CN101503623B - 一种磁性荧光复合纳米粒子及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂及其制备方法。所述磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂的制备方法首先采用化学油相高温法制备疏水性单分散的Fe₃O₄纳米粒子，并对疏水性Fe₃O₄纳米粒子表面进行改性使其分散于水相，再制备表面带羧基的CdTe荧光量子点，通过共沉聚使CdTe荧光量子点沉淀在磁性Fe₃O₄纳米粒子表面，然后利用配体交换在CdTe荧光量子点表面修饰硅烷偶联剂，最后通过硅烷或硅酸酯水解形成最外层的SiO₂包覆层。所述磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂直径为30～50nm，同时具有磁性和荧光双功能，标记大鼠骨髓间充质干细胞后，荧光强度强而持久，细胞磁共振信号明显减低。该粒子在生物标记、生物分离等诸多领域有着广泛的应用前景。

Description

一种磁性荧光复合纳米粒子及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于纳米材料、生物医学技术领域，特别涉及一种磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂及其制备方法与应用。

背景技术

在分子影像学中，以超顺磁性氧化铁为核心的纳米颗粒已经成为磁共振分子影像学研究的主要技术手段之一。磁共振成像(MRI)具有无损害、空间分辨率高、可多维立体观察的优点。近年来发展迅速的干细胞研究中也广泛通过各种转染试剂(如聚赖氨酸(PLL)、硫酸鱼精蛋白、阳离子脂质体等)或配体-受体、抗原-抗体反应介导氧化铁纳米粒子标记干细胞，达到体外或活体成像的目的。多项研究证明，氧化铁纳米颗粒能够成功标记干细胞，在实验动物的肝脏、脑、心肌、肾脏等不同部位可较长时间(最长可长达8周)活体监测干细胞的存活、定居、迁移甚至分化，而且1.5T磁共振扫描仪可达到对氧化铁纳米粒子标记的BMSCs进行活体示踪的目的。但是，一般认为磁共振成像敏感性相对较低，尤其是临床应用的磁共振扫描仪，只能达到组织和细胞群层面，在活体内还不能达到对低数量级细胞群、单个细胞或者分子成像的目的，这一不足使磁共振成像在活体内细胞和分子影像学研究的应用有所受限。为了解决这一不足，方法之一就是开发多功能的纳米粒子，同时应用于磁共振成像和其他成像技术，将空间分辨率高的磁共振成像与其他敏感性高的成像技术的优点结合。

活体可见光成像，包括生物发光和荧光成像技术，是一种新兴的活体内光学成像技术，其优点之一就是敏感度高，在活体内的研究也证实活体可见光成像可以检测最低至10²个数量级的被标记细胞，可以与磁共振成像相结合，弥补其敏感性相对较低的不足。近年来常用的荧光纳米材料——量子点(QDs)，是一种由II～VI族或III～V族元素组成的纳米晶粒，直径2～10nm，激发后能自发荧光，可用于小动物活体可见光成像，追踪标记的目的细胞，与传统的有机荧光染料相比，具有荧光强度高、光化学稳定性高、抗光漂白作用强、可反复多次激发观察的优点，其荧光强度至少是有机荧光染料的20倍，稳定性则强100倍以上。与生物发光相比，QDs也具有不需要底物、不存在基因脱落的可能、发光强度高，可用于反复多次长期观察等优势。QDs成像的的敏感度极高且稳定，可以单分子成像，Dahan.M等就通过QDs观察到了活神经细胞细胞膜上单个甘氨酸受体的横向动力学。

磁性粒子具有磁靶向、磁分离、磁共振显影等多种功能，量子点具有优秀的荧光性能，因而磁性粒荧光纳米复合材料在生物标记、生物分离、疾病的检测与治疗等诸多领域具有非常广阔的应用前景。公开号为CN1831079、名称为“荧光磁性多功能纳米材料的制备方法”的专利申请公开了一种磁性纳米粒子与荧光量子点直接通过静电作用复合的方法。公开号为CN1559656、名称为“磁性微粒与量子点的核-壳式纳米复合粒子的制备方法”专利申请公开了一种磁性粒子通过分子偶联与量子点形成核壳粒子的方法。这两种方法由于量子点表面没有包覆层，其毒性使得这些粒子难以在活体内应用。公告号为CN1539913、名称为“荧光磁性多功能纳米材料及其制备方法”的国家发明专利公开了一种将荧光量子点与磁性纳米粒子共同包覆入高分子微球的方法，但由于这些高分子表面继续改性困难，限制了微球与生物分子的连接而使其应用受限。公开号为CN1698582、名称为“表面包硅的近红外荧光磁性纳米粒子及其制备方法和应用”的专利申请公开了一种表面包硅的近红外荧光磁性纳米复合粒子的制备方法，用于肿瘤靶向热疗。但此方法中水相合成的磁性粒子易团聚，与量子点同时包埋于二氧化硅时，复合粒子的粒径不易控制，而且其包被的近红外荧光量子点也主要局限于热疗应用。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点与不足之处，本发明的首要目的在于提供一种能获得粒径较小、分散性好、饱和磁化强度高、易于与生物分子结合的磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂。

所述的磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂，由磁性粒子Fe₃O₄，CdTe荧光量子点和SiO₂包覆层组成，以所述磁性粒子Fe₃O₄为球核心，中间层为所述CdTe荧光量子点，所述CdTe荧光量子点分布在所述磁性粒子Fe₃O₄表面，最外层为所述SiO₂包覆层，SiO₂包覆层包覆由所述磁性粒子Fe₃O₄和所述CdTe荧光量子点形成的球体。

本发明的另一目的还在于提供上述磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂的制备方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂的制备方法，包括如下工艺步骤和工艺条件：

(1)油相高温法制备疏水性Fe₃O₄纳米粒子：在惰性气体保护下，混匀0.5mmol乙酰丙酮铁、2.5mmol 1，2-十六烷二醇、1.5mmol油酸、1.Smmol油胺和5ml苄醚组成的混合物，200℃下保温2小时后继续加热至300℃，回流1小时，冷却至室温，产物用无水乙醇沉淀，10000～12000rpm/min离心分离5～8分钟，将沉淀物溶于含有0.013ml油酸和0.013ml油胺的10～15ml正己烷中，6000～8000rpm/min离心分离8～10分钟，沉淀物分散在2～3ml正己烷中，制得一级疏水性Fe₃O₄纳米粒子；根据所需疏水性Fe₃O₄纳米粒子的尺寸，以一级疏水性Fe₃O₄纳米粒子为晶种进行生长，制备得各种粒径的疏水性Fe₃O₄纳米粒子，具体步骤如下：A、在含20mg一级疏水性Fe₃O₄纳米粒子的1～2ml正己烷中，加入0.5mmol乙酰丙酮铁、2.5mmol 1，2-十六烷二醇、0.5mmol油酸、0.5mmol油胺和5ml苄醚组成的混合物，在惰性气体保护下搅拌均匀，加热至100℃保持0.5小时，然后在200℃下保温1小时，再加热至300℃回流0.5小时，冷却至室温；B、产物用无水乙醇沉淀，10000～12000rpm/min离心分离5～8分钟，将沉淀物溶于含有0.013ml油酸和0.013ml油胺的10～15ml正己烷中，6000～8000rpm/min离心分离5～8分钟，沉淀物分散在1～2ml正己烷中，制得二级疏水性Fe₃O₄纳米粒子；C、再以二级疏水性Fe₃O₄纳米粒子为晶种，循环重复B步骤，直至获得所需尺寸的疏水性Fe₃O₄纳米粒子。

(2)亲水性Fe₃O₄纳米粒子的制备：用无水乙醇沉淀步骤(1)制得的所需尺寸的疏水性Fe₃O₄纳米粒子，得到疏水性Fe₃O₄纳米粒子沉淀物，然后将20～30mg沉淀物分散于3～5ml于氯仿中，加入15～25μl三乙胺，制得溶液A。另取15～25mg 2，3-二巯基丁二酸(DMSA)溶于3～5ml二甲亚砜(DMSO)中，制得溶液B。将溶液A和溶液B混合均匀，60～70℃下振荡24～36小时，10000～12000rpm/min下离心分离，得到沉淀，无水乙醇洗涤，重复离心、洗涤3～4次。接着，将沉淀重新分散于30～50ml无水乙醇溶液中，加入15～25μl三乙胺，制得溶液C。另取15～25mg 2，3-二巯基丁二酸溶于3～5ml二甲亚砜中，制得溶液D。将溶液C和溶液D混合均匀，60～70℃下振荡12～24小时，产物在10000～12000rpm/min下离心分离，用无水乙醇洗涤，重复离心、洗涤3～4次。接着，将沉淀分散于5～6ml超纯水中，制得亲水性Fe₃O₄纳米粒子。

(3)CdTe荧光量子点的制备：100ml CdCl₂溶液(1.25×10^-3mol/L)中加入26.14μl巯基丙酸，用0.1mol/L NaOH溶液调pH至9.1，剧烈搅拌下通N₂脱氧20～30分钟，加入10μl NaHTe溶液，使反应物摩尔比为Cd²⁺∶HTe^-∶巯基丙酸＝1∶0.5∶2.4。100℃加热回流10分钟～5小时，得到不同荧光颜色的CdTe荧光量子点的水分散液；所述NaHTe溶液通过以下方法制备：127.5mgTe粉和80mg NaBH₄，所述NaBH₄∶Te粉摩尔比为2∶1，加入1ml H₂O，于室温下反应2～3min，即可获得NaHTe溶液。

(4)Fe₃O₄/CdTe纳米粒子的制备：在含0.4mg亲水性Fe₃O₄纳米粒子的100μl水分散液中，加入2～3ml CdCl₂溶液(0.1mol/L，pH 6.0)，超声20～30分钟后，加入1～2ml步骤(3)制得的CdTe荧光量子点的水分散液，室温振荡6～8小时。磁分离，依次用超纯水和无水乙醇洗涤2～3次。

(5)磁性荧光复合粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂的制备：在步骤(4)所述的Fe₃O₄/CdTe纳米粒子中加入3～4ml无水乙醇和500～600μl 3-巯丙基三甲氧基硅烷，振荡5～6小时，10000～12000rpm/min分离，用无水乙醇洗涤、离心，重复3～4次。沉淀物与无水醇和超纯水混合，加入正硅酸乙酯或硅烷偶联剂，振荡6～7小时，无水乙醇洗涤3～4次，得到磁性荧光复合粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂。

所述步骤(1)中的惰性气体优选为氮气。

所述步骤(1)中的疏水性Fe₃O₄纳米粒子直径为6nm～10nm之间。

所述步骤(2)中的亲水性Fe₃O₄纳米粒子直径为6nm～10nm之间。

所述步骤(3)中的CdTe荧光量子点发射光谱在521～647nm之间，呈现绿、黄、橙或红颜色的荧光。

所述步骤(5)中的无水醇为无水甲醇或无水乙醇；所述硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷或3-巯丙基三甲氧基硅烷。

所述步骤(5)中的磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂直径为30～50nm，其分散性好、呈现超顺磁性。

根据上述制备方法制备的磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂应用于骨髓间充质干细胞的标记和成像。

本发明的原理为首先采用油相高温法制备单分散、具有磁性的疏水性氧化铁纳米粒子，并对疏水性氧化铁纳米粒子表面进行改性使其成为亲水性氧化铁纳米粒子，分散于水相，再制备表面带羧基的荧光量子点，通过共凝聚使荧光量子点沉淀在磁性粒子表面，然后利用配体交换在荧光量子点表面修饰硅烷偶联剂，最后通过硅烷或硅酸酯水解形成最外层的二氧化硅包覆层。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

1、本发明采用油相高温法制备Fe₃O₄磁核，单分散性好，粒子间无团聚，可严格控制单个磁性粒子与荧光量子点结合，从而控制最终复合粒子具有较小的粒径，避免复合粒子由于粒径过大在活体内应用时被巨噬细胞清除。

2.本发明通过用共凝聚方法将表面带羧基的荧光量子点沉淀在氧化铁纳米粒子表面，操作简单易行，反应快速，而且CdTe荧光量子点分布在氧化铁纳米粒子表面，可有效减少CdTe荧光量子点的用量，增加磁性荧光复合纳米粒子的安全性。

3、本发明中的SiO₂包覆层，既可通过正硅酸乙酯水解得到表面带羟基的硅层，又可通过氨基硅烷或巯基硅烷直接水解得到表面带氨基或巯基的硅层，便于进一步连接生物分子，制成具有特异性的分子探针。

4、本发明制备得到的磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂，分散性好，具有超顺磁性，荧光明显。磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂能够成功的对大鼠BMSCs一步进行双重标记，即标记后的大鼠骨髓间充质干细胞具有磁性和荧光，标记后荧光强度强而持久，细胞磁共振信号明显减低。

附图说明

图1是实施例1所制得的磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂的透射电镜图。

图2是实施例1所制得的CdTe荧光量子点、Fe₃O₄/CdTe纳米粒子和磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂的荧光光谱图。

图3是实施例1所制得的磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂磁化曲线图。

图4是实施例1所制得的磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂双标记大鼠骨髓间充质干细胞与对照组细胞的磁共振扫描图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)疏水性Fe₃O₄纳米粒子的制备：在氮气保护下，快速混匀0.5mmol乙酰丙酮铁、2.5mmol 1，2-十六烷二醇、1.5mmol油酸、1.5mmol油胺和5ml苄醚组成的混合物，200℃下保温2小时后继续加热至300℃，回流1小时，冷却至室温，产物用无水乙醇沉淀，10000rpm/min离心分离5分钟，将沉淀物溶于含有0.013ml油酸和0.013ml油胺的10ml正己烷中，6000rpm/min离心分离10分钟，将沉淀物分散在2ml正己烷中，制得6nm的一级疏水性Fe₃O₄纳米粒子；接着，按以下步骤制备得到10nm的疏水性Fe₃O₄纳米粒子：A、含20mg 6nm一级疏水性Fe₃O₄纳米粒子的2ml正己烷中，加入0.5mmol乙酰丙酮铁、2.5mmol1，2-十六烷二醇、0.5mmol油酸、0.5mmol油胺和5ml苄醚组成的混合物，在氮气保护下搅拌均匀，加热至100℃保温0.5小时，然后在200℃保温1小时，再加热至300℃回流0.5h，冷却至室温；B、产物用无水乙醇沉淀，10000rpm/min离心分离5分钟，将沉淀物溶于含有0.013ml油酸和0.013ml油胺的10ml正己烷中，6000rpm/min离心分离10分钟，将沉淀物分散在2ml正己烷中，制得8nm的二级疏水性Fe₃O₄粒子；C、以20mg8nm的二级疏水性Fe₃O₄粒子为晶种，按由6nm的一级疏水性Fe₃O₄纳米粒子制备8nm的二级疏水性Fe₃O₄粒子的反应条件，制备10nm的疏水性Fe₃O₄纳米粒子。

(2)亲水性Fe₃O₄纳米粒子的制备：用无水乙醇沉淀10nm的疏水性Fe₃O₄纳米粒子。将30mg疏水性Fe₃O₄纳米粒子沉淀物分散于3ml氯仿，加入15μl三乙胺，得到溶液A，另取15mg DMSA溶于3ml DMSO中，得到溶液B，将溶液A和溶液B混合均匀，60℃下振荡24小时，接着，12000rpm/min下离心分离10分钟，无水乙醇洗涤，重复离心、洗涤步骤4次。接着，将沉淀物重新分散于30ml无水乙醇中，加入15μl三乙胺，得到溶液C，另取15mgDMSA溶于3ml DMSO，得到溶液D，将溶液C和溶液D混合均匀，60℃下振荡12小时，接着在12000rpm/min下离心分离10分钟，用无水乙醇洗涤后分散于5ml超纯水中，得到4mg/ml的亲水性Fe₃O₄纳米粒子的水分散液。

(3)CdTe荧光量子点的制备：100ml CdCl₂溶液(1.25×10^-3mol/L)中加入26.14μl巯基丙酸，用0.1mol/L NaOH调pH至9.1，在剧烈搅拌条件下通氮气20分钟进行脱氧，加入100μl NaHTe上清液，100℃加热回流4小时，得到发射峰为630nm的CdTe荧光量子点水分散液；上述NaHTe上清液的制备为127.5mg Te粉和80mg NaBH₄加入1ml H₂O，于室温下反应，生成NaHTe上清液。

(4)Fe₃O₄/CdTe纳米粒子的制备：取100μl 10nm亲水性Fe₃O₄纳米粒子的水分散液，依次加入500μl超纯水和2ml CdCl₂溶液(0.1mol/L，pH6.0)，超声30min后，加入1ml步骤(3)的CdTe荧光量子点水分散液，室温振荡6小时。磁分离，超纯水洗涤2次，无水乙醇洗涤三次，得到Fe₃O₄/CdTe纳米粒子沉淀物。

(5)磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂的制备：在Fe₃O₄/CdTe纳米粒子沉淀物中加入3ml无水乙醇和50μl 3-巯丙基三甲氧基硅烷，振荡5小时，12000rpm/min离心分离，得到Fe₃O₄/CdTe纳米粒子沉淀物，乙醇洗涤，重复离心、洗涤步骤3次。在Fe₃O₄/CdTe纳米粒子沉淀物中加入2.1ml无水乙醇，0.1ml超纯水，10μl正硅酸乙酯，振荡7小时，无水乙醇洗涤，得到表面带羟基的磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂粒子。

图1为本实施例制得的磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂的透射电镜图，可看出粒子的直径约为50nm，分散性好，无团聚。图2为本实施例制得的CdTe荧光量子点与Fe₃O₄/CdTe纳米粒子以及磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂的荧光光谱。可以看出，各粒子都有明显的荧光发射峰，与CdTe相比，Fe₃O₄/CdTe纳米粒子和磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂的荧光峰发生了红移，从630nm红移到705nm左右，这是由于复合后CdTe荧光量子点周围的微环境发生变化以及量子点的聚集引起的。图3为本实施例制得的磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂的磁性曲线图，从图中可以看出所制得的磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂具有超顺磁性。

实施例2

(1)疏水性Fe₃O₄纳米粒子的制备：按实施例1步骤(1)相同的方法制备6nm疏水性Fe₃O₄粒子。

(2)亲水性Fe₃O₄纳米粒子的制备：按实施例1步骤(2)相同的方法制备6nm亲水性Fe₃O₄粒子。

(3)CdTe荧光量子点的制备：按实施例1步骤(3)相同方法制备，区别在于回流时间为10分钟，得到荧光发射峰为521nm的CdTe荧光量子点水分散液。

(4)Fe₃O₄/CdTe纳米粒子的制备：取6nm亲水性Fe₃O₄纳米粒子和荧光发射波长为521nm的量子点，按实施例1步骤(4)相同的方法制备Fe₃O₄/CdTe纳米粒子。

(5)磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂的制备：按实施例1步骤(5)相同方法制备，得到直径为45nm、表面带羟基的磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂。

实施例3

(1)疏水性Fe₃O₄纳米粒子的制备：按实施例1步骤(1)相同的方法制备8nm疏水性Fe₃O₄粒子。

(2)亲水性Fe₃O₄纳米粒子的制备：按实施例1步骤(2)相同的方法制备8nm亲水性Fe₃O₄粒子。

(3)CdTe荧光量子点的制备：按实施例1步骤(3)相同方法制备，区别在于回流时间为1小时，得到荧光发射峰为560nm的CdTe荧光量子点水分散液。

(4)Fe₃O₄/CdTe纳米粒子的制备：取8nm亲水性Fe₃O₄纳米粒子和荧光发射波长为560nm的CdTe荧光量子点，按实施例1步骤(4)相同的方法制备Fe₃O₄/CdTe纳米粒子。

(5)磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂的制备：Fe₃O₄/CdTe纳米粒子中加入加入3ml乙醇，50μl 3-巯丙基三甲氧基硅烷，振荡5小时，12000rpm/min离心分离，乙醇洗涤，重复离心、洗涤步骤3次。沉淀物加入2.1ml甲醇，0.1ml水，再加入10μl 3-巯丙基三甲氧基硅烷，7.5μl四甲基氢氧化胺，振荡2小时，然后加热到60℃保持5分钟，冷却到室温，甲醇洗涤，得到直径为30nm、表面带巯基的磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂。

实施例4

(1)疏水性Fe₃O₄纳米粒子的制备：按实施例1步骤(1)相同的方法制备10nm疏水性Fe₃O₄粒子。

(2)亲水性Fe₃O₄纳米粒子的制备：按实施例1步骤(2)相同的方法制备10nm亲水性Fe₃O₄粒子。

(3)CdTe荧光量子点的制备：按实施例1步骤(3)相同方法制备，区别在于回流时间为3小时，得到荧光发射峰为608nm的CdTe荧光量子点。

(4)Fe₃O₄/CdTe纳米粒子的制备：取8nm亲水性Fe₃O₄纳米粒子和荧光发射波长为608nm的CdTe荧光量子点，按实施例1步骤(4)相同的方法制备Fe₃O₄/CdTe纳米粒子。

(5)磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂的制备：按实施例3步骤(5)相同方法制备，区别在于以10μl 3-氨丙基三乙氧基硅烷取代了实施例3步骤(5)的10μl 3-巯丙基三甲氧基硅烷，得到直径为34nm、表面带巯基的磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂。

实施例5

(1)疏水性Fe₃O₄纳米粒子的制备：按实施例1步骤(1)相同的方法制备8nm疏水性Fe₃O₄粒子。

(2)亲水性Fe₃O₄纳米粒子的制备：按实施例1步骤(2)相同的方法制备8nm亲水性Fe₃O₄粒子。

(3)CdTe荧光量子点的制备：按实施例1步骤(3)相同方法制备，区别在于回流时间为5小时，得到荧光发射峰为647nm的CdTe荧光量子点。

(4)Fe₃O₄/CdTe纳米粒子的制备：取8nm亲水性Fe₃O₄纳米粒子和荧光发射波长为647nm的CdTe荧光量子点，按实施例1步骤(4)相同的方法制备Fe₃O₄/CdTe纳米粒子。

(5)磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂的制备：按实施例3步骤(5)相同方法制备，得到直径为40nm、表面带巯基的磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂。

实施例6

(1)大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的提取、培养：无菌条件下取大鼠股骨和胫骨，完全培养基冲洗出骨髓，采用密度为1.077kg/L的Percoll液密度梯度离心(2000rpm/min，20min，取中间层)分离骨髓液，获得单个核细胞，加入含10％FBS的低糖DMEM培养液，调节细胞浓度至2×10⁵个/ml，接种于25cm²培养瓶内，5％CO₂、37℃培养箱中培养，3天首次换液，以后每3天换液及传代1次，培养过程中倒置相差显微镜动态观察细胞。取第三代贴壁细胞，采用流式细胞仪检测细胞的表面标志CD29、CD44、CD45、CD11b，鉴定BMSCs。

(2)BMSCs表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)：将已鉴定的BMSCs传代48h后，去除原培养液，以无血清DMEM培养基洗1次，加入EGFP慢病毒上清，病毒滴度(MOI)＝20，并加入8mg/L polybrene。感染96小时后，细胞出现荧光，使用含10％FBS的DMEM培养基换液，正常培养，动态观察荧光强度，挑选荧光强度高且稳定的单克隆继续培养以提高感染效率，得到荧光强度高且稳定的单克隆EGFP-BMSCs。

(3)磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂双标记EGFP-BMSCs：取实施例1制备的磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂、DMEM培养基和聚赖氨酸(PLL)混合，室温下振荡1小时，制成Fe₃O₄/CdTe/SiO₂-PLL复合物。将传代第7代的EGFP-BMSCs接种于细胞培养板；将Fe₃O₄/CdTe/SiO₂-PLL加入DMEM培养基中使铁的终浓度为25μg/ml，标记EGFP-BMSCs，在37℃、5％CO₂培养箱内孵育24h。除去培养液后，PBS充分冲洗去除细胞外铁，置于倒置相差显微镜下观察。设不加Fe₃O₄/CdTe/SiO₂-PLL复合物，DMEM培养基正常培养的EGFP-BMSCs作为对照组，同样进行以下的实验。

(4)细胞磁共振成像(MRI)：将1％琼脂糖溶液煮沸，1.5ml/孔注入装有特殊印模的24孔培养板中凝固成型，制造出一系列同规格的圆锥形空洞。收集以铁浓度25μg/ml双标记的生长良好的EGFP-BMSCs(细胞数≥5×10⁶个/ml)，PBS充分冲洗，0.25％胰酶消化并离心(1500rpm/min，3min)，重悬后计数，取少量用分光光度计测量铁含量，其余按3×10⁶、1×10⁶、5×10⁵、1×10⁵、5×10⁴、1×10⁴、5×10³、1×10³数量取BMSCs的细胞悬液分别加至8个EP管，离心(1500rpm，3min)后将细胞重悬于30μl1％温热琼脂糖溶液中，植入圆锥形空洞，凝固后，注入0.5ml 1％温琼脂糖溶液封闭空洞，以消除磁敏感伪影。MR扫描采用头线圈，视野(FOV)16cm×16cm，层厚2mm，矩阵320×224。成像序列包括：(1)自旋回波(SE)T₁WI：重复时间(TR)400ms，回波时间(TE)Minfull，激励次数2.0；(2)快速自旋回波(FSE)T₂WI：重复时间(TR)2500ms，回波时间(TE)85ms，回波链12，激励次数8.0；(3)梯度回波序列(GRE)T₂ ^*WI：重复时间(TR)450ms，回波时间(TE)15ms，翻转角20°，激励次数6.0。

荧光显微镜下观察磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂双标记EGFP-BMSCs，激发波长450-490nm时，可见双标记EGFP-BMSCs的绿色荧光和胞浆内Fe₃O₄/CdTe/SiO₂纳米颗粒的红色荧光，而未标记的EGFP-BMSCs的对照组仅见细胞的绿色荧光。图4为磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂标记细胞与对照组未标记细胞的磁共振扫描结果。对磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂标记的8个不同数量级的EGFP-BMSCs进行磁共振扫描(图5中B 1、B2、B3、B4、D1、D2、D3、D4所示，分别对应3×10⁶、1×10⁶、5×10⁵、1×10⁵、5×10⁴、1×10⁴、5×10³、1×10³个标记后的EGFP-BMSCs细胞)，相对于相同数量级无标记的EGFP-BMSCs(图中A1、A2、A3、A4、C1、C2、C3、C4所示，分别对应3×10⁶、1×10⁶、5×10⁵、1×10⁵、5×10⁴、1×10⁴、5×10³、1×10³个未标记的EGFP-BMSCs细胞)，可见由于细胞内超顺磁性氧化铁的存在，3×10⁶～5×10⁴数量级细胞T₂WI、T₂ ^*WI信号明显低于未标记的细胞，以3×10⁶最为明显。随着细胞数量级减小，两组之间的信号差异逐渐减小，数量级小于1×10⁴则与对照组信号差异不明显，不能被观察到。所有序列中T₂ ^*WI信号差异较T₂WI明显。以上结果表明，Fe₃O₄/CdTe/SiO₂纳米粒子能够成功地对大鼠BMSCs一步进行双重标记，标记后的磁共振和荧光信号明显。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂的制备方法，包括如下工艺步骤和工艺条件：

（1）油相高温法制备疏水性Fe₃O₄纳米粒子：在惰性气体保护下，混匀0.5mmol乙酰丙酮铁、2.5mmol 1,2-十六烷二醇、1.5mmol油酸、1.5mmol油胺和5ml苄醚组成的混合物，200℃下保温2小时后继续加热至300℃，回流1小时，冷却至室温，产物用无水乙醇沉淀，10000～12000rpm/min离心分离5～8 分钟，将沉淀物溶于含有0.013 ml油酸和0.013 ml油胺的10～15 ml正己烷中，6000 ～8000rpm/min离心分离8～10分钟，沉淀物分散在2～3 ml正己烷中，制得一级疏水性Fe₃O₄纳米粒子；根据所需疏水性Fe₃O₄纳米粒子的尺寸，以一级疏水性Fe₃O₄纳米粒子为晶种进行生长，制备得各种粒径的疏水性Fe₃O₄纳米粒子，具体步骤如下：A、在含20 mg 一级疏水性Fe₃O₄纳米粒子的1～2 ml正己烷中，加入0.5mmol乙酰丙酮铁、2.5mmol 1,2-十六烷二醇、0.5mmol油酸、0.5mmol油胺和5ml苄醚组成的混合物，在惰性气体保护下搅拌均匀，加热至 100℃保持0.5 小时，然后在200℃下保温1小时，再加热至300℃回流0.5小时，冷却至室温；B、产物用无水乙醇沉淀，10000～12000rpm/min离心分离5～8 分钟，将沉淀物溶于含有0.013 ml油酸和0.013 ml油胺的10～15 ml正己烷中，6000～8000rpm/min离心分离5～8 分钟，沉淀物分散在1～2 ml正己烷中，制得二级疏水性Fe₃O₄纳米粒子；C、再以二级疏水性Fe₃O₄纳米粒子为晶种，循环重复B步骤，直至获得所需尺寸的疏水性Fe₃O₄纳米粒子；

（2）亲水性Fe₃O₄纳米粒子的制备：用无水乙醇沉淀步骤（1）制得的所需尺寸的疏水性Fe₃O₄纳米粒子，得到疏水性Fe₃O₄纳米粒子沉淀物，然后将20～30 mg沉淀物分散于3～5 ml于氯仿中，加入15～25μl三乙胺，制得溶液A，另取15～25 mg 2,3-二巯基丁二酸溶于3～5 ml二甲亚砜中，制得溶液B，将溶液A和溶液B混合均匀，60～70℃下振荡24～36 小时，10000～12000 rpm/min下离心分离，得到沉淀，无水乙醇洗涤，重复离心、洗涤3～4次；接着，将沉淀重新分散于30～50 ml无水乙醇溶液中，加入15～25μl三乙胺，制得溶液C，另取15～25 mg 2,3－二巯基丁二酸溶于3～5 ml二甲亚砜中，制得溶液D，将溶液C和溶液D混合均匀，60～70℃下振荡12～24 小时，产物在10000～12000 rpm/min下离心分离，用无水乙醇洗涤，重复离心、洗涤3～4次；接着，将沉淀分散于5～6 ml超纯水中，制得亲水性Fe₃O₄纳米粒子；

（3）CdTe荧光量子点的制备：100 ml 1.25×10^-3mol/L CdCl₂溶液中加入26.14 μl巯基丙酸，用0.1mol/L NaOH溶液调pH至9.1，剧烈搅拌下通N₂ 脱氧20～30 分钟，加入10 μl  NaHTe溶液，使反应物摩尔比为Cd²⁺:HTe^- :巯基丙酸 = 1:0.5:2.4，100℃加热回流10 分钟～5小时，得到不同荧光颜色的CdTe荧光量子点的水分散液；所述NaHTe溶液通过以下方法制备：127.5mgTe粉和80mg NaBH₄，所述 NaBH₄: Te粉摩尔比为 2:1，加入1ml H₂O，于室温下反应2～3 分钟，即可获得NaHTe溶液；

（4）Fe₃O₄/CdTe纳米粒子的制备：在含0.4 mg亲水性Fe₃O₄纳米粒子的100μl水分散液中，加入2～3ml 0.1 mol/L，pH 6.0CdCl₂溶液，超声20～30分钟后，加入1～2 ml步骤（3）制得的CdTe荧光量子点的水分散液，室温振荡6～8 小时；磁分离，依次用超纯水和无水乙醇洗涤2～3次；

（5）磁性荧光复合粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂的制备：在步骤（4）所述的Fe₃O₄/ CdTe纳米粒子中加入3～4 ml无水乙醇和500～600 μl 3-巯丙基三甲氧基硅烷，振荡5～6 小时，10000～12000 rpm/min分离，用无水乙醇洗涤、离心，重复3～4次；沉淀物与无水醇和超纯水混合，加入正硅酸乙酯或硅烷偶联剂，振荡6～7小时，无水乙醇洗涤3～4次，得到磁性荧光复合粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂；

所述磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂由磁性粒子Fe₃O₄，CdTe荧光量子点和SiO₂包覆层组成，以所述磁性粒子Fe₃O₄为球核心，中间层为所述CdTe荧光量子点，所述CdTe荧光量子点分布在所述磁性粒子Fe₃O₄表面，最外层为所述SiO₂包覆层，SiO₂包覆层包覆由所述磁性粒子Fe₃O₄和所述CdTe荧光量子点形成的球体。

2.根据权利要求1所述磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中的惰性气体为氮气。

3.根据权利要求1所述磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中的疏水性氧化铁纳米粒子直径为6～10 nm之间。

4.根据权利要求1所述磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的亲水性氧化铁纳米粒子直径为6～10 nm之间。

5.根据权利要求1所述磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中的CdTe荧光量子点发射光谱在521～647 nm之间，呈现绿、黄、橙或红颜色的荧光。

6.根据权利要求1所述磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂的制备方法，其特征在于：所述步骤（5）中的无水醇为无水甲醇或无水乙醇；所述步骤（5）中的硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷或3-巯丙基三甲氧基硅烷。

7.根据权利要求1所述磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂的制备方法，其特征在于：所述步骤（5）中的磁性荧光复合纳米粒子Fe₃O₄/CdTe/SiO₂直径为30～50 nm，其分散性好、呈现超顺磁性。

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