CN109706163A

CN109706163A - 微环dna表达连接人与动物靶细胞与效应细胞的桥接分子及其应用

Info

Publication number: CN109706163A
Application number: CN201711012914.XA
Authority: CN
Inventors: 谢亦武
Original assignee: Shenzhen New Connaught Micro Ring Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen New Connaught Micro Ring Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2017-10-26
Filing date: 2017-10-26
Publication date: 2019-05-03

Abstract

本申请涉及微环DNA表达连接人与动物靶细胞与效应细胞的桥接分子及其应用。具体涉及一种用于在体内表达人‑动物交叉反应性双特异性抗体(crBsAb)的微环DNA载体。人‑动物双特异性抗体(crBsAb)能够结合人或动物的靶细胞，也能够结合人或动物的效应细胞(T细胞或NK细胞)，用于癌症、感染、及其它疾病的治疗。在药物临床试验前，人‑动物交叉反应性双特异性抗体有利于借助动物模型评价双特异性抗体类药物的安全性与有效性，以促进药物的开发进程。因为，本发明使用于大动物实验与临床上用于人的微环DNA‑基因药完全一样，避免现在常见的使用大动物与人两个不同版本的生物药造成结果解说上的困难。

Description

微环DNA表达连接人与动物靶细胞与效应细胞的桥接分子及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种微环(Minicircle,MC)DNA载体，更具体为一种用于在体内表达人-动物交叉反应性双特异性抗体(Bispecific antibody cross-reactive between human and animal，crBsAb)的微环DNA载体。

背景技术

双特异性抗体(Bispecific antibody，简称BsAb)是基因工程抗体的一种，是一类具有双功能的抗体杂交分子，两价抗体中的可变结构域(或者Fab段)分别具有不同的特异性，能够与两种不同的配体结合。研究人员在设计BsAb分子时，考虑到BsAb能够与靶细胞上的抗原分子结合，又可以与效应细胞上的功能分子结合。这样，BsAb分子就在靶细胞(抗原分子)和效应细胞(功能分子)之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应。抗肿瘤和抗免疫活性细胞(比如T细胞或NK细胞)的双特异性抗体，不仅具有激活免疫活性细胞的作用，而且可以通过抗肿瘤的Fab段特异性结合肿瘤细胞而发挥作用，提高局部免疫活性细胞的浓度，增强效应分子杀伤肿瘤的能力。BsAb现已成为抗体工程领域的研究热点，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景，是未来抗体药物市场的发展方向。

目前双特异性抗体BsAb的制备主要包括三种方法：化学偶联法、杂交-杂交瘤法、基因工程抗体制备法。其中基因工程的方法是目前最常用和最先进的工艺技术。微环DNA载体表达方法属于基因工程制备法。利用微环DNA载体可以表达微环双特异性抗体MC.BsAb，所表达的双特异性抗体可以连接靶细胞与T细胞或NK细胞，并触发T细胞或NK细胞杀灭靶细胞。与该发明最接近的相关技术是我们之前发明的微环DNA载体表达双特异性抗体的技术MC.BsAb(CN201710245146.6)。

在药物临床前研究中，动物模型的相关试验是必不可少的。猴和鼠类模型是常见的模式动物，常用来评价药物临床前的安全性与有效性。目前研发中的双特异性抗体大多是人化或人源化的，仅对来源于人的抗原具有特异性的，与猴或鼠类的抗原无交叉反应，难以利用猴或鼠类评估其安全性与有效性。相反，少数只对猴与鼠类有效的抗体，实验结果也不一定等同于人。然而，本发明解决了这个难题，因为存在人-动物的交叉反应，只一个版本的微环基因药就能够同时用于动物实验、人的临床试验和上市的产品，避免了不同版本的生物药可能存在的差异及潜在的安全隐忧。由此可见，开发一种人-动物交叉反应性双特异性抗体(Bispecific antibody cross-reactive between human and animal，crBsAb)，有利于借助动物模型(如猴或鼠类)评价双特异性抗体类药物的安全性与有效性，以促进药物的开发进程，是一个重要的进步。

发明内容

本发明提供一种表达人-动物交叉反应性靶细胞-效应细胞桥接分子(Bridgebetween target cell and effector cell of both human and animals，crBTEC)的重组基因载体，所述桥接分子包含：与靶细胞作用靶点特异性结合的部分A，和与效应细胞作用靶点特异性结合的部分B。

在一个实施方案中，所述重组基因载体选自非病毒基因载体。优选的，所述重组基因载体选自微环DNA载体。其中，所述桥接分子选自蛋白或多肽。优选的，所述桥接分子选自双特异性抗体。其中，所述动物选自猴或鼠类。优选的，所述猴选自食蟹猴，鼠类选自大鼠或小鼠。

在一个实施方案中，所述重组基因载体为重组表达载体，选自原核表达载体或真核表达载体；优选真核表达载体；更优选用于哺乳动物细胞真核表达的重组表达载体。

在一个实施方案中，所述部分A和所述部分B分别选自蛋白分子或多肽分子。优选的，所述部分A和部分B分别选自Fab、Fab’、单链抗体(scFv)、单域抗体(V_HH)、单链T细胞受体(scTCR)和其它。

在一个实施方案中，所述靶细胞选自癌细胞、受感染细胞或其它。所述效应细胞选自T细胞、NK细胞或其它。优选的，所述部分A特异性结合的作用靶点选自：CD19、CD20、EpCAM、EGFR、HER2、VEGFR、PD-1、PD-L1、IL-17R、TNF-αR、病毒抗原或其它。所述部分B特异性结合的作用靶点选自：CD3、CD16、CD28、4-1BB、OX40、TCR、CD56、NKG2D、NCR或其它。

在一个实施方案中，所述部分A包含：重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1、5或9所示，和轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3、7或11所示；以及，所述部分B包含：重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：13或17所示，和轻链可变区，其氨基酸序列如SEQID NO：15或19所示。

在一个实施方案中，所述桥接分子选自人-动物交叉反应性双特异性抗体(crBsAb)。所述crBsAb能够结合人或动物的靶细胞作用靶点，也能够结合人或动物的效应作用靶点。其中，所述动物选自猴或鼠类。优选的，所述猴选自食蟹猴，鼠类选自大鼠或小鼠。

在一个实施方案中，所述部分A包含的重链可变区具有与SEQ ID NO：1所示序列具有至少90％、95％、98％或99％同源性的氨基酸序列，包含的轻链可变区具有与SEQ ID NO：3所示序列具有至少90％、95％、98％或99％同源性的氨基酸序列。

在一个实施方案中，所述部分B包含的重链可变区具有与SEQ ID NO：5所示序列具有至少90％、95％、98％或99％同源性的氨基酸序列，包含的轻链可变区具有与SEQ ID NO：7所示序列具有至少90％、95％、98％或99％同源性的氨基酸序列。

本发明提供了一种表达人-动物交叉反应性靶细胞-效应细胞桥接分子的重组基因载体，所述重组基因载体包含所述桥接分子的编码基因。

在一个实施方案中，所述重组基因载体包含：部分A的编码基因，和/或包含部分B的编码基因。优选的，部分A的编码基因包含：重链可变区的编码基因，其核苷酸序列如SEQID NO：2、6或10所示，和/或轻链可变区的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4、8或12所示。优选的，部分B的编码基因包含：重链可变区的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：14或18所示，和/或轻链可变区的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：16或20所示。

在一个实施方案中，所述重组基因载体包含：与上述部分A和/或部分B的编码基因的核苷酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同源性的核苷酸序列，且编码得到的桥接分子具有与之前实施方案中所述的桥接分子相同的功能。本领域技术人员公知，在不改变所编码的氨基酸的情况下，所述编码基因序列中的一个或多个密码子可以进行等义替换，如一个或几个密码子，如1、2、3、4、5、6、8、9、10、15、20、30、40、50个密码子。

在一个实施方案中，所述重组基因载体包含所述桥接分子的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：21-38中任一项所示。在一个实施方案中，所述重组基因载体包含：与上述桥接分子的编码基因的核苷酸序列具有至少90％、95％、98％或99％同源性的核苷酸序列，且编码得到的桥接分子具有与之前实施方案中所述的桥接分子相同的功能。本领域技术人员公知，在不改变所编码的氨基酸的情况下，所述编码基因序列中的一个或多个密码子可以进行等义替换，如一个或几个密码子，如1、2、3、4、5、6、8、9、10、15、20、30、40、50个密码子。

本发明提供了一种由之前实施方案中所述的重组基因载体所表达的桥接分子。优选的，所述重组基因载体选自非病毒基因载体。更优选的，所述重组基因载体选自微环DNA载体。

本发明提供了一种之前实施方案中所述的重组基因载体的制备方法，具体步骤包括：

(1)从现有技术中分别获取人-猴交叉反应性抗体的重链可变区(VH)序列、轻链可变区(VL)序列。

(2)根据上述VH、VL序列设计成多种组合形式的桥接分子，并构建表达所述桥接分子的重组基因载体。

任选的，(3)在体内外鉴定所述桥接分子的表达水平，并检测表达产物介导效应细胞对靶细胞的杀伤效果。

在一个实施方案中，所述重组基因载体选自非病毒基因载体。优选的，所述重组基因载体选自微环DNA载体。优选的，所述桥接分子选自双特异性抗体。更优选的，所述重组基因载体选自表达双特异性抗体的微环DNA载体(MC.BsAb)。其中，所述猴选自食蟹猴。

本发明提供了一种宿主细胞，包含之前实施方案中所述的重组基因载体，或由之前实施方案中所述的制备方法所得到的重组基因载体。

在一个实施方案中，所述宿主细胞包括细菌细胞、酵母菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

本发明提供了一种之前实施方案中所述的双特异性抗体的制备方法，具体步骤包括：

(1)构建所述重组基因载体；

(2)将所述重组基因载体导入宿主细胞；

(3)在适合表达的条件下，培养宿主细胞，诱导表达，分离纯化，获得所述双特异性抗体。

本发明提供了一种药物组合物，包含之前实施方案中所述的重组基因载体，或由之前实施方案中所述的制备方法所得到的重组基因载体，或由之前实施方案中所述的重组基因载体所表达的桥接分子，以及药学上可接受的载体。

在一个实施方案中，所述药物组合物可根据常规方法制成药物制剂。制剂过程中，优选将重组基因载体或双特异性抗体与药学上可接受的载体混合或用载体稀释。当载体作为稀释剂时，其可以为固体、半固体或液体。制剂选自片剂、丸剂、粉剂、胶囊、混悬剂、乳剂、溶液剂、气溶胶、胶囊、注射用溶液等形式。合适的载体、赋形剂或稀释剂包括水、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、硅酸钙、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。制剂还可以包括填充剂、抗凝血剂、润滑剂、保湿剂、调味剂、乳化剂、防腐剂等。

本发明提供了一种之前实施方案中所述的重组基因载体、所述的桥接分子、所述的宿主细胞或所述的药物组合物在制备用于治疗癌症、感染或其它疾病的药物中的用途。

本发明的积极效果包括：

在药物临床试验之前，需要分子阶段、细胞阶段、动物阶段的试验数据，而动物的试验数据是必不可少的。本发明的人-动物交叉反应性双特异性抗体既能够结合人的抗原分子，又能够交叉识别动物的抗原分子，有利于借助模式动物来评价双特异性抗体类药物的安全性与有效性，以促进药物的开发进程。

附图说明

图1：表达抗CD19(scFv)/CD3(scFv)双特异性抗体的微环DNA载体结构图。

图2：表达抗CD19/CD3人-动物交叉反应性桥接分子crBTEC(DART)的微环DNA载体结构图。

图3：表达抗CD19/CD3人-动物交叉反应性桥接分子crBTEC(DART-Fc)的微环DNA载体结构图。

图4：表达抗EpCAM(scFv)/CD3(scFv)双特异性抗体的微环DNA载体结构图。

图5：表达抗EpCAM/CD3人-动物交叉反应性桥接分子crBTEC(DART)的微环DNA载体结构图。

图6：表达抗EpCAM/CD3人-动物交叉反应性桥接分子crBTEC(DART-Fc)的微环DNA载体结构图。

图7：采用PAGE检测EpCAM/CD3人-动物交叉反应性桥接分子crBTEC的表达。

具体实施方式

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。在不背离本发明精神的情况下，本领域技术人员结合公知技术，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

实施例1、人-动物交叉反应性桥接分子(crBTEC)的构建

设计crBTEC并构建相应的微环DNA表达载体，crBTEC表达框包括多种结构，如下：

(1)scFv-scFv结构：

其中，SP为信号肽(Signal Peptide)；Linker为连接序列。Tar表示靶细胞(Target)抗原，如CD19、CD20、EpCAM、Her2等。anti-Tar.V_H的氨基酸序列如SEQ ID NO：1、5或9所示，anti-Tar.V_L的氨基酸序列如SEQ ID NO：3、7或11所示；anti-CD3.V_H的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，anti-CD3.V_L的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示；

anti-CD16.V_H的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示，anti-CD16.V_L的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示。其中还包括上述各个元件的编码基因；scFv-scFv双特异性抗体的编码基因如SEQ ID NO：21、24、27、30、33或36所示。

(2)双特异性抗体DART(Dual-Affinity Re-Targeting antibody)结构：

DART表达框经翻译、剪切后形成两条链(Chain 1、Chain 2)；这两条链通过配对的E/K-coli形成稳定的异二聚体。

其中，SP为信号肽(Signal Peptide)，SP前加Kozak序列可增强表达；Linker为连接序列，Furin为furin蛋白酶剪切位点、2A为2A自剪切位点。Furin剪切位点的氨基酸序列为R-X-[R/K]-R(比如RRKR)，X指代任一种氨基酸；E/K coli为电性相反、配对的螺旋结构，且K coli和E coli可互换位置；2A包括E2A、F2A、P2A和T2A等，在2A前加入GSG序列可增加剪切效率。Tar表示靶细胞(Target)抗原，如CD19、CD20、EpCAM、Her2等。其中还包括上述各个元件的编码基因；DART双特异性抗体的编码基因如SEQ ID NO：22、25、28、31、34或37所示。

(3)双特异性抗体DART-Fc结构：

DART-Fc表达框经翻译、剪切后形成两条链(Chain 1、Chain 2)；Chain 1和Chain2通过配对的E/K-coli以及Fc“knob-into-hole”结构形成稳定的异二聚体。“knob-into-hole”设计既可避免同二聚体的产生，还能增加半衰期。

其中，SP为信号肽(Signal Peptide)，SP前加Kozak序列可增强表达；Linker为连接序列，Furin为furin蛋白酶剪切位点、2A为2A自剪切位点。Furin剪切位点的氨基酸序列为R-X-[R/K]-R(比如RRKR)，X指代任一种氨基酸；E/K coli为电性相反、配对的螺旋结构，且K coli和E coli可互换位置；Fc-knob和Fc-hole分别为IgG Fc段CH2-CH3突变体，也可互换位置；2A包括E2A、F2A、P2A和T2A等，2A前加入GSG序列可增加剪切效率。Tar表示靶细胞(Target)抗原，如CD19、CD20、EpCAM、Her2等。其中还包括上述各个元件的编码基因；DART-Fc双特异性抗体的编码基因如SEQ ID NO：23、26、29、32、35或38所示。

实施例2、微环DNA载体的构建以及微环(MC)的制备

(a)合成crBTEC的编码基因。

(b)选择合适的位点双酶切微环DNA空载体pMC.BESPX。

(c)使用seamless克隆或者传统克隆方法(如，酶切-连接)将crBTEC的编码基因插入双酶切后的空载体pMC.BESPX中，构建成微环DNA载体(pMC.crBTEC)。

(d)载体pMC.crBTEC转化大肠杆菌E coli.ZYCY10P3S2T，按标准微环制备方法得到微环(MC.crBTEC)。

其中，微环DNA空载体pMC.BESPX、工程菌E coli.ZYCY10P3S2T，以及微环制备方法见参考文献Nat Biotechnol.2010,28:1287-1289.

实施例3、crBTEC的表达和纯化

一、crBTEC在293T细胞中的表达

采用superfect质粒转染试剂盒(Invitrogen公司)将上述微环DNA转染293T细胞，在无血清培养基中培养三天后分别收集293T细胞上清液。

二、crBTEC的纯化

收集细胞培养上清低温超速离心，取上清，再采用His-Tag亲和树脂纯化(cOmplete His-Tag Purification Resin，Roche)，纯化后的蛋白PAGE或Western Blot定性检测，并使用Bradford法定量检测蛋白浓度。纯化产物置于-20或-80℃长期保存。

实施例4、crBTEC的结合实验

4.1、crBTEC与人效应细胞、靶细胞的结合

以抗EpCAM/CD3-crBTEC和抗CD19/CD16-crBTEC为例，采用流式细胞术分别检测crBTEC与人靶细胞(Targets，T)、效应细胞(Effector，E)的结合活性，包括如下步骤：

(a)细胞培养：靶细胞(表达特异抗原靶点的细胞)；效应细胞(T细胞或NK细胞)。本例中抗EpCAM/CD3-crBTEC对应的靶细胞具体指人EpCAM阳性细胞(如卵巢癌细胞SKOV-3)，效应细胞指人CD3⁺T细胞(如JurKat细胞或CIK细胞)；抗CD19/CD16-crBTEC对应的靶细胞指人CD19阳性细胞(如B-淋巴瘤细胞Raji)，对应的效应细胞指人NK细胞(CD16⁺)。

(b)收集细胞：贴壁细胞使用胰酶消化，加含血清培养基中和后离心弃上清得细胞；悬浮细胞直接离心收集。

(c)两种细胞均用预冷PBS洗涤2次，200g离心4min，收集细胞，分别计数。

(d)每个实验组分别分配1×10⁵个靶细胞和效应细胞，分组如下：

空白组(不加crBTEC)和crBTEC组

(e)加入crBTEC溶液100μL/组冰上孵育30min。

(f)加入1mL预冷PBS洗涤，200g离心4min，收集细胞，加事先预冷并混好anti-flag抗体的PBS 100μL，冰上孵育30min。

(g)加入1mL预冷PBS洗涤，200g离心4min，收集细胞，加入100μL PBS重悬，上流式观察结合情况。

4.2、crBTEC与食蟹猴效应细胞、靶细胞的结合

以抗EpCAM/CD3-crBTEC和抗CD19/CD16-crBTEC为例，采用流式细胞术分别检测crBTEC与食蟹猴靶细胞(Targets，T)、效应细胞(Effector，E)的结合活性，步骤与4.1所述基本一致，区别在于本例中效应细胞、靶细胞替换为食蟹猴来源的细胞。具体的，本例中抗CD19/CD16-crBTEC对应的效应细胞为食蟹猴NK细胞，靶细胞为食蟹猴CD19⁺B细胞；抗EpCAM/CD3-crBTEC对应的靶细胞为食蟹猴EpCAM阳性细胞(如转染)，效应细胞为食蟹猴CD3⁺T细胞。

实施例5、crBTEC介导效应细胞杀伤靶细胞

5.1、以抗EpCAM/CD3-crBTEC和抗CD19/CD16-crBTEC为例，利用cck8法测定crBTEC介导人效应细胞对人靶细胞的杀伤作用(具体的效应细胞/靶细胞参见4.1)。

(a)提前1天将靶细胞接种于96孔板上，细胞接种量为2×10⁴/孔；同时设置分组(如表1所示；每组3个复孔)；

表1crBTEC介导效应细胞杀伤靶细胞的不同分组

组别	T(2×10<sup>4</sup>cells/孔)	E(1.6×10<sup>5</sup>cells/孔)	crBTEC(10ng/mL)
				组1(T)	+	-	-
组2(E)	-	+	-
				组3(T&E)	+	+	-
组4(crBTEC)	+	+	+
				组5(空白)	-	-	-

(b)第二天更换新鲜opti-MEM培养基，100μL/孔。

(c)效应细胞(E)计数并重悬于opti-MEM培养基中，按照T∶E＝1∶8的比例，根据(a)中分组加入相应数量的效应细胞(1.6×10⁵/孔，100μL/孔)。

(d)根据分组，在相应的孔中每孔加入纯化的crBTEC(终浓度为10ng/mL)，混匀。

(e)37℃细胞培养箱孵育6小时。

(f)加入cck8(Dojindo，日本)试剂(20μL/孔)，37℃细胞培养箱孵育2小时后，450nm处测定吸光度。

(g)根据cck8试剂盒(Dojindo，日本)说明书，统计活细胞数目并推算杀伤效率：

杀伤率＝[((T+E)-T&E)/T]×100％

其中，T代表活的靶细胞数量；E代表活的效应细胞数量；则T+E等于活的靶细胞和效应细胞的总数；T&E代表靶细胞经效应细胞杀伤后的活细胞数量。

5.2、以抗EpCAM/CD3-crBTEC和抗CD19/CD16-crBTEC为例，利用cck8法测定crBTEC介导食蟹猴效应细胞对食蟹猴靶细胞的杀伤作用(具体的效应细胞/靶细胞同5.2)。cck8法实验步骤同上所述5.1。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳新诺微环生物科技有限公司

<120> 微环DNA表达连接人与动物靶细胞与效应细胞的桥接分子及其应用

<160> 38

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 120

<212> PRT

<213> 抗CD19 VH氨基酸序列

<400> 1

Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

65 70 75 80

Phe Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Met Glu Leu Trp Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 360

<212> DNA

<213> 抗CD19 VH的编码基因

<400> 2

caggtcacac tgagagagag cggaccagct ctggtgaagc ctacccagac cctgaccctg 60

acttgcacct tcagcggctt cagcctgagc acaagcggaa tgggagtggg ttggatcagg 120

cagcctccag gaaaagcact cgagtggctg gctcacattt ggtgggacga cgacaagcgg 180

tacaacccag ccctgaagag cagactgacc atcagcaagg acaccagcaa gaaccaggtg 240

ttcctgacca tgaccaacat ggaccccgtg gacaccgcta cctactattg cgcccggatg 300

gagctctgga gctactactt cgactattgg ggccagggca caaccgtgac agtgtctagc 360

<210> 3

<211> 106

<212> PRT

<213> 抗CD19 VL氨基酸序列

<400> 3

Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp His Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Val Tyr Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 4

<211> 318

<212> DNA

<213> 抗CD19 VL的编码基因

<400> 4

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atcacttgca gagccagcca gagcgtgtcc tacatgcatt ggtaccagca gaagccaggc 120

caggctccta gactgctgat ctacgacgcc agcaacaggg ctagcggagt gcctagcaga 180

ttcagcggca gcggaagcgg cacagatcac accctgacca tctcttctct ggaagccgag 240

gacgccgcta catactactg cttccagggc agcgtgtacc cctttacctt cggccagggc 300

accaagctgg agatcaag 318

<210> 5

<211> 120

<212> PRT

<213> 抗EpCAM VH氨基酸序列

<400> 5

Glu Val Gln Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly

1 5 10 15

Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn

20 25 30

Tyr Trp Leu Gly Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Asp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asn Ile His Tyr Asn Glu Lys

50 55 60

Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala

65 70 75 80

Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe

85 90 95

Cys Ala Arg Leu Arg Asn Trp Asp Glu Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 6

<211> 360

<212> DNA

<213> 抗EpCAM VH的编码基因

<400> 6

gaagtgcagc tgctggaaca gagcggagca gaactcgtga gacccggcac cagcgtgaag 60

atcagctgca aggccagcgg ctacgccttc acaaactact ggctgggttg ggtgaagcag 120

aggccaggac acggcctgga gtggatcggt gacattttcc ccggcagcgg caacatccac 180

tacaacgaga agttcaaggg caaggccacc ctgacagccg ataagagcag cagcaccgcc 240

tacatgcagc tgtctagcct gaccttcgag gacagcgccg tgtacttttg cgccaggctg 300

cgcaattggg acgagcctat ggactattgg ggccagggaa ccaccgtgac agtgtctagc 360

<210> 7

<211> 115

<212> PRT

<213> 抗EpCAM VL氨基酸序列

<400> 7

Asp Ile Glu Leu Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr

1 5 10 15

Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu

20 25 30

Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

35 40 45

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

50 55 60

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

65 70 75 80

Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu

100 105 110

Glu Ile Lys

115

<210> 8

<211> 345

<212> DNA

<213> 抗EpCAM VL的编码基因

<400> 8

gatatcgagc tcgtgatgac acagtctcca tcctccctga ctgtgacagc aggagagaag 60

gtcactatga gctgcaagtc cagtcagagt ctgcttaaca gtggaaatca aaagaactac 120

ttgacctggt accagcagaa accagggcag cctcctaaac tgttgatcta ctgggcatcc 180

actagggaat ctggggtccc tgatcgcttc acaggcagtg gatctggaac agatttcact 240

ctcaccatca gcagtgtgca ggctgaagac ctggcagttt attactgcca gaatgattat 300

agttatcctc tcaccttcgg tgctgggacc aaacttgaga tcaaa 345

<210> 9

<211> 120

<212> PRT

<213> 抗HER2 VH氨基酸序列

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 10

<211> 360

<212> DNA

<213> 抗HER2 VH的编码基因

<400> 10

gaagtgcagc tggtggagtc aggaggagga ctggtgcagc caggaggatc tctgagactg 60

tcttgcgccg ccagcggctt caacatcaag gacacctaca tccattgggt ccggcaggct 120

ccaggaaaag gactcgagtg ggtggccaga atctacccca ccaacggcta cacccgctac 180

gccgatagcg tgaaaggccg gttcaccatc agcgccgata ccagcaagaa caccgcctac 240

ctgcagatga acagcctgag agccgaggac accgccgtgt actattgtag ccggtgggga 300

ggagacggct tctacgccat ggactattgg ggccagggaa cactggtgac agtgtcttcc 360

<210> 11

<211> 107

<212> PRT

<213> 抗HER2 VL氨基酸序列

<400> 11

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 12

<211> 321

<212> DNA

<213> 抗HER2 VL的编码基因

<400> 12

gacatccaga tgacccagag ccctagctct ctgagcgcca gcgtgggcga tagagtgacc 60

atcacctgca gagcctctca ggacgtgaac accgcagtgg cttggtacca gcagaagcca 120

gggaaggccc ctaagctgct gatctacagc gcctctttcc tgtacagcgg cgtgcctagc 180

aggttcagcg gaagcagaag cggcaccgat ttcaccctga ccatcagctc tctgcagcca 240

gaggacttcg ccacctacta ctgccagcag cactacacaa cccctcctac ctttggccag 300

ggcacaaagc tggagatcaa a 321

<210> 13

<211> 125

<212> PRT

<213> 抗CD3 VH氨基酸序列

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 14

<211> 375

<212> DNA

<213> 抗CD3 VH的编码基因

<400> 14

gaggtgcaac tcgtcgaatc aggagggggc ctggtccaac ccggaggaag cctgaggctc 60

agttgtgctg cctcaggctt taccttcaat acttacgcga tgaactgggt aagacaagct 120

cctgggaagg ggcttgaatg ggtggctcgc attcggtcaa agtataataa ttatgcgacc 180

tactatgccg attctgtaaa ggatagattc acaataagcc gagacgacag caaaaactca 240

ctttaccttc agatgaactc actcaaaaca gaggacacag cagtgtatta ctgtgtgaga 300

cacgggaact tcgggaactc ttatgtcagt tggtttgcgt actggggtca aggcacactc 360

gtgaccgtat catca 375

<210> 15

<211> 109

<212> PRT

<213> 抗CD3 VL氨基酸序列

<400> 15

Gln Ala Trp Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr

1 5 10 15

Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn

20 25 30

Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly Leu

35 40 45

Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln

65 70 75 80

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu

85 90 95

Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105

<210> 16

<211> 327

<212> DNA

<213> 抗CD3 VL的编码基因

<400> 16

caagcctgga ctcaggagcc atcccttaca gtgtctcctg gaggaactgt aacactcacc 60

tgcagatcat caaccggggc tgtgacaacg agcaactacg ctaattgggt ccaacagaag 120

cctggtcaag ctccgcgagg attgatcggg ggaacaaaca aacgcgcacc ttggacacct 180

gcacgcttta gcggcagtct cctgggaggt aaggcggccc tgactattac cggagcgcag 240

gctgaagatg aagctgatta ttattgtgct ctttggtata gcaatctttg ggtattcggt 300

gggggaacca agctcactgt gctcggc 327

<210> 17

<211> 120

<212> PRT

<213> 抗CD16 VH氨基酸序列

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

1 5 10 15

Ser Leu Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Tyr Asp Phe Ala Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 360

<212> DNA

<213> 抗CD16 VH的编码基因

<400> 18

caagtccagc ttgtgcagtc aggtgctgag gttaaaaaac caggagaaag tctgaaggta 60

tcatgtaagg cctcaggtta tacgtttact tcatattaca tgcactgggt gcgacaggct 120

cctggtcagg ggttggagtg gatgggaatc atcaatccat ccggtggtag caccagctac 180

gcacaaaagt ttcagggtcg cgtgacaatg acaagagaca cgtccacgtc cacggtctac 240

atggaattgt catccctgag atcagaggac accgccgtat attattgtgc acgcggcagt 300

gcttactact acgatttcgc agattattgg gggcagggga ctttggttac agtctcctcc 360

<210> 19

<211> 106

<212> PRT

<213> 抗CD16 VL氨基酸序列

<400> 19

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Thr Ile Ser Cys Gly Gly His Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Asn Tyr Ser Val Leu

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 20

<211> 318

<212> DNA

<213> 抗CD16 VL的编码基因

<400> 20

tcctacgttc tcactcagcc cagtagtgtc tcagttgctc cagggcaaac ggccacgatt 60

agttgcggag gtcacaacat aggcagtaag aatgtacatt ggtaccaaca gcgaccaggc 120

cagagccccg ttttggtcat ctatcaggat aataagcggc caagtggaat accggagcgg 180

ttcagcggta gtaacagtgg gaacaccgcc actctgacta tatccggtac gcaagctatg 240

gacgaagcag actactattg ccaggtgtgg gataactaca gcgtactgtt cggaggcggg 300

acgaaactta cagtcttg 318

<210> 21

<211> 1596

<212> DNA

<213> 抗CD19/CD3 (scFv-scFv)双特异性抗体的编码基因

<400> 21

atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactccgac 60

tacaaagatg atgacgataa ggaggtgcaa ctcgtcgaat caggaggggg cctggtccaa 120

cccggaggaa gcctgaggct cagttgtgct gcctcaggct ttaccttcaa tacttacgcg 180

atgaactggg taagacaagc tcctgggaag gggcttgaat gggtggctcg cattcggtca 240

aagtataata attatgcgac ctactatgcc gattctgtaa aggatagatt cacaataagc 300

cgagacgaca gcaaaaactc actttacctt cagatgaact cactcaaaac agaggacaca 360

gcagtgtatt actgtgtgag acacgggaac ttcgggaact cttatgtcag ttggtttgcg 420

tactggggtc aaggcacact cgtgaccgta tcatcaggcg aaggtactag tactggttct 480

ggtggaagtg gaggttcagg tggagcagac caagcctgga ctcaggagcc atcccttaca 540

gtgtctcctg gaggaactgt aacactcacc tgcagatcat caaccggggc tgtgacaacg 600

agcaactacg ctaattgggt ccaacagaag cctggtcaag ctccgcgagg attgatcggg 660

ggaacaaaca aacgcgcacc ttggacacct gcacgcttta gcggcagtct cctgggaggt 720

aaggcggccc tgactattac cggagcgcag gctgaagatg aagctgatta ttattgtgct 780

ctttggtata gcaatctttg ggtattcggt gggggaacca agctcactgt gctcggcggt 840

ggaggtggat ctcaggtcac tcttcgggaa tctggtcccg ccttggtgaa gccaacgcaa 900

actttgacat tgacctgcac gttttcagga ttttccctct caaccagcgg catgggtgtc 960

ggctggatca ggcagcctcc ggggaaagca cttgaatggc ttgctcatat ttggtgggat 1020

gacgacaagc gatacaaccc agcactgaaa agcaggttga ctatttcaaa ggacactagt 1080

aagaaccaag tgtttctgac tatgacaaac atggacccag tggataccgc gacctactat 1140

tgtgctcgga tggaattgtg gagctactat ttcgactact gggggcaggg aacgacagta 1200

actgtgtcct caggcggggg gggatcagga ggtggaggca gtggcggtgg tggctctgaa 1260

aatgtcctca ctcagtcccc cgccactttg tcagtaactc ccggcgaaaa ggcaacaata 1320

acctgtcggg caagtcaatc cgtgtcctat atgcactggt atcagcagaa accagggcaa 1380

gctccacgac tgcttatata tgatgcgtca aatagagcgt caggtgtgcc gtctcgattc 1440

agtggttcag gttctggaac agatcacact ttgactatct cttccctcga agctgaagat 1500

gctgcaacat attactgctt ccaaggtagc gtctacccgt ttacgtttgg tcaaggtaca 1560

aaattggaaa tcaaacacca ccaccaccac cactaa 1596

<210> 22

<211> 1845

<212> DNA

<213> 抗CD19/CD3-crBTEC (DART)的编码基因

<400> 22

atggagaccg acacactgct cctgtgggtc ctgctcctct gggtgccagg aagtacagga 60

caggcagtgg tgacccagga accttctctg accgtgtctc caggcggaac agtgacactg 120

acctgcagaa gcagcacagg cgccgtgaca accagcaact acgccaattg ggtgcagcag 180

aagccaggac aggcccctag aggcctgatt ggaggcacaa acaagagagc cccttggacc 240

ccagccagat tctccggatc tctgctggga ggcaaagccg ccctgacaat cacaggagct 300

caggccgaag acgaggccga ctactattgc gccctctggt acagcaacct ctgggtgttc 360

ggcggaggaa caaagctgac agtgctggga ggaggaggaa gcggaggagg aggacaggtc 420

acactgagag agagcggacc agctctggtg aagcctaccc agaccctgac cctgacttgc 480

accttcagcg gcttcagcct gagcacaagc ggaatgggag tgggttggat caggcagcct 540

ccaggaaaag cactcgagtg gctggctcac atttggtggg acgacgacaa gcggtacaac 600

ccagccctga agagcagact gaccatcagc aaggacacca gcaagaacca ggtgttcctg 660

accatgacca acatggaccc cgtggacacc gctacctact attgcgcccg gatggagctc 720

tggagctact acttcgacta ttggggccag ggcacaaccg tgacagtgtc tagcgctagc 780

accaagggca aggtggcagc ttgcaaggag aaggtggccg ctctgaagga gaaagtggcc 840

gctctgaagg agaaagtggc cgccctgaag gagagaagaa agagaggcag cggcgaggga 900

agaggatctc tgctgacttg cggcgacgtg gaagagaatc ccggccctat ggagaccgac 960

acactcctcc tctgggtgct gctcctctgg gtgccaggat ctacaggcga gaacgtgctg 1020

acccagtctc cagccacact gagcgtgaca ccaggcgaga aggccaccat cacttgcaga 1080

gccagccaga gcgtgtccta catgcattgg taccagcaga agccaggcca ggctcctaga 1140

ctgctgatct acgacgccag caacagggct agcggagtgc ctagcagatt cagcggcagc 1200

ggaagcggca cagatcacac cctgaccatc tcttctctgg aagccgagga cgccgctaca 1260

tactactgct tccagggcag cgtgtacccc tttaccttcg gccagggcac caagctggag 1320

atcaagggcg gcggaagcgg aggaggagga gaagtgcagc tggtggaaag cggaggagga 1380

ctggtgcagc caggaggatc tctgagactg tcttgcgccg ccagcggctt tacattcagc 1440

acctacgcca tgaattgggt ccggcaggct ccaggaaaag gactcgagtg ggtcggaagg 1500

atccggagca agtacaacaa ctacgccacc tactacgccg acagcgtgaa gggcaggttc 1560

accatcagcc gggacgacag caagaacagc ctgtacctgc agatgaacag cctgaagacc 1620

gaggacacag ccgtgtacta ttgcgtgcgc cacggcaact tcggcaacag ctacgtcagc 1680

tggttcgcct attgggggca gggaacactg gtgacagtgt ctagcgccag caccaaaggc 1740

gaagtggcag cttgcgagaa ggaagtggcc gctctggaga aggaagtggc cgctctggaa 1800

aaggaagtgg cagccctgga gaagcatcat caccatcatc attga 1845

<210> 23

<211> 3225

<212> DNA

<213> 抗CD19/CD3-crBTEC (DART-Fc)的编码基因

<400> 23

atggagaccg acacactgct cctgtgggtc ctgctcctct gggtgccagg aagtacagga 60

caggcagtgg tgacccagga accttctctg accgtgtctc caggcggaac agtgacactg 120

acctgcagaa gcagcacagg cgccgtgaca accagcaact acgccaattg ggtgcagcag 180

aagccaggac aggcccctag aggcctgatt ggaggcacaa acaagagagc cccttggacc 240

ccagccagat tctccggatc tctgctggga ggcaaagccg ccctgacaat cacaggagct 300

caggccgaag acgaggccga ctactattgc gccctctggt acagcaacct ctgggtgttc 360

ggcggaggaa caaagctgac agtgctggga ggaggaggaa gcggaggagg aggacaggtc 420

acactgagag agagcggacc agctctggtg aagcctaccc agaccctgac cctgacttgc 480

accttcagcg gcttcagcct gagcacaagc ggaatgggag tgggttggat caggcagcct 540

ccaggaaaag cactcgagtg gctggctcac atttggtggg acgacgacaa gcggtacaac 600

ccagccctga agagcagact gaccatcagc aaggacacca gcaagaacca ggtgttcctg 660

accatgacca acatggaccc cgtggacacc gctacctact attgcgcccg gatggagctc 720

tggagctact acttcgacta ttggggccag ggcacaaccg tgacagtgtc tagcgctagc 780

accaagggca aggtggcagc ttgcaaggag aaggtggccg ctctgaagga gaaagtggcc 840

gctctgaagg agaaagtggc cgccctgaag gagggaggcg gcgataagac acacacttgc 900

cctccttgtc cagctccaga agcagcagga ggacctagcg tgttcctgtt ccctcccaag 960

cctaaggaca ccctgatgat cagccggacc ccagaagtga cttgcgtggt ggtggacgtg 1020

tcccacgaag accccgaggt caagttcaat tggtacgtgg acggagtgga ggtgcacaac 1080

gctaagacca agcccaggga ggagcagtac aacagcacct acagggtggt gtccgtgctg 1140

acagtgctgc accaggattg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt gtccaacaag 1200

gccctgccag cccctatcga gaagaccatc agcaaggcca agggccagcc tagagaacct 1260

caggtgtaca ccctgccccc tagcagagag gagatgacca agaaccaggt ctccctctgg 1320

tgcctggtga agggcttcta ccctagcgac atcgccgtgg agtgggaatc taacggtcag 1380

ccagagaaca actacaagac caccccccca gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg 1440

tacagcaagc tgaccgtgga caaaagccgc tggcagcagg gcaacgtgtt ctcttgcagc 1500

gtgatgcacg aggccctgca caaccactac acccagaaga gcctgagcct gagcccagga 1560

aagagaagaa agagaggcag cggcgaggga agaggatctc tgctgacttg cggcgacgtg 1620

gaagagaatc ccggccctat ggagaccgac acactcctcc tctgggtgct gctcctctgg 1680

gtgccaggat ctacaggcga gaacgtgctg acccagtctc cagccacact gagcgtgaca 1740

ccaggcgaga aggccaccat cacttgcaga gccagccaga gcgtgtccta catgcattgg 1800

taccagcaga agccaggcca ggctcctaga ctgctgatct acgacgccag caacagggct 1860

agcggagtgc ctagcagatt cagcggcagc ggaagcggca cagatcacac cctgaccatc 1920

tcttctctgg aagccgagga cgccgctaca tactactgct tccagggcag cgtgtacccc 1980

tttaccttcg gccagggcac caagctggag atcaagggcg gcggaagcgg aggaggagga 2040

gaagtgcagc tggtggaaag cggaggagga ctggtgcagc caggaggatc tctgagactg 2100

tcttgcgccg ccagcggctt tacattcagc acctacgcca tgaattgggt ccggcaggct 2160

ccaggaaaag gactcgagtg ggtcggaagg atccggagca agtacaacaa ctacgccacc 2220

tactacgccg acagcgtgaa gggcaggttc accatcagcc gggacgacag caagaacagc 2280

ctgtacctgc agatgaacag cctgaagacc gaggacacag ccgtgtacta ttgcgtgcgc 2340

cacggcaact tcggcaacag ctacgtcagc tggttcgcct attgggggca gggaacactg 2400

gtgacagtgt ctagcgccag caccaaaggc gaagtggcag cttgcgagaa ggaagtggcc 2460

gctctggaga aggaagtggc cgctctggaa aaggaagtgg cagccctgga gaagggaggc 2520

ggcgataaga cacacacttg ccctccttgt ccagctccag aagcagcagg aggacctagc 2580

gtgttcctgt tccctcccaa gcctaaggac accctgatga tcagccggac cccagaagtg 2640

acttgcgtgg tggtggacgt gtcccacgaa gaccccgagg tcaagttcaa ttggtacgtg 2700

gacggagtgg aggtgcacaa cgctaagacc aagcccaggg aggagcagta caacagcacc 2760

tacagggtgg tgtccgtgct gacagtgctg caccaggatt ggctgaacgg caaggagtac 2820

aagtgcaagg tgtccaacaa ggccctgcca gcccctatcg agaagaccat cagcaaggcc 2880

aagggccagc ctagagaacc tcaggtgtac accctgcccc ctagcagaga ggagatgacc 2940

aagaaccagg tgtccctgtc ttgcgccgtg aagggcttct accctagcga catcgccgtg 3000

gagtgggaat ctaacggtca gccagagaac aactacaaga ccaccccccc cgtgctggat 3060

agcgacggca gcttcttcct ggtgtccaag ctgaccgtgg acaaaagccg ctggcagcag 3120

ggcaacgtgt tctcttgcag cgtgatgcac gaggccctgc ataacagata cacccagaag 3180

agcctgagcc tgagcccagg aaagcatcat caccatcatc attga 3225

<210> 24

<211> 1572

<212> DNA

<213> 抗CD19/CD16-crBTEC (scFv-scFv)的编码基因

<400> 24

atgggatgga gctgtatcat cctcttcttg gtagcaacag ctacaggtgt ccactccgac 60

tacaaagatg atgacgataa gcaagtccag cttgtgcagt caggtgctga ggttaaaaaa 120

ccaggagaaa gtctgaaggt atcatgtaag gcctcaggtt atacgtttac ttcatattac 180

atgcactggg tgcgacaggc tcctggtcag gggttggagt ggatgggaat catcaatcca 240

tccggtggta gcaccagcta cgcacaaaag tttcagggtc gcgtgacaat gacaagagac 300

acgtccacgt ccacggtcta catggaattg tcatccctga gatcagagga caccgccgta 360

tattattgtg cacgcggcag tgcttactac tacgatttcg cagattattg ggggcagggg 420

actttggtta cagtctcctc cggcgaaggt actagtactg gttctggtgg aagtggaggt 480

tcaggtggag cagactccta cgttctcact cagcccagta gtgtctcagt tgctccaggg 540

caaacggcca cgattagttg cggaggtcac aacataggca gtaagaatgt acattggtac 600

caacagcgac caggccagag ccccgttttg gtcatctatc aggataataa gcggccaagt 660

ggaataccgg agcggttcag cggtagtaac agtgggaaca ccgccactct gactatatcc 720

ggtacgcaag ctatggacga agcagactac tattgccagg tgtgggataa ctacagcgta 780

ctgttcggag gcgggacgaa acttacagtc ttgggtggag gtggatctca ggtcactctt 840

cgggaatctg gtcccgcctt ggtgaagcca acgcaaactt tgacattgac ctgcacgttt 900

tcaggatttt ccctctcaac cagcggcatg ggtgtcggct ggatcaggca gcctccgggg 960

aaagcacttg aatggcttgc tcatatttgg tgggatgacg acaagcgata caacccagca 1020

ctgaaaagca ggttgactat ttcaaaggac actagtaaga accaagtgtt tctgactatg 1080

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<211> 1818

<212> DNA

<213> 抗CD19/CD16-crBTEC (DART)的编码基因

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<210> 31

<211> 1839

<212> DNA

<213> 抗EpCAM/CD16-crBTEC (DART)的编码基因

<400> 31

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<213> 抗EpCAM/CD16-crBTEC (DART-Fc)的编码基因

<400> 32

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catcaccatc atcattag 1578

<210> 37

<211> 1821

<212> DNA

<213> 抗Her2/CD16-crBTEC (DART)的编码基因

<400> 37

atggagaccg acacactgct cctgtgggtc ctgctcctct gggtgccagg aagtacagga 60

tcctacgttc tcactcagcc cagtagtgtc tcagttgctc cagggcaaac ggccacgatt 120

agttgcggag gtcacaacat aggcagtaag aatgtacatt ggtaccaaca gcgaccaggc 180

cagagccccg ttttggtcat ctatcaggat aataagcggc caagtggaat accggagcgg 240

ttcagcggta gtaacagtgg gaacaccgcc actctgacta tatccggtac gcaagctatg 300

gacgaagcag actactattg ccaggtgtgg gataactaca gcgtactgtt cggaggcggg 360

acgaaactta cagtcttggg aggaggaagc ggaggaggag gagaagtgca gctggtggag 420

tcaggaggag gactggtgca gccaggagga tctctgagac tgtcttgcgc cgccagcggc 480

ttcaacatca aggacaccta catccattgg gtccggcagg ctccaggaaa aggactcgag 540

tgggtggcca gaatctaccc caccaacggc tacacccgct acgccgatag cgtgaaaggc 600

cggttcacca tcagcgccga taccagcaag aacaccgcct acctgcagat gaacagcctg 660

agagccgagg acaccgccgt gtactattgt agccggtggg gaggagacgg cttctacgcc 720

atggactatt ggggccaggg aacactggtg acagtgtctt ccgctagcac caagggcaag 780

gtggcagctt gcaaggagaa ggtggccgct ctgaaggaga aagtggccgc tctgaaggag 840

aaagtggccg ccctgaagga gagaagaaag agaggcagcg gcgagggaag aggatctctg 900

ctgacttgcg gcgacgtgga agagaatccc ggccctatgg agaccgacac actcctcctc 960

tgggtgctgc tcctctgggt gccaggatct acaggcgaca tccagatgac ccagagccct 1020

agctctctga gcgccagcgt gggcgataga gtgaccatca cctgcagagc ctctcaggac 1080

gtgaacaccg cagtggcttg gtaccagcag aagccaggga aggcccctaa gctgctgatc 1140

tacagcgcct ctttcctgta cagcggcgtg cctagcaggt tcagcggaag cagaagcggc 1200

accgatttca ccctgaccat cagctctctg cagccagagg acttcgccac ctactactgc 1260

cagcagcact acacaacccc tcctaccttt ggccagggca caaagctgga gatcaaaggc 1320

ggcggaagcg gaggaggagg acaagtccag cttgtgcagt caggtgctga ggttaaaaaa 1380

ccaggagaaa gtctgaaggt atcatgtaag gcctcaggtt atacgtttac ttcatattac 1440

atgcactggg tgcgacaggc tcctggtcag gggttggagt ggatgggaat catcaatcca 1500

tccggtggta gcaccagcta cgcacaaaag tttcagggtc gcgtgacaat gacaagagac 1560

acgtccacgt ccacggtcta catggaattg tcatccctga gatcagagga caccgccgta 1620

tattattgtg cacgcggcag tgcttactac tacgatttcg cagattattg ggggcagggg 1680

actttggtta cagtctcctc cgccagcacc aaaggcgaag tggcagcttg cgagaaggaa 1740

gtggccgctc tggagaagga agtggccgct ctggaaaagg aagtggcagc cctggagaag 1800

catcatcacc atcatcattg a 1821

<210> 38

<211> 3201

<212> DNA

<213> 抗Her2/CD16-crBTEC (DART-Fc)的编码基因

<400> 38

atggagaccg acacactgct cctgtgggtc ctgctcctct gggtgccagg aagtacagga 60

tcctacgttc tcactcagcc cagtagtgtc tcagttgctc cagggcaaac ggccacgatt 120

agttgcggag gtcacaacat aggcagtaag aatgtacatt ggtaccaaca gcgaccaggc 180

cagagccccg ttttggtcat ctatcaggat aataagcggc caagtggaat accggagcgg 240

ttcagcggta gtaacagtgg gaacaccgcc actctgacta tatccggtac gcaagctatg 300

gacgaagcag actactattg ccaggtgtgg gataactaca gcgtactgtt cggaggcggg 360

acgaaactta cagtcttggg aggaggaagc ggaggaggag gagaagtgca gctggtggag 420

tcaggaggag gactggtgca gccaggagga tctctgagac tgtcttgcgc cgccagcggc 480

ttcaacatca aggacaccta catccattgg gtccggcagg ctccaggaaa aggactcgag 540

tgggtggcca gaatctaccc caccaacggc tacacccgct acgccgatag cgtgaaaggc 600

cggttcacca tcagcgccga taccagcaag aacaccgcct acctgcagat gaacagcctg 660

agagccgagg acaccgccgt gtactattgt agccggtggg gaggagacgg cttctacgcc 720

atggactatt ggggccaggg aacactggtg acagtgtctt ccgctagcac caagggcaag 780

gtggcagctt gcaaggagaa ggtggccgct ctgaaggaga aagtggccgc tctgaaggag 840

aaagtggccg ccctgaagga gggaggcggc gataagacac acacttgccc tccttgtcca 900

gctccagaag cagcaggagg acctagcgtg ttcctgttcc ctcccaagcc taaggacacc 960

ctgatgatca gccggacccc agaagtgact tgcgtggtgg tggacgtgtc ccacgaagac 1020

cccgaggtca agttcaattg gtacgtggac ggagtggagg tgcacaacgc taagaccaag 1080

cccagggagg agcagtacaa cagcacctac agggtggtgt ccgtgctgac agtgctgcac 1140

caggattggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtgt ccaacaaggc cctgccagcc 1200

cctatcgaga agaccatcag caaggccaag ggccagccta gagaacctca ggtgtacacc 1260

ctgcccccta gcagagagga gatgaccaag aaccaggtct ccctctggtg cctggtgaag 1320

ggcttctacc ctagcgacat cgccgtggag tgggaatcta acggtcagcc agagaacaac 1380

tacaagacca cccccccagt gctggacagc gacggcagct tcttcctgta cagcaagctg 1440

accgtggaca aaagccgctg gcagcagggc aacgtgttct cttgcagcgt gatgcacgag 1500

gccctgcaca accactacac ccagaagagc ctgagcctga gcccaggaaa gagaagaaag 1560

agaggcagcg gcgagggaag aggatctctg ctgacttgcg gcgacgtgga agagaatccc 1620

ggccctatgg agaccgacac actcctcctc tgggtgctgc tcctctgggt gccaggatct 1680

acaggcgaca tccagatgac ccagagccct agctctctga gcgccagcgt gggcgataga 1740

gtgaccatca cctgcagagc ctctcaggac gtgaacaccg cagtggcttg gtaccagcag 1800

aagccaggga aggcccctaa gctgctgatc tacagcgcct ctttcctgta cagcggcgtg 1860

cctagcaggt tcagcggaag cagaagcggc accgatttca ccctgaccat cagctctctg 1920

cagccagagg acttcgccac ctactactgc cagcagcact acacaacccc tcctaccttt 1980

ggccagggca caaagctgga gatcaaaggc ggcggaagcg gaggaggagg acaagtccag 2040

cttgtgcagt caggtgctga ggttaaaaaa ccaggagaaa gtctgaaggt atcatgtaag 2100

gcctcaggtt atacgtttac ttcatattac atgcactggg tgcgacaggc tcctggtcag 2160

gggttggagt ggatgggaat catcaatcca tccggtggta gcaccagcta cgcacaaaag 2220

tttcagggtc gcgtgacaat gacaagagac acgtccacgt ccacggtcta catggaattg 2280

tcatccctga gatcagagga caccgccgta tattattgtg cacgcggcag tgcttactac 2340

tacgatttcg cagattattg ggggcagggg actttggtta cagtctcctc cgccagcacc 2400

aaaggcgaag tggcagcttg cgagaaggaa gtggccgctc tggagaagga agtggccgct 2460

ctggaaaagg aagtggcagc cctggagaag ggaggcggcg ataagacaca cacttgccct 2520

ccttgtccag ctccagaagc agcaggagga cctagcgtgt tcctgttccc tcccaagcct 2580

aaggacaccc tgatgatcag ccggacccca gaagtgactt gcgtggtggt ggacgtgtcc 2640

cacgaagacc ccgaggtcaa gttcaattgg tacgtggacg gagtggaggt gcacaacgct 2700

aagaccaagc ccagggagga gcagtacaac agcacctaca gggtggtgtc cgtgctgaca 2760

gtgctgcacc aggattggct gaacggcaag gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc 2820

ctgccagccc ctatcgagaa gaccatcagc aaggccaagg gccagcctag agaacctcag 2880

gtgtacaccc tgccccctag cagagaggag atgaccaaga accaggtgtc cctgtcttgc 2940

gccgtgaagg gcttctaccc tagcgacatc gccgtggagt gggaatctaa cggtcagcca 3000

gagaacaact acaagaccac cccccccgtg ctggatagcg acggcagctt cttcctggtg 3060

tccaagctga ccgtggacaa aagccgctgg cagcagggca acgtgttctc ttgcagcgtg 3120

atgcacgagg ccctgcataa cagatacacc cagaagagcc tgagcctgag cccaggaaag 3180

catcatcacc atcatcattg a 3201

Claims

1.一种表达人-动物交叉反应性(cross-reactive)靶细胞-效应细胞桥接分子(Bridgebetween target cell and effector cell of both human and animals，crBTEC)的重组基因载体，其特征在于，所述桥接分子包含：与靶细胞作用靶点特异性结合的部分A，和与效应细胞作用靶点特异性结合的部分B；优选的，所述重组基因载体选自非病毒基因载体；更优选的，所述重组基因载体选自微环DNA载体；再优选的，所述桥接分子选自蛋白或多肽；更优选的，所述桥接分子选自双特异性抗体；特别优选的，所述部分A和所述部分B分别选自蛋白分子或多肽分子；最优选的，所述部分A和部分B分别选自Fab、Fab’、单链抗体(scFv)、单域抗体(V_HH)、单链T细胞受体(scTCR)和其它；其中，所述动物选自猴或鼠类；优选的，所述猴选自食蟹猴，鼠类选自大鼠或小鼠。

2.如权利要求1所述的重组基因载体，其特征在于，所述靶细胞选自癌细胞、受感染细胞或其它；所述效应细胞选自T细胞、NK细胞或其它；优选的，所述部分A特异性结合的作用靶点选自：CD19、CD20、EpCAM、EGFR、HER2、VEGFR、PD-1、PD-L1、IL-17R、TNF-αR、病毒抗原或其它；再优选的，所述部分B特异性结合的作用靶点选自：CD3、CD16、CD28、4-1BB、OX40、TCR、CD56、NKG2D、NCR或其它。

3.如权利要求1或2所述的重组基因载体，其特征在于，所述部分A包含：重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1、5或9所示，和轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3、7或11所示；以及，所述部分B包含：重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：13或17所示，和轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO：15或19所示；优选的，所述桥接分子选自人-动物交叉反应性双特异性抗体(crBsAb)。

4.如权利要求1-3中任一项所述的重组基因载体，其特征在于，所述重组基因载体包含：部分A的编码基因，和/或包含部分B的编码基因；优选的，部分A的编码基因包含：重链可变区的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2、6或10所示，和/或轻链可变区的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4、8或12所示；优选的，部分B的编码基因包含：重链可变区的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：14或18所示，和/或轻链可变区的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：16或20所示。

5.如权利要求1-4中任一项所述的重组基因载体，其特征在于，所述重组基因载体包含所述桥接分子的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：21-38中任一项所示。

6.如权利要求1-5中任一项所述的重组基因载体所表达的桥接分子。

7.如权利要求1-5中任一项所述的重组基因载体的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：

(1)从现有技术中分别获取人-猴交叉反应性抗体的重链可变区(VH)序列、轻链可变区(VL)序列；

(2)根据上述VH、VL序列设计成多种组合形式的桥接分子，并构建表达所述桥接分子的重组基因载体；

任选的，(3)在体内外鉴定所述桥接分子的表达水平，并检测表达产物介导效应细胞对靶细胞的杀伤效果；

优选的，所述桥接分子选自双特异性抗体；优选的，所述重组基因载体选自表达双特异性抗体的微环DNA载体(MC.BsAb)；优选的，所述猴选自食蟹猴。

8.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求1-5中任一项所述的重组基因载体，或由权利要求7所述的制备方法所得到的重组基因载体；优选的，所述宿主细胞包括细菌细胞、酵母菌细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

9.一种药物组合物，其特征在于，包含如权利要求1-5中任一项所述的重组基因载体，或如权利要求6所述的桥接分子，或由权利要求7所述的制备方法所得到的重组基因载体，以及药学上可接受的载体。

10.如权利要求1-5中任一项所述的重组基因载体，如权利要求6所述的桥接分子，如权利要求8所述的宿主细胞，或如权利要求9所述的药物组合物在制备用于治疗癌症、感染或其它疾病的药物中的用途。