KR20200144540A - 핵산 분자 및 그 사용 방법 - Google Patents

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KR20200144540A
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마헤쉬 나라야난
안톤 도머
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페프박스, 인코포레이티드
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Abstract

예를 들어, 암 또는 감염을 치료하거나, 대상에서 면역 반응을 유도하거나, 또는 세포 내에서 또는 세포로부터 표적 분자를 전달 또는 발현하기 위해 사용될 수 있는 핵산 분자가 본 명세서에서 제공된다.

Description

핵산 분자 및 그 사용 방법
면역요법 및 유전자요법은 다양한 질병의 치료에 급격한 변화를 가져왔다. 그러나 치료법은 여전히 불완전하기 때문에, 현재까지 존재하는 난점과 단점을 극복한 새로운 치료법의 필요성이 존재한다. 본 명세서는 이러한 필요성 뿐만 아니라 다른 필요성들을 충족시킨다.
요약
본 발명의 일부 구체예에서, 핵산 분자가 제공된다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 구성적 프로모터(constitutive promoter)를 암호화하는 서열, 표적 전장(full-length) 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 서열 또는 표적 분자를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 분자는 링커의 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 분자는 유비퀴틴(ubiquitin)의 아미노산 서열을 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 분자는 표적 단백질의 적어도 7개 아미노산 잔기 또는 표적 단백질의 단편과 같은, 단편을 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 분자는 핵 위치화 신호(nuclear localization signal)를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 서로 작동 가능하게 연결된다. 일부 구체예에서, 분자는 전장 단백질, 링커, 유비퀴틴 단백질 및 전장 단백질의 단편을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 전장 단백질 및 동일한 단백질의 단편 대신에, 핵산 분자는 단편에서 중첩될 수 있음에도, 상이한 길이 또는 서열인 동일한 단백질의 2개의 단편을 암호화한다. 일부 구체예에서, 단편은 암호화되지 않는다. 일부 구체예에서, 단편이 암호화되지 않은 경우, 링커 및 유비퀴틴을 암호화하는 서열은 선택적이며 분자에는 이러한 서열이 없을 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, 발현되는 다양한 성분은 단백질 또는 표적 분자를 암호화하기 위해 서로 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 전장 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 서열; 링커의 아미노산 서열, 유비퀴틴의 아미노산 서열 및 표적 단백질의 적어도 7개 아미노산 잔기가 서로 작동 가능하게 연결되어 각각이 발현되도록 한다.
본 발명의 일부 구체예에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자를 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 일부 구체예에서, 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 PD-1, PD-L1, TNF-알파, CTL4 등에 결합하는 항체와 같은, 추가 치료제를 포함한다. 다른 유형의 치료제도 본 명세서에 제공된 핵산 분자와 조합될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, 대상(subject)에서 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 본 명세서에 제공된 핵산 분자를 대상의 세포에 도입(예를 들어, 투여)하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 세포에서 발현되고 면역 반응은 핵산 몰(mole)에 의해 암호화된 표적 단백질에 대해 유도된다.
본 발명의 일부 구체예에서, 대상에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 암을 치료하기 위해 본 명세서에 제공된 핵산 분자를 대상에 도입(예를 들어, 투여)하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산 분자에 의해 암호화되는 표적 단백질은 암 세포 또는 종양에서 과발현되는 단백질이다.
본 발명의 일부 구체예에서, 대상에서 감염원 또는 감염을 억제하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 본 명세서에 제공된 핵산 분자를 대상에 도입(예를 들어, 투여)하여 감염원을 억제하거나 대상에서 감염을 치료하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산 분자에 의해 암호화되는 표적 단백질은 감염원에 의해 발현되는 단백질이다.
본 발명의 일부 구체예에서, 표적 분자를 발현 또는 전달하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 표적 분자를 세포에 발현 또는 전달하기 위해 세포 또는 대상을 본 명세서에 제공된 핵산 분자에 도입(예를 들어, 투여)하거나 이와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 분자는 세포로부터 분비된다.
본 발명의 일부 구체예에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자를 포함하는 세포가 제공된다. 일부 구체예에서, 세포는 분리된 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 체내가 아니라 체외에 있다.
도 1은 수행된 실험의 데이터를 예시하며, 여기서 등몰(equimolar) 양의 플라스미드 DNA를 HEK-293 인간 배아 신장 세포의 동일한 배양물에 형질감염시키고 GFP 발현을 형질감염 24시간 후에 모니터링하였다. 상단 패널은 대조군을 보여주고 하단 패널은 세포에서 GFP의 발현을 보여준다.
도 2는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 플라스미드와 같은 핵산 분자의 비-제한적인 구체예를 예시한다.
도 3은 본 명세서에 기재된 바와 같이, 플라스미드와 같은 핵산 분자의 비-제한적인 구체예를 예시한다.
도 4는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 플라스미드와 같은 핵산 분자의 비-제한적인 구체예를 예시한다.
상세한 설명
본 발명의 명세서에 제공된 구체예는 예를 들어, 면역원(immunogens) 또는 표적 분자로 발현될 수 있는 외래 뉴클레오티드의 통합을 허용할 수 있는 플랫폼을 제공한다. 면역원 또는 분자의 발현은 예를 들어, 암 및/또는 감염성 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 다수의 DNA 단편을 하나의 핵산 분자로 조립하는 데 사용될 수 있다. 이것은 예를 들어, DNA 단편의 끝과 내부에서 발견되는 제한 부위 중복에도 불구하고, 수행될 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 핵산 분자는 또한 핵 내에서의 신속한 플라스미드 통합 또는 흡수를 촉진할 수 있는 핵 위치화 신호(도메인)와 같은 핵 흡수 요소를 포함할 수 있다. 이 업데이트는 면역 반응으로 이어질 수 있다.
예를 들어, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 세포막을 가로질러 핵을 형질감염시킬 수 있다. 이 과정이 발생하면 외래 뉴클레오티드가 숙주의 세포 전사 및 번역 과정에 의해 발현된다. "외래 뉴클레오티드"는 세포에 도입되고 세포의 게놈에 고유하지 않은 뉴클레오티드이다. 실시예는 본 명세서에 제공된 임의의 핵산 분자를 포함하고 실시예는 또한 본 명세서에 제공된 플라스미드 또는 다른 유형의 벡터를 포함한다. 번역 후, 항원이 세포 표면에 도달했을 때 주요 조직적합성 복합 단백질 클래스 I 또는 클래스 II와 함께 제시될 수 있다. 특정 이론에 얽매임 없이, 대식세포 또는 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포(APC)는 해당 외래 항원을 취하여 APC가 항원 표적 단백질 및/또는 단편을 제시할 림프절로 이동하고 본 명세서에 제공된 핵산 분자에 의해 암호화된 항원에 대한 면역 반응을 유도한다.
또한, 본 명세서에서 사용된 단수 형태 "a", “an" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 참조를 포함한다는 점에 유의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 참조는 당업자에게 공지된 하나 이상의 세포 및 이의 등가물 등에 대한 참조이다.
본 명세서에서 사용된 용어 “약(about)”은 그것이 사용되는 숫자의 수치 값의 플러스 또는 마이너스 10%를 의미한다. 따라서 약 50%는 45%-55% 범위를 의미한다. 본 명세서는 "약"이라는 용어로 특정 용어 또는 값을 조정하지만, 본 명세서는 또한 정확한 값을 개시하는 것으로 이해되어야 하며 단순히 편의를 위해 작성된 것은 아니다. 예를 들어, "약 9 내지 약 25"라는 구는 또한 "9 내지 25"를 개시한다. 또한, "X에서 Y까지"라는 구(X와 Y는 임의의 정수임)와 같은 범위에는 종점(endpoints)이 포함된다. 예를 들어, "1에서 5까지"라는 구는 1, 2, 3, 4 또는 5를 의미한다.
치료 수단과 함께 사용되는 “투여(adminitstering)”는 치료제를 표적 조직 내로 또는 표적 조직에 직접 투여하거나 환자에게 치료제를 투여하는 것을 의미한다. 핵산 분자를 투여하기 위해 사용될 수 있는 투여 방법의 비-제한적인 예는 형질감염, 전기천공, 주사, 소니케이션(sonication), 또는 다른 공지된 기술과 조합된 임의의 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 조합 기술에는 가열 및 복사가 포함된다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 근육 세포로 전달된다. 이것은 예를 들어, 전기천공법 또는 다른 적절한 기술에 의해 수행될 수 있다. 핵산 분자를 근육 또는 다른 조직 유형으로 전기천공하는 것은 예를 들어, 전기천공 장치를 사용하여, 수행할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 “동물(animal)”은 인간 및 야생동물, 가축 및 경작용 동물과 같은 비인간 척추동물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 “클로닝(cloning)”은 핵산 분자를 플라스미드와 같은 또다른 핵산 분자로 결찰(ligating)하는 과정과 관련하여 사용된다. 클로닝된 분자는 복제, 증폭 또는 투여를 위해 숙주 세포 또는 대상으로 전달될 수 있다.
용어 "클로닝 벡터(cloning vector)" 및 "클로닝 벡터 플라스미드(cloning vector plasmid)"는 최소한 복제 기점을 포함하는 원형 DNA 플라스미드를 지칭하는 데 사용된다. 복제 기점은 플라스미드를 포함하는 숙주 세포를 양성적으로 선택하는 데 사용할 수 있으며 항생제 내성 유전자 또는 다중 복제 부위일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 “포함하는(comprising)”(및 “포함하다(comprise)", “포함하다(comprises)” 및 “포함된(comprised)”과 같은 포함하는(comprising)의 임의의 형태), “갖는(having)”(및 “갖는다(have)” 및 “갖는다(has)”와 같은 갖는(having)의 임의의 형태), “포함하는(including)”(및 “포함하다(includes)” 및 “포함하다(include)”와 같은 포함하는(including)의 임의의 형태) 또는 “함유하는(containing)”(및 “함유하다(contains)” 및 “함유하다(contain)”와 같은 함유하는(containing)의 임의의 형태)은 포괄적이거나 개방형이며 추가, 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
본 명세서에 사용된 용어 "유전적 구조체(genetic construct)"는 표적 단백질 또는 표적 분자를 암호화하고 백신접종된 개체의 세포에서 발현을 지시할 수 있는 프로모터 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 개시 및 종료 신호를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 지칭한다. 일부 구체예에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 플라스미드 또는 바이러스 벡터의 형태로 존재한다. 일부 구체예에서, 유전적 구조체는 플라스미드 또는 바이러스 벡터이다. 일부 구체예에서, 유전적 구조체는 통합 요소를 함유하지 않는다. 일부 구체예에서, 플라스미드는 대상 또는 세포의 게놈으로 플라스미드의 통합을 촉진할 임의의 역 말단 반복 또는 다른 서열을 함유하지 않거나 이들로부터 자유롭다. 일부 구체예에서, 플라스미드는 비-통합 플라스미드이다. 비-통합 플라스미드는 대상의 게놈이나 플라스미드와 접촉하는 세포에 통합되도록 설계되지 않은 플라스미드이다. 일부 구체예에서, 비-통합 플라스미드는 플라스미드의 게놈 내로의 통합을 용이하게 하는 임의의 다른 성분없이 세포와 접촉된다. 예를 들어, 플라스미드는 플라스미드의 일부를 게놈 내에 통합하는 데 사용할 수 있는 CRISPR과 같은 유전자 편집 플랫폼과 함께 사용할 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 플라스미드는 CRISPR 또는 CAS9 등과 같은 CRISPR 유사 효소없이 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "DNA 구조체(DNA construct)"는 클로닝 벡터 플라스미드와 연속적인 클로닝 단계에 의해 합성되는 DNA 분자를 의미한다. 이것은 적절한 포유류 숙주에 유전자 발현을 지시하는 수단으로 일반적으로 사용되는 과정이다. 이 포유류 숙주는 시험관내에서 배양된 세포 또는 체내 형질전환 쥐일 수 있다.
용어 "DNA 단편(DNA fragment)"은 인트론(intron), 엑손(exon), 리포터 유전자(reporter gene), 폴리 A 테일(poly A tail) 및 상이한 클로닝 부위와 같은 플라스미드의 상이한 부분을 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 DNA 분자 분리를 의미한다. 이러한 DNA 단편은 또한 mRNA 안정화 신호 및 핵 위치화 신호와 같은 신호 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 플라스미드 벡터는 천연 및 합성 DNA 단편으로 구성될 수 있다.
용어 "인핸서 영역(enhancer region)"은 표적화된 유전자 발현에 필요하지 않지만 유전자 발현 수준을 증가시키도록 설계된 뉴클레오티드의 서열을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "발현가능한 형태(expressible form)"는 표적 단백질 또는 표적 분자를 암호화하는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 필요한 조절 요소를 함유하는 유전자 구조체를 의미하며, 개체의 세포에 존재할 때, 상기 코딩 서열이 발현된다.
본 명세서에 사용된 용어 "유전자 프로모터(gene promoter)" 또는 “프로모터(promoter)"는 유전자 발현에 필요한 뉴클레오티드의 서열을 의미하고 이와 관련된다.
본 명세서에 사용된 용어 "유전자 백신(genetic vaccine)"은 표적 단백질 또는 표적 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 구조체를 포함하고 치료적 면역 반응을 유발하는 데 유용한 약학 제제를 포함할 수 있는 약학 제제를 의미한다. 일부 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 shRNA, siRNA, 안티센스(antisense), 항체, 호르몬, 인슐린 등을 암호화한다. 보조제(이에 제한되지 않음)와 같은 다른 표적 분자도 본 명세서에 기재된 바와 같이 암호화될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "유전자 치료제(genetic therapeutic)"는 치료(therapeutic) 또는 보상(compensating) 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 구조체를 포함하는 약학 제제를 의미한다.
용어 “억제하는(inhibiting)"은 플라스미드 또는 핵산 분자의 투여로 증상의 발병을 예방하고, 증상을 완화하고, 증상을 감소시키고, 질병 및/또는 증상의 진행을 지연 또는 감소시키거나, 또는 질병, 질환 또는 장애를 제거하는 것을 포함한다.
용어 "핵 위치화 신호(nuclear localization signal)"는 목적 단백질의 세포핵으로의 세포하(subcellular) 라우팅 신호를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 지칭하기 위해 사용된다. 핵 위치화 신호는 또한 핵산 분자를 세포의 핵으로 직접 수송하는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "복제 기점(origin of replication)" 또는 "ORI"는 플라스미드의 숙주 세포 복제를 지시하거나 유도할 수 있는 뉴클레오티드의 서열을 의미한다.
"약학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)"이란 담체, 희석제 또는 부형제가 제형의 다른 성분과 양립할 수 있어야 하며 수용자에게 해롭지 않아야 함을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "폴리 A 테일(poly A tail)"은 아데닌 (A) 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열과 관련된다. 이러한 뉴클레오티드는 일반적으로 메신저(messenger) RNA 분자(mRNA)의 말단에서 발견된다. 폴리-A 테일은 목적 유전자 발현의 향상을 허용하는 DNA 구조의 끝의 3'에서 통합된다. 일부 구체예에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 폴리 A 테일을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "리포터 유전자(reporter gene)"는 특정 목적 프로모터를 모니터링하는 활성에 유용한 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 리포터 유전자의 예에는 GFP 및 SEAP와 같은 형광 단백질이 포함된다.
본 명세서에 사용된 용어 "태그 서열(tag sequence)"또는 “태그(Tag)"는 고유한 단백질 또는 펩티드 영역을 암호화하는 뉴클레오티드의 서열을 의미하며, 이는 임의의 내인성 대응물과 구별되고 검출될 수 있게 한다. 태그의 비-제한적인 예에는 His 태그, GST 태그, 칼모듈린 결합 단백질(CBP: Calmodulin Binding Protein), 말토오스-결합 단백질(MBP), myc 태그, HA 태그, FLAG 태그 등이 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "표적 단백질(target protein)"은 면역 반응이 유도될 수 있고 유도되기를 원하는 단백질을 의미할 수 있다. 표적 단백질은 예를 들어 면역원성 단백질 또는 이의 단편일 수 있으며, 이는 적어도 하나의 에피토프를 병원체의 단백질 또는 암세포와 같은 바람직하지 않은 세포-유형과 공유한다. 표적 단백질에 대한 면역 반응은 표적 단백질과 관련된 특정 감염 또는 질병에 대해 개체를 보호하고 치료할 면역 반응을 유도하는데 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 단백질은 세포 표면 단백질 또는 세포로부터 분비되는 단백질(항원)이다. 일부 구체예에서, 이러한 유형의 단백질 또는 항원을 사용하여 T-세포독성 림프구 또는 CD8+ 면역 세포로부터 활성화된 면역 반응을 유도할 수 있다. 예를 들어, 이러한 유형의 단백질 또는 항원은 CD8+ 면역 세포와 상호 작용하는 MHC(major histocompatibility complex) 클래스 I 경로에 의해 처리될 수 있다. 이 경로를 통한 단백질/항원의 제시는 예를 들어 표적 단백질의 N 말단에 유비퀴틴 모이어티를 첨가함으로써 촉진될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 핵산 분자는 유비퀴틴 모이어티에 연결되거나, (프레임 내) 융합되거나, 접합된 표적 단백질을 암호화할 수 있다.
"표적 단백질(target protein)"은 또한 세포에서 발현되거나 세포로부터 분비되는 단백질을 의미할 수 있다. 표적 단백질은 수용체, 항체, 키메라 항원 수용체(CAR), 인슐린 등과 같은 호르몬일 수 있다.
본 명세서에 기술된 핵산 분자는 또한 shRNA, siRNA, 안티센스, 마이크로 RNA 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 본 명세서에 제공된 핵산 분자와 같은 상이한 유형의 표적 분자를 발현하는 데 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "치료제"는 환자의 원치 않는 질환 또는 질병을 치료, 방지, 개선, 예방하거나 호전시키는 데 사용되는 제제를 의미한다. 부분적으로, 구체예는 암 치료 또는 세포 증식 감소에 관한 것이다. 부분적으로, 구체예는 감염 또는 감염원의 치료에 관한 것이다.
치료제의 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)” 또는 “유효량(effective amount)"은 원하는 효과를 달성하기 위해, 즉 면역 반응을 자극하기위해 계산된 정량이다. 본 방법에 의해 고려되는 활성은 적절한 경우, 의학적 치료 및/또는 예방적 치료를 모두 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 “치료하다(treat)”, “치료되는(treated)” 또는 “치료하는(treating)”은 치료법 및 예방적(prophylactic 또는 preventative) 조치를 모두 의미하며, 여기서 목적은 원치 않는 생리학적 질환, 장애 또는 질병을 예방하거나 늦추거나, 또는 유익하거나 원하는 임상 결과를 얻기 위한 것이다.
용어 "비번역 영역(untranslated region)"은 mRNA 분자 내에서 발견되는 단백질을 코딩하지 않는 뉴클레오티드 영역을 가리는(cover) 뉴클레오티드의 서열을 의미한다. 번역되지 않은 이러한 영역은 mRNA 분자의 5’ 및 3’ 영역에서 찾을 수 있다. 일부 구체예에서, 표적 단백질 또는 표적 단백질의 단편을 암호화하는 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 비번역 영역을 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에서, 본 명세서에 개시된 핵산 분자 및 방법은 “치료가 필요한(in need thereof)"이라고도 언급될 수 있는, 이러한 치료를 필요로 하는 대상과 함께 또는 대상에서 이용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, “치료가 필요한"이라는 구는 대상이 특정 방법 또는 치료에 대한 필요성이 있는 것으로 확인되었고 치료가 특정 의도로 특정 목적을 위해 대상에게 제공되었음을 의미한다.
본 발명의 일부 구체예에서, 핵산 서열은 다음을 포함한다: 구성적 프로모터를 암호화하는 서열, 표적 전장 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 서열, 링커의 아미노산 서열을 암호화하는 서열, 유비퀴틴의 아미노산 서열을 암호화하는 서열, 표적 단백질의 적어도 7개의 아미노산 잔기를 암호화하는 서열, 및 핵 위치화 신호를 암호화하는 서열(여기서 서열은 서로 작동 가능하게 연결되고 b), c), d) 및 e)의 서열은 전장 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하기 위해 서로 작동 가능하게 연결됨); 링커의 아미노산 서열, 유비퀴틴의 아미노산 서열 및 표적 단백질의 적어도 7개의 아미노산 잔기. 일부 구체예에서, 단편은 길이가 약 7 내지 약 25개 아미노산이다. 일부 구체예에서, 단편은 약 7 내지 약 15, 약 7 내지 약 12, 약 7 내지 약 10, 약 7 내지 약 9개 아미노산 길이이거나, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 아미노산 길이이다.
본 발명의 일부 구체예에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 표적 단백질의 단편을 암호화하는 서열을 함유하지 않거나 포함하지 않거나(예를 들어, 없는(free of)), 또는 대안적으로 핵산 분자는 전장 단백질이 핵산 분자에 의해 암호화되지 않은 경우 표적 단백질의 하나의 단편을 암호화하기만 한다.
본 발명의 일부 구체예에서, 핵산 서열은 프로모터를 포함한다. 일부 구체예에서, 프로모터는 구성적 프로모터 또는 조직 특이적 프로모터이다. "조직 특이적 프로모터(tissue specific promoter)"는 발현을 제한하거나 특이적 조직 유형으로 발현을 크게 제한하는 프로모터이다. 프로모터는 또한 핵산 분자의 발현이 특정 세포 또는 세포의 서브세트(subset)로 제한되기 위한 세포 특이적 프로모터일 수 있다. 사용될 수 있는 프로모터의 예에는 EF-1, SV40, Rous Sarcoma 바이러스(RSV), Mason-Pfizer 원숭이 바이러스-CTE 및 CTE+rev가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 일부 구체예에서, EF-1 프로모터는 다음의 서열에 의해 암호화된다:
GACTCTTCGCGATTATCGCCGAATTCACGCGTCGTGAGGCTCCTGCAGGGCCGACTAGTGGAGCCGAGAGTAATTCATACAAAAGGAGGGATCGCCTTCGCAAGGGGAGAGCCCAGGGACCGTCCCTAAATTCTCACAGACCCAAATCCCTGTAGCCGCCCCACGACAGCGCGAGGAGCATCCGCCCAGGGCTGAGCGCGGGTAGATCAGAGCACACAAGCTCACAGTCCCCGGCGGTGGGGGGAGGGGCGCGCTGAGCGGGGGCCAGGGAGCTGGCGCGGGGCAAACTGGGAAAGTGGTGTCGTGTGCTGGCTCCGCCCTCTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACGGTATATAAGTGCGGTAGTCGCCTTGGACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGTCAGAACGCAGCTGAAGCTTCGAGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCCAGCTAGCGTTTAAACTTGCCGCCACC (서열 번호 1)
프로모터의 이러한 비-제한적 예는 구성적 프로모터라고도 할 수 있다. 프로모터의 이러한 비-제한적인 예는 공지되어 있으며 핵산 분자 내에 내포될 수 있다. 그러나, 핵산 분자로부터 표적 단백질의 발현을 유도하는 데 사용할 수 있는 수많은 프로모터가 있기 때문에 이 리스트(list)는 단지 예시 목적일뿐이다. 본 명세서에 제공된 바와 같이, 프로모터를 암호화하는 핵산 분자는 세포에서 표적 단백질의 발현을 제어, 조절 또는 구동하기 위해 표적 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 작동 가능하게 연결된다.
본 발명의 일부 구체예에서, 핵산 분자는 표적 단백질 또는 표적 분자를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 표적 단백질은 MAGE-A4, MAGE-A2, 인슐린, 항체, 호르몬, 키메라 항원 수용체, 수용체, 융합 단백질, GFP, SEAP 등이다. 이들 표적 분자는 유비퀴틴, 표적 분자의 단편, 링커 등과 같은 플라스미드의 다른 요소와 함께 또는 이들 없이 발현될 수 있다. 일부 구체예에서, 항체는 단일 사슬 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 단일 도메인 항체(sdAb)이다. 일부 구체예에서, 항체는 scFV이다.
본 명세서에 제공된 바와 같이, 표적 분자는 핵산 분자(예: 플라스미드)로부터 발현되는 항체일 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "항체"는 광의적인 의미이며 다클론 항체를 포함하는 면역글로불린 또는 항체 분자, 뮤린(murine), 인간, 인간화 및 키메라 단일클론 항체를 포함하는 단일클론 항체 및 ScFv 또는 헥사바디(hexabodies)와 같은 항체 단편을 포함한다(PLOS Biology | DOI:10.1371/journal.pbio.1002344 January 6, 2016, 이는 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함됨).
본 명세서에 사용된 용어 "인간화 항체(humanized antibody)", "조작된 항체(engineered antibody)", "적응된 인간 프레임워크(human framework adapted)" 및 "HFA"는 인간 기원의 서열로부터 유래된 가변 영역 프레임워크를 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 더욱이, 항체가 불변 영역을 포함하는 경우, 불변 영역은 이러한 인간 서열, 예를 들어 인간 생식선 서열, 또는 자연 발생(예를 들어, 알로타이프(allotypes)) 또는 인간 생식선 서열의 돌연변이된 버전으로부터 유래될 수 있다. 인간화 항체는 인간 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발 또는 체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다.
일반적으로, 항체는 특정 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는 단백질 또는 폴리펩티드이다. 온전한 항체는 2개의 경쇄와 2개의 중쇄로 구성된 헤테로테트라머(heterotetrameric) 단백질이다. 전형적으로, 각 경쇄는 하나의 공유 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되는 반면, 이황화 결합의 수는 상이한 면역글로불린 아이소타입(isotypes)의 중쇄 사이에서 다양하다. 각 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적으로 이격된 사슬내 이황화결합을 가지고 있다. 각 중쇄는 한쪽 끝에 가변 도메인(VH)이 있고 그 뒤에 여러 불변 도메인이 있다. 각 경쇄는 한쪽 끝에 가변 도메인(VL)과 다른쪽 끝에 불변 도메인을 가지고 있고; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 첫번째 불변 도메인과 정렬되고 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 임의의 척추동물 종의 항체 경쇄는 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 두 가지 분명하게 구별되는 유형, 즉 카파 및 람다 중 하나에 할당될 수 있다. 면역글로불린은 중쇄 불변 도메인 아미노산 서열에 따라, 5개의 주요 클래스, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM에 할당될 수 있다. IgA 및 IgG는 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 아이소타입으로 추가로 하위-분류된다.
용어 "항체 단편(antibody fragment)"은 온전한 항체의 일부, 일반적으로 온전한 항체의 항원 결합 또는 가변 영역을 의미한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab’)2 및 Fv 단편, 이중체(diabodies), 단일 사슬 항체 분자 및 적어도 2개의 온전한 항체로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, 항체는 단일-사슬 가변 단편(scFv) 항체일 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, MAGE-A2를 암호화하는 핵산 분자는 다음을 포함한다:
ATGCCGCTCGAACAGAGGAGCCAGCACTGTAAACCAGAAGAAGGACTCGAAGCGAGGGGGGAAGCGTTGGGGTTGGTAGGTGCTCAAGCACCAGCAACTGAGGAACAGCAAACTGCGAGTTCTTCTTCCACATTGGTGGAAGTTACTCTTGGGGAGGTTCCCGCTGCGGACAGTCCCTCCCCTCCACATTCCCCCCAGGGTGCAAGTTCCTTTAGCACCACAATCAACTACACCCTGTGGCGACAGTCAGATGAGGGAAGTTCTAATCAAGAAGAAGAGGGGCCACGCATGTTTCCCGACCTCGAGTCTGAGTTCCAAGCCGCTATAAGCAGGAAGATGGTTGAGTTGGTTCATTTTCTGCTCCTCAAGTATCGAGCCAGGGAGCCGGTCACAAAGGCAGAAATGCTGGAGAGTGTCCTCAGAAATTGCCAGGACTTCTTTCCCGTGATCTTCAGCAAAGCCTCCGAGTACTTGCAGCTGGTCTTTGGCATCGAGGTGGTGGAAGTGGTCCCCATCAGCCACTTATACATCCTTGTCACCTGCCTGGGCCTCTCCTACGATGGCCTGCTGGGCGACAATCAGGTCATGCCCAAGACAGGCCTCCTGATAATCGTCCTGGCCATAATCGCAATAGAGGGCGACTGTGCCCCTGAGGAGAAAATCTGGGAGGAGCTGAGTATGTTGGAGGTGTTTGAGGGGAGGGAGGACAGTGTCTTCGCACATCCCAGGAAGCTGCTCATGCAAGACCTGGTGCAGGAAAACTACCTGGAGTACCGGCAGGTGCCTGGTAGAGACCCAGCCTGTTATGAATTTCTGTGGGGACCAAGAGCACTTATCGATACTAGTTATGTGAAAGTCCTGCACCATACACTAAAGATCGGTGGAGAACCTCACATTTCCTACCCACCCCTGCATGAACGGGCTTTGAGAGAGGGAGAAGAG (서열 번호 2)
본 발명의 일부 구체예에서, 핵산 서열은 다음의 서열을 포함하는 MAGE-A2의 단백질을 암호화한다
MPLEQRSQHCKPEEGLEARGEALGLVGAQAPATEEQQTASSSSTLVEVTLGEVPAADSPSPPHSPQGASSFSTTINYTLWRQSDEGSSNQEEEGPRMFPDLESEFQAAISRKMVELVHFLLLKYRAREPVTKAEMLESVLRNCQDFFPVIFSKASEYLQLVFGIEVVEVVPISHLYILVTCLGLSYDGLLGDNQVMPKTGLLIIVLAIIAIEGDCAPEEKIWEELSMLEVFEGREDSVFAHPRKLLMQDLVQENYLEYRQVPGRDPACYEFLWGPRALIDTSYVKVLHHTLKIGGEPHISYPPLHERALREGEE(서열 번호 3)
본 발명의 일부 구체예에서, MAGE-A4를 암호화하는 핵산 분자는 다음을 포함한다:
atgtcttctgagcagaagagtcagcactgcaagcctgaggaaggcgttgaggcccaagaagaggccctgggcctggtgggtgcacaggctcctactactgaggagcaggaggctgctgtctcctcctcctctcctctggtccctggcaccctggaggaagtgcctgctgctgagtcagcaggtcctccccagagtcctcagggagcctctgccttacccactaccatcagcttcacttgctggaggcaacccaatgagggttccagcagccaagaagaggaggggccaagcacctcgcctgacgcagagtccttgttccgagaagcactcagtaacaaggtggatgagttggctcattttctgctccgcaagtatcgagccaaggagctggtcacaaaggcagaaatgctggagagagtcatcaaaaattacaagcgctgctttcctgtgatcttcggcaaagcctccgagtccctgaagatgatctttggcattgacgtgaaggaagtggaccccgccagcaacacctacacccttgtcacctgcctgggcctttcctatgatggcctgctgggtaataatcagatctttcccaagacaggccttctgataatcgtcctgggcacaattgcaatggagggcgacagcgcctctgaggaggaaatctgggaggagctgggtgtgatgggggtgtatgatgggagggagcacactgtctatggggagcccaggaaactgctcacccaagattgggtgcaggaaaactacctggagtaccggcaggtacccggcagtaatcctgcgcgctatgagttcctgtggggtccaagggctctggctgaaaccagctatgtgaaagtcctggagcatgtggtcagggtcaatgcaagagttcgcattgcctacccatccctgcgtgaagcagctttgttagaggaggaagagggagtctga(서열 번호 4)
본 발명의 일부 구체예에서, 핵산 분자는 다음의 서열을 포함하는 MAGE-A4의 단백질을 암호화한다:
MSSEQKSQHCKPEEGVEAQEEALGLVGAQAPTTEEQEAAVSSSSPLVPGTLEEVPAAESAGPPQSPQGASALPTTISFTCWRQPNEGSSSQEEEGPSTSPDAESLFREALSNKVDELAHFLLRKYRAKELVTKAEMLERVIKNYKRCFPVIFGKASESLKMIFGIDVKEVDPASNTYTLVTCLGLSYDGLLGNNQIFPKTGLLIIVLGTIAMEGDSASEEEIWEELGVMGVYDGREHTVYGEPRKLLTQDWVQENYLEYRQVPGSNPARYEFLWGPRALAETSYVKVLEHVVRVNARVRIAYPSLREAALLEEEEGV(서열 번호 5)
당업자에게 알려진 바와 같이, 특정 아미노산 서열을 갖는 펩티드는 유전 코드가 변성된다는 사실 때문에 상이한 핵산 분자에 의해 암호화될 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자의 서열은 최적화된다. 서열은 사용되는 세포 유형 또는 핵산 분자가 투여되는 대상에 따라 코돈 사용 및 빈도에 기초하여 최적화될 수 있다. 코돈 최적화는 단백질 발현을 최대화하는데 유용할 수 있다. 이것은 포유류 세포에 대한 mRNA 서열의 코돈 사용을 최적화함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자 내에서 사용되는 감염성 표적 단백질을 암호화하는 면역원 유전자 서열을 변경하여 발현 및 발현된 단백질 면역원성을 증가시킬 수 있다. 코돈 사용을 최적화하는 방법은 공지되어 있다. 추가로, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 서열에 정지 코돈을 가질 수 있다. 당업자는 정지 코돈이 변성된 정지 코돈으로 대체될 수 있음을 이해할 것이다. 정지 코돈은 U(T)AA, U(T)AG 및 U(T)GA로 공지되어 있다.
따라서, 상기 표에 제시된 핵산 서열은 단지 예시 목적일 뿐이며 표적 단백질의 관련 아미노산 서열을 암호화하는 것으로 제한하려는 의도는 아니다. 추가로, 일부 구체예에서, 표적 단백질의 전체 길이 미만이 사용된다. 일부 구체예에서, N- 및/또는 C-말단으로부터 독립적으로 적어도 5, 10, 15 또는 20개의 아미노산 잔기는 핵산 분자에 의해 암호화되지 않는다. 일부 구체예에서, 표적 단백질은 핵산 분자에 의해 암호화되는 표적 단백질의 단편보다 크다.
본 발명의 일부 구체예에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자에 의해 암호화된 단백질은 보존적 치환을 포함한다. 보존적 치환은 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, 핵산 분자는 표적 단백질의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 상이한 핵산 분자를 포함한다. 일부 구체예에서, 단편은 약 7 내지 약 25개의 표적 단백질 잔기를 포함한다. 일부 구체예에서, 단편은 약 7 내지 약 20, 약 7 내지 약 18, 약 7 내지 약 15, 약 7 내지 약 13, 약 7 내지 약 12, 약 7 내지 약 11, 약 7 내지 약 9, 약 8 내지 약 25, 약 8 내지 약 20, 약 8 내지 약 18, 약 8 내지 약 15, 약 8 내지 약 13, 약 8 내지 약 12, 약 8 내지 약 11, 약 8 내지 약 9, 약 9 내지 약 25, 약 9 내지 약 20, 약 9 내지 약 18, 약 9 내지 약 15, 약 9 내지 약 13, 약 9 내지 약 12, 약 9 내지 약 11개의 표적 단백질 잔기 등을 포함한다. 일부 구체예에서, 단편은 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 또는 약 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개의 아미노산 잔기의 길이이다.
본 발명의 일부 구체예에서, 표적 단백질의 단편 및/또는 표적 단백질 자체는 MHC I 또는 MHC II CD8+ 면역 세포 또는 T-세포독성 림프구에 의한 면역원성 반응을 유도한다. 일부 구체예에서, 표적 단백질의 단편은 다음 표에서 아미노산 서열로 표시된다:
Figure pct00001
단편은 또한 단편을 암호화하는 서열을 포함하는 다른 핵산 분자에 의해 암호화될 수 있다. 표에 제시된 핵산 서열은 단지 설명을 위한 것이며 이를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 일부 구체예에서, 핵산 서열은 글리신-세린 또는 글리신-알라닌 링커와 같지만 이에 제한되지 않는 링커를 암호화하는 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 글리신-세린 링커는 GGGGS(서열 번호 13)의 서열을 포함한다. 링커는 또한 이 서열의 반복을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 GGGGS 반복을 포함한다. 일부 구체예에서, 글리신-알라닌 링커는 GGGGA의 서열(서열 번호 10)을 포함한다. 링커는 또한 이 서열의 반복을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 GGGGA(서열 번호 10) 반복을 포함한다. 링커는 또한 링커 서열의 혼합을 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 링커는 GGGGSGGGGAGGGGS(서열 번호 11) 등의 서열을 포함할 수 있다. 다른 펩티드 링커도 사용할 수 있다. 일부 구체예에서, 글리신-세린 링커는 GGSGS(서열 번호 12)의 서열 및 이의 다중 반복을 포함한다. 본 명세서에 제공된 임의의 링커의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 반복이 있을 수 있다. 링커는 서로 혼합될 수도 있다. 일부 구체예에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 링커를 암호화하는 서열을 함유하지 않거나 포함하지 않는다(예를 들어, 존재하지 않음).
본 발명의 일부 구체예에서, 핵산 분자는 단일 유비퀴틴 단백질 또는 2개 이상의 유비퀴틴 단백질 사슬로서 유비퀴틴을 암호화한다. 일부 구체예에서, 유비퀴틴을 암호화하는 서열은 UBB, UBC, UBA52 및 RPS27A를 암호화하는 서열로부터 선택된다. 암호화된 유비퀴틴은 동종 유비퀴틴 사슬 또는 상이한 유비퀴틴 분자를 포함하는 이종 유비퀴틴 사슬일 수 있다. 이러한 서열의 예에는 다음 표의 서열이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다:
Figure pct00002
본 발명의 일부 구체예에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 유비퀴틴 단백질을 암호화하는 서열을 포함하지 않는다(예를 들어, 존재하지 않음).
본 발명의 일부 구체예에서, 핵산 서열은 핵 위치화 신호를 암호화하는 서열을 포함한다. 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 핵 위치화 신호의 비-제한적인 예는 다음의 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 암호화될 수 있는 요소 1이다:
CACAATTCCACACATGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACACACGTGCTAAAACTTCATTTT (서열 번호 19)
본 발명의 일부 구체예에서, 전장 단백질, 글리신-세린 링커, 유비퀴틴 단백질 및 전장 단백질의 단편을 포함하는 단백질을 암호화하는 핵산 분자가 제공된다. 일부 구체예에서, 단편을 암호화하는 핵산 분자는 핵산 분자 또는 플라스미드에 포함되지 않는다. 표적 분자의 단편이 없으면, 유비퀴틴 단백질을 암호화하는 서열은 필요하지 않다. 따라서, 일부 구체예에서, 유비퀴틴 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 존재하지 않거나, 달리 말하면, 핵산 분자에는 유비퀴틴 단백질을 암호화하는 서열이 없다.
따라서, 일부 구체예에서, 링커 서열, 유비퀴틴 단백질 또는 단백질의 단편을 암호화하는 분자없이 전장 단백질 및 NLS 신호를 포함하는 단백질을 암호화하는 핵산 분자가 제공된다. 핵산 분자는 플라스미드일 수 있다.
단편의 예는 본 명세서에서 제공되며 약 7 내지 약 25개의 아미노산 길이 또는 본 명세서에 달리 기재된 바와 같을 수 있다. 이러한 단백질의 비-제한적인 예는 도 2에 나타난 바와 같이 예시될 수 있다. 다른 비-제한적인 예는 도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이 예시될 수 있다:
본 발명의 일부 구체예에서, 이들 구체예의 Gly/Ser 링커는 GGGGS, GGGGA 또는 GGSGS를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 본 명세서에 제공된 바와 같다. 일부 구체예에서, 유비퀴틴 단백질은 UBB, 또는 서열 번호 14이다. 일부 구체예에서, 단편은 서열 번호 6 또는 8이다.
본 발명의 일부 구체예에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 링커를 암호화하는 서열을 함유하지 않거나 포함하지 않는다(예를 들어, 존재하지 않음).
핵산 분자의 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 다른 요소는 단백질을 암호화하는 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, 구성적 프로모터를 암호화하는 서열, 표적 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 서열, 링커의 아미노산 서열을 암호화하는 서열, 유비퀴틴의 아미노산 서열을 암호화하는 서열, 표적 단백질의 적어도 7개 아미노산 잔기 펩티드 단편을 암호화하는 서열, 및 핵 위치화 신호를 암호화하는 서열(여기서 서열은 서로 작동 가능하게 연결되고 b), c), d), 및 e)의 서열은 서로 작동 가능하게 연결되어 전장 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화함); 링커의 아미노산 서열, 유비퀴틴의 아미노산 서열 및 표적 단백질의 적어도 7개의 아미노산 잔기를 포함하는 핵산 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 본 명세서에 기재된 핵산 분자를 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 다른 단편 크기가 본 명세서에 제공된다.
또한 본 명세서에 기술된 핵산 분자에 의해 암호화되는 단백질 또는 펩티드가 본 명세서에 제공된다.
본 발명의 일부 구체예에서, 핵산 분자가 제공되며, 여기서 핵산 분자는 프로모터를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 사용될 수 있는 구성적 프로모터의 비-제한적인 예가 본 명세서에 제공된다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 표적 분자 또는 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 표적 분자 및 단백질의 예가 본 명세서에 제공된다. 이러한 예는 설명 목적으로만 사용되며 비-제한적이다. 표적 분자 또는 단백질은 핵산 분자에 의해 암호화되도록 선택한 핵산 분자에 의해 암호화되는 임의의 분자 또는 단백질일 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 링커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 링커의 예가 본 명세서에 제공된다. 예를 들어, 링커는 핵산 분자에 의해 암호화될 수 있는 임의의 펩티드 링커일 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 유비퀴틴을 암호화하는 폴리뉴클레오티를 포함한다. 링커의 예가 본 명세서에 제공된다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 표적 단백질의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 명세서에서 다양한 단편 크기가 제공된다. 일부 구체예에서, 단편은 표적 단백질의 약 7 내지 약 25개 아미노산 잔기이다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 핵 위치화 신호(NLS)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구체예에서, NLS는 발현되는 단백질 또는 태그를 암호화하지 않는다. 대신, NLS는 세포에 의해 인식되는 핵산 분자일 수 있고 NLS를 포함하는 핵산 분자가 핵에 존재(예를 들어, 전달됨)되도록 보장할 수 있다. 본 명세서에 제공된 요소는 서로 작동 가능하게 연결될 수 있다. 모든 요소가 존재하는 경우 핵산 분자는 전장 단백질의 아미노산 서열; 링커의 아미노산 서열, 유비퀴틴의 아미노산 서열 및 표적 단백질의 단편을 포함하는 단백질을 암호화할 수 있다.
본 명세서에 제공된 핵산 분자는 단일 분자, 예를 들어 플라스미드로 제공될 수 있다. 일부 구체예에서, 각 요소는 상이한 요소를 암호화하는 별개의 뉴클레오티드 분자와는 대조적으로 단일 폴리뉴클레오티드 서열(또는 플라스미드(이에 제한되지는 않음)와 같은 이중 가닥 분자)에 의해 암호화된다. 플라스미드와 같은 단일 분자를 사용하면 사용자가 표적 분자 또는 표적 단백질을 관련 세포 또는 세포 환경 내에 효율적으로 도입할 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 구성적 프로모터를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드; 목적 분자로도 지칭될 수 있는 표적 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 핵 위치화 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며; 여기서 서열은 서로 작동 가능하게 연결될 수 있거나 연결된다. 일부 구체예에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 구성적 프로모터를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 목적 분자로도 지칭될 수 있는 표적 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및 핵 위치화 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고; 여기서 서열은 서로 작동 가능하게 연결된다. 목적 분자(표적 분자)는 핵산 분자에 의해 암호화될 수 있는 임의의 분자일 수 있다. 예를 들어, 표적 분자는 T-세포 또는 다른 유형의 세포에서 발현될 수 있고 T-세포에서 기능할 수 있는 키메라 항원 수용체(CAR)일 수 있다. 따라서, 플라스미드 형태일 수 있는 핵산 분자를 사용하여 표적 분자를 목적 세포에 전달할 수 있다. 일부 구체예에서, 세포는 T-세포, 수지상 세포, NK 세포, TIL, MIL 등과 같은 면역 세포이다.
본원발명의 일부 구체예에서, 핵산 분자는 세포에서 발현될 수 있는 표적 분자를 전달하는 데 사용된다. 따라서, 플라스미드일 수 있는 핵산 분자는 세포에서 단백질 또는 핵산 분자를 발현하는 데 사용될 수 있다. 표적 분자는 단백질, 안티센스 핵산 분자, siRNA 분자, 마이크로RNA, 항체, 수용체 또는 본 명세서에 설명된 것과 같은 핵산 분자에 의해 암호화될 수 있는 다른 유형의 분자를 암호화하는 핵산 분자일 수 있다. 암호화될 수 있는 생성물의 다른 예로는 인슐린, 호르몬, 유전자 산물 등이 있다. 유전자 산물의 특정 구조는 반드시 중요하지는 않지만, 플라스미드와 같은 핵산 분자가 사용될 수 있는 다양한 구체예를 보여준다. 일부 구체예에서, 표적 분자는 암을 치료할 수 있는 항체, 예를 들어 PD-1, PD-L1, BSMA 등에 결합하는 항체이다. 이러한 항체의 예는 펨브롤리주맙, 니볼루맙 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 CAR의 예는 PD-1, PD-L1, BSMA, PSMA 등에 결합하는 세포 외 영역을 포함하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, CAR은 CD19 세포 외 결합 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, CAR은 4-1BB 세포내 영역을 포함한다. 일부 구체예에서, CAR은 CD3
Figure pct00003
세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, CAR은 CD28 세포내 도메인을 포함한다. 일부 구체예에서, CAR의 막횡단 도메인은 CD3
Figure pct00004
막횡단 도메인 또는 CD28 막횡단 도메인이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 일부 구체예에서, 핵산 분자, 예를 들어. 플라스미드는 비-통합 핵산 분자이다.
본 발명의 일부 구체예에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 대상에게 투여되고 세포에 의해 흡수된다. 일부 구체예에서, 세포는 체외 핵산 분자(예를 들어, 플라스미드)로 처리된 다음 체내에서 분자를 발현하기 위해 대상에게 다시 투여된다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 특정 세포 유형에 핵산 분자를 전달하기 위해 나노입자와 복합된다. 예를 들어, 핵산 분자는 지질 나노입자, 폴리머 나노입자, 리포좀, 중성 리포좀, 생분해성 폴리머 매트릭스(예: 하이드로겔) 등과 캡슐화되거나 복합될 수 있다. 나노입자의 예는 Xiao et al., Molecular Therapy: Methods & Clinical Development Vol. 12 March 2019, pp. 1-18에 기술되어 있고, 이는 전체가 참조로 본 명세서에 포함된다. 사용할 수 있는 폴리머의 예로는 폴리에테르이미드(PEI), 락토실화 폴리라이신(PLL), 폴리아크릴산(PAA), 폴리(지방족 에스테르)(PAE) 및 폴리(N,N-디메틸아미노에틸 메타크릴레이트)(PDMAEMA)에 가장 중점을 둔 연구가 있지만 이에 한정되지 않는다. 이러한 폴리머는 화학적 변형에 의해 변형되거나 변형이 없을 수 있다. 다른 폴리머에는 키토산(예: 양이온성 키토산), 폴리(에틸렌글리콜)-변형 키토산(PEG-CS), 카르복시메틸 덱스트란(CMD)-키토산, 젤라틴(예: 양이온성 젤라틴), 덱스트란(예: 양이온성 덱스트란), 셀룰로오스(예: 양이온성 셀룰로오스), 시클로덱스트린(예: 양이온성 시클로 덱스트린)이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일부 구체예에서, 핵산 분자는 담체 또는 나노입자로 캡슐화되지 않는다. 일부 구체예에서, 약학 조성물은 핵산 분자를 캡슐화하는 나노입자가 없다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 핵산 분자는 프로모터, 예컨대 구성적 프로모터를 포함할 수 있다. 구성적 프로모터의 예에는 EF-1, SV40, Rous Sarcoma 바이러스 및 Mason-Pfizer 원숭이 바이러스-CTE가 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 일부 구체예에서, 프로모터는 EF-1이다. 일부 구체예에서, 프로모터는 SV40이다. 일부 구체예에서, 프로모터는 RSV이다. 일부 구체예에서, 프로모터는 Mason-Pfizer 원숭이 바이러스-CTE이다.
핵산 분자는 또한 하나 이상의 보조제를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 보조제는 IL-12이다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 항-CD40 항체, GM-CSF, 베바시주맙, 인터페론-알파, 인터페론-베타, 폴리-(I:C) 및 유도체, RNA 인터루킨 (IL)-1, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, IL-13, IL-15, IL-21 및 IL-23 등으로 이루어진 군으로부터 하나 이상을 암호화한다.
본 발명의 일부 구체예에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자는 핵 위치화 신호(NLS)를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, NLS는 요소 1이다. 일부 구체예에서, 서열은 서열 19에 제시된 바와 같다.
의심의 여지를 없애기 위해, 본 명세서에 제공된 임의의 핵산 분자는 플라스미드 또는 다른 유형의 원형 DNA 서열일 수 있으며, 따라서 세포에서 그 생성물을 발현하는 데 사용할 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 핵산 분자를 포함하는 약학 조성물이 제공된다. 약학 조성물의 예가 본 명세서에 제공된다.
본 발명의 일부 구체예에서, 분자를 세포에 전달하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 본 명세서에 제공된 바와 같은 핵산 분자와 세포를 대상의 세포 또는 대상 내로 접촉시키는 것을 포함하고, 상기 핵산 서열은 대상의 세포에 의해 흡수된다. 그 후 핵산 분자가 발현되고 표적 분자 또는 다른 발현 카세트가 세포에서 발현된다. 일부 구체예에서, 핵산 서열은 전기천공, 주사, 소니케이션, 형질감염, 형질도입, 유전자 총(gene gun)에 의해 세포 또는 대상에 도입되고, 나노입자, 리포입자(lipoparticles), 또는 핵산 분자를 대상 또는 세포에 도입하기에 적합한 다른 투여 방식에 의해 내포된다. 일부 구체예에서, 핵산 분자가 전달되는 세포 또는 조직은 피부, 근육, 유방, 폐, 췌장, 뇌, 난소, 자궁, 자궁 내막, 결장, 전립선, 식도, 잇몸, 혀, 인후 또는 신장 조직 또는 세포이다.
이들 예는 비-제한적이며 본 명세서에 제공된 분자 및 조성물은 사용자가 원하는 임의의 조직 또는 세포 유형에서 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 조성물 및 분자는 암 치료에 사용될 수 있다. 치료될 수 있는 암의 예는 뇌, 유방, 폐, 난소, 자궁 내막, 결장, 폐, 피부(예를 들어 흑색종) 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에 기재된 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 약학 조성물은 약 1 ng 내지 약 10,000 ㎍의 핵산 분자를 포함한다. 약학 조성물은 사용되는 투여 방식에 따라 제형화될 수 있다. 당업자는 본 명세서에 기술된 바와 같은 유전자 구조체 또는 핵산 분자를 포함하는 약학 조성물을 용이하게 제형화할 수 있다. 근육내 주사가 선택된 투여 방식인 경우, 등장성 제형을 사용할 수 있다. 일부 구체예에서, 등장성을 위한 첨가제는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨, 락토스 등을 포함할 수 있다. 어떤 경우에는 인산염 완충 식염수와 같은 등장성 용액이 사용된다. 일부 구체예에서, 약학 조성물은 안정화제를 포함한다. 안정화제의 예는 젤라틴 및 알부민을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 약학 제제는 멸균 및 발열원이 없는 상태로 제공될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, 대상에서 표적 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 핵산 분자를 대상에 도입하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 대상의 세포에 도입된다. 핵산 분자는 세포에 흡수될 수도 있다. 세포 내부에 들어가면 세포의 기구를 사용하여 핵산 분자에 의해 암호화되는 표적 단백질과 구조체를 발현할 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 본 명세서에 기재된 바와 같다. 도입 또는 투여 방법은 본 명세서에 기재된 방법을 포함하는 임의의 방법일 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 전기천공 또는 주사에 의해 도입된다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 소니케이션, 형질감염, 형질도입, 유전자 총, 나노입자, 리포입자, 또는 핵산 분자를 대상 또는 세포 등에 도입하기에 적합한 다른 투여 방식에 의해 대상에 도입되거나 투여된다.
본 발명의 일부 구체예에서, 부피바카인(bupivacaine) 또는 다른 유사한 보조제가 사용되어 면역반응의 유도를 용이하게 한다.
본 발명의 일부 구체예에서, 핵산 분자는 대상의 조직에 투여된다. 일부 구체예에서, 조직은 피부, 근육, 간, 지방 등이다.
본 발명의 일부 구체예에서, 암 치료 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 본명세서에 기재된 핵산 분자를 대상에게 도입하거나 투여하는 대상에서 암을 치료하는 방법이다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 세포 내로 직접 도입된다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 세포에 의해 흡수되고 세포에서 발현된다. 일부 구체예에서, 표적 단백질 및 표적 단백질의 단편은 암 세포에서 과발현되거나 특이적으로 발현되는 단백질이다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 전기천공, 주사, 소니케이션, 형질감염, 형질도입 등에 의해 투여된다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 대상의 피부, 근육 또는 다른 조직에 투여된다. 일부 구체예에서, 암은 폐암, 유방암, 자궁암, 전립선암, 난소암, 대장암, 흑색종, 골수종, 뇌암, 결장암, 췌장암 등이다. 일부 구체예에서, 암은 삼중 음성 유방암, 자궁암, 전립선암, 난소암 또는 대장암이다.
본 발명의 일부 구체예에서, 대상에서 감염원 또는 감염을 치료하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 핵산 분자를 대상에게 도입/투여하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 대상의 세포 내에 직접 투여된다. 전체에 걸쳐 설명된 바와 같이, 핵산 분자는 세포에 흡수되어 세포에서 발현될 수 있다. 특정 이론에 얽매이지 않고, 핵산 분자가 발현될 때 대상의 면역 반응은 표적 단백질과 표적 단백질의 단편을 이물질로 인식하고 면역 반응이 생성된다. 생성된 면역 반응은 감염을 치료하거나 예방할 수 있다. 일부 구체예에서, 생성된 면역 반응은 감염원이 질병을 유발하는 것을 치료 또는 예방할 수 있거나 감염의 증상을 개선하기 위해 감염원의 성장을 억제할 것이다. 투여 방법은 본 명세서에 기재된 임의의 방법일 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 대상의 피부, 근육, 지방, 신장 또는 다른 조직에 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 대상의 점막에 투여된다. 일부 구체예에서, 대상에서 감염원을 치료하는 방법은 핵산 분자를 대상의 세포에 도입하는 것을 포함하고, 상기 핵산 서열은 대상의 세포에 의해 흡수되며, 여기서 단백질은 감염원에 의해 발현되는 단백질이다. 일부 구체예에서, 핵산 분자는 전기천공, 주사, 소니케이션, 형질감염 및 형질도입에 의해 대상 또는 세포로 도입된다.
본 발명의 일부 구체예에서, 표적 단백질은 Gp120, Gag, Nef, Tat, 헤마글루티닌(HA), 뉴라미니다제(NA) 등과 같은 HIV 또는 인플루엔자 단백질이다.
본 발명의 일부 구체예에서, 대상은 또한 종양형성에 관련된 단백질을 표적으로 하는 항체로 치료될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 대상에게 본 명세서에 기재된 핵산 분자와 함께 항-PD-L1, 항-PD-1 및/또는 항-CTL4 항체가 투여된다. 항체는 본 명세서에 제공된 핵산 분자 전, 후에 또는 동시에 투여될 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, 본 명세서에 제공된 핵산 분자를 포함하는 세포가 제공된다. 일부 구체예에서, 세포는 분리된 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 대상 내가 아니라 체외이다. 세포는 T-세포, 근육 세포, 피부 세포, 뇌 세포 등과 같은 임의의 세포 유형일 수 있다.
다음 실시예는 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법을 예시하는 것이지만 이에 제한되지는 않는다. 당업자에게 알려진 다른 적절한 수정 및 변형은 다음 구체예의 범위 내에 있다.
실시예 1. 요소 1이었던 Nuclear Localization Domain이라는 DNA 요소는 세포 내부의 바이러스 경로를 모방하는 서열을 함유하고 있으며, 이는 세포 핵으로의 DNA의 위치화뿐만 아니라 핵에서 암호화된 mRNA 수송을 도울 수 있다.
실험은 표준 녹색 형광 단백질(GFP)-발현 플라스미드 DNA 발현 벡터의 서열에 이들 요소를 도입하고 상업적으로 이용가능한 양이온성 지질 형질감염 시약(즉, 리포펙트민(Lipofectmine))을 사용하여 포유류 세포에 형질감염시켰을 때, 도 1에 도시된 바와 같이 GFP 발현을 몇 배까지 향상시킬 수 있음을 보여주었다.
본 명세서에 제공된 것과 같은 핵산 분자는 종양 부담(tumor load)을 감소시키고 그리고/또는 종양 재발을 예방하는 데 사용될 수 있는 CD8+ 및 CD4+ 림프구를 통해 면역계를 직접적으로 향상시킬 수 있는 DNA-기반 전달 시스템으로 설계되었다. 항-PD-L1(예: Atezolizumab) 및/또는 항-CTL4(예: Ipilimumab)와 함께 최적화된 SMART Plasmid DNA에 대한 전-임상(Pre-clinical) 연구는 현재 화학요법의 독성을 감소시킬 수 있는 전신 면역 반응을 시작할 가능성을 입증하기 위한 테스트를 진행 중이다. PD-L1 및/또는 CTL4는 항체를 사용하는 잠재적 종양 면역요법 표적인 것으로 밝혀졌다.
또한, 항-PD-L1 및/또는 항-CTL4와 함께 SMART 플라스미드 DNA는 MAGE-A와 같은 단백질 항원을 발현하는 많은 종양에 대한 독립 치료법으로 사용될 수 있다.
선행 연구를 통해, 렌티바이러스 인테그라제 단백질과 같은 바이러스 단백질의 특정 영역은 바이러스 DNA의 핵 수송을 향상시킬 수 있다.
SMART Plasmid DNA는 이러한 바이러스 단백질의 일부를 요소 1에 통합하여, 바이러스 DNA가 핵으로 유입되도록 하고 표적 서열을 번역하는 과정을 시작한다.
SMART Plasmid DNA에서 요소 1의 DNA 위치화 특성은 외인성으로 추가된 바이러스 단백질과 조합하여 사용될 때 확대된다.
플라스미드 DNA 요소의 서열 및 플라스미드 내의 구조적 배향은 시험관내 단백질 발현을 향상시킨다.
특정 이론에 얽매이지 않고, 이러한 요소에 대한 작용 메커니즘은 DNA가 향상된 수동 수송을 통해 포유류 세포 핵 기공을 통해 보다 효율적으로 수송되거나 규칙적으로 핵으로 이동하는 분자와 상호작용하여 기공을 통해 활발히 수송될 수 있도록 하는 3-차원 구조 요소를 제공하는 것으로 이해된다. 또한, 핵산 분자 내에 포함된 요소 1 NLS는 핵에서 세포질로 전사된 메신저 RNA를 위치화할 수 있으며, 여기서 이러한 mRNA 분자는 예를 들어 치료적 이점을 위해 단백질 내로 번역될 수 있다.
포유류 세포 형질도입을 위한 렌티바이러스-유사 벡터 입자를 생산하기 위한 완전 합성 방법은 항원 발현 종양 및 기타 질병 개체의 치료를 위한 면역요법을 구축하는 강력한 주형이다. 이는 유전자 전달 기술, 형질감염 및 면역요법의 주요 기술 발전을 나타낸다.
DNA 서열은 또한 원형 플라스미드로 표현될 수 있고 MAGE A-2인 표적 단백질을 암호화할 수 있다. 플라스미드는 EF-1 프로모터 뉴클레오티드 서열, MAGE-A2 전장 뉴클레오티드 서열, 글리신-세린 링커 뉴클레오티드 서열, 유비퀴틴 뉴클레오티드 서열, MAGE-A2 9mer 펩티드 뉴클레오티드 서열 및 요소 1(핵 위치화 도메인) 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 플라스미드는 또한 Kanamcin/Neomycin 뉴클레오티드 서열 영역의 서열 및 ColE1 기원 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. MAGE A2 9-mer 플라스미드 서열의 비-제한적인 예는 하기 서열 번호 20으로 제공된다:
MAGE A2 9-mer 플라스미드 서열:
GACTCTTCGCGATTATCGCCGAATTCACGCGTCGTGAGGCTCCTGCAGGGCCGACTAGTGGAGCCGAGAGTAATTCATACAAAAGGAGGGATCGCCTTCGCAAGGGGAGAGCCCAGGGACCGTCCCTAAATTCTCACAGACCCAAATCCCTGTAGCCGCCCCACGACAGCGCGAGGAGCATCCGCCCAGGGCTGAGCGCGGGTAGATCAGAGCACACAAGCTCACAGTCCCCGGCGGTGGGGGGAGGGGCGCGCTGAGCGGGGGCCAGGGAGCTGGCGCGGGGCAAACTGGGAAAGTGGTGTCGTGTGCTGGCTCCGCCCTCTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACGGTATATAAGTGCGGTAGTCGCCTTGGACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGTCAGAACGCAGCTGAAGCTTCGAGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCCAGCTAGCGTTTAAACTTGCCGCCACCATGCCGCTCGAACAGAGGAGCCAGCACTGTAAACCAGAAGAAGGACTCGAAGCGAGGGGGGAAGCGTTGGGGTTGGTAGGTGCTCAAGCACCAGCAACTGAGGAACAGCAAACTGCGAGTTCTTCTTCCACATTGGTGGAAGTTACTCTTGGGGAGGTTCCCGCTGCGGACAGTCCCTCCCCTCCACATTCCCCCCAGGGTGCAAGTTCCTTTAGCACCACAATCAACTACACCCTGTGGCGACAGTCAGATGAGGGAAGTTCTAATCAAGAAGAAGAGGGGCCACGCATGTTTCCCGACCTCGAGTCTGAGTTCCAAGCCGCTATAAGCAGGAAGATGGTTGAGTTGGTTCATTTTCTGCTCCTCAAGTATCGAGCCAGGGAGCCGGTCACAAAGGCAGAAATGCTGGAGAGTGTCCTCAGAAATTGCCAGGACTTCTTTCCCGTGATCTTCAGCAAAGCCTCCGAGTACTTGCAGCTGGTCTTTGGCATCGAGGTGGTGGAAGTGGTCCCCATCAGCCACTTATACATCCTTGTCACCTGCCTGGGCCTCTCCTACGATGGCCTGCTGGGCGACAATCAGGTCATGCCCAAGACAGGCCTCCTGATAATCGTCCTGGCCATAATCGCAATAGAGGGCGACTGTGCCCCTGAGGAGAAAATCTGGGAGGAGCTGAGTATGTTGGAGGTGTTTGAGGGGAGGGAGGACAGTGTCTTCGCACATCCCAGGAAGCTGCTCATGCAAGACCTGGTGCAGGAAAACTACCTGGAGTACCGGCAGGTGCCTGGTAGAGACCCAGCCTGTTATGAATTTCTGTGGGGACCAAGAGCACTTATCGATACTAGTTATGTGAAAGTCCTGCACCATACACTAAAGATCGGTGGAGAACCTCACATTTCCTACCCACCCCTGCATGAACGGGCTTTGAGAGAGGGAGAAGAGGGTGGTTCTGGTAGCATGCAGATCTTCGTGAAGACGTTAACCGGTAAAACCATAACTCTCGAAGTTGAACCATCCGATACCATCGAAAACGTTAAGGCTAAAATTCAAGACAAGGAAGGCATTCCACCTGATCAACAAAGATTGATCTTTGCCGGTAAGCAGCTGGAGGACGGTAGAACGCTGTCTGATTACAACATTCAGAAGGAGTCGACCTTACATCTTGTCTTAAGACTAAGAGGTGGTAAAATGGTTGAACTTGTTCATTTTCTTTGACTCGAGCGCGCTGGGCCCTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACCGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTCGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGCTCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGAGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAATTATTAACGCTTACAATTTCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATACAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCACGTGTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACACACGTGCTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGGCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTT (서열 번호. 20)
실시예 2. 폐로 표적 분자의 전달. CFTR 단백질을 암호화하는 플라스미드를 포함하는 약학 조성물은 낭포성 섬유증을 앓고있는 환자의 폐에 투여된다. 플라스미드는 서열 번호 19의 NLS를 함유하고 구성적 프로모터에 연결된다. 폐의 세포가 플라스미드를 흡수하고 CFTR 단백질이 발현되고 대상 폐 세포에서 제대로 기능하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 3. 근육에서 표적 분자의 분비. 인슐린 단백질을 암호화하는 플라스미드를 포함하는 약학 조성물은 제1형 당뇨병을 앓고있는 환자의 근육 세포에 투여된다. 플라스미드는 서열 번호 19의 NLS를 함유하고 구성적 프로모터에 연결된다. 근육 세포는 면역 체계에 의해 파괴된 췌장의 베타 세포 대신 필요한 인슐린을 분비하여, 환자에게 정상적인 기능을 제공한다.
실시예 4. 골수로 표적 분자의 전달. 글루탐산을 암호화하는 플라스미드를 포함하는 약학 조성물은 적혈구 생산이 일어나는 골수 내에 투여된다. 플라스미드는 서열 번호 19의 NLS를 함유하고 구성적 프로모터에 연결된다. 글루탐산에 대한 서열은 환자의 알파 서브유닛의 위치 6에서 부정확한 발린(valine) 코딩으로 대체되어, 환자의 적혈구의 정상적인 모양과 기능을 가져온다.
실시예 5. 표적 분자를 췌장으로 전달. 성장 조절용 miRNA를 암호화하는 플라스미드를 포함하는 약학 조성물은 췌장암을 앓고있는 환자의 췌장에 투여된다. 플라스미드는 서열 번호 19의 NLS를 함유하고 구성적 프로모터에 연결된다. miRNA 서열은 손실된 miRNA를 대체하고 암 네트워크에 대한 원래의 제어를 복원하고 암 공격성과 성장을 역전시킬 수 있다.
본 명세서에 제공된 실시예는 분자를 전달하고 발현시키기 위한 본 명세서에 기재된 핵산 분자의 유연성을 입증한다. 이것은 단순히 분자를 세포 또는 조직에 전달하는 데 사용되거나 다양한 표적 분자에 대한 면역 반응을 유도하는 데 사용할 수 있다.
본 명세서에 설명된 실시예는 예시적인 방식이며 구체예의 범위를 제한하기 위해 의도되거나 사용되어서도 안된다. 각각의 모든 참조, 간행물, 수탁 번호, 특허, 문서 등은 의도된 목적을 위해 전체적으로 참조로 통합된다.
본 명세서는 설명된 특정 공정, 조성 또는 방법론으로 제한되지 않으며, 이는 다양할 수 있다. 명세서에 사용된 용어는 단지 특정 설명 또는 구체예를 설명하기 위한 것이며, 본 명세서에 설명된 구체예의 범위를 제한하려는 의도가 아니다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성을 위해 그리고/또는 용이한 참조를 위해 본 명세서에서 정의되며, 이러한 정의의 포함은 당업계에서 일반적으로 이해되는 것과 실질적인 차이를 나타내는 것으로 반드시 해석되어야 하는 것은 아니다. 그러나 상충되는 경우, 정의를 포함한 특허 명세서가 우선한다.
전술한 바로부터, 본 명세서의 다양한 구체예들이 예시의 목적으로 명세서에 설명되었으며, 본 명세서의 범위 및 사상을 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 명세서에 개시된 다양한 구체예는 제한하려는 의도가 아니다.
SEQUENCE LISTING <110> Pepvax, Inc. Narayanan, Mahesh Dormer, Anton <120> Nucleic Acid Molecules and Methods of Using the Same <130> 145310.00102 <150> 62/639092 <151> 2018-03-06 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 720 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gactcttcgc gattatcgcc gaattcacgc gtcgtgaggc tcctgcaggg ccgactagtg 60 gagccgagag taattcatac aaaaggaggg atcgccttcg caaggggaga gcccagggac 120 cgtccctaaa ttctcacaga cccaaatccc tgtagccgcc ccacgacagc gcgaggagca 180 tccgcccagg gctgagcgcg ggtagatcag agcacacaag ctcacagtcc ccggcggtgg 240 ggggaggggc gcgctgagcg ggggccaggg agctggcgcg gggcaaactg ggaaagtggt 300 gtcgtgtgct ggctccgccc tcttcccgag ggtgggggag aacggtatat aagtgcggta 360 gtcgccttgg acgttctttt tcgcaacggg tttgccgtca gaacgcagct gaagcttcga 420 gggctcgcat ctctccttca cgcgcccgcc gccctacctg aggccgccat ccacgccggt 480 tgagtcgcgt tctgccgcct cccgcctgtg gtgcctcctg aactgcgtcc gccgtctagg 540 taagtttaaa gctcaggtcg agaccgggcc tttgtccggc gctcccttgg agcctaccta 600 gactcagccg gctctccacg ctttgcctga ccctgcttgc tcaactctac gtctttgttt 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gtgcaggaaa actacctgga gtaccggcag 780 gtgcctggta gagacccagc ctgttatgaa tttctgtggg gaccaagagc acttatcgat 840 actagttatg tgaaagtcct gcaccataca ctaaagatcg gtggagaacc tcacatttcc 900 tacccacccc tgcatgaacg ggctttgaga gagggagaag ag 942 <210> 3 <211> 314 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Pro Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu 1 5 10 15 Glu Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala 20 25 30 Thr Glu Glu Gln Gln Thr Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val 35 40 45 Thr Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Asp Ser Pro Ser Pro Pro His Ser 50 55 60 Pro Gln Gly Ala Ser Ser Phe Ser Thr Thr Ile Asn Tyr Thr Leu Trp 65 70 75 80 Arg Gln Ser Asp Glu Gly Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro Arg 85 90 95 Met Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Ile Ser Arg Lys 100 105 110 Met Val Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu 115 120 125 Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Glu Ser Val Leu Arg Asn Cys Gln 130 135 140 Asp Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Glu Tyr Leu Gln Leu 145 150 155 160 Val Phe Gly Ile Glu Val Val Glu Val Val Pro Ile Ser His Leu Tyr 165 170 175 Ile Leu Val Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp 180 185 190 Asn Gln Val Met Pro Lys Thr Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile 195 200 205 Ile Ala Ile Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu Glu 210 215 220 Leu Ser Met Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Val Phe Ala 225 230 235 240 His Pro Arg Lys Leu Leu Met Gln Asp Leu Val Gln Glu Asn Tyr Leu 245 250 255 Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Arg Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu 260 265 270 Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ile Asp Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His 275 280 285 His Thr Leu Lys Ile Gly Gly Glu Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu 290 295 300 His Glu Arg Ala Leu Arg Glu Gly Glu Glu 305 310 <210> 4 <211> 954 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgtcttctg agcagaagag tcagcactgc aagcctgagg aaggcgttga ggcccaagaa 60 gaggccctgg gcctggtggg tgcacaggct cctactactg aggagcagga ggctgctgtc 120 tcctcctcct ctcctctggt ccctggcacc 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Ser Ser Glu Gln Lys Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Val 1 5 10 15 Glu Ala Gln Glu Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Thr 20 25 30 Thr Glu Glu Gln Glu Ala Ala Val Ser Ser Ser Ser Pro Leu Val Pro 35 40 45 Gly Thr Leu Glu Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Ala Gly Pro Pro Gln 50 55 60 Ser Pro Gln Gly Ala Ser Ala Leu Pro Thr Thr Ile Ser Phe Thr Cys 65 70 75 80 Trp Arg Gln Pro Asn Glu Gly Ser Ser Ser Gln Glu Glu Glu Gly Pro 85 90 95 Ser Thr Ser Pro Asp Ala Glu Ser Leu Phe Arg Glu Ala Leu Ser Asn 100 105 110 Lys Val Asp Glu Leu Ala His Phe Leu Leu Arg Lys Tyr Arg Ala Lys 115 120 125 Glu Leu Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Glu Arg Val Ile Lys Asn Tyr 130 135 140 Lys Arg Cys Phe Pro Val Ile Phe Gly Lys Ala Ser Glu Ser Leu Lys 145 150 155 160 Met Ile Phe Gly Ile Asp Val Lys Glu Val Asp Pro Ala Ser Asn Thr 165 170 175 Tyr Thr Leu Val Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly 180 185 190 Asn Asn Gln Ile Phe Pro Lys Thr Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Gly 195 200 205 Thr Ile Ala Met Glu Gly Asp Ser Ala Ser Glu Glu Glu Ile Trp Glu 210 215 220 Glu Leu Gly Val Met Gly Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Thr Val Tyr 225 230 235 240 Gly Glu Pro Arg Lys Leu Leu Thr Gln Asp Trp Val Gln Glu Asn Tyr 245 250 255 Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asn Pro Ala Arg Tyr Glu Phe 260 265 270 Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ala Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu 275 280 285 Glu His Val Val Arg Val Asn Ala Arg Val Arg Ile Ala Tyr Pro Ser 290 295 300 Leu Arg Glu Ala Ala Leu Leu Glu Glu Glu Glu Gly Val 305 310 315 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Lys Met Val Glu Leu Val His Phe Leu 1 5 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 aaaatggttg aacttgttca ttttctt 27 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Lys Val Asp Glu Leu Ala His Phe Leu 1 5 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 aaggtggatg agttggctca ttttctg 27 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 10 Gly Gly Gly Gly Ala 1 5 <210> 11 <211> 15 <212> 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taagcagctg gaggacggta gaacgctgtc tgattacaac 180 attcagaagg agtcgacctt acatcttgtc ttaagactaa gaggtggt 228 <210> 16 <211> 685 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 1 5 10 15 Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp 20 25 30 Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys 35 40 45 Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu 50 55 60 Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe 65 70 75 80 Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser 85 90 95 Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile 100 105 110 Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp 115 120 125 Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His 130 135 140 Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu 145 150 155 160 Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu 165 170 175 Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln 180 185 190 Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu 195 200 205 Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg 210 215 220 Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr 225 230 235 240 Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala 245 250 255 Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile 260 265 270 Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn 275 280 285 Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly 290 295 300 Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 305 310 315 320 Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp 325 330 335 Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys 340 345 350 Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu 355 360 365 Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe 370 375 380 Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser 385 390 395 400 Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile 405 410 415 Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp 420 425 430 Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His 435 440 445 Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu 450 455 460 Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu 465 470 475 480 Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln 485 490 495 Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu 500 505 510 Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg 515 520 525 Leu Arg Gly Gly Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr 530 535 540 Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala 545 550 555 560 Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile 565 570 575 Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn 580 585 590 Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly 595 600 605 Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 610 615 620 Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp 625 630 635 640 Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys 645 650 655 Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu 660 665 670 Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Val 675 680 685 <210> 17 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 1 5 10 15 Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp 20 25 30 Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys 35 40 45 Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu 50 55 60 Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Ile Ile Glu Pro 65 70 75 80 Ser Leu Arg Gln Leu Ala Gln Lys Tyr Asn Cys Asp Lys Met Ile Cys 85 90 95 Arg Lys Cys Tyr Ala Arg Leu His Pro Arg Ala Val Asn Cys Arg Lys 100 105 110 Lys Lys Cys Gly His Thr Asn Asn Leu Arg Pro Lys Lys Lys Val Lys 115 120 125 <210> 18 <211> 156 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu 1 5 10 15 Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp 20 25 30 Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys 35 40 45 Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu 50 55 60 Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Ala Lys Lys Arg 65 70 75 80 Lys Lys Lys Ser Tyr Thr Thr Pro Lys Lys Asn Lys His Lys Arg Lys 85 90 95 Lys Val Lys Leu Ala Val Leu Lys Tyr Tyr Lys Val Asp Glu Asn Gly 100 105 110 Lys Ile Ser Arg Leu Arg Arg Glu Cys Pro Ser Asp Glu Cys Gly Ala 115 120 125 Gly Val Phe Met Ala Ser His Phe Asp Arg His Tyr Cys Gly Lys Cys 130 135 140 Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Asn Lys Pro Glu Asp Lys 145 150 155 <210> 19 <211> 105 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 cacaattcca cacatgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacat gtgtgaaatt 60 gttatccgct cacaattcca cacacacgtg ctaaaacttc atttt 105 <210> 20 <211> 4259 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 20 gactcttcgc gattatcgcc gaattcacgc gtcgtgaggc tcctgcaggg ccgactagtg 60 gagccgagag taattcatac aaaaggaggg atcgccttcg caaggggaga gcccagggac 120 cgtccctaaa ttctcacaga cccaaatccc tgtagccgcc ccacgacagc gcgaggagca 180 tccgcccagg gctgagcgcg ggtagatcag agcacacaag ctcacagtcc ccggcggtgg 240 ggggaggggc gcgctgagcg ggggccaggg agctggcgcg gggcaaactg ggaaagtggt 300 gtcgtgtgct ggctccgccc tcttcccgag ggtgggggag aacggtatat aagtgcggta 360 gtcgccttgg acgttctttt tcgcaacggg tttgccgtca gaacgcagct gaagcttcga 420 gggctcgcat ctctccttca cgcgcccgcc gccctacctg aggccgccat ccacgccggt 480 tgagtcgcgt tctgccgcct cccgcctgtg gtgcctcctg aactgcgtcc gccgtctagg 540 taagtttaaa gctcaggtcg agaccgggcc tttgtccggc gctcccttgg agcctaccta 600 gactcagccg gctctccacg ctttgcctga ccctgcttgc tcaactctac gtctttgttt 660 cgttttctgt tctgcgccgt tacagatcca agccagctag cgtttaaact tgccgccacc 720 atgccgctcg aacagaggag ccagcactgt aaaccagaag aaggactcga agcgaggggg 780 gaagcgttgg ggttggtagg tgctcaagca ccagcaactg aggaacagca aactgcgagt 840 tcttcttcca cattggtgga agttactctt ggggaggttc ccgctgcgga cagtccctcc 900 cctccacatt ccccccaggg tgcaagttcc tttagcacca caatcaacta caccctgtgg 960 cgacagtcag atgagggaag ttctaatcaa gaagaagagg ggccacgcat gtttcccgac 1020 ctcgagtctg agttccaagc cgctataagc aggaagatgg ttgagttggt tcattttctg 1080 ctcctcaagt atcgagccag ggagccggtc acaaaggcag aaatgctgga gagtgtcctc 1140 agaaattgcc aggacttctt tcccgtgatc ttcagcaaag cctccgagta cttgcagctg 1200 gtctttggca tcgaggtggt ggaagtggtc cccatcagcc acttatacat ccttgtcacc 1260 tgcctgggcc tctcctacga tggcctgctg ggcgacaatc aggtcatgcc caagacaggc 1320 ctcctgataa tcgtcctggc cataatcgca atagagggcg actgtgcccc tgaggagaaa 1380 atctgggagg agctgagtat gttggaggtg tttgagggga gggaggacag tgtcttcgca 1440 catcccagga agctgctcat gcaagacctg gtgcaggaaa actacctgga gtaccggcag 1500 gtgcctggta gagacccagc ctgttatgaa tttctgtggg gaccaagagc acttatcgat 1560 actagttatg tgaaagtcct gcaccataca ctaaagatcg gtggagaacc tcacatttcc 1620 tacccacccc tgcatgaacg ggctttgaga gagggagaag agggtggttc tggtagcatg 1680 cagatcttcg tgaagacgtt aaccggtaaa accataactc tcgaagttga accatccgat 1740 accatcgaaa acgttaaggc taaaattcaa gacaaggaag gcattccacc tgatcaacaa 1800 agattgatct ttgccggtaa gcagctggag gacggtagaa cgctgtctga ttacaacatt 1860 cagaaggagt cgaccttaca tcttgtctta agactaagag gtggtaaaat ggttgaactt 1920 gttcattttc tttgactcga gcgcgctggg ccctttaaac ccgctgatca gcctcgaccg 1980 tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg 2040 aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga 2100 gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg 2160 aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat ggcttctact gggcggtttt 2220 atggacagca agcgaaccgg aattgccagc tggggcgccc tctggtaagg ttgggaagcc 2280 ctgcaaagta aactggatgg ctttctcgcc gccaaggatc tgatggcgca ggggatcaag 2340 ctctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc 2400 aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat 2460 cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt 2520 caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaagac gaggcagcgc ggctatcgtg 2580 gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag 2640 ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc 2700 tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc 2760 tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga 2820 agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga 2880 actgttcgcc aggctcaagg cgagcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg 2940 cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg 3000 tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc 3060 tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc 3120 cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgaa ttattaacgc 3180 ttacaatttc ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat 3240 acaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata 3300 cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatagcac 3360 gtgtgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacatg tgtgaaattg ttatccgctc 3420 acaattccac acatgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaca cgtgctaaaa 3480 cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa 3540 atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 3600 tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 3660 ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 3720 ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac 3780 cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 3840 gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 3900 gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 3960 acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc 4020 gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 4080 agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 4140 tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 4200 agcaacgcgg cctttttacg gttcctgggc ttttgctggc cttttgctca catgttctt 4259

Claims (42)

  1. a. 구성적 프로모터를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
    b. 표적 분자 또는 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
    c. 선택적으로 링커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
    d. 선택적으로 유비퀴틴(ubiquitin)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
    e. 선택적으로 상기 표적 단백질의 약 7개 내지 약 25개 아미노산 잔기의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및
    f. 핵 위치화 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오티드,
    를 포함하는 핵산 분자로서,
    상기 서열 a) 내지 f)는 서로 작동 가능하게 연결되고 상기 b) 및 c)의 서열, 및 선택적인 서열 d) 및 e)는 서로 작동 가능하게 연결되어 전장 단백질의 아미노산 서열; 선택적인 상기 링커의 아미노산 서열, 상기 선택적인 유비퀴틴의 아미노산 서열, 및 상기 표적 단백질의 약 7개 내지 약 25개 아미노산 잔기 단편을 포함하는 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자는
    a. 구성적 프로모터를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
    b. 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
    c. 링커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
    d. 유비퀴틴을 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
    e. 상기 표적 단백질의 약 7개 내지 약 25개 아미노산 잔기의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및
    f. 핵 위치화 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오티드,
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  3. 제1항에 있어서, 상기 구성적 프로모터가 EF-1, SV40, Rous Sarcoma 바이러스 및 Mason-Pfizer 원숭이 바이러스-CTE로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  4. 제1항에 있어서, 상기 표적 단백질을 암호화하는 서열이 MAGE-A4, MAGE-A2, Gp120, Gag, Nef, Tat, 헤마글루티닌(HA), 뉴라미니다제(NA), GFP 및 SEAP로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질을 암호화하는 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  5. 제1항에 있어서, 상기 표적 단백질의 단편을 암호화하는 서열이 MAGE-A4, MAGE-A2, Gp120, Gag, Nef, 및 Nef, Tat, 헤마글루티닌(HA), 뉴라미니다제(NA), GFP 및 SEAP로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 단편을 암호화하는 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  6. 제1항에 있어서, 상기 링커를 암호화하는 서열이 글리신-세린 링커를 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  7. 제6항에 있어서, 상기 글리신 링커가 GGGGS, GGGGA, GGSGS, 또는 이들의 임의의 조합의 반복 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  8. 제6항에 있어서, 상기 글리신-세린 링커를 암호화하는 서열이 GGGGS, GGGGA 및/또는 GGSGS의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 반복을 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  9. 제1항에 있어서, 상기 유비퀴틴이 단일 유비퀴틴 단백질 또는 2개 이상의 유비퀴틴 단백질 사슬인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  10. 제1항에 있어서, 상기 유비퀴틴을 암호화하는 서열이 UBB, UBC, UBA52 및 RPS27A로 이루어진 군으로부터 선택된 유비퀴틴 분자를 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  11. 제1항에 있어서, 상기 표적 단백질의 약 7개 내지 약 25개 아미노산 단편을 암호화하는 서열이 MHC I 또는 MHC II CD8+ 면역 세포 또는 T-세포독성 림프구에 의한 면역원성 반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  12. 제1항에 있어서, 상기 핵 위치화 신호를 암호화하는 서열이 요소 1인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 상기 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 상기 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 세포.
  15. 제14항의 상기 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  16. 대상의 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 상기 핵산 서열을 상기 대상의 세포 또는 상기 대상 내로 도입하고 상기 핵산 서열을 상기 대상의 세포에 의해 흡수하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 핵산 서열이 전기천공, 주사, 소니케이션(sonication), 형질감염, 형질도입, 유전자 총에 의해 상기 세포 또는 대상에 도입되고, 나노입자, 리포입자 또는 핵산 분자를 대상 또는 세포 내로 도입하기에 적합한 다른 투여 방식에 의해 내포되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 조직이 피부, 근육, 폐, 유방, 결장, 전립선, 난소 및 신장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제16항에 있어서, 상기 표적 단백질의 단편을 암호화하는 서열이 MHC I 또는 MHC II CD8+ 면역세포 또는 T-세포독성 림프구에 의한 면역원성 반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 대상에서 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 상기 핵산 서열을 상기 대상의 세포 내로 도입하고 상기 핵산 서열이 상기 대상의 세포에 의해 흡수되는 것을 포함하고, 상기 단백질은 암세포에서 과발현되는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 핵산 서열이 전기천공, 주사, 소니케이션, 형질감염, 형질도입에 의해 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 상기 세포 내로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 조직이 피부, 근육, 폐, 유방, 결장, 전립선, 난소 및 신장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제20항에 있어서, 상기 암이 유방암, 삼중 음성 유방암, 자궁암, 전립선암, 난소암 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 대상에서 감염원을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 상기 핵산 서열을 상기 대상의 세포 내에 도입하고 상기 핵산 서열이 상기 대상의 세포에 의해 흡수되는 것을 포함하고, 상기 표적 단백질은 상기 감염원에 의해 발현되는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 감염원이 HIV 및 인플루엔자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 감염원에 의해 발현되는 단백질이 Gp120, Gag, Nef, Tat, 헤마글루티닌(HA), 뉴라미니다제(NA) 등인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 구성적 프로모터를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
    표적 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드; 및
    핵 위치화 신호를 암호화하는 폴리뉴클레오티드;
    를 포함하는 핵산 분자로서,
    상기 프로모터 및 표적 분자는 서로 작동 가능하게 연결되는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  28. 제27항에 있어서, 상기 구성적 프로모터가 EF-1, SV40, Rous Sarcoma 바이러스 및 Mason-Pfizer 원숭이 바이러스-CTE로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  29. 제27항에 있어서, 상기 표적 분자를 암호화하는 서열이 CFTR, MAGE-A4, MAGE-A2, Gp120, Gag, Nef, Tat, 헤마글루티닌(HA), 뉴라미니다제(NA), 인슐린, 글루탐산 또는 성장 조절 miRNA, GFP 및 SEAP로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 또는 분자를 암호화하는 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  30. 제27항에 있어서, 상기 표적 분자를 암호화하는 서열이 MAGE-A4, MAGE-A2, Gp120, Gag, Nef, Tat, 헤마글루티닌(HA), 뉴라미니다제(NA), GFP 및 SEAP로 이루어진 군으로부터 선택된 분자의 단편을 암호화하는 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  31. 제27항에 있어서, 상기 표적 분자를 암호화하는 서열이 siRNA, shRNA, miRNA 또는 안티센스 분자를 암호화하는 서열인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  32. 제27항에 있어서, 상기 핵 위치화 신호를 암호화하는 서열이 요소 1인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  33. 제27항 내지 제32항 중 어느 한 항의 상기 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  34. 제33항의 상기 숙주 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  35. 제27항 내지 제32항 중 어느 한 항의 상기 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  36. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자가 플라스미드인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  37. 제1항에 있어서, 상기 핵산 분자가 비-통합 플라스미드인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  38. 제27항에 있어서, 상기 핵산 분자가 플라스미드인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  39. 제27항에 있어서, 상기 핵산 분자가 비-통합 플라스미드인 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  40. 분자를 세포에 전달하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제12항 또는 제27항 내지 제32항 중 어느 한 항의 핵산 서열과 세포를 상기 대상의 세포 내로 또는 상기 대상 내로 접촉시키고 상기 핵산 서열이 상기 대상의 세포에 의해 흡수되는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 핵산 서열이 전기천공, 주사, 소니케이션, 형질감염, 형질도입, 유전자 총에 의해 상기 세포 또는 대상 내에 도입되고, 나노입자, 리포입자 또는 대상 또는 세포 내로의 핵산 분자 도입에 적합한 다른 투여 방식에 의해 내포되는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 상기 세포가 피부, 근육, 폐, 유방, 결장, 전립선, 난소 및 신장 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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