CN107778481A - 一种配体修饰的肌醇‑聚乙烯亚胺基因载体的制备方法及其应用 - Google Patents

一种配体修饰的肌醇‑聚乙烯亚胺基因载体的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种配体修饰的肌醇‑聚乙烯亚胺基因载体的制备方法。该方法首先将活化的肌醇与聚乙烯亚胺经一步反应得到肌醇‑聚乙烯亚胺聚合物，然后将该聚合物进一步与靶向配体结合，得到新的配体修饰的肌醇‑聚乙烯亚胺基因载体，将其应用于基因治疗，其生物相容性好，毒性低，作为非病毒载体具有基因转染效率高的特点。

Description

一种配体修饰的肌醇-聚乙烯亚胺基因载体的制备方法及其 应用
技术领域
本发明属于非病毒基因载体制备技术领域，具体涉及一种具有高效基因转染效率的配体修饰的肌醇-聚乙烯亚胺基因载体的制备方法及其在基因治疗方面的应用。
背景技术
基因治疗是将外源基因靶向组织细胞，用于纠正缺陷或受损基因，达到疾病治疗的目的。利用基因治疗，可以医治多种疾病，如肿瘤，艾滋病，糖尿病，免疫缺陷病等。在基因治疗中，除了有效的基因以外，基因靶向目的细胞的基因载体的有效获得是基因治疗的一个关键问题。目前，基因载体主要分为病毒载体和非病毒载体。相对于病毒载体，非病毒载体因具有较高的安全性和化学结构易修饰性等特点而受到普遍关注。
聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)为一类研究比较广泛的阳离子聚合物。PEI根据乙烯亚胺的连接方式不同，可分为线性PEI(LPEI)和枝状PEI(BPEI)。高分子量PEI具有较好基因转染效率，但毒性较大；低分子量PEI虽然不具有毒性，但几乎不显示基因转染性能。将低分子量的PEI进行结构修饰，使其保持低毒性的同时，提高基因转染效率，有望发展成为有潜力的生物可降解基因药物载体。
肌醇(inositol,INO)广泛分布在动物和植物体内，是动植物生长的营养因子。INO能促进细胞生长，参与体内代谢活动，是生理活性物质如磷脂酰肌醇、膜磷脂、鞘脂等的前体物质。除了以化合物形式存在机体内以外，正常人体内也含有游离INO。因此，INO被广泛用于药品和食品的开发中。INO具有立体环己六醇的结构，目前发现了九种INO的立体异构体，其中以myo-INO在体内含量最高。鉴于INO具有多个功能基团，适宜作为母体进行低分子量PEI的嫁接。Li等先将INO进行羧甲基化，然后将BPEI600及BPEI25KD与羧甲基化INO进行结合，合成得到新的INO-PEI阳离子聚合物，研究发现，该聚合物可以有效进行基因转染，且进入体内可降解为低分子量PEI，毒性较小，生物相容性较高(参见文献(1)Biomaterials,2014.35(6):p.2039-2050.(2)International Journal of Nanomedicine,2015.10:p.2871-2884.)。然而，该反应使用剧毒物质氯乙酸，若能找到安全有效且方便的合成方法，将更利于这一类聚合物的开发利用。
在载体的设计过程中，针对不同疾病类型，在载体上接枝特异性靶向配体，可以有效实现载体对肿瘤细胞的主动靶向。目前，糖，多肽和抗体等作为配体被广泛研究，用于实现载体对肿瘤细胞的主动靶向，在提高基因转染效率的同时，能有效降低毒副作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种配体修饰的肌醇-聚乙烯亚胺基因载体的制备方法。该方法首先将活化的肌醇与聚乙烯亚胺经一步反应得到肌醇-聚乙烯亚胺聚合物，然后将该聚合物进一步与靶向配体结合，得到新的配体修饰的肌醇-聚乙烯亚胺基因载体，将其应用于基因治疗，其生物相容性好，毒性低，作为非病毒载体具有基因转染效率高的特点。
本发明所述的肌醇-聚乙烯亚胺基因载体的制备方法为：将肌醇、N,N’-羰基二咪唑(CDI)、催化剂溶于溶剂中，室温搅拌活化1-48h，然后滴入聚乙烯亚胺溶液中，室温搅拌过夜，透析，冷冻干燥，得到白色絮状的肌醇-聚乙烯亚胺基因载体。
所述聚乙烯亚胺为分子量在600D-25KD范围内的线状或枝状聚乙烯亚胺。
所述肌醇与聚乙烯亚胺的摩尔比为1：1-1：6。
所述N,N’-羰基二咪唑与聚乙烯亚胺的摩尔比为1：1-1：12。
所述催化剂为有机碱，具体选自二乙胺，三乙胺，乙二胺，吡啶中的一种或几种。
所述制备方法中采用的溶剂为DMSO，水，乙醇，DMF，THF。
本发明所述的配体修饰的肌醇-聚乙烯亚胺基因载体的制备方法为：将配体溶于水中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温反应0.5-3h，然后滴入肌醇-聚乙烯亚胺基因载体溶液中，室温反应过夜，透析，冷冻干燥，得到白色絮状的配体修饰的肌醇-聚乙烯亚胺基因载体。
所述配体为乳糖、半乳糖、甘露糖、多肽、蛋白质、抗体及其衍生物。
所述配体与肌醇-聚乙烯亚胺基因载体的摩尔比为0.2：1-2：1。
所述配体与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比为1：1-1：10。
所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为5：1-1：5。
由上述制备的配体修饰的肌醇-聚乙烯亚胺基因载体与DNA或RNA组成复合物。
所述的DNA包括报告基因、抗癌基因和/或细胞因子基因。
所述的RNA包含iRNA，miRNA。
本发明的优点在于：
使用CDI为缩合剂，可以方便将低分子量PEI结合为可生物降解的高分子量PEI。该反应使用无毒试剂，反应条件温和，且采用了新的连接基团进行结合反应。将配体连接在INO-PEI上可以增加载体的靶向能力，提高治疗效果，降低毒性。
附图说明
附图1是INO-BPEI600的1H-NMR图谱(D2O)。
附图2是INO-LPEI2500的1H-NMR图谱(CD3OD)。
附图3是乳糖-INO-BPEI600的1H-NMR图谱(D2O)。
附图4是INO-BPEI600作为载体对EGFP报告基因的转染效率。
附图5是INO-LPEI2500作为载体对EGFP报告基因的转染效率。
附图6是INO-BPEI600作为载体对luciferase报告基因的转染效率。
附图7是INO-LPEI2500作为载体对luciferase报告基因的转染效率。
附图8是INO-LPEI2500载luciferase报告基因后实验小鼠基因表达情况。
具体实施方式
下面对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
称取INO 0.18g(1mmol)，CDI 0.16g(1mmol)，将其溶于30ml DMSO中，向其中加入乙二胺60μl，室温搅拌2h。将所得液滴入0.6g(1mmol)BPEI600的20ml DMSO溶液中，室温反应24h。透析，冷冻干燥得白色絮状的肌醇-聚乙烯亚胺基因载体(INO-BPEI600)。
实施例2
称取INO 0.18g(1mmol)，CDI 1.94g(12mmol)，将其溶于30ml DMSO中，向其中加入三乙胺60μl，室温搅拌48h。将所得液滴入3.6g(6mmol)BPEI600的20ml DMSO溶液中，室温反应24h。透析，冷冻干燥得白色絮状的肌醇-聚乙烯亚胺基因载体(INO-BPEI600)。
实施例3
称取INO 4.5mg(0.025mmol)，CDI 12mg(0.075mmol)，将其溶于10ml DMSO中，向其中加入三乙胺60μl，室温搅拌5h。将所得液滴入200mg(0.05mmol)LPEI2500的20ml H2O溶液中，室温反应24h。透析，冷冻干燥得白色絮状的肌醇-聚乙烯亚胺基因载体(INO-BPEI600)。
实施例4
将乳糖酸8.2mg(0.02mmol)溶于1ml水中，向其中加入EDC 22mg(0.12mmol)和NHS6.4mg(0.12mmol)，室温搅拌1h。将所得液滴入INO-BPEI600 50mg(0.07mmol)的1ml水溶液中，室温搅拌过夜。透析，冷冻干燥，得配体修饰的肌醇-聚乙烯亚胺基因载体。
实施例5
将乳糖酸25.6mg(0.07mmol)溶于1mL水中，向其中加入EDC68.6mg(1.6mmol)和NHS41mg(1.6mmol)，室温搅拌1h。将所得液滴入INO-BPEI600 50mg(0.07mmol)的1ml水溶液中，室温搅拌过夜。透析，冷冻干燥，得配体修饰的肌醇-聚乙烯亚胺基因载体。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前体下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种肌醇-聚乙烯亚胺基因载体的制备方法，其特征在于，其具体操作步骤为：将肌醇、N,N’-羰基二咪唑、催化剂溶于溶剂中，室温搅拌活化1-48h，然后滴入聚乙烯亚胺溶液中，室温搅拌过夜，透析，冷冻干燥，得到白色絮状的肌醇-聚乙烯亚胺基因载体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯亚胺为分子量在600D-25KD范围内的线状或枝状聚乙烯亚胺。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述肌醇与聚乙烯亚胺的摩尔比为1：1-1：6；所述N,N’-羰基二咪唑与聚乙烯亚胺的摩尔比为1：1-1：12。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述催化剂为有机碱，具体选自二乙胺，三乙胺，乙二胺，吡啶中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法中采用的溶剂为DMSO，水，乙醇，DMF，THF。
6.一种配体修饰的肌醇-聚乙烯亚胺基因载体的制备方法，其特征在于，其具体操作步骤为：将配体溶于水中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，室温反应0.5-3h，然后滴入肌醇-聚乙烯亚胺基因载体溶液中，室温反应过夜，透析，冷冻干燥，得到白色絮状的配体修饰的肌醇-聚乙烯亚胺基因载体。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述配体为乳糖、半乳糖、甘露糖、多肽、蛋白质、抗体及其衍生物。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述配体与肌醇-聚乙烯亚胺基因载体的摩尔比为0.2：1-2：1；所述配体与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐的摩尔比为1：1-1：10；所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为5：1-1：5。
9.根据权利要求6-8所述方法制备得到的配体修饰的肌醇-聚乙烯亚胺基因载体与DNA或RNA组成的复合物。
10.根据权利要求9所述的配体修饰的肌醇-聚乙烯亚胺基因载体与DNA或RNA组成的复合物，其特征在于，所述的DNA包括报告基因、抗癌基因和/或细胞因子基因，所述的RNA包含iRNA，miRNA。
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