CN112292142A - 核酸分子及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了可以用于例如治疗癌症或感染，或者在受试者中诱导免疫应答，或者在细胞中或从细胞递送或表达靶分子的核酸分子。

Description

核酸分子及其使用方法

背景技术

免疫疗法和基因疗法彻底改变了各种疾病的治疗。然而，该疗法仍然是不完善的，并且因此，需要提供克服目前仍然存在的缺点和不足的新疗法。本公开满足这些需求以及其他需求。

发明内容

在一些实施方式中，提供了核酸分子。在一些实施方式中，所述核酸分子包括多核苷酸，该多核苷酸包括编码组成型启动子的序列、编码靶全长蛋白的氨基酸序列的序列或编码靶分子的序列。在一些实施方式中，所述分子包括编码接头的氨基酸序列的序列。在一些实施方式中，所述分子包括编码泛素的氨基酸序列的序列。在一些实施方式中，所述分子包括编码片段，诸如所述靶蛋白的至少7个氨基酸残基的片段的序列或编码靶蛋白的序列。在一些实施方式中，所述分子包括编码核定位信号的序列。在一些实施方式中，核苷酸序列可操作地彼此连接。在一些实施方式中，所述分子包括编码包括全长蛋白、接头、泛素蛋白和全长蛋白片段的多肽的序列。在一些实施方式中，所述核酸分子编码相同蛋白的两个片段而不是全长蛋白和其片段，所述两个片段具有不同的长度或序列，尽管所述两个片段中可能有重叠。在一些实施方式中，不对所述片段进行编码。在一些实施方式中，当不对所述片段进行编码时，编码所述接头和所述泛素的序列是任选的，并且所述分子可以不含这样的序列。

在一些实施方式中，表达的各种组分可操作地彼此连接，以编码蛋白或靶分子。例如，在一些实施方式中，编码包括所述全长蛋白的氨基酸序列、所述接头的氨基酸序列、所述泛素的氨基酸序列和所述靶蛋白的至少7个氨基酸残基的蛋白的序列可操作地彼此连接，使得各自表达。

在一些实施方式中，提供了包括本文提供的所述核酸分子的药物组合物。在一些实施方式中，所述药物组合物包括药学上可接受的赋形剂或载体。在一些实施方式中，所述组合物包括额外的治疗剂，诸如与PD-1、PD-L1、TNF-α、CTL4等结合的抗体。其他类型的治疗剂也可以与本文提供的所述核酸分子组合。

在一些实施方式中，提供了在受试者中诱导针对蛋白质的免疫应答的方法。在一些实施方式中，所述方法包括将本文提供的核酸分子引入(例如施用)到所述受试者的细胞中。在一些实施方式中，所述核酸分子在所述细胞中表达，并且诱导针对由所述核酸分子编码的靶蛋白的免疫应答。

在一些实施方式中，提供了在受试者中治疗癌症的方法。在一些实施方式中，所述方法包括将本文提供的所述核酸分子引入(例如施用)到所述受试者中以治疗癌症。在一些实施方式中，由所述核酸分子编码的靶蛋白是在癌细胞或肿瘤中过表达的蛋白。

在一些实施方式中，提供了在受试者中抑制感染原(infectious agent)或感染的方法。在一些实施方式中，所述方法包括将本文提供的所述核酸分子引入(例如施用)到所述受试者中以在所述受试者中抑制所述感染原或治疗感染。在一些实施方式中，由所述核酸分子编码的靶蛋白是由所述感染原表达的蛋白。

在一些实施方式中，提供了表达或递送靶分子的方法。在一些实施方式中，所述方法包括将本文提供的所述核酸分子引入(例如施用)到细胞或受试者或将细胞或受试者与本文提供的所述核酸分子接触，以表达靶分子或将靶分子递送到细胞。在一些实施方式中，所述靶分子是从细胞中分泌的。

在一些实施方式中，提供了包括本文提供的所述核酸分子的细胞。在一些实施方式中，所述细胞是分离的细胞。在一些实施方式中，所述细胞是离体的并且不在受试者中。

附图说明

图1示出了已进行的实验的数据，其中将等摩尔量的质粒DNA转染到完全相同的HEK-293人胚肾细胞的培养物上，并且在转染后24小时监测GFP表达。上面的图示出了对照，并且下面的图示出了来自细胞的GFP表达。

图2示出了如本文所述的核酸分子，诸如质粒的非限制性实施方式。

图3示出了如本文所述的核酸分子，诸如质粒的非限制性实施方式。

图4示出了如本文所述的核酸分子，诸如质粒的非限制性实施方式。

具体实施方式

本文提供的实施方式提供了可以例如允许表达为免疫原或靶分子的外来核苷酸的整合的平台。免疫原或分子的表达可以用在例如预防或治疗癌症和/或传染病的方法中。在一些实施方式中，本文提供的核酸分子可以用于将一些DNA片段组装成一个核酸分子。例如，尽管在DNA片段的末端和DNA片段内发现了限制性位点冗余，但仍可以做到这一点。本文提供的核酸分子也可以包括细胞核摄取组分，诸如可以促进细胞核内快速质粒整合或摄取的核定位信号(结构域)。此摄取可能会导致免疫学应答。

例如,本文提供的核酸分子可以穿过细胞膜并且转染细胞核。一旦该过程发生，之后外来核苷酸就会通过宿主细胞转录和翻译过程表达。“外来核苷酸”是被引入到细胞中的，且不是细胞基因组的天然核苷酸。实例包括本文提供的任何核酸分子，并且实例也包括本文提供的质粒或其他类型的载体。在翻译之后，抗原到达细胞表面时可以与主要组织相容性复合蛋白I类或II类一起呈现。不受任何特定理论的束缚，抗原呈递细胞(APC)，诸如巨噬细胞或树突细胞将捕获该外来抗原并且行进到淋巴结，在淋巴结处APC将呈递抗原靶蛋白和/或片段，其然后导致对由本文提供的核酸分子编码的抗原的免疫应答。

还必须注意，除非上下文另外明确指出，否则如本文所用，单数形式的“一个/一种(a/an)”和“所述/该(the)”包括复数含义。因此，例如，对“细胞”的引用是对本领域技术人员已知的一个或更多个细胞及其等同物的引用，等等。

如本文所用，术语“约”意指正在使用的数值的正负10％。因此，约50％意指在45％-55％的范围内。本公开用术语“约”修饰某些术语或值，然而，该公开也应理解为公开确切的值，并且为了方便起见而没有写出来。例如，短语“约9至约25”还公开了“9至25”。另外，范围诸如短语“从X至Y”——其中X和Y为任何整数——包括端点。例如，短语“从1至5”意指1、2、3、4或5。

当与治疗手段一起使用时，“施用”意指将治疗剂直接施用到靶组织内或靶组织上或者向患者施用治疗剂。可以用于施用核酸分子的施用方法的非限制性实例包括但不限于转染、电穿孔、注射、超声处理或通过任何方法组合其他已知技术。这样的组合技术包括加热和辐射。在一些实施方式中，将核酸分子递送到肌肉细胞。这可以例如通过电穿孔或其他合适的技术来进行。将核酸分子电穿孔到肌肉或其他组织类型是可以进行的，例如，使用电穿孔装置。

本文所使用的术语“动物”包括但不限于人和非人脊椎动物，诸如野生、家养和农场动物。

术语“克隆”用于指核酸分子到另一个核酸分子诸如质粒中的连接过程。然后可以将克隆的分子转移到宿主细胞或受试者中进行复制、扩增或施用。

术语“克隆载体”和“克隆载体质粒”用于指至少包含复制起点的环状DNA质粒。复制起点可以用于阳性筛选携带质粒的宿主细胞，并且可以是抗生素抗性基因或多克隆位点。

如本文所用，术语包括(comprising)”(和任何形式的包括，诸如“包括(comprise)”、“包括(comprises)”和“包括(comprised)”)、“具有(having)”(和任何形式的具有，诸如“具有(have)”和“具有(has)”、“包括(including)”(和任何形式的包括，诸如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“包含(containing)”(和任何形式的包含，诸如“包含(contains)”和“包含(contain)”)是包括性的或开放式的并且不排除额外的未引用的元素或方法步骤。

如本文所用，术语“遗传构建体”是指DNA或RNA分子，其包括核苷酸序列，该核苷酸序列编码靶蛋白或靶分子并且包括可操作地连接到调控元件的起始和终止信号，该调控元件包括能够指导在接种的个体的细胞中表达的启动子和多腺苷酸化信号。在一些实施方式中，本文提供的核酸分子为质粒或病毒载体的形式。在一些实施方式中，遗传构建体是质粒或病毒载体。在一些实施方式中，遗传构建体不包含整合元件。在一些实施方式中，质粒不包含或者不含有任何反向末端重复或其他序列——其有助于将质粒整合到受试者或细胞的基因组中。在一些实施方式中，质粒是非整合质粒。非整合质粒，是没有设计成整合到与该质粒接触的受试者或细胞的基因组中的质粒。在一些实施方式中，使非整合质粒与细胞接触，没有任何有助于质粒整合到基因组中的其他组分。例如，质粒可以与可用于将质粒的部分整合到基因组中的基因编辑平台诸如CRISPR一起使用。因此，在一些实施方式中，可以在没有CRISPR或CRISPR样酶，诸如CAS9等的情况下使用质粒。

如本文所用，“DNA构建体”是指通过与克隆载体质粒连续的克隆步骤合成的DNA分子。这是通常用作将基因表达引导到合适的哺乳动物宿主的手段的过程。这种哺乳动物宿主可以是体外培养的细胞或体内转基因小鼠。

术语“DNA片段”是指任何DNA分子分离物，其包括但不限于质粒的不同部分，诸如内含子、外显子、报道基因、聚腺苷酸尾和不同的克隆位点。这些DNA片段也可以包括信号核苷酸，诸如mRNA稳定信号和核定位信号。质粒载体可以包括天然和合成的DNA片段。

术语“增强子区域”是指靶向基因表达不需要，但是被设计为增加基因表达水平的核苷酸序列。

如本文所用，术语“可表达形式”是指基因构建体，其包含与编码靶蛋白或靶分子的编码序列可操作地连接的必要调控元件，使得当存在于个体细胞中时，编码序列将被表达。

如本文所用，术语“基因启动子”或“启动子”是指并且涉及基因表达所需的核苷酸序列。

如本文所用，术语“基因疫苗”是指包括遗传构建体的药物制剂，该遗传构建体包括编码靶蛋白或靶分子的核苷酸序列，并且可以包括可用于引起治疗性免疫应答的药物制剂。在一些实施方式中，核苷酸序列编码shRNA、siRNA、反义、抗体、激素、胰岛素等。如本文所述，也可以编码其他靶分子，诸如但不限于佐剂。

如本文所用，术语“遗传治疗剂”是指包括遗传构建体的药物制剂，该遗传构建体包括编码治疗性或补偿性蛋白的核苷酸序列。

术语“抑制”包括质粒或核酸分子的施用预防症状发作、减轻症状、减少症状、延迟或减少疾病和/或其症状的进展或者消除疾病、状况或病症。

术语“核定位信号”用于指编码目的蛋白到细胞的细胞核的亚细胞路径的信号的核苷酸序列。核定位信号也可以用于引导核酸分子向细细胞核的转运。

如本文所用，术语“复制起点”或“ORI”是指可以引导或导致质粒的宿主细胞复制的核苷酸序列。

“药学上可接受的”意指载体、稀释剂或赋形剂必须与制剂的其他成分相容并且对其接受者无害。

如本文所用，术语“聚腺苷酸尾”是指腺嘌呤(A)核苷酸的核苷酸序列。这些核苷酸通常出现在信使RNA分子(mRNA)的末端。在DNA构建体末端的3'处掺入聚腺苷酸尾，考虑增强目的基因的表达。在一些实施方式中，本文提供的核酸分子包括聚腺苷酸尾。

如本文所用，术语“报道基因”是指编码用于监测特定目的启动子的活性的蛋白的核苷酸序列。报道基因的实例包括荧光蛋白，诸如GFP和SEAP。

如本文所用，术语“标签序列”或“标签”是指编码独特的蛋白质或肽区域的核苷酸序列，其允许对其进行检测并与任何内源性对应体区分开。标签的非限制性实例包括His标签、GST标签、钙调蛋白结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、myc标签、HA标签、FLAG标签等。

如本文所用，术语“靶蛋白”可以指针对其可以引发免疫应答并且期望针对其引发免疫应答的蛋白。靶蛋白可以是例如，与来自病原体或不期望的细胞类型诸如癌细胞的蛋白共享至少一个表位的免疫原性蛋白或其片段。针对靶蛋白的免疫应答可以用于诱导免疫应答，该免疫应答保护个体抵御与靶蛋白相关的特定感染或疾病和治疗个体的与靶蛋白相关的特定感染或疾病。在一些实施方式中，靶蛋白是细胞表面蛋白或从细胞分泌的蛋白(抗原)。在一些实施方式中，这些类型的蛋白或抗原可用于引发来自T细胞毒性淋巴细胞或CD8+免疫细胞的激活的免疫应答。例如，这些类型的蛋白或抗原可以通过与CD8+免疫细胞相互作用的主要组织相容性复合体(MHC)I类途径进行加工。可以例如通过在靶蛋白的N末端处添加泛素部分来促进通过该途径的蛋白/抗原的呈递。如本文所述，核酸分子可编码与泛素部分连接、融合(框内)或缀合的靶蛋白。

“靶蛋白”也可以指在细胞中表达或从细胞中分泌的蛋白。靶蛋白可以是受体、抗体、嵌合抗原受体(CAR)、激素诸如胰岛素等。

本文所述的核酸分子还可用于表达不同类型的靶分子，诸如本文提供的核酸分子，其包括但不限于shRNA、siRNA、反义、微RNA等。

如本文所用，术语“治疗剂”意指用于治疗、对抗、改善、预防或改进患者的不希望的状况或疾病的剂。部分地，实施方式涉及癌症的治疗或细胞增殖的减少。部分地，实施方式涉及感染或感染原的治疗。

治疗剂的“治疗有效量”或“有效量”是经计算以实现期望效果，即刺激免疫应答的预定量。本方法预期的活性包括适当的医学治疗和/或预防性治疗。

如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treated)”或“治疗(treating)”指治疗剂治疗和预防法或预防措施，其中目的是预防或减慢(减轻)不期望的生理状况、病症或疾病，或者获得有益或期望的临床结果。

术语“非翻译区”是指覆盖不编码在mRNA分子内发现的蛋白的核苷酸区域的核苷酸序列。这些未翻译的区域可以在mRNA分子的5'和3'区域找到。在一些实施方式中，本文提供的编码靶蛋白或靶蛋白片段的核酸分子包括非翻译区。

在一些实施方式中，本文公开的核酸分子和方法可以与有这样的治疗需要——也可以称为“需要其”——的受试者一起使用或在其上使用。如本文所用，短语“需要其”意指已将受试者鉴定为有特定的方法或治疗需要，并且已经出于特定意图的特定目的对受试者进行了治疗。

在一些实施方式中，核酸序列包括：编码组成型启动子的序列、编码靶全长蛋白的氨基酸序列的序列、编码接头的氨基酸序列的序列、编码泛素的氨基酸序列的序列、编码靶蛋白的至少7个氨基酸残基的序列和编码核定位信号的序列，其中，序列可操作地彼此连接，并且b)、c)、d)和e)的序列可操作地彼此连接，以编码包括全长蛋白的氨基酸序列、接头的氨基酸序列、泛素的氨基酸序列和靶蛋白的至少7个氨基酸残基的蛋白。在一些实施方式中，片段的长度为约7至约25个氨基酸。在一些实施方式中，片段的长度为约7至约15、约7至约12、约7至约10、约7至约9个氨基酸，或者长度为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。

在一些实施方式中，本文提供的核酸分子不包含或不包括(例如不含)编码靶蛋白的片段的序列，或替代地，如果全长蛋白不是由核酸分子编码的，则核酸分子仅编码靶蛋白的一个片段。

在一些实施方式中，核酸序列包括启动子。在一些实施方式中，启动子是组成型启动子或组织特异性启动子。“组织特异性启动子”是限制表达或在很大程度上将表达限制到特定组织类型的启动子。启动子也可以是细胞特异性启动子，使得核酸分子的表达仅限于特定细胞或细胞亚群。可以使用的启动子的实例包括但不限于EF-1、SV40、劳斯肉瘤病毒(RSV)、梅森-菲舍(Mason-Pfizer)猴病毒-CTE和CTE+rev。在一些实施方式中，EF-1启动子由以下序列编码：

GACTCTTCGCGATTATCGCCGAATTCACGCGTCGTGAGGCTCCTGCAGGGCCGACTAGTGGAGCCGAGAGTAATTCATACAAAAGGAGGGATCGCCTTCGCAAGGGGAGAGCCCAGGGACCGTCCCTAAATTCTCACAGACCCAAATCCCTGTAGCCGCCCCACGACAGCGCGAGGAGCATCCGCCCAGGGCTGAGCGCGGGTAGATCAGAGCACACAAGCTCACAGTCCCCGGCGGTGGGGGGAGGGGCGCGCTGAGCGGGGGCCAGGGAGCTGGCGCGGGGCAAACTGGGAAAGTGGTGTCGTGTGCTGGCTCCGCCCTCTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACGGTATATAAGTGCGGTAGTCGCCTTGGACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGTCAGAACGCAGCTGAAGCTTCGAGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCCAGCTAGCGTTTAAACTTGCCGCCACC(SEQ ID NO:1)

启动子的这些非限制性实例也可以称为组成型启动子。启动子的这些非限制性实例是已知的，并且可以掺入核酸分子中。然而，该列表仅出于实例目的，因为有许多可以用于驱动从核酸分子的靶蛋白的表达的启动子。如本文所提供的，编码启动子的核酸分子与编码靶蛋白的核酸分子可操作地连接，以控制、调节或驱动靶蛋白在细胞中的表达。

在一些实施方式中，核酸分子包括编码靶蛋白或靶分子的核酸分子。在一些实施方式中，靶蛋白是MAGE-A4、MAGE-A2、胰岛素、抗体、激素、嵌合抗原受体、受体、融合蛋白、GFP、SEAP等。这些靶分子可以与或者可以不与质粒的其他元件诸如泛素、靶分子的片段、接头等一起表达。在一些实施方式中，抗体是单链抗体。在一些实施方式中，抗体是单域抗体(sdAb)。在一些实施方式中，抗体是scFV。

如本文所提供的，靶分子可以是从核酸分子(例如质粒)表达的抗体。如本文所用，术语“抗体”意指广义的并且包括免疫球蛋白或抗体分子，抗体分子包括多克隆抗体、包括鼠、人、人源化和嵌合单克隆抗体的单克隆抗体以及抗体片段，诸如ScFv或六抗体(PLOSBiology|DOI:10.1371/journal.pbio.1002344 2016年1月6日，通过引用将其全文并入于本文)。

如本文所用，术语“人源化抗体”、“工程抗体”、“适应的人框架”和“HFA”旨在包括具有源自人起源的序列的可变区框架的抗体。而且，如果抗体包含恒定区，则该恒定区可以衍生自这样的人序列，例如人种系序列，或人种系序列的天然存在的(例如同种异型)或突变形式。人源化抗体可以包括未由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机诱变或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。

通常，抗体是表现出对特定抗原的结合特异性的蛋白或多肽。完整的抗体是异四聚体蛋白，由两条轻链和两条重链组成。通常，每条轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数目在不同的免疫球蛋白同种型的重链之间变化。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链在一端具有可变域(V_H)，其后是一些恒定域。每条轻链在一端具有可变域(V_L)，并且在另一端具有恒定域；轻链的恒定域与重链的第一恒定域对齐，并且轻链的可变域与重链的可变域对齐。基于它们恒定域的氨基酸序列，可以将任何脊椎动物物种的抗体轻链分配为两种明显不同的类型之一，即κ和λ。取决于重链恒定域氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为五个主要类别，即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。IgA和IgG进一步亚分类为亚型IgA₁、IgA₂、IgG₁、IgG₂、IgG₃和IgG₄。

术语“抗体片段”意指完整抗体的一部分，通常是完整抗体的抗原结合或可变区域。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段、双抗体、单链抗体分子和由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体。在一些实施方式中，抗体可以是单链可变片段(scFv)抗体。

在一些实施方式中，编码MAGE-A2的核酸分子包括：

ATGCCGCTCGAACAGAGGAGCCAGCACTGTAAACCAGAAGAAGGACTCGAAGCGAGGGGGGAAGCGTTGGGGTTGGTAGGTGCTCAAGCACCAGCAACTGAGGAACAGCAAACTGCGAGTTCTTCTTCCACATTGGTGGAAGTTACTCTTGGGGAGGTTCCCGCTGCGGACAGTCCCTCCCCTCCACATTCCCCCCAGGGTGCAAGTTCCTTTAGCACCACAATCAACTACACCCTGTGGCGACAGTCAGATGAGGGAAGTTCTAATCAAGAAGAAGAGGGGCCACGCATGTTTCCCGACCTCGAGTCTGAGTTCCAAGCCGCTATAAGCAGGAAGATGGTTGAGTTGGTTCATTTTCTGCTCCTCAAGTATCGAGCCAGGGAGCCGGTCACAAAGGCAGAAATGCTGGAGAGTGTCCTCAGAAATTGCCAGGACTTCTTTCCCGTGATCTTCAGCAAAGCCTCCGAGTACTTGCAGCTGGTCTTTGGCATCGAGGTGGTGGAAGTGGTCCCCATCAGCCACTTATACATCCTTGTCACCTGCCTGGGCCTCTCCTACGATGGCCTGCTGGGCGACAATCAGGTCATGCCCAAGACAGGCCTCCTGATAATCGTCCTGGCCATAATCGCAATAGAGGGCGACTGTGCCCCTGAGGAGAAAATCTGGGAGGAGCTGAGTATGTTGGAGGTGTTTGAGGGGAGGGAGGACAGTGTCTTCGCACATCCCAGGAAGCTGCTCATGCAAGACCTGGTGCAGGAAAACTACCTGGAGTACCGGCAGGTGCCTGGTAGAGACCCAGCCTGTTATGAATTTCTGTGGGGACCAAGAGCACTTATCGATACTAGTTATGTGAAAGTCCTGCACCATACACTAAAGATCGGTGGAGAACCTCACATTTCCTACCCACCCCTGCATGAACGGGCTTTGAGAGAGGGAGAAGAG(SEQ ID NO:2)

在一些实施方式中，编码MAGE-A2的蛋白的核酸序列包括以下序列：

MPLEQRSQHCKPEEGLEARGEALGLVGAQAPATEEQQTASSSSTLVEVTLGEVPAADSPSPPHSPQGASSFSTTINYTLWRQSDEGSSNQEEEGPRMFPDLESEFQAAISRKMVELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLESVLRNCQDFFPVIFSKASEYLQLVFGIEVVEVVPISHLYILVTCLGLSYDGLLGDNQVMPKTGLLIIVLAIIAIEGDCAPEEKIWEELSMLEVFEGREDSVFAHPRKLLMQDLVQENYLEYRQVPGRDPACYEFLWGPRALIDTSYVKVLHHTLKIGGEPHISYPPLHERALREGEE(SEQ ID NO:3)

在一些实施方式中，编码MAGE-A4的核酸分子包括：

atgtcttctgagcagaagagtcagcactgcaagcctgaggaaggcgttgaggcccaagaagaggccctgggcctggtgggtgcacaggctcctactactgaggagcaggaggctgctgtctcctcctcctctcctctggtccctggcaccctggaggaagtgcctgctgctgagtcagcaggtcctccccagagtcctcagggagcctctgccttacccactaccatcagcttcacttgctggaggcaacccaatgagggttccagcagccaagaagaggaggggccaagcacctcgcctgacgcagagtccttgttccgagaagcactcagtaacaaggtggatgagttggctcattttctgctccgcaagtatcgagccaaggagctggtcacaaaggcagaaatgctggagagagtcatcaaaaattacaagcgctgctttcctgtgatcttcggcaaagcctccgagtccctgaagatgatctttggcattgacgtgaaggaagtggaccccgccagcaacacctacacccttgtcacctgcctgggcctttcctatgatggcctgctgggtaataatcagatctttcccaagacaggccttctgataatcgtcctgggcacaattgcaatggagggcgacagcgcctctgaggaggaaatctgggaggagctgggtgtgatgggggtgtatgatgggagggagcacactgtctatggggagcccaggaaactgctcacccaagattgggtgcaggaaaactacctggagtaccggcaggtacccggcagtaatcctgcgcgctatgagttcctgtggggtccaagggctctggctgaaaccagctatgtgaaagtcctggagcatgtggtcagggtcaatgcaagagttcgcattgcctacccatccctgcgtgaagcagctttgttagaggaggaagagggagtctga(SEQ ID NO:4)

在一些实施方式中，编码MAGE-A4的蛋白的核酸分子包括以下序列：

MSSEQKSQHCKPEEGVEAQEEALGLVGAQAPTTEEQEAAVSSSSPLVPGTLEEVPAAESAGPPQSPQGASALPTTISFTCWRQPNEGSSSQEEEGPSTSPDAESLFREALSNKVDELAHFLLRKYRAKELVTKAEMLERVIKNYKRCFPVIFGKASESLKMIFGIDVKEVDPASNTYTLVTCLGLSYDGLLGNNQIFPKTGLLIIVLGTIAMEGDSASEEEIWEELGVMGVYDGREHTVYGEPRKLLTQDWVQENYLEYRQVPGSNPARYEFLWGPRALAETSYVKVLEHVVRVNARVRIAYPSLREAALLEEEEGV(SEQ ID NO:5)

如技术人员已知的，由于遗传密码是简并性的事实，具有特定氨基酸序列的肽可以由不同的核酸分子编码。在一些实施方式中，将核酸分子的序列优化。可以基于密码子使用和频率来优化序列，所述密码子使用和频率取决于正在使用的细胞类型或正在施用核酸分子的受试者。密码子优化可以用于最大化蛋白表达。这可以通过优化针对哺乳动物细胞的mRNA序列的密码子使用来完成。例如，改变编码核酸分子内使用的感染性靶蛋白的免疫原基因序列可以用于增加表达以及表达的蛋白的免疫原性。优化密码子使用的方法是已知的。另外地，本文提供的核酸分子可以在序列中具有终止密码子。本领域技术人员将理解终止密码子可以被简并的终止密码子替代。已知终止密码子为U(T)AA、U(T)AG和U(T)GA。

因此，上表中示出的核酸序列仅出于说明目的，并且不旨在限制于编码靶蛋白相关氨基酸序列的那些核酸序列。另外地，在一些实施方式中，使用小于全长的靶蛋白。在一些实施方式中，核酸分子未将独立于N和/或C末端的至少5、10、15或20个氨基酸残基进行编码。在一些实施方式中，靶蛋白大于由核酸分子编码的靶蛋白的片段。

在一些实施方式中，由本文提供的核酸分子编码的蛋白包括保守置换。保守置换是技术人员已知的。

在一些实施方式中，核酸分子包括不同的包括编码靶蛋白片段的核酸序列的核酸分子。在一些实施方式中，该片段包括约7至约25个靶蛋白的残基。在一些实施方式中，该片段包括约7至约20、约7至约18、约7至约15、约7至约13、约7至约12、约7至约11、约7至约9、约8至约25、约8至约20、约8至约18、约8至约15、约8至约13、约8至约12、约8至约11、约8至约9、约9至约25、约9至约20、约9至约18、约9至约15、约9至约13、约9至约12、约9至约11个靶蛋白的残基等。在一些实施方式中，该片段的长度是或是约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、29、20、21、22、23、24或25个氨基酸残基。

在一些实施方式中，靶蛋白的片段和/或靶蛋白本身通过MHC I或MHC II CD8+免疫细胞或T细胞毒性淋巴细胞引发免疫原性应答。在一些实施方式中，靶蛋白的片段通过下表中的氨基酸序列表示：

该片段也可以由包括编码该片段的序列的其他核酸分子编码。表中表示的核酸序列仅出于说明目的，并且不应解释为限制性的。

在一些实施方式中，核酸序列包括编码接头的序列，该接头诸如但不限于甘氨酸-丝氨酸接头或甘氨酸-丙氨酸接头。在一些实施方式中，甘氨酸-丝氨酸接头包括序列GGGGS(SEQ ID NO:13)。接头也可以包括此序列的重复。在一些实施方式中，接头包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个GGGGS重复。在一些实施方式中，甘氨酸-丙氨酸接头包括序列GGGGA(SEQ IDNO:10)。接头也可以包括此序列的重复。在一些实施方式中，接头包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个GGGGS(SEQ ID NO:10)重复。接头也可以包括该接头序列的混合物。因此，在一些实施方式中，接头可以包括序列GGGGSGGGGAGGGGS(SEQ ID NO:11)等。也可以使用其他肽接头。在一些实施方式中，甘氨酸-丝氨酸接头包括序列：GGSGS(SEQ ID NO:12)及其多个重复。可以有本文提供的任何接头的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个重复。接头也可以彼此混合。在一些实施方式中，本文提供的核酸分子不包含或不包括(例如不含)编码接头的序列。

在一些实施方式中，核酸分子将泛素编码为单个泛素蛋白或者2个或更多个泛素蛋白的链。在一些实施方式中，编码泛素的序列选自编码UBB、UBC、UBA52和RPS27A的序列。编码的泛素可以是同质泛素链或包括不同泛素分子的异质泛素链。这样的序列的实例将包括但不限于下表中的那些序列：

在一些实施方式中，本文提供的核酸分子不包括(例如不含)编码泛素蛋白的序列。

在一些实施方式中，该核酸序列包括编码核定位信号的序列。由核苷酸序列编码的核定位信号的非限制性实例是元件1，其可以由包括以下序列的核酸分子编码：

CACAATTCCACACATGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACACACGTGCTAAAACTTCATTTT(SEQ ID NO:19)

在一些实施方式中，提供了核酸分子，其编码包括全长蛋白、甘氨酸-丝氨酸接头、泛素蛋白和全长蛋白的片段的蛋白。在一些实施方式中，编码片段的核酸分子不包括在核酸分子或质粒中。如果没有靶分子的片段，则不需要编码泛素蛋白的序列。因此，在一些实施方式中，不存在编码泛素蛋白的核酸分子，或者换句话说，该核酸分子不含编码泛素蛋白的序列。

因此，在一些实施方式中，提供了核酸分子，其编码包括全长蛋白和NLS信号的蛋白，而没有编码接头序列、泛素蛋白或该蛋白片段的分子。核酸分子可以是质粒。

本文提供片段的实例，并且其长度可以为约7至约25个氨基酸或如本文另外所述。如图2所示，可以示出这样的蛋白的非限制性实例。如图3和4所示，可以示出其他非限制性实例。

在一些实施方式中，这些实施方式的甘氨酸/丝氨酸接头是如本文所提供的，包括但不限于GGGGS、GGGGA或GGGSS。在一些实施方式中，泛素蛋白是UBB或SEQ ID NO:14。在一些实施方式中，片段是SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8。

在一些实施方式中，本文提供的核酸分子不包含或不包括(例如不含)编码接头的序列。

核酸分子的其他元件——其可能存在或可能不存在——可以可操作地连接到编码蛋白质的序列。

在一些实施方式中，提供了一种药物组合物，包括本文所述的核酸分子，诸如但不限于，包括编码组成型启动子的序列、编码靶蛋白的氨基酸序列的序列、编码接头的氨基酸序列的序列、编码泛素的氨基酸序列的序列、编码靶蛋白的至少7个氨基酸残基的肽片段的序列和编码核定位信号的序列的核酸分子，其中，这些序列可操作地彼此连接，并且b)、c)、d)和e)序列可操作地彼此连接，以编码包括全长蛋白的氨基酸序列的蛋白、接头的氨基酸序列、泛素的氨基酸序列和靶蛋白的至少7个氨基酸残基的蛋白。本文提供了其他片段大小。

本文还提供了由本文所述的核酸分子编码的蛋白或肽。

在一些实施方式中，提供了核酸分子，其中所述核酸分子包括编码启动子的多核苷酸。在一些实施方式中，启动子是组成型启动子。本文提供了可以使用的组成型启动子的非限制性实例。在一些实施方式中，核酸分子包括编码靶分子或靶蛋白的多核苷酸。本文提供了靶分子和靶蛋白的实例。这些实例仅出于说明目的，并且旨在是非限制性的。靶分子或蛋白可以是由选择为由核酸分子编码的核酸分子编码的任何分子或蛋白。在一些实施方式中，核酸分子包括编码接头的多核苷酸。本文提供了接头的实例。例如，接头可以是可以由核酸分子编码的任何肽接头。在一些实施方式中，核酸分子包括编码泛素的多核苷酸。本文提供了接头的实例。在一些实施方式中，核酸分子包括编码靶蛋白片段的多核苷酸。本文提供了各种片段大小。在一些实施方式中，片段为靶蛋白的约7至约25个氨基酸残基。在一些实施方式中，核酸分子包括编码核定位信号(NLS)的多核苷酸。在一些实施方式中，NLS不编码表达的蛋白或标签。相反，NLS可以是由细胞识别的核酸分子，并且确保包括NLS的核酸分子存在于(例如转运到)细胞核中。本文提供的元件可以可操作地彼此连接。如果存在所有元件，则核酸分子可以编码包括全长蛋白的氨基酸序列、接头的氨基酸序列、泛素的氨基酸序列和靶蛋白片段的蛋白。

本文提供的核酸分子可以作为单个分子，例如作为质粒提供。在一些实施方式中，与编码不同元件的不同核苷酸分子相反，每个元件由单个多核苷酸序列(或双链分子，诸如，但不限于质粒)编码。诸如质粒的单个分子的使用允许使用者有效地将靶分子或靶蛋白引入到相关的细胞或细胞环境中。

在一些实施方式中，本文提供的核酸分子包括一种或更多种编码组成型启动子的多核苷酸；编码靶分子——其也可以称为目标分子——的多核苷酸；和编码核定位信号的多核苷酸；其中，序列可以是或是可操作地彼此连接的。在一些实施方式中，本文提供的核酸分子包括编码组成型启动子的多核苷酸；编码靶分子——也可以称为目标分子——的多核苷酸；编码核定位信号的多核苷酸；其中序列可操作地彼此连接。目的分子(靶分子)可以是可以由核酸分子编码的任何分子。例如，靶分子可以是可以在T细胞或其他类型的细胞中表达并且在T细胞中起作用的嵌合抗原受体(CAR)。因此，可以呈质粒形式的核酸分子可以用于将靶分子递送至目的细胞。在一些实施方式中，细胞是免疫细胞，诸如T细胞、树突细胞、NK细胞、TIL、MIL等。

在一些实施方式中，核酸分子用于递送可以在细胞中表达的靶分子。因此，可以是质粒的核酸分子可以用于在细胞中表达蛋白或核酸分子。靶分子可以是编码蛋白的核酸分子、反义核酸分子、siRNA分子、微RNA、抗体、受体或可以由核酸分子编码的任何其他类型的分子，诸如本文所述的那些。可被编码的产物的其他实例是胰岛素、激素、基因产物等。基因产物的特定结构不一定是关键的，而是显示可以使用的核酸分子诸如质粒的各种实施方式。在一些实施方式中，靶分子是可以治疗癌症的抗体，诸如与PD-1、PD-L1、BSMA等结合的抗体。这样的抗体的实例包括但不限于派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)等。可以使用的CAR的实例包括那些包括与PD-1、PD-L1、BSMA、PSMA等结合的细胞外区域的那些CAR。在一些实施方式中，CAR包括CD19细胞外结合结构域。在一些实施方式中，CAR包括4-1BB细胞内区域。在一些实施方式中，CAR包括CD3ζ细胞内信号传导结构域。在一些实施方式中，CAR包括CD28细胞内结构域。在一些实施方式中，CAR的跨膜结构域是CD3ζ跨膜结构域或CD28跨膜结构域。如本文所述，在一些实施方式中，该核酸分子例如质粒是非整合核酸分子。

在一些实施方式中，将本文提供的核酸分子施用到受试者并且由细胞摄取。在一些实施方式中，将细胞用核酸分子(例如质粒)离体处理，并且之后施用回到受试者中以在体内表达该分子。在一些实施方式中，核酸分子与纳米颗粒复合以将核酸分子递送到特定细胞类型。例如，可以将核酸分子与脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒、脂质体、中性脂质体、可生物降解的聚合物基质(例如水凝胶)等封装或复合。纳米颗粒的实例在Xiao et al.,Molecular Therapy:Methods&Clinical Development Vol.12March 2019,pp.1-18中描述，通过引用将其全文合并于此。可以使用的聚合物的实例包括但不限于：研究最多集中在聚醚酰亚胺(PEI)、乳糖酰化聚赖氨酸(PLL)、聚丙烯酸(PAA)、聚(脂族酯)(PAE)和聚(N,N-甲基丙烯酸二甲氨基乙酯)(PDMAEMA)。这些聚合物可以通过化学改性来改性或可以不进行改性。其他聚合物包括但不限于壳聚糖(例如阳离子壳聚糖)、聚(乙二醇)改性的壳聚糖(PEG-CS)、羧甲基葡聚糖(CMD)-壳聚糖、明胶(例如阳离子明胶)、葡聚糖(例如阳离子葡聚糖)、纤维素(例如阳离子纤维素)、环糊精(例如阳离子环糊精)。

在一些实施方式中，核酸分子不与载体或纳米颗粒封装。在一些实施方式中，药物组合物不含封装核酸分子的纳米颗粒。

如本文所述，核酸分子可以包括启动子，诸如组成型启动子。组成型启动子的实例包括但不限于EF-1、SV40、劳斯肉瘤病毒和梅森-菲舍猴病毒-CTE。在一些实施方式中，启动子是EF-1。在一些实施方式中，启动子是SV40。在一些实施方式中，启动子是RSV。在一些实施方式中，启动子是梅森-菲舍猴病毒-CTE。

核酸分子还可以进一步包括编码一种或更多种佐剂的核酸序列。在一些实施方式中，佐剂是IL-12。在一些实施方式中，该核酸分子编码由以下组成的组的一种或更多种：抗CD40抗体、GM-CSF、贝伐珠单抗(bevacizumab)、干扰素-α、干扰素-β、聚-(I:C)和衍生物、RNA白介素(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、IL-13、IL-15、IL-21和IL-23等。

在一些实施方式中，本文提供的核酸分子可以包括编码核定位信号(NLS)的序列。在一些实施方式中，NLS是元件1。在一些实施方式中，序列如SEQ ID NO:19示出。

为了避免疑问，本文提供的任何核酸分子可以是质粒或其他类型的环状DNA序列，使得其可以用于在细胞中表达它的产物。

在一些实施方式中，提供了包括本文所述的核酸分子的药物组合物。本文提供了药物组合物的实例。

在一些实施方式中，提供了将分子递送到细胞的方法。在一些实施方式中，该方法包括使细胞与本文提供的核酸分子接触到受试者的细胞中或受试者中，并且所述核酸序列由所述受试者中的细胞摄取。然后表达核酸分子，并在细胞中表达靶分子或其他表达盒。在一些实施方式中，通过电穿孔、注射、超声处理、转染、转导、基因枪、纳米颗粒、脂质颗粒包围或其他适合于将核酸分子引入到受试者或细胞中的施用方式将该核酸序列引入到细胞或受试者中。在一些实施方式中，将核酸分子递送到的细胞或组织是皮肤、肌肉、乳房、肺、胰、脑、卵巢、子宫、子宫内膜、结肠、前列腺、食道、牙龈、舌、咽喉或肾组织或者细胞。

这些实例是非限制性的，并且本文提供的分子和组合物可以用于使用者所期望的任何组织或细胞类型。

在一些实施方式中，本文所述的组合物和分子可以用于治疗癌症。可以治疗的癌症的实例包括但不限于脑、乳房、肺、卵巢、子宫内膜、结肠、肺、皮肤(例如黑素瘤)等。

本文所述的药物组合物可以进一步包括药学上可接受的载体或稀释剂。在一些实施方式中，药物组合物包括约1ng至约10,000μg的核酸分子。可以根据要使用的施用方式来配制药物组合物。本领域普通技术人员可以容易地配制包括如本文所述的遗传构建体或核酸分子的药物组合物。在肌肉内注射为选择的施用方式的情况下，可以使用等渗制剂。在一些实施方式中，用于等渗的添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇、乳糖等。在一些情况下，使用等渗溶液，诸如磷酸盐缓冲盐水。在一些实施方式中，药物组合物包括稳定剂。稳定剂的实例包括但不限于明胶和白蛋白。药物制剂可以呈无菌且无热原提供。

在一些实施方式中，提供了在受试者中诱导针对靶蛋白的免疫应答的方法。在一些实施方式中，该方法包括将本文所述的核酸分子引入到受试者中。在一些实施方式中，将核酸分子引入到受试者的细胞中。核酸分子也可以被细胞摄取。一旦在细胞内，细胞的机器就可以用来表达靶蛋白和由核酸分子编码的构建体。在一些实施方式中，核酸分子如本文所述。引入或施用的方法可以是任何方法，包括本文所述的方法。在一些实施方式中，通过电穿孔或注射将核酸分子引入。在一些实施方式中，将核酸分子通过超声处理、转染、转导、基因枪、纳米颗粒、脂质颗粒或其他适合于将核酸分子引入到受试者中或细胞中的施用方式等引入到受试者中或施用给受试者。

在一些实施方式中，布比卡因或其他类似的佐剂用于帮助促进免疫应答的诱导。

在一些实施方式中，向受试者的组织施用核酸分子。在一些实施方式中，组织是皮肤、肌肉、肝脏、脂肪等。

在一些实施方式中，提供了治疗癌症的方法。在一些实施方式中，在受试者中治疗癌症的方法为向受试者引入或施用本文所述的核酸分子。在一些实施方式中，将核酸分子直接引入到细胞中。在一些实施方式中，核酸分子由细胞摄取并且在细胞中表达。在一些实施方式中，靶蛋白和靶蛋白片段是在癌细胞中过表达或特异性表达的蛋白。在一些实施方式中，通过电穿孔、注射、超声处理、转染、转导等施用核酸分子。在一些实施方式中，向受试者的皮肤、肌肉或其他组织施用核酸分子。在一些实施方式中，癌症是肺癌、乳腺癌、子宫癌、前列腺癌、卵巢癌、结直肠癌、黑素瘤、骨髓瘤、脑癌、结肠癌、胰腺癌等。在一些实施方式中，癌症是三阴性乳腺癌、子宫癌、前列腺癌、卵巢癌或结直肠癌。

在一些实施方式中，提供了治疗受试者中的感染原或感染的方法。在一些实施方式中，所述方法包括向受试者引入/施用本文所述的核酸分子。在一些实施方式中，将核酸分子直接施用到受试者的细胞中。在一些实施方式中，核酸分子可以由细胞摄取并且在细胞中表达。不受任何特定理论的束缚，当表达核酸分子时，受试者的免疫应答将将靶蛋白和靶蛋白片段识别为外来的，并且将产生免疫应答。产生的免疫应答可以治疗或预防感染。在一些实施方式中，所产生的免疫应答可以治疗感染原或防止感染原引起疾病或将抑制感染原的生长以改善感染症状。施用方法可以是本文所述的任何方法。在一些实施方式中，可以向受试者的皮肤、肌肉、脂肪、肾或其他组织施用核酸分子。在一些实施方式中，向受试者的粘膜施用核酸分子。在一些实施方式中，在治疗受试者中感染原的方法包括将核酸分子引入到受试者的细胞中，并且所述核酸序列由受试者中的细胞摄取，其中，蛋白是由感染原表达的蛋白。在一些实施方式中，通过电穿孔、注射、超声处理、转染和转导将核酸分子引入到受试者或细胞中。

在一些实施方式中，靶蛋白是HIV或流感蛋白，诸如Gp120、Gag、Nef、Tat、血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)等。

在一些实施方式中，也可以用靶向与涉及肿瘤发生的蛋白的抗体治疗受试者。例如，在一些实施方式中，向受试者施用抗PD-L1、抗PD-1和/或抗CTL4抗体和本文所述的核酸分子。抗体可以在本文提供的核酸分子之前、之后或同时施用。

在一些实施方式中，提供了包括本文提供的所述核酸分子的细胞。在一些实施方式中，所述细胞是分离的细胞。在一些实施方式中，所述细胞是离体的并且不在受试者中。细胞可以是任何细胞类型，诸如T细胞、肌肉细胞、皮肤细胞、脑细胞等。

以下实施例是说明性的，但不限制本文所述的组合物和方法。本领域技术人员已知的其他合适的修改和改编在以下实施方式的范围内。

实施例1称为核定位域的DNA元件——其为元件1——包含模拟病毒在细胞内部运输的序列，该序列可以帮助DNA定位到细胞核以及编码的mRNA从细胞核中输出。

实验表明，当将这些元件引入到标准的绿色荧光蛋白(GFP)表达质粒DNA表达载体的序列中，并使用商购的阳离子脂质转染试剂(即Lipofectmine)将其转染到哺乳动物细胞中时，如图1示出的，它们将GFP的表达增强几倍。

核酸分子，诸如本文提供的那些核酸分子被设计为基于DNA的递送系统，其可以经由可以用于减少肿瘤负荷和/或预防肿瘤复发的CD8+和CD4+淋巴细胞直接增强免疫系统。优化的SMART质粒DNA连同抗PD-L1(例如阿替利珠单抗(Atezolizumab))和/或抗CTL4(例如伊匹木单抗(Ipilimumab))的临床前研究正在经历测试，以证明引发可以导致当前化学疗法的毒性降低的全身性免疫应答的潜能。使用抗体已经发现PD-L1和/或CTL4是潜在肿瘤免疫疗法靶标。

另外，SMART质粒DNA连同抗PD-L1和/或抗CTL4一起可以用作许多表达蛋白抗原诸如MAGE-A的肿瘤的独立治疗。

通过先前的研究，病毒蛋白诸如慢病毒整合酶蛋白的特定区域能够增强病毒DNA的核转运。

SMART质粒DNA将这样的病毒蛋白的一部分掺入到元件1中，这增强了病毒DNA到细胞核中的输入并开始靶序列的翻译过程。

当与外源添加的病毒蛋白结合使用时，SMART质粒DNA中的元件1的DNA定位特性被放大。

质粒DNA元件的序列以及它们在质粒内的结构定向导致体外蛋白表达增强。

不受任何特定理论的束缚，认为这些元件的作用机理提供了3维结构元件，其经由增强的被动运输，使DNA更有效地被转运通过哺乳动物细胞的核孔，或者通过与有规律地穿梭于细胞核的分子相互作用，使DNA主动地转运通过所述孔。另外，包含在核酸分子内的元件1NLS可以将转录的信使RNA从细胞核定位到细胞质，在细胞质中，可以将这些mRNA分子翻译成蛋白质，例如，为了治疗益处。

用于生产针对哺乳动物细胞转导的慢病毒样载体颗粒的完全合成方法是强大的模板，在该模板中建立免疫疗法用于治疗表达抗原的肿瘤和其他疾病实体。它代表了基因递送技术、转染和免疫疗法的重大技术进步。

该DNA序列也可以在环状质粒中表示，并编码为MAGE A-2的靶蛋白。质粒包含以下序列：EF-1启动子核苷酸序列、MAGE-A2全长核苷酸序列、甘氨酸-丝氨酸接头核苷酸序列、泛素核苷酸序列、MAGE-A2 9聚体肽核苷酸序列和元件1(核定位域)核苷酸序列。质粒也可以包括卡那霉素/新霉素核苷酸序列区域的序列和ColE1起源核苷酸序列。提供MAGE A2 9-聚体质粒序列的非限制性实例为下面的SEQ ID NO:20：

MAGE A2 9-聚体质粒序列：

GACTCTTCGCGATTATCGCCGAATTCACGCGTCGTGAGGCTCCTGCAGGGCCGACTAGTGGAGCCGAGAGTAATTCATACAAAAGGAGGGATCGCCTTCGCAAGGGGAGAGCCCAGGGACCGTCCCTAAATTCTCACAGACCCAAATCCCTGTAGCCGCCCCACGACAGCGCGAGGAGCATCCGCCCAGGGCTGAGCGCGGGTAGATCAGAGCACACAAGCTCACAGTCCCCGGCGGTGGGGGGAGGGGCGCGCTGAGCGGGGGCCAGGGAGCTGGCGCGGGGCAAACTGGGAAAGTGGTGTCGTGTGCTGGCTCCGCCCTCTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACGGTATATAAGTGCGGTAGTCGCCTTGGACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGTCAGAACGCAGCTGAAGCTTCGAGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCCAGCTAGCGTTTAAACTTGCCGCCACCATGCCGCTCGAACAGAGGAGCCAGCACTGTAAACCAGAAGAAGGACTCGAAGCGAGGGGGGAAGCGTTGGGGTTGGTAGGTGCTCAAGCACCAGCAACTGAGGAACAGCAAACTGCGAGTTCTTCTTCCACATTGGTGGAAGTTACTCTTGGGGAGGTTCCCGCTGCGGACAGTCCCTCCCCTCCACATTCCCCCCAGGGTGCAAGTTCCTTTAGCACCACAATCAACTACACCCTGTGGCGACAGTCAGATGAGGGAAGTTCTAATCAAGAAGAAGAGGGGCCACGCATGTTTCCCGACCTCGAGTCTGAGTTCCAAGCCGCTATAAGCAGGAAGATGGTTGAGTTGGTTCATTTTCTGCTCCTCAAGTATCGAGCCAGGGAGCCGGTCACAAAGGCAGAAATGCTGGAGAGTGTCCTCAGAAATTGCCAGGACTTCTTTCCCGTGATCTTCAGCAAAGCCTCCGAGTACTTGCAGCTGGTCTTTGGCATCGAGGTGGTGGAAGTGGTCCCCATCAGCCACTTATACATCCTTGTCACCTGCCTGGGCCTCTCCTACGATGGCCTGCTGGGCGACAATCAGGTCATGCCCAAGACAGGCCTCCTGATAATCGTCCTGGCCATAATCGCAATAGAGGGCGACTGTGCCCCTGAGGAGAAAATCTGGGAGGAGCTGAGTATGTTGGAGGTGTTTGAGGGGAGGGAGGACAGTGTCTTCGCACATCCCAGGAAGCTGCTCATGCAAGACCTGGTGCAGGAAAACTACCTGGAGTACCGGCAGGTGCCTGGTAGAGACCCAGCCTGTTATGAATTTCTGTGGGGACCAAGAGCACTTATCGATACTAGTTATGTGAAAGTCCTGCACCATACACTAAAGATCGGTGGAGAACCTCACATTTCCTACCCACCCCTGCATGAACGGGCTTTGAGAGAGGGAGAAGAGGGTGGTTCTGGTAGCATGCAGATCTTCGTGAAGACGTTAACCGGTAAAACCATAACTCTCGAAGTTGAACCATCCGATACCATCGAAAACGTTAAGGCTAAAATTCAAGACAAGGAAGGCATTCCACCTGATCAACAAAGATTGATCTTTGCCGGTAAGCAGCTGGAGGACGGTAGAACGCTGTCTGATTACAACATTCAGAAGGAGTCGACCTTACATCTTGTCTTAAGACTAAGAGGTGGTAAAATGGTTGAACTTGTTCATTTTCTTTGACTCGAGCGCGCTGGGCCCTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACCGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTCGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAATTATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCACGTGTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACACACGTGCTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGGCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTT(SEQ ID NO.20)

实施例2将靶分子递送至肺。向患有囊性纤维化的患者的肺施用包括编码CFTR蛋白的质粒的药物组合物。质粒包含SEQ ID NO:19的NLS，并且连接到组成型启动子。肺细胞摄取该质粒，并且CFTR蛋白得以表达，并发现CFTR蛋白在受试者肺的细胞中适当起作用。

实施例3靶分子在肌肉中的分泌。向患有1型糖尿病的患者的肌肉细胞施用包括编码胰岛素蛋白的质粒的药物组合物。质粒包含SEQ ID NO:19的NLS，并且连接到组成型启动子。肌肉细胞而不是已被免疫系统破坏的胰腺中的β细胞分泌所需的胰岛素，为患者带来正常的功能。

实施例4将靶分子递送到骨髓中。将包括编码谷氨酸的质粒的药物组合物施用到红细胞的产生发生的骨髓中。质粒包含SEQ ID NO:19的NLS，并且连接到组成型启动子。用谷氨酸的序列代替患者的在α亚基第6位处的缬氨酸的不正确编码，使患者的红细胞具有正常的形状和功能性。

实施例5将靶分子递送到胰中。将包括编码用于生长调节miRNA的质粒的药物组合物施用到患有胰腺癌的患者的胰中。质粒包含SEQ ID NO:19的NLS，并且连接到组成型启动子。miRNA序列可以替代丢失的miRNA，并且恢复对癌症网络的原始控制并逆转癌症侵占性和生长。

本文提供的实施例证明了本文所述的核酸分子递送分子并使其表达的灵活性。这可以用于简单地将分子递送到细胞或组织，或者可以用于诱导针对各种靶分子的免疫应答。

本文所述的实施例在方式上是示例性的，并且并不旨在也不应该将其用于限制实施方式的范围。出于其预期目的，将各自及每个参考文献、出版物、登录号、专利、文件等以其全部通过引用并入本文。

本说明书不限于所述的特定过程、组合物或方法论，因为这些可能会变化。本说明书中使用的术语仅出于描述特定版本或实施方式的目的，并且不旨在限制本文所述的实施方式的范围。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。在某些情况下，为了清楚和/或易于参考，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且在本文中这样的定义的包含不应该被解释为表示与本领域通常理解的实质性区别。然而，在冲突的情况下，将以包括定义的本专利说明书为准。

从前述，应当理解，出于说明的目的已经在本文中描述了本公开的各种实施方式，并且在不脱离本公开的范围和精神的情况下可以进行各种修改。因此，本文公开的各种实施方式并非旨在限制。

序列表

<110> PEPVAX公司(PEPVAX, Inc.)

M·纳拉亚南(NARAYANAN, Mahesh)

A·多默(DORMER, Anton)

<120> 核酸分子及其使用方法

<130> 145310.00102

<150> US 62/639,092

<151> 2018-03-06

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 720

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

gactcttcgc gattatcgcc gaattcacgc gtcgtgaggc tcctgcaggg ccgactagtg 60

gagccgagag taattcatac aaaaggaggg atcgccttcg caaggggaga gcccagggac 120

cgtccctaaa ttctcacaga cccaaatccc tgtagccgcc ccacgacagc gcgaggagca 180

tccgcccagg gctgagcgcg ggtagatcag agcacacaag ctcacagtcc ccggcggtgg 240

ggggaggggc gcgctgagcg ggggccaggg agctggcgcg gggcaaactg ggaaagtggt 300

gtcgtgtgct ggctccgccc tcttcccgag ggtgggggag aacggtatat aagtgcggta 360

gtcgccttgg acgttctttt tcgcaacggg tttgccgtca gaacgcagct gaagcttcga 420

gggctcgcat ctctccttca cgcgcccgcc gccctacctg aggccgccat ccacgccggt 480

tgagtcgcgt tctgccgcct cccgcctgtg gtgcctcctg aactgcgtcc gccgtctagg 540

taagtttaaa gctcaggtcg agaccgggcc tttgtccggc gctcccttgg agcctaccta 600

gactcagccg gctctccacg ctttgcctga ccctgcttgc tcaactctac gtctttgttt 660

cgttttctgt tctgcgccgt tacagatcca agccagctag cgtttaaact tgccgccacc 720

<210> 2

<211> 942

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

atgccgctcg aacagaggag ccagcactgt aaaccagaag aaggactcga agcgaggggg 60

gaagcgttgg ggttggtagg tgctcaagca ccagcaactg aggaacagca aactgcgagt 120

tcttcttcca cattggtgga agttactctt ggggaggttc ccgctgcgga cagtccctcc 180

cctccacatt ccccccaggg tgcaagttcc tttagcacca caatcaacta caccctgtgg 240

cgacagtcag atgagggaag ttctaatcaa gaagaagagg ggccacgcat gtttcccgac 300

ctcgagtctg agttccaagc cgctataagc aggaagatgg ttgagttggt tcattttctg 360

ctcctcaagt atcgagccag ggagccggtc acaaaggcag aaatgctgga gagtgtcctc 420

agaaattgcc aggacttctt tcccgtgatc ttcagcaaag cctccgagta cttgcagctg 480

gtctttggca tcgaggtggt ggaagtggtc cccatcagcc acttatacat ccttgtcacc 540

tgcctgggcc tctcctacga tggcctgctg ggcgacaatc aggtcatgcc caagacaggc 600

ctcctgataa tcgtcctggc cataatcgca atagagggcg actgtgcccc tgaggagaaa 660

atctgggagg agctgagtat gttggaggtg tttgagggga gggaggacag tgtcttcgca 720

catcccagga agctgctcat gcaagacctg gtgcaggaaa actacctgga gtaccggcag 780

gtgcctggta gagacccagc ctgttatgaa tttctgtggg gaccaagagc acttatcgat 840

actagttatg tgaaagtcct gcaccataca ctaaagatcg gtggagaacc tcacatttcc 900

tacccacccc tgcatgaacg ggctttgaga gagggagaag ag 942

<210> 3

<211> 314

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Met Pro Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu

1 5 10 15

Glu Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala

20 25 30

Thr Glu Glu Gln Gln Thr Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val

35 40 45

Thr Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Asp Ser Pro Ser Pro Pro His Ser

50 55 60

Pro Gln Gly Ala Ser Ser Phe Ser Thr Thr Ile Asn Tyr Thr Leu Trp

65 70 75 80

Arg Gln Ser Asp Glu Gly Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro Arg

85 90 95

Met Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Ile Ser Arg Lys

100 105 110

Met Val Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu

115 120 125

Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Glu Ser Val Leu Arg Asn Cys Gln

130 135 140

Asp Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Glu Tyr Leu Gln Leu

145 150 155 160

Val Phe Gly Ile Glu Val Val Glu Val Val Pro Ile Ser His Leu Tyr

165 170 175

Ile Leu Val Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp

180 185 190

Asn Gln Val Met Pro Lys Thr Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile

195 200 205

Ile Ala Ile Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu Glu

210 215 220

Leu Ser Met Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Val Phe Ala

225 230 235 240

His Pro Arg Lys Leu Leu Met Gln Asp Leu Val Gln Glu Asn Tyr Leu

245 250 255

Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Arg Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu

260 265 270

Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ile Asp Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His

275 280 285

His Thr Leu Lys Ile Gly Gly Glu Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu

290 295 300

His Glu Arg Ala Leu Arg Glu Gly Glu Glu

305 310

<210> 4

<211> 954

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

atgtcttctg agcagaagag tcagcactgc aagcctgagg aaggcgttga ggcccaagaa 60

gaggccctgg gcctggtggg tgcacaggct cctactactg aggagcagga ggctgctgtc 120

tcctcctcct ctcctctggt ccctggcacc ctggaggaag tgcctgctgc tgagtcagca 180

ggtcctcccc agagtcctca gggagcctct gccttaccca ctaccatcag cttcacttgc 240

tggaggcaac ccaatgaggg ttccagcagc caagaagagg aggggccaag cacctcgcct 300

gacgcagagt ccttgttccg agaagcactc agtaacaagg tggatgagtt ggctcatttt 360

ctgctccgca agtatcgagc caaggagctg gtcacaaagg cagaaatgct ggagagagtc 420

atcaaaaatt acaagcgctg ctttcctgtg atcttcggca aagcctccga gtccctgaag 480

atgatctttg gcattgacgt gaaggaagtg gaccccgcca gcaacaccta cacccttgtc 540

acctgcctgg gcctttccta tgatggcctg ctgggtaata atcagatctt tcccaagaca 600

ggccttctga taatcgtcct gggcacaatt gcaatggagg gcgacagcgc ctctgaggag 660

gaaatctggg aggagctggg tgtgatgggg gtgtatgatg ggagggagca cactgtctat 720

ggggagccca ggaaactgct cacccaagat tgggtgcagg aaaactacct ggagtaccgg 780

caggtacccg gcagtaatcc tgcgcgctat gagttcctgt ggggtccaag ggctctggct 840

gaaaccagct atgtgaaagt cctggagcat gtggtcaggg tcaatgcaag agttcgcatt 900

gcctacccat ccctgcgtga agcagctttg ttagaggagg aagagggagt ctga 954

<210> 5

<211> 317

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Met Ser Ser Glu Gln Lys Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Val

1 5 10 15

Glu Ala Gln Glu Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Thr

20 25 30

Thr Glu Glu Gln Glu Ala Ala Val Ser Ser Ser Ser Pro Leu Val Pro

35 40 45

Gly Thr Leu Glu Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Ala Gly Pro Pro Gln

50 55 60

Ser Pro Gln Gly Ala Ser Ala Leu Pro Thr Thr Ile Ser Phe Thr Cys

65 70 75 80

Trp Arg Gln Pro Asn Glu Gly Ser Ser Ser Gln Glu Glu Glu Gly Pro

85 90 95

Ser Thr Ser Pro Asp Ala Glu Ser Leu Phe Arg Glu Ala Leu Ser Asn

100 105 110

Lys Val Asp Glu Leu Ala His Phe Leu Leu Arg Lys Tyr Arg Ala Lys

115 120 125

Glu Leu Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Glu Arg Val Ile Lys Asn Tyr

130 135 140

Lys Arg Cys Phe Pro Val Ile Phe Gly Lys Ala Ser Glu Ser Leu Lys

145 150 155 160

Met Ile Phe Gly Ile Asp Val Lys Glu Val Asp Pro Ala Ser Asn Thr

165 170 175

Tyr Thr Leu Val Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly

180 185 190

Asn Asn Gln Ile Phe Pro Lys Thr Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Gly

195 200 205

Thr Ile Ala Met Glu Gly Asp Ser Ala Ser Glu Glu Glu Ile Trp Glu

210 215 220

Glu Leu Gly Val Met Gly Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Thr Val Tyr

225 230 235 240

Gly Glu Pro Arg Lys Leu Leu Thr Gln Asp Trp Val Gln Glu Asn Tyr

245 250 255

Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asn Pro Ala Arg Tyr Glu Phe

260 265 270

Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ala Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu

275 280 285

Glu His Val Val Arg Val Asn Ala Arg Val Arg Ile Ala Tyr Pro Ser

290 295 300

Leu Arg Glu Ala Ala Leu Leu Glu Glu Glu Glu Gly Val

305 310 315

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Lys Met Val Glu Leu Val His Phe Leu

1 5

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 智人

<400> 7

aaaatggttg aacttgttca ttttctt 27

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

Lys Val Asp Glu Leu Ala His Phe Leu

1 5

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 智人

<400> 9

aaggtggatg agttggctca ttttctg 27

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 10

Gly Gly Gly Gly Ala

1 5

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 11

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 12

Gly Gly Ser Gly Ser

1 5

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 13

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 14

<211> 76

<212> PRT

<213> 智人

<400> 14

Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu

1 5 10 15

Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp

20 25 30

Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys

35 40 45

Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu

50 55 60

Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly

65 70 75

<210> 15

<211> 228

<212> DNA

<213> 智人

<400> 15

atgcagatct tcgtgaagac gttaaccggt aaaaccataa ctctcgaagt tgaaccatcc 60

gataccatcg aaaacgttaa ggctaaaatt caagacaagg aaggcattcc acctgatcaa 120

caaagattga tctttgccgg taagcagctg gaggacggta gaacgctgtc tgattacaac 180

attcagaagg agtcgacctt acatcttgtc ttaagactaa gaggtggt 228

<210> 16

<211> 685

<212> PRT

<213> 智人

<400> 16

Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu

1 5 10 15

Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp

20 25 30

Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys

35 40 45

Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu

50 55 60

Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe

65 70 75 80

Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser

85 90 95

Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile

100 105 110

Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp

115 120 125

Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His

130 135 140

Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu

145 150 155 160

Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu

165 170 175

Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln

180 185 190

Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu

195 200 205

Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg

210 215 220

Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr

225 230 235 240

Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala

245 250 255

Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile

260 265 270

Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn

275 280 285

Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly

290 295 300

Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu

305 310 315 320

Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp

325 330 335

Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys

340 345 350

Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu

355 360 365

Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe

370 375 380

Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser

385 390 395 400

Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile

405 410 415

Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp

420 425 430

Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His

435 440 445

Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu

450 455 460

Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu

465 470 475 480

Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln

485 490 495

Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu

500 505 510

Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg

515 520 525

Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr

530 535 540

Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala

545 550 555 560

Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile

565 570 575

Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn

580 585 590

Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly

595 600 605

Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu

610 615 620

Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp

625 630 635 640

Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys

645 650 655

Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu

660 665 670

Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Val

675 680 685

<210> 17

<211> 128

<212> PRT

<213> 智人

<400> 17

Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu

1 5 10 15

Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp

20 25 30

Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys

35 40 45

Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu

50 55 60

Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Ile Ile Glu Pro

65 70 75 80

Ser Leu Arg Gln Leu Ala Gln Lys Tyr Asn Cys Asp Lys Met Ile Cys

85 90 95

Arg Lys Cys Tyr Ala Arg Leu His Pro Arg Ala Val Asn Cys Arg Lys

100 105 110

Lys Lys Cys Gly His Thr Asn Asn Leu Arg Pro Lys Lys Lys Val Lys

115 120 125

<210> 18

<211> 156

<212> PRT

<213> 智人

<400> 18

Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu

1 5 10 15

Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp

20 25 30

Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys

35 40 45

Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu

50 55 60

Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Ala Lys Lys Arg

65 70 75 80

Lys Lys Lys Ser Tyr Thr Thr Pro Lys Lys Asn Lys His Lys Arg Lys

85 90 95

Lys Val Lys Leu Ala Val Leu Lys Tyr Tyr Lys Val Asp Glu Asn Gly

100 105 110

Lys Ile Ser Arg Leu Arg Arg Glu Cys Pro Ser Asp Glu Cys Gly Ala

115 120 125

Gly Val Phe Met Ala Ser His Phe Asp Arg His Tyr Cys Gly Lys Cys

130 135 140

Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Asn Lys Pro Glu Asp Lys

145 150 155

<210> 19

<211> 105

<212> DNA

<213> 智人

<400> 19

cacaattcca cacatgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacat gtgtgaaatt 60

gttatccgct cacaattcca cacacacgtg ctaaaacttc atttt 105

<210> 20

<211> 4259

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成序列

<400> 20

gactcttcgc gattatcgcc gaattcacgc gtcgtgaggc tcctgcaggg ccgactagtg 60

gagccgagag taattcatac aaaaggaggg atcgccttcg caaggggaga gcccagggac 120

cgtccctaaa ttctcacaga cccaaatccc tgtagccgcc ccacgacagc gcgaggagca 180

tccgcccagg gctgagcgcg ggtagatcag agcacacaag ctcacagtcc ccggcggtgg 240

ggggaggggc gcgctgagcg ggggccaggg agctggcgcg gggcaaactg ggaaagtggt 300

gtcgtgtgct ggctccgccc tcttcccgag ggtgggggag aacggtatat aagtgcggta 360

gtcgccttgg acgttctttt tcgcaacggg tttgccgtca gaacgcagct gaagcttcga 420

gggctcgcat ctctccttca cgcgcccgcc gccctacctg aggccgccat ccacgccggt 480

tgagtcgcgt tctgccgcct cccgcctgtg gtgcctcctg aactgcgtcc gccgtctagg 540

taagtttaaa gctcaggtcg agaccgggcc tttgtccggc gctcccttgg agcctaccta 600

gactcagccg gctctccacg ctttgcctga ccctgcttgc tcaactctac gtctttgttt 660

cgttttctgt tctgcgccgt tacagatcca agccagctag cgtttaaact tgccgccacc 720

atgccgctcg aacagaggag ccagcactgt aaaccagaag aaggactcga agcgaggggg 780

gaagcgttgg ggttggtagg tgctcaagca ccagcaactg aggaacagca aactgcgagt 840

tcttcttcca cattggtgga agttactctt ggggaggttc ccgctgcgga cagtccctcc 900

cctccacatt ccccccaggg tgcaagttcc tttagcacca caatcaacta caccctgtgg 960

cgacagtcag atgagggaag ttctaatcaa gaagaagagg ggccacgcat gtttcccgac 1020

ctcgagtctg agttccaagc cgctataagc aggaagatgg ttgagttggt tcattttctg 1080

ctcctcaagt atcgagccag ggagccggtc acaaaggcag aaatgctgga gagtgtcctc 1140

agaaattgcc aggacttctt tcccgtgatc ttcagcaaag cctccgagta cttgcagctg 1200

gtctttggca tcgaggtggt ggaagtggtc cccatcagcc acttatacat ccttgtcacc 1260

tgcctgggcc tctcctacga tggcctgctg ggcgacaatc aggtcatgcc caagacaggc 1320

ctcctgataa tcgtcctggc cataatcgca atagagggcg actgtgcccc tgaggagaaa 1380

atctgggagg agctgagtat gttggaggtg tttgagggga gggaggacag tgtcttcgca 1440

catcccagga agctgctcat gcaagacctg gtgcaggaaa actacctgga gtaccggcag 1500

gtgcctggta gagacccagc ctgttatgaa tttctgtggg gaccaagagc acttatcgat 1560

actagttatg tgaaagtcct gcaccataca ctaaagatcg gtggagaacc tcacatttcc 1620

tacccacccc tgcatgaacg ggctttgaga gagggagaag agggtggttc tggtagcatg 1680

cagatcttcg tgaagacgtt aaccggtaaa accataactc tcgaagttga accatccgat 1740

accatcgaaa acgttaaggc taaaattcaa gacaaggaag gcattccacc tgatcaacaa 1800

agattgatct ttgccggtaa gcagctggag gacggtagaa cgctgtctga ttacaacatt 1860

cagaaggagt cgaccttaca tcttgtctta agactaagag gtggtaaaat ggttgaactt 1920

gttcattttc tttgactcga gcgcgctggg ccctttaaac ccgctgatca gcctcgaccg 1980

tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg 2040

aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga 2100

gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg 2160

aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctact gggcggtttt 2220

atggacagca agcgaaccgg aattgccagc tggggcgccc tctggtaagg ttgggaagcc 2280

ctgcaaagta aactggatgg ctttctcgcc gccaaggatc tgatggcgca ggggatcaag 2340

ctctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc 2400

aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat 2460

cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt 2520

caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaagac gaggcagcgc ggctatcgtg 2580

gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag 2640

ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc 2700

tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc 2760

tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga 2820

agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga 2880

actgttcgcc aggctcaagg cgagcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg 2940

cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg 3000

tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc 3060

tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc 3120

cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgaa ttattaacgc 3180

ttacaatttc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat 3240

acaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata 3300

cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatagcac 3360

gtgtgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacatg tgtgaaattg ttatccgctc 3420

acaattccac acatgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaca cgtgctaaaa 3480

cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 3540

atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 3600

tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 3660

ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 3720

ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac 3780

cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 3840

gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 3900

gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 3960

acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc 4020

gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 4080

agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 4140

tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 4200

agcaacgcgg cctttttacg gttcctgggc ttttgctggc cttttgctca catgttctt 4259

Claims (42)

1.一种核酸分子，包括：

a.编码组成型启动子的多核苷酸；

b.编码靶分子或靶蛋白的多核苷酸；

c.任选地编码接头的多核苷酸；

d.任选地编码泛素的多核苷酸；

e.任选地编码所述靶蛋白的约7至约25个氨基酸残基片段的多核苷酸；和

f.编码核定位信号的多核苷酸，

其中，序列可操作地彼此连接，并且所述b)和c)的序列以及所述任选的序列d)和e)可操作地彼此连接，以编码包括全长蛋白的氨基酸序列、任选的所述接头的氨基酸序列、任选的泛素的氨基酸序列和所述靶蛋白的约7至约25个氨基酸残基片段的蛋白。

2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包括：

a.编码组成型启动子的多核苷酸；

b.编码靶蛋白的多核苷酸；

c.编码接头的多核苷酸；

d.编码泛素的多核苷酸；

e.编码所述靶蛋白的约7至约25个氨基酸残基片段的多核苷酸；和

f.编码核定位信号的多核苷酸。

3.根据权利要求1所述的核酸分子，其中，所述组成型启动子选自由以下组成的组：EF-1、SV40、劳斯肉瘤病毒和梅森-菲舍猴病毒-CTE。

4.根据权利要求1所述的核酸分子，其中，编码靶蛋白的序列是编码选自由以下组成的组的蛋白的序列：MAGE-A4、MAGE-A2、Gp120、Gag、Nef、Tat、血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、GFP和SEAP。

5.根据权利要求1所述的核酸分子，其中，编码所述靶蛋白片段的序列是编码选自由以下组成的组的蛋白的片段的序列：MAGE-A4、MAGE-A2、Gp120、Gag、Nef、Tat、血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、GFP和SEAP。

6.根据权利要求1所述的核酸分子，其中，编码接头的序列编码甘氨酸-丝氨酸接头。

7.根据权利要求6所述的核酸分子，其中，所述甘氨酸接头包括GGGGS、GGGGA、GGSGS或其任何组合的再次重复。

8.根据权利要求6的所述核酸分子，其中，编码所述甘氨酸-丝氨酸接头的序列编码GGGGS、GGGGA和/或GGSGS的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个重复。

9.根据权利要求1所述的核酸分子，其中，所述泛素是单个泛素蛋白或者2个或更多个泛素蛋白的链。

10.根据权利要求1所述的核酸分子，其中，编码泛素的序列编码选自由以下组成的组的泛素分子：UBB、UBC、UBA52和RPS27A。

11.根据权利要求1所述的核酸分子，其中，编码所述靶蛋白的约7至约25个氨基酸片段的序列通过MHCI或MHCIICD8+免疫细胞或T细胞毒性淋巴细胞引发免疫原性应答。

12.根据权利要求1所述的核酸分子，其中，编码核定位信号的序列是元件1。

13.一种药物组合物，包括权利要求1-11中任一项所述的核酸分子。

14.一种分离的细胞，包括权利要求1-12中任一项所述的核酸分子。

15.一种药物组合物，包括权利要求14所述的细胞。

16.一种在受试者中诱导针对蛋白的免疫应答的方法，所述方法包括将权利要求1-12中任一项所述的核酸序列引入到所述受试者的细胞中或所述受试者中，并且所述核酸序列由所述受试者中的细胞摄取。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，通过电穿孔、注射、超声处理、转染、转导、基因枪、纳米颗粒、脂质颗粒包围或其他适合于将核酸分子引入到受试者或细胞中的施用方式将所述核酸序列引入到所述细胞或受试者中。

18.根据权利要求16所述的方法，其中，所述组织选自由以下组成的组：皮肤、肌肉、肺、乳房、结肠、前列腺、卵巢和肾。

19.根据权利要求16所述的方法，其中，编码所述靶蛋白片段的所述序列通过MHCI或MHCIICD8+免疫细胞或T细胞毒性淋巴细胞引发免疫原性应答。

20.一种在受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括将权利要求1-12中任一项所述的核酸序列引入到受试者的细胞中，并且所述核酸序列由所述受试者中的细胞摄取，其中蛋白是在癌细胞中过表达的蛋白。

21.根据权利要求20所述的方法，其中，通过电穿孔、注射、超声处理、转染、转导或如本文所述将所述核酸序列引入到所述细胞中。

22.根据权利要求20所述的方法，其中，所述组织选自由以下组成的组：皮肤、肌肉、肺、乳房、结肠、前列腺、卵巢和肾脏。

23.根据权利要求20所述的方法，其中，所述癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、三阴性乳腺癌、子宫癌、前列腺癌、卵巢癌和结直肠癌。

24.一种在受试者中治疗感染原的方法，所述方法包括将权利要求1-12中任一项所述的核酸序列引入到所述受试者的细胞中，并且所述核酸序列由所述受试者中的细胞摄取，其中所述靶蛋白是由所述感染原表达的蛋白。

25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述感染原选自由HIV或流行性感冒组成的组。

26.根据权利要求25所述的方法，其中，由所述感染原表达的所述蛋白是Gp120、Gag、Nef、Tat、血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)等。

27.一种核酸分子，包括：

编码组成型启动子的多核苷酸；

编码靶分子的多核苷酸；和

编码核定位信号的多核苷酸；

其中所述启动子和所述靶分子可操作地彼此连接。

28.根据权利要求27所述的核酸分子，其中，所述组成型启动子选自由以下组成的组：EF-1、SV40、劳斯肉瘤病毒和梅森-菲舍猴病毒-CTE。

29.根据权利要求27所述的核酸分子，其中，编码所述靶分子的序列是编码选自由以下组成的组的蛋白或分子的序列：CFTR、MAGE-A4、MAGE-A2、Gp120、Gag、Nef、Tat、血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、胰岛素、谷氨酸或生长调节miRNA、GFP和SEAP。

30.根据权利要求27所述的核酸分子，其中，编码所述靶分子的序列是编码选自由以下组成的组的分子的片段的序列：MAGE-A4、MAGE-A2、Gp120、Gag、Nef、Tat、血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、GFP和SEAP。

31.根据权利要求27所述的核酸分子，其中，编码所述靶分子的序列是编码siRNA、shRNA、miRNA或反义分子的序列。

32.根据权利要求27所述的核酸分子，其中，编码核定位信号的序列是元件1。

33.一种宿主细胞，包括权利要求27-32中任一项所述的核酸分子。

34.一种药物组合物，包括权利要求33所述的宿主细胞。

35.一种药物组合物，包括权利要求27-32中任一项所述的核酸分子。

36.根据权利要求1所述的核酸分子，其中，所述核酸分子是质粒。

37.根据权利要求1所述的核酸分子，其中，所述核酸分子是非整合质粒。

38.根据权利要求27所述的核酸分子，其中，所述核酸分子是质粒。

39.根据权利要求27所述的核酸分子，其中，所述核酸分子是非整合质粒。

40.一种将分子递送到细胞的方法，所述方法包括使细胞与权利要求1-12或27-32中任一项所述的核酸序列接触到受试者的细胞中或所述受试者中，并且所述核酸序列由所述受试者中的细胞摄取。

41.根据权利要求40所述的方法，其中，通过电穿孔、注射、超声处理、转染、转导、基因枪、纳米颗粒、脂质颗粒包围或其他适合于将核酸分子引入到受试者或细胞中的施用方式将所述核酸序列引入到所述细胞或受试者中。

42.根据权利要求40或41所述的方法，其中，所述细胞选自由以下组成的组：皮肤、肌肉、肺、乳房、结肠、前列腺、卵巢和肾细胞。

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