单独(0nM、25nM、50nM、100nM)
BAEE-PRX/siRNA(0nM、25nM、50nM、100nM)
DET-PRX/siRNA(0nM、25nM、50nM、100nM)
DMAE-PRX/siRNA(0nM、25nM、50nM、100nM)
在样本存在下，在37℃下培养4小时后，用无血清培养基洗涤两次。添加500μL的含有10％FBS的DMEM后，在37℃下培养68小时。然后，用流式细胞术评价了RNAi效果。
结果如图22所示。在BAEE-PRX/siRNA、DET-PRX/siRNA以及DMAE-PRX/siRNA中，DET-PRX/siRNA展现了最高的RNAi效果。这表明，与Cas9RNP的情况相同，在以往的核酸递送中，具有胞内体逸出能力的DET是最佳的修饰氨基。
(实施例8)核酸递送中的端帽-轴向分子间键合的优化
为了优化核酸递送中的端帽-轴向分子间键合，使用siRNA作为模型核酸，并考察了将具有4种端帽-轴向分子间键合的DET-PRX(酰胺-DET-PRX、氨基甲酸酯-DET-PRX、二硫化物-DET-PRX以及缩酮-DET-PRX)与siRNA的复合体引入细胞时的RNAi效果。
将HeLa/GFP细胞接种(3.75×104细胞/孔)到24孔板，在37℃下培养24小时。向用无血清培养基洗涤两次后的细胞中添加了300μL的含有以下各种样本的无血清培养基。
(样本)
siRNA单独(0nM、25nM、50nM、100nM)
酰胺-DET-PRX/siRNA(0nM、25nM、50nM、100nM)
氨基甲酸酯-DET-PRX/siRNA(0nM、25nM、50nM、100nM)
二硫化物-DET-PRX/siRNA(0nM、25nM、50nM、100nM)
缩酮-DET-PRX/siRNA(0nM、25nM、50nM、100nM)
在样本存在下，在37℃下培养4小时后，用无血清培养基洗涤两次。添加500μL的含有10％FBS的DMEM后，在37℃下培养68小时。用流式细胞术评价了RNAi。
结果如图23所示。在具有4种端帽-轴向分子间键合的DET-PRX与siRNA的复合体中，氨基甲酸酯-DET-PRX/siRNA显示了最高的RNAi效果。在以往的核酸递送中，端帽-轴向分子之间具有可能长期被水解的氨基甲酸酯键的DET-PRX(氨基甲酸酯-DET-PRX)与具有酰胺键的DET-PRX(酰胺-DET-PRX)相比，显示了优异的核酸引入能力。这表明，氨基甲酸酯键的细胞内酶降解不仅在生物体相容性上至关重要，而且在负载分子的释放方面也至关重要。
(实施例9)Amino-PRX(5G)/siRNA的细胞毒性
为了将Amino-PRX(5G)/siRNA的细胞毒性与LipofectamineTM2000/siRNA进行比较，进行了以下试验。
将HeLa细胞接种(1.5×104细胞/孔)到96孔板，在37℃、5％CO2条件下培养24小时。向用无血清培养基洗涤两次后的细胞中添加200μL的含有以下各种样本的无血清培养基。
(样本)
Amino-PRX(5G)/siRNA(0nM、25nM、50nM、100nM、150nM、200nM、300nM、400nM)
LipofectamineTM2000/siRNA(0nM、25nM、50nM、100nM、150nM、200nM、300nM、400nM)
在样本存在下，在37℃、5％CO2的条件下培养4小时后，用无血清培养基洗涤两次。添加200μL的含有10％FBS的培养基，并在37℃、5％CO2的条件下培养20小时。用HBSS洗涤两次后，混合了100μL的HBSS和10μL的WST-8(Dojindo，日本熊本)。向各孔中添加110μL的HBSS/WST-8混合液，在37℃下培养1小时。用微型平板阅读器测量了吸光度(测量波长：450nm，参考波长：655nm)。
结果如图24所示。Amino-PRX(5G)/siRNA与LipofectamineTM2000/siRNA相比显示了显著低的细胞毒性。这表明，在引入siRNA时，Amino-PRX(5G)与作为市售的核酸引入用试剂的LipofectamineTM2000相比，具有优异的安全性。
(实施例10)Amino-PRX(5G)/ASO的GFP敲除效果
为了评价使模型核酸作为反义核酸(反义寡核苷酸antisense oligonucleotide：ASO)而实现的Amino-PRX(5G)的核酸递送能力，进行了以下试验。
将HeLa/GFP细胞接种(3.75×104细胞/孔)到24孔板，在37℃下培养24小时。向用无血清培养基洗涤两次后的细胞中添加300μL的含有以下各种样本的无血清培养基。此外，作为用于GFP敲除的ASO，使用了GFP ASO(TTGCCGGTGGTGCAGATAAA(序列号8))。
(样本)
ASO单独(50nM、100nM、200nM)
LipofectamineTM2000/ASO(50nM、100nM、200nM)
Amino-PRX(5G)/ASO(50nM、100nM、200nM)
在样本存在下，在37℃下培养4小时后，用无血清培养基洗涤两次。添加500μL的含有10％FBS的DMEM后，在37℃下培养68小时。用流式细胞术评价了基因抑制效果。
结果如图25所示。Amino-PRX(5G)/ASO与-LipofectamineTM2000/ASO相比具有显著高的GFP敲除效果。这表明，Amino-PRX(5G)在ASO递送中也具有实用性。
(实施例11)Amino-PRX(5G)/ASO的细胞毒性
为了将Amino-PRX(5G)/ASO的细胞毒性与LipofectamineTM2000/siRNA进行比较，进行了以下试验。
将HeLa细胞接种(1.5×104细胞/孔)到96孔板，在37℃、5％CO2的条件下培养24小时。向用无血清培养基洗涤两次后的细胞中添加200μL的含有以下各种样本的无血清培养基。
(样本)
Amino-PRX(5G)/ASO(0nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM)
LipofectamineTM2000/ASO(0nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM)
在样本存在下，在37℃、5％CO2的条件下培养4小时后，用无血清培养基洗涤两次。添加200μL的含有10％FBS的培养基，在37℃、5％CO2的条件下培养20小时。用HBSS洗涤两次后，混合了100μL的HBSS和10μL的WST-1(Dojindo，日本熊本)。向各孔添加110μL的HBSS/WST-1混合液，在37℃下培养1小时。用微型平板阅读器测量了吸光度(测量波长：450nm，参考波长：655nm)。
结果如图26所示。Amino-PRX(5G)/ASO与LipofectamineTM2000/ASO相比显示了显著低的细胞毒性。这表明，在引入ASO时，Amino-PRX(5G)与作为市售的核酸引入用试剂的LipofectamineTM2000相比具有更优异的安全性。
(实施例12)Amino-PRX(5G)/gapmer型ASO的mRNA敲除效果
为了通过将模型核酸作为反义核酸(gapmer型ASO)来评价Amino-PRX(5G)的核酸递送能力，进行了以下试验。
将HeLa/GFP细胞接种(3.75×104细胞/孔)到24孔板，在37℃下培养24小时。向用无血清培养基洗涤两次后的细胞中添加300μL的含有以下各种样本的无血清培养基。其中，作为用于GFP敲除的gapmer型ASO，使用了GFP ASO gapmer(GAACTTCAGGGTCAGC(序列号9)；在所有核酸之间加入了硫代磷酸酯(phosphorothioate)修饰(S化)。下化线部为LNA。)。
(样本)
HBSS(Control)
单独的gapmer型ASO(100nM)
Amino-PRX(5G)NP2/gapmer型ASO(100nM)
Amino-PRX(5G)NP5/gapmer型ASO(100nM)
Amino-PRX(5G)NP10/gapmer型ASO(100nM)
其中，上述NP2、NP5、NP10中的NP表示Amino-PRX(5G)的氨基(正电荷)与gapmer型ASO的磷酸基(负电荷)的比率。
在样本存在下，在37℃下培养4小时后，用无血清培养基洗涤两次。添加500μL的含有10％FBS的DMEM后，在37℃下培养44小时。用流式细胞术评价了基因抑制效果。
结果如图27所示。在使用Amino-PRX(5G)将gapmer型ASO引入到细胞内时，GFP敲除效果升高。这表明，Amino-PRX(5G)在gapmer型ASO递送中也具有实用性。
(实施例13)Amino-PRX(5G)的酸性蛋白质递送能力
使用β-半乳糖苷酶(β-Gal)作为酸性模型蛋白质，评价了Amino-PRX(5G)的酸性蛋白质递送能力。具体而言，将Amino-PRX(5G)与β-Gal的复合体引入到细胞，并通过测量细胞内的β-Gal酶活性，对β-Gal能否从胞内体逸出以及在细胞内的释放进行了考察。
使用了作为细胞内β-Gal活性检测试剂盒的SPiDER-β-Gal(Dojindo，日本熊本)进行了细胞内的β-Gal酶活性的测量。SPiDER-β-Gal渗透细胞膜并被细胞内的β-Gal裂解，然后，通过与细胞内蛋白质结合而发出荧光，因此，能够特异性地仅检测到存在于细胞内的β-Gal的酶活性。
将HeLa细胞接种(1.5×104细胞/孔)到35mm的玻璃底皿中，在37℃下培养24小时。向用无血清培养基洗涤两次后的细胞中添加200mL的Amino-PRX(5G)/β-Gal复合体溶液(β-Gal 25nm)。在37℃、5％CO2的条件下培养4小时后，用无血清培养基洗涤两次。添加200mL的SPiDER-β-Gal，在37℃下培养15分钟。用4％多聚甲醛处理10分钟使其固定，使用Hoechst33342进行核染色后，用荧光显微镜观察源自SPiDER-β-Gal的荧光(激发波长：480nm，荧光波长：530nm)。
结果如图28所示。使用Amino-PRX(5G)向细胞内引入的β-Gal保持了较高的酶活性。这表明，Amino-PRX(5G)是一种有用的载体，其在蛋白质引入方面亦能够确保蛋白质在细胞内的吸纳、蛋白质的胞内体逸出以及蛋白质在细胞质中的释放。
(实施例14)Amino-PRX(5G)的mRNA递送能力
为了使用mCherry mRNA对Amino-PRX(5G)的mRNA递送能力进行评价，进行了以下试验。
将HeLa细胞接种(3.75×104细胞/孔)到24孔板，在37℃下培养24小时。向用无血清培养基洗涤两次后的细胞中添加300μL的含有以下各种样本的无血清培养基。
(样本)
单独的mCherry mRNA(1500ng)
LipofectamineTM2000/mCherry mRNA(1500ng)
Amino-PRX(5G)NP0.5/mCherry mRNA(1500ng)
Amino-PRX(5G)NP0.75/mCherry mRNA(1500ng)
Amino-PRX(5G)NP1/mCherry mRNA(1500ng)
Amino-PRX(5G)NP2/mCherry mRNA(1500ng)
此外，上述NP0.5、NP0.75、NP1、NP2中的NP表示，Amino-PRX(5G)的氨基(正电荷)与mCherry mRNA的磷酸基(负电荷)的比率。
在样本存在下，在37℃下培养4小时后，用无血清培养基洗涤两次。添加500μL的含有10％FBS的DMEM后，在37℃下培养44小时。用流式细胞术评价了mCherry的平均荧光强度(MFI)。
结果如图29所示。在使用Amino-PRX(5G)将mCherry mRNA引入到细胞内时，发现mCherry的表达量增加。这表明，Amino-PRX(5G)作为mRNA递送载体而具有实用性。
(实施例15)优化Amino-PRX(5G)的取代度
对优化Amino-PRX(5G)的取代度进行了考察，并评价了构建的低取代度的Amino-PRX(5G)的Cas9 RNP引入能力。在此所述的“取代度”是PRX中的1个大环分子中被修饰的官能基团的数量。在PRX中的大环分子键合有多种官能基团的情况下，官能基团的数量是1个大环分子的各种官能基团的修饰数量的总数，在PRX中的大环分子键合有单一种类的官能基团的情况下，官能基团的数量是1个大环分子的该官能基团的修饰数量。此外，在Amino-PRX(5G)中，大环分子是环糊精(CyD)。低取代度是指官能基团的修饰数量较少。在此所述的“官能基团的修饰数量较少”是指，PRX中的1个大环分子的各种官能基团的修饰数量分别小于或等于1(PRX中的大环分子键合有单一种类的官能基团时，该官能基团的修饰数量小于或等于1)。即，当为Amino-PRX(5G)时，低取代度(即，官能基团的修饰数量较少)是指，PRX中的1个CyD1分子中的Cys和DET的修饰数量分别小于或等于1。
作为低取代度化Amino-PRX(5G)，使用了Cys(0.6)-DET(0.7)-PRX。“Cys(0.6)-DET(0.7)-PRX”表示，相对于PRX中的CyD1分子，平均键合有0.6个Cys，且平均键合有0.7个DET。
将HeLa/GFP细胞接种(3.75×104细胞/孔)到24孔板，在37℃下培养24小时。向用无血清培养基洗涤两次后的细胞中添加500μL的含有以下各种样本的无血清培养基。
(样本)
HBSS(Control)
单独的Cas9/sgGFP RNP(29.2nM)
CRISPRMAX/Cas9 RNP(sgCont)(29.2nM)
CRISPRMAX/Cas9 RNP(sgGFP)(29.2nM)
低取代度化Amino-PRX(5G)/Cas9 RNP(sgCont)(29.2nM)
低取代度化Amino-PRX(5G)/Cas9 RNP(sgGFP)(29.2nM)
在样本存在下，在37℃下培养4小时后，用无血清培养基洗涤两次。添加500μL的含有10％FBS的DMEM后，在37℃下培养44小时。每天更换培养基共培养120小时后，用流式细胞术评价了GFP敲除率。
结果如图30所示。低取代度化Amino-PRX(5G)/Cas9 RNP(sgGFP)与CRISPRMAX/Cas9 RNP(sgGFP)相比展现了优异的基因组编辑效果。另一方面，对于相同的Cas9 RNP浓度(29.2nm)，高取代度的Amino-PRX(5G)/Cas9 RNP展现了与CRISPRMAX/Cas9 RNP等同的基因组编辑效果(图17)。此外，图17中的高取代度的Amino-PRX(5G)为Cys(1.2)-DET(1.3)-PRX。这表明，低取代度化Amino-PRX(5G)与高取代度的Amino-PRX(5G)相比，其Cas9 RNP释放能力提升，并且基因组编辑效果提升。此外表明，PRX中的1个CyD1分子中的Cys的修饰数量和DET的修饰数量分别优选为小于或等于1，更优选为小于或等于0.7。
此外，若取代度过低，则载体在水中的溶解性下降，从而导致载体与药物的相互作用减弱，因此，取代度优选为大于或等于0.5，更优选为大于或等于1。例如，当为Amino-PRX(5G)时，PRX中的1个CyD1分子中的Cys的修饰数量和DET的修饰数量的总数优选为大于或等于0.5，更优选为大于或等于1。
序列表
<110> 国立大学法人熊本大学
<120> 功能性核酸以及蛋白质引入用载体
<130> PG03213A
<150> JP 2021-010606
<151> 2021-01-26
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向GFP的sgRNA (sgGFP)
<400> 1
gggcgaggag cuguucaccg 20
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 非靶向sgRNA (sgCont)
<400> 2
aaaugugaga ucagaguaau 20
<210> 3
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> crRNA (非靶向)
<400> 3
aaaugugaga ucagaguaau 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GFP正向引物
<400> 4
atggtgagca agggcgag 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GFP反向引物
<400> 5
ccggtggtgc agatgaactt 20
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸 (靶向GFP的siRNA的有义链
(siGFP))
<400> 6
gcaagcugac ccugaaguuc autt 24
<210> 7
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GFP 靶向 siRNA 的反义链 (siGFP)
<400> 7
augaacuuca gggucagcuu gccg 24
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向GFP的ASO
<400> 8
ttgccggtgg tgcagataaa 20
Claims (24)
1.一种聚轮烷，其具有多个大环分子、贯穿所述大环分子的环的轴向分子、以及键合在所述轴向分子的末端的端帽，所述聚轮烷的特征在于，
通过使修饰部分与至少一部分所述大环分子键合而形成所述聚轮烷，其中，所述修饰部分在中性pH值下具有1价质子，并在酸性pH值下具有2价质子，且含有胺。
2.根据权利要求1所述的聚轮烷，其特征在于，
所述修饰部分具有仲胺以及氨基。
3.根据权利要求2所述的聚轮烷，其特征在于，
所述修饰部分为二乙烯三胺。
4.一种聚轮烷，其具有多个大环分子、贯穿所述大环分子的环的轴向分子、以及键合在所述轴向分子的末端的端帽，所述聚轮烷的特征在于，
氨基经由在细胞内能够降解的键与至少一部分所述大环分子键合。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的聚轮烷，其特征在于，
不同于所述修饰部的氨基经由在细胞内能够降解的键与至少一部分所述大环分子键合。
6.根据权利要求4或5所述的聚轮烷，其特征在于，
所述在细胞内能够降解的键是选自氨基甲酸酯、缩酮、酰胺、酯以及二硫化物中的键。
7.根据权利要求6所述的聚轮烷，其特征在于，
所述在细胞内能够降解的键是二硫化物键。
8.根据权利要求7所述的聚轮烷，其特征在于，
胱胺与至少一部分所述大环分子键合。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的聚轮烷，其特征在于，
所述端帽经由在细胞内能够降解的键与所述轴向分子键合。
10.根据权利要求9所述的聚轮烷，其特征在于，
所述在细胞内能够降解的键是选自氨基甲酸酯、缩酮、酰胺、酯以及二硫化物的键。
11.根据权利要求10所述的聚轮烷，其特征在于，
所述在细胞内能够降解的键是氨基甲酸酯键。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的聚轮烷，其特征在于，
所述大环分子是α-环糊精。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的聚轮烷，其特征在于，
所述轴向分子是PEG。
14.一种聚轮烷组合物，其特征在于，
含有权利要求1所述的聚轮烷和权利要求4所述的聚轮烷。
15.一种聚离子复合物，其特征在于，
是生物学材料和聚轮烷的聚离子复合物，所述聚轮烷是权利要求1～13中任一项所述的聚轮烷。
16.根据权利要求15所述的聚离子复合物，其特征在于，
所述生物学材料是核酸分子，或者是Cas9蛋白质与向导RNA的复合体(Cas9RNP)。
17.根据权利要求15或16所述的聚离子复合物，其特征在于，
所述聚离子复合物的印迹率为20％～100％。
18.一种方法，是制造权利要求15～17中任一项所述的聚离子复合物的方法，其特征在于，包括：
混合所述生物学材料和权利要求1～13中任一项所述的聚轮烷，并形成聚离子复合物。
19.一种方法，是将生物学材料引入到细胞的方法，其特征在于，包括：
使权利要求15～17中任一项所述的聚离子复合物和细胞相接触，从而使所述聚离子复合物被吸纳到所述细胞内。
20.一种方法，是将生物学材料引入到细胞的方法，其特征在于，包括：
利用权利要求18所述的方法制造聚离子复合物；以及
使所制造的聚离子复合物和细胞相接触，从而使所述聚离子复合物被吸纳到所述细胞内。
21.一种方法，是用于基因组编辑的方法，其特征在于，包括：
使聚离子复合物和细胞相接触，从而使所述聚离子复合物被吸纳到所述细胞内，其中，所述聚离子复合物是复合体和聚轮烷的聚离子复合物，所述复合体是Cas9蛋白质和向导RNA的复合体(Cas9 RNP)，所述聚轮烷是权利要求1～13中任一项所述的聚轮烷。
22.一种方法，是用于基因组编辑的方法，其特征在于，包括：
使复合体和聚轮烷混合并形成聚离子复合物，其中所述复合体是Cas9蛋白质和向导RNA的复合体(Cas9 RNP)，所述聚轮烷是权利要求1～13中任一项所述的聚轮烷；以及
使所述聚离子复合物和细胞相接触，从而使所述聚离子复合物被吸纳到所述细胞内。
23.一种生物学材料的细胞引入剂，其特征在于，
含有权利要求1～13中任一项所述的聚轮烷。
24.一种医药组合物，其特征在于，
含有权利要求1～13中任一项所述的聚轮烷，或含有权利要求15～17中任一项所述的聚离子复合物。
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