TWI725424B - Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子及其製造方法 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子及其製造方法，製造方法包含：製備一磁性奈米粒子溶液、一Cas9胜肽溶液與一甲殼素微酸溶液；將磁性奈米粒子溶液、Cas9胜肽溶液與甲殼素微酸溶液混合均勻以獲得一混合溶液，並將混合溶液作用1~120分鐘；將混合溶液以磁力作用，以獲得一澄清液與一沉澱物，移除澄清液並保留沉澱物；以純水清洗沉澱物至少一次，以獲得Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子。

Description

Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子及其製造方法

本發明係關於一種Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子及其製造方法，獲得之Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子具專一性辨識Cas9蛋白質之功效。

於生物醫學的相關研究中，常會透過使細胞大量表現特定基因，或是抑制特定基因的表現，以研究該基因的功能以及對生物體的影響。目前用於調控細胞基因表現的方法包含以特定化學物質促進或是抑制基因表現，但是此方法的專一性相當低，且對細胞的影響範圍大，較不適合用於研究單一基因的作用；又，亦可利用載體將表現特定基因的質體DNA運輸到細胞中，或是以載體將抑制特定基因表現的小干擾RNA(siRNA)運輸到細胞中，以促進或是抑制特定基因的表現，但是目前使用的載體例如脂質類載體(如Lipofectamine 2000)或是病毒載體(腺病毒載體、慢病毒載體或是反轉錄病毒載體等等)，對細胞皆具有一定的毒性，且病毒載體亦可能會引起生物體免疫反應，甚至是引起其他副作用，因此在使用上仍需要非常小心。

分子拓印技術係於一高分子物質上拓印一目標分子的形狀，以令高分子物質可專一辨識並吸附目標分子；現今的分子拓印高分子可製備成奈米大小的顆粒以作為載體使用，例如以藥物拓印之高分子顆粒作為藥物載體，將藥物輸送到細胞中進行疾病治療。

今，發明人有鑑於現有蛋白質高分子拓印之技術仍具有改善空間，於是乃一本孜孜不倦之精神，並藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐，而加以改善，並據此研創出本發明。

本發明係關於一種Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子及其製造方法，製得之Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子具專一性辨識Cas9蛋白質之功效。

本發明之Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子，係包含一磁性奈米粒子與以一Cas9胜肽拓印之甲殼素聚合物。

本發明Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子製造方法包含：步驟一，製備一磁性奈米粒子溶液，一Cas9胜肽溶液與一甲殼素微酸溶液；步驟二，將磁性奈米粒子溶液、Cas9胜肽溶液與甲殼素微酸溶液混合均勻以獲得一混合溶液；步驟三，將混合溶液作用1~120分鐘；步驟四，將混合溶液以磁力作用，以使混合溶液分層以獲得一澄清液與第一沉澱物，移除澄清液並保留第一沉澱物；以及步驟五，以純水清洗第一沉澱物至少一次，以獲得本案之Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子。

於本發明之一實施例中，磁性奈米粒子溶液之製造方法係包含：步驟一，將硫酸亞鐵(FeSO₄ ‧7H₂ O)、氯化鐵(FeCl₃ ‧6H₂ O)以及純水混合，以獲得一鐵離子溶液，並將該鐵離子溶液隔水加熱至沸騰；步驟二，於該鐵離子溶液中加入氫氧化鈉以獲得一鐵離子/氫氧化鈉溶液，再以磁力作用於該鐵離子/氫氧化鈉溶液，以獲得一第二沉澱物；以及步驟三：以純水清洗該第二沉澱物，移除純水後再另加入一乾淨的純水，以獲得該磁性奈米粒子溶液。

於本發明之一實施例中，Cas9胜肽溶液係包含一Cas9胜肽，且該Cas9胜肽溶液濃度係介於0.1~1000 μg/mL。

於本發明之一實施例中，Cas9胜肽之序列係選自由SEQ ID NO:1與SEQ ID NO:2所構成之群組。

於本發明之一實施例中，甲殼素微酸溶液係含有0.001~5 wt%甲殼素之醋酸溶液。

於本發明之一實施例中，該混合溶液係於0~37℃下作用1~120分鐘。

於本發明之一實施例中，該混合溶液係於0~4℃下作用10~30分鐘。

藉此，本發明製得之Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子，可以有效辨認並吸附Cas9蛋白質。

本發明之目的及其結構功能上的優點，將依據以下圖面所示，配合具體實施例予以說明，俾使審查委員能對本發明有更深入且具體之瞭解。

本發明係關於一種Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子及其製造方法，所製得的Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子能有效辨識並吸附Cas9蛋白質。

本發明之Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子的製造方法包含步驟一：製備一磁性奈米粒子溶液、一Cas9胜肽溶液與一甲殼素微酸溶液；步驟二：將該磁性奈米粒子溶液、該Cas9胜肽溶液與該甲殼素微酸溶液混合均勻以獲得一混合溶液；步驟三，將該混合溶液於一低溫環境作用10~60分鐘；步驟四：將該混合溶液以磁力作用，以使該混合溶液分層以獲得一澄清液與一第一沉澱物，移除該澄清液並保留該第一沉澱物；以及步驟五：以純水清洗該第一沉澱物至少一次，以獲得該Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子。

此外，藉由下述具體實施例，可進一步證明本發明可實際應用之範圍，但不意欲以任何形式限制本發明之範圍。

一、Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子之製造

(一)、磁性奈米粒子溶液製備

配置一鐵離子溶液，鐵離子溶液中含有0.01~2 M之硫酸亞鐵(FeSO₄ ‧7H₂ O)以及0.02~4 M之氯化鐵(FeCl₃ ‧6H₂ O)，其硫酸亞鐵對氯化鐵濃度比為1:2；取10~1000 mL之鐵離子溶液以隔水加熱的方式加熱到沸騰，再加入1~50 mL的1~14 N氫氧化鈉(NaOH)溶液，以獲得一鐵離子/氫氧化鈉溶液；於此實際實施例中，鐵離子溶液含有0.126 M之硫酸亞鐵(FeSO₄ ‧7H₂ O)以及0.252 M之氯化鐵(FeCl₃ ‧6H₂ O)；製備鐵離子/氫氧化鈉溶液時，係取30 mL之沸騰的鐵離子溶液與10 mL的7 N氫氧化鈉(NaOH)溶液混合。

製備鐵離子/氫氧化鈉溶液時，於加入氫氧化鈉溶液十秒後將鐵離子/氫氧化鈉溶液放置於一強力磁鐵上，此時鐵離子/氫氧化鈉溶液會產生分層並產生一上清液與一沉澱層，將上層之上清液移除；加入30 mL之純水，並與沉澱層攪拌一分鐘以清洗產生的磁性奈米粒子，再將溶液放置於強力磁鐵，利用磁力吸附住磁性奈米粒子以移除上清液；重複上述的清洗步驟至少一次，即至少以純水清洗磁性奈米粒子兩次，並移除上清液；最後加入60 mL之純水，並將溶液以超音波震盪1~60秒鐘以獲得磁性奈米粒子溶液，並保存於4℃。

(二)、甲殼素微酸溶液製備

甲殼素微酸溶液為含有0.001~5 wt%甲殼素之0.1~2 wt%醋酸溶液，於本實施例中係使用含有0.01 wt%甲殼素之醋酸溶液。

(三)、Cas9胜肽溶液製備

將Ca9胜肽溶解於去離子水中，並配置成含有0.001 μg/mL、 0.01 μg/mL 、0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、100 μg/mL以及1000 μg/mL之Cas9胜肽溶液；本實施例中所用的Cas9胜肽序列分別為SEQ ID NO:1與SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:1之胜肽序列為「QLFVEQHKHYLDE」，後續簡稱為胜肽Q；SEQ ID NO:2之胜肽序列為「RRQEDFYPFLKDNR」，後續簡稱為胜肽R。

(四)、甲殼素分子量對甲殼素複合奈米粒子之粒徑影響

使用分子量分別為50~190 K、190~310 K、310~375 K以及370 K之甲殼素，將其溶解於0.1~2 wt%醋酸溶液中，以配置成0.001~5 wt%甲殼素微酸溶液。

取10~2000 μL之甲殼素微酸溶液，與20~4000 μL磁性奈米粒子溶液混合均勻，冰浴，且持續攪拌1~30分鐘，並將作用溫度維持於0~40℃之間，且較佳作用溫度為0~4℃，以使甲殼素包覆於磁性奈米粒子外，此過程亦稱為相變化；將作用完成後的混合液放在強力磁鐵盤上靜置0.5~24小時，以使溶液分層並產生一澄清液層與甲殼素複合奈米粒子層；移除澄清液，再加入0.1~30 mL純水並震盪1~30分鐘，再將混合液放置於強力磁鐵盤上靜置0.5~24小時，並移除澄清液，以完成一次的清洗步驟；重複一次上述之清洗步驟，並於移除澄清液以獲得甲殼素複合奈米粒子，此甲殼素複合奈米粒子並未以胜肽進行分子拓印，故稱為MNIP (Magnetic non-imprinted chitosan)。於本案以下的實施例中，係將250 μL之甲殼素微酸溶液與500 μL磁性奈米粒子溶液混合均勻，冰浴且攪拌10分鐘，並將作用溫度維持在0~4℃之間作用2小時；溶液分層之後，再進行後續的清洗步驟。

利用動態光散射粒徑分析儀(Dynamic light scattering analyser)測量以不同分子量甲殼素製備的MNIP粒徑，並以無甲殼素包覆的奈米磁性粒子作為對照組；請參見第一圖(A)，無包覆甲殼素的奈米磁性粒子(組別「無包覆」)平均粒徑為78 ± 6 nm，以50~190 K甲殼素製備之MNIP平均粒徑為70 ± 10 nm，以190~310 K甲殼素製備之MNIP平均粒徑為72 ± 11 nm，以310~375 K甲殼素製備之MNIP平均粒徑為78 ± 11 nm，以及使用370 K甲殼素製備之MNIP平均粒徑為72 ± 10 nm，顯示甲殼素複合奈米粒子之粒徑與奈米磁性粒子相比，約下降6~8 nm。請再參見第一圖(B)，為奈米磁性粒子與各MNIP之粒徑分布曲線圖，不論是奈米磁性粒子或是各MNIP，其粒徑分布皆落於30~120 nm之間。

由於磁性奈米粒子之超順磁性的特性，使其容易團聚，而以天然高分子物質例如本實施例之甲殼素包覆之後，能有效降低磁性奈米粒子的團聚情形，以降低粒徑；雖然以各種分子量之甲殼素製備的MNIP於粒徑上沒有太大的差異，但因為分子量370 K之甲殼素製備之MNIP的分子量分布較為狹窄，故後續皆選用分子量370 K之甲殼素製備甲殼素複合奈米粒子，以提高甲殼素複合奈米粒子的穩定性。

(五)、Cas9胜肽濃度對Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子之影響

將20~4000 μL之磁性奈米粒子溶液、10~2000 μL之甲殼素微酸溶液，以及30~6000 μL之Cas9胜肽溶液充分混合，並震盪0.5~120分鐘；將混合液持續攪拌1~120分鐘，並將作用溫度維持於0~40℃之間；將混合液放置於強力磁鐵盤上靜置0.5~24小時，以使混合液分層並產生一澄清液層與第一沉澱物；移除澄清液，再加入0.1~30 mL純水並震盪1~30分鐘，再將混合液放置於強力磁鐵盤上靜置0.5~24小時，並移除澄清液，以完成一次的清洗步驟；至少重複一次上述之清洗步驟，並移除澄清液以獲得Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子；使用SEQ ID NO:1胜肽(胜肽Q)所製成的Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子簡稱為MQIP (magnetic peptide Q imprinted polymers)，使用SEQ ID NO:2胜肽(胜肽R)所製成的Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子簡稱為MRIP (magnetic peptide R imprinted polymers)。

於本案以下之實施例中，Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子之製備方法為：將500 μL之磁性奈米粒子溶液、250 μL之甲殼素微酸溶液，以及250 μL之Cas9胜肽溶液充分混合並震盪1分鐘；將混合液冰浴，且持續攪拌1分鐘，並將作用溫度維持於0~4℃之間；將混合液放置於強力磁鐵盤上靜置2小時，以使混合液分層並產生一澄清液層與第一沉澱物；移除澄清液，再加入1 mL純水並震盪5分鐘，再將混合液放置於強力磁鐵盤上靜置1小時，並移除澄清液，以完成一次的清洗步驟，至少重複一次上述之清洗步驟，並移除澄清液以獲得Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子。

請參見第二圖(A)，以0.1~100 μg/mL之胜肽Q溶液製得之MQIP粒徑於純水清洗前為60~80 nm，而請洗後的粒徑為90~100 nm，高於清洗前的粒徑；又，以濃度1~100 μg/mL之胜肽Q溶液製備的MQIP，不論是清洗前或清洗後的粒徑，各組別之間的粒徑變化量約為1~6 nm；根據第二圖(A)，使用濃度1~100 μg/mL之胜肽Q溶液製備的MQIP，粒徑並不會隨著胜肽Q溶液濃度上升而有明顯變化。

請參見第二圖(B)，以不同濃度之胜肽R溶液製備的MRIP，清洗前的粒徑分布於60~80 nm，而清洗後的粒徑分布則落於180~230 nm；其中以0.1~1 μg/mL之胜肽R溶液製備的MRIP，於清洗前與清洗後的粒徑皆隨著使用胜肽溶液濃度的增加而上升；而以濃度1~100 μg/mL之胜肽R溶液製備的MRIP粒徑變化的情形較為緩和，其中清洗前的MRIP粒徑變化量為4~7 nm，而清洗後的MRIP粒徑變化量為15~24 nm。

根據第二圖，不論是MQIP或是MRIP，於清洗後的粒徑都比清洗前大，分別多出24~52 nm與65~180 nm，推測是因為MQIP或MRIP表面拓印的胜肽被純水洗去後會留下胜肽拓印孔洞，因為胺基酸具有不同的親疏水性，疏水性的孔洞會彼此相吸引而團聚，而親水性的拓印孔洞則會分散在水相當中，使MQIP或是MRIP呈現團聚的現象而導致粒徑增加。因理論上當奈米粒子具有越小的粒徑，其比表面積就會越大，能夠吸附目標分子也會越多；而於清洗後之MQIP粒徑比清洗後之MRIP粒徑小60~175 nm，故暗示MQIP的比表面積較大，也具有較高的吸附力。

二、Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子之特性測試

(一)、Cas9胜肽吸附力測試

(1)、不同濃度胜肽拓印之甲殼素複合奈米粒子的再吸附力

將上述製得的MQIP以及MRIP，分別與50 μg/mL之胜肽Q或是胜肽R作用，於20~30℃進行吸附實驗，吸附時間為2分鐘~3小時，再以高壓液向層析儀(high performance liquid chromatography，HPLC)測量MQIP或是MRIP的再吸附量，以測量MQIP與MRIP對於胜肽Q或是胜肽R的再吸附力。其中，使用無拓印胜肽甲殼素複合奈米粒子(MNIP)作為對照組，以計算MQIP以及MRIP的拓印效率(α)。此實施例中，因為用於拓印甲殼素複合奈米粒子的胜肽濃度分別為0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL以及100 μg/mL，因此後續將其所製得的MQIP或是MRIP簡寫為MQIP(0.1)、MQIP(0.5)、MQIP(1)或是MRIP(0.1)、MRIP(0.5)、MRIP(1)等等，以此類推。

請參見表一，為MQIP或是MRIP分別對於胜肽Q以及胜肽R的吸附量；根據表一，MQIP對於胜肽Q的再吸附量都高於MRIP對於胜肽R的吸附量，且MQIP的再吸附量高出MRIP的再吸附量10~23 μg/mg。此外，MNIP對於胜肽Q的吸附量為35.8 ±1.2 μg/mg，MNIP對於胜肽R的吸附量為23.9 ±0.8 μg/mg。

表一

	胜肽Q吸附量		胜肽R吸附量
MQIP(0.1)	28.7 ±2.2 μg/mg	MRIP(0.1)	17.8 ±2.2 μg/mg
MQIP(0.5)	38.2 ±1.4 μg/mg	MRIP(0.5)	26.8 ±0.6 μg/mg
MQIP(1)	39.2 ±2.2 μg/mg	MRIP(1)	29.4 ±1.6 μg/mg
MQIP(5)	37.9 ±1.1 μg/mg	MRIP(5)	25.9 ±1.9 μg/mg
MQIP(10)	32.4 ±3.7 μg/mg	MRIP(10)	18.1 ±0.9 μg/mg
MQIP(100)	27.8 ±0.9 μg/mg	MRIP(100)	20.9 ±3.8 μg/mg

請參見表二與第三圖(A)，為MQIP、MRIP之拓印效率(α)分析圖，拓印效率(α)之計算公式如下：

拓印效率(α)=MQIP或MRIP之再吸附量/MNIP再吸附量

因此α＞1時，表示Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子表面確實有成功拓印出吸附Cas9胜肽的孔洞，故可以吸附更多的Cas9胜肽。

表二

	胜肽Q拓印效率(α)		胜肽R拓印效率(α)
MQIP(0.1)	0.8	MRIP(0.1)	0.74
MQIP(0.5)	1.07	MRIP(0.5)	1.12
MQIP(1)	1.10	MRIP(1)	1.23
MQIP(5)	1.06	MRIP(5)	1.09
MQIP(10)	0.91	MRIP(10)	0.77
MQIP(100)	0.78	MRIP(100)	0.88

根據表二，MQIP(0.1)與MRIP(0.1)的α值皆小於1，表示以 0.1 μg/mL胜肽進行拓印的效果不佳；又，MQIP(0.5)、MQIP(1)、MQIP(5)、MRIP(0.5)、MRIP(1)與MRIP(5)的α值皆大於1，表示以0.5~5 μg/mL胜肽進行拓印所得到的具有Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子的吸附效果佳，且能有效的增加胜肽吸附量，其中又以使用1 μg/mL胜肽進行拓印得到的Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子吸附效果最佳；MQIP(1)的α值為1.10，且MRIP(1)的α值為1.23。當以高濃度胜肽進行拓印時，所製得之甲殼素複合奈米粒子的胜肽再吸附效量並沒有持續增加，如表二所示，MQIP(10)、MQIP(100)、MRIP(10)以及MRIP(100)的α值皆小於1，可能是因為以高濃度胜肽進行拓印，過多的胜肽會使甲殼素複合奈米粒子上的拓印孔洞不完整，進而阻礙甲殼素複合奈米粒子再吸附力。

將進行再吸附後的MQIP與MRIP以清水清洗，並將清洗液進行高效液相層析(high performance liquid chromatography)分析，結果請見第三圖(B)與第三圖(C)，MQIP所吸附胜肽的滯留時間(retention time)為12.76分鐘，確實為胜肽Q，且MRIP吸附胜肽的滯留時間為12.16分鐘，確實為胜肽R。

(2)、Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子對不同濃度胜肽的吸附力

此實施例中係以100 μg/mL胜肽拓印的甲殼素複合奈米粒子(MQIP(100)或MRIP(100))，於4℃下，分別針對胜肽Q以及胜肽R進行再吸附實驗，吸附時間為15分鐘，以測試其在不同濃度胜肽溶液中MQIP與MRIP的吸附情形，另使用未拓印胜肽的MNIP作為對照組，以計算拓印效率(α)；所使用的胜肽溶液濃度包含30 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL以及200 μg/mL。請參見第四圖(A)，於所測試的胜肽濃度範圍內(30~200 μg/mL)，MQIP的再吸附量會隨著胜肽濃度上升而上升；MNIP對於胜肽Q吸附臨界濃度為100 μg/mL，即當胜肽Q溶液濃度高於100 μg/mL時，MNIP對胜肽Q的再吸附量就不會明顯增加。請再參見第四圖(B)，MRIP於胜肽R溶液濃度低於100 μg/mL時，其吸附量會隨著胜肽R溶液濃度上升而提高，但是於胜肽R溶液濃度高於100 μg/mL時，其吸附曲線會漸趨平緩，表示MRIP的胜肽R吸附臨界濃度為100 μg/mL；而當胜肽溶液濃度高於100 μg/mL之後，所增加的吸附胜肽可能是藉由胜肽與胜肽之間的親和力而達成；又MNIP對於胜肽R的吸附臨界濃度為50 μg/mL，低於MNIP對胜肽Q的吸附臨界濃度，此差異是因甲殼素對於胜肽Q與胜肽R有不同的親和力所導致。根據第四圖(A)，MQIP(100)與MNIP相比，於胜肽溶液濃度為100 μg/mL所測得的拓印效率(α)為1.86，於胜肽溶液濃度為150 μg/mL所測得的拓印效率(α)為2.3；根據第四圖(B)，MRIP(100)與MNIP相比，於胜肽溶液濃度為100 μg/mL所測得的拓印效率(α)為1.25，於胜肽溶液濃度為150 μg/mL所測得的拓印效率(α)為4.45。

接著，將所吸附的胜肽溶液濃度固定為50 μg/mL，並改變MQIP(100)與MRIP(100)的吸附時間，以觀察不同吸附時間對於MQIP(100)與MRIP(100)的胜肽再吸附量的影響；請參見第四圖(C)，MQIP(100)與MRIP(100)在吸附時間為1~10分鐘時，所吸附的胜肽量皆會隨著吸附時間上升而增加，但是當吸附時間大於10分鐘後，二者的吸附量增加趨勢會逐漸平緩，表示二者於吸附時間10分鐘之後，吸附量已經接近飽和，故後續將以吸附時間為10分鐘之作用條件進行吸附測試；其中MQIP(100)於吸附時間為10分鐘時，對胜肽Q的吸附量為32.23 μg/mg，而MRIP(100)於吸附時間為10分鐘時，對胜肽R的吸附量為15.92 μg/mg。

(3)、Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子的競爭吸附測試

將未拓印之甲殼素複合奈米粒子(MNIP)以及以100 μg/mL胜肽拓印的甲殼素複合奈米粒子(MQIP(100)與MRIP(100))，分別進行胜肽Q與胜肽R的吸附實驗，並觀察各種甲殼素複合奈米粒子對於胜肽Q或胜肽R的吸附情形；請參見第五圖(A)，為MQIP(100)或MRIP(100)所吸附之胜肽種類分析圖，結果顯示所吸附之胜肽確實為胜肽Q或是胜肽R；再請參見第五圖(B)，在胜肽Q的吸附實驗中，MQIP(100)具有最高的胜肽Q吸附量，其次為MNIP，而胜肽Q吸附量最少的為MRIP(100)，其中MQIP(100)對於胜肽Q的吸附量比MRIP(100)對胜肽Q之吸附量高出52%。在胜肽R的吸附實驗中，MNIP與MRIP(100)具有較佳的胜肽R吸附量，而MQIP(100)之胜肽R的吸附量最少，其中MRIP(100)對胜肽R的吸附量比MQIP(100)對胜肽R的吸附量高出7.8%。因為MNIP對於胜肽R的吸附量高於MNIP對胜肽Q的吸附量，顯示甲殼素本身對於胜肽R具有較高的親和力；根據此實驗結果，可知MQIP相比於MRIP具有較佳的胜肽辨識專一性。

(二)、Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子之比表面積分析結果

將以100 μg/mL胜肽拓印之MQIP與MRIP(MQIP(100)與(MRIP(100))，測量其以純水清洗前與清洗後的比表面積；請參見第六圖，MQIP(100)於清洗前的比表面積為224.6 m² /g，清洗後的比表面積為559.9 m² /g，增加了335.3 m² /g；而MRIP(100)於清洗前的比表面積為183.4 m² /g，清洗後的比表面積為205.9 m² /g，增加了22.5 m² /g；可知於製備過程中以純水清洗Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子，確實可以移除甲殼素上拓印的胜肽，並留下拓印得到的孔洞；又清洗後的MQIP(100)比表面積比清洗後MRIP(100)的比表面積高出312.8 m² /g，此結果與MQIP(100)的吸附力高於MRIP(100)吸附力的實驗結果相呼應。

(三)、Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子之磁通量測試

取Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子(MQIP與MRIP)以及無包附甲殼素的磁性奈米粒子(MNP)，以超導量子干涉儀(Superconducting quantum interference device， SQUID)測量其磁通量；請參見第七圖(A)與第七圖(B)，當正向外加磁場增加時，MNP、清洗前後的MQIP與清洗前後的MRIP之磁通量密的也會隨之增加至出現飽和，並沒有出現鐵磁性材料的磁滯現象；而當外加磁場逐漸降低至0時，MNP、清洗前後的MQIP與清洗前後的MRIP之磁通量密度也會降低，最後降低至0；而反向外加磁場增加時，MNP、MQIP與MRIP的磁通量密度亦會隨之增加至出現飽和；此結果顯示不論是清洗前或清洗後，MQIP與MRIP皆具備超順磁性的特徵。

根據第七圖，無包附甲殼素的磁性奈米粒子(MNP)的磁通量為-55.8~55.8 emu/g，清洗前的MQIP磁通量為-49.1~49.1 emu/g、清洗後的MQIP磁通量為-52.8~52.9 emu/g、清洗前的MRIP磁通量為-48.3~48.3 emu/g、以及清洗後的MRIP磁通量為-49.4~49.5 emu/g；MNP的磁力表現皆比MQIP以及MRIP優良，可能是因為四氧化三鐵(Fe₃ O₄ )等磁性物質於胜肽拓印甲殼素之後，其超順磁性會受到影響。又，清洗後的MQIP與MRTP的磁通量會高於清洗前的磁通量，MQIP清洗後的磁通量的增加量為-3.7~3.8 emu/g，且MRIP清洗後的磁通量的增加量為-1.1~1.2 emu/g，推測可能的原因為清洗後的MQIP與MRIP樣品質量改變所致。

(四)、Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子之細胞毒性測試

本試驗係使用1 μg/mL胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子(MQIP(1)與MRIP(1))以及無胜肽拓印之甲殼素複合奈米粒子(MNIP)，以濃度1~1000 μg/mL的條件下與HEK293細胞(human embryonic kidney 293 cells)，共同培養12~48小時，由於甲殼素帶有正電性，因此細胞會藉由胞飲作用(pinocytosis)進入細胞中；於培養後以顯微鏡觀察細胞型態，並使用MTT存活試驗檢測細胞的存活率；此外，亦利用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino- 2-phenylindole)染劑(DAPI染劑)進行細胞核染色，且定量細胞發螢光的區域以作為細胞存活的指標；請參見第八圖(A)，為MTT存活試驗的定量結果，於MQIP粒子的MTT試驗結果中，於添加濃度介於1~100 μg/mL時，細胞的存活率介於82~100%之間且沒有明顯的改變；於添加MNIP或是MRIP粒子的MTT試驗結果中，在甲殼素複合奈米粒子使用濃度為1~100 μg/mL時，細胞的存活率介於82~100%之間，但是當使用濃度高於100 μg/mL時，可能是因為甲殼素複合奈米粒子的添加量過多，造成ELISA測定上有誤差，因此細胞存活率會有突然升高的現象，因此另外以DAPI染色進行測試，再於染色後針對發螢光的區域進行定量，定量結果請參見第八圖(B)；根據第八圖(B)，與無使用甲殼素複合奈米粒子的細胞相比，不論是MNIP、MQIP(1)或是MRIP(1)，於使用濃度1000 μg/mL時，DAPI染色後發螢光的面積並沒有明顯改變，表示在使用濃度1000 μg/mL時，MNIP、MQIP(1)或是MRIP(1)也不會對細胞產生明顯的毒性。

三、Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子之功效測試

(一)、Cas9融合蛋白之表現

以下實施例中所使用的Cas9融合蛋白質，係將不具有內切酶(endonuclease)活性的突變型Cas9基因(dCas9)，與具有活化轉錄(transcription)活性的蛋白質基因，以分子生物技術融合後以獲得一質體DNA，再將該質體DNA轉染到細胞中，令細胞表現出Cas9融合蛋白質(fusion protein)。本實施例使用的Cas9融合蛋白質分別為將dCas9與Suntag融合的Cas9-Suntag融合蛋白、將dCas9與P300融合之Cas9-P300融合蛋白，以及將dCas9與VP64-p65-Rta(VPR)融合之Cas9-VPR融合蛋白；此質體DNA係由中研院購得。

(二)、Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子之Cas9蛋白質吸附力

將HEK293細胞培養於10公分細胞培養盤中，培養隔夜後轉染表現Cas9-Suntag、Cas9-P300或是Cas9-VPR之質體DNA，並於轉染後24小時萃取細胞蛋白質，蛋白質萃取皆於低溫操作，萃取步驟簡述如下：將培養盤中的培養液移除，並以1 X PBS緩衝液(Phosphate buffered saline)清洗細胞至少一次，再將1 X PBS緩衝液吸乾；於培養盤中加入蛋白質萃取溶液(lysis buffer)以及蛋白酶抑制劑(protease inhibitor)，並於0~4℃作用2~120分鐘；以刮勺收集細胞液，並將細胞液以超音波震盪器震盪10~120秒；將細胞液以轉速1000 rpm離心10分鐘，收集上清液並分裝，以獲得蛋白質萃取液。

將含有20-2000 μg蛋白質之蛋白質萃取液與1-100 mg之MNIP、MQIP或是MRIP混合，並於冰上作用1-60 分鐘，再利用強力磁鐵將MNIP、MQIP或是MRIP與蛋白質萃取液分離後，移除蛋白質萃取液，留下甲殼素複合奈米粒子；將所獲得的甲殼素複合奈米粒子進行免疫螢光染色，以觀察甲殼素複合奈米粒子上吸附Cas9融合蛋白質的情形；接著，再以0.1~10 mL清水清洗與蛋白質萃取液作用完畢的MNIP、MQIP或是MRIP，使MNIP、MQIP或是MRIP所吸附的蛋白質與甲殼素複合奈米粒子分離，收集清洗液，並以酵素免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)分析清洗液中的Cas9融合蛋白質含量。

請參見第九圖，為MNIP、MNQP與MNRP吸附實驗的ELISA分析結果，結果顯示三種甲殼素複合奈米粒子對於Cas9-Sungtag的吸附量最多，其吸附量可以是Cas9-VPR或Cas9-P300萃取量的4~5倍；又，MQIP對於Cas9-Suntag的萃取量與MRIP對Cas9-Suntag的吸附量相比高出25%，MQIP對於Cas9-VPR的吸附量與MRIP對Cas9-VPR的吸附量相比高出66%；但是於Cas9-P300的吸附能力上，MQIP與MRIP的吸附量差異不大。根據以上實驗結果，MQIP不論是對吸附胜肽的專一性，或是對融合蛋白質的吸附能力，都比MRIP好。

請再參見第十圖，為MQIP吸附三種Cas9融合蛋白質的免疫螢光染色結果，結果顯示MQIP都可以有效吸附Cas9-Suntag、Cas9-P300以及Cas9-VRP三種融合蛋白。

由上述之實施說明可知，本案製得之Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子內包含了磁性奈米粒子，因此於製備或是純化時皆相當方便；又本案之Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子確實能專一辨識Cas9蛋白質並有效吸附Cas9蛋白質。

綜上所述，本發明之Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子及其製造方法，的確能藉由上述所揭露之實施例，達到所預期之使用功效，且本發明亦未曾公開於申請前，誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請，懇請惠予審查，並賜准專利，則實感德便

惟，上述所揭之說明，僅為本發明之較佳實施例，非為限定本發明之保護範圍；大凡熟悉該項技藝之人士，其所依本發明之特徵範疇，所作之其它等效變化或修飾，皆應視為不脫離本發明之設計範疇。

無

第一圖(A)：磁性奈米粒子與無拓印甲殼素複合奈米粒子粒徑分析圖。

第一圖(B)：磁性奈米粒子與無拓印甲殼素複合奈米粒子粒徑分布圖。

第二圖(A)：胜肽Q拓印甲殼素複合奈米粒子之粒徑分析圖。

第二圖(B)：胜肽R拓印甲殼素複合奈米粒子之粒徑分析圖。

第三圖(A)：Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子拓印效率分析圖。

第三圖(B)：胜肽Q拓印甲殼素複合奈米粒子吸附胜肽種類分析圖。

第三圖(C)：胜肽R拓印甲殼素複合奈米粒子吸附胜肽種類分析圖。

第四圖(A)：胜肽Q拓印甲殼素複合奈米粒子再吸附能力分析圖。

第四圖(B)：胜肽R拓印甲殼素複合奈米粒子再吸附能力分析圖。

第四圖(C)：吸附時間對於胜肽再吸附量影響之分析圖。

第五圖(A)：Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子吸附胜肽種類分析圖。

第五圖(B)：Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子胜肽吸附量分析圖。

第六圖：Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子比表面積分析圖。

第七圖(A)：胜肽Q拓印甲殼素複合奈米粒子磁通量分析圖。

第七圖(B)：胜肽R拓印甲殼素複合奈米粒子磁通量分析圖。

第八圖(A)：胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子之細胞毒性分析圖。

第八圖(B)：胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子之細胞存活率分析圖。

第九圖：Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子之Cas9吸附能力分析圖。

第十圖：胜肽Q拓印甲殼素複合奈米粒子吸附Cas9免疫螢光染色分析圖。

無

Claims (7)

1. 一種Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子的製造方法，包含：步驟一：製備一磁性奈米粒子溶液、一Cas9胜肽溶液與一甲殼素微酸溶液，其中該Cas9胜肽之序列係選自由SEQ ID NO：1與SEQ ID NO：2所構成之群組；步驟二：將該磁性奈米粒子溶液、該Cas9胜肽溶液與該甲殼素微酸溶液混合均勻以獲得一混合溶液，並將該混合溶液作用10~60分鐘；步驟三：將該混合溶液以磁力作用，以使該混合溶液分層以獲得一澄清液與一第一沉澱物，移除該澄清液並保留該第一沉澱物；步驟四：以純水清洗該第一沉澱物至少一次，以獲得該Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子。
2. 如請求項1所述之Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子的製造方法，其中該磁性奈米粒子溶液之製造方法係包含：步驟一：將硫酸亞鐵(FeSO₄‧7H₂O)、氯化鐵(FeCl₃‧6H₂O)以及純水混合，以獲得一鐵離子溶液，並將該鐵離子溶液隔水加熱至沸騰；步驟二：於該鐵離子溶液中加入氫氧化鈉以獲得一鐵離子/氫氧化鈉溶液，再以磁力作用於該鐵離子/氫氧化鈉溶液，以獲得一第二沉澱物；步驟三：以純水清洗該第二沉澱物，移除純水後再另加入一乾淨的純水，以獲得該磁性奈米粒子溶液。
3. 如請求項1所述之Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子的製造方法，其中該Cas9胜肽溶液係包含一Cas9胜肽，且該Cas9胜肽溶液濃度係介於0.1~1000μg/mL。
4. 如請求項1所述之Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子的製造方法，其中該甲殼素微酸溶液係含有0.001~5wt%甲殼素之醋酸溶液。
5. 如請求項1所述之Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子的製造方法，其中該混合溶液係於0~37℃下作用1~120分鐘。
6. 如請求項5所述之Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子的製造方法，其中該混合溶液係於0~4℃下作用10~30分鐘。
7. 一種以請求項1至請求項6其中任一項所述之製造方法製得的Cas9胜肽拓印甲殼素複合奈米粒子，係包含一以Cas9胜肽拓印之甲殼素聚合物與複數個磁性奈米粒子。

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