CN1564694A

CN1564694A - 提高免疫应答的方法

Info

Publication number: CN1564694A
Application number: CNA028195884A
Authority: CN
Inventors: 索尼娅·莫雷诺·洛佩斯; 马科斯·蒂蒙·希门尼斯
Original assignee: Mologen AG
Current assignee: Mologen AG
Priority date: 2001-10-02
Filing date: 2002-10-02
Publication date: 2005-01-12
Anticipated expiration: 2022-10-02
Also published as: DK1432439T3; AU2002349277A1; DE50205223D1; WO2003031469A3; CN1310676C; HK1073064A1; WO2003031469A2; ATE311899T1; ES2254758T3; EP1432439A2; EP1432439B1; CY1105447T1; US20040235771A1

Abstract

本发明涉及一种由注射抗原编码表达构建体来引起细胞毒性免疫应答的方法。根据本发明，使用微小化表达构建体，其仅由启动子、编码序列和终止子组成并且在它们的两端包含发夹形脱氧核糖核苷酸，阳离子肽被共价连接到该环。皮内注射这些偶联了肽的表达构建体后引起明显的细胞介导的反应类型。描述了在真核细胞中可操纵的DNA表达构建体在制备皮内注射引起1型细胞介导免疫应答的疫苗中的用途。

Description

提高免疫应答的方法

技术领域

本发明涉及一种在真核细胞中可操纵的DNA表达构建体在制备疫苗中的应用，皮内注射该疫苗来诱导1型细胞介导免疫应答，还涉及对应的将介导转移的分子连接到基因表达构建体来提高免疫应答的方法。

本发明涉及遗传免疫领域。

遗传免疫依据的原理是接种基因表达构建体以代替接种灭活病原体或者其特异性抗原的传统方法。这些表达构建体编码病毒、细菌或者寄生虫等病原体的免疫原性蛋白，或者在发生恶性疾病时特异性地表达或者呈递的抗原。因此，仅仅是给被接种者提供生产外源蛋白的遗传信息，结果病人的体细胞内生成了外源蛋白，随后形成有效的抵抗外源抗原的免疫应答。

背景技术

以往，预防感染性疾病以及免疫方法的原理都是基于机体免疫系统对已经被有效抵抗的病原体的识别。

两种主要途径差别显著：体液途径依赖于B淋巴细胞生成抗体以及非获得性免疫如补体系统的体液成分，而细胞免疫系统依赖于T-淋巴细胞、NK细胞和抗原呈递细胞的活性。T-淋巴细胞能够识别感染了病毒的细胞。现今已知道称为1型辅助细胞诱导免疫系统的细胞途径，而2型辅助细胞激活后诱导体液途径(Mosmann等，免疫学杂志(J.Immuno.)，1986，136(10)：3561-6)。相应地，细胞途径也称为Th1途径以及体液途径也称为Th2途径。存在于细胞外的细菌通常通过Th2途径被杀死。Th2途径对于体内中和细菌毒素和抵抗细胞外的不同种类寄生虫的反应也是重要的。

此外，主要寄居在细胞内的病原体，如已知的一些细菌种属和所有病毒，主要是通过Th1途径即细胞毒性细胞来对抗。

已知多种方法用于将编码免疫原性抗原或其部分的DNA，通过化学、物理或者生物转染方法，转移(“转染”)到抗原呈递细胞或者其他体细胞的细胞核中。

转染方法，也称为“基因穿梭”，指病毒载体、质粒或者共价闭合微小化DNA构建体(参见EP0914318 B1；下文称为MIDGE(微小化的免疫学限定的基因表达载体(minimalistic immunologically defined geneexpression vectors)))。与之密切相关的野生型病毒和载体通常具有高的转染效率和组织特异性，但是出于对安全性考虑以及抗载体免疫的问题，它们被认为是有争议的。使用裸DNA不存在抗载体免疫的问题。当在体内以及体外应用来自质粒的转染系统时，出现了在细胞类型和组织中涉及转染效率和特异性的问题。因此，人们已经进行优化基于DNA的转染方法的尝试。通过不同连接方法把各种多肽和其他有机分子连接到基因穿梭上。还利用配体受体相互作用通过连接配体来提高基因穿梭的摄入(Fraser等，1998，免疫学论文(Semin.Immunl.)，10(5)：363-72)。

通过将猴病毒SV40的核定位信号共价连接到编码乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的表达盒上，肌肉应用后，抗体滴毒提高10-15倍(Schirmbeck等，分子医学杂志(J.Mol.Med.)，2001年6月，79(5-6)：343-50)。出现不同的抗体反应的亚型分布，在皮内应用粒子介导基因转移(“基因枪”)后，强烈偏向Th2特异的IgG1亚型，而在肌肉应用后偏向Th1特异的IgG2a亚型。未出现与使用不同载体(质粒、微小化载体)相关的差别。

类似地，HIV-1基因产物TAT的11氨基酸T肽片段(YGRKKRRQRRR)用于将200nm脂质体转移到细胞中。但是为使试验成功，必须每个脂质体使用数量约500的T肽(Torchilin等，PNAS2001，98(15)：8786-8791)。Frankel证明了这种肽具有能够将肽蛋白转运到细胞内的膜穿透功能(Frankel等，1988，细胞(Cell)55：1179-1188，Green等，1988，细胞(Cell)55：1179-1188，US5670617)。

应用抵抗各种疾病的免疫治疗来诱导Th1型免疫应答的预防接种似乎是有利的。特别是对于细胞内寄生虫如利什曼原虫和疟疾以及病毒性疾病如HIV。从这点上看，任何在注射DNA后提高Th1倾向的方法对于形成有效免疫应答是有利的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种方法，按接种的DNA表达构建体的每个含量计算，与本领域现有技术中的方法相比，该方法激发更强烈和更具有细胞倾向性的(Th1)免疫应答。

本目的通过独立权利要求来实现。

已经发现，通过将含有蛋白转导结构域或者核定位结构域的肽共价连接到编码用于免疫接种的抗原的共价闭合DNA构建体(MIDGE)的发夹环上，随后将该构建体免疫接种动物，产生的免疫应答的数量和质量都显著偏向细胞免疫应答。总之，本发明提供一种药物组合物，其用于通过皮内注射溶液形式的表达抗原的、缀合了肽的DNA表达构建体，以激发1型细胞介导免疫应答。在其他方面，本发明也明显地区别于本领域现有技术，这种1型反应的诱导完全不是本领域科学界能够预见的。作为这种偏见的例子可以参见白细胞生物学杂志上一篇由DNA免疫接种领域的奠基人之一David Weiner发表的文章(Shedlock und Weiner，白细胞生物学杂志(J.Leukocyte Bio.)，68卷，2000年12月，793-806)：作者明确阐述关于不同应用形式的预期(如上，第795页左栏下方)：“针对皮肤的输送方式，包括皮内注射......已经被证明首先引起体液反应，表现为迅速递进成Th2型反应，伴随生成IgA和IgG1亚型抗体。”Th1反应是无法预期的，这使得本发明对于本领域相关技术人员来说是意外和不可预见的。

本申请人和德国乌尔姆大学研究小组合作(Schirmbeck等，被引用)未能解释当与未修饰载体比较以及通过粒子轰击皮肤应用时抗体水平变化的原因。因此，不得不推断本发明得到的有益效果仅限于皮肤注射的应用。

但是这将是巨大的技术进步。原因之一，将DNA表达构建体应用于皮肤是有益的，这是由于皮肤存在较多造成这些构建体次级效应的细胞，因此，只需要接种较少DNA。另一个原因是肌肉注射比较痛苦，对于家畜伴随形成接种疤痕，妨碍接种部位作为食用肉的商业应用，导致免疫接种动物的价值降低。

TAT肽的转导序列元件能够转移数量级别比其天然底物更大的核酸构建体，这种结果令人惊奇和难以预期。由于迄今试验仅仅给出转移小得多的分子的效果，这种结果不能预期。Dowdy等证明把这种肽序列融合到蛋白分子中使得将大小为120kDa的蛋白转移到细胞中成为可能(Dowdy等，2000，医药科学趋势(Trends Pharmacol.Sci.)，21(2)：45-8)。因此，申请人旨在证实TAT衍生的T肽是否也能够转导数量级别更大的DNA表达构建体。仅由于分子大小(1800bp表达构建体的大小为1.2MDa)和完全不同的分子形状，这种假设并不是微不足道和绝对的。虽然蛋白质和多肽通常是球形的，但是缺乏拓扑张力的DNA分子首先估计认为是线性分子。考虑到与蛋白的区别，还需要考虑到磷酸残基引起的表面电荷，其使得DNA成为一个负电荷强烈的分子。

而且，肽序列区别于含有核定位信号(NLS)的猴病毒SV40。一些生物体中存在这种用于将蛋白质传送到细胞核所必需的信号序列。大于60kDa的分子只能通过这种核定位信号传送到细胞核中。特别地，已经证明SV-40 NLS可以把分子量为465kDa的蛋白转移细胞核内(Lanford等，1986，细胞15；46(4)：575-82)。本发明利用肽的这种功能来提高基因转移。所用的肽序列为PKKKRKV。

用于制备这种在细胞或者细胞复合体中转录RNA分子的核酸构建体的方法，基于EP0941318 B1，其中核酸构建体

●通过由一条具有与相应的另一条链部分互补并且反向平行的碱基序列的脱氧核糖核酸环链构成，得到一个形似哑铃的结构，

●其中与相应的另一条链部分互补并且反向平行的碱基序列，主要由启动子序列、编码序列以及或者聚腺苷酸信号或者其他RNA稳定序列元件组成，

●未互补的碱基序列形成含有单链脱氧核酸的两个环(“发夹环”)，与相应的另一条链部分互补并反向平行的碱基序列的5’和3’端相连，

其中

●发夹环至少由下面的寡核苷酸(ODN1或ODN2)之一形成

ODN 1：5’-PH-GGG AGT CCA GT XT TTC TGG AC

ODN 2：5’-PH-AGG GGT CCA GTT TTC TGG AC，

其中X表示一个氨基残基修饰激活的核苷残基(胸腺嘧啶)，

●和一种通过交联分子共价连接到这个发夹环的有机分子。

这种方法能够将分子共价连接到核酸构建体上。从本领域现有技术知晓的解决问题的方案中，配体的连接不是通过将配体直接连接到质粒上来实现，而是借助桥连分子，而且尚未在分子水平上确定连接位点。因而存在启动子或者治疗基因的功能会受到这些修饰损害的危险。从分子水平上确定的连接，也使得按照现代药物生产的标准和规则来描述这些构建体成为可能，这是这些载体作为药物应用的先决条件。申请人在室内实验中已经发现，当肽以非共价方式加入时，不出现所观察到的诱导Th-1反应的效果。由于上述原因，共价连接显然是有利的；原因应当是由于牢固的共价连接提高了转染以及转录的效果。根据申请人进行的实验，通过连接许多其他碱性(阳离子)肽也能够获得观察到的效果，因此，本发明的保护范围不只限于本申请所描述的两种肽的应用。

用编码HBsAg的MIDGE载体进行的小鼠体内实验和用p36 LACK抵抗硕大利什曼原虫的免疫实验，已经确证了这些理论性考虑。在本发明中，不同的肽被共价连接到载体上。通过比较不同免疫接种方式(vaccination regiem)，确定一种有效而且安全的免疫接种保护。测定的参数是Th2/Th1强度的变化和通过免疫接种获得的保护，这些参数通过用硕大利什曼原虫的前鞭毛体攻击后测定病灶的大小来确定。在该范围内这是很重要的，因为利什曼原虫小鼠攻击系统是Th1-Th2二分理论模型，并且除了为各种抗原而测定的替代物参数外，例如抗体亚型数量，以及生物效应-免受感染-可以在完整的生物体中测定。在本申请中可以看到从使用“裸”的、非肽修饰的DNA到连接到阳离子肽的表达构建体的巨大创造性。前者没有产生显著的对攻击感染的保护，而肽修饰表达构建体的两种应用，没有进一步使用白细胞介素或者其他的免疫调节剂，产生完全保护。在本发明中，这表明本发明的免疫接种方式引起免疫接种方式朝向干扰素-γ介导的1型免疫应答强烈偏向(Th1免疫应答具有干扰素-γ细胞因子分布和免疫球蛋白Th1亚型偏向)，这无法通过替代物参数来检测。本发明的疫苗在溶液中应用。

在通过来自未致敏T辅助细胞的抗原呈递细胞(APC)呈递抗原过程中，形成T辅助细胞朝向或者Th1(细胞毒性的)或者Th2(体液的)免疫应答的偏向。其中，这种偏向的一个决定因素是APC和辅助细胞在其中发生相互作用的细胞因子环境，以及参与相互作用的受体的特性(Pulendran等，科学，193，253-256，2001)。

由于亚型IgG1和IgG2a反映整个免疫应答的偏向，测定抵抗两种抗原(HBsAg和p36/LACK)的干扰素γ(IgG)的亚型分布。从这点上看，IgG1亚型是体液反应的特征，伴随被激活的淋巴细胞分泌的白细胞介素I1-4和IL-10的增加；而亚型IgG2a水平上升是典型的细胞的Th1反应，伴随着IFNg和IL-12分泌量增加。此时不排除存在各种亚型，但是可以相对滴度作为形成的主导类型的免疫应答的指标。

皮内应用HbsAg表达质粒溶液仅仅产生Th2型免疫应答(见附图1)。没有出现朝向Th1抗体亚型的改变参见附图3)。然而，许多医学上非常重要的疾病，要求形成细胞毒性反应，这些疾病为肝炎(hepatide)、白细胞病毒感染如HIV和细胞内寄生虫感染。从这点上看，作为本发明的目的，形成Th1主导的免疫应答不仅仅是数量上提高，因为较少的DNA产生了较高的滴度。相反，与本领域现有技术相比，本发明是质量改进，不能从文献中公开的数据预期。

现今还不知晓这种质量变化背后的机制。将配体连接到微小化表达载体上引起报道基因体外表达增加的事实(数据未显示)并不必要地预示免疫接种改善，其Th亚型减少。如果能够根据当前科学知识作任何预测，那么导致Th2反应的DNA使用量的下降应当是由于减少使用免疫刺激细菌DNA基序(motif)。而对于在本申请中探究的连接到NLS和T肽的载体，情况正好相反。

抗硕大利什曼原虫抗原p36LACK的免疫接种试验的结果表明从保护效果上看，本发明所述方法优于本领域现有技术中目前熟知的用重组牛痘病毒(rVV)进行二次免疫(加强)的免疫接种方式。此外，本发明的方法避免了由质粒和减毒病毒引起的潜在副作用，同时在保护效果上还具有可比性(Gonzalo等，微生物与感染(Microbes and Infection)：3(9)：701-711)。而且就达到相似或者更好的保护效果来看，制备本发明所述方法更简单和经济，最重要的是，本发明的方法更加安全。

用HBsAg进行的体内试验的结果非常令人惊奇，其DNA的使用量比现有文献中描述的用于免疫的不用颗粒组合物的未加佐剂的DNA用量少得多。用HBsAg进行免疫时，通常30-100μg质粒被注射到肌肉或者真皮中(Schirmbeck等，1998，疫苗，16卷，第9/10期：949-954)。

本发明的优点总结如下：

●微小化核酸构建体被修饰，来提高免疫应答。

●这些被修饰的微小化核酸构建体引起更强烈地受免疫系统中的细胞途径介导的免疫应答。

采用本发明的DNA表达构建体和含有这种构建体的疫苗的令人惊奇的效果显示在附图包含的描述中。缩写表示：

pMOK p36 编码p36抗原的质粒

Mp36-NLS 编码p36抗原的MIDGE连接到NLS肽

PMOK ctr 编码HBsAg的对照质粒

rVVp36 编码p36的重组牛痘病毒

phosphate 作为对照的磷酸缓冲液

control+ 阳性对照，感染硕大利什曼原虫的小鼠的血清

control- 阴性对照，未处理小鼠的血清

从属权利要求中描述更有效的方法；下面通过实施例和附图更加详细描述本发明。

附图说明

附图1ELISA测定小鼠中抗乙肝表面抗原(HBsAg)的总IgG；

附图2ELISA测定在用1μg DNA加强后抗乙肝表面抗原的总IgG；

附图3和4抗乙肝表面抗原的IgG的亚型IgG1和IgG2a的测定；

附图5抗硕大利什曼原虫的p36LACK抗原的免疫接种试验的结果。

附图6测定在用硕大利什曼原虫攻击感染后抗p36 LACK的总IgG抗体滴度。所有免疫接种方案都有一个可检测的抗体反应，其中循环抗体滴度最高的由MIDGE p36-NLS/MIDGE p36-NLS引起。

实施例

实施例1激活用于连接硫醇功能化分子的寡脱氧核糖核苷酸

通常可以通过许多化学反应来实现多肽、糖或者其他天然化合物等分子的连接。这些标准反应形成酰胺键、酯键或者亚胺键，这些化学键都可以从有机合成化学构成中知晓。

在发明中申请人进行被连接的分子中含有的硫醇残基与核酸分子上的马来酰亚胺的反应来说明发明。通过氨基残基(表示为X)反应，将马来酰亚胺残基导入核酸组成中，是在ODN合成中使用商业上可以购得的双功能偶联试剂通过NHS羧酸的转酰胺基反应导入的。制备只有一个位点被修饰的MIDGE构建体，使用发夹环中含有一个脱氧尿嘧啶(XT)残基被氨基残基修饰的ODN1和未被修饰的ODN2：

5’-PH-GGG AGT CCA GT XT TTC TGG AC(柏林TIB-Molbiol，简称：ODN1＝Seq ID 5)，其中PH表示5’-OH磷酸化，

和

5’-PH-AGG GGT CCA GTT TTC TGG AC(柏林TIB-Molbiol，简称：ODN 2＝Seq ID 6)。

氨基修饰的ODN1按下述方式用于连接：用于共价连接的交联分子(本申请：溶于DMF中的硫代-KMUS(N-(马来酰亚胺基十一酰氧基)磺基琥珀酰亚胺(sulfo-KMUS(N-Maleimidoundecanoyloxy)sulfosuccinimide))，PIERCE产品-Nr.21111)按4倍于氨基-ODN的含量加入(最终浓度为0.1mM)，每次间隔30分钟，直到最终浓度达到5mM。在交联反应缓冲液中(50mM NaHPO₄，75mM NaCl，pH7.6)，37℃下反应两个小时以上。随后，加入Tris-HCl(pH7.5；最终浓度50mM)来中止反应。激活的氨基ODN在-70℃乙醇(300mM NaOAc pH5.3；20mM MgCl2；2.5倍反应体积的100％乙醇)中沉淀30分钟。沉淀物以15000rpm(4℃)离心30分钟，并在相同的条件下用70％乙醇洗涤15分钟。最后，激活的氨基ODN溶解在水中(MilliQ级)，在-20℃保存待用。

实施例2将T肽连接到寡脱氧核糖核苷酸(ODN)上

把在实施例1中描述的激活的氨基ODN溶解在偶联反应缓冲液中(1x＝50mM NaHPO₄，75mM NaCl，pH7.0)，最终浓度为0.1mM。随后，加入序列为YGRKKRRQRRR的T肽(＝Seq ID 3；由柏林Charité的PeterHenklein博士制备和提供)的水溶液，最终浓度为0.2mM。在37℃下持续反应1小时。

通过反相HPLC从未反应的ODN中纯化和分离生成的肽连接ODN。通过凝胶电泳分析每个反应批次。用真空离心机浓缩含有T-ODN的片段并溶解在超纯水中。用Nukleosil-300 C18柱(10μm，250mm长×8mm内径)通过HPLC纯化修饰的ODN。梯度持续从0％缓冲液A(100mM碳酸铵)到42％缓冲液B(80％乙腈)，流速为2.4ml/min 47分钟以上。

实施例3将SV-40 NLS连接到激活的ODN上

将在实施例1中描述的激活的氨基ODN溶解在偶联反应缓冲液中(1x＝50mM NaHPO₄，75mM NaCl，pH7.0)，最终浓度为0.1mM。随后，加入序列为PKKKRKV的SV-40 NLS肽(＝Seq ID 4；Henklein博士制备和提供)的水溶液，最终浓度为0.2mM。在37℃下持续反应1小时。

通过反相HPLC从未反应的ODN中纯化和分离生成的肽连接ODN。通过凝胶电泳分析每个反应批次。用真空离心机浓缩含有NLS-ODN的片段并溶解在超纯水中。

实施例4制备MIDGE-HbsAgT-肽

MIDGE是由仅表达盒组成的双链DNA构成的微小化表达载体，表达盒为CMV启动子、内含子、各个基因序列和聚腺苷酸序列。按如下方式制备所述构建体：质粒pMOK HbsAg用Eco311彻底消化。存在Eco311时，用T4 DNA连接酶进行按照实施例1偶联了T肽的5’磷酸化发夹形的ODN1以及ODN2的连接，加热到70℃来终止反应。浓缩得到的混合物，在没有脱氧核糖核苷酸三磷酸情况下用Eco311和T7DNA聚合酶进行处理。通过阴离子色谱来纯化。通过限制性内切酶消化来验证各种配体已被成功偶联。通过凝胶电泳比较从MIDGE上消化(用BamHI和Eco311)得到的ODN与各个对照ODN的大小，结果表明载体连接到多肽。(HbsAg的序列显示于Seq ID1)。

类似地进行MIDGE HbsAg NLS-肽的制备。

实施例5质粒pMOKp36的重组构建体

从起始质粒pSCp36 PCR扩增得到2个片段：

1.PCR约800bp

引物：左5’-TTATATGGTACCATGAACATACGAGGGTCACCT(＝Seq ID7)，

引物：右5’-TTATATGAGCTCAGAAGACACGGACAGGGACCTCTTCCGTCG(＝Seq ID 8)

2.PCR约950bp

引物：左5’-TTATATGGTACCATGAACATACGAGGGTCACCT(＝Seq ID9)，

引物：右5’-TTATATGAGCTCTTACTCGGCCGTCGGAGATGG(＝Seq ID10)

用Eco311消化第二次PCR反应的PCR产物，分离较小片段(约200bp)。

用Bpil消化第一次PCR反应的PCR产物。

连接200bp的片段和第一次PCR反应的被消化片段，然后用Kpnl和Sacl消化，通过连接将其插入到已经用Kpnl和Sacl消化了的pMOK载体上。得到的质粒命名为pMOK p36。pMOK p36用于制备MIDGEp36-NLS(p36 LACK的序列显示在Seq ID 2)。

激活ODN、将NLS序列连接到寡核苷酸上以及制备MIDGE p36-NLS按照上述方法进行。

结果

下列附图中详细描述获得的结果：

附图1表示总IgG HBsAg水平的测定。通过ELISA测定抗体水平，波长入＝450nm时的吸收值读作OD(光密度)。以质粒和未修饰的MIDGE载体作为对照。具有不同连接的MIDGE表现为抗体滴度明显升高，表明HBsAg表达量增加。采用缩写：

pMOK：质粒

MIDGE：未修饰MIDGE

M-NLS：连接到NLS的MIDGE

M-TAT：连接到T肽的MIDGE

附图2表示在11周后用1μgDNA二次免疫的增强效果。在首次和第二次免疫中免疫所用DNA的含量为1μg。在本试验中，修饰的MIDGE仍然显著提高免疫应答。

附图3和4表示抗HbsAg的IgG亚型IgG1和IgG2a的测定。令人惊奇地发现，连接到T肽和连接到NLS序列的MIDGE引起细胞毒性免疫应答(Th1)，这在抗体亚型分布中显示。

附图5表示在二次免疫和用硕大利什曼原虫前鞭毛体攻击感染后，抗体亚型分布IgG1和IgG2a的比例。免疫方式MIDGE p36-NLS/MIDGEp36-NLS具有引起细胞(Th1)免疫应答的不可预期的效果。通过比较，pMOK p36/rVVp36方式引起的免疫应答中Th2/Th1的波动是细微的。

实验例1：小鼠中HBsAg抗体的测定

按照实施例4制备编码乙肝表面抗原(亚型ay)MIDGE。通过ELISA测定乙肝抗原的抗体滴度来证实表达了所编码抗原。根据实施例4制备MIDGE。特别地，制备未修饰的MIDGE和具有一个配体的MIDGE，特别是MIDGE-NLS和MIDGE-T。质粒pMOK HBsAg作为附加对照。未处理小鼠的血清用作阴性对照。

将MIDGE(未修饰的以及NLS修饰的)和质粒溶解在50μl pH7.2的磷酸钠中，注射到Balb/c小鼠的皮内。所用DNA的量为10μg，每只小鼠分别每次接种1μg。每组5只小鼠。11周后，进行二次免疫(加强)。在第2、4和8周，测定血清中抗体。结果在图1中表示。当使用10μg DNA时，在第4周可以观察到总免疫球蛋白G(IgG)明显增加，表明与质粒相比，所有MIDGE构建体所表达的HBsAg都升高。最好的效果是由被修饰的MIDGE引起。误差杆显示标准偏差。首次使用1μg DNA不会引起HBsAg滴度在第4周显著上升(结果未显示)，但是，在第11周加强后出现滴度令人意外地急剧升高。而且，修饰的MIDGE具有最好效果(见附图2)。这些结果表明即使是使用最小量的DNA，MIDGE也能产生高抗体滴度。

实验例2：抗利什曼原虫p36抗体的接种试验

使用36kDa抗原，也称为LACK，免疫接种产生抗硕大利什曼原虫属的有效保护。在免疫接种试验中，使用所有编码免疫原性p36抗原的不同基因穿梭：具有NLS连接的MIDGE、质粒pMOK p36和重组牛痘病毒p36(rVV)。按照下表将表达构建体注射到雌性小鼠(Balb/c)，与最有效的首次/加强免疫接种进行比较。

组别	首次免疫	二次免疫(强化)
组别	首次免疫	二次免疫(强化)	1	pMOKp36	pMOKp36
2	MIDGE p36-NLS	MIDGE p36-NLS	1	pMOKp36	pMOKp36
2	MIDGE p36-NLS	MIDGE p36-NLS	3	pMOK对照	pMOK对照
4	pMOK p36	rVVp36	3	pMOK对照	pMOK对照
4	pMOK p36	rVVp36	5	MIDGE p36-NLS	rVVp36
7	磷酸缓冲液	磷酸缓冲液	5	MIDGE p36-NLS	rVVp36

每组10只小鼠。

DNA量为：

pMOK p36：100μg，皮内注射

MIDGE p36-NLS：54.8μg，皮内注射

rVVp36：5×10⁷pfu/小鼠，腹腔注射

并溶解在pH7.2磷酸钠缓冲液中。

2周后，用各种DNA构建体(见表)进行二次免疫(加强)。在加强后3周，用5×10⁴硕大利什曼原虫前鞭毛体攻击感染。小鼠右后足皮下注射。

攻击感染后8周，对所有小鼠放血取血清(见附图6)。通过ELISA测定抗p36的总IgG抗体滴度以及测定IgG1和IgG2a，波长入＝406nm时的吸收值读作光密度。

序列表

<110>莫洛根有限公司

<120>提高免疫应答的方法

<130>XI 1420/02

<150>DE 101 48 697.9

<151>2001-10-02

<150>DE 101 56 678.6

<151>2001-11-12

<160>10

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>4533

<212>DNA

<213>pMOK HBsAg

<220>

<221>其他特征

<222>(1839)..(1045)

<223>卡那霉素抗性，反向互补

<220>

<221>polyA_位点

<222>(4080)..(4281)

<223>

<220>

<221>其他特征

<222>(2447)..(3243)

<223>CMV

<220>

<221>内含子

<222>(3250)..(3386)

<223>

<220>

<221>其他特征

<222>(3393)..(4073)

<223>插入HBsAg subtyp ay

<400>1

tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 60

tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 120

aacatgtctc gggaggcctc acgtgacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 180

cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 240

aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 300

tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 360

ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat 420

ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 480

cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 540

ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 600

gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt 660

atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 720

aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 780

aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 840

gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc 900

cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct 960

gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca 1020

tccatagttg cctgactccc cgtctcagaa gaactcgtca agaaggcgat agaaggcgat 1080

gcgctgcgaa tcgggagcgg cgataccgta aagcacgagg aagcggtcag cccattcgcc 1140

gccaagctct tcagcaatat cacgggtagc caacgctatg tcctgacagc ggtccgccac 1200

acccagccgg ccacagtcga tgaatccaga aaagcggcca ttttccacca tgatattcgg 1260

caagcaggca tcgccatggg tcacgacgag atcctcgccg tcgggcatgc tcgccttgag 1320

cctggcgaac agttcggctg gcgcgagccc ctgatgctct tcgtccagat catcctgatc 1380

gacaagaccg gcttccatcc gagtacgtgc tcgctcgatg cgatgtttcg cttggtggtc 1440

gaatgggcag gtagccggat caagcgtatg cagccgccgc attgcatcag ccatgatgga 1500

tactttctcg gcaggagcaa ggtgagatga caggagatcc tgccccggca cttcgcccaa 1560

tagcagccag tcccttcccg cttcagtgac aacgtcgagc acagctgcgc aaggaacgcc 1620

cgtcgtggcc agccacgata gccgcgctgc ctcgtcttgc agttcattca gggcaccgga 1680

caggtcggtc ttgacaaaaa gaaccgggcg cccctgcgct gacagccgga acacggcggc 1740

atcagagcag ccgattgtct gttgtgccca gtcatagccg aatagcctct ccacccaagc 1800

ggccggagaa cctgcgtgca atccatcttg ttcaatcata atattattga agcatttatc 1860

agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag 1920

gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca 1980

tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtctcgcg cgtttcggtg 2040

atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag 2100

cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg 2160

gctggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg 2220

aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgccattcg ccattcaggc 2280

tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga 2340

aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac 2400

gttgtaaaac gacggccagt gccaagcttg gtctcctccc ggatcctcaa tattggccat 2460

tagccatatt attcattggt tatatagcat aaatcaatat tggctattgg ccattgcata 2520

cgttgtatct atatcataat atgtacattt atattggctc atgtccaata tgaccgccat 2580

gttggcattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 2640

gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 2700

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 2760

ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 2820

atcaagtgta tcatatgcca agtccgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 2880

cctggcatta tgcccagtac atgaccttac gggactttcc tacttggcag tacatctacg 2940

tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacaccaat gggcgtggat 3000

agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 3060

tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa taaccccgcc ccgttgacgc 3120

aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagaggtcgt ttagtgaacc 3180

gtcagatcac tagaagcttt attgcggtag tttatcacag ttaaattgct aacgcagtca 3240

gtgctcgagc aggtaagtat caaggttaca agacaggttt aaggaggcca atagaaactg 3300

ggcttgtcga gacagagaag actcttgcgt ttctgatagg cacctattgg tcttactgac 3360

atccactttg cctttctctc cacaggggta ccatggagaa catcacatca ggattcctag 3420

gaccccttct cgtgttacag gcggggtttt tcttgttgac aagaatcctc acaataccgc 3480

agagtctaga ctcgtggtgg acttctctca attttctagg gggaactacc gtgtgtcttg 3540

gccaaaattc gcagtcccca acctccaatc actcaccaac ctcttgtcct ccaacttgtc 3600

ctggttatcg ctggatgtgt ctgcggcgtt ttatcatctt cctcttcatc ctgctgctat 3660

gcctcatctt cttgttggtt cttctggact atcaaggtat gttgcccgtt tgtcctctaa 3720

ttccaggatc ctcaacaacc agcacgggac catgccggac ctgcatgact actgctcaag 3780

gaacctctat gtatccctcc tgttgctgta ccaaaccttc ggacggaaat tgcacctgta 3840

ttcccatccc atcatcctgg gctttcggaa aattcctatg ggagtgggcc tcagcccgtt 3900

tctcctggct cagtttacta gtgccatttg ttcagtggtt cgtagggctt tcccccactg 3960

tttggctttc agttatatgg atgatgtggt attgggggcc aagtctgtac agcatcttga 4020

gtcccttttt accgctgtta ccaattttct tttgtctctg ggtatacatt taagagctcg 4080

atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt tgtgaaattt 4140

gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt aacaacaaca 4200

attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg ggaggttttt taaagcaagt 4260

aaaacctcta caaatgtggt agaattcagg gggagaccca attcgtaatc atggtcatag 4320

ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc 4380

ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc 4440

tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa 4500

cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgc 4533

<210>2

<211>4791

<212>DNA

<213>质粒pSCp36

<220>

<221>其他特征

<222>(1939)..(1045)

<223>卡那霉素抗性，反向互补

<220>

<221>启动子

<222>(2447)..(3243)

<223>CMV

<220>

<221>内含子

<222>(3250)..(3386)

<223>

<220>

<221>其他特征

<222>(3393)..(4331)

<223>p36蛋白质

<220>

<221>polyA_位点

<222>(4338)..(4539)

<223>poly A位点aus SV 40

<400>2

tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 60

tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 120

aacatgtctc gggaggcctc acgtgacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 180

cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 240

aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 300

tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 360

ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat 420

ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 480

cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 540

ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 600

gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt 660

atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 720

aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 780

aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 840

gaaaactcac 9ttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc 900

cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct 960

gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca 1020

tccatagttg cctgactccc cgtctcagaa gaactcgtca agaaggcgat agaaggcgat 1080

gcgctgcgaa tcgggagcgg cgataccgta aagcacgagg aagcggtcag cccattcgcc 1140

gccaagctct tcagcaatat cacgggtagc caacgctatg tcctgatagc ggtccgccac 1200

acccagccgg ccacagtcga tgaatccaga aaagcggcca ttttccacca tgatattcgg 1260

caagcaggca tcgccatggg tcacgacgag atcctcgccg tcgggcatgc tcgccttgag 1320

cctggcgaac agttcggctg gcgcgagccc ctgatgctct tcgtccagat catcctgatc 1380

gacaagaccg gcttccatcc gagtacgtgc tcgctcgatg cgatgtttcg cttggtggtc 1440

gaatgggcag gtagccggat caagcgtatg cagccgccgc attgcatcag ccatgatgga 1500

tactttctcg gcaggagcaa ggtgagatga caggagatcc tgccccggca cttcgcccaa 1560

tagcagccag tcccttcccg cttcagtgac aacgtcgagc acagctgcgc aaggaacgcc 1620

cgtcgtggcc agccacgata gccgcgctgc ctcgtcttgc agttcattca gggcaccgga 1680

caggtcggtc ttgacaaaaa gaaccgggcg cccctgcgct gacagccgga acacggcggc 1740

atcagagcag ccgattgtct gttgtgccca gtcatagccg aatagcctct ccacccaagc 1800

ggccggagaa cctgcgtgca atccatcttg ttcaatcata atattattga agcatttatc 1860

agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag 1920

gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca 1980

tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtctcgcg cgtttcggtg 2040

atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag 2100

cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg 2160

gctggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg 2220

aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgccattcg ccattcaggc 2280

tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga 2340

aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac 2400

gttgtaaaac gacggccagt gccaagcttg gtctcctccc ggatcctcaa tattggccat 2460

tagccatatt attcattggt tatatagcat aaatcaatat tggctattgg ccattgcata 2520

cgttgtatct atatcataat atgtacattt atattggctc atgtccaata tgaccgccat 2580

gttggcattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 2640

gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 2700

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 2760

ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 2820

atcaagtgta tcatatgcca agtccgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 2880

cctggcatta tgcccagtac atgaccttac gggactttcc tacttggcag tacatctacg 2940

tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacaccaat gggcgtggat 3000

agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 3060

tttggcacca aaatcaacg9 gactttccaa aatgtcgtaa taaccccgcc ccgttgacgc 3120

aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagaggtcgt ttagtgaacc 3180

gtcagatcac tagaagcttt attgcggtag tttatcacag ttaaattgct aacgcagtca 3240

gtgctcgagc aggtaagtat caaggttaca agacaggttt aaggaggcca atagaaactg 3300

ggcttgtcga gacagagaag actcttgcgt ttctgatagg cacctattgg tcttactgac 3360

atccactttg cctttctctc cacaggggta ccatgaacta cgagggtcac ctgaagggcc 3420

accgcggatg ggtcacctcc ctggcctgcc cgcagcaggc ggggtcgtac atcaaggtgg 3480

tgtcgacgtc gcgcgatggc acggccatct cgtggaaagc caaccccgac cgccacagcg 3540

tggacagcga ctacggtctg ccgagccacc gcctcgaggg ccacaccggc ttcgtgtcgt 3600

gtgtgtcgct ggcccacgcc accgactacg cgctgaccgc gtcctgggac cgctccatcc 3660

gcatgtggga cctgcgcaat ggccagtgcc agcgcaagtt cctgaagcac accaaggacg 3720

tgctcgccgt cgccttctcg ccggacgacc gcctgatcgt gtccgcgggc cgcgacaacg 3780

tgatccgcgt gtggaacgtg gcgggcgagt gcatgcacga gttcctgcgc gacggccacg 3840

aggactgggt gagcagcatc tgtttctcgc cgtcgctgga gcatccgatc gtggtgtccg 3900

gcagctggga caacaccatc aaggtatgga acgtgaacgg gggcaagtgt gagcgcacgc 3960

tcaagggcca cagcaactac gtgtccacgg tgacggtgtc gccagacggg tcgctgtgcg 4020

cgtccggcgg caaggacggc gcggcgctgc tgtgggacct gagcaccggc gagcagctgt 4080

tcaagatcaa cgtggagtcg cccatcaacc agatcgcctt ctcgcccaac cgcttctgga 4140

tgtgcgtcgc gacggagagg tccctgtccg tgtacgacct ggagagcaag gctgtgattg 4200

cggagctgac gccggacggc gcgaagccgt ccgagtgcat ctccattgcc tggtccgccg 4260

acggcaacac tctgtactcc ggtcacaagg acaacctgat ccgcgtgtgg tccatctccg 4320

acgccgagta agagctcgat gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat 4380

gctttatttg tgaaatttgt gatgctattg ctttatttgt aaccattata agctgcaata 4440

aacaagttaa caacaacaat tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg gaggtgtggg 4500

aggtttttta aagcaagtaa aacctctaca aatgtggtag aattcagggg gagacccaat 4560

tcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac 4620

aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc 4680

acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg 4740

cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg c 4791

<210>3

<211>11

<212>PRT

<213>人类免疫缺陷病毒1型，TAT肽

<400>3

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210>4

<211>7

<212>PRT

<213>猴病毒40，NLS肽

<400>4

Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

1 5

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>ODN 1

<220>

<221>修饰的碱基

<222>(12)..(12)

<223>XT＝用反应性氨基修饰的胸腺嘧啶

<400>5

gggagtccag ttttctggac 20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>ODN 2

<400>6

aggggtccag ttttctggac 20

<210>7

<211>33

<212>DNA

<213>1.PCR：引物左

<400>7

ttatatggta ccatgaacat acgagggtca cct 33

<210>8

<211>42

<212>DNA

<213>1.PCR：引物右

<400>8

ttatatgagc tcagaagaca cggacaggga cctcttccgt cg 42

<210>9

<211>33

<212>DNA

<213>2.PCR：引物左

<400>9

ttatatggta ccatgaacat acgagggtca cct 33

<210>10

<211>33

<212>DNA

<213>2.PCR：引物右

<400>10

ttatatgagc tcttactcgg ccgtcggaga tgg 33

Claims

1.在真核细胞中可操纵的DNA表达构建体在制备用于皮内注射引起1型细胞介导的免疫应答的疫苗中的用途，其中所述构建体在启动子序列的调控下编码一种或多种抗原，且所述DNA表达构建体被共价连接于一或多个寡肽以提高转染效率。

2.权利要求1所述的DNA表达构建体的用途，其中免疫接种多核苷酸序列以表达构建体的形式存在，所述表达构建体由含有线性双链区的共价闭合线性脱氧核糖核酸分子组成，其中形成双链的单链是通过由脱氧核糖核苷酸组成的短单链环连接，其中所述形成双链的单链仅由在被免疫接种的动物的体内可操纵的启动子和终止子序列调控下的编码序列组成。

3.权利要求1或2所述的DNA表达构建体的用途，其中所述构建体编码乙肝表面抗原(HBsAg)。

4.前述的一个或多个权利要求所述的DNA表达构建体的用途，其中寡肽具有5-25个氨基酸长度并且其中至少一半氨基酸是由赖氨酸和精氨酸组成的组的成员之一。

5.权利要求4所述的DNA表达构建体的用途，其中所述的寡肽含有核定位序列。

6.权利要求4或5所述的DNA表达构建体的用途，其中所述的寡肽含有序列PKKKRKV(脯氨酸-赖氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-赖氨酸-缬氨酸)。

7.权利要求4或5所述的DNA表达构建体的用途，其中所述的寡肽含有序列YGRKKRRQRRR。

8.使用权利要求1-7所述的DNA表达构建体皮下注射来引起1型细胞介导的免疫应答的疫苗。

9.权利要求8所述的疫苗，其中该疫苗存在于溶液中。

10.应用于人类的权利要求8和9所述的疫苗。