KR20070059171A - 생분해성을 가지는 양이온성 폴리머 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 세포에 생활성제를 전달하기에 바람직한, 폴리에틸렌이민, 생분해성 기, 및 비교적 수소성을 가지는 기를 포함하는 폴리머에 관한 것이다.
생분해성, 양이온성, 리포폴리머, 트랜스펙션, 복합체

Description

생분해성을 가지는 양이온성 폴리머 {BIODEGRADABLE CATIONIC POLYMERS}
관련 출원
본원은 2004년 10월 4일자로 출원된 미국가출원 제60/615,764호, 및 2005년 7월 11일자로 출원된 미국가출원 제60/698,357호에 근거한 우선권을 주장하며, 전술한 두 특허문헌은 그 전체로서 원용되어, 본 명세서에 포함된다.
기술 분야
본 발명은 생활성제(bioactive agent)를 세포에 전달하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 구현예로서, 본 발명은 폴리에틸렌이민(PEI: polyethylenimine), 생분해성 기, 및 비교적 소수성을 가지는 기를 포함하는 양이온성 리포폴리머(lipopolymer); 및 DNA, RNA, 올리고뉴클레오타이드, 단백질, 펩타이드, 및 약물과 같은 생활성제를 전달하기 위해, 상기 리포폴리머를 이용하는 방법을 제공한다.
생활성제를 세포에 전달하는 기법으로서는 바이러스 트랜스펙션 시스템(viral transfection system), 및 비(非)바이러스 트랜스펙션 시스템을 이용하는 기법을 비롯하여, 다양한 기법을 이용할 수 있다. 통상적으로 바이러스 시스템은 비바이러스 시스템에 비해 트랜스펙션 효과가 크지만, 바이러스 시스템의 안전성에 있어서는 문제가 제기되어 왔다. 이와 관련해서는 Verma LM 및 Somia N., Nature 389 (1997), pp. 239-242; Marhsall E. Science 286 (2000), pp. 2244-2245를 참조한다. 뿐만 아니라, 바이러스 벡터의 제조 공정은 복잡하고, 많은 비용이 소요되는 공정이 되어가는 추세이다. 일반적으로, 비바이러스 트랜스펙션 시스템은 바이러스 시스템에 비해 효과가 작기는 하지만, 바이러스 시스템에 비해 안전하고 용이하게 제조할 수 있다고 여겨지기 때문에, 많은 주목을 받아왔다.
다양한 비바이러스 트랜스펙션 시스템에서는 생활성제와 복합체를 형성하는 양이온성 폴리머가 이용된다. 유전자 담체(carrier)로서 이용되어 온 양이온성 폴리머를 예시하면, 폴리(L-라이신) (PLL), 폴리에틸렌이민 (PEL), 키토산, PAMAM 덴드리머(dendrimer), 및 폴리(2-디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트 (pDMAEMA)를 들 수 있다. 유감스럽게도, PLL을 이용한 경우에는 통상적으로 트렌스펙션 효과가 불량하며, 고분자량의 PLL은 세포에 대해 큰 독성을 나타낸다. 경우에 따라서, PEI는 엔도좀 분해제(endosomolytic agent) 또는 표적화제(targeting agent)의 필요 없이, 효과적인 유전자 전달이 가능하다. 이와 관련하여, Boussif O., Lezoualc'h F., Zanta M. A., Mergny M. D., Scherman D., Demeneix B., Behr J. P., Proc Natl Acad Sci USA. Aug. 1, 1995, 92(16) 7297-301에 기재된 내용을 참조한다. 유전자 전달 시스템으로서, 다양한 폴리아미도아민 덴드리머에 대한 연구가 진행되어 왔다 (Eichman J. D., Bielinska A. U., Kukowska-Latallo J. F., Baker J. R. Jr., Pharm. Sci. Technol. Today 2000 July; 3(7):232- 245 참조). 그러나, PEI와 덴드리머 둘 다, 세포에 대해 독성을 나타낸다고 보고된 바 있기 때문에, 인간 환자에게 적용하는 경우, 유전자 전달 수단으로서 PEI를 이용하는 데 제약이 있다. 또한, 상업적으로 실용 가능한 유전자 트랜스펙션 효율을 가지는 폴리아미도아민 덴드리머는 비교적 고가이다.
분해성을 가지는 양이온성 폴리머를 이용하여 제조된 유전자 담체는 세포 독성이 감소된 상태로 유전자를 포유 동물 세포 내로 전달한다고 알려져 있다 (Lim Y. B., Kim S. M., Lee Y., Lee W. K., Yang T. G., Lee M. J., Suh H., Park J. S., J. Am. Chem. Soc, 123 (10), 2460-2461, 2001 참조). 그러나, 이러한 분해성 시스템 역시 비(非)분해성 폴리머에 비해 유전자 전달 효율이 낮다. Gosselin 등의 보고에 따르면, 저분자량 PEI의 트랜스펙션 효율을 향상시키기 위하여, 디설파이드 함유 링커를 이용하여, 고분자량 PEI를 얻을 수 있다고 한다 (Gosselin, Micheal A., Guo, Menjin, and Lee, Robert J. Bioconjugate Chem. 2001. 12:232-245 참조). 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트) (DSP), 및 디메틸-3,3'-디티오비스프로피온이미데이트-2HCl (DTBP)을 이용하여 제조된 PEI 폴리머는 유사한 유전자 트랜스펙션 효율, 및 보다 낮은 세포 독성을 나타내었다. 그러나, 상기 디설파이드 함유 링커는 고가이기 때문에, 이러한 시스템은 대규모 스케일로 제조하기 어려우며, 적절하지 않다. 디설파이드 함유 링커를 가지는 폴리머는 환원 조건 하에서만 분해되므로, 그 외 조건에서 상기 폴리머를 이용하는 데 제약이 있다.
Lynn 등의 문헌에는, 양이온성 화합물 간의 링커 분자로서 디아크릴레이트가 이용된, 생분해성을 가지는 양이온성 폴리머의 합성 방법에 대해 기재되어 있다 (Lynn, David A.; Anderson, Daniel G.; Putnam, David; and Langer, Robert. J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 8155-8156을 참조). 그러나, 이렇게 하여 얻어진 폴리머의 경우, 각종 생활성제와의 복합체가 잘 형성되지 않는다는 문제점이 있다. 그러므로, 이러한 폴리머의 합성을 완료하려면, 며칠의 시간이 소요되며, 유전자 전달에 이용될 수 있는 유효한 생성물의 양이 적다. Lynn 등의 방법에 따라서, 100종 이상의 양이온성 폴리머가 제조되었지만, 이들 중 단 2종의 폴리머만이 효과적인 유전자 트랜스펙션 효율을 나타내었다. 이러한 인자들에 의해, 전술한 고분자량 폴리머의 제조 방법은 수행하기 까다롭다.
이에 따라, 세포로의 생활성제의 전달을 안전하고도 효과적으로 촉진할 수 있는 양이온성 폴리머에 대한 개발이 필요한 실정이다.
본 발명의 일 구현예로서, 본 발명은 하기 일반식 (Ia) 및 일반식 (Ib)로 표시되는 반복 단위로 이루어진 군에서 선택되는 반복 단위를 포함하는 폴리머를 제공한다:
Figure 112007030597690-PCT00001
Figure 112007030597690-PCT00002
상기 일반식 (Ia) 및 (Ib)에서,
PEI는 폴리에틸렌이민 반복 단위이고, R은 전자쌍(electron pair), 수소, C2∼C10 알킬, C2∼C10 헤테로알킬, C5∼C30 아릴, 및 C2∼C30 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택되고, L은 C2∼C50 알킬, C2∼C50 헤테로알킬, C2∼C50 알케닐, C2∼C50 헤테로알케닐, C5∼C50 아릴; C2∼C50 헤테로아릴; C2∼C50 알키닐, C2∼C50 헤테로알키닐, C5∼C50 아릴; C2∼C50 헤테로아릴; C2∼C50 카르복시알케닐, 및 C2∼C50 카르복시헤테로알케닐로 이루어진 군에서 선택되고, W는 약 2개 내지 약 50개의 탄소 원자를 포함하는 양이온성 모이어티(cationic moiety)이고, m은 약 1 내지 약 30의 정수임.
본 명세서에서는 상기 각각의 일반식 (Ia) 및 일반식 (Ib)로 표시되는 반복 단위로 이루어진 군에서 선택되는 반복 단위를 일반식 (I)로 표시되는 반복 단위라고 칭할 수도 있다. 그러므로, 예를 들면, 상기 각각의 일반식 (Ia) 및 일반식 (Ib)로 표시되는 반복 단위로 이루어진 군에서 선택되는 반복 단위를 포함하는 폴리머는, 일반식 (I)로 표시되는 반복 단위를 포함하는 폴리머, 또는 일반식 (I)로 표시되는 폴리머로서 칭할 수 있다. 본 명세서에서 상기 일반식 (I)로 표시되는 반복 단위를 포함하는 폴리머는 양이온성 리포폴리머로서 칭할 수도 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 일반식 (Ia) 및 (Ib)에서의 PEI는 하기 일반식 (II)의 반복 단위로 표시되는 것을 특징으로 한다:
Figure 112007030597690-PCT00003
(상기 일반식 (II)에서,
x는 약 1 내지 약 100의 정수이고, y는 약 1 내지 약 100의 정수임).
상기 일반식 (I)로 표시되는 반복 단위에서 질소 원자는 양이온성 전하를 가질 수 있기 때문에, 음하전된 각종 이온종(negatively charged species), 예컨대, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드(iodide), 설페이트 등과 같은 음이온과 이온 결합을 형성할 수 있다는 것에 대해서는 당업자들에게 잘 알려져 있다. 상기 일반식 (I)로 표시되는 복수의 폴리머는 제조된 후, 이용 시까지 저장될 수 있으며, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 복수의 폴리머를 포함하는 폴리머 라이브러리(polymer library)를 제공하며, 여기서, R, L, PEI, W, 및 m으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 파라미터는 상기 복수의 폴리머 중 둘 이상의 폴리머에 있어서 상이하다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 일반식 (I)로 표시되는 반복 단위를 포함하는 폴리머는, 상기 폴리머와 복합체를 형성하는 생체 분자(biomolecule)를 더 포함한다. 상기 생체 분자는 하나 이상의 음이온성 기를 가질 수 있으며, 상기 일반식 (I)로 표시되는 반복 단위와 이온 결합을 형성할 수 있다. 상기 하나 이상의 음이온성 기를 가지는 생체 분자를 예시하면, 핵산(예컨대, DNA, 단일 가닥 RNA, 이중 가닥 RNA, 리보자임(ribozyme), DNA-RNA 혼성체(hybridizer), siRNA, 안티센스 DNA, 및 안티센스 올리고), 단백질, 펩타이드, 지질, 및 탄수화물을 들 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 일반식 (I)로 표시되는 반복 단위를 포함하는 폴리머는 생체 분자, 진핵 세포로의 진입이 가능한 전달 촉진제(delivery enhancing agent), 및/또는 상기 폴리머와 복합체를 형성하는 진단용 이미지화 조성물(diagnostic imaging composition)을 더 포함한다. 상기 전달 촉진제는 상기 진핵 세포 내에서 한 가지 이상의 작용, 예를 들면, 수용체 인식, 내재화(internalization), 세포 엔도좀으로부터의 생체 분자 방출, 핵내 위치화(nucleus localization), 생체 분자 방출, 및 시스템 안정화 작용을 촉진할 수 있다.
상기 일반식 (I)로 표시되는 반복 단위를 포함하고, 생체 분자를 더 포함하며, 진핵 세포로의 진입이 가능한 전달 촉진제, 및/또는 상기 폴리머와 복합체를 형성하는 진단용 이미지화 조성물을 더 포함하는 상기 폴리머는 진핵 세포의 트랜스펙션에 적합하다. 따라서, 본 발명은 다른 구현예로서, 진핵 세포의 트랜스펙션 방법을 제공하며, 본 발명의 진핵 세포의 트랜스펙션 방법은, 상기 폴리머(상기 일반식 (I)로 표시되는 반복 단위 및 생체 분자를 포함하며, 선택적으로, 전달 촉진제 및/또는 진단용 이미지화 조성물을 더 포함하는 폴리머)와 진핵 세포를 접촉시킴으로써, 상기 생체 분자를 상기 세포에 전달하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 포유 동물의 치료 방법을 포함하며, 상기 치료 방법은 유전자 치료가 필요한 포유 동물을 규명하는 단계, 및 상기 포유 동물에게 전술한 폴리머를 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 생체 분자는 siRNA이고, 여기서, siRNA는 관심 있는 유전자의 하향 발현에 효과적이다.
본 발명의 다른 구현예로서, 본 발명은 진핵 세포의 특이적 수용체를 인식하는 리간드, 및 폴리머를 포함하는 의학용 진단 시스템을 제공하며, 여기서, 상기 폴리머는 상기 일반식 (I)로 표시되는 반복 단위, 및 생체 분자를 포함하고, 진핵 세포로의 진입이 가능한 전달 촉진제, 및/또는 상기 폴리머와 복합체를 형성하는 진단용 이미지화 조성물을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 본 발명은 증감제(sensitizer agent), 및 폴리머를 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 여기서, 상기 폴리머는 상기 일반식 (I)로 표시되는 반복 단위, 및 생체 분자를 포함하고, 진핵 세포로의 진입이 가능한 전달 촉진제, 및/또는 상기 폴리머와 복합체를 형성하는 진단용 이미지화 조성물을 더 포함할 수 있다. 상기 증감제는, 광 또는 기타 자극에 노출되는 경우, 특성을 변화시킴으로써(예를 들면, 상기 폴리머의 분해 속도를 증가시킴으로써), 상기 생체 분자의 전달을 촉진할 수 있는 화합물일 수 있다. 상기 증감제는, 자극이 주어질 때, 활성의 변화가 나타나는 생체 분자 자신일 수도 있다.
이하, 전술한 구현예에 대해 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 구현예에 대한 설명
본 발명의 일 구현예로서, 본 발명은 폴리에틸렌이민, 생분해성 기, 및 비교적 소수성을 가지는 "리포" 기를 포함하는 양이온성 리포폴리머를 제공한다. 바람직하기로는, 상기 양이온성 리포폴리머는 하기 일반식 (Ia) 및 (Ib)로 표시되는 반복 단위로 이루어진 군에서 선택되는 반복 단위를 포함한다:
Figure 112007030597690-PCT00004
Figure 112007030597690-PCT00005
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본 명세서에서와 같이, 상기 일반식 (Ia) 및 일반식 (Ib) 둘 다, "일반식 (I)"이라고 칭할 수 있다. 상기 일반식 (I)에서, PEI는 폴리에틸렌이민(예컨대, 상기 일반식 (II)로 표시되는 반복 단위를 포함하는 폴리머)이고, 상기 에스테르 결합은 생분해성 기이고, L은 비교적 소수성을 가지는 "리포" 기이며, m은 약 1 내지 약 30의 수이다. 예컨대, 본 발명의 일 구현예에 따르면, L은 C2∼C50 알킬, C2∼C50 헤테로알킬, C2∼C50 알케닐, C2∼C50 헤테로알케닐, C5∼C50 아릴; C2∼C50 헤테로아릴; C2∼C50 알키닐, C2∼C50 헤테로알키닐, C5∼C50 아릴; C2∼C50 헤테로아릴; C2∼C50 카르복시알케닐, 및 C2∼C50 카르복시헤테로알케닐로 이루어진 군에서 선택된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, L은 C12 내지 C18 지방산, 콜레스테롤, 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된다. 상기 일반식 (I)에서 R은 전자쌍, 또는 수소 원자를 나타낼 수 있다. 동 기술분야의 당업자라면, R이 전자쌍인 경우, 상기 일반식 (I)로 표시되는 반복 단위는 낮은 pH에서 양이온성을 가진다는 것을 알 수 있다. 또한, 상기 일반식 (I)에서의 R은 C2∼C10 알킬, C2∼C10 헤테로알킬, C5∼C30 아릴, 또는 C2∼C30 헤테로아릴과 같은, 비교적 소수성을 가지는 리포 기(lipo group)를 나타낼 수도 있으며, 동 기술분야의 당업자라면, 질소 원자는 통상적으로 넓은 pH 범위에 걸쳐서 양전하를 가진다는 것을 알 수 있다.
상기 일반식 (I)로 표시되는 반복 단위를 포함하는 양이온성 리포폴리머는 하기 도식 A에 나타낸 바와 같이, 하기 일반식 (III)으로 표시되는 디아크릴레이트 모노머와 폴리에틸렌이민(PEI)을 반응시킴으로써 제조될 수 있다:
도식 A
Figure 112007030597690-PCT00006
상기 일반식 (III)에서, 각각의 R 및 L은 상기 일반식 (I)로 표시되는 반복 단위를 포함하는 양이온성 리포폴리머에서와 동일하게 정의된다. 상기 도식 A에는 상기 일반식 (Ia)로 표시되는 반복 단위를 포함하는 폴리머의 제조 방법이 도시되어 있다. 상기 일반식 (Ib)로 표시되는 반복 단위를 포함하는 폴리머의 제조는 적절한 W기 함유 디아크릴레이트 모노머를 이용하여, 전술한 방법과 유사한 방법에 따라 수행될 수 있다는 것은 자명하다. 상기 PEI는 하기 일반식 (II)(단, x는 약 1 내지 약 100의 정수이고, y는 약 1 내지 약 100의 정수임)로 표시되는 반복 단위를 포함하는 것이 바람직하다:
Figure 112007030597690-PCT00007
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상기 도식 A에 도시된 반응은, 에탄올과 같은 상호 용매(mutual solvent) 중에서, 바람직하게는 실온에서 몇 시간 동안 상기 PEI와 상기 디아크릴레이트(III)를 교반하면서 함께 혼합한 다음, 상기 용매를 증발시켜, 얻어진 폴리머를 회수함으로써 수행될 수 있다. 본 발명을 어떠한 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, 상기 PEI와 상기 디아크릴레이트(III) 간 반응은, 상기 PEI의 하나 이상의 아민과 상기 디아크릴레이트의 이중 결합(들) 간의 미카엘 반응(Michael reaction)을 포함한다 (J. March, Advanced Organic Chemistry 3rd Ed., pp.711-712 (1985) 참조). 상기 도식 A에 도시된 디아크릴레이트는 하기 실시예에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.
상기 일반식 (I)로 표시되는 반복 단위를 포함하는 각종 폴리머는 상기 PEI의 분자량 및 구조, 상기 디아크릴레이트(III) 상의 R, W, 및 L기의 종류와 크기, 및 상기 디아크릴레이트(III)와 상기 PEI의 비를 다양하게 하여, 도식 A에 따라 제조될 수 있다. 서로 다른 디아크릴레이트의 혼합물, 및/또는 서로 다른 PEI의 혼합물을 이용할 수도 있다. 상기 PEI는 다관능성(multifunctional)일 수 있으므로, 둘 이상의 디아크릴레이트와 반응할 수 있다. 가교제를 이용하여, 가교된 양이온성 리포폴리머를 제조할 수 있고, 및/또는 다관능성 PEI와 디아크릴레이트(III)의 상대적 비율을 조정하여, 가교된 양이온성 리포폴리머를 제조할 수 있다. 상기 PEI의 분자량은 약 600 내지 약 25,000 돌턴(Dalton)인 것이 바람직하다. 상기 PEI와 상기 디아크릴레이트의 몰 비는 약 1:2 내지 약 1:20인 것이 바람직하다. 상기 양이온성 리포폴리머의 중량 평균 분자량은 약 500 돌턴 내지 약 1,000,000 돌턴일 수 있으며, 바람직하게는 약 2,000 돌턴 내지 약 200,000 돌턴일 수 있다. 분자량은 PEG 표준을 이용한 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)에 의해, 또는 아가로즈(agarose) 겔 전기영동에 의해 측정될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 폴리머 라이브러리는, 둘 이상의 폴리머에 있어서 R, L, W, PEI, 및/또는 m이 상이한 복수의 리포폴리머를 제조함으로써, 얻어진다.
상기 양이온성 리포폴리머는 분해성을 가지는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 생분해성, 예컨대, 가수 분해, 효소에 의한 분해(enzyme cleavage), 환원, 광분해, 및 음파 파쇄(sonication)로 이루어진 군에서 선택되는 메카니즘에 의해 생분해되는 특성을 가진다. 본 발명을 이론으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, 세포내에서의, 상기 일반식 (I)로 표시되는 반복 단위를 포함하는 양이온성 리포폴리머의 분해는 효소에 의한 분해, 및/또는 에스테르 결합의 가수 분해에 의해 진행된다고 여겨진다.
상기 양이온성 리포폴리머는 생체 분자와 복합체를 형성할 수 있으므로, 세포에 생체 분자를 전달하기 위한 담체로서 바람직하다. 상기 일반식 (I)로 표시되는 양이온성 리포폴리머와 복합체를 형성하는 생체 분자를 예시하면, 핵산, 단백질, 펩타이드, 지질, 및 카르보네이트를 들 수 있다. 상기 핵산의 예로서는, DNA, 단일 가닥 RNA, 이중 가닥 RNA, 리보자임, DNA-RNA 혼성체, 및 안티센스 DNA(예컨대, 안티센스 올리고)를 들 수 있다. 그 중에서도 상기 핵산으로서는 siRNA가 바람직하다. 상기 양이온성 리포폴리머와 복합체를 형성하는 생체 분자를 포함하는 상기 리포폴리머는, 상호 용매 중에서 상기 양이온성 리포폴리머와 생체 분자를 함께 혼합함으로써, 보다 바람직하게는 하기 실시예에 기재된 방법에 따라 형성될 수 있다.
양이온성 리포폴리머와 복합체를 형성하는 생체 분자를 포함하는 상기 리포폴리머는 진핵 세포로의 진입이 가능한 전달 촉진제를 더 포함할 수 있다. 상기 전달 촉진제는 상기 복합체에 용해될 수도 있고, 또는 상기 복합체와 혼합될 수도 있고, 또는 상기 양이온성 리포폴리머에 커플링될 수도 있다(예를 들면, 상기 양이온성 리포폴리머에 공유 결합되거나, 상기 양이온성 리포폴리머와 복합체를 형성할 수 있음). 통상적으로 전달 촉진제는 막을 통한 생체 분자/담체 복합체(carrier complex)의 수송을 촉진함으로써, 수송하는 동안, 분해를 감소시키고, 및/또는 상기 담체로부터 상기 생체 분자의 방출을 촉진함으로써, 세포로의 생체 분자의 수송을 촉진하는 물질이다. 유전자와 같은 생체 분자를 세포로 수송하는 방법은, 생체 분자/담체 복합체를 상기 세포막, 엔도좀막, 및 핵막에 통과시킨 다음, 상기 담체로부터 상기 생체 분자를 방출하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 핵산의 경우, 상기 핵산/담체 복합체는 먼저 상기 세포막을 통과한다. 세포내 이입(endocytosis)에 의해 이러한 수송이 이루어지면, 상기 핵산/담체 복합체가 내재화된다. 세포막이 함몰되면서 핵산과 담체는 막에 둘러 싸여 세포 내부로 들어가, 주머니(pocket)가 형성되고, 상기 세포막으로부터 떨어져 나온다. 그 결과, 상기 핵산과 상기 담체를 둘러싸는 거대한 막 결합 구조체인 세포 엔도좀이 형성된다. 그런 다음, 상기 핵산 복합체는 상기 엔도좀 막을 거쳐 세포질로 나옴으로써, 상기 세포질에서의 효소에 의한 분해를 피할 수 있으며, 핵막을 통과한다. 일단 핵 내에 진입하면, 상기 핵산은 상기 담체로부터 분리된다.
통상적으로, 전달 촉진제는 바이러스 담체 시스템, 및 비(非)바이러스 담체 시스템의 두 가지로 분류된다. 인간 바이러스는 위에서 논의한 핵 내로의 진입에서의 문제점을 해결할 수 있는 해결책으로서 제안된 바 있기 때문에, 바이러스 또는 바이러스성 성분은 세포 내로의 핵산 전달에 이용하기에 바람직하다. 전달 촉진제로서 바람직한 바이러스성 성분의 일례를 들면, 적혈구 응집소 펩타이드(hemagglutinin peptide: HA-peptide)가 있다. 상기 바이러스 펩타이드는 엔도좀 파괴에 의해 생체 분자의 세포내로의 전달을 촉진한다. 상기 엔도좀의 산성 pH에서 상기 단백질은 상기 생체 분자 및 담체를 세포질액(cytosol)으로 방출시킨다. 전술한 것 외에, 전달 촉진제로서 바람직한 바이러스성 성분의 예는 당업자들에게 잘 알려져 있다.
비바이러스 전달 촉진제는 통상적으로 폴리머계 또는 지질계이다. 이러한 비바이러스 전달 촉진제는 일반적으로, 상기 핵산의 음전하와 균형을 이루도록 작용하는 다가 양이온(polycation)이다. 부분적인 이유로서, 이러한 다가 양이온 폴리머는 비제한적 크기를 가지는 DNA 플라스미드를 응축시킬 수 있다는 점과, 바이러스 벡터의 이용시 문제되는 안전성을 감안하여, 비바이러스 유전자 전달 촉진제로서 큰 기대를 받아왔다. 상기 비바이러스 유전자 전달 촉진제를 예시하면, 올리고-라이신, 올리고-아르기닌, 또는 이들의 조합과 같은 염기성 아미노산, 및 PEI를 다량 포함하는 영역을 가지는 펩타이드를 들 수 있다. 이러한 다가 양이온성 폴리머는 DNA의 응축에 의해 수송을 촉진한다고 생각된다. PEI 및 수지상 덴드리머(starburst dendrimer)와 같은, 분지화된 사슬 형태의 다가 양이온은 DNA 응축 및 엔도좀 방출 모두를 매개할 수 있다 (Boussif 등 (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 92: 7297-7301 참조). PEI는, pH 6.9에서 이온화 가능한 말단 아민(terminal amine), pH 3.9에서 이온화 가능한 내부 아민(internal amine)을 가지는, 분지화도가 높은 폴리머로서 제조될 수 있다. 이러한 구조로 인해, PEI는 소포체의 팽윤을 유발하는 소포체 pH를 변화시킬 수 있고, 궁극적으로는 엔도좀 함입에 의해 방출될 수 있다.
그 밖에도 전달을 촉진하는 방법으로서는, 상기 양이온성 리포폴리머가, 생체 분자를 수송하기 위해 표적화된 세포 상의 수용체에 의해 인식되는 리간드를 포함하도록 하는 방법이다. 이렇게 함으로써, 수용체의 인식에 의해, 상기 세포로의 생체 분자 전달이 개시될 수 있다. 전술한 경우에 있어서 "리간드"란, 상기 표적 세포의 표면, 또는 상기 세포의 핵 또는 세포질에 위치하는 특이적 수용체 단백질에 결합할 수 있는 생체 분자를 일컫는다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 리간드는 항체, 호르몬, 페로몬, 또는 신경 전달 물질, 또는 상기 수용체에 결합되어, 리간드와 같은 작용이 가능한 임의의 생체 분자일 수 있다. 항체는, 항원에 반응하여, B 림프구에 의해 생성되는 임의의 단백질을 의미한다. 상기 리간드가 특정 세포 수용체에 결합되는 경우, 세포내 이입이 자극된다. 생체 분자의 수송을 촉진하기 위해, 각종 세포 형태로 이용되어 온 리간드를 예시하면, 갈락토스, 트랜스페린(transferrin), 당단백질 아시알로오로소뮤코이드(glycoprotein asialoorosomucoid), 아데노바이러스 섬유, 말라리아 서컴스포로자이트 단백질(malaria circumsporozite protein), 표피 성장 인자(epidermal growth factor), 인간 유두종 바이러스 캡시드(human papilloma virus capsid), 섬유모세포 성장 인자(fibroblast growth factor), 및 폴산(folic acid)을 들 수 있다. 폴레이트 수용체(folate receptor)의 경우, 수용체에 결합된 리간드는 포토사이토시스(potocytosis)라고 하는 과정을 거쳐 세포내로 유입되며, 이 과정에서 수용체가 리간드와 결합하면, 주변의 세포막을 이를 둘러싸면서 세포 표면으로부터 세포내로 소포체를 형성하면서 들어가게 되고, 소포체내의 물질은 소포체의 막을 통과하여 세포질내로 전달된다 (Gottschallc 등 (1994) Gene Ther 1:185-191 참조).
각종 전달 촉진제들은 엔도좀 파괴를 통하여 기능을 하는 것으로 생각된다. 예를 들면, 전술한 HA-단백질 외에도, 결손 바이러스 입자 역시 엔도좀 분해제로서 이용되어 왔다 (Cotten 등 (July 1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 89: 6094-6098 페이지 참조). 비바이러스제는 통상적으로 양친성(amphiphillic)이거나, 또는 지질계이다.
엔도좀 파괴를 매개하거나, 또는 분해도를 감소시키거나, 또는 이러한 과정을 전혀 거치지 않게 하는 제제를 이용하여, DNA와 같은 생체 분자를 세포질로 방출할 수 있다. 엔도좀의 pH를 상승시키는 클로로퀸(chloroquine)은 라이소좀(lysosome) 가수분해 효소의 작용을 저해함으로써, 세포내에 이입된 물질의 분해도를 감소시키는 데 이용되어 왔다 (Wagner 등 (1990) Proc Natl Acad Sci USA vol. 87: 3410-3414 참조). PEI와 같은 분지화된 사슬 다가 양이온, 및 수지상 덴드리머 역시 전술한 바와 같이 엔도좀의 방출을 촉진한다.
상기 양이온성 리포폴리머/생체 분자 복합체 내에 배합될 수 있는 키메라 단백질의 성분으로서, 디프테리아 독소 및 슈도모나스 외독소(Pseudomonas exotoxin)와 같은 독소의 서브유닛을 배합함으로써, 엔도좀의 분해를 피할 수 있다 (Uherek 등(1998) J. Biol. Chem. vol. 273: 8835-8841 참조). 이들 성분은 엔도좀 막을 통한 핵산의 수송과, 세포질 세망(endoplasmic reticulum)을 통해 핵산을 다시 되돌리는 수송을 수송을 촉진한다.
일단 세포질에 들어가면, 핵산-담체상에 핵 위치화 신호가 포함되어 있기 때문에 상기 생체 분자의 핵으로의 수송이 촉진될 수 있다. 예를 들면, 핵 위치화 신호(NLS: nuclear-localization signal)로서 작용하는 특이적 아미노산 서열을 이용할 수 있다. 생체 분자/담체 복합체 상의 NLS는 세포질액 내에 위치한 특이적 핵 수송 수용체 단백질과 상호 반응하는 것으로 생각된다. 상기 생체 분자/담체 복합체가 형성되면, 상기 복합체 중의 수용체 단백질은 뉴클레오포린(nucleoporin)과 복수 회 접촉함으로써, 핵의 기공을 통해 상기 복합체가 수송되는 것이라고 생각된다. 상기 생체 분자/담체 복합체가 목적지에 도달한 다음, 상기 복합체는 해리되어, 상기 생체 분자 및 그 밖의 성분들로 분리된다. SV40 거대 T-항원으로부터 얻어지는 염기 서열 Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val을 이용하여, 핵산 내로 수송할 수 있다. SV40 거대 T-항원에서 얻어지는 이러한 짧은 염기 서열은 결합된 매크로분자를 핵내로 수송하는 신호를 제공할 수 있다고 생각된다.
상기 양이온성 리포폴리머는, 상기 폴리머와 복합체를 형성하는 형광성, 방사성, 또는 방사선 불투과성(radio-opaque) 염료와 같은 진단용 이미지화 화합물을 더 포함할 수 있다. 상기 복합체는, 상기 양이온성 리포폴리머와 상기 진단용 이미지화 화합물을 상호 용매 중에서 함께 혼합함으로써 형성될 수 있다. 상기 폴리머를 포유 동물에게 투여한 후, 잘 알려진 기법, 예컨대, PET, MRI, CT, SPECT 등과 같은 기법을 이용하여, 상기 폴리머(상기 진단용 이미지화 화합물과 복합체를 형성함)를 추적할 수 있다 (Molecular Imaging of Gene Expression and Protein Function In Vivo With PET and SPECT, Vijay Sharma, PhD, Gary D. Luker, MD, and David Piwnica-Worms, MD, Ph.D., JOURNAL OF MAGNETIC RESONANCE IMAGING 16:336-351 (2002) 참조).
본 발명의 다른 구현예로서, 본 발명은 증감제, 및 상기 폴리머를 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 여기서, 상기 폴리머는 상기 일반식 (I)로 표시되는 반복 단위, 및 생체 분자를 포함하며, 진핵 세포로의 진입이 가능한 전달 촉진제, 및/또는 상기 폴리머와 복합체를 형성하는 진단용 이미지화 조성물을 더 포함할 수 있다. 상기 증감제는 광 또는 기타 자극에 노출되는 경우, 특성을 변화시킴으로써(예를 들면, 상기 폴리머의 분해 속도를 증가시킴으로써), 상기 생체 분자의 전달을 촉진할 수 있는 화합물일 수 있다. 상기 증감제는, 자극이 주어질 때, 활성의 변화가 나타나는 생체 분자 자신일 수도 있다. 상기 증감제는 광에 의해 활성화되는 약물일 수도 있다. 상기 광에 의해 활성화되는 약물을 예시하면, 플루오레세인(fluorescein), 메로시아닌(merocyanin), 잔텐(xanthene) 및 그의 유도체, 및 피롤에서 유래된 광반응성 매크로사이클, 및 이들의 유도체를 들 수 있으나, 전술한 것으로 제한되지는 않는다. 상기 피롤에서 유래된 광반응성 매크로사이클로서 적절한 것을 예시하면, 천연 또는 합성 포르피린(porphyrin), 천연 또는 합성 클로린(chlorin), 천연 또는 합성 박테리오클로린(bacteriochlorin), 합성 이소박테리오클로린, 프탈로시아닌, 나프탈로시아닌, 및 확장된(expanded) 피롤계 매크로사이클 시스템(예컨대, 포르피센(porphycene), 사피린(sapphyrin), 및 텍사피린(texaphyrin))을 들 수 있으나, 전술한 것으로 제한되지는 않는다.
도 1은 리포폴리머(5A, 5B, 및 5C), 및 리포펙타민 2000을 이용하여 293 세포에 트랜스펙션한 후, 상기 세포에서 관찰되는 대표적인 GFP 신호를 도시한 도면이다.
도 2는 리포폴리머(5A, 5B, 및 5C), 및 리포펙타민 2000을 이용하여 208 F 세포에 트랜스펙션한 후, 상기 세포에서 관찰되는 대표적인 GFP 신호를 도시한 도면이다.
도 3은 리포폴리머(5A, 5B, 및 5C), 및 리포펙타민 2000("리포")을 이용하여 208 F 및 293 세포에 각각 트랜스펙션한 후, 상기 각각의 세포의 상대 형광도(relative fluorescent level)를 플롯팅(plotting)하여 도시한 도면이다.
도 4는 리포폴리머(5A, 5B, 및 5C), 및 리포펙타민 2000을 이용하여 HT-GFP 세포에 siRNA를 전달한 후, 상기 세포에서 관찰되는 대표적인 GFP 신호를 도시한 도면이다.
도 5는 리포폴리머(5A, 5B, 및 5C), 및 리포펙타민 2000을 이용하여 HeLa-GFP 세포에 siRNA를 전달한 후, 상기 세포에서 관찰되는 대표적인 GFP 신호를 도시한 도면이다.
도 6은 리포폴리머(5A, 5B, 및 5C), 및 리포펙타민 2000("리포")을 이용하여 HT-GFP 세포 및 HeLa GFP 세포에 각각 siRNA를 전달한 후, 상기 각각의 세포의 상대 형광도를 플롯팅하여 도시한 도면이다.
도 7은 siRNA의 전달 후, 리포폴리머(5A, 5B, 및 5C), 및 리포펙타민 2000("리포")의 세포 생존률을 플롯팅하여 도시한 도면이다.
도 8은 양이온성 폴리머(5A, 5B, 및 5C)를 이용하여, 서로 다른 siRNA를 전달한 후, HT-GFP 유전자의 상대 형광도를 플롯팅하여 도시한 도면이다.
도 9는 안티센스 올리고/리포폴리머 복합체의 RFU(relative fluorescent unit)를, 프리 올리고 용액(free oligo solution)의 경우와 비교하여 도시한 도면.
도 10은 DNA에 결합하는 폴리머 6의 결합도에 대한 겔 전기영동 분석 결과를 도시한 도면이다.
도 11은 폴리머 7A, 및 리포펙타민 2000을 이용하여 293 세포에 트랜스펙션한 후, 상기 세포에서 관찰되는 통상적인 GFP 신호를 도시한 도면이다.
도 12는 폴리머 7A, 및 리포펙타민 2000을 이용하여 luc 705 세포에 안티센스 올리고를 전달한 후, 상기 세포에서의 루시퍼라제(Luciferase) 활성을 플롯팅하여 도시한 도면이다.
도 13은 폴리머 7A, 및 리포펙타민 2000을 매개로 CHO-AA8 luc에 siRNA를 전 달한 후, 상기 세포에서의 루시퍼라제 활성을 플롯팅하여 도시한 도면이다.
도 14는 폴리머 7A, 및 리포펙타민 2000을 이용하여 트랜스펙션한 후의 세포 생존률을 도시한 도면이다.
도 15는 opti MEM을 다양한 시간 인큐베이션(incubation)한 후, 폴리머 7A의 GFP 트랜스펙션 효율을 플롯팅하여 도시한 도면이다.
실시예 1
Figure 112007030597690-PCT00008
0℃에서 디클로로메탄(DCM, 200 mL)과 N,N-디메틸포름아미드(DMF, 3방울) 내 올레산(1)(10.7 g, 38 mmol)의 용액에 옥살릴 클로라이드(13.5 mL, 152 mmol)를 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 약 1시간 동안 교반한 다음, 실온으로 승온(warming)하였다. 승온 후 1시간 경과시, 상기 용액을 톨루엔으로 희석한 다음, 증류하였다. 잔류물을 디클로로메탄(200 mL)에 용해한 다음, 0℃로 냉각시켰다. 상기 용액에 디에탄올아민(10.9 mL, 114 mmol), 4-(디메틸아미노)피리딘(490 mg, 4 mmol), 및 트리에틸아민(21 mL, 152 mmol)을 첨가하였다. 얻어진 용액을 0℃에서 30분간 교반한 다음, 실온에서 하룻밤 동안 방치하였다. 상기 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 희석한 다음, 1N의 HCl, 및 NaHCO3 수용액으로 세척하였다. 유기상(organic phase)을 건조시켜(Na2SO4), 감압 농축하였다. 미정제 잔류물(crude residue)을 실리카겔 칼럼(에틸 아세테이트:메탄올=10:1)에서 정제함으로써, 무색 오일로서 13.5 g(99.9 %)의 화합물 2를 얻었다.
실시예 2
Figure 112007030597690-PCT00009
트리에틸아민(8.1 g, 80 mmol), DMAP (0.5 g, 4 mmol), 및 화합물 2(7.1 g, 20 mmol)를 실온에서 200 ml의 디클로로메탄에 용해하였다. 시스템을 아르곤으로 플러싱(flushing)한 다음, 아이스 배스(ice bath)에서 상기 용액을 냉각하였다. 25 ml의 디클로로메탄에 아크릴로일 클로라이드(5.4 g, 60 mmol)를 적하 첨가하였다. 첨가 후, 얻어진 반응물을 실온으로 승온한 다음, 하룻밤 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 디클로로메탄으로 희석한 후, 물 및 NaHCO3 수용액으로 세척하였다. 유기 상을 건조한 다음(Na2SO4), 감압 농축하였다. 그런 다음, 미정제 잔류 물을 실리카겔 칼럼(에틸 아세테이트:헥산=1:3)에서 정제함으로써, 무색 오일로서 7.5 g(81 %)의 화합물 3을 얻었다.
실시예 3
분자량이 600인 폴리에틸렌이민(PEI-600)을 하기 절차에 따라서 화합물 3과 반응시킴으로써, 도식 A에 따른 양이온성 리포폴리머의 합성 반응을 수행하였다: 약 0.6 g의 PEI-600 (Aldrich)을 칭량한 다음, 소형 바이알에 넣은 후, 에탄올 10 ml를 첨가하였다. 상기 PEI-600을 완전히 용해한 다음, 얻어진 PEI 용액을 교반하면서, 10 ml의 에탄올 내 3.7 g (8.0 mmol)의 화합물 3을 상기 용액에 신속하게 첨가하였다. 얻어진 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 상기 유기 용매를 감압 하에 제거한 후, 점성을 갖는 투명한 액체가 얻어졌다. 1H-NMR 스펙트럼으로부터, 아크릴의 탄소-탄소 이중 결합이 완전히 소멸되었음을 확인하였다. 이렇게 하여 얻어진 폴리머의 분자량을 아가로즈 겔 전기영동에 의해 측정하였다. 전술한 합성 과정은 이와 유사한 화합물을 포함하는 그 외 합성 과정의 모델로서 제공되는 일반적 과정이며, 분해성을 가지는 일련의 양이온성 리포폴리머를 합성하는 데 이용될 수 있다.
실시예 4
상기 반응 혼합물을 실온(25℃)에서 2시간 동안 교반한 다음, 에테르 내 4M의 HCl 2.5 mL를 상기 반응 혼합물에 첨가하여, 중화시킨 것을 제외하고는, 실시예 3에 기재된 바와 같이 양이온성 리포폴리머를 제조하였다. 백색 침전물 5C를 여과 하여, 에탄올로 세척한 다음, 실온에서 감압 건조하였다. 이렇게 하여 얻어진 폴리머 5C를 NMR 분광분석계, 및 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 폴리머 5A 및 5B를 유사한 방법으로 제조하였다: 5A: PEI1800, m=12; 5B: PEI600, m=3; 5C: PEI600, m=8. 전술한 합성 과정은 이와 유사한 화합물을 포함하는 그 외 합성 과정의 모델로서 제공되는 일반적 과정이며, 분해성을 가지는 일련의 양이온성 리포폴리머를 합성하는 데 이용될 수 있다.
실시예 5
세포 배양: 37℃, 5% CO2, 및 100% 습도 조건하에, 10% FBS, 100 유닛/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 배지에서 HEK 293T, 208F, HT 1080-EGFP, 및 HeLa-EGFP 세포를 배양하였다. 상기 배지 중에서 상기 각각의 세포는 배가 시간(doubling time)이 약 20시간이었으며, 포화(confluency) 상태를 피하기 위해 3∼4일마다 계대 배양하였다.
실시예 6
플라스미드 DNA 준비: BD Sciences Clontech company로부터 pEGFP-N1 플라스미드를 입수하였으며, 이 플라스미드는 포유 동물 세포에서의 상향 발현 및 보다 높은 형광도 수득에 적합화된, 적색 편이된 야생형 GFP의 변이유전자를 코딩한다. GFP 단백질 발현을 CMV(PCMV IE)의 최조기 프로모터(immediate early promoter)에 의해 조절하였다. 상기 플라스미드는 DH5α E. coli 에서 증폭되었으며, Qiagen Plasmid Max Preparation Kit로 정제한 후, A260 /A280 값은 항상 1.7보다 큰 값이 었다.
실시예 7
시험관내 트랜스펙션: 293 세포 및 208F 세포를 96웰 조직 배양판(293 세포의 경우에는 5×104 개/웰, 208F 세포의 경우에는 1×104 개/웰)에 플레이팅한 다음, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 인큐베이션하였다. 상기 플라스미드-폴리머 복합체의 정확한 혼합 순서는 트랜스펙션의 결과의 주요 파라미터이다. 각각의 웰에 대하여, 0.6 ㎍의 pEGFP-N1 플라스미드를 포함하는 DNA 용액 7.5 ㎕에 7.5 ㎕의 상이한 농도의 리포폴리머 용액의 분취물을 첨가한 다음, 완전히 혼합하였다. 그런 다음, DNA와 리포폴리머의 혼합물을 실온에서 15분간 인큐베이션함으로써, DNA-리포폴리머 복합체를 생성하였다. 상기 복합체를 각각의 웰에 첨가한 다음, 상기 세포들을 온도 37℃, 5% CO2에서 24시간 배양하였다. 그런 다음, GFP 신호 분석에 의해 EGFP 유전자 트랜스펙션 효율을 결정하였다. 제조자가 제공하는 프로토콜에 따라서, 리포펙타민을 양성 대조군으로서 이용하였다.
실시예 8
GFP 신호의 관찰: 형광 현미경을 이용하여, 실시예 3에 따라 트랜스펙션된 세포에서의 녹색 형광 신호를 관찰하였다(Olympus, 필터 520 ㎚). 10× 대물 렌즈를 이용하여, 상기 세포들의 사진을 촬영하였다. 최적의 양이온성 폴리머량에 대한, 트랜스펙션된 배양액에서 GFP 신호를 가지는 세포의 백분률을, 3개 필드의 카운트로 결정하였다. 293 세포에서의 리포펙타민 2000의 트랜스펙션 효율은 약 60% 였으며, 5A, 5B, 및 5C의 트랜스펙션 효율은 각각 약 25%, 55%, 및 40%였으나, 5A와 5C의 형광 밀도(fluorescent density)는 약간 작았다(도 1 참조). 또한, 208F 세포에서는 전술한 리포폴리머의 유전자 트랜스펙션 효율이 확인되었으며, 5A, 5B, 5C, 및 리포펙타민 2000에 의해 매개되는 트랜스펙션 후의 GFP 양성 세포의 효율은 각각 약 40%, 45%, 25%, 및 50%였다 (도 2 참조). 상기 리포폴리머들은 리포펙타민 2000 정도의 양호한 수준이 아니기는 했지만, 5B의 트랜스펙션 효율은 리포펙타민 2000(주요 트랜스펙션 제제)과 상당히 유사하였다. 이러한 결과로부터, 상기 리포폴리머들은 다양한 세포주에 있어서 트랜스펙션 제제로서의 잠재성을 가진다는 것을 알 수 있다.
상기 트랜스펙션 효율을 정량화하기 위해, 형광 마이크로플레이트 판독기(FLX 800, Bio-TEK Instruments Co Ltd.)를 이용하여, 트랜스펙션된 세포의 RFU(relative fluorescent unit)를 결정하였다. 상기 리포펙타민 2000이 트랜스펙션된 293 세포의 RFU는 14596이었고, 5B 트랜스펙션된 세포의 RFU(6318)의 약 2.3배값이었으며, 리포펙타민 2000 및 5C로 각각 트랜스펙션된 208F 세포의 RFU는 각각 2544, 및 1954이었으며, 이들 결과로부터, 상기 트랜스펙션 제제는 서로 다른 세포에서 상이한 성능을 나타내며, 상기 신규한 리포폴리머는 몇몇 세포주에서 보다 나은 성능을 가질 수 있다는 것을 확인할 수 있다(도 3 참조).
실시예 9
siRNA 전달에 관한 연구: 안정한 EGFP 유전자 발현과 함께, 각각 HT1080 세포 및 HeLa 세포에서 유래된 HT1080-EGFP 세포, 및 HeLa EGFP 세포에서의 siRNA 전 달 효율을 측정하였다. Dharmacon Research Inc.에서 합성한, EGFP 유전자, 및 루시퍼라제 유전자를 표적으로 하는 siRNA를 이용하였다. EGFP 유전자, 및 루시퍼라제 유전자를 표적으로 하는 siRNA는 21bp의 이중가닥 스트랜드 RNA이며, 이들의 센스 스트랜드 염기 서열은 각각 AAC GAG AAG CGC GAU CAC AUG 및 AAG UGC GCU GCU GGU GCC AAC이다.
1.5×1O4 HT1080-EGFP 세포 및 HeLa-EGFP세포를 트랜스펙션하기 24시간 전에, 각각의 96웰 플레이트에 깔았다. 각각의 웰에 대해서 2.0 pmol siRNA를 포함하는 7.5 ㎕ DNA에, 7.5 ㎕의 각각 다른 농도의 리포폴리머 용액의 분취물을 첨가한 다음, 완전히 혼합하였다. 상기 DNA와 리포폴리머의 혼합물을 실온에서 15분간 인큐베이션함으로써, siRNA-리포폴리머 복합체를 형성하였다. 각각의 웰에 상기 복합체를 첨가한 다음, 상기 세포들을 온도 37℃, 및 5% CO2 조건에서 48시간 배양하였다. 제조자가 제공하는 프로토콜에 따라서, 리포펙타민을 양성 대조군으로서 이용하였다. GFP 신호 분석에 의해 siRNA 전달 효율을 측정하였다.
5C의 매개에 의해 siRNA 전달을 수행한 후에는 GFP 신호가 대폭 억제되었기 때문에, HT-GFP 세포 및 HeLa GFP 세포 모두에 있어서 상기 5C의 siRNA 전달 효율이 상당히 높게 나타났다. 5C의 매개에 의해 siRNA 전달된 HT-GFT 세포 및 HeLa-GFP 세포에서의 GFP 신호는 리포펙타민 2000의 매개에 의한 siRNA 전달 세포에 비해 낮다. 이들 결과로부터, 5C는 상기 두 세포주에서 리포펙타민 2000보다 높은 siRNA 전달 효율을 가진다는 것을 알 수 있다(도 4 및 도 5 참조). 한편, 샘플 5A 및 5B는 리포펙타민 2000에 비해서 낮기는 하지만, siRNA 전달 효율을 나타내었다. 형광 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 상대 형광도를 측정한 결과, 5C의 매개에 의한 siRNA 전달 HT1080-EGFP 세포 및 HeLa EGFP 세포의 상대 형광도 수준은 전달이 되지 않은 제제군의 27∼28%에 불과한 것으로 확인되었으며, 이는 리포펙타민 2000의 매개에 의한 siRNA 전달 세포보다 낮은 수준(리포펙타민 2000의 매개에 의한 경우, 전달이 되지 않은 제제군에 비해 약 33 내지 46%의 상대 형광도를 나타냄)이었다. 즉, 5C의 매개에 의해 전달된 세포에서의 EGFP 유전자 발현 저해 효율은 약 72∼73%로서, 이는 리포펙타민 2000보다 대단히 높은 값이다(리포펙타민 2000의 저해 효율은 54∼67%임). 전술한 결과들로부터, 5C는 리포펙타민 2000에 비해 높은 siRNA 전달 효율을 가진다는 것을 알 수 있다.
실시예 10
세포 독성 분석: 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT)를 이용하여, 포유 동물 세포에서의 양이온성 유전자 담체의 세포 독성을 평가하였다. 실시예 9에 기재된 방법에 따라 siRNA 전달 후 48시간 경과시, 10 ㎕의 MTT 용액(PBS 중 5.0 ㎎/ml, Sigma)을 각각의 웰에 첨가한 다음, 37℃에서 3시간 인큐베이션하였다. 그런 다음, 상기 배지를 제거한 후, 200 ㎕ DMSO를 각각의 웰에 첨가하여, 생존 세포(living cell)에 의해 생성된 포르마잔 결정을 용해하였다. 상기 용액의 흡광도를 570 ㎚에서 측정하였다. 다음 식에 의해 세포 생존률(viability)을 계산하였다:
생존율 (%) = ｛Abs570(샘플) /Abs570(대조군)｝× 100.
상기 대조군의 경우, 세포에 임의의 제제 또는 siRNA를 전혀 첨가하지 않았다. 본 실험의 결과로부터, 5A, 5B, 및 5C의 3가지 샘플은 세포 독성이 상당히 낮았으며, 적절한 조건에서 siRNA 전달 후의 세포 생존률이 95%보다 높은 반면, 리포펙타민 2000에 의해 siRNA 전달한 후의 세포 생존률은 약 65%임을 알 수 있다. HeLa 세포는 트랜스펙션 제제의 세포 독성에 감성을 가지기 때문에, 전술한 결과로부터, 상기 신규한 리포폴리머가 상당히 낮은 세포 독성을 가진다는 것을 확인할 수 있다.
실시예 11
siRNA 전달에서의 리포폴리머의 특이성: GFP 신호의 저해가 세포 독성 또는 그 밖의 비특이적 인자에 의해 영향을 받는지에 대해 평가하기 위해, siRNA 전달의 특이성에 대해 실험하였다. 5A, 5B, 및 5C를 이용하여, GFP 및 Luc 유전자를 표적화하는 siRNA를 HT-GFP 세포 내로 전달하였다. 전달 후 48시간 경과시, GFP 신호를 관찰하였다: 5B 및 5A는 GFP 신호에서 별다른 변화가 없었기 때문에, 낮은 전달 효율을 가진다는 것을 알 수 있다. 5C의 경우, 적절한 조건에서 siRNA 전달(GFP 유전자를 표적화함) 후 48시간 경과시, GFP의 72%가 저해되었기 때문에 상당히 높은 전달 효율을 가진다는 것을 알 수 있다. 한편, Luc 유전자를 표적화하는 siRNA를 이용한 경우에는 별다른 저해 반응이 관찰되지 않았다. 이들 결과로부터, GFP 신호는 siRNA 전달에 의해 특이적으로 저해된다는 것을 알 수 있다.
실시예 12
분해 연구: 생분해성을 검출하기 위해, 상기 리포폴리머를 적절한 MEM 배지에서 최종 농도 320 ㎍/ml로 희석한 다음, 37℃에서 각각 2시간, 4시간, 8시간, 24시간 인큐베이션하였다. FITC로 표지된 안티센스 올리고를 이용하여, 각각의 샘플의 DNA 결합 친화성을 평가하였다. 혼합물을 보르텍스(vortex) 혼합하면서, 96웰 플레이트 중의 100 ㎕의 올리고 용액(2 μmol/L)에 100 ㎕ 폴리머를 첨가한 다음, 얻어진 혼합물을 15분간 인큐베이션하였다. 그런 다음, 형광 마이크로플레이트 판독기(감도=45)를 이용하여, 형광도를 측정하였다. 프리 올리고 용액(free oligo solution)(100 ㎕의 opti MEM 용액과 혼합된 올리고 용액)의 상대 형광도는 약 5200 RFU이었으며, PEI25K 또는 PEI 600의 상대 형광도는 각각 1823 및 4350이었다. 이들 결과로부터, 높은 DNA 결합 친화성을 가지는 PEI 25K는 형광 저해율(저해율: 약 64%)이 높게 나타난 반면, PEI 600은 상당히 낮은 DNA 결합 친화성을 가지기 때문에, 형광 저해율(18%)이 대단히 낮았다. 상기 양이온성 지질계 폴리머의 경우에는 형광도의 저해율이 약 65% 내지 70%인 것으로 보아, 상기 폴리머가 DNA 결합 친화성이 높다는 것을 알 수 있다.
적절한 MEM 배지, 온도 37℃에서 24시간 배양한 후의 PEI 25K 및 PEI 600은 원래 샘플에 비해 형광 신호에서의 변화가 거의 나타나지 않았기 때문에, DNA 결합 친화성이 변화하지 않았다는 것을 알 수 있으며, 이로써, PEI 25K는 생분해성을 가지지 않는다는 것을 확인할 수 있다. 그러나, 온도 37℃에서 8시간 배양한 후에는 5A, 5B, 및 5C의 형광 저해율은 PEI 600보다 낮은 값인 약 10%로 점진적으로 감소 하였다. 이러한 결과로부터, 상기 리포폴리머는 opti MEM에서 생분해성을 가진다는 것을 알 수 있다.
실시예 13
Figure 112007030597690-PCT00010
펜타에틸렌헥사민(PEHA) (43 mg, 0.19 mmol) (Aldrich)을 칭량하여, 소형 바이알에 넣은 다음, 2 ml의 에탄올을 첨가하였다. PEHA를 완전히 용해한 다음, 얻어진 PEHA 용액을 교반하면서, 상기 용액에 신속하게 화합물 6(n × 100 ㎎, n × 0.19 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물을 실온(25℃)에서 2시간 동안 교반하였다. 그런 다음, 에테르에 용해된 4M의 HCl 1 mL를 첨가하여, 상기 반응 혼합물을 중화하였다. 백색 침전물을 여과한 다음, 에탄올로 세척한 후, 실온에서 감압 하에 건조하였다. 이렇게 하여 얻어진 폴리머 7을 NMR 분석 및 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석하였다.
그 밖에도, PEHA와 화합물 6의 비율을 다음과 같이 다양하게 함으로써, 가교된, 생분해성을 가지는 양이온성 리포폴리머를 유사한 방법으로 제조하였다: 폴리머 7A: PEHA/6=1/1; 폴리머 7B: PEHA/6=2/1; 폴리머 7C: PEHA/6=3/1; 폴리머 7D: PEHA/6 = 4/1; 폴리머 7E: PEHA/6 = 5/1; 및 폴리머 7F: PEHA/6 = 6/1.
실시예 14
세포 배양: 37℃, 5% CO2, 및 100% 습도 조건하에, 10% FBS, 100 유닛/ml의 페니실린, 및 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 배지에서 HEK 293 세포 및 HeLa 705 세포를 배양하였다. 10% FBS, 및 항생제를 함유하는 MEM 배지에서 CHO-AA8 luc를 배양하였으며, 이 때, 그 외 조건은 상기 293 세포 및 HeLa 705 세포의 배양에서와 동일하게 하였다. 상기 각각의 세포는 배가 시간이 약 20시간이었으며, 포화 상태를 피하기 위해 3∼4일마다 계대 배양하였다.
플라스미드 DNA의 제조: BD Sciences Clontech company로부터 pEGFP-N1 플라스미드를 입수하였으며, 이 플라스미드는 포유 동물 세포에서의 상향 발현 및 보다 높은 형광도 수득에 적합화된, 적색 편이된 야생형 GFP의 변이체를 코딩한다. GFP 단백질 발현을 CMV(PCMV IE)의 최조기 프로모터에 의해 조절하였다. pCMV-luc 플라스미드를 동일한 방법으로 제조하였다. 상기 플라스미드는 DH5α E. coli 에서 증폭되었으며, Qiagen Plasmid Max Preparation Kit로 정제한 후, A260 /A280 값은 항 상 1.7보다 큰 값이었다.
폴리머 7의 DNA 결합: 폴리머 7의 일련의 샘플, 및 DNA를 각각 opti MEM에서 희석시킨 다음, 10 ㎕의 폴리머 7 용액을 DNA 용액(20 ㎍/ml)과 보르텍스 혼합하면서, 상기 DNA 용액에 첨가하였다. 상기 폴리머:DNA는 32:1, 16:1, 8:1, 및 10:1이었다. 상기 혼합물을 실온에서 15분간 인큐베이션함으로써, 폴리머/DNA 복합체가 형성되었다. 그런 다음, 5 ㎕의 DNA 로딩 완충액을 상기 복합체에 첨가한 후, 0.3% 아가로즈 겔의 각 웰에 15 ㎕의 혼합물을 첨가하였다. 상기 샘플을 100V에서 약 30분간 전기영동하였고, UV광을 이용하여 상기 겔의 전기영동 결과를 가시화하였다. DNA 결합 친화성 결과는 도 10에 도시되어 있다. 대부분의 샘플에서는 DNA 결합 친화성이 낮게 나타났다. 예컨대, 폴리머:DNA가 32:1인 경우라도, 상기 폴리머 7B, 7C, 7D, 7E, 및 7F/DNA 혼합물의 DNA 전기영동 패턴은 DNA를 포함하지 않는 경우(폴리머량이 0임)와 동일하였다. 그러나, 폴리머:DNA가 32:1 및 16:1인 경우, 상기 플라스미드는 폴리머 7A에 의해 저해되었으며, 이로써, 샘플 7A가 DNA 결합 친화성을 가진다는 것을 확인할 수 있다.
실시예 15
시험관내 유전자 트랜스펙션: 293 세포를 96웰 조직 배양판(5×104 개/웰)에 깔은 다음, 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 각각의 웰에 대하여, 0.6 ㎍의 pEGFP-N1 플라스미드를 포함하는 DNA 용액 7.5 ㎕에 7.5 ㎕ 리포폴리머 7 용액의 분취물을 서로 다른 농도로 첨가한 다음, 완전히 혼합 하였다. 그런 다음, DNA와 리포폴리머 7의 혼합물을 실온에서 15분간 인큐베이션함으로써, DNA-리포폴리머 복합체를 생성하였다. 상기 복합체를 각각의 웰에 첨가한 다음, 상기 세포들을 온도 37℃, 5% CO2에서 24시간 인큐베이션하였다. 그런 다음, GFP 신호 분석에 의해 EGFP 유전자 트랜스펙션 효율을 결정하였다. 제조자가 제공하는 프로토콜에 따라서, 리포펙타민을 양성 대조군으로서 이용하였다. 형광 현미경(Olympus, 필터 520 ㎚)을 이용하여, 트랜스펙션된 세포에서의 녹색 형광 신호를 관찰하였다. 10× 대물 렌즈를 이용하여, 상기 세포들의 사진을 촬영하였다. 최적의 양이온성 폴리머량에 대한, 트랜스펙션된 배양액에서 GFP 신호를 가지는 세포의 백분률을, 3개 필드의 카운트로 결정하였다.
트랜스펙션 후 약 24시간 경과시, 7A 트랜스펙션된 293 세포의 약 28%가 트랜스펙션 효율을 나타내었다. 상기 결과로부터, 리포폴리머 7A가 트랜스펙션 제제임을 알 수 있다(도 11 참조).
실시예 16
안티센스 올리고 전달: Northern Carolina 대학교의 Kole 박사는 안티센스 전달의 기능적 분석을 위한 루시퍼라제 705 유전자 시스템을 개발하였다. 상기 시스템에서는 705에 돌연변이를 가지는 인간의 β-글로빈을 루시퍼라제 cDNA 사이의 염기 서열 내로 삽입하였다. 안정한 유전자 발현을 위해 상기 플라스미드를 HeLa 세포 내로 도입하고, 상기 세포주를 HeLa luc705라 명명하였다. 통상적으로 상기 세포는 잘못된 루시퍼라제 단백질을 발현시키기 때문에, 루시퍼라제 활성이 낮다. 그러나, 705 염기 서열에 대한 안티센스 올리고 결합에 의해, 잘못된 스플라이싱 부위(splicing site)를 차단할 수 있으며, 생물학적 활성을 가지는 루시퍼라제 단백질을 생산할 수 있다. 현재, 루시퍼라제 705는 안티센스 올리고 전달에 있어서의 기능적 모델로서 이용된다: 루시퍼라제 활성이 더 높으면, 안티센스 전달 효율이 높다는 것을 나타낸다.
폴리머 7 샘플의 Luc 705 세포주에서의 안티센스 올리고 전달 효율을 평가하였다. luc 705를 표적화하는 올리고의 최종 농도는 1.0 μmol/L였으며, 상기 각각의 폴리머의 농도는 320 ㎍/ml 및 160 ㎍/ml이었다(트랜스펙션하는 동안, 폴리머/DNA 비가 16: 및 8:1인 경우의 폴리머량과 동일함). 트랜스펙션 후 24시간 경과시, 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
705 세포에서의 루시퍼라제 활성의 배경값(background luciferase activity)은 약 1.6×105 RLU/㎎ 단백질이었다. 7A에 의해 상기 세포에 전달된 안티센스 올리고의 루시퍼라제 활성은 전달이 되지 않은 세포의 경우에 비해 약 50배 정도의 값으로 크게 증가하였다. 리포펙타민 2000의 전달 효율은 그보다 작았으며, 전달되지 않은 세포에 비해 약 15배 수준이었다. 이들 결과로부터, 상기 리포폴리머 7A는 리포펙타민 2000에 비해 안티센스 올리고 전달 효율이 높다는 것을 확인할 수 있다(도 12 참조).
실시예 17
CHO-AA8-luc 세포주에서 리포폴리머의 siRNA 전달 효율을 확인하였다. CHO- AA8-Luc는 Tet-off 세포주로서, 루시퍼라제 유전자 발현은 Dox에 의해 제어된다. 이러한 루시퍼라제 유전자 발현은 Dox를 세포에 첨가하면 중단되며, Dox를 제거한 후에는 유전자가 발현된다.
siRNA 전달에 관한 연구에 있어서, 표적 유전자의 발현이 이미 중단되었더라도, 표적 유전자에 존재하는 단백질의 반감기가 긴 경우에는 단백질이 검출될 수 있기 때문에, 상기 단백질은 평가에 영향을 미칠 수 있다. 이 경우, CHO-AA8 Luc 세포가 장점을 나타낸다. Dox를 첨가하여, 배경 단백질량을 저하시킴으로써, 상기 루시퍼라제 유전자 발현을 중단할 수 있다. siRNA를 전달하는 동안, 상기 배지를 갈아, Dox를 제거할 수도 있으며, 상기 루시퍼라제 유전자가 발현되기 시작하고, 동시에 siRNA가 상기 세포 내로 성공적으로 전달된 경우에는 siRNA에 의해 상기 루시퍼라제 발현 수준이 제한될 수 있다.
96웰 플레이트에 CHO AA8 luc를 Dox와 함께 시딩(seeding)하였다. 18∼24시간 후, siRNA 카세트/폴리머 7 복합체가 제조되었다. 폴리머의 최종 농도는 320 ㎍/ml, 및 160 ㎍/ml이었다(유전자 트랜스펙션시, 16:1 및 8:1인 경우와 동일한 농도임). siRNA 카세트의 양은 150 ng/ml이었다. 배지를 교환하고, 상기 세포를 PBS로 세척한 다음, siRNA/폴리머 7 복합체를 상기 세포 내에 첨가하였다. 세포를 37℃에서 48시간 인큐베이션한 후, 루시퍼라제 활성을 평가하였다.
7A 및 리포펙타민 2000에 의한 siRNA 카세트 전달 후의 대조군(블랭크)의 루시퍼라제 활성은 약 107 RLU/㎎ 단백질이었으며, 루시퍼라제 활성은 각각 2.47 및 3.49×106 RLU/㎎ 단백질로 크게 저하되었다. 전술한 결과로부터, 7A는 세포내로 siRNA 카세트를 효과적으로 전달할 수 있으며, 그 전달 효율은 리포펙타민보다 높다는 것을 알 수 있다(도 13 참조).
실시예 18
3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT)를 이용하여, 포유 동물 세포에서의 양이온성 리포폴리머 7 유전자 담체의 세포 독성을 평가하였다. 전술한 방법에 따라 유전자 트랜스펙션을 수행하고 48시간 경과 후, 10 ㎕의 MTT 용액(PBS 중 5.0 ㎎/ml, Sigma)을 각각의 웰에 첨가한 다음, 37℃에서 3시간 인큐베이션하였다. 그런 다음, 상기 배지를 제거한 후, 200 ㎕ DMSO를 각각의 웰에 첨가하여, 생존 세포에 의해 생성된 포르마잔 결정을 용해하였다. 상기 용액의 흡광도를 570 ㎚에서 측정하였다. 다음 식에 의해 세포 생존률을 계산하였다:
생존율 (%) = ｛Abs570(샘플) /Abs570(대조군)｝× 100.
본 실험의 결과로부터, 7A는 세포 독성이 상당히 낮았고, 적절한 조건에서 siRNA 전달 후의 세포 생존률이 95%보다 높은 반면, 리포펙타민 2000에 의해 siRNA 전달한 후의 세포 생존률은 약 75%임을 알 수 있다. 이로써, 7A는 상당히 낮은 세포 독성을 가진다는 것을 확인할 수 있다(도 14 참조).
실시예 19
폴리머 7의 생분해성: 폴리머 7A를 적절한 MEM 배지에서 최종 농도 320 ㎕ /ml로 희석하였다. 일련의 샘플을 37℃에서 각각 4시간, 8시간, 및 24시간 인큐베이션한 다음, 96웰 플레이트 중의 293 세포 시드(seed)에서 유전자 트랜스펙션 연구용 샘플들을 취하였다. 전술한 프로토콜에 따라 트랜스펙션을 수행하였다. 트랜스펙션 후, GFP 신호를 관찰하였다.
7A의 GFP 유전자 트랜스펙션 효율은 약 25%였으며, 상기 샘플들을 4시간 인큐베이션한 후, 상기 트랜스펙션 효율에서의 변화가 없었다. 상기 샘플들을 8시간 인큐베이션한 후, 상기 트랜스펙션 효율이 크게 감소하였으며, 상기 샘플들을 24시간 인큐베이션한 후에는 트렌스펙션 효율이 거의 나타나지 않았다. 이로써, 7A는 중성 조건 하에 생분해성을 가진다는 것을 알 수 있다 (도 15 참조).
본 발명은 바람직한 실시예를 참조하여 자세히 표시되고 설명되어 있지만, 본 발명의 범위내에서 형태나 구체적인 사항이 다양하게 변경될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.

Claims (34)

  1. 하기 각각의 일반식 (Ia) 및 일반식 (Ib)로 표시되는 반복 단위로 이루어진 군에서 선택되는 반복 단위를 포함하는 폴리머:
    Figure 112007030597690-PCT00011
    Figure 112007030597690-PCT00012
    (상기 일반식 (Ia) 및 (Ib)에서,
    PEI는 폴리에틸렌이민 반복 단위이고,
    R은 전자쌍(electron pair), 수소, C2∼C10 알킬, C2∼C10 헤테로알킬, C5∼C30 아릴, 및 C2∼C30 헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택되고,
    L은 C2∼C50 알킬, C2∼C50 헤테로알킬, C2∼C50 알케닐, C2∼C50 헤테로알케닐, C5∼C50 아릴; C2∼C50 헤테로아릴; C2∼C50 알키닐, C2∼C50 헤테로알키닐, C5∼C50 아릴; C2∼C50 헤테로아릴; C2∼C50 카르복시알케닐, 및 C2∼C50 카르복시헤테로알케닐로 이루어진 군에서 선택되고,
    W는 약 2개 내지 약 50개의 탄소 원자를 포함하는 양이온성 모이어티(cationic moiety)이고,
    m은 약 1 내지 약 30의 정수임).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 PEI는 하기 일반식 (II)의 반복 단위로 표시되는 것을 특징으로 하는 폴리머:
    Figure 112007030597690-PCT00013
    (상기 일반식 (II)에서,
    x는 약 1 내지 약 100의 정수이고, y는 약 1 내지 약 100의 정수임).
  3. 제1항에 있어서,
    상기 폴리머는 상기 일반식 (Ia)로 표시되는 반복 단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리머.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 폴리머는 상기 일반식 (Ib)로 표시되는 반복 단위를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리머.
  5. 제1항에 있어서,
    W가,
    아민, 및 C2∼C50 알킬, C2∼C50 헤테로알킬, C2∼C50 알케닐, C2∼C50 헤테로알케닐, C5∼C50 아릴; C2∼C50 헤테로아릴; C2∼C50 카르복시알케닐, 및 C2∼C50 카르복시헤테로알케닐로 이루어진 군에서 선택되는 탄소 함유기를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리머.
  6. 제1항에 있어서,
    생분해성을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리머.
  7. 제1항에 있어서,
    가수 분해, 효소에 의한 분해, 환원, 광분해, 및 음파 파쇄(sonication)로 이루어진 군에서 선택되는 메카니즘에 의해 분해되는 것을 특징으로 하는 폴리머.
  8. 제1항에 있어서,
    L이, C2∼C50 알킬, C2∼C50 헤테로알킬, C2∼C50 알케닐, C2∼C50 헤테로알케 닐, C2∼C50 알키닐, 및 C2∼C50 헤테로알키닐로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리머.
  9. 제1항에 있어서,
    L이, C12 내지 C18 지방산, 콜레스테롤, 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리머.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 폴리에틸렌이민 반복 단위는 약 600 돌턴(Dalton) 내지 약 25,000 돌턴 범위의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리머.
  11. 제1항에 있어서,
    중량 평균 분자량이 약 500 돌턴 내지 약 1,000,000 돌턴인 것을 특징으로 하는 폴리머.
  12. 제1항에 있어서,
    중량 평균 분자량이 약 2,000 돌턴 내지 약 200,000 돌턴인 것을 특징으로 하는 폴리머.
  13. 제1항에 있어서,
    가교 결합된 것을 특징으로 하는 폴리머.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 폴리머와 복합체를 형성하는 생체 분자(biomolecule)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리머.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 생체 분자가 핵산, 단백질, 펩타이드, 지질, 및 탄수화물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리머.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 핵산은 DNA, 단일 가닥 RNA, 이중 가닥 RNA, 리보자임(ribozyme), DNA-RNA 혼성체(hybridizer), 및 안티센스 DNA로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리머.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 핵산이 siRNA, 또는 안티센스 올리고인 것을 특징으로 하는 폴리머.
  18. 제14항에 있어서,
    진핵 세포로의 진입이 가능한 전달 촉진제(delivery enhancing agent)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리머.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 폴리머와 복합체를 형성하는 진단용 이미지화 조성물(diagnostic imaging composition)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리머.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 전달 촉진제가 상기 진핵 세포 내에서, 수용체 인식, 내재화(internalization), 세포 엔도좀으로부터의 생체 분자 방출, 핵내 위치화(nucleus localization), 생체 분자 방출, 및 시스템 안정화 작용으로 이루어진 군에서 선택되는 한 가지 이상의 작용을 촉진하는 것을 특징으로 하는 폴리머.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 생체 분자가 핵산, 펩타이드, 단백질, 및 탄수화물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리머.
  22. 제18항에 있어서,
    상기 전달 촉진제가 상기 폴리머와 커플링(coupling)된 것을 특징으로 하는 폴리머.
  23. 제14항 기재의 폴리머와 진핵 세포를 접촉시킴으로써, 상기 생체 분자를 상기 세포에 전달하는 단계를 포함하는, 진핵 세포의 트랜스펙션(transfection) 방법.
  24. 포유 동물의 치료 방법으로서,
    유전자 치료가 필요한 포유 동물을 규명하는 단계, 및
    상기 포유 동물에게 제17항 기재의 폴리머를 투여하는 단계를 포함하며,
    상기 핵산은 관심 있는 유전자의 하향 발현에 효과적인 siRNA를 포함하는
    것을 특징으로 하는 포유 동물의 치료 방법.
  25. 제1항에 있어서,
    상기 폴리머와 복합체를 형성하는 진단용 이미지화 조성물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리머.
  26. 제25항 기재의 폴리머를 포유 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유 동물에게 진단용 이미지화 조성물을 전달하는 방법.
  27. 제1항 기재의 복수의 폴리머를 포함하는 폴리머 라이브러리(polymer library)로서,
    R, L, PEI, W, 및 m으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 파라미터가 상기 폴리머 중 둘 이상의 폴리머에 있어서 상이한 것을 특징으로 하는 폴리머 라이브러리.
  28. 제1항 기재의 폴리머, 및 진핵 세포의 특이적 수용체를 인식하는 리간드를 포함하는 의학용 진단 시스템.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 폴리머가 상기 리간드에 커플링된 것을 특징으로 하는 의학용 진단 시스템.
  30. 증감제(sensitizer agent), 및 제1항 기재의 폴리머를 포함하는 약학적 조성물.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 증감제가 가시 광선 및 자외선 중 하나 이상에 감성을 가지는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  32. 제30항에 있어서,
    상기 폴리머가 생체 분자에 대해 친화성을 가지는 것을 특징으로 하는 약학 적 조성물.
  33. 조영제(image contrast agent), 및 제1항 기재의 폴리머를 포함하는 진단용 이미지화 조성물.
  34. 제33항에 있어서,
    표적화제(targeting agent)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 이미지화 조성물.
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100894585B1 (ko) * 2008-05-30 2009-04-24 전북대학교산학협력단 표면개질된 바이오매스, 그의 제조방법 및 그를 이용하는 생체흡착제
WO2009148292A3 (ko) * 2008-05-30 2010-03-25 전북대학교 산학협력단 표면개질된 바이오매스, 그의 제조방법 및 그를 이용하는 유가금속의 회수 방법
KR101050383B1 (ko) * 2009-03-11 2011-07-19 전북대학교산학협력단 표면개질된 대장균 바이오매스의 제조방법 및 이에 의한 생체흡착제
US8906132B2 (en) 2009-04-14 2014-12-09 Industrial Cooperation Foundation Chonbuk National University Surface-modified biomass, preparation method thereof, and method for recovering valuable metals using the same
WO2016068617A1 (ko) * 2014-10-30 2016-05-06 서울대학교 산학협력단 폴리올계 삼투압적 폴리디자일리톨 폴리머 유전자 전달체 및 이의 용도

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1667732B1 (en) * 2003-09-29 2010-04-21 Nitto Denko Corporation Biodegradable polyacetals for in vivo polynucleotide delivery
US7358223B2 (en) * 2004-10-04 2008-04-15 Nitto Denko Corporation Biodegradable cationic polymers
US20120269886A1 (en) 2004-12-22 2012-10-25 Nitto Denko Corporation Therapeutic agent for pulmonary fibrosis
WO2006068232A1 (ja) 2004-12-22 2006-06-29 Sapporo Medical University 線維化抑制のための薬物担体および薬物担体キット
US7674452B2 (en) * 2005-03-16 2010-03-09 Nitto Denko Corporation Polymer coating of cells
JP4870941B2 (ja) * 2005-05-09 2012-02-08 公立大学法人大阪府立大学 高分子化合物
US20060263328A1 (en) * 2005-05-19 2006-11-23 Sang Van Hydrophilic polymers with pendant functional groups and method thereof
JP5059312B2 (ja) * 2005-09-16 2012-10-24 Ｈｏｙａ株式会社 高分散性リン酸カルシウム系化合物ナノ粒子及びその製造方法
US9572886B2 (en) 2005-12-22 2017-02-21 Nitto Denko Corporation Agent for treating myelofibrosis
US7700541B2 (en) * 2006-04-06 2010-04-20 Nitto Denko Corporation Biodegradable cationic polymers
CN100549044C (zh) * 2006-11-16 2009-10-14 南京慧基生物技术有限公司 可生物降解的交联聚乙烯亚胺及其应用
TWI407971B (zh) 2007-03-30 2013-09-11 Nitto Denko Corp Cancer cells and tumor-related fibroblasts
US20080312174A1 (en) * 2007-06-05 2008-12-18 Nitto Denko Corporation Water soluble crosslinked polymers
CN107049965A (zh) * 2007-08-06 2017-08-18 Clsn实验室股份有限公司 核酸‑脂聚合物组合物
CA2698812A1 (en) 2007-09-14 2009-03-19 Nitto Denko Corporation Drug carriers
WO2009091812A2 (en) * 2008-01-14 2009-07-23 Surmodics, Inc. Devices and methods for elution of nucleic acid delivery complexes
JP2011514423A (ja) * 2008-03-14 2011-05-06 エーゲン、インコーポレイテッド 生分解性架橋分枝状ポリ（アルキレンイミン）
DE102008002254A1 (de) * 2008-06-06 2010-01-21 Evonik Röhm Gmbh Monomermischungen, Polymere sowie Beschichtungszusammensetzungen
BR112012002341A8 (pt) 2009-08-06 2017-10-10 Koninklijke Philips Electronics Nv Semente radioativa para uso na terapia oncológica e método de terapia oncológica
US20130079382A1 (en) 2009-10-12 2013-03-28 Larry J. Smith Methods and Compositions for Modulating Gene Expression Using Oligonucleotide Based Drugs Administered in vivo or in vitro
TWI543763B (zh) * 2009-12-09 2016-08-01 日東電工股份有限公司 Ｈｓｐ４７表現之調節
EP2553019A1 (en) 2010-03-26 2013-02-06 Mersana Therapeutics, Inc. Modified polymers for delivery of polynucleotides, method of manufacture, and methods of use thereof
JP6000287B2 (ja) 2011-03-03 2016-09-28 クォーク ファーマシューティカルズ インコーポレーティッドＱｕａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． 肺疾患および損傷を治療するための組成物および方法
KR101786905B1 (ko) 2011-06-21 2017-10-19 닛토덴코 가부시키가이샤 아포토시스 유도제
CN103509182A (zh) * 2012-06-21 2014-01-15 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 具有高缓冲能力基于聚乙烯亚胺的基因载体及其制备方法
CN103509183A (zh) * 2012-06-21 2014-01-15 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 基于聚乙烯亚胺可降解的基因载体及其制备方法
US9109087B2 (en) * 2012-09-13 2015-08-18 International Business Machines Corporation Low molecular weight branched polyamines for delivery of biologically active materials
JP6340162B2 (ja) 2012-12-20 2018-06-06 日東電工株式会社 アポトーシス誘導剤
JP6076076B2 (ja) 2012-12-21 2017-02-08 日東電工株式会社 組織再生促進剤
CN104109241B (zh) * 2013-04-17 2019-01-11 复旦大学附属肿瘤医院 共价疏水修饰的聚乙烯亚胺及其制备方法和应用
WO2015194522A1 (ja) 2014-06-17 2015-12-23 日東電工株式会社 アポトーシス誘導剤
CN105732981A (zh) * 2014-12-10 2016-07-06 深圳先进技术研究院 改性聚乙烯亚胺、基因载体复合物及其制备方法和应用
EP3225246A1 (en) * 2016-03-31 2017-10-04 Klinikum der Universität München Synthetic compound for improving efficiency of transfection
RU2755544C2 (ru) 2016-04-14 2021-09-17 Бенитек Биофарма Лимитед Реагенты для лечения окулофарингеальной мышечной дистрофии (OPMD) и их применение
AU2019392748A1 (en) * 2018-12-05 2021-06-10 Fred Hutchinson Cancer Center Reduced and minimal manipulation manufacturing of genetically-modified cells
CN109776347B (zh) * 2019-02-18 2021-03-26 华南农业大学 一种热固性植物油基丙烯酸酯衍生物及其制备方法和应用
EP4010027A1 (en) 2019-08-05 2022-06-15 PolyPlus Transfection Compositions for transfecting a nucleic acid molecule into a cell comprising heterocyclic compounds grafted to a cationic polymer, and their applications
GB2603454A (en) 2020-12-09 2022-08-10 Ucl Business Ltd Novel therapeutics for the treatment of neurodegenerative disorders
GB202117758D0 (en) 2021-12-09 2022-01-26 Ucl Business Ltd Therapeutics for the treatment of neurodegenerative disorders
CN114874422B (zh) * 2022-06-16 2023-05-12 上海云沂生物医药科技有限公司 一种聚烷基胺、其合成方法、颗粒及用途

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2229711A (en) * 1938-06-29 1941-01-28 Ansul Chemical Co Method of preventing formation of ice crystals in refrigerants
GB2092164B (en) * 1980-12-17 1984-12-05 Hitachi Ltd Loght or radiation-sensitive polymer composition
US4897355A (en) * 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US6509032B1 (en) 1991-08-28 2003-01-21 Mcmaster University Cationic amphiphiles
US5240939A (en) * 1991-10-31 1993-08-31 Anaquest, Inc. Nitrogen bridge tetrahydroisoquinolines
DE4142130A1 (de) 1991-12-20 1993-06-24 Basf Ag Verwendung von polyacetalen auf basis von vinylethern und dihydroxyverbindungen in wasch- und reinigungsmitteln und polyacetale
JPH0789909A (ja) * 1993-09-22 1995-04-04 Nippon Soda Co Ltd 新規アニリニウム塩化合物および重合開始剤
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
AU696455C (en) 1994-03-23 2006-03-02 Case Western Reserve University Compacted nucleic acids and their delivery to cells
EP0769063A1 (en) 1994-06-27 1997-04-23 The Johns Hopkins University Targeted gene delivery system
US5767168A (en) 1995-03-30 1998-06-16 The Proctor & Gamble Company Biodegradable and/or compostable polymers made from conjugated dienes such as isoprene and 2,3-dimethyl-1, 3-butadiene
US5811510A (en) 1995-04-14 1998-09-22 General Hospital Corporation Biodegradable polyacetal polymers and methods for their formation and use
WO1997034620A1 (en) 1996-03-18 1997-09-25 The Regents Of The University Of California Peptide inhibitors of neurotransmitter secretion by neuronal cells
US20010007771A1 (en) 1996-05-29 2001-07-12 Sean M. Sullivan Cationic polymers and lipids for the delivery of nucleic acids
US6072101A (en) 1997-11-19 2000-06-06 Amcol International Corporation Multicomponent superabsorbent gel particles
US20020006664A1 (en) 1999-09-17 2002-01-17 Sabatini David M. Arrayed transfection method and uses related thereto
WO2001091725A2 (en) * 2000-05-31 2001-12-06 Univ Johns Hopkins Biologically useful polyphosphates
WO2002020663A2 (en) 2000-09-06 2002-03-14 Ap Pharma, Inc. Degradable polyacetal polymers
US20040142474A1 (en) 2000-09-14 2004-07-22 Expression Genetics, Inc. Novel cationic lipopolymer as a biocompatible gene delivery agent
US6696038B1 (en) 2000-09-14 2004-02-24 Expression Genetics, Inc. Cationic lipopolymer as biocompatible gene delivery agent
US7427394B2 (en) 2000-10-10 2008-09-23 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof
US6998115B2 (en) * 2000-10-10 2006-02-14 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof
US6652886B2 (en) 2001-02-16 2003-11-25 Expression Genetics Biodegradable cationic copolymers of poly (alkylenimine) and poly (ethylene glycol) for the delivery of bioactive agents
US20030120355A1 (en) 2001-06-08 2003-06-26 Urs Hafeli Biocompatible and biodegradable polymers for diagnostic and therapeutic radioisotope delivery
KR100448170B1 (ko) 2001-06-23 2004-09-10 주식회사 태평양 폴리에틸렌이민을 친수성 블록으로 갖고 폴리에스테르계고분자를 소수성 블록으로 갖는 양친성 생분해성 블록공중합체 및 이를 이용한 수용액 상에서의 고분자자기조합 회합체
US6586524B2 (en) 2001-07-19 2003-07-01 Expression Genetics, Inc. Cellular targeting poly(ethylene glycol)-grafted polymeric gene carrier
US20030186915A1 (en) 2002-02-11 2003-10-02 Yang Pan Regulatory polynucleotides and uses thereof
US20030186916A1 (en) 2002-03-12 2003-10-02 Lei Yu Vector for transfection of eukaryotic cells
US20030215395A1 (en) 2002-05-14 2003-11-20 Lei Yu Controllably degradable polymeric biomolecule or drug carrier and method of synthesizing said carrier
CN1166831C (zh) * 2002-08-23 2004-09-15 清华大学 表面高接枝率高分子抗菌纤维的制备方法
US20040048260A1 (en) 2002-09-10 2004-03-11 Fu-Hsiung Chang Transfection of nucleic acid
US20070269891A9 (en) 2003-01-13 2007-11-22 Yasunobu Tanaka Solid surface with immobilized degradable cationic polymer for transfecting eukaryotic cells
US20040138154A1 (en) 2003-01-13 2004-07-15 Lei Yu Solid surface for biomolecule delivery and high-throughput assay
US6878374B2 (en) 2003-02-25 2005-04-12 Nitto Denko Corporation Biodegradable polyacetals
US7332477B2 (en) 2003-07-10 2008-02-19 Nitto Denko Corporation Photocleavable DNA transfer agent
US7048925B2 (en) 2003-08-28 2006-05-23 Nitto Denko Corporation Acid-sensitive polyacetals and methods
EP1667732B1 (en) 2003-09-29 2010-04-21 Nitto Denko Corporation Biodegradable polyacetals for in vivo polynucleotide delivery
US7163677B2 (en) 2003-10-24 2007-01-16 Nitto Denko Corporation Cationic polymers having degradable crosslinks
US7125709B2 (en) 2004-02-10 2006-10-24 Nitto Denko Corporation Culture device and method for eukaryotic cell transfection
US7358223B2 (en) 2004-10-04 2008-04-15 Nitto Denko Corporation Biodegradable cationic polymers
JP4739352B2 (ja) 2004-12-17 2011-08-03 日東電工株式会社 真核細胞をトランスフェクトするための固定化分解性カチオンポリマーを持つ固体表面
WO2006068232A1 (ja) * 2004-12-22 2006-06-29 Sapporo Medical University 線維化抑制のための薬物担体および薬物担体キット
JP2009221164A (ja) * 2008-03-17 2009-10-01 Nitto Denko Corp 肺線維症処置剤
US7588754B2 (en) 2005-05-10 2009-09-15 Nitto Denko Corporation Biodegradable polyacetals and methods
US20060263328A1 (en) 2005-05-19 2006-11-23 Sang Van Hydrophilic polymers with pendant functional groups and method thereof
US20060278751A1 (en) * 2005-06-13 2006-12-14 Chen Hsiu-Man Y Membrane reel fixing device for a membrane strapping dispenser
JP5342834B2 (ja) * 2008-09-05 2013-11-13 日東電工株式会社 骨髄線維症処置剤
EP1971652A1 (en) 2006-01-04 2008-09-24 Dow Global Technologies Inc. Reactive (meth)acrylate monomer compositions and preparation and use thereof
US7700541B2 (en) * 2006-04-06 2010-04-20 Nitto Denko Corporation Biodegradable cationic polymers
TWI407971B (zh) * 2007-03-30 2013-09-11 Nitto Denko Corp Cancer cells and tumor-related fibroblasts
US20080312174A1 (en) 2007-06-05 2008-12-18 Nitto Denko Corporation Water soluble crosslinked polymers
CA2698812A1 (en) * 2007-09-14 2009-03-19 Nitto Denko Corporation Drug carriers
KR20110051214A (ko) 2008-07-30 2011-05-17 닛토덴코 가부시키가이샤 약물 담체
WO2010029760A1 (en) 2008-09-12 2010-03-18 Nitto Denko Corporation Imaging agents of fibrotic diseases

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100894585B1 (ko) * 2008-05-30 2009-04-24 전북대학교산학협력단 표면개질된 바이오매스, 그의 제조방법 및 그를 이용하는 생체흡착제
WO2009148292A3 (ko) * 2008-05-30 2010-03-25 전북대학교 산학협력단 표면개질된 바이오매스, 그의 제조방법 및 그를 이용하는 유가금속의 회수 방법
KR101050383B1 (ko) * 2009-03-11 2011-07-19 전북대학교산학협력단 표면개질된 대장균 바이오매스의 제조방법 및 이에 의한 생체흡착제
US8906132B2 (en) 2009-04-14 2014-12-09 Industrial Cooperation Foundation Chonbuk National University Surface-modified biomass, preparation method thereof, and method for recovering valuable metals using the same
WO2016068617A1 (ko) * 2014-10-30 2016-05-06 서울대학교 산학협력단 폴리올계 삼투압적 폴리디자일리톨 폴리머 유전자 전달체 및 이의 용도
US10086083B2 (en) 2014-10-30 2018-10-02 Seoul National University R&Db Foundation Polyol-based osmotic polydixylitol polymer gene transporter and use thereof

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US7358223B2 (en) 2008-04-15
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WO2006041617A1 (en) 2006-04-20
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AU2005294699A1 (en) 2006-04-20
HK1108904A1 (en) 2008-05-23

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