CN104530188A - 一种由功能肽r11修饰的基因载体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种由功能肽R11修饰的基因载体及其制备方法和应用。所述双功能肽R11的氨基酸序列为：Arg-Gly-Asp-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val，该双功能肽具有靶向于αvβ3和提高核递送能力特点。利用交联技术将R11与聚乙烯亚胺PEI衍生物偶联，构建了新型非病毒基因载体系统。该载体系统不仅有低毒性的特点，而且具有更强的靶向性，可以更好的靶向于细胞进行转染。
Description
【技术领域】
本发明涉及基因载体技术领域，具体地说，是一种由功能肽R11修饰的基因载体及其制备方法和应用。
【背景技术】
基因治疗是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学技术。基因治疗过程中，外源性DNA首先在载体的保护下到达靶细胞，避免或减少被核酸酶降解；与靶细胞结合后，通过内吞或胞饮作用进入细胞内体，并从细胞内体中释放进入细胞质；当DNA转运进入细胞核内，经转录、翻译，最终在细胞质中表达得到相应的蛋白质后，才能真正的发挥治疗作用。基因治疗的关键之一在于开发安全、高效的基因载体。
聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)是近年来研究最为广泛的阳离子多聚物非病毒基因载体，富含阳离子，具有强大的缓冲能力，有较强结合DNA和黏附细胞的能力。然而，由于聚乙烯亚胺是利用自身所带的正电荷，与细胞表面带负电荷的受体通过静电作用相结合，所以细胞的选择特异性差。解决靶向性问题已成为非病毒载体中最为关注的问题。因此，如何将PEI改造成靶向性强、转染效率高的基因载体材料是解决PEI应用难题的突破口。
普朗尼克P123(Pluronic P123)是一种由中部疏水的聚氧丙烯链侧面连接两段亲水聚氧乙烯(EO)构成的非离子式三嵌段共聚物。该物质无毒、无刺激、无免疫原性，可通过化学交联的方法连接PEI，尤其低分子量PEI(如PEI600/800/2000kDa)，以形成多分枝状或网状结构的高分子量PEI衍生物，该衍生物可保证较高转染效率，转染进入体内细胞后，这些交联的化学键又可以通过水解等反应断开，高分子量PEI衍生物断裂成易代谢的低分子量低毒性的PEI，这就使得其在保证一定转染效率的前提下，大大降低了高分子PEI所带来的细胞毒性；另一方面，P123的亲水亲油平衡值适中，同时具有亲水性的聚氧乙烯(EO)链和疏水性的聚环氧乙烷(PO)链，它在水中可自发形成稳定的多分子球形胶束样结构，该胶束尺寸可达纳米级，因此适宜基因药物在体内的传输。
整合素在肿瘤的侵袭转移中发挥重要作用，有研究表明，在肿瘤诱导的新生血管中表达丰富的整合素αvβ3对肿瘤血管的生成起重要作用。利用整合素αvβ3在人肿瘤细胞和肿瘤新生血管高表达的特点，可将其作为基因治疗的靶点，针对整合素亚基设计一段特异的反义寡核苷酸，并通过转基因载体将其转染入肿瘤细胞中，从而调节整合素αvβ3介导的生物学作用。
RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽，广泛存在于生物体内，是整合素和其配体相互作用的识别位点，能以一定的亲和力结合整合素αvβ3，成为肿瘤治疗新的靶向策略，RGD肽在肿瘤治疗中的应用已成为研究热点。
核定位信号(nuclear localization signal，NLS)是一种存在于细胞内许多蛋白质中、并介导蛋白质由细胞质向细胞核内转运的氨基酸序列。NLS是核内功能蛋白进入细胞核的结构基础，是介导某些蛋白进入细胞核的一段充分而必要的信息片段；大分子物质可通过NLS的介导经核孔复合物主动运转至细胞核内，其中研究最多的NLS是来自SV40的T抗原，其主要功能序列为Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val(PKKKRKV)。
因此，理论上可将RGD短肽与核定位信号肽NLS(PKKKRKV)连接，合成具有靶向于αvβ3和提高核递送能力的含RGD和NLS(PKKKRKV)双功能多肽，用于修饰PEI衍生物，提高其肿瘤细胞选择性，又可促进载体穿膜，从而增加DNA的转染效率。
发明人还提交过专利申请CN201110372844.5，公开日2012.04.04，该专利是将普郎尼克P123连接PEI，得到多分枝状或网络状结构的高分子量PEI衍生物P123-PEI，选择特异亲和整合素αvβ3的RGD短肽，与细胞穿膜肽Tat(49-57)连接，合成具有靶向于αvβ3和促进载体穿膜的双功能肽，再利用交联技术将R13与PEI衍生物偶联，构建新型非病毒基因载体系统，并检验了该系统的细胞毒性和体外转染效率。
然而，上述非病毒基因载体系统虽然表现出细胞毒性明显降低、体外转染效率及肿瘤靶向能力提高等一系列优点，但其转染效率仍然偏低，限制其进一步应用。因此提高基因载体材料的转染率是解决PEI应用难题的突破口。
【发明内容】
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种双功能肽。
本发明的再一的目的是，提供一种基因载体。
本发明的另一的目的是，提供一种上述基因载体的制备方法。
本发明的第四个目的是，提供一种复合物。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种双功能肽，所述的双功能肽的氨基酸序列为:Arg-Gly-Asp-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
一种基因载体，所述的基因载体由上述双功能肽和聚乙烯亚胺衍生物偶联而成，所述的聚乙烯亚胺衍生物是普郎尼克修饰的聚乙烯亚胺即普郎尼克P123-聚乙烯亚胺，所述的普郎尼克与聚乙烯亚胺的摩尔比为1:1-1:20，所述的聚乙烯亚胺的分子量范围为600-70000Da。
所述的普郎尼克与聚乙烯亚胺的摩尔比为1:1-1:10。
所述的双功能肽与聚乙烯亚胺衍生物的摩尔比为2:1。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
如上任一所述的基因载体的制备方法，包括以下步骤：
(a)合成权利要求1所述的多肽；
(b)普郎尼克P123除水，加入两倍摩尔量的三光气，溶于无水甲苯和无水二氯甲烷的混合液中，室温下磁力搅拌过夜；除去溶剂后再用无水甲苯和无水二氯甲烷溶解，加入N-羟基琥珀酰亚胺，磁力搅拌下逐滴加入无水三乙胺；反应完全后过滤，除去溶剂，将残渣溶于乙酸乙酯中，离心取上清液，旋蒸除去乙酸乙酯，冷却固化后得活化的普郎尼克P123；
(c)将活化后的普郎尼克P123和除水后的聚乙烯亚胺PEI分别溶于无水二氯甲烷，再将所得的两液同时加入无水二氯甲烷低液中，氮气饱和后磁力搅拌过夜，离心取上清液，旋转蒸发得到普朗尼克P123-聚乙烯亚胺；
(d)将表面活性剂溶解于二甲基亚砜DMSO溶液中，步骤(a)所制备的双功能肽和步骤(c)所制备的普郎尼克P123-聚乙烯亚胺分别溶解于PBS溶液；搅拌普郎尼克P123-聚乙烯亚胺溶液，边搅拌边滴加表面活性剂溶液，室温下反应30min，通过凝胶色谱柱除去未结合的表面活性剂，得到马来酰亚胺化的P123-PEI液；将双功能肽液按2倍摩尔比加入到马来酰亚胺化的P123-PEI溶液中，4℃摇动反应过夜，离心冻干。
为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
如上任一所述的基因载体与DNA形成的复合物。
所述的DNA含报告基因、抗癌基因和/或细胞因子基因。
为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述的多肽以及如上任一所述的基因载体在制备用于基因治疗的药物中的应用。
本发明优点在于：
用普郎尼克P123连接PEI得到多分枝状或网络状结构的高分子量PEI衍生物，然后利用整合素αvβ3在人肿瘤细胞和肿瘤新生血管高表达的特点，选择特异亲和该整合素的RGDC短肽，与核定位信号肽NLS(PKKKRKV)连接，合成具有靶向于αvβ3和提高核递送能力的双功能肽RGDC-NLS(PKKKRKV)(命名为R11)，利用交联技术将R11与PEI衍生物偶联，构建了新型非病毒基因载体系统。该载体系统不仅有低毒性的特点，而且具有更强的靶向性，可以更好的靶向于细胞进行转染。
【附图说明】
附图1是双功能肽R11修饰的P123-PEI细胞毒性。图中，左起第一簇的3根柱子从左至右分别代表P123-PEI-R11、PEI 2KDa、PEI 25KDa。
附图2是双功能肽R11修饰的P123-PEI转染效率。图中，左起第一簇的3根柱子从左至右分别代表P123-PEI-R11、P123-PEI、PEI 2KDa。
【具体实施方式】
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
本文中，SMCC是一类含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯和马来酰亚胺的双功能偶联剂，可以将分别含有巯基和氨基的化合物键接在一起，其分子结构为如下。
实施例1双功能肽R11修饰的P123-PEI的制备和功能验证(一)
一、P123-PEI-R11的制备
1、P123-PEI的制备
称取除水后的P123(0.6mmol)，溶于无水甲苯和无水二氯甲烷的混合溶液(40ml)中，加入1.2mmol双(三氯甲基)碳酸酯(三光气)，室温下磁力搅拌反应过夜。真空旋蒸除去溶剂，再用适量无水甲苯和无水二氯甲烷溶解，然后加入2.0mmol N-羟基琥珀酰亚胺，磁力搅拌下，将2.0mmol无水三乙胺逐滴加入反应液中，继续搅拌反应约4h。待反应完全后，将反应液过滤并再次真空旋蒸除去溶剂，所得残渣溶解于乙酸乙酯中，高速离心后取上清液，旋转蒸发，挥去乙酸乙酯，冷却固化反应物，即得活化后的P123。PEI 2K(0.20g,0.10mmol)除水后溶于10mL无水二氯甲烷中，活化后的P123(0.01mmol)溶于无水二氯甲烷中，同时将上述两液缓慢的滴入10mL无水二氯甲烷底液中，氮气饱和后室温磁力搅拌过夜，透析，冻干，得P123-PEI。
2、双功能肽R11的合成
双功能肽R11的氨基酸序列为Arg-Gly-Asp-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val，由上海吉尔生化有限公司采用固相法合成。作为对照的P123-PEI-R13中双功能肽R13的序列为Arg-Gly-Asp-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg，也由上海吉尔生化有限公司采用固相法合成。
3、R11对P123-PEI的修饰
将表面活性剂SMCC溶解于二甲基亚砜(DMSO)溶液中至终浓度为3.33mg/mL，双功能肽R11与P123-PEI分别溶解于PBS溶液中至浓度分别为10mg/mL、9mg/mL，再将SMCC液按摩尔比2:1逐滴加入P123-PEI溶液中，边加边搅拌，在室温下反应30mim，通过凝胶色谱柱除去未结合的SMCC，即得马来酰亚胺化的P123-PEI(maleimided P123-PEI)。将R11液按按摩尔比2:1加入马来酰亚胺化的Plu-PEI液中，4℃摇动反应过夜。然后用超滤离心管离心，冻干，即得P123-PEI-R11。(P123-PEI-R13的合成方法同P123-PEI-R11)
二、P123-PEI-R11的细胞毒性实验
将B16细胞接种于96孔板上，培养48h，使细胞汇合度达到70％-80％。实验前，吸去培养基，每孔加入不同浓度阳离子聚合物(4，6，8，16，24，32μg/mL，无血清1640作为溶剂)，继续培养72h，MTT法检测细胞毒性，统计细胞存活率，结果如图1、表1所示。从中可看出，未修饰的PEI 25K细胞毒性较强，而P123-PEI-R11几乎无毒，保证了P123-PEI-R11作为基因载体的可行性。
表1细胞毒性数据
三、P123-PEI-R11的体外转染实验
将B16细胞接种于24孔板上，培养48h，使细胞汇合度达到70％-80％。将P123-PEI-R11与虫荧光素酶报告基因按质量比5:1、10:1、20:1和30:1制成复合物，加入24孔板上，培养4h，替换含血清培养基继续培养48h，检测虫荧光素酶表达，统计转染效率，结果如图2、表2所示。从中可看出，P123-PEI-R11显示了很强转染效率，远远高于对照组PEI 2K，说明P123-PEI-R11可以很好的靶向于细胞进行转染。
表2细胞体外转染数据
四、P123-PEI-R11与P123-PEI-R13体外转染对比实验
将B16细胞接种于24孔板上，培养48h，使细胞汇合度达到70％-80％。取P123-PEI-R11与P123-PEI-R13分成两组，分别与虫荧光素酶报告基因按质量比5:1、10:1、20:1和30:1制成复合物，加入24孔板上，培养4h，替换含血清培养基继续培养48h，检测虫荧光素酶表达，统计转染效率，结果如表3所示。从表3可以看出，P123-PEI-R11显示了很强转染效率，远高于对照组P123-PEI-R13，说明P123-PEI-R11具有更强的靶向性，可以更好的靶向于细胞进行转染。
表3P123-PEI-R11与P123-PEI-R13转染率对比
实施例2双功能肽R11修饰的P123-PEI的制备和功能验证(二)
P123-PEI-R11的制备及体外转染实验步骤同实施例1，不同之处在于：本实施例中PEI分子量为70KDa，制备P123-PEI时所用的P123与PEI摩尔比为1:1；作为对照的P123-PEI-R13的制备同P123-PEI-R11。
体外转染实验结果表明P123-PEI-R11荧光素酶的表达强度远远高于对照组P123-PEI-R13；质量比为30时，P123-PEI-R11荧光素酶的表达强度为对照组的28倍，说明P123-PEI-R11可以更好的靶向于细胞进行转染。
实施例3双功能肽R11修饰的P123-PEI的制备和功能验证(三)
P123-PEI-R11的制备及体外转染实验步骤同实施例1，不同之处在于：本实施例中PEI分子量为4KDa，制备P123-PEI时所用的P123与PEI摩尔比为1:5；作为对照的P123-PEI-R13的制备同P123-PEI-R11。
体外转染实验结果表明P123-PEI-R11荧光素酶的表达强度远远高于对照组P123-PEI-R13；质量比为30时，P123-PEI-R11荧光素酶的表达强度为对照组的24倍，说明P123-PEI-R11可以更好的靶向于细胞进行转染。
实施例4双功能肽R11修饰的P123-PEI的制备和功能验证(四)
P123-PEI-R11的制备及体外转染实验步骤同实施例1，不同之处在于：本实施例中PEI分子量为600Da，制备P123-PEI时所用的P123与PEI摩尔比为1:20；作为对照的P123-PEI-R13的制备同P123-PEI-R11。
体外转染实验结果表明P123-PEI-R11荧光素酶的表达强度远远高于对照组P123-PEI-R13；质量比为30时，P123-PEI-R11荧光素酶的表达强度为对照组的26倍，说明P123-PEI-R11可以更好的靶向于细胞进行转染。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种双功能肽，其特征在于，所述的双功能肽的氨基酸序列为：Arg-Gly-Asp-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val。
2.一种基因载体，其特征在于，它是由权利要求1所述的双功能肽和聚乙烯亚胺衍生物偶联而成，所述的聚乙烯亚胺衍生物是普郎尼克修饰的聚乙烯亚胺即普郎尼克P123-聚乙烯亚胺，所述的普郎尼克与聚乙烯亚胺的摩尔比为1:1-1:20，所述的聚乙烯亚胺的分子量范围为600-70000Da。
3.根据权利要求2所述的基因载体，其特征在于，所述的普郎尼克与聚乙烯亚胺的摩尔比为1:1-1:10。
4.根据权利要求2所述的基因载体，其特征在于，所述的双功能肽与聚乙烯亚胺衍生物的摩尔比为2:1。
5.权利要求2-4任一所述的基因载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)合成权利要求1所述的多肽；
(b)普郎尼克P123除水，加入两倍摩尔量的三光气，溶于无水甲苯和无水二氯甲烷的混合液中，室温下磁力搅拌过夜；除去溶剂后再用无水甲苯和无水二氯甲烷溶解，加入N-羟基琥珀酰亚胺，磁力搅拌下逐滴加入无水三乙胺；反应完全后过滤，除去溶剂，将残渣溶于乙酸乙酯中，离心取上清液，旋蒸除去乙酸乙酯，冷却固化后得活化的普郎尼克P123；
(c)将活化后的普郎尼克P123和除水后的聚乙烯亚胺PEI分别溶于无水二氯甲烷，再将所得的两液同时加入无水二氯甲烷低液中，氮气饱和后磁力搅拌过夜，离心取上清液，旋转蒸发得到普朗尼克P123-聚乙烯亚胺；
(d)将表面活性剂溶解于二甲基亚砜DMSO溶液中，步骤(a)所制备的双功能肽和步骤(c)所制备的普郎尼克P123-聚乙烯亚胺分别溶解于PBS溶液；搅拌普郎尼克P123-聚乙烯亚胺溶液，边搅拌边滴加表面活性剂溶液，室温下反应30min，通过凝胶色谱柱除去未结合的表面活性剂，得到马来酰亚胺化的P123-PEI液；将双功能肽液按2倍摩尔比加入到马来酰亚胺化的P123-PEI溶液中，4℃摇动反应过夜，离心冻干。
6.权利要求2-4任一所述的基因载体与DNA形成的复合物。
7.根据权利要求6所述的复合物，其特征在于，所述的DNA含报告基因、抗癌基因和/或细胞因子基因。
8.权利要求1所述的多肽以及权利要求2-4任一所述的基因载体在制备基因治疗的药物中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |