CN107519501A - 一种铁磁性纳米材料及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种铁磁性纳米材料，内核为四氧化三铁纳米立方体，中间层采用聚已内酯和油酸修饰，外层通过静电吸引作用修饰阳离子聚合物；所述中间层包括两层油酸以及连接两层油酸疏水端的聚已内酯。本发明还涉及该铁磁性纳米材料的制备及应用，该铁磁性纳米材料能够稳定分散在水相体系，并实现对干细胞的高效标记和MRI T2加强成像。

Description

一种铁磁性纳米材料及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及磁性纳米材料技术领域，具体涉及一种铁磁性纳米材料及制备方法和应用。
背景技术
干细胞治疗是近年来出现的一种新型疾病治疗手段。由于干细胞具有分化为特定细胞的潜能，同时能够分泌一些细胞因子参与受损组织的修复，因此已经被广泛应用于组织再生、脑缺血、心肌梗死以及肝脏损伤等疾病的治疗研究。临床上，干细胞治疗也已被用于对骨和软骨损伤等的修复治疗。
然而，当前干细胞治疗依然面临着诸多挑战。其中一个重要的瓶颈问题，便是如何对移植的干细胞进行特异性标记以便对其输入体内后的命运过程进行非侵袭性示踪。因此，设计一种对干细胞友好的细胞标记和造影材料便显得十分迫切。
氧化铁纳米粒(IONPs)被认为是一种潜在的良好磁共振成像(MRI)造影剂，其可以缩短水质子的横向弛豫时间，使输出的磁共振信号减弱，从而使磁共振成像图像变暗，即所谓的T2成像。作为造影剂，IONPs的最大优势在于其制备工艺相对简单，易于大规模的工业生产，同时相比一些其他金属造影剂其对细胞几乎无毒性，具有较好的安全性，因而在对干细胞的标记和造影上具有较好的应用前景。
然而，当前多数作为造影剂使用的IONPs如Feridex，其MRI成像能力(T2加权值)却受制于自身的多分散性和超顺磁性而并不十分理想。理论上，铁磁性的IONPs相比顺磁性或者超顺磁性的IONPs具有更好的T2加权值。但是，传统的共沉淀法或者水热法等方法制备的IONPs却由于尺寸效应，多分散性和较差的结晶性而很难制备较小纳米尺寸的铁磁性IONPs。虽然，增大IONPs的尺寸可以改善其磁性特征，但是尺寸的增加又会影响细胞对IONPs的摄取，从而影响IONPs对细胞的标记效率。
采用新一代热分解法，在非极性溶剂中可以获得单分散性和结晶性俱佳、且尺寸均一可控的IONPs。同时，还可以通过对反应条件的优化来控制纳米晶体的成核和生长过程，进而控制纳米粒的形貌(如立方体形貌)，从而实现在较小纳米尺寸下制备铁磁性IONPs的目的，进而获得较高的细胞标记效率和成像能力。但是，不同于传统的共沉淀法或者水热法在水相体系中直接获得IONPs，采用这一方法制备的IONPs往往只能较好地分散于非极性溶剂中，一旦转入水相体系就容易发生纳米粒的沉聚，这就给他们进一步在细胞上的的应用带来了困难。
因此，研发一种具有较小的纳米尺寸，良好的铁磁性和单分散性，且能在水相体系中稳定分散的铁磁性纳米材料，有望为解决当前干细胞治疗所面临的非侵袭示踪难题提供一种切实可行的解决方案，具有十分重要的科学研究价值和临床治疗意义。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种铁磁性纳米材料及制备方法和应用，该铁磁性纳米材料能够稳定分散在水相体系中，并能够实现对干细胞的高效标记和MRI T2加强成像。
本发明解决上述技术问题所提供的技术方案为：
一种铁磁性纳米材料，内核为四氧化三铁纳米立方体，中间层采用聚已内酯和油酸修饰，外层通过静电吸引作用修饰阳离子聚合物；所述中间层包括两层油酸以及连接两层油酸疏水端的聚已内酯。
上述技术方案中，以四氧化三铁纳米立方体(FION)为内核，采用双层油酸(OA)和聚已内酯(PCL)修饰，PCL连接两层OA的疏水端，使外层OA的亲水端暴露于铁磁性纳米立方体的外表面，从而实现FION从油相至水相的相转化，并稳定分散在水相体系中。
再通过静电吸引作用修饰阳离子聚合物，由于铁磁性纳米立方体的外表面为带负电荷的OA，可与阳离子聚合物通过静电吸引作用相互结合，最终通过自组装反应获得表面带正电荷的铁磁性纳米材料。正电荷的存在有利于提高铁磁性纳米材料被细胞摄取的效率，从而实现铁磁性纳米材料对细胞的高效标记。同时，正电荷间的相互排斥作用也有利于提高铁磁性纳米材料在水相体系中的分散性和稳定性，减少因FION的铁磁性而导致的纳米粒间的聚集。
优选的，所述铁磁性纳米材料的粒径为25～50nm。
优选的，所述阳离子聚合物选自支状聚乙烯亚胺、线状聚乙烯亚胺、精胺、聚赖氨酸、丙二胺、壳聚糖或β-氨基酯。进一步优选为支状聚乙烯亚胺(PEI-25k)。
本发明还提供一种如上述的铁磁性纳米材料的制备方法，包括如下步骤：
1)通过热分解法，利用油酸还原乙酰丙酮铁，得到四氧化三铁纳米立方体；
2)将四氧化三铁纳米立方体分散于混合溶剂中，分别加入聚已内酯和油酸，反应得到能在水相体系中稳定分散的铁磁性纳米立方体；
3)将溶解有过量阳离子聚合物的混合溶剂加入到步骤2)中的铁磁性纳米立方体的反应体系中，相转化反应得到表面带正电荷的铁磁性纳米材料。
优选的，所述步骤1)中得到的四氧化三铁纳米立方体的粒径为22～35nm。进一步优选为22～25nm。上述粒径范围可在保证纳米粒较好的铁磁性特征的前提下，又不因纳米粒磁性过强而导致纳米粒间的聚集。同时，较小的粒径也有利于纳米粒被干细胞的摄取。
优选的，所述步骤1)中热分解法可以采用现有的方法，所合成的FION具有良好的铁磁性，同时也使该铁磁性纳米材料具有良好的磁共振(MR)成像能力。
优选的，所述步骤1)中热分解法具体为：将乙酰丙酮铁、联苯-4-羧酸、油酸和溶剂二苄醚混合后，抽真空，快速升温至280～320℃使纳米粒成核，然后继续在上述温度下加热，使纳米粒结晶生长，最终得到所需的四氧化三铁纳米立方体。反应所得的产物用乙醇洗净后重悬于氯仿中保存。进一步优选，所述乙酰丙酮铁、联苯-4-羧酸、油酸和溶剂二苄醚的质量比为0.5～1:0.2～0.6:1～1.5:10.4。所述升温速率为20℃/分钟；所述结晶生长温度为290℃。不同的结晶生长时间可以获得不同尺寸的纳米立方体，优选的，所述结晶生长时间为30分钟。
优选的，所述步骤2)和步骤3)中的混合溶剂选自氯仿、二氯甲烷、环己烷、正己烷和二氧六环中的一种与四氢呋喃的混合溶剂。进一步优选为氯仿与四氢呋喃的混合溶剂，体积比为1:1。
优选的，所述步骤2)中四氧化三铁纳米立方体、聚已内酯和油酸的质量比为8～12:2～5:1。通过对质量比的控制，可以调节FION表面聚合物层的修饰厚度，从而调节铁磁性纳米立方体在水相体系中的稳定性和与阳离子聚合物的结合率。对于不同尺寸的FION内核，其最优质量比会有所差异。以尺寸在22～25nm的FION为例，优选的，质量比为10:2:1，该质量比下可以获得稳定性和单分散性最好的铁磁性纳米立方体。
优选的，所述步骤3)中阳离子聚合物可以为各种阳离子聚合物，如支状聚乙烯亚胺、线状聚乙烯亚胺、精胺、聚赖氨酸、丙二胺、壳聚糖或β-氨基酯。进一步优选，所述阳离子聚合物在分子量为25k的支状聚乙烯亚胺。
优选的，所述步骤3)中相转化反应是指：向反应体系中加入双蒸水并超声得到稳定的褐色乳剂，减压蒸发除去混合溶剂中的有机相，并用双蒸水反复清洗分离产物，得到铁磁性纳米材料。该材料可以保存于4℃的环境中。进一步优选，所述混合溶液与双蒸水的体积比为3:7至4:5之间，更优选为4:5，有机相与水相的比例对于乳剂的形成和稳定性具有重要影响；所述超声功率为500W，超声时间为5min；所述减压蒸发压力在0.06～0.07Pa，蒸发时间在4h以上。
本发明还提供一种如上述的铁磁性纳米材料在干细胞标记中的应用。由于该铁磁性纳米材料能够被干细胞高效内吞并滞留在细胞质中，因而可实现对干细胞的高效标记。
本发明还提供一种如上述的铁磁性纳米材料在制备核磁共振T2造影剂中的应用。由于其较好的弛豫率使得被标记的干细胞能在临床常用的3T MRI下即实现较为灵敏的细胞成像。
同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
(1)本发明中的铁磁性纳米材料可在较小纳米尺寸下保持铁磁性，具有良好的单分散性，并能稳定分散在水相体系中，可用于干细胞的高效标记和作为MRI T2造影剂，在干细胞的标记和造影方面具有很好的研究及应用前景。
(2)本发明中的铁磁性纳米材料制备方法简便，尺寸可控，形貌均一，在水相体系中可长期稳定分散。克服了现有磁性材料单分散性差、容易沉聚、不易长期储存等缺点，且成本低廉，可大量生产，适用性广，推广性强。
附图说明
图1a为实施例1制备四氧化三铁纳米立方体的合成示意图，图1b为所合成的四氧化三铁纳米立方体的TEM图、高分辨TEM图和衍射环图；图1c为所合成的四氧化三铁纳米立方体的SEM图；
图2a为铁磁性纳米材料的结构示意图；图2b为实施例3中合成的铁磁性纳米材料的TEM图，图2c为实施例3中合成的铁磁性纳米材料的SEM图；
图3为实施例中合成的FION、FION@OA/PCL和FION@OA/PCL-PEI的红外光谱图；
图4为实施例3中合成的铁磁性纳米材料对外加磁场的响应图及磁滞曲线；
图5为实施例3中合成的铁磁性纳米材料标记后的人脐带血间质干细胞采用普鲁士蓝染色后的显微镜图；
图6为实施例3中合成的铁磁性纳米材料的浓度-弛豫率曲线；
图7为不同数目的经实施例3中合成的铁磁性纳米材料标记的人脐带血间质干细胞在MRI下的T2造影图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例和说明书附图对本发明作进一步说明。
实施例1：四氧化三铁纳米立方体(FION)的合成
准确称取0.706g乙酰丙酮铁，0.4g联苯-4-羧酸和1.27g油酸，然后加入高沸点溶剂二苄醚10.4g，搅拌下混合均匀。混合溶液在室温下抽真空1h，然后采用控温仪以20℃/min的速率升温至290℃左右，随后在该温度下继续保持加热0.5h，然后迅速冷却至室温，产物用乙醇洗净后重悬于氯仿中保存，所得的纳米立方体尺寸在22-25nm。
实施例2：四氧化三铁纳米立方体(FION)的合成
准确称取0.706g乙酰丙酮铁，0.4g联苯-4-羧酸和1.27g油酸，然后加入高沸点溶剂二苄醚10.4g，搅拌下混合均匀。混合溶液在室温下抽真空1h，然后采用控温仪以20℃/min的速率升温至300℃左右，随后在该温度下继续保持加热1h，然后迅速冷却至室温，产物用乙醇洗净后重悬于氯仿中保存，所得的纳米立方体尺寸在30-35nm。
实施例3：铁磁性纳米材料的合成
1)将实施例1中合成的四氧化三铁纳米立方体(FION)、聚已内酯(PCL)和油酸(OA)按质量比10:2:1，先后加入4mL氯仿和四氢呋喃的混合溶剂中(vol/vol＝1)，机械搅拌下以400rpm速率搅拌2h。
2)称取过量PEI，待在4mL氯仿和四氢呋喃的混合溶剂中(vol/vol＝1)充分溶解后，搅拌下逐滴加入至上述1)中的混合溶液中，以400rpm速率继续搅拌2h。
3)向上述2)中的混合溶液加入10mL双蒸水，500W功率下探头超声5min，得到均匀的褐色乳剂，旋转蒸发仪下减压蒸发除去有机溶剂，获得稳定分散于水相体系中的铁磁性纳米材料。将所获溶液离心后继续双蒸水反复清洗至少3遍，除去残留的有机溶剂和过量的游离PEI。最终得到表面为正电荷的尺寸均一的铁磁性纳米材料。
实施例4：铁磁性纳米材料的合成
将实施例1中合成的四氧化三铁纳米立方体(FION)、聚已内酯(PCL)和油酸(OA)按质量比10:5:1，先后加入4mL氯仿和四氢呋喃的混合溶剂中(vol/vol＝1)，机械搅拌下以400rpm速率搅拌2h，随后操作步骤同实施例3，最终得到表面为正电荷的尺寸均一的铁磁性纳米材料。
实施例5：铁磁性纳米材料的合成
1)将实施例1中合成的四氧化三铁纳米立方体(FION)、聚已内酯(PCL)和油酸(OA)按质量比10:2:1，先后加入4mL二氯甲烷和四氢呋喃的混合溶剂中(vol/vol＝1)，机械搅拌下以400rpm速率搅拌2h。
2)称取过量PEI，待在4mL二氯甲烷和四氢呋喃的混合溶剂中(vol/vol＝1)充分溶解后，搅拌下逐滴加入至上述1)中的混合溶液中，以400rpm速率继续搅拌2h。
3)向上述2)中的混合溶液加入10mL双蒸水，500W功率下探头超声5min，得到均匀的褐色乳剂，旋转蒸发仪下减压蒸发除去有机溶剂，获得稳定分散于水相体系中的铁磁性纳米材料。将所获溶液离心后继续双蒸水反复清洗至少3遍，除去残留的有机溶剂和过量的游离PEI。最终得到表面为正电荷的尺寸均一的铁磁性纳米材料。
表征实验
(1)四氧化三铁纳米立方体(FION)的电镜图
取实施例1合成的四氧化三铁纳米立方体，适量稀释后，滴加于涂有超薄碳膜的铜网上，分别在透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)下观察FION的形貌。
图1a为四氧化三铁纳米立方体的合成示意图，图1b为其TEM图、高分辨TEM图和衍射环图，图1c为其SEM图。由图可知合成的纳米粒为单分散的立方体，具有较好结晶性。
(2)铁磁性纳米材料的电镜图
取实施例3合成的分散于水相体系中的铁磁性纳米材料，适量稀释后，滴加于涂有超薄碳膜的铜网上，分别在透射电镜(TEM)和扫描电镜(SEM)下观察聚合物在FION表面的修饰情况。
图2a为铁磁性纳米材料的结构示意图，可知该材料由三层结构组成，内核为四氧化三铁纳米立方体，中间层采用聚已内酯和油酸修饰，外层通过静电吸引作用修饰阳离子聚合物。
结果如图2b所示，TEM结果显示FION表面修饰有明显的聚合物层，厚度约为3.16nm；如图2c所示，SEM结果进一步证明聚合物已被修饰至FION表面。由此证明，OA/PCL-PEI被成功修饰至了FION表面。
(3)红外光谱(IR)分析
将实施例1合成的FION固体、实施例3步骤1)合成的未修饰PEI的磁性纳米立方体(FION@OA/PCL)以及实施例3合成的铁磁性纳米材料(FION@OA/PCL-PEI)分别与溴化钾以质量比1:10于玛瑙研钵中研细混匀，进行红外光谱分析，获得三者的透光率，结果如图3所示。
在FION@OA/PCL中可以观察到PCL的特征峰：ν(C＝O)＝1736cm-1，表明PCL被成功合成至了FION表面。但是进一步修饰PEI后，其PCL特征峰明显变弱，原因可能是PEI的修饰包覆住了PCL。同时，在FION@OA/PCL-PEI的红外图谱上出现了PEI上的氨基特征峰：δ(NH+)＝1656cm-1，由此表明PEI被修饰至了OA/PCL的外层。
(4)磁场响应性及铁磁性考察
将实施例3合成的分散于水相体系中的纳米材料，放置于钴镍磁铁旁，考察铁磁性纳米材料对外加磁场的响应性。同时，测定该铁磁性纳米材料的磁滞曲线。结果如图4所示，该纳米材料对外加磁场表现出了非常快速的响应性，磁滞曲线进一步表明该磁性纳米材料呈现出明显的铁磁性特征。
应用例1：铁磁性纳米材料用于干细胞的标记
(1)对干细胞的高效标记
以人脐带血来源的间质干细胞(hMSC)为例，利用实施例3合成的铁磁性纳米材料来高效标记hMSC，具体步骤如下：
1)将1×105个hMSC接种于直径为10mm培养皿中，5％CO2，37℃下培养24h；
2)将灭菌后的铁磁性纳米材料用磷酸缓冲液(pH＝7)稀释成铁离子浓度为15μg/mL的溶液；
3)将上述1)接种后的细胞弃去培养液，用磷酸缓冲液(pH 7.4)漂洗两次，加入1.5mL不含血清的hMSC培养液，然后加入80μL上述2)配制的溶液；
4)5％CO2，37℃下孵育1h后，弃去培养液，并重新更换为含10％胎牛血清的hMSC培养液，继续培养24h后完成细胞标记。
(2)普鲁士染色观察细胞标记效率
采用普鲁士蓝染色来显色被干细胞内吞的铁磁性纳米材料，从而观察铁磁性纳米材料对hMSC的标记效率。同时，hMSC采用Nuclear fast red染色来显色。具体步骤如下：
1)普鲁士蓝染液的配制：分别配制10wt.％的亚铁氰化钾溶液(100mg/mL)和20vol.％的盐酸溶液。临用时，将上述两种溶液混合后使用。
2)Nuclear fast red染液的配制：分别称取0.2g Nuclear fast red试剂和10g硫酸铝，加入200mL双蒸水，搅拌下加热至近沸腾。过夜冷却后，抽滤除去不溶的杂质，即获得Nuclear fast red染液。
3)染色时，先用4％多聚甲醛固定hMSC(10min)，磷酸缓冲液(pH 7.4)漂洗三次，加入新鲜配制的普鲁士蓝染液，室温下染色20min。显微镜下检查染色效果。然后，磷酸缓冲液(pH 7.4)漂洗三次，除去多余的普鲁士蓝染液，加入Nuclear fast red染液，继续染色10min，磷酸缓冲液(pH 7.4)漂洗三次除去多余染料，显微镜下观察染色结果，结果如图5所示。
由图5可知，黑色为铁磁性纳米材料，深灰为细胞核，浅灰为细胞质，说明铁磁性纳米材料基本分布在每个细胞的细胞质中，具有良好的细胞标记效率，因此可以用于干细胞的高效标记。
应用例2：铁磁性纳米材料用于标记后干细胞的磁共振造影(MRI)
(1)T2加权值测定
将实施例3合成的铁磁性纳米材料用双蒸水按铁离子浓度稀释成系列浓度：0.1000mM，0.0875mM，0.075 0mM，0.0625mM，0.0375mM。然后利用3.0T MRI(GE Healthcare)进行T2扫描，并测定相应浓度的弛豫率，绘制浓度-弛豫率曲线，从而计算相应的T2加权值，结果如图6所示。
由图6可知，该铁磁性纳米材料在临床常用的3.0T MRI下的T2加权值为310.92mM- 1S-1，具有较好的T2成像潜力。
(2)铁磁性纳米材料标记的hMSC用于MRI造影
按上述应用例1(1)中获得的标记有铁磁性纳米材料的hMSC，胰酶消化计数后，分别加入不同量磷酸缓冲液(pH 7.4)使稀释成不同细胞数目的样品(106、105、104、102个细胞)。1200rpm转速下离心5min，获得细胞沉淀，弃去上清液后，趁热加入100μL 1％的琼脂糖凝胶使细胞沉淀固定。然后利用3.0T MRI对上述不同细胞数目的样品进行T2扫描，获得不同细胞数目的T2造影图，结果如图7所示。
由图7可见，铁磁性纳米材料标记后的hMSC相比水溶液呈现了明显的T2信号加强，且细胞数目与T2信号强弱成正比关系。由此说明，该铁磁性纳米材料可以作为hMSC的良好T2造影剂。

Claims (10)

1.一种铁磁性纳米材料，其特征在于，内核为四氧化三铁纳米立方体，中间层采用聚已内酯和油酸修饰，外层通过静电吸引作用修饰阳离子聚合物；所述中间层包括两层油酸以及连接两层油酸疏水端的聚已内酯。
2.根据权利要求1所述的铁磁性纳米材料，其特征在于，所述铁磁性纳米材料的粒径为25～50nm。
3.根据权利要求1所述的铁磁性纳米材料，其特征在于，所述阳离子聚合物选自支状聚乙烯亚胺、线状聚乙烯亚胺、精胺、聚赖氨酸、丙二胺、壳聚糖或β-氨基酯。
4.如权利要求1～3任一所述的铁磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)通过热分解法，利用油酸还原乙酰丙酮铁，得到四氧化三铁纳米立方体；
2)将四氧化三铁纳米立方体分散于混合溶剂中，分别加入聚已内酯和油酸，反应得到能在水相体系中稳定分散的铁磁性纳米立方体；
3)将溶解有过量阳离子聚合物的混合溶剂加入到步骤2)中的铁磁性纳米立方体的反应体系中，相转化反应得到表面带正电荷的铁磁性纳米材料。
5.根据权利要求4所述的铁磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中得到的四氧化三铁纳米立方体的粒径为22～35nm。
6.根据权利要求4所述的铁磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中热分解法具体为：将乙酰丙酮铁、联苯-4-羧酸、油酸和溶剂二苄醚混合后，抽真空，快速升温至280～320℃使纳米粒成核，然后继续在上述温度下加热，使纳米粒结晶生长，最终得到所需的四氧化三铁纳米立方体。
7.根据权利要求4所述的铁磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，所述步骤2)和步骤3)中的混合溶剂选自氯仿、二氯甲烷、环己烷、正己烷和二氧六环中的一种与四氢呋喃的混合溶剂。
8.根据权利要求4所述的铁磁性纳米材料的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中四氧化三铁纳米立方体、聚已内酯和油酸的质量比为8～12:2～5:1。
9.如权利要求1～3任一所述的铁磁性纳米材料在干细胞标记中的应用。
10.如权利要求1～3任一所述的铁磁性纳米材料在制备核磁共振T2造影剂中的应用。
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