KR20220003055A - 재조합 폴리클로날 단백질 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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르네 릉
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Abstract

본원에서는 포유동물 형질세포 및 형질모세포로부터 유래된 재조합 폴리클로날 단백질(RPP)을 포함하는 조성물이 제공된다. 또한, 상기 RPP를 사용하는 방법이 제공된다.

Description

재조합 폴리클로날 단백질 및 이의 사용 방법
1. 관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2019년 4월 30일에 출원된 미국 가출원 번호 62/841,097의 이익 및 우선권을 주장하며, 이 내용은 모든 목적을 위해 이의 전체가 참고로 포함된다.
2. 서열 목록
본 출원에는 EFS-Web을 통해 제출된 120158개의 서열을 갖는 서열 목록이 포함되어 있으며, 이의 전체 내용이 참조로 포함된다. 2020년 4월 30일에 생성된 상기 ASCII 카피의 이름은 GGN035WOsequencelisting.txt이고, 크기는 30.3 MB이다.
3. 기술분야
예를 들어 백신 및 라이브러리를 포함하는 항원에 대한 결합 특이성을 갖는, 재조합 폴리클로날 항체 단백질, 재조합 과면역 글로불린 또는 단순 재조합 과면역체라고도 하는, 재조합 폴리클로날 단백질(RPP: recombinant polyclonal protein), 및 약학적 조성물을 포함하는 이러한 RPP를 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다. 또한, RPP의 제조 방법, 및 예를 들어 치료 목적을 위한 RPP의 사용 방법이 제공된다.
4. 배경기술
활성 백신의 보급으로 예방 가능한 감염병의 발병률이 크게 감소했지만, 백신에 의한 면역 반응이 낮거나 전혀 없음으로 인한 백신 실패는 여전히 심각한 문제로 남아 있다. 노인이나 선천성 체액성 면역 결핍증이 있는 개인을 포함하여 특정 인구는 특히 감염 위험이 있으며, 이들의 약화된 면역 체계는 백신 항원에 대한 적절한 면역 반응의 유도를 막는다. [문헌(D'Acremont et al., 2006; Jilkova et al., 2009; Weinberger et al., 2010; Langley et al., 2011; Cramer et al., 2016; Bader, 2007; Goldacker et al., 2007; van Assen et al., 2010)]. 반응이 좋지 않은 사람들은 감염 위험이 상당히 높아져 입원률이 증가하고, 항생제 또는 항바이러스 치료가 필요하거나 장기간의 질병이나 사망을 초래한다. 이러한 환자들은 실패한 백신 양상에 대한 대안으로 방어 면역을 제공할 항체 대체 요법의 혜택을 받을 것이다.
수동 예방 접종(문헌[McDonagh, 1966])은 활성 백신에 반응하지 않는 면역 결핍이 있는 개인을 위한 대체 방어 전략을 제공한다. 예를 들어, 정맥 면역글로불린(IVIg)은 수천 명의 인간 공여자의 혈장에서 파생된 광범위한 폴리클로날 항체 요법이다. IVIg는 체액성 면역 결핍증 환자의 항체 대체 요법으로 사용된다[문헌(Lucas et al., 2010; Resnick et al., 2012)]. 그러나, IVIg는 많은 일반적인 병원체에 대한 항체 역가가 낮기 때문에 면역 결핍 환자에서 상당한 질병률과 사망률을 초래한다[문헌(Orange et al., 2010)]. 항병원체 역가를 증가시키기 위해 몇몇 그룹에서 종종 과면역체라고 하는 고역가 혈장-유래 항체를 개발했다[문헌(Bozzo & Jorquera, 2017)]. 과면역체는 일반적으로 B형 간염 바이러스에 대한 역가가 높은 HyperHEP B(Grifols)와 같은 활성 백신 투여 직후 공여자의 혈장에서 유래된다.
최근 활성 백신을 투여한 공여자로부터 유래된 과면역체는 수동 면역화를 위한 탁월한 선택이지만 이러한 제품을 상업적으로 확장하는 것은 어려운 일이다[문헌(Kreil et al., 2012)]. 중요한 것은 백신을 접종하고 혈장을 반복적으로 기증할 의사가 있는 강력한 반응자를 식별하기 어려울 수 있다는 것이다. 따라서, 과면역체 제조 로트는 필수적으로 서로 다른 공여자 세트에서 유래되므로, 로트 간 변동성이 발생한다. 항병원체 역가는 2배에서 3배[문헌(Schampera et al., 2017)]에서 많게는 50배[문헌(Kreil et al., 2012)]까지 과면역체에 따라 크게 달라진다. 따라서, 어떤 경우에는 의사가 단순히 더 많은 양의 IVIg를 투여할 수 있다[문헌(Polilli et al., 2012)]. 의사와 환자는 대규모로 제조하기 쉬운 보다 일관되고 더 높은 역가의 과면역체로부터 이익을 얻을 것이다.
5. 발명의 내용
예를 들어, 백신 및 라이브러리를 포함하는 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 RPP(재조합 폴리클로날 항체 단백질, 재조합 과면역 글로불린 또는 재조합 과면역체라고도 하는 재조합 폴리클로날 단백질), 및, 예를 들어 인간 치료법으로서의, 이러한 RPP의 사용 방법이 본원에서 제공된다. RPP는 재조합형이며, 이의 서열은 말초 혈액 형질세포 또는 형질모세포에서 유래된다. 말초 혈액 형질세포 또는 형질모세포는 예를 들어 공여자에게 투여된 백신에 의해 동원되고, 말초 혈액 형질세포 또는 형질모세포는 다른 말초 혈액 세포와 특이적으로 분리된다. 말초 혈액 세포는 마우스, 쥐, 인간, 원숭이, 말 또는 소와 같은 모든 포유동물에서 유래할 수 있다.
RPP는 항원에 특이적으로 결합한다. 예로는 헤모필리우스 인플루엔자 b 다당류, 폐렴구균 다당류, B형 간염 바이러스 항원 또는 인간 흉선세포가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 RPP 조성물은 예를 들어 바이러스로부터 유래된 단백질 항원을 포함하는 백신에 의해 동원된 형질세포 또는 형질모세포로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 백신은 포유동물 세포, 예를 들어 면역 세포 또는 암세포이다. 다른 실시양태에서, 백신은 사멸되거나 불활성화된 병원체, 예를 들어 박테리아 또는 바이러스이다. 다른 실시양태에서, 백신은 세균성 다당류이다. 일부 실시양태에서, 백신은 감염성 질환에 대한 예방을 위해 미국 식품의약국에서 승인한 제제이다. 모든 실시양태에서, 백신은 말초 혈액에 형질세포 또는 형질모세포를 동원하거나, 말초 혈액에 형질세포 또는 형질모세포가 동원되도록 한다.
RPP의 라이브러리는 RPP, 예를 들어 항체의 혼합물을 포함하고, 폴리클로날 항체로 불릴 수 있다. 항체의 혼합물은 10, 100, 1,000, 10,000, 100,000 또는 100,000개 초과의 별개의 항체 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 라이브러리는 본원에 개시된 동족 중쇄 CDR3 및 경쇄 CDR3 서열을 갖는 RPP를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 키메라이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간화된다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간이다. 일부 실시양태에서, RPP는 항체 단편의 혼합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, RPP는 단일쇄 가변 단편(scFv)의 혼합물을 포함한다. 일부 실시양태에서 RPP는 전장 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG, IgA 또는 IgM이다.
본원에서 제공되는 RPP는 백신을 포함하는 항원에 대한 결합과 관련된 다양한 생물학적 효과를 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 RPP는 세포에 대한 바이러스의 결합을 방지하고, 여기서 바이러스가 세포 내로 진입하는 것을 방지한다. 일부 실시양태에서, 제공된 RPP는 박테리아의 세포 표면에 결합하여 면역계에 의한 박테리아의 용해를 가능하게 한다. 일부 실시양태에서, RPP는 병리와 관련된 세포를 제거하기 위해 환자 세포의 세포 표면에 결합한다. 일부 실시양태에서, RPP는 이식에서 자가면역 질환 또는 이식편 대 숙주 질환과 관련된 T 세포를 제거하기 위해 T 세포의 표면에 결합한다.
또한, 본원에 제공된 RPP, 및 이의 부분을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 일부 양태에서, 본 발명은 본원에 제공된 RPP를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 혼합물을 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 혼합물을 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 또는 벡터의 혼합물을 포함하는 숙주 세포 클론의 혼합물을 제공한다.
또한, 본원에 제공된 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 숙주 세포를 사용하여 RPP를 생산하는 방법이 제공된다. 본 발명의 일부 양태는 폴리뉴클레오티드 벡터의 라이브러리를 사용하여 숙주 세포에서 항체를 발현시키는 단계, 및 RPP를 분리하는 단계를 포함하는 RPP를 생산하는 방법에 관한 것이다.
또한, RPP 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
또한 유효량의 본원에서 제공된 RPP, 또는 이러한 RPP를 포함하는 약학적 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 본원에서 제공된 RPP를 사용하는 방법, 예를 들어 이를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다. 일부 양태에서, 질환 또는 병태는 암 또는 알츠하이머병이다. 일부 양태에서, 질환 또는 병태는 바이러스 또는 박테리아 감염이다. 일부 양태에서, 방법은 하나 이상의 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 추가 치료제는 면역 자극제 또는 억제제이다. 일부 양태에서, RPP는 이식 셋팅에서 이식편 대 숙주 또는 숙주 대 이식편 반응을 조절하는 데 사용된다. 일부 양태에서, RPP는 이식 셋팅에서 바이러스 질환을 조절하는 데 사용된다.
일부 실시양태에서, RPP는 대상체에게 투여될 때 감염성 질환에 대한 예방에 충분한 양으로 존재한다. 일부 실시양태에서, RPP는 감염과 적극적으로 싸우는 개체에서 감염성 질환을 제거하기에 충분한 양이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 재조합 항체의 라이브러리를 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 포유동물 공여자에게 B형 간염 바이러스(HBV)에 대한 항원을 주입하는 단계; 공여자의 형질세포 또는 형질모세포를 분리하는 단계; 형질세포 또는 형질모세포로부터 재조합 항체의 라이브러리를 생성하는 단계를 포함하고, 여기서 재조합 항체 라이브러리의 활성은 항원에 대한 상기 공여자의 혈청 역가 활성을 10배 이상 초과한다. 포유동물 공여자는 1명 초과의 개체를 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 포유동물 공여자는 인간, 마우스, 인간화 마우스, 랫트, 인간화 랫트, 말 또는 소일 수 있다. 본 발명의 방법은 적어도 100개의 재조합 항체, 예를 들어 적어도 1,000개의 재조합 항체, 예컨대 적어도 10,000개의 재조합 항체를 생성할 수 있다. 일 실시양태에서, 본 발명의 방법은 100,000개 이상의 재조합 항체를 생성할 수 있다.
본 발명의 방법과 관련하여, 활성 역가는 시험관 내 병원체 중화 검정에 의해 측정될 수 있다. 대안적으로, 활성 역가는 항원 분석에 대한 시험관 내 결합에 의해 측정될 수 있다. 일 실시양태에서, 활성 역가는 생체 내 효능 검정에 의해 측정될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명의 방법은 단일 형질세포 또는 형질모세포로부터의 동족 쌍으로부터 중쇄 가변 도메인을 코딩하는 제1 서열; 및 동족 쌍으로부터의 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 제2 서열; 및 제1 및 제2 서열을 연결하고 제한 부위를 포함하는 제3 서열을 각각 포함하는 복수의 제1 선형 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계; 및 제1 폴리뉴클레오티드의 일부에 상동성인 제4 서열을 포함하는, 제1 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결되지 않은 제2 선형 폴리뉴클레오티드를 수득하는 단계; 및 복수의 제1 폴리뉴클레오티드 각각을 제2 폴리뉴클레오티드로 원형화하여 재조합 항체의 라이브러리를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 생성하는 단계로서, 원형화는 깁슨 어셈블리를 통해 수행되는 단계; 및 재조합 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 포함하는 포유동물 세포에서 재조합 항체의 라이브러리를 발현시켜 재조합 항체의 라이브러리를 생성하는 단계를 포함한다.
6. 도면의 간단한 설명
도 1은 백신이 투여된 포유동물 숙주로부터 분리된 말초 혈액 형질세포 또는 형질모세포에서 발현된 전사체로부터 유래된 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 생성하는 방법을 요약한 것이다.
도 2는 용해된 세포로부터 핵산 표적을 포획하는 용해 혼합물 및 고체 지지체를 갖는 물리적 용기에 형질세포 또는 형질모세포를 캡슐화하는 방법을 요약한 것이다.
도 3은 고체 지지체에 부착된 핵산 표적으로 표적 특이적 프라이머를 캡슐화하는 방법을 요약한 것이다.
도 4는 상보적 영역을 갖는 개별 표적 핵산을 증폭하는 방법을 나타낸다.
도 5는 상보적 영역을 갖는 개별 증폭된 표적 핵산을 나타낸다.
도 6은 별개의 증폭된 핵산 표적을 단일 융합된 핵산 작제물로 융합하는 방법을 요약한 것이다.
도 7은 융합된 핵산 작제물로부터 원형화된 유전자 발현 작제물을 생성하는 방법을 보여준다.
7. 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
7.1. 정의
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함한다. 일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용되는 명명법 및 기술은 당업계에 널리 공지되고 일반적으로 사용된다. 본 발명의 방법 및 기술은 일반적으로 당업계에 잘 알려진 통상적인 방법에 따라, 그리고 달리 지시되지 않는 한 본 명세서 전체에 걸쳐 인용 및 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)], 문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992)], 및 문헌[Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)]을 참조한다. 효소 반응 및 정제 기술은 당업계에서 일반적으로 달성되거나 본원에 기재된 바와 같이 제조자가 지정한 대로 수행된다. 본원에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학, 의약 및 약학 화학과 관련하여 사용되는 용어, 실험실 절차 및 기술은 당업계에 잘 알려져 있고 일반적으로 사용되는 것들이다. 표준 기술은 화학 합성, 화학 분석, 약제 준비, 제형 및 전달, 환자 치료에 사용할 수 있다.
달리 명시되지 않는 한 하기 용어는 하기와 같은 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다:
용어 "면역글로불린"은 일반적으로 두 쌍의 폴리펩티드 사슬, 즉 한 쌍의 경쇄(L) 및 한 쌍의 중쇄(H)를 포함하는 구조적으로 관련된 단백질 부류를 지칭한다. "온전한 면역글로불린"에서 이러한 4개의 사슬 모두는 이황화 결합으로 서로 연결되어 있다. 면역글로불린의 구조는 특성화가 잘 되어 있다. 예를 들어, 문헌[Paul, Fundamental Immunology 7th ed., Ch. 5 (2013) Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA]을 참고한다. 간략하게, 각각의 중쇄는 통상적으로 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역(CH)을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 통상적으로 CH1, CH2 및 CH3으로 약칭되는 3개의 도메인을 포함한다. 각각의 경쇄는 통상적으로 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 통상적으로 CL로 약칭되는 하나의 도메인을 포함한다.
용어 "재조합 폴리클로날 단백질(RPP)"은 항원 또는 에피토프, 또는 다중 항원 및 에피토프에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항원-결합 도메인을 포함하는 단백질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 항원-결합 도메인은 자연 발생 항체의 것과 유사한 특이성 및 친화도로 항원 또는 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, RPP는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, RPP는 항체로 이루어진다. 일부 실시양태에서, RPP는 기본적으로 항체로 이루어진다. 일부 실시양태에서, RPP는 대안 스캐폴드를 포함한다. 일부 실시양태에서, RPP는 대안 스캐폴드로 구성된다. 일부 실시양태에서, RPP는 기본적으로 대안 스캐폴드로 구성된다. 일부 실시양태에서, RPP는 항체 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, RPP는 항체 단편으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, RPP는 기본적으로 항체 단편으로 이루어진다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되며 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항원-결합 도메인을 포함하는 특정 유형의 면역글로불린 분자를 포함한다. 항체는 구체적으로 온전한 항체(예를 들어, 온전한 면역글로불린), 항체 단편, 및 다중-특이적 항체를 포함한다. 항원-결합 도메인의 하나의 예는 VH-VL 이량체에 의해 형성된 항원-결합 도메인이다. 항체는 한 유형의 RPP를 포함한다.
용어 "대안 스캐폴드"는 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항원-결합 도메인을 생성하기 위해 하나 이상의 영역이 다양화될 수 있는 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 항원-결합 도메인은 자연 발생 항체의 것과 유사한 특이성 및 친화도로 상기 항원 또는 에피토프에 결합한다. 예시적인 대안 스캐폴드는 피브로넥틴(예를 들어, AdnectinsTM), β-샌드위치(예를 들어, iMab), 리포칼린(예를 들어, Anticalins®), EETI-II/AGRP, BPTI/LACI-D1/ITI-D2(예를 들어, Kunitz 도메인), 티오레독신 펩티드 압타머, 단백질 A(예를 들어, Affibody®), 안키린 반복부(예를 들어, DARPins), 감마-B-크리스탈린/유비퀴틴(예를 들어, Affilins), CTLD3(예를 들어, Tetranectins), Fynomers, 및 (LDLR-A 모듈)(예를 들어, Avimers)로부터 유래된 것들을 포함한다. 대안 스캐폴드에 대한 추가적인 정보는 문헌(Binz et al., Nat. Biotechnol., 2005 23:1257-1268; Skerra, Current Opin. in Biotech., 2007 18:295-304; and Silacci et al., J. Biol. Chem., 2014, 289:14392-14398)에 제공되며, 이들 각각은 이의 전문에 참고로 포함된다. 대안 스캐폴드는 한 유형의 RPP로 구성된다.
용어 "항원-결합 도메인"은 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 부분을 의미한다.
용어 "전장 항체", "온전한 항체" 및 "전체 항체"는 자연 발생 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖고 Fc 영역을 포함하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다.
용어 "Fc 영역"은 자연 발생 항체에서 Fc 수용체 및 보체 시스템의 특정 단백질과 상호작용하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 의미한다. 다양한 면역글로불린의 Fc 영역의 구조 및 이에 포함된 글리코실화 부위는 당업계에 공지되어 있다. 전문이 참조로 포함된 문헌[Schroeder and Cavacini, J. Allergy Clin. Immunol., 2010, 125:S41-52]을 참고한다. Fc 영역은 자연 발생 Fc 영역, 또는 본 개시내용의 다른 곳에 기재된 바와 같이 변형된 Fc 영역일 수 있다.
VH 및 VL 영역은 더 보존된 영역에 산재된 초가변 영역("초가변성 영역(HVR)"은 또한 "상보성 결정 영역(CDR)"이라고도 함)으로 더 세분화될 수 있다. 더 많이 보존된 영역을 프레임워크 영역(FR)이라고 한다. 각각의 VH 및 VL은 일반적으로 하기 순서(N-말단에서 C-말단으로)로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다: FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4. CDR은 항원 결합에 관여하며 항체의 항원 특이성 및 결합 친화도에 영향을 미친다. 전문이 참조로 포함된 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest 5th ed. (1991) Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD]을 참고한다.
임의의 척추동물 종의 경쇄는 이의 불변 도메인의 서열에 따라 카파(κ) 및 람다(λ)라고 하는 두 가지 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
임의의 척추동물 종의 중쇄는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5가지 다른 부류(또는 이소타입) 중 하나로 지정될 수 있다. 이러한 부류는 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로도 지정된다. IgG 및 IgA 부류는 서열과 기능의 차이에 따라 하위 부류로 더 나뉜다. 인간은 하기 하위 부류를 발현한다: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2.
CDR의 아미노산 서열 경계는 문헌[Kabat et al., supra ("Kabat" numbering scheme)]; 문헌[Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948 ("Chothia" numbering scheme)]; 문헌[MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol. 262:732-745 ("Contact" numbering scheme)]; 문헌[Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol., 2003, 27:55-77 ("IMGT" numbering scheme)]; 및 문헌[Honegge and Pluckthun, J. Mol. Biol., 2001, 309:657-70 ("AHo" numbering scheme)]에 기재된 것들을 포함하는 공지된 넘버링 반식 중 임의의 것을 사용하여 당업에 지식을 가진 자에 의해 결정될 수 있으며, 상기 문헌은 이의 전체가 참고로 포함된다.
표 1은 Kabat 및 Chothia 방식에 의해 확인된, CDR1-L(VL의 CDR1), CDR2-L(VL의 CDR2), CDR3-L(VL의 CDR3), CDR1-H(VH의 CDR1), CDR2-H(VH의 CDR2) 및 CDR3-H(VH의 CDR3)의 위치를 제공한다. CDR1-H의 경우, Kabat 및 Chothia 넘버링 방식 둘 다를 사용하여 잔기 넘버링이 제공된다.
CDR은, www.bioinf.org.uk/abs/abnum/에서 입수 가능하고, 전문이 참조로 포함된 문헌[Abhinandan and Martin, Immunology, 2008, 45:3832-3839]에 기재된, 예를 들어 예를 들어 Abnum과 같은 항체 넘버링 소프트웨어를 사용하여 지정될 수 있다.
[표 1]
Figure pct00001
"EU 넘버링 방식"은 일반적으로 항체 중쇄 불변 영역의 잔기를 언급할 때 사용된다(예를 들어, 상기 Kabat et al.에 보고된 바와 같음).
"항체 단편"은 온전한 항체의 항원-결합 또는 가변 영역과 같은 온전한 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편은 예를 들어 Fv 단편, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, scFv(sFv) 단편, 및 scFv-Fc 단편을 포함한다.
"Fv" 단편은 하나의 중쇄 가변 도메인 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 비공유-연결된 이량체를 포함한다.
"Fab" 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 더하여 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 포함한다. Fab 단편은 예를 들어 재조합 방법에 의해 또는 전장 항체의 파파인 절단에 의해 생성될 수 있다.
"F(ab')2" 단편은 이황화 결합에 의해 힌지 영역 근처에서 연결된 두 개의 Fab' 단편을 포함한다. F(ab')2 단편은 예를 들어 재조합 방법 또는 온전한 항체의 펩신 절단에 의해 생성될 수 있다. F(ab') 단편은 예를 들어 β-머캅토에탄올로 처리하여 분리할 수 있다.
"단일쇄 Fv" 또는 "sFv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄에 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함한다. VH 및 VL은 일반적으로 펩티드 링커에 의해 연결된다. 문헌[Pluckthun A. (1994)]을 참고한다. 일부 실시양태에서, 링커는 (GGGGS)n(서열 번호: 5)이다. 일부 실시양태에서, n = 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6이다. 문헌[Antibodies from Escherichia coli. In Rosenberg M. & Moore G.P. (Eds.), The Pharmacology of Monoclonal Antibodies vol. 113 (pp. 269-315). Springer-Verlag, New York]를 참고하며, 이의 전문은 참조로 포함된다.
"scFv-Fc" 단편은 Fc 도메인에 부착된 scFv를 포함한다. 예를 들어, Fc 도메인은 scFv의 C-말단에 부착될 수 있다. Fc 도메인은 scFv에서 가변 도메인의 배향(즉, VH -VL 또는 VL -VH)에 따라 VH 또는 VL을 따를 수 있다. 당업계에 공지되어 있거나 본원에 기재된 임의의 적합한 Fc 도메인이 사용될 수 있다. 일부 경우에, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인을 포함한다.
용어 "단일 도메인 항체"는 항체의 하나의 가변 도메인이 다른 가변 도메인의 존재 없이 항원에 특이적으로 결합하는 분자를 의미한다. 단일 도메인 항체 및 이의 단편은 문헌[Arabi Ghahroudi et al., FEBS Letters, 1998, 414:521-526] 및 문헌[Muyldermans et al., Trends in Biochem. Sci., 2001, 26:230-245]에 기재되어 있으며, 이들 각각은 이의 전체가 참조로 포함된다.
"단일특이적 RPP"는 단일 에피토프에 특이적으로 결합하는 결합 부위를 포함하는 RPP이다. 단일특이성 RPP의 예는 2가이지만 각 항원-결합 도메인에서 동일한 에피토프를 인식하는 자연 발생 IgG 분자이다. 결합 특이성은 임의의 적합한 원자가로 존재할 수 있다.
"다중특이적 RPP"는 하나 이상의 에피토프에 비특이적으로 결합하는 결합 부위를 포함하는 RPP이다. 다중특이성 RPP의 예는 폐렴구균 박테리아의 다른 혈청형에 결합하는 항체 혼합물이다.
용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터의 항체를 지칭한다. 실질적으로 균질한 항체의 집단은 실질적으로 유사하고 동일한 에피토프(들)에 결합하는 항체를 포함하지만, 모노클로날 항체의 생산 중 일반적으로 발생할 수 있는 변이체는 예외이다. 이러한 변이체는 일반적으로 소량만 존재한다. 모노클로날 항체는 통상적으로 복수의 항체로부터 단일 항체의 선택을 포함하는 과정에 의해 수득된다. 예를 들어, 선택 프로세스는 하이브리도마 클론, 파지 클론, 효모 클론, 박테리아 클론 또는 기타 재조합 DNA 클론의 풀과 같은 복수의 클론으로부터 고유한 클론을 선택하는 것일 수 있다. 선택된 항체는, 예를 들어, 표적에 대한 친화도를 개선하기 위해("친화도 성숙화"), 항체를 인간화하기 위해, 세포 배양에서 이의 생산을 개선하기 위해, 및/또는 대상체에서 이의 면역원성을 감소시키기 위해 추가로 변경될 수 있다.
용어 "폴리클로날 항체"는 2개 이상의 모노클로날 항체의 혼합물을 의미한다. 폴리클로날 항체는 단일특이성 또는 다중특이성일 수 있다.
용어 "키메라 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되는 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지는 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다.
"인간화" 형태의 비인간 항체는 비인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 인간화 항체는 일반적으로 하나 이상의 CDR의 잔기가 비인간 항체(공여자 항체)의 하나 이상의 CDR의 잔기로 대체된 인간 항체(수혜자 항체)이다. 공여자 항체는 원하는 특이성, 친화성 또는 생물학적 효과를 갖는 마우스, 랫트, 토끼, 닭, 또는 비인간 영장류 항체와 같은 임의의 적합한 비인간 항체일 수 있다. 일부 예에서, 수혜자 항체의 선택된 프레임워크 영역 잔기는 공여자 항체의 상응하는 프레임워크 영역 잔기로 대체된다. 인간화 항체는 또한 수혜자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 기능을 추가로 개선하기 위해 만들어질 수 있다. 좀더 상세하게, 문헌[Jones et al., Nature, 1986, 321:522-525; Riechmann et al., Nature, 1988, 332:323-329]; 및 문헌[Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 1992, 2:593-596]을 참고하며, 이의 전문은 각각 참조로 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 것이거나, 인간 항체 레퍼토리 또는 인간 항체-코딩 서열(예를 들어, 인간 자원에서 얻거나 새로 설계된 것)을 이용하는 비인간 공급원으로부터 유래되는 것이다. 인간 항체는 특히 인간화 항체를 제외한다.
"분리된 RPP" 또는 "분리된 핵산"은 이의 자연 환경의 구성요소로부터 분리 및/또는 회수된 RPP 또는 핵산이다. 자연 환경의 구성 요소에는 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 물질이 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 분리된 RPP는 예를 들어 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 수득하기에 충분한 정도로 정제된다. 일부 실시양태에서, 분리된 RPP는 환원 또는 비환원 조건 하에 겔 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE)에 의해 균질하게 정제되고, 쿠마시 블루 또는 은 염색에 의해 검출된다. 분리된 RPP는, RPP의 자연 환경 중 적어도 하나의 구성 요소가 존재하지 않기 때문에, 재조합 세포 내에 제자리에 있는 RPP를 포함한다. 일부 양태에서, 분리된 RPP 또는 분리된 핵산은 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조된다. 일부 실시양태에서, 분리된 RPP 또는 분리된 핵산은 적어도 80 중량%, 85 중량%, 90 중량%, 95 중량%, 또는 99 중량%로 정제된다. 일부 실시양태에서, 분리된 RPP 또는 분리된 핵산은 적어도 80 부피%, 85 부피%, 90 부피%, 95 부피%, 또는 99 부피%로 정제된다. 일부 실시양태에서, 분리된 RPP 또는 분리된 핵산은 적어도 85 중량%, 90 중량%, 95 중량%, 98 중량%, 99 중량% 내지 100 중량% RPP 또는 핵산을 포함하는 용액으로 제공된다. 일부 실시양태에서, 분리된 RPP 또는 분리된 핵산은 적어도 85 부피%, 90 부피%, 95 부피%, 98 부피%, 99 부피% 내지 100 부피% RPP 또는 핵산을 포함하는 용액으로 제공된다.
"친화성"은 분자(예를 들어, RPP)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너(예를 들어, 항원 또는 에피토프) 간의 비공유 상호작용의 총계의 강도를 의미한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "친화도"는 결합 쌍의 구성원(예를 들어, RPP 및 항원 또는 에피토프) 간의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 해리 평형 상수(KD)로 나타낼 수 있다. 해리 평형 상수에 기여하는 운동 성분은 아래에 더 자세히 기재되어 있다. 친화도는 본원에 기재된 것을 포함하여 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다. 친화성은 예를 들어, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기술(예를 들어, BIACORE®) 또는 생물층 간섭계(예를 들어, FORTEBIO®)를 사용하여 결정할 수 있다.
표적 분자에 대한 RPP의 결합과 관련하여, 용어 "결합하다", "특이적 결합", "~에 특이적으로 결합한다", "~에 대해 특이적", "선택적으로 결합한다" 및 특정 항원(예를 들어, 폴리펩티드 표적) 또는 특정 항원 상의 에피토프에 "선택적"이라는 것은 비-특이적 또는 비-선택적 상호작용(예를 들어, 비-표적 분자와의)과 측정 가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은 예를 들어, 표적 분자에 대한 결합을 측정하고 이를 비표적 분자에 대한 결합과 비교함으로써 측정할 수 있다. 특이적 결합은 또한 표적 분자 상에서 인식되는 에피토프를 모방하는 대조군 분자와의 경쟁에 의해 결정될 수 있다. 이 경우, 표적 분자에 대한 RPP의 결합이 대조군 분자에 의해 경쟁적으로 억제되면 특이적 결합을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "kd"(sec-1)는 특정 ABP-항원 상호작용의 해리 속도 상수를 지칭한다. 이 값을 koff 값이라고도 한다.
본원에 사용된 용어 "ka"(M-1 x sec-1)는 특정 ABP-항원 상호작용의 결합 속도 상수를 지칭한다. 이 값을 kon 값이라고도 한다.
본원에 사용된 용어 "KD"(M)는 특정 ABP-항원 상호작용의 해리 평형 상수를 지칭한다. KD = kd/ka.
본원에 사용된 용어 "KA"(M-1)는 특정 ABP-항원 상호작용의 결합 평형 상수를 지칭한다. KA = ka/kd.
"면역접합체"는 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 RPP이다.
"효과기 기능"은 항체의 Fc 영역에 의해 매개되는 생물학적 활성을 말하며, 그 활성은 항체 이소타입에 따라 달라질 수 있다. 항체 효과기 기능의 예로는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 활성화하기 위한 C1q 결합, 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)을 활성화하기 위한 Fc 수용체 결합, 및 항체 의존성 세포 식세포작용(ADCP)이 포함된다.
2개 이상의 RPP와 관련하여 본원에 사용될 때, 용어 "~와 경쟁하다" 또는 "~와 교차 경쟁하다"는 2개 이상의 RPP가 항원(예를 들어, 폐렴구균 다당류)에 대한 결합에 대해 경쟁함을 나타낸다. 하나의 예시적인 분석에서, 폐렴구균 다당류는 표면 상에 코팅되고, 제1 폐렴구균 다당류 RPP와 접촉되고, 그 후에 제2 폐렴구균 다당류 RPP가 첨가된다. 다른 예시적인 분석에서, 제1 폐렴구균 다당류 RPP가 표면에 코팅되고, 폐렴구균 다당류와 접촉된 다음, 제2 폐렴구균 다당류 RPP가 첨가된다. 두 분석 모두에서 제1 폐렴구균 다당류 RPP의 존재가 제2 폐렴구균 다당류 RPP의 결합을 감소시키면 RPP가 경쟁한다. "~와 경쟁하다"라는 용어는 또한 한 RPP가 다른 RPP의 결합을 감소시키지만 RPP가 역순으로 추가될 때 경쟁이 관찰되지 않는 RPP의 조합을 포함한다. 그러나, 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 RPP는 이들이 첨가되는 순서에 관계없이 서로의 결합을 억제한다. 일부 실시양태에서, 하나의 RPP는 이의 항원에 대한 또 다른 RPP의 결합을 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%까지 감소시킨다. 숙련된 기술자는 폐렴구균 다당류에 대한 RPP의 친화도 및 RPP의 원자가에 기초하여 경쟁 분석에 사용되는 항체의 농도를 선택할 수 있다. 이러한 정의에 기재된 분석은 예시이며, 숙련된 기술자는 항체가 서로 경쟁하는지 여부를 결정하기 위해 임의의 적합한 분석을 사용할 수 있다. 적합한 분석은 예를 들어 문헌[Cox et al., "Immunoassay Methods," in Assay Guidance Manual [Internet], 2014년 12월 24일에 업데이트됨 (www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/; 2015년 9월 29일에 액세스됨)]; 문헌[Silman et al., Cytometry, 2001, 44:30-37]; 및 문헌[Finco et al., J. Pharm. Biomed. Anal., 2011, 54:351-358]에 기재되어 있으며, 이의 각각은 이의 전문이 참조로 포함된다.
용어 "에피토프"는 RPP에 특이적으로 결합하는 항원의 일부를 의미한다. 에피토프는 흔히 표면-접근 가능한 아미노산 잔기 및/또는 당 측쇄로 구성되며, 특정 3차원 구조적 특성과 특정 전하 특성을 가질 수 있다. 형태 및 비형태 에피토프는 변성 용매의 존재 하에 전자에 대한 결합이 손실될 수 있지만, 후자는 손실되지 않을 수 있다는 점에서 구별된다. 에피토프는 결합에 직접적으로 관여하는 아미노산 잔기, 및 결합에 직접적으로 관여하지 않는 다른 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. RPP가 결합하는 에피토프는 예를 들어, 폐렴구균 다당류 혈청형에 있어서의 RPP 결합에 대한 시험과 같은 에피토프 결정을 위한 공지된 기술을 사용하여 결정될 수 있다.
폴리펩티드 서열과 참조 서열 사이의 퍼센트 "동일성"은 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입한 후 참조 서열의 아미노산 잔기와 동일한 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN, MEGALIGN(DNASTAR), CLUSTALW, CLUSTAL OMEGA 또는 MUSCLE 소프트웨어와 같은 공개적으로 사용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 해당 기술 분야의 기술 범위 내에서 다양한 방식으로 획득할 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열을 정렬하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다.
"보존적 치환" 또는 "보존적 아미노산 치환"은 아미노산이 화학적으로 또는 기능적으로 유사한 아미노산으로 치환되는 것을 지칭한다. 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 표 2 내지 표 4에 제공된 아미노산 그룹은 일부 실시양태에서 서로에 대한 보존적 치환으로 간주된다.
[표 2]
Figure pct00002
[표 3]
Figure pct00003
[표 4]
Figure pct00004
추가적인 보존적 치환은 예를 들어, 문헌[Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties 2nd ed. (1993) W. H. Freeman & Co., New York, NY]에서 찾을 수 있다. 모 RPP에서 아미노산 잔기의 하나 이상의 보존적 치환을 만들어 생성된 RPP를 "보존적으로 변형된 변이체"라고 한다.
용어 "치료하는"(및 "치료하다" 또는 "치료"와 같은 이의 변형)은 이를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 병태의 자연적 경과를 변경하려는 시도에서의 임상적 개입을 지칭한다. 치료는 예방과 임상 병리 과정 모두에서 수행할 수 있다. 치료의 바람직한 효과에는 질병의 발생 또는 재발 방지, 증상 완화, 질병의 직간접적 병리학적 결과의 감소, 전이 예방, 질병 진행 속도 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 완화 또는 개선된 예후가 포함된다.
본원에 사용된 용어 "치료적 유효량" 또는 "유효량"은 대상체에게 투여될 때 질환 또는 질병을 치료하는 데 효과적인 본원에 제공된 RPP 또는 약학적 조성물의 양을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 포유동물 대상체를 의미한다. 예시적인 대상체는 인간, 원숭이, 개, 고양이, 생쥐, 랫트, 소, 말, 낙타, 염소, 토끼 및 양을 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서 대상체는 본원에 제공된 RPP로 치료될 수 있는 질환 또는 병태를 갖는다. 일부 양태에서, 질환 또는 병태는 암이다. 일부 양태에서, 질환 또는 병태는 바이러스 감염이다.
"패키지 삽입물"이라는 용어는 적응증, 사용법, 용량, 투여, 병용 요법, 치료 또는 진단 제품의 사용에 관한 금기 사항 및/또는 경고에 대한 정보를 포함하는, 치료 또는 진단 제품(예를 들면, 키트)의 상용 패키지에 관례적으로 포함되는 지침을 나타내는 데 사용된다.
본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다.
"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화합물을 의미한다. 화학요법제는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 작용을 하는 "항호르몬제" 또는 "내분비 치료제"를 포함한다.
용어 "세포증식억제제"는 시험관 내 또는 생체 내에서 세포의 성장을 정지시키는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 세포증식억제제는 S기에서 세포의 백분율을 감소시키는 제제이다. 일부 실시양태에서, 세포증식억제제는 S기에서 세포의 백분율을 약 20% 이상, 약 40% 이상, 약 60% 이상, 또는 약 80% 이상 감소시킨다.
용어 "종양"은 악성이든 양성이든 모든 신생 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. "암", "암성", "세포 증식성 질병", "증식성 질병" 및 "종양"이라는 용어는 본원에 언급된 바와 같이 상호 배타적이지 않다. 용어 "세포 증식성 질병" 및 "증식성 질병"은 어느 정도의 비정상적인 세포 증식과 관련된 질병을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 세포 증식성 장애는 암이다.
용어 "약학적 조성물"은 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 대상체를 치료하는 데 효과적일 수 있는 형태이고, 대상체에게 허용할 수 없을 정도로 독성이 있는 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 의미한다.
용어 "조절하다" 및 "조절"은 인용된 변수를 감소 또는 억제하거나 대안적으로 활성화 또는 증가시키는 것을 지칭한다.
"증가" 및 "활성화"라는 용어는 인용된 변수에서 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배 또는 그 이상의 증가를 지칭한다.
용어 "감소" 및 "억제"는 인용된 변수에서 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배 또는 그 이상의 감소를 지칭한다.
"작용하다"라는 용어는 수용체의 활성화와 관련된 생물학적 반응을 유도하기 위한 수용체 신호전달의 활성화를 지칭한다. "작용제"는 수용체에 결합하여 작용하는 실체이다.
용어 "길항하다"는 수용체의 활성화와 관련된 생물학적 반응을 억제하기 위한 수용체 신호전달의 억제를 지칭한다. "길항제"는 수용체에 결합하고 이를 길항하는 실체이다.
용어 "효과기 T 세포"는 T 헬퍼(즉, CD4+) 세포 및 세포독성(즉, CD8+) T 세포를 포함한다. CD4+ 효과기 T 세포는 B 세포의 형질세포 및 기억 B 세포로의 성숙, 세포독성 T 세포 및 대식세포의 활성화를 비롯한 여러 면역학적 과정의 발달에 기여한다. CD8+ 효과기 T 세포는 바이러스에 감염된 세포와 종양 세포를 파괴한다. 효과기 T 세포에 대한 추가 정보는, 이의 전문이 참조로 포함된, 문헌[Seder and Ahmed, Nature Immunol., 2003, 4:835-842]을 참고한다.
"조절 T 세포"라는 용어는 예를 들어 효과기 T 세포를 억제함으로써 면역학적 관용을 조절하는 세포를 포함한다. 일부 양태에서, 조절 T 세포는 CD4+CD25+Foxp3+ 표현형을 갖는다. 일부 양태에서, 조절 T 세포는 CD8+CD25+ 표현형을 갖는다. 조절 T 세포에 대한 추가 정보는, 이의 전문이 참조로 포함된, 문헌[Nocentini et al., Br. J. Pharmacol., 2012, 165:2089-2099]을 참고한다.
"수지상 세포"라는 용어는 나이브 T 세포를 활성화하고 B 세포의 성장 및 분화를 자극할 수 있는 전문 항원 제시 세포를 의미한다.
"형질세포"라는 용어는 많은 양의 항체를 분비하는 백혈구를 의미한다. 이들은 혈장과 림프계에 의해 운반된다. B 세포(예를 들어, 배 중심 나이브 B 세포 또는 기억 B 세포)는 전구체 B 세포의 수용체를 따라 밀접하게 모델링된 항체 분자를 생성하는 형질세포로 분화된다. 이러한 항체 분자는 일단 혈액과 림프로 방출되면 표적 항원(이물질)에 결합하여 이의 중화 또는 파괴를 시작한다. 말단 분화 형질세포는 상대적으로 적은 수의 표면 항원을 발현하고, CD19 및 CD20과 같은 일반적인 범-B 세포 마커를 발현하지 않는다. 대신, CD138, CD78 및 인터루킨-6 수용체의 추가 발현에 의한 유세포 분석을 통해 형질세포가 식별된다. 인간에서, CD27은 형질세포에 대한 좋은 마커이고, 나이브 B 세포는 CD27-이고, 기억 B 세포는 CD27+이고, 형질세포는 CD27++이다. 표면 항원 CD138(신데칸-1)은 높은 수준으로 발현된다. 또 다른 중요한 표면 항원은 CD319(SLAMF7)이다. 이 항원은 정상 인간 형질세포에서 높은 수준으로 발현된다. 또한 다발성 골수종의 악성 형질세포에서도 발현된다. 생체 외에서 빠르게 사라지는 CD138과 비교하여 CD319의 발현은 훨씬 더 안정적이다.
"형질모세포"라는 용어는 항원 자극시 기억 B 세포와 같은 활성화된 B 세포로부터 분화되는 말초 혈액 내의 항체-분비 세포를 지칭한다. 형질세포 계통으로 간주되는 가장 미성숙한 혈액 세포는 형질모세포이다. 형질모세포는 B 세포보다 더 많은 항체를 분비하지만, 형질세포보다는 적게 분비한다. 이들은 빠르게 분열하고, 여전히 항원을 내재화하고 세포에 제시할 수 있다. 세포는 며칠 동안 이 상태에 머물다가, 죽거나 완전히 분화된 성숙한 형질세포로 돌이킬 수 없게 분화할 수 있다. 성숙한 B 세포의 형질세포로의 분화는 전사 인자 Blimp-1/PRDM1 및 IRF4에 따라 달라진다.
"기억 B 세포"라는 용어는 1차 감염 후 배 중심 내에서 형성되는 B 세포 하위 유형을 말하며, 재감염의 경우 가속화되고 보다 강력한 항체 매개 면역 반응을 생성하는 데 중요한다(2차 면역 반응으로 알려져 있음). 기억 B 세포는 특정 항원에 의해 활성화될 때까지 항체를 분비하지 않는다.
"나이브 B 세포"라는 용어는 항원에 노출되지 않은 B 세포를 의미한다. 일단 항원에 노출되면, 나이브 B 세포는 기억 B 세포가 되거나 원래 결합된 항원에 특이적인 항체를 분비하는 형질세포가 된다. 형질세포는 순환에서 오래 지속되지 않으며, 이것은 매우 오랜 기간 동안 지속되는 기억 세포와 대조된다.
"역가"라는 용어는 여전히 긍정적인 결과를 제공하는 최대 희석(연속 희석)의 역수로 표현되는 특정 에피토프 또는 항원을 인식하는 유기체가 생산하는 항체의 양을 측정한 것이다. 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)은 항체 역가를 결정하는 일반적인 수단이다.
"말초 혈액"이라는 용어는 말초 혈관을 통해 이동하는 혈액을 의미한다. 말초 혈액은 일반적으로 정맥천자(정맥절개라고도 함) 또는 소량의 경우 손가락을 찔러 채취한다.
"백신"이라는 용어는 신체의 면역 체계를 자극하여 제제를 위협으로 인식하고, 파괴하며, 미래에 마주칠 수 있는 해당 제제와 관련된 미생물을 추가로 인식하고 파괴하는 제제를 의미한다. 백신이라는 용어는 특정 질병에 대한 능동적 획득 면역을 제공하는 생물학적 제제를 의미할 수 있다. 백신에는 종종 질병을 유발하는 미생물과 유사한 물질이 포함되어 있으며 종종 약화되거나 사멸된 형태의 미생물, 독소 또는 표면 단백질 중 하나로 만들어진다. 백신은 예방적(예를 들어, 자연 또는 "야생" 병원체에 의한 미래 감염의 영향을 예방 또는 개선하기 위해) 또는 치료적(예를 들면, 암에 대한 백신이 조사 중임)일 수 있다. 보다 일반적으로, 용어 백신은 면역 반응을 유도하는 모든 제제를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 암 세포를 사용하여 특정 암 항원에 대해 개인에게 백신을 접종할 수 있다. 일부 백신에는 화학 물질, 열 또는 방사선으로 파괴된, 비활성화되었지만 이전에 독성이 있었던 미생물이 포함되어 있다. 예를 들면 소아마비 백신, A형 간염 백신, 광견병 백신 및 일부 인플루엔자 백신이 포함된다. 일부 백신에는 살아있는 약독화 미생물이 포함되어 있다. 이들 중 다수는 독성 특성을 비활성화하거나 밀접하게 관련되어 있지만 덜 위험한 유기체를 사용하여 광범위한 면역 반응을 생성하는 조건에서 배양된 활성 바이러스이다. 대부분의 약독화 백신은 바이러스성이지만, 일부는 본질적으로 박테리아성이다. 예로는 바이러스성 질병 황열병, 홍역, 볼거리, 풍진과 세균성 질병 장티푸스가 포함된다. Calmette와 Guerin이 개발한 결핵균 생백신은 전염성 균주로 만들어지지 않았지만, 백신에 대한 면역 반응을 유도하는 데 사용되는 "BCG"라고 하는 악성 변형 균주를 포함한다. 페스트균(Yersinia pestis) EV 균주를 포함하는 약독화 생백신은 전염병 예방접종에 사용된다. 약독화 백신에는 몇 가지 장점과 단점이 있다. 이들은 일반적으로 더 내구성 있는 면역학적 반응을 유발하며, 건강한 성인에게 선호되는 유형이다. 그러나 면역이 저하된 개인에게 사용하기에 안전하지 않을 수 있으며, 드물게 독성 형태로 돌연변이되어 질병을 일으킬 수 있다. 톡소이드 백신은 미생물이 아닌 질병을 유발하는 비활성화된 독성 화합물로 만들어진다. 톡소이드 기반 백신의 예로는 파상풍과 디프테리아가 포함된다. 톡소이드 백신은 이들의 효능으로 알려져 있다. 모든 톡소이드가 미생물을 위한 것은 아니며, 예를 들어, Crotalus atrox 톡소이드는 개에게 방울뱀에 물리지 않도록 예방 접종을 하는 데 사용된다. 단백질 하위유닛 백신에서, 비활성화되거나 약화된 미생물을 면역계에 도입하는 것보다("전체 작용제" 백신을 구성함), 이의 단편이 면역 반응을 일으킬 수 있다. 예로는 바이러스의 표면 단백질로만 구성된 B형 간염 바이러스에 대한 하위유닛 백신(이전에는 만성 감염 환자의 혈청에서 추출했지만 지금은 바이러스 유전자를 효모로 재조합하여 생산함) 또는 식용 조류 백신으로서, 바이러스 주요 캡시드 단백질, 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제 하위유닛으로 구성된 인유두종바이러스(HPV)에 대한 바이러스-유사 입자(VLP) 백신을 포함한다. 접합 백신의 경우, 특정 박테리아에는 면역원성이 낮은 다당류 외피가 있다. 이러한 외부 코트를 단백질(예를 들어, 독소)에 연결함으로써 면역계가 다당류를 마치 단백질 항원인 것처럼 인식하도록 할 수 있다. 이러한 접근법은 헤모필루스 인플루엔자 B형 백신에 사용된다. 수지상 세포 백신은 수지상 세포와 항원을 결합하여 항원을 신체의 백혈구에 제시함으로써 면역 반응을 자극한다. 이러한 백신은 뇌종양 치료에 대한 몇 가지 긍정적인 예비 결과를 보여주었고, 악성 흑색종에서도 시험되었다. 재조합 벡터 백신의 경우 한 미생물의 생리와 다른 미생물의 DNA를 결합하여 복잡한 감염 과정을 갖는 질병에 대한 면역을 생성할 수 있다. 2018년 콩고에서 에볼라 퇴치를 위해 사용되고 있는 Merck에 허가된 RVSV-ZEBOV 백신이 그 예이다. 감염원의 DNA에서 생성된, DNA 백신접종이라 불리는 백신 접종에 대한 대안적이고 실험적인 접근 방식이 개발 중이다. 제안된 메커니즘은 바이러스 또는 박테리아 DNA를 인간 또는 동물 세포에 삽입(및 전기천공법을 사용하여 면역 시스템 인식을 촉발함으로써 강화된 발현)하는 것이다. 발현된 단백질을 인식하는 면역계의 일부 세포는 이러한 단백질과 이를 발현하는 세포에 대한 공격을 시작할 것이다. 이러한 세포는 매우 오래 살기 때문에, 이러한 단백질을 정상적으로 발현하는 병원체를 나중에 만나면 즉시 면역계의 공격을 받게 된다. DNA 백신의 잠재적인 이점 중 하나는 생산 및 저장이 매우 쉽다는 것이다. 백신은 1가(일기능성이라고도 함) 또는 다가(다기능성이라고도 함)일 수 있다. 1가 백신은 단일 항원 또는 단일 미생물에 대해 면역화하도록 설계되었다. 다가 또는 다기능성 백신은 동일한 미생물의 2개 이상의 균주 또는 2개 이상의 미생물에 대해 면역화하도록 설계되었다. 다가 백신의 원자가는 그리스어 또는 라틴어 접두사로 표시될 수 있다(예를 들면, 4가 또는 4기능성). 어떤 경우에는 강력한 면역 반응을 빠르게 발달시키기 위해 1가 백신이 더 나을 수 있다.
"과면역"이라는 용어는, 특정 유기체 또는 항원에 대한 항체 역가가 높은 공여자의 혈장에서 제조된다는 점을 제외하고는, 정맥 면역글로불린(IVIg)과 유사한 폴리클로날 항체 제제를 의미한다. 과면역이라는 용어는 종종 "과면역 감마글로불린" 및 "과면역 글로불린"이라는 용어와 같은 의미로 사용된다. 과면역 글로불린을 사용할 수 있는 일부 약제에는 B형 간염, 광견병, 파상풍 독소, 수두 대상포진 등이 있다. 과면역 글로불린의 투여는 약제에 대해 환자에게 "수동적" 면역을 제공한다. 이것은 "능동" 면역을 제공하는 백신과 대조적이다. 그러나 백신은 그 목적을 달성하는 데 훨씬 더 오랜 시간이 걸리는 반면, 과면역 글로불린은 즉각적인 "수동적" 단기 면역을 제공한다.
"생체 내(in vivo)"라는 용어는 "살아있는 것 내에서"으로 번역되며, 다양한 생물학적 개체의 효과가 조직 추출물이나 죽은 유기체와는 대조적으로, 전체, 살아있는 유기체 또는 세포, 일반적으로 인간을 포함한 동물 및 식물에 대해 시험되는 과학적 연구를 나타낸다. 이것은 시험관 내("유리 내"), 즉 시험관, 페트리 접시 등을 사용하는 실험실 환경에서 수행된 실험과 혼동되어서는 안 된다. 생체 내 조사의 예는 하기와 같다: 세균 감염의 효과와 정제된 세균 독소의 효과를 비교한 질병의 발병기전; 비항생제, 항바이러스제, 신약 개발 전반; 및 새로운 수술 절차. 결과적으로 동물 실험과 임상 실험은 생체 내 연구의 주요 요소이다. 생체 내 시험은 살아있는 대상에 대한 실험의 전반적인 효과를 관찰하는 데 더 적합하기 때문에 시험관 내 시험보다 자주 사용된다.
"활성"이라는 용어는 항원, 백신, 단백질, 에피토프, 세포, 박테리아 또는 바이러스에 대한 RPP 또는 항체의 정량적 측정을 의미한다. 활성은 생체 내 또는 시험관 내 방법을 사용하여 평가할 수 있다.
"재조합체"라는 용어는 살아있는 세포 내에서 재조합 DNA의 발현으로부터 생성된 단백질을 지칭한다. 재조합 DNA는 적어도 두 개의 별도 DNA 세그먼트의 조합에 의해 생성된 DNA 조각의 일반적 명칭이다.
"시험관 내"라는 용어는 "유리 내"로 번역되며, 미생물, 세포 또는 생물학적 분자로 정상적인 생물학적 맥락을 벗어나 수행되는 과학적 연구를 나타낸다. 구어체로 "시험관 실험"이라고 하는 이러한 생물학 및 하위 분야의 연구는 전통적으로 시험관, 플라스크, 페트리 접시 및 미세역가 플레이트와 같은 실험실 도구에서 수행된다. 일반적인 생물학적 환경에서 분리된 유기체의 구성 요소를 사용하여 수행된 연구는 전체 유기체로 수행할 수 있는 것보다 더 자세하고 편리한 분석을 허용하지만, 시험관 내 실험에서 얻은 결과는 전체 유기체에 미치는 영향을 완전히 또는 정확하게 예측하지 못할 수 있다. 시험관 내 실험과 달리 생체 내 연구는 인간을 포함한 동물과 전체 식물에서 수행되는 연구이다.
"중화"라는 용어는 표적 세포에 들어가는 데 사용하는 바이러스의 부위(들)를 차단하는 특정 항체의 능력을 나타낸다. 중화 항체의 효과는 이 항원에 대한 특이성이 결여된 경우 항체 생산이 과도하더라도 무시할 수 있다. 특정 항체의 생산은 다음 설명에 있어서 더 빠른 반응을 위해 학습될 수 있다. 상동성 감염원의 감소 또는 파괴는 부분적이거나 완전할 수 있으며, 더 이상 다른 세포에 감염되거나 병원성을 갖지 않도록 할 수 있다.
폴리펩티드(예를 들어, 항체)의 "변이체"는 하나 이상의 아미노산 잔기가 천연 폴리펩티드 서열에 비해 아미노산 서열 내로 삽입, 결실 및/또는 치환된 아미노산 서열을 포함하고, 기본적으로 천연 폴리펩티드와 동일한 생물학적 활성을 보유한다. 폴리펩티드의 생물학적 활성은 당업계의 표준 기술을 사용하여 측정될 수 있다(예를 들어, 변이체가 항체인 경우, 이의 활성은 본원에 기재된 바와 같이 결합 검정에 의해 시험될 수 있음). 본 발명의 변이체는 단편, 유사체, 재조합 폴리펩티드, 합성 폴리펩티드, 및/또는 융합 단백질을 포함한다.
폴리펩티드의 "유도체"는 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 알부민(예를 들어, 인간 혈청 알부민), 인산화, 및 글리코실화와 같은 다른 화학적 부분에 결합하여 화학적으로 변형되는 폴리펩티드(예를 들어, 항체)이다. 달리 명시되지 않는 한, 용어 "항체"는 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄를 포함하는 항체 이외에 이의 유도체, 변이체, 단편 및 뮤테인을 포함하며, 이들의 예는 하기에 기재되어 있다.
조절 서열이 뉴클레오티드 서열의 발현(예를 들어, 발현 수준, 시기 또는 위치)에 영향을 미치는 경우, 뉴클레오티드 서열은 조절 서열에 "작동 가능하게 연결"된다. "조절 서열"은 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현(예를 들어, 발현 수준, 시기 또는 위치)에 영향을 미치는 핵산이다. 예를 들어, 조절 서열은 조절된 핵산에 직접적으로 또는 하나 이상의 다른 분자(예를 들어, 조절 서열 및/또는 핵산에 결합하는 폴리펩티드)의 작용을 통해 효과를 발휘할 수 있다. 조절 서열의 예로는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 조절 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)가 포함된다. 조절 서열의 추가 예는 예를 들어 문헌[Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA] 및 문헌[Baron et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06]에 기재되어 있다.
"숙주 세포"는 핵산, 예를 들어, 본 발명의 핵산을 발현하는 데 사용될 수 있는 세포이다. 숙주 세포는 원핵생물, 예를 들어, E. coli일 수 있거나, 진핵생물, 예를 들어 단세포 진핵생물(예를 들어, 효모 또는 기타 진균), 식물 세포(예를 들어, 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포(예를 들어, 인간 세포, 원숭이 세포, 햄스터 세포, 랫트 세포, 마우스 세포, 또는 곤충 세포) 또는 하이브리도마일 수 있다. 숙주 세포의 예로는 CS-9 세포, 원숭이 신장 세포의 COS-7 라인(ATCC CRL 1651)(문헌[Gluzman et al., 1981, Cell 23:175] 참조), L 세포, C127 세포, 3T3 세포(ATCC CCL 163), 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 이들의 유도체, 예를 들어 Veggie CHO 및 무혈청 배지에서 성장하는 관련 세포주(문헌[Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31] 참조), HeLa 세포, BHK(ATCC CRL 10) 세포주, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주 CV1에서 유래된 CV1/EBNA 세포주(ATCC CCL 70)(문헌[McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821] 참조), 293, 293 EBNA 또는 MSR 293과 같은 인간 배아 신장 세포, 인간 표피 A431 세포, 인간 Colo205 세포, 기타 형질전환된 영장류 세포주, 정상 이배체 세포, 1차 조직, 1차 외식편, HL-60, U937, HaK 또는 Jurkat 세포의 시험관 내 배양에서 유래된 세포 균주를 포함한다. 통상적으로, 숙주 세포는 이후 숙주 세포에서 발현될 수 있는 폴리펩티드-코딩 핵산으로 형질전환되거나 형질감염될 수 있는 배양된 세포이다.
"재조합 숙주 세포"라는 어구는 발현될 핵산으로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포를 나타내기 위해 사용될 수 있다. 숙주 세포는 또한 핵산을 포함하지만 조절 서열이 핵산과 작동 가능하게 연결되도록 숙주 세포 내로 도입되지 않는 한 원하는 수준으로 이를 발현하지 않는 세포일 수 있다. 용어 숙주 세포는 특정 대상체 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭하는 것으로 이해된다. 예를 들어 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 특정 변형이 후속 세대에서 발생할 수 있기 때문에 이러한 자손은 실제로 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만 여전히 본원에 사용된 용어의 범위 내에 포함된다.
7.2. 기타 해석상의 규칙
본원에 인용된 범위는 인용된 종점을 포함하는 범위 내의 모든 값에 대한 약칭으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 및 50로 구성된 그룹의 임의의 수, 숫자의 조합 또는 하위 범위를 포함하는 것으로 이해된다.
달리 지시되지 않는 한, 하나 이상의 입체중심을 갖는 화합물에 대한 언급은 각각의 입체이성질체 및 이의 입체이성질체의 모든 조합을 의미한다.
7.3. RPP 및 RPP 라이브러리
본원에 기술된 RPP 라이브러리의 각 구성원은 항원에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드, 예를 들어 항체 또는 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, RPP는 본원에 개시된 중쇄 및 경쇄 CDR3 서열의 동족 쌍을 포함한다. 일부 실시양태에서 RPP는 scFv이다. 일부 실시양태에서 RPP는 전장 항체이다.
일부 실시양태에서, RPP는 항체 단편이다. Fab 단편은 VL, VH, CL 및 CH1 도메인을 갖는 1가 단편이고; F(ab')2 단편은 힌지 영역에서 이황화 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 갖는 2가 단편이고; Fd 단편은 VH 및 CH1 도메인을 갖고; Fv 단편은 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인을 갖고; dAb 단편은 VH 도메인, VL 도메인, 또는 VH 또는 VL 도메인의 항원 결합 단편을 갖는다(미국 특허 번호 제6,846,634호, 제6,696,245호, 미국 특허 공개 번호 제05/0202512호, 제04/0202995호, 제04/0038291호, 제04/0009507호, 제03/0039958호, 문헌[Ward et al., Nature 341:544-546, 1989]).
자연 발생 면역글로불린 사슬은 상보성 결정 영역 또는 CDR이라고도 하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 상대적으로 보존된 프레임워크 영역(FR)의 동일한 일반 구조를 나타낸다. N-말단에서 C-말단까지, 경쇄 및 중쇄 둘 다 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각 도메인에 대한 아미노산 할당은 문헌[Kabat et al. in Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991]에서 정의된 것에 따른다.
"완전한 인간 항체"로도 지칭되는 용어 "인간 항체"는 인간 면역글로불린 서열로부터 유래된 하나 이상의 가변 및 불변 영역을 갖는 모든 항체를 포함한다. 일 실시양태에서, 모든 가변 및 불변 도메인은 인간 면역글로불린 서열(완전한 인간 항체)로부터 유래된다. 이들 항체는 인간 중쇄 및/또는 경쇄-코딩 유전자로부터 유래된 항체를 발현하도록 유전적으로 변형된 마우스의 관심 항원으로의 면역화를 통한 것을 포함하여, 다양한 방식으로 제조될 수 있으며, 이의 예는 하기에 기재되어 있다.
인간화 항체는, 인간화 항체가 면역 반응을 유도할 가능성이 적고/적거나 인간 대상체에 투여될 때 비-인간 종 항체와 비교하여 덜 심각한 면역 반응을 유도하도록 비-인간 종으로부터 유래된 항체의 서열과 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 부가에 의해 상이한 서열을 가진다. 일 실시양태에서, 비-인간 종 항체의 중쇄 및/또는 경쇄의 프레임워크 및 불변 도메인 내의 특정 아미노산이 돌연변이되어 인간화 항체를 생성한다. 또 다른 실시양태에서, 인간 항체로부터의 불변 도메인(들)은 비-인간 종의 가변 도메인(들)에 융합된다. 또 다른 실시양태에서, 비-인간 항체의 하나 이상의 CDR 서열 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 인간 대상체에게 투여될 때 비-인간 항체의 가능한 면역원성을 감소시키기 위해 변경되며, 여기서 변경된 아미노산 잔기는, 항원에 대한 인간화 항체의 결합이 비-인간 항체의 항원에 대한 결합보다 유의하게 나쁘지 않도록, 이의 항원에 대한 항체의 면역특이적 결합에 중요하지 않거나, 생성된 아미노산 서열에 대한 변화가 보존적 변화이다. 인간화 항체를 만드는 방법의 예는 미국 특허 번호 제6,054,297호, 제5,886,152호 및 제5,877,293호에서 찾을 수 있다.
항체의 단편 또는 유사체는 본 명세서의 교시에 따라 당업계에 널리 공지된 기술을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 단편 또는 유사체의 바람직한 아미노- 및 카르복시-말단은 기능적 도메인의 경계 근처에서 발생한다. 구조적 및 기능적 도메인은 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열 데이터를 공개 또는 독점 서열 데이터베이스와 비교하여 식별할 수 있다. 알려진 구조 및/또는 기능의 다른 단백질에서 발생하는 서열 모티프 또는 예측된 단백질 형태 도메인을 컴퓨터화된 비교 방법을 사용하여 확인할 수 있다. 알려진 3차원 구조로 접히는 단백질 서열을 확인하는 방법이 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Bowie et al., 1991, Science 253:164]을 참조한다.
RPP는 또한 합성 또는 유전적으로 조작된 단백질일 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 경쇄 가변 영역으로 구성된 분리된 단편, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역으로 구성된 "Fv" 단편, 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩티드 링커에 의해 연결된 재조합 단일 사슬 폴리펩티드 분자(scFv 단백질)를 포함한다.
항체 단편의 또 다른 형태는 항체의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 펩티드이다. CDR("최소 인식 단위" 또는 "초가변 영역"으로도 지칭됨)은 공유적으로 또는 비공유적으로 분자에 통합되어 이를 항원 결합 단백질로 만들 수 있다. CDR은 관심 대상의 CDR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 작제함으로써 얻을 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 항체 생성 세포의 mRNA를 주형으로 사용하여 가변 영역을 합성하기 위해 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 제조된다(예를 들어, 문헌[Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991]; 문헌[Courtenay Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), page 166 (Cambridge University Press 1995)]; 및 문헌[Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (eds.), page 137 (Wiley Liss, Inc. 1995)] 참조).
RPP의 가변 영역 도메인은 임의의 자연 발생 가변 도메인 또는 이의 조작된 버전일 수 있다. 조작된 버전은 재조합 DNA 조작 기술을 사용하여 생성된 가변 영역 도메인을 의미한다. 이러한 조작된 버전은 예를 들어, 특정 항체의 아미노산 서열에 또는 이에 대한 삽입, 결실 또는 변경에 의해 특정 항체 가변 영역으로부터 생성된 것들을 포함한다. 특정 예는 제1 항체로부터의 하나 이상의 CDR 및 선택적으로 하나 이상의 프레임워크 아미노산 및 제2 항체로부터의 가변 영역 도메인의 나머지를 함유하는 조작된 가변 영역 도메인을 포함한다.
가변 영역 도메인은 C 말단 아미노산에서 적어도 하나의 다른 항체 도메인 또는 이의 단편에 공유적으로 부착될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 가변 영역 도메인에 존재하는 VH 도메인은 면역글로불린 CH1 도메인 또는 이의 단편에 연결될 수 있다. 유사하게, VL 도메인은 CK 도메인 또는 이의 단편에 연결될 수 있다. 이러한 방식으로, 예를 들어, 항체는 항원 결합 도메인이 각각의 C 말단에서 CH1 및 CK 도메인에 공유 연결된 관련 VH 및 VL 도메인을 함유하는 Fab 단편일 수 있다. CH1 도메인은 예를 들어 Fab' 단편에서 발견되는 힌지 영역 또는 힌지 영역 도메인의 일부를 제공하거나, 항체 CH2 및 CH3 도메인과 같은 추가 도메인을 제공하기 위해 추가 아미노산으로 확장될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, RPP는 본원에 기재된 중쇄 및 경쇄 CDR3 서열의 동족 쌍을 포함한다. 예를 들어, CDR은 공지된 항체 프레임워크 영역(IgG1, IgG2 등)에 통합되거나, 이의 반감기를 강화시키기 위해 적합한 비히클에 접합될 수 있다. 적합한 비히클은 Fc, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 알부민, 트랜스페린 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 이들 및 다른 적합한 비히클은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 접합된 CDR 펩티드는 단량체, 이량체, 사량체 또는 기타 형태일 수 있다. 일 실시양태에서, 하나 이상의 수용성 중합체는 결합제의 하나 이상의 특정 위치, 예를 들어 아미노 말단에서 결합된다.
특정 실시양태에서, RPP의 항체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 글리콜, 또는 폴리프로필렌 글리콜을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 수용성 중합체 부착물을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제4,640,835호, 제4,496,689호, 제4,301,144호, 제4,670,417호, 제4,791,192호 및 제4,179,337호를 참조한다. 특정 실시양태에서, 유도체 결합제는 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜, 덱스트란, 셀룰로오스, 또는 기타 탄수화물-기반 중합체, 폴리-(N-비닐 피롤리돈)-폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올(예를 들어, 글리세롤) 및 폴리비닐 알코올, 뿐만 아니라 이러한 중합체의 혼합물 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 수용성 중합체는 하나 이상의 측쇄에 무작위로 부착된다. 특정 실시양태에서, PEG는 항체와 같은 결합제에 대한 치료 능력을 개선하는 작용을 할 수 있다. 이러한 특정 방법은 예를 들어 미국 특허 번호 제6,133,426호에 기술되어 있으며, 이는 어떤 목적으로든 참고로 여기에 포함된다.
RPP는 예를 들어, 자연 발생 면역글로불린의 구조를 가질 수 있다. "면역글로불린"은 사량체 분자이다. 자연 발생 면역글로불린에서, 각각의 사량체는 2개의 동일한 폴리펩티드 사슬 쌍으로 구성되며, 각 쌍은 하나의 "경쇄"(약 25 kDa)와 하나의 "중쇄"(약 50 내지 70 kDa)를 갖는다. 각 사슬의 아미노 말단 부분은 항원 인식을 주로 담당하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각 사슬의 카르복시 말단 부분은 주로 효과기 기능을 담당하는 불변 영역을 정의한다. 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 중쇄는 뮤, 델타, 감마, 알파 또는 엡실론으로 분류되며, 항체의 이소타입은 각각 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 정의된다. 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되며, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 일반적으로 문헌[Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))]을 참조한다(그 전문은 참조로서 본원에 포함됨). 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 온전한 면역글로불린이 2개의 결합 부위를 갖도록 항체 결합 부위를 형성한다.
다른 RPP는 질병 표적의 다른 영역에 결합하거나, 다른 작용 기전에 의해 작용할 수 있다. 본원에서 특히 지시된 바와 같이, 도메인 영역은 달리 지시되지 않는 한 그룹을 포함하도록 지정된다. 예를 들어, 아미노산 4 내지 12는 9개의 아미노산, 즉 4번과 12번 위치의 아미노산과 서열의 7개 개재 아미노산을 나타낸다. 다른 예에는 이의 표적 세포에 대한 병원체의 결합, 즉 중화 활성을 억제하는 항원 결합 단백질이 포함된다. 항원 결합 단백질은 본 발명에서 사용하기 위해 표적 세포에 대한 결합을 완전히 억제할 필요가 없다.
본원에 기재된 RPP는 FC 영역, 예를 들어 이량체 Fc 폴리펩티드를 포함할 수 있다. PCT 출원 WO 93/10151(본원에 참조로 포함됨)에 기재된 하나의 적합한 Fc 폴리펩티드는 인간 IgG1 항체의 Fc 영역의 N-말단 힌지 영역에서 천연 C-말단까지 연장되는 단일 사슬 폴리펩티드이다. 또 다른 유용한 Fc 폴리펩티드는 미국 특허 제5,457,035호 및 문헌[Baum et al., 1994, EMBO J. 13:3992-4001]에 기재된 Fc 뮤테인이다. 이 뮤테인의 아미노산 서열은 19번 아미노산이 Leu에서 Ala로, 20번 아미노산이 Leu에서 Glu로, 22번 아미노산이 Gly에서 Ala로 변경된 것을 제외하고, WO 93/10151에서 나타낸 천연 Fc 서열의 것과 동일하다. 뮤테인은 Fc 수용체에 대해 감소된 친화력을 나타낸다.
본 발명의 RPP의 항원-결합 단편은 통상적인 기술에 의해 생성될 수 있다. 이러한 단편의 예는 Fab 및 F(ab')2 단편을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 유전 공학 기술에 의해 생성된 항체 단편 및 유도체가 또한 고려된다.
추가 실시양태는 키메라 항체, 예를 들어 비-인간(예를 들어, 뮤린) 모노클로날 항체의 인간화 버전을 포함한다. 이러한 인간화 항체는 공지된 기술에 의해 제조될 수 있고, 항체가 인간에게 투여될 때 감소된 면역원성의 이점을 제공한다. 일 실시양태에서, 인간화 항체는 뮤린 항체의 가변 도메인(또는 이의 항원 결합 부위의 전부 또는 일부) 및 인간 항체로부터 유래된 불변 도메인을 포함한다. 대안적으로, 인간화 항체 단편은 뮤린 항체의 항원 결합 부위 및 인간 항체로부터 유래된 가변 도메인 단편(항원 결합 부위 결여)을 포함할 수 있다. 키메라 및 추가 조작된 항체의 생산을 위한 절차는 문헌[Riechmann et al., 1988, Nature 332:323], 문헌[Liu et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84:3439], 문헌[Larrick et al., 1989, Bio/Technology 7:934], 및 문헌[Winter et al., 1993, TIPS 14:139]에 기재되어 있는 것을 포함한다. 일 실시양태에서, 키메라 항체는 CDR 이식된 항체이다. 항체를 인간화하기 위한 기술은 예를 들어 미국 특허 번호 제5,869,619호, 제5,225,539호, 제5,821,337호, 제5,859,205호, 제6,881,557호, 및 문헌[Padlan et al., 1995, FASEB J. 9:133-39, and Tamura et al., 2000, J. Immunol. 164:1432-41]에 기술되어 있다.
비-인간 동물에서 인간 또는 부분적으로 인간 항체를 생성하기 위한 절차가 개발되었다. 예를 들어, 하나 이상의 내인성 면역글로불린 유전자가 다양한 수단에 의해 비활성화된 마우스가 준비되었다. 비활성화된 마우스 유전자를 대체하기 위해 인간 면역글로불린 유전자가 마우스에 도입되었다. 동물에서 생산된 항체는 동물에 도입된 인간 유전 물질에 의해 코딩된 인간 면역글로불린 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 일 실시양태에서, 유전자도입 마우스와 같은 비-인간 동물은 백신으로 면역화되어 백신 항원에 대한 항체가 동물에서 생성된다.
인간 또는 부분적 인간 항체를 생성하기 위한 유전자도입 동물의 제조 및 사용 기술의 예는 미국 특허 제5,814,318호, 제5,569,825호, 및 제5,545,806호, 문헌[Davis et al., 2003, Production of human antibodies from transgenic mice in Lo, ed. Antibody Engineering: Methods and Protocols, Humana Press, NJ:191-200], 문헌[Kellermann et al., 2002, Curr Opin Biotechnol. 13:593-97], 문헌[Russel et al., 2000, Infect Immun. 68:1820-26], 문헌[Gallo et al., 2000, Eur J Immun. 30:534-40], 문헌[Davis et al., 1999, Cancer Metastasis Rev. 18:421-25], 문헌[Green, 1999, J Immunol Methods. 231:11-23], 문헌[Jakobovits, 1998, Advanced Drug Delivery Reviews 31:33-42], 문헌[Green et al., 1998, J Exp Med. 188:483-95], 문헌[Jakobovits A, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs. 7:607-14], 문헌[Tsuda et al., 1997, Genomics. 42:413-21], 문헌[Mendez et al., 1997, Nat Genet. 15:146-56], 문헌[Jakobovits, 1994, Curr Biol. 4:761-63], 문헌[Arbones et al., 1994, Immunity. 1:247-60], 문헌[Green et al., 1994, Nat Genet. 7:13-21], 문헌[Jakobovits et al., 1993, Nature. 362:255-58], 문헌[Jakobovits et al., 1993, Proc Natl Acad Sci U S A. 90:2551-55], 문헌[Chen, J., M. Trounstine, F. W. Alt, F. Young, C. Kurahara, J. Loring, D. Huszar. Inter'l Immunol. 5 (1993): 647-656], 문헌[Choi et al., 1993, Nature Genetics 4: 117-23], 문헌[Fishwild et al., 1996, Nature Biotech. 14: 845-51], 문헌[Harding et al., 1995, Annals of the New York Academy of Sciences], 문헌[Lonberg et al., 1994, Nature 368: 856-59], 문헌[Lonberg, 1994, Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies in Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101], 문헌[Lonberg et al., 1995, Internal Review of Immunology 13: 65-93], 문헌[Neuberger, 1996, Nature Biotechnology 14: 826], 문헌[Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20: 6287-95], 문헌[Taylor et al., 1994, Inter'l Immunol. 6: 579-91], 문헌[Tomizuka et al., 1997, Nature Genetics 16: 133-43], 문헌[Tomizuka et al., 2000, Pro. Nat'lAcad. Sci. USA 97: 722-27], 문헌[Tuaillon et al., 1993, Pro.Nat'lAcad.Sci. USA 90: 3720-24], 및 문헌[Tuaillon et al., 1994, J.Immunol. 152: 2912-20]에 기재되어 있다.
본 발명의 RPP(예를 들어, 항체, 항체 단편 및 항체 유도체)는 당업계에 공지된 임의의 불변 영역을 포함할 수 있다. 경쇄 불변 영역은 예를 들어, 카파- 또는 람다-형 경쇄 불변 영역, 예를 들어, 인간 카파- 또는 람다-형 경쇄 불변 영역일 수 있다. 중쇄 불변 영역은 예를 들어, 알파-, 델타-, 엡실론-, 감마-, 또는 뮤-형 중쇄 불변 영역, 예를 들어, 인간 알파-, 델타-, 엡실론-, 감마-, 또는 뮤-형 중쇄 불변 영역일 수 있다. 일 실시양태에서, 경쇄 또는 중쇄 불변 영역은 자연 발생 불변 영역의 단편, 유도체, 변이체 또는 뮤테인이다.
관심 항체로부터 상이한 하위부류 또는 이소타입의 항체를 유도하는 기술, 즉 하위부류 스위칭에 대한 기술이 알려져 있다. 따라서, IgG 항체는 예를 들어, IgM 항체에서 유래할 수 있으며, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 이러한 기술은 주어진 항체(모 항체)의 항원-결합 특성을 보유하지만, 또한 모 항체의 것과 상이한 항체 이소타입 또는 하위부류와 관련된 생물학적 특성을 나타내는 새로운 항체의 제조를 허용한다. 재조합 DNA 기술을 사용할 수 있다. 특정 항체 폴리펩티드를 코딩하는 클로닝된 DNA, 예를 들어, 원하는 이소타입의 항체의 불변 도메인을 코딩하는 DNA가 이러한 절차에 사용될 수 있다. 문헌[Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178:303-16] 또한 참조한다.
단일 사슬 항체(scFv)는 아미노산 브릿지(짧은 펩티드 링커, 예를 들어, 아미노산 잔기의 합성 서열)를 통해 중쇄 및 경쇄 가변 도메인(Fv 영역) 단편을 연결하여 형성되어 단일 폴리펩티드 사슬을 생성할 수 있다. 이러한 단일-사슬 Fv(scFv)는 2개의 가변 도메인 폴리펩티드(VL 및 VH)를 코딩하는 DNA 사이에 펩티드 링커를 코딩하는 DNA를 융합하여 제조되었다. 생성된 폴리펩티드는 2개의 가변 도메인 사이의 유연한 링커의 길이에 따라 자체적으로 접혀서 항원-결합 단량체를 형성하거나 다량체(예를 들어, 이량체, 삼량체 또는 사량체)를 형성할 수 있다[문헌(Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10:423]; 문헌[Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18:95-108]; 문헌[Bird et al., 1988, Science 242:423-26]; 및 문헌[Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-83]). 상이한 VL 및 VH-포함 폴리펩티드를 조합함으로써, 상이한 에피토프에 결합하는 다량체 scFv를 형성할 수 있다(문헌[Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18:31-40]). 단일 사슬 항체의 생산을 위해 개발된 기술에는 미국 특허 번호 제4,946,778호; 문헌[Bird, 1988, Science 242:423]; 문헌[Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879]; 문헌[Ward et al., 1989, Nature 334:544]; 및 문헌[de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol. 178:379-87]에 기재된 것을 포함한다.
특정 양태에서, 본 발명은 항체-코딩 발현 벡터의 라이브러리로부터 생성된 RPP를 포함한다. RPP는 10, 100, 1,000, 10,000 또는 100,000개 이상의 별개의 항체 서열을 포함한다. 특정 양태에서, RPP는 단일 형질세포 또는 형질모세포에 의해 코딩되는 항체 서열로 재조합적으로 조작된 포유동물 세포로부터 생성된다. 특정 양태에서, RPP는 상이한 항원-결합 특성을 갖는 항체를 포함한다는 점에서 다가이다. 일부 실시양태에서, RPP는 표적 항원 상의 다중 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, RPP는 다중 항원에 결합한다.
7.4. RPP의 CDR3 서열
본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 12개의 RPP의 각 구성원을 포함하는 CDR3H(중쇄 면역글로불린) 및 CDR3L(경쇄 면역글로불린) 폴리펩티드 서열이 서열 목록에 제공되어 있다. 서열의 요약은 표 5에 나타내었다. 서열은 본 출원과 함께 제출된 서열 목록에서 찾을 수 있다. 면역원으로서 인간 흉선세포 또는 인간 T 세포를 사용하여 본원에 제공된 RPP는 완전한 인간 V(D)J 항체 서열을 발현하는 인간화 마우스로부터 생성된다. 폐렴구균 다당류, 인플루엔자 A 바이러스 항원, B형 간염 바이러스 항원, 또는 헤모필루스 인플루엔자 B 다당류를 사용하여 본원에 제공된 RPP는 백신 접종된 인간 공여자로부터 생성되었다. RPP는 1,141 내지 10,537개의 고유한 항체를 포함한다.
[표 5]
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올리고펩티드 또는 폴리펩티드는 아미노산 서열이 본원에서 제공된 CDR 적어도 하나와 적어도 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 경우 본 발명의 범위 내에 있다.
7.5. 핵산
한 양태에서, 본 발명은 분리된 핵산 분자를 제공한다. 핵산은, 예를 들어, RPP의 전체 또는 일부, 예를 들어, 본 발명의 항체의 하나 또는 둘 모두의 사슬, 또는 이의 단편, 유도체, 뮤테인 또는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 확인, 분석, 돌연변이 또는 증폭하기 위한 혼성화 프로브, PCR 프라이머 또는 서열 프라이머로서 사용하기 위해 충분한 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하기 위한 안티센스 핵산, 및 상기의 상보적 서열을 포함한다. 핵산은 임의의 길이일 수 있다. 이들은 예를 들어 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1,000, 1,500, 3,000, 5,000개 이상의 뉴클레오티드 길이일 수 있고/있거나, 하나 이상의 추가 서열, 예를 들어 조절 서열을 포함할 수 있고/있거나, 더 큰 핵산, 예를 들어 벡터의 일부일 수 있다. 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있고, RNA 및/또는 DNA 뉴클레오티드, 및 이의 인공 변이체(예를 들어, 펩티드 핵산)를 포함할 수 있다.
항체 폴리펩티드(예를 들어, 중쇄 또는 경쇄, 가변 도메인만, CDR만, 또는 전장)를 코딩하는 핵산은 백신으로 면역화된 마우스의 B-세포로부터 분리될 수 있다. 핵산은 중합효소연쇄반응(PCR)과 같은 통상적인 절차에 의해 분리될 수 있다.
중쇄 및 경쇄 가변 영역의 가변 영역으로부터의 CDR3의 폴리펩티드 서열이 본원에 제시되어 있다. 당업자는 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, 본원에 개시된 각각의 폴리펩티드 서열이 다수의 다른 핵산 서열에 의해 코딩된다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은 본 발명의 각각의 RPP를 코딩하는 각각의 축퇴성 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
핵산을 혼성화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Curr. Prot. in Mol. Biol., John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]을 참조한다. 본원에서 정의된 바와 같이, 적당히 엄격한 혼성화 조건은 5X 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC), 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA(pH 8.0)를 함유하는 예비세척 용액, 약 50% 포름아미드의 혼성화 완충액, 6X SSC 및 55℃의 혼성화 온도(또는 42℃의 혼성화 온도를 갖는 약 50% 포름아미드를 함유하는 것과 같은 다른 유사한 혼성화 용액) 및 0.5X SSC, 0.1% SDS에서 60℃의 세척 조건을 사용한다. 엄격한 혼성화 조건은 45℃의 6X SSC에서 혼성화한 후 68℃에서 0.1X SSC, 0.2% SDS에서 한 번 이상 세척한다. 또한, 당업자는, 적어도 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98, 또는 99%가 서로 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 통상적으로 서로 혼성화 상태로 유지될 수 있도록 혼성화의 엄격성을 증가 또는 감소시키기 위해 혼성화 및/또는 세척 조건을 조작할수 있다. 혼성화 조건의 선택 및 적합한 조건을 고안하기 위한 지침에 영향을 미치는 기본 매개변수는, 예를 들어, 문헌[Sambrook, Fritsch, and Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 and 11]; 및 문헌[Curr. Prot. in Mol. Biol. 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4]에 설정되어 있으며, 예를 들어, DNA의 길이 및/또는 염기 조성을 기반으로 하는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
변화는 핵산 내로의 돌연변이에 의해 도입될 수 있고, 이에 의해 이것이 코딩하는 폴리펩티드(예를 들어, RPP)의 아미노산 서열의 변화를 야기할 수 있다. 돌연변이는 당업계에 공지된 임의의 기술을 사용하여 도입될 수 있다. 일 실시양태에서, 하나 이상의 특정 아미노산 잔기는, 예를 들어, 부위-지정 돌연변이유발 프로토콜을 사용하여 변경된다. 또 다른 실시양태에서, 하나 이상의 무작위로 선택된 잔기는, 예를 들어, 무작위 돌연변이유발 프로토콜을 사용하여 변경된다. 그러나, 돌연변이 폴리펩티드는 원하는 특성(예를 들어, 바이러스에 대한 결합)에 대해 발현되고 스크리닝될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 서열의 검출을 위한 프라이머 또는 혼성화 프로브로서 사용하기에 적합한 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 핵산 분자는 본 발명의 전장 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 일부만을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있는 단편 또는 활성 부분(예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 바이러스 결합 부분)을 암호화하는 단편을 포함한다.
본 발명의 핵산의 서열에 기초한 프로브는 핵산 또는 유사한 핵산, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 전사체를 검출하는 데 사용될 수 있다. 프로브는 표지 그룹, 예를 들어 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소, 또는 효소 보조인자를 포함할 수 있다. 이러한 프로브는 폴리펩티드를 발현하는 세포를 식별하는 데 사용할 수 있다
또 다른 양태에서, 본 발명은 형질모세포 및 형질세포로부터 유래된 항체 단백질 라이브러리를 암호화하는 핵산 라이브러리를 제공한다. 이러한 핵산 라이브러리는 형질모세포 및 형질세포를 단일-세포 반응 용기로 분리함으로써 생성되며, 여기서 이들이 용해되고 항체-특이적 핵산은, 예를 들어, 비드와 같은 고체 지지체 상에서 정제 또는 포획된다. 본 발명은 동시에 수백만 개의 단일 세포로부터 전사체의 포획을 수행하는 방법을 제공한다. 전사체의 포획은 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 코딩하는 핵산을 증폭하고, 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 둘 다를 코딩하는 융합 작제물의 라이브러리로 상기 핵산을 이후 연결시킨다. 이러한 라이브러리에서 원래 입력 형질모세포 및 형질세포에서 발견되는 중쇄 및 경쇄 면역글로불린의 고유한 쌍이 유지된다. 이러한 방법은 수백만 개의 단일 세포에 대해 동시에 수행되어, 융합된 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 핵산의 생성 라이브러리가 수백만 개의 단일 세포에 대해 고유하게 쌍을 이루는 서열을 포함하도록 한다. 이러한 방법은 다른 곳에 설명되어 있다(문헌[Adler et al., Mabs 9, 1282-1996, 2017]).
7.6. 벡터 및 발현 벡터
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 일부를 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터의 예로는 플라스미드, 바이러스 벡터, 비-에피솜 포유동물 벡터 및 발현 벡터, 예를 들어, 재조합 발현 벡터를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명의 핵산 분자 및 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터가 또한 제공되고, 이러한 벡터로 형질전환된 숙주 세포, 및 폴리펩티드의 생산 방법이 또한 제공된다. 용어 "발현 벡터"는 폴리뉴클레오티드 서열로부터 폴리펩티드를 발현하기 위한 플라스미드, 파지, 바이러스 또는 벡터를 지칭한다. 폴리펩티드의 발현을 위한 벡터는 벡터 증식 및 클로닝된 삽입물의 발현에 필요한 최소한의 서열을 함유한다. 발현 벡터는 (1) 유전자 발현에서 조절 역할을 하는 유전 요소 또는 요소들, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서, (2) mRNA로 전사되고 단백질로 번역될 폴리펩티드 및 단백질을 코딩하는 서열, 및 (3) 적절한 전사 개시 및 종료 서열의 어셈블리를 포함하는 전사 단위를 포함한다. 이러한 서열은 선택 마커를 추가로 포함할 수 있다. 숙주 세포에서의 발현에 적합한 벡터는 쉽게 이용 가능하며, 핵산 분자는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 벡터에 삽입된다. 이러한 벡터는 특정 조직에서 기능하는 프로모터, 및 표적화된 인간 또는 동물 세포에서 폴리펩티드의 발현을 위한 바이러스 벡터를 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태로 본 발명의 핵산을 포함할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 발현될 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된, 발현에 사용될 숙주 세포에 기초하여 선택된 하나 이상의 조절 서열을 포함한다. 조절 서열은 많은 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 지시하는 것들(예를 들어, SV40 초기 유전자 인핸서, 라우스 육종 바이러스 프로모터 및 거대세포바이러스 프로모터), 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하는 것들(예를 들어, 조직-특이적 조절 서열(문헌[Voss et al., 1986, Trends Biochem. Sci. 11:287], 문헌[Maniatis et al., 1987, Science 236:1237] 참조, 전체 내용이 본원에 참조로 포함됨), 및 특정 치료 또는 조건에 대한 뉴클레오티드 서열의 유도성 발현을 지시하는 것들(예를 들어, 포유동물 세포의 메탈로티오닌 프로모터 및 원핵 및 진핵 시스템 둘 다의 tet-반응성 및/또는 스트렙토마이신 반응성 프로모터(id. 참조))을 포함한다. 당업자는 발현 벡터의 디자인이 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 의존할 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입되어, 본원에 기재된 바와 같은 핵산에 의해 코딩되는 융합 단백질 또는 펩티드를 비롯한 단백질 또는 펩티드를 생성할 수 있다.
본 발명은 폴리펩티드, 예를 들어, RPP를 제조하는 방법을 추가로 제공한다. 다양한 다른 발현/숙주 시스템이 이용될 수 있다. 벡터 DNA는 통상적인 형질전환 또는 형질감염 기술을 통해 원핵생물 또는 진핵생물 시스템에 도입될 수 있다. 이러한 시스템에는 재조합 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아(예, 대장균)와 같은 미생물; 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV); 담배 모자이크 바이러스(TMV))로 형질감염되거나 박테리아 발현 벡터(예를 들어, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 재조합 단백질 생산에 유용한 포유동물 세포에는 VERO 세포, HeLa 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주 또는 Veggie CHO와 같은 이들의 유도체 및 무혈청 배지에서 자라는 관련 세포주(문헌]Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31] 참조) 또는 DHFR이 결핍된 CHO 균주 DX-B11(문헌[Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20] 참조) 원숭이 신장 세포의 COS-7 라인과 같은 COS 세포(ATCC CRL 1651)(문헌[Gluzman et al., 1981, Cell 23:175] 참조), W138, BHK, HepG2, 3T3(ATCC CCL 163), RIN, MDCK, A549, PC12, K562, L 세포, C127 세포, BHK(ATCC CRL 10) 세포주, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주 CV1에서 유래한 CV1/EBNA 세포주(ATCC CCL 70)(문헌[McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821] 참조), 293, 293 EBNA 또는 MSR 293과 같은 인간 배아 신장 세포, 인간 표피 A431 세포, 인간 Colo205 세포, 기타 형질전환된 영장류 세포주, 정상 이배체 세포, 1차 조직, 1차 외식편, HL-60, U937, HaK 또는 Jurkat 세포의 시험관 내 배양으로부터 유래된 세포 균주를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 포유동물 발현은 성장 배지로부터 회수될 수 있는 분비 또는 가용성 폴리펩티드의 생산을 가능하게 한다.
포유류 세포의 안정적인 형질감염을 위해, 사용된 발현 벡터 및 형질감염 기술에 따라 소수의 세포만이 외래 DNA를이들의 게놈에 통합시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 통합체를 확인하고 선택하기 위해, 선택 가능한 마커(예를 들어, 항생제 내성을 위함)를 코딩하는 유전자가 일반적으로 관심 유전자와 함께 숙주 세포에 도입된다. 이러한 세포가 원하는 발현 카세트 뿐만 아니라 선택 가능한 마커를 포함하는 벡터로 형질전환되면, 예를 들어, 세포가 선택 배지로 전환되기 전에 농축 배지에서 성장하도록 할 수 있다. 선택 가능한 마커는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 성장 및 회복을 허용하도록 설계된다. 안정적으로 형질전환된 세포의 저항성 덩어리는 사용된 세포주에 적절한 조직 배양 기술을 사용하여 증식시킬 수 있다. 재조합 단백질의 발현에 대한 개요는 문헌[Methods of Enzymology, v. 185, Goeddell, D.V., ed., Academic Press (1990)]에서 찾을 수 있다. 바람직한 선택 가능한 마커는 G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여하는 것들을 포함한다. 도입된 핵산으로 안정적으로 형질감염된 세포는 다른 방법 중에서 약물 선택(예를 들어, 선택 가능한 마커 유전자를 포함하는 세포는 생존하지만, 다른 세포는 사멸함)에 의해 확인할 수 있다.
형질전환된 세포는 폴리펩티드의 발현을 촉진하는 조건 하에 배양될 수 있고, 폴리펩티드는 통상적인 단백질 정제 절차(상기 정의된 바와 같음)에 의해 회수될 수 있다.
원핵생물 시스템을 사용한 발현과 같은 일부 경우에, 본 발명의 발현된 폴리펩티드는 생물학적으로 활성이 되기 위해 생성된 적절한 3차 구조 및 이황화 결합으로 "재접힘(refolded)"되고, 산화될 필요가 있을 수 있다. 재접힘은 당업계에 잘 알려진 다수의 절차를 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 가용화된 폴리펩티드를 카오트로픽제의 존재 하에 일반적으로 7보다 높은 pH에 노출시키는 것을 포함한다. 카오트로프의 선택은 봉입체 가용화에 사용되는 선택과 유사하지만, 카오트로프는 일반적으로 더 낮은 농도에서 사용된다. 예시적인 카오트로픽제는 구아니딘 및 요소이다. 대부분의 경우, 재접힘/산화 용액은 또한 환원제와 이의 산화된 형태를 특정 비율로 포함하여, 시스테인 브릿지 형성을 위해 이황화물 셔플링이 발생하도록 하는 특정 산화환원 전위를 생성한다. 일반적으로 사용되는 산화환원 커플에는 시스테인/시스타민, 글루타티온/디티오비스GSH, 염화제2구리, 디티오트레이톨 DTT/디티안 DTT 및 2-머캅토에탄올(bME)/디티오-bME가 포함된다. 많은 경우에, 공용매는 재접힘의 효율성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로 사용되는 공용매는 글리세롤, 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜, 및 아르기닌을 포함한다.
또한, 폴리펩티드는 통상적인 기술에 따라 용액 또는 고체 지지체 상에서 합성될 수 있다. 다양한 자동 합성기가 시판되고 있으며, 공지된 프로토콜에 따라 사용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d.Ed., Pierce Chemical Co. (1984)]; 문헌[Tam et al., J Am Chem Soc, 105:6442, (1983)]; 문헌[Merrifield, Science 232:341-347 (1986)]; 문헌[Barany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds, Academic Press, New York, 1-284]; 문헌[Barany et al., Int J Pep Protein Res, 30:705-739 (1987)]을 참조한다.
본 발명의 폴리펩티드 및 단백질은 당업자에게 잘 알려진 단백질 정제 기술에 따라 정제될 수 있다. 이러한 기술은 어느 단계가 되면 단백질성 및 비단백질성 분획의 조 분획법을 포함한다. 펩티드 폴리펩티드를 다른 단백질로부터 분리한 후, 관심 펩티드 또는 폴리펩티드는 크로마토그래피 및 전기영동 기술을 사용하여 추가로 정제하여 부분적 또는 완전한 정제(또는 균질성을 위한 정제)를 달성할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "정제된 폴리펩티드"는 다른 성분으로부터 분리 가능한 조성물을 지칭하는 것으로 의도되며, 여기서 폴리펩티드는 이의 자연적으로 획득 가능한 상태와 비교해서 어느 정도 정제된다. 따라서 정제된 폴리펩티드는 또한 이것이 자연적으로 발생할 수 있는 환경이 없는 폴리펩티드를 지칭한다. 일반적으로, "정제된"은 다양한 기타 성분을 제거하기 위해 분획화되고, 조성물이 이의 발현된 생물학적 활성을 실질적으로 유지하는 폴리펩티드 조성물을 지칭할 것이다. "실질적으로 정제된"이라는 용어가 사용되는 경우, 이 명칭은 폴리펩티드 또는 펩티드가 조성물 중 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 85%, 또는 약 90% 이상의 단백질을 구성하는 바와 같이, 조성물의 주요 성분을 형성하는, 펩티드 또는 폴리펩티드 조성물을 지칭할 것이다.
정제에 사용하기에 적합한 다양한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있을 것이다. 여기에는, 예를 들어, 황산암모늄, PEG, 항체(면역침전) 등을 사용한 침전 또는 열 변성 후 원심분리; 친화성 크로마토그래피(단백질-A 컬럼), 이온 교환, 겔 여과, 역상, 하이드록시아파타이트, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 등전점 초점, 겔 전기영동 및 이들 기술의 조합과 같은 크로마토그래피가 포함된다. 당업계에 일반적으로 알려진 바와 같이, 다양한 정제 단계를 수행하는 순서는 변경될 수 있거나, 특정 단계가 생략될 수 있고, 실질적으로 정제된 폴리펩티드의 제조를 위한 적합한 방법이 여전히 생성될 수 있다고 믿어진다. 예시적인 정제 단계는 하기 실시예에서 제공된다.
폴리펩티드의 정제 정도를 정량화하는 다양한 방법은 본 개시내용에 비추어 당업자에게 공지될 것이다. 여기에는, 예를 들어, 활성 분획의 특이적 결합 활성을 결정하거나, SDS/PAGE 분석을 통해 분획 내 펩티드 또는 폴리펩티드의 양을 평가하는 것이 포함된다. 폴리펩티드 분획의 순도를 평가하기 위한 바람직한 방법은 분획의 결합 활성을 계산하고, 이를 초기 추출물의 결합 활성과 비교하여, 본원에서 "-배 정제 숫자"로 평가되는 정제 정도를 계산하는 것이다. 결합 활성의 양을 나타내기 위해 사용되는 실제 단위는, 물론, 정제를 따르도록 선택된 특정 분석 기술 및 폴리펩티드 또는 펩티드가 검출 가능한 결합 활성을 나타내는지 여부에 따라 달라질 것이다.
일부 양태에서, 본 발명은 포유동물 게놈으로의 부위-지정 통합을 위한 항체-코딩 핵산 벡터의 라이브러리를 포함한다. 이러한 벡터에는 플라스미드, 레트로바이러스 및 렌티바이러스가 포함된다. 이러한 벡터 라이브러리는 항체 서열 라이브러리를 코딩하고, 이는 RPP 생산을 위해 포유동물 세포를 조작하는 데 사용된다. 핵산 벡터의 라이브러리는 10, 100, 1,000, 10,000, 또는 100,000개 초과의 상이한 항체-코딩 서열을 포함할 수 있다. 서열은 형질모세포 및 형질세포로부터 유래된다. 이러한 핵산 라이브러리는 형질모세포 및 형질세포를 단일-세포 반응 용기로 분리함으로써 생성되며, 여기서 이들이 용해되고 항체-특이적 핵산은, 예를 들어, 비드와 같은 고체 지지체 상에서 정제 또는 포획된다. 본 발명은 동시에 수백만 개의 단일 세포로부터 전사체의 포획을 수행하는 방법을 제공한다. 전사체의 포획은 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 코딩하는 핵산을 증폭하고, 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 둘 다를 코딩하는 융합 작제물의 라이브러리로 상기 핵산을 이후 연결시킨다. 이러한 라이브러리에서 원래 입력 형질모세포 및 형질세포에서 발견되는 중쇄 및 경쇄 면역글로불린의 고유한 쌍이 유지된다. 이러한 방법은 수백만 개의 단일 세포에 대해 동시에 수행되어, 융합된 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 핵산의 생성 라이브러리가 수백만 개의 단일 세포에 대해 고유하게 쌍을 이루는 서열을 포함하도록 한다. 다음에 이러한 짝을 이룬 융합 앰플리콘은 깁슨 어셈블리(Gibson Assembly), 제한 엔도뉴클레아제 또는 기타 재조합 DNA 기술을 사용하여 전장 항체 작제물로 조작된다.
전장 항체 작제물로의 조작은 전체 라이브러리 상에서 일괄적으로 수행되어, 라이브러리의 항체 서열 함량 및 항체 서열 카운트가 기본적으로 프로세스 전반에 걸쳐 유지된다. 일부 양태에서, 발현 벡터의 라이브러리는 scFv 앰플리콘이 중간 벡터로 서브클로닝된 다음, 2차 라운드의 깁슨 어셈블리, 제한 분해 또는 기타 재조합 기술을 사용하여 항체의 추가 도메인을 scFv의 링커로 조작되도록 한다(USPTO 14/734,953). 중쇄 및 경쇄 면역글로불린의 고유한 쌍은 전장 발현 벡터 라이브러리로 조작하는 과정 전반에 걸쳐 기본적으로 유지된다. 벡터는 다양한 방향으로 설계되며, 예를 들어, 두 개의 별개 프로모터가 중쇄 및 경쇄 면역글로불린의 발현을 유도하거나, 하나의 프로모터가 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 둘 다의 발현을 유도하고, 번역 스킵 모티브를 사용하여 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 별개의 폴리펩티드로 별도로 번역한다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 포유동물 생산 세포로의 부위-지정 통합을 위한 서열을 포함하며, 예를 들어 CRISPR-Cas9, Flp-In, Cre/Lox, 또는 아연 집게 재조합 방법이 있다. 부위-지정 통합은 각 포유동물 생산 세포가 단일 항체 서열을 코딩하도록 하고 단일 생산 세포 사이의 발현 수준의 가변성을 감소시킨다.
7.7 RPP, 예를 들어, 항체 생산 방법
RPP는, 헤파린 HP 컬럼을 사용하여, 염 구배를 사용하여, 또는 단백질 A 수지를 사용하여 숙주 세포 배양액의 여과된 상청액을 용리함으로써 항체를 코딩하는 유전자에 의해 형질감염된 숙주 세포로부터 정제될 수 있다.
완전한 인간 모노클로날 항체는 당업자에게 친숙할 임의의 수의 기술에 의해 생성될 수 있다. 이러한 방법에는 인간 말초혈액 세포(예를 들어, B 림프구 함유)의 엡스타인 바 바이러스(EBV) 형질전환, 인간 B-세포의 시험관 내 면역화, 삽입된 인간 면역글로불린 유전자를 보유하는 면역화된 형질전환 마우스로부터의 비장 세포 융합, 인간 면역글로불린 V 영역 파지 라이브러리로부터의 분리, 또는 당업계에 공지되고 본원의 개시내용에 기초한 다른 절차를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 완전한 인간 모노클로날 항체는 항원 공격에 대한 반응으로 특이적 인간 항체를 생성하도록 조작된 형질전환 마우스로부터 얻을 수 있다. 형질전환 마우스로부터 완전한 인간 항체를 얻는 방법은, 예를 들어, 문헌[Green et al., Nature Genet. 7:13, 1994]; 문헌[Lonberg et al., Nature 368:856, 1994]; 문헌[Taylor et al., Int. Immun. 6:579, 1994]; 미국 특허 번호 제5,877,397호; 문헌[Bruggemann et al., 1997 Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58]; 문헌[Jakobovits et al., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:525-35]에 기재되어 있다. 이러한 기술에서, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 요소는 내인성 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 표적화된 파괴를 함유하는 배아 줄기 세포주로부터 유래된 마우스 균주에 도입된다(문헌[Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol.8:455-58 (1997)] 참고). 예를 들어, 인간 면역글로불린 이식유전자는 마우스 림프 조직에서 B-세포 특이적 DNA 재배열 및 과돌연변이를 겪는 효모 인공 염색체 상의 미니-유전자 작제물 또는 전위체(transloci)일 수 있다. 완전한 인간 모노클로날 항체는 형질전환 마우스를 면역화하여 얻을 수 있으며, 이는 항원 표적 또는 표적에 특이적인 인간 항체를 생성할 수 있다. 면역화된 형질전환 마우스의 림프 세포는 본원에 기재된 방법에 따라 인간 항체-분비 하이브리도마를 생산하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 인간 항체를 생성하는 또 다른 방법은 EBV 형질전환에 의해 인간 말초혈액 세포를 불멸화하는 것을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제4,464,456호를 참조한다. 표적 또는 표적들에 특이적으로 결합하는 RPP를 생성하는 이러한 불멸화된 B-세포주(또는 림프모구 세포주)는 본원에 제공된 바와 같은 면역검출 방법, 예를 들어 ELISA에 의해 확인될 수 있고, 그 다음 표준 클로닝 기술에 의해 분리될 수 있다. RPP를 생산하는 림프모구 세포주의 안정성은 형질전환된 세포주를 뮤린 골수종과 융합하여 당업계에 공지된 방법에 따라 마우스-인간 하이브리드 세포주를 생산함으로써 개선될 수 있다(예를 들어, 문헌[Glasky et al., Hybridoma 8:377-89 (1989)] 참조). 인간 RPP를 생성하는 또 다른 방법은 항원 표적으로 인간 비장 B 세포를 프라이밍한 다음 이종 하이브리드 융합 파트너와 프라이밍된 융합을 포함하는 시험관 내 면역화이다. 예를 들어, 문헌[Boerner et al., 1991 J. Immunol. 147:86-95]을 참조한다.
특정 실시양태에서, RPP를 생성하는 B-세포가 선택되고, 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 당업계에 공지된 분자 생물학 기술에 따라 B-세포로부터 클로닝된다[WO 92/02551; 미국 특허 제5,627,052호; 본원에 기재된 문헌[Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48 (1996)]). 면역화된 동물로부터의 B-세포는 항원 표적에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 세포를 선택함으로써 비장, 림프절 또는 말초 혈액 샘플로부터 분리될 수 있다. B-세포는 또한 인간, 예를 들어, 말초 혈액 샘플로부터 분리될 수 있다.
원하는 특이성을 갖는 항체를 생성하는 단일 B-세포를 검출하는 방법은, 예를 들어, 플라크 형성, 형광-활성화된 세포 분류, 시험관 내 자극에 이은 특이적 항체의 검출 등에 의해 당업계에 잘 알려져 있다. 특이적 항체-생산 B-세포의 선택을 위한 방법은, 예를 들어, 항원 표적을 함유하는 연한천에서 B-세포의 단일 세포 현탁액을 제조하는 것을 포함한다. B-세포에 의해 생성된 특정 항체가 항원에 결합하면 복합체가 형성되며, 이는 면역침전물로 보일 수 있다.
일부 실시양태에서, 특이적 항체-생산 B-세포는 자연적으로 쌍을 이루는 항체를 식별할 수 있는 방법을 사용하여 선택된다. 예를 들어, 이의 전문이 본원에 참고로 포함된 문헌[Adler et al., A natively paired antibody library yields drug leads with higher sensitivity and specificity than a randomly paired antibody library, MAbs (2018)]에 기재된 방법을 이용할 수 있다. 이 방법에는 미세유체 기술, 분자 유전체학, 효모 단일-사슬 가변 단편(scFv) 디스플레이, 형광-활성화 세포 분류(FACS) 및 딥 시퀀싱(deep sequencing)이 결합되어 있다. 요약하면, B 세포는 면역화된 동물에서 분리된 다음 풀링될 수 있다. B 세포는 올리고-dT 비드 및 용해 용액이 있는 액적(droplets)으로 캡슐화되고, mRNA-결합 비드가 액적에서 정제된 다음 중쇄 및 경쇄 Ig의 고유 쌍을 갖는 scFv를 암호화하는 DNA 앰플리콘을 생성하는 OE-RT-PCR 증폭 믹스가 있는 두 번째 에멀젼에 주입된다. 기본적으로 쌍을 이루는 앰플리콘의 라이브러리는 scFv 디스플레이를 위해 효모에 전기천공된다. FACS는 고친화성 scFv를 식별하는 데 사용된다. 마지막으로, 항체 딥 시퀀싱을 사용하여 사전 및 사후 분류 scFv 라이브러리의 모든 클론을 식별할 수 있다.
원하는 항체를 생산하는 B-세포가 선택된 후, 특정 항체 유전자는 당업계에 공지되고 본원에 기재된 방법에 따라 DNA 또는 mRNA를 분리 및 증폭함으로써 클로닝될 수 있다.
본 발명의 항체를 얻는 방법은 또한 당업계에 공지된 다양한 파지 디스플레이 기술을 채택할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Winter et al., 1994 Annu. Rev. Immunol. 12:433-55; Burton et al., 1994 Adv. Immunol. 57:191-280]을 참조한다. 인간 또는 쥐 면역글로불린 가변 영역 유전자 조합 라이브러리는 RPP 또는 이의 변이체 또는 단편에 특이적으로 결합하는 Ig 단편(Fab, Fv, sFv 또는 이의 다량체)을 선택하기 위해 스크리닝될 수 있는 파지 벡터에서 생성될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,223,409호; 문헌[Huse et al., 1989 Science 246:1275-81]; 문헌[Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5728-32 (1989)]; 문헌[Alting-Mees et al., Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990)]; 문헌[Kang et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363-66]; 문헌[Hoogenboom et al., 1992 J. Molec. Biol. 227:381-388]; 문헌[Schlebusch et al., 1997 Hybridoma 16:47-52], 및 이에 인용된 참고문헌을 참고한다. 예를 들어, Ig 가변 영역 단편을 코딩하는 복수의 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 라이브러리는 파지 코트 단백질을 코딩하는 서열과 프레임에 있는, M13 또는 이의 변이체와 같은 필라멘트 박테리오파지의 게놈 내로 삽입될 수 있다. 융합 단백질은 코트 단백질과 경쇄 가변 영역 도메인 및/또는 중쇄 가변 영역 도메인과의 융합일 수 있다. 특정 실시양태에 따르면, 면역글로불린 Fab 단편은 또한 파지 입자 상에 디스플레이될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 번호 제5,698,426호 참조).
일 실시양태에서, 하이브리도마에서 관심 모노클로날 항체를 발현하는 유전자의 가변 영역은 뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭된다. 이러한 프라이머는 당업자에 의해 합성될 수 있거나, 상업적으로 입수 가능한 공급원으로부터 구입할 수 있다. (예를 들어, 특히 VHa, VHb, VHc, VHd, CH1, VL 및 CL 영역용 프라이머를 포함하는 마우스 및 인간 가변 영역용 프라이머를 판매하는 Stratagene(캘리포니아주 라 졸라 소재) 참조) 이러한 프라이머는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 증폭하는 데 사용할 수 있으며, 이는 각각 ImmunoZAPTMH 또는 ImmunoZAPTML(Stratagene)과 같은 벡터에 삽입될 수 있다. 그런 다음 이러한 벡터는 발현을 위해 대장균, 효모 또는 포유동물-기반 시스템에 도입될 수 있다. VH 및 VL 도메인의 융합을 함유하는 다량의 단일-사슬 단백질이 이러한 방법을 사용하여 생성될 수 있다(문헌[Bird et al., Science 242:423-426, 1988] 참조).
본 발명에 따른 항체를 생산하는 세포가 상기 기재된 면역화 및 기타 기술 중 임의의 것을 사용하여 수득되면, 특정 항체 유전자는 본원에 기재된 바와 같은 표준 절차에 따라 이로부터 DNA 또는 mRNA를 분리 및 증폭함으로써 클로닝될 수 있다. 이로부터 생산된 항체는 서열이 결정될 수 있고, 확인된 CDR 및 CDR을 코딩하는 DNA는 본 발명에 따른 다른 항체를 생성하기 위해 이전에 기재된 바와 같이 조작될 수 있다.
본 발명의 RPP는 바람직하게는 본원에 기술된 세포-기반 분석 및/또는 본원에 기술된 생체 내 분석에서 활성을 갖고/갖거나 본원에 기술된 하나 이상의 도메인에 결합한다. 따라서, 이러한 결합제는 본원에 기재된 분석을 사용하여 확인될 수 있다.
본 발명에 따른 다른 항체는 본원에 기재되고 당업계에 공지된 바와 같은 통상적인 면역화 및 세포 융합 절차에 의해 수득될 수 있다.
항체 결합 부위의 중심에 있는 상보성 결정 영역(CDR)의 분자 진화는 또한, 문헌[Schier et al., 1996, J. Mol. Biol. 263:551]에 기재된 바와 같이, 친화도가 증가된 항체, 예를 들어, c-erbB-2에 대한 친화도가 증가된 항체를 분리하는 데 사용된다.
인간, 부분적으로 인간, 또는 인간화 항체가 많은 적용, 특히 인간 대상체에 대한 항체의 투여를 포함하는 적용에 적합할 것이지만, 다른 유형의 항원 결합 단백질이 특정 적용에 적합할 것이다. 본 발명의 비-인간 항체는, 예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 염소, 당나귀 또는 비-인간 영장류(예컨대, 원숭이(예를 들어, 사이노몰로거스 또는 레서스 원숭이)) 또는 유인원(예를 들어, 침팬지)와 같은 항체-생성 동물로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 비-인간 항체는, 예를 들어, 시험관 내 및 세포-배양 기반 적용, 또는 본 발명의 항체에 대한 면역 반응이 발생하지 않고, 미미하고, 예방될 수 있고, 우려 사항이 아니거나, 요망되는 임의의 다른 적용에 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 발명의 비-인간 항체는 비-인간 대상체에게 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 비-인간 항체는 비-인간 대상체에서 면역 반응을 유도하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 비-인간 항체는 비-인간 대상체와 동일한 종으로부터 유래되며, 예를 들어, 본 발명의 마우스 항체는 마우스에 투여된다. 특정 종의 항체는, 예를 들어, 해당 종의 동물을 원하는 면역원으로 면역화하거나 해당 종의 항체를 생성하기 위한 인공 시스템(예를 들어, 특정 종의 항체를 생성하기 위한 박테리아 또는 파지 디스플레이-기반 시스템)을 사용함으로써, 또는, 예를 들어, 항체의 불변 영역을 다른 종의 불변 영역으로 대체함으로써 한 종의 항체를 다른 종의 항체로 전환함으로써, 또는 항체의 하나 이상의 아미노산 잔기를 대체하여 다른 종의 항체 서열과 더 유사하도록 함으로써, 생성할 수 있다. 일 실시양태에서, 항체는 2종 이상의 상이한 종으로부터의 항체에서 유래된 아미노산 서열을 포함하는 키메라 항체이다.
항원 결합 단백질은 임의의 다수의 통상적인 기술에 의해 제조되고 원하는 특성에 대해 스크리닝될 수 있다. 특정 기술은 관심 RPP의 폴리펩티드 사슬(또는 이의 일부)을 암호화하는 핵산을 분리하고, 재조합 DNA 기술을 통해 핵산을 조작하는 것을 포함한다. 핵산은 다른 관심 핵산에 융합되거나, 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기를 추가, 결실 또는 치환하기 위해 (예를 들어, 돌연변이유발 또는 다른 통상적인 기술에 의해) 변경될 수 있다. 또한, 항원 결합 단백질은 이를 자연적으로 발현하는 세포로부터 정제될 수 있거나(예를 들어, 항체는 이를 생성하는 하이브리도마로부터 정제될 수 있음), 당업계에 공지된 임의의 기술을 사용하여 재조합 발현 시스템에서 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, New York (1980)]; 및 문헌[Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988)]을 참조한다.
당업계에 공지된 임의의 발현 시스템을 사용하여 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 발현 시스템은 상기에 포괄적으로 자세히 설명되어 있다. 일반적으로, 숙주 세포는 원하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된다. 사용될 수 있는 숙주 세포 중에는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포가 있다. 원핵생물에는 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 대장균 또는 바실루스가 포함된다. 고등 진핵 세포에는 곤충 세포와 포유류 기원의 확립된 세포주가 포함된다. 적합한 숙주 세포주의 예로는 원숭이 신장 세포의 COS-7 주(ATCC CRL 1651)(문헌[Gluzman et al., 1981, Cell 23:175)], L 세포, 293 세포, C127 세포, 3T3 세포(ATCC CCL 163), 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, HeLa 세포, BHK(ATCC CRL 10) 세포주, 및 문헌[McMahan et al., 1991, EMBO J. 10: 2821]에 기재된 바와 같이 아프리카 그린 원숭이 세포주 CVI로부터 유래된 CVI/EBNA 세포주(ATCC CCL 70)가 포함된다. 박테리아, 진균, 효모 및 포유동물 세포 숙주와 함께 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 문헌[Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985)]에 기재되어 있다.
모노클로날 항체(mAb)에 대한 생산 세포주는 통상적으로 포유동물 생산 세포 게놈, 예를 들어, CHO 게놈에 발현 작제물을 무작위로 삽입하여 생산된다(문헌(Rita Costa et al., 2010]). 그러나, 이러한 표준 방법은 CHO 게놈에 삽입된 mAb의 다수 복사본을 가진 세포주를 생성한다. 우리의 폴리클로날 항체 구성 라이브러리를 CHO 게놈에 무작위로 삽입하면, 많은 클론이 다중 항체를 발현하여 중쇄 Ig와 경쇄 Ig 사이에 비-자연 쌍이 자주 발생한다. 또한, 다른 게놈 위치는 다른 전사 활성 수준을 가지므로(문헌[Kito et al., 2002]), 이는 이질적이고 일관성이 없고/없거나 불안정한 생물 생산을 초래할 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 본 발명은 게놈 내로 안정적으로 조작된 Flp 재조합효소 인식 표적(FRT) 랜딩 패드를 갖는 CHO 세포주를 제공한다. 그런 다음 이러한 부위-지정 게놈 통합 세포주는 RPP의 안정적인 발현에 사용된다.
본 발명의 항체는 항체가 결합 특이성을 유지한다면 적어도 하나의 아미노산 치환을 가질 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 항체 구조에 대한 변형은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 여기에는 RPP를 포함하는 항체의 결합 능력을 파괴하지 않는 보존적 또는 비-보존적일 수 있는 아미노산 치환이 포함될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 비-자연 발생 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며, 이는 통상적으로 생물학적 시스템에서의 합성보다는 화학적 펩티드 합성에 의해 통합된다. 여기에는 펩티도미메틱 및 기타 역전되거나 역전된 형태의 아미노산 모이어티가 포함된다. 보존적 아미노산 치환은 또한 그 위치에서 아미노산 잔기의 극성 또는 전하에 거의 또는 전혀 영향이 없도록 천연 아미노산 잔기를 규범적인 잔기로 치환하는 것을 포함할 수 있다.
비-보존적 치환은 다른 물리적 특성(예를 들어, 크기, 극성, 소수성, 전하)을 갖는 다른 부류의 구성원에 대한 아미노산 또는 아미노산 모방체의 한 부류의 구성원의 교환을 포함할 수 있다. 이러한 치환된 잔기는 비-인간 항체와 상동성인 인간 항체의 영역 내로, 또는 분자의 비-상동성 영역 내로 도입될 수 있다.
더욱이, 당업자는 각각의 원하는 아미노산 잔기에서 단일 아미노산 치환을 함유하는 시험 변이체를 생성할 수 있다. 이어서, 변이체는 당업자에게 공지된 활성 분석을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 이러한 변형은 적합한 변형에 대한 정보를 수집하는 데 사용할 수 있다. 예를 들어, 특정 아미노산 잔기에 대한 변화가 파괴된, 바람직하지 않은 감소된, 또는 부적합한 활성을 초래한다는 것을 발견한 경우, 이러한 변화를 갖는 변이체를 피할 수 있다. 다시 말해서, 이러한 일상적인 실험으로부터 수집된 정보에 기초하여, 당업자는 단독으로 또는 다른 돌연변이와 조합하여 추가 치환을 피해야 하는 아미노산을 쉽게 결정할 수 있다.
숙련된 기술자는 공지된 기술을 사용하여 본원에 기재된 폴리펩티드의 적합한 변이체를 결정할 수 있을 것이다. 특정 실시양태에서, 당업자는 활성에 중요하지 않은 것으로 여겨지는 영역을 표적화함으로써 활성을 파괴하지 않고 변화될 수 있는 분자의 적합한 영역을 확인할 수 있다. 특정 실시양태에서, 유사한 폴리펩티드 사이에 보존된 분자의 잔기 및 부분을 확인할 수 있다. 특정 실시양태에서, 생물학적 활성 또는 구조에 중요할 수 있는 영역조차도 생물학적 활성을 파괴하지 않거나 폴리펩티드 구조에 악영향을 미치지 않으면서 보존적 아미노산 치환을 받을 수 있다.
또한, 당업자는 활성 또는 구조에 중요한 유사한 폴리펩티드의 잔기를 식별하는 구조-기능 연구를 검토할 수 있다. 이러한 비교를 고려하여, 유사한 단백질의 활성 또는 구조에 중요한 아미노산 잔기에 해당하는 단백질의 아미노산 잔기의 중요성을 예측할 수 있다. 당업자는 이러한 예측된 중요한 아미노산 잔기에 대해 화학적으로 유사한 아미노산 치환을 선택할 수 있다.
당업자는 또한 유사한 폴리펩티드의 구조와 관련하여 3차원 구조 및 아미노산 서열을 분석할 수 있다. 이러한 정보에 비추어, 당업자는 항체의 3차원 구조에 대한 아미노산 잔기의 정렬을 예측할 수 있다. 특정 실시양태에서, 당업자는 단백질의 표면 상에 있을 것으로 예상되는 아미노산 잔기에 라디칼 변화를 일으키지 않는 것을 선택할 수 있는데, 그 이유는 이러한 잔기가 다른 분자와의 중요한 상호작용에 포함될 수 있기 때문이다.
많은 과학 간행물이 2차 구조의 예측에 전념했다. 문헌[Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996)], 문헌[Chou et al., Biochem., 13(2):222-245 (1974)]; 문헌[Chou et al., Biochem., 113(2):211-222 (1974)]; 문헌[Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978)]; 문헌[Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47:251-276]; 및 문헌[Chou et al., Biophys. J., 26:367-384 (1979)]을 참조한다. 더욱이, 컴퓨터 프로그램은 현재 2차 구조를 예측하는 데 도움을 줄 수 있다. 2차 구조를 예측하는 한 가지 방법은 상동성 모델링을 기반으로 한다. 예를 들어, 30% 초과의 서열 동일성 또는 40% 초과의 유사성을 갖는 2개의 폴리펩티드 또는 단백질은 종종 유사한 구조적 토폴로지를 갖는다. 최근 단백질 구조 데이터베이스(PDB)의 성장은 폴리펩티드 또는 단백질 구조 내의 잠재적인 접힘 수를 포함하여 2차 구조의 향상된 예측 가능성을 제공했다. 문헌[Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247 (1999)]을 참조한다. 주어진 폴리펩티드 또는 단백질에는 제한된 수의 접힘이 있고, 한 번 중요한 구조의 수가 해결되면 구조적 예측이 훨씬 더 정확해질 것이라는 것이 제안되었다[문헌(Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997))].
2차 구조를 예측하는 추가적인 방법에는 "스레딩(threading)"(문헌[Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997)]; 문헌[Sippl et al., Structure, 4(1):15-19 (1996)], "프로파일 분석(profile analysis)"(문헌[Bowie et al., Science, 253:164-170 (1991)]; 문헌[Gribskov et al., Meth. Enzym., 183:146-159 (1990)]; 문헌[Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13):4355-4358 (1987)], 및 "진화적 연계(evolutionary linkage)"(상기 문헌[Holm (1999)], 및 상기 문헌[Brenner (1997)] 참조)가 포함된다.
특정 실시양태에서, 항체의 변이체는 글리코실화 변이체를 포함하며, 여기서 글리코실화 부위의 수 및/또는 유형은 모 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교하여 변경된다. 특정 실시양태에서, 변이체는 천연 단백질보다 더 많거나 더 적은 수의 N-연결 글리코실화 부위를 포함한다. N-연결 글리코실화 부위는 하기 순서가 특징이다: Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr, 여기서 X로 지정된 아미노산 잔기는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 잔기일 수 있다. 이 서열을 생성하기 위한 아미노산 잔기의 치환은 N-연결 탄수화물 사슬의 추가를 위한 잠재적인 새로운 부위를 제공한다. 대안적으로, 이 서열을 제거하는 치환은 기존의 N-연결 탄수화물 사슬을 제거할 것이다. 또한, 하나 이상의 N-연결 글리코실화 부위(통상적으로, 자연 발생하는 것)가 제거되고, 하나 이상의 새로운 N-연결 부위가 생성되는 N-연결 탄수화물 사슬의 재배열이 제공된다. 추가의 바람직한 항체 변이체는 모 아미노산 서열과 비교하여 하나 이상의 시스테인 잔기가 다른 아미노산(예를 들어, 세린)으로부터 결실되거나 치환된 시스테인 변이체를 포함한다. 시스테인 변이체는 불용성 봉입체를 분리한 후와 같이 항체를 생물학적 활성 형태로 다시 접어야 할 때 유용할 수 있다. 시스테인 변이체는 일반적으로 천연 단백질보다 더 적은 시스테인 잔기를 가지며, 통상적으로 짝을 이루지 않은 시스테인으로 인한 상호작용을 최소화하기 위해 짝수를 갖는다.
특정 실시양태에 따르면, 바람직한 아미노산 치환은 (1) 단백질 분해에 대한 감수성 감소, (2) 산화에 대한 감수성 감소, (3) 단백질 복합체 형성을 위한 결합 친화도 변경, (4) 결합 친화도 변경, 및/또는 (4) 이러한 폴리펩티드에 다른 물리화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 변형하는 것이다. 특정 실시양태에 따르면, 단일 또는 다중 아미노산 치환(특정 실시양태에서, 보존적 아미노산 치환)은 자연-발생 서열(특정 실시양태에서, 분자간 접촉을 형성하는 도메인(들) 외부의 폴리펩티드 부분)에서 이루어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 보존적 아미노산 치환은 통상적으로 모 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키지 않을 수 있다(예를 들어, 대체 아미노산은 모 서열에서 발생하는 나선을 깨뜨리는 경향이 있어서는 안 되며, 또는 모 서열을 특징짓는 다른 유형의 2차 구조를 교란하는 경향이 있어서도 안 됨). 당업계에 인정된 폴리펩티드 2차 및 3차 구조의 예는 문헌[Proteins, Structures and Molecular Principles]에 기재되어 있다(문헌[Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)]; 문헌[Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)]; 및 문헌[Thornton et al. Nature 354:105 (1991)], 이는 각각 본원에 참고로 포함됨).
특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 중합체, 지질 또는 다른 부분과 화학적으로 결합될 수 있다.
결합제는 생체적합성 프레임워크 구조에 통합된 본원에 기재된 CDR 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 한 예에서, 생체적합성 프레임워크 구조는 국부적 표면 영역에서 항원(예를 들어, CDRs, 가변 영역 등)에 결합하는 아미노산의 하나 이상의 서열을 디스플레이할 수 있는 형태적으로 안정적인 구조적 지지체, 또는 프레임워크, 또는 스캐폴드를 형성하기에 충분한 폴리펩티드 또는 이의 부분을 포함한다. 이러한 구조는 자연 발생 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 "접힘"(구조적 모티프)일 수 있거나, 자연 발생 폴리펩티드 또는 접힘에 비해 아미노산의 추가, 결실 또는 치환과 같은 하나 이상의 변형을 가질 수 있다. 이러한 스캐폴드는 인간, 기타 포유동물, 기타 척추동물, 무척추동물, 식물, 박테리아 또는 바이러스와 같은 임의의 종(또는 하나 초과의 종)의 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다.
통상적으로, 생체적합성 프레임워크 구조는 면역글로불린 도메인 이외의 단백질 스캐폴드 또는 골격을 기반으로 한다. 예를 들어, 피브로넥틴, 안키린, 리포칼린, 네오카르지노스테인, 시토크롬 b, CP1 아연 집게, PST1, 코일드 코일(coiled coil), LACI-D1, Z 도메인 및 텐다미스타트 도메인을 기반으로 하는 것들이 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Nygren and Uhlen, 1997, Curr. Opin. in Struct. Biol., 7, 463-469] 참조).
본 발명의 항체는 본원에 기재된 인간화 항체를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 본원에 기재된 것과 같은 인간화 항체는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 생성될 수 있다(문헌[Zhang, W., et al., Molecular Immunology. 42(12):1445-1451, 2005]; 문헌[Hwang W. et al., Methods.36(1):35-42, 2005]; 문헌[Dall'Acqua WF, et al., Methods 36(1):43-60, 2005]; 및 문헌[Clark, M., Immunology Today.21(8):397- 402, 2000]).
항체가 상기 기재된 바와 같이 CDR1-H, CDR2-H, CDR3-H, CDR1-L, CDR2-L 및 CDR3-L 중 하나 이상을 포함하는 경우, 이는 이들 서열을 코딩하는 DNA를 함유하는 숙주 세포로부터의 발현에 의해 수득될 수 있다. 각 CDR 서열을 코딩하는 DNA는 CDR의 아미노산 서열에 기초하여 결정될 수 있고, 올리고뉴클레오티드 합성 기술, 부위 특이적 돌연변이 유도 및 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 적절하게 사용하여 임의의 원하는 항체 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 DNA 서열과 함께 합성될 수 있다. 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역에 대한 DNA 코딩은 GenBank®와 같은 유전자 서열 데이터베이스로부터 당업자에게 널리 이용 가능하다.
일단 합성되면, 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 코딩하는 DNA는 임의의 수의 공지된 발현 벡터를 사용하여 핵산 절제, 결찰, 형질전환 및 형질감염을 위한 다양한 공지된 절차 중 임의의 것에 따라 증식 및 발현될 수 있다. 따라서, 특정 실시양태에서 항체 단편의 발현은 대장균과 같은 원핵 숙주에서 바람직할 수 있다(예를 들어, 문헌[Pluckthun et al., 1989 Methods Enzymol. 178:497-515] 참조). 특정 다른 실시양태에서, 항체 또는 이의 단편의 발현은 효모(예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 및 피히아 파스토리스(Pichia pasteris)), 동물 세포 (포유류 세포 포함) 또는 식물 세포를 포함하는 진핵 숙주 세포에서 바람직할 수 있다. 적합한 동물 세포의 예는 골수종(예컨대, 마우스 NSO 계통), COS, CHO 또는 하이브리도마 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 식물 세포의 예로는 담배, 옥수수, 대두, 및 벼 세포가 포함된다.
항체 가변 및/또는 불변 영역을 코딩하는 DNA를 함유하는 복제가능한 발현 벡터는 항체 생산이 일어날 것인 적절한 세포주, 예를 들어 마우스 NSO 계통과 같은 비생산성 골수종 세포주 또는 대장균과 같은 박테리아를 형질전환하기 위해 제조 및 사용될 수 있다. 효율적인 전사 및 번역을 얻기 위해, 각 벡터의 DNA 서열은 적절한 조절 서열, 특히 가변 도메인 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터 및 리더 서열을 포함해야 한다. 이러한 방식으로 항체를 생산하는 특정 방법은 일반적으로 잘 알려져 있고, 일상적으로 사용된다. 예를 들어, 기본 분자 생물학 절차는 문헌[Maniatis et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989](Maniatis et al, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, (2001) 또한 참조)에 의해 기재되어 있다. DNA 시퀀싱은 문헌[Sanger et al. PNAS 74:5463, (1977)] 및 문헌[Amersham International plc sequencing handbook]에 기재되어 있는 것과 같이 수행할 수 있으며, 부위 특이적 돌연변이 유도는 당업계에 공지된 방법(문헌[Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12:9441, (1984)]; 문헌[Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-92 (1985)]; 문헌[Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154:367-82 (1987)]; 문헌[the Anglian Biotechnology Ltd. handbook])에 따라 수행될 수 있다. 또한, 다수의 간행물이 DNA 조작, 발현 벡터 생성, 적절한 세포의 형질전환 및 배양에 의한 항체 제조에 적합한 기술을 설명한다(문헌[Mountain A and Adair, J R in Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (ed. Tombs, M P, 10, Chapter 1, 1992, Intercept, Andover, UK)]; 문헌["Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F.M. Ausubel (ed.), Wiley Interscience, New York]).
하나 이상의 상기 언급된 CDR을 함유하는 본 발명에 따른 항체의 친화도를 개선하는 것이 바람직한 경우, CDR 유지(문헌[Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995)]), 사슬 셔플링(문헌[Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992]), 대장균 돌연변이 균주의 사용(문헌[Low et al., J. Mol. Biol., 250, 350-368, 1996]), DNA 셔플링(문헌[Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997]), 파지 디스플레이(문헌[Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 7-88, 1996]) 및 성적 PCR(문헌[Crameri, et al., Nature, 391, 288-291, 1998])을 포함하는 다수의 친화도 성숙 프로토콜에 의해 수득될 수 있다. 친화도 성숙의 이러한 모든 방법은 문헌[Vaughan et al. Nature Biotech., 16, 535-539, 1998]에 의해 논의된다.
항체와 같은 일부 단백질은 다양한 번역 후 변형을 겪을 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 이러한 변형의 유형과 정도는 종종 단백질을 발현하는 데 사용되는 숙주 세포주와 배양 조건에 따라 달라진다. 이러한 변형은 글리코실화, 메티오닌 산화, 디케토피페리진 형성, 아스파르테이트 이성질체화 및 아스파라긴 탈아미드화의 변형을 포함할 수 있다. 빈번한 변형은 카르복시펩티다아제의 작용으로 인한 카르복시-말단 염기성 잔기(예컨대, 라이신 또는 아르기닌)의 손실이다(문헌[Harris, R.J. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995]에 기재된 것과 같음).
7.8 약학적 조성물
본 발명의 RPP를 함유하는 약학적 조성물이 또한 제공된다. 이러한 조성물은 약학적으로 허용가능한 물질, 및 생리학적으로 허용가능한 제형 물질과의 혼합물로 치료학적 또는 예방학적 유효량의 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다.
약학적 조성물은, 예를 들어, pH, 삼투압 농도, 점도, 투명도, 색상, 등장성, 냄새, 무균성, 안정성, 조성물의 용해 또는 방출 속도, 흡착 또는 침투를 변형, 유지 또는 보존하기 위한 제형 물질을 함유할 수 있다.
적합한 제형 물질은, 이에 제한되지는 않지만, 아미노산(예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신); 항균제; 항산화제(예컨대, 아스코르브산, 아황산나트륨 또는 아황산수소나트륨); 완충제(예컨대, 붕산염, 중탄산염, Tris-HCl, 시트르산염, 인산염, 기타 유기산); 증량제(예컨대, 만니톨 또는 글리신), 킬레이트제(예컨대, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)); 착화제(예컨대, 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린 또는 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린); 필러; 단당류; 이당류 및 기타 탄수화물(예컨대, 포도당, 만노스 또는 덱스트린); 단백질(예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린); 착색제; 향미제 및 희석제; 유화제; 친수성 폴리머(예컨대, 폴리비닐피롤리돈); 저분자량 폴리펩티드; 염-형성 반대이온(예컨대, 나트륨); 방부제(예컨대, 염화벤잘코늄, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소); 용매(예컨대, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜); 당 알코올(예컨대, 만니톨 또는 소르비톨); 현탁제; 계면활성제 또는 습윤제(예컨대, 플루로닉, PEG, 소르비탄 에스테르, 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 트리톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 티록사팔); 안정성 향상제(자당 또는 소르비톨); 등장성 강화제(예컨대, 알칼리 금속 할로겐화물(바람직하게는, 염화나트륨 또는 염화칼륨, 만니톨 소르비톨), 전달 비히클, 희석제, 부형제 및/또는 약학적 보조제를 포함한다. 중성 완충 식염수 또는 동종 혈청 알부민과 혼합된 식염수가 적절한 희석제의 예이다. 적절한 산업 표준에 따라 벤질 알코올과 같은 방부제를 첨가할 수도 있다. 조성물은 희석제로서 적절한 부형제 용액(예를 들어, 수크로스)을 사용하여 동결건조물로 제형화될 수 있다. 적합한 성분은 사용된 용량 및 농도에서 수혜자에게 무독성이다. 약학적 제형에 사용될 수 있는 성분의 추가 예는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed. (1980) and 20th Ed. (2000), Mack Publishing Company, Easton, PA]에 나타나 있다.
선택적으로, 조성물은, 여기에 제공된 비-배타적인 예인, 하나 이상의 생리학적 활성제, 예를 들어, 항혈관신생 물질, 화학요법 물질(예컨대, 카페시타빈, 5-플루오로우라실 또는 독소루비신), 진통 물질 등을 추가로 포함한다. 다양한 특정 실시양태에서, 조성물은 RPP에 더하여 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 생리학적 활성제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 예시적인 약학적으로 허용가능한 염은 산 부가염(단백질의 유리 아미노기와 함께 형성됨)을 포함하며, 이는, 예를 들어, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산으로 형성된다. 유리 카르복실기로 형성된 염은 또한, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화 제2철과 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 제형화 시, 용액은 투여 제형과 양립가능한 방식으로 치료적으로 효과적인 양으로 투여될 것이다.
담체는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅제, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 추가로 포함할 수 있다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 성분과 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 치료 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 보조 활성 성분이 또한 조성물에 포함될 수 있다. "약학적으로 허용가능한"이라는 문구는 인간에게 투여될 때 알레르기 반응 또는 유사한 이상 반응을 일으키지 않는 분자 실체 및 조성물을 의미한다.
최적의 약학적 조성물은, 예를 들어, 의도된 투여 경로, 전달 형식 및 원하는 투여량에 따라 당업자에 의해 결정될 것이다. 예를 들어, 상기 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences]를 참조한다. 이러한 조성물은 폴리펩티드의 물리적 상태, 안정성, 생체 내 방출 속도 및 생체 내 제거 속도에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 적합한 조성물은 주사용 수, 비경구 투여용 생리 식염수일 수 있다.
7.8.1 약학적 활성 성분의 함량
통상적인 실시양태에서, 활성 성분(즉, 본 발명의 단백질 및 폴리펩티드)은 약학적 조성물에 적어도 0.01 mg/ml, 적어도 0.1 mg/ml, 적어도 0.5 mg/ml, 또는 적어도 1 mg/ml의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 활성 성분은 약학적 조성물에 적어도 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml 또는 25 mg/ml의 농도로 존재한다. 특정 실시양태에서, 활성 성분은 약학 조성물에 적어도 30 mg/ml, 35 mg/ml, 40 mg/ml, 45 mg/ml 또는 50 mg/ml의 농도로 존재한다.
7.8.2 일반적 제형
약학적 조성물은 액체, 오일, 에멀젼, 겔, 콜로이드, 에어로졸 또는 고체를 포함하는 인간 또는 수의학에 적합한 임의의 형태일 수 있다.
약학적 조성물은 경장 및 비경구 투여 경로를 포함하는 인간 또는 수의학에 적합한 임의의 투여 경로에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 약학적 조성물은 흡입에 의한 투여를 위해 제형화된다. 이들 중 특정 실시양태에서, 약학적 조성물은 기화기에 의한 투여를 위해 제형화된다. 이들 중 특정 실시양태에서, 약학적 조성물은 분무기에 의한 투여용으로 제형화된다. 이들 중 특정 실시양태에서, 약학적 조성물은 에어로졸라이저에 의한 투여용으로 제형화된다.
다양한 실시양태에서, 약학적 조성물은 경구 투여용, 협측 투여용, 또는 설하 투여용으로 제형화된다.
일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 정맥 내, 근육 내 또는 피하 투여용으로 제형화된다.
일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 척추강 내 또는 뇌실 내 투여를 위해 제형화된다.
일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 국소 투여용으로 제형화된다.
7.8.3 주사에 적합한 약리학적 조성물
정맥 내, 피부 또는 피하 주사 또는 고통 부위에 주사하는 경우, 활성 성분은 발열원이 없고 적절한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용가능한 수용액 형태일 것이다. 당업자는, 예를 들어, 염화나트륨 주입, 링거 주입, 젖산 링거 주입과 같은 등장성 비히클을 사용하여 적절한 용액을 잘 제조할 수 있다. 필요에 따라 방부제, 안정제, 완충제, 항산화제 및/또는 기타 첨가제가 포함될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 단위 투여 형태는 바이알, 앰플, 병, 또는 미리 충전된 주사기이다. 일부 실시양태에서, 단위 투여 형태는 0.01 mg, 0.1 mg, 0.5 mg, 1 mg, 2.5 mg, 5 mg, 10 mg, 12.5 mg, 25 mg, 50 mg, 75 mg, 또는 100 mg의 약학적 조성물을 함유한다. 일부 실시양태에서, 단위 투여 형태는 125 mg, 150 mg, 175 mg, 또는 200 mg의 약학적 조성물을 함유한다. 일부 실시양태에서, 단위 투여 형태는 250 mg의 약학적 조성물을 함유한다.
통상적인 실시양태에서, 단위 투여 형태의 약학적 조성물은 액체 형태이다. 다양한 실시양태에서, 단위 투여 형태는 0.1 mL 내지 50 ml의 약학적 조성물을 함유한다. 일부 실시양태에서, 단위 투여 형태는 1 ml, 2.5 ml, 5 ml, 7.5 ml, 10 ml, 25 ml 또는 50 ml의 약학적 조성물을 함유한다.
특정 실시양태에서, 단위 투여 형태는 0.01 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.5 mg/ml, 또는 1 mg/ml의 농도로 1 ml의 약학적 조성물을 함유하는 바이알이다. 일부 실시양태에서, 단위 투여 형태는 0.01 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.5 mg/ml, 또는 1 mg/ml의 농도로 2 ml의 약학적 조성물을 함유하는 바이알이다.
일부 실시양태에서, 단위 투여 형태의 약학적 조성물은 가용화에 적합한, 동결건조물과 같은 고체 형태이다.
피하, 피내, 또는 근육 내 투여에 적합한 단위 투여 형태 실시양태는 미리 로딩된 주사기, 자동-주사기, 및 자동주사 펜을 포함하고, 각각은 상기 기재된 약학적 조성물의 미리 결정된 양을 함유한다.
다양한 실시양태에서, 단위 투여 형태는 주사기 및 미리 결정된 양의 약학적 조성물을 포함하는 사전 로딩된 주사기이다. 소정의 사전 로딩된 주사기 실시양태에서, 주사기는 피하 투여에 적합하다. 특정 실시양태에서, 주사기는 자가-투여에 적합하다. 특정 실시양태에서, 사전 로딩된 주사기는 일회용 주사기이다.
다양한 실시양태에서, 사전 로딩된 주사기는 약 0.1 mL 내지 약 0.5 mL의 약학적 조성물을 함유한다. 특정 실시양태에서, 주사기는 약 0.5 mL의 약학적 조성물을 함유한다. 특정 실시양태에서, 주사기는 약 1.0 mL의 약학적 조성물을 함유한다. 특정 실시양태에서, 주사기는 약 2.0 mL의 약학적 조성물을 함유한다.
특정 실시양태에서, 단위 투여 형태는 자가주사 펜이다. 자가주사 펜은 본원에 기재된 바와 같은 약학적 조성물을 함유하는 자가주사 펜을 포함한다. 일부 실시양태에서, 자가주사 펜은 미리 결정된 부피의 약학적 조성물을 전달한다. 다른 실시양태에서, 자가주사 펜은 사용자에 의해 설정된 일정 부피의 약학적 조성물을 전달하도록 구성된다.
다양한 실시양태에서, 자가주사 펜은 약 0.1 mL 내지 약 5.0 mL의 약학적 조성물을 함유한다. 특정 실시양태에서, 자가주사 펜은 약 0.5 mL의 약학적 조성물을 함유한다. 특정 실시양태에서, 자가주사 펜은 약 1.0 mL의 약학적 조성물을 함유한다. 다른 실시양태에서, 자가주사 펜은 약 5.0 mL의 약학적 조성물을 함유한다.
7.8.4 재조합형 과면역과 혈장 IVIg의 혼합물
일부 실시양태에서, 재조합형 과면역은 IVIg의 항-병원체 역가를 증가시키기 위해 통상적인 혈장 IVIg에 스파이킹된다. 일부 실시양태에서, 여러 항-병원체 재조합형 과면역은 통상적인 혈장 IVIg에 스파이킹되고, 예를 들어, Hib, 폐렴구균, 인플루엔자 A 바이러스 및 파상풍에 대한 과면역이 동시에 혈장 IVIg에 스파이킹되어 원발성 면역 결핍 환자를 치료한다. 과면역의 스파이킹은 1차 면역 결핍 환자가 특히 취약한 병원체에 대한 항체 역가를 증가시킨다. 임의의 수의 스파이크-인(spike-ins)을 혈장 IVIg와 혼합하여 임의의 수의 병원체에 대해 증가된 역가를 생성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 스파이크-인 재조합형 과면역은 약사에 의해 혈장 IVIg와 혼합된다. 일부 실시양태에서, 스파이크-인 재조합형 과면역은 제조자에 의해 혈장 IVIg와 혼합된다.
7.9 단위 투여 형태
약학적 조성물은 단위 투여 형태로 편리하게 제공될 수 있다.
단위 투여 형태는 통상적으로 약학적 조성물의 하나 이상의 특정 투여 경로에 적합할 것이다.
다양한 실시양태에서, 단위 투여 형태는 흡입에 의한 투여에 적합하다. 이들 중 특정 실시양태에서, 단위 투여 형태는 기화기에 의한 투여에 적합하다. 이들 중 특정 실시양태에서, 단위 투여 형태는 분무기에 의한 투여에 적합하다. 이들 중 특정 실시양태에서, 단위 투여 형태는 에어로졸라이저에 의한 투여에 적합하다.
다양한 실시양태에서, 단위 투여 형태는 경구 투여, 협측 투여, 또는 설하 투여에 적합하다.
일부 실시양태에서, 단위 투여 형태는 정맥 내, 근육 내 또는 피하 투여에 적합하다.
일부 실시양태에서, 단위 투여 형태는 척추강 내 또는 뇌실 내 투여에 적합하다.
일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 국소 투여용으로 제형화된다.
단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성하는 화합물의 양일 것이다.
8. RPP 활성
RPP, 예를 들어, 본 발명에 따른 항체는 5 x 10-7M 이하, 1 x 10-7M 이하, 0.5 x 10-7M 이하, 1 x 10-8M 이하, 1 x 10-9M 이하, 1 x 10-10M 이하, 1 x 10-11M 이하, 또는 이하 1 x 10-12M의 항원 표적에 대한 결합 친화도를 가질 수 있다.
항체가 결합을 억제하는 정도 뿐만 아니라 RPP의 친화도는 통상적인 기술, 예를 들어 문헌[Scatchard et al. Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660-672 (1949)] 또는 표면 플라즈몬 공명(SPR; BIAcore, Biosensor, Piscataway, NJ)에 의해 기재된 것들을 사용하여 당업에 통상적인 기술을 가진 자에 의해 결정될 수 있다. 표면 플라즈몬 공명을 위해 표적 분자는 고체상에 고정되고, 유동 셀을 따라 흐르는 이동상의 리간드에 노출된다. 고정된 표적에 리간드 결합이 발생하면, 국부적인 굴절률이 변화하여 SPR 각도의 변화로 이어지며, 이는 반사광의 세기 변화를 감지하여 실시간으로 모니터링할 수 있다. SPR 신호의 변화 속도는 결합 반응의 결합 및 해리 단계에 대한 겉보기 속도 상수를 산출하기 위해 분석될 수 있다. 이들 값의 비는 겉보기 평형 상수(친화도)를 제공한다[예를 들어, 문헌[Wolff et al., Cancer Res. 53:2560-65(1993)] 참조).
9. RPP에 반응하는 질병의 치료 방법
또 다른 양태에서, RPP에 반응성인 질병을 갖는 대상체를 치료하기 위한 방법이 제시된다. 질병은 암, AIDS, 알츠하이머병 또는 바이러스 또는 박테리아 감염일 수 있다. 특정 양태에서, RPP는 장기, 조직 또는 세포 집단을 공여자로부터 숙주로 이식하는 동안 내성을 유도하는 데 사용된다.
용어 "치료", "치료하는" 등은 일반적으로 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미하기 위해 사용된다. 이 효과는 질병, 상태 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다는 점에서 예방적일 수 있고/있거나, 질병 또는 상태 및/또는 질병 또는 상태에 기인하는 증상과 같은 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 치유의 관점에서 치료적일 수 있다. 본원에 사용된 "치료"는 포유동물, 특히 인간의 질병 또는 상태의 모든 치료를 포함하며, 하기를 포함한다: (a) 질병 또는 상태에 걸리기 쉬울 수 있지만 아직 가지고 있는 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질병 또는 병태가 발생하는 것을 방지하는 것; (b) 질병 또는 병태를 억제하는 것(예를 들어, 이의 발병을 정지시키는 것); 또는 (c) 질병 또는 병태를 완화시키는 것(예를 들어, 질병 또는 병태의 퇴행을 유발하는 것, 하나 이상의 증상의 개선을 제공하는 것). 임의의 병태에서의 개선은 당업계에 공지된 표준 방법 및 기술에 따라 쉽게 평가될 수 있다. 질병의 방법에 의해 치료되는 대상체의 집단은 바람직하지 않은 병태 또는 질병을 앓고 있는 대상체 뿐만 아니라 병태 또는 질병의 발병 위험이 있는 대상체를 포함한다.
"치료적 유효 용량" 또는 "유효량"이라는 용어는 이것이 투여되는 목적하는 효과를 생성하는 용량 또는 양을 의미한다. 정확한 투여량 또는 양은 치료의 목적에 따라 달라질 것이고, 공지된 기술을 사용하여 당업자에 의해 확인될 수 있을 것이다(문헌[Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding] 참조).
"충분한 양"이라는 용어는 원하는 효과를 내기에 충분한 양을 의미한다.
"치료적 유효량"이라는 용어는 질병의 증상을 개선하는 데 효과적인 양이다. 치료적 유효량은 예방이 치료법으로 간주될 수 있기 때문에 "예방적 유효량"일 수 있다.
용어 "개선"은 질병 상태, 예를 들어, 신경퇴행성 질병 상태의 치료에서 예방, 중증도 또는 진행의 감소, 관해 또는 치유를 포함하는 치료학적으로 유익한 결과를 지칭한다.
생체 내 및/또는 시험관 내 분석은 최적의 투여량 범위를 식별하는 데 도움이 되도록 선택적으로 사용될 수 있다. 제형에 사용되는 정확한 용량 역시 투여 경로 및 상태의 심각성에 따라 달라지며, 의사의 판단과 각 피험자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효 용량은 체외 또는 동물 모델 시험 시스템에서 파생된 용량-반응 곡선에서 추론할 수 있다.
투여되는 실제 양, 투여 속도 및 시간 경과는 치료되는 단백질 응집 질환의 성질 및 중증도에 따라 달라질 것이다. 치료 처방, 예를 들어, 복용량 등에 대한 결정은 일반의 및 기타 의사의 책임 하에 있으며, 통상적으로 치료할 장애, 개별 환자의 병태, 전달 부위, 투여 방법, 및 의사에게 알려진 기타 요인을 고려한다. 위에서 언급한 기술 및 프로토콜의 예는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A.(ed), 1980]에서 찾을 수 있다.
일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 흡입, 경구, 협측 투여, 설하 투여, 주사 또는 국소 적용에 의해 투여된다.
일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 뉴런의 생존 또는 도파민 방출을 조절하기에 충분한 양으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 주요 칸나비노이드는 용량당 1 g 미만, 500 mg 미만, 100 mg 미만, 10 mg 미만의 양으로 투여된다.
일부 실시양태에서, 약학적 조성물은 1일 1회, 1일 2 내지 4회, 1주 2 내지 4회, 1주 1회, 또는 2주마다 1회 투여된다.
10. 실시예
하기는 본 발명을 수행하기 위한 구체적인 실시양태의 예이다. 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되며, 어떤 식으로든 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력했지만 약간의 실험적 오류와 편차는 물론 허용되어야 한다.
본 발명의 실시는 달리 명시되지 않는 한, 당해 기술 분야의 기술 내에서 단백질 화학, 생화학, 재조합 DNA 기술 및 약리학의 통상적인 방법을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 모두 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌[T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993)]; 문헌[A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition)]; 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)]; 문헌[Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)]; 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990)]; 문헌[Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3 rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B(1992)]를 참조한다.
10.1.1 실시예 1: 인간 흉선세포 또는 T 세포에 대한 활성을 갖는 RPP 라이브러리 생성
인간 흉선세포 또는 T 세포, 즉 재조합 인간 항-흉선세포 글로불린(rhATG)을 표적으로 하는 4개의 RPP 라이브러리를 생성하였다. 시험관 내 및 생체 내 연구 모두 사용하여 상기 rhATG와 상업적으로 이용 가능한 토끼-ATG(Thymoglobulin, Sanofi) 간의 기능적 유사성을 입증했다. 중쇄 및 경쇄 CDR3 서열은 RPP 10-13의 상기 표 5에 제공되어 있다.
상업용 항-흉선세포 글로불린(ATG, (Thymoglobulin, Sanofi))은 이식 내성을 유도하는 데 유용하며, 뉴질랜드 토끼를 인간 흉선세포로 면역시켜 제조하고; 수천 마리의 동물에서 혈액을 채취하고 혈장에서 항체를 정제한다. 본원에 개시된 RPP 라이브러리, 즉 rhATG는 폴리클로날 ATG의 효능 이점과 완전한 인간 재조합 RPP 라이브러리의 안전성 이점을 결합한다.
먼저, 인간 면역글로불린 유전자가 삽입된 형질전환 마우스를 인간 흉선세포 또는 인간 T 세포로 면역화시켰다. 3주 동안 2마리의 Trianni 마우스에 발바닥 주사를 매주 2회 수행한 후 2주 동안 부스트를 실시했다. 각 시점에서 각 마우스에 100만 내지 200만 개의 흉선세포를 주입했다. 최종 부스트 전에, 흉선세포 항체의 혈청 역가는 1:200에서 시작하여 1:145,000에서 끝나는 각 동물 혈청의 희석 시리즈를 사용하여 유세포 분석에 의해 평가하였다.두 동물 모두에서 강한 혈청 반응을 관찰했으며 한 동물은 약간 더 강한 반응을 보였다. 림프절(슬와, 서혜부, 겨드랑이 및 장간막)은 희생 후 외과적으로 제거하였다. 각 동물에 대한 단일 세포 현탁액은 수동 파괴 후 70 μm 필터를 통과시켜 만들었다. 다음으로, EasySepTM Mouse Pan-B Cell Isolation Kit(Stemcell Technologies) 음성 선택 키트를 사용하여 각 샘플에서 B 세포를 분리했다. 림프절 B 세포 집단은 C-Chip 혈구계산기(Incyto)에서 계수하여 정량화하고 트립판 블루를 사용하여 생존율을 평가했다. 그런 다음 세포를 12% OptiPrepTM 밀도 구배 배지(Sigma)가 포함된 인산염 완충 식염수(PBS)에서 5,000 내지 6,000 세포/mL로 희석했다. 이러한 세포 혼합물을 미세 유체 캡슐화에 사용하였다. 에멀젼 액적 미세유체 플랫폼을 통해 6마리 동물 각각에서 약 백만 개의 B 세포를 수행했다.
에멀젼 액적 미세유체 플랫폼 또는 볼텍스 에멀젼을 사용하여, 천연 중경량 Ig 쌍이 손상되지 않은, 단일 세포의 RNA로부터 scFv를 코딩하는 DNA 라이브러리를 생성했다. DNA 라이브러리를 생성하는 방법은 1) 폴리(A) + mRNA 캡처, 2) 다중 중첩 확장 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(OE-RT-PCR), 3) 딥 시퀀싱 또는 효모 디스플레이 라이브러리를 위한, 아티팩트 제거 및 어댑터 추가를 위한 이중 PCR로 구분하였다. scFv 라이브러리는 양성 역가를 달성한 각 동물의 약 백만개의 B 세포에서 생성된다.
폴리(A) + mRNA 캡처를 위해, 유리(Dolomite)로 제작된 맞춤형 공동 흐름 에멀젼 액적 미세유체 칩을 사용하였다. 미세유체 칩에는 플루오로카본 오일(Dolomite)에 대한 두 개의 입력 채널, 위에서 설명한 세포 현탁액 믹스에 대한 입력 채널 하나, 세포 용해 완충액(20 mM Tris pH 7.5, 0.5 M NaCl, 1 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 0.5% Tween-20, 및 20 mM 디티오트레이톨) 중의 1.25 mg/ml에서 올리고-dT 비드(NEB)에 대한 입력 채널 하나를 갖는다. 입력 채널은 대부분의 칩 길이에 대해 50 μm x 150 μm로 에칭되고, 액적 접합부에서 55 μm로 좁으며, 소수성 Pico-Glide(Dolomite)로 코팅하였다. 3개의 Mitos P-Pump 압력 펌프(Dolomite)가 칩을 통해 액체를 펌핑하는 데 사용되었다. 액적 크기는 압력에 따라 다르지만, 통상적으로 직경이 약 45 μm인 액적이 최적으로 안정적이었다. 에멀젼을 냉각된 2 ml 미세원심분리 튜브에 수집하고, mRNA 캡처를 위해 40℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. Pico-Break(Dolomite)을 사용하여 액적에서 비드를 추출하였다. 일부 실시양태에서, 볼텍스를 사용하여 유사한 단일 세포 분할 에멀젼을 제조한다.
다중 OE-RT-PCR의 경우, 유리 Telos 액적 에멀젼 미세유체 칩(Dolomite)을 사용하였다. mRNA-결합 비드를 OE-RT-PCR 믹스에 재현탁하고, 27 μm 액적을 생성하는 압력에서 미네랄 오일-기반 계면활성제 믹스(GigaGen에서 상업적으로 사용 가능)를 사용하여 미세 유체 칩에 주입하였다. OE-RT-PCR 믹스에는 2x 1-단계 RT-PCR 완충액, 2.0 mM MgSO4, SuperScript III 역전사효소, 및 플래티넘 Taq(Thermo Fisher Scientific)에 더하여 IgK C 영역, IgG C 영역, 및 모든 V 영역에 대한 프라이머 혼합물이 포함되어 있다. 중첩 영역은 Gly-Ser가 풍부한 scFv 링커 서열을 코딩하는 DNA 서열이다. 액적 파괴 용액(GigaGen에서 상업적으로 이용 가능)을 사용하여 액적에서 DNA 단편을 회수한 다음 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 일부 실시양태에서, 볼텍스를 사용하여 유사한 OE-RT-PCR 에멀젼을 제조하였다.
이중 PCR(Nested PCR)의 경우, 정제된 OE-RT-PCR 생성물을 먼저 150 V에서 80분 동안 1.7% 아가로스 겔에서 러닝하였다. 연결된 생성물에 해당하는 1200 내지 1500 염기쌍(bp)의 밴드를 NucleoSpin Gel과 PCR Clean-up Kit(Macherey Nagel)를 사용하여 절제하고 정제하였다. 그런 다음 PCR을 수행하여 Illumina 시퀀싱 또는 효모 디스플레이용 어댑터를 추가하고, 시퀀싱의 경우 후속하는 다음 세대 시퀀싱 단계에서 염기 소집 정확도를 높이기 위해 7개 뉴클레오티드의 무작위자를 추가한다. 이중 PCR은 프라이머를 포함하는 Illumina 어댑터 또는 효모 발현 벡터로 클로닝하기 위한 프라이머를 사용하여 2x NEBNext 고충실도 증폭 믹스(NEB)로 수행하였다. 이중 PCR 생성물은 150 V에서 50분 동안 1.2% 아가로스 겔에서 러닝하였다. NucleoSpin Gel과 PCR Clean-up Kit(Macherey Nagel)를 사용하여 800 내지 1100 bp의 밴드를 절제하고 정제하였다.
GigaLink™ scFv 라이브러리를 전장 CHO 발현 라이브러리로 변환하기 위해 이중 외부 PCR 프라이머를 사용하여 scFv 라이브러리의 5' 및 3' 말단에 깁슨 어셈블리용 오버행이 있는 어댑터를 추가하였다. 그런 다음 NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(NEB, Ipswich, MA, USA)를 사용하여 scFv 라이브러리를 단일 프로모터, 경쇄 Ig에 대한 분비 리더 서열 및 나머지 IgG1 불변 영역을 포함하는 벡터에 삽입하여 클로닝된 scFv 라이브러리를 생성하였다. 이러한 중간 라이브러리를 대장균으로 형질전환하고 LB-암피실린 플레이트에 펼친 후 ZymoPURE II Plasmid Maxiprep Kits(Zymo Research, Irvine, CA, USA)를 사용하여 플라스미드 정제를 위해 0.5 내지 100만 콜로니를 긁어 모았다. 전장 항체 라이브러리를 생성하기 위해, GA1의 생성물을 BamHI-HF(NEB, Ipswich, MA, USA)로 선형화하고 이를 벡터로 사용하여 경쇄 Ig 불변 영역, 경쇄 Ig에 대한 폴리(A) 신호, IgG 유전자에 대한 프로모터 및 IgG 유전자에 대한 분비 리더 서열을 포함하는 합성 앰플리콘을 삽입함으로써 두 번째 깁슨 어셈블리를 수행하였다. 그런 다음 전장 라이브러리를 대장균으로 형질전환하고, LB-암피실린 플레이트에 펼치고, 50만 초과의 콜로니를 긁어내고, 플라스미드를 ZymoPURE II 플라스미드 Maxiprep 키트(Zymo Research)로 정제하여 형질전환용 전장 재조합 과면역 맥시프렙 라이브러리를 만들었다.
부착성 Flp-In™-CHO 세포주는 현탁 배양을 위해 게놈 통합 FRT 부위(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 적응시켰다. 적응 과정의 모든 단계에서, "Ham's F-12"는 Ham's F-12(L-글루타민 포함, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 플러스 10% FBS(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 나타내며, "BalanCD"는 4 mM Glutamax(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)가 포함된 BalanCD CHO Growth A(Irvine Scientific)를 나타낸다. 이 세포주를 현탁액에 적용하기 위해, 먼저 세포를 T-플라스크의 50% Ham's F-12와 50% BalanCD의 혼합물에 계대하였다. 다음으로 세포를 25% Ham's F-12 플러스 75% BalanCD로 계대하고, 진탕 삼각 플라스크로 스위칭하였다. 그런 다음 세포를 10% Ham's F-12, 90% BalanCD + 0.2% 항응집제(Irvine Scientific, Santa Ana, CA, USA)로 계대하고, 향후 사용을 위해 보관하였다.
1억 개의 적응된 Flp-In CHO 세포를 Amaxa Nucleofector 4D(SG 완충액, 펄스 DU133; Lonza, Basel, Switzerland)를 사용하여 재조합 과면역 라이브러리당 형질감염시켰다. 이 세포를 진탕 삼각 플라스크에 넣고 37℃ 및 125 rpm의 인큐베이터에서 48시간 동안 회수하였다. 48시간 후, 세포를 계수하여 생존율을 결정하고, 세포를 1백만 세포/mL로 시딩하고, 신선한 배지에서 600 μg/mL 하이그로마이신-B(Gemini Bio, West Sacramento, CA, USA)를 사용하여 선택을 시작하였다. 7일 선택 동안 세포를 계수하고 배지를 2 내지 3일마다 교체하였다. 생존율이 95%를 초과할 때까지 확장시키는 동안 라이브러리를 600 μg/mL 하이그로마이신-B(Gemini Bio, West Sacramento, CA, USA)에 보관하였다. 세포가 95% 초과 생존하고 24시간마다 2배로 증가할 때, 세포주는 액체 질소 저장을 위해 세포 은행에 보관하였다.
항체 라이브러리를 안정적으로 발현하는 CHO 세포는 90% BalanCD CHO Growth A 배지(Irvine Scientific, Santa Ana, CA), 9% Ham's F-12(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), 1% FBS(ThermoFisher Scientific), 4mM Glutamax(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), 0.2% 응집 방지제(Irvine Scientific, Santa Ana, CA, USA)로 구성되는 배지에서 성장시켰다. 소규모 생산을 위해 세포를 250 mL 삼각 플라스크의 50 mL 배지에 1 x 106 cells/mL로 시딩하고 37℃, 5% CO2, 125 rpm에서 성장시켰다. 세포는 이러한 조건 하에서 지속적으로 성장시키고, 생산 러닝 제2, 4 및 7일에 7.5 mL CHO Feed 1(Irvine Scientific, Santa Ana, CA, USA)을 보충하였다. 상층액은 원심분리에 의해 제8일에 수확한 후 1 μm 사전-필터(EMD Millipore, Burlington, MA, USA)가 있는 0.22 μm 250 mL 필터 병(EMD Millipore, Burlington, MA, USA)을 통해 여과하였다. 수확된 세포 배양액(HCCF)은 단백질 A 정제 때까지 4℃에 보관하였다. 형질세포 재조합 과면역의 대규모 생산을 위해, 생산 조건을 약간 수정하여 동일한 배지에서 세포를 성장시켰다. 시드 트레인을 사용하여 37℃에서 2 x 107 세포에서 1.2 x 1010 세포로 배양 규모를 늘렸다. 그런 다음 세포를 5 L 플라스크에서 2 L 중 1 x 106개 세포/mL로 시딩하였다(3회; 제0일). 제2일에는 온도를 37℃에서 33℃로 변경하였다. 배양 제2, 4, 6, 8, 10 및 13일에 각 플라스크에 300 mL CHO Feed 1(Irvine Scientific, Santa Ana, CA, USA)을 공급하였다. 상청액을 제14일에 수확하였다.
수확 후, HCCF는 다음 완충액을 사용하여 MabSelect SuRe Protein A 수지(GE Life Sciences, Marlborough, MA, USA)로 정제하였다: 평형화, 체이스, 세척 2(25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.4), 세척 1(25 mM Tris, 1 M NaCl, pH 7.4), 용출(20 mM 시트르산, pH 3.0), 중화(소규모의 경우 100 mM Tris, pH 8.0, 대규모의 경우 1 M Tris, pH 9.0). 컬럼은 0.1 N NaOH로 사용 전후에 소독하였다. 형질세포 재조합 과면역의 대규모 생산을 위해, 0.5 M 아르기닌, pH 7.4로 구성된 추가 세척 3을 사용한 후 용출 전에 세척 2로 추가 세척하였다. 정제 단계는 평형화, 로드, 체이스, 세척 1, 세척 2, (대규모: 세척 3, 세척 2), 용리, 중화(용출물 분획 수집에 사용되는 튜브에 수동으로 추가) 순서이다. 재조합 과면역(RPP)은 Vivaspin 20, 30 Da 분자량 차단 스핀 농축기(Sartorius, Gottingen, Germany)를 사용하여 농축하고, PBS(소규모 생산) 또는 0.2 M 글리신, pH 4.5(대규모 생산), 그 다음 0.22 μm 여과로 제형화하였다.
ELISA를 사용해, T 세포 및 흉선세포의 표면에서 발현되는 것으로 알려진 항원에 대한 rhATG, 즉 항-T 세포 및 항-흉선세포 RPP의 결합을 시험하였다. ELISA는 CD4, CD45 및 CD81에 대한 결합을 보여주었다. 항원을 ELISA 플레이트에 1 ug/mL로 코팅하였다. EC50을 결정하기 위해 1/3 단계적 희석으로 각 항체의 100 ug/mL에서 시작하여 적정 곡선을 수행하였다. 상이한 2차 검출 항체를 사용했기 때문에, EC50 값은 토끼-ATG와 rhATG 간에 직접 비교할 수 없었다. 그러나, 각 라이브러리 내에서 이들 각각의 배경보다 더 강한 결합을 갖는 항원이 결정되었다. 항체 반응은, rhATG 및 토끼-ATG 양자의 경우, 많은 T 세포 항원에 대해 광범위하게 반응하였고, 둘 다 CD45 및 CD5에 매우 강하게 결합하고, CD4, CD11 및 CD81에 더 약하게 결합하였다(데이터는 나타내지 않음).
생체 내 검증 연구를 수행하였다. GvHD(이식편 대 숙주 질환)의 생체 내 모델을 사용하여 GvHD에 대한 ATG 치료 유도 지연의 기능적 효능을 입증하였다. 단일 공여자로부터의 1 x 10^7 인간 PBMC를 NSG 마우스에 이식하였다. 이 연구에서는 rhATG(RPP), 상업용 토끼-ATG 및 비히클 대조군과 같은 시험된 약물을 IV 주입하여 그룹당 6마리의 마우스를 사용하였다. 동물은 생착 7일 후 단일 시점에 처리하였다(6 mg/kg). 또한, 양성 대조군(8마리 마우스)은 GvHD를 예방하기 위해 일반적으로 사용되는 약물인 Abatacept를 투여받았고, 이는 제5일부터 연구 종료까지 격일로 복강 내(IP) 투여하였다. 면역 세포는 GvHD로의 진행을 나타내는 확장에 대해 유세포 분석에 의해 측정하였고, 동물을 체중 감소 및 사망으로 이어지는 GvHD의 임상적 표현에 대해 모니터링하였다.
PBMC 생착 42일 후, 아직 살아있는 모든 동물을 제거하고 각 처리 그룹에 대한 생존 분석을 완료하였다. rhATG(p=0.2, Mantel-Cox)에서는 유의한 지연이 없었고, 토끼-ATG(p=0.01, Mantel-Cox)에서는 GvHD에 대한 약간의 지연만 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음). 유세포 분석을 사용하여 이식된 PBMC를 처리 전, 처리 2일 후 및 처리 9일 후에 측정하였다. 처리 2일 후에 볼 수 있듯이, rhATG 및 토끼-ATG는 CD45+ 세포를 고갈시켰고, 이는 D45+ 세포의 완전한 생착의 지연을 유도했지만, 제9일까지 그룹 간에 유의미한 차이가 없었다(데이터는 나타내지 않음).
결과는, 비록 일부 차이점이 관찰되었지만, rhATG(RPP 라이브러리)가 현재 이용 가능한 상업용 토끼-ATG와 유사한 항원 특이적 항체 결합 프로필을 가지고 있음을 보여주었다. 또한, rhATG는 다른 투여 요법을 사용하는 마우스에서 GvHD로의 진행을 지연시키는 데 있어 상업용 토끼-ATG와 유사하게 수행한다.
10.1.2 실시예 2: 인간 공여자로부터 B형 헤모필루스 인플루엔자(Hib)에 대한 활성을 갖는 RPP 라이브러리 생성
시험관 내 및 생체 내 연구 모두를 수행하여 B형 헤모필루스 인플루엔자(Hib)에 대한 활성으로 폴리클로날 항체 풀(pAb), 즉 RPP 라이브러리를 시험하였다. Pedvax-HIB 접합 백신으로 예방접종을 받은 공여자로부터 수집된 4개의 다른 B 세포 하위유형으로 만든 항-Hib pAb를 시험하였다. 시험된 4개의 하위유형은 CD43+ 형질모세포, CD27+ 기억 B 세포, 말초 CD138+ 형질세포, 및 범-B 세포(모든 B 세포)였다. 4개의 pAb 모두는 먼저 시험관 내에서 시험하였다. CD138+ 형질세포로 만든 pAb는 시험관 내에서 가장 강력했기 때문에 이 제품을 생체 내 챌린지 모델에서 IVIG와 비교하여 시험하였다.
RPP의 중쇄 및 경쇄 CDR3 서열의 서열 번호는 RPP 3-6로 상기 표 5에 나타내었다.
CRO(BloodCenter Wisconsin, Milwaukee, WI, USA)를 사용해 두 명의 공여자(공여자 1, 26세 백인 여성, 공여자 2, 21세 아시아 남성)에게 PedvaxHIB 백신(Merck, Kenilworth, NJ, USA)을 접종하였다. 백혈구 성분채집술은 PBMC를 얻기 위해 8일 또는 9일 후에 수행하였다. 병행하여, 혈장은 백혈구 성분채집 당일 및 백신 접종 전에 별도의 채혈로부터 분리하였다. 혈장 샘플에 대한 Hib에 대한 ELISA(Alpha Diagnostics, San Antonio, TX, 하기 방법 참조)는 백신 접종 전 동일한 공여자의 혈장과 비교하여 백신에 대한 반응을 확인하였다. 샘플 수집 프로토콜은 GigaGen에 대한 IRB(Institutional Review Board) 프로토콜 #PRO00028063(Medical College of Wisconsin/Froedtert Hospital IRB)에 의해 승인되었다. 모든 참가자로부터 사전 동의를 얻었고 샘플은 익명으로 GigaGen에 배송하였다.
범-B 세포를 분리하기 위해 Human EasySep Pan-B 세포 농축 키트(Stemcell #19554, Vancouver, BC, Canada)를 사용하였다. CD43+ 세포를 분리하기 위해, 범-B 세포와 CD43에 대한 양성 선택 비드(Miltenyi #130-091-333, Bergisch Gladbach, Germany)를 사용하였다. CD27+ 세포를 분리하기 위해, CD43+ 선택의 음성 분획에 CD27 양성 선택 비드(Miltenyi #130-051-601, Bergisch Gladbach, Germany)를 적용하였다. 형질세포의 경우, EasySep Human CD138 Positive Selection Kit(Stemcell #18357, Vancouver, BC, Canada)를 PBMC에 적용하였다. 분리 후 항체 생산 세포는 CryoStor® CS10(Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Canada)을 사용하여 동결 보존하였다. 쌍을 이루는 중쇄 및 경쇄 라이브러리를 생성하기 직전에, 세포를 해동하고, 차가운 DPBS + 0.5% BSA에서 세척하고, Countess™ 세포 계수기(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에서 트립판 블루로 생존율을 평가한 다음 12% OptiPrep™ 밀도 구배 배지(Sigma, St. Louis, MO, USA)에서 μl 당 5,000 내지 6,000개 세포로 재현탁하였다. 이러한 세포 혼합물은 하기 섹션에 설명된 대로 미세유체 캡슐화에 사용하였다.
항체-생산 세포로부터의 scFv 라이브러리 생성(문헌[Adler et al., Mabs 9, 1282-1996, 2017])은 (i) 폴리(A)+ mRNA 캡처, (ii) 다중 중첩 확장 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(OE-RT-PCR) 및 (iii) 이중 PCR을 통해 아티팩트를 제거하고 심층 시퀀싱 또는 효모 디스플레이 라이브러리용 어댑터 시퀀스를 추가하는 3 단계를 포함한다.
GigaLink™ scFv 라이브러리를 전장 CHO 발현 라이브러리로 변환하기 위해 우선 이중 외부 PCR 프라이머를 사용하여 scFv 라이브러리의 5' 및 3' 말단에 깁슨 어셈블리용 오버행이 있는 어댑터를 추가하였다. 그런 다음 NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(NEB, Ipswich, MA, USA)를 사용하여 scFv 라이브러리를 단일 프로모터, 경쇄 Ig에 대한 분비 리더 서열 및 나머지 IgG1 불변 영역을 포함하는 벡터에 삽입하여 클로닝된 scFv 라이브러리를 생성하였다. 이러한 중간 라이브러리를 대장균으로 형질전환하고 LB-암피실린 플레이트에 펼친 후 ZymoPURE II Plasmid Maxiprep Kits(Zymo Research, Irvine, CA, USA)를 사용하여 플라스미드 정제를 위해 0.5 내지 100만 콜로니를 긁어 모았다. 전장 항체 라이브러리를 생성하기 위해, GA1의 생성물을 BamHI-HF(NEB, Ipswich, MA, USA)로 선형화하고 이를 벡터로 사용하여 경쇄 Ig 불변 영역, 경쇄 Ig에 대한 폴리(A) 신호, IgG 유전자에 대한 프로모터 및 IgG 유전자에 대한 분비 리더 서열을 포함하는 합성 앰플리콘을 삽입함으로써 두 번째 깁슨 어셈블리를 수행하였다. 그런 다음 전장 라이브러리를 대장균으로 형질전환하고 LB-암피실린 플레이트에 펼쳤다. 통상적으로 50만 초과의 콜로니를 긁어내고, 플라스미드를 ZymoPURE II 플라스미드 Maxiprep 키트(Zymo Research)로 정제하여 형질전환용 전장 재조합 과면역 맥시프렙 라이브러리를 만들었다.
부착성 Flp-In™-CHO 세포주는 현탁 배양을 위해 게놈 통합 FRT 부위(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 적응시켰다. 적응 과정의 모든 단계에서, "Ham's F-12"는 Ham's F-12(L-글루타민 포함, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 플러스 10% FBS(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 나타내며, "BalanCD"는 4 mM Glutamax(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)가 포함된 BalanCD CHO Growth A(Irvine Scientific)를 나타낸다. 이 세포주를 현탁액에 적용하기 위해, 먼저 세포를 T-플라스크의 50% Ham's F-12 플러스 50% BalanCD의 혼합물에 계대하였다. 다음으로 세포를 25% Ham's F-12 플러스 75% BalanCD로 계대하고, 진탕 삼각 플라스크로 스위칭하였다. 그런 다음 세포를 10% Ham's F-12, 90% BalanCD + 0.2% 항응집제(Irvine Scientific, Santa Ana, CA, USA)로 계대하고, 향후 사용을 위해 보관하였다.
1억 개의 적응된 Flp-In CHO 세포를 Amaxa Nucleofector 4D(SG 완충액, 펄스 DU133; Lonza, Basel, Switzerland)를 사용하여 재조합 과면역 라이브러리당 형질감염시켰다. 이 세포를 진탕 삼각 플라스크에 넣고 37℃ 및 125 rpm의 인큐베이터에서 48시간 동안 회수하였다. 48시간 후, 세포를 계수하여 생존율을 결정하고, 세포를 1백만 세포/mL로 시딩하고, 신선한 배지에서 600 μg/mL 하이그로마이신-B(Gemini Bio, West Sacramento, CA, USA)를 사용하여 선택을 시작하였다. 7일 선택 동안 세포를 계수하고 배지를 2 내지 3일마다 교체하였다. 생존율이 95%를 초과할 때까지 확장시키는 동안 라이브러리를 600 μg/mL 하이그로마이신-B(Gemini Bio, West Sacramento, CA, USA)에 보관하였다. 세포가 95% 초과 생존하고 24시간마다 2배로 증가할 때, 세포주는 액체 질소 저장을 위해 세포 은행에 보관하였다.
항체 라이브러리를 안정적으로 발현하는 CHO 세포는 90% BalanCD CHO Growth A 배지(Irvine Scientific, Santa Ana, CA), 9% Ham's F-12(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), 1% FBS(ThermoFisher Scientific), 4mM Glutamax(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), 0.2% 응집 방지제(Irvine Scientific, Santa Ana, CA, USA)로 구성되는 배지에서 성장시켰다. 소규모 생산을 위해 세포를 250 mL 삼각 플라스크의 50 mL 배지에 1 x 106 cells/mL로 시딩하고 37℃, 5% CO2, 125 rpm에서 성장시켰다. 세포는 이러한 조건 하에서 지속적으로 성장시키고, 생산 러닝 제2, 4 및 7일에 7.5 mL CHO Feed 1(Irvine Scientific, Santa Ana, CA, USA)을 보충하였다. 상층액은 원심분리에 의해 제8일에 수확한 후 1 μm 사전-필터(EMD Millipore, Burlington, MA, USA)가 있는 0.22 μm 250 mL 필터 병(EMD Millipore, Burlington, MA, USA)을 통해 여과하였다. 수확된 세포 배양액(HCCF)은 단백질 A 정제 때까지 4℃에 보관하였다. 형질세포 재조합 과면역의 대규모 생산을 위해, 생산 조건을 약간 수정하여 동일한 배지에서 세포를 성장시켰다. 시드 트레인을 사용하여 37℃에서 2 x 107 세포에서 1.2 x 1010 세포로 배양 규모를 늘렸다. 그런 다음 세포를 5 L 플라스크에서 2 L 중 1 x 106개 세포/mL로 시딩하였다(3회; 제0일). 제2일에는 온도를 37℃에서 33℃로 변경하였다. 배양 제2, 4, 6, 8, 10 및 13일에 각 플라스크에 300 mL CHO Feed 1(Irvine Scientific, Santa Ana, CA, USA)을 공급하였다. 상청액을 제14일에 수확하였다.
수확 후, HCCF는 다음 완충액을 사용하여 MabSelect SuRe Protein A 수지(GE Life Sciences, Marlborough, MA, USA)로 정제하였다: 평형화, 체이스, 세척 2(25 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.4), 세척 1(25 mM Tris, 1 M NaCl, pH 7.4), 용출(20 mM 시트르산, pH 3.0), 중화(소규모의 경우 100 mM Tris, pH 8.0, 대규모의 경우 1 M Tris, pH 9.0). 컬럼은 0.1 N NaOH로 사용 전후에 소독하였다. 형질세포 재조합 과면역의 대규모 생산을 위해, 0.5 M 아르기닌, pH 7.4로 구성된 추가 세척 3을 사용한 후 용출 전에 세척 2로 추가 세척하였다. 정제 단계는 평형화, 로드, 체이스, 세척 1, 세척 2, (대규모: 세척 3, 세척 2), 용리, 중화(용출물 분획 수집에 사용되는 튜브에 수동으로 추가) 순서이다. 재조합 과면역은 Vivaspin 20, 30 Da 분자량 차단 스핀 농축기(Sartorius, Gottingen, Germany)를 사용하여 농축하고, PBS(소규모 생산) 또는 0.2 M 글리신, pH 4.5(대규모 생산), 그 다음 0.22 μm 여과로 제형화하였다.
모리스 이미징 cIEF 분석기(Maurice imaging cIEF analyzer, Protein Simple, San Jose, CA, USA)를 사용하여 이미징화 모세관 등전위 포커싱(Imaged capillary isoelectric focusing, iCIEF)을 수행하였다. 모세관 전기영동 소듐 도데실 설페이트(CE-SDS)는 LabChip GX II Touch HT(Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)를 사용하여 환원 및 비-환원 조건 하에 수행하였다. Endosafe nexgen-PTS(Charles River, Wilmington, MA, USA)를 사용하여 내독소 수준을 측정하였다.
본 발명자는 단백질 A 단계에서 92.2%의 HBV RPP 수율을 관찰하였다. 비-환원 조건 하에, 본 발명자는 CE-SDS를 사용하여 166.2 kDa에서 단일 피크(>99%)를 관찰하였다. 환원 조건 하에서, RPP는 99% 초과 순수 IgG 단량체 및 1% 미만의 기타 단백질을 나타내는 반면, 혈장 IVIg는 약 3.1%의 미지 단백질을 나타내어, 재조합 과면역이 혈장 IVIg보다 높은 순도의 IgG에서 생성될 수 있음을 시사하였다. iCIEF에 의한 정제된 재조합 과면역의 분석은 등전위 종(isoelectric species)의 광범위한 스펙트럼을 나타내었지만, 혈장 IVIg는 상당히 더 넓은 범위의 등전위 종의 범위를 보여주었다. 본 발명자는 혈장 IVIg가 더 다양한 항체를 포함하고 IgL뿐만 아니라 다른 IgG 이소타입(재조합 과면역은 IgG1만 있음)을 포함하기 때문에 더 다양한 등전위 종을 가지고 있다고 추측한다. 마지막으로, 내독소 수준은 재조합 mAb 치료제에 대한 전형적인 벤치마크인 0.5 미만의 내독소 단위(EU)/mg였다.
항체 딥 시퀀싱 라이브러리는 정량적 PCR Illumina 라이브러리 정량화 키트(KAPA, Wilmington, MA, USA)를 사용하여 정량화하고, 17.5 pM로 희석하였다. 라이브러리는 제조업체의 지침에 따라 500 사이클 MiSeq 시약 키트 v2를 사용하여 MiSeq(Illumina, San Diego, CA, USA)에서 시퀀싱하였다. 시퀀싱 라이브러리를 만들기 위해, 본 발명자는 테일드 엔드 PCR을 사용하여 관심 구성의 5' 및 3' 말단에 Illumina 시퀀싱 어댑터를 추가하였다. 그런 다음, 본 발명자는 340 사이클의 순방향 판독과 162 사이클의 역방향 판독을 수득하였다. 이것은 CDR3-H와 VH-유전자의 일부에서 겹치는 정방향 및 역방향 판독을 생성하여 뉴클레오티드 호출에 대한 신뢰도를 높였다. 서열 분석은 본 발명자의 이전에 보고된 생물정보학 파이프라인을 사용하여 수행하였다(문헌[Adler et al., Mabs 9, 1282-1996, 2017]). 피어슨 상관 관계(Pearson correlation)를 R 버전 3.4.2의 cor 함수를 사용하여 수행하였다.
4개의 HBV RPP 각각은 112 내지 139만 입력 셀에서 유래하였다. 레퍼토리가 본 발명자의 라이브러리 생성 파이프라인을 거친 후, 재조합 과면역의 콜로날 다양성은 모두 2,000개 미만의 항체 클론(범위: 880 내지 1,659)으로 입력 항체 다양성의 상당한 부분을 나타내었다. 4가지 재조합 과면역 모두 93%의 중간 생식계열 IgHV 동일성을 가졌으며, 이는 유의하게 더 높은 친화도를 갖는 항체를 생성한 세포 유형이 없음을 시사하며, Hib-백신 접종 개인의 이전 분석과 일치한다(문헌[Truck et al., 2015]). 클로날 다양성은 혼합물에서 가장 빈번한 항체에 강하게 편향되지 않았다. 가장 흔한 항체는 3.5%의 빈도로 존재했다(혈장 세포 과면역). 범-B 재조합 과면역은 가장 덜 치우친 클로날 다양성을 가졌고(상위 20개 항체는 모든 항체의 12.7%임), 형질세포 재조합 과면역은 가장 치우친 클로날 양성을 가졌다(상위 20개 항체는 모든 항체의 26.6%임).
본 발명자는 4개의 재조합 과면역 라이브러리의 유전적 다양성을 조사했다. 중복 분석은 주어진 2개의 재조합 과면역 라이브러리 간에 11.8% 이하의 클론이 공유된 것으로 나타났다. 피어슨 상관 관계 분석은 두 쌍의 비교 간에 유의하지 않았다(p<0.01). 4개의 모든 재조합 과면역 라이브러리는 항-Hib 레퍼토리의 다른 곳에서 볼 수 있는 다양한 IgGV-J 유전자 쌍(IgHV3-23 및 IgHJ4 유전자를 가진 항체를 높은 빈도로 포함함)을 포함했다(문헌[Silverman & Lucas, 1991; Adderson et al., 1993], 문헌[Lucas et al., 2003, Truck et al., 2015]). 다른 일반적인 IgHV 유전자에는 IgHV3-30, IgHV1-69 및 IgHV3-7이 포함된다. 모든 라이브러리에는 이전에 항-Hib 레퍼토리에서 관찰된 GYGFD 또는 GYGMD 펩티드 중 하나를 포함하는 상보성-결정 영역(CDR)3 서열도 포함된다(문헌[Lucas et al., 2003; Truck et al., 2015]). 본 발명자는 4개의 라이브러리 모두가 표준 항-Hib 서열과, 생식계열 및 유전적 다양성과 유사한 수준의 차이를 포함한다고 결론지었다. 그러나, 4개의 라이브러리는 서로 다른 기능적 특성을 가질 수 있는 별개의 항체 혼합물을 포함한다.
인간 항-Hib-PRP IgG ELISA 키트(Alpha Diagnostics #980-100-PHG, San Antonio, TX, USA)를 항-Hib ELISA 역가에 사용했다. 항체 제제의 연속 희석은 저 NSB(비-특이적 결합) 샘플 희석제로 수행하였다. 450 nm에서 플레이트 판독기(Molecular Devices, Fremont, CA, USA)에서 정량적 측정을 수행했다. EC50 값은 SoftMax Pro(Molecular Devices, Fremont, CA, USA)를 사용하여 계산하였다. 본 발명자는 또한 IVIg뿐만 아니라 Hib 활성 백신을 사용한 백신 접종 전후에 두 공여자의 혈장 풀에 대한 항-Hib PRP 항체 역가를 결정했다. 형질세포, 범-B 및 형질모세포 재조합 과면역은 IVIg보다 상당히 더 높은 Hib-결합 역가를 산출했으며(범위: 160x 내지 2,323x), 형질세포 과면역은 가장 높은 역가를 산출했다. 백신접종 후 혈장은 IVIg의 항-Hib 역가의 3.7배에 불과했고, 시험된 조건하에서 기억 B 세포 재조합 과면역에서 항-Hib 역가는 검출되지 않았다. 종합하면, 이러한 데이터는 백신 접종 공여자로부터 적절한 세포 유형을 선택함으로써 본 발명자의 제조 공정이 항-Hib 역가를 상당히 증가시킬 수 있음을 나타낸다.
시험관 내 중화 연구는 CRO(ImQuest Frederick, MD, USA)에서 수행하였다. B형 헤모필루스 인플루엔자 Eagan 균주는 Zeptometrix(#0801679, Buffalo, NY, USA)에서 냉동 글리세롤 스톡으로 입수하여 -80℃에 보관하였다. 헤모필루스 인플루엔자 균주 ATCC 10211은 American Type Culture Collection(ATCC, Frederick, MD, USA)에서 동결건조된 스톡으로 입수했으며 공급업체에서 권장하는 대로 증식시켰다. 초콜릿 한천 플레이트에서 밤새 배양한 콜로니를 성장 배지(Brain Heart Infusion, 또는 BHI 브로스, BD BBL 299070, San Jose, CA, USA, 2% Fildes 농축 포함, Remel #R45037, San Diego, CA, USA)에서 배양하고, 약 0.4의 625 nm(OD625)의 광학 밀도를 달성하도록 하였다. 배양물을 0.15의 OD625로 조정했으며, 이는 대략 5 x 108 콜로니 형성 단위(CFU)/mL에 해당한다. 배양물을 희석 완충액(Hanks Balanced Salt Solution, Gibco, Waltham, MA, USA #14025-092, 2% Fildes 농축 포함)에서 5 x 104 CFU/mL로 추가 희석하였다. 분석에 사용된 박테리아 배양물의 밀도는 50 μL의 5 x 103 및 5 x 102 희석액을 초콜릿 한천에 이중으로 플레이팅하고 37℃/5% CO2에서 24시간 동안 배양한 후 콜로니를 계수하여 확인했다.
10개의 총 희석액을 평가하도록 시험 물품을 200 μg/mL에서 시작하여 희석 완충액으로 3배 희석하였다. 시험 물품의 각 희석액 10 μL를 96-웰 미세역가 플레이트에 이중으로 첨가하였다. 대략 5 x 104 CFU/mL 농도의 Eagan 또는 ATCC 10211 박테리아를 20 μL의 부피로 플레이트에 첨가하여 총 웰내 박테리아 밀도가 1 x 104 CFU/20 μL이 되도록 했다. 37℃/5% CO2에서 15분 동안 인큐베이션한 후, 25 μL의 아기 토끼 보체(Pel-Freez #31061-1, Rogers, AR, USA) 및 25 μL의 희석 완충액을 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 37℃/5% CO2에서 60분 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 5 μL의 각 반응 혼합물을 45 μL의 희석 완충액에 희석하고 전체 50 μL를 초콜릿 한천 플레이트에 플레이팅했다. 플레이트를 37℃/5% CO2에서 약 16시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 박테리아 콜로니를 계수하였다. 박테리아 50% 초과를 죽인 시험 물품 농도가 SBI이다.
ELISA 데이터로부터 예상되는 바와 같이, 기억 B 세포 재조합 과면역은 시험된 임의의 농도에서 Hib 균주를 중화할 수 없었다. 형질세포 재조합 과면역은 Eagan 및 ATCC10211 균주에 대해 각각 81 및 243의 SBI로 가장 높은 역가를 산출했다. 범-B 및 형질모세포 재조합 과면역의 효능은 형질세포 재조합 과면역의 1/9였다. 시험된 농도에서 IVIg에 대한 중화가 검출되지 않았다. 본 발명자는 형질세포 재조합 과면역이 시험된 4가지 세포 유형 중에서 가장 높은 효능을 보인다고 결론지었다.
모든 척추 동물 실험은 동물 복지법 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에 통합된 표준(National Research Council of the National Academies, Eighth Edition)에 따라 미국 미주리주의 싱클레어 연구 센터 LLC(Sinclair Research Center, LLC, Missouri(USA))의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 또는 EU 지침 2010/63/EU(허가 번호: 2014-15-0201-00171)의 표준에 따라 덴마크의 국립 동물 윤리 위원회의 감독 및 승인 하에 수행되었다.
급성 독성의 경우, Balb/cJ 마우스(Charles River, Wilmington, MA, USA)는 CRO(Sinclair Research, Auxvasse, MO, USA)에 의해 그룹당 6마리의 동물로 구성된 7개 그룹으로 무작위로 나누었다. 3개의 그룹에는 30 mg/kg, 100 mg/kg 또는 300 mg/kg의 단일 용량으로 재조합 과면역을 투여하였다. 음성 대조군에는 단일 용량의 식염수 비히클을 투여하였다. 나머지 세 그룹에는 30 mg/kg, 100 mg/kg 또는 300 mg/kg의 혈장 IVIg(Gammagard; Grifols, Sant Cugat, Catalonia)의 단일 용량을 투여하였다. 시험 물품 샘플을 0.2 M 글리신, pH 4.5로 희석하였다. 시험물질 투여는 꼬리정맥을 통해 정맥 내로 수행하였다. 용량 부피는 각 개별 동물의 가장 최근 체중을 기준으로 계산하였다. 그 다음, 마우스를 8일 동안 매일 2회 일반적인 건강, 시험 물품 투여 부위에서의 반응, 이환율 및 사망률, 체중, 육안 검사(피부, 점막, 눈, 귀, 코 및 호흡)에 대해 관찰하였다. 동물을 3일 후 CO2 가스로 안락사시키고, 알부민, 글로불린, 포도당, 총 단백질, 혈액 요소 질소 및 기타 여러 지표를 포함한 최종 혈청 화학 분석을 수행했다.
본 발명자는 모든 시험군 대해 시험 물품 관련 결과를 관찰하지 못했다. 본 발명자는 형질세포 재조합 과면역의 단일 정맥 내 투여에 대한 NOAEL(관찰된 부작용 없음 수준: no-observed-adverse-effect level)이 300 mg/kg이라고 결론지었다. IVIg는 통상적으로 Hib 및 기타 병원체에 대한 보호를 위해 약 300 mg/kg로 면역결핍 환자에게 투여되며 Hib 과면역 제품은 수천 배 더 강력하므로, 형질세포 재조합 과면역은 최소한의 효과적인 복용량에 있어서 관찰 가능한 독성이 없다고 결론지었다.
약동학을 위해 CRO(Sinclair Research, Auxvasse, MO, USA)는 20마리의 수컷 Balb/cJ 마우스(Charles River, Wilmington, MA, USA)에게 형질세포 재조합 과면역의 100 mg/kg 정맥 내 꼬리 정맥 용량을 투여했다. 마우스가 예정된 7개의 PK 혈액 샘플링 중 2개 이상을 받지 않도록, 드문드문 혈액 샘플링 절차를 수행했다. 그런 다음 샌드위치 리간드 결합 분석(LBA) 및 Meso Scale Discovery(MSD; Rockville, MD, USA) 전기화학발광(ECL) 기술을 사용하여 혈청 인간 IgG를 측정했다. 포획 항체(SouthernBiotech #2049-01, Birmingham, AL, USA)를 96웰 플레이트(MSD, Rockville, MD, USA)에 코팅하였다. 혈청 샘플을 1% BSA(PBS/T/BSA)를 함유하는 PBS/T에서 1:100의 최소 요구 희석도(MRD)로 희석하였다. 다음으로, 희석된 샘플을 지정된 웰에 첨가하였다. 또 다른 세척 단계 후, 웰에 1 mg/mL의 비오틴화된 염소 항-인간 IgG(SouthernBiotech #2049-08, Birmingham, AL, USA)를 함유하는 PBS/T/BSA를 접종했다. 인큐베이션 후, 스트렙타비딘-SULFO-TAG를 첨가한 다음, 2x 판독 완충액 T(MSD, Rockville, MD, USA)를 첨가하였다. ECL 단위는 MSD QuickPlex SQ 120 기기를 사용하여 측정하였다. 형질세포 기반 재조합 과면역을 사용하여 각 실행에 대해 표준 곡선을 추가로 생성했다. Discovery Workbench 소프트웨어(MSD, Rockville, MD, USA)를 사용하여 평균 ECL 단위 대 명목 IgG 표준 값의 4-매개변수 로지스틱(4-PL) 곡선 적정을 사용하여 데이터를 적정하였다. 본 발명자는 정맥 투여가 실패했다는 가정 하에 1시간 시점에서 1100 ng/mL 이하 판독값을 가진 두 마리의 동물을 추가 분석에서 제거했다. 그런 다음 R의 PKNCA 패키지(문헌[Denney et al., 2015])를 사용하여 농도-시간 데이터에 비구획 분석을 적용하여 최대 관찰 혈장 농도(Cmax), 최대 관찰 혈장 농도의 시간(Tmax) 및 반감기(t1/2)를 추정했다.
최대 관찰 혈장 농도는 투여 후 1시간(Tmax)에서 관찰된 12,360 ng/mL(Cmax)였다. 재조합 과면역의 반감기(t1/2)는 대략 34.5시간이었다. 이러한 데이터를 ELISA 역가 데이터와 결합하여 최대 항-Hib 최저 수준이 단일 100 mg/kg 정맥 내 용량에 대해 861 IU/mL인 것으로 추정했다.
헤모필루스 인플루엔자 균주 ATCC10211은 초콜릿 한천 플레이트 및 35℃ 및 5% CO2에서 밤새 성장시켰다. 하룻밤 동안 단일 콜로니를 멸균 식염수로 1.5 x 108 CFU/mL로 재현탁시켰다. 이 현탁액을 5% 뮤신 및 2% 헤모글로빈을 포함하는 BHI 브로스에서 대략 1 x 106 CFU/mL로 희석하고, 추가로 10 CFU/mL로 10배 희석했다.
Balb/cJ 마우스(Taconic, 덴마크; 그룹당 n=6)에 104, 105 또는 106 CFU/mL Hib 박테리아(균주 ATCC10211)의 단일 0.5 mL 복강 내 용량을 접종했다. 접종 약 1시간 전에 마우스에 통증 완화제로 45 μL Nurofen(약 30 mg/kg에 해당하는 20 mg 이부프로펜/mL)을 경구 처리했다. 접종 24시간 전에 마우스에 300 mg/kg 재조합 Hib 과면역, 300 mg/kg 혈장 IVIg 또는 식염수를 투여했다. 접종 1시간 후 마우스에 양성 대조군 처리로서 20 mg/kg 시프로플락신 항생제를 투여하였다. 마우스는 2 내지 6시간마다 감염의 임상 징후에 대해 점수를 매겼고 감염에 의해 심하게 영향을 받았을 때 희생시켰다. 추가 72시간 후, 모든 살아있는 동물을 Zoletil 혼합물로 마취시키고 겨드랑이 절개로 혈액을 수집했다. 마우스를 경추 탈구로 희생시키고, 2 mL의 멸균 식염수를 복강 내 주사하고, 복부를 열기 전에 부드럽게 마사지하고 피펫으로 유체를 샘플링하였다. 각 샘플을 식염수로 10배 희석하고 20 μL 스팟을 초콜릿 한천 플레이트에 적용했다. 모든 한천 플레이트를 주변 공기에서 35℃에서 18 내지 22시간 동안 인큐베이션했다.
Hib 감염은 비히클 대조군에서 모든 접종 용량에서 1마리를 제외한 모든 마우스에게 치명적이었다. 대조적으로, 18마리의 마우스 중 1마리만이 재조합 과면역 치료군(106 CFU 접종군)에서 심각한 영향을 받았다. IVIg는 재조합 과면역보다 훨씬 덜 보호적이었으며, 105 CFU 및 106 CFU 접종 그룹의 5/6 마우스와 104 CFU 접종 그룹의 2/6 마우스가 감염에 의해 심각하게 영향을 받았다. 혈액 내 세균 부하 분석은 재조합 과면역이 모든 동물의 혈류에서 Hib를 제거한 반면, IVIg 처리는 접종 그룹 중 하나에서만 비히클 대조군보다 세균 부하가 유의하게 더 낮았고 두 접종 그룹에서는 유의미한 감소가 없었음을 보여주었다(Dunnett's 다중 비교 테스트, p<0.05). 복막 세척에서 재조합 과면역은 비히클 대조군에 비해 세균 부하를 다시 유의하게 감소시켰다(Dunnett의 다중 비교 테스트, p<0.05). 그러나, Hib 박테리아가 시프로플락신으로 처리된 생존 동물의 복막 세척에서 검출되지 않은 반면, Hib 박테리아는 재조합 과면역으로 처리된 6/17 생존 동물의 복막 세척에서 검출 가능했다(범위: 23 내지 77 CFU/mL). 이것은, 아마도 복막에서의 약물이나 보체의 생체이용률로 인해 복막과 혈액 사이의 재조합 과면역의 효능에 차이가 있음을 나타낸다.
일부 실시양태에서, Hib 과면역은 IVIg의 항-Hib 역가를 증가시키기 위해 통상적인 혈장 IVIg에 스파이킹된다. 일부 실시양태에서, 여러 항병원체 과면역이 통상적인 혈장 IVIg에 스파이킹되고, 예를 들어 Hib, 폐렴구균, 인플루엔자 A 바이러스 및 파상풍에 대한 과면역이 혈장 IVIg에 스파이킹되어 1차 면역 결핍 환자를 치료한다. 과면역의 스파이킹은 1차 면역 결핍 환자가 특히 취약한 병원체에 대한 항체 역가를 증가시킨다. 임의의 수의 스파이크-인(spike-ins)을 혈장 IVIg와 혼합하여 임의의 수의 병원체에 대해 증가된 역가를 생성할 수 있다.
일련의 시험관 내 및 생체 내 실험을 사용하여 하기를 결정했다. Hib의 경우 백신 접종 후 형질세포가 가장 강력한 RPP를 생성한다. 형질세포 Hib RPP는 혈장 IVIG보다 2,300배 초과로 더 강력했다(ELISA에 의함). 형질세포 Hib RPP는 생체 내 챌린지 모델에서 Hib 감염에 대해 강력하게 보호되었다. 형질모세포 및 범-B 세포의 사용은 또한, 비록 형질세포보다 덜 강력하지만, 시험관 내에서 강력한 RPP를 유도하였다. 이 항원의 경우, 기억 B 세포로 만든 RPP는 시험관 내 분석에서 검출할 수 없는 수준의 효능을 보였다.
10.1.3 실시예 3: 폐렴연쇄구균 협막 다당류에 대한 활성을 갖는 RPP 라이브러리 생성
폐렴연쇄구균은 폐렴 구균성 폐렴을 유발한다. 폐렴연쇄구균에 대한 활성이 있는 재조합 폴리클로날 항체(pAb), 즉 RPP 라이브러리, "GG-Pnc"를 생성하였다. GG-Pnc를 시험관 내에서 테스트하였다. 결과는 폐렴연쇄구균 협막 다당류에 대한 활성과 함께 GG-Pnc의 시험관 내 기능적 효능과 잠재력을 보여준다. 라이브러리는 벌크 폐렴구균 다당류 ELISA, 혈청형-특이적 ELISA 및 혈청형-특이적 옵소닌 식세포 분석법(opsonophagocytic assays)으로 분석하였다.
GG-Pnc의 중쇄 및 경쇄 CDR3 서열의 서열 번호는 상기 표 5에 나타냈다(RPP1).
실시예 1 및 2에 기재된 재조합 기술을 사용하여 GG-Pnc, 즉 RPP 라이브러리를 제조하였다. 이 라이브러리는 Pneumovax-23 백신을 접종한 3명의 공여자로부터 제조하였다. Pneumovax-23은 23개의 폐렴구균 혈청형의 협막 다당류로 구성된다. 3명의 공여자 모두 ELISA로 측정한 바와 같이 백신 접종 후 폐렴구균 협막 다당류에 대한 역가의 증가를 보여주었다. rpAb는 공여자로부터 분리된 모든 B 세포 하위유형의 혼합물로 만들어졌다.
Alpha Diagnostics ELISA는 Pneumovax-23 백신에서 발견되는 23개의 폐렴구균 다당류에 대한 벌크 다당류 특이적 항체 반응을 측정하고, RPP 라이브러리의 EC50을 측정하는 데 사용되었다. 8단계, 3배 희석 시리즈를 수행하고 4포인트 로지스틱 분석을 수행하여 EC50을 계산했다. RPP 라이브러리 GG-Pnc는 IVIG보다 100배 더 강력했다.
IVIG와 비교하여 GG-Pnc RPP 라이브러리의 항체 다양성을 평가하기 위해 혈청형 다중 ELISA를 수행했다. 20개의 폐렴구균 혈청형을 ELISA로 측정하였다. 폐렴구균 특이적 반응에 대한 국제 표준을 사용하여 GG-Pnc 및 IVIG(Gamunex)에서 항체 특이적 반응을 측정하였다. GG-Pnc는 혈청형 6A를 제외한 모든 혈청형에 대해 IVIG와 유사하거나 더 높은 농도를 가졌다.
항체-유발 사멸 기능을 평가하기 위해 혈청형 특이적 옵소닌 식세포 분석법을 수행했다. 14개의 폐렴구균 혈청형을 GG-Pnc 및 IVIG(Gamunex)를 사용하여 옵소닌 식세포 반응으로 측정했다. 다중-ELISA와 일치하게, GG-Pnc는 6A를 제외한 모든 혈청형에 대해 IVIG와 유사하거나 더 효과적이었다.
혈청형 2-특이적 ELISA는 GG-Pnc가 이 혈청형에 결합하는 능력을 결정하기 위해 수행되었는데, 이는 이전 분석에 포함되지 않았지만 생체 내 마우스 모델에 사용 가능한 옵션이기 때문이다. 8단계, 3배 희석 시리즈를 수행하고, 4-포인트 로지스틱 분석을 사용하여 EC50을 계산했고; IVIG는 매우 높은 농도에서도 혈청형 2에 대한 결합이 최소였기 때문에 GG-Pnc만이 값을 가졌다.
GG-Pnc RPP 라이브러리는 다양한 세트의 폐렴구균 혈청형에 강력하게 결합했으며, 시험관 내 옵소닌 식세포작용 분석법을 기반으로 시험한 모든 혈청형을 중화시킬 수 있었다. GG-Pnc는, 백신 접종 공여자로부터 분리된 모든 B 세포를 사용하고 혈청형 특이적 농축 절차를 수행하지 않은 상태에서, 하나의 혈청형(결합 및 사멸 모두에 대해)을 제외한 모든 혈청형에 대해 IVIG와 유사하거나 더 강력했다. GG-Pnc는 또한 혈청형 2에 강하게 결합하였다.
10.1.4 실시예 4: 인플루엔자 A 항원에 대한 활성을 갖는 RPP 라이브러리 생성
인플루엔자 A 항원(RPP1)에 대한 활성을 갖는 RPP 라이브러리는 본원에 기술된 재조합 방법을 사용하여 생성하였다.
RPP1의 중쇄 및 경쇄 CDR3 서열의 서열 번호는 상기 표 5에 나타냈다(RPP1).
10.1.5 실시예 5: B형 간염 바이러스 항원에 대한 활성을 갖는 RPP 라이브러리 생성(Engerix, GSK)
B형 간염 바이러스 항원(RPP8 및 RPP9)에 대한 활성을 갖는 2개의 RPP 라이브러리를 본원에 기재된 재조합 방법을 사용하여 생성하였다.
RPP9 및 RPP9의 중쇄 및 경쇄 CDR3 서열의 서열 번호는 상기 표 5에 나타냈다(RPP1).
11. 참조로 통합
본 출원에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 기타 문서는 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원 또는 기타 문서가 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함된다.
12. 등가물
다양한 특정 실시양태가 예시되고 설명되었지만, 상기 명세서는 제한적이지 않다. 본 발명(들)의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 본 명세서를 검토하면 많은 변형이 당업자에게는 명백해질 것이다.

Claims (20)

  1. 항원에 특이적으로 결합하는 재조합 폴리클로날 단백질(RPP)의 라이브러리이고,
    a. 상기 항원은 헤모필루스 인플루엔자 b 다당류이며, 상기 라이브러리는 서열 번호: 33981 내지 47174의 서열로부터 선택되는 중쇄 CDR3 및 경쇄 CDR3 서열의 동족 쌍 (cognate pair)을 각각 갖는 적어도 100 내지 6597개의 RPP를 포함하고; 또는
    b. 상기 항원은 헤모필루스 인플루엔자 b 다당류이며, 상기 라이브러리는 서열 번호: 47175 내지 64340의 서열로부터 선택되는 중쇄 CDR3 및 경쇄 CDR3 서열의 동족 쌍을 각각 갖는 적어도 100 내지 8583개의 RPP를 포함하고; 또는
    c. 상기 항원은 헤모필루스 인플루엔자 b 다당류이며, 상기 라이브러리는 서열 번호: 64341 내지 80252의 서열로부터 선택되는 중쇄 CDR3 및 경쇄 CDR3 서열의 동족 쌍을 각각 갖는 적어도 100 내지 7956개의 RPP를 포함하고; 또는
    d. 상기 항원은 헤모필루스 인플루엔자 b 다당류이며, 상기 라이브러리는 서열 번호: 80253 내지 100626의 서열로부터 선택되는 중쇄 CDR3 및 경쇄 CDR3 서열의 동족 쌍을 각각 갖는 적어도 100 내지 10187개의 RPP를 포함하고; 또는
    e. 상기 항원은 폐렴구균 다당류이고, 상기 라이브러리는 서열 번호: 1 내지 21074의 서열로부터 선택되는 중쇄 CDR3 및 경쇄 CDR3 서열의 동족 쌍을 각각 갖는 적어도 100 내지 10537개의 RPP를 포함하고; 또는
    f. 상기 항원은 B형 간염 바이러스 항원이고, 상기 라이브러리는 서열 번호: 100627 내지 103860의 서열로부터 선택되는 중쇄 CDR3 및 경쇄 CDR3 서열의 동족 쌍을 각각 갖는 적어도 100 내지 1617개의 RPP를 포함하고; 또는
    g. 상기 항원은 B형 간염 바이러스 항원이고, 상기 라이브러리는 서열 번호: 103861-106380의 서열로부터 선택되는 중쇄 CDR3 및 경쇄 CDR3 서열의 동족 쌍을 각각 갖는 적어도 100 내지 1260개의 RPP를 포함하고; 또는
    h. 상기 항원은 인간 흉선세포를 포함하고, 상기 라이브러리는 서열 번호: 106381 내지 12015의 서열로부터 선택되는 중쇄 CDR3 및 경쇄 CDR3 서열의 동족 쌍을 각각 갖는 적어도 100 내지 6889개의 RPP를 포함하는, RPP의 라이브러리.
  2. 제1항에 있어서, 각각의 RPP는 scFv인, RPP의 라이브러리.
  3. 제1항에 있어서, 각각의 RPP는 전장 항체 (full-length antibody)인, RPP의 라이브러리.
  4. 제1항에 있어서, 각각의 RPP는 전장 항체이고, CHO 세포에서 생성되는, RPP의 라이브러리.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 RPP는 항원이 주입된 적어도 한 명의 공여자의 형질세포 (plasma cells) 또는 형질모세포 (plasmablasts)에서 유래된 서열을 사용하여 재조합적으로 생성되는, RPP의 라이브러리.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 RPP는 항원이 주입된 적어도 한 명의 공여자의 형질세포 또는 형질모세포에서 유래된 서열을 사용하여 재조합적으로 생성되고, RPP의 라이브러리의 활성은 항원에 대한 공여자의 혈청 역가 활성 (serum titer activity)의 적어도 10배 초과하는, RPP의 라이브러리.
  7. 제6항에 있어서, 상기 활성은 시험관 내 병원체 중화 분석 또는 항원에 대한 시험관 내 결합 분석 또는 생체 내 효능 분석에 의해 측정되는, RPP의 라이브러리.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공여자는 인간인, RPP의 라이브러리.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 100, 적어도 1000, 적어도 10,000 또는 적어도 100,000개의 RPP를 포함하는, RPP의 라이브러리.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 RPP 라이브러리 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물.
  11. 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 RPP 라이브러리 또는 제10항의 약학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 대상체는 면역 결핍, 암, 알츠하이머병, 바이러스 감염, 세균 감염을 앓거나, 또는 고형 장기 또는 세포 이식 시술을 받고 있는, 방법.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 RPP의 라이브러리 또는 제10항의 약학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 제제의 투여 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  15. 복수의 분리된 폴리뉴클레오티드로서, 각각의 폴리뉴클레오티드는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 RPP의 라이브러리의 한 구성원을 코딩하는, 복수의 분리된 폴리뉴클레오티드.
  16. 복수의 분리된 벡터로서, 각각의 벡터는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 RPP의 라이브러리의 한 구성원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 복수의 분리된 벡터.
  17. 제16항에 있어서, 상기 벡터는 발현 벡터인, 복수의 분리된 벡터.
  18. 복수의 분리된 숙주 세포로서, 제15항의 복수의 분리된 폴리뉴클레오티드 또는 제16항 또는 제17항의 복수의 분리된 벡터를 포함하는, 복수의 분리된 숙주 세포.
  19. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 RPP의 라이브러리의 제조 방법으로서, 상기 방법은 제18항의 분리된 숙주 세포를 RPP의 라이브러리의 발현을 위한 조건 하에 인큐베이션하는 것, 및 RPP를 분리하는 것을 포함하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 RPP는 전장 항체이고, 상기 분리된 숙주 세포는 CHO 세포인, 방법.
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