CN101035835B - 可生物降解的阳离子聚合物 - Google Patents

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Abstract

用于向细胞输送生物活性剂的组合物，其包含聚乙烯亚胺、可生物降解的基团和相对疏水的基团。

Description

可生物降解的阳离子聚合物 
                             相关申请 
本申请要求于2004年10月4日提交的美国临时申请第60/615,764号和于2005年7月11日提交的美国临时申请第60/698,357号的优先权，本文引入这两篇申请的全部内容作为参考。 
                             发明背景 
发明领域
本发明涉及用于向细胞输送生物活性剂的组合物和方法。在优选实施方案中，本发明涉及包含聚乙烯亚胺(PEI)、可生物降解的基团和相对疏水的基团的阳离子脂质聚合物，还涉及使用这样的脂质聚合物来输送生物活性剂的方法，该生物活性剂例如是DNA、RNA、寡聚核苷酸、蛋白质、肽和药物。
相关技术描述
多种技术可用于向细胞输送生物活性剂，其包括使用病毒转染体系和非病毒转染体系。病毒体系通常具有比非病毒体系更高的转染率，但是对于病毒体系的安全性已经存在各种问题。参见Verma I.M andSomia N.，Nature 389(1997)，pp 239-242；Marhsall E.Science 286(2000)，pp 2244-2245。此外，病毒载体的制备倾向于是复杂且昂贵的过程。尽管非病毒转染体系效率通常低于病毒体系，但它们受到更多的关注，因为通常认为它们相对于病毒体系来说更为安全且更加容易制备。
多种非病毒转染体系涉及使用与生物活性剂配合的阳离子聚合物。已经被用作基因载体的阳离子聚合物的实例包括聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚乙烯亚胺(PEL)、壳聚糖、PAMAM树状聚合物和聚甲基丙烯酸(2-甲氨基)乙酯(pDMAEMA)。不幸的是，使用PLL的转染率通 常很差，并且高分子量的PLL已显示出对细胞的显著毒性。在某些情况下，PEI提供有效的基因转移而无需内溶剂(endosomolytic)或靶向剂。参见Boussif O.，Lezoualc′h F.，Zanta M.A.，Mergny M.D.，SchermanD.，Demeneix B.，Behr J.P.，Proc Natl Acad Sci USA.Aug.1，1995，92(16)7297-301。对一系列作为基因输送体系的聚氨胺树状聚合物进行了研究。参见Eichman J.D.，Bielinska A.U.，Kukowska-Latallo J.F.，Baker J.R.Jr.，Pharm.Sci.Technol.Today 2000 July；3(7)：232-245。不幸的是，已经被报道了PEI和树状聚合物对细胞均具有毒性，因而限制了在人类患者中将PEI用作基因输送工具的潜力。此外，具有商业实用性的基因转染率的聚氨胺树状聚合物的成本相对较高。
已经报道了由可降解的阳离子聚合物制成的基因载体以降低的细胞毒性将基因输送至哺乳动物细胞。参见Lim Y.B.，Kim S.M.，Lee Y.，Lee W.K.，Yang T.G.，Lee M.J.，Suh H.，Park J.S.，J.Am.Chem.Soc，123(10)，2460-2461，2001。不幸地，相对于不可降解的聚合物来说，这些可降解体系同样具有较低的基因转移效率。为了改善低分子量PEI的转染率，Gosselin等人报道了通过使用含有二硫化物的连接剂，可以获得更高分子量的PEI。参见Gosselin，Micheal A.，Guo，Menjin and Lee，Robert J.Bioconjugate Chem.2001.12：232-245。使用二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)和二甲基-3，3’-二硫代双丙酸亚酰胺酯(dithiobispropionimidate)-2HCl(DTBP)制造的PEI聚合物显示出可比的基因转染率和较低的细胞毒性。然而，含有二硫化物的连接剂是昂贵的，这使得该体系的大量制备是困难的并且是不合需要的。具有含有二硫化物的连接剂的聚合物在还原条件下仅仅被降解，这限制了聚合物在其它条件下的应用。
Lynn等人已经描述了合成可生物降解的阳离子聚合物的方法，其中使用二丙烯酸酯作为阳离子化合物之间的连接剂分子。参见Lynn，David A.；Anderson，Daniel G.；Putnam，David；and Langer，Robert.J.Am.Chem.Soc.2001，123，8155-8156。然而，所得聚合物不会与众多生体活性剂良好地配合。这些聚合物的合成需要数天完成，并且可被用于基因输送中有效产物的量较低。根据Lynn等人的方法，制造了 超过一百种阳离子聚合物，但是这些聚合物中仅有两种显示出有效的基因转染率。这些因素使得通过该方法进行高分子聚合物的制备难以完成。
因此，仍然亟需能够用于安全且有效地促进将生物活性剂输送至细胞的阳离子聚合物。
发明概述
一实施方案提供了包含选自通式(Ia)和通式(Ib)的重复单元的聚合物：
Figure A20058003378400091
其中：PEI是聚乙烯亚胺重复单元；R选自电子对、氢、C2-C10烷基、C2-C10杂烷基、C5-C30芳基和C2-C30杂芳基；L选自C2-C50烷基、C2-C50 杂烷基、C2-C50烯基、C2-C50杂烯基、C5-C50芳基；C2-C50杂芳基；C2-C50 炔基、C2-C50杂炔基、C5-C50芳基；C2-C50杂芳基；C2-C50羧基烯基和C2-C50羧基杂烯基；W是包含约2至约50个碳原子的阳离子部分；以及m是约1至约30的整数。
选自通式(Ia)和通式(Ib)的重复单元在本文中也可以称为式(I)的重复单元。因此，例如包含选自通式(Ia)和通式(Ib)的重复单元的聚合物在本文中也可以称为包含通式(I)的重复单元的聚合物或者称为通式(I)的聚合物。包含通式(I)的重复单元的聚合物在本文中也可以称为阳离子脂质聚合物。
在优选的实施方案中，通式(Ia)和(Ib)中的PEI由通式(II)的重复单元表示：
Figure DEST_PATH_G200580033784701D00011
其中x为约1至约100的整数并且y是约1至约100的整数。本领域技术人员可以理解，通式(I)的重复单元中的氮原子可带有阳离子型电荷并因此可以与多种带负电荷的物质形成离子键，所述带负电荷的物质例如阴离子，如氯化物、溴化物、碘化物、硫酸根等。可以制备式(I)的多种聚合物并储存直至使用，并因此另一实施方案提供了包括多种聚合物的聚合物库，其中每一聚合物独立地包含通式(I)的重复单元，其中对于所述聚合物至少两种，其选自R、L、PEI、W和m的至少一个参数是不同的。在另一实施方案中，提供包含选自通式(Ia)和通式(Ib)的重复单元的聚合物，其中W包括胺和选自如下的含碳基团：C2-C50烷基、C2-C50杂烷基、C2-C50烯基、C2-C50杂烯基、C5-C50芳基；C2-C50杂芳基；C2-C50羧基烯基和C2-C50羧基杂烯基。
在另一实施方案中，包含通式(I)重复单元的聚合物还包括与聚合物配合的生物分子。该生物分子可带有一个或多个阴离子基团并可与通式(I)的重复单元形成离子键。带有一个或多个阴离子基团的生物分子的实例包括核酸(例如DNA、单链RNA、双链RNA、核酶、DNA-RNA杂交体、siRNA、反义DNA和反义寡核苷酸(oligo))、蛋白质、肽、脂质和碳水化合物。
在另一实施方案中，包含通式(I)重复单元的聚合物还包含生物分子、能够进入真核细胞的输送增强剂和/或与所述聚合物配合的诊断显 像组合物。该输送增强剂可促进真核细胞内的一种或多种功能，例如受体识别、内化作用、该生物分子从细胞核内体的脱逸、核定位、生物分子释放和体系稳定化。
包含通式(I)的重复单元的聚合物可用于转染真核细胞，所述聚合物还包含生物分子，并且还可以包含能够进入真核细胞的输送增强剂和/或与所述聚合物配合的诊断显像组合物。因此，另一实施方案提供了转染真核细胞的方法，其包括使细胞与这样的聚合物(包含通式(I)的重复单元和生物分子，任意地含包括石松增强剂和/或诊断显像组合物)接触，以由此将该生物分子输送至细胞。该方法可以涉及治疗哺乳动物，其包括识别需要基因治疗的哺乳动物并将这样的聚合物给予该哺乳动物。在一优选的实施方案中，所述生物分子是siRNA，其中该siRNA能有效降低所关注的基因的表达。
另一实施方案提供了医学诊断系统，其包括识别真核细胞的特异性受体的配体和聚合物，其中所述聚合物包含通式(I)的重复单元和生物分子，并且还可以包含能够进入真核细胞的输送增强剂和/或与该聚合物配合的诊断显像组合物。
另一实施方案提供了药物组合物，其包含致敏剂和聚合物，其中所述聚合物包含通式(I)的重复单元和生物分子，并且还可以包含能够进入真核细胞的输送增强剂和/或与该聚合物配合的诊断显像组合物。所述致敏剂可以是通过暴露于光或其它刺激而经历了性质的转变，由此促进生物分子的输送(例如通过提高所述聚合物的降解速率)的化合物。所述致敏剂本身可以是对刺激活性有所改变的生物分子。
另一实施方案提供了向哺乳动物输送诊断显像组合物的方法，其包括对所述哺乳动物给予组合物，其中所述组合物包含与含有选自通式(Ia)和通式(Ib)的重复单元的聚合物配合的诊断显像剂。
另一实施方案诊断显像组合物，其包含图像对比度试剂和含有选自通式(Ia)和通式(Ib)的重复单元的聚合物，并且所述聚合物还能够包含靶向剂。
如下更详细地描述这些及其他实施方案。
附图的简要说明
图1显示由脂质聚合物(5A、5B和5C)和lipofectamine 2000转染后，293细胞中典型的GFP信号。
图2显示由脂质聚合物(5A、5B和5C)和lipofectamine 2000转染后，208F细胞中典型的GFP信号。
图3显示由脂质聚合物(5A、5B和5C)和lipofectamine 2000(“lipo”)转染后，208F和293细胞的相对荧光水平的图。
图4显示由脂质聚合物(5A、5B和5C)和lipofectamine 2000进行siRNA输送后，HT-GFP细胞中典型的GFP信号。
图5显示由脂质聚合物(5A、5B和5C)和lipofectamine 2000进行siRNA输送后，HeLa-GFP细胞中典型的GFP信号。
图6显示由脂质聚合物(5A、5B和5C)和lipofectamine 2000(“lipo”)进行siRNA输送后，HT-GFP和HeLa GFP细胞的相对荧光水平的图。
图7显示siRNA输送后，脂质聚合物(5A、5B和5C)和lipofectamine2000(“lipo”)的细胞存活分数的图。
图8显示由阳离子脂质聚合物(5A、5B和5C)输送不同的SiRNA后，HT-GFP基因的相对荧光水平的图。
图9显示与游离寡核苷酸的溶液相比，反义寡核苷酸/脂质聚合物配合物的相对荧光单位的图。
图10显示聚合物6与DNA结合的凝胶电泳的结果。
图11显示由7A和lipofectamine 2000转染后，293细胞的典型的GFP信号。
图12显示由聚合物7A和lipofectamine 2000输送反义寡核苷酸后，luc 705细胞中虫荧光素酶活性的图。
图13显示聚合物7A和lipofectamine 2000介导的SiRNA输送后，CHO-AA8luc中虫荧光素酶活性的图。
图14显示使用7A和lipofectamine转染后表明细胞存活分数的图。
图15显示在opti MEM中孵育不同时间后，7A的GFP转染率的图。
实施方案的详细说明
一实施方案提供包含聚乙烯亚胺、可生物降解的基团和相对疏水的“脂”基团的阳离子脂质聚合物。优选的阳离子脂质聚合物包含选自通式(Ia)和通式(Ib)的重复单元：
Figure DEST_PATH_G200580033784701D00041
应该理解，本文使用的“通式(I)”表示通式(Ia)和通式(Ib)。在通式(I)中，PEI是聚乙烯亚胺(例如包含由上述通式(II)表示的重复单元的聚合物)，酯键是可生物降解的基团，L代表相对疏水的“脂”基团，并且m为约1至约30。例如，在某些实施方案中，L选自C2-C50烷基、C2-C50杂烷基、C2-C50烯基、C2-C50杂烯基、C5-C50芳基；C2-C50杂芳基；C2-C50炔基、C2-C50杂炔基、C5-C50芳基；C2-C50杂芳基；C2-C50羧基烯基和C2-C50羧基杂烯基。在优选实施方案中，L选自C12-C18脂肪酸、胆固醇以及它们的衍生物。通式(I)中的R可以代表电子对或氢原子。本领域技术人员可以理解，当R代表电子对时，在低pH下，通式(I)的重复单元是阳离子型的。通式(I)中的R也可以代表相对疏水的脂基团，例如C2-C10烷基、C2-C10杂烷基、C5-C30芳基或C2-C30杂芳基，在这样的情况下，应该理解，通常在较宽的pH范围内，氮原子带有阳离子型电荷。
如下列方案所示，包含通式(I)重复单元的阳离子脂质聚合物可以由通式(III)的二丙烯酸酯单体与聚乙烯亚胺(PE1)反应来制备：
方案A
Figure G05833784720070406D000081
在通式(III)中，R和L具有与上述包含通式(I)的重复单元的阳离子脂质聚合物相同的含义。方案A说明了包含通式(Ia)的重复单元的聚合物的制备。应该理解，可以按照类似的方式从含有W基团的合适的二丙烯酸酯单体来制备包含通式(Ib)的重复单元的聚合物。PEI优选含有通式(II)的重复单元，其中x是约1至约100的整数并且y是约1至约100的整数。
Figure A20058003378400142
方案A中说明的反应可以通过在诸如乙醇等互溶剂中搅拌混合PEI和二丙烯酸酯(III)来进行，优选在室温下进行数小时的反应，然后蒸发溶剂以回收所得到的聚合物。本发明并不受到理论的约束，但是我们认为PEI和二丙烯酸酯(III)之间的反应涉及一种或多种PEI的胺与 二丙烯酸酯的双键之间的Michael反应。参见J.March，AdvancedOrganic Chemistry 3rd Ed.，pp 711-712(1985)。可以使用下述实施例中所述的方法制备方案A中所示的二丙烯酸酯。
通过改变PEI的分子量和结构、二丙烯酸酯(III)上的R、W和L基团的尺寸和类型以及二丙烯酸酯(III)与PEI之比，可以根据方案A制备多种包含通式(I)的重复单元的聚合物。可以使用不同的二丙烯酸酯的混合物和/或不同的PEI的混合物。PEI可以为多功能的，并因此能够与两种或多种二丙烯酸酯反应。可以使用交联剂以生产交联的阳离子脂质聚合物和/或可以调节多功能PEI和二丙烯酸酯(III)的相对比例以生产交联的阳离子脂质聚合物。PEI的分子量优选为约600至大25,000道尔顿。PEI与二丙烯酸酯的摩尔比优选为约1∶2至约1∶20。所述阳离子脂质聚合物的重均分子量可以为约500道尔顿至约1,000,000道尔顿，优选为约2,000道尔顿至约200,000道尔顿。可以使用PEG标准样品通过尺寸排阻色谱法或通过琼脂糖凝胶电泳来确定分子量。在一实施方案中，通过制备其中对于至少两种聚合物来说R、L、W、PEI和/或m不同的多种阳离子脂质聚合物来提供聚合物库。
所述阳离子脂质聚合物优选为可降解的，更优选为可生物降解的，例如可通过选自水解、酶裂解、还原、光裂解和超声处理等机制降解。虽然本发明并不限制于理论，但是人们认为细胞内通式(I)阳离子脂质聚合物的降解是通过酶裂解和/或酯键的水解进行的。
所述阳离子脂质聚合物可以与生物分子形成配合物并因此可用作将生物分子输送至细胞的载体。与通式(I)所述阳离子脂质聚合物形成配合物的生物分子的实例包括核酸、蛋白质、肽、脂质和碳水化合物。核酸的实例包括DNA、单链RNA、双链RNA、核酶、DNA-RNA杂交体和反义DNA，例如反义寡核苷酸。优选的核酸是siRNA。可以通过在互溶剂中混合阳离子脂质聚合物和生物分子来形成包含与聚合物配合的生物分子的阳离子脂质聚合物，更优选通过以下实施例中所述的方法进行。
包含与聚合物配合的生物分子的阳离子脂质聚合物还可以包含能够进入真核细胞的输送增强剂。所述输送增强剂可以被所述配合物溶 解或与所述配合物混合，或者可以与所述阳离子脂质聚合物偶联(例如共价连接或配合)。输送增强剂是促进生物分子向细胞运输的物质，通常通过增强生物分子/载体配合物的跨膜运输、减少运输期间的降解和/或促进生物分子从载体的释放。诸如基因等生物分子运输进细胞优选涉及生物分子/载体配合物穿过细胞膜、核内体膜和核膜后，从载体中释放生物分子。例如，在核酸的情况下，核酸/载体配合物首先穿过细胞膜。当这通过内吞作用完成时，核酸/载体配合物被内在化。通过形成袋状物由细胞膜包裹载体和核酸-负载物(cargo)，并随后修整所述袋状物。所得是细胞核内体，这是一种包含核酸负载物和载体的大的膜包裹结构。核酸-载体配合物随后通过核内体膜脱逸而进入细胞质，避免了细胞质中的酶降解，并穿过核膜。一旦处于核中，所述核酸负载物就从载体分离出来。
通常，输送增强剂分为两类：病毒载体体系和非病毒载体体系。由于人类病毒已经进化出克服运障碍以运输入上述细胞核的方法，所以病毒或病毒成分可用于将核酸运输入细胞。可用作输送增强剂的病毒成分的一个实例是血细胞凝集素肽(HA-肽)。该病毒肽通过核内体破裂促进了生物分子向细胞的转移。在核内体的酸性pH下，该蛋白质引起生物分子和载体向细胞溶质的释放。可用作输送增强剂的病毒成分的其它实例是本领域技术人员公知的。
非病毒输送增强剂通常是基于聚合物的或基于脂质的。它们通常是平衡所述核酸负电荷的聚阳离子。部分由于聚阳离子聚合物能够浓缩无限大小的DNA质粒以及对于病毒载体的安全性的顾虑，聚阳离子聚合物已经显示出非常有希望作为非病毒基因输送增强剂。实例包括具有富含碱性氨基酸区域的肽，所述碱性氨基酸例如寡赖氨酸、寡精氨酸或其组合以及PEI。这些聚阳离子聚合物被认为通过DNA的浓缩促进了运输。诸如PEI等聚阳离子的支链形式和星形树状聚合物可以介导DNA的浓缩和核内体的释放。参见Boussif，et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA vol.92：7297-7301。PEI可以被制备为具有可在pH 6.9时可电离的位于末端的胺并且具有在pH 3.9时可电离的位于内部的胺的高度支化聚合物。由于该结构，PEI可以产生泡pH的变化，该变化 导致泡的膨胀，并且最终从核内体捕集释放。
对于阳离子脂质聚合物，增强输送的另一方式包括由已经靶向生物分子负载物输送的细胞上的受体识别的配体。生物分子向细胞的输送可随后由受体识别启动。在本文中，术语“配体”指可以与位于靶细胞表面或者其细胞核或细胞溶质中的特异性受体蛋白结合的生物分子。在一实施方案中，所述配体可以是抗体、激素、信息素或神经递质、或能够作为配体与受体结合的任何生物分子。抗体指由B淋巴细胞应答抗原而产生的任何蛋白质。当配体与特定的细胞受体结合时，内吞作用得到刺激。已经与多种细胞类型使用以增强生物分子运输的配体实例是半乳糖、铁传递蛋白、糖蛋白脱唾液酸血清类粘蛋白、腺病毒纤维、疟原虫环子孢子(circumsporozite)蛋白质、表皮生长因子、人类乳头状瘤病毒衣壳、成纤维细胞生长因子和叶酸。在叶酸受体的情况下，所述结合配体通过被称作饮液作用的过程内在化，其中所述受体结合所述配体，围绕膜封闭细胞表面，以及所述内在化的材料随后穿过液胞膜进入细胞质。参见Gottschallc，et al.(1994)Gene Ther1：185-191。
多种输送增强剂被认为通过核内体破裂起作用。例如，除了上述的HA-蛋白质以外，缺损的病毒颗粒也已用作内溶剂。参见Cotten，et al.(July 1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA vol.89：pages 6094-6098。非病毒剂通常是两亲的或者是基于脂质的。
可以通过介导核内体破裂、减少降解或同时绕过该过程的试剂来增强诸如DNA等生物分子释放入细胞的细胞质。提高核内体pH的氯喹已经被用于通过抑制溶酶体水解酶来减少胞吞材料的降解。参见Wagner et al.(1990)Proc Natl Acad Sci USA vol.87：3410-3414。诸如PEI等支链聚阳离子和星形树状聚合物也促进了上述核内体的释放。
核内体的降解可以通过并入作为嵌合蛋白质成分的毒素的亚单位而回避，所述毒素例如白喉(Diptheria)毒素和假单胞菌属(Pseudomonas)外毒素，所述嵌合蛋白质可以并入阳离子脂质聚合物/生物分子配合物。参见Uherek et al.(1998)J Biol.Chem.vol.273：8835-8841。这些成分促进了核酸穿过核内体膜并返回内质网。
一旦处于细胞质中，生物分子负载物向细胞核的运输可以通过包含核酸载体上核定位信号的包含而得到增强。例如，可以使用作为核定位信号(NLS)而起作用的特异性氨基酸顺序。人们认为生物分子/载体配合物上的NLS与位于细胞溶质中的特异性核运输受体蛋白相互作用。一旦所述生物分子/载体配合物得到装配，配合物中的受体蛋白被认为与核孔蛋白产生多重接触，由此通过核膜孔输送配合物。所述生物分子/载体配合物到达其目的地后，发生解离，释放出负载物及其他成分。来自SV40大型T抗原的序列Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val可以被用于向细胞核运输。人们认为来自SV40大型T抗原的该短序列可以提供引起缔合大分子运输至细胞核的信号。
阳离子脂质聚合物还可以包含与所述聚合物配合的诊断显像化合物，例如荧光的、放射性的或放射性不可穿透的染料。可以通过在互溶剂中混合阳离子脂质聚合物和诊断显像化合物来形成所述配合物。对哺乳动物给药后，可以使用公知技术，例如PET、MRI、CT、SPECT等来追踪所述聚合物(与诊断显像化合物配合的)。(参见MolecularImaging of Gene Expression and Protein Function In Vivo With PET andSPECT(使用PET和SPECT对体内基因表达和蛋白质功能的分子显像)，Vijay Sharma，PhD，Gary D.Luker，MD，and David Piwnica-Worms，MD，Ph.D.，JOURNAL OF MAGNETIC RESONANCE IMAGING 16：336-351(2002))。
另一实施方案提供了药物组合物，其包含致敏剂和聚合物，其中所述聚合物包含通式(I)的重复单元和生物分子，并还可以包含能够进入真核细胞的输送增强剂和/或与所述聚合物配合的诊断显像组合物。所述致敏剂可以是通过暴露于光或其它刺激而经历了性质改变，由此促进生物分子输送(例如通过提高所述聚合物的降解速率)的化合物。所述致敏剂本身可以是对刺激活性有所改变的生物分子。所述致敏剂可以为光活化的药物。合适的光活化的药物包括但不局限于荧光素、部花青(merocyanin)、氧杂蒽及其衍生物，以及光反应的吡咯衍生的大环及其衍生物。合适的光反应的吡咯衍生的大环包括但不局限于天然存在的或合成的卟啉、天然存在的或合成的二氢卟酚、天然存在的或 合成的菌绿素、合成的异菌绿素、酞菁、萘酞菁、以及扩展的基于吡咯的大环体系，例如porphycenes、sapphyrins和texaphyrins。
实施例1
Figure G05833784720070406D000131
在0℃下，向油酸1(10.7g，38mmol)的二氯甲烷(DCM，200mL)和N，N-二甲基甲酰胺(DMF，三滴)溶液中加入乙二酰氯(13.5mL，152mmol)。将反应混合物搅拌约1小时，然后温和加热至室温。1小时后，用甲苯稀释所述溶液并蒸馏。将残余物溶于二氯甲烷(200mL)并冷却至0℃。将二乙醇胺(10.9mL，114mmol)、4-(二甲氨基)吡啶(490mg，4mmol)和三乙胺(21mL，152mmol)加入至所述溶液。在0℃下将溶液搅拌30分钟，然后使其在室温下过夜。用二氯甲烷稀释所述反应混合物并用1N HCl和NaHCO3水溶液洗涤。干燥(Na2SO4)有机相并减压浓缩。然后使用硅胶柱(10∶1乙酸乙酯∶甲醇)纯化粗残余物，得到13.5g(99.9％)无色油状化合物2。
实施例2
Figure G05833784720070406D000141
在室温下将三乙胺(8.1g，80mmol)、DMAP(0.5g，4mmol)和2(7.1g，20mmol)溶于200mL的二氯甲烷中。使用氩气冲洗体系并在冰浴中冷却所述溶液。滴加烯丙酰氯(5.4g，60mmol)的25mL二氯甲烷溶液。加入后，反应被温和加热至室温并搅拌过夜。用二氯甲烷稀释所述反应混合物并用1N HCl和NaHCO3水溶液洗涤。干燥(Na2SO4)有机相并减压浓缩。然后使用硅胶柱(1∶3乙酸乙酯∶己烷)纯化粗残余物，得到7.5g(81％)无色油状化合物3。
实施例3
根据方案A，通过将具有分子量为600的聚乙烯亚胺(PEI-600)与化合物3反应，如下进行阳离子脂质聚合物的合成：称量约0.6gPEI-600(Aldrich)并放入小瓶中，并且加入10mL乙醇。在PEI-600完全溶解后，将3.7g(8.0mmol)3的10mL乙醇溶液迅速加入至PEI溶液中同时搅拌。在室温下将所述反应混合物搅拌2小时。减压除去有机溶剂后，得到透明的粘稠液体。1H-NMR光谱显示丙烯酸的碳-碳双键完全消失。通过琼脂糖凝胶电泳估计所得到的聚合物的分子量。这是作为涉及类似化合物的其它合成操作模型的通常操作，并且可被用来合成一系列的可降解的阳离子脂质聚合物。
实施例4
如实施例3所述来制备阳离子脂质聚合物，所不同的是在室温(25℃)下搅拌反应混合物2小时后，通过加入的2.5ml 4M HCl的醚溶液来中和所述反应混合物。过滤白色沉淀物5C，使用乙醇洗涤，并且在室温下减压干燥。使用NMR波谱仪和琼脂糖凝胶电泳表征所得到的聚合物5C。使用类似的方法制备聚合物5A和5B：5A：PEI1800，m＝12；5B：PEI600，m＝3；5C：PEI600，m＝8。这是作为涉及类似化合物的其它合成操作模型的通常操作，并且可被用来合成一系列的可降解的阳离子脂质聚合物。
实施例5
细胞培养：在37℃、5％CO2和100％湿度的条件下，将HEK 293T、208F、HT 1080-EGFP和HeLa-EGFP细胞保持在含有10％FBS、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM中。在该培养基中，细胞具有约20小时的倍增时间并且每3-4天进行分离以避免融合。
实施例6
质粒DNA制备：从BD Sciences Clontech公司购买pEGFP-N1质粒，编码野生型GFP的红移变体，将其优化用于哺乳动物细胞中更亮的荧光和更高的表达。通过CMV(PCMV IE)的立即早期启动子控制GFP。所述质粒在DH5αE.coli中扩增并且使用Qiagen Plasmid Max PreparationKit进行纯化，并且其总是具有大于1.7的A260/A280。
实施例7
体外转染：将293和208F细胞置于96孔组织培养板中(对于293细胞5×104细胞/孔，对于208F细胞1×104细胞/孔)并在含有10％FBS的DMEM中孵育过夜。质粒-聚合物配合物的准确混合顺序是转染结果中的关键参数。对于每一孔，将等份的不同浓度的7.5μl的脂质聚合物溶液加入至含有0.6μg pEGFP-N1质粒的7.5μl DNA溶液中并完全混合。在室温下将DNA和脂质聚合物的混合物孵育15分钟以形成DNA-脂质聚合物配合物。将配合物加入每一孔并且在37℃、5％CO2下将细胞孵 育24小时。通过GFP信号分析确定EGFP基因转染率。根据制造商提供的实验方案，Lipofectamine被用作阳性对照。
实施例8
GFP信号的观察：在荧光显微镜(Olympus，520nm滤波器)下观察来自实施例3的转染细胞中的绿色荧光信号。使用10倍物镜对细胞拍照。从最佳阳离子聚合物数量的三场(three fields)计数来确定转染的培养物中具有GFP信号的细胞百分比。293细胞中的lipofectamine 2000的转染率约为60％，5A、5B和5C的转染率分别为约25％、55％和40％，但5A和5C的荧光密度稍许降低(参见图1)。在208F中也检测到了上述脂质聚合物的基因转染率，其中在通过5A、5B、5C和lipofectamine 2000介导的转染后，GFP阳性细胞分别为约40％、45％、25％和50％(参见图2)。虽然脂质聚合物不如lipofectamine 2000那么好，但是5B的转染率与lipofectamine 2000很接近，所述lipofectamine 2000是市场上一种主要的转染试剂。结果显示所述脂质聚合物具有成为多种细胞系的转染试剂的潜力。
为了定量所述转染率，通过荧光微量培养板读板器(FLX 800，Bio-TEK Instruments Co Ltd)确定转染细胞的相对荧光单位。lipofectamine 2000转染的293细胞的相对荧光单位(RFU)是14596，为5B转染的细胞(6318)的约2.3倍，而lipofectamine 2000和5C转染的208F细胞的RFU分别是2544和1954，这表明在不同的细胞中转染试剂显示出不同的性能并且新的脂质聚合物在某些细胞系中可能具有更好的性能(参见图3)。
实施例9
SiRNA输送研究：在HT1080-EGFP和HeLa EGFP细胞中确定SiRNA输送效率，其分别来源于具有稳定EGFP基因表达的HT 1080和HeLa细胞。通过Dharmacon Research Inc.的SiRNA靶向EGFP来合成SiRNA靶向EGFP基因和虫荧光素酶基因，并且虫荧光素酶基因是21bp的双链RNA，其有义链的序列分别是AAC GAG AAG CGC GAU CAC AUG和AAG UGC GCU GCU GGU GCC AAC。
转染前，对于每一孔，将1.5×104 HT1080-EGFP和HeLa-EGFP接种在96孔板中24h。对于每一孔，将等份的不同浓度的7.5μl的脂质聚合物溶液加入至含有2.0pmol siRNA的7.5μl DNA溶液中并完全混合。在室温下将DNA和脂质聚合物的混合物孵育15分钟以形成SiRNA-脂质聚合物配合物。向每一孔中加入所述配合物并在37℃、5％CO2下将细胞孵育48小时。根据制造商提供的实验方案，Lipofectamine被用作阳性对照。通过GFP信号分析确定siRNA输送效率。
在HT-GFP和HeLa GFP细胞中，5C显示出非常高的siRNA输送，因为在5C介导siRNA输送后，GFP信号被极大地抑制。5C介导的siRNA输送的HT-GFP和HeLa-GFP细胞中的GFP信号低于lipofectamine 2000介导的siRNA输送细胞中的GFP信号。结果表明在两种细胞系中5C均具有比lipofectamine 2000更高的SIRNA输送效率(图4和图5)。另一方面，样品5A和5B也显示出siRNA输送效率，尽管该效率低于lipofectamine 2000的效率。通过荧光微量培养板读板器来确定相对荧光单位，并且结果显示5C介导的siRNA输送的HT1080-EGFP和HeLaEGFP细胞的相对荧光水平仅为未输送试剂基团的27-28％，低于lipofectamine 2000介导的siRNA输送细胞，与未输送试剂基团相比，这显示出约33-46％的相对荧光水平。换句话说，在5C介导的输送的细胞中的EGFP基因表达抑制效率约为72-73％，比lipofectamine 2000高得多后者显示出54-67％的抑制效率。结果表明5C比lipofectamine 2000具有更高的siRNA输送效率。
实施例10
细胞毒性试验：使用3-[4，5二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鎓溴化物(MTT)在哺乳动物细胞中评价阳离子基因载体的细胞毒性。通过实施例9中描述的方法siRNA输送48小时后，将10μl MTT溶液(PBS中5.0mg/mL，Sigma)加入至每一孔，并在37℃下孵育3小时。随后除去培养基并将200μl DMSO加入每一孔以溶解活细胞产生的甲 (formazan)晶体。在570nm测量该溶液的吸光度。使用如下等式来计算 细胞活力：活力(％)＝{Abs570(样品)/Abs570对照}。对照指没有向细胞加入任何试剂或siRNA。结果表明所有的3个样品5A、5B和5C的细胞毒性都很低，在最优条件下，siRNA输送后超过95％的细胞存活，通过lipofectamine 2000的siRNA输送后，细胞活力约为65％。由于HeLa细胞对转染试剂的细胞毒性敏感，该结果表明新的脂质聚合物具有很低的细胞毒性。
实施例11
在siRNA输送中脂质聚合物的特异性：为了评价GFP信号的抑制是否是由细胞毒性或其它非特异性因素引起的，研究了siRNA输送的特异性。将SiRNA靶向GFP和Luc基因由5A、5B和5C输送到HT-GFP细胞。在输送后48小时观察GFP信号：发现5B和5A具有低的输送效率，因为GFP信号没有任何改变。5C显示出很高的输送效率，因为当在最优条件下时，在SiRNA输送(靶向GFP基因)48小时后，72％的GFP受到抑制。另一方面，当使用SiRNA靶向luc基因时，没有发现任何抑制。该结果表明SiRNA输送特异性地抑制GFP信号，而不是细胞毒性引起的抑制。
实施例12
降解研究：为了检测生物降解，在opti MEM中将脂质聚合物稀释至320μg/ml的最终浓度并在37℃下分别孵育2、4、8和24小时。通过FITC标记的反义寡核苷酸来确定样品的DNA结合亲合力。将100μl聚合物加入到96孔板中的100μl寡核苷酸溶液(2μmol/L)中，同时旋涡振荡，并将该混合物孵育15分钟。然后，通过荧光微量培养板读板器来确定荧光(灵敏度＝45)。游离寡核苷酸溶液(寡核苷酸溶液仅仅与100μl的opti MEM溶液混合)的相对荧光单位约为5200RFU，而PEI 25K和PEI 600分别为1823和4350。该结果表明具有高DNA结合亲合力的PEI25K显示出高的荧光抑制(约64％抑制)，而PEI 600显示出很低的荧光单位抑制(18％)，因为PEI 600通常显示出很低的DNA结合亲合力。至于基于阳离子脂质的聚合物，荧光抑制效率约为65％至70％，这表明该聚合物具有高的DNA结合亲合力。
在37℃下在opti MEM中孵育24h后，PEI 25K和PEI 600均没有显示出DNA结合亲合力的显著变化，因为与原始样品相比，荧光信号几乎没有发生变化，这表明PEI 25K是不可降解的。然而，在37℃下孵育8小时后，5A、5B和5C的荧光抑制效率逐渐地降低至约10％，低于PEI600。该结果表明脂质聚合物在opti MEM中是可降解的。
实施例13
Figure A20058003378400251
称量五亚乙基六胺(PEHA)(43mg，0.19mmol)并放入小瓶中，并加入2ml乙醇。PEHA完全溶解后，将化合物6(n×100mg，n×0.19mmol)迅速加入该PEHA溶液中，同时搅拌。在室温(25℃)下将反应混合物搅拌2小时。然后，通过加入1ml 4M HCl的醚溶液来中和该反应混合物。过滤白色沉淀物，使用乙醇洗涤，并且在室温下减压干燥。由NMR和琼脂糖凝胶电泳表征所得到的聚合物7。
使用类似的方法通过改变PEHA与6之比如下制备其它交联的可降解的阳离子脂质聚合物：7A：PEHA/6＝1/1；7B：PEHA/6＝2/1；7C： PEHA/6＝3/1；7D：PEHA/6＝4/1；7E：PEHA/6＝5/1；7F：PEHA/6＝6/1。
实施例14
细胞培养：在37℃、5％CO2以及100％湿度条件下，将HEK 293细胞和HeLa 705细胞保持在含有10％FBS、100单位/mL青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基中。在含有10％FBS和抗生素的MEM培养基中培养CHO-AA8luc，其它条件与293和HeLa 705细胞相同。所述细胞具有约20小时的倍增时间并且每3-4天进行分离以避免融合。
质粒DNA制备：从BD Sciences Clontech公司购买pEGFP-N1质粒，编码野生型GFP的红移变体，其被优化用于哺乳动物细胞中更亮的荧光和更高的表达。通过CMV(PCMV IE)的立即早期启动子控制GFP。以相同方式构建pCMV-luc质粒。所述质粒在DH5αE.coli中倍增并且使用Qiagen Plasmid Max Preparation Kit进行纯化，并且其具有大于1.7的A260/A280。
聚合物7的DNA结合：在opti MEM中分别稀释聚合物7和DNA的一系列样品，然后将10μl聚合物7的溶液加入到DNA溶液(20μg/ml)中，同时涡旋振动。聚合物/DNA之比为32∶1、16∶1、8∶1和10∶1。在室温下将该混合物孵育15分钟以形成聚合物/DNA配合物。然后，向所述配合物中加入5μl DNA荷载缓冲液并且对于每一孔，将15μl混合物加入到0.3％琼脂糖凝胶中。在100V下对样品进行电泳约30分钟并且使用紫外光将所述凝胶可视化。图10显示了DNA结合亲合力的结果。大多数样品显示较低的DNA结合亲合力。例如，即使当聚合物/DNA之比为32∶1时，7B、7C、7D、7E和7F/DNA混合物的DNA电泳图谱与游离的DNA(聚合物数量为0)也是相同的。然而，当聚合物/DNA比率为32∶1和16∶1时，7A阻滞了质粒，这表明样品7A具有DNA结合亲合力。
实施例15
体外基因转染：将293细胞置于96孔组织培养板(5×104细胞/孔)中并且在含有10％FBS的DMEM中孵育过夜。对于每一孔，将等份的不同浓度的7.5μl的脂质聚合物7溶液加入到含有0.6μg pEGFP-N1质粒 的7.5μl DNA溶液中并完全混合。在室温下将DNA和脂质聚合物7的混合物孵育15分钟以形成DNA-脂质聚合物配合物。将所述配合物加入至每一孔并在37℃、5％CO2下将细胞孵育24小时。通过GFP信号分析来确定EGFP基因转染率。根据制造商提供的实验方案，Lipofectamine被用作阳性对照。荧光显微镜(Olympus，520nm滤波器)下观察来自样品的转染细胞中的绿色荧光信号。使用10倍物镜对细胞拍照。从最佳阳离子聚合物数量的三场计数来确定转染的培养物中具有GFP信号的细胞百分比。
转染后约24小时，约28％的7A转染的293细胞显示出转染率。该结果表明脂质聚合物7A是转染试剂(图11)。
实施例16
反义寡核苷酸输送：University of Northern Carolina的Dr.Kole研发出用于反义输送的功能分析的虫荧光素酶705基因系统。在该系统中，将在705具有突变的人类β-球蛋白插入虫荧光素酶cDNA间的序列。该质粒被引入到HeLa细胞用于稳定的基因表达，该细胞系被称作HeLaluc705。通常，所述细胞具有低虫荧光素酶活性，因为它表达错误的虫荧光素酶蛋白质。然而，与705序列结合的反义寡核苷酸将阻止所述错误的剪接位点并产生具有生物活性的虫荧光素酶蛋白质。虫荧光素酶705现在被用作反义寡核苷酸输送中功能模型：较高的虫荧光素酶活性表明较高的反义输送效率。
在Luc 705细胞系中评价聚合物7样品的反义寡核苷酸输送效率。寡核苷酸靶向luc 705的最终浓度为1.0μmol/L，聚合物浓度为320和160μg/ml(与转染期间聚合物/DNA之比是16∶1和8∶1时聚合物的量相同)。转染约24小时后，确定虫荧光素酶活性。
705细胞中的背景虫荧光素酶活性约为1.6×105RLU/mg蛋白质。由7A输送至细胞的反义寡核苷酸的虫荧光素酶活性极大地增加，接近非输送细胞中的50倍。lipofectamine 2000的输送效率较低，约为非输送细胞中的15倍。该结果表明脂质聚合物7A具有比lipofectamine 2000更高的反义寡核苷酸输送效率(图12)。
实施例17
在CHO-AA8-luc细胞系中确定脂质聚合物的SiRNA输送效率。CHO-AA8 Luc为Tet-off细胞系，其中通过Dox控制虫荧光素酶基因表达。当Dox被加入到细胞中时，虫荧光素酶基因表达将被关闭，并且在除去Dox后，它将继续表达。
在SiRNA输送研究中，靶基因的存在的蛋白质可影响评价，因为如果半衰期时间长，尽管靶基因已经被关闭，但是仍然可以检测到蛋白质。在该情况下，CHO-AA8 Luc细胞显示出优势。通过加入Dox可以关闭虫荧光素酶基因表达以减少背景蛋白质。在SiRNA输送期间，可以通过改变培养基除去Dox，并且虫荧光素酶基因开始表达，与此同时，如果将SiRNA成功地输送至细胞，则可以通过SiRNA来抑制该虫荧光素酶的表达水平。
将CHO AA8 luc接种于含有Dox的96孔板中。18-24小时后，产生SiRNA盒/聚合物7配合物。聚合物的最终浓度为320和160μg/ml(与基因转染中16∶1和8∶1时浓度相同)。SiRNA盒的量为150ng/ml。改变培养基并且使用PBS洗涤细胞后，将SiRNA/聚合物7配合物加入到细胞中。在37℃下将细胞孵育48小时后，检测到虫荧光素酶活性。
对照(空白)的虫荧光素酶活性约为107RLU/mg蛋白质，由7A和lipofectamine 2000输送SiRNA盒后，虫荧光素酶活性分别被极大地抑制至2.47和3.49×106RLU/mg蛋白质。该结果表明7A可以有效地将siRNA盒输送至细胞并且其输送效率高于lipofectamine(图13)。
实施例18
使用3-[4，5二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑输溴化物(MTT)在哺乳动物细胞中评价阳离子脂质聚合物7基因载体的细胞毒性。通过上述的方法进行基因转染48小时后，向每一孔中加入10μl MTT溶液(PBS中5.0mg/ml，Sigma)，并且在37℃下孵育3小时。然后除去培养基并向每一孔中加入200μl DMSO以溶解活细胞产生的甲
Figure 200580033784710000210003_1
(formazan)晶体。在570nm测量该溶液的吸光度。使用如下等式来计算细胞活力：活力 (％)＝{AbS570(样品)/AbS570对照}。该结果显示7A的细胞毒性很低，在最佳的条件下输送siRNA后，超过95％细胞成活，而由lipofectamine 2000输送siRNA后，细胞活力约为75％。该结果表明7A具有很低的细胞毒性(图14)。
实施例19
聚合物7的生物降解：使用opti MEM将聚合物7A稀释至最终浓度为320μl/ml。在37℃下将一系列样品孵育4小时、8小时和24小时，然后将样品用于在96孔板中的293细胞种子的基因转染研究。通过上述实验方案进行转染。在转染后24小时观察GFP信号。
7A的GFP基因转染率约为25％，并且在将样品孵育4小时后转染率没有显著的变化。在将样品孵育8小时后转染率极大地减低，并且将样品孵育24小时后几乎没有发现转染率。该结果表明该7A在中性条件下是可生物降解的(图15)。
本领域技术人员应该理解，在不偏离本发明范围的情况下，可以对上述的组合物和方法进行各种省略、添加和修改，并且正如所附的权利要求所限定的那样，所有这样的修改和改变都属于本发明的范围。

Claims (36)

1.含有选自通式(Ia)和通式(Ib)的重复单元的聚合物：
Figure FSB00000144239400011
其中：
PEI是聚乙烯亚胺重复单元；
R选自电子对、氢、C2-C10烷基、C2-C10杂烷基、C5-C30芳基和C2-C30杂芳基，其中当R是氢、C2-C10烷基、C2-C10杂烷基、C5-C30芳基或C2-C30杂芳基时，通式(Ia)和通式(Ib)中的氮原子带有阳离子型电荷；
L选自C2-C50烷基、C2-C50杂烷基、C2-C50烯基、C2-C50杂烯基、C5-C50芳基；C2-C50杂芳基；C2-C50炔基、C2-C50杂炔基、C2-C50羧基烯基、C2-C50羧基杂烯基、和C12-C18脂肪酸基团、胆固醇基团；
W是包含2至50个碳原子的阳离子部分；以及
m是1至30的整数，
所述聚合物具有500道尔顿至1,000,000道尔顿的重均分子量。
2.如权利要求1所述的聚合物，其中所述PEI由通式(II)的重复单元表示：
Figure FSB00000144239400021
其中x是1至100的整数，并且y是1至100的整数。
3.如权利要求1所述的聚合物，其中所述聚合物包含所述通式(Ia)的重复单元。
4.如权利要求1所述的聚合物，其中所述聚合物包含所述通式(Ib)的重复单元。
5.如权利要求1所述的聚合物，其中W包括胺和选自如下的含碳基团：C2-C50烷基、C2-C50杂烷基、C2-C50烯基、C2-C50杂烯基、C5-C50芳基；C2-C50杂芳基；C2-C50羧基烯基和C2-C50羧基杂烯基。
6.如权利要求1所述的聚合物，其是可生物降解的。
7.如权利要求1所述的聚合物，其能够通过选自水解、酶裂解、还原、光裂解和超声处理的机制降解。
8.如权利要求1所述的聚合物，其中L选自C2-C50烷基、C2-C50杂烷基、C2-C50烯基、C2-C50杂烯基、C2-C50炔基、C2-C50杂炔基、C2-C50羧基烯基和C2-C50羧基杂烯基。
9.如权利要求1所述的聚合物，其中L选自C12-C18脂肪酸基团和胆固醇基团。
10.如权利要求1所述的聚合物，其中所述聚乙烯亚胺重复单元具有600道尔顿至25,000道尔顿的分子量。
11.如权利要求1所述的聚合物，具有2,000道尔顿至200,000道尔顿的重均分子量。
12.如权利要求1所述的聚合物，其是交联的。
13.如权利要求1所述的聚合物，其中所述聚合物包含通式(Ia)的重复单元，其中PEI是聚乙烯亚胺重复单元；R是电子对或氢；L是C2-C50羧基烯基；并且m是1至30的整数。
14.如权利要求1所述的聚合物，其中L的结构为：
Figure FSB00000144239400031
15.如权利要求1所述的聚合物，其中L是油酸基团。
16.组合物，其包含与权利要求1所述聚合物配合的生物分子。
17.如权利要求16所述的组合物，其中所述生物分子选自核酸、蛋白质、肽、脂质和碳水化合物。
18.如权利要求17所述的组合物，其中所述核酸选自DNA、单链RNA、双链RNA、核酶、DNA-RNA杂交体和反义DNA。
19.如权利要求17所述的组合物，其中所述核酸是siRNA或反义寡核苷酸。
20.如权利要求16所述的组合物，其还包含能够进入真核细胞的输送增强剂。
21.如权利要求20所述的组合物，其还包含与所述聚合物配合的诊断显像组分。
22.如权利要求20所述的组合物，其中所述输送增强剂促进真核细胞内的一种或多种功能，所述功能选自：受体识别、内化作用、所述生物分子从细胞核内体的脱逸、核定位、生物分子释放和体系稳定化。
23.如权利要求22所述的组合物，其中所述生物分子选自核酸、肽、蛋白质和碳水化合物。
24.如权利要求20所述的组合物，其中所述输送增强剂与所述聚合物偶联。
25.向源于培养细胞系的真核细胞输送生物分子的方法，其包括使所述细胞与权利要求16所述的组合物在体外接触，由此向所述细胞输送所述生物分子。
26.权利要求19定义的组合物在制备用于治疗需要基因治疗的哺乳动物的药物中的用途。
27.组合物，其包含与权利要求1所述聚合物配合的诊断显像剂。
28.权利要求27定义的组合物在制备向哺乳动物输送诊断显像组合物的药物中的用途。
29.聚合物库，其包括多种权利要求1所述的聚合物，其中对于所述聚合物中的至少两种，选自R、L、W、PEI和m的至少一个参数是不同的。
30.医学诊断系统，其包括权利要求1所述的聚合物和识别真核细胞的特异性受体的配体。
31.如权利要求30所述的医学诊断系统，其中所述聚合物与所述配体偶联。
32.药物组合物，其包含致敏剂和权利要求1所述的聚合物。
33.如权利要求32所述的药物组合物，其中所述致敏剂对可见光辐射、紫外线辐射或同时对二者敏感。
34.如权利要求32所述的药物组合物，其中所述聚合物对生物分子具有亲合力。
35.诊断显像组合物，其包含图像对比度试剂和权利要求1所述的聚合物。
36.如权利要求35所述的诊断显像组合物，其还包含靶向剂。
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