CN106480092A - 一种基于功能肽R9修饰的PEG化Fe3+/PEI基因载体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于功能肽R9修饰的PEG化Fe3+/PEI基因载体及其制备方法和应用。所述基因载体包含聚乙二醇修饰的Fe3+/聚乙烯亚胺与功能肽R9所形成的偶联物。优点:本发明首先通过金属离子Fe3+与PEI反应,加以PEG修饰,形成PEG化Fe3+/PEI,然后合成具有提高核递送能力和靶向于αvβ3的功能肽R9,利用交联技术将R9与PEG‑Fe3+/PEI衍生物偶联,从而构建新型非病毒基因载体系统PEG‑Fe3+/PEI。本发明在降低PEI细胞毒性的基础上,通过提高其在体内的靶向性和核递送能力,进而提高载体在体内的转染效率,为基因治疗最终应用于临床探索有效途径。
Description
技术领域
本发明涉及医疗技术领域,具体涉及一种基于功能肽R9修饰的PEG化Fe3+/PEI基因载体及其制备方法和应用。
背景技术
基因治疗是近年来建立在基因工程技术和分子遗传学原理基础上的新型治疗方法,因肿瘤发生与发展的生物学基础是基因突变,所以基因治疗现已成为攻克肿瘤最具希望的领域。基因治疗有三个重要环节,即目的基因、转基因载体和靶细胞。基因导入系统是基因治疗的核心技术,现阶段面临的最大难题在于尚未找到理想的基因载体。目前应用的载体包括病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体转染效率较高但存在运载能力低、有潜在安全威胁等问题,因此,非病毒载体近年来发展迅速,尤其是阳离子聚合物。
聚乙烯亚胺(polyethylenimine PEI)是近年来研究最为广泛的阳离子多聚物非病毒基因载体,富含阳离子,具有强大的缓冲能力,有较强结合DNA和黏附细胞的能力。然而,聚乙烯亚胺作为基因载体使用存在二个突出问题:第一,转染效率与细胞毒性存在矛盾。小分子PEI虽细胞毒性低,但在生理的离子浓度下与DNA易发生解离,造成转染效果差;分子量在20kd以上的PEI虽具有较理想转染效率,但由于PEI的表面富含阳性电荷以及体内不可降解性,致使高分子量PEI表现出较强的细胞毒性。第二,聚乙烯亚胺靶向性差:它是利用自身所带的正电荷,与细胞表面带负电荷的受体通过静电作用相结合,所以细胞的选择特异性差,解决靶向性问题已成为非病毒载体中最为关注的问题。另外,聚合物/DNA复合物是需要进入到细胞核中,并被RNA解离从而发挥作用。因此,如何提高阳离子复合物在体内靶细胞的细胞核递送成为其能否应用于临床的关键之一。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足,提供一种基于功能肽R9修饰的PEG化Fe3+/PEI基因载体,该基因载体具有高转染效率、靶向性强的的优点。
本发明的第二个目的是,提供如上所述基因载体的制备方法。
本发明的第三个目的是,提供如上所述基因载体的用途。
本发明的第四个目的是,提供一种DNA复合物。
本发明的第五个目的是,提供一种功能肽R9。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案是:
一种基于功能肽R9修饰的PEG化Fe3+/PEI基因载体,所述基因载体包含聚乙二醇修饰的Fe3+/聚乙烯亚胺与功能肽R9所形成的偶联物,所述Fe3+/聚乙烯亚胺是由金属离子Fe3+与聚乙烯亚胺通过配位聚合作用形成的聚乙烯亚胺衍生物;所述功能肽R9的氨基酸序列为:Arg-Gly-Asp-Cys-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys(多肽序列为RGDCKKKRK);所述聚乙烯亚胺的分子量为600-25000Da;所述聚乙烯亚胺与金属离子Fe3+的摩尔比为1:1-10;所述聚乙二醇修饰的Fe3+/聚乙烯亚胺与功能肽R9的摩尔比为1:2-10。
进一步,所述聚乙烯亚胺的分子量为5KDa。
进一步,所述聚乙烯亚胺与金属离子Fe3+的摩尔比为1:6。
进一步,所述聚乙二醇修饰的Fe3+/聚乙烯亚胺与功能肽R9的摩尔比为1:5。
为实现上述第二个目的,本发明采取的技术方案是:
如上任一所述基于功能肽R9修饰的PEG化Fe3+/PEI基因载体的制备方法,包括如下步骤:
1)合成功能肽R9,所述功能肽R9的氨基酸序列为:Arg-Gly-Asp-Cys-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys;
2)将FeCl3·6H2O、PEI、乙烯砜、PEG-NHS分别用超纯水溶解,依次加入到吐温80的环己烷溶液中,反应结束后,向乳浊液中加入乙醇,离心,除去上清液,反复进行三次,最后离心完毕后,对沉淀进行溶解,即得PEG-Fe3+/PEI聚合物溶液;
3)SMCC溶解于DMSO溶液中,功能肽R9与PEG-Fe3+/PEI分别溶解于PBS溶液中,将SMCC溶液加入PEG-Fe3+/PEI液中,反应30mim得到马来酰亚胺化的PEG-Fe3+/PEI;
4)将功能肽R9溶液加入马来酰亚胺化的PEG-Fe3+/PEI溶液中,反应得到PEG-Fe3+/PEI-R9。
进一步,所述制备方法包括如下步骤:
(1)PEG-Fe3+/PEI的合成
将吐温80,溶于一定量的环己烷中,制成吐温80的环己烷溶液,再将FeCl3·6H2O、PEI、乙烯砜、PEG-NHS分别用超纯水溶解,制成一定溶度的水溶液。依次加入上述溶液到吐温80的环己烷溶液中,室温,充分搅拌12h。反应结束后,向乳浊液中加入过量乙醇,离心,小心除去上清液,采用声波降解法将沉淀再次分散在乙醇中,反复进行三次,最后离心完毕后,用超纯水对沉淀进行溶解,即得PEG-Fe3+/PEI聚合物溶液。
(2)R9对PEG-Fe3+/PEI的修饰
多肽R9采用固相法合成。SMCC溶解于DMSO溶液中,R9与PEG-Fe3+/PEI分别溶解于PBS溶液中,将SMCC液逐滴加入PEG-Fe3+/PEI液中,边加边搅拌,在室温下反应30mim,通过凝胶色谱柱除去未结合的SMCC,即得maleimidedPEG-Fe3+/PEI。将R9液按一定摩尔比加入maleimided PEG-Fe3+/PEI液中,4℃摇动反应过夜。反应液经截留分子量为10000的超滤离心管离心去除未被结合的R9,经冷冻干燥后得PEG-Fe3+/PEI-R9。
为实现上述第三个目的,本发明采取的技术方案是:
如上任一所述的基因载体在制备用于基因治疗的药物中的应用。
为实现上述第四个目的,本发明采取的技术方案是:
一种DNA复合物,由如上任一所述的基因载体与DNA复合形成。
进一步,所述的DNA含报告基因、抗癌基因和/或细胞因子基因。
为实现上述第五个目的,本发明采取的技术方案是:
一种功能肽R9,所述功能肽R9的氨基酸序列为:Arg-Gly-Asp-Cys-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys。
本发明首先通过金属离子Fe3+与PEI反应,加以PEG修饰,形成PEG化Fe3+/PEI,然后合成具有提高核递送能力和靶向于αvβ3的功能肽R9,利用交联技术将R9与PEG-Fe3+/PEI衍生物偶联,从而构建新型非病毒基因载体系统PEG-Fe3+/PEI。本发明在降低PEI细胞毒性的基础上,通过提高其在体内的靶向性和核递送能力,进而提高载体在体内的转染效率,为基因治疗最终应用于临床探索有效途径。
本发明PEG-Fe3+/PEI-R9的细胞毒性:将PEI及PEG-Fe3+/PEI-R9以不同浓度梯度加入到B16细胞的96孔板中,培养48h,采用MTT法测定细胞毒性,结果PEG-Fe3+/PEI-R9显示了较高细胞活性,证明了其可以作为基因载体的可行性。
本发明PEG-Fe3+/PEI-R9的体外转染效率:将B16细胞接种于24孔板,孵箱中培养36~48h,待细胞密度为70~80%时进行转染实验。将聚合物与虫荧光素酶质粒按照一定的N/P混合形成复合物,加入各孔中,于培养箱培养4h后,吸去培养液,每孔加入含10%血清的新鲜培养液继续培养,48h后测定虫荧光素酶。结果PEG-Fe3+/PEI-R9显示了很高转染效率。
本发明优点在于:
1、本发明选择金属离子Fe3+与低分子量PEI通过配位聚合作用形成高分子量PEI类似物Fe3+/PEI,并进行PEG化处理。Fe3+可随机交联低分子量PEI,发生共聚螯合作用,组装成具有立体网状结构的高分子量PEI衍生物,该衍生物可保证与高分子量PEI类似的较高转染效率,但该衍生物本质仍由低毒性的低分子量PEI组建,这就使得其在保证一定转染效率的前提下,大大降低了高分子PEI所带来的细胞毒性。
2、胶粒较大、低硬度的纳米粒子具有血液长循环特性,而血液长循环特性是肿瘤靶向的前提。本发明的Fe3+/PEI无定形网状结构可限定在200-400nm较大的纳米尺度范围内,
并利用PEG的柔性形成橡胶般的“弹性”纳米胶体,因此适宜基因药物在体内的传输。
3、本发明通过筛选设计合成了具有提高核递送能力和靶向于αvβ3的功能多肽R9,将R9用于修饰PEG-Fe3+/PEI聚合物,提高其肿瘤细胞选择性,又可促进载体向细胞核递送,从而增加DNA的转染效率。
4、不同PEI与Fe3+摩尔比、PEI分子量、PEG化FE3+/PEI与多肽R9摩尔比对PEG-Fe3+/PEI体外转染效果有显著影响,本发明的PEG-Fe3+/PEI-R9是通过大量实验筛选的,具有转染效率高的优点。
附图说明
附图1为多肽R9修饰的PEG-Fe3+/PEI细胞毒性实验结果。
附图2为多肽R9修饰的PEG-Fe3+/PEI体外转染实验结果
具体实施方式
下面结合具体实施方式,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明记载的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1 多肽R9修饰的PEG-Fe3+/PEI基因载体的制备及功能验证(一)
1、PEG-Fe3+/PEI的合成
分别将20μL FeCl3·6H2O(250mg/mL),30μLbPEI(250mg/mL),10μL乙烯砜(10mg/mL),15μL PEG-NHS(Mw=5000,10mg/mL)依次加入1mL吐温80的环己烷溶液(250mg/mL)中,室温,充分搅拌12h。反应结束后,向乳浊液中加入过量乙醇,10000r/min离心1小时,小心除去上清液,采用声波降解法将沉淀再次分散在乙醇中,反复进行三次,最后离心完毕后,用1mL超纯水对沉淀进行溶解,所得即为PEG-Fe3+/PEI聚合物溶液。
2、功能肽R9的合成
功能肽R9的序列为Arg-Gly-Asp-Cys-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys,由上海吉尔生化有限公司采用固相法合成。
3、多肽R9修饰的PEG-Fe3+/PEI的制备
将SMCC溶解于二甲基亚砜(DMSO)溶液中至终浓度为3.33mg/mL,将PEG-Fe3+/PEI聚合物溶解于PBS溶液中至终浓度为10mg/mL;将制备好的SMCC溶液按照摩尔比5:1逐渐加入PEG-Fe3+/PEI溶液中,边加边搅拌,在室温下反应30min。将反应液通过HiTrap DesaltingSephadexTM G-25Superfine凝胶色谱柱,以除去未结合的SMCC,既得maleimided PEG-Fe3+/PEI。将多肽R9溶解于PBS溶液中至终浓度为10mg/mL,将其按照摩尔比5:1逐滴加入maleimided PEG-Fe3+/PEI液中,4℃摇动反应过夜,然后用截流分子量10000的超滤离心管离心,除去未与maleimided PEG-Fe3+/PEI结合的多肽R9,冷冻干燥既得目的产物。
4、PEG-Fe3+/PEI-R9的细胞毒性试验
将B16细胞接种于96孔板上,培养48h,使细胞汇合度达到70%-80%。实验前,吸去培养基,每孔加入不同浓度阳离子聚合物(4、6、8、16、24、32μg/ml,无血清1640作为溶剂),继续培养72h,MTT法检测细胞毒性。结果如图1所示,从图1可以看到,未修饰的PEI 25K细胞毒性较强,而PEG-Fe3+/PEI-R9几乎无毒,本发明的PEG-Fe3+/PEI-R9对细胞毒性低,保证了PEG-Fe3+/PEI-R9作为基因载体的可行性。
5、PEG-Fe3+/PEI-R9的体外转染实验
将B16细胞接种于24孔板上,培养48h,使细胞汇合度达到70%-80%。将PEG-Fe3+/PEI-R9与虫荧光素酶报告基因按质量比2:1、5:1、10:1、20:1和30:1制成复合物,加入24孔板上,培养4h,替换含血清培养基继续培养48h,检测虫荧光素酶表达。结果如图2所示,从图2可以看出,相比于PEG-Fe3+/PEI,PEG-Fe3+/PEI-R9显示了较高的转染效率,同时其转染效率也远高于对照组PEI 2K,这说明PEG-Fe3+/PEI-R9可以很好的靶向于细胞转染。
实施例2 多肽R9修饰的PEG-Fe3+/PEI基因载体的制备及功能验证(二)
PEG-Fe3+/PEI-R9的制备、细胞毒性试验、体外转染实验同实施例1,不同之处在于:本实施例所制备的PEG-Fe3+/PEI-R9,其中PEI与Fe3+的摩尔比是1:6,PEI分子量是5KDa,所述的PEG化FE3+/PEI与多肽R9的摩尔比是1:5。
细胞毒性试验结果表明:PEG-Fe3+/PEI-R9几乎无毒,本实施例的PEG-Fe3+/PEI-R9对细胞毒性低,保证了PEG-Fe3+/PEI-R9作为基因载体的可行性。体外转染实验结果如表1所示。
实施例3 多肽R9修饰的PEG-Fe3+/PEI基因载体的制备及功能验证(三)
PEG-Fe3+/PEI-R9的制备、细胞毒性试验、体外转染实验同实施例1,不同之处在于:本实施例所制备的PEG-Fe3+/PEI-R9,其中PEI与Fe3+的摩尔比是1:10,PEI分子量是25KDa,所述的PEG化FE3+/PEI与多肽R9的摩尔比是1:10。
细胞毒性试验结果表明:PEG-Fe3+/PEI-R9几乎无毒,本实施例的PEG-Fe3+/PEI-R9对细胞毒性低,保证了PEG-Fe3+/PEI-R9作为基因载体的可行性。体外转染实验结果如表1所示。
实施例4 多肽R9修饰的PEG-Fe3+/PEI基因载体的制备及功能验证(四)
PEG-Fe3+/PEI-R9的制备、细胞毒性试验、体外转染实验同实施例1,不同之处在于:本实施例所制备的PEG-Fe3+/PEI-R9,其中PEI与Fe3+的摩尔比是1:1,PEI分子量是0.6KDa,所述的PEG化FE3+/PEI与多肽R9的摩尔比是1:2。
细胞毒性试验结果表明:PEG-Fe3+/PEI-R9几乎无毒,本实施例的PEG-Fe3+/PEI-R9对细胞毒性低,保证了PEG-Fe3+/PEI-R9作为基因载体的可行性。体外转染实验结果如表1所示。
表1不同实施例所制备的PEG-Fe3+/PEI基因载体体外转染数据
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种基于功能肽R9修饰的PEG化Fe3+/PEI基因载体,其特征在于,所述基因载体包含聚乙二醇修饰的Fe3+/聚乙烯亚胺与功能肽R9所形成的偶联物,所述Fe3+/聚乙烯亚胺是由金属离子Fe3+与聚乙烯亚胺通过配位聚合作用形成的聚乙烯亚胺衍生物;所述功能肽R9的氨基酸序列为:Arg-Gly-Asp-Cys-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys;所述聚乙烯亚胺的分子量为600-25000Da;所述聚乙烯亚胺与金属离子Fe3+的摩尔比为1:1-10;所述聚乙二醇修饰的Fe3+/聚乙烯亚胺与功能肽R9的摩尔比为1:2-10。
2.根据权利要求1所述基于功能肽R9修饰的PEG化Fe3+/PEI基因载体,其特征在于,所述聚乙烯亚胺的分子量为5KDa。
3.根据权利要求1所述基于功能肽R9修饰的PEG化Fe3+/PEI基因载体,其特征在于,所述聚乙烯亚胺与金属离子Fe3+的摩尔比为1:6。
4.根据权利要求1所述基于功能肽R9修饰的PEG化Fe3+/PEI基因载体,其特征在于,所述聚乙二醇修饰的Fe3+/聚乙烯亚胺与功能肽R9的摩尔比为1:5。
5.权利要求1-4任一所述基于功能肽R9修饰的PEG化Fe3+/PEI基因载体的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)合成功能肽R9,所述功能肽R9的氨基酸序列为:Arg-Gly-Asp-Cys-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys;
2)将FeCl3·6H2O、PEI、乙烯砜、PEG-NHS分别用超纯水溶解,依次加入到吐温80的环己烷溶液中,反应结束后,向乳浊液中加入乙醇,离心,除去上清液,反复进行三次,最后离心完毕后,对沉淀进行溶解,即得PEG-Fe3+/PEI聚合物溶液;
3)SMCC溶解于DMSO溶液中,功能肽R9与PEG-Fe3+/PEI分别溶解于PBS溶液中,将SMCC溶液加入PEG-Fe3+/PEI液中,反应30mim得到马来酰亚胺化的PEG-Fe3+/PEI;
4)将功能肽R9溶液加入马来酰亚胺化的PEG-Fe3+/PEI溶液中,反应得到PEG-Fe3+/PEI-R9。
6.权利要求1-4任一所述的基因载体与DNA形成的复合物。
7.根据权利要求6所述的复合物,其特征在于,所述的DNA含报告基因、抗癌基因和/或细胞因子基因。
8.权利要求1-4任一所述的基因载体在制备用于基因治疗的药物中的应用。
9.一种功能肽R9,其特征在于,所述功能肽R9的氨基酸序列为:Arg-Gly-Asp-Cys-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys。
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Legal Events
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---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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