TW202024329A

TW202024329A - 包含核酸及car修飾的免疫細胞的治療劑及其應用

Info

Publication number: TW202024329A
Application number: TW108130348A
Authority: TW
Inventors: 胡放; 陳璨; 肖�琳; 傅瑾; 張蓉
Original assignee: 大陸商杭州優善生物科技有限公司; 大陸商杭州康萬達醫藥科技有限公司
Priority date: 2018-08-24
Filing date: 2019-08-23
Publication date: 2020-07-01
Also published as: EP3842051A4; WO2020038490A1; US20230321238A1; JP2021536435A; JP7546925B2; CN110856724A; CN112584849A; CN112584849B; TWI830771B; EP3842051A1; CN110856724B

Abstract

涉及包含核酸及CAR修飾的免疫細胞的治療劑及應用。該治療劑包含第一組合物和第二組合物，第一組合物包含用於導入腫瘤細胞和/或癌細胞的、具有標記性多肽編碼序列的核酸；該標記性多肽具有可操作地連接的胞外抗原決定區、間隔部分和跨膜部分，能夠經表達而修飾在該腫瘤細胞和/或癌細胞的表面；該胞外抗原決定區的氨基酸序列含有一或複數抗原表位多肽的氨基酸序列；其中在自然狀態下，哺乳動物細胞膜蛋白或分泌蛋白的氨基酸序列不含有該抗原表位多肽的氨基酸序列；該第二組合物包含嵌合抗原受體修飾的免疫細胞；該嵌合抗原受體修飾的免疫細胞能夠特異性識別並結合該標記性多肽的該胞外抗原決定區。本發明實現了協同療效。

Description

包含核酸及CAR修飾的免疫細胞的治療劑及其應用

本發明屬於醫學生物工程領域，具體而言，涉及包含核酸及CAR修飾的免疫細胞的治療劑、標記性多肽、嵌合抗原受體、編碼核酸、表達載體、重組病毒、藥盒及其應用。

癌症免疫治療是藉由活化體內的免疫系統，特異性地清除癌症微小殘留病灶或明顯抑制癌症細胞增殖的治療方法。這種治療方法具有作用期長和副作用小等優點，被稱為現代癌症治療的第4種模式。最近幾年，癌症免疫治療獲得了不少進展，《Science》雜志把癌症免疫治療列為2013年的重大科學突破。嵌合性抗原受體CAR修飾的免疫細胞是現在最有效、最有希望的腫瘤細胞免疫治療産品。CAR免疫細胞技術具有抗體藥的專一性與細胞療法的可持續性，是精準醫療，也是個性化醫療。在未來5年內，免疫療法，包括CAR免疫療法，有望取代化療，成為癌症治療的標準療法。CAR免疫療法目前主要以T-細胞為載體，在治療惡性血液癌症方面已取得革命性進展，全球市場達到百億美元。但CAR-T在實體瘤治療中當前的結果不佳，仍需要解決安全性、有效性和大規模生産等問題。這些問題解決後CAR免疫療法會逐漸滲透千億美元的實體瘤市場。

CAR是人工改造的受體，因此可將識別任意抗原的特異性受體嫁接到免疫效應細胞上。CAR的基礎設計中包括一個腫瘤相關抗原（tumor-associated antigen，TAA）結合區（通常來源於單殖株抗體抗原結合區域的scFV段），一個胞外鉸鏈區，一個跨膜區和一個胞內信號區。由於這種受體的不同部分有不同的來源，因此這種受體被稱為嵌合受體。簡單地說，CAR-T就是將識別腫瘤細胞表面抗原的抗體與活化T細胞所需的信號分子連接，這樣就可以讓T細胞在抗體的指引下直接進攻癌細胞。CAR免疫細胞技術克服了發展抗腫瘤免疫治療上一項高挑戰性問題，即腫瘤形成的免疫逃逸機制。逃逸機制可使腫瘤免受免疫系統的攻擊，主要包括處理加工抗原能力下降，組織相容性複合體表達下降，腫瘤表面抗原表達下降，細胞因子表達下降，免疫抑制性分子表達增加。CAR免疫細胞的靶標跟細胞毒性T淋巴細胞不同，不是攻擊腫瘤表面的藉由抗原提呈途徑被提呈的抗原，而是攻擊腫瘤表面特異性分子，可以是蛋白，也可以是其它非蛋白分子。這些分子的表達與腫瘤細胞抗原加工能力及組織相容性複合體表達無關。所以，CAR免疫細胞的功能不受組織相容性複合物相關調節的限制。

但CAR-T技術在治療實體瘤方面還存在很大的挑戰，主要難點包括：1）實體瘤表達高度異質性的腫瘤抗原，即是多樣性，使癌細胞容易逃過免疫系統的監視；這與血液癌症不一樣，如CD19白血病基本上都是CD19陽性；由於實體瘤抗原多樣性，很難找到能殺傷所有的癌細胞的合適靶點，殘餘的靶點陰性癌細胞會引起腫瘤復發；2）實體瘤腫瘤抗原很多在正常組織上也有表達，很難設計腫瘤專一性的CAR，脫靶機率很大，靶向/脫靶毒性的風險高；3）T細胞腫瘤歸巢差；實體腫瘤的細胞被緻密的基質包裹，形成腫瘤的微環境；基質由被募集來的正常組織和骨髓來源的（基質）細胞聚集而成，阻止免疫細胞穿透這一屏障；4）實體瘤有很強的免疫抑制能力，許多腫瘤微環境中的細胞能抑制免疫細胞抗癌功能；所以浸潤進入實體瘤的CAR-T也無法發揮高效癌細胞殺傷作用。

為解決上述先前技術中所存在的問題，本發明提供了治療劑、標記性多肽、嵌合抗原受體、編碼核酸、表達載體、重組病毒、藥盒及其應用。

具體而言，本發明提供了：（1）一種用於治療腫瘤和/或癌症的治療劑，包含：（a）第一組合物，其中該第一組合物包含位於第一可藥用載體中的第一活性成分，該第一活性成分包括或含有用於導入腫瘤細胞和/或癌細胞的、具有標記性多肽編碼序列的核酸；該標記性多肽具有可操作地連接的胞外抗原決定區、間隔部分和跨膜部分，能夠經表達而修飾在該腫瘤細胞和/或癌細胞的表面；該胞外抗原決定區的氨基酸序列含有一或複數抗原表位多肽的氨基酸序列；其中在自然狀態下，哺乳動物細胞膜蛋白或分泌蛋白的氨基酸序列不含有該抗原表位多肽的氨基酸序列；以及（b）第二組合物，其中該第二組合物包含位於第二可藥用載體中的第二活性成分，該第二活性成分包含嵌合抗原受體修飾的免疫細胞；所述的嵌合抗原受體修飾的免疫細胞能夠特異性識別並結合該標記性多肽的該胞外抗原決定區。

（2）根據（1）所述的治療劑，其中該抗原表位多肽的氨基酸序列來源於自然界存在的蛋白的氨基酸序列，或者為人工合成的自然界不存在的氨基酸序列。

（3）根據（2）所述的治療劑，其中該自然界存在的蛋白包括哺乳動物細胞內蛋白、病毒蛋白、和所有其它非哺乳動物蛋白。

（4）根據（1）所述的治療劑，其中該抗原表位多肽的氨基酸序列包括以下標籤的氨基酸序列：Myc標籤、HA標籤、Strep標籤II、Flag標籤、HAT標籤、S標籤、S1標籤、蛋白C標籤、tag-100標籤、E2標籤、TAP標籤、HSV標籤、KT3標籤、V5標籤、VSV-G標籤、His標籤或RFP標籤。

（5）根據（1）所述的治療劑，其中該胞外抗原決定區的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5所示。

（6）根據（1）所述的治療劑，其中該間隔部分來自CD8α的鉸鏈區、IgG的鉸鏈區或IgD的鉸鏈區；較佳地，該間隔部分的氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示；其中該跨膜部分來源於CD8、CD3ζ、CD4或CD28的跨膜區；較佳地，該跨膜部分的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示。

（7）根據（1）所述的治療劑，其中該標記性多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 15所示。

（8）根據（1）所述的治療劑，其中該核酸包括DNA或RNA；該RNA包括由該DNA轉錄的mRNA。

（9）根據（1）所述的治療劑，其中該第一活性成分為重組病毒，該重組病毒的基因組具有標記性多肽編碼序列；其中，該重組病毒包括選擇複製型重組溶瘤病毒或複製缺陷型重組病毒。

（10）根據（9）所述的治療劑，其中該重組溶瘤病毒來源於具有溶瘤作用的經基因突變的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒；較佳地，該重組溶瘤病毒來源於具有溶瘤作用的腺病毒、痘病毒、單純疱疹病毒、麻疹病毒、塞姆利基森林病毒、水疱性口炎病毒、脊髓灰質炎病毒、逆轉錄病毒、呼腸孤病毒、塞內卡谷病毒、埃可型腸道病毒、柯薩奇病毒、新城疫病毒和馬拉巴病毒。

（11）根據（1）所述的治療劑，其中該嵌合抗原受體包括可操作地連接的、依次串聯的抗原結合結構域、間隔區、跨膜區和胞內結構域，該抗原結合結構域能夠特異性識別並結合該標記性多肽的該胞外抗原決定區。

（12）根據（11）所述的治療劑，其中該抗原結合結構域的氨基酸序列如SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43或SEQ ID NO: 44所示。

（13）根據（11）所述的治療劑，其中該胞內結構域來自淋巴細胞胞內活化信號轉導區和可任選的淋巴細胞共刺激信號轉導區，其中該胞內活化信號轉導區選自CD3ζ或DAP12的胞內活化信號轉導區；該可任選的淋巴細胞共刺激信號轉導區選自4-1BB、CD28、CD27、OX40、GITR、和/或ICOSS的共刺激信號轉導區。

（14）根據（11）所述的治療劑，其中該間隔區來自CD8α的鉸鏈區、IgG的鉸鏈區或IgD的鉸鏈區，該跨膜區來自CD8α的跨膜區、CD3ζ的跨膜區、CD4的跨膜區或CD28的跨膜區。

（15）根據（11）所述的治療劑，其中該嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47或SEQ ID NO: 48所示。

（16）根據（1）所述的治療劑，其中該免疫細胞包括T細胞或NK細胞；其中，該NK細胞包括自體NK細胞、異體NK細胞或NK細胞株，並且該T細胞包括原始T細胞或其前體細胞，效應T細胞，記憶T細胞，NKT細胞，或T細胞株。

（17）根據（1）所述的治療劑，其中該第一組合物和該第二組合物各自獨立地存在於該治療劑中而互不混合。

（18）根據（8）所述的治療劑，其中該第一組合物包含治療有效量的該DNA、或治療有效量的該mRNA。

（19）根據（9）所述的治療劑，其中該第一組合物包含治療有效量的該重組病毒。

（20）根據（1）所述的治療劑，其中該第二組合物包含治療有效量的所述的嵌合抗原受體修飾的免疫細胞。

（21）根據（8）所述的治療劑，其中該DNA配製成藉由瘤內注射或靜脈給藥；該mRNA配製成藉由瘤內注射或靜脈給藥。

（22）根據（9）所述的治療劑，其中該重組病毒配製成藉由瘤內注射給藥或靜脈給藥。

（23）根據（1）所述的治療劑，其中所述的嵌合抗原受體修飾的免疫細胞配製成藉由靜脈給藥或局部給藥。

（24）根據（1）所述的治療劑，其中該治療劑由該第一組合物和該第二組合物組成。

（25）根據（1）-（24）中任一項所述的治療劑在製備用於治療腫瘤和/或癌症的藥物中的用途。

（26）根據（25）所述的用途，其中該腫瘤和/或癌症包括：乳腺癌、頭頸部腫瘤、滑膜癌、腎癌、結締組織癌、黑色素瘤、肺癌、食管癌、結腸癌、直腸癌、腦癌、肝癌、骨癌、絨毛膜癌、胃泌素瘤、嗜鉻細胞瘤、催乳素瘤、von Hippel-Lindau病、Zollinger-Ellison綜合症、肛門癌、膽管癌、膀胱癌、輸尿管癌、神經膠質瘤、神經母細胞瘤、腦膜瘤、脊髓腫瘤、骨軟骨瘤、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤、原發部位不明癌、類癌、纖維肉瘤、佩吉特病、宮頸癌、膽囊癌、眼癌、卡波西氏肉瘤、前列腺癌、睪丸癌、皮膚鱗狀細胞癌、間皮瘤、多尖端骨髓瘤、卵巢癌、胰腺內分泌瘤、胰高血糖素瘤、胰腺癌、陰莖癌、垂體癌、軟組織肉瘤、視網膜母細胞瘤、小腸癌、胃癌、胸腺癌、滋養細胞癌、葡萄胎、子宮內膜癌、陰道癌、外陰癌、蕈樣真菌病、胰島素瘤、心臟癌、腦膜癌、腹膜癌、胸膜癌和血液癌。

（27）一種標記性多肽，其中，該標記性多肽具有可操作地連接的胞外抗原決定區、間隔部分和跨膜部分，能夠經表達而修飾在腫瘤細胞和/或癌細胞的表面；該胞外抗原決定區的氨基酸序列含有一或複數抗原表位多肽的氨基酸序列；其中在自然狀態下，哺乳動物細胞膜蛋白或分泌蛋白的氨基酸序列不含有該抗原表位多肽的氨基酸序列。

（28）根據（27）所述的標記性多肽，其中該抗原表位多肽的氨基酸序列來源於自然界存在的蛋白的氨基酸序列，或者為人工合成的自然界不存在的氨基酸序列。

（29）根據（28）所述的標記性多肽，其中該自然界存在的蛋白包括哺乳動物細胞內蛋白、病毒蛋白、和所有其它非哺乳動物蛋白。

（30）根據（27）所述的標記性多肽，其中該抗原表位多肽的氨基酸序列包括以下標籤的氨基酸序列：Myc標籤、HA標籤、Strep標籤II、Flag標籤、HAT標籤、S標籤、S1標籤、蛋白C標籤、tag-100標籤、E2標籤、TAP標籤、HSV標籤、KT3標籤、V5標籤、VSV-G標籤、His標籤或RFP標籤。

（31）根據（27）所述的標記性多肽，其中該胞外抗原決定區的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5所示。

（32）根據（27）所述的標記性多肽，其中該間隔部分來自CD8α的鉸鏈區、IgG的鉸鏈區或IgD的鉸鏈區；較佳地，該間隔部分的氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示；其中該跨膜部分來源於CD8、CD3ζ、CD4或CD28的跨膜區；較佳地，該跨膜部分的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示。

（33）根據（27）所述的標記性多肽，其中該標記性多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 15所示。

（34）一種分離的、具有根據（27）-（33）中任一項所述的標記性多肽的編碼序列的核酸。

（35）根據（34）所述的核酸，其中該核酸依次包含可操作地連接的啓動子、信號肽編碼序列、以及根據（27）-（33）中任一項所述的標記性多肽的編碼序列。

（36）根據（34）所述的核酸，其中該核酸包括DNA和mRNA。

（37）一種重組表達載體，其中該重組表達載體依次包含可操作地連接的啓動子、信號肽編碼序列、以及根據（27）-（33）中任一項所述的標記性多肽的編碼序列。

（38）一種分離的重組病毒，其中該重組病毒的基因組具有依次的可操作地連接的啟動子、信號肽編碼序列、以及根據（27）-（33）中任一項所述的標記性多肽的編碼序列，並且該標記性多肽能夠經表達而修飾在腫瘤細胞和/或癌細胞的表面；並且，該重組病毒包括選擇複製型重組溶瘤病毒或複製缺陷型重組病毒。

（39）根據（38）所述的重組病毒，其中該重組病毒為選擇複製型重組溶瘤病毒，並且該重組溶瘤病毒來源於具有溶瘤作用的經基因突變的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒；較佳地，該重組溶瘤病毒來源於具有溶瘤作用的腺病毒、痘病毒、單純疱疹病毒、麻疹病毒、塞姆利基森林病毒、水疱性口炎病毒、脊髓灰質炎病毒、逆轉錄病毒、呼腸孤病毒、塞內卡谷病毒、埃可型腸道病毒、柯薩奇病毒、新城疫病毒和馬拉巴病毒。

（40）一種嵌合抗原受體，該嵌合抗原受體包括可操作地連接的、依次串聯的抗原結合結構域、間隔區、跨膜區和胞內結構域，其中，該抗原結合結構域能夠識別並結合根據（27）-（33）中任一項所述的標記性多肽的胞外抗原決定區。

（41）根據（40）所述的嵌合抗原受體，其中該抗原結合結構域的氨基酸序列如SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43或SEQ ID NO: 44所示。

（42）根據（40）所述的嵌合抗原受體，其中該胞內結構域來自淋巴細胞胞內活化信號轉導區和可任選的淋巴細胞共刺激信號轉導區，其中該胞內活化信號轉導區選自CD3ζ或DAP12的胞內活化信號轉導區；該可任選的淋巴細胞共刺激信號轉導區選自4-1BB、CD28、CD27、OX40、GITR、和/或ICOSS的共刺激信號轉導區。

（43）根據（40）所述的嵌合抗原受體，其中該間隔區來自CD8α的鉸鏈區、IgG的鉸鏈區或IgD的鉸鏈區，該跨膜區來自CD8α的跨膜區、CD3ζ的跨膜區、CD4的跨膜區或CD28的跨膜區。

（44）根據（40）所述的嵌合抗原受體，其中該嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47或SEQ ID NO: 48所示。

（45）一種分離的、具有根據（40）-（44）中任一項所述的嵌合抗原受體的編碼序列的DNA。

（46）根據（45）所述的DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54或SEQ ID NO: 55所示。

（47）一種分離的、由根據（45）或（46）所述的DNA轉錄的mRNA。

（48）一種重組表達載體，其中該重組表達載體依次包含可操作地連接的啓動子、信號肽編碼序列、以及根據（40）-（44）中任一項所述的嵌合抗原受體的編碼序列。

（49）一種嵌合抗原受體修飾的免疫細胞，該免疫細胞的表面被（40）-（44）中任一項所述的嵌合抗原受體修飾。

（50）根據（49）所述的嵌合抗原受體修飾的免疫細胞，其中該免疫細胞為NK細胞或T細胞；其中，該NK細胞包括自體NK細胞、異體NK細胞或NK細胞株，並且該T細胞包括原始T細胞或其前體細胞，效應T細胞，記憶T細胞，NKT細胞，或T細胞株。

（51）一種用於治療腫瘤和/或癌症的具有協同作用的聯合藥物的藥盒，包括：

第一容器，該第一容器裝有根據（1）-（24）中任一項所述的治療劑中的第一組合物；

第二容器，該第二容器裝有根據（1）-（24）中任一項所述的治療劑中的第二組合物，其中該第一容器和該第二容器是獨立的；以及

載明給藥時機和給藥方式的說明書。

（52）根據（34）-（36）中任一項所述的核酸在製備用於治療或預防腫瘤和/或癌症的藥物中的用途。

（53）根據（38）或（39）所述的重組病毒在製備用於治療或預防腫瘤和/或癌症的藥物中的用途。

（54）根據（49）或（50）所述的嵌合抗原受體修飾的免疫細胞在製備用於治療或預防腫瘤和/或癌症的藥物中的用途。

（55）根據（51）所述的藥盒在製備用於治療或預防腫瘤和/或癌症的藥物中的用途。

（56）根據（52）-（55）中任一項所述的用途，其中該腫瘤和/或癌症包括：乳腺癌、頭頸部腫瘤、滑膜癌、腎癌、結締組織癌、黑色素瘤、肺癌、食管癌、結腸癌、直腸癌、腦癌、肝癌、骨癌、絨毛膜癌、胃泌素瘤、嗜鉻細胞瘤、催乳素瘤、von Hippel-Lindau病、Zollinger-Ellison綜合症、肛門癌、膽管癌、膀胱癌、輸尿管癌、神經膠質瘤、神經母細胞瘤、腦膜瘤、脊髓腫瘤、骨軟骨瘤、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤、原發部位不明癌、類癌、纖維肉瘤、佩吉特病、宮頸癌、膽囊癌、眼癌、卡波西氏肉瘤、前列腺癌、睪丸癌、皮膚鱗狀細胞癌、間皮瘤、多尖端骨髓瘤、卵巢癌、胰腺內分泌瘤、胰高血糖素瘤、胰腺癌、陰莖癌、垂體癌、軟組織肉瘤、視網膜母細胞瘤、小腸癌、胃癌、胸腺癌、滋養細胞癌、葡萄胎、子宮內膜癌、陰道癌、外陰癌、蕈樣真菌病、胰島素瘤、心臟癌、腦膜癌、腹膜癌、胸膜癌和血液癌。

（57）一種治療腫瘤和/或癌症的方法，包括：對腫瘤和/或癌症患者施用根據（1）-（24）中任一項所述的治療劑中的第一組合物；和對該腫瘤和/或癌症患者施用根據（1）-（24）中任一項所述的治療劑中的第二組合物。

（58）根據（57）所述的方法，包括以下依次進行的步驟： 1）對該腫瘤和/或癌症患者施用該第一組合物；和 2）在施用該第一組合物之後，對該腫瘤和/或癌症患者施用該第二組合物。

（59）根據（57）所述的方法，其中該腫瘤和/或癌症包括：乳腺癌、頭頸部腫瘤、滑膜癌、腎癌、結締組織癌、黑色素瘤、肺癌、食管癌、結腸癌、直腸癌、腦癌、肝癌、骨癌、絨毛膜癌、胃泌素瘤、嗜鉻細胞瘤、催乳素瘤、von Hippel-Lindau病、Zollinger-Ellison綜合症、肛門癌、膽管癌、膀胱癌、輸尿管癌、神經膠質瘤、神經母細胞瘤、腦膜瘤、脊髓腫瘤、骨軟骨瘤、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤、原發部位不明癌、類癌、纖維肉瘤、佩吉特病、宮頸癌、膽囊癌、眼癌、卡波西氏肉瘤、前列腺癌、睪丸癌、皮膚鱗狀細胞癌、間皮瘤、多尖端骨髓瘤、卵巢癌、胰腺內分泌瘤、胰高血糖素瘤、胰腺癌、陰莖癌、垂體癌、軟組織肉瘤、視網膜母細胞瘤、小腸癌、胃癌、胸腺癌、滋養細胞癌、葡萄胎、子宮內膜癌、陰道癌、外陰癌、蕈樣真菌病、胰島素瘤、心臟癌、腦膜癌、腹膜癌、胸膜癌和血液癌。

本發明與先前技術相比具有以下優點和積極效果：本發明為了提高CAR修飾的免疫細胞治療腫瘤的效果，以及增加CAR修飾的免疫細胞治療腫瘤的適用範圍，提出用外源標記性多肽標記腫瘤和/或癌症細胞的表面以及採用與識別該標記性多肽的CAR修飾的免疫細胞聯用的策略，有效解決了腫瘤（特別是實體腫瘤）抗原表達的異質性和腫瘤和/或癌症細胞逃脫免疫監視的問題，提高了CAR修飾的免疫細胞對腫瘤和/或癌症細胞的識別敏感性，且有效降低靶向/脫靶毒性的風險，從而提高了CAR修飾的免疫細胞殺傷腫瘤細胞的療效。當藉由溶瘤病毒作為載體介導外源標記性多肽在腫瘤細胞中的表達時，在溶瘤病毒已有的溶瘤殺傷作用上，靶向標記性多肽的CAR修飾的細胞能有效清除已被溶瘤病毒感染的殘餘腫瘤細胞。同時由於溶瘤病毒破壞腫瘤的微環境，CAR修飾的細胞腫瘤歸巢能力會有所提高，進一步提升實體瘤治療的有效性。

具體而言，本發明首先設計了具有胞外抗原決定區、間隔部分和跨膜部分的標記性多肽氨基酸序列，以及具有該標記性多肽的編碼序列的核酸，使得該核酸在轉染腫瘤細胞和/或癌細胞後、或在將該核酸插入病毒基因組後使所得到的重組病毒感染腫瘤細胞和/或癌細胞後，腫瘤細胞和/或癌細胞能夠表達該標記性多肽，該標記性多肽會最終修飾在腫瘤細胞和/或癌細胞表面。由於該標記性多肽的胞外抗原決定區的氨基酸序列含有一或複數抗原表位多肽的氨基酸序列，因此本發明有效解決了實體腫瘤抗原表達的異質性和腫瘤逃避免疫監視的問題。本發明還提出將包括或含有該標記性多肽的編碼核酸的活性成分與識別胞外抗原決定區（特別是其中的抗原表位肽）的CAR修飾的免疫細胞聯用，提高了CAR修飾的免疫細胞對腫瘤細胞的識別敏感性，從而進一步提高了CAR修飾的免疫細胞殺傷腫瘤細胞的能力。並且由於在自然狀態下，哺乳動物細胞膜蛋白或分泌蛋白的氨基酸序列不含有該抗原表位多肽的氨基酸序列，因此識別外源標記性多肽的胞外抗原決定區（特別是其中的抗原表位肽）的CAR修飾的免疫細胞不會對患者體內其它的表面未修飾外源標記性多肽的正常細胞進行識別和殺傷，因此本發明大大降低了CAR修飾的免疫細胞可能對患者造成的脫靶毒性。

進一步地，本發明藉由溶瘤病毒將該標記性多肽編碼核酸導入腫瘤細胞和/或癌細胞，使得溶瘤病毒在殺傷腫瘤細胞和/或癌症細胞作用的同時，進一步達到上述顯著加強外源的抗原表位肽在腫瘤細胞表面的表達與CAR修飾的免疫細胞聯合所達到的協同治療效果。由於溶瘤病毒破壞了腫瘤的微環境，使得CAR修飾的免疫細胞的腫瘤歸巢能力提高，從而進一步提升腫瘤（特別是實體瘤）治療的有效性。此外，CAR修飾的免疫細胞還可以有效清除被溶瘤病毒感染後，不能完成複製周期並産生足夠數量的子病毒而發生裂解的腫瘤細胞；由此實現了進一步的協同作用。此外，被溶瘤病毒裂解的腫瘤細胞所釋放的抗原可進一步活化機體自身的抗腫瘤免疫，從而可實現比單獨使用溶瘤病毒或CAR修飾的免疫細胞更好的腫瘤殺傷效果，實現了協同治療效果。

本發明藉由上述發明構思提供了一個全新的腫瘤治療概念，具有成為有效的抗腫瘤生物藥的強大發展前景。定義

在本發明中，詞語“腫瘤”、“癌症”、“腫瘤細胞”、“癌細胞”涵蓋本領域通常認為的含義。

本文所用的詞語“溶瘤病毒”是指能夠選擇性地在腫瘤細胞中複製並裂解腫瘤細胞的病毒。

本文所用的詞語“治療有效量”是指功能藥劑或藥物組合物能夠表現出可檢測的治療效果或抑制效果的量，或者起到抗腫瘤效果的量。該效果可以藉由本領域任何已知的檢驗方法檢測。

本文所用的詞語“給藥”或“施用”是指向受試者提供化合物、複合物或組合物（包括病毒和細胞）。

本文所用的詞語“患者”是指人或非人類生物。因此，本文所述的方法和組合物適用於人類疾病和獸類疾病。在一些實施方案中，患者患有腫瘤。在一些例子中，患者同時患有一種或多種類型的癌症。

本文所用的詞語“協同效果”是指兩種或多種藥劑共同起到的效果，該效果大於其中各藥劑的單獨效果的總和。

本文所用的術語“pfu”或“蝕斑形成單位”（plaque forming unit）是指：產生一個蝕斑的病毒量稱為一個蝕斑形成單位（pfu）。

本文所用的術語“VP”是指病毒顆粒的個數。

本文所用的術語“VP/kg”是指病毒顆粒數/千克患者體重。

本文所用的術語“TCID50”是指半數組織培養感染劑量（median tissue culture infective dose），表示使半數組織培養物遭受感染，而發生細胞病變的病毒劑量。

本文所用的術語“MOI”或“感染複數”（Multiplicity of infection）也即，病毒與細胞個數比，是指用以起始病毒感染的每個細胞感染病毒顆粒的粒數。MOI=pfu/細胞，即細胞個數×MOI=總PFU。

以下藉由具體實施方式的描述並參照附圖對本發明作進一步說明，但這並非是對本發明的限制，本領域技術人員根據本發明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要不脫離本發明的基本思想，均在本發明的範圍之內。

本發明的發明人意識到上述先前技術中的不足，藉由理論研究和實驗驗證，設計了能夠經表達而修飾在該腫瘤細胞和/或癌細胞的表面並具有胞外抗原決定區的標記性多肽，並提出用該標記性多肽標記腫瘤和/或癌症細胞，並與識別該標記性多肽的CAR修飾的免疫細胞聯用的策略，有效解決了腫瘤（特別是實體腫瘤）抗原表達的異質性和腫瘤和/或癌症細胞逃脫免疫監視的問題，提高了CAR修飾的免疫細胞對腫瘤和/或癌症細胞的識別敏感性，並能有效降低靶向/脫靶毒性的風險，從而提高了CAR修飾的免疫細胞殺傷腫瘤細胞的能力。

具體而言，本發明一個方面提供了一種用於治療腫瘤和/或癌症的治療劑，包含：（a）第一組合物，其中該第一組合物包含位於第一可藥用載體中的第一活性成分，該第一活性成分包括或含有用於導入腫瘤細胞和/或癌細胞的、具有標記性多肽編碼序列的核酸；該標記性多肽具有可操作地連接的胞外抗原決定區、間隔部分和跨膜部分，能夠經表達而修飾在該腫瘤細胞和/或癌細胞的表面；該胞外抗原決定區的氨基酸序列含有一或複數抗原表位多肽的氨基酸序列；其中在自然狀態下，哺乳動物細胞膜蛋白或分泌蛋白的氨基酸序列不含有該抗原表位多肽的氨基酸序列；以及（b）第二組合物，其中該第二組合物包含位於第二可藥用載體中的第二活性成分，該第二活性成分包含嵌合抗原受體修飾的免疫細胞；所述的嵌合抗原受體修飾的免疫細胞能夠特異性識別並結合該標記性多肽的該胞外抗原決定區。

以下逐一對該治療劑中的活性成分進行詳細說明。 標記性多肽

本發明特別設計了用於修飾腫瘤細胞和/或癌細胞表面的標記性多肽的氨基酸序列，其中該標記性多肽具有可操作地連接的胞外抗原決定區、間隔部分和跨膜部分，能夠經表達而修飾在腫瘤細胞和/或癌細胞的表面；該胞外抗原決定區的氨基酸序列含有一或複數抗原表位多肽的氨基酸序列；其中在自然狀態下，哺乳動物細胞膜蛋白或分泌蛋白的氨基酸序列不含有該抗原表位多肽的氨基酸序列。

本文所用的術語“胞外抗原決定區”是指標記性多肽在表達於細胞表面時，位於細胞膜以外的含有抗原表位多肽的部分。

較佳地，該抗原表位多肽的氨基酸序列來源於自然界存在的蛋白的氨基酸序列，或者為人工合成的自然界不存在的氨基酸序列。其中，自然界存在的蛋白包括哺乳動物細胞內蛋白和除哺乳動物外的其它生物的蛋白。除哺乳動物外的其它生物的蛋白包括病毒蛋白、細菌蛋白、真菌蛋白、原生動物蛋白、植物蛋白、除哺乳動物外的其它動物蛋白。

在本發明的一些實施方案中，該抗原表位多肽的氨基酸序列來源於以下標籤的氨基酸序列：Myc標籤、HA標籤、Strep標籤II、Flag標籤、HAT標籤、S標籤、S1標籤、蛋白C標籤、tag-100標籤、E2標籤、TAP標籤、HSV標籤、KT3標籤、V5標籤、VSV-G標籤、His標籤或RFP標籤等。

上述標籤的氨基酸序列和核苷酸序列均為已知的，可以由本領域常用的公開資料庫查詢到。

在本發明的較佳實施方案中，該抗原表位多肽的氨基酸序列來源於以下標籤的氨基酸序列：人Myc標籤（相應的標記性多肽記為TT1）、流感病毒HA標籤（相應的標記性多肽記為TT2）、Strep標籤II（相應的標記性多肽記為TT3）。還較佳地，該抗原表位多肽的氨基酸序列與人Myc蛋白的第410位-第419位氨基酸序列一致；或者該抗原表位多肽的氨基酸序列與流感病毒HA蛋白的第119位-第127位氨基酸序列一致；或者該抗原表位多肽的氨基酸序列與Strep標籤II（Strep標籤II的詳細描述見文獻“Molecular Interaction Between the Strep-tag Affinity Peptide and its Cognate Target, Streptavidin, Thomas G. M. Schmidt, Jurgen Koepke, Ronald Frank and Arne Skerra”）一致。在本發明另一些實施方案中，TT1和TT2的抗原表位多肽的氨基酸序列可向上述序列的上下游擴展不超過10個氨基酸。其中，人Myc蛋白的氨基酸序列可為UniProtKB中編號為P01106 isoform1的氨基酸序列。流感病毒HA蛋白的氨基酸序列可為UniProtKB中編號為Q03909的氨基酸序列。

在一個具體實施方案中，該標記性多肽的胞外抗原決定區的氨基酸序列包括一或複數該抗原表位多肽的氨基酸序列，其中當該標記性多肽的胞外抗原決定區的氨基酸序列包括多個該抗原表位多肽的氨基酸序列時，每兩個相鄰的該抗原表位多肽之間是可操作地連接的，例如可以採用接頭連接，也可以不採用接頭而直接連接。該接頭的氨基酸序列可以為（例如）：G（如標記性多肽C1&2a、C1&2b中所採用）、GGS（如C1&2a、C1&2b中所採用）、GGGGSGGGGS（如TT1-TT3中所採用）。

為了增強標記性多肽的免疫原性，該標記性多肽的胞外抗原決定區較佳包含n個抗原表位多肽，其中n為大於等於1的整數，例如n=1、2、3、4…。較佳的是，n為1-10之間的整數；還較佳的是，n為2-5之間的整數；還較佳的是，n=2或3。例如，該標記性多肽的胞外抗原決定區可以包含3個重複的來源於Myc標籤的抗原表位多肽（參見（例如）TT1），或包含3個重複的來源於HA標籤的抗原表位多肽（參見（例如）TT2），或包含3個重複的來源於Strep標籤II的抗原表位多肽（參見（例如）TT3）、或包含3個重複的來源於Myc標籤的抗原表位多肽以及3個重複的來源於HA標籤的抗原表位多肽（參見（例如）C1&2a）、或包含2個重複的來源於Myc標籤的抗原表位多肽以及2個重複的來源於HA標籤的抗原表位多肽（參見（例如）C1&2b）。

在本發明的一個實施方案中，該胞外抗原決定區的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1（對應於TT1）、SEQ ID NO: 2（對應於TT2）、SEQ ID NO: 3（對應於TT3）、SEQ ID NO: 4（對應於C1&2a）、SEQ ID NO: 5所示（對應於C1&2b）。

較佳地，該跨膜部分來源於CD8、CD3ζ、CD4或CD28的跨膜區，其全長氨基酸序列和核苷酸序列均為已知的，可以由本領域常用的公開資料庫查詢到。還較佳地，該跨膜部分來源於人CD8α的跨膜區。更佳地，該跨膜部分的氨基酸序列包含如SEQ ID NO: 7所示的氨基酸序列。CD8為跨膜的糖基化膜蛋白，由α和β兩個亞基組成，與T細胞表面受體共同作用使T細胞與特定抗原結合，CD8特異性結合MHC I，介導細胞毒性T細胞的殺傷作用。跨膜區通常為跨越細胞膜的疏水性α螺旋。

在本發明的標記性多肽中，該跨膜部分與該胞外抗原決定區可以藉由間隔部分相連。這一區域的結構應該是易彎曲的，這樣可以使胞外抗原決定區適應不同的方向，以促進相應的CAR的識別和結合。形式最簡單的間隔部分是免疫球蛋白IgG l的鉸鏈區，也可以是免疫球蛋白C_H2 C_H3 區的一部分。藉由研究和實驗摸索，本發明發現，該間隔部分較佳來自CD8α的鉸鏈區，並且該跨膜區較佳來自CD8α的跨膜區。較佳地，該間隔部分的氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示。還較佳地，該間隔部分和跨膜部分構成間隔跨膜部分，並且其中該間隔跨膜部分的氨基酸序列與CD8α的第Y位-第210位氨基酸序列一致，且118≤Y≤128，Y為整數。其中，CD8α的氨基酸序列的UniProtKB編號可為P01732。也就是說，該間隔跨膜部分的氨基酸序列較佳選自CD8α的第118-210位氨基酸、並且包含第128-210位氨基酸。例如，該間隔跨膜部分的氨基酸序列如以下氨基酸序列組中任一氨基酸序列所示：CD8α的第118-210位氨基酸、第119-210位氨基酸、第120-210位氨基酸、第121-210位氨基酸、第122-210位氨基酸、第123-210位氨基酸、第124-210位氨基酸、第125-210位氨基酸、第126-210位氨基酸、第127-210位氨基酸、或第128-210位氨基酸。

本文所用的術語“間隔部分”和“跨膜部分”的定義是本領域已知的，具體可參考“《免疫學導論》，于善謙，高等教育出版社，2008”；以及“《Immunobiology》，第七版，Kenneth Murphy, Paul Travers, Mark Walport等”。

在本發明的具有標記性多肽編碼序列的核酸中，在標記性多肽編碼序列的5’端之前還較佳包含信號肽編碼序列，信號肽具有引導目的蛋白分泌到細胞表面的功能。本發明發現，將該胞外抗原決定區與來自GM-CSFα鏈的信號肽進行組合，可使標記性多肽表達於腫瘤細胞表面。GM-CSFα鏈信號肽是將本發明的標記性多肽靶向至分泌途徑的前導序列，其編碼序列首先與標記性多肽的編碼序列一起在細胞內被翻譯成蛋白質，引導合成的蛋白進入胞內分泌途徑。在細胞表面表達標記性多肽前，信號肽被去除。GM-CSFα鏈的全長氨基酸序列和核苷酸序列均為已知的，可以由本領域常用的公開資料庫查詢到。較佳地，該信號肽的氨基酸序列選自人GM-CSFα鏈的第1位-第22位氨基酸。更佳的，該信號肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示。其中，GM-CSFα鏈的氨基酸序列來自UniProtKB-P15509。

在本發明具體的實施方案中，該標記性多肽包括可操作地連接且依次串聯的以下氨基酸序列：胞外抗原決定區（其包括一或複數該抗原表位多肽的氨基酸序列）、間隔部分和跨膜部分。在本發明更具體的實施方案中，該胞外抗原決定區的抗原表位多肽的氨基酸序列來自以下多肽中的抗原表位多肽的氨基酸序列：源於人細胞內蛋白Myc的Myc標籤、源於流感病毒HA蛋白的HA標籤、人工合成自然界不存在的序列Strep標籤II，該間隔部分來自人CD8α鉸鏈區，該跨膜部分來自人CD8α跨膜區。

如上所述，信號肽和胞外抗原決定區之間、胞外抗原決定區和間隔部分之間、間隔部分和跨膜部分之間是可操作地連接的，例如可以採用接頭連接，也可以不採用接頭而直接連接。在本發明的一個實施方案中，信號肽和胞外抗原決定區之間採用接頭連接，例如為GAHADITS（如TT1-TT3中所採用）、GAHAAQLTLTKGNK（如C1&2a中所採用）、GAHA（如C1&2b中所採用）。胞外抗原決定區和間隔部分之間採用接頭連接，（例如）為-Ala-Ser-、G，而間隔部分和跨膜部分之間未採用接頭而直接連接。

本發明還進一步發現標記性多肽可以同時表達兩種抗原表位多肽，具體而言，本發明設計了標記性多肽C1&2a，其抗原決定區含有Myc標籤和HA標籤的各三個重複。本發明還設計了標記性多肽C1&2b，其抗原決定區含有Myc標籤和HA標籤的各兩個重複；為了進一步穩定標記性多肽在細胞膜表面的表達，在C1&2b的間隔部分加入了TIGIT的間隔區，其中該加入的間隔區的氨基酸序列與TIGIT的第24位-第140位氨基酸序列一致。其中，TIGIT的氨基酸序列來自UniProtKB-Q495A1。更佳的，該添加的TIGIT間隔的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，該C1&2b的間隔跨膜部分的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。

較佳地，該標記性多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11（對應於TT1）、SEQ ID NO: 12（對應於TT2）、SEQ ID NO: 13（對應於TT3）、SEQ ID NO: 14（對應於C1&2a）或SEQ ID NO: 15（對應於C1&2b）所示。

SEQ ID NO: 11： GAHADITSEQKLISEEDL GGGGSGGGGSEQKLISEEDL GGGGSGGGGSEQKLISEEDL GGGGSGGGGSASFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN 其中黑體示出抗原表位多肽，灰色部分示出來自CD8鉸鏈區的間隔部分，下劃線示出來自CD8跨膜區的跨膜部分。

SEQ ID NO: 12： GAHADITSYPYDVPDYA GGGGSGGGGSYPYDVPDYA GGGGSGGGGSYPYDVPDYA GGGGSGGGGSASFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN 其中黑體示出抗原表位多肽，灰色部分示出來自CD8鉸鏈區的間隔部分，下劃線示出來自CD8跨膜區的跨膜部分。

SEQ ID NO: 13： GAHADITSNWSHPQFEK GGGGSGGGGSNWSHPQFEK GGGGSGGGGSNWSHPQFEK GGGGSGGGGSASFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN 其中黑體示出抗原表位多肽，灰色部分示出來自CD8鉸鏈區的間隔部分，下劃線示出來自CD8跨膜區的跨膜部分。

SEQ ID NO: 14： GAHAAQLTLTKGNKEQKLISEEDL GEQKLISEEDL GEQKLISEEDL GGSYPYDVPDYA GYPYDVPDYA GYPYDVPDYA ASFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN 其中黑體示出抗原表位多肽，灰色部分示出來自CD8鉸鏈區的間隔部分，下劃線示出來自CD8跨膜區的跨膜部分。

SEQ ID NO: 15： GAHAEQKLISEEDL GEQKLISEEDL GGSYPYDVPDYA GYPYDVPDYA GTGTIETTGNISAEKGGSIILQCHLSSTTAQVTQVNWEQQDQLLAICNADLGWHISPSFKDRVAPGPGLGLTLQSLTVNDTGEYFCIYHTYPDGTYTGRIFLEVLESSVAEHGARFQIASFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN 其中黑體示出抗原表位多肽，深灰色部分示出間隔部分中來自TIGIT間隔區的部分，淺灰色部分示出間隔部分中來自CD8鉸鏈區的部分，下劃線示出來自CD8跨膜區的跨膜部分。 具有標記性多肽編碼序列的核酸

該標記性多肽編碼序列包含胞外抗原決定區編碼序列、間隔部分和跨膜部分編碼序列，該胞外抗原決定區編碼序列編碼該標記性多肽的胞外抗原決定區，該間隔部分編碼序列編碼該標記性多肽的間隔部分，該跨膜部分編碼序列編碼該標記性多肽的跨膜部分。該胞外抗原決定區編碼序列含有一或複數抗原表位多肽的編碼序列；其中在自然狀態下，哺乳動物細胞膜蛋白或分泌蛋白的編碼序列不含有該抗原表位多肽的編碼序列。

在本發明的一些實施方案中，該抗原表位多肽編碼序列來源於以下標籤的編碼序列：Myc標籤、HA標籤、Strep標籤II、Flag標籤、HAT標籤、S標籤、S1標籤、蛋白C標籤、tag-100標籤、E2標籤、TAP標籤、HSV標籤、KT3標籤、V5標籤、VSV-G標籤、His標籤或RFP標籤等。

較佳地，該抗原表位多肽編碼序列來源於以下標籤的氨基酸序列：Myc標籤的編碼序列、HA標籤的編碼序列、Strep標籤II的編碼序列。

在一個具體實施方案中，該標記性多肽的胞外抗原決定區編碼序列包括一或複數該抗原表位多肽的編碼序列，其中當該標記性多肽的胞外抗原決定區編碼序列包括多個該抗原表位多肽的編碼序列時，每兩個相鄰的該抗原表位多肽編碼序列之間是可操作地連接的，例如可以採用接頭編碼序列連接，也可以不採用接頭編碼序列而直接連接。

如上所述，為了增強標記性多肽的免疫原性，該標記性多肽的胞外抗原決定區較佳包含n個抗原表位多肽，其中n為大於等於1的整數，例如n=1、2、3、4…。較佳的是，n為1-10之間的整數；還較佳的是，n為2-5之間的整數；還較佳的是，n=2或3。例如，該標記性多肽的胞外抗原決定區可以包含3個重複的來源於人Myc蛋白的抗原表位多肽，或包含2個重複的來源於流感病毒HA蛋白的抗原表位多肽。因此，該標記性多肽的胞外抗原決定區編碼序列相應地較佳包含3個重複或2個重複的該抗原表位多肽編碼序列。

在本發明的較佳實施方案中，該胞外抗原決定區編碼序列的核苷酸序列如SEQ ID NO: 16（對應於TT1）、SEQ ID NO: 17（對應於TT2）、SEQ ID NO: 18（對應於TT3）、SEQ ID NO: 19（對應於C1&2a）或SEQ ID NO: 20（對應於C1&2b）所示。

較佳地，該跨膜部分編碼序列來源於CD8、CD3ζ、CD4或CD28的跨膜區的編碼序列。還較佳地，該跨膜部分編碼序列來源於人CD8α的跨膜區的編碼序列。更佳地，該跨膜部分編碼序列的核苷酸序列包含如SEQ ID NO: 21所示的核苷酸序列。

在該標記性多肽編碼序列中，該跨膜部分編碼序列與該胞外抗原決定區編碼序列可以藉由間隔部分編碼序列相連。形式最簡單的間隔部分是免疫球蛋白IgG l的鉸鏈區，也可以是免疫球蛋白C_H2 C_H3 區的一部分。藉由研究和實驗摸索，本發明發現，該間隔部分編碼序列較佳來自CD8α的鉸鏈區編碼序列，並且該跨膜部分編碼序列較佳來自CD8α的跨膜區編碼序列。較佳地，該間隔部分編碼序列的核苷酸序列如SEQ ID NO: 22所示。還較佳地，該間隔部分編碼序列和跨膜部分編碼序列構成間隔跨膜部分編碼序列，間隔部分和跨膜部分之間可以不採用接頭而直接連接。

在本發明的具有標記性多肽編碼序列的核酸中，在標記性多肽編碼序列的5’端之前還較佳包含信號肽編碼序列，該信號肽編碼序列編碼該信號肽，信號肽具有引導目的蛋白分泌到細胞表面的功能，其是將本發明的標記性多肽靶向至分泌途徑的前導序列，其編碼序列首先與標記性多肽的編碼序列一起在細胞內被翻譯成蛋白質，引導合成的蛋白進入胞內分泌途徑。在細胞表面表達標記性多肽前，信號肽被去除。

較佳地，該信號肽編碼序列的核苷酸序列來源於人GM-CSFα鏈的信號肽編碼序列。更佳的，該信號肽編碼序列的核苷酸序列如SEQ ID NO: 23所示。

在本發明具體的實施方案中，具有標記性多肽編碼序列的核酸中包括可操作地連接且依次串聯的以下編碼序列：信號肽編碼序列、胞外抗原決定區編碼序列（其包括一或複數該抗原表位多肽的編碼序列）、間隔部分編碼序列和跨膜部分編碼序列。在本發明更具體的實施方案中，該胞外抗原決定區的抗原表位多肽的編碼序列來自以下標籤的編碼序列：Myc標籤、HA標籤或Strep標籤II；該信號肽編碼序列來自人GM-CSFα鏈的信號肽編碼序列；該間隔部分編碼序列來自人CD8α鉸鏈區編碼序列，該跨膜部分編碼序列來自人CD8α跨膜區編碼序列。

如上所述，信號肽編碼序列和胞外抗原決定區編碼序列之間、胞外抗原決定區編碼序列和間隔部分編碼序列之間、間隔部分編碼序列和跨膜部分編碼序列之間是可操作地連接的，例如可以採用接頭編碼序列連接，也可以不採用接頭編碼序列而直接連接。在本發明的一個實施方案中，信號肽編碼序列和胞外抗原決定區編碼序列採用接頭編碼序列連接，例如，GGCGCGCATGCCGACATTACTAGT（如具有TT1-TT3編碼序列的核酸中所採用）、GGCGCGCATGCCGCTCAGTTGACATTGACGAAGGGCAATAAA（如具有C1&2a編碼序列的核酸中所採用）、GGCGCGCATGCC（如具有C1&2b編碼序列的核酸中所採用），胞外抗原決定區編碼序列和間隔部分編碼序列之間採用接頭編碼序列連接，（例如）為GCTAGC、GGG，而間隔部分編碼序列和跨膜部分編碼序列之間未採用接頭編碼序列而直接連接。

較佳地，在C1&2b的間隔部分編碼序列中加入了TIGIT間隔區編碼序列，其中該TIGIT間隔區編碼序列編碼TIGIT的第24位-第140位氨基酸。其中，TIGIT的氨基酸序列來自UniProtKB - Q495A1。較佳地，該TIGIT間隔區編碼序列包含如SEQ ID NO: 24所示的核苷酸序列。較佳地，該C1&2b的間隔跨膜部分編碼序列包含如SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列。

較佳地，該具有標記性多肽編碼序列的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO: 26（對應於TT1）、SEQ ID NO: 27（對應於TT2）、SEQ ID NO: 28（對應於TT3）、SEQ ID NO: 29（對應於C1&2a）或SEQ ID NO: 30（對應於C1&2b）所示。

較佳地，該具有標記性多肽編碼序列的核酸包括DNA或RNA；該RNA包括由該DNA轉錄的mRNA。

較佳地，該核酸依次包含可操作地連接的啟動子和該標記性多肽編碼序列。該啓動子的例子包括本領域已知的用於啓動下游DNA序列轉錄的任何啟動子，例如CMV啟動子、T7啟動子等。 重組病毒

在本發明一個實施方案中，該第一活性成分為重組病毒，該重組病毒的基因組具有依次的、可操作地連接的啟動子、信號肽編碼序列、該標記性多肽編碼序列；其中，該重組病毒包括選擇複製型重組溶瘤病毒或複製缺陷型重組病毒。

較佳地，該重組溶瘤病毒來源於具有溶瘤作用的經基因突變的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒；較佳地，該重組溶瘤病毒來源於具有溶瘤作用的腺病毒、痘病毒、單純疱疹病毒、麻疹病毒、塞姆利基森林病毒、水疱性口炎病毒、脊髓灰質炎病毒、逆轉錄病毒、呼腸孤病毒、塞內卡谷病毒、埃可型腸道病毒、柯薩奇病毒、新城疫病毒和馬拉巴病毒。

溶瘤病毒療法具有悠久的歷史，有很多種類的病毒已被改造用於溶瘤病毒研發，包括腺病毒、疱疹病毒、痘病毒、小核糖核酸病毒、副黏病毒、呼腸孤病毒、細小病毒、彈狀病毒。截止至目前，有兩種溶瘤病毒（H101和T-VEC）獲批可用於臨床腫瘤的治療。溶瘤病毒是經人工改造的病毒，這些病毒的致病基因被剔除，基本無法在正常組織細胞內複製，但是可以在腫瘤細胞內選擇性的複製以發揮溶瘤作用。以痘病毒為例，溶瘤痘病毒通常藉由遺傳生物工程手段利用同源重組技術剔除痘病毒內源性胸苷激酶（Thymidine Kinase，TK）基因或雙剔除TK和痘苗生長因子（Vaccinia growth factor，VGF）基因來建構。TK是DNA合成的關鍵酶之一，痘病毒在複製程序中需要藉助TK作用形成高濃度核酸池以完成子代順利複製。痘病毒常藉由VGF基因産物促進宿主及周邊細胞增殖，實現自身的複製增殖，而缺失VGF的痘病毒大大減弱了病毒對正常細胞的損傷。由於缺失TK和VGF基因，病毒在正常細胞內的複製能力受到限制，在溶瘤病毒載體上插入的外源性基因的表達也會受到極大的限制。但大多數腫瘤細胞環境內TK基因是高表達的狀態，為痘病毒的複製、包裝提供了有利的環境，使得痘病毒具有選擇性在腫瘤細胞內複製、溶瘤的功能，並且高表達在溶瘤病毒載體上插入的外源性基因。除了直接的溶瘤作用，溶瘤病毒還可以使腫瘤細胞釋放全息的腫瘤抗原以活化機體內在的抗腫瘤免疫，同時對腫瘤微環境具有一定的調節作用。

本發明將該標記性多肽編碼序列插入溶瘤病毒的基因組，從而將該標記性多肽編碼核酸導入腫瘤細胞和/或癌細胞，這樣在發揮溶瘤病毒殺傷腫瘤細胞和/或癌症細胞作用的同時，外源的抗原表位肽在腫瘤細胞表面表達與CAR修飾的免疫細胞聯合達到協同治療效果。由於溶瘤病毒破壞了腫瘤的微環境，使得CAR修飾的免疫細胞的腫瘤歸巢能力提高，從而進一步提升實體瘤治療的有效性。此外，CAR修飾的免疫細胞還可以有效清除被溶瘤病毒感染後，不能完成複製周期並産生足夠數量的子病毒而發生裂解的腫瘤細胞；由此實現了進一步的協同作用。此外，被溶瘤病毒裂解的腫瘤細胞所釋放的抗原可進一步活化機體自身的抗腫瘤免疫，從而可實現比單獨使用溶瘤病毒或CAR修飾的免疫細胞更好的腫瘤殺傷效果，實現了協同治療效果。

在本發明的一個實施方案中，所得到的選擇複製型重組溶瘤痘病毒的基因組中插入有具有標記性多肽編碼序列的核酸（其核苷酸序列可為（例如）SEQ ID NO: 26-30中任意一者）。

較佳地，該重組溶瘤病毒是TK基因和VGF基因功能缺陷型的重組溶瘤痘病毒。該TK基因可以藉由插入外源核苷酸序列而使該TK基因功能缺陷。該VGF基因可以藉由基因剔除或插入外源核苷酸序列而使該VGF基因功能缺陷，但較佳將該VGF基因剔除。

本發明在提及溶瘤病毒的基因時所使用的術語“功能缺陷”是指該溶瘤病毒無法發揮該基因應有的功能，即功能喪失，該目的可藉由（例如）在基因中插入外源片段或剔除該基因而實現。

還較佳地，該重組溶瘤痘病毒是惠氏株或WR株。

該標記性多肽編碼序列可以插入TK基因中，從而得到本發明所述的重組溶瘤病毒。該標記性多肽編碼序列也可以插入VGF基因中，從而得到本發明所述的重組溶瘤病毒。

在一個較佳的實施方案中，該重組溶瘤痘病毒是對VSC20痘病毒進行基因改造而得到的。VSC20痘病毒是VGF基因缺失的痘病毒，製備方法可參見科技文獻：“McCart, JA, et al. Systemic cancer therapy with a tumor-selective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes. Cancer Res (2001) 61: 8751–8757.”。該基因改造包括將外源標記性多肽編碼序列插入該VSC20痘病毒的TK基因中，從而使該TK基因功能缺陷。

該重組病毒的基因組中還可以整合有其它外源基因，例如外源篩選基因，該外源篩選基因包括嘌呤黴素基因、gpt基因和/或LacZ基因。該外源篩選基因可以在純化含有外源標記性多肽編碼基因的時候藉由基因剔除系統（例如，LoxP）剔除。

在一些實施方案中，本發明藉由分別使用痘病毒早/晚啟動子p7.5控制外源篩選基因，以及人工合成痘病毒早啓動子pSEL控制信號肽序列和外源標記性多肽編碼序列，使用體外細胞內重組技術將外源篩選基因編碼序列以及信號肽編碼序列和標記性多肽編碼序列插入到痘病毒VSC20株的TK基因區中，以此建構溶瘤病毒，兩個啓動子以背靠背的方式分別啓動各自調控基因的表達。

在本發明的另一個實施方案中，利用Crisper-Cas9基因編輯技術建構重組溶瘤痘病毒。

較佳地，該Crisper-Cas9基因編輯方法可以同時在一個基因的兩個位點進行剪切和進行同源重組，以達到一次性完成對一段序列進行剔除和轉基因插入的目的。

較佳地，該Crisper-Cas9基因編輯方法可以同時對靶序列和供體（donor）序列進行剪切，以提高同源重組的效率。

本發明所述的Crisper-Cas9基因編輯方法的剪切和同源重組的設計如第3圖和第4圖所示。

具體而言，該Crisper-Cas9體系可以包括先導RNA、供體DNA。

較佳地，先導RNA包括先導RNA-1和先導RNA-2。該先導RNA-1的核苷酸序列較佳與痘病毒TK基因中第123位到第145位核苷酸一致，該先導RNA-2的核苷酸序列較佳與痘病毒TK基因中第411位到第433位核苷酸一致，TK基因的核苷酸序列的Genbank編號可為AAO89373.1。較佳地，該先導RNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO: 31所示，該先導RNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO: 32所示。

較佳地，該供體DNA中左側同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO:33所示，右側同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO: 34所示。

較佳地，該供體DNA的核苷酸序列包含上述信號肽編碼序列（例如，SEQ ID NO:23）和標記性多肽編碼序列，並且同時含有puro-GFP編碼序列。該puro-GFP編碼序列的核苷酸序列如SEQ ID NO: 35所示。

該puro-GFP編碼序列較佳在核苷酸序列為SEQ ID NO: 36的啓動子的控制下，該信號肽編碼序列和標記性多肽編碼序列較佳在核苷酸序列為SEQ ID NO: 37的啓動子的控制下。

在本發明一個較佳的實施方案中，該供體DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO: 38所示。 嵌合抗原受體

該嵌合抗原受體包括可操作地連接的、依次串聯的抗原結合結構域、間隔區、跨膜區和胞內結構域，該抗原結合結構域能夠特異性識別並結合該標記性多肽的該胞外抗原決定區，該間隔區用於間隔抗原結合結構域和跨膜區，該胞內結構域用於信號傳遞。

本發明該術語“抗原結合結構域”、“間隔區”、“跨膜區”、“胞內結構域”的定義可參考“《免疫學導論》，于善謙，高等教育出版社，2008”；以及“《Immunobiology》，第七版，Kenneth Murphy, Paul Travers, Mark Walport等”。

該抗原結合結構域較佳是包括輕鏈和重鏈的單鏈抗體（ScFv），該輕鏈和重鏈可以藉由一段連接子彼此連接，如第1圖所示。

本發明進一步發現，較佳的是，靶向TT1的抗原結合結構域的輕鏈的氨基酸序列與抗Myc抗體（例如殖株9e10）的輕鏈的第1位-第111位氨基酸序列一致（在本發明另一些實施方案中，靶向TT1的抗原結合結構域的輕鏈的氨基酸序列可向上述序列的下游擴展不超過10個氨基酸），重鏈的氨基酸序列與抗Myc抗體（例如殖株9e10）的重鏈的第23位-第143位的氨基酸序列一致（在本發明另一些實施方案中，靶向TT1的抗原結合結構域的重鏈的氨基酸序列可向上述序列的上下游擴展不超過10個氨基酸）。

較佳的是，靶向TT2的抗原結合結構域的輕鏈的氨基酸序列與抗HA抗體（例如殖株12ca5）的輕鏈的第2位-第121位氨基酸序列一致（在本發明另一些實施方案中，靶向TT2的抗原結合結構域的輕鏈的氨基酸序列可向上述序列的下游擴展不超過10個氨基酸），重鏈的氨基酸序列與抗HA抗體（例如殖株12ca5）的重鏈的第2位-第114位氨基酸序列一致（在本發明另一些實施方案中，靶向TT2的抗原結合結構域的重鏈的氨基酸序列可向上述序列的下游擴展不超過10個氨基酸）。

較佳的是，靶向TT3的抗原結合結構域的輕鏈的氨基酸序列與抗Strep標籤II抗體（參見（例如）專利文獻EP2871189A1）的輕鏈一致，重鏈的氨基酸序列與抗Strep標籤II抗體（參見（例如）專利文獻EP2871189A1）的重鏈一致。

其中，抗Myc抗體（殖株9e10）輕鏈的氨基酸序列可以源自編號為PDB: 2ORB_L的氨基酸序列（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/2ORB_L），抗Myc抗體（殖株9e10）重鏈的氨基酸序列可以源自編號為GenBank: CAA73271.1的氨基酸序列（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/CAA73271.1?report=genbank&log$=protalign&blast_rank=1&RID=P597FX1S014），連接輕鏈和重鏈的連接子的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示。抗HA抗體（殖株12ca5）輕鏈的氨基酸序列可以源自編號為PDB: 5XCS_B的氨基酸序列（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/1258501213），抗HA抗體（殖株12ca5）重鏈的氨基酸序列可以源自編號為PDB: 5XCS_A的氨基酸序列（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/5XCS_A），連接輕鏈和重鏈的連接子的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:40所示。抗Strep標籤抗體輕鏈和重鏈的氨基酸序列可以源自專利文獻EP2871189A1所揭露的氨基酸序列，連接輕鏈和重鏈的連接子的氨基酸序列可以如SEQ ID NO:41所示。

更佳地，該靶向TT1、TT2和TT3的抗原結合結構域的氨基酸序列分別如SEQ ID NO:42-44所示。

胞內結構域起到信號傳遞從而活化T或NK細胞的作用。最初用於T細胞的CAR的胞內結構域只有一個信號分子，通常為免疫球蛋白E的受體相關Fc ε RI γ（與IgE有高親和力的受體的一個亞基）或T細胞抗原受體信號的基礎傳導分子CD3ζ；有的胞內結構域包含由一種或幾種T細胞活化基序組成的T細胞活化結構域。

較佳地，該胞內結構域來自淋巴細胞胞內活化信號轉導區和可任選的淋巴細胞共刺激信號轉導區（可包括0-2個共刺激信號轉導區）。較佳地，該胞內活化信號轉導區來自CD3ζ、DAP12的胞內信號區，共刺激信號轉導區來自4-1BB、CD28、CD27、OX40、GITR和/或ICOS的胞內信號區。

更佳地，本發明發現，將上述抗原結合結構域與來自4-1BB和CD3ζ的胞內信號區進行組合，可得到能夠使T或NK細胞發揮強烈的靶向殺瘤活性的CAR。較佳地，該胞內結構域的氨基酸序列選自4-1BB的第209-255位氨基酸以及CD3ζ的第52-164位氨基酸。其中，CD3ζ的氨基酸序列編號為UniProtKB - P20963，4-1BB的氨基酸序列的編號為UniProtKB - Q07011。該胞內結構域的氨基酸序列更佳如SEQ ID NO:45所示。

本發明更進一步選擇了間隔區和跨膜區，從而獲得了具有抗原結合結構域-間隔區-跨膜區-胞內結構域的特定組合的CAR。間隔區連接抗原結合結構域和跨膜區，這一區域的結構應該是易彎曲的，這樣可以使抗原結合結構域適應不同的方向，以促進相應的針對抗原的識別和結合。形式最簡單的間隔區是免疫球蛋白IgGl的鉸鏈區，也可以是免疫球蛋白C_H2 C_H3 區的一部分。跨膜區一般是跨越細胞膜的疏水性α螺旋。該間隔區可以來自CD8α的鉸鏈區、IgG的鉸鏈區或IgD的鉸鏈區，該跨膜區可以來自CD8α的跨膜區、CD3ζ的跨膜區、CD4的跨膜區或CD28的跨膜區。

藉由研究和實驗摸索，本發明發現，該間隔區更佳來自CD8α的鉸鏈區，該跨膜區更佳來自CD8α的跨膜區。CD8為跨膜的糖基化膜蛋白，由α和β兩個亞基組成，與T細胞表面受體共同作用使T細胞與特定抗原結合，CD8特異性結合MHC I，介導細胞毒性T細胞的殺傷作用。

更佳地，該間隔區和跨膜區構成間隔跨膜區，並且其中該間隔跨膜區的氨基酸序列與CD8α的第Y位-第210位氨基酸序列一致，且118≤Y≤128，Y為整數。其中，CD8α的氨基酸序列的UniProtKB編號可為P01732。也就是說，該間隔跨膜區的氨基酸序列較佳選自CD8α的第118-210位氨基酸、並且包含第128-210位氨基酸。例如，該間隔跨膜區的氨基酸序列如以下氨基酸序列組中任一氨基酸序列所示：CD8α的第118-210位氨基酸、第119-210位氨基酸、第120-210位氨基酸、第121-210位氨基酸、第122-210位氨基酸、第123-210位氨基酸、第124-210位氨基酸、第125-210位氨基酸、第126-210位氨基酸、第127-210位氨基酸、或第128-210位氨基酸。

較佳地，該嵌合抗原受體的表達受信號肽引導。信號肽具有引導目的蛋白分泌到細胞表面的功能。本發明發現，將上述抗原結合結構域與來自GM-CSFα鏈的信號肽進行組合，可有效地使嵌合抗原受體表達於免疫效應細胞表面。GM-CSFα鏈信號肽是將本發明的嵌合抗原受體靶向至分泌途徑的前導序列，其編碼序列首先與嵌合抗原受體的編碼序列一起在細胞內被翻譯成蛋白質，引導合成的蛋白進入胞內分泌途徑。在細胞表面表達嵌合抗原受體前信號肽被去除。

較佳地，該信號肽的氨基酸序列選自GM-CSF的第1位-第22位氨基酸，其中，信號肽的氨基酸序列編號為UniProtKB - P15509。更佳的，該信號肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

在本發明具體的實施方案中，該嵌合抗原受體包括可操作地連接且依次串聯的抗原結合結構域、間隔區、跨膜區和胞內結構域。在本發明更具體的實施方案中，該抗原結合結構域為ScFv，輕鏈和重鏈分別來自抗Myc、HA或Strep標籤抗體的輕鏈和重鏈，該間隔區來自人CD8α鉸鏈區，該跨膜區來自人CD8α跨膜區，該胞內結構域來自CD3ζ和4-1BB的胞內信號區的組合。

在本發明中，信號肽、抗原結合結構域、間隔區、跨膜區、胞內結構域是依次串聯的；信號肽和抗原結合結構域之間、抗原結合結構域和間隔區之間、間隔區和跨膜區之間、跨膜區和胞內結構域之間是可操作地連接的，例如可以採用接頭連接，也可以不採用接頭而直接連接。在本發明一個實施方案中，信號肽和抗原結合結構域之間採用接頭連接，例如GAHA，抗原結合結構域和間隔區之間採用接頭連接（該接頭（例如）為-Ala-Ser-），而間隔區和跨膜區之間、跨膜區和胞內結構域之間未採用接頭而直接連接。

在本發明一個較佳的實施方案中，該嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO: 46（對應於靶向TT1）、SEQ ID NO: 47（對應於靶向TT2）或SEQ ID NO: 48（對應於靶向TT3）所示。

SEQ ID NO: 46： GAHADIVLTQSPAFLAVSLGQRATISCRASESVDNYGFSFMNW FQQKPGQPPKLLIYAISNRGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPVEEDDP AMYFCQQTKEVPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKG QVQL QESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSHYGMSWVRQTPDKRLEWVA TIGSRGTYTHYPDSVKGRFTISRDNDKNALYLQMNSLKSEDTAMYY CARRSEFYYYGNTYYYSAMDYWGQGASVTVSSASFVPVFLPAKPT TTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIW APLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRN RFSVVKRGRKKLLYIFKQPFM RPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL RVKFSRSADAPAYQQGQN QLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQ KDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ ALPPR 其中深灰色示出嵌合抗原受體的ScFv，斜體示出連接輕鏈和重鏈的連接子，淺灰色示出間隔區，單下劃線示出跨膜區，黑體示出胞內信號區中來自4-1BB的部分，雙下劃線示出胞內信號區中來自CD3ζ的部分。

SEQ ID NO: 47： GAHAEVKLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYGMSWVR QTPDKRLEWVATISRGGSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMS SLKSEDTAMYYCARRETYDEKGFAYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGG SGGGGS DIELTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTW YQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGRDFTLTISSVQAED LAVYYCQNDNSHPLTFGAGTKLELKASFVPVFLPAKPTTTPAPRPPT PAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCG VLLLSLVITLYCNHRN RFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQE EDGCSCRFPEEEEGGCEL RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLG RREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAY SEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR 其中深灰色示出嵌合抗原受體的ScFv，斜體示出連接輕鏈和重鏈的連接子，淺灰色示出間隔區，單下劃線示出跨膜區，黑體示出胞內信號區中來自4-1BB的部分，雙下劃線示出胞內信號區中來自CD3ζ的部分。

SEQ ID NO: 48： GAHAELVMTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYGKSFMH WYQLKPGQPPKLLIYRASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEAD DAATYYCQQNNEDPWTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKG EV QLEQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTNYYMKWVKQSHGKSLE WIGDLNPNNGDTFYNQKFKGKATLTVDKSSNTAYMQLNSLTSEDS AVYYCARTGRYEENAMDYWGQGTSVTVSSASFVPVFLPAKPTTTP APRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPL AGTCGVLLLSLVITLYCNHRN RFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPV QTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL RVKFSRSADAPAYQQGQNQLY NELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDK MAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP R 其中深灰色示出嵌合抗原受體的ScFv，斜體示出連接輕鏈和重鏈的連接子，淺灰色示出間隔區，單下劃線示出跨膜區，黑體示出胞內信號區中來自4-1BB的部分，雙下劃線示出胞內信號區中來自CD3ζ的部分。 嵌合抗原受體編碼 DNA

本發明所述的嵌合抗原受體的編碼DNA包括可操作地連接的、依次串聯的抗原結合結構域編碼元件、間隔區編碼元件、跨膜區編碼元件和胞內結構域編碼元件，其中，該抗原結合結構域編碼元件編碼的抗原結合結構域能夠識別並結合根據本發明所述的標記性多肽的胞外抗原決定區。

該抗原結合結構域編碼元件的核苷酸序列編碼該抗原結合結構域的氨基酸序列。較佳地，靶向TT1的抗原結合結構域編碼元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:49所示。較佳地，靶向TT2的抗原結合結構域編碼元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:50所示。較佳地，靶向TT3的抗原結合結構域編碼元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:51所示。

該胞內結構域編碼元件的核苷酸序列編碼該胞內結構域的氨基酸序列。較佳地，該胞內活化信號轉導區編碼元件來自CD3ζ、DAP12的胞內信號區編碼DNA，共刺激信號轉導區編碼元件來自4-1BB、CD28、CD27、OX40、GITR和/或ICOS的胞內信號區編碼DNA。更佳地，該胞內結構域編碼元件來自4-1BB和CD3ζ的胞內信號區編碼DNA。更佳地，該胞內結構域編碼元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:52。

該間隔區編碼元件較佳來自CD8α的鉸鏈區編碼DNA、IgG的鉸鏈區編碼DNA或IgD的鉸鏈區編碼DNA。該跨膜區編碼元件較佳來自CD8α的跨膜區編碼DNA、CD3ζ的跨膜區編碼DNA、CD4的跨膜區編碼DNA或CD28的跨膜區編碼DNA。其中，間隔區編碼元件更佳來自CD8α的鉸鏈區編碼DNA，該跨膜區編碼元件更佳來自CD8α的跨膜區編碼DNA。

較佳地，該間隔區編碼元件和該跨膜區編碼元件構成間隔跨膜區編碼元件，該間隔跨膜區編碼元件的核苷酸序列編碼該間隔跨膜區的氨基酸序列。較佳地，該間隔區編碼元件的核苷酸序列包含SEQ ID NO:22所示的序列。

較佳地，該嵌合抗原受體的表達受信號肽引導，信號肽的核苷酸序列編碼該信號肽的氨基酸序列。較佳地，該信號肽的氨基酸序列選自GM-CSFα的第1-22位氨基酸。較佳地，該信號肽編碼元件的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示。

在本發明一個具體實施方案中，該嵌合抗原受體編碼DNA包括可操作地連接的且依次串聯的抗原結合結構域碼元件、間隔區編碼元件、跨膜區編碼元件和胞內區編碼元件，其中，抗原結合結構域的輕鏈和重鏈的編碼元件分別來自抗Myc標籤、HA標籤或Strep標籤II抗體的輕鏈和重鏈的編碼DNA，該間隔區編碼元件來自CD8α的鉸鏈區編碼DNA，該跨膜區編碼元件來自CD8α的跨膜區編碼DNA，該胞內結構域來自4-1BB和CD3ζ的胞內信號區編碼DNA。

較佳地，具有信號肽編碼序列和該嵌合抗原受體編碼序列的DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO: 53（對應於靶向TT1）、SEQ ID NO: 54（對應於靶向TT2）或SEQ ID NO: 55（對應於靶向TT3）所示。 嵌合抗原受體修飾的免疫細胞

該免疫細胞包括T細胞或NK細胞；其中，該NK細胞包括自體NK細胞、異體NK細胞或NK細胞株，並且該T細胞包括原始T細胞或其前體細胞，效應T細胞，記憶T細胞，NKT細胞，或T細胞株。

該嵌合抗原受體對免疫細胞的修飾可以是藉由慢病毒感染和mRNA電轉。

較佳地，該第一組合物和該第二組合物各自獨立地存在於該治療劑中而互不混合。

該具有標記性多肽編碼序列的核酸包括DNA或RNA；該RNA包括由該DNA轉錄的mRNA。較佳地，該第一組合物包含治療有效量的該DNA、或治療有效量的該mRNA。較佳地，該第一組合物包含劑量為0.01-10mg/天的該DNA或mRNA。

較佳地，該第一組合物包含治療有效量的該重組病毒。還較佳地，該第一組合物包含每個療程總劑量範圍為5×10⁷ -5×10¹² 個病毒顆粒或5×10⁷ -5×10¹² PFU的該重組溶瘤痘病毒。

較佳地，該第二組合物包含治療有效量的所述的嵌合抗原受體修飾的免疫細胞。較佳地，包含每個療程總劑量範圍為1×10⁴ 至1×10⁹ 個細胞/Kg體重的該嵌合抗原受體修飾的免疫細胞。

該DNA可以配製成藉由瘤內注射或靜脈給藥；該mRNA可以配製成藉由瘤內注射或靜脈給藥。例如，以質體的形式直接腫瘤內注射，也可用脂質體包裝後瘤內注射，也可連接到奈米顆粒上（如多聚L-賴氨酸、聚氨基酸、聚亞乙基亞胺(polyethyleneimine)和殼聚糖等聚合物）瘤內注射，也可瘤內注射後用電轉方法加強轉染率。

該重組病毒可以配製成藉由瘤內注射給藥或靜脈給藥。

所述的嵌合抗原受體修飾的免疫細胞可以配製成藉由靜脈給藥或局部給藥。

較佳地，該治療劑由該第一組合物和該第二組合物組成。

本領域的技術人員可以理解，本發明的治療劑還可包含合適的可藥用的輔料，包括藥用或生理載體、賦形劑、稀釋劑（包括生理鹽水、PBS溶液）、以及各種添加劑，包括糖類、脂類、多肽、氨基酸、抗氧化劑、佐劑、保鮮劑等。

本發明還提供了所述的治療劑在製備用於治療腫瘤和/或癌症的藥物中的用途。

該腫瘤和/或癌症包括：乳腺癌、頭頸部腫瘤、滑膜癌、腎癌、結締組織癌、黑色素瘤、肺癌、食管癌、結腸癌、直腸癌、腦癌、肝癌、骨癌、絨毛膜癌、胃泌素瘤、嗜鉻細胞瘤、催乳素瘤、von Hippel-Lindau病、Zollinger-Ellison綜合症、肛門癌、膽管癌、膀胱癌、輸尿管癌、神經膠質瘤、神經母細胞瘤、腦膜瘤、脊髓腫瘤、骨軟骨瘤、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤、原發部位不明癌、類癌、纖維肉瘤、佩吉特病、宮頸癌、膽囊癌、眼癌、卡波西氏肉瘤、前列腺癌、睪丸癌、皮膚鱗狀細胞癌、間皮瘤、多尖端骨髓瘤、卵巢癌、胰腺內分泌瘤、胰高血糖素瘤、胰腺癌、陰莖癌、垂體癌、軟組織肉瘤、視網膜母細胞瘤、小腸癌、胃癌、胸腺癌、滋養細胞癌、葡萄胎、子宮內膜癌、陰道癌、外陰癌、蕈樣真菌病、胰島素瘤、心臟癌、腦膜癌、腹膜癌、胸膜癌和血液癌。

本發明還提供了本發明上文所述的標記性多肽。該標記性多肽的各實施方案如上文該。

較佳地，該標記性多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 15所示。

本發明還提供了一種分離的、具有根據本發明所述的標記性多肽的編碼序列的核酸。該核酸的各實施方案如上文該。

該核酸依次包含可操作地連接的啓動子、信號肽編碼序列、以及根據本發明所述的標記性多肽的編碼序列。

該核酸包括DNA和mRNA。較佳地，該核酸為DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29或SEQ ID NO: 30所示。

本發明還提供了一種重組表達載體，其中該重組表達載體依次包含可操作地連接的啓動子、信號肽編碼序列、以及根據本發明所述的標記性多肽的編碼序列。

為了使一種腫瘤細胞可以同時被兩種以上的標記性多肽標記，該重組表達載體可以包含兩種以上的本發明所述的標記性多肽的編碼序列。

較佳地，該用於製備標記性多肽mRNA的重組表達載體（例如pFastbac1-TT1、pFastbac1-TT2、pFastbac1-TT3、pFastbac1-C1&2a、pFastbac1-C1&2b）在根據本發明所述的標記性多肽的編碼序列之前依次包含CMV啟動子、T7啟動子、具有kozak序列的5’UTR和GM-CSF α鏈信號肽編碼序列；並且在根據本發明所述的標記性多肽的編碼序列之後包含具有polyA信號的α球蛋白的3’UTR。本發明的重組表達載體的上述作用元件的組合能夠促進DNA的轉錄和翻譯，並增強mRNA的穩定性。本發明還對上述各作用元件的結構作了如下最佳化，從而更好地發揮其應有的功能。較佳地，在本發明中，CMV啟動子序列為SEQ ID NO:56。CMV啓動子功能為使下游的DNA序列開始轉錄。

較佳地，在本發明中，T7啟動子序列為SEQ ID NO:57。T7啓動子功能為使下游的DNA序列開始轉錄。

較佳地，在本發明中，具有kozak序列的5’UTR的序列為SEQ ID NO:58，具有kozak序列的5’UTR的功能為增強mRNA的翻譯效率。

較佳地，在本發明中，GM-CSF α鏈信號肽編碼序列的序列為SEQ ID NO:23。

較佳地，在本發明中，α球蛋白的3’UTR序列為SEQ ID NO:59，其中含有polyA信號。其作用是增強mRNA的穩定性。

在一個具體實施方案中，該重組表達載體的基本骨架為市售可得的pFastbac1載體，然後在其中插入上述各元件。

由於本發明最佳化了3’UTR和5’UTR結構，因此可以例如應用Tail-PCR技術由該重組表達載體合成其中正鏈帶有PolyA、反鏈帶有對應的PolyT的DNA雙鏈模板，這樣降低了DNA模板的不穩定性，進而可在體外合成mRNA。所述的正鏈中所帶有的PolyA中的A的個數範圍(或者其反鏈中對應的PolyT中的T的個數範圍)為140-170個，較佳為150-170個，更佳為150個左右(例如150個)。

將這種重組表達載體導入腫瘤細胞的方法包括病毒和非病毒的方法。非病毒的方法包括生物、物理、化學介導的基因轉染方法。生物轉染方法包括直接注射、受體介導基因轉移等。物理轉染方法包括電轉、顯微注射等。化學轉染方法包括脂質體和各種陽離子聚合物介導的轉染等。

本發明還提供了一種分離的重組病毒，其中該重組病毒的基因組具有依次的可操作地連接的啓動子、信號肽編碼序列、以及根據本發明所述的標記性多肽的編碼序列，並且該標記性多肽能夠經表達而修飾在腫瘤細胞和/或癌細胞的表面；並且，該重組病毒包括選擇複製型重組溶瘤病毒或複製缺陷型重組病毒。

較佳地，該重組病毒為選擇複製型重組溶瘤病毒，並且該重組溶瘤病毒來源於具有溶瘤作用的經基因突變的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒；較佳地，該重組溶瘤病毒來源於具有溶瘤作用的腺病毒、痘病毒、單純疱疹病毒、麻疹病毒、塞姆利基森林病毒、水疱性口炎病毒、脊髓灰質炎病毒、逆轉錄病毒、呼腸孤病毒、塞內卡谷病毒、埃可型腸道病毒、柯薩奇病毒、新城疫病毒和馬拉巴病毒。

該重組病毒的各實施方案如上文該。

本發明還提供了一種用於製備重組病毒的重組表達載體（pFastbac1-TT3-PuroGFP（其核苷酸序列如SEQ ID NO: 38所示）），其含有與pS啓動子有效連接的含有上文所述的TT3標記性多肽編碼序列（即，SEQ ID NO: 28）、與p7.5啓動子有效連接的含有上文所述的puro-GFP篩選基因編碼序列、LoxP位點、左側和右側同源臂和gRNA剪切位點的供體DNA。該重組表達載體用於利用Crisper-Cas9基因編輯技術建構重組溶瘤痘病毒。

本發明對上述各作用元件的結構作了如下最佳化，從而更好地發揮其應有的功能。

較佳地，在本發明中，pS啟動子序列為SEQ ID NO:37。pS啓動子功能為使下游的TT3標記性多肽編碼序列開始轉錄。

較佳地，在本發明中，p7.5啟動子序列為SEQ ID NO:36。p7.5啓動子功能為使下游的puro-GFP編碼序列開始轉錄。

較佳地，在本發明中，LoxP位點的序列為SEQ ID NO:60。LoxP位點的功能為去除篩選基因提供了方便。

較佳地，在本發明中，左側同源臂的序列為SEQ ID NO:33，右側同源臂的序列為SEQ ID NO:34。同源臂的功能為使痘病毒基因組與供體質體進行同源重組。

較佳地，在本發明中，gRNA-1剪切位點的序列為SEQ ID NO:61，gRNA-2剪切位點的序列為SEQ ID NO:62。gRNA剪切位點的功能為使Crisper-Cas9可以對供體（donor）質體進行剪切，以提高同源重組的效率。

在一個具體實施方案中，該重組表達載體的基本骨架為市售可得的pFastbac1載體，然後在其中插入上文所述的各元件。

本發明還提供了一種嵌合抗原受體，該嵌合抗原受體包括可操作地連接的、依次串聯的抗原結合結構域、間隔區、跨膜區和胞內結構域，其中，該抗原結合結構域能夠識別並結合根據本發明所述的標記性多肽的胞外抗原決定區。

該嵌合抗原受體的各實施方案如上文該。

較佳地，該嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO: 46（對應於靶向TT1）、SEQ ID NO: 47（對應於靶向TT2）或SEQ ID NO: 48（對應於靶向TT3）所示。

本發明還提供了一種分離的、具有編碼根據本發明所述的嵌合抗原受體編碼序列的DNA。

該具有嵌合抗原受體編碼序列的DNA的各實施方案如上文該。

較佳地，該DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO: 53（對應於靶向TT1）、SEQ ID NO: 54（對應於靶向TT2）或SEQ ID NO: 55（對應於靶向TT3）所示。

本發明還提供了一種分離的、由根據本發明所述的DNA轉錄的mRNA。

本發明還提供了一種重組表達載體（例如pFastbac1-aTT1-CD8a-4-1BB-CD3ζ、pFastbac1-aTT2-CD8a-4-1BB-CD3ζ、pFastbac1-aTT3-CD8a-4-1BB-CD3ζ），其中該重組表達載體依次包含可操作地連接的啓動子、信號肽編碼序列、以及根據本發明所述的嵌合抗原受體的編碼序列。

較佳地，該重組表達載體在根據本發明所述的嵌合抗原受體的編碼序列之前依次包含CMV啟動子、T7啟動子、具有kozak序列的5’UTR和GM-CSF α鏈信號肽編碼序列；並且在根據本發明所述的嵌合抗原受體的編碼序列之後包含具有polyA信號的α球蛋白的3’UTR。本發明的重組表達載體的上述作用元件的組合能夠促進DNA的轉錄和翻譯，並增強mRNA的穩定性。本發明還對上述各作用元件的結構作了如下最佳化，從而更好地發揮其應有的功能。

較佳地，在本發明中，CMV啟動子序列為SEQ ID NO:56。CMV啓動子功能為使下游的DNA序列開始轉錄。

本發明還提供了一種嵌合抗原受體修飾的免疫細胞，該免疫細胞的表面被本發明所述的嵌合抗原受體修飾。

該免疫細胞可以為NK細胞或T細胞；其中，該NK細胞包括自體NK細胞、異體NK細胞或NK細胞株，並且該T細胞包括原始T細胞或其前體細胞，效應T細胞，記憶T細胞，NKT細胞，或T細胞株。

該嵌合抗原受體對免疫細胞的修飾可以是藉由慢病毒感染、轉座子以及mRNA電轉。

本發明還提供了一種用於治療腫瘤和/或癌症的具有協同作用的聯合藥物的藥盒，包括：第一容器，該第一容器裝有根據本發明所述的治療劑中的第一組合物；第二容器，該第二容器裝有根據本發明所述的治療劑中的第二組合物，其中該第一容器和該第二容器是獨立的；以及載明給藥時機和給藥方式的說明書。

本發明還提供了所述的分離的、具有根據本發明所述的標記性多肽的編碼序列的核酸在製備用於治療或預防腫瘤和/或癌症的藥物中的用途。

本發明還提供了所述的重組病毒在製備用於治療或預防腫瘤和/或癌症的藥物中的用途。

本發明還提供了所述的嵌合抗原受體修飾的免疫細胞在製備用於治療或預防腫瘤和/或癌症的藥物中的用途。

本發明還提供了所述的藥盒在製備用於治療或預防腫瘤和/或癌症的藥物中的用途。

本發明還提供了一種治療腫瘤和/或癌症的方法，包括：對腫瘤和/或癌症患者施用根據本發明所述的治療劑中的第一組合物；和對該腫瘤和/或癌症患者施用根據本發明所述的治療劑中的第二組合物。

該治療劑中的第一組合物和第二組合物可以同時（例如，作為混合物）、分開但同時（例如，分別藉由瘤內和靜脈注射給藥）或依次施用（例如，首先施用第一組合物，然後施用第一組合物）。

較佳地，該方法包括以下依次進行的步驟： 1）對該腫瘤和/或癌症患者首先施用該第一組合物；和 2）在施用該第一組合物之後，對該腫瘤和/或癌症患者施用所述的治療劑中的第二組合物。

較佳地，在首先施用該第一組合物之後的第1-30天，對該腫瘤和/或癌症患者施用所述的治療劑中的第二組合物。

“在首先施用該第一組合物之後的第1-30天，對該腫瘤和/或癌症患者施用所述的治療劑中的第二組合物”是指首次第二組合物的施用與首次第一組合物施用的時間間隔為1-30天（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13……30天），或首次第二組合物的施用與在其之前最相鄰一次的該第一組合物施用的時間間隔為1-30天（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13……30天）。較佳地，首次第二組合物的施用與在其之前最相鄰一次的該第一組合物施用的時間間隔為1-30天（例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13……30天）。

在本發明的一個較佳實施方案中，該核酸的施用劑量為0.01-10mg/天，1天施用1-3次，連續施用1-7天。

在本發明的一個較佳實施方案中，該重組溶瘤痘病毒的施用劑量為：每個療程總劑量範圍為約5×10⁷ -5×10¹² 個病毒顆粒（可以單次施用或多次施用），或上述範圍間的任何值，或者該重組溶瘤痘病毒的施用劑量為：每個療程總劑量範圍為約5×10⁷ -5×10¹² PFU（可以單次施用或多次施用），或上述範圍間的任何值。其精確劑量還取決於從業者的判斷以及每個人的特有情況。在多次施用的情況下，1天施用1-3次，連續施用1-7天。

在本發明的一個較佳實施方案中，該嵌合抗原受體修飾的免疫細胞的施用劑量為，每個療程總劑量範圍為1×10⁴ -1×10⁹ 個細胞/Kg體重。較佳地，1天施用1-3次，連續施用1-7天。

在某些實施方案中，該治療腫瘤和/或癌症的方法還包括對患者施用其它用於治療腫瘤和/或癌症的藥物，和/或用於調節患者免疫系統的藥物，以增強該嵌合抗原受體修飾的免疫細胞在體內的數量和功能。該其它用於治療腫瘤和/或癌症的藥物包括但不限於：化療藥物，例如環磷醯胺、氟達拉濱（fludarabine）；放療藥物；免疫抑制劑，例如環孢素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麥考酚酯（mycophenolate）、FK50；抗體，例如抗CD3、IL-2、IL-6、IL-17、TNFα的抗體。

該DNA可以配製成藉由瘤內注射或靜脈給藥；該mRNA可以配製成藉由瘤內注射或靜脈給藥。例如，以質體的形式直接腫瘤內注射，也可用脂質體包裝後瘤內注射，也可連接到奈米顆粒上（如多聚L-賴氨酸、聚氨基酸、聚亞乙基亞胺和殼聚糖等聚合物）瘤內注射，也可瘤內注射後用電轉方法加強轉染率。

該重組病毒可以配製成藉由瘤內注射給藥或靜脈給藥。

以下藉由例子的方式進一步解釋或說明本發明的內容，但這些例子不應被理解為對本發明的保護範圍的限制。例子

除非特別說明，否則以下例子中所用實驗方法均使用醫學生物工程領域的常規實驗流程、操作、材料和條件進行。

以下除非特別說明，否則各試劑的百分濃度（%）均指該試劑的體積百分濃度（%(v/v)）。

除非特別說明，否則細胞培養在37℃、5%CO₂ 、潮化（95%相對濕度）的條件下進行。

以下例子中所用實驗材料的來源如下： PBMC來源於健康捐獻者外周血。

人重組IL-2（hrIL2）購自Peprotech。

DPBS購自Gibco。

電擊杯購自Bio-Rad。

除非特別說明，否則FBS均購自Sigma。

人卵巢癌細胞系SKOV3-luc、人T細胞系Jurkat、人肝癌細胞系SK-HEP-1、非洲綠猴腎細胞CV-1、人骨肉瘤細胞143B細胞購自ATCC，人結直腸癌細胞系HCT116-luc購自Perkin Elmer。

痘病毒（DDVV-RFP）：溶瘤痘病毒DDVV-RFP是已知的，屬於溶瘤痘病毒WR株（可參見（例如）科技文獻：“X Song, et al. T-cell Engager-armed Oncolytic Vaccinia Virus Significantly Enhances Antitumor TherapyMolecular Therapy. (2014); 22 1, 102-111”），該病毒的TK基因和VGF基因均為功能缺陷型，且攜帶有外源紅色螢光蛋白（RFP）基因。由於RFP基因僅起到篩選/報告作用，因此溶瘤痘病毒DDVV-RFP的抗腫瘤功能基本等同TK基因和VGF基因功能缺陷型的溶瘤痘病毒。溶瘤痘病毒DDvv-RFP也可採用本領域常規技術對VSC20痘病毒進行基因改造而得到。VSC20痘病毒是VGF基因缺失的痘病毒，製備方法可參見科技文獻：“McCart, JA, et al. Systemic cancer therapy with a tumor-selective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes. Cancer Res (2001) 61: 8751–8757.”。該基因改造包括使用人工合成痘病毒早/晚期啟動子pSEL調控外源DsRed基因（即RFP基因），使用體外細胞內重組技術將DsRed基因插入到痘病毒VSC20株的TK基因區中，從而建構得到溶瘤痘病毒DDVV-RFP。製備例1：藉由電穿孔技術分別製備被TT1、TT2、TT3、C1&2a、C1&2b標記的腫瘤細胞

將5×10⁶ 個Jurkat細胞、HCT116-luc、SKOV3-luc或SK-HEP-1與5μg分別具有TT1（SEQ ID NO: 11）、TT2（SEQ ID NO: 12）或TT3（SEQ ID NO: 13）、C1&2a（SEQ ID NO: 14）、C1&2b（SEQ ID NO: 15）編碼序列的mRNA（分別按照製備例8的方法得到）混合於電轉液P3（產品名稱“P3Primary Cell 4D-X Kit L”，Lonza，貨號V4XP-3012）中，置於100μl Nucleocuvette TM管（産品名稱“P3Primary Cell 4D-X Kit L”，Lonza，貨號V4XP-3012），並進行冰浴5分鐘。然後使用4D-NucleofectorTM電轉儀(Lonza)，選擇其自帶的腫瘤細胞電轉程序進行電轉。電轉後，將細胞取出置於相應的腫瘤細胞培養液中。Jurkat培養液為RPMI（Gibco）+10%FBS（Hyclone），SKOV3-luc和HCT116-luc培養液為McCoy’s 5A+10%FBS，SK-HEP-1培養液為EMEM（Gibco）+10%FBS。並加入DNase（Roche）使其終濃度為10 ng/mL，置於37℃，5% CO₂ 孵箱中恢復過夜。24小時後，收集細胞，使用流式細胞儀（購自BD，型號C6Samplar）對電轉細胞進行鑑定，得到了分別由TT1、TT2、TT3、C1&2a、或C1&2b標記的各腫瘤細胞。試驗例1：利用電穿孔技術對腫瘤細胞進行標記性多肽的標記的驗證

按照製備例1的方法，分別將具有TT1（SEQ ID NO: 11）、TT2（SEQ ID NO: 12）或TT3（SEQ ID NO: 13）編碼序列的mRNA（分別按照製備例8的方法得到）藉由4D-NucleofectorTM電轉儀(Lonza)電轉至Jurkat永生化T淋巴細胞、人卵巢癌細胞SKOV3-luc、人結直腸癌細胞HCT116-luc或人肝癌細胞SK-HEP-1內。分別用FITC偶聯的抗Myc抗體（Santa Cruz）、FITC偶聯的抗HA抗體（Biolegend）、FITC偶聯的抗Strep tag II抗體（Genscript）（稀釋比例各是1:50）進行染色，使用流式細胞儀（購自BD，型號C6Samplar）對細胞進行鑑定。

結果如第5圖所示，可成功檢測到TT1、TT2和TT3在腫瘤細胞表面的高強度表達。其中TT1和TT2標記的是Jurkat永生化T淋巴細胞（如第5A圖和第5B圖所示），TT3標記的是人卵巢癌細胞SKOV3-luc（第5C圖）、人結直腸癌細胞HCT116-luc（第5C圖）和人肝癌細胞SK-HEP-1（第5E圖）。圖中左側峰為上述抗體染色的野生型腫瘤細胞（陰性對照曲線），右側峰為腫瘤細胞分別電轉編碼TT1、TT2或TT3的mRNA後，TT1（A）、TT2（B）或TT3（C-E）的表達強度曲線。製備例2：製備分別靶向TT1、TT2、TT3的CAR-T細胞

將2×10⁶ 人PBMC細胞重懸於1ml T細胞培養液（添加有1%人AB血清（Valley Biomedical）的AIMV（Gibco））中，添加終濃度為100ng/ml的OKT3（eBioscience）和300IU/ml的hrIL-2（Peprotech），接種至24孔板的一個孔，置於37℃、5%CO₂ 的潮化細胞培養箱（Thermo Fisher）。每隔2-3天補充終濃度300IU/ml的hrIL-2，根據細胞的生長，補充新鮮的T細胞培養液，調整細胞數至1×10⁶ 個細胞/ml。

將培養7-14天的T細胞(1×10⁷ 個)與4μg aTT3-CD8-41BB-CD3ζ mRNA（即SEQ ID NO: 55所示核苷酸序列所對應的mRNA（按照製備例8的方法得到））混合於電轉液P3（產品名稱“P3Primary Cell 4D-X Kit L”，Lonza，貨號V4XP-3012）中，置於100μl Nucleocuvette TM管（産品名稱“P3Primary Cell 4D-X Kit L”，Lonza，貨號V4XP-3012），並進行冰浴冷凍5分鐘。然後使用4D-NucleofectorTM電轉儀(Lonza)，選擇其自帶的T細胞電轉程序進行電轉。電轉後，將細胞取出置於T培養液中，加入300IU/ml（終濃度）的hrIL2和10 ng/mL的DNase（Roche），置於37℃，5％CO₂ 孵箱中恢復過夜。24小時後，收集細胞，使用流式細胞儀對電轉細胞進行鑑定，得到了靶向TT3的CAR（即，aTT3-CD8-41BB-CD3ζ CAR）修飾的T細胞。

靶向TT1、TT2的CAR-T細胞的製備方法同上，不同之處在於其中分別採用aTT1-CD8-41BB-CD3ζ mRNA（即SEQ ID NO: 53所示核苷酸序列所對應的mRNA（按照製備例8的方法得到））、aTT2-CD8-41BB-CD3ζ mRNA（即SEQ ID NO: 54所示核苷酸序列所對應的mRNA（按照製備例8的方法得到））。實施例1：靶向標記性多肽的CAR-T細胞對藉由電轉而標記有標記性多肽的腫瘤細胞的殺瘤能力

本實施例測試了針對標記性多肽的CAR-T細胞對電轉標記後Jurkat細胞的殺傷能力。將按製備例2的方法得到的靶向TT1或TT2的CAR修飾的或沒有修飾的T細胞分別與按製備例1的方法得到的藉由電轉被TT1或TT2標記的人T細胞系Jurkat共培養於U型96孔板，上述CAR-T效應細胞與靶標細胞的個數比例（E:T）範圍為1.25:1-20:1。每組實驗重複3次。經過2小時的共培養後，用DELFIA EuTDA細胞毒性試劑盒(美國的PerkinElmer公司)檢測CAR-T細胞溶解腫瘤細胞的能力，殺傷效果用如下公式計算：%特異性裂解＝((實驗組釋放(讀數)-空白組釋放(讀數))/(最大釋放(讀數)-空白組釋放(讀數))×100。

結果如第6圖和第7圖所示：與陰性對照的T細胞組相比（Mock組，不加入編碼CAR的mRNA，只對T細胞進行空白電轉），針對TT1或TT2的CAR-T細胞對電轉TT1或TT2後的Jurkat細胞的殺傷能力顯著升高，其殺傷值可分別增加15%和40%（E:T=20:1）。實施例2：靶向標記性多肽的CAR-T可殺傷多種藉由電轉而標記有標記性多肽的腫瘤細胞

本實施例測試了CAR-T對電轉標記的腫瘤細胞殺傷的廣譜適用性。將按製備例2的方法得到的靶向TT3的CAR修飾的T細胞或野生型T細胞（作為CAR的陰性對照組）分別與藉由電轉被TT3標記的人T細胞系Jurkat或人結直腸癌細胞系HCT116-luc共培養於U型96孔板，上述效應細胞與靶標細胞的個數比例（E:T）範圍為由2.5:1到20:1。每組實驗重複3次。經過2小時的共培養後，用DELFIA EuTDA細胞毒性試劑盒(得自美國的PerkinElmer公司)檢測CAR-T細胞溶解腫瘤細胞的能力，殺傷效果用如下公式計算：％特異性裂解＝((實驗組釋放(讀數)-空白組釋放(讀數))/(最大釋放(讀數)-空白組釋放(讀數))×100。

結果如第8圖所示：與野生型T細胞相比，靶向TT3的CAR-T細胞不僅可以顯著殺傷電轉TT3標記的Jurkat細胞，也可以殺傷電轉TT3標記的HCT116-luc細胞。其殺傷值可分別增加超過40%（HCT116-luc細胞）和35%（Jurkat細胞）（E:T=20:1）。實施例3：靶向標記性多肽的CAR-T細胞可特異性地殺傷電轉標記的腫瘤細胞

本實施例測試了本發明的靶向標記性多肽的CAR-T細胞對被標記的腫瘤細胞的特異性。將按製備例2的方法得到的靶向TT3的CAR-T細胞或mGFP-Z修飾的T細胞（用GFP序列（其Genbank編號為YP_002302326.1）代替aTT3-CD8-41BB-CD3ζ CAR中的抗原結合結構域，作為CAR的陰性對照組）分別與電轉被TT3標記或沒有被標記的人結直腸癌細胞系HCT116-luc共培養於U型96孔板，上述效應細胞與靶標細胞的個數比例（E:T）範圍為由5:1到20:1。每組實驗重複3次。經過2小時的共培養後，用DELFIA EuTDA細胞毒性試劑盒(得自美國的PerkinElmer公司)檢測CAR-T細胞溶解腫瘤細胞的能力，殺傷效果用如下公式計算：％特異性裂解＝((實驗組釋放(讀數)-空白組釋放(讀數))/(最大釋放(讀數)-空白組釋放(讀數))×100。

結果如第9圖所示：與CAR的陰性對照組（mGFP-Z）相比，靶向TT3的CAR-T細胞可以顯著殺傷電轉TT3被標記的HCT116-luc細胞（第9A圖），其殺傷值可增加超過20%（E:T 20:1）。而對於沒有被標記的HCT116-luc細胞，CAR的陰性對照組和靶向TT3的CAR-T細胞對HCT116-luc的殺傷幾乎沒有區別。這證明瞭靶向TT3的CAR對TT3的特異性。實施例4：腫瘤細胞可被2種抗原表位多肽標記並被相應的CAR-T細胞識別

將兩種抗原表位多肽複製到一個載體中，使腫瘤細胞被兩種抗原表位多肽同時標記，從而可以用不同的CAR-T同時或先後對被標記的腫瘤細胞進行追蹤和殺傷。進一步而言，按製備例8所示的方法，將2種抗原表位多肽複製至pFastbac1載體（Life Technologies）中，採用不同的間隔跨膜區，製備得到了表達標記性多肽C1&2a和C1&2b的載體（分別為pFastbac1-C1&2a、pFastbac1-C1&2b），進而製備得到C1&2a（SEQ ID NO: 14）、C1&2b（SEQ ID NO: 15）編碼序列的mRNA。進一步按製備例1的方法得到被C1&2a或C1&2b標記的Jurkat細胞。其中，C1&2a包含3個重複的來源於Myc標籤的抗原表位多肽以及3個重複的來源於HA標籤的抗原表位多肽。C1&2b包含2個重複的來源於Myc標籤的抗原表位多肽以及2個重複的來源於HA標籤的抗原表位多肽。C1&2a的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示，C1&2b的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示。具有標記性多肽C1&2a編碼序列的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO: 29所示，具有標記性多肽C1&2b編碼序列的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO: 30所示。

藉由IFNγELISpot（Mabtech）檢測CAR-T被腫瘤細胞刺激後其IFNγ的分泌。將空白電轉的T細胞（Mock-T）或按製備例2的方法得到的電轉靶向TT1或TT2 CAR的mRNA的T細胞分別與按製備例1的方法得到的、被C1&2a或C1&2b標記的Jurkat細胞共培養於IFNγ ELISPOT檢測板，上述CAR-T效應細胞與靶標細胞的數量比例（E:T）為10:1。每組實驗重複3次。經過24小時的共培養後，顯影並使用軟件Immunospot進行ELISPOT點計數。

如第10圖所示：左圖是IFNγELISpot的代表性圖片，右圖是對IFNγ斑點數目的統計。與沒有CAR修飾的T細胞相比，靶向TT1或TT2的CAR-T可同時對C1&2a或C1&2b標記的Jurkat細胞表現出應答。針對TT1或TT2的CAR-T對C1&2b的應答比C1&2a要強。製備例3：製備靶向TT3的嵌合抗原受體修飾的NK細胞

將細胞數為20×10⁶ 個的人PBMC細胞和2mL NK細胞活化劑I（購自深圳達科為，DKW35-CYT-NK001）均勻混合於400ml NK培養液（NK培養液為AIM V®培養基（購自Life Technologies）+1%人類血清（購自Valley Biomedical，貨號HP1022HI））中，接種於一個G-Rex100細胞培養器（購自Wilson Wolf），加入IL2（終濃度：50IU/ml），放置於37℃細胞培養箱中，每隔一天補充全液體積的IL2（終濃度：50IU/ml），培養10天，收集細胞計數，計數完畢取出收集細胞中的20×10⁶ 個細胞與另外的2mL NK細胞活化劑I均勻混合於400ml NK培養液中，接種回G-Rex100細胞培養器，相同條件繼續培養7天。上述第10天時的剩餘細胞凍存備用，第16天時的細胞收集計數，取出2×10⁶ 個細胞用於流式細胞儀進行細胞表型分析（使用抗CD3和抗CD56抗體，分別為：PE偶聯的抗人CD3抗體和APC偶聯的抗人CD56抗體（購自Miltenyi），1:50稀釋）。

將培養16天的NK細胞(1×10⁷ 個)與4μg aTT3-CD8-41BB-CD3ζ mRNA（按照製備例8的方法得到）混合於電轉液P3(產品名稱“P3Primary Cell 4D-X Kit L”，Lonza，貨號V4XP-3012)中，置於100μl NucleocuvetteTM管(產品名稱“P3Primary Cell 4D-X Kit L”，Lonza，貨號V4XP-3012)，並進行冰浴冷凍5分鐘。然後使用4D-NucleofectorTM電轉儀(Lonza)，選擇其自帶的NK細胞電轉程序進行電轉。電轉後，將細胞取出置於NK細胞培養液中，加入50IU/ml的IL2和10 ng/mL的DNase，置於37℃，5％CO₂ 孵箱中恢復過夜。24小時後，收集細胞，使用流式細胞儀（購自B D，型號C6 Samplar）對電轉細胞進行鑑定，得到了靶向TT3的CAR（即，aTT3-CD8-41BB-CD3ζ CAR）修飾的NK細胞。實施例5：靶向標記性多肽的CAR-NK細胞對電轉標記腫瘤細胞的殺瘤能力

本實施例測試了針對標記性多肽的CAR修飾的NK細胞對電轉標記的SKOV3-luc或SK-HEP-1細胞的殺傷能力。將靶向TT3的CAR修飾的NK細胞或mGFP-Z修飾的NK細胞（用GFP序列（其Genbank編號為YP_002302326.1）代替aTT3-CD8-41BB-CD3ζ CAR的抗原結合結構域，作為CAR的陰性對照組）分別與按製備例1的方法得到的、藉由電轉被TT3標記的人卵巢癌細胞系SKOV3-luc或人肝癌細胞系SK-HEP-1共培養於U型96孔板，上述CAR-NK效應細胞與靶標細胞的個數比例（E:T）為10:1。每組實驗重複3次。經過2小時的共培養後，用DELFIA EuTDA細胞毒性試劑盒(美國的PerkinElmer公司)檢測CAR-NK細胞溶解腫瘤細胞的能力，殺傷效果用如下公式計算：％特異性裂解＝((實驗組釋放(讀數)-空白組釋放(讀數))/(最大釋放(讀數)-空白組釋放(讀數))×100。

結果如第11圖所示：與陰性對照組相比，靶向TT3的CAR-NK細胞對電轉TT3後的SKOV3-luc和SK-HEP-1細胞的殺傷能力顯著升高，其殺傷值可分別增加約40%。製備例4：製備被TT3穩定標記的HCT116-luc細胞系

首先將可用於mRNA合成的重組表達載體pFastbac1-TT3用ClaI限制性內切酶線性化後，藉由切膠回收線性化後的片段。接種4×10⁵ 個HCT116-luc細胞至6孔板的一個孔，將2μg線性化的質體與4μl P3000（購自Life Technologies），125μl的Opti-MEM（Gibco）混合，命名為混合物1；將6μl Lipo3000（購自Life Technologies）與125μl的Opti-MEM混合，命名為混合物2。將混合物1和混合物2混合，命名為混合物3，室溫孵育15分鐘。棄掉6孔板中的培養液，添加2ml McCoy’s 5A+10%FBS培養液，將混合物3加入培養液中。轉染24小時後，棄掉培養液，更換2ml新鮮的McCoy’s 5A+10%FBS培養液。培養一週後用FITC偶聯的抗Strep Tag II抗體（購自Genscript，1:50稀釋）染色HCT116-luc細胞（於4度染色半個小時），藉由BD FACSAria IIsorter進行單細胞分選，分選出表達TT3（即FITC陽性）的細胞，繼續培養擴大即可使用。製備例5：藉由慢病毒製備靶向TT3的嵌合抗原受體修飾的T細胞

具有靶向TT3的嵌合抗原受體編碼序列的DNA的核苷酸序列（如SEQ ID NO: 55所示）按本領域常規技術被插入第三代自我滅活的慢病毒表達載體（CD810A-1;System Biosciences）。慢病毒藉由HEK293FT細胞生產（Life Technologies）。獲得病毒上清液後，藉由超速離心在25,000轉濃縮3小時。為製備慢病毒轉導的CAR-T細胞，首先藉由Ficoll-Paque密度梯度離心（GE Healthcare）從健康捐贈者的新鮮血中分離出人外周血單個核細胞（PBMCs）。將分離的PBMC用人類CD3 / CD28 dynabeads®（Life Technologies）活化後，培養在添加5%人AB血清（Valley Biomedical）和300IU/ml IL-2（Peprotech）的AIM-V（Life Technologies）培養液中。培養一週後，用含有靶向TT3的嵌合抗原受體序列的慢病毒感染被活化的PBMC細胞，繼續培養一週後，即可使用。實施例6：靶向TT3的CAR-T在小鼠體內有效殺傷藉由慢病毒而被TT3穩定標記的腫瘤細胞

進一步利用植入人體腫瘤的小鼠模型測試了靶向TT3 CAR-T細胞的體內殺瘤效果。實驗用小鼠為非肥胖型糖尿病/重症聯合免疫缺陷/IL-2Rγcnull (NSG)小鼠（6-8周，雌性），每隻小鼠被植入1×10⁷ 個被TT3標記的人結直腸癌細胞系HCT116-luc（藉由製備例4製備）。腫瘤植入7天後，利用活體生物成像技術（BLI），在IVIS Spectrum成像平臺觀測到了腫瘤的生長，並用成像儀（得自美國PerkinElmer公司）拍照記錄腫瘤的生長情况。擁有相似BLI強度（BLI強度指的是活體成像儀記錄的小鼠體內腫瘤細胞螢光強度）的小鼠被隨機分為4組，分別為：磷酸鹽緩衝液（PBS）組，對照RNA CAR-T細胞組，靶向TT3 RNA CAR-T細胞組，和靶向TT3 DNA CAR-T細胞組，每組5隻小鼠。對照RNA CAR-T（轉染了mGFPZ-CAR）和靶向TT3 RNA CAR-T按照製備例2的方法製備，靶向TT3 DNA CAR-T按照製備例5的製備方法製備。所有CAR-T細胞組以每隻小鼠每次1×10⁷ 細胞數腹腔注射，PBS組每隻小鼠每次腹腔注射100 μL量的PBS。細胞注射方案為：腫瘤接種第7天時注射。密切地觀察小鼠的行為和生存情況，並將腫瘤的發展狀況由BLI記錄。所有的光信號和圖片都由Xenogen活體成像軟件v2.5記錄分析。

如第12圖所示，腫瘤植入後第14天，腫瘤生長狀況顯示PBS組小鼠腫瘤持續生長；對照RNA CAR-T細胞組（圖中顯示為“對照RNA CAR/T”）的全部5隻小鼠腫瘤生長停止，其腫瘤大小顯著小於PBS組；靶向TT3 RNA CAR-T細胞組（圖中顯示為“靶向TT3 RNA CAR/T”）的腫瘤有所緩解，其腫瘤大小顯著小於對照RNA CAR/T組；靶向TT3 DNA CAR-T細胞組（圖中顯示為“靶向TT3 DNA CAR/T”）的腫瘤有顯著的緩解，腫瘤幾乎完全消失。由此可見，靶向TT3 CAR修飾的T細胞能夠有效殺死體內被TT3標記的腫瘤。

DNA CAR-T比RNA CAR-T效果更好是因為DNA CAR-T中CAR的元件是持續表達的，因此CAR-T遇到抗原後可以在體內持續擴增；而RNA CAR-T中CAR的元件是RNA，只可持續表達5-7天，在這5-7天內表達量也會越來越低，且隨著T細胞的擴增RNA會逐漸被稀釋，因此DNA CAR-T的效果比RNA CAR-T的效果好。DNA CAR-T只需單次注射，RNA CAR-T需要反覆多次注射，這裡都只注射了一次。製備例6：藉由Crisper-Cas9技術製備基因組中含有TT3的重組溶瘤痘病毒

將4×10⁵ CV-1細胞重懸於2ml添加10%FBS（Sigma）的DMEM（Gibco）培養基中，接種於6孔板（Costar）的一個孔。培養過夜後，棄掉舊的培養基。用無血清的DMEM培養基稀釋痘病毒（DDVV-RFP），添加1 ml的病毒稀釋液（0.05 MOI）。病毒感染4小時後，棄掉含有病毒的培養液，添加2ml含有5%FBS的DMEM培養液。將1.5μg Cas9蛋白（購自IDT）、9pmol先導RNA-1和9pmol tracr RNA（購自IDT）稀釋至37.5μl Opti-MEM（Gibco），室溫孵育10分鐘，命名為混合物1；另將1.5μg Cas9蛋白（購自IDT）、9pmol先導RNA-2和9pmol tracr RNA（購自IDT）稀釋至37.5μl Opti-MEM（Gibco），室溫孵育10分鐘，命名為混合物2。將6μl的Lipo3000（購自Life Technologies）和150μl的Opti-MEM混合在一起，命名為混合物3。將混合物1、混合物2和75μl的混合物3混合在一起，室溫繼續孵育15分鐘，命名為混合物4。將2μg供體質體pFastbac1-TT3-PuroGFP（如第3圖所示）、4μL的P3000（購自Life Technologies）和75μl的Opti-MEM混合在一起，再與75μl的混合物3混合在一起，室溫孵育15分鐘，命名為混合物5。最後將混合物4和5混合在一起，加入上述CV-1細胞的6孔板中。轉染後48小時，收集上清液和細胞，反覆凍融，可得到重組痘病毒。用重組痘病毒感染143B細胞，可見帶有綠色螢光的重組子。利用綠色螢光可對重組子進行篩斑純化，可得到純化的攜帶TT3編碼序列的重組痘病毒（vvDD-TT3）。

按本領域的常規技術製備供體質體pFastbac1-TT3-PuroGFP（如第3圖所示），包括：首先，改造pfastbac1，包括只保留pUC ori、AmpR、bla啟動子、f1 ori，加上Ecor1、sal1、age1、Hind3、Kpn1和Cla殖株位點，産生pBS1質體；藉由IDT分別合成片段1（ecor1-gRNA1-LHR480-sal1）、片段2（sal1-TT3-age1）、片段3（age1-pSEL-loxp-p7.5-hind3）、片段4（hind3-puromycin-gfp-loxp-kpn1）、片段5（kpn1-RHR520-gRNA2-cla1）；依次將5個片段連接入pBS1即可。所得質體的核苷酸序列如SEQ ID NO: 38所示。製備例7：藉由重組溶瘤痘病毒感染製備細胞表面表達TT3的腫瘤細胞

第0天，分別接種1.5×10⁶ 個SKOV3-luc、HCT116-luc和SK-HEP-1至10cm細胞培養皿。第1天，棄掉細胞培養液（SKOV3-luc和HCT116-luc的細胞培養液為McCoy5A+10%FBS，SK-HEP-1的培養液為EMEM+10%FBS），將按照製備例6的方法得到的重組溶瘤痘病毒（vvDD-TT3）分別稀釋至5ml相應的無血清細胞培養液中，分別加入SKOV3-luc、HCT116-luc和SK-HEP-1的細胞培養皿中，感染MOI分別為0.02、0.2、0.02，每半小時輕輕晃一下細胞培養皿。感染2小時後，棄掉病毒稀釋液，加入含有5% FBS（Sigma）的細胞培養液（SKOV3-luc和HCT116-luc為McCoy5A，SK-HEP-1的培養液為EMEM）。繼續培養46小時後，獲得細胞。用生物素偶聯的抗Strep tag II抗體（Genscript）作為一抗和鏈親和素-APC作為二抗（均為1:50稀釋）進行染色，使用流式細胞儀（購自BD，型號C6 Samplar）檢測細胞表面TT3的表達。

結果如第13圖所示，可成功地檢測到GFP的表達，並且TT3在被感染腫瘤細胞表面具有高強度的表達。實施例7：靶向TT3的CAR-NK對利用重組溶瘤痘病毒被標記的腫瘤細胞的體外殺傷作用

本實施例測試了針對標記性多肽的CAR修飾的NK細胞對用重組溶瘤痘病毒感染後被標記的SKOV3-luc或SK-HEP-1細胞的殺傷能力。將按照製備例3的方法得到的靶向TT3的CAR修飾的NK細胞和mGFP-Z修飾的NK細胞（用GFP代替aTT3-CD8-41BB-CD3ζ CAR的抗原結合結構域，作為CAR的陰性對照組）分別與藉由重組溶瘤痘病毒感染從而被TT3標記的SKOV3-luc和SK-HEP-1（按照製備例7的方法得到，各腫瘤細胞感染重組溶瘤痘病毒後48小時與上述NK細胞混合）、以及未經標記的SKOV3-luc和SK-HEP-1共培養於U型96孔板，上述CAR-NK效應細胞與靶標細胞的個數比例（E:T）為10:1。每組實驗重複3次。經過2小時的共培養後，用DELFIA EuTDA細胞毒性試劑盒(美國的PerkinElmer公司)檢測CAR-T細胞溶解腫瘤細胞的能力，殺傷效果用如下公式計算：%特異性裂解＝((實驗組釋放(讀數)-空白組釋放(讀數))/(最大釋放(讀數)-空白組釋放(讀數))×100。

結果如第14圖所示，與陰性對照組的mGFP-Z修飾的NK細胞（圖中顯示為NK mGFPZ）相比，靶向TT3的CAR-NK細胞（圖中顯示為NK aTT3 CAR）對重組溶瘤痘病毒感染後被TT3標記的SKOV3-luc（圖中顯示為SKOV3-vvDD）和SK-HEP-1細胞（圖中顯示為SK-HEP-1-vvDD）的殺傷能力顯著升高，其殺傷值可分別增加約18%和23%。製備例8：編碼標記性多肽TT1、TT2、TT3、C1&2a、C1&2b的mRNA以及分別靶向TT1、TT2、TT3的aTT1-CD8a-4-1BB-CD3ζ mRNA、aTT2-CD8a-4-1BB-CD3ζ mRNA、aTT3-CD8a-4-1BB-CD3ζ mRNA的體外合成

重組表達載體pFastbac1-aTT1-CD8a-4-1BB-CD3ζ、pFastbac1-aTT2-CD8a-4-1BB-CD3ζ、pFastbac1-aTT3-CD8a-4-1BB-CD3ζ的建構：按照本領域常規技術，首先合成一段依次含有T7啟動子、含有Kozak序列的5’UTR、GM-CSFα信號肽、含有EcoRI、SphI、SalI、Hind III和ClaI的多殖株位點以及α球蛋白3’UTR的序列（AIT Biotech），並插入pFastbac1載體（Life Technologies），以建構載體pFBCMV-T7。再合成含有以下序列的片段：EcoRI酶切位點的接頭序列，分別靶向TT1、TT2或TT3的嵌合抗原受體的編碼序列，SalI酶切位點的接頭序列。將pFBCMV-T7載體和合成的基因片段分別進行EcoRI和SalI（NEB）雙酶切反應，酶切產物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行DNA片段回收，然後進行連接、轉化One Shot® Chemically Competent TOP10化學感受態細胞（購自Life Technologies），37℃培養18小時後挑取單殖株，37℃，250rpm培養16小時後用質體小提試劑盒（購自Omega Bio Tek）提取質體，分別得到pFastbac1-aTT1-CD8a-4-1BB-CD3ζ、pFastbac1-aTT2-CD8a-4-1BB-CD3ζ、pFastbac1-aTT3-CD8a-4-1BB-CD3ζ。各質體經測序鑑定無誤。

重組表達載體pFastbac1-TT1、pFastbac1-TT2、pFastbac1-TT3、pFastbac1-C1&2a、pFastbac1-C1&2b的建構：首先按照上述方法得到載體pFBCMV-T7。並且合成含有以下序列的片段：EcoRI酶切位點的接頭序列，標記性多肽（TT1、TT2、TT3、C1&2a或C1&2b）的編碼序列、SalI酶切位點的接頭序列。將pFBCMV-T7載體和合成的基因片段分別進行EcoRI和SalI（NEB）雙酶切反應，酶切產物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行DNA片段回收，然後進行連接、轉化One Shot® Chemically Competent TOP10化學感受態細胞（購自Life Technologies），37℃培養18小時後挑取單殖株，37℃，250rpm培養16小時後用質體小提試劑盒（購自Omega Bio Tek）提取質體，分別得到pFastbac1-TT1、pFastbac1-TT2、pFastbac1-TT3、pFastbac1-C1&2a、pFastbac1-C1&2b。各質體經測序鑑定後無誤。

應用Tail-PCR技術大劑量合成其中正鏈帶有PolyA、反鏈帶有對應的PolyT的DNA雙鏈模板用來進行試管內RNA合成，減少了DNA模板的不穩定性。具有標記性多肽TT1、TT2、TT3、C1&2a或C1&2b編碼序列的DNA分別以該pFastbac1-TT1、pFastbac1-TT2、pFastbac1-TT3、pFastbac1-C1&2a、pFastbac1-C1&2b載體作為DNA模板進行Tail-PCR擴增，用以分別合成具有標記性多肽TT1、TT2、TT3、C1&2a、C1&2b編碼序列的線性化DNA模板。

具有嵌合抗原受體編碼序列的DNA分別以所述的pFastbac1-aTT1-CD8a-4-1BB-CD3ζ、pFastbac1-aTT2-CD8a-4-1BB-CD3ζ、pFastbac1-aTT3-CD8a-4-1BB-CD3ζ載體作為DNA模板進行Tail-PCR擴增，用以分別合成具有嵌合抗原受體aTT1-CD8a-4-1BB-CD3ζ、aTT2-CD8a-4-1BB-CD3ζ、aTT3-CD8a-4-1BB-CD3ζ編碼序列的線性化DNA模板。Tail-PCR反應條件參照KAPA HiFiHotStartReadyMix (2X)的說明書，反應體系（50 µL）如下：雙蒸水（無核酸酶）：25 µL 2X KAPA HiFiHotStart Uracil+ ReadyMix：25 µL P7（SEQ ID NO: 15）（100µM）：0.15 µL P8（SEQ ID NO: 16）（100µM）：0.15 µL 載體DNA模板（500ng/µL）：0.5 µL 將上述PCR產物用1%(w/v)的瓊脂糖凝膠進行鑑定。鑑定正確的產物用於編碼標記性多肽TT1、TT2、TT3、C1&2a、C1&2b的mRNA（分別為SEQ ID No: 26、27、28、29、30所示核苷酸序列所對應的mRNA）以及分別靶向TT1、TT2、TT3的aTT1-CD8a-4-1BB-CD3ζ mRNA、aTT2-CD8a-4-1BB-CD3ζ mRNA、aTT3-CD8a-4-1BB-CD3ζ mRNA（分別為SEQ ID No: 53、54、55所示核苷酸序列所對應的mRNA）的體外合成。用mRNA體外合成試劑盒合成戴帽的mRNA，試劑盒為mMESSAGEmMACHINE T7 ULTRA轉錄試劑盒（可得自美國Invitrogen公司）或者mScript™ RNA system（可得自美國Epicentre公司）。按照試劑盒的說明，並用試劑盒提供的試劑進行合成即可。

將體外合成的mRNA產物用1%(w/v)的瓊脂糖凝膠進行分離鑑定。鑑定正確的mRNA存放於-80℃保存備用。製備例9：藉由重組溶瘤痘病毒感染製備細胞表面表達TT3的SK-HEP-1細胞

第0天，接種1×10⁶ 個SK-HEP-1至10cm細胞培養皿。第1天，棄掉細胞培養液（EMEM+10%FBS），將按照製備例6的方法得到的重組溶瘤痘病毒（vvDD-TT3）稀釋至5ml相應的無血清細胞培養液中，加入SK-HEP-1的細胞培養皿中，感染MOI為0.25或0.50，每半小時輕輕晃一下細胞培養皿。感染2小時後，棄掉病毒稀釋液，加入含有5% FBS（Sigma）的EMEM細胞培養液。繼續培養22小時後，獲得細胞。

用生物素偶聯的抗Strep tag II抗體（Genscript）作為一抗和鏈親和素-APC作為二抗（均為1:50稀釋）進行染色，使用流式細胞儀（購自ACEA Biosicences，型號Novocyte）檢測細胞表面TT3的表達。結果可成功地檢測到GFP的表達（GFP的表達可藉由流式細胞儀直接檢測），並且TT3在被感染腫瘤細胞表面具有高強度的表達。實施例8：靶向TT3的CAR-T對利用重組溶瘤痘病毒被標記的腫瘤細胞的體外殺傷作用

本實施例測試了針對標記性多肽的CAR修飾的T細胞對用重組溶瘤痘病毒感染後被標記的SK-HEP-1細胞的殺傷能力。將按照製備例2的方法得到的靶向TT3的CAR修飾的T細胞和mGFP-Z修飾的T細胞（用GFP代替aTT3-CD8-41BB-CD3ζ CAR的抗原結合結構域，作為CAR的陰性對照組）分別與藉由重組溶瘤痘病毒感染從而被TT3標記的SK-HEP-1（按照製備例9的方法得到，其中腫瘤細胞感染0.25MOI重組溶瘤痘病毒後24小時與上述T細胞混合；記為SK-HEP-1-vvDD）、以及未經標記的SK-HEP-1（記為SK-HEP-1）共培養於U型96孔板，上述CAR-T效應細胞與靶標細胞的個數比例（E:T）為40:1（CAR-T效應細胞的個數為2×10⁵ 個/孔）。每組實驗重複3次。經過3小時的共培養後，用DELFIA EuTDA細胞毒性試劑盒(美國的PerkinElmer公司)檢測CAR-T細胞溶解腫瘤細胞的能力，殺傷效果用如下公式計算：%特異性裂解＝((實驗組釋放(讀數)-空白組釋放(讀數))/(最大釋放(讀數)-空白組釋放(讀數))×100。

結果如第15圖所示。在第15A圖中，陰性對照組的mGFP-Z修飾的T細胞（圖中顯示為T mGFPZ）與靶向TT3的CAR-T細胞（圖中顯示為T aTT3 CAR）對未經標記的SK-HEP-1細胞的殺傷能力無顯著性差異。在第15B圖中，與陰性對照組的mGFP-Z修飾的T細胞（圖中顯示為T mGFPZ）相比，靶向TT3的CAR-T細胞（圖中顯示為T aTT3 CAR）對重組溶瘤痘病毒感染後被TT3標記的SK-HEP-1細胞的殺傷能力顯著升高，其殺傷值可增加30%。實施例9：靶向TT3的CAR-NK與利用重組溶瘤痘病毒被標記的腫瘤細胞共培養後細胞因子的分泌

本實施例藉由ELISA檢測了針對標記性多肽的CAR修飾的NK細胞與重組溶瘤痘病毒感染後被標記的SK-HEP-1細胞共培養過夜後， GM-CSF的分泌。將按照製備例3的方法得到的靶向TT3的CAR修飾的NK細胞和mGFP-Z修飾的NK細胞（用GFP代替aTT3-CD8-41BB-CD3ζ CAR的抗原結合結構域，作為CAR的陰性對照組）分別與藉由重組溶瘤痘病毒感染從而被TT3標記的SK-HEP-1（按照製備例9的方法得到，其中腫瘤細胞分別感染0.25MOI或0.50MOI重組溶瘤痘病毒後24小時與上述NK細胞混合，分別記為SK-HEP-1-vvDD（0.25MOI）和SK-HEP-1-vvDD（0.50MOI））、藉由電轉編碼TT3 mRNA而被TT3標記的SK-HEP-1（按照製備例1的方法得到，記為SK-HEP-1-EP）、以及未經標記的SK-HEP-1（記為SK-HEP-1）共培養於24孔板，上述CAR-NK效應細胞與靶標細胞的個數比例（E:T）為5:1(CAR-NK效應細胞的個數為2.5×10⁴ 個/孔)。共培養過夜後，用Human GM-CSF ELISA檢測試劑盒(美國R&D公司)檢測CAR-NK細胞GM-CSF的分泌，每組實驗重複2次。

如第16圖所示：與陰性對照組的mGFP-Z修飾的NK細胞（圖中顯示為NK mGFPZ）相比，靶向TT3的CAR-NK細胞（圖中顯示為NK aTT3 CAR）受到TT3刺激後，可以分泌更多的GM-CSF。與藉由電轉編碼TT3 mRNA而被TT3標記的SK-HEP-1（圖中顯示為SK-HEP-1-EP）共培養後，NK aTT3 CAR的GM-CSF分泌量為NK mGFPZ的2.4倍；與藉由重組溶瘤痘病毒感染從而被TT3標記的SK-HEP-1（分別為SK-HEP-1-vvDD（0.25MOI）、SK-HEP-1-vvDD（0.50MOI））共培養後，NK aTT3 CAR的GM-CSF分泌量分別為NK mGFPZ的約1.32和1.64倍。實施例10：靶向TT3的CAR-T與利用重組溶瘤痘病毒被標記的腫瘤細胞共培養後細胞因子的分泌

本實施例藉由ELISA檢測了針對標記性多肽的CAR修飾的T細胞與重組溶瘤痘病毒感染後被標記的SK-HEP-1細胞共培養過夜後， IFNγ和GM-CSF的分泌。將按照製備例3的方法得到的靶向TT3的CAR修飾的T細胞和mGFP-Z修飾的T細胞（用GFP代替aTT3-CD8-41BB-CD3ζ CAR的抗原結合結構域，作為CAR的陰性對照組）分別與藉由重組溶瘤痘病毒感染從而被TT3標記的SK-HEP-1（按照製備例9的方法得到，其中腫瘤細胞分別感染0.25MOI或0.50MOI重組溶瘤痘病毒後24小時與上述T細胞混合，分別記為SK-HEP-1-vvDD（0.25MOI）和SK-HEP-1-vvDD（0.5MOI））、藉由電轉編碼TT3 mRNA而被TT3標記的SK-HEP-1（按照製備例1的方法得到，記為SK-HEP-1-EP）、以及未經標記的SK-HEP-1（記為SK-HEP-1）共培養於24孔板，上述CAR-T效應細胞與靶標細胞的個數比例（E:T）為5:1(CAR-T效應細胞的個數為2.5×10⁴ 個/孔)。共培養過夜後，用Human IFNγ ELISA檢測試劑盒(美國Biolegend公司)檢測CAR-T細胞IFNγ的分泌，用Human GM-CSF ELISA檢測試劑盒（美國R&D公司）檢測CAR-T細胞GM-CSF的分泌，每組實驗重複2次。

如第17圖所示：與陰性對照組的mGFP-Z修飾的T細胞（圖中顯示為T mGFPZ）相比，靶向TT3的CAR-T細胞（圖中顯示為T aTT3 CAR）受到TT3刺激後，可以分泌更多的IFNγ和GM-CSF。與藉由電轉編碼TT3 mRNA而被TT3標記的SK-HEP-1（圖中顯示為SK-HEP-1-EP）共培養後，T aTT3 CAR的IFNγ的分泌量為T mGFPZ的約2倍（見第17A圖），T aTT3 CAR的GM-CSF分泌量為T mGFPZ的約4.45倍（見第17B圖）；與藉由重組溶瘤痘病毒感染從而被TT3標記的SK-HEP-1（分別為SK-HEP-1-vvDD（0.25MOI）、SK-HEP-1-vvDD（0.5MOI））共培養後，T aTT3 CAR的IFNγ分泌量分別為T mGFPZ的約11.5和14.2倍（見第17A圖），T aTT3 CAR的GM-CSF分泌量分別為T mGFPZ的約10和10倍（見第17B圖）。實施例11：重組溶瘤痘病毒瘤內注射後，TT3在腫瘤組織中的分佈。

實驗用小鼠為非肥胖型糖尿病/重症聯合免疫缺陷/IL-2Rγcnull (NCG)小鼠（6-8周，雌性，得自江蘇集萃藥康生物科技有限公司）。每隻小鼠皮下被植入1×10⁷ 個人肝癌細胞系SK-HEP-1，腫瘤植入6天後，選出12只腫瘤大小範圍在80-120mm³ 的成模質量好的小鼠，每隻小鼠瘤內注射50µl 5×10⁶ pfu vvDD-TT3。分別在痘病毒注射後的第7、14、21、29天隨機處死3只剝離小鼠的皮下腫瘤組織，用手術刀將腫瘤組織從中間切開，經組織固定以及石蠟包埋，製備成5µm厚度的切片。所有的切片都經蘇木精(得自上海碧雲天生物技術有限公司)進行細胞核染色，同時用生物素抗strep 標籤II（biotin anti-strep tag II）抗體（Genscript）進行TT3 的檢測。所用二抗是兔二步法檢測試劑盒（得自北京中杉金橋生物技術有限公司），顯色試劑盒為DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒（得自上海碧雲天生物技術有限公司）。最後藉由江豐全自動數字病理切片掃描儀進行切片的全景掃描。

結果如第18圖所示。在第18圖中，淺灰色為TT3陰性部分，深灰色為TT3陽性區域。由此可見，vvDD-TT3瘤內注射7、14、21、29天後，可在腫瘤組織中檢測到TT3的表達，且TT3在腫瘤組織中呈現較為廣泛的分布。實施例12：重組溶瘤痘病毒和CAR-NK聯合給藥對小鼠皮下腫瘤生長的影響。

實驗用小鼠為非肥胖型糖尿病/重症聯合免疫缺陷/IL-2Rγcnull (NCG)小鼠（6-8周，雌性，得自江蘇集萃藥康生物科技有限公司）。每隻小鼠皮下被植入1×10⁷ 個人肝癌細胞系SK-HEP-1，腫瘤植入6天後，選出30只腫瘤大小範圍在80-120mm³ 的成模質量好的小鼠，隨機分為6組，每組5隻小鼠。第一組為“空白對照”組（IL-2/PBS/0.9% NaCl），腫瘤接種6天後瘤內注射50µl PBS（記為“給藥後0天”），PBS注射10天後（即給藥後第10天）瘤內注射100µl 0.9% NaCl，在給藥後第10、12、14、16、18、20、22、24、26天，腹腔注射IL-2；第二組為“vvDD-TT3”組（即，重組溶瘤痘病毒單藥組（IL-2/vvDD-TT3/0.9% NaCl）），腫瘤接種6天後瘤內注射50µl vvDD-TT3（記為“給藥後0天”），vvDD-TT3注射10天後（即給藥後第10天）瘤內注射100µl 0.9% NaCl，在給藥後第10、12、14、16、18、20、22、24、26天，腹腔注射IL-2；第三組為“NK mGFPZ”組（即，陰性CAR NK單藥對照組（IL-2/PBS/NK mGFPZ）），腫瘤接種6天後瘤內注射50µl PBS（記為“給藥後0天”），PBS注射10、13、16、19、23、26天後（即給藥後第10、13、16、19、23、26天）瘤內注射100µl NK mGFPZ，在給藥後第10、12、14、16、18、20、22、24、26天，腹腔注射IL-2；第四組為“NK aTT3 CAR”組（即，陽性CAR NK單藥組（IL-2/PBS/NK aTT3 CAR）），腫瘤接種6天後瘤內注射50µl PBS（記為“給藥後0天”），PBS注射10、13、16、19、23、26天後（即給藥後第10、13、16、19、23、26天）瘤內注射100µl NK aTT3 CAR，在給藥後第10、12、14、16、18、20、22、24、26天，腹腔注射IL-2；第五組為“vvDD-TT3+NK mGFPZ”組（即，聯合給藥對照組（IL-2/vvDD-TT3/NK mGFPZ）），腫瘤接種6天後瘤內注射50µl vvDD-TT3（記為“給藥後0天”），vvDD-TT3注射10、13、16、19、23、26天後（即給藥後第10、13、16、19、23、26天）瘤內注射100µl NK mGFPZ，在給藥後第10、12、14、16、18、20、22、24、26天，腹腔注射IL-2；第六組為“vvDD-TT3+NK aTT3 CAR”組（即，本發明聯合給藥組（IL-2/vvDD-TT3/NK aTT3 CAR）），腫瘤接種6天後瘤內注射50µl vvDD-TT3（記為“給藥後0天”），vvDD-TT3注射10、13、16、19、23、26天後（即給藥後第10、13、16、19、23、26天）瘤內注射100µl NK aTT3 CAR，在給藥後第10、12、14、16、18、20、22、24、26天，腹腔注射IL-2。NK mGFPZ和靶向NK aTT3 CAR按照製備例3的方法製備，所有CAR-NK細胞給藥時以每隻小鼠每次1×10⁷ 細胞數瘤內注射，所有IL-2按每次每隻小鼠20000IU腹腔注射，vvDD-TT3給藥劑量為5×10⁶ pfu每隻小鼠。分別在分組當天、首次給藥後每週2次、安樂死前，利用遊標卡尺測量並記錄腫瘤長、短徑，計算腫瘤體積，並根據腫瘤體積繪製腫瘤生長曲線。腫瘤體積的計算公式為 V=1/2×長徑×短徑² 。相對腫瘤體積（RTV）的計算公式為 RTV=Vt/V0，Vt：每一次測量腫瘤得到的瘤體積；V0：初始瘤體積（給藥前）。相對腫瘤增殖率（T/C）%的計算公式為T/C %=給藥組的RTV平均值/空白對照組的RTV平均值×100%，如果T/C %≤40 %，試驗組RTV與模型組RTV經統計學處理P>0.05，為有腫瘤增長抑制作用；反之，如果T/C %>40 %，則為對腫瘤增長無抑制作用。

如第19A圖所示，腫瘤植入後，腫瘤生長狀況顯示第一組“空白對照”組小鼠腫瘤持續生長；第二組“vvDD-TT3”組可顯著抑制腫瘤的生長；第三組“NK mGFPZ”組和第四組“NK aTT3 CAR”組可微弱地延緩腫瘤的生長；第五組“vvDD-TT3+NK mGFPZ”組較“vvDD-TT3”組可進一步抑制腫瘤的生長；第六組“vvDD-TT3+NK aTT3 CAR”組較第五組可進一步抑制腫瘤的生長，甚至減少腫瘤的負荷。如第19B圖所示，第六組“vvDD-TT3+NK aTT3 CAR”在給藥後第21天時，相對腫瘤抑制率已達到40%，而第二組“vvDD-TT3”組和第五組“vvDD-TT3+NK mGFPZ”在給藥後第28天，相對腫瘤抑制率才達到40%。由此可見，vvDD-TT3與靶向TT3 CAR修飾的NK細胞可以特異性地聯合治療腫瘤，並更快地抑制腫瘤的生長。

E:T:個數比例

第1圖是示出本發明一種構思的示意圖。第2圖是示出本發明一個實施方案中包含標記性多肽編碼序列的核酸的結構示意圖，從5’到3’端分別包括啓動子、信號肽、胞外抗原決定區、間隔部分和跨膜部分。第3圖是本發明一個實施方案中利用Crisper Cas9技術製備重組溶瘤痘病毒時供體質體的結構示意圖，從左到右分別是bla啟動子、氨苄抗性基因、pUC起始點、先導RNA-1（gRNA1）的剪切位點、左側同源臂（LHR480）、標記性多肽TT3編碼序列、信號肽編碼序列（未示出）、pS啟動子、LoxP位點、p7.5啟動子、PuroGFP編碼序列、LoxP位點、右側同源臂（RHR520）、先導RNA-2（gRNA2）的剪切位點。第4圖是本發明一個實施方案中Crisper Cas9對DDVV-RFP溶瘤痘病毒基因組TK位點進行剪切的示意圖。上圖代表DDVV-RFP溶瘤痘病毒基因組，下圖示意性示出兩個先導RNA對TK基因的左半部分和右半部分介導的剪切。第5圖示出本發明製備例1中利用電轉技術對腫瘤細胞進行標記，並藉由流動式細胞測量術檢測標記性多肽在腫瘤細胞表面表達的結果。第5A圖和第5B圖分別示出TT1和TT2標記的Jurkat永生化T淋巴細胞的結果，第5C圖至第5E圖分別示出TT3標記的人卵巢癌細胞SKOV3-luc、人結直腸癌細胞HCT116-luc和人肝癌細胞SK-HEP-1的結果。圖中橫坐標為流式細胞儀所顯示的螢光強度讀數，縱坐標表示相對細胞數。第6圖示出本發明實施例1中針對TT1的CAR-T細胞對標記後的Jurkat細胞的體外殺傷實驗結果。其中縱坐標表示腫瘤細胞被殺傷後的%特異性裂解（即，特異性裂解的比例）；橫坐標表示效應細胞和腫瘤細胞的比例；實線即“TT1-BBZ”示出靶向TT1的CAR修飾的T細胞組對TT1標記的Jurkat細胞的殺傷結果；虛線即“空白”（Mock）示出空白電轉的T細胞組（陰性對照組）對TT1標記的Jurkat細胞的殺傷結果。第7圖示出本發明實施例1中針對TT2的CAR-T細胞對標記後的Jurkat細胞的體外殺傷實驗結果。其中縱坐標表示腫瘤細胞被殺傷後的%特異性裂解；橫坐標表示效應細胞和腫瘤細胞的比例；實線即“TT2-BBZ”示出靶向TT2的CAR修飾的T細胞組對TT2標記的Jurkat細胞的殺傷結果；虛線即“空白”示出空白電轉的T細胞組（陰性對照組）對TT2標記的Jurkat細胞的殺傷結果。第8圖示出本發明實施例2中靶向TT3的CAR-T細胞對標記後的HCT116-luc（A）和Jurkat（B）細胞的體外殺傷實驗結果。其中縱坐標表示腫瘤細胞被殺傷後特異性裂解的比例；橫坐標表示效應細胞和腫瘤細胞的比例；實線即“CAR T/HCT116 TT3”和“CAR T/Jurkat TT3”分別示出靶向TT3的CAR修飾的T細胞組的結果；虛線即“WT T/HCT116 TT3”和“WT T/Jurkat TT3”分別示出野生型T細胞組（陰性對照組）的結果。第9圖示出本發明實施例3中靶向TT3的CAR-T細胞對被TT3標記和沒有被標記的HCT116-luc的體外殺傷實驗結果。第9A圖為HCT116-luc標記有TT3，第9B圖為HCT116-luc沒有被TT3標記。其中縱坐標表示腫瘤細胞被殺傷後特異性裂解的比例；橫坐標表示效應細胞和腫瘤細胞的比例；實線即“αTT3-41BBζ”示出靶向TT3的CAR修飾的T細胞組的結果；虛線即“GFP-ζ”示出mGFP-Z修飾的T細胞組（陰性對照組）的結果。第10圖示出本發明實施例4中靶向TT1或TT2的CAR-T細胞與標記後的Jurkat細胞共培養後，釋放IFN-γ的Elispot結果。左圖為Elispot實驗孔的圖片，右圖為Elispot的分析統計結果。圖中“空白-T”表示沒有被CAR修飾的T細胞組（對照組），“TT1 CAR-T”和“TT2 CAR-T”分別表示被靶向TT1或TT2的CAR修飾的T細胞組。右圖中橫坐標表示用不同標記性多肽標記的Jurkat細胞，縱坐標表示相對IFN-γ數量(以每5×10⁴ 個T細胞中的斑點數表示)。第11圖示出本發明實施例5中靶向TT3的CAR-NK細胞（圖中示為NK aTT3 CAR）對被標記和沒有標記的SKOV3-luc或SK-HEP-1的體外殺傷實驗結果。第11A圖為沒有被TT3標記的SKOV3-luc（圖中示為SKOV3）的結果，第11B圖為藉由電轉被標記有TT3的SKOV3-luc（圖中示為SKOV3-EP）的結果；第11C圖為沒有被TT3標記的SK-HEP-1（圖中示為SK-HEP-1）的結果，第11D圖為藉由電轉被標記有TT3的SK-HEP-1（圖中示為SK-HEP-1-EP）的結果。其中以mGFP-Z修飾的NK細胞（圖中示為NK mGFPZ）作為陰性對照；縱坐標表示腫瘤細胞被殺傷後特異性裂解的比例；橫坐標表示不同的實驗組；效應細胞和靶細胞的比例為10:1。第12圖示出本發明實施例6中過繼回輸靶向TT3 CAR-T細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。腫瘤接種7天後，小鼠分別被給與（1）PBS、（2）對照RNA CAR-T、（3）靶向TT3 RNA CAR-T、（4）靶向TT3 DNA CAR-T。第12A圖示出分別在第7天和第14天藉由生物螢光成像所顯示的小鼠體內的腫瘤。第12B圖示出第14天小鼠體內腫瘤細胞的BLI螢光強度。第12B圖中橫坐標表示不同的治療組，縱坐標表示活體成像儀記錄的動物體內腫瘤細胞螢光強度，其中縱坐標中所示輻射率（單位為“p/sec”，即，光子/秒）指單位時間從動物體表發出的光子數。第13圖示出本發明製備例7中利用重組溶瘤痘病毒對腫瘤細胞進行標記後，藉由流動式細胞測量術檢測GFP的表達和標記性多肽在腫瘤細胞表面表達的結果。各圖中左側峰為抗體染色的野生型腫瘤細胞（未經重組溶瘤痘病毒感染）陰性對照曲線，右側峰為腫瘤細胞被重組溶瘤痘病毒感染48小時之後GFP（第13A圖至第13C圖）或TT3（第13D圖至第13F圖）的表達強度曲線，第13A圖和第13D圖為SKOV3-luc細胞的結果；第13B圖和第13E圖為HCT116-luc細胞的結果；第13C圖和第13F圖為SK-HEP-1細胞的結果。各圖中橫坐標表示用流式細胞儀所顯示的GFP或TT3螢光強度讀數，縱坐標表示相對細胞數。第14圖示出本發明實施例7中靶向TT3的CAR-NK細胞對標記和沒有標記的SKOV3-luc或SK-HEP-1的體外殺傷實驗結果。第14A圖為沒有被TT3標記的SKOV3-luc的結果；第14B圖為藉由重組溶瘤痘病毒感染後被標記有TT3的SKOV3-luc的結果；第14C圖為沒有被TT3標記的SK-HEP-1的結果；第14D圖為藉由重組溶瘤痘病毒感染後被標記有TT3的SK-HEP-1的結果。各圖中縱坐標表示腫瘤細胞被殺傷後特異性裂解的比例；橫坐標為不同的實驗組；效應細胞和靶細胞的比例為10:1。第15圖示出本發明實施例8中靶向TT3的CAR-T細胞對標記或沒有標記的SK-HEP-1的體外殺傷實驗結果。第15A圖為沒有被TT3標記的SK-HEP-1的結果；第15B圖為藉由重組溶瘤痘病毒感染後被標記有TT3的SK-HEP-1的結果（圖中“***”表示p>0.001）。各圖中縱坐標表示腫瘤細胞被殺傷後特異性裂解的比例，橫坐標為不同的實驗組，效應細胞和靶細胞的比例為40:1。第16圖示出本發明實施例9中靶向TT3的CAR-NK細胞與標記或沒有標記的SK-HEP-1共培養後GM-CSF的分泌。圖中縱坐標表示共培養上清液中GM-CSF的濃度（pg/ml），橫坐標為不同的實驗組。圖中白色柱子代表NK mGFPZ，灰色柱子代表NK aTT3 CAR，“**”表示p>0.01。第17圖示出本發明實施例10中靶向TT3的CAR-T細胞與標記和沒有標記的SK-HEP-1共培養後IFNγ（第17A圖）和GM-CSF（第17B圖）的分泌。圖中縱坐標表示共培養上清液中IFNγ（第17A圖）或GM-CSF（第17B圖）的濃度（pg/ml），橫坐標為不同的實驗組。圖中白色柱子代表T mGFPZ，灰色柱子代表T aTT3 CAR。第18圖示出本發明實施例11中藉由免疫組化檢測重組溶瘤痘病毒瘤內給藥後，腫瘤組織中TT3的表達。第18A圖至第18D圖分表代表重組溶瘤痘病毒瘤內注射7（A）、14（B）、21（C）、29（D）天後，TT3在腫瘤組織中的表達。每個圖中的三個切片分別來自三隻小鼠的腫瘤組織，放大倍數範圍為0.5-1.5倍。第19圖示出本發明實施例12中重組溶瘤痘病毒和CAR-NK聯合用藥對小鼠皮下腫瘤生長的抑制作用。第19A圖示出不同給藥組中小鼠皮下腫瘤的生長曲線。橫坐標代表重組溶瘤痘病毒給藥後的天數，縱坐標代表腫瘤的體積。第19B圖示出不同給藥組中小鼠皮下腫瘤的相對增殖率隨給藥後天數的變化曲線。橫坐標代表重組溶瘤痘病毒給藥後的天數，縱坐標代表相對腫瘤增殖率%。

Claims

一種用於治療腫瘤和/或癌症的治療劑，包含：（a）一第一組合物，其中該第一組合物包含位於一第一可藥用載體中的一第一活性成分，該第一活性成分包括或含有用於導入一腫瘤細胞和/或癌細胞的、具有一標記性多肽編碼序列的核酸；該標記性多肽具有可操作地連接的一胞外抗原決定區、一間隔部分和一跨膜部分，能夠經表達而修飾在該腫瘤細胞和/或癌細胞的表面；該胞外抗原決定區的氨基酸序列含有一或複數抗原表位多肽的氨基酸序列；其中在自然狀態下，哺乳動物細胞膜蛋白或分泌蛋白的氨基酸序列不含有該抗原表位多肽的氨基酸序列；以及（b）一第二組合物，其中該第二組合物包含位於一第二可藥用載體中的一第二活性成分，該第二活性成分包含一嵌合抗原受體修飾的免疫細胞；所述的嵌合抗原受體修飾的免疫細胞能夠特異性識別並結合該標記性多肽的該胞外抗原決定區。
如申請專利範圍第1項所述的治療劑，其中該抗原表位多肽的氨基酸序列來源於自然界存在的蛋白的氨基酸序列，或者為人工合成的自然界不存在的氨基酸序列。
如申請專利範圍第2項所述的治療劑，其中該自然界存在的蛋白包括哺乳動物細胞內蛋白、病毒蛋白、和所有其它非哺乳動物蛋白。
如申請專利範圍第1項所述的治療劑，其中該抗原表位多肽的氨基酸序列包括以下標籤的氨基酸序列：Myc標籤、HA標籤、Strep標籤II、Flag標籤、HAT標籤、S標籤、S1標籤、蛋白C標籤、tag-100標籤、E2標籤、TAP標籤、HSV標籤、KT3標籤、V5標籤、VSV-G標籤、His標籤或RFP標籤。
如申請專利範圍第1項所述的治療劑，其中該胞外抗原決定區的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5所示。
如申請專利範圍第1項所述的治療劑，其中該間隔部分來自CD8α的鉸鏈區、IgG的鉸鏈區或IgD的鉸鏈區；較佳地，該間隔部分的氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示；其中該跨膜部分來源於CD8、CD3ζ、CD4或CD28的跨膜區；較佳地，該跨膜部分的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示。
如申請專利範圍第1項所述的治療劑，其中該標記性多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 15所示。
如申請專利範圍第1項所述的治療劑，其中該核酸包括一DNA或一RNA；該RNA包括由該DNA轉錄的mRNA。
如申請專利範圍第1項所述的治療劑，其中該第一活性成分為一重組病毒，該重組病毒的基因組具有標記性多肽編碼序列；其中，該重組病毒包括一選擇複製型重組溶瘤病毒或一複製缺陷型重組病毒。
如申請專利範圍第9項所述的治療劑，其中該重組溶瘤病毒來源於具有溶瘤作用的經基因突變的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒；較佳地，該重組溶瘤病毒來源於具有溶瘤作用的腺病毒、痘病毒、單純疱疹病毒、麻疹病毒、塞姆利基森林病毒、水疱性口炎病毒、脊髓灰質炎病毒、逆轉錄病毒、呼腸孤病毒、塞內卡谷病毒、埃可型腸道病毒、柯薩奇病毒、新城疫病毒和馬拉巴病毒。
如申請專利範圍第1項所述的治療劑，其中該嵌合抗原受體包括可操作地連接的、依次串聯的一抗原結合結構域、一間隔區、一跨膜區和一胞內結構域，該抗原結合結構域能夠特異性識別並結合該標記性多肽的該胞外抗原決定區。
如申請專利範圍第11項所述的治療劑，其中該抗原結合結構域的氨基酸序列如SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43或SEQ ID NO: 44所示。
如申請專利範圍第11項所述的治療劑，其中該胞內結構域來自一淋巴細胞胞內活化信號轉導區和一可任選的淋巴細胞共刺激信號轉導區，其中該胞內活化信號轉導區選自CD3ζ或DAP12的胞內活化信號轉導區；該可任選的淋巴細胞共刺激信號轉導區選自4-1BB、CD28、CD27、OX40、GITR、和/或ICOSS的共刺激信號轉導區。
如申請專利範圍第11項所述的治療劑，其中該間隔區來自CD8α的鉸鏈區、IgG的鉸鏈區或IgD的鉸鏈區，該跨膜區來自CD8α的跨膜區、CD3ζ的跨膜區、CD4的跨膜區或CD28的跨膜區。
如申請專利範圍第11項所述的治療劑，其中該嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47或SEQ ID NO: 48所示。
如申請專利範圍第1項所述的治療劑，其中該免疫細胞包括T細胞或NK細胞。
如申請專利範圍第1項所述的治療劑，其中該第一組合物和該第二組合物各自獨立地存在於該治療劑中而互不混合。
如申請專利範圍第8項所述的治療劑，其中該第一組合物包含治療有效量的該DNA、或治療有效量的該mRNA。
如申請專利範圍第9項所述的治療劑，其中該第一組合物包含治療有效量的該重組病毒。
如申請專利範圍第1項所述的治療劑，其中該第二組合物包含治療有效量的所述的嵌合抗原受體修飾的免疫細胞。
如申請專利範圍第8項所述的治療劑，其中該DNA配製成藉由瘤內注射或靜脈給藥；該mRNA配製成藉由瘤內注射或靜脈給藥。
如申請專利範圍第9項所述的治療劑，其中該重組病毒配製成藉由瘤內注射給藥或靜脈給藥。
如申請專利範圍第1項所述的治療劑，其中所述的嵌合抗原受體修飾的免疫細胞配製成藉由靜脈給藥或局部給藥。
如申請專利範圍第1項所述的治療劑，其中該治療劑由該第一組合物和該第二組合物組成。
如申請專利範圍第1項至第24項中任一項所述的治療劑在製備用於治療腫瘤和/或癌症的藥物中的用途。
如申請專利範圍第25項所述的用途，其中該腫瘤和/或癌症包括：乳腺癌、頭頸部腫瘤、滑膜癌、腎癌、結締組織癌、黑色素瘤、肺癌、食管癌、結腸癌、直腸癌、腦癌、肝癌、骨癌、絨毛膜癌、胃泌素瘤、嗜鉻細胞瘤、催乳素瘤、von Hippel-Lindau病、Zollinger-Ellison綜合症、肛門癌、膽管癌、膀胱癌、輸尿管癌、神經膠質瘤、神經母細胞瘤、腦膜瘤、脊髓腫瘤、骨軟骨瘤、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤、原發部位不明癌、類癌、纖維肉瘤、佩吉特病、宮頸癌、膽囊癌、眼癌、卡波西氏肉瘤、前列腺癌、睪丸癌、皮膚鱗狀細胞癌、間皮瘤、多尖端骨髓瘤、卵巢癌、胰腺內分泌瘤、胰高血糖素瘤、胰腺癌、陰莖癌、垂體癌、軟組織肉瘤、視網膜母細胞瘤、小腸癌、胃癌、胸腺癌、滋養細胞癌、葡萄胎、子宮內膜癌、陰道癌、外陰癌、蕈樣真菌病、胰島素瘤、心臟癌、腦膜癌、腹膜癌、胸膜癌和血液癌。
一種標記性多肽，其中，該標記性多肽具有可操作地連接的一胞外抗原決定區、一間隔部分和一跨膜部分，能夠經表達而修飾在腫瘤細胞和/或癌細胞的表面；該胞外抗原決定區的氨基酸序列含有一或複數抗原表位多肽的氨基酸序列；其中在自然狀態下，哺乳動物細胞膜蛋白或分泌蛋白的氨基酸序列不含有該抗原表位多肽的氨基酸序列。
如申請專利範圍第27項所述的標記性多肽，其中該抗原表位多肽的氨基酸序列來源於自然界存在的蛋白的氨基酸序列，或者為人工合成的自然界不存在的氨基酸序列。
如申請專利範圍第28項所述的標記性多肽，其中該自然界存在的蛋白包括哺乳動物細胞內蛋白、病毒蛋白、和所有其它非哺乳動物蛋白。
如申請專利範圍第27項所述的標記性多肽，其中該抗原表位多肽的氨基酸序列包括以下標籤的氨基酸序列：Myc標籤、HA標籤、Strep標籤II、Flag標籤、HAT標籤、S標籤、S1標籤、蛋白C標籤、tag-100標籤、E2標籤、TAP標籤、HSV標籤、KT3標籤、V5標籤、VSV-G標籤、His標籤或RFP標籤。
如申請專利範圍第27項所述的標記性多肽，其中該胞外抗原決定區的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4或SEQ ID NO: 5所示。
如申請專利範圍第27項所述的標記性多肽，其中該間隔部分來自CD8α的鉸鏈區、IgG的鉸鏈區或IgD的鉸鏈區；較佳地，該間隔部分的氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示；其中該跨膜部分來源於CD8、CD3ζ、CD4或CD28的跨膜區；較佳地，該跨膜部分的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示。
如申請專利範圍第27項所述的標記性多肽，其中該標記性多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 15所示。
具有如申請專利範圍第27項至第33項中任一項所述的標記性多肽的編碼序列的核酸。
如申請專利範圍第34項所述的核酸，其中該核酸依次包含可操作地連接的啓動子、信號肽編碼序列、以及所述的標記性多肽的編碼序列。
如申請專利範圍第34項所述的核酸，其中該核酸包括DNA和mRNA。
一種重組表達載體，其中該重組表達載體依次包含可操作地連接的啓動子、信號肽編碼序列、以及如申請專利範圍第27項至第33項中任一項所述的標記性多肽的編碼序列。
一種分離的重組病毒，其中該重組病毒的基因組具有依次的可操作地連接的啟動子、信號肽編碼序列、以及如申請專利範圍第27項至第33項中任一項所述的標記性多肽的編碼序列，並且該標記性多肽能夠經表達而修飾在腫瘤細胞和/或癌細胞的表面；並且，該重組病毒包括一選擇複製型重組溶瘤病毒或一複製缺陷型重組病毒。
如申請專利範圍第38項所述的重組病毒，其中該重組病毒為選擇複製型重組溶瘤病毒，並且該重組溶瘤病毒來源於具有溶瘤作用的經基因突變的病毒和具有溶瘤作用的野生型病毒；較佳地，該重組溶瘤病毒來源於具有溶瘤作用的腺病毒、痘病毒、單純疱疹病毒、麻疹病毒、塞姆利基森林病毒、水疱性口炎病毒、脊髓灰質炎病毒、逆轉錄病毒、呼腸孤病毒、塞內卡谷病毒、埃可型腸道病毒、柯薩奇病毒、新城疫病毒和馬拉巴病毒。
一種嵌合抗原受體，該嵌合抗原受體包括可操作地連接的、依次串聯的一抗原結合結構域、一間隔區、一跨膜區和一胞內結構域，其中，該抗原結合結構域能夠識別並結合如申請專利範圍第27項至第33項中任一項所述的標記性多肽的胞外抗原決定區。
如申請專利範圍第40項所述的嵌合抗原受體，其中該抗原結合結構域的氨基酸序列如SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43或SEQ ID NO: 44所示。
如申請專利範圍第40項所述的嵌合抗原受體，其中該胞內結構域來自一淋巴細胞胞內活化信號轉導區和一可任選的淋巴細胞共刺激信號轉導區，其中該胞內活化信號轉導區選自CD3ζ或DAP12的胞內活化信號轉導區；該可任選的淋巴細胞共刺激信號轉導區選自4-1BB、CD28、CD27、OX40、GITR、和/或ICOSS的共刺激信號轉導區。
如申請專利範圍第40項所述的嵌合抗原受體，其中該間隔區來自CD8α的鉸鏈區、IgG的鉸鏈區或IgD的鉸鏈區，該跨膜區來自CD8α的跨膜區、CD3ζ的跨膜區、CD4的跨膜區或CD28的跨膜區。
如申請專利範圍第40項所述的嵌合抗原受體，其中該嵌合抗原受體的氨基酸序列如SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47或SEQ ID NO: 48所示。
具有如申請專利範圍第40項至第44項中任一項所述的嵌合抗原受體的編碼序列的DNA。
如申請專利範圍第45項所述的DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54或SEQ ID NO: 55所示。
由如申請專利範圍第45項或第46項所述的DNA轉錄的mRNA。
一種重組表達載體，其中該重組表達載體依次包含可操作地連接的啓動子、信號肽編碼序列、以及如申請專利範圍第40項至第44項中任一項所述的嵌合抗原受體的編碼序列。
一種嵌合抗原受體修飾的免疫細胞，該免疫細胞的表面被如申請專利範圍第40項至第44項中任一項所述的嵌合抗原受體修飾。
如申請專利範圍第49項所述的嵌合抗原受體修飾的免疫細胞，其中該免疫細胞為NK細胞或T細胞。
一種用於治療腫瘤和/或癌症的具有協同作用的聯合藥物的藥盒，包括：一第一容器，該第一容器裝有如申請專利範圍第1項至第24項中任一項所述的治療劑中的一第一組合物；一第二容器，該第二容器裝有如申請專利範圍第1-24中任一項所述的治療劑中的一第二組合物，其中該第一容器和該第二容器是獨立的；以及一載明給藥時機和給藥方式的說明書。
如申請專利範圍第34項至第36項中任一項所述的核酸在製備用於治療或預防腫瘤和/或癌症的藥物中的用途。
如申請專利範圍第38項或第39項所述的重組病毒在製備用於治療或預防腫瘤和/或癌症的藥物中的用途。
如申請專利範圍第49項或第50項所述的嵌合抗原受體修飾的免疫細胞在製備用於治療或預防腫瘤和/或癌症的藥物中的用途。
如申請專利範圍第51項所述的藥盒在製備用於治療或預防腫瘤和/或癌症的藥物中的用途。
如申請專利範圍第52項至第55項中任一項所述的用途，其中該腫瘤和/或癌症包括：乳腺癌、頭頸部腫瘤、滑膜癌、腎癌、結締組織癌、黑色素瘤、肺癌、食管癌、結腸癌、直腸癌、腦癌、肝癌、骨癌、絨毛膜癌、胃泌素瘤、嗜鉻細胞瘤、催乳素瘤、von Hippel-Lindau病、Zollinger-Ellison綜合症、肛門癌、膽管癌、膀胱癌、輸尿管癌、神經膠質瘤、神經母細胞瘤、腦膜瘤、脊髓腫瘤、骨軟骨瘤、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤、原發部位不明癌、類癌、纖維肉瘤、佩吉特病、宮頸癌、膽囊癌、眼癌、卡波西氏肉瘤、前列腺癌、睪丸癌、皮膚鱗狀細胞癌、間皮瘤、多尖端骨髓瘤、卵巢癌、胰腺內分泌瘤、胰高血糖素瘤、胰腺癌、陰莖癌、垂體癌、軟組織肉瘤、視網膜母細胞瘤、小腸癌、胃癌、胸腺癌、滋養細胞癌、葡萄胎、子宮內膜癌、陰道癌、外陰癌、蕈樣真菌病、胰島素瘤、心臟癌、腦膜癌、腹膜癌、胸膜癌和血液癌。
一種治療腫瘤和/或癌症的方法，包括：對腫瘤和/或癌症患者施用如申請專利範圍第1項至第24項中任一項所述的治療劑中的一第一組合物；和對該腫瘤和/或癌症患者施用如申請專利範圍第1項至第24項中任一項所述的治療劑中的一第二組合物。
如申請專利範圍第57項所述的方法，包括以下依次進行的步驟： 1）對該腫瘤和/或癌症患者施用該第一組合物；和 2）在施用該第一組合物之後，對該腫瘤和/或癌症患者施用該第二組合物。
如申請專利範圍第57項所述的方法，其中該腫瘤和/或癌症包括：乳腺癌、頭頸部腫瘤、滑膜癌、腎癌、結締組織癌、黑色素瘤、肺癌、食管癌、結腸癌、直腸癌、腦癌、肝癌、骨癌、絨毛膜癌、胃泌素瘤、嗜鉻細胞瘤、催乳素瘤、von Hippel-Lindau病、Zollinger-Ellison綜合症、肛門癌、膽管癌、膀胱癌、輸尿管癌、神經膠質瘤、神經母細胞瘤、腦膜瘤、脊髓腫瘤、骨軟骨瘤、軟骨肉瘤、尤文氏肉瘤、原發部位不明癌、類癌、纖維肉瘤、佩吉特病、宮頸癌、膽囊癌、眼癌、卡波西氏肉瘤、前列腺癌、睪丸癌、皮膚鱗狀細胞癌、間皮瘤、多尖端骨髓瘤、卵巢癌、胰腺內分泌瘤、胰高血糖素瘤、胰腺癌、陰莖癌、垂體癌、軟組織肉瘤、視網膜母細胞瘤、小腸癌、胃癌、胸腺癌、滋養細胞癌、葡萄胎、子宮內膜癌、陰道癌、外陰癌、蕈樣真菌病、胰島素瘤、心臟癌、腦膜癌、腹膜癌、胸膜癌和血液癌。