KR20160030317A - 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 dna 재조합 모 플라스미드, 상기 발현 카세트를 갖는 미니서클 dna 및 용도 - Google Patents

유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 dna 재조합 모 플라스미드, 상기 발현 카세트를 갖는 미니서클 dna 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드 및 상기 플라스미드의 제조 방법, 상기 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA, 상기 DNA의 제조 방법 및 이의 용도, 및 상기 미니서클 DNA를 갖는 숙주 세포, 상기 세포의 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 유전자 조작된 항체, 이의 제조 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드, 상기 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 및 용도{MINICIRCLE DNA RECOMBINANT PARENTAL PLASMID HAVING GENETICALLY ENGINEERED ANTIBODY GENE EXPRESSION CASSETTE, A MINICIRCLE DNA HAVING THE EXPRESSION CASSETTE, AND APPLICATIONS}
본 출원은 2013년 8월 6일자로 출원되고 본원에 전체 내용이 참고로 인용된, "유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드, 상기 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 및 용도(Minicircle DNA Recombinant Parental Plasmid Having Genetically Engineered Antibody Gene Expression Cassette, A Minicircle DNA Having the Expression Cassette, and Applications)" 란 발명의 명칭을 갖는 중국 출원 제 201310339305.0 호에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명은 생명공학 분야, 특히 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드, 이의 제조 방법 및 용도, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA, 이의 제조 방법 및 용도, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 숙주 세포 및 이의 용도, 및 유전자 조작된 항체, 및 이의 발현 방법 및 용도에 관한 것이다.
임상 실무에서, 재조합 항체는 암 및 자가면역 질환을 비롯한 다양한 질환을 치료하기 위해 사용되어 왔다. 현재, 유전자 조작된 항체는 일반적으로 시험관내 생산된 후, 치료를 위해 신체 내에 주입된다. 그러나, 상기 접근법은 다음과 같은 많은 단점을 갖는다: (1) 생산, 포장, 수송 등의 고비용; (2) 단백질 항체 약제의 낮은 순도, 오염물에 의해 야기된 부작용, 잠재적인 안전성 위험; (3) 항체가 이의 짧은 반감기로 인해 반복적으로 주입되어야 하는 점. 때때로, 마이크로펌프 투여를 통해 생체 내에서 효과적인 농도를 유지해야 하는데, 이것이 임상 실무에서 항체를 적용하는 것을 더 어렵게 만든다.
단백질 항체 약제의 직접 주입에 의해 야기되는 문제들을 배제하기 위한 효과적인 한 방법은 치료용 유전자로 인간 표적 세포를 형질감염시키는 것이고, 이것은 유전자 치료로 알려져 있다. 유전자 치료에서, 효과적인 벡터를 통한 발현을 위해 표적 유전자를 효과적으로 안전하게 숙주 세포에 전달하는 것이 매우 중요하다. 임상 실무에 사용되는 벡터는 주로 재조합 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 플라스미드 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터는 높은 형질감염률을 갖지만, 생산 비용이 높고, 삽입 돌연변이유발 및 면역원성의 위험은 환자에서 발암 및 치명적인 면역 반응의 위험을 초래할 것이다. 전통적인 바이러스 벡터 플라스미드 벡터는 바이러스 벡터보다 안전하지만, 형질감염률이 더 낮다. 또한, 외인성 유전자는 일시적으로만 발현될 수 있다. 외인성 유전자의 안정하고 지속적인 발현을 원한다면, 벡터가, 삽입 돌연변이유발 및 외인성 유전자 침묵 가능성을 갖는 숙주 세포 염색체 내에 통합되어야 한다. 또한, 전통적인 플라스미드 벡터는 세균 복제 서열, 저항성 유전자 및 비메틸화 CpG 유전자 서열과 같은 일부 숨겨진 신호를 함유하는데, 이들은 플라스미드 복제에 필수적이고 유전자 치료에서 심각한 생물학적 안전성 문제를 야기할 수 있다.
이를 고려하여, 본 발명의 첫 번째 양태는 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드를 제공하고, 이때 상기 미니서클 DNA 모 플라스미드는 숙주 균주에서 미니서클 DNA의 재조합 과정을 완료시켜 원핵 플라스미드 요소를 배제시킨다.
본 발명의 두 번째 양태는 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 세 번째 양태는, 숙주 세포 게놈 DNA와 분리되어 유전자 조작된 항체 유전자의 안정하고 지속적인 발현을 제공하는, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA를 제공한다.
본 발명의 네 번째 양태는 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 다섯 번째 양태는 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA를 함유하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 여섯 번째 양태는 유전자 조작된 항체를 제공한다.
본 발명의 일곱 번째 양태는 유전자 조작된 항체의 발현 방법을 제공한다.
본 발명의 여덟 번째 양태는 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드의 용도, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA의 용도, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA를 함유하는 숙주 세포의 용도, 및 유전자 조작된 항체의 용도를 제공한다.
첫 번째 양태에서, 본 발명은 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드를 제공하고, 이때 상기 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드는 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트의 유전자 서열을 미니서클 DNA 빈(empty) 플라스미드의 다중 클로닝 부위에 삽입함으로써 수득되고, 상기 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트는 유전자 조작된 항체 유전자를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "미니서클 DNA 빈 플라스미드"는 부위-특이적 재조합 부위를 갖는 플라스미드 벡터를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 유전자 조작 연구에서 "플라스미드 벡터"는 외인성 DNA를 삽입하는 것이 가능하고 수용 세포에서 복제될 수 있는 DNA 구조물을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "플라스미드" 및 "플라스미드 벡터"는 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드"는 부위-특이적 재조합 부위를 갖고, "미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드"는 부위-특이적 재조합 부위의 부위-특이적 재조합을 통해 미니서클 DNA 및 주쇄 DNA를 생성할 수 있는 재조합 모 플라스미드를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드" 및 "미니서클 DNA 모 플라스미드"는 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "미니서클 DNA"는, 주로 초나선형(superhelical) 구조로 존재하고 원핵 플라스미드 주쇄 DNA 서열이 없는 벡터를 말한다. 인간 및 포유동물 세포의 염색체 DNA를 함유하지 않는 미니서클 DNA는 전사 또는 표적 유전자의 안정하고 지속적인 발현을 제공할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "표적 유전자"는 바람직하게는 유전자 조작된 항체 유전자이고, 유전자 조작된 항체 유전자는 유전자 조작된 항체를 암호화하는 유전자이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "미니서클 DNA" 및 "미니서클 DNA 벡터"는 상호교환적으로 사용된다.
바이러스 벡터 및 플라스미드 벡터와 비교하여, 미니서클 DNA는, 세균으로부터 유래된 주쇄 DNA 서열의 제거로 인해 시험관내 또는 생체내 염증 발생 및 유전자 발현 침묵의 가능성을 감소시켜, 보다 장기적이고 더 강한 발현을 제공한다. 또한, 미니서클 DNA에서 저항성 마커 유전자 및 복제 기점을 비롯한 세균 서열의 결여로 인해 임상 안전성이 개선된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "주쇄 DNA 서열"은 표준 플라스미드에서 세균 플라스미드의 복제를 수행하거나 플라스미드를 함유하는 숙주를 선별하는 DNA 서열을 갖는다. 상기 DNA 서열은 세균 복제 서열, 저항성 유전자 및 비메틸화 CpG 유전자 서열 등을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "주쇄 DNA" 및 "주쇄 DNA 벡터"는 상호교환적으로 사용된다.
바람직한 태양에서, 미니서클 DNA 모 플라스미드는 숙주 세포 내로 형질전환되고, 유도 후에, 상기 미니서클 DNA 모 플라스미드는 부위-특이적 재조합 부위의 부위-특이적 재조합 사건을 통해 미니서클 DNA 및 주쇄 DNA를 생성한다.
바람직하게, 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)이다.
바람직하게, 부위-특이적 재조합 부위는 phiC31 부위-특이적 재조합 부위, parA 부위-특이적 재조합 부위 또는 Cre 부위-특이적 재조합 부위이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "부위-특이적 재조합"은 바람직하게는 문헌[Hu Chunsheng, etc. in "Letters in Biotechnology (22 (1): 104-109 (2011))"]에 보고된 phiC31(φC31) 재조합효소(recombinase) 시스템, parA 재조합효소 시스템 또는 Cre 재조합효소 시스템을 사용한다.
바람직하게, 주쇄 DNA는 하나 이상의 DNA 엔도뉴클레아제 부위를 함유한다.
더 바람직하게, DNA 엔도뉴클레아제는 I-Sce1 엔도뉴클레아제이다.
상기 바람직한 조건 하에서, 주쇄 DNA는 숙주 세포에서 DNA 엔도뉴클레아제에 의해 절단되고 분해됨으로써, 미니서클 DNA의 정제를 촉진할 수 있다. 또한, 비-재조합 미니서클 DNA 모 플라스미드도 또한 DNA 엔도뉴클레아제 부위를 가지기 때문에, 마찬가지로 숙주 세포에서 DNA 엔도뉴클레아제에 의해 절단되고 분해될 수 있다.
다른 바람직한 태양에서, 미니서클 DNA를 제조하기 위해 phiC31 재조합효소가 사용되고, 이때 미니서클 DNA 빈 플라스미드의 부위-특이적 재조합 부위는 attB 및 attP 부위이다. 바람직한 attB 및 attP 부위는 phiC31 재조합효소에 의해 인식될 수 있는 최소 인식 서열이다(attB, attP 최소 인식 서열은 서열번호 31 및 서열번호 32로 제시된다).
또 다른 바람직한 태양에서, 본원에서 제조된 미니서클 DNA 모 플라스미드는 attB 및 attP 부위를 갖고, attB 및 attP 부위는 주쇄 DNA와 미니서클 DNA의 뉴클레오티드 서열 사이에 존재한다.
특히, attB 및 attP 부위는 φC31 재조합효소의 존재 하에서 재조합되어, 미니서클 모 플라스미드가 attL 부위를 함유하는 플라스미드 주쇄 DNA 및 attR 부위를 함유하는 미니서클 DNA를 비가역적으로 생성할 수 있게 한다.
당해 분야에 숙련된 자라면 필요한 대로 적절한 재조합효소 시스템을 선택할 수 있고, 상응하는 재조합효소를 발현할 수 있는 적절한 숙주 균주를 선택할 수 있고, 상응하는 부위-특이적 재조합 부위를 갖는 미니서클 DNA 빈 벡터를 제조할 수 있다.
바람직하게, φC31 재조합효소 발현 카세트는 미니서클 DNA 빈 플라스미드 또는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드 상에 위치하고, 미니서클 DNA 제조시 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드에 의해 발현될 수 있다.
바람직하게, φC31 재조합효소 발현 카세트는 숙주 세포 유전자에 위치하고 숙주 세포에 의해 발현될 수 있다.
바람직하게, 미니서클 DNA 빈 플라스미드는 p2φC31 플라스미드 또는 pMC.BESPX 플라스미드이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "p2φC31 빈 플라스미드"는 φC31 재조합효소의 존재 하에서 재조합될 수 있는 attB 및 attP 부위를 갖는다.
특히, 빈 플라스미드 p2φC31의 제조 방법은 문헌[Chen ZY et al., Molecular Therapy, 8 (3), 495-500 (2003)]; 문헌[Chen ZY, et al., Human Gene Therapy, 16 (1), 126-131 (2005)] 및 미국 특허 제 7,897,380 B2 호에서 찾을 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "pMC.BESPX 빈 플라스미드"는 φC31 재조합효소의 존재 하에서 재조합될 수 있는 attB 및 attP 부위를 갖는다.
특히, 빈 플라스미드 pMC.BESPX 및 완전 게놈 서열의 제조 방법은 문헌[Chen ZY et al., Nature Biotechnology, 28, (12), 1289-1291 (2010)]에서 찾을 수 있다.
본 발명의 바람직한 태양에서 사용되는 p2φC31 플라스미드 및 pMC.BESPX 플라스미드는, p2φC31 벡터가 φC31 재조합효소 및 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 반면, pMC.BESPX 벡터가 φC31 재조합효소 및 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖지 않으므로, pMC.BESPX 벡터를 사용하여 제조된 미니서클 DNA 모 플라스미드가 더 우수한 질을 갖고 재조합효소 및 엔도뉴클레아제의 뉴클레오티드 서열의 오염을 감소시킨다는 점에서 상이하다. 그러나, pMC.BESPX 벡터는 φC31 재조합효소 및 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 기능을 갖는 에스케리키아 콜라이 ZYCY10P3S2T 조작된 세균과 함께 사용되어야 한다. φC31 재조합효소(즉, phiC31 재조합효소) 및 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖지 않는 pMC.BESPX는 생체내 부위-특이적 재조합을 야기하고(에스케리키아 콜라이 TOP 10은 상기 기능을 갖지 않는다) 궁극적으로 미니서클 DNA를 생성하도록 ZYCY10P3S2T 조작된 세균과 함께 사용되어야 한다. 따라서, p2φC31 벡터는 TOP 10에서 부위-특이적 재조합을 야기하고 궁극적으로 미니서클 DNA를 생성하도록 TOP 10과 함께 사용되어야 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체 유전자"는 유전자 조작된 항체를 암호화하고, 상기 유전자 조작된 항체는 천연 항체 및 재조합 항체를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체 유전자"는 유전자 조작된 항체를 암호화하고, 상기 유전자 조작된 항체는 인간 및 뮤린 항체를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체 유전자"는 유전자 조작된 항체를 암호화하고, 상기 유전자 조작된 항체는 치료 항체를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체 유전자"는 유전자 조작된 항체를 암호화하고, 상기 유전자 조작된 항체는 단일 표적화 항체, 이중-표적화 항체 또는 다중-표적화 항체일 수 있다.
"표적화"란, 항체가 항원에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. "이중-표적화"란, 항체가 2개의 항원 특이적 결합 부위를 갖는 것을 의미한다. "다중-표적화"란, 항체가 2개보다 많은 항원 특이적 결합 부위를 갖는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "주쇄 DNA" 및 "주쇄 DNA 벡터"는 상호교환적으로 사용된다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트는 유전자 조작된 항체 유전자에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 포함한다.
보다 바람직하게, 프로모터는 신호 펩티드의 유전자 서열 및 태그의 유전자 서열 중 하나 이상에 의해 유전자 조작된 항체 유전자에 작동가능하게 연결된다.
보다 더 바람직하게, 신호 펩티드는 면역글로불린 κ쇄 신호 펩티드이다.
보다 더 바람직하게, 태그는 His 태그, GST 태그, c-myc 태그 및 Flag 태그 중 하나 이상이다.
상기 신호 펩티드 및 태그는 본 발명에서 바람직하다. 당해 분야에 숙련된 자라면 필요한 대로 적절한 신호 펩티드 및 표지를 선택할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트"는 표적 폴리펩티드(본 발명에서 유전자 조작된 항체)의 발현에 필요한 모든 필수 요소를 함유하는 유전자 발현 시스템을 말한다. 상기 유전자 발현 시스템은 통상적으로 하기 요소를 포함한다: 프로모터, 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 서열 및 종결자. 또한, 신호 펩티드의 암호화 서열이 선택적으로 포함될 수 있다. 상기 요소는 작동가능하게 연결된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "작동가능하게 연결되는"은 2개 이상의 핵산 영역 또는 핵산 서열의 기능적 배열을 말한다. 예를 들어, 프로모터 영역은, 프로모터 영역이 핵산 서열의 전사를 지향하도록 표적 핵산 서열에 대해 특정한 특이적 위치에 배치되고, 프로모터 영역은 핵산 서열에 "작동가능하게 연결된다".
본 발명의 첫 번째 양태의 바람직한 형태로서, 본 발명은 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드를 제공하고, 이때 상기 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드는 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트의 유전자 서열을 미니서클 DNA 빈 플라스미드의 다중 클로닝 부위 내에 삽입시킴으로써 수득되고, 상기 미니서클 DNA 빈 플라스미드는 p2φC31 플라스미드 또는 pMC.BESPX 플라스미드이고, 상기 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트는 하기 (a) 내지 (g)로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
(a) A-a-B-d-e
(b) A-b-B-d-e
(c) A-B-c-d-e
(d) A-a-b-B-c-d-e
(e) A-a-B-c-d-e
(f) A-a-b-B-d-e
(g) A-b-B-c-d-e
이때,
A는 프로모터를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이고;
B는 유전자 조작된 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이고;
a, b, c, d 및 e는 각각 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열, Flag 태그를 암호화하는 염기 서열, His6 태그를 암호화하는 염기 서열, 정지 코돈 및 폴리A 테일링(tailing) 신호를 나타내고;
"-"는 각각의 염기 서열로 나타낸 유전자 단편 사이에서 "작동가능하게 연결됨"을 나타낸다.
본원에서 사용된 용어 "뉴클레오티드 서열"은 이중-가닥 DNA의 1개 가닥의 유전자 또는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 예를 들어, "유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트는 ...으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다"는 "유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트"가 "...으로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열"의 유전자 단편을 포함하는 것을 의미하는 것으로 이해된다.
DNA는 3,5-포스포다이에스터 결합에 의해 함께 연결되는 4개의 데옥시뉴클레오티드(dAMP, dGMP, dCMT 및 dTMP)로 이루어진 데옥시리보핵산이다. "염기 서열"은 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타내기 위해 사용되는 것으로 이해된다.
본 발명의 첫 번째 양태의 바람직한 형태로서, 본 발명은 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드를 제공하고, 이때 상기 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드는 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트의 유전자 서열을 미니서클 DNA 빈 플라스미드의 다중 클로닝 부위(MCS)에 삽입시킴으로써 수득되고, 상기 미니서클 DNA 빈 플라스미드는 p2φC31 플라스미드 또는 pMC.BESPX 플라스미드이고, 상기 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트는, 순차적으로 연결되는, 프로모터, 면역글로불린 κ쇄 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열, Flag 태그를 암호화하는 염기 서열, 유전자 조작된 항체 유전자, His6 태그를 암호화하는 염기 서열, 정지 코돈 및 폴리A 테일링 신호를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "염기 서열"은 이중-가닥 DNA의 1개 가닥의 유전자 또는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 예를 들어, "유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트는 면역글로불린 κ쇄 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열을 포함한다"는 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트가 "면역글로불린 κ쇄 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열"의 유전자 단편을 포함한다는 것을 의미하는 것으로 이해된다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자는 유전자 조작된 항체를 암호화하는 염기 서열을 갖고, 상기 유전자 조작된 항체는 이중-표적화 특이적 항체이고, 상기 이중-표적화 특이적 항체는 표적화 면역 효과기 세포 항원 에피토프 결합 부위 및 종양 세포 항원 에피토프 결합 부위를 갖는다.
보다 바람직하게, 면역 효과기 세포는 T 림프구, 자연 살해 세포 및 대식세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
더 바람직하게, 종양 세포는 종양 세포의 B 림프구, 백혈병 세포, 폐암 세포, 위암 세포, 대장암 세포, 간암 세포, 식도암 세포, 유방암 세포, 췌장암 세포, 방광암 세포 및 갑상선암 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 바람직한 면역 효과기 세포 및 종양 세포는 사실상 다른 면역 효과기 세포 및 종양 세포의 사용을 제한하지 않는다.
보다 바람직하게, 이중-표적화 특이적 항체는 종양 세포의 하나 이상의 항원 에피토프와 결합한다.
바람직하게, 빈 플라스미드 p2φC31의 제조 방법은 문헌[Chen ZY et al., Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo, Molecular Therapy, 2003, Volume 8, Number 3, 495-500]; 문헌[Chen ZY et al., Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo, Human Gene Therapy, 2005, Volume 16, Number 1, 126-131] 및 미국 특허 제 7,897,380 B2 호에서 찾을 수 있다.
바람직하게, pMC.BESPX 플라스미드의 완전 게놈 서열은 문헌[Chen ZY et al., A robust system for production of minicircle DNA vectors, Nature Biotechnology, 2010, Volume 28, Number 12, 1289-1291]에 기술되어 있다.
바람직하게, 프로모터는 사이토메갈로바이러스 CMV 프로모터, 라우스 육종(Rous sarcoma) 바이러스 RSV 프로모터, 유비퀴틴 UBC 프로모터 및 신장 인자(elongation factor) EF1α 프로모터를 포함한다.
보다 바람직하게, 프로모터는 사이토메갈로바이러스 CMV 프로모터이다.
바람직하게, 사이토메갈로바이러스 CMV 프로모터의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 23에 제시된 서열이다.
본 발명의 프로모터는 진핵 프로모터, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스 CMV, RSV, UBC 및 EF1α 등일 수 있다. 본 발명에서, CMV 프로모터가 미니서클 DNA 모 플라스미드의 제조에 더 바람직하다. 본 발명은 상이한 숙주 세포에 따라 상이한 프로모터를 사용하여 미니서클 DNA 모 플라스미드를 제조한다.
본 발명에 의해 제공된 면역글로불린 κ쇄 신호 펩티드는 유전자 조작된 항체 유전자의 분비에 유리하다.
바람직하게, 면역글로불린 κ쇄 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열은 서열번호 24에 제시된 서열이다.
본 발명에서 제공된 Flag 태그는 유전자 조작된 항체 유전자의 발현에 유리하고, c-myc, 글루타티온-S 트랜스퍼라제(GST), 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 에피토프(HA) 및 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 다른 통상적으로 사용되는 표지보다 더 우수하다.
바람직하게, Flag 태그의 염기 서열은 서열번호 25에 제시된 서열이다.
본 발명에서 제공된 His6 태그는 시험관내 항체의 정제 및 확인에 유리한 6-히스티딘 펩티드이다.
바람직하게, His6 태그의 염기 서열은 서열번호 26에 제시된 서열이다.
본 발명에서 제공된 Flag 태그 및 히스티딘 태그는 각각 유전자 조작된 항체 유전자의 상류 및 하류에 위치한다. 특정한 벡터 제조 과정에서, 이들의 위치는 교환될 수 있다.
바람직하게, 정지 코돈의 염기 서열은 TTA이다.
바람직하게, 폴리A 테일링 신호는 소 성장 호르몬 폴리뉴클레오티드 bpA 또는 SV40이다.
더 바람직하게, 폴리A 테일링 신호는 소 성장 호르몬 폴리뉴클레오티드 bpA이다.
바람직하게, 소 성장 호르몬 폴리뉴클레오티드 bpA의 염기 서열은 서열번호 27에 제시된 서열이다.
본 발명의 폴리A 테일링 신호는 SV40 등일 수 있다. 본 발명에서, bpA 테일링 신호가 미니서클 DNA 모 플라스미드의 제조에 더 바람직하다. 본 발명은 상이한 숙주 세포에 따라 상이한 테일링 신호를 사용하여 미니서클 DNA 모 플라스미드를 제조한다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자는 이중특이적 단일쇄 항체의 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열을 갖고, 상기 이중특이적 단일쇄 항체의 아미노산 서열의 연결 형태는 하기 (a) 내지 (h)로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(a) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
(b) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
(c) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
(d) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
(e) VLCD20-링커1-VHCD20-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
(f) VHCD20-링커1-VLCD20-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
(g) VLCD20-링커1-VHCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
(h) VHCD20-링커1-VLCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
이때,
VLCD19의 아미노산 서열은 서열번호 1에 제시된 서열이고;
VHCD19의 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시된 서열이고;
VLCD3의 아미노산 서열은 서열번호 3 및 서열번호 4에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
VHCD3의 아미노산 서열은 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
링커1의 아미노산 서열은 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
링커2의 아미노산 서열은 서열번호 11에 제시된 서열이고;
VLCD20의 아미노산 서열은 서열번호 29에 제시된 서열이고;
VHCD20의 아미노산 서열은 서열번호 30에 제시된 서열이다.
이하, 염기, 아미노산 서열 및 폴리펩티드 사이에 표시된 기호 "-"는 염기, 아미노산 서열 및 폴리펩티드 사이에서의 순차적 연결을 나타낸다.
바람직하게, 이중특이적 단일쇄 항체의 아미노산 서열은 (a) 내지 (e)로 나타낸 임의의 서열에 대해 95%보다 큰 동일성(바람직하게는 98% 이상)을 나타내는 아미노산 서열이다.
보다 바람직하게, 본 발명에서 제공된 유전자 조작된 항체 유전자는 하기 아미노산 서열을 함유하는 유전자 조작된 항체를 암호화한다:
(a) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3의 아미노산 서열: 서열번호 1-서열번호 9-서열번호 2-서열번호 11-서열번호 4-서열번호 10-서열번호 6
(b) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3의 아미노산 서열: 서열번호 2-서열번호 10-서열번호 1-서열번호 11-서열번호 3-서열번호 8-서열번호 5
(c) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3의 아미노산 서열: 서열번호 1-서열번호 10-서열번호 2-서열번호 11-서열번호 5-서열번호 8-서열번호 3
(d) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3의 아미노산 서열: 서열번호 2-서열번호 8-서열번호 1-서열번호 11-서열번호 7-서열번호 9-서열번호 4
(e) VHCD20-링커1-VLCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3의 아미노산 서열: 서열번호 29-서열번호 10-서열번호 30-서열번호 11-서열번호 7-서열번호 9-서열번호 4
이때,
기호 "-"는 아미노산 서열 사이의 순차적 연결을 나타낸다.
보다 바람직하게, 본 발명의 유전자 조작된 항체 유전자는 하기 염기 서열을 갖는다:
(a') VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 12-서열번호 20-서열번호 13-서열번호 22-서열번호 15-서열번호 21-서열번호 17
(b') VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 13-서열번호 21-서열번호 12-서열번호 22-서열번호 14-서열번호 19-서열번호 16
(c') VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 12-서열번호 21-서열번호 13-서열번호 22-서열번호 16-서열번호 19-서열번호 14
(d') VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 13-서열번호 19-서열번호 12-서열번호 22-서열번호 18-서열번호 20-서열번호 15
(e') VLCD20-링커1-VHCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 33-서열번호 21-서열번호 34-서열번호 22-서열번호 18-서열번호 20-서열번호 15
이때,
서열번호 29(VLCD20의 아미노산 서열)를 암호화하는 염기 서열은 서열번호 33이고;
서열번호 30(VHCD20의 아미노산 서열)을 암호화하는 염기 서열은 서열번호 34이다.
본원에서 (a'), (b'), (c'), (d'), (e') 및 (f')로 나타낸 모든 염기 서열은 2개의 단일-가닥 유전자의 1개 가닥의 뉴클레오티드 서열(DNA 단편)이고, 기호 "-"는 염기 서열 사이의 순차적 연결을 나타낸다.
당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면 뉴클레오티드 서열이 변성되거나 돌연변이될 가능성으로 인해 염기를 조정할 수 있는 것으로 이해된다. 염기의 변화가 코돈에서의 변화를 초래할 것이지만, 코돈에 의해 번역된 아미노산에서의 변화는 야기하지 않을 것이다. 통상적으로 접하는 류신 코돈은 UUA, UUG 및 CUU와 같은 다양한 코돈을 갖는다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자는 (a') 내지 (e')로 나타낸 임의의 서열에 대해 95%보다 큰 동일성(바람직하게는 98% 이상)을 나타내는 염기 서열이다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자는 (a') 내지 (e')로 나타낸 임의의 서열에 대해 95%보다 큰 동일성(바람직하게는 98% 이상)을 나타내는 염기 서열이다. 또한, 유전자 조작된 항체 유전자의 암호화 아미노산 서열은 (a') 내지 (e')로 나타낸 임의의 서열의 암호화 아미노산 서열과 완전히 또는 기본적으로 동일하다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자는 전체 유전자 합성 또는 PCR 클로닝 접근법으로부터 수득된다.
바람직하게, 본 발명의 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드는 이중특이적 단일쇄 항체를 암호화하는 유전자를 갖고, 이때 상기 이중특이적 단일쇄 항체는 4개의 상이한 도메인, 즉 인간 CD19 항원에 결합하는 경쇄의 가변 도메인(VLCD19), 인간 CD19 항원에 결합하는 중쇄의 가변 도메인(VHCD19), 인간 CD3 항원에 결합하는 경쇄의 가변 도메인(VLCD3), 인간 CD3 항원에 결합하는 중쇄의 가변 도메인(VHCD3)을 갖는다. VLCD19, VHCD19, VLCD3 및 VHCD3 폴리펩티드의 암호화 유전자는 항체 라이브러리를 선별하여 수득되고, 이때 VLCD19 및 VHCD19는 인간 CD19 항원에 결합하는 기능성 도메인을 구성하고, VLCD3 및 VHCD3은 인간 CD3 항원에 결합하는 기능성 도메인을 구성하므로, 본 발명의 유전자 조작된 항체는 바람직하게는 항-CD19xCD3 이중특이적 단일쇄 항체(즉, 항-CD19xCD3 BiTE)이다.
바람직하게, 항-CD19xCD3 이중특이적 단일쇄 항체의 바람직한 구조 형태는 다음과 같다: VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3(이때, 링커는 주로 글리신 및 세린으로 구성되는 폴리펩티드 서열을 사용하는 링커 펩티드이다). 글리신은 최소 아미노산이고, 이의 최소 측쇄로 인해 측쇄의 유연성을 증가시킬 수 있다. 가장 친수성 아미노산으로서, 세린은 펩티드 쇄의 친수성을 증가시킬 수 있다.
두 번째로, 본 발명의 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트는 면역글로불린 κ쇄 단일 펩티드를 암호화하는 염기 서열 및 Flag 태그를 암호화하는 염기 서열을 갖고, 이것은 유전자 조작된 항체의 N-말단에 면역글로불린 κ 경쇄 분비 신호 펩티드 및 Flag 태그를 부가하는 것을 가능하게 한다. 이것은 항체가 발현되고 숙주 세포 밖으로 분비되는 것을 보장한다. 또한, His6 태그는 C-말단에 유전자 조작된 항체를 연결시키고, 이것은 니켈 컬럼 친화 크로마토그래피에 의해 항체를 정제하는데 유리하다.
항-CD20xCD3 이중특이적 단일쇄 항체(즉, CD20xCD3 BiTE)는 4개의 상이한 도메인, 즉 인간 CD20 항원에 결합하는 경쇄의 가변 도메인(VLCD20), 인간 CD20 항원에 결합하는 중쇄의 가변 도메인(VHCD20), 인간 CD3 항원에 결합하는 경쇄의 가변 도메인(VLCD3), 인간 CD3 항원에 결합하는 중쇄의 가변 도메인(VLCD20)을 갖는다.
본원에 기술된 염기 서열은 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로 이해된다.
두 번째 양태에서, 본 발명은
(1) 유전자 조작된 항체 유전자를 포함하는 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트의 유전자 서열을 갖는 DNA 단편을 제공하거나 제조하는 단계; 및
(2) 단계 (1)에서 수득된 DNA 단편을 미니서클 DNA 빈 플라스미드의 다중 클로닝 부위 내에 삽입시켜 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드를 수득하는 단계
를 포함하는, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드의 제조 방법을 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "미니서클 DNA 빈 플라스미드"는 부위-특이적 재조합 부위를 갖는 플라스미드 벡터를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 유전자 조작 연구에서 "플라스미드 벡터"는 외인성 DNA를 삽입하는 것이 가능하고 수용 세포에서 복제될 수 있는 DNA 구조물을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "플라스미드" 및 "플라스미드 벡터"는 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드"는 부위-특이적 재조합 부위를 갖고, "미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드"는 부위-특이적 재조합 부위의 부위-특이적 재조합을 통해 미니서클 DNA 및 주쇄 DNA를 생성할 수 있는 재조합 모 플라스미드를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드" 및 "미니서클 DNA 모 플라스미드"는 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "미니서클 DNA"는 주로 초나선형 구조로 존재하고 원핵 플라스미드 주쇄 DNA 서열이 없는 벡터를 말한다. 인간 및 포유동물 세포의 염색체 DNA를 함유하지 않는 미니서클 DNA는 전사 또는 표적 유전자의 안정하고 지속적인 발현을 제공할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "표적 유전자"는 바람직하게는 유전자 조작된 항체 유전자이고, 상기 유전자 조작된 항체 유전자는 유전자 조작된 항체를 암호화하는 유전자이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "미니서클 DNA" 및 "미니서클 DNA 벡터"는 상호교환적으로 사용된다.
바이러스 벡터 및 플라스미드 벡터와 비교하여, 미니서클 DNA는, 세균으로부터 유래된 주쇄 DNA 서열의 제거로 인해 시험관내 또는 생체내 염증 발생 및 유전자 발현 침묵의 가능성을 감소시키므로, 보다 장기적이고 더 강한 발현을 제공한다. 또한, 미니서클 DNA에서 저항성 마커 유전자 및 복제 기점을 비롯한 세균 서열의 결여로 인해 임상 안전성이 개선된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "주쇄 DNA 서열"은 표준 플라스미드에서 세균 플라스미드의 복제를 수행하거나 플라스미드를 함유하는 숙주를 선별하는 DNA 서열을 갖는다. 상기 DNA 서열은 세균 복제 서열, 저항성 유전자, 비메틸화 CpG 유전자 서열 등을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "주쇄 DNA" 및 "주쇄 DNA 벡터"는 상호교환적으로 사용된다.
바람직한 태양에서, 미니서클 DNA 모 플라스미드는 숙주 세포 내로 형질전환되고, 유도 후에, 상기 미니서클 DNA 모 플라스미드는 부위-특이적 재조합 부위의 부위-특이적 재조합 사건을 통해 미니서클 DNA 및 주쇄 DNA를 생성한다.
바람직하게, 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이이다.
바람직하게, 부위-특이적 재조합 부위는 phiC31 부위-특이적 재조합 부위, parA 부위-특이적 재조합 부위 또는 Cre 부위-특이적 재조합 부위이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "부위-특이적 재조합"은 바람직하게는 문헌[Hu Chunsheng, etc. in "Letters in Biotechnology (22 (1): 104-109 (2011))"]에 보고된 phiC31(φC31) 재조합효소 시스템, parA 재조합효소 시스템 또는 Cre 재조합효소 시스템을 사용한다.
바람직하게, 주쇄 DNA는 하나 이상의 DNA 엔도뉴클레아제 부위를 함유한다.
더 바람직하게, DNA 엔도뉴클레아제는 I-Sce1 엔도뉴클레아제이다.
상기 바람직한 조건 하에서, 주쇄 DNA는 숙주 세포에서 DNA 엔도뉴클레아제에 의해 절단되고 분해됨으로써, 미니서클 DNA의 정제를 촉진할 수 있다. 또한, 비-재조합 미니서클 DNA 모 플라스미드도 또한 DNA 엔도뉴클레아제 부위를 가지기 때문에, 마찬가지로 숙주 세포에서 DNA 엔도뉴클레아제에 의해 절단되고 분해될 수 있다.
다른 바람직한 태양에서, 미니서클 DNA를 제조하기 위해 phiC31 재조합효소가 사용되고, 이때 미니서클 DNA 빈 플라스미드의 부위-특이적 재조합 부위는 attB 및 attP 부위이다. 바람직한 attB 및 attP 부위는 phiC31 재조합효소에 의해 인식될 수 있는 최소 인식 서열이다(attB, attP 최소 인식 서열은 서열번호 31 및 서열번호 32로 제시된다).
또 다른 바람직한 태양에서, 본원에서 제조된 미니서클 DNA 모 플라스미드는 attB 및 attP 부위를 갖고, attB 및 attP 부위는 주쇄 DNA와 미니서클 DNA의 뉴클레오티드 서열 사이에 존재한다.
특히, attB 및 attP 부위는 φC31 재조합효소의 존재 하에서 재조합되어, 미니서클 모 플라스미드가 attL 부위를 함유하는 플라스미드 주쇄 DNA 및 attR 부위를 함유하는 미니서클 DNA를 비가역적으로 생성할 수 있게 한다.
당해 분야에 숙련된 자라면 필요한 대로 적절한 재조합효소 시스템을 선택할 수 있고, 상응하는 재조합효소를 발현할 수 있는 적절한 숙주 균주를 선택할 수 있고, 상응하는 부위-특이적 재조합 부위를 갖는 미니서클 DNA 빈 벡터를 제조할 수 있다.
바람직하게, φC31 재조합효소 발현 카세트는 미니서클 DNA 빈 플라스미드 또는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드 상에 위치하고, 미니서클 DNA 제조시 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드에 의해 발현될 수 있다.
바람직하게, φC31 재조합효소 발현 카세트는 숙주 세포 유전자에 위치하고 숙주 세포에 의해 발현될 수 있다.
바람직하게, 미니서클 DNA 빈 플라스미드는 p2φC31 플라스미드 또는 pMC.BESPX 플라스미드이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "p2φC31 빈 플라스미드"는 φC31 재조합효소의 존재 하에서 재조합될 수 있는 attB 및 attP 부위를 갖는다.
특히, 빈 플라스미드 p2φC31의 제조 방법은 문헌[Chen ZY et al., Molecular Therapy, 8(3), 495-500 (2003)]; 문헌[Chen ZY, et al., Human Gene Therapy, 16(1), 126-131 (2005)] 및 미국 특허 제 7,897,380 B2 호에서 찾을 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "pMC.BESPX 빈 플라스미드"는 φC31 재조합효소의 존재 하에서 재조합될 수 있는 attB 및 attP 부위를 갖는다.
특히, 빈 플라스미드 pMC.BESPX 및 완전 게놈 서열의 제조 방법은 문헌[Chen ZY et al., Nature Biotechnology, 28, (12), 1289-1291 (2010)]에서 찾을 수 있다.
본 발명의 바람직한 태양에서 사용되는 p2φC31 플라스미드 및 pMC.BESPX 플라스미드는, p2φC31 벡터가 φC31 재조합효소 및 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 반면, pMC.BESPX 벡터가 φC31 재조합효소 및 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖지 않으므로, pMC.BESPX 벡터를 사용하여 제조된 미니서클 DNA 모 플라스미드가 더 우수한 질을 갖고 재조합효소 및 엔도뉴클레아제의 뉴클레오티드 서열의 오염을 감소시킨다는 점에서 상이하다. 그러나, pMC.BESPX 벡터는 φC31 재조합효소 및 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 기능을 갖는 에스케리키아 콜라이 ZYCY10P3S2T 조작된 세균과 함께 사용되어야 한다. φC31 재조합효소(즉, phiC31 재조합효소) 및 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖지 않는 pMC.BESPX는 생체내 부위-특이적 재조합을 야기하고(에스케리키아 콜라이 TOP 10은 상기 기능을 갖지 않는다) 궁극적으로 미니서클 DNA를 생성하도록 ZYCY10P3S2T 조작된 세균과 함께 사용되어야 한다. 따라서, p2φC31 벡터는 TOP 10에서 부위-특이적 재조합을 야기하고 궁극적으로 미니서클 DNA를 생성하도록 TOP 10과 함께 사용되어야 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체 유전자"는 유전자 조작된 항체를 암호화하고, 상기 유전자 조작된 항체는 천연 항체 및 재조합 항체를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체 유전자"는 유전자 조작된 항체를 암호화하고, 상기 유전자 조작된 항체는 인간 및 뮤린 항체를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체 유전자"는 유전자 조작된 항체를 암호화하고, 상기 유전자 조작된 항체는 치료 항체를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체 유전자"는 유전자 조작된 항체를 암호화하고, 상기 유전자 조작된 항체는 단일 표적화 항체, 이중-표적화 항체 또는 다중-표적화 항체일 수 있다.
"표적화"란, 항체가 항원에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. "이중-표적화"란, 항체가 2개의 항원 특이적 결합 부위를 갖는 것을 의미한다. "다중-표적화"란, 항체가 2개보다 많은 항원 특이적 결합 부위를 갖는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "주쇄 DNA" 및 "주쇄 DNA 벡터"는 상호교환적으로 사용된다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트는 유전자 조작된 항체 유전자에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 포함한다.
보다 바람직하게, 프로모터는 신호 펩티드의 유전자 서열 및 태그의 유전자 서열 중 하나 이상에 의해 유전자 조작된 항체 유전자에 작동가능하게 연결된다.
보다 더 바람직하게, 신호 펩티드는 면역글로불린 κ쇄 신호 펩티드이다.
보다 더 바람직하게, 태그는 His 태그, GST 태그, c-myc 태그 및 Flag 태그 중 하나 이상이다.
상기 신호 펩티드 및 태그는 본 발명에서 바람직하다. 당해 분야에 숙련된 자라면 필요한 대로 적절한 신호 펩티드 및 표지를 선택할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트"는 표적 폴리펩티드(본 발명에서 유전자 조작된 항체)의 발현에 필요한 모든 필수 요소를 함유하는 유전자 발현 시스템을 말한다. 상기 유전자 발현 시스템은 통상적으로 하기 요소를 포함한다: 프로모터, 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 서열 및 종결자. 또한, 신호 펩티드의 암호화 서열이 선택적으로 포함될 수 있다. 상기 요소는 작동가능하게 연결된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "작동가능하게 연결됨"은 2개 이상의 핵산 영역 또는 핵산 서열의 기능적 배열을 말한다. 예를 들어, 프로모터 영역은, 프로모터 영역이 핵산 서열의 전사를 지향하도록 표적 핵산 서열에 대해 특정한 특이적 위치에 배치되고, 프로모터 영역은 핵산 서열에 "작동가능하게 연결된다".
본 발명의 두 번째 양태의 바람직한 형태로서, 본 발명은
(1) 유전자 조작된 항체 유전자를 포함하는 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트의 유전자 서열을 갖는 DNA 단편을 제공하거나 제조하는 단계; 및
(2) 단계 (1)에서 수득된 DNA 단편을 미니서클 DNA 빈 플라스미드의 다중 클로닝 부위 내에 삽입시켜 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드를 수득하는 단계
를 포함하는, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드의 제조 방법을 제공하고, 이때 상기 미니서클 DNA 빈 플라스미드는 p2φC31 플라스미드 또는 pMC.BESPX 플라스미드이고, 상기 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트는 하기 (a) 내지 (g)로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
(a) A-a-B-d-e
(b) A-b-B-d-e
(c) A-B-c-d-e
(d) A-a-b-B-c-d-e
(e) A-a-B-c-d-e
(f) A-a-b-B-d-e
(g) A-b-B-c-d-e
이때,
A는 프로모터를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이고;
B는 유전자 조작된 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이고;
a, b, c, d 및 e는 각각 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열, Flag 태그를 암호화하는 염기 서열, His6 태그를 암호화하는 염기 서열, 정지 코돈 및 폴리A 테일링 신호를 나타내고;
"-"는 각각의 염기 서열로 나타낸 유전자 단편 사이에서 "작동가능하게 연결됨"을 나타낸다.
DNA는 3,5-포스포다이에스터 결합에 의해 함께 연결되는 4개의 데옥시뉴클레오티드(dAMP, dGMP, dCMT 및 dTMP)로 이루어진 데옥시리보핵산이다. "염기 서열"은 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타내기 위해 사용되는 것으로 이해된다.
본 발명의 두 번째 양태의 다른 바람직한 형태로서, 본 발명은
(1) 순차적으로 연결되는, 면역글로불린 κ쇄 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열, Flag 태그를 암호화하는 염기 서열, 유전자 조작된 항체 유전자, His6 태그를 암호화하는 염기 서열 및 정지 코돈을 갖는 DNA 단편을 제공하거나 제조하는 단계;
(2) 단계 (1)에서 수득된 DNA 단편을 발현 벡터의 다중 클로닝 부위 내에 삽입시켜 발현 벡터의 다중 클로닝 부위의 말단에 존재하는 폴리A 테일링 신호, 프로모터 및 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 재조합 발현 벡터를 수득하는 단계; 및
(3) 단계 (2)에서 수득된 재조합 발현 벡터를 2개의 효소로 절단하여 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 함유하는 DNA 단편을 생성하고, 이어서 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 함유하는 DNA 단편을 p2φC31 플라스미드 또는 pMC.BESPX 플라스미드 내에 삽입시켜 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드를 수득하는 단계로서, 상기 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트가, 순차적으로 연결되는, 프로모터, 면역글로불린 κ쇄 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열, Flag 태그를 암호화하는 염기 서열, 유전자 조작된 항체 유전자, His6 태그를 암호화하는 염기 서열, 정지 코돈 및 폴리A 테일링 신호를 포함하는, 단계
를 포함하는, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드의 제조 방법을 제공한다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자는 유전자 조작된 항체를 암호화하는 염기 서열을 갖고, 상기 유전자 조작된 항체는 이중-표적화 특이적 항체이고, 상기 이중-표적화 특이적 항체는 표적화 면역 효과기 세포 항원 에피토프 결합 부위 및 종양 세포 항원 에피토프 결합 부위를 갖는다.
보다 바람직하게, 면역 효과기 세포는 T 림프구, 자연 살해 세포 및 대식세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
더 바람직하게, 종양 세포는 종양 세포의 B 림프구, 백혈병 세포, 폐암 세포, 위암 세포, 대장암 세포, 간암 세포, 식도암 세포, 유방암 세포, 췌장암 세포, 방광암 세포 및 갑상선암 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
보다 바람직하게, 이중-표적화 특이적 항체는 종양 세포의 하나 이상의 항원 에피토프와 결합한다.
바람직하게, 단계 (2)에서, 프로모터 발현 벡터는 사이토메갈로바이러스 CMV 프로모터, 라우스 육종 바이러스 RSV 프로모터, 유비퀴틴 UBC 프로모터 및 신장 인자 EF1α 프로모터를 포함한다.
보다 바람직하게, 단계 (2)에서, 프로모터 발현 벡터는 사이토메갈로바이러스 CMV 프로모터이다.
바람직하게, 단계 (2)에서, 폴리A 테일링 신호 발현 벡터는 소 성장 호르몬 폴리뉴클레오티드 bpA 또는 SV40이다.
더 바람직하게, 단계 (2)에서, 폴리A 테일링 신호 발현 벡터는 소 성장 호르몬 폴리뉴클레오티드 bpA이다.
본 발명의 프로모터는 진핵 프로모터, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스 CMV, RSV, UBC 및 EF1α 등일 수 있다. 본 발명에서, CMV 프로모터가 미니서클 DNA 모 플라스미드의 제조에 더 바람직하다. 본 발명은 상이한 숙주 세포에 따라 상이한 프로모터를 사용하여 미니서클 DNA 모 플라스미드를 제조한다. 본 발명의 폴리A 테일링 신호는 SV40 등일 수 있다. 본 발명에서, bpA 테일링 신호가 미니서클 DNA 모 플라스미드의 제조에 더 바람직하다. 본 발명은 상이한 숙주 세포에 따라 상이한 테일링 신호를 사용하여 미니서클 DNA 모 플라스미드를 제조한다.
바람직하게, 단계 (2)에서, 발현 벡터는 사이토메갈로바이러스 CMV 프로모터 및 소 성장 호르몬 폴리뉴클레오티드 bpA 테일링 신호를 함유한다. 다중 클로닝 부위는 발현 벡터의 CMV와 bpA 사이에 존재하고, 해당 유전자 단편이 삽입될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "다중 클로닝 부위"는, 다중 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 함유하고 외인성 DNA를 위한 다중 삽입 부위 및 분해를 제공하는 벡터의 합성 서열을 말한다.
"해당 유전자 단편"이란 표적화 유전자를 의미한다.
바람직하게, 표적화 유전자는 유전자 조작된 항체를 암호화하는 유전자이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체"는 천연 항체, 항원 및 항원 에피토프, 및 재조합 항체, 항원 및 항원 에피토프를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체"는 인간 및 뮤린 항체를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체 유전자"는 치료 항체를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체 유전자"는 단일 표적화 항체, 이중-표적화 항체 또는 다중-표적화 항체일 수 있다.
"표적화"란, 항체가 항원에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. "이중-표적화"란, 항체가 2개의 항원 특이적 결합 부위를 갖는 것을 의미한다. "다중-표적화"란, 항체가 2개보다 많은 항원 특이적 결합 부위를 갖는 것을 의미한다. 바람직하게, 단계 (2)에서, 발현 벡터는 pCMV.bpA 발현 벡터이다.
본원에 기술된 용어 "pCMV.bpA 발현 벡터"는 대장균(colon bacillus)의 다중 클로닝 부위 내에 삽입되는 유전자 단편을 복제하고 증폭시킬 수 있는 플라스미드 벡터를 말한다. "pCMV.bpA 발현 벡터" 다중 클로닝 부위는 상류에 CMV 프로모터 및 하류에 bpA 테일링 신호를 갖는다.
당해 분야에 숙련된 자라면 필요한 대로 pCMV.bpA의 대체 발현 벡터를 선택할 수 있으므로, 단계 (1)로부터의 DNA 단편의 상류에 상이한 프로모터를 부가할 수 있을 것으로 이해된다.
바람직하게, pCMV.bpA 발현 벡터의 CMV 상류 및 bpA 테일링 신호의 하류는 각각 SpeI 및 OMI 엔도뉴클레아제 부위(도 1-b에 도시됨)를 갖는다. SpeI 및 OMI 엔도뉴클레아제 부위는 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual(제 4 판)]에 기술된 방법에 따라 제조된다. 보다 바람직하게, CMV 프로모터, bpA 테일링 신호, SpeI 및 OMI 엔도뉴클레아제 부위를 함유하는 pCMV.bpA 발현 벡터의 제조 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 빈 플라스미드 벡터를 선택하는 단계; 및 (b) CMV 프로모터 및 bpA 테일링 신호를 상이한 다중 클로닝 부위 내에 삽입시키는 단계로서, 상기 CMV 프로모터와 bpA 테일링 신호 사이에 외인성 유전자를 위한 다중 클로닝 부위가 존재하고, 상기 CMV 프로모터의 상류가 SpeI 엔도뉴클레아제 부위를 갖는 반면, bpA 테일링 신호의 하류가 Psp OMI 엔도뉴클레아제 부위를 갖는, 단계.
본 발명의 바람직한 태양에서, pCMV.bpA 발현 벡터는 SpeI 엔도뉴클레아제 부위 및 Psp OMI 엔도뉴클레아제 부위를 갖는다. SpeI 엔도뉴클레아제 부위와 Psp OMI 엔도뉴클레아제 부위 사이에 CMV 프로모터의 뉴클레오티드 서열 및 bpA 테일링 신호의 뉴클레오티드 서열이 존재한다. CMV 프로모터의 뉴클레오티드 서열과 bpA 테일링 신호의 뉴클레오티드 서열 사이에 HindIII 엔도뉴클레아제 부위 및 EcoRI 엔도뉴클레아제 부위가 존재한다.
본 발명의 다른 바람직한 태양에서, DNA 단편을 제공하거나 제조하는 단계(단계 (1))는 다음을 포함한다:
(1-1) 완전 게놈 서열 또는 PCR 클로닝 접근법을 이용하여 DNA 단편을 합성하는 단계로서, 상기 DNA 단편이, 순차적으로 연결되는, HindIII 효소 부위, 면역글로불린 κ쇄 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열, Flag 태그를 암호화하는 염기 서열, 유전자 조작된 항체 유전자, His6 태그를 암호화하는 염기 서열, 정지 코돈 및 EcoRI 효소를 포함하는, 단계; 및
(1-2) 단계 (1-1)에서 수득된 DNA 단편을 pUC57 벡터의 HindIII 및 EcoRI 부위(플라스미드 지도 도 1-a 참조) 내에 삽입시켜 증폭시키고, 표적 단편을 2개의 효소로 절단하고, DNA 단편을 회수하는 단계.
바람직하게, 단계 (2)에서, 단계 (1)에서 수득된 DNA 단편을 pCMV.bpA 벡터의 HindIII 및 EcoRI 부위 내에 삽입시켜 pCMV.bpA.Bab 재조합 발현 벡터를 수득한다.
바람직하게, 단계 (3)에서, 단계 (2)에서 수득된 재조합 발현 벡터를 2개의 효소로 절단하여 유전자 조작된 항체 유전자 카세트를 갖는 DNA 단편을 수득한다. 유전자 조작된 항체 유전자 카세트를 갖는 DNA 단편을 p2φC31 플라스미드 또는 pMC.BESPX 플라스미드 내에 삽입시키는 단계는 다음을 포함한다:
(1-4) p2φC31 플라스미드 또는 pMC.BESPX 플라스미드를 제공하는 단계;
(1-5) p2φC31 플라스미드 또는 pMC.BESPX 플라스미드를 SpeI 및 Psp OMI 엔도뉴클레아제로 절단하고, 선형 플라스미드를 회수하는 단계;
(1-6) pCMV.bpA.Bab 재조합 발현 벡터를 SpeI 및 Psp OMI 엔도뉴클레아제로 절단하고, 유전자 조작된 항체 유전자 카세트를 갖는 DNA 단편을 회수하는 단계; 및
(1-7) 단계 (1-5)에서 회수된 선형 플라스미드를 DNA 리가제를 사용하여 단계 (1-6)에서 회수된 DNA 단편과 연결시켜 유전자 조작된 항체 유전자 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드 p2φC31.Bab 또는 pMC.Bab를 수득하는 단계로서, 상기 유전자 조작된 항체 유전자 카세트가, 순차적으로 연결되는, 사이토메갈로바이러스 CMV 프로모터, 면역글로불린 κ쇄 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열, Flag 태그를 암호화하는 염기 서열, 유전자 조작된 항체 유전자, His6 태그를 암호화하는 염기 서열, 정지 코돈, 폴리A 테일링 신호, 및 소 성장 호르몬 폴리뉴클레오티드 bpA 테일링 신호를 포함하는, 단계.
바람직하게, 단계 (1-7)에서, DNA 리가제는 T4 DNA 리가제이다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자는 이중특이적 단일쇄 항체의 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열을 갖고, 상기 이중특이적 단일쇄 항체의 아미노산 서열의 연결 형태는 하기 (a) 내지 (h)로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(a) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
(b) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
(c) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
(d) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
(e) VLCD20-링커1-VHCD20-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
(f) VHCD20-링커1-VLCD20-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
(g) VLCD20-링커1-VHCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
(h) VHCD20-링커1-VLCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
이때,
VLCD19의 아미노산 서열은 서열번호 1에 제시된 서열이고;
VHCD19의 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시된 서열이고;
VLCD3의 아미노산 서열은 서열번호 3 및 서열번호 4에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
VHCD3의 아미노산 서열은 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
링커1의 아미노산 서열은 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
링커2의 아미노산 서열은 서열번호 11에 제시된 서열이고;
VLCD20의 아미노산 서열은 서열번호 29에 제시된 서열이고;
VHCD20의 아미노산 서열은 서열번호 30에 제시된 서열이다.
바람직하게, 이중특이적 단일쇄 항체의 아미노산 서열은 (a) 내지 (e)로 나타낸 임의의 서열에 대해 95%보다 큰 동일성(바람직하게는 98% 이상)을 나타내는 아미노산 서열이다.
보다 바람직하게, 본 발명에서 제공된 유전자 조작된 항체 유전자는 하기 아미노산 서열을 함유하는 유전자 조작된 항체를 암호화한다:
(a) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3의 아미노산 서열: 서열번호 1-서열번호 9-서열번호 2-서열번호 11-서열번호 4-서열번호 10-서열번호 6
(b) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3의 아미노산 서열: 서열번호 2-서열번호 10-서열번호 1-서열번호 11-서열번호 3-서열번호 8-서열번호 5
(c) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3의 아미노산 서열: 서열번호 1-서열번호 10-서열번호 2-서열번호 11-서열번호 5-서열번호 8-서열번호 3
(d) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3의 아미노산 서열: 서열번호 2-서열번호 8-서열번호 1-서열번호 11-서열번호 7-서열번호 9-서열번호 4
(e) VHCD20-링커1-VLCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3의 아미노산 서열: 서열번호 29-서열번호 10-서열번호 30-서열번호 11-서열번호 7-서열번호 9-서열번호 4
이때,
기호 "-"는 아미노산 서열 사이의 순차적 연결을 나타낸다.
보다 바람직하게, 본 발명의 유전자 조작된 항체 유전자는 하기 염기 서열을 갖는다:
(a') VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 12-서열번호 20-서열번호 13-서열번호 22-서열번호 15-서열번호 21-서열번호 17
(b') VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 13-서열번호 21-서열번호 12-서열번호 22-서열번호 14-서열번호 19-서열번호 16
(c') VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 12-서열번호 21-서열번호 13-서열번호 22-서열번호 16-서열번호 19-서열번호 14
(d') VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 13-서열번호 19-서열번호 12-서열번호 22-서열번호 18-서열번호 20-서열번호 15
(e') VLCD20-링커1-VHCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 33-서열번호 21-서열번호 34-서열번호 22-서열번호 18-서열번호 20-서열번호 15
이때,
서열번호 29(VLCD20의 아미노산 서열)를 암호화하는 염기 서열은 서열번호 33이고;
서열번호 30(VHCD20의 아미노산 서열)을 암호화하는 염기 서열은 서열번호 34이다.
본원에서 (a'), (b'), (c'), (d'), (e') 및 (f')로 나타낸 모든 염기 서열은 2개의 단일-가닥 유전자의 1개 가닥의 뉴클레오티드 서열(DNA 단편)이고, 기호 "-"는 염기 서열 사이의 순차적 연결을 나타낸다.
당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면 뉴클레오티드 서열이 변성되거나 돌연변이될 가능성으로 인해 염기를 조정할 수 있는 것으로 이해된다. 염기의 변화는 코돈에서의 변화를 초래할 것이지만, 코돈에 의해 번역된 아미노산에서의 변화는 야기하지 않을 것이다. 통상적으로 접하는 류신 코돈은 UUA, UUG 및 CUU와 같은 다양한 코돈을 갖는다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자는 (a') 내지 (e')로 나타낸 임의의 서열에 대해 95%보다 큰 동일성(바람직하게는 98% 이상)을 나타내는 염기 서열이다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자는 (a') 내지 (e')로 나타낸 임의의 서열에 대해 95%보다 큰 동일성(바람직하게는 98% 이상)을 나타내는 염기 서열이다. 또한, 유전자 조작된 항체 유전자의 암호화 아미노산 서열은 (a') 내지 (e')로 나타낸 임의의 서열의 암호화 아미노산 서열과 완전히 또는 기본적으로 동일하다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자는 전체 유전자 합성 또는 PCR 클로닝 접근법으로부터 수득된다.
바람직하게, 본 발명의 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드는 이중특이적 단일쇄 항체를 암호화하는 유전자를 갖고, 이때 상기 이중특이적 단일쇄 항체는 4개의 상이한 도메인, 즉 인간 CD19 항원에 결합하는 경쇄의 가변 도메인(VLCD19), 인간 CD19 항원에 결합하는 중쇄의 가변 도메인(VHCD19), 인간 CD3 항원에 결합하는 경쇄의 가변 도메인(VLCD3), 인간 CD3 항원에 결합하는 중쇄의 가변 도메인(VHCD3)을 갖는다. VLCD19, VHCD19, VLCD3 및 VHCD3 폴리펩티드의 암호화 유전자는 항체 라이브러리를 선별하여 수득되고, 이때 VLCD19 및 VHCD19는 인간 CD19 항원에 결합하는 기능성 도메인을 구성하고, VLCD3 및 VHCD3은 인간 CD3 항원에 결합하는 기능성 도메인을 구성하므로, 본 발명의 유전자 조작된 항체는 바람직하게는 항-CD19xCD3 이중특이적 단일쇄 항체(즉, 항-CD19xCD3 BiTE)이다.
바람직하게, 항-CD19xCD3 이중특이적 단일쇄 항체의 바람직한 구조 형태는 다음과 같다: VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3(이때, 링커는 주로 글리신 및 세린으로 구성되는 폴리펩티드 서열을 사용하는 링커 펩티드이다). 글리신은 최소 아미노산이고, 이의 최소 측쇄로 인해 측쇄의 유연성을 증가시킬 수 있다. 가장 친수성 아미노산으로서, 세린은 펩티드 쇄의 친수성을 증가시킬 수 있다.
두 번째로, 본 발명의 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트는 면역글로불린 κ쇄 단일 펩티드를 암호화하는 염기 서열 및 Flag 태그를 암호화하는 염기 서열을 갖고, 이것은 유전자 조작된 항체의 N-말단에 면역글로불린 κ 경쇄 분비 신호 펩티드 및 Flag 태그를 부가하는 것을 가능하게 한다. 이것은 항체가 발현되고 숙주 세포 밖으로 분비되는 것을 보장한다. 또한, His6 태그는 C-말단에 유전자 조작된 항체를 연결시키고, 이것은 니켈 컬럼 친화 크로마토그래피에 의해 항체를 정제하는데 유리하다.
항-CD20xCD3 이중특이적 단일쇄 항체(즉, CD20xCD3 BiTE)는 4개의 상이한 도메인, 즉 인간 CD20 항원에 결합하는 경쇄의 가변 도메인(VLCD20), 인간 CD20 항원에 결합하는 중쇄의 가변 도메인(VHCD20), 인간 CD3 항원에 결합하는 경쇄의 가변 도메인(VLCD3), 인간 CD3 항원에 결합하는 중쇄의 가변 도메인(VLCD20)을 갖는다.
본원에 기술된 염기 서열은 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로 이해된다.
본 발명의 p2φC31 플라스미드 및 pMC.BESPX 플라스미드는, p2φC31 벡터가 φC31 재조합효소 및 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 반면, pMC.BESPX 벡터가 φC31 재조합효소 및 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖지 않으므로, pMC.BESPX 벡터를 사용하여 제조된 미니서클 DNA 모 플라스미드가 더 우수한 질을 갖고 재조합효소 및 엔도뉴클레아제의 뉴클레오티드 서열의 오염을 감소시킨다는 점에서 상이하다. 그러나, pMC.BESPX 벡터는 φC31 재조합효소 및 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 기능을 갖는 에스케리키아 콜라이 ZYCY10P3S2T 조작된 세균과 함께 사용되어야 한다. φC31 재조합효소(즉, phiC31 재조합효소) 및 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖지 않는 pMC.BESPX는 생체내 부위-특이적 재조합을 야기하고(에스케리키아 콜라이 TOP 10은 상기 기능을 갖지 않는다) 궁극적으로 미니서클 DNA를 생성하도록 ZYCY10P3S2T 조작된 세균과 함께 사용되어야 한다. 따라서, p2φC31 벡터는 TOP 10에서 부위-특이적 재조합을 야기하고 궁극적으로 미니서클 DNA를 생성하도록 TOP 10과 함께 사용되어야 한다.
바람직하게, 본 발명의 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA는 암을 위한 약제에 사용될 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA는 CD19 양상 암 질환을 위한 약제에 사용될 수 있다.
세 번째 양태에서, 본 발명은 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA를 제공하고, 이때 상기 미니서클 DNA는 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 원형 DNA이고, 상기 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트는 유전자 조작된 항체 유전자를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "미니서클 DNA"는 주로 초나선형 구조로 존재하고 원핵 플라스미드 주쇄 DNA 서열이 없는 벡터를 말한다. 인간 및 포유동물 세포의 염색체 DNA를 함유하지 않는 미니서클 DNA는 전사 또는 표적 유전자의 안정하고 지속적인 발현을 제공할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "미니서클 DNA" 및 "미니서클 DNA 벡터"는 상호교환적으로 사용된다.
바이러스 벡터 및 플라스미드 벡터와 비교하여, 미니서클 DNA는, 세균으로부터 유래된 주쇄 DNA 서열의 제거로 인해 시험관내 또는 생체내 염증 발생 및 유전자 발현 침묵의 가능성을 감소시켜, 보다 장기적이고 더 강한 발현을 제공한다. 또한, 미니서클 DNA에서 저항성 마커 유전자 및 복제 기점을 비롯한 세균 서열의 결여로 인해 임상 안전성이 개선된다.
바람직한 태양에서, 미니서클 DNA는 부위-특이적 재조합 부위의 부위-특이적 재조합을 통해 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드로부터 생성된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드는 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트의 유전자 서열을 미니서클 DNA 빈 플라스미드의 다중 클로닝 부위 내에 삽입시킴으로써 수득되고, 상기 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트는 유전자 조작된 항체 유전자를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "미니서클 DNA 빈 플라스미드"는 부위-특이적 재조합 부위를 갖는 플라스미드 벡터를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 유전자 조작 연구에서 "플라스미드 벡터"는 외인성 DNA를 삽입하는 것이 가능하고 수용체 세포에서 복제될 수 있는 DNA 구조물을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "플라스미드" 및 "플라스미드 벡터"는 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드"는 부위-특이적 재조합 부위를 갖고, "미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드"는 부위-특이적 재조합 부위의 부위-특이적 재조합을 통해 미니서클 DNA 및 주쇄 DNA를 생성할 수 있는 재조합 모 플라스미드를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드" 및 "미니서클 DNA 모 플라스미드"는 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "주쇄 DNA 서열"은 표준 플라스미드에서 세균 플라스미드의 복제를 수행하거나 플라스미드를 함유하는 숙주를 선별하는 DNA 서열을 갖는다. 상기 DNA 서열은 세균 복제 서열, 저항성 유전자, 비메틸화 CpG 유전자 서열 등을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "주쇄 DNA" 및 "주쇄 DNA 벡터"는 상호교환적으로 사용된다.
바람직한 태양에서, 미니서클 DNA 모 플라스미드는 숙주 세포 내로 형질전환되고, 유도 후에, 상기 미니서클 DNA 모 플라스미드는 부위-특이적 재조합 부위의 부위-특이적 재조합 사건을 통해 미니서클 DNA 및 주쇄 DNA를 생성한다.
바람직하게, 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이이다.
바람직하게, 부위-특이적 재조합 부위는 phiC31 부위-특이적 재조합 부위, parA 부위-특이적 재조합 부위 또는 Cre 부위-특이적 재조합 부위이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "부위-특이적 재조합"은 바람직하게는 문헌[Hu Chunsheng, etc. in "Letters in Biotechnology (22 (1): 104-109 (2011))"]에 보고된 phiC31(φC31) 재조합효소 시스템, parA 재조합효소 시스템 또는 Cre 재조합효소 시스템을 사용한다.
바람직하게, 주쇄 DNA는 하나 이상의 DNA 엔도뉴클레아제 부위를 함유한다.
더 바람직하게, DNA 엔도뉴클레아제는 I-Sce1 엔도뉴클레아제이다.
상기 바람직한 조건 하에서, 주쇄 DNA는 숙주 세포에서 DNA 엔도뉴클레아제에 의해 절단되고 분해됨으로써, 미니서클 DNA의 정제를 촉진할 수 있다. 또한, 비-재조합 미니서클 DNA 모 플라스미드도 또한 DNA 엔도뉴클레아제 부위를 가지기 때문에, 마찬가지로 숙주 세포에서 DNA 엔도뉴클레아제에 의해 절단되고 분해될 수 있다.
다른 바람직한 태양에서, 미니서클 DNA를 제조하기 위해 phiC31 재조합효소가 사용되고, 이때 미니서클 DNA 빈 플라스미드의 부위-특이적 재조합 부위는 attB 및 attP 부위이다. 바람직한 attB 및 attP 부위는 phiC31 재조합효소에 의해 인식될 수 있는 최소 인식 서열이다(attB, attP 최소 인식 서열은 서열번호 31 및 서열번호 32로 제시된다).
또 다른 바람직한 태양에서, 본원에서 제조된 미니서클 DNA 모 플라스미드는 attB 및 attP 부위를 갖고, attB 및 attP 부위는 주쇄 DNA와 미니서클 DNA의 뉴클레오티드 서열 사이에 존재한다.
특히, attB 및 attP 부위는 φC31 재조합효소의 존재 하에서 재조합되어, 미니서클 모 플라스미드가 attL 부위를 함유하는 플라스미드 주쇄 DNA 및 attR 부위를 함유하는 미니서클 DNA를 비가역적으로 생성할 수 있게 한다.
당해 분야에 숙련된 자라면 필요한 대로 적절한 재조합효소 시스템을 선택할 수 있고, 상응하는 재조합효소를 발현할 수 있는 적절한 숙주 균주를 선택할 수 있고, 상응하는 부위-특이적 재조합 부위를 갖는 미니서클 DNA 빈 벡터를 제조할 수 있다.
바람직하게, φC31 재조합효소 발현 카세트는 미니서클 DNA 빈 플라스미드 또는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드 상에 위치하고, 미니서클 DNA 제조시 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드에 의해 발현될 수 있다.
바람직하게, φC31 재조합효소 발현 카세트는 숙주 세포 유전자에 위치하고 숙주 세포에 의해 발현될 수 있다.
바람직하게, 미니서클 DNA 빈 플라스미드는 p2φC31 플라스미드 또는 pMC.BESPX 플라스미드이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "p2φC31 빈 플라스미드"는 φC31 재조합효소의 존재 하에서 재조합될 수 있는 attB 및 attP 부위를 갖는다.
특히, 빈 플라스미드 p2φC31의 제조 방법은 문헌[Chen ZY et al., Molecular Therapy, 8(3), 495-500 (2003)]; 문헌[Chen ZY, et al., Human Gene Therapy, 16(1), 126-131 (2005)] 및 미국 특허 제 7,897,380 B2 호에서 찾을 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "pMC.BESPX 빈 플라스미드"는 φC31 재조합효소의 존재 하에서 재조합될 수 있는 attB 및 attP 부위를 갖는다.
특히, 빈 플라스미드 pMC.BESPX 및 완전 게놈 서열의 제조 방법은 문헌[Chen ZY et al., Nature Biotechnology, 28, (12), 1289-1291 (2010)]에서 찾을 수 있다.
본 발명의 바람직한 태양에서 사용되는 p2φC31 플라스미드 및 pMC.BESPX 플라스미드는, p2φC31 벡터가 φC31 재조합효소 및 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 반면, pMC.BESPX 벡터가 φC31 재조합효소 및 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖지 않으므로, pMC.BESPX 벡터를 사용하여 제조된 미니서클 DNA 모 플라스미드가 더 우수한 질을 갖고 재조합효소 및 엔도뉴클레아제의 뉴클레오티드 서열의 오염을 감소시킨다는 점에서 상이하다. 그러나, pMC.BESPX 벡터는 φC31 재조합효소 및 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 기능을 갖는 에스케리키아 콜라이 ZYCY10P3S2T 조작된 세균과 함께 사용되어야 한다. φC31 재조합효소(즉, phiC31 재조합효소) 및 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖지 않는 pMC.BESPX는 생체내 부위-특이적 재조합을 야기하고(에스케리키아 콜라이 TOP 10은 상기 기능을 갖지 않는다) 궁극적으로 미니서클 DNA를 생성하도록 ZYCY10P3S2T 조작된 세균과 함께 사용되어야 한다. 따라서, p2φC31 벡터는 TOP 10에서 부위-특이적 재조합을 야기하고 궁극적으로 미니서클 DNA를 생성하도록 TOP 10과 함께 사용되어야 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체 유전자"는 유전자 조작된 항체를 암호화하고, 상기 유전자 조작된 항체는 천연 항체 및 재조합 항체를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체 유전자"는 유전자 조작된 항체를 암호화하고, 상기 유전자 조작된 항체는 인간 및 뮤린 항체를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체 유전자"는 유전자 조작된 항체를 암호화하고, 상기 유전자 조작된 항체는 치료 항체를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체 유전자"는 유전자 조작된 항체를 암호화하고, 상기 유전자 조작된 항체는 단일 표적화 항체, 이중-표적화 항체 또는 다중-표적화 항체일 수 있다.
"표적화"란, 항체가 항원에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. "이중-표적화"란, 항체가 2개의 항원 특이적 결합 부위를 갖는 것을 의미한다. "다중-표적화"란, 항체가 2개보다 많은 항원 특이적 결합 부위를 갖는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "주쇄 DNA" 및 "주쇄 DNA 벡터"는 상호교환적으로 사용된다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트는 유전자 조작된 항체 유전자에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 포함한다.
보다 바람직하게, 프로모터는 신호 펩티드의 유전자 서열 및 태그의 유전자 서열 중 하나 이상에 의해 유전자 조작된 항체 유전자에 작동가능하게 연결된다.
보다 더 바람직하게, 신호 펩티드는 면역글로불린 κ쇄 신호 펩티드이다.
보다 더 바람직하게, 태그는 His 태그, GST 태그, c-myc 태그 및 Flag 태그 중 하나 이상이다.
상기 신호 펩티드 및 태그는 본 발명에서 바람직하다. 당해 분야에 숙련된 자라면 필요한 대로 적절한 신호 펩티드 및 표지를 선택할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트"는 표적 폴리펩티드(본 발명에서 유전자 조작된 항체)의 발현에 필요한 모든 필수 요소를 함유하는 유전자 발현 시스템을 말한다. 상기 유전자 발현 시스템은 통상적으로 하기 요소를 포함한다: 프로모터, 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 서열 및 종결자. 또한, 신호 펩티드의 암호화 서열이 선택적으로 포함될 수 있다. 상기 요소는 작동가능하게 연결된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "작동가능하게 연결됨"은 2개 이상의 핵산 영역 또는 핵산 서열의 기능적 배열을 말한다. 예를 들어, 프로모터 영역은, 프로모터 영역이 핵산 서열의 전사를 지향하도록 표적 핵산 서열에 대해 특정한 특이적 위치에 배치되고, 프로모터 영역은 핵산 서열에 "작동가능하게 연결된다".
본 발명의 세 번째 양태의 바람직한 형태로서, 본 발명은 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA를 제공하고, 이때 상기 미니서클 DNA는 attR 부위 및 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 원형 DNA이고, 상기 유전자 발현 카세트는 하기 (a) 내지 (g)로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
(a) A-a-B-d-e
(b) A-b-B-d-e
(c) A-B-c-d-e
(d) A-a-b-B-c-d-e
(e) A-a-B-c-d-e
(f) A-a-b-B-d-e
(g) A-b-B-c-d-e
이때,
A는 프로모터를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이고;
B는 유전자 조작된 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이고;
a, b, c, d 및 e는 각각 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열, Flag 태그를 암호화하는 염기 서열, His6 태그를 암호화하는 염기 서열, 정지 코돈 및 폴리A 테일링 신호를 나타내고;
"-"는 각각의 염기 서열로 나타낸 유전자 단편 사이에서 "작동가능하게 연결됨"을 나타낸다.
DNA는 3,5-포스포다이에스터 결합에 의해 함께 연결되는 4개의 데옥시뉴클레오티드(dAMP, dGMP, dCMT 및 dTMP)로 이루어진 데옥시리보핵산이다. "염기 서열"은 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타내기 위해 사용되는 것으로 이해된다.
본 발명의 세 번째 양태의 바람직한 형태로서, 본 발명은 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA를 제공하고, 이때 상기 미니서클 DNA는 attR 부위 및 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 원형 DNA이고, 상기 유전자 발현 카세트는, 순차적으로 연결되는, 프로모터, 면역글로불린 κ쇄 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열, Flag 태그를 암호화하는 염기 서열, 유전자 조작된 항체 유전자, His6 태그를 암호화하는 염기 서열, 정지 코돈 및 폴리A 테일링 신호를 포함한다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자는 유전자 조작된 항체를 암호화하는 염기 서열을 갖고, 상기 유전자 조작된 항체는 이중-표적화 특이적 항체이고, 상기 이중-표적화 특이적 항체는 표적화 면역 효과기 세포 항원 에피토프 결합 부위 및 종양 세포 항원 에피토프 결합 부위를 갖는다.
보다 바람직하게, 면역 효과기 세포는 T 림프구, 자연 살해 세포 및 대식세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
더 바람직하게, 종양 세포는 종양 세포의 B 림프구, 백혈병 세포, 폐암 세포, 위암 세포, 대장암 세포, 간암 세포, 식도암 세포, 유방암 세포, 췌장암 세포, 방광암 세포 및 갑상선암 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
보다 바람직하게, 이중-표적화 특이적 항체는 종양 세포의 하나 이상의 항원 에피토프와 결합한다.
바람직하게, 프로모터는 사이토메갈로바이러스 CMV 프로모터, RSV 프로모터, UBC 프로모터 및 EF1α 프로모터를 포함한다.
보다 바람직하게, 프로모터는 사이토메갈로바이러스 CMV 프로모터이다.
바람직하게, 폴리A 테일링 신호는 소 성장 호르몬 폴리뉴클레오티드 bpA 또는 SV40이다.
더 바람직하게, 폴리A 테일링 신호는 소 성장 호르몬 폴리뉴클레오티드 bpA이다.
본 발명의 프로모터는 진핵 프로모터, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스 CMV, RSV, UBC 및 EF1α 등일 수 있다. 본 발명에서, CMV 프로모터가 미니서클 DNA의 제조에 더 바람직하다. 본 발명은 상이한 숙주 세포에 따라 상이한 프로모터를 사용하여 미니서클 DNA를 제조한다. 본 발명의 폴리A 테일링 신호는 SV40 등일 수 있다. 본 발명에서, bpA 테일링 신호가 미니서클 DNA의 제조에 더 바람직하다. 본 발명은 상이한 숙주 세포에 따라 상이한 테일링 신호를 사용함으로써 미니서클 DNA를 제조한다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자는 이중특이적 단일쇄 항체의 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열을 갖고, 이중특이적 단일쇄 항체 유전자는 이중특이적 단일쇄 항체의 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열을 갖고, 상기 이중특이적 단일쇄 항체의 아미노산 서열의 연결 형태는 하기 (a) 내지 (h)로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(a) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
(b) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
(c) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
(d) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
(e) VLCD20-링커1-VHCD20-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
(f) VHCD20-링커1-VLCD20-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
(g) VLCD20-링커1-VHCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
(h) VHCD20-링커1-VLCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
이때,
VLCD19의 아미노산 서열은 서열번호 1에 제시된 서열이고;
VHCD19의 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시된 서열이고;
VLCD3의 아미노산 서열은 서열번호 3 및 서열번호 4에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
VHCD3의 아미노산 서열은 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
링커1의 아미노산 서열은 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
링커2의 아미노산 서열은 서열번호 11에 제시된 서열이고;
VLCD20의 아미노산 서열은 서열번호 29에 제시된 서열이고;
VHCD20의 아미노산 서열은 서열번호 30에 제시된 서열이다.
바람직하게, 이중특이적 단일쇄 항체의 아미노산 서열은 (a) 내지 (e)로 나타낸 임의의 서열에 대해 95%보다 큰 동일성(바람직하게는 98% 이상)을 나타내는 아미노산 서열이다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA는 숙주 균주에서 부위-특이적 재조합을 통해 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드로부터 생성된다.
바람직하게, attR 부위의 염기 서열은 서열번호 28에 제시된 서열이다.
보다 바람직하게, 본 발명에서 제공된 유전자 조작된 항체 유전자는 하기 아미노산 서열을 함유하는 유전자 조작된 항체를 암호화한다:
(a) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3의 아미노산 서열: 서열번호 1-서열번호 9-서열번호 2-서열번호 11-서열번호 4-서열번호 10-서열번호 6
(b) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3의 아미노산 서열: 서열번호 2-서열번호 10-서열번호 1-서열번호 11-서열번호 3-서열번호 8-서열번호 5
(c) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3의 아미노산 서열: 서열번호 1-서열번호 10-서열번호 2-서열번호 11-서열번호 5-서열번호 8-서열번호 3
(d) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3의 아미노산 서열: 서열번호 2-서열번호 8-서열번호 1-서열번호 11-서열번호 7-서열번호 9-서열번호 4
(e) VHCD20-링커1-VLCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3의 아미노산 서열: 서열번호 29-서열번호 10-서열번호 30-서열번호 11-서열번호 7-서열번호 9-서열번호 4
이때,
기호 "-"는 아미노산 서열 사이의 순차적 연결을 나타낸다.
보다 바람직하게, 본 발명의 유전자 조작된 항체 유전자는 하기 염기 서열을 갖는다:
(a') VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 12-서열번호 20-서열번호 13-서열번호 22-서열번호 15-서열번호 21-서열번호 17
(b') VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 13-서열번호 21-서열번호 12-서열번호 22-서열번호 14-서열번호 19-서열번호 16
(c') VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 12-서열번호 21-서열번호 13-서열번호 22-서열번호 16-서열번호 19-서열번호 14
(d') VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 13-서열번호 19-서열번호 12-서열번호 22-서열번호 18-서열번호 20-서열번호 15
(e') VLCD20-링커1-VHCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 33-서열번호 21-서열번호 34-서열번호 22-서열번호 18-서열번호 20-서열번호 15
이때,
서열번호 29(VLCD20의 아미노산 서열)를 암호화하는 염기 서열은 서열번호 33이고;
서열번호 30(VHCD20의 아미노산 서열)을 암호화하는 염기 서열은 서열번호 34이다.
본원에서 (a'), (b'), (c'), (d'), (e') 및 (f')로 나타낸 모든 염기 서열은 2개의 단일-가닥 유전자의 1개 가닥의 뉴클레오티드 서열(DNA 단편)이고, 기호 "-"는 염기 서열 사이의 순차적 연결을 나타낸다.
당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면 뉴클레오티드 서열이 변성되거나 돌연변이될 가능성으로 인해 염기를 조정할 수 있는 것으로 이해된다. 염기의 변화는 코돈에서의 변화를 초래할 것이지만, 코돈에 의해 번역된 아미노산에서의 변화는 야기하지 않을 것이다. 통상적으로 접하는 류신 코돈은 UUA, UUG 및 CUU와 같은 다양한 코돈을 갖는다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자는 (a') 내지 (e')로 나타낸 임의의 서열에 대해 95%보다 큰 동일성(바람직하게는 98% 이상)을 나타내는 염기 서열이다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자는 (a') 내지 (e')로 나타낸 임의의 서열에 대해 95%보다 큰 동일성(바람직하게는 98% 이상)을 나타내는 염기 서열이다. 또한, 유전자 조작된 항체 유전자의 암호화 아미노산 서열은 (a') 내지 (e')로 나타낸 임의의 서열의 암호화 아미노산 서열과 완전히 또는 기본적으로 동일하다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자는 전체 유전자 합성 또는 PCR 클로닝 접근법으로부터 수득된다.
바람직하게, 본 발명의 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드는 이중특이적 단일쇄 항체를 암호화하는 유전자를 갖고, 이때 상기 이중특이적 단일쇄 항체는 4개의 상이한 도메인, 즉 인간 CD19 항원에 결합하는 경쇄의 가변 도메인(VLCD19), 인간 CD19 항원에 결합하는 중쇄의 가변 도메인(VHCD19), 인간 CD3 항원에 결합하는 경쇄의 가변 도메인(VLCD3), 인간 CD3 항원에 결합하는 중쇄의 가변 도메인(VHCD3)을 갖는다. VLCD19, VHCD19, VLCD3 및 VHCD3 폴리펩티드의 암호화 유전자는 항체 라이브러리를 선별하여 수득되고, 이때 VLCD19 및 VHCD19는 인간 CD19 항원에 결합하는 기능성 도메인을 구성하고, VLCD3 및 VHCD3은 인간 CD3 항원에 결합하는 기능성 도메인을 구성하므로, 본 발명의 유전자 조작된 항체는 바람직하게는 항-CD19xCD3 이중특이적 단일쇄 항체(즉, 항-CD19xCD3 BiTE)이다.
바람직하게, 항-CD19xCD3 이중특이적 단일쇄 항체의 바람직한 구조 형태는 다음과 같다: VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3(이때, 링커는 주로 글리신 및 세린으로 구성되는 폴리펩티드 서열을 사용하는 링커 펩티드이다). 글리신은 최소 아미노산이고, 이의 최소 측쇄로 인해 측쇄의 유연성을 증가시킬 수 있다. 가장 친수성 아미노산으로서, 세린은 펩티드 쇄의 친수성을 증가시킬 수 있다.
두 번째로, 본 발명의 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트는 면역글로불린 κ쇄 단일 펩티드를 암호화하는 염기 서열 및 Flag 태그를 암호화하는 염기 서열을 갖고, 이것은 유전자 조작된 항체의 N-말단에 면역글로불린 κ 경쇄 분비 신호 펩티드 및 Flag 태그를 부가하는 것을 가능하게 한다. 이것은 항체가 발현되고 숙주 세포 밖으로 분비되는 것을 보장한다. 또한, His6 태그는 C-말단에 유전자 조작된 항체를 연결시키고, 이것은 니켈 컬럼 친화 크로마토그래피에 의해 항체를 정제하는데 유리하다.
항-CD20xCD3 이중특이적 단일쇄 항체(즉, CD20xCD3 BiTE)는 4개의 상이한 도메인, 즉 인간 CD20 항원에 결합하는 경쇄의 가변 도메인(VLCD20), 인간 CD20 항원에 결합하는 중쇄의 가변 도메인(VHCD20), 인간 CD3 항원에 결합하는 경쇄의 가변 도메인(VLCD3), 인간 CD3 항원에 결합하는 중쇄의 가변 도메인(VLCD3)을 갖는다.
본원에 기술된 염기 서열은 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로 이해된다.
전통적인 플라스미드 벡터와 비교하여, 본 발명의 유전자 조작된 항체를 갖는 미니서클 DNA는, 미니서클 DNA에서 저항성 마커 유전자 및 복제 기점을 비롯한 세균 서열의 결여로 인해 임상 안전성을 개선시키므로, 임상 안전성을 개선하고 유전자 조작된 항체 유전자의 보다 장기적이고 더 강한 발현을 제공한다. 바이러스 벡터와 비교하여, 삽입 돌연변이유발 및 면역원성의 위험을 갖지 않는 미니서클 DNA는 비용이 적게 든다. 그러므로, 본 발명의 유전자 조작된 항체를 함유하는 미니서클 DNA는 일종의 안전하고, 효과적이고 경제적인 치료 벡터이다.
네 번째 양태에서, 본 발명은
(1) 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드를 제공하거나 제조하는 단계로서, 상기 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드가 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트의 유전자 서열을 미니서클 DNA 빈 플라스미드의 다중 클로닝 부위 내에 삽입함으로써 수득되고 부위-특이적 재조합 부위를 갖는, 단계;
(2) 단계 (1)에서 수득된 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드로 숙주 균주를 형질전환시켜, 재조합효소의 존재 하에서 부위-특이적 재조합 부위의 부위-특이적 재조합을 통해 미니서클 DNA 및 주쇄 DNA를 생성하는 단계; 및
(3) 단계 (2)에서 수득된 미니서클 DNA 및 주쇄 DNA를 단리하고 정제하는 단계로서, 상기 미니서클 DNA가 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 원형 DNA이고, 상기 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트가 유전자 조작된 항체 유전자를 포함하는
유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA의 제조 방법을 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "미니서클 DNA"는 주로 초나선형 구조로 존재하고 원핵 플라스미드 주쇄 DNA 서열이 없는 벡터를 말한다. 인간 및 포유동물 세포의 염색체 DNA를 함유하지 않는 미니서클 DNA는 전사 또는 표적 유전자의 안정하고 지속적인 발현을 제공할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "미니서클 DNA" 및 "미니서클 DNA 벡터"는 상호교환적으로 사용된다.
바이러스 벡터 및 플라스미드 벡터와 비교하여, 미니서클 DNA는, 세균으로부터 유래된 주쇄 DNA 서열의 제거로 인해 시험관내 또는 생체내 염증 발생 및 유전자 발현 침묵의 가능성을 감소시켜, 보다 장기적이고 더 강한 발현을 제공한다. 또한, 미니서클 DNA에서 저항성 마커 유전자 및 복제 기점을 비롯한 세균 서열의 결여로 인해 임상 안전성이 개선된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드는 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트의 유전자 서열을 미니서클 DNA 빈 플라스미드의 다중 클로닝 부위 내에 삽입시킴으로써 수득되고, 상기 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트는 유전자 조작된 항체 유전자를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "미니서클 DNA 빈 플라스미드"는 부위-특이적 재조합 부위를 갖는 플라스미드 벡터를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 유전자 조작 연구에서 "플라스미드 벡터"는 외인성 DNA를 삽입하는 것이 가능하고 수용 세포에서 복제될 수 있는 DNA 구조물을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "플라스미드" 및 "플라스미드 벡터"는 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드"는 부위-특이적 재조합 부위를 갖고, "미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드"는 부위-특이적 재조합 부위의 부위-특이적 재조합을 통해 미니서클 DNA 및 주쇄 DNA를 생성할 수 있는 재조합 모 플라스미드를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드" 및 "미니서클 DNA 모 플라스미드"는 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "주쇄 DNA 서열"은 표준 플라스미드에서 세균 플라스미드의 복제를 수행하거나 플라스미드를 함유하는 숙주를 선별하는 DNA 서열을 갖는다. 상기 DNA 서열은 세균 복제 서열, 저항성 유전자, 비메틸화 CpG 유전자 서열 등을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "주쇄 DNA" 및 "주쇄 DNA 벡터"는 상호교환적으로 사용된다.
세균 또는 진균류가 숙주 세포로 사용되는 경우, "숙주 세포" 및 "숙주 균주"는 상호교환적으로 사용된다.
바람직하게, 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이이다.
바람직하게, 부위-특이적 재조합 부위는 phiC31 부위-특이적 재조합 부위, parA 부위-특이적 재조합 부위 또는 Cre 부위-특이적 재조합 부위이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "부위-특이적 재조합"은 바람직하게는 문헌[Hu Chunsheng, etc. in "Letters in Biotechnology (22 (1): 104-109 (2011))"]에 보고된 phiC31(φC31) 재조합효소 시스템, parA 재조합효소 시스템 또는 Cre 재조합효소 시스템을 사용한다.
바람직하게, 주쇄 DNA는 하나 이상의 DNA 엔도뉴클레아제 부위를 함유한다.
더 바람직하게, DNA 엔도뉴클레아제는 I-Sce1 엔도뉴클레아제이다.
상기 바람직한 조건 하에서, 주쇄 DNA는 숙주 세포에서 DNA 엔도뉴클레아제에 의해 절단되고 분해됨으로써, 미니서클 DNA의 정제를 촉진할 수 있다. 또한, 비-재조합 미니서클 DNA 모 플라스미드도 또한 DNA 엔도뉴클레아제 부위를 가지기 때문에, 마찬가지로 숙주 세포에서 DNA 엔도뉴클레아제에 의해 절단되고 분해될 수 있다.
또 다른 바람직한 태양에서, 미니서클 DNA를 제조하기 위해 phiC31 재조합효소가 사용되고, 이때 미니서클 DNA 빈 플라스미드의 부위-특이적 재조합 부위는 attB 및 attP 부위이다. 바람직한 attB 및 attP 부위는 phiC31 재조합효소에 의해 인식될 수 있는 최소 인식 서열이다(attB, attP 최소 인식 서열은 서열번호 31 및 서열번호 32로 제시된다).
또 다른 바람직한 태양에서, 본원에서 제조된 미니서클 DNA 모 플라스미드는 attB 및 attP 부위를 갖고, attB 및 attP 부위는 주쇄 DNA와 미니서클 DNA의 뉴클레오티드 서열 사이에 존재한다.
특히, attB 및 attP 부위는 φC31 재조합효소의 존재 하에서 재조합되어, 미니서클 모 플라스미드가 attL 부위를 함유하는 플라스미드 주쇄 DNA 및 attR 부위를 함유하는 미니서클 DNA를 비가역적으로 생성할 수 있게 한다.
당해 분야에 숙련된 자라면 필요한 대로 적절한 재조합효소 시스템을 선택할 수 있고, 상응하는 재조합효소를 발현할 수 있는 적절한 숙주 균주를 선택할 수 있고, 상응하는 부위-특이적 재조합 부위를 갖는 미니서클 DNA 빈 벡터를 제조할 수 있다.
바람직하게, φC31 재조합효소 발현 카세트는 미니서클 DNA 빈 플라스미드 또는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드 상에 위치하고, 미니서클 DNA 제조시 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드에 의해 발현될 수 있다.
바람직하게, φC31 재조합효소 발현 카세트는 숙주 세포 유전자에 위치하고 숙주 세포에 의해 발현될 수 있다.
바람직하게, 미니서클 DNA 빈 플라스미드는 p2φC31 플라스미드 또는 pMC.BESPX 플라스미드이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "p2φC31 빈 플라스미드"는 φC31 재조합효소의 존재 하에서 재조합될 수 있는 attB 및 attP 부위를 갖는다.
특히, 빈 플라스미드 p2φC31의 제조 방법은 문헌[Chen ZY et al., Molecular Therapy, 8(3), 495-500 (2003)]; 문헌[Chen ZY, et al., Human Gene Therapy, 16(1), 126-131 (2005)] 및 미국 특허 제 7,897,380 B2 호에서 찾을 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "pMC.BESPX 빈 플라스미드"는 φC31 재조합효소의 존재 하에서 재조합될 수 있는 attB 및 attP 부위를 갖는다.
특히, 빈 플라스미드 pMC.BESPX 및 완전 게놈 서열의 제조 방법은 문헌[Chen ZY et al., Nature Biotechnology, 28, (12), 1289-1291 (2010)]에서 찾을 수 있다.
본 발명의 바람직한 태양에서 사용되는 p2φC31 플라스미드 및 pMC.BESPX 플라스미드는, p2φC31 벡터가 φC31 재조합효소 및 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 반면, pMC.BESPX 벡터가 φC31 재조합효소 및 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖지 않으므로, pMC.BESPX 벡터를 사용하여 제조된 미니서클 DNA 모 플라스미드가 더 우수한 질을 갖고 재조합효소 및 엔도뉴클레아제의 뉴클레오티드 서열의 오염을 감소시킨다는 점에서 상이하다. 그러나, pMC.BESPX 벡터는 φC31 재조합효소 및 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 기능을 갖는 에스케리키아 콜라이 ZYCY10P3S2T 조작된 세균과 함께 사용되어야 한다. φC31 재조합효소(즉, phiC31 재조합효소) 및 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖지 않는 pMC.BESPX는 생체내 부위-특이적 재조합을 야기하고(에스케리키아 콜라이 TOP 10은 상기 기능을 갖지 않는다) 궁극적으로 미니서클 DNA를 생성하도록 ZYCY10P3S2T 조작된 세균과 함께 사용되어야 한다. 따라서, p2φC31 벡터는 TOP 10에서 부위-특이적 재조합을 야기하고 궁극적으로 미니서클 DNA를 생성하도록 TOP 10과 함께 사용되어야 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체 유전자"는 유전자 조작된 항체를 암호화하고, 상기 유전자 조작된 항체는 천연 항체 및 재조합 항체를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체 유전자"는 유전자 조작된 항체를 암호화하고, 상기 유전자 조작된 항체는 인간 및 뮤린 항체를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체 유전자"는 유전자 조작된 항체를 암호화하고, 상기 유전자 조작된 항체는 치료 항체를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체 유전자"는 유전자 조작된 항체를 암호화하고, 상기 유전자 조작된 항체는 단일 표적화 항체, 이중-표적화 항체 또는 다중-표적화 항체일 수 있다.
"표적화"란, 항체가 항원에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. "이중-표적화"란, 항체가 2개의 항원 특이적 결합 부위를 갖는 것을 의미한다. "다중-표적화"란, 항체가 2개보다 많은 항원 특이적 결합 부위를 갖는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "주쇄 DNA" 및 "주쇄 DNA 벡터"는 상호교환적으로 사용된다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트는 유전자 조작된 항체 유전자에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 포함한다.
보다 바람직하게, 프로모터는 신호 펩티드의 유전자 서열 및 태그의 유전자 서열 중 하나 이상에 의해 유전자 조작된 항체 유전자에 작동가능하게 연결된다.
보다 더 바람직하게, 신호 펩티드는 면역글로불린 κ쇄 신호 펩티드이다.
보다 더 바람직하게, 태그는 His 태그, GST 태그, c-myc 태그 및 Flag 태그 중 하나 이상이다.
상기 신호 펩티드 및 태그는 본 발명에서 바람직하다. 당해 분야에 숙련된 자라면 필요한 대로 적절한 신호 펩티드 및 표지를 선택할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트"는 표적 폴리펩티드(본 발명에서 유전자 조작된 항체)의 발현에 필요한 모든 필수 요소를 함유하는 유전자 발현 시스템을 말한다. 상기 유전자 발현 시스템은 통상적으로 하기 요소를 포함한다: 프로모터, 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 서열 및 종결자. 또한, 신호 펩티드의 암호화 서열이 선택적으로 포함될 수 있다. 상기 요소는 작동가능하게 연결된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "작동가능하게 연결됨"은 2개 이상의 핵산 영역 또는 핵산 서열의 기능적 배열을 말한다. 예를 들어, 프로모터 영역은, 프로모터 영역이 핵산 서열의 전사를 지향하도록 표적 핵산 서열에 대해 특정한 특이적 위치에 배치되고, 프로모터 영역은 핵산 서열에 "작동가능하게 연결된다".
본 발명의 네 번째 양태의 바람직한 형태로서, 본 발명은 부위-특이적 재조합 부위가 attB 및 attP 부위인, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA의 제조 방법을 제공하고, 상기 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트는 하기 (a) 내지 (g)로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
(a) A-a-B-d-e
(b) A-b-B-d-e
(c) A-B-c-d-e
(d) A-a-b-B-c-d-e
(e) A-a-B-c-d-e
(f) A-a-b-B-d-e
(g) A-b-B-c-d-e
이때,
A는 프로모터를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이고;
B는 유전자 조작된 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이고;
a, b, c, d 및 e는 각각 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열, Flag 태그를 암호화하는 염기 서열, His6 태그를 암호화하는 염기 서열, 정지 코돈 및 폴리A 테일링 신호를 나타내고;
"-"는 각각의 염기 서열로 나타낸 유전자 단편 사이에서 "작동가능하게 연결됨"을 나타낸다.
DNA는 3,5-포스포다이에스터 결합에 의해 함께 연결되는 4개의 데옥시뉴클레오티드(dAMP, dGMP, dCMT 및 dTMP)로 이루어진 데옥시리보핵산이다. "염기 서열"은 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타내기 위해 사용되는 것으로 이해된다.
본 발명의 네 번째 양태의 다른 바람직한 형태로서, 본 발명은
(1) 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드를 제공하거나 제조하는 단계로서, 상기 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드가 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트의 유전자 서열을 미니서클 DNA 빈 플라스미드의 다중 클로닝 부위 내에 삽입함으로써 수득되고, 상기 미니서클 DNA 빈 플라스미드가 p2φC31 플라스미드 또는 pMC.BESPX 플라스미드이고, 상기 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트가, 순차적으로 연결되는, 프로모터, 면역글로불린 κ쇄 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열, Flag 태그를 암호화하는 염기 서열, 유전자 조작된 항체 유전자, His6 태그를 암호화하는 염기 서열, 정지 코돈 및 폴리A 테일링 신호를 포함하는, 단계;
(2) 단계 (1)에서 수득된 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드로 숙주 균주를 형질전환시켜, φC31 재조합효소의 존재 하에서 attL 부위를 함유하는 세균 플라스미드 DNA 및 attR 부위를 함유하는 미니서클 DNA를 비-가역적으로 생성하는 단계; 및
(3) attL 부위를 함유하고 단계 (2)에서 수득된 세균 플라스미드 DNA를 I-Sce 엔도뉴클레아제로 절단하여 선형 DNA 단편을 생성하고, 플라스미드가 숙주 균주에서 분해된 후에, attR 부위를 함유하는 미니서클 DNA를 통상적인 플라스미드 정제 키트를 사용하여 정제하는 단계로서, 상기 미니서클 DNA가 attR 부위 및 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 원형 DNA이고, 상기 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트가, 순차적으로 연결되는, 프로모터, 면역글로불린 κ쇄 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열, Flag 태그를 암호화하는 염기 서열, 유전자 조작된 항체 유전자, His6 태그를 암호화하는 염기 서열, 정지 코돈 및 폴리A 테일링 신호를 포함하는, 단계
를 포함하는, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA의 제조 방법을 제공한다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자는 유전자 조작된 항체를 암호화하는 염기 서열을 갖고, 상기 유전자 조작된 항체는 이중-표적화 특이적 항체이고, 상기 이중-표적화 특이적 항체는 표적화 면역 효과기 세포 항원 에피토프 결합 부위 및 종양 세포 항원 에피토프 결합 부위를 갖는다.
보다 바람직하게, 면역 효과기 세포는 T 림프구, 자연 살해 세포 및 대식세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
더 바람직하게, 종양 세포는 종양 세포의 B 림프구, 백혈병 세포, 폐암 세포, 위암 세포, 대장암 세포, 간암 세포, 식도암 세포, 유방암 세포, 췌장암 세포, 방광암 세포 및 갑상선암 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
보다 바람직하게, 이중-표적화 특이적 항체는 종양 세포의 하나 이상의 항원 에피토프와 결합한다.
바람직하게, 프로모터는 사이토메갈로바이러스 CMV 프로모터, RSV 프로모터, UBC 프로모터 및 EF1α 프로모터를 포함한다.
보다 바람직하게, 프로모터는 사이토메갈로바이러스 CMV 프로모터이다.
바람직하게, 폴리A 테일링 신호는 소 성장 호르몬 폴리뉴클레오티드 bpA 또는 SV40이다.
더 바람직하게, 폴리A 테일링 신호는 소 성장 호르몬 폴리뉴클레오티드 bpA이다.
본 발명의 프로모터는 진핵 프로모터, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스 CMV, RSV, UBC 및 EF1α 등일 수 있다. 본 발명에서, CMV 프로모터가 미니서클 DNA의 제조에 더 바람직하다. 본 발명은 상이한 숙주 세포에 따라 상이한 프로모터를 사용하여 미니서클 DNA를 제조한다. 본 발명의 폴리A 테일링 신호는 SV40 등일 수 있다. 본 발명에서, bpA 테일링 신호가 미니서클 DNA의 제조에 더 바람직하다. 본 발명은 상이한 숙주 세포에 따라 상이한 테일링 신호를 사용함으로써 미니서클 DNA를 제조한다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자는 이중특이적 단일쇄 항체의 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열을 갖고, 이중특이적 단일쇄 항체의 아미노산 서열의 연결 형태는 하기 (a) 내지 (h)로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(a) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
(b) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
(c) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
(d) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
(e) VLCD20-링커1-VHCD20-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
(f) VHCD20-링커1-VLCD20-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
(g) VLCD20-링커1-VHCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
(h) VHCD20-링커1-VLCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
이때,
VLCD19의 아미노산 서열은 서열번호 1에 제시된 서열이고;
VHCD19의 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시된 서열이고;
VLCD3의 아미노산 서열은 서열번호 3 및 서열번호 4에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
VHCD3의 아미노산 서열은 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
링커1의 아미노산 서열은 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
링커2의 아미노산 서열은 서열번호 11에 제시된 서열이고;
VLCD20의 아미노산 서열은 서열번호 29에 제시된 서열이고;
VHCD20의 아미노산 서열은 서열번호 30에 제시된 서열이다.
바람직하게, 이중특이적 단일쇄 항체의 아미노산 서열은 (a) 내지 (e)로 나타낸 임의의 서열에 대해 95%보다 큰 동일성(바람직하게는 98% 이상)을 나타내는 아미노산 서열이다.
바람직하게, 이중특이적 단일쇄 항체의 아미노산 서열은 (a) 내지 (e)로 나타낸 임의의 서열에 대해 95%보다 큰 동일성(바람직하게는 98% 이상)을 나타내는 아미노산 서열이다.
바람직하게, attR 부위의 염기 서열은 서열번호 28에 제시된 서열이다.
보다 바람직하게, 본 발명에서 제공된 유전자 조작된 항체 유전자는 하기 아미노산 서열을 함유하는 유전자 조작된 항체를 암호화한다:
(a) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3의 아미노산 서열: 서열번호 1-서열번호 9-서열번호 2-서열번호 11-서열번호 4-서열번호 10-서열번호 6
(b) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3의 아미노산 서열: 서열번호 2-서열번호 10-서열번호 1-서열번호 11-서열번호 3-서열번호 8-서열번호 5
(c) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3의 아미노산 서열: 서열번호 1-서열번호 10-서열번호 2-서열번호 11-서열번호 5-서열번호 8-서열번호 3
(d) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3의 아미노산 서열: 서열번호 2-서열번호 8-서열번호 1-서열번호 11-서열번호 7-서열번호 9-서열번호 4
(e) VHCD20-링커1-VLCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3의 아미노산 서열: 서열번호 29-서열번호 10-서열번호 30-서열번호 11-서열번호 7-서열번호 9-서열번호 4
이때,
기호 "-"는 아미노산 서열 사이의 순차적 연결을 나타낸다.
보다 바람직하게, 본 발명의 유전자 조작된 항체 유전자는 하기 염기 서열을 갖는다:
(a') VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 12-서열번호 20-서열번호 13-서열번호 22-서열번호 15-서열번호 21-서열번호 17
(b') VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 13-서열번호 21-서열번호 12-서열번호 22-서열번호 14-서열번호 19-서열번호 16
(c') VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 12-서열번호 21-서열번호 13-서열번호 22-서열번호 16-서열번호 19-서열번호 14
(d') VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 13-서열번호 19-서열번호 12-서열번호 22-서열번호 18-서열번호 20-서열번호 15
(e') VLCD20-링커1-VHCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 33-서열번호 21-서열번호 34-서열번호 22-서열번호 18-서열번호 20-서열번호 15
이때,
서열번호 29(VLCD20의 아미노산 서열)를 암호화하는 염기 서열은 서열번호 33이고;
서열번호 30(VHCD20의 아미노산 서열)을 암호화하는 염기 서열은 서열번호 34이다.
본원에서 (a'), (b'), (c'), (d'), (e') 및 (f')로 나타낸 모든 염기 서열은 2개의 단일-가닥 유전자의 1개 가닥의 뉴클레오티드 서열(DNA 단편)이고, 기호 "-"는 염기 서열 사이의 순차적 연결을 나타낸다.
당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면 뉴클레오티드 서열이 변성되거나 돌연변이될 가능성으로 인해 염기를 조정할 수 있는 것으로 이해된다. 염기의 변화는 코돈에서의 변화를 초래할 것이지만, 코돈에 의해 번역된 아미노산에서의 변화는 야기하지 않을 것이다. 통상적으로 접하는 류신 코돈은 UUA, UUG 및 CUU와 같은 다양한 코돈을 갖는다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자는 (a') 내지 (e')로 나타낸 임의의 서열에 대해 95%보다 큰 동일성(바람직하게는 98% 이상)을 나타내는 염기 서열이다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자는 (a') 내지 (e')로 나타낸 임의의 서열에 대해 95%보다 큰 동일성(바람직하게는 98% 이상)을 나타내는 염기 서열이다. 또한, 유전자 조작된 항체 유전자의 암호화 아미노산 서열은 (a') 내지 (e')로 나타낸 임의의 서열의 암호화 아미노산 서열과 완전히 또는 기본적으로 동일하다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자는 전체 유전자 합성 또는 PCR 클로닝 접근법으로부터 수득된다.
바람직하게, 본 발명의 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드는 이중특이적 단일쇄 항체를 암호화하는 유전자를 갖고, 이때 상기 이중특이적 단일쇄 항체는 4개의 상이한 도메인, 즉 인간 CD19 항원에 결합하는 경쇄의 가변 도메인(VLCD19), 인간 CD19 항원에 결합하는 중쇄의 가변 도메인(VHCD19), 인간 CD3 항원에 결합하는 경쇄의 가변 도메인(VLCD3), 인간 CD3 항원에 결합하는 중쇄의 가변 도메인(VHCD3)을 갖는다. VLCD19, VHCD19, VLCD3 및 VHCD3 폴리펩티드의 암호화 유전자는 항체 라이브러리를 선별하여 수득되고, 이때 VLCD19 및 VHCD19는 인간 CD19 항원에 결합하는 기능성 도메인을 구성하고, VLCD3 및 VHCD3은 인간 CD3 항원에 결합하는 기능성 도메인을 구성하므로, 본 발명의 유전자 조작된 항체는 바람직하게는 항-CD19xCD3 이중특이적 단일쇄 항체(즉, 항-CD19xCD3 BiTE)이다.
바람직하게, 항-CD19xCD3 이중특이적 단일쇄 항체의 바람직한 구조 형태는 다음과 같다: VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3(이때, 링커는 주로 글리신 및 세린으로 구성되는 폴리펩티드 서열을 사용하는 링커 펩티드이다). 글리신은 최소 아미노산이고, 이의 최소 측쇄로 인해 측쇄의 유연성을 증가시킬 수 있다. 가장 친수성 아미노산으로서, 세린은 펩티드 쇄의 친수성을 증가시킬 수 있다.
두 번째로, 본 발명의 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트는 면역글로불린 κ쇄 단일 펩티드를 암호화하는 염기 서열 및 Flag 태그를 암호화하는 염기 서열을 갖고, 이것은 유전자 조작된 항체의 N-말단에 면역글로불린 κ 경쇄 분비 신호 펩티드 및 Flag 태그를 부가하는 것을 가능하게 한다. 이것은 항체가 발현되고 숙주 세포 밖으로 분비되는 것을 보장한다. 또한, His6 태그는 C-말단에 유전자 조작된 항체를 연결시키고, 이것은 니켈 컬럼 친화 크로마토그래피에 의해 항체를 정제하는데 유리하다.
항-CD20xCD3 이중특이적 단일쇄 항체(즉, CD20xCD3 BiTE)는 4개의 상이한 도메인, 즉 인간 CD20 항원에 결합하는 경쇄의 가변 도메인(VLCD20), 인간 CD20 항원에 결합하는 중쇄의 가변 도메인(VHCD20), 인간 CD3 항원에 결합하는 경쇄의 가변 도메인(VLCD3), 인간 CD3 항원에 결합하는 중쇄의 가변 도메인(VLCD20)을 갖는다.
본원에 기술된 염기 서열은 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로 이해된다.
바람직하게, 재조합효소는 φC31 재조합효소이다.
바람직하게, 숙주 균주는 TOP 10이다.
바람직하게, 숙주 균주는 ZYCY10P3S2T 조작된 세균이다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드의 부위-특이적 재조합 사건의 과정은 숙주 균주에서 일어나고, 다음을 포함한다: 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 재조합 발현 벡터는 φC31 재조합효소의 존재 하에서 재조합될 수 있는 attB 및 attP 부위를 함유하여, 미니서클 모 플라스미드가 attL 부위를 함유하는 세균 플라스미드 DNA 및 attR 부위를 함유하는 미니서클 DNA를 비-가역적으로 생성하게 한다. attR 부위를 함유하는 미니서클 DNA는 전핵 플라스미드의 서열이 없고 인간 및 포유동물 세포의 염색체 DNA를 함유하지 않아서, 유전자 조작된 항체의 안정하고 지속적인 발현을 제공한다. attL 부위를 함유하는 세균 플라스미드 DNA는 I-Sce 엔도뉴클레아제로 절단되어 선형 DNA를 생성하고, 상기 플라스미드는 숙주 균주에서 분해된다.
본 발명은 또한, 세 번째 양태의 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA를 적용하는 방법, 또는 네 번째 양태의 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA를 제조하는 방법을 제공하되, 상기 방법은 하기 (1) 내지 (4)로부터 선택되는 방법이다:
(1) 단독으로 상기 미니서클 DNA를 적용하는 방법;
(2) 화학요법, 방사선요법, 수술, 생물요법 및 면역요법 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 상기 미니서클 DNA를 적용하는 방법;
(3) 상기 미니서클 DNA를 표적 전달 접근법에 의해 치료받을 환자에게 전달하는 방법; 및
(4) 면역 효과기 세포를 시험관내 형질감염 기술에 의해 상기 미니서클 DNA로 형질감염시키고, 이어서 상기 미니서클 DNA로 형질감염된 면역 효과기 세포를 치료받을 환자에게 전달하는 방법.
바람직하게, 방법 (4)에서, 면역 효과기 세포는 T 림프구, 자연 살해 세포, 대식세포 및 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
방법 (4)에서, 면역 효과기 세포는 CIK 세포 또는 D-CIK 세포이다.
attR 부위를 함유하는 미니서클 DNA는 전핵 플라스미드의 서열이 없고 인간 및 포유동물 세포의 염색체 DNA를 함유하지 않아서, 유전자 조작된 항체의 안정하고 지속적인 발현을 제공한다. 미니서클 DNA는 표적화 치료에 단독으로 사용되어, 예를 들어, 유전자 조작된 항체의 발현을 위해 환자에게 전달되어, T 세포가 종양 세포를 특이적으로 사멸시키게 할 수 있다.
본 발명의 미니서클 DNA는 시험관내 환자의 면역 효과기 세포를 형질감염시키기 위해 사용될 수 있고, 이어서 상기 미니서클 DNA로 형질감염된 면역 효과기 세포는 치료받을 환자에게 전달된다.
본 발명의 미니서클 DNA는 화학요법, 방사선요법, 수술, 생물요법 및 면역요법과 함께 치료에 사용될 수 있다.
다섯 번째 양태에서, 본 발명은 세 번째 양태 또는 네 번째 양태에서 기술된 미니서클 DNA를 포함하는 숙주를 제공한다.
바람직하게, 숙주는 인간 또는 포유동물이다.
바람직하게, 숙주는 인간 또는 포유동물 세포이다.
보다 바람직하게, 포유동물 세포는 CHO 세포이다.
여섯 번째 양태에서, 본 발명은 이중-표적화 특이적 항체인 유전자 조작된 항체를 제공하고, 상기 이중-표적화 특이적 항체는 표적화 면역 효과기 세포 항원 에피토프 결합 부위 및 종양 세포 항원 에피토프 결합 부위를 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체"는 천연 항체 및 재조합 항체를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체"는 인간 및 뮤린 항체를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체 유전자"는 치료 항체를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체 유전자"는 단일 표적화 항체, 이중-표적화 항체 또는 다중-표적화 항체일 수 있다.
"표적화"란, 항체가 항원에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. "이중-표적화"란, 항체가 2개의 항원 특이적 결합 부위를 갖는 것을 의미한다. "다중-표적화"란, 항체가 2개보다 많은 항원 특이적 결합 부위를 갖는 것을 의미한다.
바람직하게, 면역 효과기 세포는 T 림프구, 자연 살해 세포 및 대식세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게, 종양 세포는 종양 세포의 B 림프구, 백혈병 세포, 폐암 세포, 위암 세포, 대장암 세포, 간암 세포, 식도암 세포, 유방암 세포, 췌장암 세포, 방광암 세포 및 갑상선암 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게, 이중-표적화 특이적 항체는 종양 세포의 하나 이상의 항원 에피토프와 결합한다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체는 이중특이적 단일쇄 항체이고, 상기 이중특이적 단일쇄 항체의 아미노산 서열의 연결 형태는 하기 (a) 내지 (h)로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(a) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
(b) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
(c) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
(d) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
(e) VLCD20-링커1-VHCD20-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
(f) VHCD20-링커1-VLCD20-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
(g) VLCD20-링커1-VHCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
(h) VHCD20-링커1-VLCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
이때,
VLCD19의 아미노산 서열은 서열번호 1에 제시된 서열이고;
VHCD19의 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시된 서열이고;
VLCD3의 아미노산 서열은 서열번호 3 및 서열번호 4에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
VHCD3의 아미노산 서열은 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
링커1의 아미노산 서열은 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
링커2의 아미노산 서열은 서열번호 11에 제시된 서열이고;
VLCD20의 아미노산 서열은 서열번호 29에 제시된 서열이고;
VHCD20의 아미노산 서열은 서열번호 30에 제시된 서열이다.
바람직하게, 이중특이적 단일쇄 항체의 아미노산 서열은 (a) 내지 (e)로 나타낸 임의의 서열에 대해 95%보다 큰 동일성(바람직하게는 98% 이상)을 나타내는 아미노산 서열이다.
보다 바람직하게, 본 발명에서 제공된 유전자 조작된 항체 유전자는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
(a) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3의 아미노산 서열: 서열번호 1-서열번호 9-서열번호 2-서열번호 11-서열번호 4-서열번호 10-서열번호 6
(b) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3의 아미노산 서열: 서열번호 2-서열번호 10-서열번호 1-서열번호 11-서열번호 3-서열번호 8-서열번호 5
(c) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3의 아미노산 서열: 서열번호 1-서열번호 10-서열번호 2-서열번호 11-서열번호 5-서열번호 8-서열번호 3
(d) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3의 아미노산 서열: 서열번호 2-서열번호 8-서열번호 1-서열번호 11-서열번호 7-서열번호 9-서열번호 4
(e) VHCD20-링커1-VLCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3의 아미노산 서열: 서열번호 29-서열번호 10-서열번호 30-서열번호 11-서열번호 7-서열번호 9-서열번호 4
이때,
기호 "-"는 아미노산 서열 사이의 순차적 연결을 나타낸다.
보다 바람직하게, 본 발명의 유전자 조작된 항체 유전자는 하기 염기 서열을 갖는다:
(a') VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 12-서열번호 20-서열번호 13-서열번호 22-서열번호 15-서열번호 21-서열번호 17
(b') VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 13-서열번호 21-서열번호 12-서열번호 22-서열번호 14-서열번호 19-서열번호 16
(c') VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 12-서열번호 21-서열번호 13-서열번호 22-서열번호 16-서열번호 19-서열번호 14
(d') VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 13-서열번호 19-서열번호 12-서열번호 22-서열번호 18-서열번호 20-서열번호 15
(e') VLCD20-링커1-VHCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 33-서열번호 21-서열번호 34-서열번호 22-서열번호 18-서열번호 20-서열번호 15
이때,
서열번호 29(VLCD20의 아미노산 서열)를 암호화하는 염기 서열은 서열번호 33이고;
서열번호 30(VHCD20의 아미노산 서열)을 암호화하는 염기 서열은 서열번호 34이다.
본원에서 (a'), (b'), (c'), (d'), (e') 및 (f')로 나타낸 모든 염기 서열은 2개의 단일-가닥 유전자의 1개 가닥의 뉴클레오티드 서열(DNA 단편)이고, 기호 "-"는 염기 서열 사이의 순차적 연결을 나타낸다.
당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면 뉴클레오티드 서열이 변성되거나 돌연변이될 가능성으로 인해 염기를 조정할 수 있는 것으로 이해된다. 염기의 변화는 코돈에서의 변화를 초래할 것이지만, 코돈에 의해 번역된 아미노산에서의 변화는 야기하지 않을 것이다. 통상적으로 접하는 류신 코돈은 UUA, UUG 및 CUU와 같은 다양한 코돈을 갖는다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자는 (a') 내지 (e')로 나타낸 임의의 서열에 대해 95%보다 큰 동일성(바람직하게는 98% 이상)을 나타내는 염기 서열이다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자는 (a') 내지 (e')로 나타낸 임의의 서열에 대해 95%보다 큰 동일성(바람직하게는 98% 이상)을 나타내는 염기 서열이다. 또한, 유전자 조작된 항체 유전자의 암호화 아미노산 서열은 (a') 내지 (e')로 나타낸 임의의 서열의 암호화 아미노산 서열과 완전히 또는 기본적으로 동일하다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자는 전체 유전자 합성 또는 PCR 클로닝 접근법으로부터 수득된다.
바람직하게, 본 발명의 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드는 이중특이적 단일쇄 항체를 암호화하는 유전자를 갖고, 이때 상기 이중특이적 단일쇄 항체는 4개의 상이한 도메인, 즉 인간 CD19 항원에 결합하는 경쇄의 가변 도메인(VLCD19), 인간 CD19 항원에 결합하는 중쇄의 가변 도메인(VHCD19), 인간 CD3 항원에 결합하는 경쇄의 가변 도메인(VLCD3), 인간 CD3 항원에 결합하는 중쇄의 가변 도메인(VHCD3)을 갖는다. VLCD19, VHCD19, VLCD3 및 VHCD3 폴리펩티드의 암호화 유전자는 항체 라이브러리를 선별하여 수득되고, 이때 VLCD19 및 VHCD19는 인간 CD19 항원에 결합하는 기능성 도메인을 구성하고, VLCD3 및 VHCD3은 인간 CD3 항원에 결합하는 기능성 도메인을 구성하므로, 본 발명의 유전자 조작된 항체는 바람직하게는 항-CD19xCD3 이중특이적 단일쇄 항체(즉, 항-CD19xCD3 BiTE)이다.
바람직하게, 항-CD19xCD3 이중특이적 단일쇄 항체의 바람직한 구조 형태는 다음과 같다: VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3(이때, 링커는 주로 글리신 및 세린으로 구성되는 폴리펩티드 서열을 사용하는 링커 펩티드이다). 글리신은 최소 아미노산이고, 이의 최소 측쇄로 인해 측쇄의 유연성을 증가시킬 수 있다. 가장 친수성 아미노산으로서, 세린은 펩티드 쇄의 친수성을 증가시킬 수 있다.
두 번째로, 본 발명의 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트는 면역글로불린 κ쇄 단일 펩티드를 암호화하는 염기 서열 및 Flag 태그를 암호화하는 염기 서열을 갖고, 이것은 유전자 조작된 항체의 N-말단에 면역글로불린 κ 경쇄 분비 신호 펩티드 및 Flag 태그를 부가하는 것을 가능하게 한다. 이것은 항체가 발현되고 숙주 세포 밖으로 분비되는 것을 보장한다. 또한, His6 태그는 C-말단에 유전자 조작된 항체를 연결시키고, 이것은 니켈 컬럼 친화 크로마토그래피에 의해 항체를 정제하는데 유리하다.
항-CD20xCD3 이중특이적 단일쇄 항체(즉, CD20xCD3 BiTE)는 4개의 상이한 도메인, 즉 인간 CD20 항원에 결합하는 경쇄의 가변 도메인(VLCD20), 인간 CD20 항원에 결합하는 중쇄의 가변 도메인(VHCD20), 인간 CD3 항원에 결합하는 경쇄의 가변 도메인(VLCD3), 인간 CD3 항원에 결합하는 중쇄의 가변 도메인(VLCD20)을 갖는다.
본원에 기술된 염기 서열은 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로 이해된다.
일곱 번째 양태에서, 본 발명은
(1) 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 원형 DNA인 미니서클 DNA를 제공하거나 제조하는 단계로서, 상기 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트가 유전자 조작된 항체 유전자를 포함하는, 단계; 및
(2) 단계 (1)에서 수득된 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA로 숙주 세포를 형질감염시켜, 상기 숙주 세포에서 유전자 조작된 항체를 발현시키고 생성하는 단계
를 포함하는, 유전자 조작된 항체의 제조 방법을 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "미니서클 DNA"는 주로 초나선형 구조로 존재하고 원핵 플라스미드 주쇄 DNA 서열이 없는 벡터를 말한다. 인간 및 포유동물 세포의 염색체 DNA를 함유하지 않는 미니서클 DNA는 전사 또는 표적 유전자의 안정하고 지속적인 발현을 제공할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "미니서클 DNA" 및 "미니서클 DNA 벡터"는 상호교환적으로 사용된다.
바이러스 벡터 및 플라스미드 벡터와 비교하여, 미니서클 DNA는, 세균으로부터 유래된 주쇄 DNA 서열의 제거로 인해 시험관내 또는 생체내 염증 발생 및 유전자 발현 침묵의 가능성을 감소시켜, 보다 장기적이고 더 강한 발현을 제공한다. 또한, 미니서클 DNA에서 저항성 마커 유전자 및 복제 기점을 비롯한 세균 서열의 결여로 인해 임상 안전성이 개선된다.
바람직한 태양에서, 미니서클 DNA는 부위-특이적 재조합 부위의 부위-특이적 재조합을 통해 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드로부터 생성된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드는 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트의 유전자 서열을 미니서클 DNA 빈 플라스미드의 다중 클로닝 부위 내에 삽입시킴으로써 수득되고, 상기 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트는 유전자 조작된 항체 유전자를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "미니서클 DNA 빈 플라스미드"는 부위-특이적 재조합 부위를 갖는 플라스미드 벡터를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 유전자 조작 연구에서 "플라스미드 벡터"는 외인성 DNA를 삽입하는 것이 가능하고 수용 세포에서 복제될 수 있는 DNA 구조물을 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "플라스미드" 및 "플라스미드 벡터"는 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드"는 부위-특이적 재조합 부위를 갖고, "미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드"는 부위-특이적 재조합 부위의 부위-특이적 재조합을 통해 미니서클 DNA 및 주쇄 DNA를 생성할 수 있는 재조합 모 플라스미드를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드" 및 "미니서클 DNA 모 플라스미드"는 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "주쇄 DNA 서열"은 표준 플라스미드에서 세균 플라스미드의 복제를 수행하거나 플라스미드를 함유하는 숙주를 선별하는 DNA 서열을 갖는다. 상기 DNA 서열은 세균 복제 서열, 저항성 유전자, 비메틸화 CpG 유전자 서열 등을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "주쇄 DNA" 및 "주쇄 DNA 벡터"는 상호교환적으로 사용된다.
바람직한 태양에서, 미니서클 DNA 모 플라스미드는 숙주 세포 내에 형질전환되고, 유도 후에, 상기 미니서클 DNA 모 플라스미드는 부위-특이적 재조합 부위의 부위-특이적 재조합 사건을 통해 미니서클 DNA 및 주쇄 DNA를 생성한다.
바람직하게, 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이이다.
바람직하게, 부위-특이적 재조합 부위는 phiC31 부위-특이적 재조합 부위, parA 부위-특이적 재조합 부위 또는 Cre 부위-특이적 재조합 부위이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "부위-특이적 재조합"은 바람직하게는 문헌[Hu Chunsheng, etc. in "Letters in Biotechnology (22 (1): 104-109 (2011))"]에 보고된 phiC31(φC31) 재조합효소 시스템, parA 재조합효소 시스템 또는 Cre 재조합효소 시스템을 사용한다.
바람직하게, 주쇄 DNA는 하나 이상의 DNA 엔도뉴클레아제 부위를 함유한다.
더 바람직하게, DNA 엔도뉴클레아제는 I-Sce1 엔도뉴클레아제이다.
상기 바람직한 조건 하에서, 주쇄 DNA는 숙주 세포에서 DNA 엔도뉴클레아제에 의해 절단되고 분해됨으로써, 미니서클 DNA의 정제를 촉진할 수 있다. 또한, 비-재조합 미니서클 DNA 모 플라스미드도 또한 DNA 엔도뉴클레아제 부위를 가지기 때문에, 마찬가지로 숙주 세포에서 DNA 엔도뉴클레아제에 의해 절단되고 분해될 수 있다.
다른 바람직한 태양에서, 미니서클 DNA를 제조하기 위해 phiC31 재조합효소가 사용되고, 이때 미니서클 DNA 빈 플라스미드의 부위-특이적 재조합 부위는 attB 및 attP 부위이다. 바람직한 attB 및 attP 부위는 phiC31 재조합효소에 의해 인식될 수 있는 최소 인식 서열이다(attB, attP 최소 인식 서열은 서열번호 31 및 서열번호 32로 제시된다).
또 다른 바람직한 태양에서, 본원에서 제조된 미니서클 DNA 모 플라스미드는 attB 및 attP 부위를 갖고, attB 및 attP 부위는 주쇄 DNA와 미니서클 DNA의 뉴클레오티드 서열 사이에 존재한다.
특히, attB 및 attP 부위는 φC31 재조합효소의 존재 하에서 재조합되어, 미니서클 모 플라스미드가 attL 부위를 함유하는 플라스미드 주쇄 DNA 및 attR 부위를 함유하는 미니서클 DNA를 비가역적으로 생성할 수 있게 한다.
당해 분야에 숙련된 자라면 필요한 대로 적절한 재조합효소 시스템을 선택할 수 있고, 상응하는 재조합효소를 발현할 수 있는 적절한 숙주 균주를 선택할 수 있고, 상응하는 부위-특이적 재조합 부위를 갖는 미니서클 DNA 빈 벡터를 제조할 수 있다.
바람직하게, φC31 재조합효소 발현 카세트는 미니서클 DNA 빈 플라스미드 또는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드 상에 위치하고, 미니서클 DNA 제조시 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드에 의해 발현될 수 있다.
바람직하게, φC31 재조합효소 발현 카세트는 숙주 세포 유전자에 위치하고 숙주 세포에 의해 발현될 수 있다.
바람직하게, 미니서클 DNA 빈 플라스미드는 p2φC31 플라스미드 또는 pMC.BESPX 플라스미드이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "p2φC31 빈 플라스미드"는 φC31 재조합효소의 존재 하에서 재조합될 수 있는 attB 및 attP 부위를 갖는다.
특히, 빈 플라스미드 p2φC31의 제조 방법은 문헌[Chen ZY et al., Molecular Therapy, 8(3), 495-500 (2003)]; 문헌[Chen ZY, et al., Human Gene Therapy, 16(1), 126-131 (2005)] 및 미국 특허 제 7,897,380 B2 호에서 찾을 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "pMC.BESPX 빈 플라스미드"는 φC31 재조합효소의 존재 하에서 재조합될 수 있는 attB 및 attP 부위를 갖는다.
특히, 빈 플라스미드 pMC.BESPX 및 완전 게놈 서열의 제조 방법은 문헌[Chen ZY et al., Nature Biotechnology, 28, (12), 1289-1291 (2010)]에서 찾을 수 있다.
본 발명의 바람직한 태양에서 사용되는 p2φC31 플라스미드 및 pMC.BESPX 플라스미드는, p2φC31 벡터가 φC31 재조합효소 및 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 반면, pMC.BESPX 벡터가 φC31 재조합효소 및 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖지 않으므로, pMC.BESPX 벡터를 사용하여 제조된 미니서클 DNA 모 플라스미드가 더 우수한 질을 갖고 재조합효소 및 엔도뉴클레아제의 뉴클레오티드 서열의 오염을 감소시킨다는 점에서 상이하다. 그러나, pMC.BESPX 벡터는 φC31 재조합효소 및 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 기능을 갖는 에스케리키아 콜라이 ZYCY10P3S2T 조작된 세균과 함께 사용되어야 한다. φC31 재조합효소(즉, phiC31 재조합효소) 및 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖지 않는 pMC.BESPX는 생체내 부위-특이적 재조합을 야기하고(에스케리키아 콜라이 TOP 10은 상기 기능을 갖지 않는다) 궁극적으로 미니서클 DNA를 생성하도록 ZYCY10P3S2T 조작된 세균과 함께 사용되어야 한다. 따라서, p2φC31 벡터는 TOP 10에서 부위-특이적 재조합을 야기하고 궁극적으로 미니서클 DNA를 생성하도록 TOP 10과 함께 사용되어야 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체"는 천연 항체 및 재조합 항체를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체"는 인간 및 뮤린 항체를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체 유전자"는 치료 항체를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체 유전자"는 단일 표적화 항체, 이중-표적화 항체 또는 다중-표적화 항체일 수 있다.
"표적화"란, 항체가 항원에 특이적으로 결합하는 것을 의미한다. "이중-표적화"란, 항체가 2개의 항원 특이적 결합 부위를 갖는 것을 의미한다. "다중-표적화"란, 항체가 2개보다 많은 항원 특이적 결합 부위를 갖는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "주쇄 DNA" 및 "주쇄 DNA 벡터"는 상호교환적으로 사용된다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트는 유전자 조작된 항체 유전자에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 포함한다.
보다 바람직하게, 프로모터는 신호 펩티드의 유전자 서열 및 태그의 유전자 서열 중 하나 이상에 의해 유전자 조작된 항체 유전자에 작동가능하게 연결된다.
보다 더 바람직하게, 신호 펩티드는 면역글로불린 κ쇄 신호 펩티드이다.
보다 더 바람직하게, 태그는 His 태그, GST 태그, c-myc 태그 및 Flag 태그 중 하나 이상이다.
상기 신호 펩티드 및 태그는 본 발명에서 바람직하다. 당해 분야에 숙련된 자라면 필요한 대로 적절한 신호 펩티드 및 표지를 선택할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트"는 표적 폴리펩티드(본 발명에서 유전자 조작된 항체)의 발현에 필요한 모든 필수 요소를 함유하는 유전자 발현 시스템을 말한다. 상기 유전자 발현 시스템은 통상적으로 하기 요소를 포함한다: 프로모터, 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 서열 및 종결자. 또한, 신호 펩티드의 암호화 서열이 선택적으로 포함될 수 있다. 상기 요소는 작동가능하게 연결된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "작동가능하게 연결됨"은 2개 이상의 핵산 영역 또는 핵산 서열의 기능적 배열을 말한다. 예를 들어, 프로모터 영역은, 프로모터 영역이 핵산 서열의 전사를 지향하도록 표적 핵산 서열에 대해 특정한 특이적 위치에 배치되고, 프로모터 영역은 핵산 서열에 "작동가능하게 연결된다".
본 발명의 일곱 번째 양태의 바람직한 형태로서, 본 발명은
(1) attR 부위, 및 하기 (a) 내지 (g)로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 원형 DNA인 미니서클 DNA를 제공하거나 제조하는 단계:
(a) A-a-B-d-e
(b) A-b-B-d-e
(c) A-B-c-d-e
(d) A-a-b-B-c-d-e
(e) A-a-B-c-d-e
(f) A-a-b-B-d-e
(g) A-b-B-c-d-e
[이때,
A는 프로모터를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이고;
B는 유전자 조작된 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이고;
a, b, c, d 및 e는 각각 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열, Flag 태그를 암호화하는 염기 서열, His6 태그를 암호화하는 염기 서열, 정지 코돈 및 폴리A 테일링 신호를 나타내고;
"-"는 각각의 염기 서열로 나타낸 유전자 단편 사이에서 "작동가능하게 연결됨"을 나타낸다]; 및
(2) 단계 (1)에서 수득된 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA로 숙주 세포를 형질감염시켜, 상기 숙주 세포에서 유전자 조작된 항체를 발현시키고 생성하는 단계
를 포함하는, 유전자 조작된 항체의 제조 방법을 제공한다.
DNA는 3,5-포스포다이에스터 결합에 의해 함께 연결되는 4개의 데옥시뉴클레오티드(dAMP, dGMP, dCMT 및 dTMP)로 이루어진 데옥시리보핵산이다. "염기 서열"은 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타내기 위해 사용되는 것으로 이해된다.
본 발명의 일곱 번째 양태의 다른 바람직한 형태로서, 본 발명은
(1) 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA를 제공하거나 제조하는 단계로서, 상기 미니서클 DNA가 attR 부위 및 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 원형 DNA이고, 상기 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트가, 순차적으로 연결되는, 프로모터, 면역글로불린 κ쇄 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열, Flag 태그를 암호화하는 염기 서열, 유전자 조작된 항체 유전자, His6 태그를 암호화하는 염기 서열, 정지 코돈 및 폴리A 테일링 신호를 포함하는, 단계; 및
(2) 단계 (1)에서 수득된 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA로 숙주 세포를 형질감염시켜, 상기 숙주 세포에서 유전자 조작된 항체를 발현시키고 생성하는 단계
를 포함하는, 유전자 조작된 항체의 제조 방법을 제공한다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자는 유전자 조작된 항체를 암호화하는 염기 서열을 갖고, 상기 유전자 조작된 항체는 이중-표적화 특이적 항체이고, 상기 이중-표적화 특이적 항체는 표적화 면역 효과기 세포 항원 에피토프 결합 부위 및 종양 세포 항원 에피토프 결합 부위를 갖는다.
보다 바람직하게, 면역 효과기 세포는 T 림프구, 자연 살해 세포 및 대식세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
더 바람직하게, 종양 세포는 종양 세포의 B 림프구, 백혈병 세포, 폐암 세포, 위암 세포, 대장암 세포, 간암 세포, 식도암 세포, 유방암 세포, 췌장암 세포, 방광암 세포 및 갑상선암 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
보다 바람직하게, 이중-표적화 특이적 항체는 종양 세포의 하나 이상의 항원 에피토프와 결합한다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체는 이중특이적 단일쇄 항체이고, 상기 이중특이적 단일쇄 항체의 아미노산 서열의 연결 형태는 하기 (a) 내지 (h)로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(a) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
(b) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
(c) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
(d) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
(e) VLCD20-링커1-VHCD20-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
(f) VHCD20-링커1-VLCD20-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
(g) VLCD20-링커1-VHCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
(h) VHCD20-링커1-VLCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
이때,
VLCD19의 아미노산 서열은 서열번호 1에 제시된 서열이고;
VHCD19의 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시된 서열이고;
VLCD3의 아미노산 서열은 서열번호 3 및 서열번호 4에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
VHCD3의 아미노산 서열은 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
링커1의 아미노산 서열은 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
링커2의 아미노산 서열은 서열번호 11에 제시된 서열이다.
바람직하게, 이중특이적 단일쇄 항체의 아미노산 서열은 (a) 내지 (e)로 나타낸 임의의 서열에 대해 95%보다 큰 동일성(바람직하게는 98% 이상)을 나타내는 아미노산 서열이다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA는 숙주 균주에서 부위-특이적 재조합을 통해 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드로부터 생성된다.
바람직하게, attR 부위의 염기 서열은 서열번호 28에 제시된 서열이다.
보다 바람직하게, 본 발명에서 제공된 유전자 조작된 항체 유전자는 하기 아미노산 서열을 갖는다:
(a) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3의 아미노산 서열: 서열번호 1-서열번호 9-서열번호 2-서열번호 11-서열번호 4-서열번호 10-서열번호 6
(b) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3의 아미노산 서열: 서열번호 2-서열번호 10-서열번호 1-서열번호 11-서열번호 3-서열번호 8-서열번호 5
(c) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3의 아미노산 서열: 서열번호 1-서열번호 10-서열번호 2-서열번호 11-서열번호 5-서열번호 8-서열번호 3
(d) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3의 아미노산 서열: 서열번호 2-서열번호 8-서열번호 1-서열번호 11-서열번호 7-서열번호 9-서열번호 4
(e) VHCD20-링커1-VLCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3의 아미노산 서열: 서열번호 29-서열번호 10-서열번호 30-서열번호 11-서열번호 7-서열번호 9-서열번호 4
이때,
기호 "-"는 아미노산 서열 사이의 순차적 연결을 나타낸다.
보다 바람직하게, 본 발명의 유전자 조작된 항체 유전자는 하기 염기 서열을 갖는다:
(a') VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 12-서열번호 20-서열번호 13-서열번호 22-서열번호 15-서열번호 21-서열번호 17
(b') VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 13-서열번호 21-서열번호 12-서열번호 22-서열번호 14-서열번호 19-서열번호 16
(c') VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 12-서열번호 21-서열번호 13-서열번호 22-서열번호 16-서열번호 19-서열번호 14
(d') VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 13-서열번호 19-서열번호 12-서열번호 22-서열번호 18-서열번호 20-서열번호 15
(e') VLCD20-링커1-VHCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3을 암호화하는 염기 서열: 서열번호 33-서열번호 21-서열번호 34-서열번호 22-서열번호 18-서열번호 20-서열번호 15
이때,
서열번호 29(VLCD20의 아미노산 서열)를 암호화하는 염기 서열은 서열번호 33이고;
서열번호 30(VHCD20의 아미노산 서열)을 암호화하는 염기 서열은 서열번호 34이다.
본원에서 (a'), (b'), (c'), (d'), (e') 및 (f')로 나타낸 모든 염기 서열은 2개의 단일-가닥 유전자의 1개 가닥의 뉴클레오티드 서열(DNA 단편)이고, 기호 "-"는 염기 서열 사이의 순차적 연결을 나타낸다.
당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면 뉴클레오티드 서열이 변성되거나 돌연변이될 가능성으로 인해 염기를 조정할 수 있는 것으로 이해된다. 염기의 변화는 코돈에서의 변화를 초래할 것이지만, 코돈에 의해 번역된 아미노산에서의 변화는 야기하지 않을 것이다. 통상적으로 접하는 류신 코돈은 UUA, UUG 및 CUU와 같은 다양한 코돈을 갖는다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자는 (a') 내지 (e')로 나타낸 임의의 서열에 대해 95%보다 큰 동일성(바람직하게는 98% 이상)을 나타내는 염기 서열이다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자는 (a') 내지 (e')로 나타낸 임의의 서열에 대해 95%보다 큰 동일성(바람직하게는 98% 이상)을 나타내는 염기 서열이다. 또한, 유전자 조작된 항체 유전자의 암호화 아미노산 서열은 (a') 내지 (e')로 나타낸 임의의 서열의 암호화 아미노산 서열과 완전히 또는 기본적으로 동일하다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체 유전자는 전체 유전자 합성 또는 PCR 클로닝 접근법으로부터 수득된다.
바람직하게, 본 발명의 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드는 이중특이적 단일쇄 항체를 암호화하는 유전자를 갖고, 이때 상기 이중특이적 단일쇄 항체는 4개의 상이한 도메인, 즉 인간 CD19 항원에 결합하는 경쇄의 가변 도메인(VLCD19), 인간 CD19 항원에 결합하는 중쇄의 가변 도메인(VHCD19), 인간 CD3 항원에 결합하는 경쇄의 가변 도메인(VLCD3), 인간 CD3 항원에 결합하는 중쇄의 가변 도메인(VHCD3)을 갖는다. VLCD19, VHCD19, VLCD3 및 VHCD3 폴리펩티드의 암호화 유전자는 항체 라이브러리를 선별하여 수득되고, 이때 VLCD19 및 VHCD19는 인간 CD19 항원에 결합하는 기능성 도메인을 구성하고, VLCD3 및 VHCD3은 인간 CD3 항원에 결합하는 기능성 도메인을 구성하므로, 본 발명의 유전자 조작된 항체는 바람직하게는 항-CD19xCD3 이중특이적 단일쇄 항체(즉, 항-CD19xCD3 BiTE)이다.
바람직하게, 항-CD19xCD3 이중특이적 단일쇄 항체의 바람직한 구조 형태는 다음과 같다: VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3(이때, 링커는 주로 글리신 및 세린으로 구성되는 폴리펩티드 서열을 사용하는 링커 펩티드이다). 글리신은 최소 아미노산이고, 이의 최소 측쇄로 인해 측쇄의 유연성을 증가시킬 수 있다. 가장 친수성 아미노산으로서, 세린은 펩티드 쇄의 친수성을 증가시킬 수 있다.
두 번째로, 본 발명의 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트는 면역글로불린 κ쇄 단일 펩티드를 암호화하는 염기 서열 및 Flag 태그를 암호화하는 염기 서열을 갖고, 이것은 유전자 조작된 항체의 N-말단에 면역글로불린 κ 경쇄 분비 신호 펩티드 및 Flag 태그를 부가하는 것을 가능하게 한다. 이것은 항체가 발현되고 숙주 세포 밖으로 분비되는 것을 보장한다. 또한, His6 태그는 C-말단에 유전자 조작된 항체를 연결시키고, 이것은 니켈 컬럼 친화 크로마토그래피에 의해 항체를 정제하는데 유리하다.
항-CD20xCD3 이중특이적 단일쇄 항체(즉, CD20xCD3 BiTE)는 4개의 상이한 도메인, 즉 인간 CD20 항원에 결합하는 경쇄의 가변 도메인(VLCD20), 인간 CD20 항원에 결합하는 중쇄의 가변 도메인(VHCD20), 인간 CD3 항원에 결합하는 경쇄의 가변 도메인(VLCD3), 인간 CD3 항원에 결합하는 중쇄의 가변 도메인(VLCD3)을 갖는다.
본원에 기술된 염기 서열은 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로 이해된다.
바람직하게, 프로모터는 사이토메갈로바이러스 CMV 프로모터, RSV 프로모터, UBC 프로모터 및 EF1α 프로모터를 포함한다.
보다 바람직하게, 프로모터는 사이토메갈로바이러스 CMV 프로모터이다.
바람직하게, 폴리A 테일링 신호는 소 성장 호르몬 폴리뉴클레오티드 bpA 또는 SV40이다.
더 바람직하게, 폴리A 테일링 신호는 소 성장 호르몬 폴리뉴클레오티드 bpA이다.
본 발명의 프로모터는 진핵 프로모터, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스 CMV, RSV, UBC 및 EF1α 등일 수 있다. 본 발명에서, CMV 프로모터가 미니서클 DNA의 제조에 더 바람직하다. 본 발명은 상이한 숙주 세포에 따라 상이한 프로모터를 사용하여 미니서클 DNA를 제조한다. 본 발명의 폴리A 테일링 신호는 SV40 등일 수 있다. 본 발명에서, bpA 테일링 신호가 미니서클 DNA의 제조에 더 바람직하다. 본 발명은 상이한 숙주 세포에 따라 상이한 테일링 신호를 사용함으로써 미니서클 DNA를 제조한다.
항-CD19xCD3 이중특이적 단일쇄 항체에서, VLCD19 및 VHCD19는 인간 CD19 항원에 결합하는 기능성 도메인을 구성하는 반면, VLCD3 및 VHCD3은 인간 CD3 항원에 결합하는 기능성 도메인을 제조한다. 그러므로, 항-CD19xCD3 이중특이적 단일쇄 항체는 T 세포(CD3 항원 함유) 및 CD19 양성 암 세포를 효과적으로 결합시켜, T 림프구를 활성화시키고, 사이토카인, 퍼포린, 입자 효소 및 Fas/FasL을 방출시켜 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 상기 항체는 MHC I 분자에 결합되지 않고, 공동-자극 분자를 필요로 하지 않는다.
여덟 번째 양태에서, 본 발명은 세 번째 양태에서 기술된 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA의 용도, 네 번째 양태에서 기술된 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA의 제조 방법의 용도, 다섯 번째 양태에서 기술된 숙주의 용도, 여섯 번째 양태에서 기술된 유전자 조작된 항체의 용도, 및 일곱 번째 양태에서 기술된 유전자 조작된 항체의 제조 방법의 용도를 제공한다.
바람직하게, 세 번째 양태에서 기술된 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA, 네 번째 양태에서 기술된 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA의 제조 방법, 다섯 번째 양태에서 기술된 숙주, 여섯 번째 양태에서 기술된 유전자 조작된 항체, 및 일곱 번째 양태에서 기술된 유전자 조작된 항체의 제조 방법은 암을 위한 약제에 사용될 수 있다.
보다 바람직하게, 세 번째 양태에서 기술된 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA, 네 번째 양태에서 기술된 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA의 제조 방법, 다섯 번째 양태에서 기술된 숙주, 여섯 번째 양태에서 기술된 유전자 조작된 항체, 및 일곱 번째 양태에서 기술된 유전자 조작된 항체의 제조 방법은 CD19 또는 CD20 양성 암 질환을 위한 약제에 사용될 수 있다.
아홉 번째 양태에서, 본 발명은
(1) 단독으로 미니서클 DNA를 적용하는 방법;
(2) 화학요법, 방사선요법, 수술, 생물요법 및 면역요법 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 미니서클 DNA를 적용하는 방법;
(3) 미니서클 DNA를 표적 전달 접근법에 의해 치료받을 환자에게 전달하는 방법; 및
(4) 면역 효과기 세포를 시험관내 형질감염 기술에 의해 미니서클 DNA로 형질감염시키고, 이어서 상기 미니서클 DNA로 형질감염된 면역 효과기 세포를 치료받을 환자에게 전달하는 방법
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 임의의 하나 이상의 방법을 포함하는, 일곱 번째 양태의 유전자 조작된 항체를 적용하는 방법을 제공한다.
바람직하게, 방법 (4)에서, 면역 효과기 세포는 T 림프구, 자연 살해 세포, 대식세포 및 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게, 방법 (4)에서, 면역 효과기 세포는 CIK 세포 또는 D-CIK 세포이다.
열 번째 양태에서, 본 발명은
(1) 암 또는 종양을 치료하기 위해 단독으로 미니서클 DNA를 적용하는 방법;
(2) 암 또는 종양을 치료하기 위해 화학요법, 방사선요법, 수술, 생물요법 및 면역요법 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 미니서클 DNA를 적용하는 방법;
(3) 암 또는 종양을 치료하기 위해 미니서클 DNA를 표적 전달 접근법에 의해 치료받을 환자에게 전달하는 방법; 및
(4) 암 또는 종양을 치료하기 위해 면역 효과기 세포를 시험관내 형질감염 기술에 의해 미니서클 DNA로 형질감염시키고, 이어서 상기 미니서클 DNA로 형질감염된 면역 효과기 세포를 환자에게 전달하는 방법
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 포함하는, 암 또는 종양을 치료하기 위해 유전자 조작된 항체를 사용하는 방법을 제공한다.
바람직하게, 유전자 조작된 항체는 본 발명의 일곱 번째 양태에서 기술된 바와 같거나, 유전자 조작된 항체는 본 발명의 여덟 번째 양태에서 기술된 방법에 의해 제조된다.
바람직하게, 방법 (4)에서, 면역 효과기 세포는 T 림프구, 자연 살해 세포, 대식세포 및 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
방법 (4)에서, 면역 효과기 세포는 CIK 세포 또는 D-CIK 세포이다.
바람직하게, 방법 (4)에서, 0.01 내지 0.04 ㎍/㎕의 유전자 조작된 항체를 4x104 내지 16x104의 면역 효과기 세포와 혼합한다.
보다 바람직하게, 유전자 조작된 항체는 항-CD20xCD3 유전자 조작된 항체 및 CD19xCD3 유전자 조작된 항체 중 하나 이상이다.
바람직하게, 방법 (4)에서, 유전자 조작된 항체는 본 발명의 일곱 번째 양태에서 기술된 하나 이상의 유전자 조작된 항체이다.
바람직하게, 방법 (4)에서, 유전자 조작된 항체는 본 발명의 여덟 번째 양태에서 기술된 방법과 같이 제조된 하나 이상의 유전자 조작된 항체이다.
상기 바람직한 조건 하에서, 면역 효과기 세포 및 표적화 세포의 수의 비는 2 내지 8:1의 범위이고, 이때 표적화 세포는 암 세포 또는 종양 세포이다.
attR 부위를 함유하는 미니서클 DNA는 전핵 플라스미드의 서열이 없고 인간 및 포유동물 세포의 염색체 DNA를 함유하지 않아서, 유전자 조작된 항체의 안정하고 지속적인 발현을 제공한다. 미니서클 DNA는 표적화 치료에 단독으로 사용되어, 예를 들어, 유전자 조작된 항체의 발현을 위해 환자에게 전달되어, T 세포가 종양 세포를 특이적으로 사멸시키게 할 수 있다.
본 발명의 미니서클 DNA는 시험관내 환자의 면역 효과기 세포를 형질감염시키기 위해 사용될 수 있고, 이어서, 미니서클 DNA로 형질감염된 면역 효과기 세포는 치료받을 환자에게 전달된다.
본 발명의 미니서클 DNA는 화학요법, 방사선요법, 수술, 생물요법 및 면역요법과 함께 치료에 사용될 수 있다.
본 발명은 하기 이점을 제공한다:
(1) 본 발명에 의해 제공된 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드는 숙주 균주에서 재조합 과정을 완료하여, 원핵 플라스미드 요소를 제거하여 유전자 조작된 항체를 갖는 미니서클 DNA를 형성한다.
(2) 유전자 조작된 항체 유전자 카세트를 갖는 미니서클 DNA는 숙주 세포에서 유전자 조작된 항체 유전자의 장기적이고 안정한 발현을 제공한다. 미니서클 DNA는 바이러스 벡터보다 더 안전하고, 더 경제적이고, 통상적인 벡터보다 더 효과적이기 때문에, 미니서클 DNA는 일종의 효과적이고, 안전하고, 경제적인 유전자 치료 벡터이다. 또한, 미니서클 DNA는 Flag 태그 및 his6 태그를 갖는 유전자 조작된 항체를 발현시켜, 정제 및 후속 연구에 유리하다.
(3) 본 발명의 유전자 조작된 항체는 T 세포(CD3 항원 함유)를 종양 세포와 결합시키고, T 세포가 종양 세포를 사멸시키도록 유도할 수 있다.
(4) 유전자 조작된 항체 유전자 카세트를 갖는 미니서클 DNA, 상기 미니서클 DNA를 함유하는 숙주, 및 상기 미니서클 DNA에 의해 발현된 유전자 조작된 항체는, 암 환자에, 단독으로 사용될 수 있거나, 화학요법, 방사선, 수술, 생물요법 및 면역요법 중 하나 이상의 치료 접근법과 병용될 수 있다.
도 1은 실시예 1에서 제공된 pUC57 및 pCMV.bpA 벡터를 도시한다.
도 2는 실시예 1에서 제공된 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드 p2φ31.Bab의 제조 방법을 도시한다.
도 3은 실시예 1에서 제공된 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드 pUC57.Bab를 도시한다.
도 4는 실시예 1에서 제공된 재조합 발현 벡터 pCMV.bpA.Bab를 도시한다.
도 5는 실시예 1에서 제공된 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드 p2φC31.Bab를 도시한다.
도 6은 실시예 2에서 제공된 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드 p2φC31.Bab를 사용하는 미니서클 DNA MC.Rab의 제조 방법을 도시한다.
도 7은 실시예 2에서 제공된 미니서클 DNA MC.Rab를 도시한다.
도 8은 실시예 6에서 제공된 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드 pMC.Bab의 제조 방법을 도시한다.
도 9는 실시예 6에서 제공된 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드 pMC.Bab를 도시한다.
도 10은 실시에 6에서 제공된 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드 pMC.Bab를 사용하는 미니서클 DNA MC.Rab의 제조 방법을 도시한다.
도 11은 유도 전 및 후에 효소로 절단된 실시예 2의 미니서클 DNA 재조합 플라스미드 p2φC31.Bab의 아가로스 겔 전기영동 결과를 도시한다.
도 12는 Raji에 대한 실시예 12의 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체의 결합을 유세포 분석기 분석 결과를 도시한다.
도 13은 실시예 17의 정제된 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체의 SDS-PAGE 결과를 도시한다.
도 14는 실시예 18의 항-CD20xCD3 유전자 조작된 항체의 유세포 분석기 분석 결과를 도시한다.
도 15는 실시예 19에서 CCK-8 세포를 사용하여 사멸 효율을 확인한 결과를 도시한다.
도 16 및 도 17은 CD19xCD3 및 CD20xCD3 BiTE에 의해 증폭된 D-CIK로 Raji 세포를 사멸시킨 검출 결과를 도시한다.
도 18 및 도 19는 B 림프종 마우스의 생존 곡선을 도시한다.
본 발명을 이하 바람직한 태양에 근거하여 상세히 설명한다. 본 발명의 사상 및 범주에서 벗어나지 않고 다양한 변화가 이루어질 수 있음이 이해될 것이다.
본 발명의 태양에서 사용된 플라스미드 벡터 pUC57, pCMV.bpA, 균주 DH5α 및 에스케리키아 콜라이 TOP 10은 인비트로겐 캄파니(Invitrogen Company)로부터 구입하였다. ZYCY10P3S2T 조작된 균주(에스케리키아 콜라이)는 에스비아이 캄파니(SBI Company)에서 구입하였다. 빈 p2φC31은 문헌[Chen ZY et al., Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo, Molecular Therapy, 2003, Volume 8, Number 3, 495-500]; 문헌[Chen ZY et al., Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo, Human Gene Therapy, 2005, Volume 16, Number 1, 126-131] 및 미국 특허 제 7,897,380 B2 호에 기술된 방법에 따라 제조하였다. 빈 플라스미드 pMC.BESPX 및 완전 게놈 서열의 제조 방법은 문헌[Chen ZY et al., A robust system for production of minicircle DNA vectors, Nature Biotechnology, 2010, Volume 28, Number 12, 1289-1291]에서 찾을 수 있다. 본원에 사용된 모든 시약은 시장에서 구입하였다.
실시예 1
유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드 p2φC31.Bab의 제조 방법은 하기 단계를 포함한다.
(1) 도 2-a에 도시된 바와 같은 유전자 조작된 항체 항-CD19xCD3 유전자(즉, CD19xCD3 BiTE)를 갖는 재조합 벡터 pUC57.Bab의 제조.
(1a) 본 발명자들은 완전 게놈 서열 합성 방식으로, 순차적으로 연결되는, HindIII 효소 부위-면역글로불린 κ쇄 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열(서열번호 24)-Flag 태그를 암호화하는 염기 서열(서열번호 25)-BiTE의 유전자 서열(서열번호 12-서열번호 21-서열번호 13-서열번호 22-서열번호 16-서열번호 19-서열번호 14)-His6 태그를 암호화하는 염기 서열(서열번호 26)-정지 코돈(TTA)-EcoRI 효소 부위의 염기 서열을 합성하였다(이때, 서열번호 12-서열번호 21-서열번호 13-서열번호 22-서열번호 16-서열번호 19-서열번호 14는 각각 BiTE를 암호화하는 VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3 염기 서열에 상응한다). 순차적으로 연결되는 염기 서열은 완전 게놈 합성 유전자의 이중-가닥 중 1개 가닥(DNA 단편)일 뿐이고, 다른 가닥은 순차적으로 연결되는 염기 서열에 상보적이다.
(1b) pUC57 벡터 및 단계 (1a)에서 합성된 염기 서열을 HindIII 및 EcoRI로 절단하였다. 결과를 아가로스 겔 전기영동으로 특성화하였다. 선형 pUC57 벡터 및 뉴클레오티드 단편을 회수하였다.
(1c) 본 발명자들은 단계 (1b)에서 수득된 뉴클레오티드 단편 및 선형 pUC57 벡터를 16 ℃에서 밤새 또는 실온에서 2 시간 동안 3:1의 몰비로 T4 DNA 리가제와 접합시킨 후, 형질전환을 위해 에스케리키아 콜라이 DH5α 균주 컴피턴트 세포 현탁액에 생성물을 첨가하고, 암피실린을 함유하는 LB 플레이트에 접종시켰다. 반응물을 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 2개의 효소(HindIII 및 EcoRI)를 사용하는 재조합 플라스미드 벡터 확인을 위해 단일 콜로니를 골라내었다. 본 발명자들은 서열분석에 의해 양성 클론을 추가로 확인하였다. 단계 (1a)에서 합성된 염기 서열과 동일한 뉴클레오티드 단편이 삽입된 벡터를 pUC57.Bab(4240bp)로 명명하였고, 이의 플라스미드 지도는 도 3에 도시된다.
(2) 도 2-b에 도시된 바와 같은 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 재조합 발현 벡터 pCMV.bpA.Bab의 제조.
(2a) pCMV.bpA 벡터 및 pUC57.Bad를 HindIII 및 EcoRI로 절단하였다. 결과를 아가로스 겔 전기영동으로 특성화하였다. 선형 pCMV.bpA 벡터 및 뉴클레오티드 단편을 회수하였다.
(2b) 본 발명자들은 단계 (2a)에서 수득된 뉴클레오티드 단편 및 선형 pCMV.bpA 벡터를 16 ℃에서 밤새 또는 실온에서 2 시간 동안 3:1의 몰비로 T4 DNA 리가제와 접합시킨 후, 형질전환을 위해 에스케리키아 콜라이 DH5α 균주 컴피턴트 세포 현탁액에 생성물을 첨가하고, 암피실린을 함유하는 LB 플레이트에 접종시켰다. 반응물을 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 2개의 효소(HindIII 및 EcoRI)를 사용하는 재조합 플라스미드 벡터 확인을 위해 단일 콜로니를 골라내었다. 본 발명자들은 서열분석에 의해 양성 클론을 추가로 확인하였다. 단계 (1a)에서 합성된 염기 서열과 동일한 뉴클레오티드 단편이 삽입된 벡터를 pCMV.bpA.Bab(4814bp)로 명명하였고, 이의 플라스미드 지도는 도 4에 도시된다.
(3) 도 2-c에 도시된 바와 같은 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드 p2φC31.Bab의 제조.
(3a) 단계 (1c)에서 골라낸 양성 클론을 배양하였다. pCMV.bpA.Bab 재조합 발현 벡터를 플라스미드 정제 키트(오메가 캄파니(OMEGA Company))를 사용하여 정제하였다.
(3b) 단계 (2a)에서 수득된 p2φC31 벡터 및 pCMV.bpA.Bab 재조합 발현 벡터를 SpeI 및 Psp OMI 엔도뉴클레아제로 절단하였다. 결과를 아가로스 겔 전기영동에 의해 특성화하였다. 선형 p2φC31 벡터 및 뉴클레오티드 단편(유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 함유하는 DNA 단편)을 회수하였다.
(3c) 본 발명자들은 단계 (2)에서 수득된 뉴클레오티드 단편 및 선형 p2φC31 플라스미드를 16 ℃에서 밤새 또는 실온에서 2 시간 동안 3:1의 몰비로 T4 DNA 리가제와 접합시킨 후, 형질전환을 위해 에스케리키아 콜라이 DH5α 균주 컴피턴트 세포 현탁액에 생성물을 첨가하고, 암피실린을 함유하는 LB 플레이트에 접종시켰다. 반응물을 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 2개의 효소(HindIII 및 EcoRI)를 사용하는 재조합 플라스미드 벡터 확인을 위해 단일 콜로니를 골라내었다. 본 발명자들은 서열분석에 의해 양성 클론을 추가로 확인하였다. p2φC31.Bab(12290bp)를 수득하였다. p2φC31.Bab는 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드이고, 이의 플라스미드 지도는 도 5에 도시된다.
실시예 2
도 6에 도시된 바와 같은 유전자 조작된 항체 유전자 카세트를 갖는 미니서클 DNA의 흐름도와 함께, 본 태양은, 하기의 단계를 포함하는, 유전자 조작된 항체 유전자 카세트를 갖는 미니서클 DNA의 제조 방법을 제공한다.
(1a) TOP 10을 실시예 1에서 수득된 p2φC31.Bab 플라스미드로 형질전환시키고, 밤새 배양하였다.
(1b) 단계 (1a)에서 수득된 배양 배지의 세균을 1% 아라비노스를 함유하는 새로운 유도 배지에 현탁시키고, 32 ℃에서 2 시간 동안 250 rpm으로 교반 하에 배양하였다. 본 발명자들은 φC31 재조합효소의 발현을 유도하여 attL 부위를 함유하는 세균 플라스미드(pBackbone) DNA 및 attR 부위를 함유하는 미니서클 DNA의 형성을 매개하였다.
(1c) 이어서, 배양 온도를 37 ℃로 상승시켰다. 본 발명자들은 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 유도하여 I-Sce1 부위에서 pBackbone을 절단하였다. pBackbone DNA 쇄를 세균의 엑소뉴클레아제로 신속히 분해시켰다. 유일한 염색체외 원형 DNA로서 미니서클 DNA를 친화성 컬럼으로 추출하였다. 유전자 조작된 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA(MC.Rab(2640bp))의 플라스미드 지도는 도 7에 도시된다.
실시예 3 내지 5
본 발명의 유리한 효과를 충분히 예시하기 위해, 본 발명자들은 실시예 3 내지 5를 또한 제공하고, 이때 실시예 3은 실시예 3(단계 (1a))에서의 BiTE의 염기 서열이 다음과 같은 점에서 실시예 1과 상이하다:
서열번호 12-서열번호 20-서열번호 13-서열번호 22-서열번호 15-서열번호 21-서열번호 17
실시예 4는 실시예 4(단계 (1a))에서의 BiTE의 염기 서열이 다음과 같은 점에서 실시예 1과 상이하다:
서열번호 13-서열번호 21-서열번호 12-서열번호 22-서열번호 14-서열번호 19-서열번호 16
실시예 5는 실시예 5(단계 (1a))에서의 BiTE의 염기 서열이 다음과 같은 점에서 실시예 1과 상이하다:
서열번호 13-서열번호 19-서열번호 12-서열번호 22-서열번호 18-서열번호 20-서열번호 15
실시예 3 내지 5에서, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 모 플라스미드를 실시예 2에 기술된 방법에 따라 제조하였다.
CD20xCD3 BiTE 를 함유하는 미니서클 DNA 모 플라스미드의 제조
본 발명의 유리한 효과를 충분히 예시하기 위해, 본 발명자들은 유전자 조작된 항체(CD20xCD3 BiTE)를 함유하는 미니서클 DNA를 제조하는 태양을 또한 제공하고, 이때 상기 태양은 상기 태양(단계 (1a))의 BiTE의 염기 서열이 다음과 같은 점에서 실시예 1과 상이하다:
서열번호 33-서열번호 21-서열번호 34-서열번호 22-서열번호 18-서열번호 20-서열번호 15
구체적으로, 완전 게놈 서열 합성 방식으로, 순차적으로 연결되는, HindIII 효소 부위-면역글로불린 κ쇄 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열(서열번호 24)-Flag 태그를 암호화하는 염기 서열(서열번호 25)-BiTE의 유전자 서열(서열번호 33-서열번호 21-서열번호 34-서열번호 22-서열번호 18-서열번호 20-서열번호 15)-His6 태그를 암호화하는 염기 서열(서열번호 26)-정지 코돈(TTA)-EcoRI 효소 부위의 염기 서열을 합성하였다(이때, 서열번호 33-서열번호 21-서열번호 34-서열번호 22-서열번호 18-서열번호 20-서열번호 15는 각각 BiTE를 암호화하는 VLCD20-링커1-VHCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3 염기 서열에 상응한다). 순차적으로 연결되는 염기 서열은 완전 게놈 합성 유전자의 이중-가닥 중 1개 가닥(DNA 단편)일 뿐이고, 다른 가닥은 순차적으로 연결되는 염기 서열에 상보적이다.
CD20xCD3 BiTE 를 함유하는 미니서클 DNA 의 제조
수득된, CD20xCD3 BiTE를 갖는 미니서클 DNA 모 플라스미드를 실시예 2에 기술된 방법에 따라 제조하였다.
실시예 6
유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드 pMC.Bab의 제조 방법은 하기의 단계를 포함한다.
(1) 실시예 1(단계 1)에 기술된 방법에 따른, 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체(BiTE) 유전자를 갖는 pUC57.Bab 재조합 벡터의 제조.
(2) 실시예 1(단계 2)에 기술된 방법에 따른, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 pCMV.bpA.Bab 재조합 벡터의 제조.
(3) 도 8에 도시된 바와 같은 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드 pMC.Bab의 제조.
(3a) 단계 (1c)로부터 골라낸 양성 클론을 배양하였다. pCMV.bpA.Bab 재조합 발현 벡터를 플라스마 정제 키트(오메가 캄파니)를 사용하여 정제하였다.
(3b) 단계 (2a)에서 수득된 pMC.BESPX 벡터 및 pCMV.bpA.Bap 재조합 발현 벡터를 SpeI 및 Psp OMI 엔도뉴클레아제로 절단하였다. 결과를 아가로스 겔 전기영동에 의해 특성화하였다. 선형 pMC.BESPX 벡터 및 뉴클레오티드 단편을 회수하였다.
(3c) 본 발명자들은 단계 (2)에서 수득된 뉴클레오티드 단편 및 선형 pMC.BESPX 플라스미드를 16 ℃에서 밤새 또는 실온에서 2 시간 동안 3:1의 몰비로 T4 DNA 리가제와 접합시킨 후, 형질전환을 위해 에스케리키아 콜라이 DH5α 균주 컴피턴트 세포 현탁액에 생성물을 첨가하고, 암피실린을 함유하는 LB 플레이트에 접종시켰다. 반응물을 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 2개의 효소(HindIII 및 EcoRI)를 사용하는 재조합 플라스미드 벡터 확인을 위해 단일 콜로니를 골라내었다. 서열분석에 의해 양성 클로닝을 추가로 확인하였다. pMC.Bab(6639bp)를 수득하였다. pMC.Bab는 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드이고, 이의 플라스미드 지도는 도 9에 도시된다.
실시예 7
도 10에 도시된 바와 같은 유전자 조작된 항체 유전자 카세트를 갖는 미니서클 DNA의 흐름도와 함께, 본 태양은, 하기의 단계를 포함하는, 유전자 조작된 항체 유전자 카세트를 갖는 미니서클 DNA의 제조 방법을 제공한다.
(1a) 조작된 균주 ZYCY10P3S2T를 실시예 6에서 수득된 pMC.Bab 플라스미드로 형질전환시키고, 밤새 배양하였다.
(1b) 단계 (1a)에서 수득된 배양 배지의 세균을 1% 아라비노스를 함유하는 새로운 유도 배지에 현탁시키고, 32 ℃에서 2 시간 동안 250 rpm으로 교반 하에 배양하였다. 본 발명자들은 φC31 재조합효소의 발현을 유도하여 attL 부위를 함유하는 세균 플라스미드(pBackbone) DNA 및 attR 부위를 함유하는 미니서클 DNA의 형성을 매개하였다.
(1c) 이어서, 배양 온도를 37 ℃로 상승시켰다. 본 발명자들은 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 유도하여 I-Sce1 부위에서 pBackbone을 절단하였다. pBackbone DNA 쇄를 세균의 엑소뉴클레아제로 신속히 분해시켰다. 유일한 염색체외 원형 DNA로서 미니서클 DNA를 친화성 컬럼으로 추출하였다. 유전자 조작된 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA(MC.Rab(2640bp))의 플라스미드 지도는 도 7에 도시된다.
pMC.BESPX는 p2φC31 벡터에 존재하는 φC31 재조합효소 및 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 염기 서열을 갖지 않으므로, 미니서클 DNA 상의 염기 서열 오염을 감소시켜, 미니서클 DNA 모 플라스미드가 더 우수한 질을 갖게 한다. pMC.BESPX는 φC31 재조합효소 및 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 염기 서열을 갖지 않으므로, 미니서클 DNA에 재조합효소 및 엔도뉴클레아제의 뉴클레오티드 서열의 오염을 감소시킬 수 있다. 그러나, 실시예 6의 미니서클 DNA 모 플라스미드는 미니서클 DNA를 생성하기 위해 ZYCY10P3S2T 조작된 균주와 함께 사용되었다. φC31 재조합효소 및 I-Sce1 엔도뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖지 않는 pMC.Bab는 생체내 부위-특이적 재조합을 야기하고 궁극적으로 미니서클 DNA, 즉, MC.Rab를 생성하기 위해 ZYCY10P3S2T 조작된 세균과 함께 사용되어야 하기 때문이다.
본 발명의 유리한 효과를 충분히 예시하기 위해, 유도 전 및 후에 효소로 절단된 실시예 6의 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드 pMC.Bab(6639bp)의 아가로스 겔 전기영동 결과를 제공한다. 도 11(a)에서 도시된 바와 같이, 레인 1은 EcoRI 및 SacII를 사용하여 아라비노스에 의해 유도된 정제된 플라스미드를 절단한 결과이다. 유일한 밴드의 출현은 모 플라스미드 pMC.Bab의 성공적인 재조합 및 두 종류의 원의 생성을 나타낸다. 세균 서열을 갖는 원은 세균내 효소에 의해 분해되는 반면, EcoRI 및 SacII를 갖지 않는 남은 미니서클 DNA(2640)는 절단될 수 없다, 즉, 밴드는 레인 1에서 나타난다. 레인 2는 DNA 마커, 1 Kb 플러스 DNA 래더(1 Kb Plus DNA Ladder)(인비트로겐에서 구입)이다. 레인 3은 아라비노스에 의한 유도 전에 정제된 플라스미드를 EcoRI 및 XCMI로 절단한 결과이다. 두 밴드의 출현은 pMC.Bab의 모 플라스미드가 유도 전에 ZYCY10P3S2T에 존재함을 나타낸다. 레인 4는 아라비노스에 의한 유도 전에 정제된 플라스미드를 EcoRI로 절단한 결과이다. 유일한 밴드의 출현은 ZYCY10P3S2T에서 모 플라스미드 pMC.Bab의 성공적인 형질절환을 나타낸다.
실시예 8 내지 10
본 발명의 유리한 효과를 충분히 예시하기 위해, 본 발명자들은 실시예 8 내지 10을 또한 제공하고, 이때 실시예 8은 실시예 8(단계 (1a))에서의 BiTE의 염기 서열이 다음과 같은 점에서 실시예 6과 상이하다:
서열번호 12-서열번호 20-서열번호 13-서열번호 22-서열번호 15-서열번호 21-서열번호 17
실시예 9는 실시예 9(단계 (1a))에서의 BiTE의 염기 서열이 다음과 같은 점에서 실시예 6과 상이하다:
서열번호 13-서열번호 21-서열번호 12-서열번호 22-서열번호 14-서열번호 19-서열번호 16
실시예 10은 실시예 10(단계 (1a))에서의 BiTE의 염기 서열이 다음과 같은 점에서 실시예 6과 상이하다:
서열번호 13-서열번호 19-서열번호 12-서열번호 22-서열번호 18-서열번호 20-서열번호 15
실시예 8 내지 10에서, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 모 플라스미드를 실시예 7에 기술된 방법에 따라 제조하였다.
CD20xCD3 BiTE 를 함유하는 미니서클 DNA 모 플라스미드( pMC . Bab - CD20 )의 제조
본 발명의 유리한 효과를 충분히 예시하기 위해, 본 발명자들은 유전자 조작된 항체(CD20xCD3 BiTE)를 함유하는 미니서클 DNA를 제조하는 태양을 또한 제공하고, 이때 상기 태양은 상기 태양(단계 (1a))의 BiTE의 염기 서열이 다음과 같은 점에서 실시예 6과 상이하다:
서열번호 33-서열번호 21-서열번호 34-서열번호 22-서열번호 16-서열번호 19-서열번호 14
구체적으로, 본 발명자들은 완전 게놈 서열 합성 방식으로, 순차적으로 연결되는, HindIII 효소 부위-면역글로불린 κ쇄 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열(서열번호 24)-Flag 태그를 암호화하는 염기 서열(서열번호 25)-BiTE의 유전자 서열(서열번호 33-서열번호 21-서열번호 34-서열번호 22-서열번호 16-서열번호 19-서열번호 14)-His6 태그를 암호화하는 염기 서열(서열번호 26)-정지 코돈(TTA)-EcoRI 효소 부위의 염기 서열을 합성하였다(이때, 서열번호 33-서열번호 21-서열번호 34-서열번호 22-서열번호 16-서열번호 19-서열번호 14는 각각 BiTE를 암호화하는 VLCD20-링커1-VHCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3 염기 서열에 상응한다). 순차적으로 연결되는 염기 서열은 완전 게놈 합성 유전자의 이중-가닥 중 1개 가닥(DNA 단편)일 뿐이고, 다른 가닥은 순차적으로 연결되는 염기 서열에 상보적이다.
CD20xCD3 BiTE 를 함유하는 미니서클 DNA 의 제조
수득된, CD20xCD3 BiTE를 갖는 미니서클 DNA 모 플라스미드를 실시예 7에 기술된 방법에 따라 제조하였다.
본 발명의 유리한 효과를 충분히 예시하기 위해, 유도 전 및 후에 효소로 절단된, CD20xCD3 BiTE를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드 pMC.Bab-CD20의 아가로스 겔 전기영동 결과를 제공한다. 도 11(b)에 도시된 바와 같이, 레인 1은 DNA 마커, 1 Kb 플러스 DNA 래더(인비트로겐에서 구입, NO. 10787026)이다. 레인 2는 아라비노스에 의한 유도 전에 정제된 플라스미드를 EcoRI 및 SacII로 절단한 결과이다. 유일한 밴드의 출현은 모 플라스미드 pMC.Bab의 성공적인 재조합 및 두 종류의 원의 생성을 나타낸다. 세균 서열을 갖는 원은 세균내 효소에 의해 분해되는 반면, EcoRI 및 SacII를 갖지 않는 남은 미니서클 DNA는 절단될 수 없다, 즉, 밴드는 레인 2에서 나타난다. 레인 3은 아라비노스에 의한 유도 전에 정제된 플라스미드를 EcoRI 및 XCMI로 절단한 결과이다. 두 밴드의 출현은 유도 전에 ZYCY10P3S2T에 모 플라스미드 pMC.Bab의 존재 및 ZYCY10P3S2T에서 모 플라스미드 pMC.Bab-2의 성공적인 형질절환을 나타낸다.
실시예 11
항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체를 발현시키고 정제하는 방법은 하기 단계를 포함한다.
(1) CHO 세포 및 CIK 세포에서 재조합 항체의 발현.
CHO 세포 및 CIK 세포를 슈퍼펙트(superfect) 플라스미드 형질감염 키트(인비트로겐 캄파니)를 사용하여 p2φC31.Bab 또는 MC.Rab로 형질감염시켰다. 무혈청 배지에서 3 일 동안 배양한 후에, CHO 세포 및 CIK 세포의 상등액을 수집하고, CD19xCD3 유전자 조작된 항체의 발현을 검출하기 위해 유세포 분석에 적용하였다.
(2) 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체의 정제.
CHO 세포 배양 상등액을 저온 초원심분리에 적용하고, 상등액을 수집하였다. 이어서, 수집된 상등액을 280 nm에서 모니터링하면서 니켈 컬럼 크로마토그래피에 적용하였다. 미결합 단백질을 세정액으로 용출시킨 반면, 결합 단백질을 용출제로 용출시켜 정제된 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체를 수득하였다. 본 발명자들은 ELISA 접근법에 의해 단백질 농도를 검출하였다. 수득된, 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체를 포함하는 용출제를 탈염시키고, 정제하고, 동결건조시키고, 이어서 장기 보존을 위해 -20 ℃에 두었다.
실시예 12
항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체를 사용하여 시험관내 결합 활성 측정 방법은 하기 단계를 포함한다.
(1) 유세포 분석에 의한 Raji 세포에 대한 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체의 결합 활성 검출.
(1a) 실험군으로서, 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체 및 Raji 세포를 1% 소 혈청 알부민(BSA), 및 0.02% 나트륨 아지드를 함유하는 포스페이트 완충 식염수(염색 완충액)와 혼합하였다. 대조군으로서, Raji 세포를 p2φC31 빈 플라스미드로 형질감염시키고, 얼음 위에서 30 분 동안 배양하였다.
(1b) 단계 (1a)에서 수득된 배양 용액을 원심분리에 적용하였다. 수득된 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 이소티오시아네이트(FITC)로 표지된 플루오레세인 His6 항체를 첨가하고, 얼음 위에서 30 분 동안 배양하였다.
(1c) 단계 (1b)에서 수득된 배양 용액을 원심분리한 후에, 수득된 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 본 발명자들은 세포를 200 ㎕의 염색 완충액으로 재현탁시키고, 유세포 분석에 의해 검출하였다. 결과는 도 12에 도시된다. 곡선 1은 대조군을 나타내는 반면, 곡선 2는 실험군을 나타낸다. 이것은 본 발명의 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체가 CD19 양성 Raji 세포에 결합할 수 있음을 나타낸다.
(2) 유세포 분석에 의한 Jurkat 세포에 대한 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체의 결합 활성의 검출.
(2a) 실험군으로서, 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체 및 Jurkat 세포를 1% 소 혈청 알부민(BSA), 및 0.02% 나트륨 아지드를 함유하는 포스페이트 완충 식염수(염색 완충액)와 혼합하고, 얼음 위에서 30 분 동안 배양하였다.
(2b) 단계 (2a)에서 수득된 배양 용액을 원심분리에 적용하였다. 수득된 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)로 표지된 항-마우스 His6 항체를 첨가하고, 얼음 위에서 30 분 동안 배양하였다.
(2c) 단계 (2b)에서 수득된 배양 용액을 원심분리한 후에, 수득된 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 본 발명자들은 세포를 200 ㎕의 염색 완충액으로 재현탁시키고, 유세포 분석에 의해 검출하였다. 결과는 본 발명의 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체가 CD19 양성 Raji 세포에 결합할 수 있음을 나타낸다.
실시예 13
항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체를 사용하여 시험관내 종양 세포 성장 활성을 억제하는 방법은 하기 단계를 포함한다.
(1) 본 발명자들은 건강한 지원자의 말초혈을 채취하고, T 림프구 분리액을 사용하여 말초혈 T 림프구를 분리한 후, 이것을 96-웰 세포 배양 플레이트에 접종하였다(1x104/웰, 200 ㎕).
(2) 본 발명자들은 상이한 농도로 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체를 제조한 후, 단계 (1)의 T-림프구 배양 웰에 첨가하였다. 상기 웰을 48 시간 동안 배양하고, 이어서 20 ㎕의 MTT 티아졸릴 블루 용액을 5 ㎎/㎖의 농도로 각 웰에 첨가한 후, 4 시간 동안 배양하였다.
(3) 단계 (2)의 배양된 T 림프구를 1,000 rpm/분의 속도로 10 분 동안 원심분리하였다. 배양 웰 중의 상등액을 제거하고, 이어서 200 ㎕의 다이메틸 설폭사이드(DMSO)를 10 분 동안 교반하면서 각 웰에 첨가하여 결정을 완전히 용해시켰다. 이어서, 효소-결합 면역흡착 검출기를 사용하여 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 세포 성장 곡선을 작성하였다.
본 발명의 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체는 T 림프구를 효과적으로 활성화시킬 수 있다.
실시예 14
항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA를 사용하여 시험관내 종양 세포 성장 활성을 억제하는 방법은 하기 단계를 포함한다.
(1) 본 발명자들은 건강한 지원자의 말초혈을 채취하고, T 림프구 분리액을 사용하여 말초혈 T 림프구를 분리한 후, 바이오-래드(BIO-RAD) 전기천공 시스템 장치를 사용하여, 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA(MC.Rab) 및 빈 벡터(p2φC31)로 따로따로 형질감염시켰다.
(2) 단계 (1)의 형질감염된 T 림프구를 96-웰 세포 배양 플레이트에 접종(1x104/웰, 200 ㎕)한 후, 48 시간 동안 배양하였다. 이어서, 20 ㎕의 MTT 티아졸릴 블루 용액을 5 ㎎/㎖의 농도로 각 웰에 첨가한 후, 4 시간 동안 배양하였다.
(3) 단계 (2)의 배양된 T 림프구를 1,000 rpm/분의 속도로 10 분 동안 원심분리하였다. 배양 웰 중의 상등액을 제거하고, 이어서 200 ㎕의 다이메틸 설폭사이드(DMSO)를 10 분 동안 교반하면서 각 웰에 첨가하여 결정을 완전히 용해시켰다. 이어서, 효소-결합 면역흡착 검출기를 사용하여 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 세포 성장 곡선을 작성하였다.
본 발명의 MC.Rab는 T 림프구를 효과적으로 형질감염시킬 수 있다.
실시예 15
항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체 및 CIK 세포를 사용하여 Raji 세포에 대해 매개된 세포독성을 측정하는 방법은 하기 단계를 포함한다.
(1) Raji 세포를 96-웰 세포 배양 플레이트에 접종하였다(1x104/웰, 200 ㎕). 부착 세포의 출현 후에, 재조합 항체를 상이한 농도로 세포 배양 웰에 첨가하면서, CIK 세포를 10:1, 20:1 및 40:1(E:T)의 CIK 세포(효과기 세포, E) 대 Raji 세포(표적 세포, T)의 비에 따라서 별도로 배양 플레이트에 첨가하였다. 효과기 세포 및 표적 세포를 별도로 배양하고 대조군(T)으로 사용하였다.
(2) 세포를 96 시간 동안 배양한 후, 20 ㎕의 MTT 티아졸릴 블루 용액을 5 ㎎/㎖의 농도로 각 웰에 첨가하고, 이어서 4 시간 동안 배양한 후, 1,000 rpm/분의 속도로 10 분 동안 원심분리하였다. 배양 웰 중의 상등액을 제거하고, 이어서 200 ㎕의 다이메틸 설폭사이드(DMSO)를 10 분 동안 교반하면서 각 웰에 첨가하여 결정을 완전히 용해시켰다.
(3) 효소-결합 면역흡착 검출기를 사용하여 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 세포 사멸 곡선을 작성하였다. 식 ODT-(ODE :T-ODE)/ODTx100%에 따라서, 사멸 효율을 산출하였다. 결과는 본 발명의 재조합 항체가 Raji 세포를 사멸하는 CIK 세포의 사멸 활성을 증가시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 16
항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체 및 CIK 세포를 사용하여 Raji 세포를 사멸하는 방법은 하기 단계를 포함한다.
(1) Raji 세포를 96-웰 세포 배양 플레이트에 접종하였다(1x104/웰, 200 ㎕). 부착 세포의 출현 후에, 바이오-래드 전기천공 시스템 장치에 의해, 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA(MC.Rab) 및 빈 벡터(p2φC31)로 CIK 세포를 형질감염시키고, 이어서 CIK 세포를 10:1, 20:1 및 40:1(E:T)의 CIK 세포(효과기 세포, E) 대 Raji 세포(표적 세포, T)의 비에 따라서 별도로 배양 플레이트에 첨가하였다. 효과기 세포(E) 및 표적 세포(T)를 별도로 배양하고 대조군으로 사용하였다.
(2) 세포를 96 시간 동안 배양한 후, 20 ㎕의 MTT 티아졸릴 블루 용액을 5 ㎎/㎖의 농도로 각 웰에 첨가하고, 이어서 4 시간 동안 배양한 후, 1,000 rpm/분의 속도로 10 분 동안 원심분리하였다. 배양 웰 중의 상등액을 제거하고, 이어서 200 ㎕의 다이메틸 설폭사이드(DMSO)를 10 분 동안 교반하면서 각 웰에 첨가하여 결정을 완전히 용해시켰다.
(3) 효소-결합 면역흡착 검출기를 사용하여 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 세포 사멸 곡선을 작성하였다. 식 ODT-(ODE :T-ODE)/ODTx100%에 따라서, 사멸 효율을 산출하였다. 결과는 본 발명의 MC.Rab가 Raji 세포를 사멸하는 CIK 세포의 사멸 활성을 증가시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 17
항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체 및 항-CD20xCD3 유전자 조작된 항체를 발현시키고 정제하는 방법은 하기 단계를 포함한다.
(1) 293F 세포에서 재조합 항체의 발현.
1.1 둔감화(habituated) 293F
293T 세포를 Expi 293 발현 배지에서 배양하였다. 293T 세포를 계대배양하여 발현 배지에 적응시켰다. 세포를 부착 세포로부터 현탁액으로 성장시켰다.
1.2 형질감염 시스템
둔감화 293F 세포의 세포 밀도를 발현 배지를 사용하여 1x106 세포/㎖로 조정하였다. 27 ㎖의 세포 현탁액을 각각의 75 cm2 배양 플라스크에 첨가하였다.
1.3 형질감염 단계(Expi293(상표) 발현 시스템 키트(라이프 테크놀로지스(Life technologies), 미국)의 지침에 따라 수행)
항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 및 항-CD20xCD3 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA를 하기 단계에 적용하였다.
(1') 30 ㎍의 미니서클 DNA를 1,500 ㎕의 Opti 무혈청 배지와 혼합하고, 실온에서 5 분 동안 반응시켰다. 81 ㎕의 293 시약을 1,500 ㎕의 Opti 무혈청 배지와 혼합하고, 실온에서 5 분 동안 반응시켰다.
(2') 반응 후에, 2개의 시험 용액을 혼합하고 실온에서 30 분 동안 배양하였다.
(3') 생성된 용액을 293F 세포를 함유하는 배양 플라스크에 첨가하였다.
(4') 세포를 37 ℃, CO2 5% (포화 습도)의 조건 하에 세포 배양기에서 16 내지 18 시간 동안 배양하였다. 이어서, 150 ㎕의 엑스피펙타민(ExpiFectamin) 293 형질감염 증강제 1 및 1,500 ㎕의 엑스피펙타민 293 형질감염 증강제 2를 각각의 배양 플라스크에 첨가하였다.
(5') 세포를 48 시간 동안 계속 배양하였다. 상등액을 수집하고 검출 또는 후속 시험에 적용하였다.
(2) 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체 및 항-CD20xCD3 유전자 조작된 항체의 정제.
단계 (1)에서 수득된, 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체를 함유하는 상등액 및 항-CD20xCD3 유전자 조작된 항체를 함유하는 상등액을 하기 단계에 적용하였다.
1.1 메카니즘: 표적 단백질은 Ni 충전제와 결합되고 이미다졸에 의해 고농도로 용출될 수 있는 His 단백질 태그를 가지므로, 표적 단백질의 정제를 달성한다.
1.2 정제 단계
(1) 표적 단백질을 함유하는 배양 배지를 Ni 충전제와 혼합하고 4 ℃에서 밤해 교반 테이블에 두어, 표적 단백질이 Ni 충전제와 완전히 결합되게 하였다.
(2) 배양 배지와 Ni 충전제의 혼합물을 컬럼 크로마토그래피에 적용하고, Ni 충전제를 수집하였다.
(3) 수집된 충전제를 20 mM의 이미다졸로 세척하여 비-표적 단백질을 제거하였다.
(4) 500 mM의 이미다졸을 사용하여 10 ㎖의 표적 단백질을 세척하였다.
(5) 용출된 표적 단백질을 10K 한외여과 컬럼에 의해 농축시키고, 이어서 PBS로 세척하여 이미다졸을 제거하였다. 이어서, 원심분리하였다. 한외여과 컬럼 상의 표적 단백질을 T551 배양 배지로 용해시키고 보존하였다. 정제된 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체 및 항-CD20xCD3 유전자 조작된 항체를 수득하였다.
본 발명의 유리한 효과를 충분히 예시하기 위해, 정제된 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체의 SDS-PAGE 상을 제공한다. 도 13에 도시된 바와 같이, 레인 1 내지 3은 상이한 로딩 양의 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체이다. 레인 4는 단백질 마커(터모 피셔(Thermo Fisher), No.: 26616)이다. 도 13은 정제된 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체, 55Ka의 생성을 나타낸다.
실시예 18
항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체를 사용하는 시험관내 결합 활성의 측정 방법은 하기 단계를 포함한다.
(1) 유세포 분석에 의한 항-CD20xCD3 유전자 조작된 항체 및 Raji 세포의 결합 활성의 검출.
(1a) 실험군, 대조군 1 및 대조군 3.
실험군: 실시예 17에서 수득된 정제된 항-CD20xCD3 유전자 조작된 항체를 1% 소 혈청 알부민(BSA), 및 0.02% 나트륨 아지드를 함유하는 포스페이트 완충 식염수(염색 완충액)와 혼합하고, 얼음 위에서 30 분 동안 배양하였다.
배양 용액을 원심분리에 적용하였다. 수득된 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)로 표지된 항-마우스 His6 항체를 첨가하고, 얼음 위에서 30 분 동안 배양하였다.
대조군 1: Raji 세포를 p2φC31 빈 플라스미드로 형질감염시켰다.
대조군 2: Raji 세포를 p2φC31 빈 플라스미드로 형질감염시키고, 이어서 얼음 위에서 30 분 동안 배양하였다.
배양 용액을 원심분리에 적용하였다. 수득된 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)로 표지된 항-마우스 His6 항체를 첨가하고, 얼음 위에서 30 분 동안 배양하였다.
(1b) 단계 (1a)의 배양 용액을 원심분리하고, 수득된 세포를 염색 완충액으로 2회 세척하였다. 본 발명자들은 세포를 200 ㎕의 염색 완충액으로 재현탁시키고, 유세포 분석에 의해 검출하였다. 결과는 도 14에 도시되고, 이때 곡선 1은 대조군 1이고, 곡선 2는 대조군 2이고, 곡선 3은 실험군이다. 결과는 본 발명의 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체가 CD20 양성 Raji 세포에 결합할 수 있음을 나타낸다.
실시예 19
유전자 조작된 항체 및 CIK 세포를 사용하여 Raji 세포에 대해 매개된 세포독성을 측정하는 방법은 하기 단계를 포함한다.
(1) Raji 세포를 96-웰 세포 배양 플레이트에 접종하였다(2x104/웰, 200 ㎕). 부착 세포의 출현 후에, 재조합 항체를 상이한 농도로 세포 배양 웰에 첨가하면서, 2:1, 40:1 및 8:1(E:T)의 CIK 세포(효과기 세포, E) 대 Raji 세포(표적 세포, T)의 비에 따라서 CIK 세포를 별도로 배양 플레이트에 첨가하였다(배양 배지는 TTS였다). 효과기 세포 및 표적 세포를 별도로 배양하고 대조군(T)으로 사용하였다. 실시예 17의 정제된 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체(CD19xCD3 BiTE로 나타냄), 항-CD20xCD3 유전자 조작된 항체(CD20xCD3 BiTE로 나타냄), CD19xCD3 BiTE와 CD20xCD3 BiTE의 결합물을 첨가하였다. T551 배양 배지만을 첨가한 블랭크 대조군을 표 1 및 표 2에 나타낸 바와 같이 설계하였다.
효과기 세포(E) 및 표적 세포(T)를 별도로 배양하고 대조군으로 사용하였다. 대조군을 사용하여 실험군과 비교하고 세포 사멸 효율을 산출하였다. 3개의 효과기 세포(E) 대조군이 존재하였다: 4x104/웰 CIK 세포(200 ㎕), 8x104/웰 CIK 세포(200 ㎕) 및 16x104/웰 CIK 세포(200 ㎕). 1개의 표적 세포(T) 대조군이 존재하였다: 2x104/웰 Raji 세포(200 ㎕).
상기 태양의 CIK 세포는 D-CIK 세포, 즉, 수지상 세포 활성화되고 사이토카인 유도된 살해 세포이다.
(2) 세포를 8 시간 동안 배양한 후, CCK-8을 첨가하였다. 24 시간 후에, 450 nm에서 검출을 수행하고 사멸 효율을 산출하였다.
CCK-8 세포 계수 키트(도진도(DOJINDO), NO.: CK04)를 상기 태양에서 사용하였다.
WST-8을 함유하는 시약은 전자 운반체 1-메톡시 PMS의 존재 하에서 데하이드로게나제에 의해 수용성 황색 포르마잔으로 환원될 수 있다. 포르마잔의 양은 살아있는 세포의 수에 비례하는 동시에, 포르마잔의 양은 이의 흡광도(450 nm 파장에서의 흡광도)에 비례한다. 그러므로, ELISA를 이용하여 450 nm 파장에서 각 웰의 흡광도를 검출할 수 있고, 결과는 세포 증식 및 독성 특징의 분석에 이용될 수 있다.
본 발명의 유리한 효과를 충분히 설명하기 위해, CCK-8 세포 계수 키트를 미리 시험하여 상기 키트가 D-CIK 세포 및 Raji 세포에 적합한지를 확인하였다. 실험 결과는 도 15에 제시된다. 도 15로부터, D-CIK 세포(또는 Raji 세포)의 수와 450 nm에서의 흡광도 값 사이에 선형 관계가 존재하므로, CCK-8 세포 계수 키트를 상기 태양에 사용할 수 있음을 알 수 있다.
사멸 효율은, 하기 식을 사용하여, OD 값에 따른, 전환 후 세포 수에 따라 산출된다:
사멸 효율 = [1 - (효과기 세포 및 표적 세포 - 상응하는 효과기 세포)/상응하는 표적 세포] x 100%
이때,
"효과기 세포 및 표적 세포"는 효과기 세포 및 표적 세포를 함유하는 실험군을 나타내고;
"상응하는 효과기 세포" 및 "상응하는 표적 세포"는 효과기 세포 또는 표적 세포만을 함유하는 대조군을 나타낸다.
CD19xCD3 및 CD20xCD3 BiTE에 의해 증대된, D-CIK에 의한 Raji 세포 사멸의 검출 결과는 도 16 및 도 17에 도시된다.
효과기 세포의 농도, 표적 세포의 농도, 효과기 세포 및 표적 세포의 수의 비, 효과기 세포에 형질감염된 미니서클 DNA의 농도와 같은 도 16의 파라미터는 표 1에 제시된다.
Figure pct00001
표 1에서, 실험군 1은 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체 및 CIK 세포에 의해 Raji 세포를 사멸시키기 위해 설계되었다.
실험군 2는 항-CD20xCD3 유전자 조작된 항체 및 CIK 세포에 의해 Raji 세포를 사멸시키기 위해 설계되었다.
대조군에서, Raji 세포를 정상적으로 배양하였다.
도 16에서, 기호 "**"는 P<0.01을 나타내고, y-축은 효과기 세포 및 표적 세포의 수의 비이다. 2-1, 4-1 및 8-1은 각각 2:1, 4:1 및 8:1을 의미한다. x-축은 사멸 세포의 백분율이다. 도 16으로부터, 실험군 1 및 2가 Raji 세포 사멸에 관한 CIK 세포의 능력을 명백하게 증대시킬 수 있음을 알 수 있다.
또한, 동일한 농도의 유전자 조작된 항체 하에서, 효과기/표적의 비의 효능이 높을수록, CIK 세포는 Raji 세포를 사멸시키는데 더 강한 능력을 나타낸다. 즉, 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체 또는 항-CD20xCD3 유전자 조작된 항체에 의해 활성화된 CIK 세포는 Raji 세포를 사멸시키는데 더 강한 능력을 나타낸다.
효과기 세포의 농도, 표적 세포의 농도 및 유전자 조작된 항체의 농도와 같은 도 17의 파라미터는 표 2에 제시된다.
Figure pct00002
표 2에서, 실험군 1은 CD19xCD3 BiTE 및 CIK 세포에 의해 Raji 세포를 사멸시키기 위해 설계되었다.
실험군 2는 CIK 세포와 결합된 상이한 농도의 CD20xCD3 BiTE에 의해 Raji 세포를 사멸시키기 위해 설계되었다.
실험군 3은 CIK 세포와 결합된 상이한 농도의 혼합 항체(CD19xCD3 BiTE 및 CD20xCD3 BiTE)에 의해 Raji 세포를 사멸시키기 위해 설계되었다.
대조군에서, Raji 세포를 정상적으로 배양하였다.
도 17에서, 기호 "**"는 P<0.01을 나타내고, x-축은 사멸 세포의 백분율이다. 도 17로부터, 실험군 1 내지 3이 Raji 세포 사멸에 관한 CIK 세포의 능력을 명백하게 증대시킬 수 있음을 알 수 있다.
또한, 8:1의 효과기/표적 세포의 비, 0.01 내지 0.04 ㎍/㎕의 유전자 조작된 항체의 형질감염 농도의 조건 하에서, 실험군 1 내지 3의 CIK 세포는 Raji 세포를 사멸시키는데 더 강한 능력을 나타낸다.
상기 결과는, 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체, 항-CD20xCD3 유전자 조작된 항체, 및 항-CD19xCD3 및 항-CD20xCD3 유전자 조작된 항체의 혼합 항체가 T 세포를 상당히 활성화시키므로, 종양 세포 및 암 세포 사멸에 관한 T 세포의 능력을 개선시킬 수 있음을 나타냈다.
실시예 20
항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 및 CIK 세포를 사용하여 종양을 치료하는 방법은 하기 단계를 포함한다.
실험 동물은 차이니즈 메디신 래버러토리 애니멀 센터(Chinese Medicine Laboratory Animal Center)에서 입수하였다(NOD/SCID, 비-비만성 당뇨/중증 복합형 면역결핍).
실험군:
(a) 대조군: 동일 부피의 식염수;
(b) 종양 동물 모델군: Raji 세포 5x106/각 동물 주입;
(c) 치료군: Raji 세포 5x106/각 동물 주입, D-CIK 세포 5x106/각 동물 주입, 3회(하루에 한번, 3회);
(d) 병용 치료군: CD19xCD3 미니서클 DNA 주입, 1회 주입; Raji 세포 5x106/각 동물 주입, D-CIK 세포 5x106/각 동물 주입, 3회(하루에 한번, 3회).
실험 절차
(1) 영양소 용액(PBS 용액)을 사용하여 종양 세포의 (0.7 내지 1.9)x106 세포/㎖ 현탁액을 제조하였다. 40마리 마우스에게 Raji 세포 5x106을 복강내 주입하였다(대조군에서는 동일 부피의 식염수를 주입하였다). 9 내지 21일 후에, 림프종 마우스 모델이 수립되었다.
(2) 단계 (1)에서 수득된 림프종 마우스 모델을 실험군 (c) 및 (d)에 기술된 절차에 적용하였다. 치료군에 D-CIK 세포를 주입하고(하루에 한번, 3회); 병용 치료군에 CD19xCD3 미니서클 DNA를 1회 주입하고; D-CIK 세포를 주입하였다(5x106/각 동물, 하루에 한번, 3회). 대조군 및 종양 동물 모델군에는 동일 부피의 식염수를 주입하였다.
항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA로 처리된 B 림프종 마우스의 생존 곡선은 도 18(일) 및 도 19(주)에 도시된다. 도 18 및 도 19로부터, 대조군 및 종양 동물 모델군에 비해, 본 출원의 치료군 및 병용 치료군이 종양 사멸에 관한 능력을 나타냄을 알 수 있다. 그러나, 병용 치료군이 더 우수한 결과를 달성하였고, 림프종 마우스 모델의 생존 시간을 연장시켰다. 이것은 본 발명의 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA가 종양 치료에 사용될 수 있음을 나타냈다. 또한, 본 발명의 항-CD19xCD3 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA는 CIK 세포를 활성화시키고 종양 사멸에 관한 이의 능력을 증대시킬 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> SHENZHEN INSTITUTES OF ADVANCED TECHNOLOGY SHENZHEN HORNETCORN BIOTECHNOLOGY COMPANY, LTD. <120> MINICIRCLE DNA RECOMBINANT PARENTAL PLASMID HAVING GENETICALLY ENGINEERED ANTIBODY GENE EXPRESSION CASSETTE, A MINICIRCLE DNA HAVING THE EXPRESSION CASSETTE, AND APPLICATIONS <130> PCT15183XJY-KR <140> PCT/CN2014/083741 <141> 2014-08-05 <150> CN 201310339305.0 <151> 2013-08-06 <160> 34 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 1 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 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atggactact ggggccaagg gaccacggtc 360 accgtctcct cc 372 <210> 14 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 gacattcagc tgacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 atgacctgca gagccagttc aagtgtaagt tacatgaact ggtaccagca gaagtcaggc 120 acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaagtgg cttctggagt cccttatcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcatac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccaacagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggtgctggg 300 accaagctgg agctgaaa 318 <210> 15 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 15 gacattgtac tgacccagtc tccagcaact ctgtctctgt ctccagggga gcgtgccacc 60 ctgagctgca gagccagtca aagtgtaagt tacatgaact ggtaccagca gaagccgggc 120 aaggcaccca aaagatggat ttatgacaca tccaaagtgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gaccgactac tctctcacaa tcaacagctt ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccaacagtgg agtagtaacc cgctcacgtt cggtggcggg 300 accaaggtgg agatcaaa 318 <210> 16 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 16 gatatcaaac tgcagcagtc aggggctgaa ctggcaagac ctggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaaga cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaaacagagg 120 cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180 aatcagaagt tcaaggacaa ggccacattg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcaactga gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagatattat 300 gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357 <210> 17 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 17 gacgtccaac tggtgcagtc aggggctgaa gtgaaaaaac ctggggcctc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaggcaggca 120 cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180 gcagacagcg tcaagggccg cttcacaatc actacagaca aatccaccag cacagcctac 240 atggaactga gcagcctgcg ttctgaggac actgcaacct attactgtgc aagatattat 300 gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca cggtcaccgt ctcctca 357 <210> 18 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 18 gacgtccaac tggtgcagtc aggggctgaa gtgaaaaaac ctggggcctc agtgaaggtg 60 tcctgcaagg cttctggcta cacctttact aggtacacga tgcactgggt aaggcaggca 120 cctggacagg gtctggaatg gattggatac attaatccta gccgtggtta tactaattac 180 aatcagaagt tcaaggaccg cgtcacaatc actacagaca aatccaccag cacagcctac 240 atggaactga gcagcctgcg ttctgaggac actgcagtct attactgtgc aagatattat 300 gatgatcatt actgccttga ctactggggc caaggcacca cggtcaccgt ctcctca 357 <210> 19 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 19 gtcgaaggtg gaagtggagg ttctggtgga agtggaggtt caggtggagt cgac 54 <210> 20 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 20 ggcgaaggta ctagtactgg ttctggtgga agtggaggtt caggtggagc agac 54 <210> 21 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 21 ggtggtggtg gttctggcgg cggcggctcc ggtggtggtg gttct 45 <210> 22 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 22 ggaggtggtg gatcc 15 <210> 23 <211> 713 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 23 acgcgcgatg tacgggccag atatacgcgt tgacattgat tattgactag ttattaatag 60 taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt 120 acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg 180 acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat 240 ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct 300 attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg 360 gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg 420 ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact cacggggatt tccaagtctc 480 caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa 540 tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc 600 tatataagca gagctctctg gctaactaga gaacccactg cttactggct tatcgaaatt 660 aatacgactc actataggga gacccaagct ggctagcgtt taaacttaag ctt 713 <210> 24 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 24 atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactcc 57 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 25 gactacaaag atgatgacga taag 24 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 26 catcatcacc atcatcat 18 <210> 27 <211> 259 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 27 gtcgactggt gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc 60 tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat 120 gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg 180 caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc 240 tctatggaac cagctgggg 259 <210> 28 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 28 cgcgcccggg gagcccaaag gttaccccag ttggggc 37 <210> 29 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 29 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 30 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 30 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 31 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 31 ggtgccaggg cgtgcccttg ggctccccgg gcgcg 35 <210> 32 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 32 cccaactggg gtaacctttg agttctctca gttgggg 37 <210> 33 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 33 gatatcgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gcccgccagc 60 attagctgca ggtctagcaa gagcctcttg cacagcaatg gcatcactta tttgtattgg 120 tacctgcaaa agccagggca gtctccacag ctcctgattt atcaaatgtc caaccttgtc 180 tctggcgtcc ctgaccggtt ctcaggatcc gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240 agcagggtgg aggctgagga tgttggagtt tattactgcg ctcagaatct agaacttcct 300 tacaccttcg gcggagggac caaggtggag atcaaa 336 <210> 34 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 34 caggtgcaat tggtgcagtc tggcgctgaa gttaagaagc ctgggagttc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttcaggata cgccttcagc tattcttgga tcaattgggt gcggcaggcg 120 cctggacaag ggctcgagtg gatgggacgg atctttcccg gcgatgggga tactgactac 180 aatgggaaat tcaagggcag agtcacaatt accgccgaca aatccactag cacagcctat 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagaaatgtc 300 tttgatggtt actggcttgt ttactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcc 357

Claims (30)

  1. 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드로서, 상기 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드가 유전자 조작된 항체 유전자를 포함하는 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트의 유전자 서열을 미니서클 DNA 빈 플라스미드의 다중 클로닝 부위 내에 삽입시켜 수득되는, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드.
  2. (1) 유전자 조작된 항체 유전자를 포함하는 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트의 유전자 서열을 갖는 DNA 단편을 제공하거나 제조하는 단계; 및
    (2) 단계 (1)에서 수득된 DNA 단편을 미니서클 DNA 빈 플라스미드의 다중 클로닝 부위 내에 삽입시켜 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드를 수득하는 단계
    를 포함하는, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드의 제조 방법.
  3. 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA로서, 상기 미니서클 DNA가 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 원형 DNA이고, 상기 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트가 유전자 조작된 항체 유전자를 포함하는, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA.
  4. 제 3 항에 있어서,
    유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트가 신호 펩티드의 유전자 서열 및/또는 태그의 유전자 서열에 의해 유전자 조작된 항체 유전자에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 포함하는, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA.
  5. 제 3 항에 있어서,
    미니서클 DNA가 attR 부위 및 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 원형 DNA이고, 상기 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트가 하기 (a) 내지 (g)로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA:
    (a) A-a-B-d-e
    (b) A-b-B-d-e
    (c) A-B-c-d-e
    (d) A-a-b-B-c-d-e
    (e) A-a-B-c-d-e
    (f) A-a-b-B-d-e
    (g) A-b-B-c-d-e
    이때,
    A는 프로모터를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이고;
    B는 유전자 조작된 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이고;
    a는 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열을 나타내고;
    b는 Flag 태그를 암호화하는 염기 서열을 나타내고;
    c는 His6 태그를 암호화하는 염기 서열을 나타내고;
    d는 정지 코돈을 나타내고;
    e는 폴리A 테일링 신호를 나타내고;
    -는 각각의 염기 서열로 나타낸 유전자 단편 사이에서 작동가능하게 연결됨을 나타낸다.
  6. 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA로서, 상기 미니서클 DNA가 attR 부위 및 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 원형 DNA이고, 상기 유전자 발현 카세트가, 순차적으로 연결되는, 프로모터, 면역글로불린 κ쇄 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열, Flag 태그를 암호화하는 염기 서열, 유전자 조작된 항체 유전자, His6 태그를 암호화하는 염기 서열, 정지 코돈 및 폴리A 테일링 신호를 포함하는, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA.
  7. 제 6 항에 있어서,
    미니서클 DNA가 유전자 조작된 항체를 암호화하는 염기 서열을 갖고, 상기 유전자 조작된 항체가 이중-표적화 특이적 항체이고, 상기 이중-표적화 특이적 항체가 표적화 면역 효과기 세포 항원 에피토프 결합 부위 및 종양 세포 항원 에피토프 결합 부위를 갖는, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA.
  8. 제 7 항에 있어서,
    면역 효과기 세포가 T 림프구, 자연 살해 세포 및 대식세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA.
  9. 제 7 항에 있어서,
    종양 세포가 종양 세포의 B 림프구, 백혈병 세포, 폐암 세포, 위암 세포, 대장암 세포, 간암 세포, 식도암 세포, 유방암 세포, 췌장암 세포, 방광암 세포 및 갑상선암 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA.
  10. 제 7 항에 있어서,
    이중-표적화 특이적 항체가 종양 세포의 하나 이상의 항원 에피토프와 결합하는, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA.
  11. 제 6 항에 있어서,
    유전자 조작된 항체 유전자가 이중특이적 단일쇄 항체의 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열을 갖고, 상기 이중특이적 단일쇄 항체의 아미노산 서열의 연결 형태가 하기 (a) 내지 (h)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA:
    (a) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
    (b) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
    (c) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
    (d) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
    (e) VLCD20-링커1-VHCD20-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
    (f) VHCD20-링커1-VLCD20-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
    (g) VLCD20-링커1-VHCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
    (h) VHCD20-링커1-VLCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
    이때,
    VLCD19의 아미노산 서열은 서열번호 1에 제시된 서열이고;
    VHCD19의 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시된 서열이고;
    VLCD3의 아미노산 서열은 서열번호 3 및 서열번호 4에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
    VHCD3의 아미노산 서열은 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
    링커1의 아미노산 서열은 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
    링커2의 아미노산 서열은 서열번호 11에 제시된 서열이고;
    VLCD20의 아미노산 서열은 서열번호 29에 제시된 서열이고;
    VHCD20의 아미노산 서열은 서열번호 30에 제시된 서열이다.
  12. 제 6 항에 있어서,
    유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA가 숙주 균주에서 부위-특이적 재조합을 통해 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드로부터 생성되는, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA.
  13. (1) 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드를 제공하거나 제조하는 단계로서, 상기 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드가 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트의 유전자 서열을 미니서클 DNA 빈 플라스미드의 다중 클로닝 부위 내에 삽입함으로써 수득되고 부위-특이적 재조합 부위를 갖는, 단계;
    (2) 단계 (1)에서 수득된 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드로 숙주 균주를 형질전환시켜, 재조합효소의 존재 하에서 부위-특이적 재조합 부위의 부위-특이적 재조합을 통해 미니서클 DNA 및 주쇄 DNA를 생성하는 단계; 및
    (3) 단계 (2)에서 수득된 미니서클 DNA 및 주쇄 DNA를 단리하고 정제하는 단계로서, 상기 미니서클 DNA가 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 원형 DNA이고, 상기 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트가 유전자 조작된 항체 유전자를 포함하는, 단계
    를 포함하는, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA의 제조 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    부위-특이적 재조합 부위가 phiC31 부위-특이적 재조합 부위, parA 부위-특이적 재조합 부위 또는 Cre 부위-특이적 재조합 부위인, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA의 제조 방법.
  15. 제 13 항에 있어서,
    유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트가 유전자 조작된 항체 유전자에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 포함하고, 상기 프로모터가 신호 펩티드의 유전자 서열 및 태그의 유전자 서열 중 하나 이상에 의해 유전자 조작된 항체 유전자에 작동가능하게 연결되는, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA의 제조 방법.
  16. 제 13 항에 있어서,
    부위-특이적 재조합 부위가 attB 및 attP 부위이고, 상기 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트가 하기 (a) 내지 (g)로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA의 제조 방법:
    (a) A-a-B-d-e
    (b) A-b-B-d-e
    (c) A-B-c-d-e
    (d) A-a-b-B-c-d-e
    (e) A-a-B-c-d-e
    (f) A-a-b-B-d-e
    (g) A-b-B-c-d-e
    이때,
    A는 프로모터를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이고;
    B는 유전자 조작된 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이고;
    a는 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열을 나타내고;
    b는 Flag 태그를 암호화하는 염기 서열을 나타내고;
    c는 His6 태그를 암호화하는 염기 서열을 나타내고;
    d는 정지 코돈을 나타내고;
    e는 폴리A 테일링 신호를 나타내고;
    -는 각각의 염기 서열로 나타낸 유전자 단편 사이에서 작동가능하게 연결됨을 나타낸다.
  17. (1) 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드를 제공하거나 제조하는 단계로서, 상기 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드가 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트의 유전자 서열을 미니서클 DNA 빈 플라스미드의 다중 클로닝 부위 내에 삽입함으로써 수득되고, 상기 미니서클 DNA 빈 플라스미드가 p2φC31 플라스미드 또는 pMC.BESPX 플라스미드이고, 상기 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트가, 순차적으로 연결되는, 프로모터, 면역글로불린 κ쇄 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열, Flag 태그를 암호화하는 염기 서열, 유전자 조작된 항체 유전자, His6 태그를 암호화하는 염기 서열, 정지 코돈 및 폴리A 테일링 신호를 포함하는, 단계;
    (2) 단계 (1)에서 수득된 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA 재조합 모 플라스미드로 숙주 균주를 형질전환시켜, φC31 재조합효소의 존재 하에서 attL 부위를 함유하는 세균 플라스미드 DNA 및 attR 부위를 함유하는 미니서클 DNA를 비가역적으로 생성하는 단계; 및
    (3) attL 부위를 함유하고 단계 (2)에서 수득된 세균 플라스미드 DNA를 I-Sce 엔도뉴클레아제로 절단하여 선형 DNA 단편을 생성하고, 플라스미드가 숙주 균주에서 분해된 후에, attR 부위를 함유하는 미니서클 DNA를 통상적인 플라스미드 정제 키트를 사용하여 정제하는 단계로서, 상기 미니서클 DNA가 attR 부위 및 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 원형 DNA이고, 상기 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트가, 순차적으로 연결되는, 프로모터, 면역글로불린 κ쇄 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열, Flag 태그를 암호화하는 염기 서열, 유전자 조작된 항체 유전자, His6 태그를 암호화하는 염기 서열, 정지 코돈 및 폴리A 테일링 신호를 포함하는, 단계
    를 포함하는, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA의 제조 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    유전자 조작된 항체 유전자가 이중특이적 단일쇄 항체의 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열을 갖고, 상기 이중특이적 단일쇄 항체의 아미노산 서열의 연결 형태가 하기 (a) 내지 (h)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA의 제조 방법:
    (a) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
    (b) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
    (c) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
    (d) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
    (e) VLCD20-링커1-VHCD20-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
    (f) VHCD20-링커1-VLCD20-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
    (g) VLCD20-링커1-VHCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
    (h) VHCD20-링커1-VLCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
    이때,
    VLCD19의 아미노산 서열은 서열번호 1에 제시된 서열이고;
    VHCD19의 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시된 서열이고;
    VLCD3의 아미노산 서열은 서열번호 3 및 서열번호 4에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
    VHCD3의 아미노산 서열은 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
    링커1의 아미노산 서열은 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
    링커2의 아미노산 서열은 서열번호 11에 제시된 서열이고;
    VLCD20의 아미노산 서열은 서열번호 29에 제시된 서열이고;
    VHCD20의 아미노산 서열은 서열번호 30에 제시된 서열이다.
  19. (1) 단독으로 제 3 항에 따른 미니서클 DNA를 적용하는 방법;
    (2) 화학요법, 방사선요법, 수술, 생물요법 및 면역요법 중 하나와 함께 또는 이들의 조합과 함께 제 3 항에 따른 미니서클 DNA를 적용하는 방법;
    (3) 제 3 항에 따른 미니서클 DNA를 표적 전달 접근법에 의해 치료받을 환자에게 전달하는 방법; 및
    (4) 면역 효과기 세포를 시험관내 형질감염 기술에 의해 제 3 항에 따른 미니서클 DNA로 형질감염시키고, 이어서 상기 미니서클 DNA로 형질감염된 면역 효과기 세포를 치료받을 환자에게 전달하는 방법
    으로부터 선택되는, 제 3 항에 따른 미니서클 DNA를 적용하는 방법.
  20. 방법 (4)에서의 면역 효과기 세포가 T 림프구, 자연 살해 세포, 대식세포 및 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제 19 항에 따른 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA의 용도.
  21. 제 3 항에 따른 미니서클 DNA를 포함하는 숙주.
  22. 표적화 면역 효과기 세포 항원 에피토프 결합 부위 및 종양 세포 항원 에피토프 결합 부위를 갖는 이중-표적화 특이적 항체인 유전자 조작된 항체.
  23. 제 22 항에 있어서,
    유전자 조작된 항체가 이중특이적 단일쇄 항체이고, 상기 이중특이적 단일쇄 항체의 아미노산 서열의 연결 형태가 하기 (a) 내지 (h)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 유전자 조작된 항체:
    (a) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
    (b) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
    (c) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
    (d) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
    (e) VLCD20-링커1-VHCD20-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
    (f) VHCD20-링커1-VLCD20-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
    (g) VLCD20-링커1-VHCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
    (h) VHCD20-링커1-VLCD20-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
    이때,
    VLCD19의 아미노산 서열은 서열번호 1에 제시된 서열이고;
    VHCD19의 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시된 서열이고;
    VLCD3의 아미노산 서열은 서열번호 3 및 서열번호 4에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
    VHCD3의 아미노산 서열은 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
    링커1의 아미노산 서열은 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
    링커2의 아미노산 서열은 서열번호 11에 제시된 서열이고;
    VLCD20의 아미노산 서열은 서열번호 29에 제시된 서열이고;
    VHCD20의 아미노산 서열은 서열번호 30에 제시된 서열이다.
  24. (1) 유전자 조작된 항체 유전자를 포함하는 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 원형 DNA인 미니서클 DNA를 제공하거나 제조하는 단계; 및
    (2) 단계 (1)에서 수득된 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA로 숙주 세포를 형질감염시켜, 상기 숙주 세포에서 유전자 조작된 항체를 발현시키고 생성하는 단계
    를 포함하는, 유전자 조작된 항체의 제조 방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트가 유전자 조작된 항체 유전자에 작동가능하게 연결되는 프로모터를 포함하고, 상기 프로모터가 신호 펩티드의 유전자 서열 및 태그의 유전자 서열 중 하나 이상에 의해 유전자 조작된 항체 유전자에 작동가능하게 연결되는, 유전자 조작된 항체의 제조 방법.
  26. 제 24 항에 있어서,
    미니서클 DNA가 attR 부위 및 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 원형 DNA이고, 상기 유전자 발현 카세트가 하기 (a) 내지 (g)로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 유전자 조작된 항체의 제조 방법:
    (a) A-a-B-d-e
    (b) A-b-B-d-e
    (c) A-B-c-d-e
    (d) A-a-b-B-c-d-e
    (e) A-a-B-c-d-e
    (f) A-a-b-B-d-e
    (g) A-b-B-c-d-e
    이때,
    A는 프로모터를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이고;
    B는 유전자 조작된 항체를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이고;
    a는 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열을 나타내고;
    b는 Flag 태그를 암호화하는 염기 서열을 나타내고;
    c는 His6 태그를 암호화하는 염기 서열을 나타내고;
    d는 정지 코돈을 나타내고;
    e는 폴리A 테일링 신호를 나타내고;
    -는 각각의 염기 서열로 나타낸 유전자 단편 사이에서 작동가능하게 연결됨을 나타낸다.
  27. (1) 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA를 제공하거나 제조하는 단계로서, 상기 미니서클 DNA가 attR 부위 및 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 원형 DNA이고, 상기 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트가, 순차적으로 연결되는, 프로모터, 면역글로불린 κ쇄 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열, Flag 태그를 암호화하는 염기 서열, 유전자 조작된 항체 유전자, His6 태그를 암호화하는 염기 서열, 정지 코돈 및 폴리A 테일링 신호를 포함하는, 단계; 및
    (2) 단계 (1)에서 수득된 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA로 숙주 세포를 형질감염시켜, 상기 숙주 세포에서 유전자 조작된 항체를 발현시키고 생성하는 단계
    를 포함하는, 유전자 조작된 항체의 제조 방법.
  28. 제 27 항에 있어서,
    유전자 조작된 항체가 이중특이적 단일쇄 항체이고, 상기 이중특이적 단일쇄 항체의 아미노산 서열의 연결 형태가 하기 (a) 내지 (d)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 유전자 조작된 항체의 제조 방법:
    (a) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
    (b) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VLCD3-링커1-VHCD3
    (c) VLCD19-링커1-VHCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
    (d) VHCD19-링커1-VLCD19-링커2-VHCD3-링커1-VLCD3
    이때,
    VLCD19의 아미노산 서열은 서열번호 1에 제시된 서열이고;
    VHCD19의 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시된 서열이고;
    VLCD3의 아미노산 서열은 서열번호 3 및 서열번호 4에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
    VHCD3의 아미노산 서열은 서열번호 5, 서열번호 6 및 서열번호 7에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
    링커1의 아미노산 서열은 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10에 제시된 서열로부터 선택되는 서열이고;
    링커2의 아미노산 서열은 서열번호 11에 제시된 서열이다.
  29. 암을 위한 약제에 있어서, 제 3 항에 따른 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA의 용도.
  30. CD19 양성 암 질환을 위한 약제에 있어서, 제 3 항에 따른 유전자 조작된 항체 유전자 발현 카세트를 갖는 미니서클 DNA의 용도.
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