TWI728309B - 一種結合ｂｃｍａ的嵌合抗原受體（ｃａｒ）及其應用 - Google Patents
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Abstract
本申請涉及一種可以特異性結合BCMA蛋白的嵌合抗原受體(CAR)，其包含BCMA結合結構域、跨膜結構域、共刺激結構域和胞內信號傳導結構域。本申請還提供了該CAR在用於治療與BCMA的表達相關的疾病或病症中的應用。
Description
本申請涉及生物醫藥領域，具體涉及一種能與BCMA蛋白特異性結合的嵌合抗原受體。
B細胞成熟抗原(BCMA)，又名CD269或TNFRSF17，是腫瘤壞死因子受體家族成員。
研究表明，BCMA可以結合B細胞激活因子受體(BAFF)和B細胞增殖誘導配體(APRIL)，促進B細胞在不同發育階段的存活。而異常的信號傳導可促使B細胞異常增殖，導致自身免疫疾病和腫瘤形成(參見Rickert等人，Immunological Reviews，2011，第244卷：115-133)。
嵌合抗原受體(CAR)是被設計為以人白細胞抗原-非依賴性的方式識別細胞表面抗原的抗原受體。利用表達CAR的基因修飾的T細胞(CAR-T)治療這些類型患者的嘗試已經得到一定程度的成功(Molecular Therapy,2010,18：4,666-668；Blood,2008，112：2261-2271)。
鑒於BCMA在B細胞惡性腫瘤，尤其是多發性骨髓瘤中作為治療靶點的有效性，本領域亟待開發新的細胞療法，以藉由作用於BCMA而實現治療目的。
本申請提供了一種可以特異性結合BCMA的嵌合抗原受體及其應用。本申請提供的BCMA嵌合抗原受體具有下列性質中的一種或多種：1)對BCMA蛋白有較高親和力；2)利用該CAR製得的CAR-T細胞可以穩定表達該CAR；3)利用該CAR製得的CAR-T細胞有較高GFP陽性率；4)該CAR可以促進細胞因子的釋放；5)可以用於治療與BCMA的表達相關的疾病或病症。
一方面，本申請包括一種嵌合抗原受體(CAR)，其中該CAR包含BCMA結合結構域、跨膜結構域、共刺激結構域和胞內信號傳導結構域，該BCMA結合結構域包含特異性結合BCMA的抗體或其片段，其中該抗體包含重鏈互補決定區1(HCDR1)，重鏈互補決定區2(HCDR2)和重鏈互補決定區3(HCDR3)，該HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示，該HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：10所示，且該HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：11所示。
在某些實施方式中，該抗體包含輕鏈互補決定區1(LCDR1)，輕鏈互補決定區2(LCDR2)和輕鏈互補決定區3(LCDR3)，該LCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：17所示，該LCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：18所示，且該LCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：19所示。在某些實施方式中，該抗體包含重鏈可變區，該重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示。在某些實施方式中，該抗體包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：15所示。在某些實施方式中，該抗體為單鏈抗體。在某些實施方式中，該抗體包含SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該CAR的跨膜結構域包含源自選自下述蛋白的跨膜結構域：T細胞受體的α，β或ζ鏈、CD28、CD3e、CD45、CD4、CD5、
CD8a、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。在某些實施方式中，所述跨膜結構域包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該CAR的共刺激結構域包含源自下述蛋白的共刺激結構域：CD28、4-1BB、OX-40和ICOS。在某些實施方式中，該共刺激結構域包含SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該CAR的胞內信號傳導結構域包含源自CD3ζ的信號傳導結構域。在某些實施方式中，該胞內信號傳導結構域包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列或。
在某些實施方式中，該CAR還包含鉸鏈區，該鉸鏈區連接該BCMA結合結構域和所述跨膜結構域。在某些實施方式中，該鉸鏈區包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該CAR還連接信號肽。在某些實施方式中，該信號肽包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該CAR還連接剪切肽。在某些實施方式中，該剪切肽包含來自T2A肽的胺基酸序列。在某些實施方式中，該剪切肽包含SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該CAR包含SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列。
另一方面，本申請還包括分離的核酸分子，其編碼本申請所述的CAR。
另一方面，本申請還包括編碼CAR的分離的核酸分子，其包含SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：52所示的核酸序列。
另一方面，本申請還包括一種載體，其包含本申請所述的核酸分子。在某些實施方式中，所述載體選自質粒、逆轉錄病毒載體和慢病毒載體。
另一方面，本申請還包括一種免疫效應細胞，其包含本申請所述的CAR，本申請所述的核酸分子，或本申請所述的載體。在某些實施方式中，所述免疫效應細胞選自T淋巴細胞和自然殺傷(NK)細胞。
另一方面，本申請還包括一種製備免疫效應細胞的方法，其包括向免疫效應細胞中引入本申請所述的載體。
另一方面，本申請還包括一種組合物，其包含本申請所述的免疫效應細胞。
另一方面，本申請還包括該CAR，該核酸分子，該載體，或該免疫效應細胞用於製備藥物的用途，其中該藥物用於治療與BCMA的表達相關的疾病或病症。在某些實施方式中，該與BCMA的表達相關的疾病或病症為癌症或惡性腫瘤。
本領域技術人員能夠從下文的詳細描述中容易地洞察到本申請的其它方面和優勢。下文的詳細描述中僅顯示和描述了本申請的示例性實施方式。如本領域技術人員將認識到的，本申請的內容使得本領域技術人員能夠對所公開的具體實施方式進行改動而不脫離本申請所涉及發明的精神和範圍。相應地，本申請的圖式和說明書中的描述僅僅是示例性的，而非為限制性的。
第1A圖顯示的是本申請所述CAR的結構；第1B圖顯示的是藉由GFP信號評估本申請所述CAR的表達情況。
第2A圖顯示的是使用本申請所述CAR質粒瞬時轉染T細胞過程示意圖；第2B圖顯示的是本申請所述CAR質粒瞬時轉染T細胞後CAR分子的表達情況。
第3圖顯示的是本申請所述CAR質粒瞬時轉染T細胞後CAR分子的表達情況。
第4圖顯示的是本申請所述CAR質粒進行慢病毒包裝後的生物滴度檢測結果。
第5圖顯示的是本申請所述CAR-T細胞的生長情況。
第6圖顯示的是本申請所述CAR-T細胞的CAR分子與BCMA結合能力的檢測結果。
第7圖顯示的是本申請所述CAR-T細胞的CD107a脫粒實驗的流式檢測結果。
第8圖顯示的是本申請所述CAR-T細胞與不同靶細胞孵育後的CD107a脫粒實驗結果。
第9圖顯示的是在BCMA蛋白競爭條件下的本申請所述CAR-T細胞與不同靶細胞孵育後的CD107a脫粒實驗結果。
第10圖顯示的是本申請所述CAR-T細胞和靶細胞共孵育後的細胞因子釋放檢測結果。
第11圖顯示的是本申請所述不同供體的CAR-T細胞功能測定結果。
第12圖顯示的是本申請所述CAR-T細胞對靶細胞的體外殺傷效果。
第13圖顯示的是本申請所述CAR-T細胞的腫瘤殺傷效果的動物模型實驗結果。
以下由特定的具體實施例說明本申請發明的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所公開的內容容易地瞭解本申請發明的其他優點及效果。本申請所述的CAR可特異性結合BCMA，利用該CAR製得的CAR-T細胞可以穩定表達所述CAR，利用該CAR製得的CAR-T細胞有較高的CAR陽性率。此外，該CAR可促進細胞因子的釋放，並可用於治療與BCMA的表達相關的疾病或病症。
除非明確指明相反，否則本申請的實施將採用本領域技術內的常規化學、生物化學、有機化學、分子生物學、微生物學、重組DNA技術、遺傳學、免疫學和細胞生物學的方法。這些方法的描述可以參見，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第3版，2001)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版,1989)；Maniatis等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1982)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley和Sons，2008年7月更新)；Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates和Wiley-Interscience；Glover，DNA Cloning：A Practical Approach,vol.I&II(IRL Press,Oxford,1985)；Anand,Techniques for the Analysis of Complex Genomes，(Academic Press,New York,1992)；Transcription and Translation(B.Hames&S.Higgins,Eds.,1984)；Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；Harlow和Lane,Antibodies，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，
Cold Spring Harbor，N.Y.,1998)Current Protocols in Immunology Q.E.Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach和W.Strober,eds.,1991)；Annual Review of Immunology；以及期刊專著如Advances in Immunology。
除非另有定義，否則本申請中使用的所有技術和科學術語均具有與本領域一般技術人員通常所理解的含義相同的含義。為了本申請的目的，下文定義了以下術語。
在本申請中，術語“嵌合抗原受體”(Chimeric Antigen Receptor，CAR)通常是指包含能夠結合抗原的胞外結構域和至少一個胞內結構域的融合蛋白。CAR是嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)的核心部件，其可包括抗原(例如，腫瘤相關抗原(tumor-associated antigen，TAA))結合區、跨膜結構域、共刺激結構域和胞內信號結構域。在本申請中，該CAR可以基於抗體的抗原(例如BCMA)特異性與T細胞受體活化胞內結構域組合在一起。經遺傳修飾表達CAR的T細胞可以特異地識別和消除表達靶抗原的惡性細胞。關於CAR和CAR T細胞的描述，可以參見例如Sadelain M,Brentjens R,Rivi `ere I.The basicprinciples of chimeric antigen receptor design.Cancer Discov.2013；3(4)：388-398；Turtle CJ,Hudecek M,Jensen MC,Riddell SR.Engineered T cells for anti-cancer therapy.Curr Opin Immunol.2012；24(5)：633-639；Dotti G,Gottschalk S,Savoldo B,Brenner MK.Design and development of therapies using chimeric antigen receptor-expressing T cells.Immunol Rev.2014；257(1)：107-126；以及WO2013154760、WO2016014789。在本申請中，術語“BCMA”和“B-細胞成熟抗原”可互換地使用，通常是指由TNFRSF17基因編碼的蛋白。BCMA蛋白是腫瘤壞死因子受體家族成員。在本申請中，所述BCMA可以為人BCMA，其GenBank
登錄號為BAB60895.1。BCMA是III型跨膜蛋白，在胞外結構域(ECD)中具有TNFR家族成員所特徵性的富半胱胺酸結構域(CRD)，該結構域形成配體結合基序。BCMA作為一種B細胞生物標誌物，在腫瘤細胞(例如多發性骨髓瘤細胞)中表達，或位於腫瘤細胞(例如存在於多發性骨髓瘤惡性漿細胞)的表面。BCMA蛋白也可包括BCMA的片段，諸如胞外結構域及其片段，例如：結合結構域、跨膜結構域、共刺激結構域和胞內信號傳導結構域以及能結合本申請任何抗體的片段。
在本申請中，術語“BCMA結合結構域”通常是指可以與BCMA蛋白特異性結合的結構域。例如，所述BCMA胞外結合結構域可包含能特異性結合B細胞上表達的人BCMA多肽的嵌合抗原受體或其片段，抗BCMA抗體或其抗原結合片段。在本申請中使用的術語“結合結構域”、“胞外結構域”、“胞外結合結構域”、“抗原特異性結合結構域”和“胞外抗原特異性結合結構域”可互換使用，並且提供了具有特異性結合目標靶抗原(例如BCMA)的能力的CAR的結構域或片段。BCMA結合結構域可以為天然來源、合成來源、半合成來源或重組來源。
在本申請中，術語“抗體”通常是指一種能夠特異性識別和/或中和特定抗原的多肽分子。例如，抗體可包含藉由二硫鍵相互連接的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈組成的免疫球蛋白，並且包括任何包含其抗原結合部分的分子。術語“抗體”包括單株抗體、抗體片段或抗體衍生物，包括但不限於人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單域抗體(例如，dAb)，單鏈抗體(例如，scFv)，以及與抗原結合的抗體片段(例如，Fab、Fab’和(Fab)2片段)。術語“抗體”還包括抗體的所有重組體形式，例如在原核細胞中表達的抗體、未糖基化的抗體
以及本申請所述的任何與抗原結合的抗體片段及其衍生物。每條重鏈可由重鏈可變區(VH)和重鏈恒定區構成。每條輕鏈可由輕鏈可變區(VL)和輕鏈恒定區構成。VH和VL區可進一步被區分為稱為互補決定區(CDR)的高變區，它們散佈在稱為構架區(FR)的更保守的區域中。每個VH和VL可由三個CDR和四個FR區構成，它們從胺基端至羧基端可按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體的恒定區可介導該免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合，所述宿主組織或因子包括免疫系統的多種細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一成分(Clq)。
在本申請中，術語“抗原結合分子”通常是指包含能夠與靶抗原結合的抗原結合區或抗原結合部分的分子，例如蛋白質或多肽。在本申請中，當靶抗原是B細胞成熟抗原(BCMA)時，結合BCMA的抗原結合分子也稱作BCMA結合分子。抗原結合分子包括例如抗體及其抗原結合片段、單鏈scFv抗體、基於scFv構建的各種融合物和綴合物，例如scFv-Fc抗體、免疫綴合物、抗體藥物偶聯物(ADC)、多/雙特異性抗體、嵌合抗原受體(CAR)。如本領域技術人員明瞭的，抗體的抗原結合部分通常包含來自“互補決定區”或“CDR”的胺基酸殘基。在一些情況下，根據上下文，“BCMA結合分子”與“本申請抗體”或“抗BCMA抗體”可以互換使用。
在本申請中，術語“單鏈抗體”可以是由該重鏈可變區和該輕鏈可變區藉由連接肽連接而成的抗體。
在本申請中，術語“跨膜結構域”(Transmembrane Domain)通常是指CAR中穿過細胞膜的結構域，其與細胞內信號轉導結構域相連接，起著傳遞信號的作用。
在本申請中，術語“共刺激結構域”通常是指可以提供免疫共刺激分子的胞內結構域，該共刺激分子為淋巴細胞對抗原的有效應答所需要的細胞表面分子。該共刺激結構域可包括CD28的共刺激結構域，還可包括TNF受體家族的共刺激結構域，例如CD28、OX40、4-1BB或ICOS的共刺激結構域。
在本申請中，術語“鉸鏈區”通常是指抗原結合區和免疫細胞Fc受體(FcR)結合區之間的連接區。
在本申請中，術語“HA-標簽”通常是指一種基於人流感病毒血凝素(Human influenza hemagglutinin)抗原的蛋白標簽，其化學本質為一段來自人流感病毒血凝素98-106號胺基酸的短胺基酸序列。使用分子生物學手段將HA-標簽序列接合到目的蛋白的一端後，就可以使用抗HA-標簽的特異性抗體結合該重組蛋白，利於免疫組織化學(IHC)、Western Blotting等實驗的進行(參見Schembri,Laura等人The HA tag is cleaved and loses immunoreactivity during apoptosis.Nature Methods.February 2007,4(2)：107-108)。
在本申請中，術語“胞內信號傳導結構域”通常是指位於細胞內部能夠轉導信號的結構域。在本申請中，該胞內信號傳導結構域可以將信號傳導至細胞內。例如，該胞內信號傳導結構域是該嵌合抗原受體的胞內信號傳導結構域。例如，在某些實施方式中，該胞內信號傳導結構域可選自CD3ζ胞內域，CD28胞內域，4-1BB胞內域和OX40胞內域。
在本申請中，術語“信號肽”(Signal peptide)通常是指引導蛋白質轉移的肽鏈。在某些實施方式中，信號肽可為短肽鏈，其長度可為5-30個胺基酸。
在本申請中，術語“剪切肽”是指能夠實現剪切蛋白的功能的一類多肽。例如，該剪切肽可以經核糖體跳躍而非蛋白酶水解來實現蛋白質剪切。例如，該剪切肽可為剪切2A肽，其可包括T2A，F2A和P2A等。
在本申請中，術語“標記檢測信號”通常是指已知功能或序列的能夠起到特異性標記作用，發出可以被檢測到的信號的基因、蛋白質或其他分子。該標記檢測信號可以為螢光蛋白，如：GFP、RFP和YFP等。所述標記檢測信號可以為EGFRt。
在本申請中，術語“EGFRt”通常是指編碼截短的人表皮生長因子受體多肽的基因。EGFRt缺乏遠端膜EGF結合域和細胞質信號傳導尾，但保留了由抗EGFR抗體是被的細胞外表位。EGFRt可用作具有遺傳修飾細胞功能的非免疫原性選擇工具以及追蹤標記。在本申請中，該EGFRt可作為CAR-T細胞的標記分子。所述EGFRt可以在必要時清除體內的CAR-T細胞西妥昔單抗介導的ADCC途徑(cetuximab mediated ADCC pathway)(參見US8802374B2)。
在本申請中，術語“Kozak序列”通常是指在真核生物的mRNA中共有的(gcc)gccRccAUGG序列，其在翻譯過程的啟動中有重要作用，被核糖體識別為翻譯起始位點(參見De Angioletti M等人a novel silent beta-thalassaemia mutation,the first in the Kozak sequence.Br J Haematol.2004,124(2)：224-31.)。
在本申請中，術語“分離的”通常是指抗體是已經與它的天然環境中的組分分離的抗體。在一些實施方案中，將抗體純化至大於95%或99%純度，
該純度藉由例如電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或色譜(例如，離子交換或反相HPLC)確定。關於評價抗體純度的方法的綜述可參見Flatman，S.等，J.Chrom.B 848(2007)79-87。
在本申請中，術語“核酸分子”通常是指從其天然環境中分離的或人工合成的任何長度的分離形式的核苷酸、脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。本申請所述的核酸分子可以為分離的。例如，其可以是藉由以下方法產生或合成的：(i)在體外擴增的，例如藉由聚合酶鏈式反應(PCR)擴增產生的，(ii)藉由選殖重組產生的，(iii)純化的，例如藉由酶切和凝膠電泳分級分離，或者(iv)合成的，例如藉由化學合成。在某些實施方式中，該分離的核酸是藉由重組DNA技術製備的核酸分子。在本申請中，可以藉由本領域已知的多種方法來製備編碼該抗體或其抗原結合片段的核酸，這些方法包括但不限於，採用限制性片段操作或採用合成性寡核苷酸的重疊延伸PCR，具體操作可參見Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.，1989；和Ausube等人Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York N.Y.,1993。
在本申請中，該“載體”通常是指能夠在合適的宿主中自我複製的核酸分子，用以將插入的核酸分子轉移到宿主細胞中和/或宿主細胞之間。該載體可包括主要用於將DNA或RNA插入細胞中的載體、主要用於複製DNA或RNA的載體，以及主要用於DNA或RNA的轉錄和/或翻譯的表達的載體。該載體還包括具有多種上述功能的載體。該載體可以是當引入合適的宿主細胞時能夠轉錄並翻譯成多肽的多核苷酸。通常，藉由培養包含該載體的合適的宿主細
胞，該載體可以產生期望的表達產物。在本申請中，所述載體中可包含一種或多種所述核酸分子。此外，所述載體中還可包含其他基因，例如允許在適當的宿主細胞中和在適當的條件下選擇該載體的標記基因。此外，該載體還可包含允許編碼區在適當宿主中正確表達的表達控制元件。這樣的控制元件為本領域技術人員所熟知的，例如，可包括啟動子、核糖體結合位點、增強子和調節基因轉錄或mRNA翻譯的其他控制元件等。在某些實施方式中，該表達控制序列為可調的元件。該表達控制序列的具體結構可根據物種或細胞類型的功能而變化，但通常包含分別參與轉錄和翻譯起始的5’非轉錄序列和5’及3’非翻譯序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非轉錄表達控制序列可包含啟動子區，啟動子區可包含用於轉錄控制功能性連接核酸的啟動子序列。本申請所述載體可選自質粒、逆轉錄病毒載體和慢病毒載體。本申請所述質粒、逆轉錄病毒載體和慢病毒載體可包含CAR。
在本申請中，術語“質粒”通常是指細菌、酵母菌等生物中染色體或擬核以外的DNA分子，存在於細胞質中，具有自主複製能力，使其能夠在子代細胞中保持恒定的拷貝數，並表達所攜帶的遺傳信息。質粒在遺傳工程研究中被用作基因的載體。
在本申請中，術語“逆轉錄病毒載體”通常是指可以可控並表達外源基因，但不能自我包裝成有增殖能力的病毒顆粒。此類病毒多具有反轉錄酶。反轉錄病毒至少含有三種基因：gag，包含組成病毒中心和結構的蛋白質的基因；pol，包含反轉錄酶的基因和env，包含組成病毒外殼的基因。藉由逆轉錄病毒轉染，逆轉錄病毒載體可將自身基因組及其攜帶的外源基因隨機、穩定地整合入宿主細胞基因組中，例如，可將CAR分子整合進宿主細胞中。
在本申請中，術語“慢病毒載體”通常是指屬逆轉錄病毒的一種二倍體RNA病毒載體。慢病毒載體是以慢病毒的基因組為基礎，將其中多個和病毒活性相關的序列結構去除，使其具有生物學的安全性，然後再在這個基因組骨架中引入實驗所需要的目標基因的序列和表達結構，並將之製備成載體。藉由慢病毒載體轉染，逆轉錄病毒載體可將自身基因組及其攜帶的外源基因隨機、穩定地整合入宿主細胞基因組中，例如，可將CAR分子整合進宿主細胞中。
在本申請中，術語“轉座子”通常是指含有轉座酶基因的離散DNA片段，側翼是含有轉座酶結合位點的末端反向重複序列(TIR)。轉座酶可與TIR結合並使轉座子轉移到新的位點。本申請所述轉座子是由一個攜帶CAR(轉座子)的質粒和另一個攜帶轉座酶的質粒組成的雙組分系統。所述轉座子可以藉由電轉導等方式導入靶細胞。例如，首先，兩種組分被電穿孔到外周血單核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC)中，表達的轉座酶作用於CAR兩側的末端反向重複序列(terminal inverted repeat，TIR)，切割CAR(轉座子)並隨後整合到靶細胞(例如T細胞)基因組中的TA二核苷酸序列上。轉座和穩定的基因組整合完成後，靶細胞表面就能表達出CAR蛋白(參見Cheng Zhang,Jun Liu,Jiang F Zhong,et al.Engineering CAR-T cells.Biomarker Research.2017，5：22)。
在本申請中，術語“基因編輯”通常是指對基因組進行定點修飾的技術，可包括基於鋅指核酸酶(zinc finger nucleases，ZFNs)、轉錄激活子樣效應因子核酸酶(transcription activator like effector nucleases，TALENs)、規律性重複短回文序列簇(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated(Cas9)，CRISPR/Cas9)等的技術。其可以對基因組進行
高效靶向修飾，藉由在基因組的特定位置添加、去除或改變遺傳物質來進行修飾。本申請所述基因編輯可包括藉由基因編輯的技術(例如CRISPR-Cas9)，將CAR分子導入受體細胞的基因組中。
在本申請中，術語“免疫效應細胞”通常是指在免疫應答中參與清除異物抗原和行使效應功能的免疫細胞。例如漿細胞、細胞毒性T細胞、NK細胞、APSC多能細胞、肥大細胞等。在本申請中，免疫效應細胞可選自T淋巴細胞和自然殺傷(NK)細胞。
在本申請中，術語“藥學上可接受的佐劑”通常是指藥學可接受的製劑載體、溶液或加強製劑特性的添加劑。此類添加劑是所屬領域技術人員熟知的。
在本申請中，術語“癌症”通常是指或描述哺乳動物的生理狀況，其典型特徵在於細胞增殖或存活失調。在本申請中，被稱為癌症的過度增殖性疾病包括但不限於實體瘤，例如發生在乳腺、呼吸道、腦、生殖器官、消化道、尿道、眼、肝臟、皮膚、頭頸、甲狀腺、甲狀旁腺的癌症，以及它們的遠端轉移。這類疾病還包括淋巴瘤、肉瘤和白血病。乳腺癌的實例包括但不限於浸潤性導管癌、浸潤性小葉癌、乳腺導管原位癌和乳腺小葉原位癌。呼吸道癌症的實例包括但不限於小細胞肺癌和非小細胞肺癌，以及支氣管腺瘤和胸膜肺母細胞瘤。腦癌的實例包括但不限於腦乾和下丘腦角質瘤、小腦和大腦星狀細胞瘤、髓母細胞瘤、室管膜瘤，以及神經外胚層和松果體腫瘤。男性生殖器腫瘤包括但不限於前列腺和睾丸癌。女性生殖器腫瘤包括但不限於子宮內膜癌、宮頸癌、卵巢癌、陰道癌和外陰癌，以及子宮瘤。消化道腫瘤包括但不限於肛門、結腸、結腸直腸、食管、膽囊、胃、胰腺、直腸、小腸和唾液腺癌。尿道腫瘤包括但
不限於膀胱、陰莖、腎、腎盂、輸尿管和尿道癌。眼癌包括但不限於眼球內黑素瘤和視網膜母細胞瘤。肝癌的實例包括但不限於肝細胞癌(有或沒有纖維板層變異的肝細胞瘤)、膽管癌(肝內膽管癌)和混合型肝細胞膽管細胞癌。皮膚癌包括但不限於鱗狀細胞癌、卡波西(Kaposi’s)肉瘤、惡性黑素瘤、Merkel細胞皮膚癌和非黑素瘤型皮膚癌。頭頸癌包括但不限於喉/下嚥/鼻咽/口咽癌，和嘴唇和口腔癌。淋巴癌包括但不限於AIDS相關的淋巴癌、非霍奇金淋巴癌、皮膚T細胞淋巴癌、霍奇金氏病，以及中樞神經系統淋巴癌。肉瘤包括但不限於軟組織肉瘤、骨肉瘤、惡性纖維組織細胞瘤、淋巴肉瘤和橫紋肌肉瘤。白血病包括但不限於急性髓樣白血病、急性淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病、慢性粒細胞白血病和毛細胞白血病。
術語“和/或”應理解為意指可選項中的任一項或可選項的兩項。
如本申請中所用，術語“包含”或“包括”意指包括所述的要素、整數或步驟，但是不排除任意其他要素、整數或步驟。在本申請中，當使用術語“包含”或“包括”時，除非另有指明，否則也涵蓋由所述及的要素、整數或步驟組成的情形。例如，當提及“包含”某個具體序列的抗體可變區時，也旨在涵蓋由該具體序列組成的抗體可變區。
在本申請中，術語“約”通常是指在指定數值以上或以下0.5%-10%的範圍內變動，例如在指定數值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%的範圍內變動。
嵌合抗原受體
在本申請中，嵌合抗原受體(CAR)可包含BCMA的胞外結構域、跨膜結構域、共刺激結構域和胞內信號傳導結構域。在本申請中，該CAR的胞外結構域可以包含本申請所述的單鏈抗體(scFv)。例如，該單鏈抗體可以藉由鉸鏈區，例如CD8鉸鏈，與跨膜結構域連接。在本申請中，該CAR可以用於轉導免疫效應細胞(例如T細胞)並在細胞表面表達。由此本申請也可提供表達該嵌合抗原受體的T細胞，以及該T細胞和/或該CAR用於製備治療B細胞相關疾病的藥物中的用途。
在本申請中，該嵌合抗原受體(CAR)可包含BCMA結合結構域、跨膜結構域、共刺激結構域和胞內信號傳導結構域。
在本申請中，該BCMA結合結構域可包含特異性結合BCMA的抗體片段，該抗體可包含重鏈互補決定區1(HCDR1)，重鏈互補決定區2(HCDR2)和重鏈互補決定區3(HCDR3)，該HCDR1-3可以依次分別包含SEQ ID NO：9-11所示的胺基酸序列；該抗體可包含輕鏈互補決定區1(LCDR1)，輕鏈互補決定區2(LCDR2)和輕鏈互補決定區3(LCDR3)，該LCDR1-3可以依次分別包含SEQ ID NO：17-19所示的胺基酸序列。在本申請中，該抗體可包含重鏈可變區，該重鏈可變區可包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列。在本申請中，該抗體可包含輕鏈可變區，該輕鏈可變區可包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗體可為單鏈抗體。在某些實施方式中，該抗體可包含SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列。例如，本申請所述抗體或其抗原結合片段可包括抗體scFv0032，其序列如SEQ ID No：43所示。
例如，本申請所述單鏈抗體可以為scFv0032，其序列如SEQ ID NO：43所示。單鏈抗體scFv0032的LCDR1-3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所示；VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：15所示；HCDR1-3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示；VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
本申請所述CAR可包括跨膜結構域，該跨膜結構域可包含來自選自下述蛋白的跨膜結構域：T細胞受體的α，β或ζ鏈，CD28、CD3e、CD45、CD4、CD5、CD8a、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。在本申請中，所述跨膜結構域可包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列或其功能性變體。例如，本申請的跨膜結構域可包括CD8a，其序列如SEQ ID NO：27所示。
本申請所述CAR可包括共刺激結構域，該共刺激結構域可包含來自選自下述蛋白的多肽：CD28、4-1BB、OX-40和ICOS。在本申請中，該共刺激結構域可包含SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列。
本申請所述CAR可包括胞內信號傳導結構域，該胞內信號傳導結構域可包含來自CD3ζ的信號傳導結構域。在本申請中，該胞內信號傳導結構域可包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列。
本申請所述CAR可包括鉸鏈區，該鉸鏈區可連接該抗體和該跨膜結構域。在本申請中，該鉸鏈區可包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列。
本申請所述CAR還可包括HA-標簽，該HA-標簽可位於所述CAR的N端。在本申請中，該HA-標簽可包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列。
在本申請中，可以藉由運用抗HA抗體與其特異性結合來檢測本申請所述CAR的表達並用於富集CAR-T細胞以進行功能性研究。
本申請所述CAR可連接信號肽，該信號肽可包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列。例如，該信號肽可為CD8a信號肽，其序列如SEQ ID NO：3所示。例如，CAR0043、CAR0097、CAR0099可連接該CD8a信號肽。
在本申請中，該CAR還可連接剪切肽。在本申請中，該剪切肽可包含來自T2A肽的胺基酸序列。在本申請中，該剪切肽可包含SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列或其功能性變體。例如，該剪切肽可為T2A，其序列如SEQ ID NO：35所示。例如，CAR0043、CAR0099可連接所述剪切肽T2A。
在本申請中，該CAR還可連接標記檢測信號，該標記檢測信號可位於所述CAR的C端。在本申請中，該標記檢測信號可為螢光蛋白，其可選自以下組：GFP、RFP和YFP。在本申請中，可以藉由檢測GFP的信號來間接評估CAR分子的表達情況。例如，該CAR可包括CAR0043，其標記檢測信號序列如SEQ ID NO：37所示。在本申請中，該標記檢測信號可為EGFRt。例如，CAR0099可連接序列如SEQ ID NO：39所示的標記檢測信號。
在本申請中，該CAR可連接Kozak序列，其序列如SEQ ID NO：1所示。在本申請中，該CAR可連接Kozak序列，該Kozak序列可位於所述CAR的N端。例如，CAR0043、CAR0097或CAR0099可連接序列如SEQ ID NO：1所示的Kozak序列。
在本申請中，該CAR可包含SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列或其功能性變體。例如，該CAR可選自CAR0043，其序列如SEQ
ID NO：49所示。又例如，該CAR可選自CAR0097，其序列如SEQ ID NO：51所示；所述CAR可選自CAR0099，其序列如SEQ ID NO：51所示。
在某些實施方式中，本申請所述CAR可包括BCMA結合結構域、跨膜結構域、共刺激結構域和胞內信號傳導結構域。其中，該CAR可包括BCMA結合結構域，該BCMA結合結構域序列如SEQ ID NO：43所示。其中，該BCMA結合結構域可包括HCDR1-3，其序列分別依次如SEQ ID NO：9-11所示；該BCMA結合結構域可包括LCDR1-3，其序列分別依次如SEQ ID NO：17-19所示；並且，該BCMA結合域可包括重鏈可變區，其序列如SEQ ID NO：7所示；該BCMA結合域還可包括輕鏈可變區，其序列如SEQ ID NO：15所示。例如，該CAR可包括CAR0043、CAR0097、CAR0099或與其具有相同的輕鏈可變區和重鏈可變區的本申請所述的CAR。所述輕鏈可變區和重鏈可變區之間還可包括連接肽，其序列如SEQ ID NO：23所示。例如，該CAR可包括CAR0043、CAR0097、CAR0099或與其具有相同的連接肽的本申請所述的CAR。
該跨膜結構域的可包含的跨膜結構域，該跨膜結構域包含來自選自下述蛋白的多肽：T細胞受體的α，β或ζ鏈、CD28、CD3e、CD45、CD4、CD5、CD8a、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154，該跨膜結構域的序列可以如SEQ ID NO：27所示。例如，該跨膜結構域可為CD8a，該CAR可包括CAR0043、CAR0097、CAR0099或與其具有相同的跨膜結構域的本申請所述的CAR。
該跨膜結構域可包含來自CD28、4-1BB、OX-40或ICOS的共刺激結構域，其序列分別如SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：31所示。例如，該共刺激結構域可為CD28，該CAR可包括CAR0043或與其具有相同的共刺激結構域
的本申請所述的CAR，其中該共刺激結構域的序列如SEQ ID NO：29所示。又例如，該共刺激結構域可為4-1BB，該CAR可包括CAR0097、CAR0099或與其具有相同的共刺激結構域的CAR，其中該共刺激結構域的序列如SEQ ID NO：31所示。
該CAR的胞內信號傳導結構域可包含來自CD3ζ的信號傳導結構域，其序列如SEQ ID NO：37所示。例如，CAR0043、CAR0097、CAR0099或與其具有相同的胞內信號轉導結構域的本申請所述的CAR。
該CAR還可包含鉸鏈區，該鉸鏈區連接該BCMA結合結構域的C端且位於該跨膜結構域的N端，其序列如SEQ ID NO：25所示。例如，該CAR可包括CAR0043、CAR0097、CAR0099或與其具有相同的鉸鏈區的本申請所述的CAR。
該CAR還可包含HA-標簽，該HA-標簽可位於該BCMA結合結構域的N端，其序列如SEQ ID NO：5所示。例如，該CAR可包括CAR0043或與其具有相同的信號肽的本申請所述的CAR。
該CAR還可連接信號肽，其可位於CAR的N端，其序列如SEQ ID NO：3所示。例如，該CAR可包括CAR0043、CAR0097、CAR0099或與其具有相同的信號肽的CAR。
該CAR可連接剪切肽，例如：T2A，該剪切肽可位於所述胞內信號轉導域的C端其序列如SEQ ID NO：35所示。例如，CAR0043、CAR0099可連接該剪切肽。
該CAR還可連接標記檢測信號，該CAR的C端，該標記檢測信號可選自以下組：GFP、RFP和YFP，其序列如SEQ ID NO：37所示。例如，該
標記檢測信號可為GFP，所述CAR可包括CAR0043或與其具有相同的標記檢測信號的本申請所述的CAR。該標記檢測信號也可為EGFRt標記檢測信號，其序列如SEQ ID NO：39所示。例如，CAR0099可連接該標記檢測信號。
例如，該CAR可包括CAR0043、CAR0097、CAR0099或與其具有相同的輕鏈可變區及重鏈可變區的本申請所述的CAR。
例如，本申請所述的CAR可以為CAR0043，其LCDR1-3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所示；VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：15所示；HCDR1-3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示；VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示；VH與VL之間的連接肽的序列如SEQ ID NO：23所示；其鉸鏈區如SEQ ID NO：25所示；其跨膜結構域如SEQ ID NO：27所示；其共刺激結構域為CD28共刺激結構域，如SEQ ID NO：29所示；其CD3ζ胞內信號傳導結構域如SEQ ID NO：33所示；該CAR0043還可包含如SEQ ID NO：35所示的剪切肽，以及如SEQ ID NO：37所示的GFP標記檢測信號；該CAR0043還可包含如SEQ ID NO：1所示的KOZAK序列，如SEQ ID NO：3所示的CD8a信號肽，如SEQ ID NO：5所示的HA-標簽。
例如，本申請所述的CAR可以為CAR0097，其LCDR1-3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所示；VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：15所示；HCDR1-3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示；VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示；VH與VL之間的連接肽的序列如SEQ ID NO：23所示；其鉸鏈區如SEQ ID NO：25所示；其跨膜結構域如SEQ ID NO：27所示；其共刺激結構域為4-1BB共刺
激結構域，如SEQ ID NO：31所示；其CD3ζ胞內信號傳導結構域如SEQ ID NO：33所示；該CAR0097還可包含如SEQ ID NO：1所示的KOZAK序列，如SEQ ID NO：3所示的CD8a信號肽。
例如，本申請所述的CAR可以為CAR0099，其LCDR1-3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所示；VL的胺基酸序列如SEQ ID NO：15所示；HCDR1-3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示；VH的胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示；VH與VL之間的連接肽的序列如SEQ ID NO：23所示；其鉸鏈區如SEQ ID NO：25所示；其跨膜結構域如SEQ ID NO：27所示；其共刺激結構域為4-1BB共刺激結構域，如SEQ ID NO：31所示；其CD3ζ胞內信號傳導結構域如SEQ ID NO：33所示；該CAR0099還可包含如SEQ ID NO：35所示的剪切肽，以及如SEQ ID NO：39所示的EGFRt標記檢測信號；該CAR0099還可包含如SEQ ID NO：1所示的KOZAK序列，如SEQ ID NO：3所示的CD8a信號肽。
在本申請中涉及的蛋白質、多肽和/或胺基酸序列，還應理解為至少包含以下的範圍：與該該蛋白質或多肽具備相同或類似功能的功能性變體或同源物。
在本申請中，該功能性變體可以為，在該蛋白質和/或所述多肽(例如，特異性結合BCMA的抗體或其片段)的胺基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或多個胺基酸的蛋白質或多肽。例如，該功能性變體可包含已經藉由至少1個，例如1-30個、1-20個或1-10個，又例如1個、2個、3個、4個或5個胺基酸取代、缺失和/或插入而具有胺基酸改變的蛋白質或多肽。該功能性變體可基本上保持改變(例如取代、缺失或添加)之前的該蛋白質或該多肽的生物
學特性。例如，該功能性變體可保持改變之前的該蛋白質或該多肽的至少60%，70%，80%，90%，或100%的生物學活性(例如抗原結合能力)。例如，該取代可以為保守取代。
在本申請中，該同源物可以為，與該蛋白質和/或該多肽(例如，特異性結合BCMA的抗體或其片段)的胺基酸序列具有至少約85%(例如，具有至少約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或更高的)序列同源性的蛋白質或多肽。
在本申請中，該同源性通常是指兩個或多個序列之間的相似性、類似或關聯。可以藉由以下方式計算“序列同源性百分比”：將兩條待比對的序列在比較窗中進行比較，確定兩條序列中存在相同核酸鹼基(例如，A、T、C、G、I)或相同胺基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的數目以得到匹配位置的數目，將匹配位置的數目除以比較窗中的總位置數(即，窗大小)，並且將結果乘以100，以產生序列同源性百分比。為了確定序列同源性百分數而進行的比對，可以按本領域已知的多種方式實現，例如，使用可公開獲得的計算機軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技術人員可以確定用於比對序列的適宜參數，包括為實現正在比較的全長序列範圍內或目標序列區域內最大比對所需要的任何算法。所述同源性也可以藉由以下的方法測定：FASTA和BLAST。對FASTA算法的描述可以參見W．R．Pearson和D．J．Lipman的“用於生物學序列比較的改進的工具”，美國國家科學院院刊(Proc．Natl．Acad．Sci．)，85：2444-2448，1988；和D．J．Lipman和W．R．Pearson的“快速靈敏的蛋白質相似性搜索”，Science，227：
1435-1441，1989。對BLAST算法的描述可參見S．Altschul、W．Gish、W．Miller、E．W．Myers和D．Lipman的“一種基本的局部對比(alignment)搜索工具”，分子生物學雜誌，215：403-410，1990。
核酸、載體、細胞、製備方法和組合物
另一方面，本申請提供了一種分離的核酸分子，其可編碼本申請所述的CAR。本申請所述編碼CAR的分離的核酸分子，其可包含SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：52所示的核酸序列或其功能性變體。本申請所述的核酸分子可以為分離的。例如，其可以是藉由以下方法產生或合成的：(i)在體外擴增的，例如藉由聚合酶鏈式反應(PCR)擴增產生的，(ii)藉由選殖重組產生的，(iii)純化的，例如藉由酶切和凝膠電泳分級分離，或者(iv)合成的，例如藉由化學合成。在某些實施方式中，該分離的核酸是藉由重組DNA技術製備的核酸分子。
另一方面，本申請提供了一種載體，其可包含所述的核酸分子。在本申請中，該載體可選自質粒、逆轉錄病毒載體和慢病毒載體中的一種或多種。本申請所述慢病毒載體可包含CAR。例如，本申請所述慢病毒載體可包含SEQ ID NO：50和/或SEQ ID NO：52所示的核酸序列或其功能性變體。此外，該載體中還可包含其他基因，例如允許在適當的宿主細胞中和在適當的條件下選擇該載體的標記基因。此外，該載體還可包含允許編碼區在適當宿主中正確表達的表達控制元件。這樣的控制元件為本領域技術人員所熟知的，例如，可包括啟動子、核糖體結合位點、增強子和調節基因轉錄或mRNA翻譯的其他控制元件等。在某些實施方式中，該表達控制序列為可調的元件。該表達控制序列的具體結構可根據物種或細胞類型的功能而變化，但通常包含分別參與轉錄和翻譯起始的5’非轉錄序列和5’及3’非翻譯序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT
序列等。例如，5’非轉錄表達控制序列可包含啟動子區，啟動子區可包含用於轉錄控制功能性連接核酸的啟動子序列。本申請所述的一種或多種核酸分子可以與所述表達控制元件可操作地連接。該載體可以包括，例如質粒、粘粒、病毒、噬菌體或者在例如遺傳工程中通常使用的其他載體。例如，該載體為表達載體，包括載體scFv質粒和/或CAR質粒。
在某些實施方式中，該病毒包含的載體可為慢病毒載體，其可包含載體scFv質粒和/或CAR質粒。例如，該病毒可為慢病毒LV0002，其可包含載體scFv質粒PXL0008其可包含核酸scFv0008分子，和/或CAR質粒PXL0009，其可包含核酸CAR0009分子。例如，該病毒可為慢病毒LV0011，其可包含載體scFv質粒PXL0008，其可包含核酸scFv0008分子，和/或CAR質粒PXL0041，其可包含核酸CAR0041分子。例如，該病毒可為慢病毒LV0013，其可包含載體scFv質粒PXL0032，其可包含核酸scFv0032，和/或CAR質粒PXL0043，其可包含核酸CAR0043。例如，該病毒可為慢病毒LV0022，其可包含載體scFv質粒PXL0032，其可包含核酸scFv0032，和/或CAR質粒PXL0097，其可包括核酸CAR0097。例如，該病毒可為慢病毒LV0023，其可包含載體scFv質粒PXL0032，其可包含核酸scFv0032，和/或CAR質粒PXL0099，其可包含核酸CAR0099。在某些實施方式中，該病毒包含的載體還可包括逆轉錄病毒載體，其可包含該scFv質粒和/或CAR質粒。在某些實施方式中，該病毒包含的載體還可包括逆轉錄病毒載體，其可包括該scFv質粒和/或CAR質粒。
在本申請中，該T淋巴細胞可包括胸腺細胞、天然T淋巴細胞、未成熟T淋巴細胞、成熟T淋巴細胞、靜息T淋巴細胞或活化的T淋巴細胞。該T細胞可以是輔助T細胞(Th)，例如輔助T細胞1(Th1)或輔助T細胞2
(Th2)細胞。該T淋巴細胞可以是CD4+輔助T細胞(HTL；CD4+T細胞)、細胞毒性T細胞(CTL；CD8+ T細胞)、腫瘤浸潤細胞毒性T細胞(TIL；CD8+T細胞)、CD4+/CD8+T細胞、CD4-/CD8-T細胞或任何其他T淋巴細胞亞型。在某些實施方式中，該T淋巴細胞可為初始T細胞(TN細胞)。在某些實施方式中，該T淋巴細胞可為中央記憶T細胞(TCM)。在某些實施方式中，該T淋巴細胞可為效應T細胞(TEM細胞)。在某些實施方式中，該T淋巴細胞可為NKT細胞。在本申請中，該T淋巴細胞可來自外周血細胞、臍帶血細胞和/或白細胞。
在本申請中，該T淋巴細胞可以為TCM細胞，其可帶有CD45RO+/CD62L+的特徵。該T淋巴細胞可以為TEM細胞，其可帶有CD45RO+/CD62L-的特徵。該T淋巴細胞可以為TN細胞，其可帶有CD45RO-/CD62L+的特徵。該T淋巴細胞可以為NKT細胞，其可分為NK1.1+以及NK1.1-、CD4+、CD4-、CD8+以及CD8-。活化後，NKT細胞可以產生大量的干擾素-γ、IL-4(白細胞介素4)，以及粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)。此外，NKT細胞還可以產生一些細胞因子和趨化因子(如IL-2、IL-13、IL-17、IL-21、腫瘤壞死因子-α)。另一方面，本申請提供給了一種免疫效應細胞，其可包含本申請所述的CAR，所述的核酸分子，或所述的載體。在本申請中，該免疫效應細胞可為哺乳動物細胞。在本申請中，免疫效應細胞可選自T淋巴細胞和自然殺傷(NK)細胞。
另一方面，本申請提供了一種製備免疫效應細胞的方法，其可包括向免疫效應細胞中引入本申請所述的載體。例如，可將本申請所述的載體引入所述免疫效應細胞中，例如T淋巴細胞或自然殺傷(NK)細胞。在某些實施方式中，每種或每個細胞可包含一個或一種本申請所述的載體。在某些實施方
式中，每種或每個細胞可包含多個(例如，2個或以上)或多種(例如，2種或以上)本申請所述的載體。例如，可將本申請所述的載體引入所述細胞中。例如，可以藉由逆轉錄病毒載體進行轉染免疫效應細胞，將帶有CAR分子的病毒基因組能整合到宿主基因組，保證目的基因長期、穩定地表達。又例如，利用轉座子，藉由攜帶CAR(轉座子)的質粒和攜帶轉座酶的質粒導入到靶細胞中。又例如，可以藉由基因編輯的方式(例如CRISPR/Cas9)將CAR分子添加進基因組中。在本申請中，可藉由本領域已知的方法將本申請所述的帶有CAR分子的載體引入該細胞中，例如電穿孔、脂質體法轉染(lipofectamine 2000，Invitrogen)等。
另一方面，本申請提供了一種組合物，其可包含該免疫效應細胞和藥學上可接受的佐劑。
該藥學上可接受的佐劑可以包括緩衝劑、抗氧化劑、防腐劑、低分子量多肽、蛋白質、親水聚合物、胺基酸、糖、螯合劑、反離子、金屬複合物和/或非離子表面活性劑等。
在本申請中，該藥物組合物可被配製用於口服給藥，靜脈內給藥(例如，靜脈注射，I.V.)，肌肉內給藥(例如，肌肉注射，I.M.)，在腫瘤部位的原位給藥，吸入，直腸給藥，陰道給藥，經皮給藥或藉由皮下儲存庫給藥。
本申請所述的組合物可以包含治療有效量的所述抗體或其抗原結合片段。該治療有效量是能夠預防和/或治療(至少部分治療)患有或具有發展風險的受試者中的病症或病症(例如癌症)和/或其任何併發症而所需的劑量。
製藥用途
另一方面，本申請提供了該CAR，該核酸分子，該載體，或該免疫效應細胞用於製備藥物的用途，其中該藥物用於治療與BCMA的表達相關的疾病或病症。在本申請中，該與BCMA的表達相關的疾病或病症可為癌症或惡性腫瘤。在某些實施方式中，該癌症或惡性腫瘤可選自漿細胞惡性腫瘤疾病，例如多發性骨髓瘤，還可選自B細胞惡性疾病，例如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。
另一方面，本申請提供了該CAR，該核酸分子，該載體，或該免疫效應細胞，其治療與BCMA的表達相關的疾病或病症。
另一方面，本申請提供了一種治療與BCMA的表達相關的疾病或病症，包括向患者施用該CAR，該核酸分子，該載體，或該免疫效應細胞。
不欲被任何理論所限，下文中的實施例僅僅是為了闡釋本申請的裝置、方法和系統的工作方式，而不用於限制本申請發明的範圍。
實施例1 重組慢病毒載體的構建
首先，人工合成以下序列：KOZAK(其核苷酸序列為SEQ ID NO：2)、CD8a信號肽(其核苷酸序列為SEQ ID NO：4)、HA-標簽(其核苷酸序列為SEQ ID NO：6)、scFv0032(其核苷酸序列為SEQ ID NO：44)、鉸鏈區(其核苷酸序列為SEQ ID NO：26)、跨膜區(其核苷酸序列為SEQ ID NO：28)、CD28共刺激結構域(其核苷酸序列為SEQ ID NO：30)、CD3ζ胞內信號傳導結構域(其核苷酸序列為SEQ ID NO：34)、T2A剪切肽(其核苷酸序列為SEQ ID NO：36)、GFP(其核苷酸序列為SEQ ID NO：38)、EGFRt(其核苷酸序列為SEQ ID NO：40)。
同時，構建scFv0008分子作為對照，scFv0008分子的胺基酸序列如SEQ ID NO：41所示(參見US9034324,SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)。
其中HA-標簽位於CAR分子的N端，其與CD8a信號肽直接相連。當CAR分子在細胞表面表達時，HA-tag可以作為標簽，用於檢測CAR分子或者富集CAR-T細胞。此外，GFP位於CAR分子的最C端，其與T2A剪切肽直接相連。T2A剪切後會形成等量的CAR分子和GFP蛋白(參見Szymczak等人correction of multi-gene deficiency in vivo using a single self-cleaving 2A peptide-based retroviral vector.nature biotechnology,2004.22：p.589)。因此，可以藉由檢測GFP的信號來間接評估CAR分子的表達情況(如第1B圖所示)。第1B圖具體展示了其檢測過程為：慢病毒顆粒(1)藉由細胞膜融合(2)進入細胞，然後除包裝(3)，隨後進行逆轉錄(4)，隨後進行整合(5)並轉錄(6)、翻譯(7)，並由T2A剪切肽進行剪切(8)。其轉導效率可由GFP的表達來評估(9)，scFv和BCMA蛋白的結合效率可藉由BCMA-Fc來研究(10)，抗HA抗體可用來檢測CAR的表達並用於富集CAR-T細胞以進行功能性分析(11)。
除檢測GFP蛋白外，CAR分子的表達還可以藉由其他方法進行。例如，可以用適量的生物素化的(biotinylated)BCMA和PE鏈黴素(streptavidin)標記CAR分子，然後藉由PE信號來反映CAR分子的表達。又例如，可以藉由適量的生物素化的抗HA單株抗體(biotinylated anti-HA mAb)和PE鏈黴素(streptavidin)標記CAR分子用於檢測。
在本申請中，所用包含scFv分子的質粒、包含CAR分子的質粒與其對應的慢病毒如表1所示：
製備以下CAR質粒(參見第1A圖)：將慢病毒載體PLVX-EF1 alpha-IRES-Puro用NotI和MluI進行雙酶切，回收載體片段。對候選scFv質粒PXL0032(其核苷酸序列為SEQ ID NO：44)進行PCR擴增，並用延伸PCR在5’端依次帶上NotI酶切位點(含保護鹼基)、CD8a信號肽、HA-標簽；鉸鏈區、跨膜區、CD28共刺激因子、CD3ζ胞內信號傳導結構域基因合成，PCR擴增；T2A剪切肽和eGFP從質粒pMy-BirA-T2A-eGFP PCR擴增出，3’端帶上MluI酶切位點及保護鹼基；然後用overlap PCR得到5’端帶NotI酶切位點3’端帶有MluI位點的PCR片段，對該片段進行NotI及MluI雙酶切，並回收。T4連接構建得到編號為PXL0043的CAR質粒(CAR0043的核苷酸序列如SEQ ID NO：50所示)。
用類似的方法獲得編號為PXL0097的CAR質粒，將慢病毒載體PLVX-EF1 alpha-IRES-Puro用NotI和MluI進行雙酶切，回收載體片段。對候選scFv質粒PXL0032進行PCR擴增，並用延伸PCR在5’端依次帶上NotI酶切位點(含保護鹼基)、CD8a信號肽、鉸鏈區、跨膜區、4-1BB共刺激因子(其核
苷酸序列為SEQ ID NO：32)、CD3ζ胞內信號傳導結構域基因合成，PCR擴增；然後用overlap PCR得到5’端帶NotI酶切位點3’端帶有MluI位點的PCR片段，對該片段進行NotI及MluI雙酶切，並回收。T4連接構建得到編號為PXL0097的CAR質粒(CAR0097的CAR分子部分的核苷酸序列如SEQ ID NO：52所示)。
用類似的方法獲得編號為PXL0099的CAR質粒，將慢病毒載體PLVX-EF1 alpha-IRES-Puro用NotI和MluI進行雙酶切，回收載體片段。對候選scFv質粒PXL0032進行PCR擴增，並用延伸PCR在5’端依次帶上NotI酶切位點(含保護鹼基)、CD8a信號肽；鉸鏈區、跨膜區、4-1BB共刺激因子(其核苷酸序列為SEQ ID NO：32)、CD3ζ胞內信號傳導結構域、T2A剪切肽、EGFRt(其核苷酸序列為SEQ ID NO：40)基因合成，PCR擴增；然後用overlap PCR得到5’端帶NotI酶切位點3’端帶有MluI位點的PCR片段，對該片段進行NotI及MluI雙酶切，並回收。T4連接構建得到編號為PXL0099的CAR質粒(CAR0099的CAR分子部分的核苷酸序列如SEQ ID NO：52所示)。
同時構建包含scFv質粒PXL0008的CAR質粒作為對照：然後用相同方法獲得編號為PXL0041的CAR質粒(CAR0041的CAR分子部分的核苷酸序列如SEQ ID NO：48所示)。將慢病毒載體PLVX-EF1 alpha-IRES-Puro用NotI和MluI進行雙酶切，回收載體片段。對候選scFv質粒PXL0008(其核苷酸序列為SEQ ID NO：42)進行PCR擴增，並用延伸PCR在5’端依次帶上NotI酶切位點(含保護鹼基)、CD8a信號肽、HA-標簽、鉸鏈區、跨膜區、CD28共刺激因子、CD3ζ胞內信號傳導結構域基因合成，PCR擴增；T2A剪切肽和GFP從質粒pMy-BirA-T2A-eGFP PCR擴增出，3’端帶上MluI酶切位點及保護鹼基；然後用overlap PCR得到5’端帶NotI酶切位點3’
端帶有MluI位點的PCR片段，對該片段進行NotI及MluI雙酶切，並回收。T4連接構建得到編號為PXL0041的CAR質粒(CAR0041的CAR分子部分的核苷酸序列如SEQ ID NO：48所示)。
用類似的方法獲得編號為PXL0009的CAR質粒，將慢病毒載體PLVX-EF1 alpha-IRES-Puro用NotI和MluI進行雙酶切，回收載體片段。對候選scFv質粒PXL0008進行PCR擴增，並用延伸PCR在5’端依次帶上NotI酶切位點(含保護鹼基)、CD8a信號肽；鉸鏈區、跨膜區、CD28共刺激因子、CD3ζ胞內信號傳導結構域基因合成，PCR擴增；然後用overlap PCR得到5’端帶NotI酶切位點3’端帶有MluI位點的PCR片段，對該片段進行NotI及MluI雙酶切，並回收。T4連接構建得到編號為PXL0009的CAR質粒(CAR0009的CAR分子部分的核苷酸序列如SEQ ID NO：46所示)。
實施例2 瞬時轉染的293T細胞樣品上CAR分子的表達
如第2A圖所示，使用PEI作為轉染試劑，瞬時轉染實施例1製備的PXL0009、PXL0041和PXL0043的CAR質粒至293T細胞中，分別得到PXL0009-293T細胞、PXL0041-293T細胞和PXL0043-293T細胞。瞬時轉染72小時後的PXL0009-293T細胞、PXL0041-293T細胞和PXL0043-293T細胞用於評價候選CAR分子的表達能力。在第2A圖中，1表示質粒和轉染試劑，2表示瞬時轉染，3表示表達和T2A剪切肽剪切。
利用實施例1中所述方法檢測CAR分子的表達。具體來說：在過量且固定濃度的PE鏈黴素(PE streptavidin)存在情況下，藉由蛋白濃度梯度稀釋來改變生物素化的BCMA(biotinylated BCMA)的用量，可以得到如第2B圖所示的PE信號的變化。其中，X軸為細胞中表達的GFP蛋白信號，Y軸為使
用梯度稀釋的生物素化的BCMA(biotinylated BCMA)和固定量的PE鏈黴素(PE-streptavidin)標記CAR分子所得的PE信號。
使用梯度稀釋的生物素化的BCMA(biotinylated BCMA)蛋白(295.86nM~3.79pM)檢測候選CAR質粒瞬時轉染的293T細胞所得PE信號變化曲線(如第3圖所示)。從曲線擬合計算出BCMA蛋白與細胞表面CAR分子結合的EC50值如表2所示。
類似的，瞬時轉染72小時後的293T細胞樣品，使用生物素化的抗HA單株抗體(biotinylated anti-HA mAb)和PE鏈黴素(PE streptavidin)標記CAR分子，用流式檢測獲得的GFP陽性率(GFP%)、CAR陽性率(CAR%)、以及二者的比值，結果如表3所示。
由實施例1可知PXL0009為參比質粒，其中所包含的CAR0009分子不包含編碼GFP和HA-標簽的序列。因此，在細胞樣品中應該無法檢測到PXL0009質粒的GFP信號，也沒有CAR與生物素化的抗HA單株抗體(biotinylated anti-HA mAb)結合的PE信號。因此，PXL0009-293T細胞樣品可以用作流式檢測的陰性對照。與PXL0009不同，作為參比質粒的PXL0041和PXL0043編碼GFP蛋白和HA標簽，因此，可以在PXL0041-293T細胞樣品中檢測到GFP信號，也可以分別檢測到CAR與生物素化的BCMA(biotinylated BCMA)蛋白或者與生物素化的抗HA單株抗體(biotinylated anti-HA mAb)的結合(PE信號)，可以用作流式檢測的陽性對照。
結果顯示，在PXL0043-293T細胞樣品中可以檢測到GFP信號，也可以檢測到CAR與生物素化的抗HA單株抗體(biotinylated anti-HAmAb)的結合(PE信號)，這說明PXL0043質粒編碼的CAR分子可以在細胞上表達。
實施例3 慢病毒轉導的293T細胞樣品上CAR分子的表達3.1 慢病毒的包裝
實施例1製備的編號為PXL0009、PXL0041和PXL0043的CAR質粒需要利用穿梭質粒和其他包裝質粒同時共轉染293T細胞，在細胞中進行慢病毒的包裝。具體步驟如下：以在10釐米的培養皿中進行慢病毒的包裝為例，將293T細胞以6×104個/cm2的密度接種在含有10% FBS的DMEM培養基中，並置於37℃，5% CO2和飽和濕度的環境下進行培養，接種3天後實施轉染。轉染前取兩支EP管，每支加500μl opti-MEM，向其中一支管加入慢病毒輔助載體3μg PSPAX2、2pMD2.G及實施例1製備的載體(編號為PXL0009、PXL0041或PXL0043的CAR
質粒)5μg，混勻，得到含有質粒的支管；向另一支管加入濃度為1mg/ml PEI 30μl，充分混勻。然後將上述另一支管中的加有PEI的溶液逐滴加入至所述含有質粒的支管中，邊加邊混勻，室溫靜止30min後，逐滴均勻加入至前述293T細胞中。轉染後24小時更換6ml含10% FBS的DMEM培養基。
72小時後，收取上清液至離心管中，3000g 4℃離心10min，並將上清液用0.45μm的濾器過濾後，準備進行純化。
將上清液用超速離心機進行離心，27000g 4℃離心4小時。棄乾上清，用100μl預冷PBS對沉澱進行重懸，無顆粒後置於4℃重懸過夜。過夜後，將病毒懸液取出並分裝。分別得到慢病毒LV0011(對應PXL0041的CAR質粒)和LV0013(對應PXL0043的CAR質粒)。
3.2 慢病毒的包裝效率評價
藉由檢測慢病毒包裝過程中收穫的上清液中具有轉導活性的病毒滴度(生物滴度)，可以評價慢病毒的包裝效率。具體檢測步驟如下：將293T細胞以1×105/孔的量接種在六孔板中，並置於37℃，5% CO2和飽和濕度的環境下，用500μl含有10% FBS的DMEM培養基進行培養。細胞培養24小時後，進行慢病毒轉導，分別取100μl、50μl、25μl和12.5μl的上述的上清液加入到六孔板中(每個取樣量設置2個孔)。然後置於37℃，5% CO2和飽和濕度的環境下繼續培養細胞。慢病毒轉導72小時後，將293T細胞消化重懸後用於流式檢測。
由於LV0013中同時攜帶了編碼CAR分子和GFP蛋白的基因，因此LV0013轉導的293T細胞會同時表達CAR分子和GFP蛋白。藉由流式檢
測293T細胞中的GFP螢光信號，可以用於計算上清液中的慢病毒生物滴度(稱為GFP滴度)：生物滴度(TU/ml)=(GFP陽性率×293T細胞數)/病毒取樣體積
或者，LV0013轉導的293T細胞用生物素化的BCMA(biotinylated BCMA)和PE-streptavidin進行標記，流式檢測CAR陽性率(稱為CAR滴度)：
生物滴度(TU/ml)=(CAR陽性率×293T細胞數)/病毒取樣體積
上述包裝過程中收穫的上清液的生物滴度檢測結果如第4圖和表4所示。
實施例4 CAR-T細胞的製備
第1天，採集約65ml健康供者的外周血，使用Ficoll分離得到PBMC，進一步使用CD3 MicroBeads分選獲得T細胞。分選後的T細胞使用CD3/CD28 Dynabeads進行活化。活化約24小時後(第2天)，分別加入實施例3製備的LV0011和LV0013慢病毒轉導(MOI=4)，轉導時T細胞密度約為1.5×106個細胞/ml。在第3天時，對轉導後的T細胞進行一次換液。之後，每天進行計數，並維持細胞密度在(0.6~2.0)×106個細胞/ml之間，並繪製細胞的生長曲線。
細胞培養至第6天時，使用流式細胞術檢測CAR陽性率(CAR%)、GFP陽性率(GFP%)，CD4/CD8比率。在第10天時，進行CAR-T細胞的體外功能評價。
根據上述過程，得到了LV0011-CAR-T細胞和LV0013-CAR-T細胞，並且以供者的T細胞作為對照。表5總結了上述CAR-T細胞的製備過程。
LV0011-CAR-T細胞、LV0013-CAR-T細胞、以及對照T細胞的生長曲線如第5圖所示。細胞培養至第6天時，使用流式細胞術檢測所得CAR陽性率等數據如表6所示。
實施例5 CAR分子與BCMA蛋白結合的數據
進一步的，在固定濃度且過量的PE鏈黴素(PE streptavidin)條件下，使用梯度稀釋的生物素化的BCMA(biotinylated BCMA)蛋白標記CAR分子的方式(與實施例2的方法相同)，對實施例4中製備的CAR-T上表達的CAR分子與BCMA蛋白結合能力進行檢測，結果如第6圖和表7所示。
根據以上數據，T細胞上表達的候選CAR分子可以正常結合BCMA蛋白。但是，不同批次製備的細胞樣品測定的EC50值存在較大差異。這種差異可能是由於細胞種類、樣品製備方法和批次不同，導致細胞表面CAR分子表達密度不同而造成的。
實施例6 CD107a脫粒實驗
6.1 CD107a脫粒實驗
使用CD107a脫粒實驗進行CAR-T細胞的體外生物學效力評估。CD107a是細胞內微囊泡的標誌物，當負載有顆粒酶的微囊泡與細胞膜融合後，細胞膜上的CD107a會增加，當用莫能酶素(monesin，購自BioLegend)阻斷其回收時，可以定量反映微囊泡釋放的強度。當CAR-T受靶細胞上靶抗原刺激後，會造成顆粒酶釋放，並可藉由流式檢測CD107a的增加來判斷T細胞的激活。
首先將從實施例4獲得的CAR-T細胞(LV0011-CAR-T細胞或LV0013-CAR-T細胞)與靶細胞U266、莫能酶素和CD107a抗體共同孵育3~6小時，CAR-T細胞與靶細胞的細胞密度均為5×105個細胞/ml。然後用CD8、PD1抗體標記樣品後，進行流式檢測。其中，候選CAR-T細胞中的CAR陽性細胞藉由共表達的GFP檢測，而作為對照的LV0011-CAR-T細胞藉由生物素化的BCMA-Fc(biotinylated BCMA-Fc)和PE鏈黴素(PE streptavidin)來標記CAR陽性細胞。實驗中的陰性對照採用K562細胞和CAR-T細胞共孵育，陽性對照採用混合物(cocktail)代替靶細胞來激活CAR-T細胞。
以LV0013-CAR-T細胞為例，流式結果如第7圖所示。
對於LV0013-CAR-T和U266共孵育的細胞樣品，在FSC：SSC散點圖上選取P1門，去除左下角的細胞碎片；對P1門中的細胞，可進一步分析CD8：PD1，從而得到CD8+/PD1-細胞群(Q3)；在CD8+/PD1-細胞群中，可再次分析GFP：CD107a，可分別得到CD8+/PD1-/CAR+細胞群(以共表達的GFP信號標記CAR陽性細胞)和CD8+/PD1-/CAR-細胞群中表達CD107a的比例。
LV0013-CAR-T和K562共孵育的細胞樣品，在FSC：SSC散點圖上，細胞分成了P1和P2兩群，其中P2群中的細胞幾乎不表達CD8，因此可
能是K562細胞；對P1門中的細胞可以進一步分析CD8：PD1；在CD8+/PD1-細胞群(Q3)中，可再次分析GFP：CD107a，從而也得到CD8+/PD1-/CAR+和CD8+/PD1-/CAR-細胞群中表達CD107a的比例。
6.2 CD107a脫粒實驗數據
根據本實施例6.1部分的實驗操作，CAR-T細胞樣品(LV0011-CAR-T和LV0013-CAR-T細胞)分別和靶細胞U266(BCMA陽性)或K562(BCMA陰性)共孵育3小時後進行流式檢測，細胞樣品的CD107a脫粒實驗的數據如表8和第8圖所示，表8和第8圖中均顯示了CD8+/PD1-/CAR+和CD8+/PD1-/CAR-兩個亞群細胞中表達CD107a陽性細胞比率。
如第8圖和第8圖所示，U266細胞共孵育的CAR-T樣品中，CD8+/PD1-/CAR+亞群細胞上的CD107a數值，可以反映CAR-T細胞被特異性激活的情況；而K562細胞共孵育的CAR-T樣品中，CD8+/PD1-/CAR+亞群細胞上的CD107a數值，可以反映CAR-T細胞被非特異性激活的情況。比較U266共孵育時的CD8+/PD1-/CAR+亞群細胞上的CD107a數值，可以看出LV0013-CAR-T細胞的CD8+/PD1-/CAR+亞群可以被BCMA陽性細胞(U266)
特異性的激活，並且LV0013-CAR-T細胞的激活情況強於於作為對照的LV0011-CAR-T細胞。
6.3 BCMA蛋白競爭條件下的CD107a脫粒實驗數據
此外，由於多發性骨髓瘤(MM)細胞表面上表達的BCMA蛋白的胞外部分可以被γ-分泌酶(γ-secretase)切割，從而形成可溶性BCMA(sBCMA)。可溶性BCMA在MM病人血清中會升高，且濃度與腫瘤惡性程度呈正相關。因此，在CAR-T細胞與靶細胞共孵育時，在培養基中加入1μg/ml BCMA蛋白(BCMA-Fc融合蛋白)，用來評估可溶性BCMA對CAR-T細胞激活的影響。
CAR-T細胞樣品，在BCMA蛋白競爭條件下的CD107a脫粒實驗檢測結果如表9和第9圖所示。如第9圖顯示，在U266細胞刺激下，LV0013-CAR-T細胞樣品的CD8+/PD1-/CAR+亞群的CD107a陽性細胞比率受BCMA蛋白競爭的影響較小；而作為對照的LV0011-CAR-T細胞樣品所受的影響較大。
實施例7 細胞因子釋放測定
細胞因子釋放測定實驗是將待測CAR-T細胞(5×105個細胞，100μl)和靶細胞(5×105個細胞，100μl)在RPMI-1640培養基中共孵育24h後，收集細胞培養上清液，然後使用CBA法測定IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α和IFN-γ等因子的分泌情況。
第一批次培養的部分CAR-T細胞樣品分別和靶細胞共孵育後的細胞因子釋放檢測結果如表10和第10圖所示。第10圖中所示的細胞因子釋放量為相對於樣本中檢測所得的最大值的百分比。由表10和第10圖所示，受BCMA陽性的靶細胞U266刺激後(+U266)，LV0013-CAR-T細胞分泌的TNF-α、IFN-γ和IL-2都大幅增加。而受到BCMA陰性的K562刺激(+K562)，LV0013-CAR-T沒有出現TNF-α、IFN-γ和IL-2的分泌增加。
實施例8 不同供體的CAR-T細胞功能
採用類似實施例4的實驗方法，藉由轉導實施例3製備的慢病毒LV0002和LV0023，制得LV0002-CAR-T細胞和LV0023-CAR-T細胞，使用LV0023病毒(對應PXL0099質粒編碼的CAR分子，其共刺激因子為4-1BB)和LV0002病毒(對應PXL0009質粒編碼的CAR分子，其共刺激因子為CD28)轉導不同供者的T細胞，製備CAR-T細胞。其中，將LV0002病毒轉導供體1的T細胞命名為LV0002-D01-CAR-T細胞，將LV0002病毒轉導供體1的T細胞命名為LV0002-D02-CAR-T細胞；將LV0023病毒轉導供體1的T細胞命名為LV0023-D01-CAR-T細胞，將LV0023病毒轉導供體2的T細胞命名為LV0023-D01-CAR-T細胞。同時，以供體自身T細胞作為對照。其中，將來自供體1的T細胞命名為T細胞-D01，將來自供體2的T細胞命名為T細胞-D02。這些CAR-T細胞的功能也使用實施例6中的CD107a脫粒實驗進行檢測，結果如表11和第11圖所示。
結果顯示，兩位不同供者的LV0023-CAR-T細胞的結果相近，都可以被BCMA陽性的U266細胞特異性的刺激產生CD107a，而在BCMA陰性的K562細胞刺激下，產生的CD107a數值和未受刺激的數值相似(空白)。作為對照的LV0002-CAR-T細胞在U266細胞刺激下可以產生更高的CD107a，這可能是因為二者的scFv和共刺激因子都不相同造成的。並且，LV0002-CAR-T細胞在未刺激(空白)和受K562細胞刺激的條件下，都會有較高的CD107a值。此外，LV0023-CAR-T產生CD107a的能力受游離BCMA蛋白的影響較小，而LV0002-CAR-T產生CD107a的能力受游離BCMA蛋白的影響較大。
實施例9 CAR-T對靶細胞的體外殺傷實驗
使用實施例8中製備的來自供體2的CAR-T細胞LV0023-D02-CAR-T進行體外殺傷功能測試，其可藉由鈣黃綠素螢光法進行檢測。具體檢測步驟如下：分別取5×105個BCMA陽性的U266細胞和BCMA陰性的K562細胞，在PBS+4% FBS溶液中重懸成1×106/ml的細胞懸液。然後用25μM的鈣黃綠素(Calcein-AM)分別標記U266和K562細胞。將標記後的U266和K562細胞按照每孔5000個細胞的量分別接種到U底96孔板中；然後在相應的孔中，分別按照50：1、25：1、5：1三個效應細胞與靶細胞的比值(E：T值)加入待測的CAR-T細胞或者作為對照的T細胞，每孔的溶液體積為200μl。此外，使用PBS溶液代替效應細胞加入U266或K562細胞中，作為檢測的陰性對照，使用細胞裂解液溶液代替效應細胞加入U266或K562細胞中，作為檢測的陽性對照。然後，將U底96孔板避光在37℃下孵育3小時，之後從每孔中吸取上清溶液(避免吸取細胞)進行螢光檢測(激發光波長485/20nm，發射光波長530/25nm)。靶細
胞(U266或K562)被效應細胞殺傷並裂解釋放出鈣黃綠素的相對比例可以藉由下列公式計算：
其中，Ftest是含有靶細胞和待測T/CAR-T細胞的複孔間的平均螢光值，Fspont.是含有靶細胞和PBS的複孔間的平均螢光值，Fmax.是含有靶細胞和裂解液的複孔間的平均螢光值。
以LV0023-D02-CAR-T樣品為例，CAR-T細胞對靶細胞的體外殺傷效果如第12圖所示，CAR-T細胞對BCMA陽性的U266細胞有較強的殺傷效果，並且殺傷效果隨著E：T值的增大而增強，表現為更大比例的U266細胞被裂解釋放出鈣黃綠素。作為對比，CAR-T細胞對BCMA陰性的K562細胞殺傷效果較差。此外，T細胞對U266細胞有一定的非特異殺傷，且非特異性殺傷不會隨著E：T值的增大而變化。因此，CAR-T細胞有明顯的針對BCMA特異性的殺傷效果。
實施例10 荷瘤動物模型體內腫瘤抑制檢測
使用實施例8製備的來自供體2的CAR-T細胞(LV0023-D02-CAR-T)進行動物模型實驗。同時，以來自供體2的T細胞(T細胞-D02)作為對照T細胞。按照每隻小鼠2×106個細胞的量，將擴增中的U266細胞皮下注射接種至免疫缺陷型NSG小鼠，建立U266皮下荷瘤模型。當腫瘤大小到達100-150mm3時，按照表12所示，將荷瘤小鼠分成5組，分別注射CAR-T細胞(LV0023-D02-CAR-T)、對照T細胞(T細胞-D02)、PBS或細胞凍存液(其包括7.5%的DMSO、23%的人血白蛋白、32.5%的複方電解質液、35%的葡萄糖注射液和2%的生理鹽水)。本申請中所述細胞凍存液包括7.5%的DMSO、23%
的人血白蛋白、32.5%的複方電解質液、35%的葡萄糖注射液和2%的生理鹽水。連續飼養小鼠，並記錄腫瘤體積和小鼠體重，以及小鼠生存狀態。結果如第13圖所示。小鼠模型實驗的結果表明，單次注射CAR-T細胞後，無論高劑量組還是低劑量組均有良好的腫瘤殺傷效果，腫瘤在注射後19天完全消失。而注射對照T細胞、PBS、或者細胞凍存液的小鼠體內的腫瘤均持續生長。
前述詳細說明是以解釋和舉例的方式提供的，並非要限制所附身請專利範圍的範圍。目前本申請所列舉的實施方式的多種變化對本領域普通技術人員來說是顯而易見的，且保留在所附的申請專利範圍和其等同方案的範圍內。
<110> 南京馴鹿醫療技術有限公司；信達生物製藥(蘇州)有限公司(NANJING IASO BIOTHERAPEUTICS CO.,LTD.) (INNOVENT BIOLOGICS(SUZHOU)CO.,LTD.)
<120> 一種結合BCMA的嵌合抗原受體(CAR)及其應用
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Claims (29)
- 種嵌合抗原受體(CAR)，其中該CAR包含BCMA結合結構域、跨膜結構域、共刺激結構域和胞內信號傳導結構域，該BCMA結合結構域包含特異性結合BCMA的抗體或其片段，其中該抗體包含重鏈互補決定區1(HCDR1)，重鏈互補決定區2(HCDR2)，重鏈互補決定區3(HCDR3)，輕鏈互補決定區1(LCDR1)，輕鏈互補決定區2(LCDR2)和輕鏈互補決定區3(LCDR3)，該HCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示，該HCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：10所示，該HCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：11所示，該LCDR1的胺基酸序列如SEQ ID NO：17所示，該LCDR2的胺基酸序列如SEQ ID NO：18所示，且該LCDR3的胺基酸序列如SEQ ID NO：19所示。
- 如申請專利範圍第1項所述的CAR，其中該抗體包含重鏈可變區，所述重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
- 如申請專利範圍第1項所述的CAR，其中該抗體包含輕鏈可變區，所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO：15所示。
- 如申請專利範圍第1項所述的CAR，其中該抗體為單鏈抗體。
- 如申請專利範圍第1項所述的CAR，其中該抗體包含SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項所述的CAR，其中該跨膜結構域包含源自選自下述蛋白的跨膜結構域：T細胞受體的α，β或ζ鏈、CD28、CD3e、CD45、CD4、CD5、CD8a、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154。
- 如申請專利範圍第1項所述的CAR，其中該跨膜結構域包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項所述的CAR，其中該共刺激結構域包含選自下述蛋白的共刺激結構域：CD28、4-1BB、OX-40和ICOS。
- 如申請專利範圍第1項所述的CAR，其中該共刺激結構域包含SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項所述的CAR，其中該胞內信號傳導結構域包含源自CD3ζ的信號傳導結構域。
- 如申請專利範圍第1項所述的CAR，其中該胞內信號傳導結構域包含SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項所述的CAR，其中該CAR還包含鉸鏈區，該鉸鏈區連接該BCMA結合結構域和該跨膜結構域。
- 如申請專利範圍第12項所述的CAR，其中該鉸鏈區包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項所述的CAR，其中該CAR還連接信號肽。
- 如申請專利範圍第14項所述的CAR，其中該信號肽包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項所述的CAR，其中該CAR還連接剪切肽。
- 如申請專利範圍第16項所述的CAR，其中該剪切肽包含來自T2A肽的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第16項所述的CAR，其中該剪切肽包含SEQ ID NO：35所示的胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項所述的CAR，其包含SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列。
- 一種分離的核酸分子，其編碼如申請專利範圍第1項所述的CAR。
- 一種編碼CAR的分離的核酸分子，其包含SEQ ID NO：50或SEQ ID NO：52所示的核酸序列。
- 一種載體，其包含如申請專利範圍第21項所述的核酸分子。
- 如申請專利範圍第22項所述的載體，其中該載體選自質粒、逆轉錄病毒載體和慢病毒載體。
- 一種免疫效應細胞，其包含如申請專利範圍第1至19項中任一項所述的CAR，如申請專利範圍第20或21項所述的核酸分子，或如申請專利範圍第22或23項所述的載體。
- 如申請專利範圍第24項所述的細胞，其中該免疫效應細胞選自T淋巴細胞和自然殺傷(NK)細胞。
- 一種製備免疫效應細胞的方法，其包括向免疫效應細胞中引入如申請專利範圍第22或23項所述的載體。
- 一種組合物，其包含如申請專利範圍第24或25項所述的免疫效應細胞。
- 一種申請專利範圍第1至19項中任一項所述的CAR、申請專利範圍第20或21項所述的核酸分子、申請專利範圍第22或23項所述的載體或申請專利範圍第24或25項中任一項所述的免疫效應細胞用於製備藥物的用途，其中該藥物用於治療與BCMA的表達相關的疾病或病症。
- 如申請專利範圍第28項所述的用途，其中該與BCMA的表達相關的疾病或病症為癌症或惡性腫瘤。
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| CN112795584B (zh) * | 2020-08-20 | 2023-01-24 | 山东省成体细胞产业技术研究院有限公司 | 抗gcc的核酸、其制备方法、具有该核酸的免疫细胞及其应用 |
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| AU2022283291A1 (en) | 2021-05-27 | 2023-11-02 | Sana Biotechnology, Inc. | Hypoimmunogenic cells comprising engineered hla-e or hla-g |
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| WO2023069790A1 (en) | 2021-10-22 | 2023-04-27 | Sana Biotechnology, Inc. | Methods of engineering allogeneic t cells with a transgene in a tcr locus and associated compositions and methods |
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| WO2023122337A1 (en) | 2021-12-23 | 2023-06-29 | Sana Biotechnology, Inc. | Chimeric antigen receptor (car) t cells for treating autoimmune disease and associated methods |
| WO2023133595A2 (en) | 2022-01-10 | 2023-07-13 | Sana Biotechnology, Inc. | Methods of ex vivo dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses |
| WO2023150518A1 (en) | 2022-02-01 | 2023-08-10 | Sana Biotechnology, Inc. | Cd3-targeted lentiviral vectors and uses thereof |
| WO2023150647A1 (en) | 2022-02-02 | 2023-08-10 | Sana Biotechnology, Inc. | Methods of repeat dosing and administration of lipid particles or viral vectors and related systems and uses |
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| WO2023193015A1 (en) | 2022-04-01 | 2023-10-05 | Sana Biotechnology, Inc. | Cytokine receptor agonist and viral vector combination therapies |
| WO2023225569A1 (en) | 2022-05-17 | 2023-11-23 | Umoja Biopharma, Inc. | Manufacturing viral particles |
| WO2023240282A1 (en) | 2022-06-10 | 2023-12-14 | Umoja Biopharma, Inc. | Engineered stem cells and uses thereof |
| WO2024026377A1 (en) | 2022-07-27 | 2024-02-01 | Sana Biotechnology, Inc. | Methods of transduction using a viral vector and inhibitors of antiviral restriction factors |
| WO2024064838A1 (en) | 2022-09-21 | 2024-03-28 | Sana Biotechnology, Inc. | Lipid particles comprising variant paramyxovirus attachment glycoproteins and uses thereof |
| WO2024081820A1 (en) | 2022-10-13 | 2024-04-18 | Sana Biotechnology, Inc. | Viral particles targeting hematopoietic stem cells |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013154760A1 (en) * | 2012-04-11 | 2013-10-17 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen |
| TW201615832A (zh) * | 2014-07-21 | 2016-05-01 | 諾華公司 | 使用人類化抗－ｂｃｍａ嵌合抗原受體治療癌症 |
| TW201710293A (zh) * | 2015-04-13 | 2017-03-16 | Pfizer | 靶向ｂ細胞成熟抗原之嵌合型抗原受體類 |
Family Cites Families (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101412271B1 (ko) * | 2003-05-09 | 2014-06-25 | 듀크 유니버시티 | Ｃｄ２０-특이적 항체 및 이를 이용한 방법 |
| JP6061469B2 (ja) | 2009-03-10 | 2017-01-25 | バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． | 抗ｂｃｍａ抗体 |
| JO3182B1 (ar) * | 2009-07-29 | 2018-03-08 | Regeneron Pharma | مضادات حيوية بشرية عالية الالفة مع تولد الاوعية البشرية - 2 |
| PL2496698T3 (pl) | 2009-11-03 | 2019-07-31 | City Of Hope | Skrócony receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFRt) do selekcji transdukowanych komórek T |
| EP2825199A4 (en) * | 2012-03-15 | 2016-01-27 | Janssen Biotech Inc | ANTIBODIES AGAINST HUMAN AUTOTAXIN AND METHODS OF USE |
| EP4001310A3 (en) * | 2014-05-02 | 2022-08-10 | MedImmune Limited | Ion channel modulators and uses thereof |
| AU2015292590B2 (en) | 2014-07-24 | 2020-01-16 | 2Seventy Bio, Inc. | BCMA chimeric antigen receptors |
| DK3230321T3 (da) | 2014-12-12 | 2019-10-28 | Bluebird Bio Inc | Kimære bcma-antigenreceptorer |
| PL3298033T5 (pl) * | 2015-05-18 | 2023-10-30 | TCR2 Therapeutics Inc. | Kompozycje i zastosowania medyczne do reprogramowania TCR z zastosowaniem białek fuzyjnych |
| AU2016309738A1 (en) * | 2015-08-17 | 2018-03-08 | Deutsches Zentrum Für Neurodegenerative Erkrankungen E.V. (Dzne) | Antibody or antibody fragment or non-Ig scaffold binding to a binding region of an anti-NMDARI-D-aspartate (NMDA) receptor antibody |
| BR112018006995A2 (pt) * | 2015-10-15 | 2018-10-30 | Us Health | receptores anti-cd30 de antígeno quimérico |
| BR112018067679A2 (pt) | 2016-03-04 | 2019-01-15 | Novartis Ag | células que expressam múltiplas moléculas do receptor de antígeno quimérico (car) e seu uso |
| CN105777911B (zh) * | 2016-04-12 | 2019-07-02 | 上海优卡迪生物医药科技有限公司 | 抗bcma嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建方法和应用 |
| HRP20230457T1 (hr) | 2016-04-15 | 2023-07-21 | Novartis Ag | Pripravci i postupci za selektivnu ekspresiju kimernih antigenskih receptora |
| CN105837693A (zh) * | 2016-05-30 | 2016-08-10 | 李斯文 | 一种基于bcma的抗原嵌合受体及其制备方法和应用 |
| WO2017211900A1 (en) * | 2016-06-07 | 2017-12-14 | Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin | Chimeric antigen receptor and car-t cells that bind bcma |
| KR20220003055A (ko) * | 2019-04-30 | 2022-01-07 | 기가젠, 인코포레이티드 | 재조합 폴리클로날 단백질 및 이의 사용 방법 |
-
2019
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013154760A1 (en) * | 2012-04-11 | 2013-10-17 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen |
| TW201615832A (zh) * | 2014-07-21 | 2016-05-01 | 諾華公司 | 使用人類化抗－ｂｃｍａ嵌合抗原受體治療癌症 |
| TW201710293A (zh) * | 2015-04-13 | 2017-03-16 | Pfizer | 靶向ｂ細胞成熟抗原之嵌合型抗原受體類 |
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